WO2002022866A2 - Method and sampling kit for analysing material containing nucleic acid - Google Patents
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Abstract
The invention relates to a method for analysing material containing nucleic acid. Said material is deposited on a filter material and the filter material is dissolved in a solvent. The inventive method is characterised in that the material containing nucleic acid is disintegrated on the filter material. The invention also relates to a sampling kit for carrying out said method. The inventive method and the sampling kit can be used to analyse all types of sample containing nucleic acid.
Description
Verfahren und Probenkit zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material Method and sample kit for the analysis of material containing nucleic acids
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material, das das Abscheiden des nucleinsaurehaltigen Materials auf einem Filtermaterial und das Auflösen des Filtermaterials in einem Lösungsmittel umfaßt. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Probenkit zur Durchführung des erfϊndungsgemäßen Verfahrens.The present invention relates to a method for the analysis of nucleic acid-containing material, which comprises depositing the nucleic acid-containing material on a filter material and dissolving the filter material in a solvent. Furthermore, the present invention also relates to a sample kit for carrying out the method according to the invention.
Bei der Analyse von nucleinsäurehaltigem Material, beispielsweise aus flüssigen Proben, ist es von entscheidender Bedeutung, daß das nucleinsäurehaltige Material bei der Probenaufbereitung möglichst quantitativ erfaßt wird. Dies ist notwendig, damit zum Beispiel bei der Analyse eines mit Keimen behafteten Lebensmittels keine der verschiedenen Keimarten unerkannt bleibt, auch wenn sie nur in geringer Konzentration vorliegt.When analyzing material containing nucleic acid, for example from liquid samples, it is of crucial importance that the material containing nucleic acid is recorded as quantitatively as possible during sample preparation. This is necessary so that, for example, when analyzing a food contaminated with germs, none of the different types of germs remain undetected, even if they are only present in low concentrations.
Unter Standardlaborbedingungen, wie sie zum Beispiel in einem Labor zur mikrobiologischen Überwachung der Produktion von Lebensmitteln vorhanden sind, werden zur Probenaufbereitung daher die Zentrifugation oder die Membranfiltration eingesetzt.Under standard laboratory conditions, such as those found in a laboratory for microbiological monitoring of food production, centrifugation or membrane filtration are used for sample preparation.
Ein Nachteil der Zentrifugation ist jedoch, daß nicht sicher alle Organismen erfaßt werden können, so daß zum Nachweis einer Spureninfektion die Filtration die bevorzugte Methode darstellt. Bei der Filtration besteht jedoch das Problem,
daß nach dem Filtrieren die abgeschiedenen Organismen sehr fest am Filtermaterial anhaften und je nach Filtertyp fest in dessen Poren eingeschlossen sein können. Daher ist es für anschließende Untersuchungen der Organismen praktisch unmöglich, die gesammelten Organismen quantitativ wieder vom Filtermaterial abzulösen.A disadvantage of centrifugation, however, is that not all organisms can be detected with certainty, so that filtration is the preferred method for detecting a trace infection. The problem with filtration is that after filtration, the separated organisms adhere very firmly to the filter material and, depending on the filter type, can be firmly enclosed in its pores. It is therefore practically impossible for subsequent tests of the organisms to quantitatively detach the collected organisms from the filter material.
Für weiterführende Untersuchungen entstehen daher sowohl bei der Zentrifugation als auch bei der herkömmlichen Filtration immer Verluste an Organismen, so daß eine quantitative Untersuchung aller Organismen einer Probe, sowohl bezüglich einer weiterführenden mikrobiologischen Analyse, als auch bezüglich einer anschließenden DNA-Isolierung, nicht gewährleistet ist. Die beschriebenen Nachteile bestehen auch für andere Arten nucleinsaurehaltigen Materials.For further investigations there are therefore always losses of organisms both in centrifugation and in conventional filtration, so that a quantitative analysis of all organisms in a sample, both with regard to further microbiological analysis and subsequent DNA isolation, is not guaranteed. The disadvantages described also exist for other types of material containing nucleic acid.
Demgemäß ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material sowie einen Probenkit zur Durchführung dieses Verfahrens bereitzustellen, das die vorstehend aufgeführten Nachteile des Standes der Technik vermeidet.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for analyzing nucleic acid-containing material and a sample kit for carrying out this method, which avoids the disadvantages of the prior art listed above.
Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren sowie einen Probekit zur Verfügung zu stellen, bei denen aus Proben von nucleinsäurehaltigem Material die Nucleinsäuren quantitativ erhalten werden.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß diese Aufgaben gelöst werden können, wenn das auf einem Filtermaterial angesammelte nucleinsäurehaltige Material auf diesem Filtermaterial aufgeschlossen wird.In particular, it is an object of the present invention to provide a method and a test kit in which the nucleic acids are obtained quantitatively from samples of material containing nucleic acid. The invention is based on the knowledge that these objects can be achieved if the nucleic acid-containing material accumulated on a filter material is digested on this filter material.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material zur Verfügung, das das Abscheiden des nucleinsaurehaltigen Materials auf einem Filtermaterial und das Auflösen des Filtermaterials in einem Lösungsmittel umfaßt, worin das nucleinsäurehaltige Material auf dem Filtermaterial aufgeschlossen wird.The present invention therefore provides a method for the analysis of nucleic acid-containing material which comprises depositing the nucleic acid-containing material on a filter material and dissolving the filter material in a solvent, wherein the nucleic acid-containing material on the filter material is digested.
Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung einen Probenkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verfügung, der ein Filtermaterial, eine Pufferlösung, sowie ein Hilfsmittel zur verbesserten Phasentrennung umfaßt.Furthermore, the present invention provides a sample kit for carrying out the method according to the invention, which comprises a filter material, a buffer solution and an aid for improved phase separation.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich, Nucleinsäuren wie DNA und RNA aus nucleinsäurehaltigem Material aller Art quantitativ zu erhalten. Dadurch ist gewährleistet, daß keine Nucleinsäuren aus dem nucleinsaurehaltigen Material verloren gehen und folglich in der Analyse nieht erkannt werden.The method according to the invention makes it possible to obtain nucleic acids such as DNA and RNA quantitatively from all types of material containing nucleic acid. This ensures that no nucleic acids are lost from the material containing nucleic acid and are consequently not recognized in the analysis.
Insbesondere ist dadurch gewährleistet, daß bei der Analyse von Spuren nucleinsaurehaltigen Materials keine Nucleinsäuren übersehen werden und ihr Gehalt in der Probe quantitativ verläßlich bestimmt werden kann.In particular, this ensures that when analyzing traces of material containing nucleic acid, no nucleic acids are overlooked and their content in the sample can be reliably determined quantitatively.
Darüberhinaus werden die Nucleinsäuren durch das erfindungsgemäße Verfahren in hoher Reinheit erhalten.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Nucleinsäuren können für weitere Analysen, wie z.B. DNA-Hybridisierungen, Klonierungen, Polymerase Chain Reaction (PCR) etc., verwendet werden. Aufgrund der hohen Reinheit der Nucleinsäuren kann dies auch direkt ohne weitere Reinigungs- oder Aufbereitungsschritte erfolgen.In addition, the nucleic acids are obtained in high purity by the method according to the invention. The nucleic acids obtained by the method according to the invention can be used for further analyzes, such as DNA hybridizations, cloning, polymerase chain reaction (PCR) etc. Because of the high purity of the nucleic acids, this can also be done directly without further purification or preparation steps.
Falls die Nucleinsäurekonzentration für weitere Analyse verfahren noch zu gering sein sollte, können diese mit gängigen Konzentrationsverfahren, wie beispielsweise der alkoholischen Fällung oder mit Hilfe von nucleinsäurebindenden Säulen, noch angereichert werden.If the nucleic acid concentration is still too low for further analysis, it can be enriched with common concentration methods, such as alcohol precipitation or with the help of nucleic acid binding columns.
Der erfindungsgemäße Probenkit ermöglicht eine anwenderfreundliche Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.The sample kit according to the invention enables the method according to the invention to be carried out in a user-friendly manner.
Das Abscheiden des nucleinsaurehaltigen Materials auf dem Filtermaterial kann aus jedem zur Filtration geeigneten Medium erfolgen. Im allgemeinen wird das nucleinsäurehaltige Material aus fluider, wie zum Beispiel flüssiger, Phase abfiltriert.The nucleic acid-containing material can be deposited on the filter material from any medium suitable for filtration. In general, the nucleic acid-containing material is filtered off from a fluid phase, such as a liquid phase.
Als Filtermaterial kann jegliches Material dienen, das zum einen zum Abscheiden des nucleinsaurehaltigen Materials geeignet ist und zum anderen in einem Lösungsmittel aufgelöst werden kann.Any material that is suitable for separating the nucleic acid-containing material and that can also be dissolved in a solvent can be used as the filter material.
Bevorzugterweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren als Filtermaterial ein Polycarbonat- oder Celluloseacetatfilter eingesetzt. Polycarbonatfilter haben den
Vorteil, daß sie sich rückstandslos im geeigneten Lösungsmittel auflösen lassen, während Celluloseacetatfilter sehr preiswert sind.A polycarbonate or cellulose acetate filter is preferably used as the filter material in the process according to the invention. Polycarbonate filters have that Advantage that they can be dissolved without residue in a suitable solvent, while cellulose acetate filters are very inexpensive.
Als Lösungsmittel zur Auflösung des Filtermaterials werden bevorzugt Chloroform oder Phenol eingesetzt. Dabei eignet sich Chloroform besonders zur Auflösung von Polycarbonatfiltern, Phenol besonders zur Auflösung von Celluloseacetatfiltern. Diese Lösungsmittel haben den Vorteil, daß sie die Nucleinsäuren nicht angreifen und die Filtermaterialien im Falle des Polycarbonatfilters vollständig und im Falle des Celluloseacetatfilters weitestgehend auflösen können.Chloroform or phenol are preferably used as solvents for dissolving the filter material. Chloroform is particularly suitable for dissolving polycarbonate filters, phenol is particularly suitable for dissolving cellulose acetate filters. These solvents have the advantage that they do not attack the nucleic acids and can completely dissolve the filter materials in the case of the polycarbonate filter and largely in the case of the cellulose acetate filter.
Das Aufschließen des auf dem Filtermaterial abgeschiedenen nucleinsaurehaltigen Materials kann mittels aller gängigen Methoden erfolgen, wie zum Beispiel einer Behandlung mit Ultraschall oder dem Kochen der Proben im Wasserbad für mehrere Minuten.The nucleic acid-containing material deposited on the filter material can be disrupted using all common methods, such as treatment with ultrasound or boiling the samples in a water bath for several minutes.
Bevorzugterweise wird zum Aufschließen des nucleinsaurehaltigen Materials das Filtermaterial mit dem darauf abgeschiedenen nucleinsaurehaltigen Material der in einem Mikrowellengerät erzeugten Strahlung, einer Hitzebehandlung, einer Behandlung mit Ultraschall oder einem mechanischen Verfahren, wie dem Rühren oder Schütteln zusammen mit festen Partikeln, ausgesetzt. Dadurch lassen sich beispielsweise bei zellhaltigem Material die Zellwände schnell und quantitativ aufschließen und somit die Nucleinsäuren freisetzen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material aller Art, wie zum Beispiel Material, das Mikroorganismen wie Hefen und Bakterien, Pilze, Viren, Algen oder pflanzliches Material umfaßt, verwendet werden.Preferably, in order to disrupt the nucleic acid-containing material, the filter material with the nucleic acid-containing material deposited thereon is exposed to the radiation generated in a microwave device, a heat treatment, a treatment with ultrasound or a mechanical method such as stirring or shaking together with solid particles. With cell-containing material, for example, this enables the cell walls to be unlocked quickly and quantitatively, thus releasing the nucleic acids. The method according to the invention can be used for the analysis of nucleic acid-containing material of all kinds, such as, for example, material which comprises microorganisms such as yeasts and bacteria, fungi, viruses, algae or vegetable material.
Bevorzugt ist der Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material, das Organismen umfaßt.Preference is given to using the method according to the invention for the analysis of nucleic acid-containing material which comprises organisms.
Diese Organismen können nach dem Abscheiden auf dem Filtermaterial vor dem Aufschließen noch mit weiteren Methoden bearbeitet werden. Dies kann zum einen so geschehen, daß zur Erhöhung der Anzahl der Organismen diese auf festen oder in flüssigen Nährmedien bebrütet werden. Damit kann eine Verbesserung der Nachweisgrenzen dieser Organismen erreicht werden.After being deposited on the filter material, these organisms can be processed using other methods before being digested. On the one hand, this can be done by incubating them on solid or in liquid nutrient media in order to increase the number of organisms. This enables the detection limits of these organisms to be improved.
Die auf dem Filtermaterial befindlichen Organismen können vor dem Aufschluß auch mikroskopiert und/oder mit Farbstoffen angefärbt werden. Als Farbstoffe können dabei beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden.The organisms on the filter material can also be microscoped and / or dyed before digestion. For example, fluorescent dyes can be used as dyes.
Durch das Mikroskopieren und/oder Anfärben der Organismen, kann beispielsweise festgestellt werden, ob die auf dem Filtermaterial angesammelten Organismen lebend oder tot sind. Nach der Untersuchung auf ihre Lebensfähigkeit können die Organismen mit molekularbiologischen Methoden weiter differenziert werden. Dabei stellt es einen besonderen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, daß die Differenzierung mit molekularbio-
logischen Methoden genau die selben Organismen betrifft, die vorher mikroskopiert und/oder durch Anfärbung analysiert wurden.By microscoping and / or staining the organisms, it can be determined, for example, whether the organisms accumulated on the filter material are alive or dead. After examining their viability, the organisms can be further differentiated using molecular biological methods. It is a particular advantage of the method according to the invention that the differentiation with molecular biological logical methods concerns exactly the same organisms that were previously microscoped and / or analyzed by staining.
Nach dem Auflösen des Filtermaterials können die Nucleinsäuren z.B. mit Hilfe eines Puffers aus der Lösung extrahiert werden. Dazu wird eine mit der Lösung nicht mischbare Pufferphase zur Lösung hinzugegeben.After dissolving the filter material, the nucleic acids can e.g. extracted from the solution with the aid of a buffer. For this purpose, a buffer phase which is immiscible with the solution is added to the solution.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zu dem zweiphasigen System ein Mittel zur Verbesserung der Phasentrennung eingesetzt. Dies ist bevorzugterweise ein Phase-Lock-Gel wie es von der Firma Eppendorf ertrieben wird.In a preferred embodiment, a means for improving the phase separation is used for the two-phase system. This is preferably a phase lock gel as it is driven by the Eppendorf company.
Die sich in der Pufferphase befindenden Nucleinsäuren können direkt zum Beispiel in die PCR eingesetzt werden. Für den Fall, daß die Nucleinsäure- konzentration noch sehr niedrig ist, können die isolierten Nucleinsäuren mit gängigen Konzentrationsverfahren, wie zum- Beispiel der alkoholischen Fällung oder mit Hilfe von nucleinsäurebindenden Säulen, noch angereichert werden.The nucleic acids in the buffer phase can be used directly in the PCR, for example. In the event that the nucleic acid concentration is still very low, the isolated nucleic acids can be enriched with common concentration methods, such as, for example, alcoholic precipitation or with the aid of nucleic acid-binding columns.
Das erfindungsgemäße Verfahren und/oder der erfindungsgemäße Probenkit können zur Analyse von fluiden Medien aller Art eingesetzt werden.The method according to the invention and / or the sample kit according to the invention can be used for the analysis of fluid media of all kinds.
Bevorzugt ist der Einsatz des Verfahrens/Probenkits dort, wo fluide Medien wie zum Beispiel Flüssigkeiten analysiert werden sollen, die über einen längeren Zeitraum oder mehrfach verwendet werden sollen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren und/oder der erfindungsgemäße Probenkit zur Analyse von Brunnenwasser oder in Wasserwerken beispielsweise zur Prüfung auf E. coli und coliforme Keime, oder zur Analyse von Frischwasser, wie sie beispielsweise für Krankenhäuser oder Altenheime in regelmäßigen Abständen, zum Beispiel zur Prüfung auf Legionellen, vorgeschrieben sind, eingesetzt.The method / sample kit is preferably used where fluid media such as liquids are to be analyzed, which are to be used over a longer period of time or several times. In a preferred embodiment, the method according to the invention and / or the sample kit according to the invention for the analysis of well water or in waterworks, for example for testing for E. coli and coliform germs, or for the analysis of fresh water, as used for example for hospitals or old people's homes at regular intervals Example for testing for Legionella, are prescribed.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren und/oder der erfmdungsgemäße Probenkit zur Prüfung auf Krankheitserreger oder andere Verunreinigungen eingesetzt, beispielsweise zur Analyse von Blutserum, Dialyseflüssigkeiten, oder Lebensmitteln, dabei vor allem Getränken wie Bier oder Soft-Getränken und Säften.In a further preferred embodiment, the method according to the invention and / or the sample kit according to the invention is used for testing for pathogens or other contaminants, for example for analyzing blood serum, dialysis fluids or foods, in particular beverages such as beer or soft drinks and juices.
Das Verfahren/der Probenkit kann auch zur Analyse von Flüssigkeiten aus dem technischen Bereich wie Schmierölen, Hydraulikflüssigkeiten, Reinigungslösungen, Kühlmittel, etc. verwendet werden.The method / the sample kit can also be used for the analysis of technical liquids such as lubricating oils, hydraulic fluids, cleaning solutions, coolants, etc.
Daneben ist -es grundsätzlich möglich, das Verfahren/den Probenkit zum Nachweis von Beimischungen organischen Materials zu jedweden Flüssigkeiten einzusetzen, zum Beispiel der Beimischung von Apfelsaft zu Orangensaft, oder Gewässerverunreinigungen, die durch organisches Material verursacht wurden.In addition, it is fundamentally possible to use the method / the sample kit for the detection of admixtures of organic material with any liquids, for example the admixture of apple juice with orange juice, or water pollution caused by organic material.
Der Probenkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt:
a) Filtermaterial zur Filtrierung einer bestimmtem Anzahl an Proben mit nucleinsäurehaltigem Material,The sample kit for carrying out the method according to the invention comprises: a) filter material for filtering a certain number of samples with material containing nucleic acid,
b) eine oder mehrere Pufferlösung(en) zur Extraktion der Nucleinsäuren, die mit dem oder den Lösungsmitteln nicht mischbar sind,b) one or more buffer solution (s) for extracting the nucleic acids which are immiscible with the solvent or solvents,
c) ein oder mehrere Reagenz(ien) zur Verbesserung der Phasentrennung zwischen Lösungsmittel und Pufferlösung bei der Extraktion der Nucleinsäuren.c) one or more reagents to improve the phase separation between solvent and buffer solution during the extraction of the nucleic acids.
Optional können dem Kit noch ein oder mehrere Lösungsmittel zur Auflösung des Filtermaterials, sowie weitere Reagenzien zur Detektion der aus der Probe isolierten Nucleinsäuren beigefügt sein.Optionally, one or more solvents for dissolving the filter material as well as further reagents for the detection of the nucleic acids isolated from the sample can be added to the kit.
In diesem Probenkit ist das für die Routineanalyse von Proben, die nucleinsäurβhaltiges Material enthalten und die beispielsweise auf eventuell vorhandene Kontaminationen mit Mikroorganismen mittels DNA-Analysen untersucht werden soll, notwendige Material zusammengestellt.This sample kit contains the material necessary for the routine analysis of samples that contain nucleic acid-containing material and that is to be examined, for example, for possible contamination with microorganisms by means of DNA analysis.
Vorteile des so zusammengestellten Kits sind, daß der Anwender nur noch wenige Arbeitsschritte selbst durchführen muß und somit der Arbeitsaufwand des Anwenders sowie das Fehlerrisiko durch zum Beispiel falsches Pipettieren oder Verwechseln von Proben oder Lösungen bei der Durchführung einer Analyse minimiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der erfindungsgemäße Probenkit:The advantages of the kit compiled in this way are that the user only has to carry out a few work steps himself, thus minimizing the workload of the user and the risk of errors due to, for example, incorrect pipetting or mistaking samples or solutions when carrying out an analysis. In a preferred embodiment, the sample kit according to the invention comprises:
a) je einen Membranfilter pro Probe,a) one membrane filter per sample,
b) Pufferlösungen für die Extraktion der Nucleinsäuren,b) buffer solutions for the extraction of the nucleic acids,
c) Mittel zur Verbesserung der Phasentrennung, wobei jeweils ein Gefäß mit der zur Bearbeitung einer Probe erforderlichen Menge pro Probe bereitgestellt wird,c) means for improving the phase separation, in each case one vessel is provided with the amount per sample required for processing a sample,
d) Reagenzien zur Durchführung einer DNA-Analyse, wobei jeweils ein Gefäß mit den für die Durchführung der PCR erforderlichen Reagenzien pro Probe bereitgestellt wird,d) reagents for performing a DNA analysis, one vessel with the reagents required for performing the PCR per sample being provided,
e) Kontrollreagenzien für die PCR, d.h. Reagenzien und Kontroll-DNA für die notwendigen Positiv-Reaktionen.e) control reagents for PCR, i.e. Reagents and control DNA for the necessary positive reactions.
Weiter bevorzugt umfaßt das Mittel zur Verbesserung der Phasentrennung ein Phase-Lock-Gel wie es von der Firma Eppendorf bezogen werden kann.More preferably, the agent for improving the phase separation comprises a phase lock gel as can be obtained from Eppendorf.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend anhand eines Beispiels beschrieben.The method according to the invention is described below using an example.
Beispiel 1:
Eine Wasserprobe wird mittels Membranfiltration über einem Polycarbonat- membranfilter abfiltriert. Der Filter wird anschließend in ein 2ml- Eppendorfgefäß überführt. Der Inhalt dieses Gefäßes wird dann 3 Minuten lang der Strahlung einer 650 Watt starken Mikrowelle ausgesetzt. Danach werden zur Probe 200 μl Wasser und 800 μl eines Chloroform/Isoamylalkohol Gemisches (Volumenanteil 24/1) hinzugefügt. Die Probe wird geschüttelt bis der Filter frei in der Probe schwimmt. Anschließend wird die Probe durch Überkopfschütteln bei 30 U/min 10 Minuten lang weiter geschüttelt, bis sich der Filter vollständig aufgelöst hat. Es werden dann 300 μl Phase Lock Gel der Firma Eppendorf in ein weiteres 2ml-Eppendorfgefäß gegeben. Der gesamte Inhalt des ersten Eppendorfgefäßes wird dann zum Phase Lock Gel hinzugegeben. Zur Phasentrennung wird bei 14.000 U/min 2 Minuten lang zentrifugiert. Anschließend werden 150 μl der oberen Phase in ein frisches Gefäß überführt. 10 μl der so aufbereiteten Probe werden für eine PCR-Analyse mit einem Ansatzvolumen von 50 μl verwendet.Example 1: A water sample is filtered off by membrane filtration over a polycarbonate membrane filter. The filter is then transferred to a 2 ml Eppendorf tube. The contents of this jar are then exposed to radiation from a 650 watt microwave for 3 minutes. Then 200 μl water and 800 μl chloroform / isoamyl alcohol mixture (volume fraction 24/1) are added to the sample. The sample is shaken until the filter floats freely in the sample. The sample is then shaken overhead by shaking at 30 rpm for 10 minutes until the filter has completely dissolved. 300 μl of Phase Lock Gel from Eppendorf are then placed in a further 2 ml Eppendorf tube. The entire content of the first Eppendorf tube is then added to the Phase Lock Gel. Centrifugation is carried out at 14,000 rpm for 2 minutes to separate the phases. Then 150 μl of the upper phase are transferred to a fresh vessel. 10 μl of the sample prepared in this way are used for a PCR analysis with a batch volume of 50 μl.
Der Probenkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im folgenden an einem Beispiel beschrieben:The sample kit for carrying out the method according to the invention is described below using an example:
Beispiel 2:Example 2:
Kit-Inhalte sindKit contents are
• 50 Polycarbonat-Membranfllter, steril einzeln verpackt . 1 Gefäß mit 5,0 ml Tris-Puffer, pH 8,5
. 1 Gefäß mit 10 ml 0,01 M Tris-EDTA-Puffer• 50 polycarbonate membrane filters, sterile, individually packed. 1 vial with 5.0 ml Tris buffer, pH 8.5 , 1 vial with 10 ml of 0.01 M Tris-EDTA buffer
• 50 2,0 ml-Eppendorfgefäße mit je 300 μl Phase Lock Gel• 50 2.0 ml Eppendorf tubes, each with 300 μl Phase Lock Gel
• Reagenzien zur Durchführung einer PCR, bestehend aus 2 Oligonucleotiden, dNTPs und PCR-Puffer, 48 x vordosiert in der für die Analyse je einer Probe erforderlichen Menge (50 μl), und getrocknet• Reagents for carrying out a PCR, consisting of 2 oligonucleotides, dNTPs and PCR buffers, 48 times predosed in the amount required for the analysis of one sample (50 μl), and dried
• Kontrollen für die PCR, ebenfalls bereits 48 x vordosiert (Reagenzien für die PCR sowie 0,05 ng Kontroll-DNA für die Positiv-Kontrolle) und getrocknet• Controls for the PCR, also 48 times pre-dosed (reagents for the PCR and 0.05 ng control DNA for the positive control) and dried
• Arbeitsvorschrift
• Working instructions
Claims
1. Verfahren zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material, das das Abscheiden des nucleinsaurehaltigen Materials auf einem Filtermaterial und das Auflösen des Filtermaterials in einem Lösungsmittel umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das nucleinsäurehaltige Material auf dem Filtermaterial aufgeschlossen wird.1. A method for the analysis of nucleic acid-containing material, which comprises depositing the nucleic acid-containing material on a filter material and dissolving the filter material in a solvent, characterized in that the nucleic acid-containing material is digested on the filter material.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Filtermaterial ein Celluloseacetat- oder Polycarbonat-Filter verwendet wird.2. The method according to claim 1, characterized in that a cellulose acetate or polycarbonate filter is used as the filter material.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtermaterial in Phenol oder Chloroform aufgelöst wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the filter material is dissolved in phenol or chloroform.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Aufschließen des auf dem Filtermaterial abgeschiedenen nucleinsaurehaltigen Materials Mikrowellenstrahlung, Hitze, Ultraschall oder ein mechanisches Verfahren eingesetzt wird.4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that microwave radiation, heat, ultrasound or a mechanical method is used to digest the material containing nucleic acid deposited on the filter material.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das nucleinsäurehaltige Material Organismen umfaßt.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the nucleic acid-containing material comprises organisms.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die auf dem Filtermaterial abgeschiedenen Organismen auf festen oder in flüssigen Nährmedien zur Erhöhung der Keimzahlen bebrütet werden 6. The method according to claim 5, characterized in that the organisms deposited on the filter material are incubated on solid or in liquid nutrient media to increase the bacterial count
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die auf dem Filtermaterial abgeschiedenen Organismen mikroskopiert und/oder mit Farbstoffen angefärbt werden.7. The method according to claim 5 or 6, characterized in that the organisms deposited on the filter material microscoped and / or stained with dyes.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuren nach Auflösen des Filtermaterials mit einem Puffer extrahiert werden.8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the nucleic acids are extracted with a buffer after dissolving the filter material.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuren nach der Extraktion direkt in der Pufferphase in die PCR eingesetzt werden.9. The method according to claim 8, characterized in that the nucleic acids are used directly after the extraction in the buffer phase in the PCR.
10. Probenkit zur Ausführung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Filtermaterial, eine Pufferlösung und ein Mittel zur Verbesserung der Phasentrennung umfaßt.10. Sample kit for carrying out the method according to one of the preceding claims, characterized in that it comprises a filter material, a buffer solution and a means for improving the phase separation.
11. Probenkit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er als Filtermaterial einen Celluloseacetat- oder Polycarbonatfilter umfaßt.11. Sample kit according to claim 10, characterized in that it comprises a cellulose acetate or polycarbonate filter as filter material.
12. Probenkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er12. Sample kit according to claim 11, characterized in that it
a) je einen Membranfilter pro Probe, b) Pufferlösungen für die Extraktion der Nucleinsäuren, c) Mittel zur Verbesserung der Phasentrennung, wobei jeweils ein Gefäß mit der zur Bearbeitung einer Probe erforderlichen Menge pro Probe bereitgestellt wird, d) Reagenzien zur Durchführung einer DNA- Analyse, wobei jeweils ein Gefäß mit den für die Durchführung der PCR erforderlichen Reagenzien pro Probe bereitgestellt wird, e) Kontrollreagenzien für die PCR, d.h. Reagenzien und Kontroll-DNA für die notwendigen Positiv-Reaktionen umfaßt.a) one membrane filter per sample, b) buffer solutions for the extraction of the nucleic acids, c) means for improving the phase separation, whereby a vessel is provided with the amount required for processing a sample per sample, d) reagents for carrying out a DNA analysis, one vessel with the reagents required for carrying out the PCR per sample being provided, e) control reagents for the PCR, ie reagents and control DNA for the necessary positive reactions.
13. Probenkit nach Anspruch 10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß er als Mittel zur Verbesserung der Phasentrennung ein Phase-Lock-Gel umfaßt. 13. Sample kit according to claim 10, 11 or 12, characterized in that it comprises a phase lock gel as a means for improving the phase separation.
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1394544A1 (en) * | 2002-08-30 | 2004-03-03 | Biowell Technology Inc. | Method for mixing ribonulceic acid in water insoluble media and application thereof |
| EP2402456A1 (en) * | 2010-06-30 | 2012-01-04 | Imeth AG | Method for detecting organisms in water |
| WO2014019634A1 (en) * | 2012-07-31 | 2014-02-06 | Sartorius Stedim Biotech Gmbh | Device and method for treating a filtration medium |
| CN113430193A (en) * | 2021-06-30 | 2021-09-24 | 上海农林职业技术学院 | Nucleic acid collection kit and use method thereof |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5187083A (en) * | 1990-11-13 | 1993-02-16 | Specialty Laboratories, Inc. | Rapid purification of DNA |
| US5654179A (en) * | 1990-11-14 | 1997-08-05 | Hri Research, Inc. | Nucleic acid preparation methods |
| WO1999045021A1 (en) * | 1998-03-03 | 1999-09-10 | Affymetrix, Inc. | Cell cycle regulated genes |
| WO2002012560A1 (en) * | 2000-08-04 | 2002-02-14 | E. & J. Gallo Winery | Method of amplifying nucleic acids of microorganisms present in fruit juice |
-
2000
- 2000-09-11 DE DE10044856A patent/DE10044856A1/en not_active Ceased
-
2001
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5187083A (en) * | 1990-11-13 | 1993-02-16 | Specialty Laboratories, Inc. | Rapid purification of DNA |
| US5654179A (en) * | 1990-11-14 | 1997-08-05 | Hri Research, Inc. | Nucleic acid preparation methods |
| WO1999045021A1 (en) * | 1998-03-03 | 1999-09-10 | Affymetrix, Inc. | Cell cycle regulated genes |
| WO2002012560A1 (en) * | 2000-08-04 | 2002-02-14 | E. & J. Gallo Winery | Method of amplifying nucleic acids of microorganisms present in fruit juice |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| STARBUCK M A B ET AL: "Ultra sensitive detection of Listeria monocytogenes in milk by the polymerase chain reaction (PCR)." LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY, Bd. 15, Nr. 6, 1992, Seiten 248-252, XP009005698 ISSN: 0266-8254 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1394544A1 (en) * | 2002-08-30 | 2004-03-03 | Biowell Technology Inc. | Method for mixing ribonulceic acid in water insoluble media and application thereof |
| EP2402456A1 (en) * | 2010-06-30 | 2012-01-04 | Imeth AG | Method for detecting organisms in water |
| WO2012001111A3 (en) * | 2010-06-30 | 2012-03-08 | Imeth Ag | Method for determining organisms in water |
| WO2014019634A1 (en) * | 2012-07-31 | 2014-02-06 | Sartorius Stedim Biotech Gmbh | Device and method for treating a filtration medium |
| US9790462B2 (en) | 2012-07-31 | 2017-10-17 | Sartorius Stedim Biotech Gmbh | Device and method for treating a filtration medium |
| CN113430193A (en) * | 2021-06-30 | 2021-09-24 | 上海农林职业技术学院 | Nucleic acid collection kit and use method thereof |
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