WO1999051974A1 - Procede de determination d'un substrat - Google Patents

Description

明 細 書

基 質 の 定 量 法 技術 分野

本 発 明 は、 試料 中 の 基質 に つ い て、 迅速 か つ 高 精 度 な 定 量 を 簡 便 に 実施す る た め の 定 量 法 に 関 す る。 背 景 技術

ス ク D — ス、 グ ル コ ー ス な ど 糖 類 の 定 量 分 析 法 と し て. 施光度 計 法、 比 色 法、 還元滴定法、 各種 ク ロ マ 卜 グ ラ フ ィ 一 を 用 い た 方 法 等 が開 発 さ れ て い る。 し カゝ し、 こ れ ら の 方 法 は い ずれ も 糖 類 に 対 す る 特 異性 が あ ま り 高 く な い の で 度 が悪 い, , こ れ ら の 方 法 の う ち 施光度 計 法 に よ れ ば、 作 は簡便 で は あ る が、 操 作 時 の 温度 の 影 響 を 大 き く 受 け る。 従 つ て、 施光度 計 法 は、 一般 の 人 々 が家庭 な ど で 易 に 糖 類 を 定 量 す る 方 法 と し て は適 切 で な い。

と こ ろ で、 近年 酵 素 の 有 す る 特 異 的 触媒 作 用 を 利 用 し た 種 の タ イ プ の パ イ ォ セ ン サ が 開 発 さ れ て い る。

以 下 に 試料液 中 の 基質 の 定 量 法 の一例 と し て グ ル コ ー ス の 定 量 法 に つ い て説 明 す る。 (4 5¾ 丫し学 的 な グ ル コ ー ス の 定 法 と し て は、 グ ル コ ー ス 才 キ シ ダ一 ゼ （ E C 1 .

1 . 3 4 ： 以 下 G O D と 略す） と 酸 素 電極 あ る い は過 酸丫ヒ水 電極 と を 使用 し て 行 う 方 法 が一般 に 知 ら れ て い る （ 例 ば、 鈴木周一編 「 バ ィ ォ セ ン サ ― 」 講 談社 ） 。

G O D は、 酸 素 を 電子伝達体 と し て、 基質 で あ る β — D — ダ ル コ — ス を D — ダ ル コ ノ ー <5 — ラ ク ト ン に 選択 的 に 酸化 す る 酸 素 の 存 在 下 で、 G O D に よ る 酸 化反 応 過 程 に お い て、 酸 素 が過酸化水 素 に 還元 さ れ る。 酸 素 電極 に よ っ て、 こ の 酸 素 の 減 少 量 を 計 測 す る 力 あ る い は過 酸 化 水 素 電極 に よ っ て 過酸化水 素 の 増 加 量 を 計 る。 酸 素 の 減 少 量 お よ び過酸化水 素 の 増 加 量 は、 試料液 中 の グル コ ー ス の 含 有 量 に 比例 す る の で、 酸 素 の 減 少 量 ま た は過 酸 化 水 素 の 増 加 量 か ら グル コ ー ス を 定 量 す る こ と が で き る。

こ の 方 法 は、 そ の 反 応過程 か ら も 推測 で き る よ う に、 測 定 結果 は試料液 に 含 ま れ る 酸 素 濃度 の 影 響 を 大 き く 受 け る 欠 点 が あ る。 ま た、 試料液 に 酸 素 が存 在 し な い 場 合 は測 定 が 不 可 能 と な る。

そ こ で、 酸 素 を 電子 伝達体 と し て 用 い ず . フ ェ リ シ ァ ン 化 カ リ ウ ム、 フ エ ロ セ ン 誘 導体、 キ ノ ン 誘導体等 の 有 機 化 合 物 や 金 属 錯 体 を 電子 伝達体 と し て 用 い る 新 し い 夕 イ ブ の グ ル コ ー ス セ ン サ が 開 発 さ れ て き た, , こ の タ イ プ の セ ン サ で は、 酵 素 反 応 の 結 果 生 じ た 電子 伝達体 の 還元 体 を 電極 上 で 酸化す る こ と に よ り、 そ の 酸化電流量 力 ^ ら 試料 液 中 に 含 ま れ る グ ル コ ー ス 濃度 が求 め ら れ る , こ の よ う な 有 機 化 合物 や 金 属 錯体 を 酸 素 の 代 わ り に 電子 伝達 体 と し て 用 い る こ と で、 既知 量 の G 〇 D と そ れ ら の 電子 伝達体 を 安 定 な 状態 で 正 確 に 電極 上 に 担持 さ せ て 反 応 層 を 形 成 す る こ と が 可 能 と な る。 こ の ¾ Π、 反 応 層 を 乾燥 状態 に 近 い 状 態 で 電極 系 と 一体化 さ せ る こ と も で き る の で、 こ の 技術 に 基 づ い た 使 い 捨 て 型 の グ ル コ ー ス セ ン サ が近 年 多 く の 注 目 を 集 め て い る。

使 い 捨 て 型 の グ ル コ ー ス セ ン サ に お い て は、 測 定 器 に 着 脱 可 能 に 接続 さ れ た セ ン サ に 試料液 を 導入 す る だ け で 容 易 に グ ル コ ー ス 濃度 を 測 定器 で測 定 す る こ と がで き る < こ の よ う な 手 法 は、 グ ル コ ー ス の 定 量 だ け に 限 ら ず、 試 料液 中 に 含 ま れ る 他 の 基質 の 定 量 に も 応用 可 能 で あ る。

上 記 の 様 な セ ン サ を 用 い た 測 定 に よ る と、 還元 型 電子 伝達体 を 作 用 極 上 に て 酸 化 し、 そ の 際 に 流れ る 酸 化 電流 値 に 基 づ い て 基質 濃度 が求 め ら れ る。 し か し な が ら、 血 液や 果 汁 等 が試料 と し て 用 い ら れ た 場 合、 そ の 試料 中 に 含 ま れ る ァ ス コ ル ビ ン 酸、 尿酸 等 の 易 酸 化性物 質 も、 還 元型 電子 伝 達体 と 同 時 に 作 用 極上 で酸化 さ れ る。 こ の 易 酸化性 物 質 の 酸化反 応 が、 測 定 結 果 に 影 響 を 与 え る 場 合 が あ る。

ま た、 上 記 の よ う な セ ン サ を 用 い た 測 定 で は、 反 応 層 に 担 持 さ れ た 電子 伝達 体 が還元 さ れ る と 同 時 に、 溶 存 酸 素 を 電子 伝 達体 と し て 過酸化水 素 を 生 成す る 反 応 が進行 す る。 さ ら に、 こ の 反 応 に て 生 成 し た 過酸 化水 素 は、 還 元型 電子 伝達体 を 再酸 化す る。 結 果 と し て、 還元型 電子 伝達体 の 酸 化電流 に 基 づ い て基質 濃度 を 測 定 す る 場 合、 溶存酸 素 が測 定結 果 に 負 の 誤差 を 与 え る 場 合 が あ る。

上 記 の 方 法 に お い て は、 電流応 答 を 得 る た め に 作 用 極 と 対 極 と の 間 に 電圧 を 印 加 す る 以 前 に、 作用 極 と 対 極 と の 間 に 電圧 を 印 加 し、 そ の 両極 間 の 電 気 的 変 化 に 基 づ い て液 絡検 知 を 行 う、 す な わ ち、 試料液 が供給 さ れ た こ と の 検知 を 行 う 場 合 が多 い。 そ の 際 に 試料 液 が十 分 量 電

、

極 系 に 供 給 さ れ る 前 に 刖 c作用 極 一 対 極 間 の 抵抗値 が 変 化 し て 測 定 が始 ま る 場 合 が あ り、 測 定 結 果 に 影 響 を 与 え る 場 合 が あ つ た。 ま た、 作用 極 の 界 面 状 態 に 変化 を 来 し、 測 定 結 果 に 影 響 を 与 え る 場 合 が あ っ た。

さ ら に、 二 電極 式 に よ る 測 定方 法 に お い て は、 対 極 を 参照 極 と し て併用 す る, こ の た め、 基 準 と な る 対 極 電位 が作 用 極 で の 酸 化還元 反 応 に 伴 い 変 動 す る 力ゝ ら、 こ れ に よ っ て 測 定 結 果 に 影響 が与 え ら れ る こ と が あ っ た。

本 発 明 は、 以 上 の よ う な 不 都 合 を な く し、 易 酸化性 物 質 に よ る 影 響 を 除去 し. 正確 な 基 質 濃度 を 測 定 で き る 定 量 法 を 提 供 す る こ と を 目 的 と す る。

本 発 明 は、 ま た 応答 の ば ら つ き が よ り 減 少 さ れ た 基 質 の 定 量 法 を 提供 す る こ と を 目 的 と す る。

発 明 の 開 示

本 発 明 は、 電気絶縁性基板 と、 前記基板 上 に 形 成 さ れ た 作 用 極、 対極、 お よ び、 妨害物 質検知 電極 と し て 使 用 さ れ る 第 3 の 電極 を 有 す る 電極 系 と、 第 3 の 電極 を 除 く 電極 系 上 に 設 け ら れ た、 少 な く と も 酸 化還元酵 素 と 電子 伝達体 を 含 有 す る 反 応 層 か ら な る バ イ オ セ ン サ を 用 い て, 試料液 に 含 ま れ る 基質 と 酸化還元酵 素 と を 反応 さ せ る 際 に 生 成 す る 電子 に よ っ て 電子伝達体 を 還元 し、 そ の 電子 伝達体 の 還元量 を 電気化学 的 に 計 測 す る こ と に よ り、 試 料液 中 の 基質 の濃度 を 定量す る 方法で あ っ て、 以下 の ェ 程 を 包含 す る こ と を特徴 と す る。

( a ) 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 に電圧 を 印 加す る 工程、

( b ) 試料液 を 反応層 に 供給す る ェ 程、

( c ) 試料液 の 反応層 へ の供給 に よ っ て生 じ た、 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 の 電気的変化 を検知 す る 工程、

( d ) 前記 の検知 す る 工程 （ c ) の後、 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 に 生 じ た電流 を 測定す る 工程、

( e ) 前記 の測定す る 工程 （ d ) の後、 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 の 電圧 印加 を解除す る 工程、

( f ) 作用 極 と 対極 と の 間 に 電圧 を 印 加す る 工程、 お よ び

( g ) そ の後、 対極 と 作用 極 と の 間 に 生 じ た 電流 を測 定す る 工 程。

本発 明 は、 ま た、 電気絶縁性基板 と、 前記基板上 に 形 成 さ れた 作用 極、 対極、 お よ び、 妨害物質検知 電極 と し て使用 さ れ る 第 3 の 電極 と を有す る 電極系 と、 第 3 の電 極 を 除 く 電極系 上 に設 け ら れた、 少 な く と も 酸化還元酵 素 と 電子伝達体 を含有 す る 反応層 と、 前記基板上 に お い て試料液 を 試料液供給 口 か ら 前記反応層 へ導 く 試料液供 給路 を 形 成す る カ バ一部材 と か ら な り、 第 3 の 電極が反 応層 よ り も 試料液供給路 の 上流側 に 配置 さ れて い る バイ ォセ ン サ を 用 い て、 試料液 に含 ま れ る 基質 と 酸化還元酵 素 と を 反応 さ せ る 際 に 生成す る 電子 に よ っ て電子伝達体 を還元 し、 そ の電子伝達体 の還元量 を 電気化学的 に 計測 す る こ と に よ り、 試料液 中 の 基質 の濃度 を定量す る 方法 で あ っ て、 以下 の 工程 を包含す る 定量法 を 提供す る。

( a ) 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 に 電圧 を 印 加す る 工程、

( ) 試料液 を 反応層 に 供給す る 工程、

( c ) 試料液 の 反応 層 へ の 供給 に よ っ て生 じ た、 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 の 電気的変化 を検知 す る 工程、

( d ) 前記 の検知す る 工程 （ c ) の後、 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 に 生 じ た 電流 を 測定す る 工程、

( e ) 前記 の 測定す る 工程 （ d ) の後、 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 の 電圧 印加 を解除す る 工程、

( f ) 作用 極 と 対極 と の 間 に電圧 を 印 加す る 工程、 お よ び

( ) そ の後、 対極 と 作用 極 と の 間 に 生 じ た電流 を測 定す る 工程。

本発 明 の 定量法 に お い て は、 第 3 の 電極 を参照極 と し て用 い る こ と が好 ま し い。 すな わ ち、 上記 の 工程 （ f ) に お い て、 作用 極 と 第 3 の 電極 と の 間 に も 電圧 を 印 加す る。

ま た、 前記基板 に カ バー部材 を組み合わ せた バイ オセ ン サ を用 い る 場合 は、 試料液供給路 に 露出 し た カ バー部 材 の 壁面 に、 レ シチ ン を 担持す る 層 を 配置す る こ と が好 ま し い。

さ ら に、 前記反応層 は、 親水性高 分子 を 含有す る こ と が好 ま し い。 図 面 の 簡 単 な 説 明

図 1 は 本発 明 の一実施例 に お け る グ ル コ ー ス セ ン サ の 反 応 層 を 除去 し た 状態 の 平 面 図 で あ る。

図 2 は本 発 明 の 他 の 実施例 に お け る グ ル コ ー ス セ ン サ の 反 応 層 を 除去 し た 状 態 の 分解斜視 図 で あ る。 発 明 を 実施す る た め の 最 良 の 形態

本発 明 の 定 量 法 に 用 い ら れ る ノ ィ ォ セ ン サ の 構成 を 説 明 す る。

ま ず、 第 1 の タ イ プ の ノ ィ ォセ ン サ を 図 1 に よ り 説 明 す る。

こ の セ ン サ は、 ポ リ エ チ レ ン テ レ フ 夕 レ ー ト な ど 力ゝ ら な る 絶縁性 の 基板 1 上 に、 対極 6、 作用 極 7、 お よ び第 3 の 電極 8 が設 け ら れ、 さ ら に こ れ ら に 電気接 続 さ れ た リ ー ド 2 、 3、 お よ び 4 が各 々 設 け ら れ て い る。 カ ー ボ ン 層 9 は、 反 応 層 の 作 製 を 容 易 に す る た め に 設 け ら れ た 層 で あ り、 電極 と し て は 機能 し な レ 第 3 の 電極 8 を 除 く、 対 極 6、 作 用 極 7 お よ び カ ー ボ ン 層 9 上 に、 酸 化還元酵 素 と 電子 伝達体 を 含 む 円 形 の 反応 層 （ 図 示 し な い ） が設 け ら れて レゝ る。 図 中、 5 は絶縁 層 で あ る。

次 に、 第 2 の タ イ プ の バ イ オセ ン サ を 図 2 に よ り 説 明 す る。

こ の セ ン サ は、 図 1 の 基板 1 に、 カ ノ 一 1 0 お よ び ス ぺ ー サ 1 1 か ら な る カ バ ー 部材 を 組 み合 わ せ た も の で あ る。 こ れ ら は、 図 2 中 に 一 点 鎖 線 で示 す よ う な 位 置 関 係 を も つ て 接着 さ れ て セ ン サ が構 成 さ れ る。

ス ぺ 一 サ 1 1 に は試料液 供給路 を 形 成 す る ス リ ッ ト 1 2 が 形 成 さ れ、 ま た、 カ バ ー 1 0 〖こ は 空 気孔 1 3 が形成 さ れ て い る。 基板 1 上 に ス ぺ 一 サ 1 1 を 介 し て 力 ゾ 一 1 0 を 積層 し 接 着 す る と、 基板 1、 ス ぺ ー サ 1 1 お よ び力 バ 一 1 0 に よ っ て 試料液供給路 と な る 空 間 部 が ス ぺ ー サ 1 1 の ス リ ッ ト 1 2 の 部 分 に 形 成 さ れ る。 こ の 空 間 部 の 終端 部 は、 空 気孔 1 3 に 連通す る。

こ の ノ ィ セ ン サ に お い て は、 作 用 極 7 は、 半 月 状 の 対 極 6 よ り も 試料液供給 口 1 2 a ( ス リ ツ 卜 1 2 の 解放端 部 に 相 当 す る ） に 近 い 位 置 に 配 置 さ れ、 第 3 の 電極 8 は、 作 用 極 7 よ り さ ら に 試料液供給 口 1 2 a に 近 い 位 置 に 配 置 さ れて い る。 こ れ ら の 電極 6 、 7、 お よ び 8 は、 そ れ ぞれ 上 記 空 間 部 に 露 出 し て い る。

上 記 の ノ ィ ォ セ ン サ を 用 い て 基 質 濃度 を 測 定 す る に は、 ま ずセ ン サ の リ ー ド 2 、 3 お よ び 4 を 有 す る 側 の 端 部 を 測 定 器 に セ ッ ト し、 対 極 6 を 基準 に し て 第 3 の 電極 8 に 所定 の 電位 を 印 加 す る。 こ の 電位 を 印 加 し た 状 態 で、 妨 害物 質 と し て例 え ば ァ ス コ ル ビ ン 酸 を 含 む 試料液 を 反応 層 上 に 滴 下 し、 反 応 層 を 試料液 に 溶解 さ せ る。

試料液 の 供給 と 同 時 に、 電極 系 の 対極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電 気 的 変 化 に 基 づ い て液 の 供給 を 検 知 す る シ ス テ ム が動作 し、 こ れ に よ つ て 測 定 夕 イ マ 一 が始 動 す る。 こ の 時、 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 に は、 電位 は 印 加 さ れ続 け て お り、 試料液 が供 給 さ れ た こ と を 検知 し て か ら 一定 時 間 経過後 に、 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値 を 測 定 す る。 第 3 の 電極 8 上 に は 反 応 層 が配 置 さ れ て い な い 力 ら、 酵 素 反 応 の 結果 生 成 し た 電子 伝達体 の 還元体 が第 3 の 電極 8 近傍 に 到 達す る ま で に は、 若干 の 時 間 を 必 要 と す る。 従 っ て、 前 記 の 電流値 は、 妨 害 物 質 と し て含 ま れ る ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 酸 化反 応 に 起 因 す る。

次 に、 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電圧 印 加 を 解 除す る。 そ の 後、 対 極 6 を 基準 に し て作 用 極 7 に、 前 記 電子 伝 達体 の 還 元 体 を 酸 化す る 電位 を 印 加 し、 対 極 6 と 作 用 極 7 間 の 電 流値 を 測 定す る。 こ の 電 流 は、 電子 伝達体 の 還 元体 と、 あ ら カゝ じ め 存 在 す る 妨 害 物 質 ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 酸化 反 応 に 起 因 す る。 す な わ ち、 ァ ス コ ル ピ ン 酸 が測 定 結 果 に 正 の 誤差 を 与 え る こ と と な る。 そ し て、 上述 の 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値 は 主 に ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 濃 度 の み を 反 映 し て い る か ら、 こ の 電流値 に 基 づ き 測 定 結 果 を 補 正 す る こ と に よ り、 ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 影 響 を 除 去 し、 正 確 な 基 質 濃度 を 求 め る こ と が で き る。

第 2 の タ イ プ の セ ン サ で は、 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 で 試料 液 の 供給 を 検知 す る た め、 作 用 極 7 の 露 出 部 全 て が確 実 に 試料液 で満 た さ れ る。 こ れ に よ り、 試料液 の 供 給 を よ り 確 実 に 判 定す る こ と が で き る。

以 下、 本 発 明 を 実施例 に よ り 詳 細 に 説 明 す る。 実施例 1

グ ル コ ー ス の 定 量 法 を 説 明 す る。 グ ル コ ー ス セ ン サ の 基板 に は 図 1 に 示す も の を 使用 し た。 こ の グ ル コ ー ス セ ン サ は以 下 の よ う に し て 作 製 し た。

ポ リ エ チ レ ン テ レ フ 夕 レ ー 卜 か ら な る 絶縁性 の 基板 1 上 に、 ス ク リ ー ン 印刷 に よ り 銀 ペ ー ス ト を 印刷 し リ ー ド 2 、 3、 お よ び 4 を 各 々 形 成 し た。 次 に、 樹脂バ イ ン ダ 一 を 含 む 導 電性 カ ー ボ ン ペ ー ス 卜 を 基板 1 上 に 印 刷 し て、 対 極 6、 作 用 極 7、 第 3 の 電極 8、 お よ びカ ー ボ ン 層 9 を 形 成 し た。 対 極 6、 作 用 極 7 お よ び第 3 の 電極 8 は、 各 々 リ ー ド 2 、 3 お よ び 4 と 電 気 的 に 接触 し て い る。

次 に そ の 基板 1 上 に、 絶縁性 ペ ー ス ト を 印刷 し て絶縁 層 5 を 形 成 し た。 絶縁 層 5 は、 対 極 6、 作 用 極 7、 第 3 の 電極 8、 お よ び 力 一 ボ ン 層 9 の 外周 部 を 覆 っ て お り、 こ れ に よ つ て 対 極 6、 作 用 極 7、 第 3 の 電極 8、 お よ び カ ー ボ ン 層 9 の 露 出 部 分 の 面 積 は 一 定 に 保 た れ る。 絶縁 層 5 は、 リ ー ド 2、 3、 お よ び 4 の 一 部 を 覆 っ て い る。

次 に、 第 3 の 電極 8 を 除 く、 対 極 6、 作 用 極 7 お よ び カ ー ボ ン 層 9 上 に カ ル ボ キ シ メ チ ル セ ル ロ ー ス （ 以 下 C M C と 略称 す る ） の 水 溶液 を 滴 下 し、 乾燥 さ せ る こ と に よ り、 C M C 層 を 形成 し た。 こ の C M C 層 上 に、 酵 素 と し て G 〇 D、 お よ び電子伝達体 と し て フ ェ リ シ ア ン 化 力 リ ウ ム を 含 む水溶液 を 滴 下 す る と、 親水性 高 分子 か ら な る C M C 層 は 一 度 溶解 し、 そ の 後 の 乾 燥過程 で酵 素 な ど と 混 合 さ れ た 形 で 反応 層 を 形 成 す る。 し か し、 撹拌等 を 伴 わ な い た め 完全 な 混 合 状 態 と は な ら ず、 電極 系 表面 は C M C の み に よ っ て 被覆 さ れ た 状態 と な る。 す な わ ち、 酵 素 お よ び電子伝達体 な ど が電極系表面 に 接触 し な い た め に、 電極系 表面 へ の タ ン パ ク 質 の 吸着 な ど を 防 ぐ こ と がで き る。

こ の セ ン サ を 用 い て グル コ ー ス 濃度 を 測定す る た め に、 ま ず リ ー ド 2、 3 お よ び 4 を有す る 側 の 端部 を 測定器 に セ ッ ト し、 対極 6 を 基準 に し て第 3 の電極 8 に 5 0 0 m V の 電位 を 印加 し た。 こ の電位 を 印 加 し た 状態 で、 妨害 物 質 と し て ァ ス コ ル ビ ン酸 を含む グル コ ー ス 水溶液 3 0 μ ΐ を、 試料液 と し て 反応層 上 に 滴下 し た。 電極 系 上 の 反応層 は、 滴下 さ れた試料液 に溶解 し た。

試料液 の 供給 と 同 時 に、 電極系 の対極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電気的変化 に基づい て液の 供給 を 検知 す る シ ス テ ム が動作す る。 こ れ に よ つ て測定 タ イ マ ーが始動 し た。 こ の 時、 対極 6 と 第 3 の 電極 8 間 に は、 電位 は印 加 さ れ 続 けて お り、 試料液が供給 さ れた こ と を検知 し て か ら 一 定時間 経過後 に、 対極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値 を 測 定 し た。 こ の 電流値 は、 妨害物質 と し て含 ま れ る ァ ス コ ル ビ ン酸 の酸化反応 に 起因 し、 そ の濃度 に対 し て比例 関 係 を 与 え た。 対極 6 と 第 3 の電極 8 間 の 電流値測定後、 両極間 の 電圧 印加 を解除 し た。

上述 し た よ う に、 第 3 の 電極 8 上 に は反応層 が配置 さ れて い な レ よ っ て、 酵 素反応 の 結果生成 し た フ エ ロ シ ア ン 化イ オ ン が第 3 の 電極 8 近傍 に到達す る ま で に は、 若干 の 時間 を 必要 と す る。 すなわ ち、 フ エ ロ シ ア ン化ィ オ ン到達 ま で の 時間 内 に お け る 対極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値 は、 主 に ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 濃度 の み を 反 映す る。 さ ら に、 試料液検知 か ら 2 5 秒 後、 対 極 6 を 基準 に し て 作 用 極 7 に 5 0 O m V を 印 加 し、 対 極 6 と 作 用 極 7 間 の 5 秒後 の 電 流値 を 測 定 し た。

液 中 の フ ェ リ シ ア ン 化 イ オ ン、 グル コ ー ス、 お よ び G 〇 D が反 応 し、 そ の 結 果、 グ ル コ ー ス が ダ ル コ ノ ラ ク ト ン に 酸化 さ れ、 フ ェ リ シ ア ン 化イ オ ン が フ エ ロ シ ア ン 化 イ オ ン に 還 元 さ れ る。 こ の フ エ ロ シ ア ン 化 イ オ ン の 濃度 は、 グ ル コ ー ス の 濃度 に 比例 す る。 試料液検 知 か ら 3 0 秒 後 の 対 極 6 と 作 用 極 7 間 の 電流 は、 フ エ ロ シ ア ン 化 ィ オ ン と、 あ ら か じ め 存 在 す る ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 酸化 反 応 に 起 因 す る。 すな わ ち、 ァ ス コ ル ビ ン 酸 が測 定 結 果 に 正 の 誤差 を 与 え る こ と と な る。 し カゝ し な が ら、 上述 し た よ う に、 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値 は主 に ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 濃度 の み を 反 映す る。 そ こ で、 そ の 結 果 に 基 づ き 測 定 結 果 を 補正 す る こ と に よ り、 ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 影 響 を 除去 し、 正確 な グ ル コ ー ス 濃度 を 求 め る こ と が で き る。 実施例 2

実施例 1 と 同 様 に、 基板 1 上 に 電極 6 、 7 、 8、 お よ び 力 一 ボ ン 層 9 を 形 成 し た。 次 に、 第 3 の 電極 8 を 除 く、 対 極 6、 作 用 極 7 お よ び カ ー ボ ン 層 9 上 に C M C 水 溶液 を 滴 下 し、 乾燥 さ せ る こ と に よ り、 C M C 層 を 形 成 し、 こ の C M C 層 上 に、 酵 素 と し て G 〇 D、 お よ び電子伝達 体 と し て フ エ リ シ ア ン 化 力 リ ゥ ム を 含 有 す る 水 溶液 を 滴 下 し、 乾 燥 さ せ る こ と に よ り、 反 応 層 を 形 成 し た。

次 に、 前 記 反応 層 上 に、 試料液 の 反 応 層 へ の 供 給 を よ り 一 層 円 滑 に す る た め に、 レ シ チ ン の 有 機溶媒溶 液、 例 え ば ト ル エ ン 溶液 を、 試料液供給 口 1 2 a か ら 反 応 層 上 に わ た つ て広 げ、 乾燥 さ せ る こ と に よ り レ シ チ ン 層 を 形 成 し た。 次 に、 基板 1 に、 カ バ 一 1 0 お よ びス ぺ ー サ 1 1 を 図 2 中 の 一点 鎖線 で示 す よ う な 位 置 関 係 を も っ て 接 着 し て グ ル コ ー ス セ ン サ を 作 製 し た。

こ の セ ン サ を 測 定器 に セ ッ ト し、 対 極 6 を 基準 に し て 第 3 の 電 極 8 に 5 0 O m V の 電位 を 印 加 し た。 こ の 電位 を 印 加 し た 状 態 で、 妨 害物 質 と し て ァ ス コ ル ビ ン 酸 を 含 む グ ル コ ー ス 水溶液 3 1 を、 試料液 と し て試料液 供給 口 1 2 a よ り 供給 し た。 試料液 は試料液供給路 を 通 っ て 空 気孔 1 3 に ま で達 し、 電極 系 上 の 反 応 層 が溶解 し た。

試料 液 の 供 給 と 同 時 に、 電極 系 の 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電 気 的 変 化 に 基 づ い て液 の 供給 を 検知 す る シ ス テ ム が動 作 し、 こ れ に よ り 測 定 タ イ マ ー が始動 し た。 こ の 時、 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 に 電位 は 印 加 さ れ続 け て お り、 試料 液 供給検知 か ら 一 定 時 間 経過後 に、 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値 を 測 定 し た。 こ の 電流値 は、 妨 害 物 質 と し て 含 ま れ る ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 酸化反応 に 起 因 し、 そ の 濃 度 に 対 し て 比例 関 係 を 与 え た。 対 極 6 と 第 3 の 電 極 8 間 の 電 流値 測 定後、 両極 間 の 電圧 印 加 を 解 除 し た。

上述 し た よ う に、 第 3 の 電極 8 上 に は反 応 層 が配 置 さ れ て い な レ よ っ て、 酵 素 反 応 の 結果 生 成 し た フ エ ロ シ ア ン 化 イ オ ン が第 3 の 電極 8 近傍 に 到 達す る ま で に は、 若 干 の 時 間 を 必 要 と す る。 す な わ ち、 フ エ ロ シ ア ン 化 ィ オ ン 到 達 ま で の 時 間 内 に お け る 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電 流値 は、 主 に ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 濃 度 の み を 反 映 す る。

さ ら に、 試料液検 知 か ら 2 5 秒後、 対極 6 を 基準 に し て 作 用 極 7 に 5 0 O m V を 印 カ卩 し、 対 極 6 と 作 用 極 7 間 の 5 秒後 の 電流値 を 測 定 し た。

液 中 の フ ェ リ シ ア ン 化 イ オ ン、 グ ル コ ー ス、 お よ び G O D が反 応 し、 そ の 結果、 グル コ ー ス が ダ ル コ ノ ラ ク ト ン に 酸化 さ れ、 フ ェ リ シ ア ン 化イ オ ン が フ エ ロ シ ア ン 化 イ オ ン に 還元 さ れ る。 こ の フ エ ロ シ ア ン 化 イ オ ン の 濃度 は、 グ ル コ ー ス の 濃度 に 比例 す る。 試料液検知 か ら 3 0 秒後 の 対 極 6 と 作用 極 7 間 の 電流 は、 フ ヱ ロ シ ア ン 化 ィ オ ン と、 あ ら か じ め 存 在 す る ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 酸 化反応 に 起 因 す る。 す な わ ち、 ァ ス コ ル ビ ン 酸 が測 定 結 果 に 正 の 誤差 を 与 え る こ と と な る。 し カゝ し な が ら、 上 述 し た よ う に、 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値 は 主 に ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 濃度 の み を 反 映す る。 そ こ で、 そ の 結 果 に 基 づ き 測 定 結 果 を 補正 す る こ と に よ り、 ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 影 響 を 除去 し、 正確 な グ ル コ ー ス 濃度 を 求 め る こ と が で き る。

本 実施例 で は、 対極 6 と 第 3 の 電極 8 間 で試料液 の 供 給 を 検知 す る た め、 作 用 極 7 の 露 出 部全 て が確 実 に 試料 液 で満 た さ れ る。 こ れ に よ り、 試料液 の 供 給 を よ り 確実 に 判 定す る こ と が で き る。 実施例 3

実施例 2 と 同 様 に グ ル コ ー ス セ ン サ を 作 製 し た。

測 定 器 に セ ン サ を セ ッ ト し、 対 極 6 を 基準 に し て 第 3 の 電極 8 に 5 0 0 m V の 電位 を 印 力 Π し た。 こ の 電位 を 印 加 し た 状 態 で、 妨 害物 質 と し て ァ ス コ ル ビ ン 酸 を 含 む グ ル コ ー ス 水溶液 3 a 1 を、 試料液 と し て試料液供 給 口 1 2 a よ り 供給 し た。 試料液 は試料液供 給路 を 通 っ て 空 気 孔 1 3 に ま で達 し、 電極 系 上 の 反 応 層 が溶解 し た。

試料液 の 供給 と 同 時 に、 電極 系 の 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電 気 的 変 化 に 基 づ い て液 の 供給 を 検知 す る シ ス テ ム が動 作 し、 こ れ に よ り 測 定 タ イ マ ー が始 動 し た。 こ の 時、 対極 6 と 第 3 の 電 極 8 間 に 電位 は 印 加 さ れ続 け て お り、 試料 液供給検 知 か ら 一 定時 間 経過後 に、 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電 流値 を 測 定 し た。 こ の 電流値 は、 妨 害 物 質 と し て 含 ま れ る ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 酸化反応 に 起 因 し、 そ の 濃度 に 対 し て 比例 関 係 を 与 え た。 対 極 6 と 第 3 の 電 極 8 間 の 電流値測 定後、 両 極 間 の 電圧 印 加 を 解 除 し た。

上述 し た よ う に、 第 3 の 電極 8 上 に は 反応 層 が配 置 さ れ て い な レ よ っ て、 酵 素 反応 の 結果 生 成 し た フ エ ロ シ ア ン 化 イ オ ン が第 3 の 電極 8 近傍 に 到 達す る ま で に は、 若干 の 時 間 を 必 要 と す る。 すな わ ち、 フ エ ロ シ ア ン 化 ィ オ ン 到達 ま で の 時 間 内 に お け る 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値 は、 主 に ァ ス コ ル ビ ン酸 の 濃度 の み を 反 映 す る。 さ ら に、 試料 液検知 力ゝ ら 2 5 秒後、 第 3 の 電極 8 を 基 準 に し て 作 用 極 7 に 5 0 0 m V を 印 加 し、 対 極 6 と 作用 極 7 間 の 5 秒後 の 電流値 を 測 定 し た。

液 中 の フ エ リ シ ァ ン 化ィ ォ ン、 グ ル コ ー ス 、 お よ び G O D が反 応 し、 そ の 結 果、 グル コ 一 ス が グ ル コ ノ ラ ク 卜 ン に 酸化 さ れ、 フ エ リ シ ァ ン 化 ィ ォ ン が フ ェ ロ シ ア ン 化 ィ ォ ン に 還元 さ れ る, , こ の フ エ 口 シ ァ ン 化 ィ オ ン の 濃度 は、 グ ル コ 一 ス の 濃度 に 比例 す る, 試料液検知 力、 ら 3 0 秒後 の 対 極 6 と 作 用 極 7 間 の 電流 は、 フ エ 口 シ ア ン 化 ィ ォ ン と、 あ ら カゝ じ め 存 在 す る ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 酸 化 反応 に 起 因 す る す な わ ち、 ァ ス コ ル ビ ン 酸 が測 定 結 果 に 正 の 誤 差 を 与 え る こ と と な る , し か し な が ら、 上 述 し た よ う に 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値 は 主 に ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 濃度 の み を 反 映す る。 そ こ で , そ の 結 果 に 基 づ き 測 定 結 果 ¾r 正 す る こ と に よ り . ァ ス コ ル ビ ン 酸 の 影 響 を 除去 し、 正 確 な グ ル コ ー ス 濃度 を 求 め る こ と が で き る。

ま た、 作 用 極 7 へ の 電位 印 加 時 に、 第 3 の 電極 8 の 電

1 Z. を 銀 ノ 塩 化銀 電極 を 基準 に し て 測 定 し た と こ ろ、 作用 極 7 に お い て 酸化 反応 が生 じ て い る に も か か わ ら ず、 第 3 の 電極 8 に お け る 電位 の 変動 は殆 ど 見 ら れ な か っ た。 ま た 作 用 極 - 対 極 間 の 抵抗値 変 化 に 基 づ い て 液 絡検知 を 行 つ て い た従来 法 に 比 べ て、 応 答 の ば ら つ き が減 少 し た。 実施例 4

実施例 2 と 同 様 に、 第 3 の 電極 8 を 除 く、 対 極 6、 作 用 極 7 お よ び 力一ボ ン 層 9 上 に 反 応 層 を 形 成 し た。

次 に、 試料液 供給路 を 形 成 す る た め の カ バ ー 部 材 上 に 形 成 さ れ た 溝 部 に、 試料液 の 反応 層 へ の 供給 を よ り 一 層 円 滑 に す る た め に、 レ シ チ ン の 有 機溶 媒溶液、 例 え ば 卜 ル ェ ン 溶 液 を 広 げ、 乾燥 さ せ る こ と に よ り レ シ チ ン 層 を 形 成 し た, , 次 に、 基板 1 に 力 バ— 1 0 お よ び ス ぺ ー サ 1 1 を 図 2 中 の一点鎖線 で 示 す よ う な 位 置 関 係 を も っ て 接 着 し て グ ル コ ー ス セ ン サ を 作 製 し た。

反 応 層 上 カゝ ら 第 3 の 電極 8 上 に わ た つ て レ シ チ ン 層 を 配 置 し た 口 、 第 3 の 電極 8 表 面 上 が レ シ チ ン 層 に よ り 変 化 を 来 た し、 そ の 応 答 特性 の ば ら つ き が大 き く な る 場 合 が あ る, ₍ 上 記 の よ う に レ シ チ ン 層 を 力 バ 一 部材側 に 配 置 す る と そ の よ う な ば ら つ き は抑 制 さ れ、 応答 特 性 に 向 上 が見 ら れ た 実 施例 5

反 応 層 カゝ ら C M C 層 を 除去 し た 以外 は、 全 て 実施例 2 と 同 様 の 方 法 で グ ル コ ー ス セ ン サ を 作 製 し た。

そ し て、 実施例 2 と 同 様 に測 定 を 行 っ た 結 果、 C M C 層 を 配 置 し た 場 合 に 比 べ て応答 の ば ら つ き は増 加 し た も の の、 ァ ス コ ル ピ ン 酸 お よ び グ ル コ ー ス に 対 す る 濃 度依 存 性 が観 察 さ れ た。 実施例 6

実施例 4 と 同様 に グル コ ー ス セ ン サ を作製 し た。

測 定器 に セ ンサ を セ ッ ト し、 対極 6 を 基準 に し て第 3 の 電極 8 に 一 1 3 0 O m V の 電位 を 印加 し た。 こ の 電位 を 印 加 し た 状態で、 空気飽和 状態 の グル コ ー ス 水溶液 3 PL 1 を、 試料液 と し て試料液供給 口 1 2 a よ り 供給 し た。 試料液 は試料液供給路 を 通 っ て空気孔 1 3 に ま で達 し、 電極系 上 の 反応層 が溶解 し た。

試料液 の 供給 と 同 時 に、 電極系 の 対極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の電気的変化 に 基づ い て液の 供給 を検知 す る シ ス テ ム が動作 し、 こ れ に よ り 測定 タ イ マ 一 が始動 し た。 こ の 時、 対極 6 と 第 3 の 電極 8 間 に電位 は 印加 さ れ続 けてお り、 試料液供給検知 か ら 一定時間経過後 に、 対極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の電流値 を測定 し た。 こ の 電流値 は、 溶存 酸 素 の 還元反応 に 起因 し、 ア ル ゴ ン に て脱気 し た ダル コ ー ス 溶液 を 供給 し た 場合 に は、 そ の還元電流 は激減 し た。 対極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値測定後、 両極間 の 電圧 印加 を解 除 し た。

上述 し た よ う に、 第 3 の電極 8 上 に は反応層 が配置 さ れて い な い。 よ っ て、 反応層 に含有す る フ ェ リ シ ア ン化 イ オ ン が第 3 の電極 8 近傍 に到達す る ま で に は、 若千 の 時間 を 必要 と す る。 すな わ ち、 フ ェ リ シ ア ン化イ オ ン が 第 3 の 電極 8 に到 達す る ま で の 時間 内 に お け る 対極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値 は、 主 に 溶存酸素濃度 の み を 反 映す る。 さ ら に、 試料液検 知 か ら 2 5 秒後、 第 3 の 電極 8 を 基 準 に し て 作 用 極 7 に 5 0 O m V を 印 力 Π し、 対極 6 と 作用 極 7 間 の 5 秒後 の 電流値 を 測 定 し た。

液 中 の フ ェ リ シ ア ン 化 イ オ ン、 グ ル コ ー ス、 お よ び G O D が 反 応 し、 そ の 結 果、 グル コ ー ス が ダ ル コ ノ ラ ク ト ン に 酸 化 さ れ、 こ の 反 応 に 伴 っ て、 フ ェ リ シ ア ン 化 ィ ォ ン が フ エ ロ シ ア ン 化 イ オ ン に 還元 さ れ る。

一 方、 こ の 反 応 の 競 争 反 応 と し て、 試料液 中 の 溶存酸 素 が電子 伝達体 と し て 働 き、 グ ル コ ー ス が ダ ル コ ノ ラ ク' ト ン に 酸 化 さ れ る の に 伴 レ 溶存 酸 素 が過酸化 水 素 に 還 元 さ れ る 反 応 が 同 時 に 進行 す る。 こ の 反 応 に よ っ て 生 成 す る 過酸 化水 素 は、 フ エ ロ シ ア ン 化 イ オ ン を フ ェ リ シ ァ ン 化 イ オ ン に 再酸化す る。 し た が っ て、 フ エ ロ シ ア ン 化 ィ オ ン の 酸化電流値 に 基づ い て グ ル コ ー ス 濃度 を 測 定 す る 場 合、 溶存 酸 素 が、 測 定 結果 に 負 の 誤差 を 与 え る。

し カゝ し、 上 述 し た よ う に、 対極 6 と 第 3 の 電 極 8 間 の 電流値 は 主 に 溶存 酸 素 濃度 の み を 反 映 す る。 そ こ で、 そ の 結 果 に 基 づ き 測 定 結 果 を 補 正 す る こ と で、 溶 存酸 素 の 影 響 を 除去 し 正確 な グ ル コ ー ス 濃度 を 求 め る こ と が で き る。 実施例 7

実 施例 4 と 同 様 に グル コ ー ス セ ン サ を 作 製 し た。

測 定 器 に セ ン サ を セ ッ ト し、 対極 6 を 基 準 と し て 第 3 の 電極 8 に 5 0 O m V の 電 位 を 印 加 し た。 こ の 電位 を 印 加 し た 状 態 で、 妨 害物 質 と し て ァ ス コ ル ビ ン 酸 を 含 む グ ル コ ー ス 水 溶 液 3 1 を、 試料液 と し て 試料液 供給 口 1

2 a よ り 供給 し た。 試料液 は試料液供給路 を 通 っ て 空 気 孔 1 3 に ま で 達 し、 電極 系 上 の 反 応 層 が溶解 し た。

試料液 の 供 給 と 同 時 に、 電極 系 の 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電 気 的 変 化 に 基 づ い て 液 の 供給 を 検 知 す る シ ス テ ム が動 作 し、 こ れ に よ り 測 定 タ イ マ ー が始動 し た。 こ の 時、 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 に 電位 は 印 加 さ れ続 け て い る。 さ ら に 試料液 供給検知 か ら 2 秒 経過後、 第 3 の 電極 8 へ の 印 力 B 電位 を 一 1 3 0 0 m V に ス テ ッ プ し た。 一 1

3 0 O m V に 電位 を ス テ ッ プす る 直 前、 お よ び 一 1 3 0 0 m V に ス テ ッ プ し て か ら 3 秒後 の、 二点 に お け る 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値 を 測 定 し た。 一 1 3 0 0 m V に 電位 を ス テ ッ プす る 直 前 の 電 流値 は、 主 と し て ァ ス コ ル ビ ン 酸濃度 に 依存 す る。 一 方、 一 1 3 0 O m V に ス テ ツ プ し て か ら 3 秒後 の 電流値 は、 主 と し て 試 料液 中 に 含 ま れ る 溶 存 酸 素 濃度 に 依存 す る。

試料液 供 給 か ら 2 秒後、 お よ び 5 秒後 の 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値測 定後、 両極 間 の 電圧 印 加 を 解 除 し た。

さ ら に 試料液検 知 か ら 2 5 秒後、 第 3 の 電極 8 を 基準 に し て 作 用 極 7 に 5 0 O m V を 印 加 し、 対極 6 と 作 用 極 7 間 の 5 秒後 の 電流値 を 測 定 し た。

上述 し た よ う に、 対 極 6 と 第 3 の 電極 8 間 の 電流値 は 主 に ァ ス コ ル ビ ン 酸 お よ び溶存 酸 素 濃度 を 反 映 す る た め、 そ の 電流値 に 基 づ き 両 物 質 の 濃度 を 求 め る こ と が で き る。 そ こ で、 そ の 結 果 に 基 づ き 測 定結 果 を 補正 す る こ と で、 ァ ス コ ル ビ ン 酸お よ び溶存 酸 素 の 影 響 を 除去 し、 正 確 な グル コ ー ス 濃度 を 求 め る こ と が で き る。 上記 実 施例 に お い て は、 試料液 の 供 給 を 検 知 し、 ァ ス コ ル ビ ン 酸 あ る い は溶存酸 素 検 出 の た め の 第 3 の 電極 8 へ の 印 カ卩 電位 を 5 0 O m V、 あ る レ は 一 1 3 0 O m V と し た が、 こ れ に 限 定 さ れ る こ と は な レ ま た、 応 答 電流 を 得 る た め の 作用 極 7 へ の 印 加 電位 を 5 0 O m V と し た が、 こ れ に 限定 さ れ る こ と は な く、 一 連 の 反 応 の 結 果 生 じ た 電子 伝達体 の 還元体 を 酸化 で き る 電位 で あ れ ば よ レ^ 電流値 を 測 定 す る 時 間 に つ い て も、 上 記実 施例 に 限定 さ れ る こ と は な レ ^。

上 記 実 施例 に お い て は、 親 水性 高 分子 と し て カ ル ポ キ シ メ チ ル セ ル ロ ー ス を 用 い た が、 親 水 性 高 分子 層 を 形 成 す る 親 水 性 高 分子 に は、 種 々 の も の を 使用 す る こ と が で き る。 例 え ば、 ヒ ド ロ キ シ ェ チ ル セ ル ロ ー ス、 ヒ ド ロ キ シ プ ロ ピ ル セ ル ロ ー ス、 メ チ ル セ ル ロ ー ス、 ェ チ ル セ ル ロ ー ス、 ェ チ ル ヒ ド ロ キ シ ェ チ ル セ ル ロ ー ス、 カ ル ボ キ シ メ チ ル ェ チ ル セ ル ロ ー ス、 ポ リ ビ ニ ル ピ ロ リ ド ン、 ポ リ ビ ニ ル ア ル コ 一 ル、 ポ リ リ ジ ン 等 の ポ リ ア ミ ノ 酸、 ポ リ ス チ レ ン ス ル ホ ン酸、 ゼ ラ チ ン お よ びそ の 誘 導体、 ポ リ ア ク リ ル酸 お よ びそ の 塩、 ポ リ メ タ ア ク リ ル酸 お よ び そ の 塩、 ス タ ー チ お よ びそ の 誘導体、 無 水 マ レ イ ン 酸 ま た はそ の塩 の重合体が あ げ ら れ る。 そ の 中 で も、 カ ルボ キ シ メ チ ルセ ル ロ ー ス、 ヒ ド ロ キ シ ェ チルセ ル ロ ー ス、 ヒ ド ロ キ シ プ ロ ピ ルセ ル ロ ー ス が好 ま し レ

反応層 に 含有 さ れ る 酸化還元酵 素 と し て は、 試料液 に 含 ま れ る 基質 に応 じ て選択 さ れ る。 酸化還元酵 素 と し て は、 例 え ば、 フ ル ク ト ー ス デ ヒ ド ロ ゲナ一ゼ、 ダル コ一 ス ォ キ シ ダーゼ、 ア ル コ ールォキ シ ダ一ゼ、 乳酸 ォキ シ ダー ゼ、 コ レ ス テ ロ ー ルォキ シ ダーゼ、 キサ ン チ ン ォキ シ ダー ゼ、 ア ミ ノ 酸 ォ キ シ ダーゼな ど が あ げ ら れ る。

電子伝達体 と し て は、 フ ェ リ シ ア ン化カ リ ウ ム、 P — ベ ン ゾキ ノ ン、 フ エ ナ ジ ン メ ト サル フ エ 一 ト、 メ チ レ ン ブルー、 フ エ 口 セ ン誘導体な ど が あ げ ら れ る。 電子伝達 体 は、 こ れ ら の 一種 ま た は二種以上が使用 さ れ る。

上記酵 素 お よ び電子伝達体 は、 試料液 に溶解 さ せて も よ く、 反応層 を基板な ど に 固定す る こ と に よ っ て試料液 に 溶 けな い よ う に し て も よ い。 酵 素お よ び電子伝達体 を 固 定化す る 場合、 反応層 は、 上記親水性高 分子 を 含有す る こ と が好 ま し レ 。

上記実施例 で は、 特定 の電極系 の例 を 図 示 し たが、 電 極形状、 電極お よ び リ ー ド の配置等 は こ れ ら に 限定 さ れ る も の で はな レ 。

ま た、 上記実施例 で は第 3 の電極 の 電極材料 と し て 力 一ボ ン に つ い て述べた が、 こ れ に 限定 さ れ る こ と は な く、 他の 導電性材料や銀 Z塩化銀電極な ど も 使用 で き る。 産 業 上 の 利 用 可能性

以 上 の よ う に 本発 明 に よ る と、 高 い 信 頼 性 を 有 す る 基 質 の 定 量 を 行 う こ と が で き る。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 電気絶縁性基板 と、 前記基板上 に 形成 さ れ た作用 極、 対極、 お よ び、 妨害物 質検知 電極 と し て使用 さ れ る 第 3 の 電極 を 有 す る 電極系 と、 第 3 の 電極 を 除 く 電極系 上 に 設 け ら れ た、 少な く と も 酸化還元酵素 と 電子伝達体 を含 有す る 反応層 か ら な る バイ オセ ン サ を 用 い て、 試料液 に 含 ま れ る 基質 と 酸化還元酵 素 と を 反応 さ せ る 際 に 生成す る 電子 に よ っ て電子伝達体 を還元 し、 そ の 電子伝達体 の 還元量 を 電気化学的 に 計測す る こ と に よ り、 試料液 中 の 基質 の 濃度 を 定量す る 方法で あ っ て、

( a ) 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 に電圧 を 印加す る 工程、

( b ) 試料液 を 反応層 に 供給す る 工程、

( c ) 試料液 の 反応層 へ の供給 に よ っ て生 じ た、 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 の 電気的変化 を検知 す る 工程、

( d ) 前記 の検知 す る 工程 （ c ) の後、 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 に 生 じ た電流 を測定す る 工程、

( e ) 前記 の測定す る 工程 （ d ) の後、 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 の 電圧印加 を解除す る 工程、

( f ) 作用 極 と 対極 と の 間 に 電圧 を 印加す る 工程、 お よ び

( ) そ の後、 対極 と 作用 極 と の 間 に 生 じ た電流 を測 定す る 工 程、

を包含す る こ と を 特徴 と す る 基質 の定量法。

2 . 前記工程 （ f ) に お い て、 作用 極 と 第 3 の 電極 と の 間 に も 電圧 を 印 加す る 請求項 1 記載 の 基質 の定量法。

3 . 電気絶縁性基板 と、 前記基板上 に 形成 さ れた作用 極、 対極、 お よ び、 妨害物 質検知 電極 と し て使用 さ れ る 第 3 の電極 と を 有す る 電極系 と、 第 3 の 電極 を 除 く 電極系 上 に 設 け ら れ た、 少 な く と も 酸化還元酵 素 と 電子伝達体 を 含有 す る 反応層 と、 前記基板 上 に お い て試料液 を 試料液 供給 口 か ら 前記反応層 へ導 く 試料液供給路 を 形成す る 力 バー 部材 と か ら な り、 第 3 の 電極が反応層 よ り も 試料液 供給路 の 上流側 に 配置 さ れて い る バイ オセ ン サ を用 い て、 試料液 に 含 ま れ る 基質 と 酸化還元酵素 と を 反応 さ せ る 際 に 生成す る 電子 に よ っ て電子伝達体 を還元 し、 そ の 電子 伝達体 の 還元量 を 電気化学的 に 計測 す る こ と に よ り、 試 料液 中 の 基質 の濃度 を定量す る 方法 で あ っ て、

( a ) 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 に 電圧 を 印加 す る 工程、

( b ) 試料液 を 反応層 に 供給す る 工程、

( c ) 試料液の 反応層 へ の 供給 に よ っ て 生 じ た、 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 の 電気的変化 を検知 す る 工程、

( d ) 前記 の検知す る 工程 （ c ) の後、 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 に 生 じ た電流 を測定す る 工程、

( e ) 前 記 の 測定す る 工程 （ d ) の後、 対極 と 第 3 の 電極 と の 間 の電圧 印 加 を解除す る 工程、

( f ) 作用 極 と 対極 と の 間 に 電圧 を 印加す る 工程、 お よ び ( g ) そ の後、 対極 と 作用 極 と の 間 に 生 じ た 電流 を測 定す る 工程、

を包含す る こ と を 特徴 と す る 基質 の定量法。

4 . 前記工程 （ f ) に お い て、 作用 極 と 第 3 の 電極 と の 間 に も 電圧 を 印加す る 請求項 3 記載 の 基質 の定量法。

5 . 前記 カ バー部材 の試料液供給路 に 露 出 し た 面 に、 レ シ チ ン を 主成分 と す る 層 を 配置 し た バイ オセ ンサ を 用 い る 請求項 3 記載 の 基質 の定量法。

6 . 前記反応層 が、 さ ら に親水性高 分子 を 含有す る バイ ォセ ンサ を 用 い る 請求項 1 記載の基質 の定量法。

7 . 前記反応層 が、 さ ら に親水性高 分子 を含有す る バイ ォセ ンサ を 用 い る 請求項 3 記載 の 基質 の 定量法。