WO1999027367A1 - Vorrichtung und verfahren zum nachweis von analyten - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of analytes and a device for carrying out the method.
  • Such devices and methods are used for the qualitative and quantitative detection of specific bonds between at least two molecules. These include, for example, the detection of receptor-ligand interactions, antibody-antigen interaction, the recognition of nucleic acids, the interaction between oligonucleotides and DNA and other molecular interactions. Methods and devices of this type can be used, for example, in chemistry, clinical analysis, pharmaceutical development, environmental analysis and in routine work. from molecular biology to the sequencing of nucleic acids.
  • immunoassays can be carried out using different detection methods. These include radioactive, fluorescence and chemiluminescence-based as well as enzymatic methods (C.P. Price, D.J. Newman: Principles and Practice of Immunoassays, Macmillan Publicers Ltd., 1991 U.K.).
  • Such agglutination tests can be used to detect 10 5 molecules using microspheres with a diameter of 10 ⁇ m, 10 8 molecules with microspheres with a diameter of 1 ⁇ m and 10 13 molecules with microspheres with a diameter of 0.1 ⁇ m.
  • theoretical sensitivities of 10 fM, 10 pM and 10 nM are given. The highest sensitivity therefore arises with relatively large microspheres, the use of which is, however, limited by their sedimentation behavior.
  • nucleic acids for example oligonucleotides, RNA and DNA
  • chip technology is not used as an electrical measurement method, but rather serves as a new synthesis method and for generation of microstructures.
  • the actual detection mechanism is optical.
  • the combination of electrical methods for the synthesis of a ligand and optical labeling and detection is, however, very complex.
  • a disadvantage of the prior art is that detection methods on a radioactive basis are subject to radiation protection and disposal problems of the radioactive waste which arises in the process.
  • enzymatic detection methods which enable an electrochemical detection of the analytes, a chemical reaction with a substance as a chemical reaction substrate must take place as an additional work step.
  • the object of the invention is to provide a device and a method which enables the detection of analytes in a quick, simple and precise manner and in which a washing step can be dispensed with.
  • the method according to the invention is therefore based on a detection method which can be regarded as essentially purely electrical. It therefore has the very high sensitivity or accuracy that is possible for the determination of electrical or electrochemical properties and consequently a very low detection limit with high sensitivity.
  • the electric field is almost exclusively influenced by marker particles with different material composition, different specific resistance of electrical surface charge or different dielectric constant, for example with the analyte or with a pad ie as a base suitable bodies or materials specific bonds have been entered. Excess unbound marker particles do not lead to a signal, so that a washing step to remove unbound marker particles from the measurement solution can be omitted.
  • the measuring range of the bioassay according to the invention can be set by specifying the electrode or underlay surfaces and by selecting the size of the marker particles.
  • the method according to the invention and the device according to the invention can be used for the detection and determination of the concentration of any analytes which can be detected via molecular interactions.
  • these include, for example, the interactions of receptor ligand, antibody antigen, antibody hapten, antibody fragment antigen, aptamers, proteins, nucleic acids, oligonucleotides, DNA and all molecular interactions in which at least one of the molecular partners is labeled with a marker particle can. This extends to the interaction of substances with the surfaces of whole cells. In principle, it is possible to implement all known immunoassay formats according to the prior art.
  • the presence of a single marker particle can lead to sufficiently high changes in the electric field.
  • Marker particles which are further away from the electrode and are not specifically bound lead to less impairment of the electrical field, so that with a suitable arrangement of the electrodes in the vicinity of a base or formation of the electrodes themselves as a base and with a suitable concentration of the marker particles the measured signal essentially only is influenced by specifically bound marker particles.
  • There- a washing step for removing excess marker particles or analytes from the measurement solution can then also be omitted.
  • the detection can be provided by the strength of the magnetic field or by the change caused by the marker particles.
  • a single bond can be verified on an electrode as a base, the surface of which is in the same order of magnitude as the largest cross-sectional area of the marker particle or at least does not differ by several orders of magnitude.
  • microelectrodes can be used for this, which have round, square, rectangular, but also any shape.
  • the diameter of the marker particles is between a few nm to a few ⁇ m, for example 10 ⁇ m.
  • the measuring range of the bio-assay can be determined by defining the electrode surfaces between the single bond area and the agglutination area.
  • the resulting movement of electrically charged or magnetic (paramagnetic or diamagnetic) marker particles enables better mixing of the analytes and the marker particles.
  • Magnetic marker particles are particularly suitable for this purpose, since a considerably lower magnetic field than with diamagnetic marker particles items is needed. Such a field-induced mixing can improve the accuracy and reproducibility of any marker-based detection method.
  • the marker particles with immobilized molecules can also include those that do not carry any molecules. These additional marker particles increase the mixing effect. This mixing of the measuring medium can also be supported by coupling ultrasound.
  • the electrophoretic transport can first transport the charged molecules to their binding sites on or in the vicinity of the electrodes when an electrical voltage is applied. After binding at the binding sites, reversing the polarity of the electrical field brings the molecule-loaded marker particles to the binding sites on or in the vicinity of the electrodes. This method is particularly advantageous when using sandwich format assays.
  • the described directed and induced by the mixing or alternating transport of electrically charged or magnetic particles induced by an electric or magnetic field can be used with all marker-based detection methods running in measurement solutions.
  • uncharged but polar marker particles can also be transported or mixed in a directed manner by the above-mentioned method.
  • an electrode in front of which an aperture with at least one small opening is arranged.
  • the diaphragm faces the measurement solution and an inhomogeneous electric field is generated via the electrode, the field lines of which pass through the small opening of the diaphragm.
  • the marker particles bind to or near the surface of the
  • Another advantage of the invention is that the current which flows through the small aperture opening to the counter electrode in the measurement solution causes only a very small current density at the electrode.
  • the current density is smaller by the ratio of the cross-sectional area of the aperture opening and the electrode area. The consequence of this is that changes in the electrical resistance are mainly caused by particle-induced field disturbances and the influence of electrochemical electrode reactions is largely negligible. In this way, the measurements can be carried out more precisely.
  • the measurement of the detection of the disturbances in the electrical field caused by the marker particles in the measurement solution is carried out using a potentiometric method, wherein the electric field on the surface of an electrode is formed by potential formation processes at the interface between the measurement solution and the electrode.
  • Electrodes with a larger diameter or larger area can also be used. This results from the fact that the potential-forming processes on the surface of a potentiometric electrode occur at distances from this electrode which are of the same order of magnitude as the diameter of marker particles. In this way, marker particles in the nm range down to the ⁇ m range can be used.
  • the marker particles in the liquid measuring medium have a significantly different electrical charge and / or potential difference on their surface than the ion-selective electrode itself. This is a favorable prerequisite for potentiometric detection for the binding of marker particles .
  • ionophones should be used here than in the ion-selective membrane, which serves to detect the bound marker particles. It is also possible to provide marker particles with a thin metal layer on the surface. Both in the amperometric and in the potentiometric detection methods, analytes can be detected in a two-step process which includes the marker particle transport and then the binding to the electrode. As described, electrophoretic and magnetic marker particle transport can be used here.
  • Fig. 1 shows the electrical flow field in the vicinity of a microelectrode a) spherical microelectrode b) planar microelectrode c) planar microelectrode with marker particles in the flow field
  • Fig. 2 electrophoretic marker particle transport a + b) to the microelectrode or c) away from the microelectrode
  • Fig. 3 macroelectrode with agglutinated marker particles
  • Fig. 4 flow cell with two microelectrodes, a) without marker particles b) with a marker particle and c) with two bound marker particles
  • Fig. 12 cross section through an immunoassay array
  • FIG. 17 measuring circuit for assays according to FIGS. 14 to 16
  • Bioassay for whole cells 20 shows further embodiments of immunoassay formats
  • FIG. 24 shows a schematic illustration of an electrode and a diaphragm with electrical flow lines without bound label particles and with a label particle bound near the aperture opening
  • 31 shows a schematic illustration of a potentiometric electrode with bound marker particles
  • Fig. 33 shows an electrode arrangement with an integrated
  • 35 shows an electrical circuit with a potentiometric electrode and counter and reference electrodes.
  • FIG. 1 a The environment of a microelectrode is shown in FIG. 1 a).
  • 1 is an insulating support on which a spherical microelectrode 2 * is arranged. Between this microelectrode 2 * and a counter electrode, not shown, an electrical
  • a liquid measuring medium 3 flows around both electrodes. Electrical field lines 4 emanate from the live microelectrode 2 *.
  • the mechanism of a bond detection is shown in FIGS. 1 b) and 1 c).
  • the planar microelectrode 2 has a square shape with an edge length of 3 ⁇ m.
  • the electrode has been produced with the aid of known thin-film processes on an insulating carrier 1, which consists of glass.
  • the material of the marker particle is, for example, Si0 2 , and the diameter is 2 ⁇ m.
  • r is the distance from the center of the microelectrode into the measuring medium.
  • a disturbance of the electrical field in the immediate vicinity of the microelectrode 2 * thus leads to a strong change in the electrical field line course.
  • a marker particle (label particle) 5 is shown, which is bound via a bond 6 to a microelectrode 2 as a base.
  • the electrical flow field 4, which is strongly disturbed by the marker particle 5, results in a strong change in the measurable electrical resistance between the microelectrode 2 and a counterelectrode, which changes is also in the aqueous measuring medium 3, but is not shown.
  • the electrical resistance can be measured with DC or AC voltages with values from a few 10 mV to a few volts, preferably in the lOOmV range, and the electrical capacitance can be measured with AC voltages with frequencies from a few Hz to a few MHz, preferably in the kHz range , be measured.
  • a quantitative measurement can be carried out dynamically by evaluating the signal-time.
  • the molecular interaction of the marker particles 5 with the base is further supported by the transport of marker particles 5 in an electrical field, provided that the marker particles 5 themselves are electrically charged. This can be described as follows.
  • Q is the charge of the ions.
  • the speed of the marker particles (v) is therefore proportional to the electric field strength E. This proportionality is described by the mobility ⁇ :
  • the mobility ⁇ depends on the type of measuring medium and the ARt of the marker particles.
  • the self-loading of the marker particle determines the direction of the field-induced transport in any case if the amount of self-loading is greater than the amount of charges of the molecules bound to the surface. If the charge of the bound molecules has the same polarity as the marker particle self-charge, the transport is strengthened by increasing the speed. With opposite charges, the speed is reduced.
  • FIG. 2 shows the electrophoretic transport of electrically charged marker particles 5 described above in theory. Due to an electrical voltage of, for example, 500 mV applied between a microelectrode 2 and a counterelectrode, not shown, the marker particles 5 move in the direction of the microelectrode, since electrical forces F e act on the particles (Fig. 2 a). After the marker particles 5 have approached (FIG. 2b) the microelectrode 2, a binding interaction 6 can occur with the electrode 2 designed as a base (FIG. 2c). After the electric field has been reversed, the electric forces F e act in the opposite direction, so that the unbound marker particles 5 are removed from the microelectrode 2 again (FIG. 2c). In this way, a pseudo-washing step is carried out by electrophoretic transport.
  • an electrical voltage of, for example, 500 mV applied between a microelectrode 2 and a counterelectrode, not shown the marker particles 5 move in the direction of the microelectrode, since electrical
  • Paramagnetic or diamagnetic marker particles can also be transported in a magnetic field, the magnetic field having to be inhomogeneous in the case of diamagnetic marker particles.
  • LIFE field effect
  • FIG. 3 shows a bio-assay for the detection of higher analyte concentrations.
  • larger electrodes 2 + for example made of glass, are used on an insulating support 1, on the surface of which there is surface coverage up to a three-dimensional agglutination of marker particles is coming.
  • the electrode has, for example, a rectangular shape with the dimensions of 10 x 50 ⁇ m.
  • the measuring range for higher analyte concentrations can be called the agglutination range.
  • the agglutination range In order to avoid agglutination of marker particles that are still freely moving in the measuring medium, the
  • Measurement can be supported by an electrophoretic marker transport to the electrode.
  • Fig. 4 shows a flow cell made of plastic with two opposing microelectrodes 2 > , 2 ', which consist for example of platinum and are applied to carrier materials 7.
  • the flow ⁇ of a measuring medium 3 moves analyte molecules and marker particles 5 through the flow cell.
  • the distance between the microelectrodes 2 2 > s is 50 ⁇ m and the electrode area in each case 5 ⁇ m ⁇ 5 ⁇ m.
  • 4 a) shows the flow-through cell without marker particles, in FIG. 4 b) with one marker particle 5 and in FIG. 4 c) with two marker particles 5 bound to one another. Due to the electrical flow field disturbed by the marker particles 5, the presence of one or more marker particles 5 between the microelectrodes 2P 2 "can be detected by measuring the electrical resistance or the complex admittance.
  • 5a shows an immunoassay for antigen detection according to the sandwich principle.
  • Antibodies 9 ' are immobilized on an electrode 2. Of the antigens 8, an antigen 8 * interacts with an immobilized antibody 9 'on the electrode 2.
  • An antibody 9 which has been immobilized on a marker particle 5 interacts with the antigen 8 *, so that a sandwich is formed forms.
  • the electrical Position of the marker particle 5 close to the trode is detected electrically or electrochemically by the marker-induced field effect.
  • 5 b shows a competitive immunoassay format for antigen detection.
  • antigens 8 compete with antigens 8' P immobilized on the marker particles 5.
  • FIG. 5 c) shows an immunoassay sandwich format for the detection of antibodies and FIG. 5 d) shows a competitive format for the detection of antibodies.
  • FIG. 5 d) shows a competitive format for the detection of antibodies.
  • FIG. 1 In a further exemplary embodiment, FIG. 1
  • This membrane consists, for example, of nitrocellulose or nylon. Marker particles 5 with immobilized antibodies 9 ′′ are located and movable in the membrane 10. Antigens 8 can now be detected in a simple manner by applying a liquid measuring medium 3 to the surface of the membrane 10.
  • This membrane can be designed as a functional layer and can take over functions that are known, for example, from the field of immunofiltration. The medium undergoes filtration and / or conditioning in this membrane. The detection of the sandwich formation is carried out as described in the example in FIG. 5 a).
  • the electrodes are covered with membranes that cannot be penetrated by microparticles.
  • the molecular binding partners are not immobilized on the electrode itself, but on the free membrane surface, on which they also interact with the molar
  • Binding partner of the marker particles occur.
  • FIG. 7 shows the various immunoassay formats for a flow measuring cell with microelectrodes 2 ', 2 >> .
  • 7 a) shows the immobilization of antibodies 9 1 'on marker particles 5, to which antigens 8 specific for the antibodies 9' 1 are bound. Antigens 8 * also agglutinate two marker particles 5.
  • antigens 8 compete with a marker particle 5, which is provided with antigens 8 ′′, for the binding sites on a marker particle 5, which contains antibodies 9 ′′. is provided.
  • the electrical measurement takes place according to the example according to FIG. 4.
  • a DNA probe is shown in FIG.
  • FIG. 8 a shows a marker particle 5 and a DNA 11 in a measuring solution.
  • the DNA 11 is immobilized on a marker particle 5 (FIG. 8 b).
  • FIG. 8 c, d shows a hybridization of DNA 11 ′′ and RNA 12 from the measuring medium.
  • FIG. 8e there is an interaction between the DNA-RNA hybrid and an immobilized antibody 9 ', so that the marker particle 5 is located near the microelectrode and can be detected electrically.
  • FIG. 9 shows a DNA probe without immobilized antibodies.
  • a DNA molecule 11 is immobilized on a marker particle 5 (FIG. 9 a).
  • hybridization takes place with an RNA strand 12 'immobilized on the microelectrode 2 (FIG. 9 b), and the marker particle 5 is localized close to the phase boundary (FIG. 9 c).
  • RNA molecules can be exchanged for DNA molecules and vice versa.
  • FIG. 10 shows a sandwich type DNA assay.
  • a DNA probe molecule 13 is immobilized on a microelectrode (FIG. 10A).
  • a DNA molecule 11 from the measuring medium interacts with the probe molecule 13 (FIG. 10 b).
  • After the molecules 13 and 11 have hybridized to form a hybrid (11 * , 13 * ), there is an interaction with a reporter-probe molecule 14 which is immobilized on a marker particle 5 (FIG. 10 c).
  • This hybridization leads to a localization of the marker particle 5 close to the microelectrode (FIG. 10d).
  • the measurement is carried out as in the previous examples. wrote. In this way, for example, DNA probe arrays can be set up for sequencing.
  • FIG. 11 A section of a microelectrode array is shown in FIG. 11. On an insulating support
  • FIG. 11 a A large number of microelectrodes 2 are realized.
  • FIG. 11 a Three microelectrodes are shown.
  • Antibodies of different types 9P 9 ° P 9 V ' are immobilized on the microelectrodes (FIG. 11 a).
  • Antigens 8 match the antibodies 9 '. 8 ° antigens match the 8 ° antibodies. If the mentioned antigens 8, 8 ° interact with the antibodies 9 ', 9 °', which are immobilized on the different microelectrodes, a sandwich can be formed by the attachment of corresponding antibodies, which are immobilized on marker particles (Fig.
  • the sandwich formation can be supported in that when charged marker particles are used, they are moved electrophoretically in the direction of the microelectrodes by applying an electrical voltage between the microelectrodes 2 and an external reference electrode (not shown) (FIGS. 11a) and b).
  • the electrophoretic transport is reversed by reversing the polarity of the electrical voltage and the force F, so that the unbound marker particles are moved away from the microelectrodes (Fig. 11 c). This is also a pseudo-washing step.
  • the marker particles bound in the sandwich are recorded electrically, as described in the previous examples.
  • the electrophoretic marker particle transport can also be replaced by a magnetically induced transport of paramagnetic marker particles. In the same way, such arrays can be used to implement a DNA chip assay which can be used for sequencing by hybridization.
  • DNA probes are used instead of the antibodies or antigens, as shown in FIGS. 8 to 10.
  • FIG. 12 shows a section from a planar microelectrode array.
  • a carrier 1 consists of glass.
  • a microelectrode 2, a conductor track 17 and an electrical contact 15 are made of platinum and were produced by a common thin-film process.
  • the media used for such a bio-assay (marker particles, antibodies, etc.) and the measuring medium can be applied to the microelectrode.
  • FIG. 13 Another embodiment is shown in FIG. 13. As a section from a larger array is a mirror-symmetrical and therefore only one-sided
  • a carrier 1 for the microelectrodes 2 * consists of a three-dimensionally structurable material.
  • silicon can be used for this, which is structured three-dimensionally by known anisotropic etching processes.
  • the silicon is electrically insulated on the surface.
  • Si0 2 layers are generated on the silicon surface by thermal oxidation.
  • an Si 3 N 4 layer can be deposited over the Si0 2 layer by CVD processes.
  • a metal film can be deposited on the carrier surface and structured. This metal film consists of
  • the conductor track 17 is covered with an electrical insulation layer 16, which consists, for example, of a polymer material.
  • the microelectrode 2 # is located in a pyramid-like depression, which can be referred to as containment 18.
  • FIG. 14 shows a simple structure for a device according to the invention as a bioassay. There are two interdigital structures on a carrier 1
  • the finger structures shown are not shown to scale.
  • the finger widths and the distances between the fingers are typically a few ⁇ m. This means that a small electrode surface is required for the detection of only a few bound marker particles.
  • the interdigital structures 19, 19p electrical conductor tracks 17, 17p 17 17 +1 and electrical connection contacts 15, 15p 15 15 + ' are produced from platinum, for example, using known thin-film processes.
  • This carrier is provided with a cover 20 (Fig. 14 b).
  • the cover 20 is assembled, for example, by gluing. It can also be applied using a screen printing process.
  • the sample can interact with the interdigital structures through openings 21, 21 'provided in the cover.
  • Antibodies were previously immobilized on the surface of one of the interdigital structures.
  • an immunoassay of the sandwich type can be carried out, as described in FIG. 5 a).
  • 22 marker particles with immobilized antibodies are weakly immobilized on the surface.
  • the marker particles located on the surface 22 can dissolve in the measuring medium. In this way, a sandwich formation can be carried out, as described in FIG. 5 a).
  • the measurement can be carried out on both interdigital structures. Because only on one of the two
  • FIG. 15 An exemplary embodiment modified compared to FIG. 14 is shown in FIG. 15.
  • the cover 20 with the openings 21, 21 '(FIG. 15 a) is covered with an additional membrane 23 (for example a dialysis membrane) (FIG. 15 b).
  • the marker particles with the immobilized molecules used for the bioassay have been introduced in soluble form into one of the openings 21, 21 'before the membrane 23 is applied.
  • the sensor configuration according to Fig. 15 b) is with its lower end in the measuring medium immersed so that the measuring medium can penetrate through the thin layer 23 into the area of the openings 21, 21 '. The measurement is carried out as described in the example in FIG. 14.
  • FIG. 16 shows in simplified form in FIG. 16, in which an assay structure according to FIG. 14 is provided with a magnet 24.
  • a magnetic field is formed in such a way that the paramagnetic marker particles are drawn into the area of the interdigital structures 19, 19 '. This is e.g. possible with the help of the small magnet 24.
  • the magnet 24 is arranged on the opposite side (above the assay structure in FIG. 16), so that the marker particles are moved away from the interdigital structures 19, 19 'and a pseudo-washing step occurs.
  • the small magnet 24 can also be replaced by an electromagnet.
  • FIG. 17 shows a measuring circuit for devices (assays) according to FIGS. 14 to 16.
  • a voltage source 29 generates a direct voltage or an alternating voltage signal in the mV range, preferably in the amount of a few 100 mV. This signal is connected via connections 34 and 35 to connections 15 and 15 + or 15 'and 15 + ' of the interdigital structures according to FIGS. 14, 15 or 16.
  • the direct or alternating current that is established via the measuring solution is registered with an ammeter 30. From the voltage-current data, the electrical conductivity is measured as a measure of the analyte concentration in the measuring medium the surroundings of the electrodes of the interdigital structure, which may be covered with marker particles.
  • a DC voltage in the range of a few 100 mV can be applied against a counter electrode from a DC voltage source 33 via resistors 31 and 32 to the connections 34 and 35.
  • the counter electrode can be located at a greater distance from the interdigital structures in the measuring medium.
  • this counter electrode consists of a chloridized silver film, as is the case in the prior art.
  • the values of the resistors 31, 32 are in the k ⁇ or M ⁇ range (e.g. 100 k ⁇ ).
  • FIG. 18 a An immunoassay test stick is shown in a highly simplified form in FIG.
  • a carrier 1 FIG. 18 a
  • an immobilization layer 25 made of a material, on the surface of which antigens are immobilized on contact.
  • This layer consists of PVA and covers an interdigital double structure (not shown), as is known from FIGS. 14 to 16.
  • the electrical connections (not shown) are located on a connection surface 26.
  • FIG. 18a If the arrangement according to FIG. 18a is placed in a vessel 27 with a measuring medium 3 which contains antigens 8, 25 antigens are immobilized on the immobilization surface (FIG. 18bl). The same can happen when the arrangement according to FIG. 18a is introduced into a tissue (e.g. meat ...) or a gel-like measuring medium (FIG. 18 b2).
  • the arrangement is then brought into contact with a liquid medium which contains marker particles with immobilized antibodies (FIG. 18c).
  • a liquid medium which contains marker particles with immobilized antibodies (FIG. 18c).
  • the measurement can be carried out as shown in the previous examples.
  • FIG. 19 Another example of a bioassay is shown in FIG. 19. With such an assay, whole cells 40 can be detected.
  • the arrangements according to FIG. 19 a) and b) correspond to an immunoassay format according to FIG. 5 a). Compared to the immunoassay, the antigens are replaced by cells 40 which have structures with the property of antigens 8 * on their surface.
  • 19 a) shows a bioassay with small cells (e.g. protocytes with diameters in the range of 0.3 and 2.5 ⁇ m).
  • Fig. 19 b) represents an assay with e.g. Eucytes with diameters between 2 and 20 ⁇ m.
  • the marker particles used in the previous exemplary embodiments can consist, for example, of microspheres made of SiO 2 , latex, diamagnetic, paramagnetic and other materials with diameters between 15 nm and 25 mm. Dendrimers can also be used.
  • marker particles made of electrically insulating materials marker particles made of metallic material can also be used.
  • electrically conductive marker particles can also be realized by evaporating electrically insulating marker particles (e.g. microspheres) with a thin metal layer.
  • FIG. 20 shows another immunoassay format as a further exemplary embodiment.
  • there is examples include a microelectrode 2 on which antibodies 9 are immobilized.
  • antigens 8 and 8 'and marker particles 5 are located in the half space above the microelectrode. These marker particles are coated with an electroactive substance A.
  • the antigens 8, 8 ' which are complementary to the antibodies 9 on the electrode 2, can enter into binding interaction. If the antigens carry an electrical charge, it is additionally possible to transport these antigens to the electrode using an electric field F e (FIGS. 20a + b).
  • the marker particles 5 with a magnetic or paramagnetic core can now be moved towards the electrode 2 with the aid of a magnetic field F m (FIG. 20c).
  • the antibodies 9 can enter into a binding interaction with the antigens 8 which have already bound to the antibodies which are immobilized on the electrode 2. Unbound marker particles can be created using a magnetic field that is reversed in the direction
  • F m can be removed from the microelectrode 2.
  • the marker particles 5 are loaded with the electroactive substance A, which can escape from the marker particle surface by diffusion.
  • the connection of marker particles close to the electrode is thus registered in that the electroactive substance A is converted at the electrode 2, in which an electric current flows in the form of electrons e.
  • an electrical voltage of a few 100 mV is applied between the microelectrode 2 and a counterelectrode (not shown).
  • an electric field can be used for electrophoretic transport. This has already been shown in the previous exemplary embodiments.
  • FIG. 21 Another embodiment is shown in FIG. 21.
  • FIG. 21 shows that there occurs a binding interaction of antigens 8 'with antibodies 9, which are immobilized on the electrode 2. This can also be supported by an electric field F e .
  • not only antibodies 9 'but also enzymes E are immobilized on the surface of the marker particles 5.
  • a substrate S for example glucose
  • the enzymes (E) immobilized on the marker particle surface lead to a conversion of the substrate (S).
  • the resulting product (P) for example H 2 0 2
  • Excess marker particles can be removed from the electrode surface by reversing the magnetic field F m .
  • the enzymatically catalyzed material conversion at the electrode 2 takes place in the same way as in known electrochemical glucose sensors.
  • an electrical voltage of a few 100 mV (preferably 600 mV) is applied between the electrode 2 and a counter electrode.
  • FIG. 22 Another embodiment is shown in FIG. 22.
  • antigens 8, 8 'and those on the elec- trode immobilized antibodies 9 come.
  • marker particles can now be transported near the electrode.
  • the marker particles 5 carry on their surface in the obilized antibody 9 and immobilized enzymes (E)
  • Fig. 22b After there has been a binding interaction between the marker particles 5 and the electrode 2, the excess of marker particles 5 (not shown) can be removed from the electrode by reversing the magnetic field. A second type of marker particles 5 'is then moved toward the electrode 2 with the aid of a magnetic field F m . These marker particles 5 'are loaded with a substrate S (for example glucose). If the marker particles 5 'are in the vicinity of the electrode 2, a diffusing substrate S interacts with the enzymes E immobilized on the marker particles 5. The product P formed in this way becomes electrochemical on the electrode 2, as shown in the previous exemplary embodiment implemented (Fig. 22d).
  • a substrate S for example glucose
  • marker particles with immobilized enzymes instead of marker particles with immobilized enzymes (FIGS. 21 and 229, marker particles which are loaded with enzymes can also be used. The enzymes can be released from these marker particles in the same way as for the electroactive substance in the example according to 20 has been described.
  • DAN probes and other bioassays can be implemented in an analogous manner. Only the immune complexes are replaced by other bonds. 20-22, assays can also be implemented with an extremely low detection limit if the area of the microelectrode is not very much larger than the projected cross-sectional area of the marker particles. Thus, an individual bond detection is also possible here, ie the attachment of a marker particle to a microelectrode is detectable.
  • the proof is based on the fact that the marker particles cause an increase in a substance concentration in their immediate vicinity. This takes place through release or through enzymatic substrate conversion on the particle surface. This is not possible, e.g. with other biosensors around a measurable signal that depends on the substrate concentration. Rather, the measurable signal is determined by the number of marker particles located near the microelectrode.
  • FIG. 23 Another exemplary embodiment is shown in FIG. 23.
  • a microelectrode 2 is attached to a carrier 1. If, as described above, there is a bond 6 between marker particles 5 and the electrode 2, the marker particles are located close to the microelectrode. If ferromagnetic marker particles with their own magnetic field are involved, the localization of the marker particles 5 close to the electrode can be detected with the aid of a sensor 37 which measures the strength of the magnetic field.
  • marker particles with a paramagnetic core. If an alternating magnetic field 4 is now generated above the carrier 1, the change in the magnetic field strength caused by the marker particles can be Sors 37 are detected, the frequency of the magnetic alternating field can be between a few Hertz and a few MHz.
  • the permeability number of the particle or the particle core differs from the permeability number of the liquid measuring medium of the substrate and when measuring the flow of the flow measuring chamber according to FIG. 4.
  • the electrophoretic transport of binding molecular partners to the electrode 2 can take place, as was described in the previous exemplary embodiments. It is also possible to effect the transport of the marker particles by means of an electrophoretic effect.
  • FIGS. 24 to 30 show a measuring arrangement for the detection of marker particles in measuring solutions, which show at least one electrode with an aperture arranged in front of it, while FIGS. 31 to 35 show a measuring arrangement for detecting marker particles in measuring solutions with potentiometric electrodes .
  • FIG. 24a shows a macroelectrode 2, which is located from an aperture 101 made of electrically non-conductive material with an aperture 105.
  • the space between the aperture 101 and the electrode 2 is filled with an internal electrolyte 103 which is in contact with the measuring medium 3 (electrolyte) via the aperture 105.
  • the internal electrolyte can be designed, for example, as a gel, it being possible for it to extend into the aperture 105.
  • a counter electrode (not shown in the figure) is located in the measuring medium at a great distance from the aperture 101.
  • An electrical direct and / or alternating voltage is applied to the electrodes, as a result of which an electric field is generated between the electrodes.
  • the electric field lines 4 ′′ emanating from the electrode 2 are concentrated in the area of the aperture 105. In the measuring medium 3, the electric field lines 4 ′′ ′′ describe a radially spreading electric field.
  • the size of the aperture 105 lies in the range between 0.5 ⁇ m and 100 ⁇ m, preferably in the range around 1 ⁇ m.
  • the distance between the diaphragm 101 and the electrode 2 can be chosen as desired if it is significantly larger than the diameter of the diaphragm opening. For example, this aperture distance is 1 mm.
  • the diameter of the marker particles is between 0.5 ⁇ m and 100 ⁇ m, preferably in the range around 1 ⁇ m.
  • a micropipette 119 which is made of glass, for example, has an aperture 101 * with an aperture 105 at its tip.
  • the pipette is filled with an internal electrolyte 103, into which an electrode 2 protrudes.
  • the electrode 2 can be connected to measuring electronics with the aid of an electrical feed line 110 and an electrical connection 111.
  • Particles 5, which are localized by bonds 6 in the vicinity of the aperture 105 lead, as shown in the example according to FIG. 24, to a disturbance of the electrical field and are therefore electrically detectable.
  • FIG. 26 shows an electrode and diaphragm configuration according to FIG. 24 in a planar construction.
  • a thin electrode layer 2 ' is located on a carrier 112.
  • the carrier 112 can consist, for example, of a plastic film. All materials with a high electrical resistance can be used for this.
  • the electrode layer 2 ' can be applied, for example, from a noble metal (gold, platinum, silver AGCl, etc.) by known thin-film processes. It is also possible to apply the electrode layer 2 'using electrically conductive pastes using the screen printing method.
  • a spacer 113 is applied to the carrier 112, for example by adhesive technology or by hot lamination.
  • the spacer 113 has an opening 115 for the electrical contacting of the thin electrode layer 2 'and a compartment 114 for the internal electrolyte.
  • the spacer can be made of the same material as the carrier 112.
  • a diaphragm film 101 ' is applied to the spacer 113 by adhesive and hot-laminating technology.
  • the aperture film 101 ' has one or more aperture openings 105'.
  • the internal electrolyte can be introduced into its compartment 114, for example, by the vacuum filling method.
  • the configuration according to FIG. 26b) is introduced into an electrolyte and a vacuum is created above the electrolyte.
  • the compartment 14 is thereby vented and the internal electrolyte penetrates.
  • the aperture openings 105 'on the aperture film 101' can be produced, for example, with the aid of a laser. It is also possible to produce a perforated screen film using the well-known LIGA process. It is also possible to implement the diaphragm film 101 'in the form of an ion track filter. With such ion track filters, microscopic openings in the ⁇ m range and in the sub ⁇ m range are created. Capillary pore membrane filters with pores in the ⁇ m and sub- ⁇ m range can also be used. Such capillary pore membrane filters are commercially available and consist, for example, of the materials polycarbonate, polyester, acrylic polymer, PP.
  • diaphragm opening 105 When using more than one diaphragm opening 105, it is important that with a diaphragm opening diameter of 0.5 ⁇ m - 10 ⁇ m distances from diaphragm openings are maintained which amount to approximately 100 ⁇ m. This ensures that starting from the Diaphragm openings 105 extend the electrical field lines radially into the measuring medium.
  • FIG. 27 shows a first variant of the configuration in FIG. 26.
  • the spacer 113 ' is equipped with a compartment 114' for the internal electrolyte, which offers an additional possibility for venting this compartment.
  • the vent opening 116 can be sealed with a suitable material (epoxy resin, silicone, etc.). Otherwise the structure corresponds to that according to FIG. 26.
  • FIG. 28 shows a second variant of the configuration according to FIG. 3.
  • two electrode layers 2 ", 2 '" are located on the carrier 112.
  • the diaphragm film 101 carries "two diaphragm openings 105", 105 '". If different molecular binding partners are immobilized in the immediate vicinity of the diaphragm openings 105" and 105' ", different analytes can be detected. This corresponds to an arrangement of two Microelectrodes as described above
  • the configuration with two electrodes and associated apertures can also be expanded to a larger array with a large number of electrodes and apertures.
  • FIG. 29 shows a further variant of the configuration according to FIG. 26.
  • a carrier 117 for a sample compartment 118 is additionally applied to the diaphragm film 101 '.
  • This carrier 117 can be made of any plastic that with Os
  • the silicon wafer 108 ' can be etched off above the layer 106 in a location-selective manner. Openings 104 and 104 ′ can be introduced into layer 106 with the aid of lithographic methods. This example has the advantage that the openings are in a very thin layer 106.
  • the silicon wafer can have a thickness of approximately 300 ⁇ m, while the layer 106 has a thickness of between 1 and 100 ⁇ m (preferably 10 ⁇ m).
  • 31 shows a measuring arrangement for a method for potentiometric measurement for the detection of analytes.
  • the fixed lead 123 of a potentiometric electrode with an ion-selective membrane 124 is located on a carrier 122. Molecules are immobilized on the surface of the ion-selective membrane 124, which molecules can form a bond 6 with the molecules that are immobilized on the particles 5.
  • the label or marker particles 5 bound to the surface of the ion-selective membrane 124 which in this exemplary embodiment have a diameter of 10 nm, cause a disturbance in the potential formation processes on the surface of the ion-selective membrane 124, which can be measured by potentiometric means.
  • the potential of the ion-selective electrode consisting of fixed lead 123 and ion-selective membrane 124 is measured against a reference electrode, which is also located in the measuring medium 3, but is not shown.
  • the carrier 122 is made of glass, for example, the fixed lead 123 of the potentiometric electrode is made of silver and the ion-selective membrane 124 is made of an Ag / AgCl layer. It is also possible to design the ion-selective membrane 124 as a polymer membrane. Other known materials can also be used for ion-selective membranes. It is also possible not to arrange another layer above the ion-selective membrane without the immobilized molecules in which the immobilized binding partners are located (without picture). This layer can consist, for example, of a hydrogel or collagen.
  • the cover 126 has openings 129 and 129 'which release the ion-selective electrodes.
  • the conductor tracks 127 and 127' and the electrical connections 128 and 128 ' can, for example, be made of silver by known thin-film or thick-film processes.
  • Ag / AgCl can in turn be used as the ion-selective membrane, it being able to be produced by the chloridization of the silver film of the fixed leads 123, 123 '.
  • the marker particle is transported electrophoretically. This is possible when using potentiometric electrodes that are relatively low-resistance. This is the case, for example, with Ag / AgCl electrodes.
  • the counter electrode 131 and the current source 140 are dispensed with.
  • the marker particle must be transported magnetically, as described above.
  • the assays described can be used not only for the analytes described here, but also generally for the detection of antibodies, antigens, nucleic acids, aptamers or any other analyte for analysis and / or diagnosis in chemistry, food chemistry, biotechnology, environmental analysis, biochemistry or medicine be used.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Analyten und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Diese werden zur Analytik oder Diagnostik im Bereich der Chemie, Biochemie, Molekulargenetik, Lebensmittelchemie, Biotechnologie, im Umweltbereich sowie in der Medizin eingesetzt. Zum Nachweis von Analyten (8) werden Markerpartikel (5) verwendet, deren elektrische Eigenschaften bzw. deren Permeabilitätszahl von denjenigen der sie umgebenden Messlösung (3) verschieden sind. Die Markerpartikel (5) binden spezifisch an den Analyten (8) oder kompetitiv zum Analyten an eine Unterlage (2). Die Analyte (8) werden über die Änderungen eines von Elektroden (2) erzeugten elektrischen Feldes bzw. eines elektrischen Stroms oder einer elektrischen Spannung an einer Elektrode oder eines magnetischen Feldes nachgewiesen, die von an ihnen gebundenen Markerpartikeln (5) oder statt ihrer von an die Unterlage gebundenen Markerpartikeln in einem elektrischen Feld hervorgerufen werden.

Description

Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von Analyten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Analyten und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens .
Solche Vorrichtungen und Verfahren, die im folgenden auch mit dem beides beschreibenden Begriff des Assays bezeichnet werden, dienen zur qualitativen und quan- titativen Erfassung von spezifischen Bindungen zwischen mindestens zwei Molekülen. Hierzu zählt zum Beispiel die Erfassung von Rezeptor-Ligand- Wechselwirkungen, Antikörper-Antigen-Wechselwirkung, die Erkennung von Nukleinsäuren, die Wechselwirkung zwischen Oligonukleotiden und DNA sowie anderer molekularer Wechselwirkungen. Verfahren und Vorrichtungen dieser Art lassen sich zum Beispiel in der Chemie, der klinischen Analytik, der pharmazeutischen Entwicklung, der Umweltanalytik sowie bei Routinearbei- ten der Molekularbiologie bis hin zur Sequenzierung von Nukleinsäuren einsetzen.
Es ist bekannt, daß Immunoassays mit unterschiedlichen Detektionsmethoden durchgeführt werden. Hierzu zählen radioaktive, fluoreszenz- und chemoluminis- zenzgestützte sowie enzymatische Verfahren (C.P. Pri- ce, D.J. Newman: Principles and Practice of Immunoassays, Macmillan Publicers Ltd., 1991 U.K.).
Bei einer besonderen Form von Immunotest kommt es aufgrund von Antikörper-Antigen-Bindungen zu einer Agglutination von Latex-Partikeln, die beispielsweise optisch nachgewiesen werden kann (J.M. Singer, CM. Plotz: The Latex Fixation Test, American Journal of
Medicine, Dec . 1965, pp . 888-892) . Mit derartigen Agglutinationstests können unter Verwendung von Mikro- sphären von 10 μm Durchmesser 105 Moleküle, von Mi- krosphären mit einem Durchmesser von 1 μm 108 Molekü- le und von Mikrosphären mit einem Durchmesser von 0,1 μm 1013 Moleküle nachgewiesen werden. Am Beispiel von IgG (MW = 100,000) werden theoretische Empfindlichkeiten von 10 fM, 10 pM bzw. 10 nM angegeben. Die höchste Empfindlichkeit ergibt sich also bei relativ großen Mikrosphären, deren Einsatz allerdings durch ihr Sedimentationsverhalten begrenzt ist.
Weiterhin können neuerdings Nukleinsäuren, beispielsweise Oligonukleotide, RNA und DNA über derartige Wechselwirkungen mittels der DNA-Mikrochip-Technolo- gie nachgewiesen werden (Nature, Genetics, Vol. 14, No. 4, Dec. 96, und D. Noble: DNA Sequencing on a chip, Anal. Chemistry, Vol. 67, No . 5, March 1, 1995) . Hier wird allerdings die Chip-Technologie nicht als elektrisches Meßverfahren benutzt, sondern sie dient als neues Syntheseverfahren und zur Erzeu- gung von MikroStrukturen. Der eigentliche Detektions- mechanismus ist optischer Art. Die Kombination aus elektrischen Verfahren zur Synthese eines Liganden und der optischen Markierung und Detektion ist jedoch sehr aufwendig.
Nachteilig am Stand der Technik ist, daß Nachweisverfahren auf radioaktiver Basis mit Strahlenschutz- und Entsorgungsproblemen des dabei entstehenden radioak- tiven Mülls behaftet sind. Bei enzymatischen Nachweismethoden, die eine elektrochemische Detektion der Analyte ermöglichen, muß als zusätzlicher Arbeitsschritt eine chemische Reaktion mit einer Substanz als chemisches Reaktionssubstrat erfolgen.
Bei allen im Stand der Technik bekannten Nachweisverfahren und Assays ist ein abschließender Waschschritt nötig, um vor der Detektion des Analyten überschüssige Reaktanten zu entfernen, um unspezifische Signale soweit wie möglich zu minimieren.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das den Nachweis von Analyten auf rasche, einfache und genaue Weise ermöglicht und bei dem auf einen Waschschritt verzichtet werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale des Haupt- und Nebenanspruchs gelöst.
Werden Markerpartikeln mit elektrischen und/oder elektrochemischen Eigenschaften, die sich von denen ihrer Umgebung, der Meßlösung, unterscheiden in ein elektrisches Feld gebracht, so wird hierdurch das elektrische Feld gestört. Diese Störungen eines in der Meßlösung erzeugten elektrischen Feldes können einfach, rasch und sehr präzise bestimmt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht also auf einer Nachweismethode, die als im Wesentlichen rein elektrisch angesehen werden kann. Daher weist es die für die Bestimmung von elektrischen bzw. elektrochemischen Eigenschaften mögliche sehr hohe Empfindlichkeit bzw. Genauigkeit und folglich eine sehr niedrige Nachweisgrenze bei hoher Empfindlichkeit auf.
Bei geeigneter Dimensionierung und/oder Positionierung der Elektroden, die das elektrische Feld erzeugen, wird das elektrische Feld nahezu ausschließlich von Markerpartikeln mit unterschiedlicher stofflicher Zusammensetzung, unterschiedlichem spezifischem Widerstand elektrischer Oberflächenladung oder unterschiedlicher Dielektrizitätskonstante beeinflußt, die beispielsweise mit dem Analyten oder mit einer Unter- läge d.h. als Unterlage geeignete Körper bzw. Materialien spezifische Bindungen eingegangen sind. Überschüssige ungebundene Markerpartikel führen zu keinem Signal, so daß ein Waschschritt zur Entfernung ungebundener Markerpartikel aus der Meßlösung entfallen kann.
Der Meßbereich des erfindungsgemäßen Bio-Assays (Verfahren und/oder Vorrichtung) kann durch Festlegung der Elektroden- bzw. Unterlagenoberflächen und durch die Wahl der Größe der Markerpartikel eingestellt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung können zum Nachweis und zur Konzen- trationsbestimmung beliebiger, über molekulare Wechselwirkungen erfaßbarer Analyten eingesetzt werden. Zu diesen zählen zum Beispiel die Wechselwirkungen von Rezeptor-Ligand, Antikörper-Antigen, Antikörper- Hapten, Antikörperfragment-Antigen, Aptameren, Proteinen, Nukleinsäuren, Oligonukleotiden, DNA sowie alle molekularen Wechselwirkungen, bei denen mindestens einer der molekularen Partner mit einem Markerpartikel markiert werden kann. Dies reicht bis hin zur Wechselwirkung von Stoffen mit den Oberflächen ganzer Zellen. Es ist prinzipiell möglich, alle bekannten Immunoassay-Formate nach dem Stand der Technik zu realisieren.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen folglich insbesondere darin, daß eine rein elektri- sehe Nachweismethode mit all ihren Vorteilen in Bezug auf Genauigkeit, Schnelligkeit und Sensitivität eingesetzt wird, und daß ferner bei Verwendung von sehr kleinen Elektroden und Markerpartikeln vergleichbarer Größe ein Einzelbindungsnachweis möglich ist.
Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden in den abhängigen Ansprüchen gegeben.
Insbesondere im Nahfeld einer ein elektrisches Feld erzeugenden Elektrode kann bereits die Anwesenheit eines einzelnen Markerpartikels zu ausreichend hohen Änderungen des elektrischen Feldes führen. Weiter von der Elektrode entfernte, nicht spezifisch gebundene Markerpartikel führen zu geringeren Beeinträchtigungen des elektrischen Feldes, so daß bei geeigneter Anordnung der Elektroden in der Nähe einer Unterlage bzw. Ausbildung der Elektroden selbst als Unterlage und bei geeigneter Konzentration der Markerpartikel das gemessene Signal im wesentlichen nur von spezifisch gebundenen Markerpartikeln beeinflußt wird. Da- durch kann dann auch ein Waschschritt zur Entfernung von überschüssigen Markerpartikeln oder Analyten aus der Meßlösung entfallen.
Bei Verwendung von Markerpartikeln deren Permeabilitätszahl sich von der Permeabilitätszahl der Meßlösung unterscheidet, wobei ein magnetisches Feld an bzw. in der Meßlösung erzeugt wird, kann der Nachweis durch die Stärke des magnetischen Feldes bzw. durch deren von den Markerpartikeln verursachte Änderung erbracht werden.
So kann beispielsweise ein Einzelbindungsnachweis an einer Elektrode als Unterlage erfolgen, deren Ober- fläche in der gleichen Größenordnung liegt wie die größte Querschnittsfläche des Markerpartikels oder sich zumindest nicht um mehrere Größenordnungen unterscheidet . Damit können hierfür Mikroelektroden verwendet werden, die runde, quadratische, rechtecki- ge, aber auch beliebige Form haben. Die Durchmesser der Markerpartikel liegen zwischen einigen nm bis einigen μm, beispielsweise bei lOμm.
Soll das Binden mehrerer Markerpartikel meßtechnisch nachgewiesen werden, so können größere Elektroden verwendet werden, an deren Oberfläche es zu einer flächenhaften Belegung bis hin zu einer dreidimensionalen Agglutination von Markerpartikeln kommt. Im Gegensatz zu den für den Stand der Technik angegebenen Werten für Agglutinationstests sinkt die theoretische
Nachweisgrenze in Abhängigkeit vom Durchmesser der Markerpartikel um mehrere Größenordnungen.
Darüber hinaus kann der Meßbereich des Bio-Assays durch Festlegung der Elektrodenoberflächen zwischen dem Einzelbindungsbereich und dem Agglutinationsbereich eingestellt werden.
Bei der Verwendung von nur einer Mikroelektrode oder sehr wenigen Mikroelektroden (mit einer dazugehörigen Gegenelektrode) können dann sehr geringe Analytkon- zentrationen erfaßt werden, wenn das die Mikroelektrode (n) umgebende Meßmedium ein nur geringes Volumen mit einer begrenzten Anzahl von Markerpartikeln auf- weist. Durch Verwendung einer sehr kleinen Probenoder Durchflußkammer in der Größenordnung von μl kann daher ein einfacher, präziser Einzelbindungsnachweis realisiert werden.
Dies gilt insbesondere beim Nachweis von Analyten durch deren spezifische Bindung an Markerpartikel in einem Durchflußmesssystem, wobei hier der Analytstrom die gebundenen Markerpartikel durch ein von außen über Elektroden angelegtes elektrisches Feld mit sich nimmt. Die Veränderungen des elektrischen Feldes, die sich als Änderungen des elektrischen Stromes bzw. der Kapazität zwischen den Elektroden in der Meßlösung zeigen und die durch die Markerpartikel ausgelöst werden, können präzise erfaßt werden. Bei entspre- chend geringem Volumen des Durchflußbereiches ist auch hier ein Einzelnachweis möglich.
Wird an die Meßlösung ein seine Polarität wechselndes elektrisches oder magnetisches Feld angelegt, so kann durch die hierdurch hervorgerufene Bewegung elektrisch geladener oder magnetischer (paramagnetischer oder diamagnetischer) Markerpartikel eine bessere Durchmischung der Analyten und der Markerpartikel erzielt werden. Insbesondere eignen sich hierzu parama- gnetische Markerpartikel, da ein erheblich geringeres magnetisches Feld als bei diamagnetischen Markerpar- tikeln benötigt wird. Durch eine derartige feldinduzierte Durchmischung kann die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit jeglichen markergestützten Nachweisverfahrens verbessert werden. Hierbei können zu den Mar- kerpartikeln mit immobilisierten Molekülen auch solche kommen, die keine Moleküle tragen. Diese zusätzlichen Markerpartikel verstärken den Durchmischungs- effekt. Diese Durchmischung des Meßmediums kann zusätzlich durch Einkoppelung von Ultraschall unter- stützt werden.
Weiterhin können durch entsprechende elektrische oder magnetische Felder derartige Markerpartikel zu ihren Bindungsstellen auf der Unterlage aufgrund eines elektrophoretisch oder magnetisch verursachten Transportes bewegt werden oder nach beendeter Bindung der Überschuß an Markerpartikeln aus dem Umkreis der Unterlage entfernt werden. Durch diesen elektrophoreti- schen oder magnetfeldinduzierten Transport der Mar- kerpartikel zu ihren Bindungsplätzen hin werden die in der Meßlδsung vorhandenen Marker besser genutzt und die Sensitivität , die Nachweisgrenze und die Reproduzierbarkeit sowie die Genauigkeit der erfindungsgemäßen Verfahren wird stark verbessert . Durch den auf die Bindung der Markerpartikel an ihre Bindungsstellen erfolgenden elektrophoretischen oder magnetfeldinduzierten Transport restlicher ungebundener Markerpartikel von den Bindungsstellen weg, wird deren Konzentration im Bereich der Unterlage und/oder der Elektroden stark verringert. Aufgrund der Sensitivität der Elektroden für Störungen, insbesondere in ihrem Nahfeld, beeinflussen die freien Markerpartikel die Messung nur noch unwesentlich. Ein besonderer Waschschritt, der nach dem Stand der Technik bei vie- len analytischen Verfahren, insbesondere Immuno-
Assays, notwendig ist, kann auch von daher entfallen. Haben die nachzuweisenden Moleküle im Meßverfahren und die molekülbeladenen Markerpartikel elektrische Ladungen mit unterschiedlichen Vorzeichen, so kann beim Anlegen einer elektrischen Spannung der elektro- phoretische Transport zunächst die geladenen Moleküle zu ihren Bindungsplätzen auf oder in der Umgebung der Elektroden transportieren. Nach erfolgter Bindung an den Bindungsplätzen werden durch Umpolung des elek- trischen Feldes die molekülbeladenen Markerpartikel zu den Bindungsplätzen auf oder im Umfeld der Elektroden gebracht. Dieses Verfahren ist besonders vorteilhaft bei der Verwendung von Sandwich-Format- Assays .
Der beschriebene, durch ein elektrisches oder magnetisches Feld induzierte gerichtete und der auf Durchmischung ausgerichtete wechselnde Transport elektrisch geladener bzw. magnetischer Partikel ist bei allen markergestützten, in Meßlösungen ablaufenden Nachweisverfahren anwendbar.
Bei Anwendung inhomogener elektrischer Felder können auch ungeladene, jedoch polare Markerpartikel durch das oben angegebene Verfahren gerichtet transportiert oder gemischt werden.
Entsprechend eines Ausführungsbeispiels der Erfindung wird eine Elektrode verwendet, vor der eine Blende mit mindestens einer kleinen Öffnung angeordnet ist. Die Blende ist dabei der Meßlösung zugewandt und es wird über die Elektrode ein inhomogenes elektrisches Feld erzeugt, dessen Feldlinien durch die kleine Öffnung der Blende hindurchgehen. Die Markerpartikel binden sich an bzw. in der Nähe der Oberfläche der
Blende . Die mit dieser Ausführungsform erzielten Vor- teile bestehen insbesondere darin, daß zur Erzeugung eines inhomogenen elektrischen Feldes keine Mikro- elektrode mit einem Durchmesser im μm-Bereich und kleiner erzeugt werden muß, da die Blendöffnung aus- schlaggbend für das elektrische Feld ist. Die Herstellung der Mikroelektroden ist zwar bekannt, aber sie erfordert einen aufwendigen technologischen Prozeß mit hohen Kosten. Bei der Verwendung einer Blende vor einer Makroelektrode sind die technologischen An- forderungen bei der Elektrodenherstellung nicht so hoch, so daß die erfindungsgemäße Vorrichtung mit geringen Kosten herzustellen ist. Es können somit Meßvorrichtungen mit Einzelelektroden oder Elektroden- arrays als Einmalartikel mit geringen Kosten herge- stellt werden.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß der Strom der durch die kleine Blendenöffnung hindurch zur Gegenelektrode in der Meßlösung fließt, an der Elektrode nur eine sehr kleine Stromdichte verursacht . Im Vergleich zur Verwendung einer Mikroelek- trode ist in diesem Falle die Stromdichte um das Verhältnis von Querschnittsfläche der Blendenöffnung und Elektrodenfläche kleiner. Dies hat zur folge, daß Än- derungen des elektrischen Widerstandes hauptsächlich durch partikelinduzierte Feldstörungen verursacht werden und der Einfluß von elektrochemischen Elektrodenreaktionen ist weitgehend vernachlässigbar. Auf diese Weise können die Messungen genauer durchgeführt werden.
Entsprechend einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird die Messung des Nachweises der durch die Markerpartikel verursachten Störun- gen des elektrischen Feldes in der Meßlösung mit einem potentiometrischen Verfahren durchgeführt, wobei das elektrische Feld an der Oberfläche einer Elektrode durch Potentialbildungsvorgänge an der Grenzfläche zwischen Meßlösung und Elektrode gebildet wird.
Die Vorteile dieser Ausführungsform bestehen insbesondere darin, daß gleichfalls Elektroden mit größerem Durchmesser bzw. größerer Fläche verwenden werden können. Dies ergibt sich aus der Tatsache, daß die potentialbildenden Vorgänge an der Oberfläche einer potentiometrischen Elektrode in Abständen von dieser Elektrode auftreten, die in der gleichen Größenordnung liegen wie die Durchmesser von Markerpartikeln. Auf diese Weise können Markerpartikel im nm-Bereich bis in den μm Bereich verwendet werden.
Wichtig für die Anwendung bei einem potentiometrischen Meßverfahren ist, daß die Markerpartikel im flüssigen Meßmedium an ihrer Oberfläche eine deutlich andere elektrische Ladung und/oder Potentialdifferenz aufweisen, als die ionenseleketive Elektrode selbst. Dies ist eine günstige Voraussetzung bei einem potentiometrischen Nachweis für das Anbinden von Markerpartikeln.
Es ist sowohl bei dem amperometrischen als auch bei dem potentiometrischen Nachweisverfahren zusätzlich möglich, die Potentialverhältnisse an der Oberfläche der Markerpartikel dadurch zu beeinflussen, daß die Markerpartikel mit Ionophoren dotiert sind, wie dies auch bei ionenselektiven Membranen der Fall ist.
Hierbei sollten andere Ionophone verwendet werden, als in der ionenselektiven Membran, die zum Nachweis der gebundenen Markerpartikel dient. Ebenso ist es möglich, Markerpartikel an der Oberfläche mit einer dünnen MetallSchicht zu versehen. Sowohl bei der amperometrischen als auch bei den potentiometrischen Nachweisverfahren kann der Nachweis von Analyten in einem Zweischrittprozeß erfolgen, der den Markerpartikeltransport und dann die Bindung an die Elektrode beinhaltet. Wie beschrieben, können hier elektrophoretischer und magnetischer Markerpartikeltransport verwendet werden.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in der Zeich- nung dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 das elektrische Strömungsfeld in der Umgebung einer Mikroelektrode a) sphärische Mikroelektrode b) planare Mikroelektrode c) planare Mikroelektrode mit Markerpartikeln im Strömungsfeld
Fig. 2 Elektrophoretischer Markerpartikel-Transport a+b) zur Mikroelektrode bzw. c) von der Mikroelektrode weg
Fig. 3 Makroelektrode mit agglutinierten Markerpar- tikeln
Fig. 4 Durchflußzelle mit zwei Mikroelektroden, a) ohne Markerpartikel b) mit einem Markerpartikel und c) mit zwei gebundenen Markerpartikeln
Fig. 5 Immunoassayformate a) und b) Antigennachweis c) und d) Antikörpernachweis a) und c) Sandwich-Verfahren und b) und d) kompetitive Verfahren
Fig. 6 Immunoassay nach Fig. 5 a) mit zusätzlicher
Membran
Fig. 7 Immunoassayformate im Durchflußverfahren a) und b) Antigennachweis c) und d) Antikörpernachweis a) und c) Sandwich-Verfahren b) und d) kompetitive Verfahren
Fig. 8 DNA-Sonde mit Antikörperwechselwirkung
Fig. 9 DNA-Sonde
Fig. 10 DNA-Sonde nach dem Sandwich-Prinzip
Fig. 11 Immuno-Assay-Array
Fig. 12 Querschnitt durch ein Immuno-Assay-Array
Fig. 13 Mikrocontainment-Assay
Fig. 14 Bio-Assay auf der Basis von Interdigital - Strukturen
Fig. 15 Modifiziertes Assay nach Fig. 14
Fig. 16 Modifiziertes Assay nach Fig. 14
Fig. 17 Meßschaltung für Assays nach Fig. 14 bis 16
Fig. 18 Immunoassay-Teststäbchen
Fig. 19 Bioassay für ganze Zellen Fig. 20 weitere Ausführungsformen von Immunoassayformate
Fig. 21 weitere Ausführungsformen von Immunoassayfor- mate
Fig. 22 weitere Ausführungsformen von Immunoassayformate
Fig. 23 schematisch eine Darstellung der Bindung im magnetischen Wechselfeld,
Fig. 24 eine schematische Darstellung einer Elektrode und einer Blende mit elektrischen Strömungs- linien ohne gebundene Labelpartikel und mit einem in der Nähe der Blendenöffnung gebundenen Labelpartikel,
Fig. 25 eine schematische Darstellung einer Elektro- den- und Blendenanordnung in Pipettenausführung,
Fig. 26 eine Elektroden- und Blendenanordnung in planarer Schichtbauweise,
Fig. 27 eine Elektroden- und Blendenanordnung in planarer Schichtbauweise nach einer weiteren
Ausführungsform,
Fig. 28 eine Elektroden- und Blendenanordnung in planarer Schichtbauweise mit zwei Elektroden und entsprechenden Blenden,
Fig. 29 eine Elektroden- und Blendenanordnung in planarer Schichtbauweise mit einer Gegenelek- trode ,
Fig. 30 eine weitere Ausführungsform einer Blende
Fig. 31 eine schematische Darstellung einer potentiometrischen Elektrode mit gebundenen Markerpartikeln,
Fig. 32 eine Realisierung von zwei potentiometrischen Elektroden auf einem planaren Träger für eine
Differenzmessung,
Fig. 33 eine Elektrodenanordnung mit integriertem
Fließkanal,
Fig. 34 eine Elektrodenanordnung mit integrierter
Fließmatrix, und
Fig. 35 eine elektrische Schaltung mit einer poten- tiometrischen Elektrode sowie gegen- und Bezugselektroden .
Der Mechanismus des Bindungsnachweises ist in Figur 1 näher beschrieben.
In Fig. 1 a) ist die Umgebung einer Mikroelektrode gezeigt. Hierin ist 1 ein isolierender Träger, auf dem eine sphärische Mikroelektrode 2* angeordnet ist. Zwischen dieser Mikroelektrode 2* und einer nicht dargestellten Gegenelektrode wird eine elektrische
Spannung angelegt. Beide Elektroden werden von einem flüssigen Meßmedium 3 umspült. Von der unter Spannung stehenden Mikroelektrode 2* gehen elektrische Feldlinien 4 aus. In Figur 1 b) und 1 c) ist der Mechanismus eines Bindungsnachweises gezeigt. Die planare Mikroelektrode 2 hat quadratische Form mit einer Kantenlänge von 3 μm. Die Elektrode ist mit Hilfe bekannter Dünnschichtver- fahren auf einem isolierenden Träger 1, der aus Glas besteht, hergestellt worden. Das Material des Markerpartikels ist z.B. Si02, und der Durchmesser beträgt 2 μm.
Im wäßrigen Meßmedium wird die spezifische Leitfähigkeit wie folgt beschrieben:
K = Σ Z2i ' F2 * μ * Ci Gleichung 1
Hierin sind z_ die Ladungszahl, μ die Beweglichkeit und C die Konzentration der Ionen. F steht für die Faraday-Konstante .
Die Zusammenhänge zwischen elektrischer Stromdichte, elektrischer Feldstärke und Spannungsabfall zwischen Mikroelektrode und flüssigem Meßmedium stellen sich vereinfacht wie folgt dar:
An einer halbkugelförmigen Mikroelektrode ergibt sich ein Zusammenhang zwischen der Stromdichte J und dem elektrischen Strom I gemäß Gleichung 2.
J - Gleichung 2
2πr2
Hierin ist r der Abstand vom Mittelpunkt der Mikroelektrode in das Meßmedium hinein. Für die elektrische Feldstärke E gilt mit der spezifischen Leitfähigkeit K des Meßmediums die Gleichung Er, = —1 * J r Gleichung 3
K
Für den Spannungsabfall zwischen der Elektrodenoberfläche und dem flüssigen Meßmedium ergibt sich in Abhängigkeit vom Radius r
Uc - Gleichung 4
Figure imgf000019_0001
Für eine planare Mikroelektrode gemäß Fig. 1 b) folgt:
Us' = Us • k mit k « 0,6 Gleichung 5
Für den Abstand r = 2r0 ergibt sich
Us (r = 2r0) = 0,5 U(r → ∞) Gleichung 6
Dies bedeutet, daß bereits in einem Abstand von einem Elektrodendurchmesser die Spannung um 50 % abgefallen ist.
Eine Störung des elektrischen Feldes in direkter Umgebung der Mikroelektrode 2* führt damit zu einer starken Veränderung des elektrischen Feldlinienver- laufes.
In Abb. 1 c) ist ein Markerpartikel (Labelpartikel) 5 gezeigt, das über eine Bindung 6 an eine Mikroelektrode 2 als Unterlage gebunden ist. Das durch das Markerpartikel 5 stark gestörte elektrische Strömungsfeld 4 wirkt sich in einer starken Änderung des meßbaren elektrischen Widerstandes zwischen der Mikroelektrode 2 und einer Gegenelektrode aus, die sich ebenfalls im wäßrigen Meßmedium 3 befindet, aber nicht dargestellt ist.
Der elektrische Widerstand kann mit Hilfe von Gleichoder WechselSpannungen mit Werten von einigen 10 mV bis wenigen Volt, vorzugsweise im lOOmV-Bereich, und die elektrische Kapazität kann mit Hilfe von Wechsel - Spannungen mit Frequenzen von wenigen Hz bis einigen MHz, vorzugsweise im kHz-Bereich, gemessen werden.
Wird das Binden von Markerpartikeln 5 im elektrodennahen Raum durch Messung des elektrischen Widerstandes bzw. der elektrischen Kapazität zeitaufgelöst registriert, so kann eine quantitative Messung auf dy- namischem Wege durch Auswertung der Signal-Zeit-
Funktion erfolgen, da deren erste Ableitung ein Maß für die Analytkonzentration ist.
Die molekulare Wechselwirkung der Markerpartikel 5 mit der Unterlage wird weiterhin durch Transport von Markerpartikeln 5 in einem elektrischen Feld unterstützt, sofern die Markerpartikel 5 selbst elektrisch geladen sind. Dies kann wie folgt beschrieben werden.
Im elektrischen Feld E, das zwischen zwei Elektroden durch Anlegen einer elektrischen Spannung im wäßrigen Meßmedium erzeugt wird, wird auf ein elektrisch geladenes Markerpartikel 5 eine Kraft F ausgeübt:
F = z± • Q • E Gleichung 7
Hierin ist Q die Ladung der Ionen.
Aufgrund dieser Kraftwirkung bewegen sich die elek- trisch geladenen Markerpartikel 5 mit einer Geschwindigkeit v im elektrischen Feld E: v = μ E Gleichung 9
Die Geschwindigkeit der Marker Partikel (v) ist also proportional zur elektrischen Feldstärke E. Diese Proportionalität wird durch die Beweglichkeit μ beschrieben:
μ = Gleichung 10
Die Beweglichkeit μ ist dabei abhängig von der Art des Meßmediums sowie der ARt der Markerpartikel.
Dies bedeutet, daß sich die Markerpartikel aufgrund ihrer eigenen elektrischen Ladung im elektrischen
Feld bewegen. Befinden sich darüber hinaus elektrisch geladene Moleküle an der Oberfläche der Markerpartikel, so bestimmt die Eigenladung des Markerpartikels auf jeden Fall dann die Richtung des feldinduzierten Transports, wenn der Betrag der Eigenladung größer ist als der Betrag der Ladungen der an der Oberfläche gebundenen Moleküle. Weist die Ladung der gebundenen Moleküle gleiche Polarität wie die Markerpartikel - Eigenladung auf, so wird der Transport durch Zunahme der Geschwindigkeit gestärkt. Bei entgegengesetzten Ladungen wird die Geschwindigkeit verringert .
In Fig. 2 ist der oben in der Theorie beschriebene elektrophoretische Transport von elektrisch geladenen Markerpartikeln 5 dargestellt. Aufgrund einer zwischen einer Mikroelektrode 2 und einer nicht dargestellten Gegenelektrode angelegten elektrischen Spannung von beispielsweise 500mV bewegen sich die Markerpartikel 5 in Richtung auf die Mikroelektrode zu, da elektrische Kräfte Fe auf die Partikel einwirken (Fig. 2 a) . Nach Annäherung (Fig. 2b) der Markerpartikel 5 an die Mikroelektrode 2 kann es zu einer bindenden Wechselwirkung 6 mit der als Unterlage ausgebildeten Elektrode 2 kommen (Fig. 2c) . Nach Umkehrung des elektrischen Feldes wirken die elektrischen Kräfte Fe in entgegengesetzter Richtung, so daß die nicht gebundenen Markerpartikel 5 von der Mikroelektrode 2 wieder entfernt werden (Fig. 2c) . Auf diese Weise erfolgt durch elektrophoretischen Transport ein Pseudo- Waschschritt. Für die Markerpartikel 5 kommt eine
Auswahl von Materialien mit unterschiedlichen Ladungen in Frage, die sich für elektrophoretischen Transport eignen.
Ein Transport von paramagnetischen oder diamagnetischen Markerpartikeln kann auch in einem magnetischen Feld erfolgen, wobei im Falle diamagnetischer Markerpartikel das magnetische Feld inhomogen zu sein hat.
Das der Erfindung zugrundeliegende Wirkprinzip von Markerpartikel-Nachweis und -Transport kann als ein durch Markerpartikel (Labelpartikel) induzierter Feldeffekt (label induced field effect, LIFE) bezeichnet werden.
In Figur 3 ist ein Bio-Assay für den Nachweis höherer Analytkonzentrationen dargestellt. Damit das Binden 6 mehrerer Markerpartikel 5 mit Durchmessern von ca. 1 μm meßtechnisch nachgewiesen werden kann, werden auf einem isolierenden Träger 1 z.B. aus Glas größere Elektroden 2+ verwendet, an deren Oberfläche es zu einer flächenhaften Belegung bis hin zu einer dreidimensionalen Agglutination von Markerpartikeln kommt. Die Elektrode hat z.B. eine rechteckige Form mit den Abmessungen von 10 x 50 μm. Der Meßbereich für höhere Analytkonzentrationen kann Agglutinationsbereich genannt werden. Um eine Agglutination von Markerpartikeln zu vermeiden, die sich noch frei im Meßmedium bewegen, kann auch hier die
Messung durch einen elektrophoretischen Marker-Transport zur Elektrode hin unterstützt werden.
Fig. 4 zeigt eine Durchflußzelle aus Kunststoff mit zwei gegenüberliegenden Mikroelektroden 2> , 2' die z.B. aus Platin bestehen und auf Trägermaterialien 7 aufgebracht sind. Der Fluß φ eines Meßmediums 3 bewegt Analytmoleküle und Markerpartikel 5 durch die Durchflußzelle. Der Abstand der Mikroelektroden 2 2>s beträgt 50 μm und die Elektrodenfläche jeweils 5 μm x 5 μm. In Fig. 4 a) ist die Durchflußzelle ohne Markerpartikel, in Fig. 4 b) mit einem Markerpartikel 5 und in Fig. 4 c) mit zwei untereinander gebundenen Markerpartikeln 5 dargestellt . Aufgrund des durch die Markerpartikel 5 gestörten elektrischen Strömungsfeldes kann durch Messung des elektrischen Widerstandes, bzw. der komplexen Admittanz, die Anwesenheit einer oder mehrerer Markerpartikel 5 zwischen den Mikroelektroden 2P 2" nachgewiesen werden.
In Fig. 5 sind vier Immunoassay-Formate nach dem LIFE-Prinzip dargestellt.
Fig. 5a) zeigt ein Immunoassay zum Antigennachweis nach dem Sandwich- rinzip. Auf einer Elektrode 2 sind Antikörper 9' immobilisiert. Von den Antigenen 8 tritt ein Antigen 8* in Wechselwirkung mit einem immobilisierten Antikörper 9' auf der Elektrode 2. Ein Antikörper 9 , der auf einem Markerpartikel 5 immo- bilisiert wurde, tritt in Wechselwirkung mit dem Antigen 8*, so daß sich ein Sandwich bildet. Die elek- trodennahe Position des Markerpartikels 5 wird durch markerinduzierten Feldeffekt elektrisch bzw. elektrochemisch nachgewiesen.
Fig. 5 b) zeigt ein kompetitives Immunoassay-Format für den Antigennachweis . An den auf einer Mikroelektrode 2 immobilisierten Antikörpern 9 ' konkurrieren Antigene 8 mit auf den Markerpartikeln 5 immobilisierten Antigenen 8 ' P Im gezeigten Beispiel kommt es zu einer Bindung zwischen einem immobilisierten Anti- gen 8' ,+ eines Markerpartikels 5 und einem auf der Mikroelektrode 2 immobilisierten Antikörper (9,+) .
Fig. 5 c) zeigt entsprechend ein Immunoassay-Sand- wichformat für den Antikörpernachweis und Fig. 5 d) entsprechend ein kompetitives Format für den Antikörpernachweis. Eine genaue Beschreibung wird zur Vermeidung von Wiederholungen der Erläuterungen zu Fig.
5 a) und 5 b) weggelassen.
Auch ist es möglich, die Messung - z.B. nach Figur 5a - mit Hilfe von zwei Elektroden durchzuführen, von denen auf einer Elektrode z.B. Antikörper immobilisiert sind und die andere Elektrode freibleibt . Wer- den nun die Widerstände oder Kapazitäten beider Elektroden gegen eine Referenzelektrode gemessen, so kann die quantitative Erfassung der Analytkonzentration aus der Signaldifferenz beider Elektroden bestimmt werden. Auf diese Weise lassen sich Effekte eliminie- ren, die durch unspezifische Bindung von Molekülen hervorgerufen werden.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel zeigt die Fig.
6 in Anlehnung an Fig. 5 a) ein Immunoassay-Format vom Sandwich-Typ . Zusätzlich zur Darstellung in Fig.
5 a) ist hier eine Membran 10 über einer Mikroelek- trode 2 angeordnet. Diese Membran besteht z.B. aus Nitrozellulose oder aus Nylon. In der Membran 10 sind Markerpartikel 5 mit immobilisierten Antikörpern 9'' lokalisiert und beweglich. Der Nachweis von Antigenen 8 kann nun auf einfache Weise dadurch erfolgen, daß ein flüssiges Meßmedium 3 auf die Oberfläche der Membran 10 aufgebracht wird. Diese Membran kann als funktionelle Schicht ausgebildet sein und Funktionen übernehmen, die z.B. aus dem Bereich der Immunfiltra- tion bekannt sind. Das Medium erfährt in dieser Membran eine Filtration und/oder eine Konditionierung. Der Nachweis der Sandwichbildung erfolgt wie im Beispiel nach Fig. 5 a) beschrieben.
Es ist aber auch möglich, die Elektroden mit Membranen zu bedecken, die von Mikropartikeln nicht durchdrungen werden können. Hierbei werden die molekularen Bindungspartner nicht auf der Elektrode selbst, sondern auf der freien Membranoberfläche immobilisiert, an der sie auch in Wechselwirkung mit dem molaren
Bindungspartner der Markerpartikel treten.
In Fig. 7 sind die verschiedenen Immunoassay-Formate für eine Durchflußmeßzelle mit Mikroelektroden 2', 2>> gezeigt. Fig. 7 a) zeigt die Immobilisierung von Antikörpern 91 ' auf Markerpartikeln 5, an die für die Antikörper 9'1 spezifische Antigene 8 gebunden sind. Über Antigene 8* kommt es auch zur Agglutination zweier Markerpartikel 5. In Fig. 7 b) konkurrieren Antigene 8 mit einem Markerpartikel 5, das mit Antigenen 8' ' versehen ist, um die Bindungsstellen auf einem Markerpartikel 5, das mit Antikörpern 9' ' versehen ist. In Fig. 7 c) und Fig. 7 d) sind die entsprechenden Formate für den Nachweis von Antikörpern dargestellt. Die elektrische Messung erfolgt gemäß dem Beispiel nach Fig. 4. In Fig. 8 ist eine DNA-Sonde dargestellt. Fig. 8 a) zeigt ein Markerpartikel 5 und eine DNA 11 in einer Meßlδsung. Auf einem Markerpartikel 5 wird die DNA 11 immobilisiert (Fig. 8 b) . Anschließend kommt es zu einer Hybridisierung von DNA 11' ' und RNA 12 aus dem Meßmedium (Fig. 8 c, d) . Im nächsten Schritt (Fig. 8e) kommt es zu einer Wechselwirkung zwischen dem DNA-RNA-Hybrid und einem immobilisierten Antikörper 9 ' , so daß der Markerpartikel 5 mikroelektrodennah lokalisiert und elektrisch nachweisbar ist.
In Fig. 9 ist eine DNA-Sonde ohne immobilisierte Antikörper dargestellt. Ein DNA-Molekül 11 wird auf ei- nem Markerpartikel 5 immobilisiert (Fig. 9 a) . Anschließend an die Bindung der DNA 11 an das Markerpartikel 5 erfolgt eine Hybridisierung mit einem auf der Mikroelektrode 2 immobilisierten RNA-Strang 12 ' (Fig. 9 b) , und es kommt zu einer phasengrenznahen Lokalisierung des Markerpartikels 5 (Fig. 9 c). In diesem Beispiel können RNA- gegen DNA-Moleküle ausgetauscht werden und umgekehrt .
Die Fig. 10 zeigt ein DNA-Assay vom Sandwich-Typ. Auf einer Mikroelektrode ist ein DNA-Sonden-Molekül 13 immobilisiert (Fig. 10A) . Ein DNA-Molekül 11 aus dem Meßmedium tritt in Wechselwirkung mit dem Sondenmolekül 13 (Fig. 10 b) . Nach Hybridisierung der Moleküle 13 und 11 zu einem Hybrid (11*, 13*) kommt es zu einer Wechselwirkung mit einem Reporter-Sonden-Molekül 14, das auf einem Markerpartikel 5 immobilisiert ist (Fig. 10 c) . Durch diese Hybridisierung kommt es zu einer mikroelektrodennahen Lokalisierung des Markerpartikels 5 (Fig. lOd) . Die meßtechnische Erfassung erfolgt wie in den vorangegangenen Beispielen be- schrieben. Auf diese Weise lassen sich z.B. DNA-Son- den-Arrays zu Sequenzierung aufbauen.
In der Fig. 11 ist ein Ausschnitt eines Mikroelektro- den-Arrays dargestellt. Auf einem isolierenden Träger
I ist eine Vielzahl von Mikroelektroden 2 realisiert. In der Fig. 11 sind drei Mikroelektroden dargestellt. Auf den Mikroelektroden sind Antikörper unterschiedlichen Typs 9P 9°P 9V' immobilisiert (Fig. 11 a) . Zu den Antikörpern 9' passen Antigene 8. Zu den Antikörpern 9°' passen Antigene 8°. Treten die genannten Antigene 8, 8° mit den Antikörpern 9', 9°' in Wechselwirkung, die auf den verschiedenen Mikroelektroden immobilisiert sind, so kann sich durch Anlagerung entsprechender Antikörper, die auf Markerpartikeln immobilisiert sind, jeweils ein Sandwich bilden (Fig.
II b) . Die Sandwichbildung kann dadurch unterstützt werden, daß bei Verwendung geladene Markerpartikel diese durch Anlegen einer elektrischen Spannung zwi- sehen den Mikroelektroden 2 und einer nicht dargestellten äußeren Referenzelektrode elektrophoretisch in Richtung der Mikroelektroden bewegt werden (Fig. 11 a) und b) . Nach Sandwichbildung (Fig. 11 b) wird der elektrophoretische Transport durch Umpolung der elektrischen Spannung und der Kraft F umgekehrt, so daß die nicht gebundenen Markerpartikel von den Mikroelektroden weg bewegt werden (Fig. 11 c) . Auch dies ist ein Pseudo-Waschschritt . Die Erfassung der im Sandwich gebundenen Markerpartikel erfolgt auf elektrische Weise, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben. Der elektrophoretische Markerpartikel-Transport kann auch durch einen magnetisch induzierten Transport paramagnetischer Markerpartikel ersetzt werden. Auf gleiche Weise kann mit solchen Arrays ein DNA- Chip-Assay realisiert werden, das für eine Sequenzierung durch Hybridisierung verwendet werden kann. Hierbei werden anstelle der Antikörper bzw. Antigene DNA-Sonden eingesetzt, wie dies in den Figuren 8 bis 10 dargestellt ist.
In Fig. 12 ist ein Ausschnitt aus einem planaren Mi- kroelektroden-Array dargestellt. Ein Träger 1 besteht aus Glas. Eine Mikroelektrode 2, eine Leiterbahn 17 sowie ein elektrischer Kontakt 15 bestehen aus Platin und wurden durch ein gängiges Dünnschichtverfahren hergestellt. Die für ein solches Bio-Assay verwendeten Medien (Markerpartikel, Antikörper usw.) sowie das Meßmedium können auf die Mikroelektrode aufgebracht werden.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel ist in Fig. 13 dargestellt. Als Ausschnitt aus einem größeren Array ist eine spiegelsymmetrische und daher nur einseitig mit
Bezugszeichen versehene Struktur mit zwei Mikroelektroden 2* dargestellt . Ein Träger 1 für die Mikroelektroden 2* besteht aus einem dreidimensional strukturierbaren Material. Hierfür läßt sich insbe- sondere Silizium einsetzen, das durch bekannte anisotrope Ätzverfahren dreidimensional strukturiert wird. An der Oberfläche ist das Silizium elektrisch isoliert. Hierfür werden Si02-Schichten an der Siliziumoberfläche durch thermische Oxydation erzeugt.
Zusätzlich kann eine Si3N4-Schicht über der Si02- Schicht durch CVD-Verfahren abgeschieden werden. Mit Hilfe eingeführter Dünnschichtverfahren kann ein Metallfilm auf der Trägeroberfläche abgeschieden und strukturiert werden. Dieser Metallfilm besteht aus
Platin. Nach der Strukturierung ergibt sich eine Mi- kroelektrode 2*, die über eine Leiterbahn 17 mit einem elektrischen Anschlußkontakt 15 verbunden ist. Die Leiterbahn 17 ist mit einer elektrischen Isolationsschicht 16 bedeckt, die z.B. aus einem Polymer- material besteht. Die Mikroelektrode 2# befindet sich in einer pyramidenartigen Vertiefung, die als Containment 18 bezeichnet werden kann. Die Containments
18 dienen einerseits zur Aufnahme des zu immobilisierenden Materials, andererseits dienen sie zur Aufnahme der Probe. Der Betrieb eines solchen Arrays kann auf gleiche Weise erfolgen wie im Beispiel nach Fig. 11 und 12.
In Fig. 14 ist eine einfache Struktur für eine Vor- richtung nach der Erfindung als Bio-Assay abgebildet. Auf einem Träger 1 sind zwei Interdigitalstrukturen
19 und 19' realisiert (Fig. 14 a) . Die gezeigten Fingerstrukturen sind nicht maßstäblich dargestellt. Die Fingerbreiten und die Abstände zwischen den Fingern betragen typisch wenige μm. Damit ist die Bedingung einer kleinen Elektrodenoberfläche für den Nachweis von nur wenigen gebundenen Markerpartikeln gegeben. Die Interdigitalstrukturen 19, 19p elektrische Leiterbahnen 17, 17p 17 17+1 sowie elektrische An- schlußkontakte 15, 15p 15 15+' sind z.B. mit Hilfe bekannter Dünnschichtverfahren aus Platin hergestellt. Dieser Träger wird mit einer Abdeckung 20 versehen (Fig. 14 b) . Die Montage der Abdeckung 20 erfolgt z.B. durch Kleben. Sie kann auch im Sieb- druckverfahren aufgebracht werden. Durch in der Abdeckung vorgesehene Durchbrüche 21, 21' kann die Probe mit den Interdigitalstrukturen in Wechselwirkung treten. Zuvor wurden auf der Fläche einer der Interdigitalstrukturen Antikörper immobilisiert. Durch Eintauchen der Struktur nach Fig. 14 b) in eine Meßlösung mit Antigenen zu den immobilisierten Antikör- pern als Analyten kann ein Immunoassay vom Sandwichtyp durchgeführt werden, wie es in Fig. 5 a) beschrieben ist. Hierfür sind auf der Fläche 22 Markerpartikel mit immobilisierten Antikörpern schwach immobilisiert. Nachdem die Struktur nach Fig. 14 b) bis zum oberen Rand der Fläche 22 in das Meßmedium eingetaucht ist, können sich die auf der Fläche 22 befindlichen Markerpartikel im Meßmedium lösen. Auf diese Weise kann eine Sandwichbildung erfolgen, wie sie in Fig. 5 a) beschrieben ist.
Zusätzlich ist es möglich, durch Anlegen einer elektrischen Spannung zwischen den Interdigitalstrukturen und einer äußeren Referenzelektrode einen elektropho- retischen Transport geladener Markerpartikel durchzuführen. Eine elektrische Schaltung hierfür ist in Fig. 17 gezeigt, die weiter unten beschrieben wird.
Die Messung kann an beiden Interdigitalstrukturen vorgenommen werden. Da nur auf einer der beiden
Strukturen Antikörper immobilisiert sind, kommt es auch nur hier zur Sandwich-Bildung. Durch eine Auswertung der Differenz der Signale von den beiden Interdigitalstrukturen kann der Einfluß nicht spezi- fisch bindender Moleküle eliminiert werden.
Ein gegenüber Fig. 14 modifiziertes Ausführungsbei- spiel ist in Fig. 15 dargestellt. Hier ist die Abdeckung 20 mit den Durchbrüchen 21, 21' (Fig. 15 a) mit einer zusätzlichen Membran 23 (z.B. einer Dialysemembran) abgedeckt (Fig. 15 b) . Die für das Bio-As- say verwendeten Markerpartikel mit den immobilisierten Molekülen sind vor dem Aufbringen der Membran 23 in löslicher Form in einen der Durchbrüche 21, 21' eingebracht worden. Die Sensorkonfiguration nach Fig. 15 b) wird mit ihrem unteren Ende in das Meßmedium eingetaucht, so daß das Meßmedium durch die dünne Schicht 23 in den Bereich der Durchbrüche 21, 21' eindringen kann. Die Messung erfolgt wie im Beispiel nach Fig. 14 beschrieben.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist es möglich, den elektrophoretischen Transport der Markerpartikel durch einen magnetischen Transport zu ersetzen. Dies ist in der Fig. 16 vereinfacht dargestellt, bei der eine Assaystruktur nach Abb. 14 mit einem Magneten 24 versehen wird. Zur Unterstützung der Sandwichbildung wird ein Magnetfeld so ausgebildet, daß die paramagnetischen Markerpartikel in den Bereich der Interdigitalstrukturen 19, 19' gezogen werden. Dies ist z.B. mit Hilfe des kleinen Magneten 24 möglich. Nach Sandwichbildung wird der Magnet 24 auf der gegenüberliegenden Seite (in der Fig. 16 oberhalb der Assaystruktur) angeordnet, so daß die Markerpartikel von den Interdigitalstrukturen 19, 19' weg bewegt werden und es zu einem Pseudowaschschritt kommt.
Der kleine Magnet 24 kann auch durch einen Elektromagneten ersetzt werden.
In Figur 17 ist eine Meßschaltung für Vorrichtungen (Assays) nach den Figuren 14 bis 16 gezeigt. Eine Spannungsquelle 29 erzeugt ein Gleichspannungs- oder ein Wechselspannungssignal im mV-Bereich, vorzugsweise in der Höhe einiger 100 mV. Dieses Signal wird über Anschlüsse 34 und 35 mit Anschlüssen 15 und 15+ bzw. 15' und 15+' der Interdigitalstrukturen nach Figuren 14, 15 oder 16 verbunden. Der sich über die Meßlösung einstellende Gleich- bzw. Wechselstrom wird mit einem Strommesser 30 registriert. Aus den Span- nungs-Strom-Daten wird der elektrische Leitwert als ein Maß für die Analytkonzentration des Meßmediums in der Umgebung der gegebenenfalls mit Markerpartikeln belegten Elektroden der Interdigitalstruktur gemessen.
Für den elektrophoretischen Markerpartikel -Transport kann von einer Gleichspannungsquelle 33 über Widerstände 31 und 32 an die Anschlüsse 34 und 35 eine Gleichspannung im Bereich von einigen 100mV gegen eine Gegenelektrode angelegt werden. Die Gegenelektrode kann sich in einer größeren Entfernung von den Interdigitalstrukturen im Meßmedium befinden. Beispielsweise besteht diese Gegenelektrode aus einem chloridisierten Silberfilm, wie dies dem Stand der Technik entspricht. Die Werte der Widerstände 31, 32 liegen im kΩ - bzw. im MΩ -Bereich (z.B. bei 100 kΩ) .
In Figur 18 ist ein Immunoassay-Teststabchen in stark vereinfachter Form dargestellt. Auf einem Träger 1 (Fig. 18 a) befindet sich eine Immobilisierungs- Schicht 25 aus einem Material, an dessen Oberfläche Antigene bei Kontakt immobilisiert werden. Diese Schicht besteht aus PVA und überdeckt eine Interdigital-Doppelstruktur (nicht dargestellt) , wie diese aus den Figuren 14 bis 16 bekannt sind. Die elektrischen Anschlüsse (nicht dargestellt) befinden sich auf einer Anschlußfläche 26. Wird die Anordnung nach Figur 18a in ein Gefäß 27 mit einem Meßmedium 3 gebracht, das Antigene 8 enthält, werden auf der Immobilisierungsfläche 25 Antigene immobilisiert (Fig. 18bl) . Gleiches kann beim Einbringen der Anordnung nach Figur 18a in ein Gewebe (z.B. Fleisch ...) oder ein gelartiges Meßmedium geschehen (Fig. 18 b2) .
Anschließend wird die Anordnung in Kontakt mit einem flüssigen Medium gebracht, das Markerpartikel mit immobilisierten Antikörpern enthält (Fig. 18c) . Nach dem Zustandekommen der Antikörper/Antigen-Wechselwir- kung mit der elektrodennahen Lokalisierung der Markerpartikel (im Bereich der Interdigitalstrukturen unter der Schicht 25) kann die Messung so erfolgen, wie in den vorangegangenen Beispielen dargestellt .
Ein weiteres Beispiel eines Bioassays ist in Fig. 19 gezeigt. Mit einem solchen Assay lassen sich ganze Zellen 40 nachweisen. Die Anordnungen gemäß Fig. 19 a) und b) entsprechen einem Immunoassay-Format gemäß Fig. 5 a) . Gegenüber dem Immunoassay sind die Antigene ersetzt durch Zellen 40, die an ihrer Oberfläche Strukturen mit der Eigenschaft von Antigenen 8* tragen. Fig. 19 a) zeigt ein Bioassay mit kleinen Zellen (z.B. Protozyten mit Durchmessern im Bereich von 0,3 und 2,5 μm) . Die Fig. 19 b) stellt ein Assay mit z.B. Euzyten mit Durchmessern zwischen 2 und 20 μm dar.
Die in den vorangegangenen Ausführungsbeispielen ver- wendeten Markerpartikel können zum Beispiel aus Mikrosphären aus Si02, Latex, diamagnetischen, paramagnetischen und anderen Materialien mit Durchmessern zwischen 15nm und 25mm bestehen. Darüber hinaus können auch Dendrimere verwendet werden.
Neben Markerpartikeln aus elektrisch isolierenden Materialien lassen sich auch Markerpartikel einsetzen, die aus metallischem Material hergestellt sind. Solche elektrisch leitfähigen Markerpartikel lassen sich auch realisieren, indem elektrisch isolierende Markerpartikel (z.B. Mikrosphären) mit einer dünnen Metallschicht bedampft werden.
Die Fig. 20 zeigt als weiteres Ausführungsbeispiel ein anderes Immunoassayformat . Auf dem Träger 1 befindet sich wie in allen vorangegangenen Ausführungs- beispielen eine Mikroelektrode 2, auf der Antikörper 9 immobilisiert sind. Wie in der Fig. 2a gezeigt, befinden sich im Halbraum oberhalb der Mikroelektrode Antigene 8 und 8' sowie Markerpartikel 5. Diese Mar- kerpartikel sind mit einem elektroaktiven Stoff A
(z.B. Ascorbinsäure) beladen. Die Antigene 8, 8', die zu den Antikörpern 9 auf der Elektrode 2 komplementär sind, können in bindende Wechselwirkung treten. Tragen die Antigene eine elektrische Ladung, so ist es zusätzlich möglich, diese Antigene mit Hilfe eines elektrischen Feldes Fe zur Elektrode zu befördern (Fig. 20a + b) . Die Markerpartikel 5 mit einem magnetischen bzw. paramagnetischen Kern können nun mit Hilfe eines magnetischen Feldes Fm auf die Elektrode 2 hin bewegt werden (Fig. 20c) . Dabei können die Antikörper 9 mit den Antigenen 8 in bindende Wechselwirkung treten, die bereits an die Antikörper angebunden haben, die auf der Elektrode 2 immobilisiert sind. Nicht gebundene Markerpartikel können mit Hilfe eines in der Richtung umgedrehten magnetischen Feldes
Fm von der Mikroelektrode 2 entfernt werden. Die Markerpartikel 5 sind mit dem elektroaktiven Stoff A beladen, der durch Diffusion aus der Markerpartikel- Oberfläche austreten kann. Somit wird das elektroden- nahe Anbinden von Markerpartikeln dadurch registriert, daß ein Umsatz des elektroaktiven Stoffes A an der Elektrode 2 erfolgt, bei dem ein elektrischer Strom in Form von Elektronen e fließt. Hierzu wird zwischen der Mikroelektrode 2 und einer Gegenelektro- de (nicht dargestellt) eine elektrische Spannung von einigen 100 mV angelegt. Alternativ zur Bewegung der Markerpartikel mit Hilfe eines magnetischen Feldes kann ein elektrisches Feld zum elektrophoretischen Transport eingesetzt werden. Dies ist in den vorange- gangenen Ausführungsbeispielen bereits gezeigt worden. Ein weiteres Ausführungsbeispiel ist in Fig. 21 gezeigt. Hier kommt es wie im Beispiel nach Fig. 20 zu einer bindenden Wechselwirkung von Antigenen 8 ' mit Antikörpern 9, die auf der Elektrode 2 immobilisiert sind. Dies kann auch wieder durch ein elektrisches Feld Fe unterstützt werden.
In diesem Ausführungsbeispiel sind an der Oberfläche der Markerpartikel 5 nicht nur Antikörper 9' sondern auch Enzyme E immobilisiert. Im Meßmedium oberhalb der Elektrode 2 befindet sich ein Substrat S (z.B. Glukose) das mit Hilfe des Enzyms (z.B. Glukoseoxyda- se) enzymatisch umgesetzt werden kann. Kommt es nun zu einem Anbinden der Markerpartikel an die Oberfläche der Elektrode 2, so führen die an der Markerpartikeloberfläche immobilisierten Enzyme (E) zu einem Umsatz des Substrates (S) . Das dabei entstehende Produkt (P) (z.B. H202) kann elektrochemisch an der Elektrodenoberfläche 2 umgesetzt werden.
Überschüssige Markerpartikel können durch Umkehrung des magnetischen Feldes Fm von der Elektrodenoberfläche entfernt werden.
Der enzymatisch katalysierte Stoffumsatz an der Elektrode 2 erfolgt in gleicher Weise wie bei bekannten elektrochemischen Glukosesensoren. Hierfür wird zwischen der Elektrode 2 und einer Gegenelektrode eine elektrische Spannung von einigen 100 mV (vorzugsweise 600 mV) angelegt.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel ist in Fig. 22 gezeigt . Hier kann es ebenso wie in den vorangegangenen Ausführungsbeispielen zu einer bindenden Wechselwirkung zwischen Antigenen 8, 8' und den auf der Elek- trode immobilisierten Antikörpern 9 kommen. Mit Hilfe eines magnetischen Feldes können nun Markerpartikel in die Nähe der Elektrode transportiert werden. Die Markerpartikel 5 tragen an ihrer Oberfläche im obili- sierte Antikörper 9 und immobilisierte Enzyme (E)
(Fig. 22b) . Nachdem es zu einer bindenden Wechselwirkung zwischen den Markerpartikeln 5 und der Elektrode 2 gekommen ist, kann durch Umkehrung des magnetischen Feldes der Überschuß an Markerpartikeln 5 (nicht dar- gestellt) von der Elektrode entfernt werden. Anschließend wird mit Hilfe eines magnetischen Feldes Fm eine zweite Sorte von Markerpartikeln 5 ' auf die Elektrode 2 zubewegt. Diese Markerpartikel 5' sind mit einem Substrat S (z.B. Glukose) beladen. Befinden sich die Markerpartikel 5' in der Nähe der Elektrode 2, so führt ein ausdiffundierendes Substrat S zu einer Wechselwirkung mit den auf den Markerpartikeln 5 immobilisierten Enzymen E. Das dabei entstehende Produkt P wird wie im vorangegangenen Ausführungsbei- spiel dargestellt an der Elektrode 2 elektrochemisch umgesetzt (Fig. 22d) .
Anstelle von Markerpartikeln mit immobilisierten Enzymen (Fig. 21 u. Fig. 229 können auch Markerpartikel verwendet werden, die mit Enzymen beladen sind. Aus diesen Markerpartikeln können die Enzyme auf gleiche Weise freigesetzt werden, wie dies für die elektroak- tive Substanz im Beispiel nach Fig. 20 beschrieben wurde .
In analoger Weise lassen sich außer den oben dargestellten Immunoassayformaten auch DAN-Sonden und andere Bioassays realisieren. Hierbei werden lediglich die Immunkomplexe durch andere Bindungen ersetzt. Auch bei den Varianten nach Fig. 20 - 22 lassen sich Assays mit einer extrem geringen Nachweisgrenze realisieren, wenn die Fläche der Mikroelektrode nicht sehr viel größer ist als die projizierte Quer- Schnittsfläche der Markerpartikel. Somit ist auch hier ein Einzelbindungsnachweis möglich, d.h. das Anbinden eines Markerpartikels auf einer Mikroelektrode ist nachweisbar.
Bei diesen Varianten beruht der Nachweis darauf, daß die Markerpartikel in ihrer unmittelbaren Umgebung eine Erhöhung einer Stoffkonzentration verursachen. Dies erfolgt durch Freisetzung bzw. durch enzymati- sche Substratumsetzung an der Partikeloberfläche. Hierbei geht es nicht, wie z.B. bei anderen Biosensoren um ein meßbares Signal, das von der Substratkonzentration abhängig ist. Vielmehr ist das meßbare Signal von der Anzahl der mikroelektrodennah lokalisierten Markerpartikel bestimmt.
Ein anderes Ausführungsbeispiel zeigt Fig. 23. Auf einem Träger 1 ist eine Mikroelektrode 2 angebracht. Kommt es wie oben beschrieben zu einer Bindung 6 zwischen Markerpartikeln 5 und der Elektrode 2, so sind die Markerpartikel mikroelektrodennah lokalisiert. Handelt es sich um ferromagnetische Markerpartikel mit einem eigenen magnetischen Feld, so kann die elektrodennahe Lokalisierung der Markerpartikel 5 mit Hilfe eines Sensors 37 nachgewiesen werden, der die Stärke des magnetischen Feldes mißt.
Es ist ebenso möglich, Markerpartikel mit paramagnetischem Kern zu verwenden. Wird nun oberhalb des Trägers 1 ein magnetisches Wechselfeld 4 erzeugt, so kann die durch die Markerpartikel verursachte Änderung der magnetischen Feldstärke mit Hilfe des Sen- sors 37 detektiert werden, die Frequenz des magnetischen Wechselfeldes kann zwischen einigen Hertz und einigen MHz liegen.
Bei der Verwendung von Markerpartikeln mit ferroma- gnetischem oder paramagnetischem Kern ist es wichtig, daß sich die Permeabilitätszahl des Partikels bzw. des Partikelkerns von der Permeabilitätszahl des flüssigen Meßmediums der Unterlage und bei einer Durchflußmessung der Durchflußmeßkammer entsprechend Fig. 4 unterscheidet.
In diesem Ausführungsbeispiel kann der elektrophoretische Transport von bindenden molekularen Partnern zur Elektrode 2 hin erfolgen, wie dies in den vorangegangenen Ausführungsbeispielen beschrieben wurde. Ebenso ist es möglich, den Transport der Markerpartikel durch elektrophoretischen Effekt zu bewirken.
In den Figuren 24 bis 30 ist eine Meßanordnung für den Nachweis von Markerpartikeln in Meßlösungen dargestellt, die mindestens eine Elektrode mit davor angeordneter Blende zeigen, während in den Figuren 31 bis 35 eine Meßanordnung zum Nachweis von Markerpar- tikeln in Meßlösungen mit potentiometrischen Elektroden dargestellt sind.
Die obigen Ausführungen gelten auch für diese Ausführungsbeispiele, wobei die Mikroelektroden durch die im folgenden beschriebenen Elektroden ersetzt werden könne .
Die Fig. 24a) zeigt eine Makroelektrode 2, die sich von einer Blende 101 aus elektrisch nichtleitendem Material mit einer Blendenöffnung 105 befindet. Der Raum zwischen der Blende 101 und der Elektrode 2 ist mit einem Innenelektrolyten 103 ausgefüllt, der über die Blendenöffnung 105 mit dem Meßmedium 3 (Elektrolyt) in Kontakt ist. Dabei kann der Innenelektrolyt beispielsweise als Gel ausgebildet sein, wobei es möglich ist, daß es sich bis in die Blendenöffnung 105 hinein erstreckt. In großer Entfernung von der Blende 101 befindet sich eine Gegenelektrode (in der Figur nicht dargestellt) im Meßmedium. An die Elektroden wird eine elektrische Gleich- und/oder Wech- selspannung angelegt, wodurch ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden erzeugt wird. Die von der Elektrode 2 ausgehenden elektrischen Feldlinien 4" konzentrieren sich im Bereich der Blendenöffnung 105. Im Meßmedium 3 beschreiben die elektrischen Feldlini- en 4 ' ' ' ein sich radial ausbreitendes elektrisches Feld.
Fig. 24b) zeigt die Elektroden- und Blendenkonfiguration mit einem Label- (Marker-) partikel 5, das mit Hilfe einer Bindung 6 an die Blende 101 gebunden ist. Sind die molekularen Bindungspartner in der Nähe der Blendenöffnung 105 lokalisiert, so erfolgt die Bindung des Labelpartikels 5 in unmittelbarer Nähe der Blendenöffnung 105. Der oben beschriebene LIFE-Effekt (Label Induced Field Effect) , d.h. ein durch Markenpartikel induzierter Feldeffekt, führt zu einer Störung des elektrischen Feldes und der elektrischen Feldlinien 4 ' ' ' im Meßmedium 3. Dies kann, wie beschrieben, elektrisch nachgewiesen werden.
Die Größe der Blendenöffnung 105 liegt im Bereich zwischen 0,5 μm und 100 μm, vorzugsweise im Bereich um 1 μm. Der Abstand zwischen der Blende 101 und der Elektrode 2 kann beliebig gewählt werden, wenn er deutlich größer ist als der Durchmesser der Blendenöffnung. Beispielsweise beträgt dieser Blendenabstand 1 mm. Der Durchmesser der Markerpartikel liegt zwischen 0,5 μm und 100 μm, vorzugsweise im Bereich um 1 μm.
In Fig. 25 ist eine Elektroden- und Blendenkonfiguration in Pipettentechnik dargestellt. Eine Mikropipet- te 119, die zum Beispiel aus Glas besteht, besitzt an ihrer Spitze eine Blende 101* mit einer Blendenöffnung 105. Die Pipette ist mit einem Innenelektrolyten 103 gefüllt, in den eine Elektrode 2 hineinragt. Die Elektrode 2 ist mit Hilfe einer elektrischen Zuleitung 110 und einem elektrischen Anschluß 111 an eine Meßelektronik anschließbar. Partikel 5, die durch Bindungen 6 in der Nähe der Blendenöffnung 105 loka- lisiert sind, führen, wie im Beispiel nach Fig. 24 gezeigt, zu einer Störung des elektrischen Feldes und sind damit elektrisch nachweisbar.
In Fig. 26 ist eine Elektroden- und Blendenkonfigura- tion nach Fig. 24 in planarer Bauweise dargestellt.
Auf einem Träger 112 befindet sich eine dünne Elektrodenschicht 2 ' . Der Träger 112 kann zum Beispiel aus einer Kunststoffolie bestehen. Hierfür sind alle Materialien einsetzbar, die einen hohen elektrischen Widerstand aufweisen. Die Elektrodenschicht 2' kann zum Beispiel aus einem Edelmetall (Gold, Platin, Silber AGCl usw.) durch bekannte Dünnschichtverfahren aufgebracht werden. Ebenso ist es möglich, die Elek- trodenschicht 2' mit Hilfe elektrisch leitfähiger Pasten nach dem Siebdruckverfahren aufzubringen. Auf dem Träger 112 ist ein Abstandshalter 113 zum Beispiel durch Klebetechnik oder durch Heißlaminieren aufgebracht. Der Abstandshalter 113 besitzt einen Durchbruch 115 für die elektrische Kontaktierung der dünnen Elektrodenschicht 2 ' sowie ein Kompartiment 114 für den Innenelektrolyten. Der Abstandshalter kann aus dem gleichen Material hergestellt sein wie der Träger 112. Auf dem Abstandshalter 113 ist eine Blendenfolie 101' durch Klebe- und Heißlaminiertech- nik aufgebracht. Die Blendenfolie 101' weist ein oder mehrere Blendenöffnungen 105' auf.
Das Einbringen des Innenelektrolyts in sein Komparti- ment 114 kann zum Beispiel nach dem Verfahren der Va- kuumbefüllung erfolgen. Hierfür wird die Konfiguration nach Fig. 26b) in einen Elektrolyten eingebracht und oberhalb des Elektrolyten ein Vakuum erzeugt . Dadurch wird das Kompartiment 14 entlüftet und der Innenelektrolyt dringt ein.
Die Blendenöffnungen 105' auf der Blendenfolie 101' können zum Beispiel mit Hilfe eines Lasers erzeugt werden. Auch ist es möglich, eine perforierte Blendenfolie nach dem bekannten LIGA-Verfahren herzustel- len. Ebenso ist es möglich, die Blendenfolie 101' in Form eines Ion-Track-Filters zu realisieren. Bei solchen Ion-Track-Filtern werden mikroskopische Öffnungen im μm-Bereich und im Sub-μm-Bereich erzeugt. Weiterhin lassen sich Kapillarporen-Membranfilter ver- wenden, die Poren im μm- und im Sub-μm-Bereich aufweisen. Solche Kapillarporen-Membranfilter sind kommerziell erhältlich und bestehen beispielsweise aus den Materialien Polykarbonat , Polyester, Acrylpoly- mer, PP.
Wichtig bei der Verwendung von mehr als einer Blendenöffnung 105 ist, daß bei einem Blendenöffnungs- Durchmesser von 0,5 μm - 10 μm Abstände von Blendenöffnungen eingehalten werden, die etwa 100 μm betra- gen. So ist gewährleistet, daß sich ausgehend von den Blendenöffnungen 105 die elektrischen Feldlinien radial in das Meßmedium hinein erstrecken.
Fig. 27 zeigt eine erste Variante zur Konfiguration in Fig. 26. Hier ist der Abstandshalter 113' mit einem Kompartiment 114' für den Innenelektrolyten ausgestattet, das eine zusätzliche Möglichkeit zur Entlüftung dieses Kompartimentes bietet. In der Blendenfolie 101" befindet sich eine Öffnung 116, über die das Probenkompartiment bei der Vakuumbefüllung schneller entlüftet werden kann. Nach Befüllung der Konfiguration nach Fig. 27 kann die Entlüftungsöffnung 116 mit einem geeigneten Material (Epoxydharz, Silikon usw.) versiegelt werden. Ansonsten entspricht der Aufbau dem nach Fig. 26.
Fig. 28 zeigt eine zweite Variante der Konfiguration nach Fig. 3. Hier befinden sich auf dem Träger 112 zwei Elektrodenschichten 2", 2'". In dieser Ausfüh- rungsform trägt die Blendenfolie 101" zwei Blendenöffnungen 105", 105'". Sind in der unmittelbaren Umgebung der Blendenöffnungen 105" und 105'" unterschiedliche molekulare Bindungspartner immobilisiert, so lassen sich unterschiedliche Analyte nachweisen. Dies entspricht einer Anordnung von zwei Mikroelektroden, wie dies oben beschrieben ist. Die Konfiguration mit zwei Elektroden und dazugehörigen Blendenöffnungen kann auch zu einem größeren Array mit einer Vielzahl von Elektroden- und Blendenöffnungen erwei- tert werden.
In Fig. 29 ist eine weitere Variante der Konfiguration nach Fig. 26 gezeigt. Hier ist zusätzlich auf der Blendenfolie 101' ein Träger 117 für ein Probenkom- partiment 118 aufgebracht. Dieser Träger 117 kann aus jedem beliebigen Kunststoff hergestellt sein, der mit Os
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läßt sich ortselektiv die Siliziumscheibe 108' oberhalb der Schicht 106 abätzen. Mit Hilfe lithographischer Verfahren können Öffnungen 104 und 104 ' in die Schicht 106 eingebracht werden. Dieses Beispiel hat den Vorteil, daß die Öffnungen sich in einer sehr dünnen Schicht 106 befinden. Die Siliziumscheibe kann eine Dicke von ca. 300 μm haben, während die Schicht 106 eine Dicke zwischen 1 und 100 μm (vorzugsweise 10 μm) besitzt.
In Fig. 31 ist eine Meßanordnung für ein Verfahren zur potentiometrischen Messung zum Nachweis von Analyten dargestellt.
Auf einem Träger 122 befindet sich die Festableitung 123 einer potentiometrischen Elektrode mit einer ionenselektiven Membran 124. An der Oberfläche der ionenselektiven Membran 124 sind Moleküle immobilisiert, die mit den Molekülen, die auf den Partikeln 5 immobilisiert sind, eine Bindung 6 eingehen können.
Die an der Oberfläche der ionenselektiven Membran 124 gebundenen Label- oder Markerpartikel 5, die in diesem Ausführungsbeispiel einen Durchmesser von 10 nm aufweisen, rufen eine Störung der Potentialbildungs- Vorgänge an der Oberfläche der ionenselektiven Membran 124 hervor, die auf potentiometrischem Wege gemessen werden kann. Gemessen wird das Potential der aus Festableitung 123 und ionenselektiven Membran 124 bestehender ionenselektiven Elektrode gegen eine Be- zugselektrode, die sich ebenfalls im Meßmedium 3 befindet, aber nicht dargestellt ist.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der Träger 122 zum Beispiel aus Glas, die Festableitung 123 der poten- tiometrischen Elektrode besteht aus Silber und die ionenselektive Membran 124 aus einer Ag/AgCl -Schicht . Ebenso ist es möglich, die ionenselektive Membran 124 als Polymermembran auszubilden. Auch können andere bekannte Materialien für ionenselektive Membranen eingesetzt werden. Es ist zusätzlich möglich, oberhalb der ionenselektiven Membran ohne immobilisierte Moleküle keine weitere Schicht anzuordnen, in der sich die immobilisierten Bindungspartner befinden (ohne Abbildung) . Diese Schicht kann zum Beispiel aus einem Hydrogel oder Kollagen bestehen.
Fig. 32 zeigt ein Ausführungsbeispiel für die Verwendung nach dem potentiometrischen Meßprinzip im Differenzverfahren. Auf einem Träger 125 befinden sich die Festableitungen 123 und 123 ' einer potentiometrischen Elektrode mit den Leiterbahnen 127 und 127' sowie den elektrischen Anschlüssen 128 und 128'. Träger und Elektroden sowie Leiterbahnen sind mit der Abdeckung 126 gegenüber dem Meßmedium geschützt. Die Abdeckung 126 besitzt Durchbrüche 129 und 129', die die ionen- selektiven Elektroden freilassen. Die Festableitung
123 und 123', die Leiterbahnen 127 und 127' sowie die elektrischen Anschlüsse 128 und 128' können zum Beispiel aus Silber nach bekannten Dünnschicht- oder Dickschichtverfahren hergestellt sein. Als ionense- lektive Membran kann wiederum Ag/AgCl verwendet werden, wobei sie durch die Chloridisierung des Silberfilms der Festableitungen 123, 123' hergestellt werden kann.
Ebenso ist es möglich, in die Durchbrüche 129 und
129' Polymermembranen mit elektroaktiven Komponenten nach bekannten Verfahren herzustellen. Hierfür lassen sich Dispensierverfahren verwenden. Die Abdeckung 126 kann durch Siebdruckverfahren aufgebracht werden. Auch das Einbringen der ionenselektiven Membranen 124 und 124' kann durch Siebdruckverfahren geschehen. Os -rt
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Mit Hilfe des elektrischen Stromes zwischen der ionenselektiven Elektrode und der Gegenelektrode erfolgt der Markerpartikeltransport auf elektrophoreti- schem Wege. Dies ist möglich bei Verwendung von po- tentiometrischen Elektroden, die relativ niederohmig sind. Dies ist zum Beispiel bei Ag/AgCl-Elektroden der Fall.
Bei hochohmigen potentiometrischen Elektroden wird auf die Gegenelektrode 131 und die Stromquelle 140 verzichtet. Hierbei muß der Markerpartikeltransport auf magnetischem Wege erfolgen, wie weiter oben beschrieben ist.
Die beschriebenen Assays können nicht nur für die hier beschriebenen Analyte, sondern auch generell zum Nachweis von Antikörpern, Antigenen, Nukleinsäuren, Aptameren oder anderen beliebigen Analyten zur Analyse und/oder Diagnostik in der Chemie, Lebensmittel - chemie, Biotechnologie, Umweltanalytik, Biochemie oder Medizin eingesetzt werden.

Claims

1 1 54 1 1 1 TJ 1
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d Φ d Λ d Pn 4 Φ 2 • Φ rH iH υ XI -P Φ (ti 03 - CQ -U
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4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Markerpartikel spezifisch an die Analyte binden, die gegebenenfalls ihrerseits spezifisch an eine Unterlage binden, die gegebenenfalls die Elektrode ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die freien Analyte mit Markerpartikeln bzw. mit Markerpartikeln, an die Analyte gebunden sind, um die für die freien
Analyte spezifischen Bindungsplätze auf einer Unterlage konkurrieren, die ggf. die Elektrode ist .
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Markerpartikel spezifisch an die Analyte binden und daß die Meßlösung anschließend zwischen zwei Elektroden hindurchfließt, durch die das elektrische Feld erzeugt wird oder daß die Meßlösung anschließend durch eine Durchflußmeßkammer fließt, in der das Magnetfeld erzeugt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich- net, daß der elektrische Strom zwischen den
Elektroden bzw. die Kapazität beim Hindurchfließen der Meßlösung bestimmt wird.
8. Ver ahren nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, dadurch gekennzeichnet, daß Markerpartikel mit einer elektrischen Ladung und/oder mit einem elektroaktiven Stoff und/oder mit Enzymen immobilisierte oder beladene Markerpartikel und/oder ferro-, dia- oder paramagnetische Markerpartikel verwendet werden. t
Os
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-H CQ rH d Di φ xi Di ε d Di * - -H CJ Φ SH ~ Φ PQ SH Φ d
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metrischem Wege gemessen werden.
14. Vorrichtung zur Bestimmung von Analyten in Meß- lδsungen mittels Markerpartikeln mit einem Trä- ger, dadurch gekennzeichnet, daß die Markerpartikel elektrische Eigenschaften und/oder elektrochemische Eigenschaften aufweisen, die von den elektrischen und/oder elektrochemischen Eigenschaften der Meßlösung verschieden sind, und daß auf dem Träger mindestens eine Elektrode einer Elektrodenanordnung angeordnet ist, die mit einer Vorrichtung zur Erzeugung eines elektrischen Feldes verbunden ist und daß eine Meßeinrichtung zur Erfassung des elektrischen Stroms oder der elektrischen Spannung vorgesehen ist .
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß auf dem Träger eine Unterlage mit spezifischen Bindungsstellen für den Analyten angeordnet ist und die Markerpartikel spezifische Bindungsstellen für die Analyte oder die Unterlage aufweisen, wobei Markerpartikel auf dem Träger oder der Abdeckung angeordnet sind.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterlage als Elektrode ausgebildet ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekenn- zeichnet, daß die Markerpartikel spezifische
Bindungsstellen für den Analyten aufweisen, und auf dem Träger eine zweite Elektrode derart angeordnet ist, daß zwischen der ersten und zweiten Elektrode eine Öffnung für den Durchfluß der Meßlösung besteht.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach außen durch eine Membran abgeschlossen ist, die für den Analyten und gegebenenfalls für die Meßlösung durchlässig ist .
19. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Markerpartikel eine elektrische Ladung aufweisen und/oder magnetisch und/oder mit einem elektroaktiven Stoff und/oder mit Enzymen versehen sind.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß auf dem Träger ein umpolbares magnetisches Element angeordnet ist.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß vor einer Elektrode zur Erzeugung eines inhomogenen elektrischen
Feldes eine mit der Meßlösung in Verbindung stehende Blende (101, 105) angeordnet ist, die mindestens eine kleine Öffnung aufweist und die als Bindungselement für die Markerpartikel dient.
22. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Raum zwischen Blende (101, 105) und Elektrode (2) mit einem Elektrolyten (103) ausgefüllt ist, der mit der Meßlösung (3) in Kontakt ist.
23. Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß die blende (101, 105) Bestandteil einer Pipette (119) ist, in die die Elektrode (2) hineinragt.
24. Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß mit dem die mindestens eine Elektrode aufweisenden flachen Träger (112) ein mit mindestens einer Durchbrechung (114) zur Aufnahme des Elektrolyten (103) versehenes Abstandselement (113) fest verbunden ist und daß die Durchbrechung (114) mit einer als Blende dienenden Abdeckung (101) abgedeckt ist, in der mindestens eine Blendenöffnung (105) vorgesehen ist.
25. Vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Elektroden (2) auf dem Träger (112) aufgebracht sind, das Abstandele- ment (113) mit mehreren den Elektroden zugeordneten Durchbrechungen versehen ist und die Abdeckung mindestens eine Blendöffnung für jede Durchbrechung aufweist.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß eine Gegenelektrode (120) auf der der Meßlösung zugewandten Seite der Abdeckung (101) mit Blendöffnung (105) aufgebracht ist.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Blende pyramidenstumpfförmig ist.
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine auf dem Träger (122, 125) angeordnete Elektrode ausgebildet ist und eine mit der Meßlösung in Verbindung stehende ionenselektive Membran (124) aufweist, die die Markerpartikel bindet.
29. Vorrichtung nach Anspruch 14 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Elektroden
(123, 124) auf einen Träger (125) aufgebracht sind, die von einem Abdeckelement (126) mit min- destens zwei Durchbrechungen (129) abgedeckt sind.
30. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweilige ionenselektive Mem- bran in der Durchbrechung (129) angeordnet ist.
31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß Markerpartikel mit einem Durchmesser verwendet werden, der im nm- Bereich bis in den Sub-mm-Bereich liegt.
32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine mit einer ionenselektiven Membran (124) versehe- ne potentiometrische Elektrode (123, 124) und eine Bezugselektrode (103, 2) auf dem Träger (25') angeordnet sind und über den Elektroden ein mit einer Zu- und/oder Abführung versehener Fließkanal (134) für die Meßlösung vorgesehen ist.
33. Vorrichtung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß auf einer mit dem Fließkanal (134) in Verbindung stehenden begrenzten Fläche (130) des Trägers (25') Markerpartikel durch die in dem Fließkanal (134) strömenden Meßlösung lösbar sind.
34. Vorrichtung nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß der Fließkanal (134) in einer den Träger mindestens teilweise überdecken- den Abdeckung (133, 26') ausgeformt ist, die eine Zuleit- und eine Ableitöffnung (135, 136) aufweist .
35. Vorrichtung nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß der Fließkanal als Fließmatrix (137) mit einer die Meßlösung von außen aufnehmenden Fläche (138) ausgebildet ist.
36. Vorrichtung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß auf einer begrenzten Fläche (30 ') der Fließmatrix Markerpartikel immobilisiert sind, die durch die in der Fließmatrix sich verbreitenden Meßlösung lösbar sind.
37. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 29 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß auf dem Träger (125, 25') eine Gegenelektrode (131) aufgebracht ist und daß zwischen potentiometrischer Elektrode (123, 124) und Gegenelektrode (131) eine Stromquelle (140) zum Einspeisen eines Stromes und zwischen potentiometrischer Elektrode und Bezugselektrode eine Spannungsmeßeinrichtung geschaltet sind.
38. Verwendung einer Vorrichtung oder eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum Nachweis von Antikörpern, Antigenen, Nukleinsäuren, Aptameren oder anderen Analyten zur Analyse und/oder Diagnostik in der Chemie, pharmazeutischen Entwicklung, Lebensmittelchemie, Biotechnologie, Umweltanalytik, Biochemie oder Medizin.
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