WO1998038542A1 - Lichtabtastvorrichtung - Google Patents

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WO1998038542A1
WO1998038542A1 PCT/EP1997/006794 EP9706794W WO9838542A1 WO 1998038542 A1 WO1998038542 A1 WO 1998038542A1 EP 9706794 W EP9706794 W EP 9706794W WO 9838542 A1 WO9838542 A1 WO 9838542A1
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WO
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light
scanning
sample
sensing
scanning device
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PCT/EP1997/006794
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Inventor
Jürgen WULF
Original Assignee
Bodenseewerk Perkin-Elmer Gmbh
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G—PHYSICS
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/08—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the direction of light
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/08—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the direction of light
    • G02B26/10—Scanning systems
    • G02B26/101—Scanning systems with both horizontal and vertical deflecting means, e.g. raster or XY scanners
    • G—PHYSICS
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/10—Beam splitting or combining systems
    • G02B27/14—Beam splitting or combining systems operating by reflection only
    • G02B27/148—Beam splitting or combining systems operating by reflection only including stacked surfaces having at least one double-pass partially reflecting surface

Definitions

  • the present invention relates to a light scanning device for the excitation and detection of an emission of secondary light, in particular fluorescent light, from a sample with a light generating device for generating scanning light in the form of a single light beam, a deflection unit for deflecting the scanning light, which can be changed in at least one direction, for scanning at least one Partial area of the sample, an imaging unit for imaging secondary light emanating from the sample and a detection unit for detecting the secondary light.
  • Light scanning devices of the aforementioned type are used, for example, for the spatially resolved fluorescence examination of a sample.
  • a narrowly limited beam focused on the sample is generated, which is deflected by means of a deflection device, e.g. in the form of tilting mirrors with two mutually perpendicular tilting or rotating axes in the optical path of the light beam, over which the sample is scanned.
  • the scanning light stimulates the generation of secondary light, e.g. in the form of fluorescent light. This secondary light is collected via imaging optics and detected on a detection unit.
  • the deflection unit irradiates a specific spot on the sample depending on the position of the tilting mirrors relative to one another and relative to the sample, a location-dependent statement about the corresponding property of the sample can be made by means of the detection unit that detects the intensity of the secondary light become.
  • the scanning time for the measurement of the entire sample depends on various parameters, such as the size of the image field on the sample, the scanning increment, the spot size of the scanning beam on the sample, the integration time of the detection unit, the scanning speed or mirror speed of the deflection unit and the desired signal -to-noise ratio.
  • Samples with dimensions in the centimeter range and high spatial resolution with a scanning beam focused on a few micrometers result in scanning times in the minutes to hours range. So long However, scan times pose a major problem in the operation of such light scanners.
  • this object is achieved by a light scanning device of the type mentioned at the outset, which is distinguished by the fact that a splitting device is provided for splitting the single light beam into at least two light beams.
  • a splitting device is provided for splitting the single light beam into at least two light beams.
  • the splitting device comprises at least one, but better two wedge-shaped double mirrors, in particular beam splitters, each with a first and second surface, on which a single incoming beam is reflected to form two beams which correspond to the wedge angle of the beam splitter Angle to each other.
  • two double mirrors four beams are generated from the initial single beam.
  • the sample is divided into four quadrants, which means that the scanning time can be reduced essentially to a quarter of the corresponding scanning time when using a single beam.
  • the two wedge-shaped double mirrors or beam splitters are advantageously part of the deflection unit and represent the respective tilting mirrors with axes of rotation of this unit which are perpendicular to one another and which are coupled to corresponding actuators.
  • a focusing lens is provided between the deflection unit and the sample. It is particularly advantageous to use an F / ⁇ lens that focuses the light beams independently of the storage, ie the distance from the optical axis. This type of arrangement of the focusing lens between the deflection unit and the sample is referred to as "pre-objective scanning".
  • the detection unit consists of a spatially resolving detector array, such as a CCD camera or a multi-channel multiplier or a multi-channel semiconductor element.
  • a spatially resolving detector array such as a CCD camera or a multi-channel multiplier or a multi-channel semiconductor element.
  • the light guides assigned to each scanning area of the sample being combined into a bundle and being fed to a corresponding detector area or a separate detector.
  • the light guides are combined in four bundles and directed to four different detectors, so that the four quadrants can be measured simultaneously.
  • color filters in front of the detectors, on the one hand to suppress the excitation light and on the other hand to carry out a selection of the secondary light.
  • the numerical aperture of the light guide limits the field of view of the secondary light emission and thus prevents channel crosstalk.
  • each of the detectors assigned to a scanning field of the sample can be equipped with a different color filter, so that e.g. four different emission wavelengths can be measured simultaneously using four detectors.
  • a structure for detecting the secondary light in a reflective, non-confocal arrangement.
  • a dichroic beam splitter is advantageously provided between the deflection unit and the sample, with which the optical path of the scanning light can be separated from the optical path of the secondary light emanating from the sample is.
  • the dichroic beam splitter is transparent to the excitation light with a first shorter wavelength, while it reflects the secondary light with a longer wavelength.
  • Figure 1 is a sketch to illustrate the basic structure and the beam path of a light scanning device according to the invention.
  • FIG. 2 shows an example of a splitting device in the form of a wedge-shaped beam splitter plate with the corresponding beam path
  • FIG. 3 shows a sketch to illustrate the various detection channels in a light scanning device according to the invention.
  • Fig. 4 is a sketch to illustrate the division of a sample into four quadrants.
  • 1 shows an example of a schematic structure of a light scanning device according to the invention.
  • a light generating device 20 for example a laser
  • a single light beam 21 of a certain wavelength is generated.
  • the light beam generated by the light generating device or the laser is advantageously spatially filtered in a spatial filter, not shown.
  • the parallel beam is expanded by, for example, an expansion lens comprising two lenses 22 and 24 into a parallel beam with a larger cross section.
  • a deflection unit 10 with tilting mirrors 11 and 12 which have mutually perpendicular axes of rotation and are connected to actuators (not shown) with corresponding controls for mutual adjustment or tilting in order to scan the beam 21 in two directions .
  • the tilt mirrors 11 and 12 each consist of wedge-shaped double mirrors or beam splitter plates, which thus form a splitting device for splitting the single incoming laser beam into a total of four separate laser beams. For the sake of clarity of illustration, only two beams 22 and 23 are shown in FIG. 1.
  • a focusing optic is arranged between the deflection unit 10 with the tilting mirrors 11 and 12 and comprises, for example, a triplet of lenses made of lenses 26, 28 and 30.
  • This focusing optics is advantageously an F / reiv objective, which focuses the radiation bundles sharply to spot sizes in the micrometer range on a sample 40, regardless of the placement.
  • pre-objective scanning This type of arrangement of the focusing optics between the deflection unit 10 with the tilting mirrors 11 and 12 and the sample 40 is referred to as "pre-objective scanning”.
  • post-objective scanning In which the focusing optics are arranged in the optical path in front of the deflection unit 10, so that the scanning light converging after the focusing optics is deflected via the scanning mirrors and directed onto the sample 40.
  • post-objective scanning In this type of arrangement of the focusing optics in front of the deflection unit 10, only minimal demands are placed on the objective. It can have a small diameter and only needs to be shown sharply in the paraxial area.
  • the deflection unit arranged behind the lens leads to a curved scanning line which lies on a circular arc around the axis of rotation of the tilting mirror. This arrangement of "post-objective scanning” is therefore not preferred for scanning flat surfaces.
  • the “pre-objective scanning” arrangement with an F / ⁇ lens with which imaging in a plane with an image coordinate proportional to the deflection angle is possible, is advantageous.
  • the F / ⁇ lens in the "pre-objective scanning” arrangement must have a relatively large diameter in order to still be able to accommodate scanning beams with a large scanning angle. It must also be corrected over a relatively large image angle in accordance with the tilting of the light beam with respect to the optical axis, and it must also have good field flattening.
  • a dichroic mirror 32 is arranged between the focusing optics and the sample 40, which transmits the excitation light with the specific wavelength and reflects the secondary light generated on or by the sample 40, which has a wavelength that is different from the excitation light, ie longer.
  • a collecting optics 34 and a detector 50 are subsequently arranged in the direction of reflection of the dichroic mirror 32.
  • the arrangement shown in FIG. 1 represents the case of measuring the secondary light in a reflective, non-confocal arrangement.
  • the non-confocal arrangement has the advantage that a larger solid angle can be recorded for the secondary light emitted by the sample than in the case of confocal imaging.
  • a confocal arrangement (not shown in FIG. 1) would also be possible, in which the secondary light emitted by the sample is returned via the same tilting mirrors 11 and 12, so that the exact same beam path as for the scanning light is traversed backwards .
  • the dichroic mirror would be provided between the light source 20 and the deflection unit 10 in order to separate the optical paths of the excitation light and the wavelength-shifted secondary light.
  • a pinhole (not shown), e.g. with a hole in the micrometer range, unwanted stray light could be largely suppressed.
  • the confocal arrangement only a very small solid angle of the secondary light, which is limited by the mirror apertures, is detected if a larger field of view is to be scanned at the same time.
  • the splitting device consists of a wedge-shaped beam splitter plate 110, on the first surface 112 and second surface 114 of which the light rays of an incident light beam 116 are each reflected in order to generate two light beam bundles 118 and 119.
  • the tilting mirror 12 shown in FIG. 1 is in the form of 2 is shown in the form of a wedge-shaped beam splitter plate 110.
  • the sample 40 is divided into four quadrants 43, 44, 45 and 46 as shown in FIG. 4.
  • the area of each quadrant of the sample is scanned by one of the four beams of the scanning light with a corresponding adjustment of the tilting mirror.
  • the time for a complete scanning of the sample is therefore reduced to a quarter of the time previously required. It is therefore possible to continue to focus the beams of the scanning light more strongly than before, at reasonable times for the scanning of a large sample, in order to increase the spatial resolution during the scanning.
  • the scanning light beam is focused on a point, scattered light can also reach neighboring molecules, the secondary light of which is also measured in the case of non-confocal imaging and is assigned to the scanning unit's current position of the tilting mirror.
  • a non-confocal setup could still be advantageous, since with a confocal expansion the signal is much smaller due to the smaller solid angle.
  • the aforementioned difficulty with regard to the scattered light is reduced by the arrangement according to the invention, since an increase in the resolution, i.e. a stronger focusing of the scanning beam without the occurrence of an increased expenditure of time when scanning the sample is possible.
  • Another advantage of the described embodiment is that by dividing the scanning light beam into four light beams and a corresponding distribution of the sample into four quadrants, each of the scanning light beams only has to cover a smaller area. This means that only smaller deflections of the tilting mirrors 11 and 12 are required, which can be realized with fewer errors or tolerances.
  • the tilting movement of the tilting mirrors is adjusted in such a way that the quadrants 43-46 shown in FIG. 4 are each completely covered by the corresponding partial beam.
  • the wedge angle of the beam splitter plates is advantageously so large that the macroscopic distance of the individual beam bundles on the sample is large compared to that mean scattering length within the sample. In the example of a sample with an area of 24 x 24 mm, this distance is optimally 12 mm.
  • the basic structure of the various detection channels is shown schematically in FIG. 4. Secondary light, represented by beams 61 and 62, is generated on the sample 40 at two points. This light is reflected on the dichroic mirror 32 as mentioned above and is focused on the detector 50 by a macro objective consisting for example of three lenses 35, 36 and 37. Each point on the sample plane clearly corresponds to a point on the detector plane.
  • the detector is advantageously a CCD camera or a multi-channel photo multiplier, e.g. the model R5900U-00-M4 from Hamamatsu, or a multi-channel semiconductor element. Such detectors are suitable for the simultaneous detection of several channels.
  • the respective sample fields of the sample (e.g. four quadrants) are mapped accordingly on the detector level.
  • a special aperture 52 which is adapted to the subdivision of the sample, can be provided in front of the detector.
  • the aperture 52 has a corresponding division into four quadrants.
  • each quadrant is combined into a bundle.
  • Four bundles are then passed to four different detectors, which can be measured simultaneously.
  • Special filters can be provided in front of the detectors to suppress the excitation light and to select the secondary light.
  • the numerical aperture of the light guide limits the field of view of the secondary light emission and thus prevents channel crosstalk. If the sample consists of fluorescent dyes of the same type, each of the detectors assigned to a quadrant can be equipped with a different color filter, so that up to four different emission wavelengths can be measured simultaneously.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Lichtabtastvorrichtung zur Anregung und Detektion einer Emission von Sekundärlicht, insbesondere von Fluoreszenzlicht, von einer Probe (40) mit einer Lichterzeugungsvorrichtung (20) zur Erzeugung des Abtastlichts in Form eines einzigen Lichtstrahlenbündels (21), einer Ablenkeinheit (10) zur in wenigstens einer Richtung veränderbaren Ablenkung des Abtastlichts zur Abtastung wenigstens einer Teilfläche der Probe (40), einer Abbildungseinheit zur Abbildung von von der Probe ausgehendem Sekundärlicht, und einer Nachweiseinheit zur Detektion des Sekundärlichts. Bei der Fluoreszenzuntersuchung einer Probe mit großer Abrasterungsfläche und gleichzeitig hoher Ortsauflösung treten unerwünscht lange Abtastzeiten auf. Zur Verringerung der Abtastzeit unter gleichzeitiger Beibehaltung der hohen Auflösung bei einer solchen Probe besitzt erfindungsgemäß die Lichtabtastvorrichtung eine Aufteilungsvorrichtung (110) zur Aufteilung des einzigen Lichtstrahlbündels in wenigstens zwei Lichtstrahlenbündel (22, 23). Dadurch wird anstelle der bisherigen sequentiellen Abtastung der Probe eine Unterteilung in Felder durchgeführt, die simultan durch die mehreren Lichtstrahlen abgetastet werden. Damit läßt sich entsprechend der Anzahl der simultan abgetasteten Felder der Probe die Abtastzeit verringern.

Description

Lichtabtastvorrichtung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Lichtabtastvorrichtung zur Anregung und Detektion einer Emission von Sekundärlicht, insbesondere von Fluoreszenzlicht, von einer Probe mit einer Lichterzeugungsvorrichtung zur Erzeugung von Abtastlicht in Form eines einzigen Lichtstrahlenbündels, einer Ablenkeinheit zur in wenigstens einer Richtung veränderbaren Ablenkung des Abtastlichts zur Abtastung wenigstens einer Teilfläche der Probe, einer Abbildungseinheit zur Abbildung von von der Probe ausgehendem Sekundärlicht und einer Nachweiseinheit zur Detektion des Sekundärlichts.
Lichtabtastvorrichtungen der zuvor genannten Art werden beispielsweise zur ortsaufgelösten Fluoreszenzuntersuchung einer Probe verwendet. Dabei wird in der genannten Vorrichtung zur Erzeugung des Abtastlichts in Form eines einzigen Strahlenbündels, bei der es sich zumeist um einen Laser handelt, ein engbegrenztes und auf die Probe fo- kussiertes Strahlenbündel erzeugt, das mittels einer Ablenkvorrichtung, z.B. in Form von Kippspiegeln mit zwei zueinander senkrecht stehenden Kipp- bzw. Drehachsen im optischen Weg des Lichtstrahlenbündels, über die Probe gerastert wird. Das Abtastlicht regt auf der Oberfläche einer Probe die Erzeugung von Sekundärlicht an, z.B. in der Form von Fluoreszenzlicht. Dieses Sekundärlicht wird über eine Abbildungsoptik gesammelt und auf einer Nachweiseinheit detektiert. Da die Ablenkeinheit in Abhängigkeit von der Stellung der Kippspiegel zueinander und relativ zur Probe auf genau definierbare Weise jeweils einen bestimmten Fleck auf der Probe bestrahlt, kann mittels der Nachweiseinheit, die die Intensität des Sekundärlichts erfaßt, eine ortsabhängige Aussage über die entsprechende Eigenschaft der Probe getroffen werden.
Die Abtastzeit für die Vermessung der gesamten Probe hängt von verschiedenen Parametern ab, wie der Größe des Bildfeldes auf der Probe, des Abtastinkrements, der Fleckgröße des Abtaststrahls auf der Probe, der Integrationszeit der Nachweiseinheit, der Abtastgeschwindigkeit bzw. Spiegelgeschwindigkeit der Ablenkeinheit und dem gewünschten Signal-zu-Rauschverhältnis. Bei Proben mit Abmessungen im Zeπtimeterbe- reich und hoher Ortsauflösung mit einem auf wenige Mikrometer fokussierten Abtaststrahlenbündel ergeben sich Abtastzeiten im Minuten- bis Stundenbereich. Derart lange Abtastzeiten stellen jedoch ein großes Problem beim Betrieb solcher Lichtabtastvorrichtungen dar.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Lichtabtastvorrichtung zur Abtastung einer Probe und zum Nachweis von durch das Abtastlicht angeregter Sekundärstrahlung zu schaffen, mit der eine schnellere und effizientere Abtastung einer großen Probe unter hoher Ortsauflösung erzielbar ist.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch eine Lichtabtastvorrichtung der eingangs genannten Art, die sich dadurch auszeichnet, daß eine Aufteilungsvorrichtung vorgesehen ist zur Aufteilung des einzigen Lichtstrahlenbündels in wenigstens zwei Lichtstrahlenbündel. Durch die Aufteilung des einzigen Lichtstrahlenbündels in wenigstens zwei Lichtstrahlenbündel wird die gesamte Fläche der Probe nicht mehr wie bisher sequentiell abgetastet, sondern es werden wenigstens zwei Gebiete der Probe durch die wenigstens zwei Abtaststrahlenbündel simultan abgerastert. Dadurch kann bei gleicher Ortsauflösung die Abtastzeit im wesentlichen halbiert werden.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung umfaßt die Aufteilungsvorrichtung wenigstens einen, besser jedoch zwei keilförmige Doppelspiegel, insbesondere Strahlteiler mit jeweils einer ersten und zweiten Fläche, an denen ein einziges einlaufendes Strahlenbündel unter Bildung von zwei Strahlenbündeln reflektiert wird, die unter einem dem Keilwinkel des Strahlteilers entsprechenden Winkel zueinander stehen. Bei der bevorzugten Verwendung von zwei Doppelspiegeln werden aus dem anfänglichen einzigen Strahlenbündel vier Strahlenbündel erzeugt. Durch die Aufteilung des einlaufenden Strahlenbündels in vier Strahlenbündel findet eine Unterteilung der Probe in vier Quadranten statt, wodurch die Abtastzeit im wesentlichen auf ein Viertel der entsprechenden Abtastzeit bei Verwendung eines einzigen Strahlenbündels verringert werden kann. Vorteilhafterweise sind die beiden keilförmigen Doppelspiegel oder Strahlteiler Teil der Ablenkeinheit und stellen die jeweiligen Kippspiegel mit zueinander senkrecht stehenden Drehachsen dieser Einheit, die mit entsprechenden Stellgliedern gekoppelt sind, dar.
In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist ein fokussierendes Objektiv zwischen der Ablenkeinheit und der Probe vorgesehen. Es ist insbesondere vorteil- haft, ein F/Θ-Objektiv zu verwenden, das die Lichtstrahlenbündel unabhängig von der Ablage, d.h. dem Abstand von der optischen Achse, scharf fokussiert. Diese Art der Anordnung des fokussierenden Objektivs zwischen der Ablenkeinheit und der Probe wird als "Pre-Objective-Scanning" bezeichnet.
In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung besteht die Nachweiseinheit aus einem ortsauflösenden Detektorarray, wie z.B. einer CCD-Kamera oder einem Mehrkanalmul- tiplier oder einem Mehrkanalhalbleiterelement. Zur Verminderung unerwünschten Übersprechens der einzelnen Kanäle, die den von den einzelnen Lichtstrahlenbündeln abgetasteten Bereichen auf der Probe entsprechen, kann eine spezielle, an die jeweils abgetasteten Probenbereiche angepaßte Blende vor dem Detektor vorgesehen werden.
Bei Messung in transmittiver Anordnung ist es vorteilhaft, hinter der Probe möglichst die gesamte Fläche mit Lichtleitern zu versehen, wobei die einem jeden Abtastgebiet der Probe zugeordneten Lichtleiter zu einem Bündel zusammengefaßt sind und einer entsprechenden Detektorfläche oder einem eigenen Detektor zugeleitet werden. Beispielsweise werden bei einer Unterteilung der Probe in vier Quadranten die Lichtleiter in vier Bündel zusammengefaßt und auf vier verschiedene Detektoren geleitet, so daß die vier Quadranten gleichzeitig vermessen werden können. Dabei ist es möglich, Farbfilter vor den Detektoren anzuordnen, um einerseits das Anregungslicht zu unterdrücken und andererseits eine Selektion des Sekundärlichts durchzuführen. Die numerische Apertur der Lichtleiter beschränkt das Gesichtsfeld der Sekundärlichtemission und verhindert somit ein Kanalübersprechen. Falls die Probe aus gleichartigen Fluoreszenzfarbstoffen besteht, kann jeder der einem Abtastfeld der Probe zugeordneten Detektoren mit einem anderen Farbfilter ausgestattet werden, so daß z.B. bei Verwendung von vier Detektoren vier verschiedene Emissionswellenlängen gleichzeitig gemessen werden können.
Anstelle der Verwendung von verschiedenen, über Lichtleiterbündel mit der Probe gekoppelten Detektoren wäre es in einer weiteren Weiterbildung der Erfindung auch möglich, eine CCD-Kamera hinter der Probe bei transmittiver Anordnung anzuordnen. Um ein Mischen des Fluoreszenzlichts aller Kanäle in der Kamera zu verhindern, wird eine Platte aus Lichtleitfasern mit geringer numerischer Apertur vor die Kamera gestellt. Damit läßt sich ein Kanalübersprechen wirksam verhindern.
In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung der erfindungsgemäßen Lichtabtastvorrichtung ist ein Aufbau vorgesehen zur Erfassung des Sekundärlichts in reflektiver nichtkon- fokaler Anordnung. Zur Schaffung der nichtkoπfokalen Anordnung, d.h. einer Ausbildung des Strahlengangs des Sekundärlichts derart, daß die Spiegel der Ablenkeinheit in dessen Strahlengang nicht enthalten sind, ist vorteilhafterweise ein dichroitischer Strahlteiler zwischen der Ablenkeinheit und der Probe vorgesehen, mit dem der optische Weg des Abtastlichts vom optischen Weg des von der Probe ausgehenden Sekundärlichts separierbar ist. Insbesondere ist der dichroitische Strahlteiler für das Anregungslicht mit einer ersten kürzeren Wellenlänge durchlässig, während er das Sekundärlicht mit einer längeren Wellenlänge reflektiert.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen gehen aus den Unteransprüchen hervor.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung beispielhaft anhand einer bevorzugten Ausführungsform unter Bezug auf die begleitenden Zeichnungen näher erläutert und beschrieben. In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 eine Skizze zur Veranschaulichung des prinzipiellen Aufbaus und des Strahlengangs einer erfindungsgemäßen Lichtabtastvorrichtung;
Fig. 2 ein Beispiel für eine Aufteilungsvorrichtung in Form einer keilförmigen Strahlteilerplatte mit dem entsprechenden Strahlengang;
Fig. 3 eine Skizze zur Veranschaulichung der verschiedenen Detektionskanäle in einer erfiπdungsgemäßen Lichtabtastvorrichtung; und
Fig. 4 eine Skizze zur Veranschaulichung der Unterteilung einer Probe in vier Quadranten. In Fig. 1 wird beispielhaft ein schematischer Aufbau einer erfindungsgemäßen Lichtabtastvorrichtung gezeigt. In einer Lichterzeugungsvorrichtung 20, z.B. einem Laser, wird ein einziges Lichtstrahlenbündel 21 bestimmter Wellenlänge erzeugt. Das von der Lichterzeugungsvorrichtung bzw. dem Laser erzeugte Lichtstrahlenbündel wird vorteilhafterweise in einem nicht gezeigten Raumfilter räumlich gefiltert. Das parallele Strahlenbündel wird durch eine beispielsweise zwei Linsen 22 und 24 umfassende Aufweitungsoptik in ein wiederum paralleles Strahlenbündel mit größerem Querschnitt aufgeweitet. Als nächstes Element im optischen Weg folgt eine Ablenkeinheit 10 mit Kippspiegeln 11 und 12, die zueinander senkrecht stehende Drehachsen aufweisen und an nicht gezeigte Stellglieder mit entsprechenden Ansteuerungen zur gegenseitigen Verstellung bzw. Verkippung angeschlossen sind, um das Strahlenbündel 21 in zwei Richtungen zu ra- stern. Wie nachfolgend in bezug auf Fig. 2 näher erläutert wird, bestehen in einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung die Kippspiegel 11 und 12 jeweils aus keilförmigen Doppelspiegeln oder Strahlteilerplatten, die somit eine Aufteilungsvorrichtung zur Aufteilung des einzigen einlaufenden Laserstrahlbündel in insgesamt vier voneinander getrennte Laserstrahlenbündel bilden. Aus Gründen der übersichtlicheren Darstellung sind in Fig. 1 nur zwei Strahlenbündel 22 und 23 gezeigt.
Zwischen der Ablenkeinheit 10 mit den Kippspiegeln 11 und 12 ist eine Fokussierungs- optik angeordnet, die beispielsweise ein Linsentriplett aus Linsen 26, 28 und 30 umfaßt. Bei dieser Fokussierungsoptik handelt es sich vorteilhafterweise um ein F/Θ-Objektiv, das die Strahlenbündel unabhängig von der Ablage scharf auf Fleckgrößen im Mikrometerbereich auf eine Probe 40 fokussiert. Bei dem F/Θ-Objektiv wird eine Abbildung der Abtaststrahlenbündel gemäß der sog. F/Θ-Bedingung y' = Fxθ durchgeführt, wobei y' die Abbildungskoordinate, F die Brennweite und θ der Winkel ist, den das Abtaststrahlenbündel mit der optischen Achse einschließt. Im Gegensatz zu herkömmlichen Objektiven, bei denen die sonst übliche Bedingung y' = F x tanθ gilt, führt das F/Θ-Objektiv zu einer tonnenförmigen Verzeichnung. Dadurch wird jedoch eine Proportionalität zwischen dem Abtastwinkel und der Bildhöhe y' und zugleich auch eine Proportionalität zwischen der Winkelgeschwindigkeit des Ablenksystems und der Abtastgeschwindigkeit in der Probenebene sichergestellt. Bei konstanter Winkelgeschwindigkeit für die Ablenkung des Strahleπbündels wird somit aufgrund der Linearität zwischen der Abtastgeschwindigkeit auf der Probe und der Winkelgeschwindigkeit eine konstante Anregungsintensität auf der Probe unabhängig von der Abtastposition geschaffen.
Diese Art der Anordnung der Fokussierungsoptik zwischen der Ablenkeinheit 10 mit den Kippspiegeln 11 und 12 und der Probe 40 wird als "Pre-Objective-Scanniπg" bezeichnet. Dies wird häufiger angewandt als ein "Post-Objective-Scanning", bei dem die Fokussierungsoptik im optischen Weg vor der Ablenkeinheit 10 angeordnet ist, so daß das nach der Fokussierungsoptik konvergente Abtastlicht über die Abtastspiegel abgelenkt und auf die Probe 40 geleitet wird. Bei dieser Art der Anordnung der Fokussierungsoptik vor der Ablenkeinheit 10 werden an das Objektiv nur minimale Forderungen gestellt. Es kann einen kleinen Durchmesser haben und braucht nur im paraxialen Gebiet scharf abzubilden. Die hinter dem Objektiv angeordnete Ablenkeinheit führt jedoch zu einer gekrümmten Abtastlinie, die auf einem Kreisbogen um die Drehachse des Kippspiegels liegt. Zum Abtasten ebener Oberflächen ist daher diese Anordnung des "Post-Objective- Scanning" nicht bevorzugt.
Daher ist die "Pre-Objective-Scanning"-Anordnung mit einem F/Θ-Objektiv, mit dem eine Abbildung in eine Ebene mit einer zum Ablenkwinkel proportionalen Bildkoordinate möglich ist, vorteilhaft. Das F/Θ-Objektiv in der "Pre-Objective-Scanning"-Anordnung muß jedoch einen relativ großen Durchmesser aufweisen, um auch Abtaststrahlenbündel mit großem Abtastwinkel noch aufzunehmen. Es muß auch über einen relativ großen Bildwinkel entsprechend der Verkippung des Lichtstrahlenbündels gegenüber der optischen Achse korrigiert sein und es muß ferner eine gute Bildfeldebnung aufweisen.
Zwischen der Fokussierungsoptik und der Probe 40 ist ein dichroitischer Spiegel 32 angeordnet, der das Anregungslicht mit der bestimmten Wellenlänge durchläßt und das auf oder von der Probe 40 erzeugte Sekundärlicht, das eine zum Anregungslicht unterschiedliche, d.h. längere, Wellenlänge aufweist, reflektiert. In der Reflexionsrichtung des dichroitischen Spiegels 32 ist nachfolgend eine Sammeloptik 34 und ein Detektor 50 angeordnet. Die in Fig. 1 gezeigte Anordnung stellt den Fall der Messung des Sekundärlichts in re- flektiver, nichtkonfokaler Anordnung dar. Die nichtkonfokale Anordnung besitzt den Vorteil, daß ein größerer Raumwinkel für das von der Probe emittierte Sekundärlicht als bei konfokaler Abbildung aufgenommen werden kann.
Trotzdem wäre im Gegensatz dazu auch eine konfokale Anordnung (in Fig. 1 nicht gezeigt) möglich, bei der das von der Probe emittierte Sekundärlicht über die gleichen Kippspiegel 11 und 12 zurückgeleitet wird, so daß der exakt gleiche Strahlengang wie für das Abtastlicht rückwärts durchlaufen wird. Der dichroitische Spiegel wäre in dieser Anordnung zwischen der Lichtquelle 20 und der Ablenkeinheit 10 vorgesehen, um die optischen Wege des Anregungslichts und des wellenlängenverschobenen Sekundärlichts zu trennen. Durch zusätzliche Fokussierung des Sekundärlichts auf eine (nicht gezeigte) Lochblende, z.B. mit einem Loch im Mikrometerbereich, könnte unerwünschtes Streulicht weitgehend unterdrückt werden. Bei der konfokalen Anordnung wird jedoch nur ein sehr kleiner Raumwinkel des Sekundärlichts, der durch die Spiegelaperturen begrenzt ist, erfaßt, wenn gleichzeitig ein größeres Gesichtsfeld abgetastet werden soll.
Im Gegensatz zu der in Fig. 1 gezeigten Anordnung wäre es auch möglich, anstatt der reflektiven Anordnung in transmittiver Anordnung zu messen. Bei der transmittiven Anordnung muß das Abtast- bzw. Anregungslicht mit Hilfe von (nicht gezeigten) Filtern (z.B. Notch-Filtem bzw. Kantenfiltern) geblockt werden, die ihrerseits Licht auf die Probe reflektieren und somit eine Verschmierung des Anregungslichtflecks auf der Probe bewirken. Aus diesem Grund ist die in Fig. 1 gezeigte Reflexionsanordnung gegenüber der transmittiven Anordnung vorteilhaft.
In Fig. 2 ist ein Beispiel für eine erfindungsgemäße Realisierung der Aufteilungsvorrichtung zur Aufteilung des einzigen Lichtstrahlenbündels in wenigstens zwei Lichtstrahlenbündel gezeigt. Die Aufteilungsvorrichtung besteht dabei aus einer keilförmigen Strahlteilerplatte 110, an deren erster Oberfläche 112 und zweiter Oberfläche 114 die Lichtstrahlen eines einfallenden Lichtstrahlenbündels 116 jeweils reflektiert werden zur Erzeugung zweier Lichtstrahlenbündel 118 und 119. Vorteilhafterweise ist der in Fig. 1 gezeigte Kippspiegel 12 in der Form der in Fig. 2 gezeigten keilförmigen Strahlteilerplatte 110 ausgebildet. Insbesondere ist es günstig, beide Kippspiegel 11 und 12 der Ablenkeinheit 10 in Fig. 1 jeweils durch eine wie in Fig. 2 gezeigte Strahlteilerplatte 110 auszubilden, wodurch eine Aufteilung des einzigen einfallenden Lichtstrahlenbündels in vier Licht- strahleπbündel erfolgt. In diesem Fall wird die Probe 40 wie in Fig. 4 gezeigt in vier Quadranten 43, 44, 45 und 46 unterteilt. Die Fläche eines jeden Quadranten der Probe wird jeweils von einem der vier Strahlenbündel des Abtastlichts bei entsprechender Verstellung der Kippspiegel abgetastet. Bei einer abgetasteten Probe mit einer makroskopischen Abmessung von etwa 24 x 24 mm wird daher die Zeitdauer für eine vollständige Abtastung der Probe auf ein Viertel der bisher notwendigen Zeit verringert. Daher ist es möglich, weiterhin unter vertretbaren Zeiten für die Abtastung einer großen Probe die Strahlenbündel des Abtastlichts stärker als bisher zu fokussieren zur Erhöhung der Ortsauflösung bei der Abtastung.
Wenn der Abtastlichtstrahl auf einen Punkt fokussiert wird, kann Streulicht auch Nachbarmoleküle erreichen, deren Sekundärlicht bei nichtkonfokaler Abbildung mitgemessen wird und der momentanen Position der Kippspiegel der Abtasteinheit zugeordnet wird. Ein nicht konfokaler Aufbau könnte trotzdem noch vorteilhaft sein, da bei einem konfokalen Ausbau das Signal wesentlich kleiner ist aufgrund des geringeren Raumwinkels. Zudem wird die zuvor genannte Schwierigkeit in bezug auf das Streulicht durch die erfindungsgemäße Anordnung vermindert, da eine Erhöhung der Auflösung, d.h. eine stärkere Fokussierung des Abtaststrahls ohne das Auftreten eines erhöhten Zeitaufwands bei der Abtastung der Probe, möglich ist.
Ein weiterer Vorteil der beschriebenen Ausführungsform besteht darin, daß durch die Aufteilung des Abtastlichtstrahlenbündels in vier Lichtstrahlenbündel und eine entsprechende Aufteilung der Probe in vier Quadranten jedes der Abtastlichtstrahlenbündel jeweils nur eine kleinere Fläche überdecken muß. Damit sind nur geringere Auslenkungen der Kippspiegel 11 und 12 erforderlich, die mit geringeren Fehlern bzw. Toleranzen realisierbar sind. Die Kippbewegung der Kippspiegel wird dabei so angepaßt, daß die in Fig. 4 gezeigten Quadranten 43-46 jeweils vollständig durch die entsprechenden Teilstrahlenbündel überstrichen werden.
Vorteilhafterweise ist der Keilwinkel der Strahlteilerplatten so groß, daß der makroskopische Abstand der einzelnen Strahlenbündel auf der Probe groß ist gegenüber der mittleren Streulänge innerhalb der Probe. Bei dem Beispiel einer Probe mit 24 x 24 mm Fläche ist dieser Abstand optimalerweise 12 mm.
In Fig. 4 ist schematisch der prinzipielle Aufbau der verschiedenen Detektionskanäle gezeigt. An der Probe 40 wird an zwei Stellen durch Strahlenbündel 61 und 62 dargestelltes Sekundärlicht erzeugt. Dieses Licht wird am dichroitischen Spiegel 32 wie zuvor erwähnt reflektiert und durch ein beispielsweise aus drei Linsen 35, 36 und 37 bestehendes Makroobjektiv auf den Detektor 50 fokussiert. Jeder Punkt der Probenebene entspricht dabei eindeutig einem Punkt in der Detektorebene. Bei dem Detektor handelt es sich vorteilhafterweise um eine CCD-Kamera oder einen Mehrkanalfotomultiplier, z.B. das Modell R5900U-00-M4 von Hamamatsu, oder ein Mehrkanalhalbleiterelement. Derartige Detektoren sind zur simultanen Erfassung mehrerer Kanäle geeignet. Die jeweiligen Abtastfelder der Probe (z.B. vier Quadranten) werden entsprechend auf die Detektorebene abgebildet. Zur Unterdrückung eines unerwünschten Übersprechens der Kanäle kann eine spezielle, an die Unterteilung der Probe angepaßte Blende 52 vor dem Detektor vorgesehen sein. Für die zuvor erwähnte Ausführungsform mit vier Abtaststrahlenbündeln besitzt die Blende 52 eine entsprechende Unterteilung in vier Quadranten.
Im Gegensatz zu der in der Fig. 1 und 3 gezeigten Anordnung zur Messung des Sekundärlichts in Reflexion ist es auch möglich, in transmittiver Anordnung zu messen. Dabei wird z.B. hinter der Probe die gesamte Fläche mit Lichtleitern versehen, wobei jeder Quadrant zusammengefaßt wird zu einem Bündel. Es werden dann vier Bündel auf vier verschiedene Detektoren geleitet, die gleichzeitig vermessen werden können. Zur Unterdrückung des Anregungslichts und zur Selektion des Sekundärlichts können spezielle Filter vor den Detektoren vorgesehen werden. Die numerische Apertur der Lichtleiter beschränkt das Gesichtsfeld der Sekundärlichtemission und verhindert somit ein Kanalübersprechen. Falls die Probe aus gleichartigen Fluoreszenzfarbstoffen besteht, kann jeder der einem Quadranten zugeordneten Detektoren mit einem anderen Farbfilter ausgestattet werden, so daß bis zu vier verschiedene Emissionswellenlängen gleichzeitig gemessen werden können. Alternativ dazu ist es möglich, einfach eine CCD-Kamera hinter der Probe vorzusehen. Diese Kamera würde jedoch das Fluoreszenzlicht aller vier Kanäle mischen. Dies wird verhindert, indem man eine Platte (sog. Face-Platte) aus Lichtleitfasern mit geringer numerischer Apertur vor die Kamera stellt, um das Kanalübersprechen zu unterdrücken.

Claims

Patentansprüche
1. Lichtabtastvorrichtung zur Anregung und Detektion einer Emission von Sekundärlicht, insbesondere von Fluoreszenzlicht, an einer Probe (40) mit
einer Lichterzeugungsvorrichtung (20) zur Erzeugung von Abtastlicht in Form eines einzigen Lichtstrahlenbündels (21),
einer Abienkeinheit (10) zur in wenigstens einer Richtung veränderbaren Ablenkung des Abtastlichts zur Abtastung wenigstens einer Teilfläche der Probe (40),
einer Abbildungseinheit (34; 35, 36, 37)zur Abbildung von von der Probe ausgehendem Sekundärlicht (61 , 62), und
einer Nachweiseinheit (50) zur Detektion des Sekundärlichts,
dadurch gekennzeichnet,
daß eine Aufteilungsvorrichtung (110) im optischen Weg des Abtastlichts vorgesehen ist zur Aufteilung des einzigen Lichtstrahlenbündels in wenigstens zwei Lichtstrahlenbündel (22, 23; 118, 119).
2. Lichtabtastvorrichtung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Aufteilungsvorrichtung (110) ein keilförmiger Doppelspiegel mit einen Winkel miteinander bildenden ersten und zweiten Spiegelflächen (112, 114) ist, an denen das einzige Lichtstrahlenbündel (116) unter Bildung von zwei den gleichen Winkel miteinander einschließenden Lichtstrahlenbündeln (118, 119) reflektiert wird.
3. Lichtabtastvorrichtung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufteilungsvorrichtung zwei derart angeordnete, keilförmige Doppelspiegel (110) umfaßt, daß an dem ersten keilförmigen Doppelspiegel das einzige Lichtstrahlenbündel unter Bildung von zwei Lichtstrahlenbündeln reflektiert wird, die auf den zweiten keil- förmigen Doppelspiegel treffen und an diesem unter Bildung von vier Lichtstrahlenbündeln reflektiert werden.
4. Lichtabtastvorrichtung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden keilförmigen Doppelspiegel Teil der Ablenkeinheit (10) sind und mit Stellvorrichtungen zur Drehung und/oder Verschiebung der jeweiligen Doppelspiegel zur Abtastung der Probe verbunden sind.
5. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fokussierungsoptik (26, 28, 30) zwischen der Aufteilungsvorrichtung und der Probe zur Fokussierung aller Lichtstrahlenbündel auf die Probe vorgesehen ist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Fokussierungsoptik ein F/Θ-Objektiv umfaßt.
7. Lichtabtastvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nachweiseinheit (50) zur ortsaufgelösten Detektion des Sekundärlichts geeignet ausgebildet ist.
8. Lichtabtastvorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die
Nachweiseinheit(50) entsprechend der Zahl der auf die Probe auftreffenden Abtastlichtstrahlenbündel in Felder unterteilt ist.
9. Lichtabtastvorrichtung gemäß Anspruch 8, wobei eine entsprechend der Felder der Nachweiseinheit unterteilte Blende (52) vor der Nachweiseinheit angeordnet ist.
10. Lichtabtastvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Abbildungseinheit (34; 35, 36, 37) zur Aufnahme von durch die Probe (40) transmittiertem Sekundärlicht geeignet angeordnet ist.
11. Lichtabtastvorrichtung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß auf der der Einfallsseite des Abtastlichts gegenüberliegenden Seite der Probe (40) zu ei- nem Bündel zusammengefaßte Lichtleiter vorgesehen sind, die entsprechend den jeweiligen Abtastgebieten der auf die Probe auftreffenden Abtastlichtstrahlenbündel an ihrem detektorseitigen Ende in Teilbündel aufgeteilt sind, denen jeweils eigene Detektoren zugeordnet sind.
12. Lichtabtastvorrichtung gemäß Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Teilbündeln aus Lichtleitern und den jeweiligen Detektoren jeweils ein Wellenlängenfilter vorgesehen ist.
13. Lichtabtastvorrichtung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlängenfilter Farbfilter für jeweils unterschiedliche Wellenlängen des Sekundärlichts sind.
14. Lichtabtastvorrichtung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Abbildungseinheit eine Platte aus Lichtleitfasern mit geringer numerischer Apertur umfaßt und daß die Nachweiseinheit (50) eine CCD-Kamera umfaßt.
15. Lichtabtastvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Aufbau zur Erfassung des Sekundärlichts in reflektiver, nichtkonfokaler Anordnung vorgesehen ist.
16. Vorrichtung gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Abbildungseinheit einen dichroitischen Strahlteiler (32) umfaßt, mit dem der optische Weg des Abtastlichts von dem des von der Probe ausgehenden Sekundärlichts separierbar ist.
17. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichterzeugungsvorrichtung (20) zur Erzeugung des Abtastlichts in Form eines einzigen Lichtstrahls einen Laser umfaßt.
18. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichterzeugungsvorrichtung zur Erzeugung des Lichtstrahls eine Vorrichtung zur räumlichen Filterung des einzigen Lichtstrahls umfaßt.
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