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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberWO2000052512 A1
Publication typeApplication
Application numberPCT/EP2000/001806
Publication date8 Sep 2000
Filing date2 Mar 2000
Priority date2 Mar 1999
Also published asDE19908883A1, EP1157297A1, EP1157297B1, US6909105
Publication numberPCT/2000/1806, PCT/EP/0/001806, PCT/EP/0/01806, PCT/EP/2000/001806, PCT/EP/2000/01806, PCT/EP0/001806, PCT/EP0/01806, PCT/EP0001806, PCT/EP001806, PCT/EP2000/001806, PCT/EP2000/01806, PCT/EP2000001806, PCT/EP200001806, WO 0052512 A1, WO 0052512A1, WO 2000/052512 A1, WO 2000052512 A1, WO 2000052512A1, WO-A1-0052512, WO-A1-2000052512, WO0052512 A1, WO0052512A1, WO2000/052512A1, WO2000052512 A1, WO2000052512A1
InventorsRainer Heintzmann, Christoph Cremer
ApplicantMax-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenscaften E.V.
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External Links: Patentscope, Espacenet
Method and device for representing an object
WO 2000052512 A1
Abstract
The invention relates to a method for obtaining an object image of at least one object (40), whereby at least two partial images of the object (40) are recorded under different conditions for each image. Said conditions take the form of spatial patterns on the object, whereby for each point on the object there is a non-linear dependency of the light which is detected from the direction of said object point on the object conditions which exist at said point on the object and whereby the partial images contain varying amounts of different space frequency components of the object structure. The desired object image is determined from the partial images by reconstructing the share of space frequency components. The invention also describes optical systems (100) for implementing such a method.
Claims  translated from German  (OCR text may contain errors)
Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Gewinnung einer Objektabbildung mindestens eines Objekts (40) , wobei mindestens zwei Teilbilder des Objekts (40) unter jeweils verschiedenen Objektbedingungen aufgenommen werden, die am Objekt mit räumlichen Mustern ausgebildet sind, wobei jeweils für einen Objektpunkt eine nichtlineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt her detektierten Lichtes von den am Objektpunkt gegebenen Objektbedingungen besteht und die Teilbilder unterschiedliche Beträge verschiedener Raumfrequenzanteile der Objektstruktur enthalten, und aus den Teilbildern durch Rekonstruktion der Raumfrequenzanteile die gewünschte Objektabbildung ermittelt wird. 1. A method for obtaining an object image at least one object (40), wherein at least two partial images of the object (40) taken under respectively different object conditions, which are formed on the object with spatial patterns, each for one object point a non-linear dependence of the from the object point is here detected light of the given object point on the object of use and the partial images contain varying amounts of different spatial frequency components of the object structure, and the desired object image is determined from the partial images by reconstructing the spatial frequency components.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem räumliche Muster mindestens einer Objektbedingung gebildet werden, für die jeweils die nicht-lineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt ausgehenden und detektierten Lichtes besteht. 2. The method according to claim 1, at least one object condition are formed in the spatial patterns, for each, the non-linear dependence of emanating from the object point and the detected light.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem räumliche Muster von mindestens zwei Objektbedingungen gebildet werden, für die eine Abhängigkeit des detektierten Lichtes von einer multi- plikativen Verknüpfung der Objekteigenschaften und eine lineare oder eine nicht-lineare Abhängigkeit des detektierten Lichtes von jeder der Objektbedingungen besteht. 3. The method of claim 1, are formed in the spatial pattern of at least two object conditions, for which there is a dependency of the detected light by a multi- plikativen linking of the object properties and a linear or non-linear dependency of the detected light of each of the object conditions ,
4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das räumliche Muster durch ein Muster einer Beleuchtungsintensität am Objekt (40) gegeben ist und das Objekt (40) mit dem Muster der Beleuchtungsintensität so beleuchtet wird, dass eine nicht-lineare Abhängigkeit der an einer Detek- toreinrichtung (60) erfassten, von einem Objektpunkt ausgehenden Lichtintensität zu der an diesem Objektpunkt gegebenen Beleuchtungsintensität besteht. 4. The method according to any one of the preceding claims, in which the spatial pattern is given by a pattern of an illumination intensity at the object (40) and the object (40) is illuminated with the pattern of the illumination intensity so that a non-linear dependence of on a Detek- gate means (60) detected, is emanating from an object point to the given light intensity at this object point illumination intensity.
5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die nicht-lineare Abhängigkeit des erfassten Lichts durch eine Sättigung von Fluoreszenzlicht von Fluorophoren unter intensiver Beleuchtung, eine Sättigung der Absorption von Beleuchtungslicht unter intensiver Beleuchtung, eine Abhängigkeit der Phase des emittierten oder gestreuten Lichtes von der im Objekt vorhandenen Beleuchtungsintensität, SHG- oder THG-Prozesse, eine Abhängigkeit der Lichteigenschaften der Ramanstreuung vom Wert einer oder mehrerer Objekteigenschaften, zeitlich kohärente Effekte an Atomen oder Molekülen im Objekt ( 0 ) , eine Mehrphotonenabsorption, CARS-Prozesse, eine stimulierte Emission, eine Besetzung langlebiger Zustände oder chemisch veränderter Zustände, strahlende oder strahlungslose Energietransferprozesse von Fluorophoren auf benachbarte Fluorophore, am Objektpunkt gegebene räumlich inhomogene elektrische oder magnetische Felder, am Objektpunkt gegebene Drucke, Scherkräfte oder 5. The method according to any one of the preceding claims, wherein the non-linear dependency of the detected light by a saturation of fluorescent light from fluorophores under intensive illumination, saturation of the absorption of illuminating light under intensive illumination, a dependency of the phase of the emitted or scattered light from existing in the object illumination intensity, SHG or THG processes, a dependency of the light properties of the Raman scattering from the value of one or more object properties, temporally coherent effects of atoms or molecules in the object (0), a multi-photon absorption, CARS processes, a stimulated emission, a population of long-lived states or chemically altered states, radiating or radiation-free energy transfer processes from fluorophores to adjacent fluorophores, given at the object point spatially inhomogeneous electric or magnetic fields, given at the object point pressures, shear forces or mechanische Spannungsverhältnisse, am Objektpunkt gegebene Temperaturen, am Objektpunkt gegebene chemische Verhältnisse und/oder zusätzliche Objektbestrahlungen mit elektromagnetischen Strahlen oder Schallwellen gebildet wird. mechanical stress conditions, given at the object point temperatures given at the object point chemical conditions and / or additional object irradiation with electromagnetic rays or formed sound waves.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das räumliche Muster einer Objektbedingung im reziproken Raum durch eine Anzahl von Punkten, die in einer, zwei oder drei Dimensionen verteilt sind, beschrieben oder annähernd beschrieben werden kann bzw. im Ortsraum räumlich periodisch oder näherungsweise periodisch in einen oder mehreren Dimensionen gebildet wird. 6. The method according to any one of the preceding claims, wherein the spatially periodic or the spatial pattern of an object condition in the reciprocal space by a number of points which can be described in one, two or three dimensions are dispersed, or approximately described or in the spatial domain is approximately is periodically formed in one or more dimensions.
7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem zur Einstellung verschiedener Objektbedingungen das Objekt und das räumliche Muster in einer oder mehreren Richtungen relativ zueinander verschoben werden. 7. The method according to any preceding claim, in which are shifted in one or more directions relative to each other for setting different object conditions the object and the spatial pattern.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem das Muster durch eine Maske oder durch Interferenz erzeugt wird und eine Verschiebung des Musters durch Verschiebung der Phase verschiedener Beugungsmaxima erzielt wird. 8. The method according to claim 7, wherein the pattern is generated by a mask or by interference and a displacement of the pattern by shifting the phase of different diffraction maxima is achieved.
9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Objektbedingungen entsprechend einer vorbestimmten zeitlichen Struktur verändert und die Teilbilder zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen werden. 9. The method according to any one of the preceding claims, in which the object conditions according to a predetermined temporal structure of modified and the partial images are taken at different times.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, bei dem zur Erzeugung verschiedener Objektbedingungen die Beleuchtungsintensität variiert wird. 10. The method of claim 9, wherein said different object conditions for generating the illumination intensity is varied.
11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Rekonstruktion der Objektabbildung aus den Teilbildern durch Lösung eines Gleichungssystems unter Berücksichtigung der nicht-linearen Abhängigkeiten oder durch eine iterative Verfahrensweise erfolgt. 11. The method according to any one of the preceding claims, in which the reconstruction of the object image from the partial images by solving a system of equations taking into account the non-linear dependencies or by an iterative procedure.
12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Position des Objekts oder eines oder mehrerer Teilobjekte des Objekts (40) ermittelt werden. 12. The method according to any one of the preceding claims, wherein the position of the object or of one or more partial objects of the object (40) are determined.
13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Rekonstruktion der Objektabbildung unter Berücksich- tigung einer vorbekannten Struktur des Objekts (40) oder von Teilen des Objekts (40) erfolgt. 13. The process is carried out according to one of the preceding claims, in which the reconstruction of the object image, taking into account a previously known structure of the object (40) or of parts of the object (40).
14. Optisches Abbildungssystem (100) mit einer Beleuchtungseinrichtung (10) und einer Detektoreinrichtung (60), die dazu eingerichtet sind, ein Objekt (40) zu beleuchten bzw. eine Abbildung des Objekts (40) oder von Teilen des Objekts (40) aufzunehmen, gekennzeichnet, durch mindestens einen Mustergenerator (20, 20', 20'') zur Erzeugung mindestens eines veränderlichen räumlichen Musters von Objektbedingungen am Objekt (40) , wobei die Beleuchtungseinrichtung (10) und/oder der Mustergenerator (20, 20', 20'') dazu eingerichtet sind, Objektbedingungen zu erzeugen, von denen das mit der Detektoreinrichtung (60) detektierbare Licht nicht-linear abhängig ist, und einen Bildgenerator (70) zur Rekonstruktion einer Objektabbildung aus Teilbildern, die mit der Detektoreinrichtung (60) aufgenommen worden sind. to illuminate or 14. An optical imaging system (100) having an illumination device (10) and a detector device (60) which are adapted to an object (40) to take a picture of the object (40) or of parts of the object (40) , characterized by at least a pattern generator (20, 20 ', 20' ') for generating at least one variable spatial pattern of object conditions at the object (40), wherein the illuminating means (10) and / or the pattern generator (20, 20', 20 '') are adapted to produce object conditions upon which the (with the detector device 60) detectable light is non-linearly dependent, and a image generator (70) for reconstructing an object image from partial images which have been taken with the detector device (60) are.
15. Optisches System gemäß Anspruch 14, bei dem der Mustergenerator (20, 20', 20'') eine Maske umfasst, mit der auf dem Objekt (40) ein räumliches Muster einer Beleuchtungsintensität gebildet werden kann. 15. An optical system according to claim 14, wherein the pattern generator (20, 20 ', 20' ') comprises a mask, a spatial pattern of an illumination intensity can be formed with the on the object (40).
16. Optisches System gemäß Anspruch 15, bei dem die Maske ein mehrdimensionales Beugungsgitter (22), ein Phasengitter, eine DMD-Einrichtung oder eine LCD-Matrix umfasst. 16. An optical system according to claim 15, wherein the mask comprises a multidimensional diffraction grating (22), a phase grating, a DMD device or an LCD matrix.
17. Vorrichtung gemäß Anspruch 15 oder 16, bei dem die Maske und die Probe (40) relativ zueinander verschiebbar und/oder drehbar angeordnet sind. 17. The apparatus according to claim 15 or 16, in which the mask and the sample (40) are arranged relative to each other and / or rotatable.
18. Optisches System gemäß Anspruch 14, bei dem der Mustergenerator (20, 20 ' , 20 ' ' ) eine Spiegelanordnung (23 - 27) umfasst, die zur Erzeugung eines Interferenzmusters auf dem Objekt (40) eingerichtet ist. 18. An optical system according to claim 14, wherein the pattern generator (20, 20 ', 20' ') a mirror arrangement (23-27) which is adapted to generate an interference pattern on the object (40).
19. Optisches System gemäß Anspruch 14, bei dem der Mustergenerator (20, 20 ' , 20 ' ' ) einen Einrichtung zur Einstellung vorbestimmter physikalischer oder chemischer Bedingungen am Objekt (40) entsprechend dem räumlichen Muster umfasst. 19. An optical system according to claim 14, wherein the pattern generator (20, 20 ', 20' ') comprises a means for setting predetermined physical or chemical conditions at the object (40) corresponding to the spatial pattern.
20. Optisches System gemäß Anspruch 14, bei dem eine Versteileinrichtung zu Verschiebung des Objekts (40) im räumlichen Muster der Objektbedingungen vorgesehen ist. 20. An optical system according to claim 14, wherein an adjusting device for displacement of the object (40) is provided in the spatial pattern of the object conditions.
21. Optisches System gemäß einem der Ansprüche 14 bis 20, bei dem die Beleuchtungseinrichtung (10) eine Blitzlampe, einen Laser oder eine Hochdrucklampe umfasst. 21. An optical system according to any one of claims 14 to 20, wherein the illumination device (10) comprises a flash lamp, a laser or a high pressure lamp.
22. Optisches System gemäß einem der Ansprüche 14 bis 21, bei dem eine Beleuchtungsoptik (30) und/oder eine Abbildungsoptik (50) vorgesehen sind. 22. An optical system according to any one of claims 14 to 21, wherein said illumination optics (30) and / or an imaging optic (50) are provided.
23. Verwendung eines Verfahrens oder eines optischen Systems gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche in Kombination mit herkömmlichen optischen Mikroskopieverfahren, insbesondere in Kombination mit der Standard-Fernfeldmikroskopie, der Epi- fluoreszenzmikroskopie, der Konfokalmikroskopie, der 4Pi- Mikroskopie, der Theta-Mikroskopie, der Nahfeldmikroskopie, mikroskopischen I 2 M-, I 3 M- und I 5 M-Verfahren, STED-Verfahren, Multiphotonenmikroskopie, CARS-Verfahren und SHG- oder THG- Mikroskopie . 23. Use of a method or of an optical system fluorescence microscopy according to any preceding claim in combination with conventional optical microscopy techniques, in particular in combination with the standard far field microscopy, epi-, confocal microscopy, the 4Pi microscopy, theta microscopy, near field microscopy , microscopic I 2 M-, I 3 M- and I 5 M methods, STED methods, multi-photon microscopy, CARS method and SHG or THG microscopy.
Description  translated from German  (OCR text may contain errors)

Verfahren und Vorrichtung zur Objektabbildung Method and device for object imaging

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Objektabbildung mit hohem räumlichen Auflösungsvermögen, insbesondere ein lichtmikroskopisches Abbildungsverfahren, und Vorrichtungen zur Durchführung eines derartigen Verfahrens. The invention relates to a process for the object image with high spatial resolution, in particular a light-microscopic imaging method and apparatus for performing such a method.

Das Auflösungsvermögen optischer Abbildungssysteme wird oft entscheidend durch die objektseitige Apertur einer Objektivlinse und deren Brechzahl bestimmt. The resolving power of optical imaging systems is often decisively determined by the object-side aperture of an objective lens and its refractive index. Von einem Objekt ausgehendes Licht kann nur erfasst werden, wenn es innerhalb des Akzeptanzwinkels des Objektivs auf dieses trifft. From an object outgoing light can be collected only when it encounters this within the acceptance angle of the lens. Je höher das Auflösungsvermögen ist, desto höhere Orts- oder Raumfrequenzen der abzubildenden Objektstruktur können erfasst werden. The higher the resolution is, the higher the local or spatial frequencies of the object to be imaged structure can be detected. Die Erfassung der Raumfrequenzen wird durch die lichtoptische Transferfunktion oder Modulationsübertragungsfunktion (im Folgenden: OTF) des optischen Systems beschrieben. The detection of the spatial frequencies is determined by the light-optical transfer function or modulation transfer function (hereinafter OTF) of the optical system described. Die OTF gibt an, welche Raumfrequenzen, aus denen sich das. Objekt mittels Fouriertransformation zusammengesetzt konstruieren lässt, bei der optischen Abbildung erhalten bleiben, bzw. wie Raumfrequenzanteile geschwächt werden. The OTF indicates which spatial frequencies that make up the. Object can construct composed by a Fourier transformation, are retained in optical imaging, or are weakened such as space frequency components. Das Auflösungsvermögen des optischen Systems (z. B. eines Lichtmikroskops) ist durch den Bereich bestimmt, in dem die OTF des Systems nicht verschwindet. The resolving power of the optical system (z. B. an optical microscope) is determined by the range in which the OTF of the system does not disappear. Verschwindet die OTF in Abschnitten des reziproken Raumes vollständig, so ist es unmöglich, ohne zusätzliche Annahmen über die Objektstruktur (z. B. räumliche Beschränktheit, Positivität) die entsprechenden Raumfrequenzen in einer Objektabbildung zu rekonstruieren. Disappears, the OTF in portions of the reciprocal space completely, it is impossible to reconstruct the corresponding spatial frequencies in an object image without additional assumptions about the object structure (for. Example, spatial limitations, positivity). Es besteht allgemein ein Interesse an der Ausdehnung der OTF auf einen möglichst großen Bereich im reziproken Raum, um die Auflösung des optischen Systems zu erhöhen. There is general interest in the extension of the OTF in the largest possible area in reciprocal space so as to increase the resolution of the optical system. Herkömmliche Verfahren zur Erhöhung des Auflösungsvermögens sind insbesondere auf eine geeignete Wahl der Objektbeleuchtung gerichtet. Conventional methods for increasing the resolving power in particular directed to a suitable choice of the object illumination. So wird bspw. beim konfokalen Mikroskop mit einem fokussierten Lichtstrahl das Objekt von einer Seite möglichst punktweise beleuchtet und gleichzeitig abgetastet (gescannt) , wobei oft die Detektion mittels einer Blende auf einen kleinen Bereich des Objekts begrenzt wird (siehe z. B. US-A 4 631 581) . Thus, the object of a page, for example. In the confocal microscope having a focused beam pointwise possible illuminated and scanned simultaneously (scanned), often the detection by means of a diaphragm is limited to a small region of the object (see, eg., US-A 4,631,581).

Bei dem in EP 0 491 289 beschriebenen 4Pi-Mikroskop wird von beiden Objektseiten kohärent beleuchtet und je nach Ausführung auch detektiert. In the process described in EP 0491289 4Pi microscope is coherently illuminated by two object side and also detected depending on the design. Beim Wellenfeld ikroskop wird üblicherweise mit kohärenten ebenen Lichtwellen von gegenüberliegenden Seiten beleuchtet (siehe z. B. US-A 4 621 911; F. Lanny et al. in „Bioimaging", Band 1, 1993, Seite 187 ff.; US-A 5 801 881) . Beim I 5 M-Mikroskop wird sowohl kohärent von beiden Seiten beleuchtet, als auch kohärent detektiert, indem die beiden Bilder des Objekts auf einem ortsauflösenden Detektor zur Interferenz gebracht werden (siehe US-A 5 671 085; MGL Gustafsson et al . in „Proceedings of SPIE", Band 2655, 1996, Seite 62 ff.). is ikroskop when wave field usually with coherent plane light waves illuminated from opposite sides (see, e.g., US-A 4,621,911;. Lanny F. et al ff in "Bioimaging", Volume 1, 1993, p 187 .; US Pat. . 5801881) when I 5 M microscope is both coherently illuminated from both sides, as well as coherently detected by the two images of the object are brought to a position-sensitive detector to interfere (see US-a 5,671,085; MGL Gustafsson et al., "Proceedings of SPIE" Vol 2655, 1996, page 62 et seq.). Von EHK Stelzer et al . From EHK Stelzer et al. in „Opt . in "Opt. Commun" Band 111, 1994, Seite 536 ff. und S. Lindeck et al. in „Handbook of Biological Confocal Microscopy", Herausgeber JB Pawley, Plenum Press, New York 1995, Kapitel 26, Seite 417 ff. wird ein Theta-Mikroskop beschrieben, bei dem Licht von drei Seiten detektiert wird, wobei mit konfokaler oder 4Pi- ähnlicher Beleuchtung gearbeitet wird. Commun "Band 111, 1994, page 536 et seq. And S. Lindeck et al.," Handbook of Biological Confocal Microscopy ", edited by JB Pawley, Plenum Press, New York 1995, Chapter 26, page 417 et seq., A theta microscope described, is detected in which light from three sides, being worked with confocal or similar 4Pi lighting. Da bei der seitlichen Detektion in der Objektebene die Auflösung entlang der optischen Achse der Beleuchtung besonders groß ist, erhält man insgesamt ein verkleinertes Fokusvolumen. Since in the lateral detection in the object plane, the resolution along the optical axis of the illumination is particularly large, it receives a scaled total focal volume.

Es ist auch bekannt, in stereomikroskopischen Oberflächentopographie-Verfahren eine räumlich variierende Beleuchtung (z, B. sinus-förmig variierend) zu verwenden. It is also known to provide a spatially varying illumination in stereo microscopic surface topography methods (e.g., B. sinusoidally varying) to use. Durch Verrechnung der gemessenen Bilder kann auf die Oberflächenstruktur des Objekts rückgeschlossen werden (siehe z. B. US-A 4 525 858; R. Windecker et al. in „Optical Engineering", Band 36, 1997, Seite 3372 ff. ) . By offsetting the measured images can be concluded on the surface structure of the object (see, e.g., US-A 4,525,858;... R. Windecker et al in "Optical Engineering", Volume 36, 1997, page 3372 ff).

Ein Verfahren zur hochauflösenden dreidimensionalen Bildge- bung durch Erfassung optischer Schnitte des Objekts ähnlich zur konfokalen Mikroskopie ist in WO 97/31282 beschrieben. A method for high-resolution three-dimensional Bildge- environment by detection of optical sections of the object similar to the confocal microscopy is described in WO 97/31282. Es basiert auf der Aufnahme mehrerer Bilder mit jeweils unterschiedlichen Mustern aus Beleuchtungslochblenden und zugehörigen Detektionslochblenden. It is based on receiving a plurality of images, each having different patterns of illumination pinhole and associated detection pinhole. Durch geeignete Rekonstruktionsverfahren lässt sich aus den aufgenommenen Daten ein Bild berechnen, das dem eines konfokalen Mikroskops äquivalent ist. By appropriate reconstruction methods can be derived from the recorded data to calculate an image that is the equivalent of a confocal microscope. Dieses Verfahren wird auch als „Aperture Correlation Micros- copy" bezeichnet (siehe auch R. Juskaitis et al . in „Nature" Band 383, 1996, Seite 804 ff., T. Wilson et al. in „Procee- dings of the SPIE", Band 2984, 1997, Seite 21 ff.). Aus WO 98/45745 ist ein Verfahren bekannt, das auf der Beleuchtung unter Abbildung eines Beugungsgitters oder mit zwei interfer- rierenden Laserstrahlen beruht (siehe auch T. Wilson et al . in „Cell Vision", Band 4, 1997, Seite 231 ff.). This process is also called "Aperture Correlation Micros copy" (see also R. Juskaitis et al. In "Nature" Band 383, 1996, page 804 ff., T. Wilson et al., "Procee- recently of the SPIE ", Volume 2984, 1997, page 21 ff.). WO 98/45745 discloses a method based on the lighting under imaging of a diffraction grating, or with two centering interfer- laser beams (see also T. Wilson et al. in" Cell vision ", Volume 4, 1997, page 231 ff.). In der Publikation von R. Heintzmann et al . In the publication by R. Heintz et al. in „Proceedings of SPIE" Band 3568, 1999, Seite 185 ff. wird ein ähnliches Verfahren zur lateralen Erhöhung des Auflösungsvermögens eingesetzt. in "Proceedings of SPIE" Band 3568, 1999, page 185 et seq., a similar method for lateral increase the resolving power used.

Die herkömmlichen Techniken besitzen die folgenden Nachteile. The conventional techniques have the following disadvantages. Die Abbildungsverfahren sind mit einem relativ großen technischen Aufwand verbunden. The imaging methods are associated with a relatively great technical effort. So ist insbesondere bei den 4Pi-, I 5 M- und Theta-Mikroskopen die Justierung besonders schwierig. Thus, in particular in the 4Pi, I 5 M and theta microscopes adjustment particularly difficult. Die Verfahren sind außerdem nur schwer zu realisieren, da sie lediglich mit großem Aufwand in vorhandene Mikroskopsysteme integrierbar sind. The procedures are also difficult to implement because they are only integrated at great expense into existing microscope systems. Beim Wellenfeldmikroskop ist es ein großes Problem, dass die OTF in axialer Richtung Be- reiche aufweist, an denen sie verschwindet. When wave field microscope, there is a big problem that the OTF rich in the axial direction Ventilation has, where it disappears. Außerdem liefert das Wellenfeldmikroskop bzw. das 4Pi-Mikroskop in lateraler Richtung, verglichen mit der herkömmlichen Epi-Fluoreszenz- Mikroskopie bzw. der konfokalen Fluoreszenz-Mikroskopie, keinen Auflösungsgewinn. In addition, the wave field microscope, or the 4Pi microscope in the lateral direction, compared with the conventional epi-fluorescence microscopy or confocal fluorescence microscopy provides, no gain in resolution.

Des Weiteren sind viele Verfahren (insbesondere die konfokale Laserscanning-4Pi- und Theta-Mikroskopie) mit einem punktweisen Abrastern des Objekts verbunden. Furthermore, many methods (especially, confocal laser scanning microscopy, 4Pi and theta) connected to a point by point scanning of the object. Dies ist zeitaufwendig und vor allem bei der Bildgebung zeitabhängiger Vorgänge problematisch. This is time consuming and especially in imaging time-dependent processes problematic. Abtastende Verfahren benötigen sehr schnelle Detektoren (z. B. Photomultiplier) , die jedoch gegenüber langsameren Detektoren mit Ortsauflösung (z. B. CCD's) oft eine deutlich niedrigere Detektionseffizienz besitzen. Scanning methods require very fast detectors (z. B. photomultiplier), but compared to slower detectors with spatial resolution (eg. As CCD's) often have a significantly lower detection efficiency. Bei der Fluoreszenz-Mikroskopie kommt noch erschwerend hinzu, dass die sinnvolle Beleuchtungsstärke durch die maximale Anregungsrate der Farbstoffe im Fokus beschränkt ist. yet, in fluorescence microscopy is added difficulty that the sensible light intensity is limited by the maximum excitation rate of the dyes in focus. Dies begrenzt die maximale Abtastgeschwindigkeit zusätzlich. This limits the maximum scanning addition.

Es sind auch mikroskopische Abbildungsverfahren auf der Basis nicht-linearer Effekte bekannt. There are also known microscopic imaging method based on non-linear effects. So wird bspw. in US-A-5 034 613, US-A-5 777 732, US-A-5 828 459 und US-A-5 796 112 die sog. Mehrphotonen-Mikroskopie beschrieben. Thus, for example will. In US-A-5,034,613, US-A-5,777,732, US-A-5,828,459 and US-A-5,796,112 the so-called. Multiphoton microscopy described. Der konfokale Effekt wird dabei durch die gleichzeitige Absorption mehrerer Photonen an bestimmten Objektorten erzielt. The confocal effect is thereby achieved by the simultaneous absorption of multiple photons at certain object locations. Andere Techniken basieren auf der stimulierten Emission (siehe US-A-5 731 588, DE-OS 44 16 558) oder dem Entvölkern des Grundzustandes von Fluoreszenz-Molekülen, indem diese gezielt in den längerlebi- gen Triplettzustand gepumpt werden (siehe SW Hell et al. in „Applied Physics B", Band 60, 1995, Seite 495 ff.). Other techniques are based on stimulated emission (see US-A-5,731,588, DE-OS 44 16 558) or to the depopulation of the ground state of fluorescent molecules in that they are specifically pumped into the längerlebi- gene triplet state (see SW Hell et al., "Applied Physics B", Volume 60, 1995, page 495 ff.).

Mit den Verfahren auf der Grundlage nicht-linearer optischer Effekte konnte bisher keine erhebliche Erhöhung des Auflösungsvermögens erreicht werden. With the method based on non-linear optical effects no significant increase in the resolving power has been achieved so far. Dies hängt insbesondere damit zusammen, dass zur Erzielung von Mehrphotonen-Absorptionen die einzelnen Photonen relativ geringe Energien und somit große Wellenlängen besitzen müssen. This is particularly due to the fact that to achieve multiphoton absorption, the individual photons must have relatively low energy and thus large wavelengths. Außerdem ist die Übertra- gungseffienz bei hohen Raumfrequenzen im Allgemeinen sehr schlecht, weil typischerweise nur ein sehr kleiner Teil des Beleuchtungsmusters hohe Raumfrequenzen enthält. In addition, the transmission is gungseffienz very poor at high spatial frequencies in general because typically only a very small part of the illumination pattern contains high spatial frequencies.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Abbildungsverfahren mit einem hohen Auflösungsvermögen anzugeben. The object of the invention is to provide an improved imaging method with a high resolving power. Das Verfahren soll insbesondere die og Nachteile herkömmlicher Mikroskopie-Verfahren überwinden, mit einem vereinfachten technischen Aufwand realisierbar sein, eine schnelle Bildaufnahme auch zeitabhängiger Vorgänge erlauben und mit herkömmlichen optischen Systemen kompatibel sein. The process should overcome particular the aforementioned drawbacks of conventional microscopy methods, be realized with a simplified technical complexity, enable rapid image capture and time-dependent process and be compatible with conventional optical systems. Das erfindungsgemäße Verfahren soll des Weiteren ermöglichen, bekannte mikroskopische Verfahren unter Beibehaltung ihrer jeweiligen Vorteile so zu erweitern, dass das Auflösungsvermögen zusätzlich gesteigert wird. The novel process should further allow to expand known microscopic methods while retaining their respective advantages so that the resolution is further enhanced. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, ein optisches System zur Durchführung derart verbesserter Verfahren anzugeben. The object of the invention is also to provide an optical system for carrying out such improved methods.

Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren und ein optisches System mit den Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1 bzw. 14 gelöst. These objects are achieved by a method and an optical system having the features according to claims 1 and 14 respectively. Vorteilhafte Ausführungsformen und Verwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. Advantageous embodiments and uses of the invention are apparent from the dependent claims.

Die Grundidee der Erfindung ist es, zur Gewinnung einer Objektabbildung (Bild einer Objektstruktur) mindestens zwei Teilbilder eines Objekts unter jeweils verschiedenen Objektbedingungen aufzunehmen, die am Objekt mit räumlichen Mustern ausgebildet sind, wobei jeweils für einen Objektpunkt eine nicht-lineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt her detektier- ten Lichtes von den am Objektpunkt gegebenen Objektbedingungen besteht und die Teilbilder unterschiedliche Beiträge ver- schiedener Raumfrequenzanteile der Objektstruktur enthalten, und aus den Teilbildern durch Rekonstruktion der Raumfrequenzanteile die gewünschte Objektabbildung zu gewinnen. The basic idea of the invention is to take for obtaining an object image (image of an object structure) at least two partial images of an object under respectively different object conditions, which are formed on the object with spatial patterns, wherein a non-linear dependence for each of an object point of the object point ago detektier- th light from the given point on the object object conditions there and the partial images different contributions comparable contain vARIOUS spatial frequency components of the object structure, and to gain the desired object image from the partial images by reconstructing the spatial frequency components. Die Einstellung von Objektbedingungen mit verschiedenen räumlichen Mustern zur Erfassung der verschiedenen Teilbilder besitzt den Vorteil, dass virtuell nieder- und höherfrequente Raumfrequenzanteile im Muster der Objektbedingungen erzeugt werden, an die die Raumfrequenzanteile der Objektstruktur gekoppelt sind. The setting of object conditions with different spatial patterns to detect the different sub-images has the advantage that virtually low and higher frequency spatial frequency components are generated in the pattern of object conditions at the spatial frequency components of the object structure are coupled. Durch diese Kopplung werden die Raumfrequenzanteile der Objektstruktur in Bezug auf das Raumfrequenzintervall verschoben, das entsprechend der lichtoptischen Transferfunktion (OTF) für eine Bilderfassung offen ist. By this coupling, the spatial frequency components of the object structure are displaced with respect to the spatial frequency interval corresponding to the light-optical transfer function (OTF) is open to an image capture. Aus den Teilbildern kann die vollständige Objektabbildung mit einem entsprechend erweiterten Raumfrequenzbereich rekonstruiert werden. From the partial images the full object image can be reconstructed with a correspondingly extended spatial frequency domain.

Durch Ausnutzung eines nicht-linearen Zusammenhangs zwischen vom Objekt ausgehenden Licht und dem lokalen, objektpunktbe- zogenen Wert einer weiteren räumlichen veränderlichen Größe (z. B. der lokalen Einstrahlungs- oder Beleuchtungsintensität) lässt sich der vom Gesamtsystem effektiv übertragene Raumfrequenzbereich beträchtlich erweitern. By utilizing a non-linear relationship between the outgoing light from the object and the local, objektpunktbe- plated value of a further spatial variable size (eg. As the local irradiation or illumination intensity), the effectively transmitted by the system as a whole spatial frequency range can be extended considerably. Durch lokale Variation der Einflussgröße und die Aufnahme mehrerer Teilbilder lässt sich eine Objektabbildung rekonstruieren, deren Auflösung aufgrund der Nicht-Linearität fundamental höher als die durch das Abbe-Limit gegebene Auflösung ist. By local variation of the influencing variable and the receiving a plurality of partial images can be reconstructed, whose resolution is higher than the fundamental given by the Abbe limit resolution due to the non-linearity of an object image. Zur Erzeugung nicht-linearer Effekte können verschiedene Möglichkeiten anwendungsabhängig gewählt werden. To generate non-linear effects various options can be selected depending on the application. Ebenfalls ist die Gewinnung der Objektabbildung aus den Teilbildern anwendungsabhängig mit verschiedenen Arten der Datenauswertung möglich. the extraction of the object image from the partial images of data analysis is also possible depending on the application with different styles.

Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist die Einstellung vorbestimmter Objektbedingungen mit verschiedenen räumlichen Mustern. An important feature of the invention is the setting of predetermined object conditions with different spatial patterns. Am Objekt werden entsprechend dem jeweiligen Muster punktweise Objektbedingungen eingestellt, von denen das er- fasste Licht nicht-linear abhangig ist. The object point by point object conditions are adjusted according to the particular pattern, of which the ER took light is non-linearly dependent. Gemäß einer ersten Ausfuhrungsform der Erfindung ist die Einstellung vorbestimmter Objektbedingungen die Bildung eines raumlichen Musters mindestens einer Objektbedingung, von der die erfasste Lichtmenge jeweils nicht-linear abhangig ist. According to a first embodiment of the invention, the adjustment object predetermined conditions is the formation of a spatial pattern of at least one object condition, from the detected amount of light is respectively non-linearly dependent. Gemäß einer abgewandelten Ausfuhrungsform der Erfindung umfasst die Einstellung vorbestimmter Objektbedingungen die Erzeugung eines raumlichen Musters von mindestens zwei verschiedenen Objektbedingungen, wobei eine Abhängigkeit der erfassten Lichtmenge von einer multiplikativen Verknüpfung der Objektbedingungen und eine lineare oder eine nicht-lineare Abhängigkeit der erfassten Lichtmenge von jeder der Objektbedingungen besteht. According to a modified embodiment of the invention the setting predetermined object conditions comprises the generation of a spatial pattern of at least two different object conditions, wherein a dependence of the detected light quantity of a multiplicative linkage of the object conditions and a linear or non-linear dependency of the detected light quantity of each of the object conditions consists. Allgemein wird von einer multi-linearen Abhängigkeit des erfassten Lichtes (z. B. der erfassten Lichtmtensitat oder Lichtphase) gesprochen. Generally of a multi-linear dependency of the detected light (z. B. the detected Lichtmtensitat or light phase) is spoken.

Die Zahl der Teilbilder ist abhangig von der Zahl der bei der Bildrekonstruktion meßbaren und anwendungsabhangig zu berücksichtigenden Raumfrequenzanteile im Muster des vom Objekt ausgesandten Lichtes. The number of fields is dependent on the number of measurable in the image reconstruction and anwendungsabhangig to be considered spatial frequency components in the pattern of the light emitted by the object. Diese Zahl ist insbesondere von der verwendeten Objektbedingung zur Einfuhrung der Nicht- Linearitat und von der Qualität des realisierten Abbildungsverfahrens abhangig. This number is dependent in particular on the used object condition for the introduction of non-linearity and the quality of the implemented imaging process. Betragt die Anzahl der genannten Raumfrequenzanteile Z, so sind in der Regel mindestens Z Teilbilder aufzunehmen. Amounts to the number of said spatial frequency components Z, as are at least Z take part images to the rule. Es kann aber fallabhangig auch ausreichend sein, weniger Teilbilder aufzunehmen, wenn genügend Informationen zur Rekonstruktion der Objektabbildung vorliegen. but it can also be fallabhangig sufficient to accommodate fewer partial images when enough information to reconstruct the object image available. Die Zahl der Teilbilder wird fest eingestellt oder automatisch in Abhängigkeit von der Qualität der gewonnenen Objektabbildung und/oder manuell vom Nutzer des optischen Systems eingestellt . The number of sub-images will be fixed or automatically adjusted in dependence on the quality of the acquired object image and / or manually by the user of the optical system. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt insbesondere die folgenden Schritte: (a) Anpassung der im Objekt herrschenden Bedingungen, die das von einem Objektpunkt ausgehende Licht zu beeinflussen imstande sind derart, daß eine nicht-lineare Abhängigkeit der von einem Objektpunkt detektierten Lichtintensität von dem Wert eines in mindestens einer Objektbedingung enthaltenen räumlichen Musters in mindestens einem detektierten Wert hervorgerufen wird oder eine jeweils zu einem Wert lineare Abhängigkeit der von diesem Objektpunkt detektierten Lichtintensität von den Werten mindestens zweier räumlicher Muster hervorgerufen wird, (b) Aufzeichnung mindestens eines Einzelbildes unter diesen Objektbedingungen, (c) Ändern der Objektbedingungen derart, daß unterschiedliche durch das Aufnahmeverfahren abgebildete Raumfrequenzanteile des Objekts sich in ihrer Amplitude und/oder Phasenbeziehung zueinander verändern, (d) Aufzeichnung wenigstens eines weiteren Einzelbildes unter jeweils gemä The inventive method in particular comprises the following steps: (a) adjustment of the pressure prevailing in the object conditions are such to influence the light emanating from an object point light capable that a non-linear dependency of the detected from an object point light intensity from the value of one in at least a spatial pattern contained object condition is caused in at least a detected value or a linear in each case to a value function of the detected from this object point light intensity caused by the values of at least two spatial patterns, (b) recording at least one image frame among these target conditions, (c) changing the object conditions such that different spatial frequency components of the object imaged by the receiving procedure to each other change in amplitude and / or phase relationship, (d) recording ACCORDING at least one other individual image by each ß (c) veränderten Objektbedingungen, und (e) Auswertung der gemessenen Bilder, indem die sich in den Einzelbildern unterschiedlich ausprägenden Objektbedingungen genutzt werden, um Informationen über das Objekt zurückzugewinnen, die zu Raumfrequenzen des Objekts gehören, welche durch eine einfache Abbildung mit dem Aufnahmeverfahren nicht zugänglich wären. Q (c) altered object conditions, and (e) evaluation of the measured images by the differently ausprägenden in the frames object conditions are used to recover information about the object belonging to the spatial frequencies of the object, which by a simple picture with the recording method would not be accessible.

Ein erfindungsgemäßes optisches System zur Objektabbildung zeichnet sich insbesondere durch einen Mustergenerator, der zur Einstellung und Veränderung vorbestimmter räumlicher Muster von Objektbedingungen eingerichtet ist, von denen das von einem Objekt detektierte Licht nicht-linear abhängig ist, und einen Bildgenerator zur Rekonstruktion der Objektabbildung aus den erfassten Teilbildern aus. An inventive optical system for object imaging is particularly characterized by a pattern generator that is configured to set and change a predetermined spatial pattern of object conditions upon which the detected light from an object is non-linearly dependent, and detected an image generator for reconstruction of the object image from the part images.

Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. The invention has the following advantages. Die Gewinnung von Objektabbildungen ist relativ einfach realisierbar. The extraction of object images is relatively easy to implement. Die Justierung des optischen Systems beschränkt sich auf einen minimalen Justierungsaufwand. The adjustment of the optical system is limited to a minimal adjustment effort. Die Erfindung kann durch Nachrüstung bestehender Abbildungssysteme implementiert werden. The invention can be implemented by retrofitting existing imaging systems.

Von besonderem Vorteil ist, dass hohe Raumfrequenzen, die in Abbildungsobjektiven ggf. stark unterdrückt werden, nun durch die Verschiebung im Frequenzraum effizienter detektiert werden können. It is of particular advantage that high spatial frequencies that are strongly suppressed in Figure lenses, if necessary, can now be detected efficiently by the shift in frequency space. Zusätzlich zum lateralen Auflösungsgewinn ergibt sich auch ein axialer Auflösungsgewinn und die Möglichkeit, zur optischen Achse senkrecht stehende Ebenen in axialer Richtung zu diskriminieren. In addition, the lateral gain in resolution is also an axial gain in resolution and the possibility to the optical axis perpendicular planes in the axial direction is determined to discriminate. Damit liefert die Erfindung vorteilhafte Verwendungen wie die Konfokalmikroskopie. Thus, the invention provides advantageous uses such as confocal microscopy. Auch in axialer Richtung ergibt sich bei Ausnutzung der nichtlinearen Abhängigkeit der erfassten Lichtmenge von den Objektbedingungen die Möglichkeit zu einem erheblichen Auflösungsgewinn. And in the axial direction, the non-linear dependency of the detected light quantity of the object conditions results in utilization of the possibility of a substantial gain in resolution.

Die Erfindung ist mit Vorteil in Kombination mit herkömmlichen Abbildungsverfahren, insbesondere Mikroskopieverfahren, anwendbar. The invention is advantageously used in combination with conventional imaging processes, especially microscopy methods, applicable. Dies betrifft insbesondere die og Techniken und die Absorptionsmikroskopie, die Reflektionsmikroskopie, die ortsaufgelöste Abbildung von Fluoreszenzlebensdauern (sog. „Fluorescence Lifetime Imaging"), die Mehrphotonenmikroskopie, Interferenzmikroskopie, Konfokalmikroskopie usw.. This particularly concerns the above mentioned techniques and the absorption microscopy, reflection microscopy, spatially resolved imaging of fluorescence lifetimes (so-called. "Fluorescence Lifetime Imaging"), the multi-photon microscopy, interference microscopy, confocal microscopy, etc ..

Das erfindungsgemäße Abbildungsverfahren besitzt eine hohe Geschwindigkeit der Bildaufnahme. The imaging process of the invention has a high speed image acquisition. Die Bildgebung kann z. The imaging z can. B. mit einer CCD-Kamera an allen Objektpunkten in der Bildebene gleichzeitig erfolgen und ist daher deutlich schneller möglich, als bei abtastenden Verfahren. For example, with a CCD camera effected at all object points in the image plane at the same time and is therefore considerably faster possible than with scanning procedures.

Die Erfindung ist unter Verwendung der verschiedenartigsten nicht-linearen Effekte realisierbar. The invention can be implemented using the most diverse non-linear effects. Bspw. For example. kann in einem Fluoreszenzmikroskop die Beleuchtung mit einer derartigen In- tensität erfolgen, dass Fluoreszenzfarbstoffe im Objekt gesättigt werden. can lighting with such in- tensity done that fluorescent dyes are saturated in the object in a fluorescence microscope. Dies ermöglicht auch, verschiedene Farbstoffe oder Farbstoffe in verschiedenen Umgebungen (z. B. in verschiedenen Bindungsgzuständen) , die sonst schlecht zu unterscheiden wären, aufgrund verschiedener nicht-linearer Eigenschaften (Sättigungseigenschaften) zu diskriminieren. This also allows various dyes or dyes in different environments (eg. As in various Bindungsgzuständen) that would distinguish otherwise bad due to various non-linear characteristics (saturation characteristics) to discriminate.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden im Folgenden aus der Beschreibung der beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Further advantages and details of the invention will become more apparent hereinafter from the description of the accompanying drawings. Es zeigen: Show it:

Figur 1 eine Illustration der Objektbeleuchtung im reziproken Raum bei sinusförmiger Beleuchtung mit geringer Intensität, Figure 1 is an illustration of the object illumination in reciprocal space with sinusoidal illumination with low intensity,

Figur 2 eine Illustration der Objektbeleuchtung im reziproken Raum bei einem nicht-linear verzerrten Anregungsmuster, Figure 2 is an illustration of the object illumination in reciprocal space in a non-linear distorted excitation pattern,

Figur 3 eine Blockdarstellung eines erfindungsgemäßen optischen Systems, Figure 3 is a block diagram of an optical system according to the invention,

Figur 4 Einzelheiten eines optischen Systems gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung, Figure 4 shows details of an optical system according to a first embodiment of the invention,

Figur 5 Einzelheiten eines optischen Systems gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, Figure 5 shows details of an optical system according to another embodiment of the invention,

Figuren 6 und 7 Simulationsergebnisse zur Illustration eines erfindungsgemäßen Verfahrens, Figures 6 and 7 simulation results illustrating a method according to the invention,

Figur 8 eine Kurvendarstellung zur Illustration des lateralen Auflösungsvermögens, Figur 9 eine Kurvendarstellung der effektiven Ge- samt-OTF eines erfindungsgemäßen optischen Systems (mit Rekonstruktion) , und Figure 8 is a graph illustrating the lateral resolution capability, Figure 9 is a graph showing the effective overall including the OTF of an optical system according to the invention (with reconstruction), and

Figur 10 Beispiele vom Objektabbildungen. Figure 10 examples of object images.

Die Erfindung wird im Folgenden zunächst anhand der theoretischen Grundlagen und anschließend an verschiedenen Beispielen erläutert. The invention is explained below first with reference to the theoretical foundations and then at various examples. Die Erfindung ist nicht auf die gegebenen Ausführungsbeispiele beschränkt. The invention is not limited to the given exemplary embodiments. Insbesondere im Rahmen der folgenden Begriffsbestimmung sind abgewandelte Ausführungsformen unter entsprechend variierten Objektbedingungen anwendungsabhängig realisierbar. Particularly in the context of the following definitions are modified embodiments depending on the application realized under varied according to the object conditions.

Der bei einer optischen Abbildung zu erfassende Gegenstand oder Teilabschnitte des Gegenstands werden im Folgenden allgemein als „Objekt" bezeichnet. Objekte sind insbesondere alle Formen von biologischen oder synthetischen Proben, wie sie mit herkömmlichen Abbildungsverfahren und ortsauflösenden Analyseverfahren, insbesondere Mikroskopie und Spektroskopie- Verfahren, untersucht werden. Anwendungen ergeben sich z. B. in der Biologie, Medizin, Chemie, Halbleitertechnik, Einzelmolekülspektroskopie u. dgl .. Das Objekt kann fest, flüssig oder auch gasförmig sein. To be detected with an optical imaging article or portions of the article are referred to below generally as "object". Objects are, in particular, all forms of biological or synthetic samples as analyzed by conventional imaging methods and spatially resolving analysis methods, in particular microscopy and spectroscopy methods, be. applications arise z. B. in biology, medicine, chemistry, semiconductor technology, single molecule spectroscopy u. .. etc. the object can be solid, liquid or gaseous.

Unter „Objektbedingungen" werden allgemein alle Parameter und/oder Bedingungen am Ort des Objektes verstanden, mit denen eine oder mehrere Eigenschaften des vom Objekt ausgehenden Lichtes beeinflussbar sind. Zu diesen Eigenschaften zählen insbesondere die Intensität, der Polarisationszustand, die Phase, die Farbe, die Pulsform, die Pulslänge, der Kohärenzgrad, die Photonenkorrelation und dergleichen. Objektbedingungen können inhärente physikalische oder chemische Ei- genschaften des Objekts, wie z. B. eine bestimmte stoffliche Zusammensetzung, eine Temperaturverteilung oder eine Druckverteilung, oder von außen aufgeprägte Parameter, wie z. B. die Beleuchtungsintensität auf der Objektoberfläche oder im Objekt, umfassen. "Object conditions" all the parameters and / or conditions are generally understood at the location of the object with which one or more properties of emanating from the object light can be influenced. These properties include in particular the intensity of the polarization state, phase, the color pulse shape, the pulse length, the degree of coherence, the photon correlation, and the like. object conditions inherent physical or chemical egg properties of the object, such as. for example, a particular material composition, in a temperature distribution or a distribution of pressure or imposed from outside parameters such. for example, the illumination intensity on the object surface or the object include.

Die Ausbildung der Objektbedingungen mit einem räumlichen Muster bedeutet, daß die Objektbedingungen mit einer bestimmten Ortsabhängigkeit beschrieben werden können. The formation of the object conditions with a spatial pattern means that the object conditions can be described with a particular spatial dependence. Das Muster kann durch eine Struktur (z. B. ein Punkt- oder Strichmuster) charakterisiert sein oder auch strukturlos sein (für alle Objektpunkte gelten die gleichen Objektbedingungen). The pattern can by a structure (eg. As a dot or line pattern) be characterized or structureless be (for all object points are the same object conditions). Die Aufnahme von Teilbilder unter verschiedenen Objektbedingungen bedeutet, daß zwischen den Aufnahmen das Muster an sich (z. B. mit einem DMD-Reflektor, su), die Position und/oder Orientierung des Musters relativ zur Probe (z. B. mit einem verschiebbaren Beugungsgitter, su) und/oder eine Intensitätseigenschaft des Musters (z. B. mit einer Variation der Intensität der Objektbeleuchtung, su) verändert wird. The inclusion of sub-images under different object conditions means that between exposures, the pattern itself (e.g., as with a DMD-reflector, see below) (the position and / or orientation of the pattern relative to the sample z. B. a sliding diffraction grating, see below) and / or an intensity characteristic of the pattern (for. example, with a variation of the intensity of the object illumination, see below) is changed.

Eine „nicht-lineare Abhängigkeit" des vom Objekt ausgehenden bzw. mit einem Detektor erfassten oder detektierten Lichtes ist gegeben, wenn dessen Lichtintensität von der jeweiligen Objektbedingung Ort der Lichtaussendung (oder -Streuung oder dergleichen) messbar keinem einfachen linearen Modell folgt. In einer Funktionenentwicklung, z. B. Taylor-Entwicklung (siehe unten), des detektierten Lichts treten Terme höherer Ordnung auf. Gemäß den og Ausführungsformen der Erfindung kann eine nicht-lineare Abhängigkeit der Lichtintensität jeweils von einer Objektbedingung oder eine lineare Abhängigkeit der Lichtintensität von mehreren Objektbedingungen gegeben sein. Im letzteren Fall treten in der Funktionenentwicklung Mischterme auf, die die unten erläuterte Erweiterung der detektierbaren Objekt-Raumfrequenzen erlauben. Die „detektierte Lichtintensität", die die vom Detektor gemessene Lichtintensität ist, kann anwendungsabhängig je nach Funktionalität des Detektors von der am A "non-linear dependence of" emanating from the object and sensed or detected with a detector light is given if the light intensity of the respective object condition location of the light emission (or scattering or the like) to measure does not follow a simple linear model. In a function development , z. B. Taylor development (see below), the detected light enter higher order terms in. According to the above embodiments of the invention, a non-linear dependency of the light intensity can be added to each of an object condition or a linear dependency of the light intensity of a plurality of object conditions be. in the latter case occur in the functional development mixed terms on which permit the below-mentioned extension of the detectable object spatial frequencies. the "detected light intensity", which is measured by the detector of light intensity, may depending on the application, depending on the functionality of the detector from the on Ort des Detektors herrschenden mittleren Lichtintensität abweichen, wenn z. different location of the detector prevailing average light intensity when z. B. zeitlich moduliert detektiert wird oder ein rohes Detektorsignal mit anderen Signalen korreliert wird (z. B. durch Lock- In-Technik) . B. is detected modulated in time or a raw detector signal is correlated with other signals (eg., By lock-in technique).

Unter einem „Teilbild" oder „Einzelbild" werden allgemein Bilddaten verstanden, die mit einem in weitesten Sinne abbildenden lichtoptischen Verfahren aufgenommen wurden. By a "partial image" or "frame" image data are generally understood to have been recorded with an imaging in the broadest sense light-optical method. Es kann sich dabei um einen einzelnen Datenpunkt, mehrere an ein oder verschiedenen Objektpunkten aufgenommene Datenpunkte oder Da- tenpunktbereiche in ein, zwei, drei oder mehr Dimensionen handeln. It can be a single data point, several data points taken at one or several object points or data tenpunktbereiche into thereby, act two, three or more dimensions. Die erfindungsgemäße Änderung von Objektbedingungen bei Aufnahme verschiedener Teilbilder kann sich auf eine Änderung oder Modulierung bei jedem Datenpunkt, für Abschnitte oder Gruppen von Datenpunkten oder für ganze zwei- oder dreidimensionale Bilder oder sogar Zeitserien vorgesehen sein. The amendment invention of object conditions when recording different partial images may be provided to a change or modulation for each data point for sections or groups of data points or for entire two- or three-dimensional images, or even time series.

Unter „detektierbaren Raumfrequenzanteilen" werden allgemein die Anteile des Frequenzraums der Fouriertransformierten des Objekts verstanden, die mit dem jeweils angewendeten Abbildungsverfahren prinzipiell detektierbar sind. By "detectable spatial frequency shares" the components of the frequency space of the Fourier transform of the object to be generally understood that in principle be detected with the respectively applied imaging methods.

Die Erfindung erlaubt nicht nur eine Objektabbildung mit erhöhtem Auflösungsvermögen, sondern auch die Gewinnung von „Informationen über das Objekt". Hierunter werden insbesondere die räumliche Verteilung einer oder mehrerer Eigenschaften des Objekts oder auch andere Parameter, wie z. B. die Position eines von seiner Struktur her bekannten Teilobjekts im Raum oder die Zusammensetzung des Objekts, verstanden. Grundlagen der Bilderfassung The invention allows not only an object image with a higher resolution, but also the recovery of "information about the object". Among these are in particular the spatial distribution of one or more properties of the object, or other parameters, such as. For example, the position of one of its structurally, known partial object in space or the composition of the object understood. fundamentals of image capture

Die Bildaufnahme wird im Folgenden am Beispiel der Fluoreszenzmikroskopie erläutert. The image will be explained below using fluorescence microscopy. In der Fluoreszenzmikroskopie werden Objekte abgebildet, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind oder selbststandig fluoreszieren. In fluorescence microscopy, objects are displayed, which are labeled with fluorescent dyes or selbststandig fluoresce. Je nach Objektstruktur und/oder Markierungstechnik sammeln sich z. Depending on the object structure and / or labeling technique for collecting. B. Markierungsfarbstoffe m bestimmten Teilbereichen (z. B. im Zellkern einer biologischen Zelle) . B. labeling dyes m certain portions (e.g., as in the nucleus of a biological cell). Zur Bildaufnahme wird das Objekt mit einer geeigneten Anregungswellenlange bestrahlt und die emittierte Fluoreszenzstrahlung detektiert. For imaging the object with an appropriate excitation wavelength is irradiated, and detects the emitted fluorescence radiation. Fluoreszenzfarbstoffe emittieren mit einer Intensität, die m ersten Näherung proportional zur Intensität des am Ort des Farbstoffs eingestrahlten Lichtes ist. Fluorescent dyes emit light at an intensity that is proportional to the intensity of the incident light on the place of the dye m first approximation. Die Emission erfolgt im Unterschied zur Absorptionsmikroskopie, Reflektionsmikrosko- pie oder auch Phasenkontrastmikroskopie im allgemeinen inkohärent zueinander. The issue is in contrast to the absorption microscopy Reflektionsmikrosko- pie or phase contrast microscopy generally incoherent to each other. Unter Annahme einer Proportionalität zwischen der an einem Objektpunkt ausgestrahlten Fluoreszenzm- tensitat zur dort eingestrahlten Lichtmtensitat des Anre- gungslichts lasst sich ein detektiertes Bild I m (x) (ruckuber- setzt m Objektraumkoordinaten x) wie folgt beschreiben. Assuming a proportionality between the radiated to an object point of the excitation Fluoreszenzm- tensitat to the irradiated light there Lichtmtensitat supply a detected image is let I m (x) (m ruckuber- sets the object space coordinates x) described as follows. Die ortsabhangige Beleuchtungsmtensitat (Bel(x)) wird mit der am jeweiligen Objektpunkt vorhandenen Farbstoffkonzentration Obj (x) (Objektstruktur) multipliziert und das Ergebnis mit der Punktbildfunktion („Point Spread Function", PSF) des abbildenden Systems gefaltet (siehe Gleichung (1) ) . The position-dependent Beleuchtungsmtensitat (Bel (x)) is reacted with existing at the respective object point dye concentration Obj (x) (reference structure) and multiplying the result with the point spread function ( "Point Spread Function" PSF) of the imaging system is folded (see equation (1) ).

I m (x) = PSF(x) ® (ßel(x) Ob(x)) ( 1 ) I m (x) = PSF (x) ® (Key (x) Ob (x)) (1)

Im reziproken Raum übersetzt sich dies m die Faltung der fouriertransformierten Beleuchtungsfunktion F(Bel(x)) mit der fouriertransformierten Ob ektfunktion F(Obj(x)) und anschließende Multiplikation mit der lichtoptischen Transferfunktion OTF(i) (F bezeichnet hier und im Folgenden die Fourierforma- tion, die Koordinaten im reziproken Raum werden mit k bezeichnet) . In reciprocal space to this (Bel (x)) with the Fourier transformed Whether translated m the folding of the Fourier-transformed illumination function F ektfunktion F (Obj (x)) and then multiplying by the light-optical transfer function OTF (i) (F denotes here and below the Fourierforma- tion, the coordinates in reciprocal space are designated by k). Analog zu Gleichung (1) ergibt sich: Analogously to equation (1) yields:

F(l m (x)) = OTF(k) (F(Bel(x)) ® F(θbj(x))) F (l m (x)) = OTF (k) (F (Bel (x)) ® F (θbj (x)))

Verallgemeinert auf andere Mikroskopieverfahren bedeutet Obj (x) den jeweiligen Wert oder die Dichte der Eigenschaften des Objekts, die zu erfassen ist, und PSF(x) die effektive Punktbildfunkion des gesamten Systems (Bildaufnahme und -re- konstruktion) . Generalized to other microscopy methods Obj (x) means the respective value or the density of the properties of the object to be detected, and PSF (x), the effective Punktbildfunkion of the entire system (image recording and -re- construction). Auch bei iterativen oder nicht-linearen Rekonstruktionsverfahren gilt dies oft noch näherungsweise. Even with iterative or non-linear reconstruction method this often applies even approximately.

In herkömmlichen abbildenden Systemen ist der im Wert von Null verschiedene Bereich der OTF, der auch als „Träger" bezeichnet wird, durch die numerische Apertur und die Wellenlänge des abzubildenden Lichts auf einen gewissen Raumfrequenzbereich eingeschränkt (siehe auch US-A-5 671 085). Gleichermaßen ist auch die Fouriertranformierte der Beleuchtungsfunktion F(Bel(x)) in der Ausdehnung ihres Trägers durch die Lichtwellenlänge und ggf. Aperturen des Beleuchtungssystems eingeschränkt . In conventional imaging systems, the value of non-zero area is also referred to as "carrier" of the OTF, is restricted by the numerical aperture and the wavelength of the imaging light on a certain spatial frequency region (see also US-A-5671085) . Likewise, the Fouriertranformierte the illumination function F (Bel (x)) in the extension of their carrier by the light wavelength and may be restricted apertures of the illumination system.

Erfindungsgemäß ist nun vorgesehen, den effektiven Bereich von detektierbaren Raumfrequenzen des Objekts F(Obj(x)) („Objekt-Raumfrequenzen") auf der Grundlage der folgenden Überlegungen zu erweitern. Bei Einführung einer nicht-linearen Abhängigkeit der erfassten Lichtintensität von den Objektbedingungen ist der rechte Teil von Gleichung (1) verallgemeinert gemäß den Ausdrücken (2) bzw. (3) zu schreiben: According to the invention it is now provided, the effective area of the detectable spatial frequencies of the object F (Obj (x)) ( "Object spatial frequencies") to expand on the basis of the following considerations. Is The introduction of a non-linear dependency of the detected light intensity of the object conditions the right-hand part of equation (1) generalized to write according to the expressions (2) or (3):

PSF(x) ® I em (Obj(x), b(x)) ( 2 ) => OTF(k) ' F(l em (θbj(x), b(x))) (3) Entsprechend dem Ausdruck (2) wird kein linearer Zusammenhang zwischen der von einem Objektpunkt ausgehenden Lichtintensität I e m(x) und der dort eingestrahlten Lichtintensität (enthalten in b(x)) vorausgesetzt. PSF (x) ® I em (Obj (x), b (x)) (2) => OTF (k) 'F (l em (θbj (x), b (x))) (3) In accordance with the expression (2) is not a linear relationship between the emanating from an object point light intensity I e m (x) and the irradiated light intensity there (in b (x)) is assumed. Vielmehr ist nun I em ( ) eine allgemeine Funktion des Wertes der zu erfassenden Objektstruktur und anderer Faktoren b(x) , die die nicht-linearen Rather, it is now I em () a general function of the value of the object to be detected structure and other factors b (x), the non-linear

Bedingungen repräsentieren. represent conditions. Der Vektorpfeil über b soll andeuten, dass es sich um mehrere Bedingungen oder Eigenschaften bi handeln kann. The vector arrow above b is meant to indicate that it can be multiple conditions or characteristics bi. Ein wichtiger Faktor bi ist die am Ort x eingestrahlte Lichtintensität Bel(x). An important factor is the bi x radiated local light intensity Bel (x). Andere Faktoren werden unten beispielhaft genannt. Other factors are exemplified below. Gemäß Gleichung (4) wird I em (x) als Taylor-Reihe mit konstanten Koeffizienten Ci angenähert ausgedrückt : According to equation (4), I em (x) is approximately expressed as Taylor series with constant coefficients Ci:

ϊ- em ≡ A + A Obj(x) + C 2 b- . ϊ- em ≡ A + A Obj (x) + C 2 b-. (x) + C 3 ' Obj(x) b- (x) (x) + C 3 'Obj (x) b- (x)

+ c 4 ' Obj(x) 2 • b- x) + c 5 Obj(x) b^x) 2 + ... + C 4 'Obj (x) 2 • x b) + c 5 Obj (x) b ^ x) 2 + ...

+ c 6 Obj(x) ' b^x) 3 + ... (4) + C 6 Obj (x) 'b ^ x) 3 + ... (4)

Zur vereinfachten Darstellung wird in Gleichung (4) nur auf eine nicht-lineare Bedingung bι(x) Bezug genommen. For simplified illustration, in equation (4), reference is made only to a non-linear condition bι (x). Anwendungsabhängig können weitere Bedingungen in den Prozess der Aussendung von Licht vom jeweiligen Objektpunkt involviert sein. Depending on the application other conditions in the process of emission of light can be involved from the respective object point. In diesem Fall treten entsprechende Terme auch in der Entwicklung gemäß Gleichung (4) auf, so insbesondere auch In this case, corresponding Terme also occur in the development according to equation (4), so, in particular also

Mischterme wie z. Mixed terms such. B. c 5b ' Obj(x) ' b^x) ' b 2 (x) . B. c 5b 'Obj (x)' b ^ x) 'b 2 (x). Der Term nach c 3 ist gerade der in Gleichung (1) genannte Ausdruck, wenn als nicht-lineare Objektbedingung b.(x) = Bel(x) angenommen wird. The term by c 3 is just in equation (1) above expression, if a non-linear object condition b. (X) = Bel (x) is assumed. Die Fouriertransformierte der ausgesandten Lichtintensität F(l em (θbj(x), b(x)j) enthält demnach analog zu Gleichung (1) den The Fourier transform of the emitted light intensity F (l em (θbj (x), b (x) j) contains therefore analogous to equation (1) the

Term c 3 F(ßel(x)) ® F(θbj(x)) . Term c 3 F (Key (x)) ® F (θbj (x)). Die Fouriertranformierte der Beleuchtungsmtensitat F(ßel(x)) ist als Summe einer Vielzahl von einzelnen δ-Funktionen darstellbar. The Fouriertranformierte the Beleuchtungsmtensitat F (Key (x)) is represented as a sum of a plurality of individual δ-functions. Je nach dem aktuellen Beleuchtungsmuster werden also Teile der fouriertransformierten Ob ektfunktion F(θb(x)) durch die Faltung mit der fouriertransformierten Beleuchtungsfunktion verschoben und mit entsprechendem Gewicht aufaddiert. Depending on the current illumination pattern so parts of the Fourier transformed Whether ektfunktion F (.theta..sub.B (x)) by the convolution with the Fourier transformed illumination function shifted and added up with appropriate weight. Dies ist m Figur 1 illustriert. This is illustrated m Figure 1.

Figur 1 zeigt die Struktur der Anregungsverteilung im reziproken Raum bei sinusförmig verteilter, geringer Beleuchtungsmtensitat entsprechend einer herkömmlichen, raumlich gemusterten Beleuchtung. Figure 1 shows the structure of the excitation distribution in reciprocal space for sinusoidally distributed, low Beleuchtungsmtensitat according to a conventional spatially patterned illumination. Die nach oben gerichteten Pfeile bezeichnen die Maxima, die aus der sinusförmigen Anregung herrühren (Fouriertransformierte der Sinusfunktion) . The upwardly directed arrows indicate the maxima resulting from the sinusoidal excitation (Fourier transform of the sine function). Zusatzlich ist die an das Maximum k b „gekoppelte" Struktur der Fouriertransformierten der Objektfunktion F(θbj +1 (k)) eingezeichnet. Die an die anderen Maxima gekoppelten Fouriertransformierten der Objektfunktion sind aus Ubersichtlichkeitsgrunden nicht eingezeichnet. Tatsächlich ist jedoch, da Obj(k) mit den virtuellen Raumfrequenzteilen im Muster der Objektbedingungen im reziproken Raum zu falten ist, Obj (k) an jedes virtuelle Maximum „gekoppelt". In addition, the k of the maximum b "coupled" drawn structure of the Fourier transform of the object function F (θbj +1 (k)). The coupled to the other maxima Fourier transform of the object function are not shown in Ubersichtlichkeitsgrunden. However, it is actually there Obj (k ) is to be folded with the virtual spatial frequency components in the pattern of the object conditions in reciprocal space, "coupled" Obj (k) to each virtual maximum. Nur der mittlere Teil an emittierten Raumfrequenzen (als Trager der OTF eingezeichnet) ist der Detektion zugänglich. Only the central part of the emitted spatial frequencies (as a carrier of the OTF shown) of the detection is accessible.

In Figur 1 ist beispielhaft illustriert, wie aus der Summe entsprechend der genannten Faltung durch die optische Abbildung (Multiplikation mit der raumfrequenzbegrenzten OTF) der detektierbare Bereich festgelegt („ausgestanzt") wird. Der Bereich detektierbarer Ob ekt-Raumfrequenzen wird bei Beleuchtung mit einem bestimmten Muster deutlich gegenüber dem Fall einer gleichmäßigen Beleuchtung erweitert. Mit den unten lo In Figure 1 is illustrated by way of example, as determined from the sum corresponding to said convolution through the optical imaging (multiplication with the space-frequency-limited OTF) of the detectable region ( "blanked") is. The range of detectable Whether ect spatial frequencies is determined when illuminated with a pattern extended significantly compared with the case of a uniform illumination. with the down lo

erläuterten Rekonstruktionsverfahren lassen sich die verschobenen Objekt-Raumfrequenzen wieder zu einem konsistenten Bild zusammensetzen. explained reconstruction methods can be put together again to form a consistent picture, the relocated object spatial frequencies.

Entsprechend Gleichung (4) liefern im nicht-linearen Fall aber auch Terme höherer Ordnung in b 1 (x) Beiträge zu I em wie z. According to equation (4) provide in the nonlinear case, but also higher-order terms in b 1 (x) contributions to em I such. B. die Terme mit den Faktoren c 5 bzw. c 6 . As the terms with the factors c 5 and c. 6 Die Fouriertransformierten dieser Terme sind auch in F(l em (θbj(x), b(x))) enthalten. The Fourier transforms of these terms are also included in F (l em (θbj (x), b (x))). Mit b 1 (x) = Bel(x) erhält man im Ausdruck (2) auch den Term c 5 ' JF(Bel(x)) ® F(Bel(x))] ® F(θbj(x)) . With b 1 (x) = Bel (x) is obtained in the expression (2) and the term c 5 'JF (Bel (x)) ® F (Bel (x))] ® F (θbj (x)). Mit einem gewissen With a certain

Anteil im Bild ist es jetzt möglich, Raumfrequenzen des Objekts zu messen, die vorher noch nicht zugänglich waren, da sie durch die Faltung mit der raumfrequenzbegrenzten Funktion F(ßel(x)) noch nicht in den mittels OTF detektierbaren Bereich geschoben werden konnten. In the image, it is now possible to measure spatial frequencies of the object that were previously not accessible because they could not be pushed into the detectable by OTF area by the convolution with the spatial frequency limited function F (Key (x)). Die Ausdehnung des Trägers von F(ßel(x)) ® F(ßel(x)) kann nun aber entsprechend größer sein, wodurch sich auch höhere Raumfrequenzen in den der OTF entsprechenden Bereich verschieben und so in der Abbildung messbar sind. The expansion of the carrier of F (Key (x)) ® F (Key (x)) can be correspondingly larger, but now, thus, higher spatial frequencies in the shift of the OTF and the corresponding area can be measured as in the figure. Weitere höhere Ordnungen wirken sich entsprechend in weiteren Faltungen mit den Fouriertransformierten der b i (x) aus, so dass noch höhere Objekt-Raumfrequenzen detektierbar sind. Other higher orders act accordingly in other convolutions with the Fourier transform of b i (x), so that still higher object spatial frequencies detectable. Im Prinzip ist es möglich, beliebig hohe Raumfrequenzen des Objekts zu detektieren und damit die Auflösung beliebig zu erhöhen, soweit entsprechende Koeffizienten in der Reihenentwicklung gemäß Gleichung (4) vorhanden sind. In principle it is possible to detect any high spatial frequencies of the object and thus to increase the resolution as desired, as far as respective coefficients of the series expansion in accordance with equation (4) are present. In der Praxis wird die bei der Rekonstruktion erzielbare Auflösung jedoch oft durch das bei den hohen Objekt-Raumfrequenzen erreichbare Signal-Rausch-Verhältnis begrenzt. In practice, the achievable resolution in the reconstruction, however, is often limited by the achievable at the high spatial frequencies of object-signal-to-noise ratio.

Das effektive Auftreten nieder- und höherfrequenter Komponenten des Beleuchtungsmusters im reziproken Raum ist in Figur 2 am Beispiel der Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. The effective appearance of low and higher frequency components of the illumination pattern in reciprocal space is shown in Figure 2 using the example of fluorescence microscopy. Wird das Objekt mit einer genügend hohen Beleuchtungsintensität be- strahlt, so ergibt sich eine nicht-lineare Abhängigkeit der Fluoreszenzemission von der Anregungsintensität (Sättigung der Fluoreszenz) und damit ein Muster der Anregbarkeit von Fluoreszenz (im Folgenden: Anregungsmuster) eines bestimmten Farbstoffes, das grundsätzlich aus unendlich vielen (virtuellen) Maxima im reziproken Raum besteht, deren absolute Höhe allerdings mit steigendem k schnell abnimmt. If the object with a sufficiently high illumination intensity radiates loading, the result is a non-linear dependence of the fluorescence emission of the excitation intensity (saturation of fluorescence) and thus a pattern of the excitability of fluorescence (hereinafter excitation pattern) of a particular dye, the principle consists of an infinite number of (virtual) maxima in reciprocal space, the absolute level but decreases rapidly with increasing k. Wie oben am Above on

Beispiel der relativ schwachen Anregungsintensität (linearer Fall, Figur 1) erläutert, ist die Objektfunktion an jede der Komponenten der Beleuchtungsfunktion gekoppelt. illustrated example, the relatively weak excitation intensity (linear case, figure 1), the object function is coupled to each of the components of the lighting function. In einem als Teilbild I em aufgenommenem Detektorsignal sind also alle Informationen, insbesondere über die interessierenden hochfrequenten Ortsfrequenzen der Objektfunktion enthalten. In a ingested as part of image I em detector signal so all information that contains in particular the interest of high frequency spatial frequencies of the object function. Die Rückgewinnung dieser Informationen wird unten in Zusammenhang mit der Bildrekonstruktion beschrieben. The recovery of this information is described below in connection with the image reconstruction.

Figur 2 illustriert die Struktur der Anregungsverteilung im reziproken Raum bei einem nicht-linear verzerrten Anregungsmuster. Figure 2 illustrates the structure of the excitation distribution in reciprocal space in a non-linear distorted excitation patterns. Zu dem virtuellen Maximum n = +2 entsprechend 2k b ist eine gekoppelte Struktur der Fouriertransformierten der Objektfunktion eingezeichnet (θbj +2 (k)j. Praktisch ist Obj(k) wiederum an jedes Maximum gekoppelt (aus Übersichtlichkeitsgründen nicht dargestellt) und mit verschobenen, unterschiedlich intensiven und phasengedrehten Versionen von sich selbst überlagert. Nur der mittlere Teil an emittierten Raumfrequenzen (Träger der OTF) ist der Detektion zugänglich. To the virtual maximum n = +2 corresponding 2k b is located (θbj +2 (k) j a coupled structure of the Fourier transform of the objective function. Practically, Obj (k) in turn coupled to each maximum (for reasons of clarity not shown) and with shifted, superimposed differing intensity and phase rotated versions of itself. Only the central part of the emitted spatial frequencies (carrier of the OTF) of the detection is accessible.

Das Ziel der optischen Abbildung ist die Gewinnung einer Objektabbildung, dh der das Objekt beschreibenden Funktion Obj(x). The aim of the optical imaging is to obtain an object image, that is, the function describing the object Obj (x). Diese Funktion muss aus den gemessenen Teilbildern I m rekonstruiert werden. This function must be I m reconstructed from the measured fields. Die Rekonstruktion der Objektabbildung basiert darauf, dass die Faktoren b i (x) aus den Teilbildern I m extrahiert werden oder unabhängig von der Bildaufnahme be- kannt sind. The reconstruction of the object image based on the fact that the factors b i (x) I m are extracted from the partial images or independently of the image pickup loading are known. Die erfindungsgemäße Unterscheidung der Faktoren b i (x) von der das Objekt beschreibenden Funktion Obj(x) erfolgt, indem die Faktoren bi, dh die oft räumlich gemusterten Objektbedingungen, variiert werden. B i (x) of the describing the object function OBJ (x) is discriminated according to the invention of the factors, the factors by bi, ie often spatially patterned object conditions, may be varied.

Die Variation der Objektbedingungen kann auf verschiedene Arten erfolgen. The variation of the object conditions can occur in various ways. Eine erste Möglichkeit besteht darin, b i (x) als ein räumliches Muster auszubilden, das am Objekt zur Aufnahme verschiedener Teil- oder Einzelbilder jeweils verschoben wird. A first possibility is b i (x) form as a spatial pattern which is shifted to the object for receiving different partial or frames. Alternativ ist es aber auch möglich, die Stärke des Musters (Kontrast der eingestellten Objektbedingungen am gesamten Objekt) oder die Form des Musters jeweils für die Aufnahme von Teilbildern zu verändern. Alternatively, it is also possible to change the strength of the pattern (contrast of the object set conditions throughout object) or the shape of the pattern in each case for the reception of frames. In jeden Falle werden die in der Entwicklung gemäß Gleichung (4) gezeigten Komponenten unterscheidbar. In each case, the in the development according to equation (4) are distinguishable components shown.

Die Bilderfassung des erfindungsgemäßen Erfahrens basiert auf der Aufnahme von mindestens zwei Teilbildern mit verschiedenen Objektbedingungen, unter denen die Faktoren b i (x), mit denen die erfasste Lichtintensität in nicht-linearem Zusammenhang steht, variiert werden. The image capture of experiencing the present invention is based on the inclusion of at least two partial images with different object conditions under which the factors b (x) with which the detected light intensity is in non-linear relationship can be varied i. Die Rekonstruktion der Objektabbildung aus den Teilbildern wird im Folgenden erläutert . The reconstruction of the object image from the partial images is explained below.

Rekonstruktion der Objektabbildung Reconstruction of the object image

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die in der Taylor-Entwicklung gemäß Gleichung (4) enthaltenen Terme, soweit sie einen messbaren Einfluss besitzen, durch das Lösen eines Gleichungssystems ermittelt und so voneinander getrennt. According to a preferred embodiment of the invention in the Taylor expansion in accordance with equation (4) terms contained so far as they have a measurable impact, determined by solving a system of equations and so separated from each other. Das Gleichungssystem, dessen Ermittlung unten im Einzelnen erläutert ist, lässt sich trotz der Multiplikation mit der OTF an jedem Punkt im Bereich des Trägers der OTF im reziproken Raum bestimmen und im Prinzip lösen. The system of equations, the determination of which is described in detail below, can be determined in reciprocal space and dissolve in principle in spite of the multiplication by the OTF at each point in the region of the wearer of the OTF. Durch Verschiebung in Fourierraum (oder durch Multiplikation mit exp(ιΔkxj im Ortsraum, Δk : Frequenzraum-Verschiebevektor) können die individuellen Komponenten dann so zusammengesetzt werden, dass sich ein hochauflosendes Bild ergibt. Dieses kann ggf. mit weiteren Dekonvolutionstechniken verarbeitet werden, um die Bildqualltat weiter zu steigern. By displacement in the Fourier space (or by multiplying by exp (ιΔkxj in the spatial domain, .DELTA.k: frequency-space displacement vector), the individual components can then be assembled so that it follows The high resolution image, this can possibly be processed further deconvolution to the Bildqualltat. to further increase.

Wie schon aus US-A-5 671 085 bekannt ist, ergibt die Beleuchtung des Objekts mit einem Muster aus möglichst hohen Raumfrequenzen eine Auflosungserhohung gegenüber der herkömmlichen Lichtmikroskopie. As is already known from US-A-5671085, the illumination of the object results in a pattern of high spatial frequencies as possible a Auflosungserhohung over conventional light microscopy. Durch die erfmdungsgemaße Ausnutzung eines nicht-linearen Zusammenhangs zwischen der Starke eines Musters, z. By erfmdungsgemaße utilization of a non-linear relationship between the strength of a pattern such. B. Werten bestimmter Objektbedingungen, an einem Objektpunkt und der von diesem Objektpunkt ausgehenden (emittierten bzw. gestreuten) Lichtintensitat ist es möglich, ein Bild mit einer noch höheren Ortsauflosung zu berechnen. B. values of certain object conditions, to an object point and the outgoing of this object point (the emitted or scattered) light intensity, it is possible to calculate an image with an even higher spatial resolution.

Ein Beispiel für die Bildung eines Musters von Objektbedingungen ist bei der Anregung von Fluoreszenz mit einer ortsab- hangigen Verteilung intensiven Anregungslichts gegeben. An example of the formation of a pattern of object conditions is given in the excitation of fluorescence with a ortsab- hangigen distribution intensive excitation light. Die nicht-lineare Abhängigkeit des vom Detektor erfassten Lichts kann z. The non-linear function of the light detected by the detector such can. B. durch die Sättigung der Anregung von im Objekt vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffen entstehen. As caused by the saturation of the excitation of the object existing fluorescent dyes. Besitzt das An- regungslicht eine genügend hohe Intensität, so erhalt man eine nicht-linearen Zusammenhang zwischen der eingestrahlten und der emittierten Lichtintensitat am betrachteten Objekt (siehe z. BDR Sandison et al. in „Handbook of Biological Confocal Microscopy", Plenum Press, New York and London, 2. Auflage, 1995, Kapitel 3, Seiten 47 bis 50; und RY Tsien et al . im genannten „Handbook of Biological Confocal Microscopy", Kapitel 16). Does the arrival excitation light a sufficiently high intensity, we obtain (a non-linear relationship between the incident and the emitted light intensity on the object being viewed see,. BDR Sandison et al., "Handbook of Biological Confocal Microscopy", Plenum Press, New York and London, 2nd edition, 1995, Chapter 3, pages 47 to 50; and RY Tsien et al in the aforementioned "Handbook of Biological Confocal Microscopy", Chapter 16).. Das detektierte Licht enthalt nun auch Informationen über Raumfrequenzen des Objekts, die sonst nicht zugänglich waren. The detected light now also contains information about spatial frequencies of the object that were otherwise inaccessible. Allerdings enthalt jedes so aufgenommene Bild eine Mischung von Anteilen hoher Raumfrequenzen, die aber dann durch Aufnahme unter unterschiedlichen Bedingungen und Verrechnung mehrerer Teilbilder getrennt und zu einem konsistenten, hochauflösenden Bild zusammengesetzt werden können. However, each so captured image contains a mixture of units of high spatial frequencies, which can be then separated by absorption under different conditions and clearing of several partial images and assembled to form a consistent, high-resolution image.

Das Gleichungssystem zur Trennung der Komponenten der Taylor- Entwicklung gemäß Gleichung (4) wird bspw. im Fall der Fluoreszenzmikroskopie bei Beleuchtung mit einer einem Liniengitter ähnlichen Struktur mit den folgenden Schritten ermittelt. The system of equations for separating the components of the Taylor expansion in accordance with equation (4), for example. Determined in the case of fluorescence microscopy under illumination with a similar lattice structure with a line the following steps.

Die Intensitätsverteilung des Anregungslichts wird bei diesem Beispiel annähernd durch eine in den positiven Bereich verschobene Sinusfunktion beschrieben. The intensity distribution of the excitation light is described in this example by approximately a shifted in the positive range sine function. Als Fouriertransformierte ergeben sich im Idealfall punktförmige Maxima bei k = 0, k = + k b und k = - k b (siehe Figur 1). Punctate maxima arise in the ideal case, as Fourier transform at k = 0, k = k + b and k = - k b (see Figure 1). Diese Maxima besitzen je nach Modulationsgrad eine bestimmte Energie und einen bestimmten Phasenwinkel in der komplexen Ebene, der von der Position bzw. der Verschiebung (Lage) des Musters des Anregungslichts abhängt. These maxima have depends depending on the degree of modulation a particular energy and a particular phase angle in the complex plane, of the position or the displacement (position) of the pattern of the excitation light. Durch den Einfluss der nicht-linearen Abhängigkeit der Fluoreszenzemission von der Anregungsintensität (Sättigung der Fluoreszenz) ergibt sich das in Figur 2 gezeigte Muster mit nieder- und höherfrequenten Komponenten im reziproken Raum, bspw. als Anregbarkeitsmuster für einen bestimmten Fluorophortyp. Due to the influence of the non-linear dependence of the fluorescence emission of the excitation intensity (saturation of fluorescence), the pattern shown in Figure 2 results with low and higher frequency components in reciprocal space, for example. As Anregbarkeitsmuster for a particular Fluorophortyp.

Zur Rekonstruktion der Objektbildung genügt es, dass näherungsweise bei einem endlichen Raumfrequenzwert k max = + mk b abgebrochen wird und in der Rechnung nur Maxima mit kleineren Raumfrequenzen berücksichtigt werden. For reconstruction of the object formation it is sufficient that is interrupted approximately at a finite spatial frequency value k max = mk + b and only be taken into account with lower spatial frequencies in the order maxima.

Wird das Anregungslichtmuster gegenüber dem Objekt verschoben, so ändern sich die jeweiligen komplexen Phasenlagen der einzelnen punktför igen Maxima im Fourieraum. If the excitation light pattern shifted from the object, then the respective complex phases of the individual punktför change strength maxima in Fourieraum. Berücksichtigt man ±m Anregungs-Maxima und das Maximum bei k = 0 , so benötigt man Z = 2m + 1 unter verschiedenen Bedingungen aufgenommene Bilder, um die einzelnen durch das Mikroskop abgebildeten Komponenten des Objekts, die mit dem jeweiligen Maximum gefaltet (also verschoben) sind, separieren zu können (in Figur 2 ist nur eine Komponente dargestellt). Taking into account ± m excitation maxima and the maximum at k = 0, so it takes Z = 2m + 1 recorded under different conditions images to the single imaged by the microscope components of the object which is folded with the respective maximum (ie, moved) to are separate (in Figure 2, only one component is shown). Es kann z. It can, for. B. vorgesehen sein, dass Z = 5 Maxima berücksichtigt werden. B. be provided that Z = 5 maxima are taken into account. Der Phasenwinkel der Maxima im Frequenzraum des Anregungsmusters bewegt sich bei Verschiebung des Musters proportional zu n , da eine Verschiebung im Raum um Δx einer Multiplikati- The phase angle of the maxima in the frequency space of the excitation pattern moves in proportion to n when shift of the pattern, since a shift in the space around Ax a multiplicative

on im Frequenzraum mit expikΔxj entspricht. on equal in frequency space with expikΔxj. Dabei entspricht n der Nu mer des jeweiligen Raumfrequenzanteils (siehe Figur 2). Where n is the instant of the respective spatial frequency component corresponding to mer (see Figure 2). Werden also verschiedene Bilder (Teilbilder) I n (k) = F(l n (x)) des Objekts mit jeweils um ein Fünftel des Grundmusters gegeneinander verschobener Phasenlage des Beleuchtungsmusters (also auch des Anregungsmusters) aufgenommen, so ergibt sich das folgende Gleichungssystem: Thus, if different images (partial images) I n (k) = F (l n (x)) of the object with each (thus also of the excitation pattern) was added to one-fifth of the basic pattern against each phase shifted location of the illumination pattern, this results in the following system of equations:

M M

Figure imgf000025_0001

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 exp(i2π / 5) exp(- i2π / 5) exp(i4π / 5) exp(- i4π / 5) 1 exp (i2π / 5) exp (- i2π / 5) exp (i4π / 5) exp (- i4π / 5)

M 1 exp(i4π / 5) exp(- i4π / 5) exp(i8π / 5) exp(- i8π / 5) M 1 exp (i4π / 5) exp (- i4π / 5) exp (i8π / 5) exp (- i8π / 5)

1 exp(iβπ / 5) exp(- i6π / 5) exp(il2π / 5) exp(- il2π / 5) 1 exp (iβπ / 5) exp (- i6π / 5) exp (il2π / 5) exp (- il2π / 5)

1 exp(i8π / 5) exp(- i8π / 5) exp(il 6π / 5) exp(- il 6π / 5) 1 exp (i8π / 5) exp (- i8π / 5) exp (il 6π / 5) exp (- il 6π / 5)

In diesem Gleichungssystem bezeichnen die Obj n (k) die zum n . In this system of equations, the Obj n (k) denote for n. Maximum des Anregungsmuster gehörenden, verschobenen kom- plexwertigen Komponenten des fouriertransformierten Objekts (Objekt-Raumfrequenz), die dann durch die OTF des abbildenden Systems transmittiert werden. Maximum of the excitation pattern belong shifted com- plexwertigen components of the Fourier transformed object (object spatial frequency), which are then transmitted through the OTF of the imaging system.

Die Lösung des Gleichungssystems liefert die individuellen Objektkomponenten, die zum jeweiligen Maximum des Anregungsmusters gehören. The solution of the system provides the individual object components that belong to the respective maximum of the excitation pattern. Die Lösung kann z. The solution for can. B. durch Invertieren der Matrix M erfolgen. Example, by inverting the matrix M. Durch Multiplikation der inversen Matrix (M _1 ) mit dem rechts stehenden Vektor der gemessenen Intensitäten I n (k) werden die individuellen transmittierenden Objektkomponenten ermittelt. By multiplying the inverse matrix (M _1) to the rightmost vector of the measured intensities I n (k) the individual transmitting property components are determined. Liegen mehr Messdaten vor als zur Lösung der Rekonstruktionsaufgabe nötig sind, so kann z. If more measured data as needed to solve the reconstruction task, such can. B. eine analoge, nicht quadratische oder rechteckige Matrix aufgestellt werden. B. an analog, not square or rectangular matrix are positioned. Für die Berechnung der Lösung ist dann z. then z to calculate the solution. B. das Verfahren der pseudoinversen Matrix anwendbar, das es erlaubt, eine Lösung im Sinne der kleinsten Fehlerquote zu ermitteln. B. the process of the pseudo inverse matrix applicable that allows to identify a solution within the meaning of the smallest error rate.

Die Rechnung wird aufgrund der Linearität der Fouriertrans- formation vorzugsweise bildpunkt- oder pixelweise im Realraum ausgeführt . The bill is due to the linearity of the Fourier transformation preferably formation on pixels as performed in real space.

Die komplexwertigen Komponenten Obj n (k) können nun um den Vektor Δk im Fourieraum (oder durch die og entsprechende Multiplikation im Realraum) verschoben werden, so dass die jeweilige Raumfrequenz k dort zu liegen kommt, wo sie bei musterfreier, gleichmäßiger Beleuchtung gemessen werden würde. The complex-valued components Obj n (k) can now be (or by the aforementioned corresponding multiplication in the real space) by the vector .DELTA.k in Fourieraum shifted so that the respective spatial frequency k there comes to lie where they would be measured in pattern-free, uniform illumination , Δk ist hier also -nk b . .delta..sub.k here so -nk b.

In einem weiteren Schritt ist eine Korrektur der Komponenten Obj n k) in ihrer komplexen Phasenlage je nach gegenseitiger Phasenlage φ n der Frequenzraum-Anregungsmaxima im Bild I 0 vorgesehen (Multiplikation mit exp(- iφ n )) . In a further step, a correction of the components Obj n k) is in its complex phase position depending on the mutual phase position φ n of the frequency domain excitation maxima in the image I 0 provided (multiplication with exp (- Iø n)). Anschließend werden die Komponenten Obj n (k), ggf. durch eine gewichtete Addition, zu einem konsistenten Bild (der gewünschten Objektabbildung) vereinigt. The components Obj n (k) are, if necessary, combined by a weighted addition to a consistent image (the desired object image). Damit wird eine Ausdehnung des Trägers der Gesamt-OTF auf einen relativ zur linearen Abbildung deutlich vergrößerten Bereich und damit eine Erhöhung des Auflösungsvermögens ermöglicht. Thus, an expansion of the carrier of the total OTF a significantly enlarged relative to the linear mapping area and thus an increase of the resolving power is made possible.

Die illustrierte Verschiebung von Raumfrequenzkomponenten kann in verschiedenen Raumrichtungen durchgeführt werden. The illustrated shift of spatial frequency components can be carried out in different directions. Dies kann nacheinander durch unterschiedliche Orientierung des Beleuchtungsmusters oder simultan durch Beleuchtung mit einer mehrdimensionalen Struktur erfolgen. This can be done sequentially by different orientation of the illumination pattern or simultaneously by illumination with a multidimensional structure. Das Auflösungsvermögen ist in ein, zwei oder drei Dimensionen vergrößerbar. The resolving power can be increased in one, two or three dimensions. Die Gesamttransferfunktion kann im Anschluss daran oder bei Zwischenschritten noch durch entsprechendes Filtern und/oder Anwenden von an sich bekannten Entfaltungstechniken verändert werden. The overall transfer function can still be changed by appropriate filtering and / or applying known deconvolution techniques thereafter or at intermediate steps.

Die Rekonstruktion der Objektabbildung ist nicht auf die beschriebene Lösung des Gleichungssystems mit der Matrix- Methode beschränkt. The reconstruction of the object image is not limited to the solution of the system with the matrix method. Alternativ können z. Alternatively, for can. B. Quadratur- Techniken (analog zu WO 98/45745) oder algebraische bzw. iterative Rekonstruktionsverfahren (Maximum Likelihood/Expecta- tion Maximization, Maximum Entropie, Algebraic Reconstruction und dergleichen) verwendet werden. B. quadrature techniques (analogous to WO 98/45745) or algebraic and iterative reconstruction method (Maximum Likelihood / Expecta- tion Maximization, maximum entropy, Algebraic Reconstruction and the like) are used.

Die Erfindung ist nicht auf die nicht-lineare Anregung von Fluoreszenzemission beschränkt. The invention is not limited to the non-linear excitation of fluorescence emission. Die Verfahrensweise ist entsprechend auch mit beliebig anderen Faktoren bi implementierbar, die geeignet sind, allein für sich oder im Zusammenwirken untereinander, insbesondere im Zusammenwirken mit der Beleuchtungsintensität, die Intensität des vom Objekt ausgehenden Lichts zu beeinflussen. The procedure is implemented in accordance with any other factors bi, which are suitable, alone or in cooperation with one another, in particular in cooperation with the illumination intensity to affect the intensity of light emanating from the object. Ausführungsbeispiele erfindungsgemäßer optischer Systeme Embodiments of the present invention optical systems

Ein erfindungsgemäßes optisches System ist in Figur 3 dargestellt. An inventive optical system is shown in FIG. 3 Die an sich bekannten Komponenten eines herkömmlichen Mikroskops sind mit gestrichelten Rahmen eingezeichnet. The components known per se of a conventional microscope are shown with dashed border. Das optische System 100 ist mit einer Beleuchtungseinrichtung 10, mindestens einem Mustergenerator 20, 20', 20'', einer Beleuchtungsoptik 30, einer Abbildungsoptik 50, einer Detektoreinrichtung 60 und einem Bildgenerator 70 aufgebaut. The optical system 100 is constructed with a lighting device 10, at least a pattern generator 20, 20 ', 20' ', an illumination optics 30, imaging optics 50, a detector device 60 and an image generator 70th Das Bezugszeichen 40 bezieht sich auf die mit dem System 100 zu untersuchende Probe. The reference numeral 40 refers to the with the system 100 to be examined sample. Die Komponenten 10, 30, 50 und 60 können durch optische Bauteile bereitgestellt werden, wie sie aus der Lichtmikroskopie und aus der optischen Mess- und Analysetechnik, z. The components 10, 30, 50 and 60 may be provided by optical components, as known from optical microscopy and from the optical measurement and analysis technology, z. B. der Spektroskopie, bekannt sind. B. spectroscopy, are known. Anwendungsabhängig können die Komponenten 30 und/oder 50 entfallen oder durch ein gemeinsames Bauteil gebildet werden. Depending on the application, the components 30 and / or 50 can be omitted or formed by a common component. Es kann auch vorgesehen sein, dass die Komponenten 20 und 30 durch ein gemeinsames optisches Bauteil gebildet werden. It may also be provided that the components are formed 20 and 30 through a common optical component.

Der Mustergenerator 20, 20' und/oder 20 ' ' ist allgemein eine Einrichtung zur Bildung von Objektbedingungen mit einem vorbestimmten räumlichen Muster am Objekt 40. Anwendungsabhängig kann der Mustergenerator 20 eine Maske mit einer bestimmten ein- oder zweidimensionalen Übertragungscharakteristik entsprechend dem gewünschten Muster sein. The pattern generator 20, 20 'and / or 20' 'is generally a device for the formation of object conditions at a predetermined spatial pattern on the object 40. Depending on the application, the pattern generator 20 may be a mask with a particular one or two dimensional transfer characteristic corresponding to the desired pattern. Die Maske kann insbesondere durch ein Beugungsgitter (siehe Figur 4) (oder Phasengitter) oder eine Matrixanordnung aus einzeln ansteuerbaren Reflektor- oder Transmissionspixeln gebildet werden. The mask may, in particular by a diffraction grating (see Figure 4) are formed (or phase grating), or a matrix array of individually controllable reflector or transmission pixels. Im letzteren Fall werden DMD-Einrichtungen („Digital Mirror Device") bzw. LCD-Matrixanordnungen verwendet. Der Mustergenerator kann auch eine Spiegelanordnung zur Erzeugung eines Interferenzmusters (siehe Figur 5) oder eine Einrichtung zur unmittelbaren physikalischen oder chemischen Beeinflussung des Objekts 40 (z. B. eine Heizeinrichtung oder einen Ultraschallgeber) umfassen. Abweichend von der Komponente 20 in Figur 3 kann der Mustergenerator auch zwischen der Beleuchtungsoptik 30 und dem Objekt 40 (Komponente 20'') oder unmittelbar am Objekt 40 vorgesehen sein (Komponente 20'). In the latter case DMD devices are ( "Digital Mirror Device") or LCD matrix assemblies used. The pattern generator may also include a mirror assembly for generating an interference pattern (see Figure 5) or a device for direct physical or chemical manipulation of the object 40 (e.g. . B. comprise a heater or an ultrasonic transducer). Notwithstanding the component 20 in Figure 3, the pattern generator between the illumination optics 30 and the object (40 component 20 '') or may be provided directly on the object 40 (component 20 ').

Der Bildgenerator enthält eine Einrichtung zur Rekonstruktion der Objektabbildung entsprechend den oben erläuterten Prinzipien. The image generator includes means for reconstructing the object image in accordance with the principles explained above. Als Bildgenerator kann ein speziell ausgelegter Schaltkreis oder auch ein entsprechend programmierter Computer verwendet werden. As an image generator is a specially designed circuit or a suitably programmed computer can be used. Der Bildgenerator kann zusätzlich Speicher-, Steuer- und/oder Anzeigekomponenten enthalten. The image generator may include additional storage, control and / or display components.

Figur 4 zeigt Einzelheiten eines erfindungsgemäßen optischen Systems am Beispiel eines Epifluoreszenzmikroskops 100. Die Beleuchtungseinrichtung 10 wird durch eine intensive Lichtquelle gebildet. Figure 4 shows details of an optical system according to the invention on the example of an epifluorescence microscope 100. The illumination device 10 is formed by an intense light source. Da zur Ausnutzung nicht-linearer Effekte hohe Lichtintensitäten benötigt werden, wird vorzugsweise eine gepulste Lichtquelle, wie z. As for the utilization of non-linear effects, high light intensities are required, preferably is a pulsed light source such. B. ein Pulslaser oder eine Blitzlampe verwendet. B. uses a pulse laser or a flash lamp. Die Beleuchtungseinrichtung kann aber auch durch eine Hochdruckdampflampe (z. B. Quecksilberdampflampe) gebildet werden. However, the illumination device can also be formed by a high-pressure vapor lamp (z. B. mercury vapor lamp). Als Mustergenerator 20 (Maske) ist beispielhaft ein verstellbares und ggf. drehbares und/oder verschiebbares Beugungsgitter 22 vorgesehen, das entsprechend der Position 21 der Bildfeldblende in einer konjugierten Objektebene angeordnet ist. As pattern generator 20 (mask) an adjustable and optionally rotatable and / or displaceable diffraction grating 22 is provided by way of example disposed according to the position of the field stop 21 in a conjugate object plane. Das Beugungsgitter 22 ist ein Transmissionsgitter mit einem Gitterabstand von z. The diffraction grating 22 is a transmission grating having a grating pitch of z. B. 30 μm. B. 30 microns. Das Beugungsgitter 22 ist an einem (nicht dargestellten) Stellantrieb angeordnet. The diffraction grating 22 is arranged on a (not shown) actuator.

Die Beleuchtungsoptik 30 weist einen Anregungsfilter 31, einen dichroitischen Spiegel 32 zum Einkoppeln des Anregungslichts in eine Mikroskopsäule und Objektivlinsen 33. Am Ort des Objekts 40 wird ein Bild des Beugungsgitters 22 als Be- leuchtung für die zu untersuchende Probe in der entsprechenden Fokusebene gebildet. The illumination optical system 30 has an excitation filter 31, a dichroic mirror 32 for coupling the excitation light in a microscope column and objective lens 33. At the location of the object 40 an image of the diffraction grating 22 as ILLUMI- for the examined sample in the corresponding focal plane is formed. Die Abbildungsoptik 50 wird wiederum durch die Objektvlinsen 33, einen Emissionsfilter 51 und einer optional vorgesehenen Optik 52 zur Bildvergrößerung gebildet. The imaging optics 50 is in turn by the Objektvlinsen 33, an emission filter 51 and an optionally provided optics 52 is formed for image magnification. Die Detektoreinrichtung 60 ist ein CCD-Detektor, von dem auf den (nicht dargestellten) Bildgenerator Daten übertragen werden. The detector device 60 is a CCD detector, data is transmitted from the (not shown) on the image generator.

Beim Aufbau gemäß Figur 4 kann das Beugungsgitter 22 durch eine DMD-Einrichtung oder eine LCD-Matrixanordnung ersetzt werden, die im Lichtweg zwischen der Beleuchtungseinrichtung 10 und dem Objekt 40 angeordnet ist. In the construction according to Figure 4, the diffraction grating 22 may be replaced by a DMD device or an LCD matrix arrangement, which is arranged in the light path between the lighting device 10 and the object 40th In diesem Fall ist zwischen den Komponenten 20 und 40 eine zusätzliche Verkleinerungsoptik vorgesehen. In this case, an additional demagnification optics is provided between the components 20 and 40th Eine DMD-Einrichtung umfaßt z. A DMD device comprises z. B. rd. B. rd. 450 " 600 Reflektorelemente mit einer Pixelgröße von rd. 17 17 μm 2 . 450 "600 reflector elements having a pixel size of approx. 17 17 microns. 2

Für die erfindungsgemäße Aufnahme mehrerer Teilbilder mit unterschiedlichen Phasenlagen wird das Beugungsgitter 22 in kleinen Schritten gegenüber dem Objekt 40 verschoben. For the inventive recording of several partial images with different phase positions of the diffraction grating is shifted in small steps over the object 40 22nd Die Schrittweite ist von der Strukturdimension der Maske und der Zahl der aufzunehmenden Teilbilder abhängig und beträgt z. The step size is dependent on the structure of the mask dimension and the number of partial images to be recorded, and is,. B. bei 30 μm Strukturdimension und 7 Teilbildern 30/7 μm) . B. microns at 30 structural dimension and 7 sub-images 30/7 .mu.m). Alternativ kann auch bei einem feststehenden Beugungsgitter 22 eine Verschiebung des Objekts 40 vorgesehen sein, wobei dies jedoch zusätzliche Schritte der Bildkorrektur bei der Rekonstruktion der Objektabbildung erfordert. Alternatively, a displacement of the object 40 may be provided also with a fixed diffraction grating 22, but this requires additional steps of image correction in the reconstruction of the object image. Alternativ ist es auch möglich, die Phase der verschiedenen Beugungsmaxima direkt durch geeignete optische Elemente zu beeinflussen. Alternatively, it is also possible to influence the phase of different diffraction maxima directly by appropriate optical elements. Die minimale Anzahl der für die Rekonstruktion des Gesamtbildes notwendigen Aufnahmen von Teilbildern ergibt sich durch die Anzahl der Unbekannten des zugehörigen Gleichungssystems (siehe oben). The minimum number of necessary for the reconstruction of the total image recordings of partial images obtained by the number of unknowns of the associated equation system (see above). Es sind mindestens zwei Teilbildaufnahmen vorgesehen. There are at least two field images are provided. Um die Auflösung in allen Raumrichtungen zur erhöhen, wird das Objekt 40 mit Mustern unter verschiedenen Winkeln nacheinander oder mit einer Maske wie bspw. mit der DMD- oder LCD-Einrichtung mit einem zweidimensionalen Muster, das Beugungsmaxima in mehreren Richtungen der Ebene hervorruft, in verschiedenen Phasenlagen in jeder Dimension beleuchtet. In order to increase the resolution in all spatial directions, the object 40 with patterns at various angles is causing or sequentially a mask such as, with the DMD or LCD device having a two-dimensional pattern, the diffraction maxima in several directions of the plane, in different phase relationships illuminated in each dimension.

Durch Erstellen von Fokusserien kann man noch zusätzliche Informationen über die axiale Struktur des Objekts gewinnen und damit dreidimensionale Objektabbildungen ableiten. By creating focus series can win additional information about the axial structure of the object and thus derive three-dimensional object images. Dies wird einerseits durch die inkohärente Lichtquelle und andererseits durch das Vorhandensein der Nullpunkt-Beugungsordnung des Gitters noch zusätzlich erleichtert. This is additionally facilitated one hand by the incoherent light source and on the other hand, by the presence of the zero-diffraction order of the grating. Ein weiterer Auflösungsgewinn kann durch Drehen des Objekts um eine auf der optischen Achse senkrecht stehende Achse unter dem optischen System erreicht werden. A further gain in resolution can be achieved by rotating the object about an axis perpendicular to the optical axis among the optical system.

Das Objekt 40 wird mit derart Momentanintensitäten beleuchtet bzw. angeregt, dass die Farbstoffe in der Probe gesättigt werden, so dass sich die gewünschten nicht-linearen Effekte zur Erhöhung des Auflösungsvermögens ergeben. The object 40 is illuminated with such instantaneous intensities or excited, that the dyes are saturated in the sample, so that results in the desired non-linear effects to increase the resolving power. Die gesuchten Anteile der sich überlagernden individuellen Ordnungen können aus den Bildern bei verschiedenen Phasenlagen der Anregungsstruktur errechnet werden. The desired proportions of overlapping individual orders can be calculated from the images at different phases of the excitation structure. Es ist auch möglich, aus Aufnahmen von Teilbildern mit verschiedener Beleuchtungsintensität hoch auflösende Bilder zu rekonstruieren. It is also possible to reconstruct high-resolution images from recordings of partial images with different illumination intensity. Unterdrückt man (z. B. durch Ausblenden) die Nullpunkt-Beugungsordnung des Beugungsgitters 21, so erhöht man damit in vorteilhafter Weise den Modulationsgrad der Beleuchtungsfunktion und damit die relative Intensität in höheren Anregungsordnungen. Suppresses one (eg. As by hiding) the zero diffraction order of the diffraction grating 21, so in an advantageous manner so that increasing the degree of modulation of the illumination function and thus the relative intensity in higher excitation magnitude. Außerdem kann die Energie in höhere Raumfrequenzbereiche geschoben werden. In addition, the energy can be pushed into higher spatial frequency ranges. Bei dem abgewandelten Aufbau eines Epifluoreszenzmikroskops 100 gemäß Figur 5 wird die Probe (das Objekt) 40 mit Laserlicht beleuchtet. In the modified construction of an epifluorescence microscope 100 according to Figure 5, the sample (object) 40 illuminated with laser light. Die Lichtquelle 10 ist vorzugsweise ein Pulslaser (z. B. mit einem optisch-parametrischen Oszillator, der mit einem frequenzverdreifachten NdYAG-Laser gepumpt ist, oder mit einem Ti-Saphir-Laser) , kann aber auch durch eine andere genügend intensive Lichtquelle gebildet werden. The light source 10 is preferably a pulse laser (for. Example, with an optical parametric oscillator which is pumped by a frequency-NdYAG laser, or a Ti-sapphire laser), but can also be formed by another sufficiently intense light source , Der Mustergenerator 20 wird durch eine Gruppe ebener Spiegel 23 - 27 gebildet, die dazu eingerichtet sind, das Anregungslicht von der Lichtquelle 10 auf verschiedene Strahlengänge zu zerlegen, die aus verschiedenen Richtungen auf das Objekt 40 treffen. The pattern generator 20 is formed by a group of plane mirrors 23 - 27 which are adapted to divide the excitation light from the light source 10 at different beam paths which meet from different directions to the object 40th Das Anregungslicht wird mit dem teildurchlässigen Spiegel 23 und die voll reflektierenden Spiegel 25 - 27 von zwei entgegengesetzten Seiten auf das Objekt 40 gerichtet. The excitation light is with the partially transmitting mirror 23 and the fully reflecting mirror 25 - 27 addressed by two opposite sides of the object 40th Optional kann der zweite teildurchlässige Spiegel 24 vorgesehen sein, um einen dritten Anregungslichtweg zum Objekt 40 zu bilden. Optionally, the second partially transmitting mirror 24 may be provided to form a third excitation light to the object 40th Es ergeben sich drei miteinander interferierende Anregungs-Lichtstrahlen, die eine Verwendung des Mikroskops 100 in der höchstauflösenden 3D-Mikroskopie erlauben. This results in three interfering with each other excitation light beams that allow use of the microscope 100 in the super-resolution 3D microscopy. Für zweidi- mensionale Anwendungen kann auf den Spiegel 24 verzichtet werden. For two-dimensional applications can be dispensed with the mirror 24th Die Strahlen interferieren über einen Bereich der in der Größenordnung der Kohärenzlänge der Lichtquelle 10 liegt. The beams interfere over a range lying in the order of the coherence length of the light source 10th

Zur Veränderung der Objektbedingungen (Interferenzmuster am Objekt 40) zur Aufnahme verschiedener Teilbilder sind mindestens zwei Spiegel verschiebbar angeordnet. For changing the object conditions (interference pattern on the object 40) for receiving different partial images are arranged displaceably at least two mirrors. Bspw. For example. ist vorgesehen, dass die Spiegel 24 und 25 zur Änderung des Interferenzmusters verschiebbar sind. it is provided that the mirrors 24 and 25 are displaced to change the interference pattern. Alternativ ist zur Veränderung der Objektbedingungen mindestens ein elektrooptisches Element zur Änderung der Phasenlage des Beleuchtungslichts in einem der Teil-Lichtwege vorgesehen. Alternatively, for changing the object conditions at least one electro-optical element for changing the phase angle of the illumination light is provided in one of the sub-light paths.

Die Beleuchtungsoptik 30 ist in Figur 5 aus Übersichtlichkeitsgründen nicht dargestellt, kann aber ggf. bauformabhän- gig ohnehin weggelassen werden. The illumination optics 30 is not shown in Figure 5 for clarity, but may possibly be omitted bauformabhän- gig anyway. Die Abbildungsoptik 50 um- fasst die Objektivlinsen 53, den Emissionsfilter zur Absorption des Anregungslichts 51 und optional eine Optik 52 zur Bildvergrößerung. The imaging optics 50 environmentally summarizes the objective lens 53, the emission filter for the absorption of the excitation light 51 and an optional optics 52 to the image magnification. Als Detektor ist wiederum ein CCD-Detektor 60 vorgesehen. The detector, in turn, a CCD detector 60 is provided.

Um ein gute axiale Diskriminierung zu erhalten, kann das Anregungslicht zugleich noch aus einer oder mehreren Richtungen durch das (nicht dargestellte) Objektiv und/oder von der dem Objektiv abgewandten Seite auf das Objekt 40 fallen, das sich im Differenzbereich der Anregungslichtstrahlen (kreuz schraffierte Region) befindet. To obtain a good axial discrimination, the excitation light can at the same time or from one or more directions (not shown) through the lens and / or fall off the side remote from the objective side to the object 40, which (in the difference region of the excitation light beams cross hatched region ) is located. Die durch Nicht-Linearitäten erzielbare zusätzlich Auflösungserhöhung kann wiederum durch Benutzung entsprechend starker Laser bzw. gepulster Laser mit hohen Momentanintensitäten erreicht werden. The achievable by non-linearities in addition increase in resolution can again be achieved by using correspondingly strong laser or pulsed laser with high instantaneous intensities. Auch die Verwendung anderer intensiver Lichtquellen (z. B. Blitzlicht) ist möglich und ggf. vorteilhaft. The use of other intense light sources (eg. B. flash light) is possible and, if advantageous.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden mehrere Teilbilder jeweils mit verschiedenen Interferenzmustern am Objekt 40 aufgenommen und nach den oben erläuterten Prinzipien zur Gewinnung der Objektabbildung verarbeitet. To carry out the process of the invention a plurality of partial images are recorded each with different interference patterns at the object 40 and processed according to the principles explained above, for obtaining the object image.

Die erläuterten Ausführungsbeispiele basieren auf der Ausnutzung der nicht-linearen Abhängigkeit des erfassten Lichtes von der Intensität des Anregungslichts durch Sättigung von Fluoreszenzfarbstoffen. The described embodiments are based on the use of non-linear dependence of the detected light from the intensity of the excitation light by saturation of fluorescent dyes. Alternative nicht-lineare Effekte sind durch die Sättigung der Absorption von Anregungslicht unter intensiver Beleuchtung, die Abhängigkeit der Phase des emittierten oder gestreuten Lichts von der im Objekt vorhandenen Beleuchtungsintensität, die sich im Detektor (z. B. über Interferenz) oder vor diesem in einer nicht-linearen Intensitätsabhängigkeit umsetzt, SHG- oder THG-Prozesse, eine Abhängigkeit der Lichteigenschaften der Ramanstreuung vom Wert einer oder mehrerer Objektbedingungen, zeitlich kohärente Effekte (z. B. Rabi-Oszillationen) an Atomen oder Molekülen im Objekt, CARS-Prozesse, Mehrphotonen-Absorptionen, stimulierte Emissionen im Objekt, die Besetzung langlebiger Anregungszustande oder chemisch veränderter Zustande in den Fluorophoren vor oder wahrend der Beleuchtung, strahlungslose Energietranferprozesse und/oder physikalische oder chemische Objektbedingungen gegeben. Alternative non-linear effects are due to the saturation of the absorption of excitation light under intensive illumination, the dependence of the phase of the emitted or scattered light from the present in the object illumination intensity in the detector (eg., Via interference), or prior to this in a non-linear intensity dependence reacted, SHG or THG processes, a dependency of the light properties of the Raman scattering from the value of one or more object conditions, temporally coherent effects (z. B. Rabi oscillations) of atoms or molecules in the object, CARS processes, multiphoton absorptions, stimulated emission in the object, the cast of long-lived excited states or chemically altered state in the fluorophores before or during given the lighting, non-radiative Energietranferprozesse and / or physical or chemical property conditions.

Insbesondere zur Ausnutzung zeitlich kohärenter Effekte (Rabi-Oszillationen) an Atomen oder Molekülen oder Fluorophoren im Objekt (in Losung, in Festkörpern, in Gasen oder auch unter Vakuumbedingungen) werden vorzugsweise Beleuchtungseinrichtungen mit extrem kurzen Pulslangen (z. B. <100 fs) verwendet. In particular for use in time coherent effects (Rabi oscillations) of atoms or molecules or fluorophores in the object (in solution, in solids, in gases or also in vacuum conditions) lighting devices with extremely short pulse lengths (e.g., B. <100 fs) used, preferably , Basiert der nicht-lineare Effekt auf der stimulierten Emission so wird diese gleichzeitig oder in zeitlicher Abfolge induziert. Based on the nonlinear effect of stimulated emission so is these induced simultaneously or in time sequence. Die stimulierte Emission kann bei der selben Wellenlange wie der des Anregungslichts oder auch bei anderen Wellenlangen, z. The stimulated emission can at the same wavelength as that of the excitation light or in other wavelengths such. B. bei einer typischen Fluoreszenzwellenlan- ge, induziert werden. B. ge be induced in a typical Fluoreszenzwellenlan-. Die Ausnutzung von Energietransferprozessen bedeutet, dass Energie der Anregungsstrahlung stählend oder strahlungslos von Fluorophoren auf benachbarte Fluoro- phor-Molekule übertragen wird und dadurch eine multi-lineare Abhängigkeit der emittierten Lichtintensitat von der am Nachbarort eingestrahlten Intensität entsteht. The exploitation of energy transfer processes means that energy of the excitation radiation is transmitted Steeling or nonradiative of fluorophores to adjacent fluorophores phor molecules and thereby results in a multi-linear dependence of the emitted light intensity on the irradiated on the neighboring intensity.

Zu den physikalischen oder chemischen Änderungen der Objektbedingungen zahlt insbesondere die Ausnutzung der nichtlinearen Abhängigkeit des von den Objektpunkten ausgehenden Lichts von einem raumlich inhomogenen elektrischen oder magnetischen Feld oder vom am Objektpunkt herrschenden Druck, Scherkräften oder mechanischen Spannungsverhaltnissen. The physical or chemical changes of the object conditions, particularly pays the utilization of the non-linear dependence of the outgoing light from the object points of a spatially inhomogeneous electric or magnetic field, or the prevailing at the object point pressure, shear forces or mechanical Spannungsverhaltnissen. Es kann auch ein am Objekt gebildeter Temperaturgradient entsprechend einem bestimmten Muster vorgesehen sein, der die gewünschte multi-lineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt ausgehenden Lichts von der jeweils herrschenden Temperatur herstellt. It may also be provided at an object temperature gradient formed in accordance with a certain pattern, which establishes the desired multi-linear dependence of the outgoing light from the object point of the prevailing temperature. Es kann auch eine multi-lineare Abhängigkeit des vom Objektpunkt ausgehenden Lichts von den dort herrschenden chemischen Bedingungen (z. B. pH-Wert) verwendet werden. It can also be used a multi-linear dependency of the light emanating from the object point of the prevailing chemical conditions (z. B. pH). Zusätzlich kann eine Objektbestrahlung mit Radiowellen, Mikrowellen, Infrarotlicht, Röntgenstrahlung oder auch Schallwellen oder Ultraschallwellen ausgenutzt werden. In addition, an object exposure to radio waves, microwaves, infrared light, X-rays or sound waves or ultrasonic waves can be exploited.

Zur Realisierung der genannten Effekte ist der Mustergenerator entsprechend angepasst. To realize the above effects, the pattern generator is adjusted accordingly. Bspw. For example. kann der Mustergenerator eine zusätzliche Bestrahlungseinrichtung umfassen, deren Emission auf das Objekt fokussiert ist. the pattern generator may comprise an additional irradiation device whose emission is focused on the object.

Die Figuren 6 und 7 illustrieren Simulationsergebnisse zum Einsatz eines Fluoreszenzmikroskops gemäß Figur 4. Die Lichtintensität ist hier als Schwärzung dargestellt. Figures 6 and 7 illustrate simulation results on the use of a fluorescence microscope according to FIG 4. The light intensity is represented here as a blackening. Aus drucktechnischen Gründen ist die Bildqualität eingeschränkt. For technical reasons, the image quality is limited. Zur besseren Sichtbarmachung der Beleuchtung wurde im Objekt (Figur 6a, 7a) eine konstante Hintergrundfluoreszenz angenommen. To better visualize the illumination (6a, 7a) has been adopted a constant background fluorescence at the object. Figur 6a zeigt das simulierte Objekt, dessen Beleuchtung mit dem beschriebenen Verfahren und Abbildung mit einem Epifluo- reszenzmikroskop simuliert wurde. 6a shows the simulated object, the illumination has been simulated with the described method and imaging with a Epifluo- reszenzmikroskop. Die Teilbilder bh repräsentieren Simulationen von jeweils mit verschiedenen Phasen des beleuchtenden Streifenmusters aufgenommenen Teilbildern. The partial images bh represent simulations of respectively with different phases of the illuminating fringe pattern captured sub-images. Figur 6i zeigt ein Beispiel, bei dem auch die Richtung des beleuchtenden Musters verändert wurde. Figure 6i illustrates an example in which the direction of the illuminating pattern was changed. Die Anregungsintensität war bei diesen Simulationen um den Faktor 5 größer als die Sättigungsintensität. The excitation intensity was greater than the saturation intensity in these simulations by a factor of 5th Die maximal erwartete Photonenzahl betrug 560 Photonen/Pixel in den Einzelbildern. The maximum expected photon count was 560 photons / pixel in the frames. Figur 7 zeigt die zugehörigen Rekonstruktionsergebnisse. Figure 7 illustrates the corresponding reconstruction results. Figur 7a wiederholt das Originalbild der Simulation. Figure 7a repeats the original image of simulation. Nach Faltung mit der Punktbildfunktion eines simulierten Mikroskops und einer Poisson-verteilten Verrauschung (Max = 560 Photonen) ergibt sich das Bild Figur 7b. By convolution with the point spread function of a simulated microscope and a Poisson-distributed noise '(Max = 560 photons) is obtained 7b the image FIG. Die erfindungsgemäße Rekonstruktion aus Teilbildern, die analog zu den Figuren 6b bis 6h mit Beleuchtungsmustern unter 3 Drehwinkeln simuliert wurden, ist in Figur 7c gezeigt. The reconstruction of the invention from partial images which were simulated similarly to FIGS 6b to 6h with illumination patterns under 3 rotation angles is shown in Figure 7c. Dabei ist keine Verstärkung hoher Raumfrequenzen vorgenommen wurden. It is not much high spatial frequencies have been made. Erfolgt zusätzlich die dem System eigene Hochfrequenzverstärkung, so ergibt sich aus Figur 7c das Bild gemäß Figur 7e. Is in addition its own high-frequency gain of the system, it follows 7e of Figure 7c, the image of FIG. Die Anwendung einer entsprechenden Hochfrequenzverstärkung bei dem (konventionellen) Bild gemäß Figur 7b würde lediglich ein Bild mit gemäß Figur 7d ergeben. Applying a corresponding high frequency gain in the (conventional) screen of FIG 7b would yield only an image as shown in FIG 7d. Der Vergleich der Bilder Figur 7e und Figur 7d zeigt die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens der Rekonstruktion hoher Raumfrequenzen aus der Aufnahme mehrerer Teilbilder. The comparison of the images figure 7e and Figure 7d shows the superiority of the inventive method, the reconstruction high spatial frequencies from the accommodating a plurality of sub-images. Figur 7f illustriert den zugehörigen simulierten Träger der mit dem Verfahren erreichten OTF bei einer berücksichtigten Anzahl von Z = 7 Maxima. Figure 7f illustrates the corresponding simulated carrier of the OTF achieved with the method at a considered number of Z = 7 maxima.

Figur 8 illustriert die Verbesserung des Auflösungsvermögens mit dem erfindungsgemäßen Verfahren. Figure 8 illustrates the improvement of the resolving power by the inventive method. Es ist die Intensität auf einer Bezugslinie entlang der zweiten senkrechten Spalte in der Punktmatrix (links oben im Originalbild) in den Figuren 7d und 7e dargestellt. It is shown (top left in the original image) in the figures 7d and 7e, the intensity of a reference line along the second vertical column in the dot matrix. Die durchgezogene Linie entspricht dem Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens. The solid line corresponds to the result of the inventive method. Die Einzelpunkte sind deutlich als Maxima erkennbar. The individual points are clearly recognizable as maxima. Mit dem herkömmlichen Verfahren (Epifluoreszenz mit nachfolgender Hochfrequenzverstärkung) ist nur der erste Punkt (teilweise) und ein Maximum zwischen den beiden untersten Punkten erkennbar. With the conventional method (epifluorescence with subsequent high frequency amplification), only the first point (in part) and a maximum between the two lowest points is recognizable. Bei der simulierten Abbildung eines Punktes ergibt sich eine Verbesserung des Auflösungsvermögens um einen Faktor von mehr als 3. In the simulated image of a point results in an improvement of the resolving power by a factor of more than third

Figur 9 zeigt einen lateralen Schnitt durch die simulierte effektive optische Transferfunktion des Gesamtsystems gemäß Figur 4. Der Gitterabstand des Beugungsgitters wurde hier so gewählt, dass nur die Beugungsordnungen 0, +1 und -1 des Beu- gungsgitters durch das Objektiv übertragen werden können. Figure 9 shows a lateral section through the simulated effective optical transfer function of the overall system according to Figure 4, the grating pitch of the diffraction grating has been chosen here, that only the diffraction orders 0, +1 and -1 of the diffraction grating can be transmitted through the lens. Durch die teilweise Sättigung der beteiligten Farbstoffe ergibt sich eine nicht-lineare Beziehung zwischen der Anregungsintensität und der Wahrscheinlichkeit der Anregung eines Farbstoffmoleküls an einem Punkt im Objektraum. By the partial saturation of the dyes involved in a non-linear relationship between the excitation intensity and the probability of excitation of a dye molecule at a point in the object space is obtained. Diese räumlich variierende Anregungswahrscheinlichkeit wird auch als Anregungsmuster bezeichnet. These spatially varying probability of excitation is also referred to as the excitation pattern. Wenn man annimmt, dass die Anregungswahrscheinlichkeit für ein bestimmtes Farbstoffmolekül eine Funktion der Anregungsintensität ist, so führt eine Nicht-Linearität dieser Funktion dazu, dass im Emissionsmuster auch räumlich höhere Harmonische des Anregungsmusters auftreten. Assuming that the excitation probability for a particular dye molecule is a function of the excitation intensity, a non-linearity leads to this function that occur in the emission patterns and spatial higher harmonics of the excitation pattern. Maxima im reziproken Raum, die jenseits der durch die Abbe-Grenze gegebenen Raumfrequenzbegrenzung liegen, können dann im Anregungsmuster auftreten. Maxima in reciprocal space that are beyond the limits set by the Abbe limit spatial frequency limit can occur in the excitation pattern. Die raumfrequenzbe- grenzte Abbildung der Multiplikation der Farbstoffverteilung mit dem Anregungsmuster enthält nun Komponenten analog zu einer linearen Anregung mit einem Muster, welches höhere Raumfrequenzen enthält. The raumfrequenzbe- bordered illustration of multiplying the distribution of dye with the excitation pattern now includes components analogous to a linear stimulating with a pattern containing higher spatial frequencies.

In Figur 9 ist im Einzelnen zu erkennen, dass die Transferfunktion bei einer herkömmlichen Abbildung mit einem Mikroskopobjektiv (mit nachfolgender Anwendung einer Hochfrequenzverstärkung) entsprechend der durchgezogenen Linie relativ schmal ist, wohingegen die Transferfunktion bei Anwendung der gesättigten Beleuchtung (mit einer Hochfrequenzverstärkung) erheblich erweitert wird (gestrichelt gezeichnet) . In Figure 9 it can be seen in detail that the transfer function is relatively narrow in a conventional imaging with a microscope lens (with subsequent application of a high frequency gain) corresponding to the solid line, whereas the transfer function by applying the saturated illumination is considerably extended (with a high frequency gain) (shown in phantom).

Figur 10 zeigt eine simulierte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ein mittels Elektronenmikroskopie aufgenommenes Schnittbild des Zellkerns einer embryonalen Bovin- Zelle. Figure 10 shows a simulated application of the method according to the invention on a recorded by means of electron-sectional image of the nucleus of an embryonic cell Bovin-. Figur 10a illustriert den invertierten elektronenmikroskopischen Ausschnitt nahe der Kernhülle mit der Kernmatrix („Nuclear Matrix"). Die simulierte epifluoreszenz- mikroskopische Aufnahme mit Entfaltung ergibt das in Figur 10b gezeigt herkömmliche Bild. Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt sich das in Figur 10c gezeigte Bild. Das mit der Methode der gesättigten lateralen Modulation aufgenommene und ausgewertete und anschließend entfaltete Bild (Maximum: 560 Photonen im Einzelbild) ist gegenüber dem herkömmlichen Bild deutlich verbessert und mit dem elektronenmikroskopischen Originalbild vergleichbar. Figure 10a illustrates the inverted electron microscopic segment close to the core sleeve with the core matrix ( "Nuclear Matrix"). The simulated epifluorescent photomicrograph at deconvolution gives the shown in Figure 10b conventional image. When applying the method according to the invention results in the in figure 10c shown image . the recorded and evaluated using the method of saturated lateral modulation and then unfolded image (maximum 560 photons in the frame) is compared to the conventional image significantly improved and comparable to the electron microscopic original image.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein. The features disclosed in the foregoing description, the drawings and the claims of the invention may be material for realizing the invention in its various embodiments both individually and in any combination.

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International ClassificationG02B27/46, G02B21/00, G02B21/36
Cooperative ClassificationG02B21/00, G02B27/46, G02B21/367
European ClassificationG02B21/36V1, G02B21/00, G02B27/46
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