WO2001038862A1 - Detecteur de cholesterol et methode permettant de determiner un cholesterol - Google Patents

Description

明 細 コレステロールセンサおよびコレステロールの定量方法 技術分野

本発明は、 血液、 血清、 血漿などの被検試料中の低密度リポ蛋白に含 まれるコレステロールを定量するセンサおよび方法に関するものである, 背景技術

近年、 高コレステロール血症の診断を行う際に、 低密度リポ蛋白中コ レステロールの濃度が重要視されている。

従来、 この種の低密度リポ蛋白中コレステロールの定量方法は、 超遠 心法を用いた分画操作によって行われていた。 しかし、 この方法では、 特殊な装置を必要とし、 さらに測定に長時間を要するという問題がある, 超遠心を行わない定量方法としては、 被検試料中の全コレステロール 高密度リポ蛋白中のコレステロール、 およびトリダリセリ ドの濃度をそ れぞれ求め、 F r i e d ewa l dの式から低密度リポ蛋白中のコレステロールの 濃度を算出する方法が一般的である。 しかし、 この方法では、 トリダリ セリ ド値が高い被検試料を用いた場合、 再現性および正確性の点で信頼 性が低いという問題がある。

さらに近年、 ト リグリセリ ド値を必要としない、 低密度リポ蛋白中の コレステロールの定量方法が提案されている。

その第一は、 α —シクロデキス トリ ン硫酸、 デキス トラン硫酸、 マグ ネシゥムイオン、 およびポリオキシエチレン—ポリオキシプロピレンブ ロックコポリエーテル存在下において、 低密度リポ蛋白中のコレステロ ールのみを酵素によって酸化し、 色素の発色度合いから低密度リポ蛋白 _n 中のコレステロール濃度を定量するものである （Clinical Chemistry第 44巻 （ 1 9 9 8年） 第 5 2 2頁参照） 。 この方法は、 α—シクロデキ ス トリン硫酸、 デキス トラン硫酸、 およびマグネシウムイオンによって、 被検試料中のカイ口ミクロン中のコレステロール、 および超低密度リポ 蛋白中のコレステロールに対する酵素の反応性を減少させ、 さらに、 ポ リオキシエチレン一ポリオキシプロピレンブロックコポリエ一テルによ つて、 被検試料中の高密度リポ蛋白中のコレステロールに対する酵素の 反応性を減少させる。

第二は、 両性界面活性剤およびカルボキシル基またはスルホン酸基を 有する脂肪族アミン類の存在下において、 低密度リポ蛋白中のコレステ ロールのみを酵素によって酸化し、 色素の発色度合いから低密度リボ蛋 白中のコレステロール濃度を定量するものである （特開平 1 0— 8 4 9 9 7号公報参照） 。 この方法は、 両性界面活性剤存在下において、 低密 度リポ蛋白以外のリポ蛋白に含まれるコレステロールに対する酵素の反 応性を減少させる。

第三は、 被検試料をポリカチオンにより処理することによって、 低密 度リポ蛋白中のコレステロールのみを酵素によって酸化し、 色素の発色 度合いから低密度リポ蛋白中のコレステロール濃度を定量するものであ る （米国特許第 4， 1 8 5， 9 6 3号参照） 。

第四は、 高密度リポ蛋白を多孔性のシリカによって吸着し、 さらに、 ポリァニオン Ζ二価カチオンによって、 カイロミクロンおよび超低密度 リポ蛋白と不溶性の複合体を形成させ、 この複合体を沈殿として溶液中 から除去した後、 低密度リポ蛋白中のコレステロールのみを酵素によつ て酸化し、 色素の発色度合いから低密度リポ蛋白中のコレステロール濃 度を定量するものである （米国特許第 5 , 4 0 1 , 4 6 6号参照） 。 上記第一から第四の方法により、 トリグリセリ ド値が高い被検試料を _n 用いた場合においても、 再現性および正確性良く測定することができる _c しかし、 上記の第一から第四の方法は、 いずれも色素の発色度合いか らコレステロール値を定量するため、 初めから着色している血液が被検 試料である場合、 定量が不可能である。 また、 再現性および正確性良く 測定するためには、 被検試料に対して、 酵素を含まない第一試薬と、 酵 素を含む第二試薬をそれぞれ用意し、 まず被検試料に第一試薬を添加し 十分に反応が進行した後、 第二試薬を添加しなければならず、 操作が煩 雑であるという問題がある。 発明の開示

本発明は、 前記従来の問題に鑑みてなされたものであり、 その目的は. 血液が被検試料である場合にも測定が可能であり、 2種類以上の試薬類 をそれぞれ別々のタイミングで被検試料に添加することをせず、 被検試 料を一度供給するだけで、 低密度リポ蛋白中のコレステロールを再現性 よく、 正確に定量することができるセンサを提供することである。

本発明は、 そのような低密度リポ蛋白中のコレステロールを定量する 方法を提供することをも目的とする。

本発明は、 絶縁性の基板、 前記基板上に形成された作用極と対極を含 む電極系、 前記電極系を含む前記基板上に形成された酵素層、 および前 記電極系への試料液供給経路において前記酵素層より上流側に形成され た試薬層を具備し、 前記酵素層は少なく とも酸化還元酵素および電子伝 達体を含み、 かつ前記試薬層は、 低密度リポ蛋白を除く リポ蛋白と結合 して水溶性の複合体を形成する試薬を含む、 低密度リポ蛋白中のコレス テロールを定量するためのコレステロールセンサに関する。

本発明は、 また、 絶縁性の基板、 前記基板上に形成された作用極と対 極を含む電極系、 前記電極系を含む前記基板上に形成された酵素層、 前 _t 記電極系への試料液供給経路において前記酵素層より上流側に形成され たフィルター、 および前記フィルターに担持されるか前記試料液供給経 路においてフィルターより上流側に形成された試薬層を具備し、 前記酵 素層は少なく とも酸化還元酵素および電子伝達体を含み、 かつ前記試薬 層は、 低密度リポ蛋白を除く リポ蛋白を吸着および/または凝集させる 機能を有する試薬を含むコレステロールセンサを提供する。

本発明は、 （ a ) 被検試料を下記 （ i ) 、 （i i) および （i i i) からな る群より選択されるいずれかの試薬または試薬群と反応させる工程、 ( i ) α—シクロデキス トリ ン硫酸、 デキス トラン硫酸、 マグネシウム イオン、 およびポリオキシエチレン—ポリオキシプロピレンブロックコ ポリエーテル、

(i i) 両性界面活性剤およびカルボキシル基またはスルホン酸基を有す る脂肪族ァミン類、

(ii i) ポリカチオン、

( b ) 次いで、 前記被検試料をコレステロールと特異的に反応する酸 化還元酵素および電子伝達体と反応させる工程、 および

( c ) 前記工程 （b ) によって還元された前記電子伝達体を電気化学 的に酸化して酸化電流値を得る工程

を有する低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法を提供する。 さらに、 本発明は、 （ a ) 被検試料を、 ポリア二オン、 二価カチオン、 および高密度リポ蛋白に対する抗体またはシリ力と反応させる工程、

( b ) 次いで、 前記被検試料をコレステロールと特異的に反応する酸化 還元酵素および電子伝達体と反応させる工程、 および

( c ) 前記工程 （ b ) によって還元された前記電子伝達体を電気化学的 に酸化して酸化電流値を得る工程

を有する低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法を提供する。 図面の簡単な説明

図 1 は本発明によりコレステロール濃度を定量する際の反応原理を説 明するためのフローチャートである。

図 2は本発明の実施の形態 1 におけるコレステロールセンサの概略縦 断面図である。

図 3は同センサの分解斜視図である。

図 4は実施の形態 2におけるコレステロールセンサの分解斜視図であ る。 発明を実施するための最良の形態

本発明による低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法は、 ( a ) 被検試料を特定の試薬と反応させる工程、

( b ) 次いで、 前記被検試料をコレステロールと特異的に反応する酸 化還元酵素および電子伝達体と反応させる工程、 および

( c ) 前記工程 （ b ) によって還元された前記電子伝達体を電気化学 的に酸化して酸化電流値を得る工程

を有し、 前記酸化電流値からコレステロールを定量する。

まず、 工程 （ a ) について説明する。 工程 （ a ) においては、 被検試 料中に含まれるリポ蛋白のうち、 低密度リポ蛋白を除く リポ蛋白を特定 試薬と反応させることにより、 低密度リポ蛋白を除く リポ蛋白中のコレ ステロールが酵素との反応に関与することを抑制する。 ここでいぅ被検 試料とは、 広く高密度リポ蛋白、 低密度リポ蛋白、 超低密度リポ蛋白お よびカイロミクロンを含みうるもので、 例えば血液、 血清、 血漿などを いう。

本発明は、 吸光度によらず電気化学的な手法によってコレステロール , を測定するから、 被検試料が血液や、 濁りのある血清または血漿でも、 低密度リポ蛋白中のコレステロールを定量することができる。

上記の工程 （ a) は、 被検試料中に含まれる低密度リポ蛋白を除く リ ポ蛋白と特定の試薬を結合させて水溶性の複合体を形成させ、 低密度リ ポ蛋白を除く リポ蛋白中のコレステロールと酵素との反応性を低下させ る工程 （ a— 1 ) 、 または被検試料中に含まれる低密度リポ蛋白を除く リポ蛋白を特定の試薬に吸着および Zまたは凝集させることにより除去 する工程 （ a— 2 ) である。

まず、 工程 （ a— 1 ) について説明する。

この工程においては、 下記 （ i ) 、 （ii) および （iii) からなる群よ り選択されるいずれかの試薬または試薬群を用いる。

( i ) ひ —シクロデキス トリン硫酸、 デキス トラン硫酸、 マグネシウム イオン、 およびポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレンブロックコ ポリエーテル、

(ii) 両性界面活性剤およびカルボキシル基またはスルホン酸基を有す る脂肪族アミン類、

(iii) ポリカチオン。

試薬として、 ポリカチオンを用いる場合、 弱イオン交換体の存在下に おいて、 被検試料とポリカチオンを反応させることが好ましい。 弱ィォ ン交換体が存在すると、 これが試料中の中性脂質を吸着するので、 中性 脂質が電極表面に吸着して電極反応を阻害するのを抑制することができ る。

ここで、 両性界面活性剤としては、 ラウリルべタイン、 ヤシ油脂肪酸 アミ ドプロピルべ夕イン、 ラウリ ン酸アミ ドプロピルべ夕イン、 2—ァ ルキルー N—カルボキシメチルー N—ヒ ドロキシェチルイミダゾリニゥ ムべタイン、 2—アルキル一 N—カルボキシェチルー N—ヒ ドロキシェ チルイミダゾリニゥムベタインなどが用いられる。

カルボキシル基またはスルホン酸基を含む脂肪族アミン類としては、 ァラニン、 グルタミン、 グルタミン酸、 N— （ 2 —ァセトアミ ド） — 2 —アミノエタンスルホン酸、 N, N—ビス （ 2 —ヒ ドロキシェチル） 一 2—アミノエタンスルホン酸、 N—シクロへキシル一 2—アミノエタン スルホン酸、 2 _ { 4 — ( 2—ヒ ドロキシェチル） 一 1 ーピペラジニ ル} エタンスルホン酸、 2 —モルホリ ノエ夕ンスルホン酸、 ピぺラジン 一 1 ， 4 —ビス （ 2 —エタンスルホン酸） 、 N— トリス （ヒ ドロキシメ チル） メチルー 2 _アミノエ夕ンスルホン酸、 N—シクロへキシルー 3 —ァミノプロパンスルホン酸、 N—シクロへキシルー 2 ーヒ ドロキシ— 3 —ァミノプロパンスルホン酸、 3 _ { N, N—ビス （ 2—ヒ ドロキシ ェチル） アミノ } _ 2—ヒ ドロキシプロパンスルホン酸、 3 — { 4 - ( 2 —ヒ ドロキシェチル） 一 1 ーピペラジニル } プロパンスルホン酸、 2 —ヒ ドロキシー 3 — { 4 — ( 2 —ヒ ドロキシェチル） 一 1 —ピペラジ 二ル} プロパンスルホン酸、 3 —モルホリ ノプロパンスルホン酸、 2 — ヒ ドロキシー 3 —モルホリ ノプロパンスルホン酸、 ピぺラジン一 1 ， 4 一ビス （ 2 —ヒ ドロキシ— 3 —プロパンスルホン酸） 、 N— トリス （ヒ ドロキシメチル） メチル— 3 —ァミノプロパンスルホン酸、 2—ヒ ドロ キシ— N— トリス （ヒ ドロキシメチル） メチルー 3—ァミノプロパンス ルホン酸、 N— ( 2 —ァセ トアミ ド） イミノニ酢酸、 N, N—ビス ( 2 —ヒ ドロキシェチル） グリシン、 N— { トリス （ヒ ドロキシメチル） メ チル } グリシンなどが用いられる。

前記ポリカチオンは、 反応性の調節が容易であることから、 ァシル化 またはアルキル化ポリカチオンであることが好ましい。

工程 （ a — l ) において、 被検試料中に含まれる低密度リボ蛋白を除 く リポ蛋白が試薬と結合して水溶性の複合体を形成することにより、 低 密度リポ蛋白を除く リポ蛋白中のコレステロールと酸化還元酵素との反 応性が低下する。 このため、 次の工程 （ b ) において、 酸化還元酵素と の反応に関与するコレステロールを、 低密度リポ蛋白中コレステロール のみとすることができる。

次に、 工程 （ a— 2 ) について説明する。

工程 （ a— 2 ) においては、 被検試料中に含まれる低密度リポ蛋白を 除く リポ蛋白を試薬に吸着させる、 および Zまたは試薬を用いて凝集さ せることにより、 除去する。

この工程においては、 試薬として、 高密度リポ蛋白に対する抗体また はシリカと、 ポリア二オンと、 二価カチオンとを用いる。 高密度リポ蛋 白には、 アポ蛋白質である Apo A- 1および Apo A- I Iが特有に含まれるので 高密度リポ蛋白に対する抗体として、 Apo A- Iまたは Apo A- I Iに対する抗 体があげられる。 この場合、 高密度リポ蛋白に対する抗体により、 被検 試料中の高密度リポ蛋白が凝集する。 一方、 ポリア二オンおよび二価力 チオンの作用により、 被検試料中の超低密度リポ蛋白およびカイロミク ロンが凝集する。 このようにして、 被検試料から高密度リポ蛋白、 超低 密度リポ蛋白およびカイロミクロンを分離 · 除去することができる。

また、 高密度リポ蛋白を除くための試薬として、 シリカを用いる場合 は、 被検試料中の高密度リポ蛋白がシリカに吸着して分離 ， 除去される。 工程 （ a— 2 ) において、 凝集した高密度リポ蛋白、 超低密度リポ蛋 白およびカイロミクロンを被検試料から分離 · 除去するには、 フィルタ —等の濾過手段を用いるのがよい。

ここに用いるポリア二オンは、 酵素反応を阻害しないという観点から、 デキス トラン硫酸、 へパリン、 ホスホタングステン酸、 ポリ ビニル硫酸 のいずれかであることが好ましい。

また、 前記二価カチオンは、 酵素反応を阻害しないという観点から、 カルシウムイオン、 マンガンイオン、 マグネシウムイオンのいずれかで あることが好ましい。

工程 （ a— 2 ) において、 被検試料中に含まれる低密度リポ蛋白を除 く リポ蛋白が試薬に吸着し、 および Zまたは凝集することにより除去さ れるため、 次の工程 （ b ) において酵素との反応に関与するコレステロ ールを、 低密度リポ蛋白中のコレステロールのみとすることができる。 次に、 工程 （ b ) について説明する。

工程 （ b ) においては、 被検試料中の低密度リポ蛋白のみに含まれる コレステロールが、 コレステロールと特異的に反応する酸化還元酵素に より酸化され、 これに伴い電子伝達体は還元される。

ここで用いる酸化還元酵素および電子伝達体は、 コレステロールの電 気化学的な定量法に用いられている従来公知のものが用いられる。

次に、 工程 （ c ) について説明する。

工程 （ c ) においては、 工程 （ b ) において還元された前記電子伝達 体を電気化学的に酸化して酸化電流値を得る。 そして、 この酸化電流値 より、 低密度リポ蛋白中のコレステロールの濃度を求める。

本発明は、 電気化学的にコレステロール値を定量するので、 初めから 着色している血液が被検試料であっても測定可能である。

ここで、 図 1 を用いて、 本発明によりコレステロール濃度を定量する 際の反応原理を説明する。

被検試料に含まれるリポ蛋白中のコレステロールの多くは、 脂肪酸と エステル結合したコレステロールエステルとして存在している。 そこで まず、 コレステロールエステラーゼ 4によって、 コレステロールエステ ル 1 を脱エステル化してコレステロール 2 とする （過程 I ) 。

次に、 酸化還元酵素 5によって、 コレステロール 2を酸化し、 酸化さ れたコレステロール 3を生成させる （過程 I I ) 。 この酸化反応は、 同時 _{{ Q} に電子伝達体 （酸化型） 6の還元を伴う （過程 I I I ) 。

次いで、 作用極 8 と対極 9の間に作用極が正となる電圧を印加するこ とによって、 作用極 8上で電子伝達体 （還元型） 7が酸化される （過程 I V) 。 このときに流れる電流値は、 電子伝達体 （還元型） 7 の濃度に依 存し、 さらに、 電子伝達体 （還元型） 7の濃度は、 コレステロール 2の 濃度に依存する。 したがって、 コレステロール 2の濃度を知るためには. 作用極 8 と対極 9の間に流れる電流量を測定すればよい。

以下に、 図面を用いて低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する センサおよび定量方法を説明する。 実施の形態 1

図 2は本発明によるセンサの概略断面図、 図 3はその分解斜視図であ る。 1 1はポリエチレンテレフタレートからなる電気絶縁性の基板を表 す。 この基板 1 1上に、 銀ペース トをスクリーン印刷し、 加熱乾燥する ことにより 2つの電極の下地とそれらに連なるリード 1 2 、 1 3を形成 してある。 次に炭素ペース トをスクリーン印刷することにより作用極 1 4および対極 1 5が形成されている。 基板上には、 スクリーン印刷に より絶縁層 1 6が形成されており、 この絶縁層により電極系の露出部分 が規定されている。

作用極および対極からなる電極系を覆うように水溶性高分子の一種で あるカルボキシメチルセルロースのナトリウム塩を含むインクをスク リ ーン印刷により印刷し、 5 0 で 1 5分間乾燥することにより水溶性高 分子層 2 1が形成されている。 次に、 コレステロールォキシダ一ゼ、 コ レステロールエステラーゼ、 およびフェリシアン化カリウムの混合水溶 液を、 水溶性高分子層 2 1 を覆うように滴下して、 5 0 °Cで 1 5分間乾 燥することにより酵素層 2 2が形成されている。 なお、 電子メデイエ一夕としては、 パラペンゾキノンおよびその誘導 体、 フエナジンメ トサルフェート、 メチレンブル一、 フエ口センおよび その誘導体のいずれかを用いることができる。

一方、 空気孔 2 0を有するカバー 1 9 と、 スリ ツ 卜 1 8を有するスぺ ーサ 1 7を貼り合わせ、 スぺ一サのスリ ツ ト 1 8に形成される凹部に、 _α—シクロデキス トリ ン硫酸、 デキス トラン硫酸、 マグネシウムイオン. およびポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレンブロックコポリエ一 テルの混合水溶液を滴下した後、 乾燥して試薬層 2 3が形成されている, この試薬層 2 3は、 電極系への試料液供給路において、 酵素層より上流 側に形成される。

上記の水溶性高分子層 2 1および酵素層 2 2を形成した基板 1 1 と、 試薬層 2 3を形成したカバ一 1 9 とスぺーサ 1 7からなるカバー部材と を接着して、 バイオセンサが組み立てられる。 このバイオセンサは、 ス ぺーサ 1 7のスリ ッ ト 1 8の部分に形成される中空部が試料液供給路を 形成している。 そして、 この試料液供給路の開口部となるスリ ッ ト 1 8 の開放端 1 8 aの部分が試料供給口となる。

この試料供給口に血液等の試料を接触させると、 試料は、 試料液供給 路の毛管現象により空気孔 2 0側に吸い込まれる。

試薬層 2 3を形成した位置に、 ガラスフィル夕一等の担体を固定して その担体中または担体表面に上記の試薬の水溶液を滴下し、 乾燥するこ とにより試薬を担持させてもよい。 そのような担体としては、 濾紙、 ガ ラスフィル夕一、 薄層クロマト担体、 セルロース繊維、 高分子化合物か らなる繊維シート、 紙、 コルク等を用いることができる。 これらのなか で、 酸化還元酵素の吸着が少ないという理由から、 ガラスフィルターま たはセルロース繊維が好ましい。

電子メデイエ一夕および酸化還元酵素のうち、 少なく ともいずれか一 ₂ 方が界面活性剤とともに担持されていると、 溶解性が向上するので、 反 応時間の短縮を図ることができる。

水溶性高分子層、 酵素層、 および試薬層のうち、 少なく ともいずれか 一つの層を凍結乾燥によって形成すると、 溶解性が向上するため、 反応 時間を短縮することができる。 特に、 図示のように、 試料液供給路内を 塞ぐように試薬層を形成するときは、 凍結乾燥によって、 多孔性の層と して形成するのが好ましい。 試料液を試薬層に接すると容易に試料液を 溶解して吸収するからである。

次に、 このバイオセンサを用いたときの、 血液中の低密度リポ蛋白中 コレステロール濃度の測定例を説明する。 まず、 被検試料である血液を 試料供給孔に供給する。 血液と接触した試薬層がまず溶解し、 次に酵素 層、 および水溶性高分子層が溶解する。 すると、 試薬層中のひーシクロ デキス トリン硫酸、 デキス トラン硫酸、 およびマグネシウムイオンの協 働作用によって、 血液中の超低密度リポ蛋白、 およびカイロミクロンが 水溶性の複合体を形成し、 ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン ブロックコポリエ一テルの作用によって、 血液中の高密度リポ蛋白が水 溶性の複合体を形成する。 これにより、 低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白 のコレステロールと、 酵素との反応性が低下する。

ここで、 酵素であるコレステロールエステラーゼ、 およびコレステロ ールォキシダーゼを作用させると、 低密度リポ蛋白中のコレステロール のみが酵素による触媒反応を受けるので、 低密度リポ蛋白中コレステロ ールの濃度を測定することができる。 具体的には、 図 3の反応原理に基 づき、 酵素層中のコレステロールエステラーゼによって、 低密度リポ蛋 白中のエステル型コレステロールが、 遊離型のコレステロールに変換さ れる。 そして、 コレステロールエステラーゼによって生じた遊離型コレ ステロールと、 元々低密度リポ蛋白中に存在していた遊離型のコレステ ロールが、 コレステロールォキシダ一ゼの作用によって、 酸化される。 そのとき同時に、 酵素層中のフェリシアン化カリウムが還元されて、 フ エロシアン化力リゥムが生成する。 血液を供給してから一定時間後に、 作用極と対極との間に作用極を正にして、 例えば 5 0 0 m Vの電圧を 5 秒間印加し、 5秒後の電流値を測定する。 この電流値を応答値とする。 本実施の形態 1 によれば、 色素の発色度合いから測定を行わないので. 血液のように初めから着色している被検試料であっても、 コレステロ一 ルを定量できるという利点がある。 また、 試薬層 2 3が酵素層 2 2から 空間的に分離して形成されているので、 被検試料を試薬層 2 3に供給す ると、 被検試料は試薬層 2 3中の試薬と反応した後、 次に酵素層 2 2に 到達して酵素層 2 2中の酸化還元酵素および電子伝達体等と反応する。 このため、 被検試料を一度供給するだけで、 複数の試薬を各々異なる夕 ィミングで被検試料に添加するという煩雑な操作を行うことなく、 被検 試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロール濃度を再現性および正確性 良く定量することができる。

本実施の形態 1 において、 試薬層 2 3に含まれる試薬として、 α —シ クロデキス トリン硫酸、 デキス トラン硫酸、 マグネシウムイオンおよび ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレンブロックコポリエ一テルの 組み合わせを用いたが、 これらに代えて、 両性界面活性剤およびカルボ キシル基またはスルホン酸基を有する脂肪族アミン類を用いてもよい。 また、 別の例として、 試薬は、 ポリカチオンであってもよい。 ポリカチ オンに加え、 さらに弱イオン交換体を含ませることが好ましい。 ここで, 前記ポリカチオンは、 ァシル化またはアルキル化ボリカチオンであるこ とが好ましい。 前記ポリカチオンとしては、 ポリエチレンィミンが好ま しく用いられる。

試薬層 2 3には ρ Η緩衝剤を添加してもよい。 ρ Η緩衝剤としては、 _{( 4}

3 —モルホリノプロパンスルホン酸、 2— { 4 - ( 2 —ヒ ドロキシェチ ル） — 1 —ピペラジニル } エタンスルホン酸、 2—モルホリノエ夕ンス ルホン酸、 ピぺラジン一 1 , 4 一ビス （ 2 —エタンスルホン酸） などの グッ ド緩衝液、 リ ン酸緩衝液などが用いられる。 実施の形態 2

図 4は本実施の形態 2におけるコレステロールセンサの分解斜視図で ある。 実施の形態 1 との相違点の 1つは、 ガラスフィル夕一からなるフ ィルターを設けたことである。

実施の形態 1 と同様に、 作用極 1 4と対極 1 5からなる電極系上に、 水溶性高分子層 2 1および酵素層 2 2を形成した基板 1 1 を用いる。 こ の基板 1 1上に方形の透孔 3 8を有するスぺ一サ 3 7、 空気孔 4 0およ び試料供給口 4 1 を設けたカバー 3 9、 並びにフィルター 4 3を組み合 わせてセンサが完成する。

フィル夕一 4 3は、 スぺーサ 3 7の透孔 3 8のところに形成される試 料液供給路において、 酵素層 2 2より上流側に納められ、 試料供給口 4 1から供給される試料液を吸収し、 これを毛管現象により試料液供給 路内を電極系側へ供給する。 フィルター 4 3には、 高密度リポ蛋白に対 する抗体、 ポリア二オンであるデキス トラン硫酸、 およびカルシウムィ オンが含浸されている。

フィルタ一としては、 濾紙、 セルロース繊維、 高分子化合物からなる 繊維シート、 メンブランフィルタ一、 メッシュ、 綿等を用いることがで きる。 フィル夕一の孔径は、 0 . 0 5〜 0 . 5 mのものが好ましい。 次に、 このセンサを用いて血液中の低密度リポ蛋白中コレステロール 濃度を測定する方法を説明する。

まず、 被検試料である血液を試料供給口 4 1からフィルター 4 3上に _{{ 5} 供給する。 血液は、 フィルター 4 3によって血球が濾過され、 血漿成分 が空気孔 4 0側に進行する。 同時に、 フィルター内の高密度リポ蛋白に 対する抗体によって、 血液中の高密度リボ蛋白が凝集する。 凝集したリ ポ蛋白は、 フィルターの網目に引つかかり、 酵素層 2 2まで到達しない, また、 血液中のカイロミクロン、 および超低密度リボ蛋白は、 フィル夕 —内のデキス トラン硫酸、 およびカルシウムイオンによって凝集する。 凝集したリポ蛋白は、 フィル夕一の網目に引つかかり、 酵素層まで到達 しない。 そのため、 酵素層まで到達した血漿成分には、 リポ蛋白のうち 低密度リポ蛋白のみが含まれる。

酵素層 2 2においては、 酵素であるコレステロールエステラーゼ、 お よびコレステロールォキシダーゼが低密度リポ蛋白に作用し、 低密度リ ポ蛋白中のコレステロールが酵素による触媒反応を受ける。 こうして、 実施の形態 1 と同様、 低密度リポ蛋白中のコレステロール濃度を測定す ることができる。

上記において、 高密度リポ蛋白を凝集させる試薬として用いた高密度 リポ蛋白に対する抗体の代わりに、 高密度リポ蛋白を吸着するシリカを 用いてもよい。 シリカは、 被検試料中の高密度リポ蛋白を吸着するので 高密度リポ蛋白は酵素層まで到達しない。 酵素層まで到達した成分には リポ蛋白のうち、 低密度リポ蛋白のみが含まれる。 なお、 フィルター 4 3には p H緩衝剤を添加してもよい。

本実施の形態 2 によれば、 実施の形態 1 と同様に、 色素の発色度合い から測定を行わないので、 血液のように初めから着色している被検試料 であっても、 コレステロールを定量できる。 また、 試薬は、 フィルター 4 3に担持され、 酵素層 2 2 とは空間的に分離して形成されているので. 被検試料をフィルター上に供給すると、 被検試料はフィル夕一中の試薬 と反応し、 フィルターを通過した後、 酵素層 2 2 に到達して酵素層中の 1 D 酸化還元酵素および電子伝達体等と反応する。 このため、 被検試料を一 度供給するだけで、 複数の試薬を各々異なる夕イミングで被検試料に添 加するという煩雑な操作を行うことなく、 被検試料中の低密度リポ蛋白 中のコレステロール濃度を再現性および正確性良く定量することができ る。

図示の例では、 フィルター 4 3に試薬を担持させたが、 フィルターと 試薬とを別々に設置してもよい。 例えば、 膜状のフィルターを酵素層 2 2の上に形成し、 フィルター 4 3の位置に試薬層を形成するか試薬を 担持した担体を設置する。 フィルターと試薬を分離するときは、 電極系 への試料液供給路において試薬をフィルターより上流に設置する。

上記の例では、 フィルター 4 3に含ませる試薬のポリア二オンとして デキス トラン硫酸を用いているが、 これに代えて、 へパリ ン、 ホスホ夕 ングステン酸、 またはポリ ビニル硫酸などを用いてもよい。 また、 二価 カチオンとしてカルシウムイオンを用いているが、 これに代えて、 マン ガンイオン、 またはマグネシウムイオンなどを用いてもよい。

フィルター 4 3に含ませる試薬として、 高密度リポ蛋白に対する抗体 ポリア二オン、 および二価カチオンの組み合わせを用いたが、 これらに 代えて、 シリカ、 ポリア二オン、 および二価カチオンの組み合わせを用 いてもよい。 この場合、 被検試料がフィルター 4 3に接触すると、 被検 試料中の高密度リポ蛋白がシリカに吸着し、 酵素層 2 2まで到達しない, また、 被検試料中の超低密度リポ蛋白およびカイロミクロンは、 前記と 同様に凝集し、 フィルター 4 3によって濾過されるので、 酵素層 2 2 ま で到達しない。

実施の形態 1および 2において、 基板 1 1 としてポリエチレンテレフ 夕レートを用いたが、 基板 1 1 の材質は、 電気絶縁性を有し、 ある程度 の剛性を有していれば特に制限はない。 例えば、 ボリエチレン、 ポリス 了 チレン、 ボリ塩化ビニル、 ポリアミ ド、 飽和ポリエステルなどの熱可塑 性樹脂、 尿素樹脂、 メラミン樹脂、 フエノール樹脂、 エポキシ樹脂、 不 飽和ボリエステル樹脂などの熱硬化性樹脂などを用いることができる。 電極は、 炭素べ一ス トを基板 1 1上にスクリーン印刷する方法により 形成したが、 パラジウムなどの金属を基板 1 1上に蒸着、 またはスパッ 夕して形成してもよい。

上記の例では、 酸化還元酵素としてコレステロールォキシダ一ゼとコ レステロールエステラーゼ、 電子伝達体としてフェリシアン化カリウム を用いたが、 これらは、 従来公知のものを特に制限なく用いることがで きる。 酸化還元酵素として、 例えばコレステロールォキシダ一ゼの代わ りにコレステロールデヒ ドロゲナ一ゼなどを用いてもよく、 また電子伝 達体として、 例えばパラベンゾキノンなどを用いてもよい。

酵素層 2 2にはコレステロールエステラーゼを含むことが好ましい。 また、 酵素層 2 2には、 リポ蛋白中のコレステロールの溶解を容易にす るために、 界面活性剤を添加してもよい。

電極系の上部には、 電極を保護するための水溶性高分子層を設けたが これは必須のものではない。

実施の形態 1 における試薬層 2 3および実施の形態 2において試薬を フィルタ一 4 3 と分離する場合においては、 試薬を担持させた担体を用 いることが好ましい。 これにより、 被検試料が試薬層を通過する時間が 長くなるので、 被検試料が酵素層 2 2に到達するまでに、 被検試料に含 まれる低密度リポ蛋白を除く リポ蛋白と試薬層中の試薬との反応を十分 に進行させることができる。 そのような担体としては、 試薬成分を内部 に担持可能であるものならば特に限定されないが、 例えばガラスフィル 夕一、 濾紙、 メンブランフィル夕一、 メッシュ、 綿などがあげられる。 このとき、 担持させる試薬は、 乾燥させた固体状態であっても溶液状態 1 o またはゲル状態であってもよい。 産業上の利用の可能性

本発明によれば、 色素の発色度合いから測定しないので、 血液のよう に初めから着色している被検試料であっても、 低密度リポ蛋白に含まれ るコレステロールを定量することができる。 また、 一度の被検試料の供 給により、 低密度リポ蛋白に含まれるコレステロールを再現性および正 確性良く定量することができる。 本発明は、 煩雑な操作を必要としない ため、 家庭用の低密度リポ蛋白中コレステロール測定キッ 卜に適してい る。

Claims

3冃

1 . 絶縁性の基板、 前記基板上に形成された少なく とも作用極と対極を 含む電極系、 前記電極系を含む前記基板上に形成された酵素層、 および 前記電極系への試料液供給経路において前記酵素層より上流側に形成さ れた試薬層を具備し、 前記酵素層は少なく とも酸化還元酵素および電子 伝達体を含み、 かつ前記試薬層は、 低密度リポ蛋白を除く リポ蛋白と結 求

合して水溶性の複合体を形成する試薬を含むことを特徴とする低密度リ の

ポ蛋白中のコレステロールを定量するためのコレステロールセンサ。

2 . 前記試薬層が、 α—シクロデキス トリ ン硫酸、 デキス トラン硫酸、 マグネシウムイオン、 およびポリォキシエチ囲レン一ポリオキシプロピレ ンブロックコポリエーテルを含む請求の範囲第 1項記載のコレステロ一 ルセンサ。

3 . 前記試薬層が、 両性界面活性剤およびカルボキシル基またはスルホ ン酸基を有する脂肪族アミン類を含む請求の範囲第 1項記載のコレステ ロールセンサ。

4 . 前記試薬層が、 ポリカチオンを含む請求の範囲第 1項記載のコレス テロールセンサ。

5 . 絶縁性の基板、 前記基板上に形成された少なく とも作用極と対極を 含む電極系、 前記電極系を含む前記基板上に形成された酵素層、 前記電 極系への試料液供給経路において前記酵素層より上流側に形成されたフ ィルター、 および前記フィルターに担持されるか前記試料液供給経路に おいてフィルターより上流側に形成された試薬層を具備し、 前記酵素層 は少なく とも酸化還元酵素および電子伝達体を含み、 かつ前記試薬層は. 低密度リポ蛋白を除く リポ蛋白を吸着および Ζまたは凝集させる機能を 有する試薬を含むことを特徴とする低密度リポ蛋白中のコレステロール を定量するためのコレステロールセンサ。

6. 前記試薬層が、 ポリア二オン、 二価カチオン、 および高密度リボ蛋 白に対する抗体またはシリ力を含む請求の範囲第 5項記載のコレステロ ールセンサ。

7. ( a) 被検試料を下記 （ i ) 、 （ii) および （iii) からなる群より 選択されるいずれかの試薬または試薬群と反応させる工程、

( i ) α—シクロデキス トリ ン硫酸、 デキス トラン硫酸、 マグネシウム イオン、 およびポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレンブロックコ ポリエーテル、

(ii) 両性界面活性剤およびカルボキシル基またはスルホン酸基を有す る脂肪族アミン類、

(iii) ポリカチオン、

(b) 次いで、 前記被検試料をコレステロールと特異的に反応する酸 化還元酵素および電子伝達体と反応させる工程、 および

( c ) 前記工程 （b) によって還元された前記電子伝達体を電気化学 的に酸化して酸化電流値を得る工程

を有する低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法。

8. ( a) 被検試料を、 ポリア二オン、 二価カチオン、 および高密度リ ポ蛋白に対する抗体またはシリカと反応させる工程、

(b) 次いで、 前記被検試料をコレステロールと特異的に反応する酸化 還元酵素および電子伝達体と反応させる工程、 および

( c ) 前記工程 （ b) によって還元された前記電子伝達体を電気化学的 に酸化して酸化電流値を得る工程

を有する低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法。