WO2003046551A2 - Measuring method for measuring the surfaces of biological and/or chemical samples - Google Patents
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Abstract
The invention relates to a measuring method for measuring the surfaces of biological and/or chemical samples by using a distance sensor, based on the confocal optical imaging principle, whereby the surface of the sample, which is to be analysed, is measured by sequential scanning of individual surface points. According to two embodiment examples of said invention, a high numeric aperture is selected for the distance sensor and/or a sensitive detector is used, because of the generally low backscattering and reflection of surfaces of biological and/or chemical samples. The present invention also relates to different evaluation methods for determining the light intensity, which is maximally backscattered by the sample to be analysed, depending on the backscatter signal which is detected by said detector.
Description
Beschreibungdescription
Messverfahren zur Oberflächenvermessung von biologischen und/oder chemischen ProbenMeasuring method for the surface measurement of biological and / or chemical samples
Die Erfindung betrifft ein Messverfahren zur dreidimensionalen Oberflächenvermessung von biologischen und/oder chemischen Proben.The invention relates to a measuring method for three-dimensional surface measurement of biological and / or chemical samples.
Aufgrund der rasanten Entwicklung der Biotechnologie in den letzten Jahren gewinnt die sogenannte Biosensorik zunehmend an Bedeutung. Unter dem Begriff Biosensorik versteht man die Entwicklung und die Verwendung von Sensoren, mit denen biologische Substanzen detektiert und/oder Eigenschaften von biologischen Substanzen erfasst werden können. Die Biosensorik profitiert dabei von einer Vielzahl von unterschiedlichen physikalischen, chemischen und/oder biochemischen Eigenschaften der zu erfassenden Substanzen. So beruhen beispielsweise viele Biosensoren auf einem für die zu erfassenden biologi- sehen Substanzen charakteristischen Bindungsverhalten an sogenannten Fängermolekülen, welche an festgelegten Stellen des verwendeten Biosensors angeordnet sind. Die an die Fängermoleküle gebundenen Biomoleküle können beispielsweise durch Messung von charakteristischer Fluoreszenzstrahlung, durch Absorption von elektromagnetischer Strahlung oder durch eine Messung der durch das Binden der Biomoleküle verursachten Änderung einer elektrischen Kapazität erfasst werden.Due to the rapid development of biotechnology in recent years, so-called biosensor technology is becoming increasingly important. The term biosensorics means the development and use of sensors with which biological substances can be detected and / or properties of biological substances can be recorded. The biosensors benefit from a variety of different physical, chemical and / or biochemical properties of the substances to be detected. For example, many biosensors are based on a binding behavior to so-called capture molecules which is characteristic of the biological substances to be detected and which are arranged at fixed points on the biosensor used. The biomolecules bound to the capture molecules can be detected, for example, by measuring characteristic fluorescent radiation, by absorbing electromagnetic radiation or by measuring the change in electrical capacity caused by the binding of the biomolecules.
Auf dem Gebiet der Optik ist aus der DE 196 08 468 C2 ein optischer Abstandssensor bekannt, welcher auf dem konfokalen optischen Abbildungsprinzip beruht und welcher zur dreidimensionalen Oberflächenvermessung geeignet ist. Ein derartiger optischer Abstandssensor, der beispielsweise in Figur 7 der DE 196 08 468 C2 dargestellt ist, umfasst eine punktförmige Lichtquelle und einen punktförmigen Empfänger. Die punktförmige Lichtquelle wird auf einer Oberfläche eines Messobjektes abgebildet. Der punktförmige Empfänger ist konfokal zur
punktförmigen Lichtquelle im bildseitigen Messbereich angeordnet. Der optische Abstandssensor zeichnet sich ferner durch eine zumindest teilweise koaxiale Führung von Beleuch- tungs- und Messstrahl aus, wobei die optische Wegstrecke zwischen dem punktförmigen Empfänger und dem Messobjekt durch den Einsatz eines in Richtung der optischen Achse einer Abbildungsoptik schwingenden Spiegelsystems variierbar ist und mittels eines Peakdetektors maximale Lichtintensitäten auf dem punktförmigen Empfänger feststellbar sind.In the field of optics, an optical distance sensor is known from DE 196 08 468 C2, which is based on the confocal optical imaging principle and which is suitable for three-dimensional surface measurement. Such an optical distance sensor, which is shown, for example, in FIG. 7 of DE 196 08 468 C2, comprises a point-shaped light source and a point-shaped receiver. The point light source is imaged on a surface of a measurement object. The punctiform receiver is confocal to punctiform light source arranged in the image-side measuring area. The optical distance sensor is also characterized by an at least partially coaxial guidance of the illumination and measurement beam, the optical path between the point-like receiver and the measurement object being variable by using a mirror system that vibrates in the direction of the optical axis of an imaging optics and by means of a Peak detector maximum light intensities can be determined on the point receiver.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Messverfahren zu schaffen, mit dem Oberflächen von biologischen und/oder chemischen Proben schnell und präzise vermessen werden können.The invention has for its object to provide a measuring method with which surfaces of biological and / or chemical samples can be measured quickly and precisely.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Messverfahren zur Oberflächenvermessung von biologischen und/oder chemischen Proben unter Verwendung eines auf dem konfokalen optischen Abbildungsprinzip beruhenden Abstandssensors gemäß Anspruch 1. Demnach wird die zu untersuchende biologische und/oder chemische Probe relativ zu dem auf das Messobjekt treffenden Beleuchtungsstrahl des Abstandssensors in eine definierte Anfangsposition gebracht, ein Reflektorsystem wird in Richtung der optischen Achse einer Abbildungsoptik bewegt, so dass die optischen Wegstrecken zwischen einer Sendeeinheit und einem Oberflächenpunkt des Messobjekts und zwischen einer Empfangseinheit und dem Oberflächenpunkt des Messobjekts variiert werden, während der Bewegung des Reflektorsystems wird der Verlauf der Lichtintensität auf der Empfangseinheit in Abhängigkeit von der Stellung des Reflektorsystems erfasst und aus dem Verlauf der Lichtintensität wird der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem Oberflächenpunkt ermittelt.This object is achieved by a measurement method for the surface measurement of biological and / or chemical samples using a distance sensor based on the confocal optical imaging principle. Accordingly, the biological and / or chemical sample to be examined is relative to the illumination beam of the Distance sensor brought into a defined initial position, a reflector system is moved in the direction of the optical axis of an imaging optics, so that the optical distances between a transmitter unit and a surface point of the measurement object and between a receiver unit and the surface point of the measurement object are varied while the movement of the reflector system the course of the light intensity on the receiving unit as a function of the position of the reflector system is detected and the course of the light intensity becomes the distance between the distance sensor and the surface point determined.
Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung nach Anspruch 2 wird nach der Ermittlung des Abstands zwischen dem Abstandssensor und dem Oberflächenpunkt die zu untersuchende Probe mittels
einer definierten Verschiebung in einer Ebene senkrecht zu dem auf das Messobiekt treffenden Beleuchtungsstrahl in eine weitere Position gebracht, das Reflektorsystem in Richtung der optischen Achse der Abbildungsoptik bewegt, so dass die optischen Wegstrecken zwischen Sendeeinheit und einem weiteren Oberflachenpunkt des Messobjekts und zwischen Empfangseinheit und dem weiteren Oberflachenpunkt des Messobjekts variiert werden. Wahrend der Bewegung des Reflektorsystems wird der Verlauf der Lichtintensitat auf der Empfangseinheit in Abhängigkeit von der Stellung des Reflektorsystems erfasst und aus dem Verlauf der Lichtintensitat wird der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem weiteren Oberflachenpunkt ermittelt. Damit kann auf vorteilhafte Weise durch das sequentielle Abtasten einer Mehrzahl von Oberflachenpunkten die zu untersuchende dreidimensionale Oberflache schnell und zuverlässig vermessen werden.According to a development of the invention according to claim 2, the sample to be examined is determined after determining the distance between the distance sensor and the surface point a defined displacement in a plane perpendicular to the illuminating beam striking the measuring object is brought into a further position, the reflector system moves in the direction of the optical axis of the imaging optics, so that the optical distances between the transmitting unit and a further surface point of the measuring object and between the receiving unit and the further one Surface point of the measurement object can be varied. During the movement of the reflector system, the course of the light intensity on the receiving unit is detected as a function of the position of the reflector system, and the distance between the distance sensor and the further surface point is determined from the course of the light intensity. The sequential scanning of a plurality of surface points advantageously allows the three-dimensional surface to be investigated to be measured quickly and reliably.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass für eine Vielzahl von Anwendungen auf dem Gebiet der Biotechnologie Biosensoren nützlich sind, mit denen die dreidimensionale Oberflache einer biologischen und/oder einer chemischen Probe vermessen werden kann. So kann beispielsweise festgestellt werden, ob ein aufgebrachtes Probenmaterial in Form eines Tropfens, als ein Plateau, als weitgehend ebene Flache oder als eine Struktur mit einzelnen Erhöhungen vorliegt. Ebenso kann untersucht werden, wie sich eine bestimmte Menge einer zu untersuchenden Probe an eine vorgegebene Oberflachenstruktur anpasst, d.h. wie sich die Flachendichte der Probe bei einer bestimmten Oberflachenrelief verhalt. Ein weiterer wichtiger Anwendungsfall ist beispielsweise die exakte Bestimmung der Menge einer bestimmten biologischen Substanz, welche in Form eines auf ein Substrat aufgebrachten Tropfens vorliegt. Aus der genauen Tropfenform kann zum Beispiel exakt das Volumen der zu untersuchenden biologischen Probe bestimmt werden, wodurch beispielweise eine genaue Aussage über die integral vorliegende Probenkonzentration möglich wird. Für den Fall, dass die räumliche Verteilung der Probenkonzentra-
tion durch Diffusion der Probenmolekuhle in eine an einer Grenzflache anliegende Losung bestimmt wird, kann die lokale Probenkonzentration insbesondere in den Randbereichen der Losung von der Große der Volumina der Randbereiche abhangen und indirekt über eine exakte Oberflachenvermessung der als Tropfen vorliegenden Probe ermittelt werden.The invention is based on the knowledge that biosensors with which the three-dimensional surface of a biological and / or a chemical sample can be measured are useful for a large number of applications in the field of biotechnology. For example, it can be determined whether an applied sample material is in the form of a drop, as a plateau, as a largely flat surface or as a structure with individual elevations. It can also be investigated how a certain amount of a sample to be examined adapts to a given surface structure, ie how the areal density of the sample behaves with a certain surface relief. Another important application is, for example, the exact determination of the amount of a certain biological substance which is in the form of a drop applied to a substrate. For example, the exact drop shape can be used to determine the exact volume of the biological sample to be examined, which makes it possible, for example, to make a precise statement about the integrally present sample concentration. In the event that the spatial distribution of the sample concentration tion is determined by diffusion of the sample molecules into a solution adjacent to an interface, the local sample concentration, in particular in the edge regions of the solution, can depend on the size of the volumes of the edge regions and can be determined indirectly via an exact surface measurement of the sample present as drops.
Die Erfindung kann auch zur genauen Erfassung der dreidimensionalen Oberflache von kleineren biologischen Objekten, insbesondere einzelne Zellen oder Proteine verwendet werden, welche häufig an Polystyrolkugelchen gebunden werden. Derartige für die Bindung von einzelnen Zellen oder Proteinen geeigneten Polystyrolkugelchen werden auch als sogenannte Beads bezeichnet. Die genaue Bestimmung der Oberflache von einzelnen Zellen oder Proteinen ermöglicht somit eine Vermessung des sterischen Aufbaus der einzelnen Zellen oder Proteine. Aus der Kenntnis des sterischen Aufbaus können zum Beispiel wichtige Erkenntnisse über das charakteristische Bindungsverhalten der untersuchten Zellen/Proteine gewonnen werden.The invention can also be used for the precise detection of the three-dimensional surface of smaller biological objects, in particular individual cells or proteins, which are often bound to polystyrene spheres. Polystyrene spheres of this type suitable for binding individual cells or proteins are also referred to as so-called beads. The exact determination of the surface of individual cells or proteins thus enables the steric structure of the individual cells or proteins to be measured. Knowledge of the steric structure can, for example, provide important insights into the characteristic binding behavior of the cells / proteins examined.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung nach Anspruch 3 wird die numerische Apertur des auf das Messobjekt treffenden Beleuchtungsstrahls so groß gewählt, dass durch das Messobjekt von dem Licht des Beleuchtungsstrahls möglichst viel Streulicht in den Raumwinkel des Messstrahls gestreut wird. Bei dem der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden konfokalen optischen Abstandssensor ist die numerische Apertur des Beleuchtungsstrahls gleich der numerischen Apertur des Messstrahls. Eine große numerischen Apertur des Messstrahls bedeutet gleichzeitig aber auch eine große Winkelakzeptanz für das von der Probenoberflache zuruckgestreute Licht. Somit ist eine große numerische Apertur des Beleuchtungsstrahls insbesondere für die Vermessung von Proben mit schwach zuruckstreuender Oberflache vorteilhaft, weil aufgrund einer großen Winkelakzeptanz auch die Lichtintensitat
erhöht ist, welche auf die Empfangseinheit des Abstandssensors trifft.According to an advantageous development of the invention according to claim 3, the numerical aperture of the illumination beam striking the measurement object is chosen to be so large that as much scattered light as possible is scattered into the solid angle of the measurement beam by the light of the illumination beam. In the confocal optical distance sensor on which the present invention is based, the numerical aperture of the illuminating beam is equal to the numerical aperture of the measuring beam. A large numerical aperture of the measuring beam also means a large angular acceptance for the light scattered back from the sample surface. Thus, a large numerical aperture of the illuminating beam is particularly advantageous for the measurement of samples with a weakly backscattering surface, because the light intensity is also due to the large angle acceptance is increased, which hits the receiving unit of the distance sensor.
Ein weiterer Vorteil einer großen numerische Apertur besteht ferner darin, dass selbst bei einer im Vergleich zur optischen Achse des auf die Probenoberfläche treffenden Beleuchtungsstrahls schräg angeordneten Probenoberfläche aufgrund der großen Winkelakzeptanz für den Messstrahl in der Regel eine für eine weitere Auswertung brauchbare Lichtintensität auf die Empfangseinheit abgebildet wird. Damit kann der sterische Aufbau einer Vielzahl von komplexen dreidimensionalen Oberflächen vermessen werden.Another advantage of a large numerical aperture is that even with a sample surface that is arranged obliquely compared to the optical axis of the illumination beam striking the sample surface, due to the large angle acceptance for the measurement beam, a light intensity that is usable for further evaluation is usually mapped onto the receiving unit becomes. This enables the steric structure of a large number of complex three-dimensional surfaces to be measured.
Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung nach Anspruch 4 wird für die Empfangseinheit zumindest ein Sekundärelektronenvervielfacher, eine Photodiode und/oder eine Avalanche-Photodiode verwendet. Die Verwendung von einem oder von mehreren derartigen hochempfindlichen Detektoren hat den Vorteil, dass der Verlauf der Lichtintensität insbesondere bei der Oberflächenvermessung von biologischen und/oder chemischen Proben, welche im allgemeinen ein geringes Streuvermögen aufweisen, zuverlässig erfasst werden kann.According to a preferred development of the invention according to claim 4, at least one secondary electron multiplier, a photodiode and / or an avalanche photodiode is used for the receiving unit. The use of one or more such highly sensitive detectors has the advantage that the course of the light intensity can be reliably detected, in particular when measuring the surface of biological and / or chemical samples, which generally have a low scattering capacity.
Gemäß Anspruch 5 wird in einer anderen Ausführungsform der Erfindung für die Ermittlung des Abstandes zumindest ein Messpunkt der Anstiegs- und zumindest ein Messpunkt der Abfallsflanke des Verlaufs der Lichtintensität verwendet. Dies hat den Vorteil, dass der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem aktuell vermessenen Oberflächenpunkt auch dann auf einfache Weise präzise bestimmt werden kann, wenn die auf die Empfangseinheit treffende Lichtintensität so gering ist, dass das Maximum des Intensitätsverlaufs nur mit einer relativ großen Unsicherheit bestimmt werden kann.In another embodiment of the invention, at least one measuring point of the rising and at least one measuring point of the falling flank of the course of the light intensity is used for determining the distance. This has the advantage that the distance between the distance sensor and the currently measured surface point can also be precisely determined in a simple manner if the light intensity striking the receiving unit is so low that the maximum of the intensity curve can only be determined with a relatively large degree of uncertainty can.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung nach Anspruch 6 wird für die Ermittlung des Abstands eine Anpassungskurve an den Verlauf der zurückgestreuten Lichtintensi-
tat bestimmt. Die Anpassung einer Modellkurve an den Verlauf der Lichtintensitat ist ebenfalls insbesondere bei sehr geringer auf die Empfangseinheit treffender Lichtintensitat vorteilhaft, da durch Rauschen verursachte Schwankungen in dem gemessenen Verlauf der Lichtintensitat durch die Ber cksichtigung des gesamten Verlaufs der Lichtintensitat zumindest teilweise kompensiert werden können und somit die Genauigkeit der Abstandsermittlung erheblich verbessert wird. Die Abstandsermittlung mittels einer Anpassungskurve eignet sich insbesondere bei der Vermessung von Messobjekten mit gering streuenden Oberflachen, welche dazu fuhren, dass das von der Empfangseinheit ausgegebene Signal nur wenig aus einem im wesentlich durch die Messelektronik bestimmten Rauschpegel herausragt .According to a further embodiment of the invention according to claim 6, an adaptation curve to the course of the backscattered light intensity is used to determine the distance. definitely did. The adaptation of a model curve to the course of the light intensity is also particularly advantageous in the case of very low light intensity striking the receiving unit, since fluctuations in the measured course of the light intensity caused by noise can be at least partially compensated for by taking into account the entire course of the light intensity and thus the Accuracy of distance determination is significantly improved. The determination of the distance by means of an adaptation curve is particularly suitable for the measurement of measurement objects with low-scattering surfaces, which result in the signal output by the receiver unit protruding only slightly from a noise level essentially determined by the measurement electronics.
Es wird darauf hingewiesen, dass für die Ermittlung des Abstands zwischen Abstandssensor und Oberflachenpunkt auch ausschließlich das Maximum der auf die Empfangseinheit zuruckgestreuten Lichtintensitat verwendet werden kann. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die von der Empfangseinheit erfasst Lichtintensitat so groß ist, dass der entsprechende Verlauf der Lichtintensitat eine relativ glatte Kurve ohne große statistische Schwankungen ist. In diesem Fall ist die Verwendung des Maximums der zuruckgestreuten Lichtintensitat die einfachste und schnellste Möglichkeit, den Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem Oberflachenpunkt zu bestimmen.It is pointed out that only the maximum of the light intensity scattered back to the receiving unit can be used to determine the distance between the distance sensor and the surface point. This is particularly advantageous if the light intensity detected by the receiving unit is so great that the corresponding course of the light intensity is a relatively smooth curve without large statistical fluctuations. In this case, using the maximum of the backscattered light intensity is the simplest and quickest way to determine the distance between the distance sensor and the surface point.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung nach Anspruch 7 wird für die Ermittlung des Abstands nicht das absolute sondern ein relatives Maximum des Verlaufs der Lichtintensitat verwendet, wobei die Lichtintensitat in dem relativen Maximum einen durch die Reflexionseigenschaften des Messobjekts vorbestimmten Wert unterschreitet. Damit kann insbesondere bei optisch transparenten Proben eine falsche Abstandsmessung verhindert werden, welche beispielweise dann auftreten wurde, wenn sich die Probe auf einem reflektieren-
den Substrattrager befindet und die Reflektivitat der Grenzschicht Probe-Substrat größer ist als die Reflektivitat der Probenoberflache .According to a preferred embodiment of the invention according to claim 7, the determination of the distance does not use the absolute but a relative maximum of the course of the light intensity, the light intensity in the relative maximum falling below a value predetermined by the reflection properties of the measurement object. In this way, in particular in the case of optically transparent samples, an incorrect distance measurement can be prevented, which would occur, for example, if the sample reflected on a the substrate carrier is located and the reflectivity of the sample-substrate interface is greater than the reflectivity of the sample surface.
Da die Reflektivitat einer Grenzschicht im wesentlichen durch die Brechungsindizes der an die Grenzschicht angrenzenden Materialien bestimmt ist, kann beispielsweise für den Fall, dass die zu vermessende Probe eine im wesentlichen wassrige Losung und das angrenzende Medium im wesentlichen Luft mit einem Brechungsindex n von eins ist (die Reflektivitat an einer Grenzschicht Luft-Wasser betragt ungefähr 0,02) ein vorbestimmter Wert von ungefähr 5% gewählt werden, welcher von der Reflektivitat in dem relativen Maximum unterschritten werden muss, wenn eine gültige Abstandsbestimmung erfolgen soll. Dabei ist ein im Vergleich zu reinem Wasser höherer Brechungsindex der Probenlosung berücksichtigt. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass aus dem von der Empfangseinheit gemessenen Verlauf der Lichtintensitat nicht der Abstand zwischen Abstandssensor und Grenzschicht Substrat-Probe sondern der Abstand zwischen Abstandssensor und Probenoberflache erfasst wird. Es wird darauf hingewiesen, dass im allgemeinen der vorbestimmte von der Reflektivitat in dem relativen Maximum zu unterschreitende Wert von dem Reflexionsverhalten der Probenoberflache und von dem Reflexionsver- halten der Grenzschicht Substrat-Probe abhangt.Since the reflectivity of a boundary layer is essentially determined by the refractive indices of the materials adjacent to the boundary layer, for example, in the event that the sample to be measured is an essentially aqueous solution and the adjacent medium is essentially air with a refractive index n of one ( the reflectivity at an air-water boundary layer is approximately 0.02), a predetermined value of approximately 5% must be selected, which must be below the reflectivity in the relative maximum if a valid distance determination is to be carried out. A higher refractive index of the sample solution compared to pure water is taken into account. This ensures that it is not the distance between the distance sensor and the interface layer between the substrate and the sample that is recorded from the course of the light intensity measured by the receiving unit, but the distance between the distance sensor and the sample surface. It is pointed out that in general the predetermined value, which is below the reflectivity in the relative maximum, depends on the reflection behavior of the sample surface and on the reflection behavior of the boundary layer substrate-sample.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden beispielhaften Beschreibung derzeit bevorzugter Ausführungsformen.Further advantages and features of the present invention result from the following exemplary description of currently preferred embodiments.
Figur 1 illustriert den Emfluss der numerischen Apertur auf das Winkelverhalten. Figur 2a illustriert die Abstandsermittlung aus einem Messpunkt der Anstiegs- und einem Messpunkt der Abfalls- flanke des Verlaufs der Lichtintensitat.
Figur 2b illustriert eine Abstandsermittlung mittels einer Anpassungskurve an den gemessenen Verlauf der Lichtintensität.Figure 1 illustrates the influence of the numerical aperture on the angular behavior. FIG. 2a illustrates the determination of the distance from a measuring point of the rising and a measuring point of the falling flank of the course of the light intensity. FIG. 2b illustrates a distance determination by means of an adaptation curve to the measured course of the light intensity.
Figur 2c illustriert die Abstandsermittlung unter Verwendung des Maximums des gemessenen Verlaufs der Lichtintensität.FIG. 2c illustrates the determination of the distance using the maximum of the measured course of the light intensity.
Wie aus Figur 1 ersichtlich, ist eine zu vermessende biologische Probe 101 auf einem Substrat 102 aufgetragen. Die biolo- gische Probe 101, welche in flüssiger bzw. zähflüssiger Form vorliegt, bildet eine dreidimensionale Oberfläche aus, welche einem Kugelsegment ähnlich ist.As can be seen from FIG. 1, a biological sample 101 to be measured is applied to a substrate 102. The biological sample 101, which is in liquid or viscous form, forms a three-dimensional surface which is similar to a spherical segment.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Probe 101 nicht unbe- dingt in Form eines Kugelsegments vorliegen muss sondern imIt is pointed out that the sample 101 does not necessarily have to be in the form of a spherical segment, but in the
Prinzip jede mögliche dreidimensionale Form annehmen kann.Principle can take any possible three-dimensional shape.
Ebenso muss die Probe 110 nicht zwingend in flüssiger bzw. zähflüssiger Form vorliegen. So kann beispielsweise eine in einem auskristallisierten oder ausgehärteten Zustand vorlie- gende Probe untersucht werden, welche beispielsweise nur bei der Aufbringung der Probe auf ein Substrat in einem flüssigen oder zähflüssigen Aggregatszustand vorgelegen hat.Likewise, the sample 110 does not necessarily have to be in liquid or viscous form. For example, a sample that is in a crystallized or hardened state can be examined, which, for example, was only present in a liquid or viscous aggregate state when the sample was applied to a substrate.
Gemäß dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel der Erfin- düng wird die Oberfläche der biologischen Probe 101 genau erfasst, so dass das Volumen der biologischen Probe 101 präzise bestimmt werden kann. Die biologische Probe 101 wird mit einem Abstandssensor vermessen, der beispielsweise in den Figuren 7 und 8 der deutschen Patentschrift DE 196 08 468 C2 beschrieben ist. Von dem verwendeten Abstandssensor ist in Figur 1 nur eine Abbildungsoptik 104 dargestellt, welche sich in der Nähe der zu erfassenden biologischen Probe 101 befindet. Die biologische Probe 101 wird von einem Beleuchtungs- strahl 103 beleuchtet, welcher in der zweidimensionalen Darstellung von Figur 1 durch die beiden Randstrahlen 103a, 103b begrenzt wird. Der Beleuchtungsstrahl 103 wird durch die Abbildungsoptik 104 derart abgebildet, dass in Abhängigkeit
von der Stellung eines ebenfalls nicht dargestellten Reflektorsystems der Beleuchtungsstrahl 103 auf einen Punkt fokus- siert wird, welcher zumindest in unmittelbarer Nähe der Oberfläche der zu untersuchenden biologischen Probe 101 liegt. Das durch den Beleuchtungsstrahl 103 auf die biologische Probe 101 treffende Licht wird von der Oberfläche der Probe 101 zumindest teilweise zurückgestreut. Figur 1 illustriert den Fall einer biologischen Probe mit einer rauhen Oberfläche, welche den auftreffenden Beleuchtungsstrahl 103 nicht oder zumindest nur sehr schwach reflektiert. Die Rückstreuung des Beleuchtungslichtes erfolgt in guter Näherung isotrop. Dieses isotrope Streuverhalten ist in Figur 1 durch die zurückgestreuten Lichtstrahlen 105 dargestellt. Wie aus Figur 1 ersichtlich, ist der Anteil des zuruckgestreuten Lichts 105, welcher durch die Abbildungsoptik 104 und weitere nicht dargestellte Komponenten des verwendeten Abstandssensors auf die ebenfalls nicht dargestellte Empfangseinheit des Abstandssensors abgebildet werden, umso größer, je größer die numerische Apertur (n • sin α) des auf die biologische Probe 101 treffenden Beleuchtungsstrahls 103 ist. Dabei ist n der Brechungsindex des an die biologische Probe 101 grenzenden Mediums. Da das in Figur 1 dargestellte System ein Trockensystem ist, ist das an die biologische Probe 101 grenzende Medium im wesentlichen Luft, so dass der Brechungsindex n in guter Näherung 1 ist. Der Winkel α, welcher ebenfalls die numerische Apertur des Abstandssensors bestimmt, ist aus Gründen der Übersichtlichkeit in Figur 1 nicht explizit dargestellt. Er hängt jedoch von dem auf die Probe 101 treffenden Beleuchtungsstrahl 103 derart ab, dass der doppelte Winkel 2α gerade gleich dem Winkel ist, welcher von den beiden auf die Probe 101 treffenden Randstrahlen 103a undAccording to the exemplary embodiment of the invention described here, the surface of the biological sample 101 is detected precisely, so that the volume of the biological sample 101 can be determined precisely. The biological sample 101 is measured with a distance sensor, which is described, for example, in FIGS. 7 and 8 of the German patent DE 196 08 468 C2. Of the distance sensor used, only one imaging optics 104 is shown in FIG. 1, which is located in the vicinity of the biological sample 101 to be detected. The biological sample 101 is illuminated by an illumination beam 103, which is delimited in the two-dimensional representation of FIG. 1 by the two edge rays 103a, 103b. The illumination beam 103 is imaged by the imaging optics 104 in such a way that it depends from the position of a reflector system, also not shown, the illumination beam 103 is focused on a point which is at least in the immediate vicinity of the surface of the biological sample 101 to be examined. The light striking the biological sample 101 through the illumination beam 103 is at least partially scattered back from the surface of the sample 101. FIG. 1 illustrates the case of a biological sample with a rough surface, which does not reflect the incident illuminating beam 103, or at least only reflects it very weakly. The backscattering of the illuminating light is isotropic to a good approximation. This isotropic scattering behavior is shown in FIG. 1 by the backscattered light rays 105. As can be seen from FIG. 1, the proportion of the backscattered light 105, which is imaged by the imaging optics 104 and further components of the distance sensor not shown, onto the receiving unit of the distance sensor, also not shown, the greater the larger the numerical aperture (n • sin α) of the illumination beam 103 striking the biological sample 101. Here n is the refractive index of the medium bordering on the biological sample 101. Since the system shown in FIG. 1 is a dry system, the medium bordering on the biological sample 101 is essentially air, so that the refractive index n is a good approximation 1. For reasons of clarity, the angle α, which also determines the numerical aperture of the distance sensor, is not shown explicitly in FIG. 1. However, it depends on the illuminating beam 103 striking the sample 101 in such a way that the double angle 2α is just equal to the angle which of the two marginal rays 103a and
103b eingeschlossen wird. Eine Erhöhung der numerischen103b is included. An increase in numerical
Apertur hat neben einer Verbesserung des WinkelverhaltensAperture has an improvement in angular behavior
(ein höherer Anteil des von der Probe 101 zurückgestreuten Lichts wird auf die Empfangseinheit des Abstandssensors abgebildet) den weiteren Vorteil, dass die laterale Auflösung des verwendeten Abstandssensors verbessert wird.
In den Figuren 2a, 2b und 2c ist illustriert, wie aus dem von der Empfangseinheit erfassten Verlauf der Lichtintensität der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem Punkt der zu vermessenden Oberfläche bestimmt wird, welcher Punkt gerade von dem Beleuchtungsstrahl 103 beleuchtet wird.(a higher proportion of the light scattered back by the sample 101 is imaged on the receiving unit of the distance sensor) the further advantage that the lateral resolution of the distance sensor used is improved. FIGS. 2a, 2b and 2c illustrate how the distance between the distance sensor and the point of the surface to be measured is determined from the course of the light intensity detected by the receiving unit, which point is currently being illuminated by the illuminating beam 103.
Figur 2a zeigt, wie aus dem Verlauf der Anstiegsflanke der gemessenen Lichtintensität 200 und dem Verlauf der Abfalls- flanke der gemessenen Lichtintensität 200 der Abstand zwischen Abstandssensor und Oberflächenpunkt ermittelt werden kann. Die gemessene Lichtintensitat 200 ist in einem Koordinatensystem dargestellt, welches als Abszisse x die Ortskoordinate des Reflektorsystems und als Ordinate I die von der Empfangseinheit erfasste Lichtintensität aufweist. Der Verlauf der Lichtintensit t 200 ist zu einem Wert xraax symmetrisch, welcher die Ortskoordinate des Reflektorsystems darstellt, bei der von der Empfangseinheit eine maximale Lichtintensität erfasst wird. Aus dem genauen Wert der Ortskoordi- nate xmax wird der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem beleuchteten Punkt der zu vermessenden Oberfläche bestimmt. Eine präzise Bestimmung der Ortskoordinate xmax erfolgt gemäß dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel der Erfindung dadurch, dass eine Referenzintensität Iref bestimmt wird, welche größer als Null und kleiner als die maximale Lichtintensität Imax ist. Aus der Referenzintensität Iref werden die beiden Ortskoordinaten des Reflektorsystems Xi und x2 bestimmt, für welche die gemessene Lichtintensität gerade gleich der Referenzlichtintensität Iref ist. Mit der Kenntnis der beiden Ortskoordinaten xi und x2 ist unter der Voraussetzung eines symmetrischen Verlaufs der gemessenen Lichtintensit t 200 die Ortskoordinate xraax des Reflektorsystems mit maximaler Lichtintensität bestimmt, welche genau in der Mitte zwischen den beiden Ortskoordinaten Xi und x2 liegt. Die mittige Lage der Ortskoordinate xmax zwischen den beiden Ortskoordinaten Xi und x2 ist in Figur 2a dadurch angedeutet, dass die Abstände auf der Abszisse x sowohl zwischen xx und
xmax als auch zwischen xmax und x2 jeweils gerade Δ/2 betragen. Die Bestimmung des Abstandes zwischen Abstandssensor und Oberflachenpunkt mittels Anstiegs- und Abfallsflanke ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die gemessene Lichtinten- sitat 200 so schwach ist, dass eine präzise Bestimmung der Ortskoordinate xmax aufgrund des insbesondere in der Nahe der Ortskoordinate xmax flachen Kurvenverlaufs der erfassten Lichtintensitat 200 nicht möglich ist.FIG. 2a shows how the distance between the distance sensor and the surface point can be determined from the course of the rising edge of the measured light intensity 200 and the course of the falling edge of the measured light intensity 200. The measured light intensity 200 is shown in a coordinate system which has the local coordinate of the reflector system as abscissa x and the light intensity detected by the receiving unit as ordinate I. The course of the light intensity t 200 is symmetrical to a value x raax , which represents the location coordinate of the reflector system at which the receiver unit detects a maximum light intensity. The distance between the distance sensor and the illuminated point of the surface to be measured is determined from the exact value of the location coordinate x max . A precise determination of the spatial coordinate x max occurs according to the embodiment described herein, the invention characterized in that a reference intensity I re f is determined, which is greater than zero and less than the maximum light intensity I max. From the reference intensity I re f the two space coordinates of the reflector system Xi and X 2 are determined, for which the measured light intensity is just equal to the reference light intensity I f re. With the knowledge of the two location coordinates xi and x 2 , the location coordinate x raax of the reflector system with maximum light intensity is determined, assuming a symmetrical course of the measured light intensity t 200, which lies exactly in the middle between the two location coordinates Xi and x 2 . The central position of the location coordinate x max between the two location coordinates Xi and x 2 is indicated in FIG. 2a by the fact that the distances on the abscissa x are both between x x and x max as well as between x max and x 2 each just Δ / 2. The determination of the distance between the distance sensor and the surface point by means of a rising and falling flank is particularly advantageous if the measured light intensity 200 is so weak that a precise determination of the location coordinate x max due to the flat course of the curve, particularly in the vicinity of the location coordinate x max detected light intensity 200 is not possible.
In Figur 2b ist skizziert, wie der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem beleuchteten Oberflachenpunkt mittels einer Anpassungskurve an den Verlauf der erfassten Lichtintensitat 210 ermittelt wird. Diese Abstandsermittlung ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die erfasste Lichtinten- sitat I so klein ist, dass der Verlauf der erfassten Lichtintensitat I, wie in Figur 2b dargestellt, von einem starken Rauschen bzw. starken statistischen Schwankungen gekennzeichnet ist. In diesem Fall kann die Ortskoordinate xmax am zuverlässigsten dadurch bestimmt werden, dass der Verlauf der gesamten erfassten Lichtintensitat 210 durch eine Anpassungskurve 211 angenähert wird. Eine geeignete Anpassungskurve 211 kann beispielsweise eine Lorenzkurve, eine Gaußkurve oder jede andere symmetrische Kurve sein, welche den allgemeinen Verlauf der gemessenen Lichtintensitat 210 zumindest anna- hernd wiedergibt. Aus den bestimmten Anpassungsparametern der Anpassungskurve 211 ist dann mit hoher Genauigkeit die Ortskoordinate xmax festgelegt.FIG. 2 b outlines how the distance between the distance sensor and the illuminated surface point is determined by means of an adaptation curve to the course of the detected light intensity 210. This determination of the distance is particularly advantageous if the detected light intensity I is so small that the course of the detected light intensity I, as shown in FIG. 2b, is characterized by strong noise or strong statistical fluctuations. In this case, the location coordinate x max can be determined most reliably by approximating the course of the entire detected light intensity 210 by means of an adaptation curve 211. A suitable adaptation curve 211 can be, for example, a Lorenz curve, a Gaussian curve or any other symmetrical curve which at least approximates the general course of the measured light intensity 210. The location coordinate x max is then determined with high accuracy from the determined adjustment parameters of the adjustment curve 211.
Wie aus Figur 2c ersichtlich, kann die Ortskoordinate xmax und damit der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem beleuchteten Oberflachenpunkt bestimmt werden, indem ausschließlich die maximale Lichtintensitat Imax bestimmt wird. Die Bestimmung von Imax kann beispielsweise durch einen sogenannten Peakdetektor erfolgen, welcher aus dem Verlauf der gemessenen Lichtintensitat 220 die Ortskoordinate xmax bestimmt. Die Abstandsermittlung zwischen dem Abstandssensor und dem beleuchteten Oberflachenpunkt anhand der maximalen
Lichtintensität ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die gemessene Lichtintensität 220 so hoch ist, dass das Rauschen oder statistische Schwankungen in guter Näherung vernachlässigt werden können.As can be seen from FIG. 2c, the location coordinate x max and thus the distance between the distance sensor and the illuminated surface point can be determined by only determining the maximum light intensity I max . I max can be determined, for example, by a so-called peak detector, which determines the location coordinate x max from the course of the measured light intensity 220. The distance between the distance sensor and the illuminated surface point based on the maximum Light intensity is particularly advantageous if the measured light intensity 220 is so high that the noise or statistical fluctuations can be neglected to a good approximation.
Zusammenfassend offenbart die Erfindung ein Messverfahren zur Oberflächenvermessung von biologischen und/oder chemischen Proben unter Verwendung eines auf dem konfokalen optischen Abbildungsprinzip beruhenden Abstandssensors, bei dem durch sequentielle Abtastung einzelner Oberflächenpunkte die Oberfläche der zu untersuchenden Probe vermessen wird. Aufgrund der im allgemeinen geringen Rückstreuung und Reflexion von Oberflächen von biologischen und/oder chemischen Proben wird gemäß zweier Ausführungsbeispiele der Erfindung für den Abstandsensor eine hohe numerische Apertur gewählt und/oder ein empfindlicher Detektor verwendet. Zur Bestimmung der maximal von der zu untersuchenden Probe zurückgestreuten Lichtintensität werden abhängig von dem von dem Detektor erfassten Rückstreusignal verschiedene Auswerteverfahren vorgeschlagen.
In summary, the invention discloses a measurement method for the surface measurement of biological and / or chemical samples using a distance sensor based on the confocal optical imaging principle, in which the surface of the sample to be examined is measured by sequential scanning of individual surface points. Due to the generally low backscattering and reflection from surfaces of biological and / or chemical samples, according to two exemplary embodiments of the invention, a high numerical aperture is selected for the distance sensor and / or a sensitive detector is used. Various evaluation methods are proposed for determining the maximum light intensity backscattered from the sample to be examined, depending on the backscatter signal detected by the detector.
Claims
1. Messverfahren zur Oberflachenvermessung von biologischen und/oder chemischen Proben unter Verwendung eines auf dem konfokalen optischen Abbildungspπnzip beruhenden Abstandssensors mit1. Measuring method for the surface measurement of biological and / or chemical samples using a distance sensor based on the confocal optical imaging principle
• einer Sendeeinheit mit mindestens einer annähernd punktförmigen Lichtquelle, die auf eine Oberflache eines Messobjektes abgebildet wird, • einer Empfangseinheit mit mindestens einem zur der Lichtquelle konfokal im bildseitigen Messbereich angeordneten annähernd punktförmigen Detektor,A transmitting unit with at least one approximately point-shaped light source which is imaged on a surface of a measurement object, a receiving unit with at least one approximately point-shaped detector which is confocal to the light source in the image-side measuring area,
• einer zumindest teilweise koaxialen Fuhrung von Beleuch- tungs- und Messstrahl, • einer Abbildungsoptik, über die der Strahlengang zwischen Sendeeinheit und Messobjekt und der Strahlengang zwischen Messobjekt und Empfangseinheit jeweils zumindest einmal gefuhrt ist, und• an at least partially coaxial guidance of the illuminating and measuring beam, • imaging optics, via which the beam path between the transmitter unit and the measurement object and the beam path between the measurement object and the receiver unit are each guided at least once, and
• einem in Bezug auf den Sendestrahl im Fokusbereich der Abbildungsoptik positionierten Reflektorsystem mit zwei umA reflector system positioned in relation to the transmission beam in the focus area of the imaging optics with two μm
90° zueinander geneigten Reflektoren, über welches die beiden Strahlengange jeweils einmal gefuhrt sind, wobei das Messverfahren folgende Schritte aufweist:Reflectors inclined at 90 ° to each other, over which the two beam paths are each guided once, the measuring method comprising the following steps:
• die zu untersuchende biologische und/oder chemische Probe relativ wird zu dem auf das Messobjekt treffenden Beleuchtungsstrahl des Abstandssensors m eine definierte Anfangsposition gebracht,The biological and / or chemical sample to be examined is brought to a defined starting position relative to the illumination beam of the distance sensor m striking the measurement object,
• das Reflektorsystem wird in Richtung der optischen Achse der Abbildungsoptik bewegt, so dass die optischen Wegstre- cken zwischen Sendeeinheit und einem Oberflachenpunkt des Messobjekts und zwischen Empfangseinheit und dem Oberflachenpunkt des Messobjekts variiert werden,The reflector system is moved in the direction of the optical axis of the imaging optics, so that the optical distances between the transmitter unit and a surface point of the measurement object and between the receiver unit and the surface point of the measurement object are varied,
• wahrend der Bewegung des Reflektorsystems wird der Verlauf der Lichtintensitat auf der Empfangseinheit in Abhangig- keit von der Stellung des Reflektorsystems erfasst und • aus dem Verlauf der Lichtintensität wird der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem Oberflächenpunkt ermittelt.• During the movement of the reflector system, the course of the light intensity on the receiving unit is recorded as a function of the position of the reflector system and • The distance between the distance sensor and the surface point is determined from the course of the light intensity.
2. Messverfahren gemäß Anspruch 1, bei dem nach der Ermittlung des Abstands zwischen dem Abstandssensor und dem Oberflächenpunkt2. Measuring method according to claim 1, in which after determining the distance between the distance sensor and the surface point
• die zu untersuchende Probe mittels einer definierten Verschiebung in einer Ebene senkrecht zu dem auf das Mess- objekt treffenden Beleuchtungsstrahl in eine weitere Position gebracht wird,The sample to be examined is brought into a further position by means of a defined displacement in a plane perpendicular to the illumination beam striking the measurement object,
• das Reflektorsystem in Richtung der optischen Achse der Abbildungsoptik bewegt wird, so dass die optischen Wegstrecken zwischen Sendeeinheit und einem weiteren Oberflä- chenpunkt des Messobjekts und zwischen Empfangseinheit und dem weiterem Oberflächenpunkt des Messobjekts variiert werden,The reflector system is moved in the direction of the optical axis of the imaging optics, so that the optical distances between the transmitter unit and a further surface point of the measurement object and between the receiver unit and the further surface point of the measurement object are varied,
• während der Bewegung des Reflektorsystems der Verlauf der Lichtintensität auf der Empfangseinheit in Abhängigkeit von der Stellung des Reflektorsystems erfasst wird und• during the movement of the reflector system, the course of the light intensity on the receiving unit is detected as a function of the position of the reflector system and
• aus dem Verlauf der Lichtintensität der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem weiteren Oberflächenpunkt ermittelt wird.• The distance between the distance sensor and the further surface point is determined from the course of the light intensity.
3. Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, bei dem die numerische Apertur des auf das Messobjekt treffenden Beleuchtungsstrahls so groß gewählt wird, dass durch das Messobjekt von dem Licht des Beleuchtungsstrahls möglichst viel Streulicht in den Raumwinkel des Messstrahls gestreut wird.3. Measuring method according to one of claims 1 to 2, in which the numerical aperture of the illuminating beam striking the measuring object is chosen so large that as much scattered light as possible is scattered into the solid angle of the measuring beam by the light of the illuminating beam.
4. Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem für die Empfangseinheit zumindest ein Sekundärelektronenvervielfacher, eine Photodiode und/oder eine Avalanche Photodio- de verwendet wird. 4. Measuring method according to one of claims 1 to 3, in which at least one secondary electron multiplier, a photodiode and / or an avalanche photodiode is used for the receiving unit.
5. Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem für die Ermittlung des Abstands zumindest einen Messpunkt (xi) der Anstiegs- und zumindest einen Messpunkt (x2) der5. Measuring method according to one of claims 1 to 4, in which for determining the distance at least one measuring point (xi) of the rise and at least one measuring point (x 2 )
Abfallsflanke des Verlaufs der Lichtintensität (200) verwen- det .Falling edge of the course of the light intensity (200) is used.
6. Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem für die Ermittlung des Abstands eine Anpassungskurve (211) an den Verlauf der Lichtintensität (210) bestimmt wird.6. Measuring method according to one of claims 1 to 5, in which an adaptation curve (211) to the course of the light intensity (210) is determined for the determination of the distance.
7. Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem für die Ermittlung des Abstands nicht das absolute sondern ein relatives Maximum des Verlaufs der Lichtintensität verwendet wird, wobei die Lichtintensität in dem relativen Maximum einen durch die Reflexionseigenschaften des Messobjekts vorbestimmten Wert unterschreitet. 7. Measuring method according to one of claims 1 to 6, in which for the determination of the distance not the absolute but a relative maximum of the course of the light intensity is used, the light intensity in the relative maximum falling below a value predetermined by the reflection properties of the measurement object.
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2002
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