WO2001063285A2 - Verfahren zum nachweis von helicobacter pylori und heilmanii - Google Patents

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Katarina Crevar
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    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of helicobacter antigens in stool and saliva samples or biopsy materials.
  • the human gastric mucosa is often colonized by bacteria of the genera Helicobacter pylori and heilmanii or Ca pylobacter. Infection with these bacteria is likely to occur from person to person, but drinking water and food are not excluded as sources of infection.
  • the Helicobacter heilmanii strain is transmitted from pets such as cats, dogs, rabbits, but also from farm animals such as cows. Therefore, people in agriculture and animal care are particularly affected by infections. In Germany, about 10% of schoolchildren, 30% of thirty-year-olds and about 75% of seniors are infected with H. pylori. Around 50% of people worldwide suffer from this infection. H. pylori causes 80% of gastrides, 95% of duodenal ulcers and 70% of ventricular ulcer cases.
  • H. pylori gastritis is also considered a precancerous condition for gastric adenocarcinoma and gastric lymphoma.
  • WHO World Health Organization
  • H. pylori is a carcinogen of the highest cancer risk class. Only a small proportion of H. pylori-infected people develop symptoms. Despite gastritis, many live without any noteworthy symptoms or they attribute the rather unspecific symptoms to other causes.
  • Acute H. pylori gastritis is characterized by indefinite pain in the upper and middle abdomen, feeling of pressure and bloating, acid regurgitation, heartburn, as well as nausea and nausea. H.
  • H. pylori infection can be detected in almost all patients with type B gastritis. Despite the mostly massive immune response, the infection became chronic. Whether an ulcer develops depends on the patient's immune system and the aggressiveness of the bacteria or the type of bacterial strain. Spontaneous cures are rare. As a rule, an I ylori infection persists throughout life if it is not treated. H. pylori infection can be diagnosed by growing the pathogen from an antrus or corpus biopsy or by histological examination of the tissue. Further diagnostic methods are the CLO test (test for campylobacter like organism) or the urease urea test, the 13 C isotope breath test, the detection of antibodies against H. pylori in serum, the PCR detection of Helicobacter DNA in one Gastric juice or stool sample and the detection of H. pylori antigens in a stool sample.
  • CLO test test for campylobacter like organism
  • urease urea test the 13 C isotope
  • the HpSA test is also unsuitable for controlling eradication therapy, since it only works with abundant amounts of H. pylori antigen in stool.
  • the other diagnostic procedures are sometimes very complex, burdensome for the patient or too expensive for routine examinations.
  • a disadvantage of the serological methods is that they do not allow therapy control, since the antibody titers remain high for months after the bacteria have eradicated. Control of the therapy is essential, however, since resistance to the antibiotics commonly used for treatment such as clarithromycin, metronidazole, amoxicillin, omeprazole or proton pump inhibitors may be present. Therapy of infections with antibiotics and naturopathic alternatives therefore requires a simple, reliable and sensitive test procedure for H. pylori. This object is achieved by an immunoassay according to claim 1. Preferred embodiments of the invention are described in the subclaims.
  • the method according to the invention for the detection of Helicobacter pathogen antigens in a sample is characterized by taking up and suspending a human sample to be examined for the pathogen in a sample buffer; bringing the sample buffer into contact with the pathogen antigen with a solid phase to which at least two different primary antibodies are bound, one of which is capable of binding pathogen antigens and the other of which binds human immunoglobulin; Washing the solid phase of non-specifically bound antigens; Bringing together the solid phase with a secondary antibody that specifically recognizes antigens of the pathogen and determining the amount of bound secondary antibody.
  • the amount of bound to the solid phase secondary antibody can be determined, for example ⁇ by a labeling of the antibody.
  • the label can be a radioactivity, a luminescent or fluorescent group, a group such as biotin that can be bound by another molecule such as streptavidin, or an enzyme such as peroxidase that catalyzes a detection reaction.
  • the amount of secondary antibody bound can also be determined by a further antibody which specifically recognizes the type of secondary antibody and bears one of the abovementioned labels.
  • the second primary antibody against human immunoglobulins bound to the solid phase is preferably an antibody which binds human IgA and particularly preferably secretory human IgA which is secreted in the saliva and in the large intestine.
  • secretory human IgA here includes human IgA and possibly also the so-called secretory component (MW: 70 kDa), which is "produced by the epithelial cells for transport and 'to protect the IgA before proteoglycans lytic enzymes is particularly preferred.
  • a mixture of two primary antibodies which specifically bind IgAl and IgA2 is very particularly preferred.
  • the 'bound to the solid phase only primary antibody a polyclonal rabbit anti-J ⁇ .pylori antibody.
  • the second primary antibody bound to the solid phase is a goat anti-human s IgA polyclonal antibody tested for cross-reactivities.
  • the secondary antibody is a biotin-conjugated rabbit anti-ff. ylori antibody so that the amount of secondary antibody bound can be determined by binding peroxidase-conjugated streptavidin and a color reaction with tetramethylbenzidine.
  • the first primary antibody bound to the solid phase is a rabbit anti-i ⁇ . ylori antibody
  • the second primary antibody is a rabbit anti-human sIgA antibody
  • the secondary antibody is a polyclonal horseradish peroxidase-conjugated goat anti-i ⁇ .pylori antibody.
  • other immunoglobulins from horse, cattle, pork, sheep, goat, rabbit, guinea pig, rat, mouse or another animal can also be used. It is particularly important to ensure that the second primary antibody for human immunoglobulin does not bind the secondary antibody against the pathogen antigen in the saliva or stool sample.
  • the antibodies can be monoclonal.
  • the second primary antibody can be an onoclonal antibody for human IgA2. It is advisable to use several monoclonal antibodies that recognize different epitopes of the pathogen or the human immunoglobulin. For primary monoclonal antibodies, it is advisable to use a mixture of several monoclonal antibodies in order to broaden the specificity of the assay.
  • the secondary antibodies are preferably conjugated with one or more markers such as biotin, fluroescein, rhutenium, europium,
  • Gold particles alkaline phosphatase, galactosidase or Horseradish peroxidase.
  • alkaline phosphatase alkaline phosphatase
  • galactosidase galactosidase
  • Horseradish peroxidase other suitable marker or detection systems can also be used.
  • the ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the ELISA is used for the qualitative and quantitative determination of H. pylori antigen in stool and saliva samples and bio-specimen material.
  • the H.pylori antigen is released from the sample in a first step and bound by a preferably polyclonal anti-i ⁇ .pylori antibody, which is bound in the usual way to a microtiter plate or another solid phase.
  • a second primary antibody is also fixed to the solid phase, which recognizes human immunoglobulins and preferably human secretory IgA. Since H.
  • pylori antigens have come into contact with the body's own human immune system in a stool or saliva sample, some or all of the H. pylori epitopes have already been bound by human immunoglobulins and are no longer suitable for binding by the first primary antibody against the pathogen accessible.
  • the pathogen antigens in the stool or saliva sample and biopsy material even if there is already an immune reaction against them, are concentrated and bound to the solid phase.
  • ff.pylori antigens are bound directly and, on the other hand, indirectly via their binding to secreted human immunoglobulin in the saliva or gastrointestinal tract.
  • bound F. pylori antigen is then immediately detected by anti-i ⁇ .pylori secondary antibodies. The amount of secondary antibody bound is then quantified using a suitable system.
  • the overall specificity of a double antibody assay is essentially determined by the specificity of the secondary antibody.
  • the fact that in the first binding step also binds human secretory antibodies with pathogen antigen increases in the case of H. pylori not only the sensitivity, but also the range of the test. It is particularly surprising that, in a significant number of cases, all of the H. pylori immunogenic epitopes are recognized by the existing human immune response. Apparently, the number of immunogenic epitopes is limited in Helicobacter organisms, so that the pathogen epitopes recognized by the human immune system and by the animal primary and secondary antibodies of the double antibody binding assay are often identical.
  • Small and masked amounts of H. pylori antigen can be detected by the test principle according to the invention.
  • H. pylori The occurrence of Helicobacter pylori in saliva has so far only aroused scientific interest with regard to the putative route of transmission (Namavar F. et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Bis., 1995, 14 (3), pp. 234-7; Shimada T. et al., Lancet, 1994, 343 (8913), pp. 1636-7).
  • the lower detection limit for H. pylori is now set so low that an examination of the saliva also allows the diagnosis of an i.pylori infection. It is particularly important for therapy control to examine the patient's saliva for H. pylori antigens. The applicant's investigations showed that H.
  • pylori infection nests can be located in the oral cavity - presumably under metal seals and dental prostheses, etc. - which can outlast conventional medicinal eradication therapy and lead to a re-infection of the gastric mucosa after the end of the therapy. Eradication therapy can therefore only be considered complete if H. pylori antigens can no longer be detected in both the stool and saliva samples.
  • the sandwich test principle according to the invention with a second primary antibody against human immunoglobulin, in particular against human secretory IgA is not limited to use on a microtiter plate. It can be adapted to fully automated processes that work with coated beads or particles.
  • the principle according to the invention with a second primary antibody against secretory human IgA is generally suitable for the diagnosis of pathogens which settle in the mouth or in the gastrointestinal tract and which cause a massive immune reaction.
  • the first primary antibody is a pool of polyclonal antibodies against different H. pylori strains. This also applies to the secondary antibody, as this improves the safety of the test.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the immunoassay according to the invention for H. pylori antigen
  • Fig. 3 is a graphical representation of the i.pylori antigen concentration in the saliva determined according to the invention before and after an eradication treatment.
  • Triton X-100, 0.02% thimerosal, pH 7.4) The stool samples were preferably dosed and homogenized using a
  • the saliva sample was diluted 1: 4 or 1: 5 depending on the viscosity in assay buffer and used immediately in the binding assay.
  • the assay buffer contains a protease inhibitor such as, for example, 5 mM PMSF.
  • protease inhibitors such as Pefabloc SC (Röche Diagnostics) can also be used.
  • Coating the microtiter plate The wells of a microtiter plate were coated with polyclonal antibodies against H. pylori antigen and human immunoglobulin-A. For this purpose, 100 ⁇ g of commercially available polyclonal rabbit anti-K. pylori antibodies (DAKO, Hamburg) were added to each well, dissolved in 200 ⁇ l of 60 mM NaCO 3 , pH 9.6, and the plate was incubated at 4 ° C. overnight , The rabbit anti-i ⁇ .pylori antibody solution in the wells was removed and each well was washed with 200 ⁇ l wash buffer (PBS, pH 7.4 with 0.1% Triton X-100).
  • PBS pH 7.4 with 0.1% Triton X-100
  • Binding assay The determinations were all made in duplicate. 100 ⁇ l standard and sample were pipetted in duplicate into the antibody-coated wells of the microtiter and incubated for one hour while shaking at room temperature. The solutions were removed and the wells of the plate were washed five times with 250 ⁇ l of washing buffer each. After the last wash, the microtiter plate was beaten dry on absorbent paper.
  • TMB tetramethylbenzidine
  • H. pylori antigens present in the stool sample were completely masked by the body's immune system and therefore could not be bound by the analytical primary antibody against the pathogen. With such a masking of the antigens, a conventional double antibody immunoassay leads to the wrong result that there is no i ⁇ .pylori infection or no longer exists.
  • the H. pylori antigens already bound or masked by the human immune system were bound to the solid phase by the second anti-human sIgA primary antibodies (see Table 2, fields shaded in gray). The masking effect was not dependent on the secondary antibody used and not on whether the sample was saliva or stool. Furthermore, the results suggest that the primary bonds of H.
  • H. pylori to the solid phase via anti-human slgA antibodies or anti-H. pylori antibodies are mutually exclusive in many cases, that is to say clearly an either-or situation regarding the bond was given.
  • the possible primary binding of the H. pylori antigens to the solid phase via binding to human immunoglobulin-A is thus an essential component of the diagnosis according to the invention.
  • a saliva sample was taken from 150 patients suspected of H. pylori infection or after eradication therapy and examined for the presence of H. pylori antigens. The analysis was carried out as indicated in Example 1, with the exception that the assay buffer also contained a protease inhibitor.
  • the detection limit for Helicobacter antigen in saliva in the test system described above is approximately 2 pg H.pylori antigen per milliliter of assay buffer.
  • the result of the series examination is summarized in a bar chart in FIG.
  • the bar chart shows that patients with an existing i ⁇ .pylori infection in saliva generally have more than 60 ng / ml H.pylori antigens.
  • the examination of the saliva is therefore suitable for the detection of an existing H. pylori infection.
  • H.pylori antigen concentrations below 25 ng per ml saliva indicate an unspecific cross-reaction with other pathogens.

Abstract

Verfahren zum Nachweis von krankheitserregenden Organismen, insbesondereHelicobacter pyloriundH. heilmanii,in Stuhl-, Speichel- und Sekretproben durch einen Doppelantikörper-Sandwich-Bindungsassay, gekennzeichnet durch Aufnehmen oder Dispergieren der Probe mit Erregerantigen in einer Pufferlösung und Zusammenbringen der Pufferlösung mit einer festen Phase, an der mindestens zwei primäre Antikörper gebunden sind, von denen einer Erregerantigen und der andere menschliches Immunglobulin-A spezifisch bindet; Waschen der festen Phase von nicht spezifisch gebundenen Proteinen und Zusammenbringen der festen Phase mit einem sekundären Antikörper, der spezifisch an Erregerantigen bindet, und Bestimmen der Menge an spezifisch gebundenem Sekundärantikörper.

Description

VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON HELICOBACTER PYLORI UND HEILMANII IN STUHL- UND SPEICHELPROBEN UND BIOPSIEMATERIAL
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Helico- bacter-Antigenen in Stuhl- und Speichelproben oder Biopsie- materialien.
Die menschliche Magenschleimhaut wird vielfach von Bakterien der Gattungen Helicobacter pylori und heilmanii oder Ca pylobacter besiedelt. Die Infektion mit diesen Bakterien erfolgt wahrscheinlich von Mensch zu Mensch, aber auch Trinkwasser und Nahrungsmittel werden als Infektionsquellen nicht ausgeschlossen. Der Stamm Helicobacter heilmanii wird von Haustieren wie Katzen, Hunden, Kaninchen, aber auch von Nutztieren wie Kühen übertragen. Daher sind Personen in der Landwirtschaft und Tierpflege besonders von Infektionen betroffen. In Deutschland sind etwa 10% der Schulkinder, 30% der Dreißigjährigen und etwa 75% der Senioren mit H. pylori infiziert. Weltweit tragen ca. 50% der Menschen diese Infektion. 80% der Gastriden, 95% der Ulcus duodeni- und 70% der Ulcus ventriculi-Fälle werden von H. pylori verursacht. Zudem gilt die chronische JJ.pylori-Gastritis (Typ-B-Gastritis) als Präkanzerose für das Magen-Adenokarzinom und das gastrische Lymphom. H. pylori ist gemäß WHO ein Kanzerogen der höchsten Krebsrisikoklasse. Nur ein kleiner Teil der H. pylori-infizierten Personen entwickelt Symptome. Viele leben trotz einer Gastritis ohne nennenswerte Beschwerden oder sie schreiben die eher unspezifischen Symptome anderen Ursachen zu. Eine akute H.pylori- Gastritis äußert sich durch unbestimmte Schmerzen im Ober- und Mittelbauch, Druck- und Völlegefühl, saures Aufstoßen, Sodbrennen sowie durch Übelkeit und Brechreiz. Bei nahezu allen Patienten mit einer Typ-B-Gastritis kann eine H. pylori- Infektion nachgewiesen werden. Trotz der zumeist massiven Immunreaktion wurde bei ihnen die Infektion chronisch. Ob sich ein Ulkus entwickelt, hängt ab, vom Immunsystem des Patienten und von der Aggressivität der Bakterien bzw. der Art des Bakterienstammes. Spontanheilungen sind selten. In der Regel bleibt eine I ylori-Infektion wenn sie nicht therapiert wird, das ganze Leben bestehen. Eine H. pylori-Infektion kann diagnostiziert werden durch Anzucht des Erregers aus einer Antru - oder Corpus-Biopsie oder durch histologische Untersuchung des Gewebes. Weitere Diagnoseverfahren sind der CLO-Test (Test auf campylobacter like organism) bzw. der Urease-Harnstofftest, der 13C-Isotopen-Atemtest, der Nachweis von Antikörpern gegen H. pylori im Serum, der PCR-Nachweis von Helicobacter-DNA in einer Magensaft- oder Stuhlprobe und der Nachweis von H. pylori-Antigenen in einer Stuhlprobe.
US 5 716 791 (Larka et al.) und EP 0 806 667 (Meridian Diagnostics Inc.) beschreiben einen Immunoassay für H.pylori-Antigene in Stuhl. Der Assay beruht auf zwei affinitätsgereinigten poly- klonalen Antikörpern gegen H. pylori-Antigen. Ferner gibt es von Connex GmbH, Martinsried, DE, einen Instanttest, der auf einer Lateralfluss-Chro atographie goldmarkierter monoklonaler Antikörper gegen H. pylori-Stuhlantigene basiert. Diese sogenannten HpSA-Tests (Helicobacter pylori Stool Antigen) haben zwar in verschiedenen klinischen Studien eine gute Übereinstimmung mit anderweitigen diagnostizierten Fällen ergeben, ein hoher Prozent- satz der Untersuchungen führt aber zu keiner klaren Aussage. Der HpSA-Test ist zudem für die Kontrolle einer Eradikationstherapie ungeeignet, da er nur bei abundanten Mengen H. pylori-Antigen im Stuhl funktioniert. Die weiteren diagnostischen Verfahren sind zum Teil sehr aufwendig, für den Patienten belastend oder zu teuer für Routineuntersuchungen. Nachteilig an den serologischen Verfahren ist, dass sie keine Therapiekontrolle erlauben, da die Antikörper- titer noch Monate nach einer Eradikation der Bakterien hoch bleiben. Eine Kontrolle der Therapie ist aber essentiell, da gegen die zur Behandlung üblicherweise eingesetzten Antibiotika wie Clarithromycin, Metronidazol, Amoxicillin, Omeprazol oder Protonenpumpenhemmer Resistenzen vorliegen können. Die Therapie der Infektionen durch Antibiotika und naturheilkundlichen Alternativen verlangt somit ein einfaches, zuverlässiges und empfindliches Testverfahren auf H. pylori . Diese Aufgabe wird gelöst durch einen Immunoassay gemäß Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Helicobacter- Erregerantigenen in einer Probe ist gekennzeichnet durch das Aufnehmen und Suspendieren einer auf den Erreger zu untersuchenden menschlichen Probe in einem Probenpuffer; das Zusammenbringen des Probenpuffers mit den Erregerantigen mit einer festen Phase, an der mindestens zwei verschiedene Primärantikörper gebunden sind, von denen einer Antigene des Erregers und der andere menschliches Immunglobulin zu binden vermag; Waschen der festen Phase von unspezifisch gebundenen Antigenen; Zusammenbringen der festen Phase mit einem Sekundärantikörper, der spezifisch Antigene des Erregers erkennt und Bestimmen der Menge an gebundenem Sekundärantikörper.
Die Menge des an die feste Phase gebundenen Sekundärantikörpers kann bestimmt werden beispielsweise ■ durch eine Markierung des Antikörpers. Die Markierung kann eine Radioaktivität sein, eine lumineszierende oder fluoreszierende Gruppe, eine Gruppe wie Biotin, die von einem weiteren Molekül wie Streptavidin gebunden werden kann, oder ein Enzym wie Peroxidase, das eine Nachweisreaktion katalysiert. Die Menge an gebundenem Sekundärantikörper kann auch durch einen weiteren Antikörper bestimmt werden, der den Typ des Sekundärantikörpers spezifisch erkennt und eine der vorgenannten Markierungen trägt.
Der an der festen Phase gebundene zweite Primärantikörper gegen menschliche Immunglobuline ist bevorzugt ein Antikörper, welcher Human-IgA und besonders bevorzugt sekretorisches Human-IgA bindet, das in den Speichel und im Dickdarm sekretiert wird. Die Bezeichnung sekretorisches Human-IgA umfasst hier Human-IgA und ggf. auch die sogenannte sekretorische Komponente (MW: 70 kDa) , die von den Epithelzellen für den Transport und '"zum Schutz des IgA vor proteo- lytischen Enzymen produziert wird. Besonders bevorzugt sind Antikörper gegen IgA2, da Helicobacter und auch andere Mikroorganismen slgAl-spaltende Proteasen erzeugen. Ganz besonders bevorzugt ist ein Gemisch zweier Primärantikörper, welche IgAl und IgA2 spezifisch binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der an der festen Phase 'gebundene erst Primärantikörper ein polyklonaler Kaninchen-Anti-Jϊ.pylori-Antikörper. Der zweite an der festen Phase gebundene Primärantikörper ist ein auf Kreuzreaktivitäten getesteter polyklonaler Ziege-Anti-Human-s-IgA-Antikörper. Der Sekundär- antikörper ist ein Biotin-konjugierter Kaninchen-Anti-ff. ylori- Antikörper, so dass die Menge an gebundenem Sekundärantikörper über die Bindung von Peroxidase-konjugiertem Streptavidin und eine Farbreaktion mit Tetramethylbenzidin bestimmt werden kann.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform ist der erste an der festen Phase gebundene Primärantikörper ein Kaninchen-anti-iϊ. ylo- ri-Antikörper, der zweite Primärantikörper ein Kaninchen-anti- Human-sIgA-Antikörper und der Sekundärantikörper ein polyklonaler Meerrettichperoxidase-konjugierter Ziege-Anti-iϊ.pylori-Antikörper . Es können aber auch andere Immunglobuline verwendet werden aus Pferd, Rind, Schwein, Schaf, Ziege, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Maus oder einem anderen Tier. Es ist besonders darauf zu achten, dass der zweite Primärantikörper für menschliches Immun- globulin nicht den Sekundärantikörper gegen das Erregerantigen in der Speichel- oder Stuhlprobe bindet. Die Antikörper können im Prinzip monoklonal sein. Insbesondere kann der zweite Primärantikörper ein onoklonaler Antikörper für Human-IgA2 sein. Es empfiehlt sich, mehrere monoklonale Antikörper zu verwenden, die verschiedene Epitope des Erregers bzw. der menschlichen Immun- globuline erkennen. Bei monoklonalen Primärantikörpern empfiehlt es sich, eine Mischung aus mehreren monoklonalen Antikörpern zu verwenden, um die Spezifität des Assays zu verbreitern.
Die Sekundärantikörper sind bevorzugt mit ein oder mehreren Markern konjugiert wie Biotin, Fluroescein, Rhutenium, Europium,
Goldpartikel, alkalischer Phosphatase, Galactosidase oder Meerrettichperoxidase. Es können aber auch andere geeignete Marker- bzw. Nachweissysteme verwendet werden.
Testprinzip am Beispiel eines ELISA Der erfindungsgemäße ELISA (enzyme-linked immunosorbens assay) dient der qualitativen und quantitativen Bestimmung von H.pylori- Antigen in Stuhl- und Speichelproben und Biospiematerial. Das H.pylori-Antigen wird in einem ersten Schritt aus der Probe freigesetzt und durch einen bevorzugt polyklonalen Anti-iϊ.pylori- Antikörper gebunden, welcher in üblicher Weise an eine Mikrotiterplatte oder eine andere feste Phase gebunden ist. An der festen Phase ist zudem ein zweiter Primärantikörper fixiert, welcher Human-Immunglobuline und bevorzugt menschliches sekretorisches IgA erkennt. Da H. pylori-Antigene in einer Stuhl- oder Speichelprobe mit dem körpereigenen menschlichen Immunsystem in Berührung gekommen sind, wurden einige oder alle H. pylori- Epitope bereits von menschlichen Immunglobulinen gebunden und sind für eine Bindung durch den ersten Primärantikörper gegen den Erreger nicht mehr zugänglich. Von den zweiten Primärantikörper gegen menschliches Immunglobulin werden aber dennoch die Erregerantigene in der Stuhl- oder Speichelprobe und Biopsiematerial, selbst wenn gegen diese bereits eine Immunreaktion besteht, an der festen Phase konzentriert und gebunden. Es werden also einerseits ff.pylori-Antigene direkt gebunden und andererseits indirekt über ihre Bindung an sekretiertes menschliches Immunglobulin im Speichel oder Magendarmtrakt. Im zweiten Schritt wird dann gebundenes F.pylori- Antigen unmittelbar durch Anti-iϊ.pylori-Sekundärantikörper detektiert. Über ein geeignetes System wird dann die Menge an gebundenem Sekundärantikörper quantifiziert.
Durch die hohe Spezifität des Senkundärantikörpers gegen iT. ylori- Antigen werden falsch positive Befunde ausgeschlossen. Die Gesamtspezifität eines Doppelantikörperassays wird nämlich im Wesentlichen von der Spezifität des Sekundärantikörpers bestimmt. Dass im ersten Bindeschritt auch menschliche sekretorische Antikörper mit Erregerantigen gebunden werden, erhöht im Fall von H. pylori nicht nur die Empfindlichkeit, sondern auch die Bandbreite des Tests. Besonders erstaunlich ist, dass offenbar in einer erheblichen Zahl der Fälle alle immunogenen Epitope des H. pylori von der bestehenden menschlichen Immunreaktion erkannt werden. Offenbar ist bei Helicobacter-Organismen die Zahl der immunogenen Epitope begrenzt, so dass die vom menschlichen Immunsystem und von den tierischen Primär- und Sekundärantikörpern des Doppelantikörper-Bindungsassays erkannten Erregerepitope oftmals identisch sind. Dies gilt insbesondere bei einer H.pylori- Besiedelung der Mundhöhle und für die Spätphase einer Eradikationstherapie, in der die menschliche Immunreaktion die nunmehr verminderte Menge an E.pylori-Epitopen, die in der Stuhloder Spe chelprobe noch vorhanden sind, abdeckt. Durch das erfindungsgemäße Testprinzip lassen sich geringe und auch maskierte Mengen H. pylori-Antigen erfassen.
Das Vorkommen von Helicobacter pylori im Speichel erregte bislang nur wissenschaftliches Interesse hinsichtlich des mutmaßlichen Übertragungsweges (Namavar F. et al., Eur . J. Clin . Microbiol . Infect . Bis . , 1995, 14(3), pp. 234-7; Shimada T. et al., Lancet, 1994, 343(8913), pp. 1636-7). Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die untere Nachweisgrenze für H. pylori nun so tief gelegt, dass auch eine Untersuchung des Speichels die Diagnose einer iϊ.pylori-Infektion erlaubt. Insbesondere für die Therapiekontrolle ist es wichtig, den Speichel des Patienten auf H. pylori-Antigene zu untersuchen. Die Untersuchungen der Anmelderin ergaben, dass sich im Mundraum - vermutlich unter Metallplomben und Zahnprothesen, etc.- H. pylori-Infektionsnester befinden können, welche eine herkömmliche medikamentöse Eradikationstherapie überdauern können und nach Beendigung der Therapie zu einem erneuten Befall der Magenschleimhaut führen. Eine Eradikationstherapie kann somit nur als abgeschlossen gelten, wenn sowohl in der Stuhl- als auch in der Speichelprobe keine H. pylori-Antigene mehr nachgewiesen werden können.
Das erfindungsgemäße Sandwich-Testprinzip mit einem zweiten Primärantikörper gegen menschliches Immunglobulin, insbesondere gegen menschliches sekretorisches IgA, ist nicht auf die Verwendung auf einer Mikrotiterplatte beschränkt. Es kann auf vollautomatisierte Verfahren adaptiert werden, welche mit beschichteten Beads bzw. Partikeln arbeiten. Das erfindungsgemäße Prinzip mit einem zweiten Primärantikörper gegen sekretorisches Human-IgA eignet sich allgemein für die Diagnostik von Erregern, die im Mundraum oder im Magendarmtrakt siedeln und eine massive Immunreaktion hervorrufen.
Im Allgemeinen ist bevorzugt, wenn der erste Primärantikörper ein Pool polyklonaler Antikörper gegen verschiedene H. pylori-Stämme ist. Dieses gilt auch für den Sekundärantikörper, da dies die Sicherheit des Tests verbessert.
Die Erfindung und. deren Vorteile werden nun an bevorzugten Ausführungsformen, Beispielen und mit Bezug auf die anliegenden Zeichnungen beschrieben. Es zeigt:
Fig. 1 ein Prinzipschema des erfindungsgemäßen Immunoassays auf H.pylori-Antigen;
Fig. 2 eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Immunoassays;
Fig. 3 graphische Darstellung der erfindungsgemäß bestimmten iϊ.pylori-Antigen-Konzentration im Speichel vor und nach einer Eradikationsbehandlung.
BEISPIEL 1 - Nachweis von H. pylori-Antigen in Stuhl und Speichel
Vorbereitung der Stuhlprobe: Es wurde ca. 100 mg Stuhl eingewogen und bei Raumtemperatur in 5 ml PBS-Waschpuffer mit 0,1% Triton X- 100 (8 mM Na2HP04, 15 M M K2H2P0, 3 mM KCl, 12,5mM NaCl, 0,1%
Triton X-100, 0,02% Thimerosal, pH 7,4) dispergiert. Die Dosierung und Homogenisierung der Stuhlproben erfolgte bevorzugt mit einem
Probenvorbereitungssystem der Röche Diagnostik, Mannheim, DE
(Best. -Nr. 745804). Das Homogenat wurde in einer Tischzentrifuge 10 Minuten bei 3000 Up zentrifugiert, 1 ml Überstand in ein
Eppendorf-Röhrchen überführt und 5 Minuten bei 13000 Upm in einer
Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde direkt in den ELISA-Test eingesetzt.
Vorbereitung der Speichelprobe : Die Speichelprobe wurden 1:4 oder 1:5 je nach Viskosität in Assaypuffer verdünnt und unmittelbar in den Bindungsassay eingesetzt. Bei Speichelproben ist es vorteilhaft, wenn der Assaypuffer einen Protease-Inhibitor wie bspw. 5 mM PMSF enthält. Es können auch kommerzielle Proteaseinhibitoren wie Pefabloc SC (Röche Diagnostics) verwendet werden.
Beschichtung der Mikrotiterplatte : Die Vertiefungen einer Mikro- titerplatte wurden mit polyklonalen Antikörpern gegen H.pylori- Antigen und Human-Immunglobulin-A beschichtet. Hierzu wurde in jede Vertiefung jeweils 100 μg käuflicher polyklonaler Kaninchen- Anti-K.pylori-Antikörper (DAKO, Hamburg) gegeben, gelöst in 200 μl 60 mM NaC03, pH 9,6, und die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Kaninchen-Anti-iϊ.pylori-Antikörper-Lösung in den Vertiefungen wurde entfernt und jede Vertiefung mit 200 μl Waschpuffer (PBS, pH 7,4 mit 0,1% Triton X-100) gewaschen. Dann wurde in jede Vertiefung 100 μg Kaninchen-Anti-Human-sIgA-Antikörper (DAKO, Hamburg) gegeben, gelöst in 200 μl 60mM NaC03, pH 9,6 und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Anti-Human- IgA-Antikörper-Lösung in den Vertiefungen wurden entfernt und jede Vertiefung erneut fünfmal mit je 250 μl Waschpuffer gewaschen. Nach dem letzten Waschgang wurden die Vertiefungen der • Mikrotiterplatte auf Saugpapier ausgeschlagen.
Bindungsassay: Die Bestimmungen erfolgten alle in Doppelwerten. 100 μl Standard und Probe wurde in Doppelwerten in die antikörperbeschichteten Vertiefungen der Mikrotiter pipettiert und eine Stunde unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösungen wurden abgenommen und die Vertiefungen der Platte fünfmal mit je 250 μl Waschpuffer gewaschen. Nach dem letzten Waschgang wurde die Mikrotiterplatte auf Saugpapier trocken geschlagen.
Bestimmung der Bindung: Es wurde jeweils 100 μl Biotin- konjugierter polyklonaler Kaninchen-Anti-H.pylori-Antikörper (1:10000; von DAKO, Hamburg) oder Meerrettichperoxidase (HRP) - konjugierte polyklonaler Ziege-Anti-iϊ.pylori-Antikörper (KPL, Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD; ein Gemisch aus polyklonalen Antikörper gegen die H. pylori-Stämme ATCC 43504, 43526, 43579) 1:1000 verdünnt in Waschpuffer, in die Vertiefungen gegeben und bei Raumtemperatur eine Stunde unter Rütteln inkubiert. Die Lösung wurde aus den Vertiefungen entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen.
Quantitative Bestimmung: Für die Farbreaktion wurde im Fall des Meerrettichperoxidase-konjugierten Ziege-Anti-tf. pylori-Antikörpers 100 μl Tetramethylbenzidin(TMB) -Substratlösung (gebrauchsfertig von NOVUM Diagnostika GmbH, Dietzenbach, DE) in die Vertiefungen gegeben und nach etwa 20 Minuten die Farbentwicklung durch Zugabe von 50 μl 0,4M H2S04 gestoppt. Im Fall des Biotin-gekoppelten Kaninchen-Anti-Jϊ.pylori-Antikörpers wurde 100 μl Meerrettich- peroxidase-konjugiertes Streptavidin (DAKO), 1:10000 verdünnt in Waschpuffer, aufgetragen, 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert, fünfmal mit Waschpuffer gewaschen und erst dann das Chromogen hinzugefügt. Die Farbentwicklung wurde jeweils bestimmt durch Messung der Extinktion bei 450 nm. Die nachstehenden Tabellen 1 und 2 zeigen repräsentative Ergebnisse von Gesunden und iϊ.pylori-infizierten Patienten, wobei die erfindungsgemäßen Bestimmungen an verschiedenen Tagen wiederholt wurden. Die Bestimmungen erfolgten wie angegeben mit unterschiedlichen Nachweissystemen bzw. Sekundärantikörpern.
VERGLEICHSBEISPIEL 2
Immunoassay ohne zweiten Antikörper gegen Human- Immunglobul in- A Die Vorbereitungen der Stuhl- und Speichelproben und der Bindungsassay erfolgten exakt wie in Beispiel 1, nur dass die jeweiligen Vertiefungen der Mikrotiterplatte ausschließlich mit affinitätsgereinigtem, polyklonalen Kaninchen-Immunglobulin gegen HelicOjacter pylori oder mit Kaninchen-Anti-Human-sIgA-Antikörper beschichtet wurde. Alle Wasch-, Beschichtungs- und Bindeschritte sowie die Farbentwicklungen erfolgten parallel auf der gleichen Mikrotiterplatte .
TABELLE 1
Extinktion bei 450 nm in OD
Figure imgf000012_0001
Ad1 : Alle Extinktionswerte sind Mittelwerte aus zwei Bestimmungen
TABELLE 2
Figure imgf000013_0001
DISKUSSION
Die Tabellen 1 und 2 zeigen, dass bei manchen Patienten die in der
Stuhlprobe vorhandenen H. pylori-Antigene vollkommen vom körpereigenen Immunsystem maskiert waren und daher nicht vom analytischen Primärantikörper gegen den Erreger gebunden werden konnten. Bei einer solchen Maskierung der Antigene führt ein herkömmlicher Doppelantikörper-Immunoassay zu dem falschen Ergebnis, dass keine iϊ.pylori-Infektion vorliegt bzw. nicht mehr vorliegt. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wurden hingegen die vom menschliche Immunsystem bereits gebundenen bzw. maskierten H. pylori-Antigene vom zweiten Anti-Human-sIgA-Primärantikörpern an die feste Phase gebunden (siehe Tabelle 2, grau unterlegte Felder) . Der Maskierungseffekt war nicht abhängig vom eingesetzten Sekundärantikörper und auch nicht davon, ob es sich bei der Probe um Speichel oder Stuhl handelte. Ferner legen die Ergebnisse nahe, dass sich die Primärbindungen von H. pylori an der festen Phase über Anti-Human- slgA-Antikörper bzw. Anti-H.pylori-Antikörper in vielen Fällen einander ausschließen, dass also deutlich eine Entweder-Oder- Situation hinsichtlich der Bindung gegeben war. Die mögliche Primärbindung der H. pylori-Antigene an die feste Phase über die Bindung an menschliches Immunglobulin-A ist somit essentieller Bestandteil der erfindungsgemäßen Diagnostik.
Beispiel 3 - Speichelreihenuntersuchungen
Es wurde von 150 Patienten mit Verdacht auf eine H. pylori Infektion bzw. nach erfolgter Eradikationstherapie eine Speichelprobe entnommen und auf die Anwesenheit von H.pylori-Antigenen untersucht. Die Analytik erfolgte wie in Beispiel 1 angegeben mit der Ausnahme, dass der Assaypuffer zudem einen Proteaseinhibitor enthielt. Die Nachweisgrenze für Helicobacter-Antigen in Speichel liegt in dem vorstehend beschriebenen Testsystem (mit HRP-konjugiertem Ziege- Anti-H.pylori-Antikörper und Tetramethylbenzidin) bei etwa 2 pg H.pylori-Antigen pro Milliliter Assaypuffer. Durch Optimierung des gewählten zweiten Antikörpers gegen das Erregerantigen und Wahl eines Lumineszenz-Detektionssystems sollten Nachweisgrenzen 0,2 pg Antigen pro Milliliter und darunter erreicht sein.
Das Ergebnis der Reihenuntersuchung wird in Figur 3 in einem Balkendiagramm zusammengefasst. Das Balkendiagramm zeigt, dass Patienten mit einer bestehenden iϊ.pylori-Infektion im Speichel in der Regel mehr als 60 ng/ml H.pylori-Antigene besitzen. Die Untersuchung des Speichels ist daher geeignet für den Nachweis einer bestehenden H.pylori-Infektion. H.pylori-Antigenkonzentrationen unter 25 ng pro ml Speichel deuten hingegen auf eine unspezifische Kreuzreaktion mit anderen Erregern hin.
Damit wurde zum ersten Mal der Beweis erbracht, dass eine H.pylori- Infektion über eine vergleichsweise einfach durchzuführende immunologische Speicheluntersuchung nachgewiesen werden kann. Auch lässt sich so der Erfolg einer Eradikationstherapie vergleichsweise einfach verfolgen. Die bisherige Analytik des Speichels auf H. pylori hingegen erlaubte keine Diagnostik einer iϊ.pylori-Infektion des Magen-Darmtrakts, sondern beruhten auf einer wissenschaftliche Untersuchungen des möglichen Übertragungsweges .

Claims

P AT E N T AN S P R Ü C H E
1. Verfahren zum Nachweis von krankheitserregenden Organismen in Stuhl-, Speichel- und Sekretproben durch einen Doppelanti- körper-Sandwich-Bindungsassay, gekennzeichnet durch
Aufnehmen oder Dispergieren der Probe mit Erregerantigen in einer Pufferlösung und Zusammenbringen der Pufferlösung mit einer festen Phase, an der mindestens zwei primäre Antikörper gebunden sind, von denen einer Erregerantigen und der andere menschliches Immunglobulin-A spezifisch bindet;
Waschen der festen Phase von nicht spezifisch gebundenen Proteinen und Zusammenbringen der festen Phase mit einem sekundären Antikörper, der spezifisch an Erregerantigen bindet, und Bestimmen der Menge an spezifisch gebundenem
Sekundärantikörper .
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der zweite Primärantikörper sekretorisches Human-IgA bindet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der zweite Primärantikörper sekretorisches Human-IgA2 bindet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Sekun- därantikörper konjugiert ist mit einer Gruppe, ausgewählt aus
Biotin, Fluroescein, Rhutenium, Europium, Goldpartikel, alkalischer Phosphatase, Galactosidase und Meerrettichperoxi- ' dase .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der erste Primärantikörper und der Sekundärantikörper FelicoJacter pylori-Antigene bindet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der erste Primärantikörper eine Mischung polyklonaler und/oder monoklonaler Antikörper gegen verschiedene Helicobacter pylori-Stämme ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Sekundärantikörper eine Mischung polyklonaler und/oder monoklonaler Antikörper gegen verschiedene ffelicoJacter pylori-Stämme ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Erreger Campylobacter ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn- zeichnet, dass der Erreger Helicobacter heilmanii ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Erreger eine massive Immunreaktion im menschlichen Körper hervorruft.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 10 zur Diagnose von verbliebenen Erregern im Mundraum nach einer medikamentösen Eradikationstherapie .
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