WO1998012351A1 - Method for purifying and eventually analyzing nucleic acids from biological test samples - Google Patents

Method for purifying and eventually analyzing nucleic acids from biological test samples Download PDF

Info

Publication number
WO1998012351A1
WO1998012351A1 PCT/EP1997/005129 EP9705129W WO9812351A1 WO 1998012351 A1 WO1998012351 A1 WO 1998012351A1 EP 9705129 W EP9705129 W EP 9705129W WO 9812351 A1 WO9812351 A1 WO 9812351A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
dna
synthetic resin
resin
subsequent
Prior art date
Application number
PCT/EP1997/005129
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
W. Kurt Roth
Dorothee Waschk
Stefan Zeuzem
Original Assignee
Roth W Kurt
Dorothee Waschk
Stefan Zeuzem
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19638362A external-priority patent/DE19638362C1/en
Priority claimed from DE19731670A external-priority patent/DE19731670C2/en
Application filed by Roth W Kurt, Dorothee Waschk, Stefan Zeuzem filed Critical Roth W Kurt
Priority to AU47754/97A priority Critical patent/AU4775497A/en
Publication of WO1998012351A1 publication Critical patent/WO1998012351A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a method for the purification and optionally analysis of nucleic acids from biological samples.
  • DNA in particular serves as the starting material for genetic analyzes in laboratory diagnostic research and in routine use.
  • nucleic acids such as DNA and RNA
  • biological samples in particular from samples of the human body, such as blood, body secretions, tissue samples, urine, stool and the like. the like
  • samples of the human body such as blood, body secretions, tissue samples, urine, stool and the like. the like.
  • the subsequent use in genetic analyzes is of particular importance, especially with regard to screening in tumor diagnosis and for the diagnosis of infectious agents such as viruses or bacteria.
  • the analysis of DNA which comes from exfoliated intestinal epithelial cells from stool samples, is of particular interest for the diagnosis of colorectal tumors. Isolation of the nucleic acid from whole blood is also of great interest in order to make the isolated nucleic acid available for genetic analysis.
  • the resulting DNA should be in high purity and be able to be subjected directly to the required subsequent reactions.
  • Nucleic acid diagnostics using DNA-a-amplification approaches in particular the polymerase chain reaction (polymerase chain reaction, hereinafter abbreviated to PCR) (see elfaiki, R. r Gelfand, DH, Stoffel, S., Scharf, SJ, Higuchi, R., Hörn, GT, Mullis, KB, Erlich, HA (1988), Science 239: 487-491), opens up diverse approaches to specific and at the same time sensitive DNA diagnostics, for example of tumors in the early stages that are not stressful and for screening are well suited. Due to the often small amount of DNA that can be isolated from a defined biological sample, such as stool samples, DNA amplification approaches such as the PCR technique seem to be a suitable method for the duplication of the DNA of interest.
  • the main difficulties are inhibitors which are isolated together with the nucleic acid of the biological sample when using conventional extraction methods and which inhibit the enzymes to be used in the nucleic acid amplification batches. It has been found that the DNA polymerase required for the PCR is inhibited. Stool samples and whole blood, in particular, are critical biological starting samples since they contain relatively large amounts of inhibitors.
  • the nucleic acid (DNA, RNA) resulting from the purification and isolation should be present in high purity and should be able to be subjected directly to the necessary subsequent reactions. The inhibitors must therefore be separated efficiently and selectively.
  • the DNA is usually isolated from cells. Cells are disrupted, for example, under strongly denaturing and possibly reducing conditions. The disruption of the cells with denaturing substances, e.g.
  • the DNA obtained by such a method e.g. from exfoliated intestinal epithelial cells from stool samples is only suitable to a limited extent for use in the subsequent subsequent reactions, in particular enzymatic amplification reactions such as PCR.
  • PCR enzymatic amplification reactions
  • Recent data show that only 103 cases out of a total of 230 extracted stool samples (efficiency of 44.7%) can be amplified using PCR (Villa, E., Dugani, A., Rebecchi, AM, Vignoli, A., Grottola, A., Buttafoco, P., Losi, L., Perini, M., Trande, P., Merighi, A., Lerose, R. and Manenti, F. (1996), Gastroenterology: 110: 1346-1353 ).
  • Intestinal epithelial cells are lysed and extracted with a buffer containing adsorbent (potato flour or potato starch or bovine serum albumin).
  • adsorbent potato flour or potato starch or bovine serum albumin.
  • the DNA-containing solution is used to break down proteins, for example nucleic acid-cleaving enzymes the proteinase K incubated.
  • the shortening of this process is due to the fact that the phenol extraction and subsequent ethanol precipitation are replaced by the use of centrifugation columns (QIAa p spin columns, QIAGEN GmbH). While the DNA reversibly attached to one
  • Binds silica membrane in the column disruptive compounds are pressed through the use of a suitable washing buffer due to the action of centrifugal forces and thus cleaned.
  • a suitable buffer By adding a suitable buffer, the purified DNA is eluted from the column as a result of a centrifugation step.
  • the object underlying the invention is therefore to provide an improved method for purifying or isolating nucleic acids (DNA, RNA and the like) from unpurified biological samples such as whole blood or stool samples; the nucleic acid should be present in sufficient quantity and purity so that it can be subjected to the necessary subsequent reactions.
  • the efficiency for a subsequent nucleic acid analysis reaction, in particular for amplification approaches such as PCR, is to be increased.
  • This object is achieved by a method for purification, optionally also analysis of nucleic acids from biological samples, the method comprising the step of reacting the nucleic acid-containing sample with an anion exchanger synthetic resin which has a binding affinity for
  • a characteristic of the present invention is the use of a bile acid binding anion exchange resin.
  • the binding affinity of the anion exchanger synthetic resin for bile acids which is preferably high, is a measure of the fact that the inhibitors for the nucleic acid analysis reaction which may have to be subsequently carried out, for example in the PCR reaction, are efficiently bound and thus separated while nucleic acids are not or are bound less and can therefore be easily recovered.
  • Another surprising result of the present invention is the very good selectivity of the anion exchange resin, which has the affinity for bile acids, for binding the inhibitors compared to binding the nucleic acid, which are not bound or are bound less in the presence of the inhibitors.
  • the nucleic acid is made available in high purity by the method according to the invention, typically in an A 2 6o / A 2e o ratio obtained via the absorption values at 260 nm and 280 nm of more than 1.5, in particular of more than 1.7.
  • the method according to the invention ensures adequate cleaning of inhibitors for any subsequent nucleic acid detection reactions while at the same time maintaining a sufficiently high nucleic acid concentration.
  • the binding affinity for bile acids characteristic of the synthetic resin used according to the invention, where typical bile acids such as cholic acid are suitable, is suitably in the range of an average binding capacity, as determined, for example, of cholic acid, of at least 0.1 equivalents of cholic acid per kg of dry synthetic resin (eq / kg).
  • the average binding capacity is preferably at least 0.5, more preferably at least 1.0 and in particular at least 2.0 equivalents of cholic acid per kg of dry synthetic resin.
  • the binding capacity to bile acids can be determined by reacting a defined amount of dry synthetic resin (50 g) with an appropriately concentrated bile acid solution (1% by weight aqueous solution of cholic acid) under suitable conditions with regard to pH and ionic strength (e.g. pH 6 , 3 at 0.9% by weight NaCl concentration). Cholic acid can be easily quantified (see for example JLIrvin et al. In "J.Biol.Chem.”, 153, 439 (1944)).
  • the total chloride exchange capacity of the synthetic resin used according to the invention is preferably more than 4 eg / kg. However, it must be taken into account that the total number of active, available anion exchange sites is not the actually decisive criterion for the effective binding of the inhibitors.
  • the characteristic underlying the nature of the bile acid-binding synthetic resin plays a further specific role here.
  • the quality of the binding or separation of the inhibitors can be determined indirectly by determining the efficiency of a subsequent nucleic acid analysis reaction.
  • a binding or separation of the inhibitors is achieved when an increase in efficiency can be determined in the subsequent nucleic acid analysis reaction, the efficiency before the cleaning according to the invention, in particular in the case of inhibitors heavily contaminated samples, may be zero.
  • the efficiency due to the different quantity and heterogeneity of the inhibitors depending on the biological sample, it can be assumed that the same biological sample was examined.
  • the efficiency is defined as the percentage of the specific PCR products to be determined in a PCR analysis approach, a simple PCR reaction, but advantageously using carrier protein, is carried out, for example according to the examples below.
  • the anion exchange resin used according to the invention binds the inhibitors from the biological starting material more selectively and more effective, so that the subsequent nucleic acid analysis reactions yield very high amplification rates even when using a simple PCR. According to the invention, significantly better results are obtained, even when using a smaller amount of anion exchange resin, and furthermore a smaller number of extraction steps are required; one incubation step is usually sufficient.
  • a comparison of conventional DNA purification and isolation methods was recently published by A. Kramvis et al. described in "Journal of Clinical Microbiology", 34, 2731-2733 (1996).
  • the selective separation of the inhibitors that can be achieved with the invention is also achieved with unpurified starting samples.
  • the method according to the invention has proven to be particularly effective in the case of starting samples which have been very problematic to date, e.g. in whole blood that has been treated with citrate and EDTA or the presumably PCR-inhibiting substance heparin, as well as in stool samples that come from the lysis of intestinal epithelial cells that have been exfoliated in stool and that have a high proportion of unknown inhibitors.
  • the advantages of the invention can also be achieved when applied to any other biological samples, for example other samples from the human body, such as body secretions, tissue samples, urine and the like. the like
  • the anion exchanger synthetic resin used according to the invention is a basic, in particular strongly basic polymer material of high molecular weight (for example in
  • 10 • 10 6 in particular 1 to 5 • 10 6 ), which is generally composed of an organic polymer or copolymer modified with tertiary and / or quaternary ammonium groups and whose characteristic feature is the affinity for bile acids described above.
  • the resin polymer is formed in a particularly suitable manner from a polystyrene which is crosslinked by divinylbenzene, preferably in a proportion of 0.5 to 5% by weight and in particular 1-3% by weight of divinylbenzene and in its network structure quaternary .Aitraionium groups, suitably in the form of benzyltrimethylammonium groups, are incorporated.
  • Colestyramine is the international free name for the copolymers of styrene (vinylbenzene) and about 2% divinylbenzene with the quaternary ammonium groups inserted into the network structure.
  • the colestyramine granules are known in the medical-therapeutic field as a highly hydrophilic, water-soluble, basic anion exchange resin for binding bile acids in bile acid loss syndromes and as a lipid-lowering agent for the treatment of hypercholesterolemia.
  • the lipid-lowering agent colestyramine is sold by STADApharm.
  • Crosslinked polyalkylamine anion exchange resins form further examples of a type of synthetic resin which is fundamentally suitable for use in the present invention.
  • the crosslinked polyalkylamine anion exchange resin is generally formed as a copolymer of a poly (lower) alkyl polyamine, for example diethylene triamine or tertaethylene pentamine, with epichlorohydrin (1-chloro-2, 3-epoxypropane).
  • An example of an anion-exchange synthetic resin of this type of polymer, which has a high affinity for bile acids and which has also achieved excellent results when used, is colestipol (average binding capacity of colestypol versus cholic acid 1.1 equivalents per kg resin dry weight) .
  • Colestipol is the international free name for the serum cholesterol-lowering copolymers of diethylene triamine and epichlorohydrin.
  • the Colestipol hydrochloride granules are also known per se as a water-insoluble, basic .anion exchange resin for binding bile acids in bile congestion and hypercholesterolemia (lipid-lowering agents). Colestipol hydrochloride was developed by Upjohn and was launched in 1977.
  • the cleaning efficiency compared to the inhibitors when using colestyramine is further increased compared to colestipol.
  • the polymers which form the synthetic resin also include other polymers and copolymers and the use of substituted representatives of the monomers which form the copolymers, provided that the inhibitors which may be present, in analogy with the ability to bind to bile acids, by increasing the efficiency of the subsequent nucleic acid analysis reaction can be determined and separated.
  • Anion exchange resins contain other additives known per se in conventional amounts, e.g. Superplasticizer.
  • the anion exchange resin also contains suitable salt partners for charge saturation; the tertiary ammonium groups are suitably in the hydrochloride form, while quaternary ammonium groups are suitably associated with chloride.
  • the resin to be used can first be in a suitable dry form, for example in the form of granules, or it can already be in an aqueous form
  • the resin suspension used for the reaction is usually buffered, suitably in the range from slightly acidic (approximately pH 5-6) to weakly basic (approximately pH 9-10).
  • nucleic acid types in particular DNA and RNA, are suitable as nucleic acid. Because of its greater importance, but above all because nucleic acid amplification reactions are usually based on DNA samples (cf. PCR), the invention is further described below, primarily for the purification or isolation of DNA.
  • the cells In the case of biological starting samples in which the nucleic acid to be isolated is present intracellularly, such as stool samples containing exfoliated intestinal epithelial cells, the cells must first be lysed in order to disrupt the intracellular material.
  • the lysis or disruption of the cells can be achieved by a simultaneous physical and chemical action on the sample containing the body cells.
  • the sample material can be frozen (-80 ° C) before lysis.
  • the lysis buffer suitably contains a denaturing agent, for example sodium dodecyl sulfate (SDS) or other detergents, which brings about chemical digestion of the cells, while stirring the suspension, for example with an automatic, mechanical stirring system, favors mechanical digestion.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • a centrifugation step can remove cell debris, undigested food residues or other macro residues.
  • the nucleic acid-containing cell lysate is treated with the special anion-exchange resin used according to the invention.
  • the resin in this case can be suitably pre-swelled in the lysis buffer.
  • the amount of the special synthetic resin used is preferably 10% by weight and less, based on the total weight of the treated sample. Above this amount there may be a tendency that not only the inhibitors but also the desired nucleic acid is increasingly bound to the resin.
  • aqueous, up to 10% by weight, in particular 5 to 10% by weight, suspension of the synthetic resin binds the inhibitors in sufficient quantity and at the same time does not, or only insignificantly, reduce the amount of DNA present in the aqueous solution.
  • the amount of synthetic resin used is inversely related to the frequency of the reaction. That is, with a relatively high salary, in particular with 7.5 to 10% by weight of resin suspension in an aqueous medium, a single reaction is preferable, while in the medium content range, approximately from 2.5 to 7.5% by weight and in particular around 5% by weight ( ⁇ 1 wt.), A two or more times implementation delivers better results.
  • the preferred ratio of resin content to frequency of implementation also depends on the sample material to be examined. For stool samples, a single reaction with 10% by weight or a double reaction with 5% by weight of copolymer resin is particularly suitable. In the case of whole blood, content ranges below 5% by weight are preferred, two reactions with 2.5% by weight of copolymer resin being particularly suitable.
  • the easiest way is to add the resin suspension to the nucleic acid-containing (possibly not pre-cleaned) sample, mix it very well, and then separate it again from the copolymer resin.
  • the latter can be conveniently carried out by centrifuging off the resin granules.
  • the reaction can also be carried out by means of a separation using a chromatography system using the special anion exchange resin.
  • the DNA can be further purified and isolated. It is advantageous to use non-specific proteinases such as Proteinase K to break down proteins and nucleic acid-cleaving enzymes. Then you get a viscous, gelatinous liquid. From this, the DNA is isolated from the aqueous phase, preferably by means of phenol extraction and subsequent ethanol precipitation. Alternatively, the DNA can be removed by using a detergent, for example a chaotropic guanidine-containing detergent (such as DNAzol TM from Gibco BRL), followed by ethanol precipitation from the aqueous phase isolate.
  • a detergent for example a chaotropic guanidine-containing detergent (such as DNAzol TM from Gibco BRL), followed by ethanol precipitation from the aqueous phase isolate.
  • the DNA-containing solution digested with Proteinase K is mixed with the detergent and ethanol and immediately pelleted by a centrifugation step. Since neither organic solvents (phenol, chloroform) are used, nor are several centrifugation steps required for extraction, this process is very user-friendly and time-saving.
  • organic solvents such as phenol or chaotropic detergents for isolating DNA
  • centrifugation columns known for this purpose, for example QIAamp-spin columns TM from Qiagen TM.
  • the quality of the nucleic acid sample required for this is provided by the method according to the invention.
  • the expected .amplicate could even be obtained in up to 100% of the samples tested.
  • the DNA purified or isolated according to the purification method according to the invention is preferably subjected to a PCR which is carried out in the presence of a carrier protein, such as bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the carrier protein concentration is chosen to be high, preferably more than 50 ⁇ g / ml. Very good amplification rates have been found for carrier protein concentrations in the range of 120-200 ⁇ g / ml.
  • relatively high concentrations of nucleotides required for the PCR deoxyribonucleoside
  • Triphosphate Triphosphate
  • primers and DNA polymerases such as Tag DNA polymerase advantageous.
  • the nucleotide concentrations are preferably in the range of 150-225 ⁇ M.
  • primer concentration is in the range from 0.75 to 1.25 ⁇ M.
  • the content of DNA polymerase is suitably in the range of 2 to 3 units per 50 ul batch.
  • the amplification is preferably carried out by a simple PCR in which 30-35 temperature cycles are carried out.
  • 200 mg of stool material is deep-frozen for at least one hour at -80 ° C, then mixed with 600 ⁇ l lysis buffer (500 M Tris, 75 mM EDTA, 10 M NaCl, 1% SDS, pH 9.0) and homogenized.
  • the lysed sample is 10 min. Centrifuged at 4 ° C and 6000 xg in an Eppendorf table centrifuge to remove coarse stool particles, cell debris, bacteria and food residues.
  • the supernatant is a second time at 4 ° C, 20,000 xg 10 min. centrifuged.
  • the DNA-containing supernatant is mixed with the same volume of a colestyramine solution (5% colestyramine in lysis buffer), mixed well, 2 min.
  • the DNA can be pelleted from the aqueous, upper phase by ethanol precipitation, by adding 1/10 volume of 3 M sodium acetate, pH 5.2 and 2.5 times the volume of 100% ethanol.
  • the DNA pellet washed in 75% ethanol and dried at room temperature, is dissolved in 100 ⁇ l of distilled water.
  • the DNA yield is 10-15 ⁇ g per 200 mg stool sample with an A 260/2 eo ratio of 1.7. 5 ⁇ l of this DNA solution are used to amplify defined genes / gene segments in a 50 ⁇ l PCR approach used.
  • the amplification mixture is composed as follows:
  • BSA bovine serum albumin
  • 200 mg of stool material is frozen for at least one hour at - 80 ° C, then mixed with 600 ⁇ l lysis buffer (500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1% SDS, pH 9.0) and homogenized.
  • the lysed sample is 10 min. Centrifuged at 4 ° C and 5000 xg in an Eppendorf table centrifuge to remove coarse stool particles, cell debris, bacteria and food residues.
  • the supernatant is a second time at 4 ° C, 13000 xg 10 min. centrifuged.
  • the DNA-containing supernatant is mixed with the same volume of a colestipol hydrochloride solution (10% colestipol hydrochloride in lysis buffer), mixed well, 2 min.
  • the clear supernatant is incubated with proteinase K (final concentration 100 ⁇ g / ml) for 2 hours at 56 ° C.
  • the digested sample is mixed with the same volume of a phenol-chloroform-isoamyl alcohol solution (25: 24: 1), mixed well and 5 min. centrifuged at room temperature and 13000 xg.
  • the aqueous, upper phase becomes a again with the same volume of a chloroform-isoamyl alcohol solution (24: 1) and centrifuged as described above.
  • the DNA can be removed from the aqueous, upper phase by ethanol precipitation, by adding 1/10 volume of 3 M sodium acetate, pH 5.2 and 2.5 times the volume
  • the DNA pellet washed in 75% ethanol and dried at room temperature, is dissolved in 100 ⁇ l of distilled water.
  • the DNA yield is 15-20 ⁇ g per 200 mg stool sample with an A 260 / A 280 ratio of 1.9. 5 ⁇ l of this DNA solution are used for the amplification of defined genes / gene segments in a 50 ⁇ l PCR approach.
  • the amplification mixture is identical to that of Example 1.
  • 500 ⁇ l citrate, heparin or EDTA blood or frozen and thawed blood are mixed with 500 ⁇ l lysis buffer (500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1% SDS, pH 9.0) and mixed well.
  • 500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1% SDS, pH 9.0 500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1% SDS, pH 9.0
  • the DNA-containing solution is mixed with the same volume of a colestyramine solution (2.5% colestyramine in lysis buffer), mixed well, 2 min. at
  • Phenol added, mixed well and 5 min. centrifuged at room temperature and 20,000 xg.
  • the aqueous, upper phase is again mixed with the same volume of a chloroform-isoamyl alcohol solution (24: 1) and as described above centrifuged.
  • the DNA can be removed from the aqueous, upper phase by ethanol precipitation , by adding 1/10 volume of 3 M sodium acetate, pH 5.2 and 2.5 times the volume of 100% ethanol.
  • the DNA pellet washed in 75% ethanol and dried at room temperature, is dissolved in 30 ⁇ l of distilled water.
  • the DNA yield is 5-10 ⁇ g per 500 ⁇ l whole blood with an ⁇ 2 6o / 2 8o ratio of 1.7. 5 ⁇ l of this DNA solution are used for the amplification of defined genes / gene segments in a 50 ⁇ l PCR approach.
  • the amplification mixture is identical to that of Example 1.

Abstract

The invention concerns a method for purifying and eventually analyzing nucleic acids from biological test samples. In said method the test sample containing nucleic acid is made to react with an anion-exchanging synthetic resin, which has a preferably high bonding affinity with bile acid. The possible existing inhibitors for the eventually ensuing nucleic acid analysis reaction are bonded and separated by the anion-exchanging synthetic resin.

Description

Verfahren zur Reinigung und gegebenenfalls .Analyse von Nukleinsäuren aus biologischen ProbenMethods for purification and, if necessary, analysis of nucleic acids from biological samples
Beschreibungdescription
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und gegebenenfalls Analyse von Nukleinsäuren aus biologischen Proben.The present invention relates to a method for the purification and optionally analysis of nucleic acids from biological samples.
Die Reinigung von Nukleinsäuren spielt eine zentrale Rolle in der Molekularbiologie. Vor allem die DNA dient als Ausgangsmaterial für genetische Analysen in der labordiagnostischen Forschung und im routinemäßigen Einsatz.The purification of nucleic acids plays a central role in molecular biology. DNA in particular serves as the starting material for genetic analyzes in laboratory diagnostic research and in routine use.
Die Isolierung von Nukleinsäuren wie DNA und RNA aus biologischen Proben, insbesondere aus Proben des menschlichen Körpers, wie zum Beispiel Blut, Körpersekreten, Gewebeproben, Urin, Stuhl u. dergl . , zum nachfolgenden Einsatz in genetischen Analysen kommt eine besondere Bedeutung zu, insbesondere im Hinblick auf ein Screening in der Tumordiagnostik sowie zur Diagnose infektiöser Agentien wie Viren oder Bakterien.The isolation of nucleic acids such as DNA and RNA from biological samples, in particular from samples of the human body, such as blood, body secretions, tissue samples, urine, stool and the like. the like The subsequent use in genetic analyzes is of particular importance, especially with regard to screening in tumor diagnosis and for the diagnosis of infectious agents such as viruses or bacteria.
So ist zum Beispiel die Analyse der DNA, die aus abgeschilferten Darmepithelzellen von Stuhlproben stammt, von besonderem Interesse zur Diagnostik kolorektaler Tumoren. Von großem Interesse ist auch eine Isolierung der Nukleinsäure aus dem Vollblut, um die isolierte Nukleinsäure einer genetischen .Analyse zugänglich zu machen.For example, the analysis of DNA, which comes from exfoliated intestinal epithelial cells from stool samples, is of particular interest for the diagnosis of colorectal tumors. Isolation of the nucleic acid from whole blood is also of great interest in order to make the isolated nucleic acid available for genetic analysis.
Insbesondere soll die dabei anfallende DNA in hoher Reinheit vorliegen und direkt den erforderlichen Folgereaktionen unterworfen werden können. Eine Nukleinsäure-Diagnostik unter Einsatz von DNA- aAinplifikationsansätzen, insbesondere der Polymerase- Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, im Folgenden mit PCR abgekürzt) (s. Ξaiki, R.r Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Hörn, G.T., Mullis, K.B., Erlich, H.A. (1988), Science 239: 487-491), eröffnet vielfältige Ansätze zu einer spezifischen und zugleich sensitiven DNA-Diagnostik, z.B. von Tumoren im Frühstadium, die nicht belastend und für ein Screening gut geeignet sind. Aufgrund der häufig geringen DNA- Menge, die aus einer definierten biologischen Probe, wie beispielsweise bei Stuhlproben, isoliert werden kann, scheinen DNA-Amplifikationsansätze wie die PCR-Technik eine geeignete Methode zur Vervielfältigung der interessierenden DNA zu sein.In particular, the resulting DNA should be in high purity and be able to be subjected directly to the required subsequent reactions. Nucleic acid diagnostics using DNA-a-amplification approaches, in particular the polymerase chain reaction (polymerase chain reaction, hereinafter abbreviated to PCR) (see elfaiki, R. r Gelfand, DH, Stoffel, S., Scharf, SJ, Higuchi, R., Hörn, GT, Mullis, KB, Erlich, HA (1988), Science 239: 487-491), opens up diverse approaches to specific and at the same time sensitive DNA diagnostics, for example of tumors in the early stages that are not stressful and for screening are well suited. Due to the often small amount of DNA that can be isolated from a defined biological sample, such as stool samples, DNA amplification approaches such as the PCR technique seem to be a suitable method for the duplication of the DNA of interest.
Hauptschwierigkeiten stellen jedoch Inhibitoren dar, die bei der Anwendung gängiger Extraktionsmethoden gemeinsam mit der Nukleinsäure der biologischen Probe isoliert werden, und die die in den Nukleinsäure-Amplifikationsansätzen einzusetzenden Enzyme inhibieren. So hat sich herausgestellt, daß die für die PCR erforderliche DNA-Polymerase inhibiert wird. Insbesondere Stuhlproben und Vollblut sind kritische biologische Ausgangsproben, da sie mit relativ großen Mengen an Inhibitoren behaftet sind. Die durch die Reinigung und Isolierung anfallende Nukleinsäure (DNA, RNA) soll in hoher Reinheit vorliegen und direkt den erforderlichen Folgereaktionen unterworfen werden können. Die Inhibitoren müssen daher effizient und selektiv abgetrennt werden. Üblicherweise wird die DNA aus Zellen isoliert. Dabei werden Zellen beispielsweise unter stark denaturierenden und gegebenenfalls reduzierenden Bedingungen aufgeschlossen. Weit verbreitet ist der Aufschluß der Zellen mit denaturierenden Substanzen, z. B. Detergenzien, und die Verwendung von bestimmten Enzymen zum .Abbau von Proteinen und Nukleinsäuren. So wird beispielsweise Natriumdodecylsulfat (SDS) als denaturierendes Agens verwendet, Proteinase K zum Abbau von Proteinen und RNase A zur Degradation von Ribonukleinsäuren (RNA) . Zur vollständigen Denaturierung von Proteinen wird die DNA-haltige Lösung mit dem organischen Lösungsmittel Phenol extrahiert. Durch die anschließende Ethanolpräzipitation erfolgt die Konzentrierung der DNA und gleichzeitig die Entfernung verbleibender Phenolreste aus der deproteinierten, wässrigen Lösung. (Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sa brook, S. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor) .The main difficulties, however, are inhibitors which are isolated together with the nucleic acid of the biological sample when using conventional extraction methods and which inhibit the enzymes to be used in the nucleic acid amplification batches. It has been found that the DNA polymerase required for the PCR is inhibited. Stool samples and whole blood, in particular, are critical biological starting samples since they contain relatively large amounts of inhibitors. The nucleic acid (DNA, RNA) resulting from the purification and isolation should be present in high purity and should be able to be subjected directly to the necessary subsequent reactions. The inhibitors must therefore be separated efficiently and selectively. The DNA is usually isolated from cells. Cells are disrupted, for example, under strongly denaturing and possibly reducing conditions. The disruption of the cells with denaturing substances, e.g. B. detergents, and the use of certain enzymes for the breakdown of proteins and nucleic acids. For example, sodium dodecyl sulfate (SDS) is used as the denaturing agent, proteinase K for the degradation of proteins and RNase A for the degradation of ribonucleic acids (RNA). To completely denature proteins, the DNA-containing solution is extracted with the organic solvent phenol. The subsequent ethanol precipitation concentrates the DNA and at the same time removes the remaining phenol residues from the deproteinized, aqueous solution. (Maniatis, T., Fritsch, EF and Sa brook, S. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor).
Die mit einem solchen Verfahren gewonnene DNA, z.B. aus abgeschilferten Darmepithelzellen von Stuhlproben, eignet sich nur begrenzt für den Einsatz in die sich anschließenden Folgereaktionen, insbesondere enzymatische Amplifikationsreaktionen, wie die PCR. So belegen jüngere Daten, daß sich nur in 103 Fällen von insgesamt 230 extrahierten Stuhlproben (Effizienz von 44,7%) die DNA mittels PCR amplifizieren läßt (Villa, E., Dugani, A., Rebecchi, A.M., Vignoli, A., Grottola, A. , Buttafoco, P., Losi, L., Perini, M., Trande, P., Merighi, A. , Lerose, R. and Manenti, F. (1996), Gastroenterology: 110:1346-1353) .The DNA obtained by such a method, e.g. from exfoliated intestinal epithelial cells from stool samples is only suitable to a limited extent for use in the subsequent subsequent reactions, in particular enzymatic amplification reactions such as PCR. Recent data show that only 103 cases out of a total of 230 extracted stool samples (efficiency of 44.7%) can be amplified using PCR (Villa, E., Dugani, A., Rebecchi, AM, Vignoli, A., Grottola, A., Buttafoco, P., Losi, L., Perini, M., Trande, P., Merighi, A., Lerose, R. and Manenti, F. (1996), Gastroenterology: 110: 1346-1353 ).
Deuter et al . veröffentlichten 1995 eine Methode zur Isolierung von DNA aus Stuhlproben, die das beschriebene Verfahren zeitlich verkürzt und vereinfacht (Deuter, R., Pietsch, R., Hertel, S. and Müller, 0. (1995), Nucl. Acids Res . , 23:3800- 3801) . Die sich im Stuhl befindlichen abgeschilfertenDeuter et al. published a method for isolating DNA from stool samples in 1995, which shortens and simplifies the described method (Deuter, R., Pietsch, R., Hertel, S. and Müller, 0. (1995), Nucl. Acids Res., 23 : 3800- 3801). The stripped in the chair
Darmepithelzellen werden lysiert und mit einem Adsorbens (Kartoffelmehl oder Kartoffelstärke oder Rinderserumalbumin) enthaltenden Puffer extrahiert. Zum Abbau von Proteinen, z.B. nukleinsäurespaltenden Enzymen, wird die DNA-haltige Lösung mit der Proteinase K inkubiert. Die zeitliche Verkürzung dieses Verfahrens beruht darauf, daß die Phenolextraktion und anschließende Ethanolfällung durch die Verwendung von Zentrifugationssäulchen (QIAa p spin columns, QIAGEN GmbH) ersetzt werden. Während die DNA reversibel an eineIntestinal epithelial cells are lysed and extracted with a buffer containing adsorbent (potato flour or potato starch or bovine serum albumin). The DNA-containing solution is used to break down proteins, for example nucleic acid-cleaving enzymes the proteinase K incubated. The shortening of this process is due to the fact that the phenol extraction and subsequent ethanol precipitation are replaced by the use of centrifugation columns (QIAa p spin columns, QIAGEN GmbH). While the DNA reversibly attached to one
Silikamembran in der Säule bindet, werden störende Verbindungen durch die Verwendung eines geeigneten Waschpuffers infolge der Wirkung von Zentrifugalkräften durch die Membran gepresst und somit abgereinigt. Durch Zugabe eines geeigneten Puffers wird die gereinigte DNA infolge eines Zentrifugationsschrittes von der Säule eluiert. Da sich jedoch Flüssigkeiten nicht vollständig aus solchen Membranen entfernen lassen, hat man immer mit einem Verlust der DNA-Ausbeute zu rechnen. Die nach diesem Verfahren gewonnene DNA liegt nicht in ausreichend guter Qualität (A26o/A28o = 1, ) und Menge (2 μgBinds silica membrane in the column, disruptive compounds are pressed through the use of a suitable washing buffer due to the action of centrifugal forces and thus cleaned. By adding a suitable buffer, the purified DNA is eluted from the column as a result of a centrifugation step. However, since liquids cannot be completely removed from such membranes, a loss of DNA yield must always be expected. The DNA obtained by this method is not of sufficiently good quality (A 2 6o / A 28 o = 1,) and amount (2 μg
DNA/200 mg Stuhlprobe) vor. Folgereaktionen, insbesondere die PCR, erfordern eine hohe und reproduzierbare Ausbeute der DNA- Rohpräparate unter gleichzeitiger intensiver Abreinigung störender Inhibitoren. Die Amplifikation eines definierten Gens/Genabschnitts der nach der von Deuter et al. beschriebenen Methode präparierten DNA mittels einer einfachen PCR zeigt eine Effizienz von 16 %. Auch durch eine nachfolgende Phenolextraktion dieser DNA läßt sich die Amplifikationseffizienz nur von 16 auf 40 % erhöhen. Lediglich die Anwendung einer verschachtelten ("nested") PCR, die sich durch eine erhöhte Empfindlichkeit und Sensitivität, bei gleichzeitiger Ausdünnung potentieller Inhibitoren, auszeichnet (Newton, C.R. and Graham, A. (1994), PCR, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland) , erzielt eine erhöhte Amplifikationsausbeute von 66 %.DNA / 200 mg stool sample). Subsequent reactions, in particular PCR, require a high and reproducible yield of the crude DNA preparations with simultaneous intensive cleaning of disruptive inhibitors. The amplification of a defined gene / gene segment according to the method described by Deuter et al. described method prepared DNA using a simple PCR shows an efficiency of 16%. A subsequent phenol extraction of this DNA can only increase the amplification efficiency from 16 to 40%. Only the use of a nested ("nested") PCR, which is distinguished by an increased sensitivity and sensitivity, with simultaneous thinning out of potential inhibitors, (Newton, CR and Graham, A. (1994), PCR, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Federal Republic of Germany ), achieves an increased amplification yield of 66%.
Es ist wünschenswert, die DNA in ausreichender Menge und in reproduzierbar guter Qualität zu isolieren, so daß definierte Gene/Genabschnitte in einer einfachen, d.h. nicht verschachtelten, PCR vervielfältigt werden können. Die Durchführung einer verschachtelten PCR zeigt sich für bestimmte Anwendungen (z. B. routinemäße Untersuchungen im diagnostischen Labor) nachteilig, da hier die Rate der falsch Positiven durch Produktkontaminationen erhöht ist.It is desirable to isolate the DNA in sufficient quantity and in a reproducibly good quality so that defined genes / gene segments can be reproduced in a simple, ie not nested, PCR. The Performing a nested PCR is disadvantageous for certain applications (e.g. routine examinations in the diagnostic laboratory), since the rate of false positives due to product contamination is increased here.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht somit in der Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Reinigung bzw. Isolierung von Nukleinsäuren (DNA, RNA und dergl.) aus ungereinigten biologischen Proben wie Vollblut oder Stuhlproben; dabei soll die Nukleinsäure in ausreichender Menge und Reinheit vorliegen, so daß sie den erforderlichen Folgereaktionen unterworfen werden kann. Die Effizienz für .eine nachfolgende Nukleinsäure-Analysereaktion, insbesondere für Amplifikationsansätze wie die PCR, soll gesteigert werden.The object underlying the invention is therefore to provide an improved method for purifying or isolating nucleic acids (DNA, RNA and the like) from unpurified biological samples such as whole blood or stool samples; the nucleic acid should be present in sufficient quantity and purity so that it can be subjected to the necessary subsequent reactions. The efficiency for a subsequent nucleic acid analysis reaction, in particular for amplification approaches such as PCR, is to be increased.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Reinigung, gegebenenfalls auch Analyse von Nukleinsäuren aus biologischen Proben, wobei das Verfahren den Schritt umfaßt, daß die Nukleinsäure-haltige Probe mit einem Anionenaustauscher- Kunstharz umgesetzt wird, welches eine Bindungsaffinität zuThis object is achieved by a method for purification, optionally also analysis of nucleic acids from biological samples, the method comprising the step of reacting the nucleic acid-containing sample with an anion exchanger synthetic resin which has a binding affinity for
Gallensäuren besitzt, wobei Inhibitoren für die gegebenenfalls anschließende Nukleinsäure-.Analysereaktion an das •Anionenaustauscherharz gebunden und abgetrennt werden.Has bile acids, where inhibitors for the subsequent subsequent nucleic acid analysis reaction are bound to and separated from the anion exchange resin.
Ein charakertistisches Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung eines Gallensäure-bindenden Anionenaustauscher-Kunstharzes .A characteristic of the present invention is the use of a bile acid binding anion exchange resin.
Die Bindungsaffinität des Anionenaustauscher-Kunstharzes gegenüber Gallensäuren, die vorzugsweise hoch ist, ist ein Maßfaktor dafür, daß die Inhibitoren für die gegebenenfalls anschließend durchzuführende Nukleinsäure-Analysenereaktion, beispielsweise in der PCR-Reaktion, effizient gebunden und somit abgetrennt werden, während Nukleinsäuren nicht oder schwächer gebunden werden und somit leicht wiedergewonnen werden können.The binding affinity of the anion exchanger synthetic resin for bile acids, which is preferably high, is a measure of the fact that the inhibitors for the nucleic acid analysis reaction which may have to be subsequently carried out, for example in the PCR reaction, are efficiently bound and thus separated while nucleic acids are not or are bound less and can therefore be easily recovered.
Der Grund, weshalb ein .Anionenaustauscher-Kunstharz mit starker Affinität gegenüber Gallensäuren sehr effizient die Inhibitoren bindet und abtrennt, ist nicht klar. Es kann jedoch vermutet werden, daß - obgleich Gallensäuren selbst offenbar nicht die Inhibitoren von Nukleinsäure-Analysereaktionen darstellen - die Gallensäurestruktur mit der einerseits permanent negativen Carboxyl-Ladungsgruppe und dem andererseits relativ hydrophoben, in ß-Stellung methylierten Steroid-Struktur- bereich, welcher aber seinerseits üblicherweise durch hydrophile Hydroxylgruppen in α-Stellung derivatisiert ist, offensichtlich relativ gut die in den Inhibitoren vorliegende grobe Strukturverteilung widerspiegelt, so daß eine analog starke Affinität zu den Inhibitoren besteht.The reason why an anion exchange resin with a strong affinity for bile acids binds and separates the inhibitors very efficiently is not clear. However, it can be assumed that - although bile acids themselves do not appear to be the inhibitors of nucleic acid analysis reactions - the bile acid structure with the permanently negative carboxyl charge group on the one hand and the relatively hydrophobic, methylated in the β-position steroid structure area on the other hand, but which is in turn usually derivatized by hydrophilic hydroxyl groups in the α-position, obviously reflects the rough structure distribution present in the inhibitors relatively well, so that there is an analogous strong affinity for the inhibitors.
Ein weiteres überraschendes Ergebnis der vorliegenden Erfindung ist die sehr gute Selektivität des Anionenaustauscher-Harzes, das die Affinität zu Gallensäuren besitzt, zur Bindung der Inhibitoren im Vergleich zur Bindung der Nukleinsäure, die in Gegenwart der Inhibitoren nicht oder schwächer gebunden werden. Gleichzeitig wird durch das erfindungsgemäße Verfahren die Nukleinsäure in hoher Reinheit zur Verfügung gestellt, typischerweise in einem über die Absorptionswerte bei 260 nm und 280 nm erhaltenen Verhältnis A26o/A2eo von über 1,5, insbesondere von über 1,7.Another surprising result of the present invention is the very good selectivity of the anion exchange resin, which has the affinity for bile acids, for binding the inhibitors compared to binding the nucleic acid, which are not bound or are bound less in the presence of the inhibitors. At the same time, the nucleic acid is made available in high purity by the method according to the invention, typically in an A 2 6o / A 2e o ratio obtained via the absorption values at 260 nm and 280 nm of more than 1.5, in particular of more than 1.7.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine ausreichende .Abreinigung von Inhibitoren für gegebenenfalls anschließende Nukleinsäure-Nachweisreaktionen unter gleichzeitigem Erhalt einer genügend hohen Nukleinsäure-Konzentration sichergestellt.The method according to the invention ensures adequate cleaning of inhibitors for any subsequent nucleic acid detection reactions while at the same time maintaining a sufficiently high nucleic acid concentration.
Die für das erfindungsgemäß eingesetzte Kunstharz charakteristische Bindungsaffinität gegenüber Gallensäuren, wobei typische Gallensäuren wie Cholsäure in Betracht kommen, liegt geeigneterweise im Bereich einer gegenüber z.B. Cholsäure ermittelten durchschnittlichen Bindungskapazität von mindestens 0, 1 Äquivalente Cholsäure pro kg trockenem Kunstharz (eq/kg) . Vorzugsweise beträgt die durchschnittliche Bindungskapazität mindestens 0,5, weiter bevorzugt mindestens 1,0 und insbesondere mindestens 2,0 Äquivalente Cholsäure pro kg trockenem Kunstharz. Die Bindungskapazität gegenüber Gallensäuren kann ermittelt werden durch Umsetzen einer definierten Menge an trockenem Kunstharz (50 g) mit einer angemessen konzentrierten Gallensäurelösung (1 gew.-%tige wässrige Lösung von Cholsäure) bei geeigneten Bedingungen bzgl. pH-Wert und Ionenstärke (z.B. pH 6,3 bei 0,9 gew.%-iger NaCl-Konzentration) . Cholsäure läßt sich leicht quantifizieren (s. z.B. J.L.Irvin et al . in „J.Biol.Chem.", 153, 439 (1944)).The binding affinity for bile acids characteristic of the synthetic resin used according to the invention, where typical bile acids such as cholic acid are suitable, is suitably in the range of an average binding capacity, as determined, for example, of cholic acid, of at least 0.1 equivalents of cholic acid per kg of dry synthetic resin (eq / kg). The average binding capacity is preferably at least 0.5, more preferably at least 1.0 and in particular at least 2.0 equivalents of cholic acid per kg of dry synthetic resin. The binding capacity to bile acids can be determined by reacting a defined amount of dry synthetic resin (50 g) with an appropriately concentrated bile acid solution (1% by weight aqueous solution of cholic acid) under suitable conditions with regard to pH and ionic strength (e.g. pH 6 , 3 at 0.9% by weight NaCl concentration). Cholic acid can be easily quantified (see for example JLIrvin et al. In "J.Biol.Chem.", 153, 439 (1944)).
Die Gesamt-Chloridaustauschkapazität des erfindungsgemäß eingesetzten Kunstharzes, bestimmt mittels üblicher Titrationsmethode, beträgt vorzugsweise mehr als 4 eg/kg. Es ist aber zu berücksichtigen, daß die Gesamtzahl der aktiven, verfügbaren Anionenaustauschstellen nicht das eigentlich maßgebliche Kriterium zur wirksamen Bindung der Inhibitoren darstellt. Die in der Natur des Gallensäure-bindenden Kunstharzes zugrundeliegende Charakteristik spielt hier eine weitere spezifische Rolle.The total chloride exchange capacity of the synthetic resin used according to the invention, determined by means of a customary titration method, is preferably more than 4 eg / kg. However, it must be taken into account that the total number of active, available anion exchange sites is not the actually decisive criterion for the effective binding of the inhibitors. The characteristic underlying the nature of the bile acid-binding synthetic resin plays a further specific role here.
Die Qualität der Bindung bzw. Abtrennung der Inhibitoren kann indirekt ermittelt werden durch die Bestimmung der Effizienz einer anschließenden Nukleinsäure-Analysereaktion. Eine Bindung bzw. Abtrennung der Inhibitoren ist dann erreicht, wenn in der anschließenden Nukleinsäure-Analysereaktion eine Steigerung der Effizienz feststellbar ist, wobei die Effizienz vor der erfindungsgemäßen Reinigung, insbesondere bei durch Inhibitoren stark verunreinigten Proben, bei null liegen kann. Für einen Vergleich ist allerdings aufgrund der unterschiedlichen Menge und Heterogenität der Inhibitoren je nach biologischer Probe von der Untersuchung derselben biologischen Probe auszugehen. Zum Beispiel bei Stuhlproben, die einen besonders hohen Gehalt an stofflich bisher nicht charakterisierten, heterogenen Inhibitor-Substanzen aufweisen, sollte wünschenswerterweise in einem Qualitätstest eine Effizienz von mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 60% und insbesondere mindestens 70% erreichbar sein. Die Effizienz ist dabei definiert als der prozentuale Anteil der spezifisch festzustellenden PCR-Produkte in einem PCR-Analyseansatz, wobei eine einfache PCR-Reaktion, vorteilhafterweise aber unter Einsatz von Trägerprotein, durchgeführt wird, beispielsweise gemäß der untenstehenden Beispiele.The quality of the binding or separation of the inhibitors can be determined indirectly by determining the efficiency of a subsequent nucleic acid analysis reaction. A binding or separation of the inhibitors is achieved when an increase in efficiency can be determined in the subsequent nucleic acid analysis reaction, the efficiency before the cleaning according to the invention, in particular in the case of inhibitors heavily contaminated samples, may be zero. For a comparison, however, due to the different quantity and heterogeneity of the inhibitors depending on the biological sample, it can be assumed that the same biological sample was examined. For example, in the case of stool samples which have a particularly high content of heterogeneous inhibitor substances which have not previously been characterized in terms of material, it should be possible in a quality test to achieve an efficiency of at least 40%, preferably at least 60% and in particular at least 70%. The efficiency is defined as the percentage of the specific PCR products to be determined in a PCR analysis approach, a simple PCR reaction, but advantageously using carrier protein, is carried out, for example according to the examples below.
Ein weiteres, überrachendes Ergebnis ergab sich aus einem Vergleich zu anderen, in Betracht kommenden, herkömmlichen basischen Anionenaustauscher-Materialien, wie einem FPLC- MonoQ™-System, dem sogenannten GeneReleaser™-System, einemAnother surprising result came from a comparison to other, possible, basic anion exchange materials, such as an FPLC-MonoQ ™ system, the so-called GeneReleaser ™ system
Diethylaminoethyl-Celluloseionenaustauscher (DE.AE-Sephacell™; DE-52) oder dem Qiagen™-Silika-Material : Obwohl es sich um das gleiche Prinzip eines Anionenaustausches handelt, bindet das erfindungsgemäß eingesetzte Anionenaustauscher-Harz die Inhibitoren aus dem biologischen Ausgangsmaterial selektiver und effektiver, so daß die nachfolgenden Nukleinsäure- Analysereaktionen bereits bei .Anwendung einer einfachen PCR sehr hohe Amplifikationsraten erbringen. Gemäß der Erfindung ergeben sich wesentlich bessere Resultate, und zwar bereits beim Einsatz einer geringeren Menge an Anionenaustauscher-Harz, und ferner sind eine geringere Anzahl an Extraktionsschritten erforderlich; in der Regel reicht ein Inkubationsschritt aus. Ein Vergleich herkömmlicher DNA-Reinigungs- und Isolierverfahren wurde vor kurzem von A.Kramvis et al . beschrieben in „Journal of Clinical Microbiology", 34, 2731-2733 (1996) .Diethylaminoethyl cellulose ion exchanger (DE.AE-Sephacell ™; DE-52) or the Qiagen ™ silica material: Although it is the same principle of an anion exchange, the anion exchange resin used according to the invention binds the inhibitors from the biological starting material more selectively and more effective, so that the subsequent nucleic acid analysis reactions yield very high amplification rates even when using a simple PCR. According to the invention, significantly better results are obtained, even when using a smaller amount of anion exchange resin, and furthermore a smaller number of extraction steps are required; one incubation step is usually sufficient. A comparison of conventional DNA purification and isolation methods was recently published by A. Kramvis et al. described in "Journal of Clinical Microbiology", 34, 2731-2733 (1996).
Die mit der Erfindung erzielbare, selektive .Abtrennung der Inhibitoren wird auch bei ungereinigten Ausgangsproben erreicht.The selective separation of the inhibitors that can be achieved with the invention is also achieved with unpurified starting samples.
So hat sich das erfindungsgemäße Verfahren als besonders wirksam erwiesen bei bisher sehr problematischen Ausgangsproben, z.B. bei Vollblut, das mit Citrat und EDTA oder der vermutlich PCR-inhibierenden Substanz Heparin behandelt wurde, sowie bei Stuhlproben, die aus der Lyse von im Stuhl abgeschilferten Darmepithelzellen stammen und einen hohen .Anteil an nicht bekannten Inhibitoren aufweisen. Selbstverständlich sind die Vorteile der Erfindung aber auch bei Anwendung auf beliebig andere biologische Proben erzielbar, beispielsweise anderen Proben aus dem menschlichen Körper, wie Körpersekreten, Gewebeproben, Urin u. dergl .The method according to the invention has proven to be particularly effective in the case of starting samples which have been very problematic to date, e.g. in whole blood that has been treated with citrate and EDTA or the presumably PCR-inhibiting substance heparin, as well as in stool samples that come from the lysis of intestinal epithelial cells that have been exfoliated in stool and that have a high proportion of unknown inhibitors. Of course, the advantages of the invention can also be achieved when applied to any other biological samples, for example other samples from the human body, such as body secretions, tissue samples, urine and the like. the like
Das erfindungsgemäß eingesetzte Anionenaustauscher-Kunstharz ist ein basisches, insbesondere stark basisches Polymermaterial hohen Molekulargewichts (beispielsweise imThe anion exchanger synthetic resin used according to the invention is a basic, in particular strongly basic polymer material of high molecular weight (for example in
Molekulargewichtsbereich von über 0,5 • 106, wie von 0,5 bisMolecular weight range above 0.5 • 10 6 , such as from 0.5 to
10 • 106, insbesondere 1 bis 5 • 106) , welches im allgemeinen aus einem mit tertiären und/oder quartären Ammoniumgruppen modifizierten organischen Polymer oder Copolymer aufgebaut ist und dessen charakteristisches Merkmal die vorstehend beschriebene Affinität zu Gallensäuren ist.10 • 10 6 , in particular 1 to 5 • 10 6 ), which is generally composed of an organic polymer or copolymer modified with tertiary and / or quaternary ammonium groups and whose characteristic feature is the affinity for bile acids described above.
Das Harz-Polymer ist dabei auf besonders geeignete Weise gebildet aus einem Polystyrol, welches durch Divinylbenzol, vorzugsweise mit einem Anteil von 0,5 bis 5 Gew.-% und insbesondere von 1 - 3 Gew.-% Divinylbenzol quervernetzt ist und in dessen Netzstruktur quartäre .Aitraioniumgruppen, geeigneterweise in Form von Benzyltrimethylammoniumgruppen, eingebaut sind.The resin polymer is formed in a particularly suitable manner from a polystyrene which is crosslinked by divinylbenzene, preferably in a proportion of 0.5 to 5% by weight and in particular 1-3% by weight of divinylbenzene and in its network structure quaternary .Aitraionium groups, suitably in the form of benzyltrimethylammonium groups, are incorporated.
Ein Beispiel für ein Anionenaustauscher-Kunstharz diesen Polymer-Typs, das eine hohe Affinität zu Gallensäuren besitzt und bei dessen Einsatz ausgezeichnete Resultate erzielt wurden, ist Colestyramin (mittlere Bindungskapazität von Colestyramin gegenüber Cholsäure = 2,2 Äquivalente pro kg Harz- Trockengewicht) . Colestyramin ist der internationale Freiname für das Plasma-Cholesterinspiegel senkende Copolymere von Styrol (Vinylbenzol) und etwa 2 % Divinylbenzol mit in die Netzstruktur eingefügten quartären .Ammoniumgruppen. Das Colestyramin-Granulat ist auf dem medizinisch-therapeutischen Gebiet bekannt als ein stark hydrophiles, wasserlösliches, basisches .Anionenaustauscherharz zur Bindung von Gallensäuren bei Gallensäurenverlustsyndromen und als Lipidsenker zur Behandlung von Hypercholesterinämie. Der Lipidsenker Colestyramin wird von der Firma STADApharm vertrieben.An example of an anion exchange synthetic resin of this type of polymer, which has a high affinity for bile acids and which has achieved excellent results when used, is colestyramine (average binding capacity of colestyramine versus cholic acid = 2.2 equivalents per kg resin dry weight). Colestyramine is the international free name for the copolymers of styrene (vinylbenzene) and about 2% divinylbenzene with the quaternary ammonium groups inserted into the network structure. The colestyramine granules are known in the medical-therapeutic field as a highly hydrophilic, water-soluble, basic anion exchange resin for binding bile acids in bile acid loss syndromes and as a lipid-lowering agent for the treatment of hypercholesterolemia. The lipid-lowering agent colestyramine is sold by STADApharm.
Weitere Beispiele für einen, zum Einsatz für die vorliegende Erfindung grundsätzlich gut geeigneten Kunstharz-Typ bilden vernetzte Polyalkylamin-Anionenaustauscherharze . Das vernetzte Polyalkylamin-.Anionenaustauscherharz ist dabei in der Regel als Copolymer aus einem Poly (niedrig) alkyl-Polyamin, beispielsweise Diethylentriamin oder Tertaethylenpentamin, mit Epichlorhydrin (l-Chlor-2, 3-epoxypropan) gebildet.Crosslinked polyalkylamine anion exchange resins form further examples of a type of synthetic resin which is fundamentally suitable for use in the present invention. The crosslinked polyalkylamine anion exchange resin is generally formed as a copolymer of a poly (lower) alkyl polyamine, for example diethylene triamine or tertaethylene pentamine, with epichlorohydrin (1-chloro-2, 3-epoxypropane).
Ein Beispiel für ein .Anionenaustauscher-Kunstharz diesen Polymer-Typs, das eine hohe Affinität zu Gallensäuren besitzt und bei dessen Einsatz ebenfalls ausgezeichnete Resultate erzielt wurden, ist Colestipol (mittlere Bindungskapazität von Colestypol gegenüber Cholsäure = 1,1 Äquivalente pro kg Harz- Trockengewicht) . Colestipol ist der internationale Freiname für das Serum-Cholesterinspiegel senkende Copolymere von Diethylentriamin und Epichlorhydrin. Das Colestipolhydrochlorid-Granulat ist ebenfalls an sich bekannt als ein wasserunlösliches, basisches .Anionenaustauscherharz zur Bindung von Gallensäuren bei Gallenstauung und Hypercholesterinämie (Lipidsenker) . Colestipolhydrochlorid wurde von der Firma Upjohn entwickelt und kam 1977 auf den Markt .An example of an anion-exchange synthetic resin of this type of polymer, which has a high affinity for bile acids and which has also achieved excellent results when used, is colestipol (average binding capacity of colestypol versus cholic acid = 1.1 equivalents per kg resin dry weight) . Colestipol is the international free name for the serum cholesterol-lowering copolymers of diethylene triamine and epichlorohydrin. The Colestipol hydrochloride granules are also known per se as a water-insoluble, basic .anion exchange resin for binding bile acids in bile congestion and hypercholesterolemia (lipid-lowering agents). Colestipol hydrochloride was developed by Upjohn and was launched in 1977.
Korrelierend mit der erhöhten Gallensäure-Bindungsaffinität ist die Reinigungseffizienz gegenüber den Inhibitoren beim Einsatz von Colestyramin im Vergleich zu Colestipol weiter erhöht.Corresponding to the increased affinity for bile acid binding, the cleaning efficiency compared to the inhibitors when using colestyramine is further increased compared to colestipol.
Die das Kunstharz aufbauenden Polymere schließen neben den zuvor genannten Copolymeren auch andere Polymere und Copolymere sowie den Einsatz von substituierten Vertretern der die Copolymere aufbauenden, beispielhaft genannten Monomere ein, sofern in .Analogie mit der Bindungsfähigkeit zu Gallensäuren die möglicherweise vorhandenen Inhibitoren in durch die Effizienzsteigerung der anschließenden Nukleinsäure-Analysereaktion feststellbarem Maße gebunden und abgetrennt werden.In addition to the copolymers mentioned above, the polymers which form the synthetic resin also include other polymers and copolymers and the use of substituted representatives of the monomers which form the copolymers, provided that the inhibitors which may be present, in analogy with the ability to bind to bile acids, by increasing the efficiency of the subsequent nucleic acid analysis reaction can be determined and separated.
Desweiteren können die erfindungsgemäß eingesetztenFurthermore, the used according to the invention
Anionenaustauscher-Harze weitere, an sich bekannte Additive in üblichen Mengen enthalten, wie z.B. Fließmittel. Zur Ladungsabsättigung enthält das Anionenaustauscher-Harz zudem geeignete Salzpartner; die tertiären Ammoniumgruppen liegen geeigneterweise in der Hydrochlorid-Form vor, während quartäre Ammoniumgruppen geeigneterweise mit Chlorid assoziiert sind.Anion exchange resins contain other additives known per se in conventional amounts, e.g. Superplasticizer. The anion exchange resin also contains suitable salt partners for charge saturation; the tertiary ammonium groups are suitably in the hydrochloride form, while quaternary ammonium groups are suitably associated with chloride.
Vor der Umsetzung der Probe kann das einzusetzende Harz zunächst in geeigneter Trockenform vorliegen, beispielsweise als Granulat, oder es kann bereits in einer wässrigenBefore the sample is reacted, the resin to be used can first be in a suitable dry form, for example in the form of granules, or it can already be in an aqueous form
Suspension vorliegen. Wird vom trockenen Harz ausgegangen, empfielt es sich, das Harz in einem geeigneten Puffer vorzuquellen, um wegen der hygroskopischen Eigenschaften des Harzes Verluste des Flüssigkeitsvolumens der verwendeten biologischen Probe zu vermeiden. Die zur Umsetzung eingesetzte Harzsuspension ist üblicherweise gepuffert, geeigneterweise im Bereich von schwach sauer (etwa pH 5-6) bis schwach basisch (etwa pH 9-10) .Suspension. When starting from the dry resin, it is advisable to pre-swell the resin in a suitable buffer in order to avoid loss of the liquid volume used due to the hygroscopic properties of the resin avoid biological sample. The resin suspension used for the reaction is usually buffered, suitably in the range from slightly acidic (approximately pH 5-6) to weakly basic (approximately pH 9-10).
Als Nukleinsäure kommen alle Nukleinsäurearten, insbesondere DNA und RNA, in Frage. Aufgrund der größeren Bedeutung, vor allem aber weil Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen in der Regel auf DNA-Proben aufgebaut sind (vgl. die PCR), wird die Erfindung im Folgenden stellvertretend vor allem zur Reinigung bzw. Isolierung von DNA weiter beschrieben.All nucleic acid types, in particular DNA and RNA, are suitable as nucleic acid. Because of its greater importance, but above all because nucleic acid amplification reactions are usually based on DNA samples (cf. PCR), the invention is further described below, primarily for the purification or isolation of DNA.
Bei biologischen Ausgangsproben, bei denen die zu isolierende Nukleinsäure intrazellulär vorliegt, wie beispielsweise abgeschilferte Darmepithelzellen enthaltende Stuhlproben, sind die Zellen zunächst zu lysieren, um das intrazelluläre Material aufzuschließen.In the case of biological starting samples in which the nucleic acid to be isolated is present intracellularly, such as stool samples containing exfoliated intestinal epithelial cells, the cells must first be lysed in order to disrupt the intracellular material.
Die Lyse bzw. der Aufschluß der Zellen kann durch eine gleichzeitige physikalische und chemische Einwirkung auf die körperzellenhaltige Probe erzielt werden. Das Probenmaterial kann vor der Lyse in tiefgefrorenem Zustand (-80 °C) vorliegen. Im Lysepuffer ist geeigneterweise ein denaturierendes Agens, z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS) oder andere Detergentien enthalten, welches den chemischen Aufschluß der Zellen bewirkt, während das Verrühren der Suspension, beispielsweise mit einem automatischen, mechanischen Rührsystem, den mechanischen Aufschluß begünstigt. Bei Stuhlproben hat sich gezeigt, daß bei sehr fester Konsistenz ein kräftiges Durchmischen der Probe mit einem Reagenzglasschüttler die Folgeanwendungen erleichtert. Durch einen Zentrifugationsschritt können Zelltrümmer, unverdaute Nahrungsmittelreste oder andere Makroreste entfernt werden. .Anschließend an die Lyse erfolgt die Behandlung des Nukleinsäure-haltigen Zellysats mit dem erfindungsgemäß eingesetzten, speziellen Anionenaustauscher-Harz. Das Harz kann in diesem Fall geeigneterweise in dem Lysepuffer vorgequellt werden.The lysis or disruption of the cells can be achieved by a simultaneous physical and chemical action on the sample containing the body cells. The sample material can be frozen (-80 ° C) before lysis. The lysis buffer suitably contains a denaturing agent, for example sodium dodecyl sulfate (SDS) or other detergents, which brings about chemical digestion of the cells, while stirring the suspension, for example with an automatic, mechanical stirring system, favors mechanical digestion. In the case of stool samples, it has been shown that with a very firm consistency, vigorous mixing of the sample with a test tube shaker makes subsequent applications easier. A centrifugation step can remove cell debris, undigested food residues or other macro residues. After the lysis, the nucleic acid-containing cell lysate is treated with the special anion-exchange resin used according to the invention. The resin in this case can be suitably pre-swelled in the lysis buffer.
Es hat sich gezeigt, daß bereits ein einmaliges Umsetzen des erfindungsgemäß eingesetzten Anionenaustauscher-Harzes eine ausreichende selektive Abreinigung der Inhibitoren ermöglichte. Die eingesetzte Menge des speziellen Kunstharzes beträgt vorzugsweise 10 Gew.-% und weniger, bezogen auf das Gesamtgewicht der behandelten Probe. Oberhalb dieser Menge kann die Tendenz bestehen, daß nicht nur die Inhibitoren, sondern auch die gewünschte Nukleinsäure in zunehmendem Maße an das Harz gebunden wird.It has been shown that a single reaction of the anion exchanger resin used in accordance with the invention enables adequate selective cleaning of the inhibitors. The amount of the special synthetic resin used is preferably 10% by weight and less, based on the total weight of the treated sample. Above this amount there may be a tendency that not only the inhibitors but also the desired nucleic acid is increasingly bound to the resin.
Es hat sich herausgestellt, daß eine zu häufige Wiederholung der batch-weisen Extraktion, insbesondere bei hohem Mengeneinsatz von über 10 Gew.-% sehr stark Gallensäure- bindender Kunstharze, zu einer nachteiligen Reduzierung der Nukleinsäure-Menge führen kann. Die Ursache hierfür ist unklar. Es wird vermutet, daß das spezielle Harz zunächst die Inhibitoren bindet und dadurch abgesättigt wird. Fehlen jedoch die Inhibitoren in der wässrigen Lösung, kann das spezielle Harz aufgrund seiner Ladungseigenschaften verstärkt die Nukleinsäure binden.It has been found that repetitive repetition of the batch-wise extraction, in particular when using a large amount of more than 10% by weight of very strongly bile acid-binding synthetic resins, can lead to a disadvantageous reduction in the amount of nucleic acid. The reason for this is unclear. It is assumed that the special resin first binds the inhibitors and is thereby saturated. However, if the inhibitors are missing in the aqueous solution, the special resin can bind the nucleic acid more effectively due to its charge properties.
Eine wässrige, bis 10 gewichts-%ige, insbesondere 5 bis 10 gewichts-%ige Suspension des Kunstharzes bindet die Inhibitoren in ausreichender Menge und setzt gleichzeitig die Menge der in der wässrigen Lösung vorliegenden DNA nicht oder nur unwesentlich herab.An aqueous, up to 10% by weight, in particular 5 to 10% by weight, suspension of the synthetic resin binds the inhibitors in sufficient quantity and at the same time does not, or only insignificantly, reduce the amount of DNA present in the aqueous solution.
Geeigneterweise steht dabei die eingesetzten Menge an Kunstharz zu der Häufigkeit der Umsetzung in einem umgekehrten Verhältnis. Das heißt, bei einem relativ hohen Gehalt, insbesondere bei 7,5 bis 10 Gew.-% Harzsuspension in wässrigem Medium, ist eine einmalige Umsetzung vorzuziehen, während im mittleren Gehaltsbereich, etwa von 2,5 bis 7,5 Gew.-% und insbesondere um 5 Gew.-% (± 1 Gew.- ), eine zwei- oder mehr- malige Umsetzung bessere Resultate liefert. Das vorzugsweise zu wählende Verhältnis von Harzgehalt zu Häufigkeit der Umsetzung hängt aber auch von dem jeweils zu untersuchenden Probenmaterial ab. So ist bei Stuhlproben ein einmaliges Umsetzen mit 10 Gew.-% oder ein zweimaliges Umsetzen mit jeweils 5 Gew.-% Copolymer-Harz gut geeignet. Bei Vollblut sind Gehaltsbereiche unter 5 Ge .-% vorzuziehen, wobei ein zweimaliges Umsetzen mit jeweils 2,5 Gew.-% Copolymer-Harz besonders gut geeignet ist.Suitably, the amount of synthetic resin used is inversely related to the frequency of the reaction. That is, with a relatively high salary, in particular with 7.5 to 10% by weight of resin suspension in an aqueous medium, a single reaction is preferable, while in the medium content range, approximately from 2.5 to 7.5% by weight and in particular around 5% by weight (± 1 wt.), A two or more times implementation delivers better results. The preferred ratio of resin content to frequency of implementation also depends on the sample material to be examined. For stool samples, a single reaction with 10% by weight or a double reaction with 5% by weight of copolymer resin is particularly suitable. In the case of whole blood, content ranges below 5% by weight are preferred, two reactions with 2.5% by weight of copolymer resin being particularly suitable.
Beim Umsetzen wird am einfachsten die Nukleinsäure-haltige (ggf. nicht vorgereinigte) Probe mit der Harz-Suspension versetzt, sehr gut gemischt, und dann wieder vom Copolymeren- Harz abgetrennt. Letzteres kann bequem durch ein .Abzentrifugieren des Harzgranulats erfolgen. Das Umsetzen kann aber auch mittels einer Trennung über ein das spezielle Anionenaustauscher-Harz einsetzende Chromatographie- System erfolgen.When reacting, the easiest way is to add the resin suspension to the nucleic acid-containing (possibly not pre-cleaned) sample, mix it very well, and then separate it again from the copolymer resin. The latter can be conveniently carried out by centrifuging off the resin granules. The reaction can also be carried out by means of a separation using a chromatography system using the special anion exchange resin.
Anschließend an die Inhibitorabreinigung kann die DNA weiter gereinigt und isoliert werden. Vorteilhaft ist es, hierfür zunächst unspezifisch wirkende Proteinasen wie die Proteinase K einzusetzen, um Proteine und Nukleinsäure-spaltende Enzyme abzubauen. Danach erhält man eine viskose, gallertartige Flüssigkeit. Daraus wird die DNA vorzugsweise mittels Phenolextraktion und anschließender Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase isoliert. Alternativ läßt sich die DNA durch die Verwendung eines Detergens, beispielsweise eines chaotropen, Guanidin-haltigen Detergens (wie DNAzol™ von Gibco BRL) , mit anschließender Ethanolfällung aus der wässrigen Phase isolieren. Dazu wird die DNA-haltige, mit Proteinase K verdaute Lösung mit dem Detergens und Ethanol versetzt und sofort durch einen Zentrifugationsschritt pelletiert. Da weder organische Lösungsmittel (Phenol, Chloroform) eingesetzt werden, noch mehrere Zentrifugationssschritte zur Extraktion nötig sind, ist dieses Verfahren sehr anwenderfreundlich und zeitersparend. Die Verwendung von organischen Lösungsmitteln wie Phenol oder chaotropen Detergentien zur Isolierung von DNA kann alternativ durch den Gebrauch von für diesen Zweck bekannten Zentrifugationssäulchen ersetzt werden, beispielsweise durch QIAamp-spin columns™ von Qiagen™. Hierbei eignet sich zur Zellyse sowohl ein Proteinase K-Verdau, sowie die Verwendung von kommerziell erhältlichen Lysepuffern (z. B. AVL-Puffer des QIAamp Viral RNA Kits™ von Qiagen, Hepatitis C Virus- Lysereagenz des Amplicor HCV Kits™ der Hoffmann-La Röche AG) . Bei der Verwendung der käuflichen Lysepuffer erfolgt die Behandlung der Proben analog dem jeweiligen Protokoll der Hersteller .After the inhibitor has been removed, the DNA can be further purified and isolated. It is advantageous to use non-specific proteinases such as Proteinase K to break down proteins and nucleic acid-cleaving enzymes. Then you get a viscous, gelatinous liquid. From this, the DNA is isolated from the aqueous phase, preferably by means of phenol extraction and subsequent ethanol precipitation. Alternatively, the DNA can be removed by using a detergent, for example a chaotropic guanidine-containing detergent (such as DNAzol ™ from Gibco BRL), followed by ethanol precipitation from the aqueous phase isolate. For this purpose, the DNA-containing solution digested with Proteinase K is mixed with the detergent and ethanol and immediately pelleted by a centrifugation step. Since neither organic solvents (phenol, chloroform) are used, nor are several centrifugation steps required for extraction, this process is very user-friendly and time-saving. The use of organic solvents such as phenol or chaotropic detergents for isolating DNA can alternatively be replaced by the use of centrifugation columns known for this purpose, for example QIAamp-spin columns ™ from Qiagen ™. Both a proteinase K digestion and the use of commercially available lysis buffers (for example AVL buffer of the QIAamp Viral RNA Kit ™ from Qiagen, hepatitis C virus lysis reagent of the Amplicor HCV Kit ™ from Hoffmann-La.) Are suitable for cell lysis Röche AG). When using the commercially available lysis buffers, the samples are treated in accordance with the manufacturer's protocol.
An die Reinigung bzw. Isolierung der DNA bzw. RNA können sich dann - je nach Wunsch - Folgereaktionen anschließen. Die hierfür erforderliche Qualität der Nukleinsäureprobe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Verfügung gestellt. Die erfindungsgemäße Verfahrensweise gewährleistet eine Präparation der Nukleinsäure mit hoher Ausbeute (beispielsweise 10-20 μg DNA pro 200 mg Stuhlprobe) und Reinheit (A26o/28o = 1/7 - 1,9) unter .Abreinigung von Inhibitoren enzymatischer Reaktionen und erlaubt es, eine qualitativ reproduzierbare .Analytik durchzuführen, insbesondere in Kombination mit enzymatischen Verfahren zur Amplifikation von DNA.Subsequent reactions can then follow the purification or isolation of the DNA or RNA, as desired. The quality of the nucleic acid sample required for this is provided by the method according to the invention. The procedure according to the invention ensures preparation of the nucleic acid with high yield (for example 10-20 μg DNA per 200 mg stool sample) and purity (A 26 o / 28o = 1/7 - 1.9) while cleaning inhibitors of enzymatic reactions and allows it to perform a qualitatively reproducible analysis, in particular in combination with enzymatic methods for amplifying DNA.
Es hat sich herausgestellt, daß das erfindungsgemäße Verfahren in besonders günstiger Weise mit einer PCR-Amplifikation kombiniert werden kann, wobei bereits eine einfache PCR in über 60 %, teilweise in über 80 % aller untersuchten Stuhlproben zum Erfolg führte.It has been found that the method according to the invention can be combined in a particularly advantageous manner with a PCR amplification, a simple PCR in over 60%, partly in over 80% of all examined stool samples led to success.
Bei einer .Amplifikation der isolierten Stuhl-DNA mittels einer verschachtelten PCR konnte sogar in bis zu 100 % der getesteten Proben das erwartete .Amplifikat erhalten werden.When the isolated stool DNA was amplified by means of a nested PCR, the expected .amplicate could even be obtained in up to 100% of the samples tested.
Die gemäß dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren gereinigte bzw. isolierte DNA wird vorzugsweise einer PCR unterworfen, die in Gegenwart eines Trägerproteins, wie Rinderserumalbumin (BSA) , ausgeführt wird. Die Trägerproteinkonzentration wird dabei hoch gewählt, vorzugsweise mehr als 50 μg/ml. Sehr gute Amplifikationsraten haben sich bei Trägerprotein- Konzentrationen im Bereich von 120 - 200 μg/ml ergeben. Weiterhin wirken sich relativ hohe Konzentrationen an für die PCR erforderlichen Nukleotiden (Desoxyribonukleosid-The DNA purified or isolated according to the purification method according to the invention is preferably subjected to a PCR which is carried out in the presence of a carrier protein, such as bovine serum albumin (BSA). The carrier protein concentration is chosen to be high, preferably more than 50 μg / ml. Very good amplification rates have been found for carrier protein concentrations in the range of 120-200 μg / ml. Furthermore, relatively high concentrations of nucleotides required for the PCR (deoxyribonucleoside
Triphosphate) , Primer und DNA-Polymeräsen wie der Tag-DNA- Polymerase vorteilhaft aus. Die Nukleotidkonzentrationen liegen vorzugsweise im Bereich von 150-225 μM. Gleichzeitig liegt die Primerkonzentration im Bereich von 0,75 bis 1,25 μM. Der Gehalt an DNA-Polymerase liegt geeigneterweise im Bereich von 2 bis 3 Units pro 50 μl-Ansatz.Triphosphate), primers and DNA polymerases such as Tag DNA polymerase advantageous. The nucleotide concentrations are preferably in the range of 150-225 μM. At the same time, the primer concentration is in the range from 0.75 to 1.25 μM. The content of DNA polymerase is suitably in the range of 2 to 3 units per 50 ul batch.
•Die Amplifikation erfolgt hinsichtlich der beabsichtigten routinemäßigen Anwendung im diagnostischen Labor vorzugsweise durch eine einfache PCR, in der 30-35 Temperaturzyklen durchlaufen werden. • With regard to the intended routine use in the diagnostic laboratory, the amplification is preferably carried out by a simple PCR in which 30-35 temperature cycles are carried out.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel 1The invention is illustrated by the following examples. example 1
Isolierung von DNA aus einer Stuhlprobe:Isolation of DNA from a stool sample:
200 mg Stuhlmaterial wird für die Dauer von mindestens einer Stunde bei -80 °C tiefgefroren, anschließend mit 600 μl Lysepuffer (500 M Tris, 75 mM EDTA, 10 M NaCl, 1 % SDS, pH 9,0) versetzt und homogenisiert. Die lysierte Probe wird 10 min. bei 4 °C und 6000 x g in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert, um grobe Stuhlpartikel, Zelltrümmer, Bakterien und Nahrungsmittelreste abzutrennen. Der Überstand wird ein zweites Mal bei 4 °C, 20000 x g 10 min. zentrifugiert. Der DNA- haltige Überstand wird mit dem gleichen Volumen einer Colestyramin-Lösung (5 % Colestyramin in Lysepuffer) versetzt, gut durchmischt, 2 min. bei Raumtemperatur inkubiert und wie oben beschrieben bei 20000 x g zentrifugiert. Nach einer Wiederholung dieses Extraktionsschrittes wird der klare Überstand mit der Proteinase K (Endkonzentration 100 μg/ml) 2 Stunden bei 56 °C inkubiert. Die verdaute Probe wird mit dem gleichen Volumen einer Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung (25:24:1) versetzt, gut durchmischt und 5 min. bei Raumtemperatur und 20000 x g abzentrifugiert . Die wässrige, obere Phase wird ein weiteres Mal mit dem gleichen Volumen einer Chloroform-Isoa ylalkohol-Lösung (24:1) versetzt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Aus der wässrigen, oberen Phase kann die DNA durch eine Ethanolpräzipitation, durch Zugabe von 1/10-Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 2,5-fachem Volumen 100 %igem Ethanol, pelletiert werden. Das in 75 %igem Ethanol gewaschene und bei Raumtemperatur getrocknete DNA-Pellet wird in 100 μl destilliertem Wasser gelöst. Die DNA-Ausbeute beträgt 10-15 μg pro 200 mg Stuhlprobe mit einem A260/2eo-Verhältnis von 1,7. 5 μl dieser DNA-Lösung werden zur Amplifikation definierter Gene/Genabschnitte in einem 50 μl-PCR-Ansatz eingesetzt. Das Amplifikationsgemisch setzt sich wie folgt zusammen:200 mg of stool material is deep-frozen for at least one hour at -80 ° C, then mixed with 600 μl lysis buffer (500 M Tris, 75 mM EDTA, 10 M NaCl, 1% SDS, pH 9.0) and homogenized. The lysed sample is 10 min. Centrifuged at 4 ° C and 6000 xg in an Eppendorf table centrifuge to remove coarse stool particles, cell debris, bacteria and food residues. The supernatant is a second time at 4 ° C, 20,000 xg 10 min. centrifuged. The DNA-containing supernatant is mixed with the same volume of a colestyramine solution (5% colestyramine in lysis buffer), mixed well, 2 min. incubated at room temperature and centrifuged as described above at 20,000 xg. After repeating this extraction step, the clear supernatant is incubated with proteinase K (final concentration 100 μg / ml) for 2 hours at 56 ° C. The digested sample is mixed with the same volume of a phenol-chloroform-isoamyl alcohol solution (25: 24: 1), mixed well and 5 min. centrifuged at room temperature and 20,000 xg. The aqueous, upper phase is mixed once more with the same volume of a chloroform-isoyl alcohol solution (24: 1) and centrifuged as described above. The DNA can be pelleted from the aqueous, upper phase by ethanol precipitation, by adding 1/10 volume of 3 M sodium acetate, pH 5.2 and 2.5 times the volume of 100% ethanol. The DNA pellet, washed in 75% ethanol and dried at room temperature, is dissolved in 100 μl of distilled water. The DNA yield is 10-15 μg per 200 mg stool sample with an A 260/2 eo ratio of 1.7. 5 μl of this DNA solution are used to amplify defined genes / gene segments in a 50 μl PCR approach used. The amplification mixture is composed as follows:
10 M Tris-HCl, pH 8, 310 M Tris-HCl, pH 8.3
50 mM KC150 mM KC1
2, 0 mM MgCl2 2.0 mM MgCl 2
200 μM jedes dNTP200 µM each dNTP
160 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA)160 μg / ml bovine serum albumin (BSA)
1 μM jeder Primer1 μM each primer
2,5 U Tag-DNA-Polymerase pro 50 μl-Ansatz2.5 U tag DNA polymerase per 50 μl mixture
Beispiel 2Example 2
Alternative Isolierung von DNA aus einer StuhlprobeAlternative isolation of DNA from a stool sample
200 mg Stuhlmaterial wird für die Dauer von mindestens einer Stunde bei - 80 °C tiefgefroren, anschließend mit 600 μl Lysepuffer (500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1 % SDS, pH 9,0) versetzt und homogenisiert. Die lysierte Probe wird 10 min. bei 4 °C und 5000 x g in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert, um grobe Stuhlpartikel, Zelltrümmer, Bakterien und Nahrungsmittelreste abzutrennen. Der Überstand wird ein zweites Mal bei 4 °C, 13000 x g 10 min. zentrifugiert. Der DNA- haltige Überstand wird mit dem gleichen Volumen einer Colestipolhydrochlorid-Lösung (10 % Colestipolhydrochlorid in Lysepuffer) versetzt, gut durchmischt, 2 min. bei Raumtemperatur inkubiert und wie oben beschrieben bei 13000 x g zentrifugiert. Nach einer Wiederholung dieses Extraktionsschrittes wird der klare Überstand mit der Proteinase K (Endkonzentration 100 μg/ml) 2 Stunden bei 56 °C inkubiert. Die verdaute Probe wird mit dem gleichen Volumen einer Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung (25:24:1) versetzt, gut durchmischt und 5 min. bei Raumtemperatur und 13000 x g abzentrifugiert . Die wässrige, obere Phase wird ein weiteres Mal mit dem gleichen Volumen einer Chloroform- Isoamylalkohol-Lösung (24:1) versetzt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Aus der wässrigen, oberen Phase kann die DNA durch eine Ethanolpräzipitation, durch Zugabe von 1/10-Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 2,5-fachem Volumen200 mg of stool material is frozen for at least one hour at - 80 ° C, then mixed with 600 μl lysis buffer (500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1% SDS, pH 9.0) and homogenized. The lysed sample is 10 min. Centrifuged at 4 ° C and 5000 xg in an Eppendorf table centrifuge to remove coarse stool particles, cell debris, bacteria and food residues. The supernatant is a second time at 4 ° C, 13000 xg 10 min. centrifuged. The DNA-containing supernatant is mixed with the same volume of a colestipol hydrochloride solution (10% colestipol hydrochloride in lysis buffer), mixed well, 2 min. incubated at room temperature and centrifuged as described above at 13000 xg. After repeating this extraction step, the clear supernatant is incubated with proteinase K (final concentration 100 μg / ml) for 2 hours at 56 ° C. The digested sample is mixed with the same volume of a phenol-chloroform-isoamyl alcohol solution (25: 24: 1), mixed well and 5 min. centrifuged at room temperature and 13000 xg. The aqueous, upper phase becomes a again with the same volume of a chloroform-isoamyl alcohol solution (24: 1) and centrifuged as described above. The DNA can be removed from the aqueous, upper phase by ethanol precipitation, by adding 1/10 volume of 3 M sodium acetate, pH 5.2 and 2.5 times the volume
100 %igem Ethanol, entfernt werden. Das in 75 %igem Ethanol gewaschene und bei Raumtemperatur getrocknete DNA-Pellet wird in 100 μl destilliertem Wasser gelöst. Die DNA-Ausbeute beträgt 15-20 μg pro 200 mg Stuhlprobe mit einem A260/A280-Verhältnis von 1,9. 5 μl dieser DNA-Lösung werden zur Amplifikation definierter Gene/Genabschnitte in einen 50 μl-PCR-Ansatz eingesetzt. Das Amplifikationsgemisch ist identisch mit demjenigen des Beispiels 1.100% ethanol. The DNA pellet, washed in 75% ethanol and dried at room temperature, is dissolved in 100 μl of distilled water. The DNA yield is 15-20 μg per 200 mg stool sample with an A 260 / A 280 ratio of 1.9. 5 μl of this DNA solution are used for the amplification of defined genes / gene segments in a 50 μl PCR approach. The amplification mixture is identical to that of Example 1.
Beispiel 3Example 3
Isolierung von DNA aus Vollblut:Isolation of DNA from Whole Blood:
500 μl Citrat-, Heparin- oder EDTA-Blut oder tiefgefrorenes und wieder aufgetautes Blut werden mit 500 μl Lysepuffer (500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1 % SDS, pH 9,0) versetzt und gut durchmischt. Die DNA-haltige Lösung wird mit dem gleichen Volumen einer Colestyramin-Lösung (2,5 % Colestyramin in Lysepuffer) versetzt, gut durchmischt, 2 min. bei500 μl citrate, heparin or EDTA blood or frozen and thawed blood are mixed with 500 μl lysis buffer (500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1% SDS, pH 9.0) and mixed well. The DNA-containing solution is mixed with the same volume of a colestyramine solution (2.5% colestyramine in lysis buffer), mixed well, 2 min. at
Raumtemperatur inkubiert und wie oben beschrieben bei 20000 x g zentrifugiert. Nach einer Wiederholung dieses Extraktionsschrittes wird der klare Überstand mit der Proteinase K (Endkonzentration 100 μg/ml) 2 Stunden bei 56 °C inkubiert. Die verdaute Probe wird mit dem gleichen VolumenIncubated at room temperature and centrifuged as described above at 20,000 x g. After repeating this extraction step, the clear supernatant is incubated with proteinase K (final concentration 100 μg / ml) for 2 hours at 56 ° C. The digested sample is of the same volume
Phenol versetzt, gut durchmischt und 5 min. bei Raumtemperatur und 20000 x g abzentrifugiert . Die wässrige, obere Phase wird ein weiteres Mal mit dem gleichen Volumen einer Chloroform- Isoamylalkohol-Lösung (24:1) versetzt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Nach effizienter Lyse aller eukaryontischen und/oder prokaryontischen Zellen und/oder Viren (gleichzeitige Inaktivierung infektiöser Pathogene) und durch Denaturierung und enzymatischen Abbau von Proteinen (gleichzeitige Entfernung der an die Nukleinsäure gebundenen Proteine) kann die DNA aus der wässrigen, oberen Phase durch eine Ethanolpräzipitation, durch Zugabe von 1/10-Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 2,5-fachem Volumen 100 %igem Ethanol, pelletiert werden. Das in 75 %igem Ethanol gewaschene und bei Raumtemperatur getrocknete DNA-Pellet wird in 30 μl destilliertem Wasser gelöst. Die DNA- Ausbeute beträgt 5 - 10 μg pro 500 μl Vollblut mit einem Ä26o/28o-Verhältnis von 1,7. 5 μl dieser DNA-Lösung werden zur Amplifikation definierter Gene/Genabschnitte in einem 50 μl- PCR-Ansatz eingesetzt. Das Amplifikationsgemisch ist identisch mit demjenigen des Beispiels 1. Phenol added, mixed well and 5 min. centrifuged at room temperature and 20,000 xg. The aqueous, upper phase is again mixed with the same volume of a chloroform-isoamyl alcohol solution (24: 1) and as described above centrifuged. After efficient lysis of all eukaryotic and / or prokaryotic cells and / or viruses (simultaneous inactivation of infectious pathogens) and through denaturation and enzymatic degradation of proteins (simultaneous removal of the proteins bound to the nucleic acid), the DNA can be removed from the aqueous, upper phase by ethanol precipitation , by adding 1/10 volume of 3 M sodium acetate, pH 5.2 and 2.5 times the volume of 100% ethanol. The DNA pellet, washed in 75% ethanol and dried at room temperature, is dissolved in 30 μl of distilled water. The DNA yield is 5-10 μg per 500 μl whole blood with an Ä 2 6o / 2 8o ratio of 1.7. 5 μl of this DNA solution are used for the amplification of defined genes / gene segments in a 50 μl PCR approach. The amplification mixture is identical to that of Example 1.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Reinigung, gegebenenfalls auch Analyse, von Nukleinsäuren aus biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren den Schritt umfaßt, daß die Nukleinsäure- haltige Probe mit einem Anionenaustauscher-Kunstharz umgesetzt wird, welches eine Bindungsaffinität zu Gallensäuren besitzt, wobei die möglicherweise vorhandenen Inhibitoren für die gegebenenfalls anschließende Nukleinsäure-Analysereaktion an das Anionenaustauscherharz gebunden und abgetrennt werden.1. A method for purification, optionally also analysis, of nucleic acids from biological samples, characterized in that the method comprises the step that the nucleic acid-containing sample is reacted with an anion exchanger synthetic resin which has a binding affinity to bile acids, which may existing inhibitors for the optionally subsequent nucleic acid analysis reaction are bound to the anion exchange resin and separated.
2. Verfahren nach .Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Anionenaustauscher-Kunstharz ein Polystyrol-Copolymer, welches mit Divinylbenzol vernetzt und durch den Einbau von tertiären und/oder quartären Ammoniumgruppen stark basisch gemacht wurde, umfaßt .2. The method according to .Anspruch 1, characterized in that the anion exchanger synthetic resin comprises a polystyrene copolymer which has been crosslinked with divinylbenzene and made strongly basic by the incorporation of tertiary and / or quaternary ammonium groups.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Copolymer Colestyramin verwendet wird.3. The method according to claim 2, characterized in that colestyramine is used as the copolymer.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Anionenaustauscher-Kunstharz ein Polyalkylamin-Harz umfaßt.4. The method according to claim 1, characterized in that the anion exchanger synthetic resin comprises a polyalkylamine resin.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Copolymer aus Polyethylenpolyamin- und Epichlorhydrin-Monomeren gebildet wurde.5. The method according to claim 4, characterized in that the copolymer was formed from polyethylene polyamine and epichlorohydrin monomers.
6. Verfahren nach .Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Copolymer Colestipol verwendet wird.6. The method according to .Anspruch 5, characterized in that Colestipol is used as a copolymer.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Umsetzung der Gehalt des Anionenaustauscher-Kunstharzes in einer Harzsuspension 10 Gew.- % nicht übersteigt.7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that in the implementation of the content of Anion exchanger synthetic resin in a resin suspension does not exceed 10% by weight.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure nach der Umsetzung mit dem .Anionenaustauscher-Kunstharz durch einen Isolierschritt isoliert wird.8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the nucleic acid is isolated by an isolation step after the reaction with the .anion exchanger synthetic resin.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Isolierschritt durch Phenolextraktion mit anschließender9. The method according to claim 8, characterized in that the isolation step by phenol extraction with subsequent
Alkoholpräzipitation erfolgt.Alcohol precipitation takes place.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden .Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gereinigte Nukleinsäure zur nachfolgenden .Analyse einer Polymerase-Kettenreaktion unterworfen wird.10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the purified nucleic acid is subjected to a polymerase chain reaction for subsequent analysis.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase-Kettenreaktion in Gegenwart von Trägerprotein erfolgt.11. The method according to claim 10, characterized in that the polymerase chain reaction takes place in the presence of carrier protein.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerprotein-Konzentration mehr als 50 μg/ml beträgt.12. The method according to claim 11, characterized in that the carrier protein concentration is more than 50 μg / ml.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Polymerase-Kettenreaktionsansatz 120-200 μg/ml Trägerprotein, 150-225 μM von jedem eingesetzten Desoxyribonukleosid-Triphosphat und 0,75-1,25 μM von jedem eingesetzten Primer enthält.13. The method according to claim 11 or 12, characterized in that the polymerase chain reaction mixture contains 120-200 μg / ml carrier protein, 150-225 μM of each deoxyribonucleoside triphosphate used and 0.75-1.25 μM of each primer used.
14. Verwendung von Colestyramin zum Reinigen und/oder Isolieren und gegebenenfalls anschließenden .Analysieren von Nukleinsäuren aus biologischen Proben. 14. Use of colestyramine for cleaning and / or isolation and, if necessary, subsequent analysis of nucleic acids from biological samples.
15. Verwendung von Colestipol zum Reinigen und/oder Isolieren und gegebenenfalls anschließenden .Analysieren von Nukleinsäuren aus biologischen Proben. 15. Use of Colestipol for cleaning and / or isolation and, if necessary, subsequent analysis of nucleic acids from biological samples.
PCT/EP1997/005129 1996-09-19 1997-09-18 Method for purifying and eventually analyzing nucleic acids from biological test samples WO1998012351A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU47754/97A AU4775497A (en) 1996-09-19 1997-09-18 Method for purifying and eventually analyzing nucleic acids from biological test samples

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19638362.5 1996-09-19
DE19638362A DE19638362C1 (en) 1996-09-19 1996-09-19 Isolation of nucleic acids from sample
DE19731670A DE19731670C2 (en) 1997-07-23 1997-07-23 Process for the purification and optionally analysis of nucleic acids from biological samples
DE19731670.0 1997-07-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1998012351A1 true WO1998012351A1 (en) 1998-03-26

Family

ID=26029568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1997/005129 WO1998012351A1 (en) 1996-09-19 1997-09-18 Method for purifying and eventually analyzing nucleic acids from biological test samples

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU4775497A (en)
WO (1) WO1998012351A1 (en)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0915171A2 (en) * 1997-11-04 1999-05-12 Becton, Dickinson and Company Sample processing method using ion exchange resin
WO2000071698A2 (en) * 1999-04-30 2000-11-30 Connex Gesellschaft Zur Optimierung Von Forschung Und Entwicklung Mbh Mixture for neutralizing enzyme inhibitors
WO2001010554A2 (en) * 1999-08-09 2001-02-15 Bilatec Ag Laboratory robot and method and reagent kit for isolating nucleic acids
US7347976B2 (en) 2001-12-20 2008-03-25 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using a hydrophilic solid support in a hydrophobic matrix
US7871827B2 (en) 2001-12-20 2011-01-18 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using anion exchange
US7939249B2 (en) 2003-12-24 2011-05-10 3M Innovative Properties Company Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step
US7981600B2 (en) 2003-04-17 2011-07-19 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using an anion exchange material that includes a polyoxyalkylene
US10435735B2 (en) 2014-03-07 2019-10-08 Dna Genotek Inc. Composition and method for stabilizing nucleic acids in biological samples
US11002646B2 (en) 2011-06-19 2021-05-11 DNA Genotek, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection
US11572581B2 (en) 2002-06-07 2023-02-07 DNA Genotek, Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2391730A1 (en) * 1977-05-23 1978-12-22 Bristol Myers Co COMPOSITION BASED ON AN ANIONIC EXCHANGE STYRENE-DIVINYLBENZENE RESIN CARRYING QUATERNARY AMMONIUM GROUPS, INTENDED TO BIND BILIARY ACIDS
EP0270017A2 (en) * 1986-12-01 1988-06-08 Syngene, Inc. Method of isolating and purifying nucleic acids from biological samples
DE4136322A1 (en) * 1991-11-05 1993-05-06 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De New pectin deriv. bile acid adsorption agents - useful for treating hyperlipidaemia and can be administered at lower doses than colestyramine or colestipol resins
JPH0623281A (en) * 1992-07-10 1994-02-01 Babcock Hitachi Kk Anion exchange resin for liquid chromatography
JPH07277993A (en) * 1994-04-01 1995-10-24 Sekisui Chem Co Ltd Bile acid-adsorbing agent

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2391730A1 (en) * 1977-05-23 1978-12-22 Bristol Myers Co COMPOSITION BASED ON AN ANIONIC EXCHANGE STYRENE-DIVINYLBENZENE RESIN CARRYING QUATERNARY AMMONIUM GROUPS, INTENDED TO BIND BILIARY ACIDS
EP0270017A2 (en) * 1986-12-01 1988-06-08 Syngene, Inc. Method of isolating and purifying nucleic acids from biological samples
DE4136322A1 (en) * 1991-11-05 1993-05-06 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De New pectin deriv. bile acid adsorption agents - useful for treating hyperlipidaemia and can be administered at lower doses than colestyramine or colestipol resins
JPH0623281A (en) * 1992-07-10 1994-02-01 Babcock Hitachi Kk Anion exchange resin for liquid chromatography
JPH07277993A (en) * 1994-04-01 1995-10-24 Sekisui Chem Co Ltd Bile acid-adsorbing agent

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEUTER R. ET AL.,: "A method for preparation of fecal DNA suitable for PCR", NUCLEIC AIDS RESEARCH, vol. 23, no. 18, - 25 September 1995 (1995-09-25), pages 3800 - 3801, XP002017414 *
KRAMVIS A. E AL.,: "Comparison of hepatitis B virus DNA extractions from serum by the QIAamp blood kit, genereleaser, and the Phenol-chloroform method", J. CLIN. MICROBIOLOGY, vol. 34, no. 11, - November 1996 (1996-11-01), pages 2731 - 2733, XP002054107 *
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 018, no. 233 (C - 1195) 28 April 1994 (1994-04-28) *
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 096, no. 002 29 February 1996 (1996-02-29) *
WIDJOJOATMODJO M. N. ET AL.,: "The magnetic immuno polymerase chain raction assay for direct detetction of salmonellae in fecal samples", J. CLIN. MICROBIOLOGY, vol. 30, no. 12, - December 1992 (1992-12-01), pages 3195 - 3199, XP002054106 *

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0915171A2 (en) * 1997-11-04 1999-05-12 Becton, Dickinson and Company Sample processing method using ion exchange resin
EP0915171A3 (en) * 1997-11-04 2000-03-22 Becton, Dickinson and Company Sample processing method using ion exchange resin
US6241980B1 (en) 1997-11-04 2001-06-05 Becton, Dickinson And Company Sample processing method using ion exchange resin
US6265224B1 (en) 1997-11-04 2001-07-24 Becton, Dickinson And Company Sample processing method using ion exchange resin
WO2000071698A2 (en) * 1999-04-30 2000-11-30 Connex Gesellschaft Zur Optimierung Von Forschung Und Entwicklung Mbh Mixture for neutralizing enzyme inhibitors
WO2000071698A3 (en) * 1999-04-30 2001-02-15 Connex Ges Zur Optimierung Von Mixture for neutralizing enzyme inhibitors
WO2001010554A2 (en) * 1999-08-09 2001-02-15 Bilatec Ag Laboratory robot and method and reagent kit for isolating nucleic acids
WO2001010554A3 (en) * 1999-08-09 2001-08-23 Bilatec Ges Zur Entwicklung Bi Laboratory robot and method and reagent kit for isolating nucleic acids
US7347976B2 (en) 2001-12-20 2008-03-25 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using a hydrophilic solid support in a hydrophobic matrix
US7871827B2 (en) 2001-12-20 2011-01-18 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using anion exchange
US11572581B2 (en) 2002-06-07 2023-02-07 DNA Genotek, Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
US7981600B2 (en) 2003-04-17 2011-07-19 3M Innovative Properties Company Methods and devices for removal of organic molecules from biological mixtures using an anion exchange material that includes a polyoxyalkylene
US7939249B2 (en) 2003-12-24 2011-05-10 3M Innovative Properties Company Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step
US11002646B2 (en) 2011-06-19 2021-05-11 DNA Genotek, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection
US11536632B2 (en) 2011-06-19 2022-12-27 DNA Genotek, Inc. Biological collection system
US11549870B2 (en) 2011-06-19 2023-01-10 DNA Genotek, Inc. Cell preserving solution
US11592368B2 (en) 2011-06-19 2023-02-28 DNA Genotek, Inc. Method for collecting and preserving a biological sample
US10435735B2 (en) 2014-03-07 2019-10-08 Dna Genotek Inc. Composition and method for stabilizing nucleic acids in biological samples
US11198899B2 (en) 2014-03-07 2021-12-14 Dna Genotek Inc. Composition and method for stabilizing nucleic acids in biological samples

Also Published As

Publication number Publication date
AU4775497A (en) 1998-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69734263T2 (en) Process for isolating ribonucleic acids.
DE4321904B4 (en) Method for chromatographic purification and separation of nucleic acid mixtures
DE69802191T3 (en) Solid phase nucleic acid isolation
EP1851313B1 (en) Method for isolating nucleic acids, wherein the nucleic acids are immobilised on a matrix at elevated temperatures
DE2915082C3 (en) Method and use of a reagent set for the detection and characterization of nucleic acids and their sequences
DE69730974T2 (en) METHOD OF ISOLATING NUCLEIC ACIDS USING ALKALINE PHOSPHATASE
EP1146049B1 (en) Process for separating double-stranded/single-stranded nucleic acid structures
EP0765335B1 (en) Universal process for isolating and purifying nucleic acids from extremely small amounts of highly contaminated various starting materials
DE10084502B4 (en) Process for purifying nucleic acid with silicon carbide
DE19900638C2 (en) Method of isolating DNA from biological materials
DE60012549T2 (en) METHOD OF ISOLATING NUCLEIC ACIDS AND KIT
DE69636553T2 (en) Nucleic acid-binding magnetic carrier and method for nucleic acid isolation using it
DE3639949A1 (en) METHOD FOR SEPARATING LONG CHAIN NUCLEIC ACIDS
DE19856064A1 (en) Universal method for the isolation of DNA from any starting material
WO1999040098A1 (en) Method for isolating and purifying nucleic acids
WO2011061274A1 (en) Method for selectively enriching and isolating microbial and optionally additional viral nucleic acids
WO2000024927A1 (en) Methods and means for isolating and purifying nucleic acids on surfaces
EP1960520A1 (en) Method of isolating nucleic acids from any starting material
DE60014399T2 (en) FAST AND EFFECTIVE DNA IMMOBILIZATION FROM A SAMPLE WITHOUT THE USE OF CELL LYING AGENTS
WO1998012351A1 (en) Method for purifying and eventually analyzing nucleic acids from biological test samples
EP1560926B1 (en) Novel buffer formulations for isolating, purifying and recovering long-chain and short-chain nucleic acids
EP1771242B1 (en) Method for efficient isolation of nucleic acids
DE69632904T2 (en) COPRECIPITATE AND METHOD FOR THE EXTRACTION OF NUCLEIC ACIDS
EP2264184A1 (en) Method for amplifying DNA using tetraethylenglycol, kit of parts for same and use of same
EP2010672B1 (en) Formulations and method for isolating nucleic acids from complex starting materials and subsequent complex genetic analysis

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CU CZ DE DK EE ES FI GB GE GH HU ID IL IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV GH

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH KE LS MW SD SZ UG ZW AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 1998514297

Format of ref document f/p: F

122 Ep: pct application non-entry in european phase
REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA