WO2004060385A1

WO2004060385A1 - 眼科用治療組成物

Info

Publication number: WO2004060385A1
Application number: PCT/JP2003/016514
Authority: WO
Inventors: Teruo Nishida; Yorihisa Uetake; Hiroaki IWATA;
Original assignee: Nihon Tenganyaku Kenkyusho Co., Ltd.
Priority date: 2002-12-27
Filing date: 2003-12-24
Publication date: 2004-07-22
Also published as: US20100099629A1; EP1586324A4; JP4313033B2; ES2475243T3; JP2004210692A; US8207119B2; EP1586324A1; EP1586324B1; US20060234945A1; AU2003296060A1

Description

眼科用治療組成物

技術分野

本発明は、眼科用治療組成物に関するものである。明

背景技術

本発明は、フイブロネクチンの活性発田現部位であるプロリンーヒスチジン一セリン一アルギニンーァスパラギン、及びこのァミノ酸配列の両末端を修飾した化学物質（以下、 P H S R N又は Ac- Pro- His_Ser-Arg_Asn - NH₂とする）に関するものである。また、この物質についての医薬として許容される塩類を有効成分とする眼科用治療組成物、または/及び予防組成物に関するものである。この組成物は、特に角膜上皮の創傷治癒促進作用を有する角膜障害の予防剤、または z及び治療剤に関するものである。

角膜は、厚さ 0 . 5 2 mm〜 l . 0匪の薄い組織である。角膜は、眼球の最前線に位置しており、外界からの光を網膜における受容体へ導くために透過性と適切な屈折力を有する高度に分化した組織である。また、角膜は、生理学上極めて重要な機能を有している。角膜の構造は、比較的単純ではある。すなわち、角膜は、上皮層、ボーマン膜、角膜実質層、デスメ膜及び内皮細胞層からなる非常に規則正しく微細な 5重構造を有している。

フイブロネクチンは、細胞の接着や伸展に関与する分子量約 4 4万の糖蛋白であり、創傷治癒作用に加えて、形態形成や発生など生物現象で重要な役割を演じている。このフイブロネクチンは、分子量 2 2万〜 2 5万のサブユニットが 2個結合したダイマー（2量体）である。フイブロネクチンはドメイン構造を備えている。フイブロネクチンは、特異的に種々の細胞外基質と結合し、細胞表面のフイブロネクチン受容体（インテグリン）との橋渡しをすることにより細胞の接着に関与している。

角膜障害は、角膜潰瘍、角膜上皮剥雕、角膜炎またはドライアイ等の種々の疾患により引き起こされる。この障害は、混合感染の併発がない場合には、自然に修復する。その修復原理としては、 ①角膜が障害を受けると、上皮欠損部の露出した角膜実質部にフイブロネクチンが出現する、 ②このフイブロネクチンがマトリックスに接着する、 ③このマトリックスに上皮細胞が伸展 '移動する、というものである。角膜が治癒していくにつれて、フイブロネクチンは角膜障害部から消失していく。

何らかの理由で修復が遅延したり、あるいは修復が行われずに上皮欠損が遷延化することがある。すると、上皮の正常な構築に悪影響を与えることに加え、実質 ·内皮の構造や機能まで害される。従来の治療法は、外界の刺激から角膜表面を保護することにより、自然に上皮が伸展して欠損部の再被覆をはかるという受動的なものである。近年、細胞生物学の発展に伴い、細胞の分裂 ·移動 ·接着 - 伸展等に関与する因子が解明されてきている。角膜上皮欠損の修復には、角膜上皮の伸展を促進する化合物が重要視されてきている。

角膜上皮創傷の治療剤として知られているものとして、フイブロネクチン、 E G F (Epidermal Growth Factor) , ヒアルロン酸等の成分がある。人の血漿中に存在するフイブロネクチンを精製して、点眼用の血液製剤として用いることができる。この点眼剤により、角膜上皮欠損の再被覆が促進され、上皮創傷治癒が促進されることが知られている。

しかしながら現在のところ、フイブロネクチンは、患者自身の血漿を用いて、特殊な精製キットを用いて精製しなければならない。このため、フイブロネクチンを得るには、非常に手間がかかり、患者にとっては大きな負担となっている。この理由により、フイブロネクチンは臨床的には有効であるものの、充分には活用されるに至っていない。

E G F (Epidermal Growth Factor)は、分子量 6 0 0 0のポリぺプチドであり、角膜上皮分裂増殖因子としての作用が知られている。上皮の分裂を抑制する因子が存在している場合は、 E G Fの効果が発揮し難いこどが知られている。加えて、炎症を伴う例や糖尿病性角膜症では、 E G Fの副作用として、血管新生が発生するという問題点を有している。

ヒアル口ン酸は、 N-ァセチル- D -ダルコサミンと D—ダルク口ン酸を構成糖とする分子量数百万のダルコサミノダリカンである。ヒアルロン酸は、ドライアイの治療剤として顕著な治療効果を示すことが知られている。ヒアルロン酸の作用は、主として、上皮細胞の接着 ·進展 '移動に働くものであり、上皮細胞の増殖効果は弱い。ヒアルロン酸は、高濃度となると粘度が増すため、点眼剤としては使用しにくいという欠点がある。

ところで、ぺプチド P H S R Nは、国際公開公報 W〇 9 8 / 2 2 6 1 7号、及び The Journal of Cl inical Investigation, 105 (11) , pl537- 1545， 2000, The PHSRN sequence induces extracellular matrix invasion and accelerates wound heal ing in obese diabetic mice に開示されてレヽるペンタぺプチドである。これらの先行技術文献中には、ペプチド P H S R Nが、外傷治癒及びがん細胞浸潤 · 増殖抑制効果を有すると記載されている。しかし、ペプチド P H S R Nについての眼科領域に関する報告は知られていない。

このように、角膜障害治療組成物として、満足できるものは知られておらず、更に優れた組成物が強く望まれていた。

前述のように、フイブロネクチンは、眼科領域において臨床的には有効であると認識されている。しかし、フイブロネクチンは、血液製剤に特有の問題（例えば、衛生面の問題、患者自身が血液を採取するという負担の大きさ、及び血漿からフイブロネクチンを精製するという煩雑さ等）を有しているために、広く使用されるには至っていない。加えて、フイブロネクチンの活性部位は、充分には明らかにされていないことから、フイブロネクチンを角膜障害治療剤の有効成分として用いるには、更なる研究開発の余地が残されていた。本発明は、以上のような事情の下でなされたものであり、一つの目的は、フィブロネクチンの活性発現部位を見いだすことであり、他の目的は、フイブロネクチンの活性発現部位を眼科用治療薬または Z及び予防薬として使用できる組成物を提供することである。発明の開示

以上のような目的を達成すべく、本発明者らは、フイブロネクチンに含まれるぺプチドに着目し、角膜障害に対する作用を検討した。その結果、本発明者らは、フイブロネクチンの活性発現部位である PH S RNが、角膜上皮の創傷治癒を促進することを見い出した。

すなわち、本発明者らは、 ① PHSRNの眼科用治療組成物としての新しい用途を見い出し、 ②角膜が損傷を受けた状態にある角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎またはドライアイ等の角膜障害の予防剤または/及び治療剤として、 P H S R N、またはその医薬として許容される塩類を用いる組成物が有用であることを見い出し、基本的には本発明を完成した。

こうして、本発明は、角膜障害に対して、少量で強い治療効果を示し、かつ低分子で安全性に優れる新規な眼科治療用組成物を提供するものである。

より具体的には、本発明においては以下のようなものを提供する。

( 1) ペプチド PHSRN、またはこのペプチドについての医薬として許容される塩類を有効成分として含有する眼科用治療組成物。

(2) ペプチド PHSRN、またはこのペプチドについての医薬として許容される塩類を有効成分とする角膜障害予防剤または z及び治療剤。

(3)角膜障害が角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎またはドライアイである（2) 記載の角膜障害予防剤または/及び治療剤。

(4) 剤型が点眼剤である（3) 記載の角膜障害予防剤または/及び治療剤。

(5) ぺプチド PHS RNまたはこのべプチドについての医薬として許容される塩類を有効成分とする角膜上皮伸展促進剤。

(6) 剤型が点眼剤である（5) 記載の角膜上皮伸展促進剤。

(7) 有効量のぺプチド PHS RNまたはこのぺプチドについての医薬として許容される塩類の使用及びこれらによる角膜障害治療方法。

なお、本明細書中において、アミノ酸残基については、次のような省略記号を用いる。つまり、ァスパラギンは Asnまたは Nを、アルギニンは Argまたは Rを、ヒスチジンは Hisまたは Hを、プロリンは Proまたは Pを、セリンは Serまたは Sを意味する。また、 Acはァセチル基を、 NH₂はアミノ基を意味する。

ペプチド PHSRNは、フイブロネクチンの活性部位であるペンタぺプチド、 Pro- His- Ser- Arg- Asn の構造を有するものである。上記アミノ酸は多数の鏡像異性体を生じ得る場合、これらすベての鏡像体及びそれらの混合物はすべて本発明に含まれるものである。ぺプチド PHS RNをモチーフとして形成された組成物については、均等の範囲として本発明の権利範囲に解釈されるべきである。また、ペプチド PHS RNにおいて、 N末端側をァセチル化し、 C末端側をアミド化した物質、つまり Ac—Pro—His— Ser— Arg— Asn— NH₂力好ましヽ。

本発明でいう予防またはノ及び治療とは、ヒトを含む動物に投与することにより、疾病の発生を未然に防ぐこと（予防）または、疾病に罹った患者を治すこと (治療）を意味している。

本発明でいう角膜障害とは、種々の要因により角膜が損傷を受けた状態にある角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎、ドライアイ等をいう。

ぺプチド PHS RNについての医薬として許容される塩類としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シユウ酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等が挙げられる。

ぺプチド PH S RN、またはこのぺプチドについての医薬として許容される塩類は、経口的、または非経口的に投与することができる。投与剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤、点眼剤等が挙げられる。このうち、特に点眼液、眼軟膏等の点眼剤が好ましい。これらは汎用されている技術を用いて製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の経口剤であれば、乳糖、結晶セルロース、デンプン、植物油等の賦形剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢斉 1J、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の崩壌剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴール、シリコン樹脂等のコーティング剤、ゼラチン皮膜等の皮膜剤などを必要に応じて加えればよい。また、点眼液であれば、塩化ナトリウム等の等張化剤、リン酸ナトリウム等の緩衝化剤、塩化ベンザルコ -ゥム等の防腐剤等を用いて製剤化することができる。これらの医薬の p Hは、眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、 4〜 8の範囲が好ましい。眼軟膏であれば、白色ヮセリン、流動パラフィン等の汎用される基剤を用いて調製することができる。

また、本発明の角膜障害治療剤は、局所投与、特に点眼剤として投与することが好ましい。点眼剤におけるペプチド P H S R Nの濃度は、症状、年令等に応じて設定すれば良く、特に限定する必要はないが、 0. 00001%〜1%が好ましい。投与量としては、点眼液を例にとると、 1回 1滴〜数滴、 1 日 1回〜数回投与することができる。点眼剤としては、通常の点眼液のほか、用時溶解型の点眼液や眼軟膏としてもよい。製剤化については通常の技術、すなわち塩化ナトリウム、塩化カリウム等の等張化剤、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等の緩衝剤、ェデト酸ナトリウム等の安定化剤、ェチルパラベン、ブチルパラベン、塩化ベンザルコニゥム等の防腐剤、水酸化ナトリウム、希塩酸等の p H調整剤、白色ヮセリン、流動パラフィン等の眼軟膏用基剤等の添加物を必要に応じて加え、常法により製剤化することができる。

本発明に係るペプチド P H S R Nは、例えば不溶性の高分子担体上でペプチド鎖を C末端から伸長していく固相法、または担体を用いない液相法などの通常のぺプチド合成で用いられる方法によって容易かつ安価に製造することができる。本発明の眼科用剤を工業的に生産するために、本発明に係るペプチド P H S R Nを使用すること、及びこれを用いて患者に投与する治療方法も本発明の適用範囲に含まれる。図面の簡単な説明

第 1図は、ぺプチド PHS RNの角膜上皮細胞の伸展に与える効果を示すダラフである。横軸は、ペプチド PH S RNの濃度（0 (コントロール）、 5 1. 2 η Μ、 1 0 2. 5 ηΜ、 1 5 3. 7 ηΜ、 25 6. 2 ηΜ、 5 1 2. 3 ηΜ) を示し、縦軸は、角膜上皮の伸展長（/ m) を示した。発明を実施するための最良の形態 '

本発明者らは、ペプチド PHSRNの有用性を調べるために、角膜障害に対するペプチド P H S R Nの影響を検討した。詳細は、後述の薬理試験の項で示した。本発明者らは、ペプチド PHSRNの点眼が、 ①角膜片の組織培養系における角膜上皮の伸展効果、及び②角膜上皮剥離後の創傷治癒を促進する効果を有することを見出した。このことから、ぺプチド PHS RNは、角膜障害（すなわち、種々の要因により角膜が損傷を受けた状態にある角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎、ドライアイ等、特に角膜上皮剥離）、及びドライアイの治療に有用であることが明らかとなつた。

次に、本発明の製剤例および薬理試験の結果を説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。

1. 製剤例

1) 点眼液

処方 1として、全量 100ml 中に、. Ac-Pro-His- Ser- Arg-Asn- NH₂を 0.01g、塩化ナトリウムを 0. 9g、及ぴ滅菌精製水を適量含む点眼液を調整する。また、処方 1 と同様にして、全量 100ml中に、 Ac- Pro- His- Ser- Arg- Asn- N が、各々 0. OOOOlg, 0. 00003g, 0. OOOlg, 0. 0005g, 0. OOlg, 0. 005g, 0. 05g, 0. Ig含まれる点眼液を調製することができる。

処方 2として、全量 100ml中に、 Ac-Pro- His-Ser-Arg- Asn- NH₂を 0. lg、塩化ナトリウムを 0. 8g、リン酸水素ナトリウムを 0. Ig、リン酸ニ水素ナトリウムを適量、及び滅菌精製水を適量含む点眼液を調整する。また、処方 2と同様にして、全量 100ml中に、 Ac- Pro - His- Ser- Arg- Asn- NH₂が、各々 0. OOOOlg, 0. 00003g, 0. OOOlg, 0. 0005g, O. OOlg, 0. 005g, 0. 05g, 0. Ig含まれる点眼液を調製することができる。

2) 眼軟膏

処方 3として、全量 100g中に、 Ac- Pro-Hi S- Ser- Arg - Asn- NH₂を 0. 05g、白色ヮセリンを 90g、及び流動パラフィンを適量含む眼軟膏を調整することができる。また、処方 3と同様にして、全量 100g中に、 Ac - Pro- His- Ser Arg- Asn- NH₂が、各々 0. OOOOlg, 0. 00003g, 0. OOOlg, 0. 0005g, 0. OOlg, 0. 005g, 0. 05g, 0. Ig含まれる眼軟膏を調製することができる。 ·

2 . 実施例

固相法により Ac- Pro-Hi S- Ser- Arg- Asn - NH₂を合成した。この化合物を用いて、 ① in vitro における角膜上皮伸展作用、及び② in vivo における角膜創傷治癒促進作用を検討した。詳細なデータは薬理試験の項に記載した。

Ac - Pro - His - Ser- Arg_Asn- NH₂を加えた群では、コント口ール群と比較すると、明らかに角膜上皮細胞層が伸展し、また角膜の創傷が早く治癒した。このことから、 Ac- Pro - His- Ser_Arg_Asn - NH₂が、角膜障害の治療剤として有用であることが立証された。

3 . 薬理試験

①角膜上皮伸展に対する作用（in vitro)

雄性日本白色ゥサギの角膜を用い、 Nishidaらの方法（J. Cell. Biol .， 97, 1653 - 1657 ( 1983) ) に準じ、角膜片の組織培養系での角膜上皮伸展長を指標にして角膜上皮伸展に対する影響を検討した。

(実験方法）

ゥサギ角膜片より角膜ブロック（1群 3個）を切り出した。この角膜ブロックを被験化合物を含む培養液（Medium— 199) 中、 37°C、 5% C0₂の条件下で、 20時間培養した。培養後、角膜ブロックをエタノール-氷酉乍酸（容積比 95 : 5) 混合液中で固定し、パラフィンで包埋して切片を作製した。切片を脱パラフィンした後、へマトキシリン-ェォジン染色し、顕微鏡で上皮細胞層の伸展長を測定した。コントロールとして、被験化合物を含まない培養液で同様に培養したものを用いた。

(結果）

図 1に示すように、 Ac - Pro- His- Ser- Arg- Asn- NH₂を含む培養液で培養をすると、角膜上皮の伸展に対して顕著な促進が認められた。

②角膜創傷治癒促進作用（1) (in vivo)

雄性日本白色ゥサギを用い、 Cintron らの方法（Ophthalmic Res. , 11， 90-96 ( 1979) )に準じて角膜上皮剥離を起こさせ、角膜に直径約 6讓の創傷を作成した。創傷面積は、フルォレセイン染色面積を指標として測定した。被験化合物の角膜創傷治癒に対する影響を検討した。

(実験方法）

角膜上皮剥離を起こさせた後、 0、 3、 6、 9、 12、 18、 24、 27、 30、 33、 36、 42 及び 48時間後に各濃度の被験化合物を含む点眼液を点眼（SO LZ回）した。創傷面積を測定する際に、フルォレセイン染色を行い角膜の写真を測定した。撮影した角膜のフルォレセィン染色面積は、画像解析処理システムを用いて算出した。コントロールとして、被験化合物を含まない基剤（PBS) を点眼したゥサギを用いた。

(結果）

下記表 1 及び表 2 は、ゥサギ角膜損傷モデルにおける Ac-Pro-Hi s-Ser-Ar g-Asn-N¾ (PHS RN) に対する治癒後効果を治癒率で示したものである。表 1及ぴ表 2に示す通り、ペプチド PH S RNの点眼は、創傷治癒に対して顕著な促進を示すことが認められた。

表 1及び表 2において、各値は平均値 ±標準偏差を示す（n -6)。統計解析は、 PBSに対する Durmettの多重比較を用い、角膜上皮剥離直後（0時間）の角膜損傷部位の面積を 100%とした（*pく 0.05、 ** <0.01 ； v. s.コントロール）。

<ゥサギ角膜損傷モデルに対する PHS RNに対する治癒後効

/口 ¾¾i半 0ノ unr 6hr 12hr

PBS 0 4.96±3.28 19.14±5.04 5

Z/l M PHSRN 0 9.66±2.21 * 26.71 ±2.62 6

20μΜ PHSRN 0 10·73±3.21 28.01 ±1.92 6

200 /M PHSRN 0 11.06 ±3.50 ** 28.69 ±4.10 ** 6

孝

2000/iM PHSRN 0 11.15±1.25 28.99±2.65 ** 6

*寧

5JUMEGF 0 14.49±3.42 31.63±1.29 7

鹏灰<灰 9 i 9HdNH V一り^ϊ.· 12 - 表 2

Λ

褂

③角膜創傷治癒促進作用（2) (in vivo)

上記②と同様の方法を用いて、日本白色ゥサギを用い角膜上皮剥離を起こさせ、角膜に直径約 8匪の創傷を作成した。創傷面積をフルォレセィン染色面積を指標として測定し、角膜創傷治癒に対する影響を検討した。

(実験方法）

角膜上皮剥離を起こさせた後、 0、 6、 12、 18、 24、 30、 36、 42、 48及ぴ 54時間後に各濃度の被験化合物を含む点眼液を点眼 (25 回) した。創傷面積を測定する際に、フルォレセイン染色を行い角膜の写真を測定した。撮影した角膜のフルォレセイン染色面積は、画像解析処理システムを用いて算出した。コント口ールとして、被験化合物を含まない基剤（生理食塩水）を点眼したゥサギを用いた。

(結果）

下記表 3 及び表 4 は、ゥサギ角膜損傷モデルにおける Ac-Pro-Hi s-Ser-Ar g-Asn-NH₂ (PHS RN) に対する治癒後効果を治癒率で示したものである。表 3及び表 4に示す通り、ペプチド PHS RNの点眼は、創傷治癒に対して顕著な促進を示すことが認められた。

表 3及び表 4において、各値は平均値土標準偏差を示す（ n =6)。統計解析は、生理食塩水に対する Dunnettの多重比較を用い、角膜上皮剥離直後（0時間）の角膜損傷部位の面積を 100%とした（*pく 0.05、 **p <0.01 ； v. s.コントロール）。

<ゥサギ角膜損傷モデルにおける PHS RNに対する治癒後効果 (治癒率) >

»3 <ゥ耀サギ角膜損傷モデルにおける P H S R Nに対する治癒後効果（治癒率） >

36hr 48hr 54hr 72hr

生理食塩水 65.63±6.69 87.06±7.72 94.46士 6.50 99-72±0.80

0.3%ヒアレ□ン酸 71.62±11.02 90.19±9.51 95·35±6.44 99.92 ±0.22

0.04% PHSRN 70.29±8.38 88.27±8.74 94.24士 6.62 98.93±2.16

*4 発明の効果

上記の薬理試験から、フィプロネクチンの最小活性発現部位であるペプチド P

H S R Nが、角膜上皮の創傷治癒促進作用を有していること、及び種々の要因により角膜が損傷を受けた状態にある角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎またはドラィアイ等の角膜障害の予防剤または / 及び治療剤として有用であること、が見い出された。

Claims

請求の範囲

1. ペプチド PHSRN、またはこのペプチドについての医薬として許容される塩類を有効成分とする眼科用治療組成物。

2. ペプチド PHSRN、またはこのペプチドについての医薬として許容される塩類を有効成分とする角膜障害予防剤または/及び治療剤。

3. 角膜障害が角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎またはドライアイである請求項 2記載の角膜障害予防剤または/及び治療剤。

4. 剤型が点眼剤である請求項 2記載の角膜障害予防剤または Z及び治療剤。

5. 剤型が点眼剤である請求項 3記載の角膜障害予防剤または Z及び治療剤。

6. ペプチド PHSRN、またはこのペプチドについての医薬として許容される塩類を有効成分とする角膜上皮伸展促進剤。

7. 剤型が点眼剤である請求項.6記載の角膜上皮伸展促進剤。

8. 有効量のペプチド PH S RN、またはこのペプチドについての医薬として許容される塩類の使用及びこれらによる角膜障害治療方法。