WO1998009154A1 - System zur unterscheidung fluoreszierender molekülgruppen durch zeitaufgelöste fluoreszenzmessung - Google Patents

System zur unterscheidung fluoreszierender molekülgruppen durch zeitaufgelöste fluoreszenzmessung Download PDF

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WO1998009154A1
WO1998009154A1 PCT/EP1997/004665 EP9704665W WO9809154A1 WO 1998009154 A1 WO1998009154 A1 WO 1998009154A1 EP 9704665 W EP9704665 W EP 9704665W WO 9809154 A1 WO9809154 A1 WO 9809154A1
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WO
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sample volume
time interval
fluorescence
time
detector
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PCT/EP1997/004665
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French (fr)
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Ralph Müller
Markus Sauer
Christoph Zander
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a system for distinguishing at least two differently fluorescent types of molecular groups which are bound to analyte molecules by time-resolved fluorescence measurement with a light source which irradiates a first sample volume with light which is suitable, the at least two types of moles - Excite cul groups for fluorescence and with a detector for the detection of fluorescence radiation emitted from a second sample volume that at least partially overlaps the first sample volume and with a control unit that is designed to activate the light source for a time interval Ti and after a time interval T has elapsed 2 to activate the detector for a time interval T 3 , the irradiation and detection of emitted fluorescent radiation being carried out at least 10000 times per millisecond, the detector signals recorded during a time interval T 3 with a recording unit by an off unit of value are evaluated and it is determined from the temporal signal curves in the time interval T 3 which of the at least two molecular groups is contained in the overlapping sample volume
  • the present invention falls into the field of chemical analysis by detection of excited fluorescent radiation.
  • Such analytical methods have a very wide range of applications, although the field of application of biochemistry has recently come to the fore.
  • the detection of fluorescent radiation can be used to carry out sequencing of nucleic acids, as described, for example, in EP-B-0 157 280.
  • sequencing method cloned DNA strands are produced, from which fragments are formed, the ends of which are provided with bases A, G, C and T, which are labeled with fluorescence.
  • apparatuses are known in the prior art, for example in US Pat. 5,252,834, with which it is possible, by suitable timing of the excitation light and the detected fluorescence, to avoid unwanted background radiation. close However, the apparatus described in US Pat. No. 5,252,834 uses a complex spectral analysis of the emitted fluorescence radiation in order to identify analyte molecules
  • EP-A-0 563 998 already describes a method for the detection of biomolecules which is based on time-resolved laser spectroscopy.
  • the method which is covered here is based on the fact that the molecules to be detected are marked by different fluorescent dyes which have different fluorescence lifetimes.
  • the fluorescence lifetimes are distinguished from one another by a time-resolved fluorescence spectroscopy, with the emitted fluorescence being detected with a time delay compared to the excitation light in order to suppress background radiation
  • the described methods and devices of the prior art are based on the fact that a larger number of molecules with the same fluorescence properties are present, so that detection and characterization of the fluorescent molecules is possible. In order to achieve this, either sufficiently high molecular concentrations must be present or must A sufficiently large sample volume is irradiated.Both procedures which aim to receive fluorescent light from a larger number of molecules have the disadvantage that the molecular ensemble does not necessarily have to be homogeneous, that is to say that molecules of different fluorescence properties may be detected. An evaluation of the fluorescence radiation is carried out in accordance with of the fluorescence lifetime, a common and therefore averaged fluorescence lifetime is assigned to the molecular ensemble under consideration.
  • a system for differentiating different types of fluorescent molecular groups according to claim 1.
  • a system of the present invention also enables the examined molecules to be reliably differentiated and assigned to specific groups possible if only a few or even individual molecules are present in the examined sample volume.
  • Another advantage of the present invention is that it is suitable for examining very small sample volumes. This opens up the possibility of greatly miniaturizing detection systems, such as those used in DNA sequencing.
  • fluorescence techniques have opened up a wide range of applications due to their simplicity and high sensitivity.
  • fluorescence analysis in particular, the focus is on methods in which the intrinsic fluorescence of the analyte molecules is not exploited, but rather the analyte molecules are first specifically bound to suitably fluorescent groups of molecules.
  • fluorescence techniques particularly in connection with immunological assays or nucleic acid detection, are of great importance, because here specifically immunological affinities or selective hybridization properties of oligonucleotides on analyte nucleic acids can be exploited.
  • the substances specifically bindable to the analyte such as.
  • detection molecules are directly or indirectly bound to fluorescent groups of molecules.
  • the fluorescent molecular groups can largely be selected independently of the analyte molecule to be detected in the respective case and the specifically bindable substance.
  • Those fluorescent dyes are preferably used which have favorable properties, such as a high quantum yield, high photostability and or a suitable absorption range, without this selection being subject to significant restrictions by the analyte molecule to be detected in each case
  • the sensitivity of fluorescence techniques is mainly limited by the background fluorescence of the sample and possibly the sample carrier.
  • the detection of emitted fluorescent light is only carried out when a predetermined time has elapsed after the fluorescence excitation. Setting a time window between the fluorescence excitation and the detection of emitted fluorescence prevents the spontaneous emission of the sample or the sample vessel from contributing to the measured fluorescence signal.
  • the time interval T 2 between irradiation of the sample volume and activation of the detector is preferably between 0.1 and 10 ns
  • Another measure which is carried out according to the invention to increase sensitivity is that only a small sample volume, preferably between 0.05 and 10 femtoliters, is irradiated with light which is suitable for exciting the fluorescent groups of molecules. In this way it can be prevented that fluorescence from outside the examined area contributes to the signal.
  • Conventional methods for fluorescence analysis assume that the emitted fluorescence originates from a molecular ensemble which comprises several thousand or several hundred thousand molecules. This ensures on the one hand that the signal intensity is sufficiently high and that there is still a statistical distribution of fluorescence lifetimes and fluorescence frequencies.
  • the molecule ensemble preferably even consists of one or a few molecules of the same type.
  • analyte molecules can be antigens, antibodies, nucleic acids or fragments thereof.
  • any substances into which analyte molecules can be specifically bound can be considered as analyte molecules.
  • the analyte molecules themselves can also contain or be bound to fluorescent molecule groups which can be detected according to the invention. The latter case occurs particularly in the case of a sequence analysis of Nucleic acids.
  • sequence analysis named after Sanger should be mentioned in this context. In this method, the counter strand to a nucleic acid to be sequenced is built up by enzymatic synthesis.
  • a primer is hybridized to a single-stranded nucleic acid, which is elongated with the incorporation of mononucleotides.
  • mononucleotide analogs are also used, which bring about a chain termination, ie that further elongation of the strand is prevented after their installation.
  • mononucleotide analogs are used for chain termination, which contain a fluorescence label.
  • fluorescent dyes are used to distinguish between the four possible mononucleotides. In the context of the invention, these fluorescent dyes are distinguished by time-resolved fluorescence measurement and thus it is determined which base the respective nucleic acid strand is terminated by.
  • the present invention can be used to carry out nucleic acid hybridization assays.
  • an unlabeled capture probe usually an oligonucleotide
  • analyte for example a PCR product
  • this can be detected directly or the analyte in turn is detected with a fluorescence-labeled detection probe.
  • the present invention can furthermore be used very advantageously for the detection and differentiation of fluorescent molecules in capillaries.
  • microcapillaries with an inner diameter of 1 to 2 ⁇ m can be used, through which the liquid to be examined flows.
  • An optical system is used for the examination, which detects the entire cross section or at least a large part of it in a region of the microcapillary, so that the passage of a fluorescent molecule through the capillary is reliably detected.
  • a use of the system is also possible in connection with conventional techniques such as HPLC or CGE.
  • the dyes that are to be distinguished from one another differ in their fluorescence lifetime.
  • the fluorescence lifetime is the average time with which an excited fluorescent dye is in the excited state. The transition from this excited state to an energetically lower state occurs spontaneously and is usually in the nanosecond range. Since the energetic transition of the molecule is a quantum mechanical process, the fluorescence lifetime of an individual molecule is indefinite and the range of experimentally occurring fluorescence lifetimes is given by the Heisenberg uncertainty principle.
  • the prior art uses a sufficiently large molecular ensemble to be irradiated with light of a suitable wavelength and to bring a large number of molecules into the excited state.
  • the transition of the molecules to the ground state usually follows first-order kinetics, so that there is an exponential decay law.
  • the signal intensity is obtained as a function of time.
  • conclusions can be drawn about the fluorescence lifetime. If there is first order kinetics, this is the time after which the fluorescence intensity has dropped to 1 / e.
  • the mean fluorescence lifetime is determined by irradiating one and the same sample volume at least 100 times within one millisecond with light which is suitable for exciting the fluorescent group of molecules.
  • Fluorescent dyes which are suitable in the context of the present invention furthermore have a sufficiently high photo stability, ie the dyes survive a high number of excitation and decay cycles without decomposing.
  • the ones in EP-A-0 563 998 have been found to be particularly suitable Proven dyes
  • Suitable dyes can be selected in particular from the class of rhodamine derivatives, oxazine and carbocyanine.
  • a system for distinguishing fluorescent dyes by time-resolved fluorescence measurement has a light source with which a first sample volume is irradiated.
  • Suitable light sources are in particular lasers, preferably diode lasers and also flash lamps.
  • the light sources must be sufficiently powerful and repeatable at high frequency. The latter property is present when the light source can be activated and deleted for a short time.
  • the repetition frequency of the light sources used is preferably above 10 MHz and has pulse half-lives of less than 1 nanosecond.
  • the emission range of light sources used is selected so that there is sufficient light output, preferably above 100 mW, in the absorption range of the fluorescent dyes. On the other hand, even if a suitable light source is present, the fluorescent dyes can be selected so that their absorption range is suitable
  • Irradiation of the first sample volume with the light source can be direct, i.e. without intermediate optics, if the light beam emitted by the light source is already focused sufficiently to ensure the very small sample volume used according to the invention.
  • the excitation light beam is preferably focused on a sample area by microscopic optics. It is advantageous to collect fluorescence radiation emitted by the sample through the same microscope optics and to direct it to a detector. By using the same optics for coupling the excitation light and coupling out the fluorescent radiation, it can be ensured that the detected signals originate from a narrowly limited spatial area.
  • the spatial area in the direction of the beam is limited by an aperture due to the decreasing sharpness with a spatial distance from the focal plane. In the plane perpendicular to the light beam, the sample volume is limited by the quality of the focusing and the aperture.
  • Irradiation of the sample and detection of fluorescent radiation is carried out according to the invention in such a way that a first sample volume is irradiated and fluorescent radiation from a second sample volume is detected, which at least partially overlaps the first sample volume.
  • a particularly good overlap of the irradiated and evaluated sample area can be achieved if both the excitation light is coupled in and the fluorescent radiation is coupled out using the same optics
  • the sample can be irradiated in a first direction with the light source and emitted fluorescent radiation can be captured independently thereof from a second direction with microscope optics. This is preferably carried out in a so-called 90 ° arrangement. H.
  • the excitation and detection beams form a right angle to each other
  • Fluorescence radiation emanating from the sample is directed onto the detector through an optical system, preferably microscope optics.
  • optical filters can be introduced which filter out background radiation.
  • the beam of rays emanating from the microscope optics is folcussed onto the detector by another optical system. With this so-called confocal arrangement, it is possible to use detectors with a small active area. The cross-section of the detector area is preferably below 500 ⁇ m.
  • Suitable detectors also have a high sensitivity to photons in order to enable an evaluation with the low intensities occurring in the selected arrangement
  • Semiconductor silicon detectors in particular due to their high quantum efficiency of up to 80% in the NIR range.
  • photomultipliers are used that have a relatively large active detector area, the area is limited by a spatial filter (pinhole) in the beam path
  • the detector is activated after the light source has been activated and a waiting time T 2 has elapsed.
  • the activation time of the detector is in the range of 1 ns, while the time resolution of the detected signals is approximately 300 ps. Deactivation of the detector can take a long time, should however, do not exceed 10 ns
  • the signals of the detector are recorded by a recording unit.
  • a recording unit has a very fast converter for converting analog detector signals into digital values that are stored.
  • An evaluation of the digital values is preferably carried out in real time, but can also be carried out with a time delay.
  • a conventional microprocessor can be used to evaluate the digital values
  • the detector signals obtained in the time interval T3 are stored, if appropriate after digitization and further electronic processing, in memory cells which are assigned to individual time intervals.
  • a memory has, for example, 100 or more memory cells that are assigned to successive time intervals.
  • Such a time interval is preferably in the range from 0.01 to 1 nanosecond.
  • the detection of a fluorescence process takes place, for example, 5 nanoseconds after irradiation, the decay time in the memory cell of 5 nanoseconds, a value stored.
  • the value can be proportional to the detected signal level, preferably however, a unit value is stored which indicates that a fluorescence process with a lifetime has occurred in the lifetime interval depicted by the memory cell.
  • the signal obtained by the detector can also be analyzed with regard to the signal intensity and the number of individual molecules from which the signal originated. The multiple of the unit value corresponding to the number of molecules is now stored in the memory cell.
  • the storage process described above is repeated for each of the individual measurements, with a summation being carried out.
  • the cumulative curve obtained in this way with the measurements for a specific sample volume can be evaluated in order to determine which fluorescent group (s) of molecules are contained in the sample volume.
  • evaluation methods can be applied to the total curve as are also used for signal curves that were obtained with a large molecular ensemble.
  • An absolute recording of the fluorescence events to within a few ten picoseconds allows a global analysis of the photon statistics. Characteristic accumulations or pauses in the global photon distribution can be recognized and determined.
  • a total photon collection efficiency of 5 to 10% based on the irradiated number of photons can be achieved. This results from an absorption efficiency of the fluorescent dyes of approximately 80%, an emission probability of approximately 90% and a detector sensitivity of up to 70%. It was found that about 200 fluorescence events detected are sufficient to suppress the uncertainty of the distinction below 10 ⁇ . At concentrations of 10 "9 to 10'12 mol 1, 5,000, better 10,000 measurements on the same sample volume are sufficient for this. It follows from this that a sample volume with measuring cycles in the MHz range according to the invention can be examined within a few milliseconds or less. It was found that the following relationship exists between the concentration c [mol / l], the measuring time T [s] and the detection volume V [l] for the occurrence of a fluorescence event:
  • Measurement time T is understood as T 3 • A, where A is the number of cycles with which activation and detection take place.
  • the detection volume and / or measurement duration can be selected so that a sufficient number of fluorescence events is obtained for the evaluation.
  • a system according to the invention further includes a control unit which is designed to activate the light source for a time interval Ti and to activate the detector for a time interval T 3 after a time interval T 2 has elapsed.
  • a control unit is suitable for enabling time-resolved fluorescence measurement.
  • the time interval Ti at which the light source is activated, serves to convert analyte molecules into an excited state, from which they go into an energetically lower state with the emission of fluorescent light.
  • the time Tj is preferably in the range of 100 ps.
  • the waiting time T 2 serves to exclude spontaneous fluorescence of the sample, which does not originate from the groups of molecules to be detected, from the measurement.
  • the time T 2 is preferably in the range between 0.1 and 10 ns.
  • the detector is activated and receives fluorescent radiation from the sample.
  • the time T 3 is preferably chosen between 20 and 100 ns.
  • the detector signals with respect to signal level and time are recorded by a recording unit. Since the measurement is carried out on individual or at least a very few molecules, no classic decay curve of fluorescence is obtained in the time interval T 3 , but in the case of a single molecule a signal peak which indicates the point in time or the time interval in which the individual molecule emits radiation, indicates. Because the measurement is carried out repeatedly, a statistical evaluation can be carried out, from which the fluorescence lifetime can be determined.
  • the determination of the fluorescence lifetime on one or a few molecules is initially problematic because many molecules disintegrate with repeated excitation and are therefore not suitable to survive the necessary number of measurement cycles which are necessary to enable an evaluation.
  • preference is given to using those fluorescent molecular groups which survive at least 1000 fluorescence cycles The small sample volumes used in the present invention, preferably in the range of 0.05 to 10 femtoliters, must ensure that the molecule or molecular ensemble under investigation does not migrate out of the sample volume under investigation through flow or diffusion processes. This fact was taken into account in accordance with the invention that at least 1000 measurement cycles are carried out per millisecond. Furthermore, suitable statistical methods must be used to evaluate the measurement results
  • the so-called maximum likelihood method and the pattern recognition have proven to be particularly suitable for statistical evaluation within the scope of the present invention.
  • the signals obtained during the detection cycles T 3 are summed up in the memory in a time-resolved manner for statistical evaluation. This means that the intensity measured in different measuring cycles increases a certain time interval within T 3 is added. This takes place for a sufficiently large number of different time intervals (for example 1000).
  • the intensity sums contained in the individual memory cells are proportional to the probability that the examined molecular ensemble emits fluorescent radiation within the respective time interval
  • the Maximun likelihood method now estimates a fluorescence lifetime and calculates the probability with which the expenmentally measured probability distribution would have been obtained with this fluorescence lifetime.
  • the fluorescence lifetime that leads to the highest probability is referred to as the maximum likelihood estimate and is that Result of the statistical evaluation
  • the maximum likelihood estimate is compared with the fluorescence lifetimes of the different types of fluorescent molecular groups used in the investigation.
  • the type of fluorescent molecular group that is as close as possible to the maximum likelihood estimate was present in the sample volume examined
  • the pattern recognition the intensities are obtained, as already described, which are obtained in a certain time interval within T 3.
  • the pattern recognition is carried out using the following mathematical formula
  • N is the sum of all photons paid over the period T 3.
  • the photons paid in a time interval i are denoted by n,.
  • the large p, (j) indicates the probability that a fluorescence event falls within the time interval i if the measured substance is of type j.
  • the photon numbers n therefore represent the signal curve of the measurement carried out, while the p, Q) Specify the pattern of the signal curve for a specific substance
  • the molecule or the molecules in the measured sample volume are assigned to the type of fluorescent molecule group for which the value I * is the smallest when using the associated p, (j)
  • Figure 2- The volume range on which the evaluation is based
  • Figure 1 shows in principle the optical structure of a system according to the present invention.
  • the sample liquid is located in a capillary (10), of which part of the interior is imaged onto a detector (2) via microscope optics (1).
  • a beam splitter (4) is located between the microscope optics (1) and the detector (2), via which light from an excitation light source (5) enters the microscope optics (1). is coupled.
  • the excitation light source is a PLP 01 diode laser from Hamamatsu. With this diode laser, repetition rates of 10 MHz with pulse widths of ⁇ 100 pSec. and pulse peak powers of over 50 mWatt can be realized.
  • the excitation radiation is coupled in via the same optics with which the fluorescence radiation is also collected, it can be achieved that a very small area of the sample volume is selectively irradiated and fluorescence radiation emanating from this area is evaluated.
  • the examined sample volume is defined very precisely in space and a disturbance of the measurement by fluorescence from outside the examined area can be prevented.
  • the detector (2) shown in FIG. 1 is a time-correlated single photon counter in the form of an avalanche photodiode.
  • Avalanche photodiodes can be used advantageously in the field of time-resolved fluorescence spectroscopy, since they have a small detection area compared to photomultipliers.
  • Avalanche photodiodes can therefore be used in particular in confocal optics in which the area of the sample volume to be examined is at the focal point of a first lens system, while the detection surface of the photodiode is at the focal point of a second lens system. With this arrangement, only light from the desired area reaches the photodiode, which means that the background portion of the measurement can be greatly reduced.
  • FIG. 2 shows a representation of the sample volume irradiated with the excitation light source (first sample volume) and the associated sample volume (second sample volume) from which the detection is carried out.
  • the areas shown overlap completely. In the practically realizable case, however, the areas are shifted somewhat from one another, so that the overlapping sample volume from which the measurement is carried out is the intersection of the two volumes.
  • the relationships shown occur when both a focused excitation light beam is used and confocal detection is performed.
  • the volume ranges outlined in FIG. 2 are limited laterally by the construction of the imaging optics and diaphragms or the diode area acting as the diaphragm. Transversely, the focus is limited by the focus area of the optics in conjunction with a diaphragm that blocks out blurred rays
  • FIG. 3 shows the time course of the fluorescence intensity over time, as can be obtained by creating a summation curve from many individual measurements using the method according to the invention.
  • An excitation light pulse which has a high slope occurs in the time interval Ti.
  • the time period Ti should be small in relation to the fluorescence lifetime.
  • the time T 2 follows the excitation light pulse. in which neither the light source nor the detector are activated in order to block out spontaneous background fluorescence that falls within this period.
  • the cumulative curve in the time interval T 3 statistically represents the decay of the fluorescence emission over time.
  • the fluorescent lifetime of the fluorescent molecular groups can be determined from the cumulative curve
  • FIG. 4 shows measurement results obtained on the same molecule.
  • the time that elapsed after the molecule was irradiated with the light source is shown on the X axis of the individual images.
  • a standard value for a received detection signal is plotted on the Y axis.
  • the box with a gray background in the individual figures indicates the time interval after which the molecule has been irradiated and the fluorescent radiation imitated by the molecule was measured. Since the fluorescence emission is a statistical process, the fluorescence emission in the individual experiments is also detected for the same molecule after different times
  • FIG. 5 shows a compilation of the individual measurements from FIG. 4.
  • the unit values obtained in the individual measurements are summed up for the individual time periods, so that a diagram is obtained which shows how often a certain area of the fluorescence lifetime was obtained during the measurements
  • FIG. 6 shows a representation corresponding to FIG. 5 but with a further higher number of individual measurements.
  • the points shown in the figure indicate how often a certain interval of the fluorescence lifetime was obtained during the measurements.
  • the times from the irradiation of the molecule to the emission of the fluorescent radiation are in turn plotted on the X axis.
  • the solid line shown in the figure represents statistically the decay of the fluorescence intensity. In the concrete experiment, the statistically determined fluorescence lifetime is 3.7 ns.

Abstract

System und Verfahren zur Unterscheidung von mindestens zwei unterschiedlich fluoreszierenden Arten von Molekülgruppen, die an Analytmoleküle gebunden sind, durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung mit einer Lichtquelle (5), die ein erstes Probevolumen mit Licht bestrahlt, das geeignet ist, die mindestens zwei Arten von Molekülgruppen zur Fluoreszenz anzuregen, sowie mit einem Detektor (2) zur Detektion von aus einem zweiten, mit dem ersten Probevolumen zumindest teilweise überlappenden Probevolumen emittierter Fluoreszenzstrahlung und mit einer Steuereinheit, die dazu ausgelegt ist, die Lichtquelle für ein Zeitintervall T1 zu aktivieren und nach Verstreichen eines Zeitintervalls T2 den Detektor für ein Zeitintervall T3 zu aktivieren, wobei die Bestrahlung und Detektion emittierter Fluoreszenzstrahlung mindestens 1000fach pro Millisekunde durchgeführt wird, die während der Zeitintervalle T3 mit einer Aufnahmeeinheit aufgenommenen Detektorsignale durch eine Auswerteeinheit ausgewertet werden und aus den zeitlichen Signalverläufen im Zeitintervall T3 ermittelt wird, welche der mindestens zwei Molekülgruppen im überlappenden Probevolumen enthalten ist.

Description

System zur Unterscheidung fluoreszierender Molekülgruppen durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein System zur Unterscheidung von mindestens zwei unterschiedlich fluoreszierenden .Arten von Molekülgruppen, die an Analytmolekule gebunden sind, durch zeitaufgeloste Fluoreszenzmessung mit einer Lichtquelle, die ein erstes Probevolumen mit Licht bestrahlt, das geeignet ist, die mindestens zwei .Arten von Mole- kulgruppen zur Fluoreszenz anzuregen sowie mit einem Detektor zur Detektion von aus einem zweiten, mit dem ersten Probevolumen zumindest teilweise überlappenden Probevolumen emittierter Fluoreszenzstrahlung und mit einer Steuereinheit, die dazu ausgelegt ist, die Lichtquelle für ein Zeitintervall Ti zu aktivieren und nach Verstreichen eines Zeitintervalls T2 den Detektor für ein Zeitintervall T3 zu aktivieren, wobei die Bestrahlung und Detektion emittierter Fluoreszenzstrahlung mindestens lOOOfach pro Millisekunde durchgeführt wird, die wahrend der Zeitintervalle T3 mit einer Aufnahmeeinheit aufgenommenen Detektorsignale durch eine Auswerteeinheit ausgewertet werden und aus den zeitlichen Signalverläufen im Zeitintervall T3 ermittelt wird, welche der mindestens zwei Molekul- gruppen im überlappenden Probevolumen enthalten ist
Die vorliegende Erfindung fallt in das Gebiet der chemischen .Analytik durch Detektion angeregter Fluoreszenzstrahlung. Derartige analytische Verfahren haben sehr breite Anwen- dungsmoglichkeiten, wobei jedoch in letzter Zeit stärker das Anwendungsgebiet der Biochemie in den Vordergrund tritt. Insbesondere kann die Detektion von Fluoreszenzstrahlung herangezogen werden, eine Sequenzierung von Nukleinsäuren vorzunehmen, wie beispielsweise in EP-B-0 157 280 beschrieben. Bei diesem Verfahren zur Sequenzierung werden klonierte DNA-Strange hergestellt, von denen Fragmente gebildet werden, deren Ende mit Basen A, G, C und T versehen sind, die fluoreszierend markiert sind Weiterhin sind im Stand der Technik Apparaturen bekannt, wie beispielsweise in US-5,252,834 beschrieben, mit denen es über eine geeignete zeitliche Abstimmung des Anregungslichtes und des de- tektierten Fluoreszen^ichtes möglich ist, unerwünschte Hintergrundstrahlung auszu- schließen Die in US-5, 252,834 beschriebene Apparatur verwendet jedoch eine apparativ aufwendige spektrale .Analyse der emittierten Fluoreszenzstrahlung, um .Analytmolekule zu identifizieren
In der EP-A-0 563 998 wird bereits ein Verfahren zur Detektion von Biomolekulen beschrieben, das auf einer zeitaufgelosten Laserspektroskopie basiert Das hier beschnebene Verfahren basiert darauf, daß die nachzuweisenden Moleküle durch verschiedene Fluores- zenzfarbstoffe markiert werden, die unterschiedliche Fluoreszenzlebensdauern besitzen Die Fluoreszenzlebensdauern werden durch eine zeitaufgeloste Fluoreszenzspektroskopie voneinander unterschieden, wobei zur Unterdrückung von Hintergrundstrahlung die emittierte Fluoreszenz gegenüber dem Anregungslicht zeitlich verzögert detektiert wird
Die beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen des Standes der Technik basieren darauf, daß eine größere Zahl von Molekülen gleicher Fluoreszenzeigenschaften vorhanden sind, so daß ein Nachweis und eine Charakterisierung der fluoreszierenden Moleküle möglich ist Um dies zu erreichen, müssen entweder ausreichend hohe Molekulkonzentrationen vorhanden sein oder es muß ein ausreichend großes Probevolumen bestrahlt werden Beide Vorgehensweisen, die darauf abstellen, Fluoreszenzlicht von einer größeren Zahl von Molekülen zu empfangen, besitzen den Nachteil, daß das Molekulensemble nicht notwendigerweise homogen sein muß, d h daß gegebenenfalls Moleküle unterschiedlicher Fluoreszenzeigenschaften detektiert werden Wird eine Auswertung der Fluoreszenzstrahlung gemäß der Fluoreszenzlebensdauer vorgenommen, so wird dem betrachteten Molekulensemble eine gemeinsame und daher gemittelte Fluoreszenzlebensdauer zugeordnet Dies kann zu einem Versagen der Zuordnung bzw. zu einer Fehlinterpretation führen Weiterhin besitzen die Verfahren des Standes der Technik den Nachteil, daß bei Vorhandensein von nur sehr wenigen Molekülen einer Sorte aufgrund statistischer Signalschwankungen sowie aufgrund geringer Signalintensitaten keine sichere Zuordnung zu einer Gruppe von Molekülen erfolgen kann
Die vorgenannten Nachteile des Standes der Technik werden durch ein System .zur Unterscheidung unterschiedlicher Arten fluoreszierender Molekulgruppen gemäß Anspruch 1 behoben Insbesondere ist mit einem System der vorliegenden Erfindung eine sichere Unterscheidung und Zuordnung der untersuchten Moleküle zu bestimmten Gruppen auch dann möglich, wenn nur wenige oder gar einzelne Moleküle im untersuchten Probevolumen vorhanden sind. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, daß es geeignet ist, sehr kleine Probevolumina zu untersuchen. Dies eröffnet die Möglichkeit, Detektionssysteme, wie sie beispielsweise bei der DNA-Sequenzierung eingesetzt werden, stark zu miniaturisieren.
Im Bereich der chemischen Analytik haben sich Fluoreszenztechniken aufgrund ihrer Einfachheit und hohen Empfindlichkeit ein breites .Anwendungsgebiet erschlossen. Insbesondere stehen bei der Fluoreszenzanalytik solche Verfahren im Vordergrund, bei denen nicht die Eigenfluoreszenz der Analytmolekule ausgenutzt wird, sondern die Analytmolekule zunächst spezifisch an geeignet fluoreszierende Molekülgruppen gebunden werden Daher sind Fluoreszenztechniken, besonders in Verbindung mit immunologischen Assays oder Nukleinsaurenachweisen, von großer Bedeutung, da hier spezifisch immunologische Affinitäten oder selektive Hybridisierungseigenschaften von Oligonukleotiden an Analyt- Nukleinsauren ausgenutzt werden können. Die spezifisch an den Analyten bindefahigen Substanzen, wie z. B Antikörper oder Detektionsoligonukleotide, werden im Folgenden als Detektionsmoleküle bezeichnet. Sie sind ihrerseits direkt oder indirekt an fluoreszierende Molekulgruppen gebunden. Die fluoreszierenden Molekulgruppen können weitestgehend unabhängig von dem im jeweiligen Fall nachzuweisenden Analytmolekul und der spezifisch bindefahigen Substanz ausgewählt werden. Bevorzugt werden solche Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt, die gunstige Eigenschaften, wie eine hohe Quantenausbeute, hohe Photostabilitat und oder einen geeigneten Absorptionsbereich aufweisen, ohne daß diese Auswahl wesentlichen Einschränkungen durch das jeweils nachzuweisende Analytmolekul unterworfen ist
Fluoreszenztechniken sind in ihrer Empfindlichkeit hauptsächlich durch die Untergrundfluoreszenz der Probe und gegebenenfalls des Probentragers limitiert. Erfindungsge aß wird die Detektion emittierten Fluoreszenzlichtes erst vorgenommen, wenn nach der Fluoreszenzanregung eine vorgegebene Zeit verstrichen ist. Durch das Setzen eines Zeitfensters zwischen der Fluoreszenzanregung und der Detektion emittierter Fluoreszenz wird verhindert, daß die spontane Emission der Probe bzw. des Probengefaßes zum gemessenen Fluoreszenzsignal beitragt. Das Zeitintervall T2 zwischen Bestrahlung des Probevolumens und Aktivierung des Detektors liegt bevorzugt zwischen 0,1 und 10 ns Eine weitere Maßnahme, die erfindungsgemäß zur Empfindlichkeitssteigerung vorgenommen wird, besteht darin, daß lediglich ein kleines Probevolumen vorzugsweise zwischen 0,05 und 10 Femtoliter mit Licht bestrahlt wird, das geeignet ist, die fluoreszierenden Molekülgruppen anzuregen. Auf diese Weise kann verhindert werden, daß Fluoreszenz von außerhalb des untersuchten Bereiches zum Signal beitragt. Herkömmliche Verfahren zur Fluoreszenzanalyse gehen davon aus, daß die emittierte Fluoreszenz von einem Molekul- ensemble ausgeht, das mehrere tausend oder mehrere hunderttausend Moleküle umfaßt. Hierdurch ist einerseits gewährleistet, daß die Signalintensität ausreichend hoch ist und weiterhin eine statistische Verteilung von Fluoreszenzlebensdauern sowie Fluoreszenzfrequenzen gegeben ist. Bei den erfindungsgemäß untersuchten sehr kleinen Probenvolumina liegen im bestrahlten Probenvolumen jedoch nur wenige Moleküle vor. Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß eine statistische Auswertung der Fluoreszenzlebensdauer der bestrahlten Moleküle trotz der geringen Zahl von Molekülen möglich ist, indem das gleiche Probevolumen mindestens lOOOfach innerhalb einer Millisekunde bestrahlt und nach den Bestrahlungen die emittierte Fluoreszenzstrahlung ausgewertet wird. Diese Erkenntnis steht im Widerspruch zu den in der einschlägigen Literatur vorherrschenden Ansichten. In dem Artikel "Single Molecule Detection in Capillary Electrophoresis: Molecular shot noise as a fundamental limit to chemical analysis" in Analytical Chemistry, Band 68, Seiten 690 - 696 (1996) von D. Chen und N.J. Dovichi, wird beschrieben, daß für eine Fluoreszenzanalyse mindestens ein Ensemble von 104 Analytmolekülen vorhanden sein muß, um die durch statistische Schwankungen verursachte Impräzision auf unter 1 % zu senken Mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedoch auch noch mit einem Ensemble bestehend aus weniger als 104 Molekülen eine verläßliche Unterscheidung der fluoreszierenden Molekülgruppen vorgenommen werden. Vorzugsweise besteht das Molekülensemble bei der vorliegenden Erfindung sogar aus einem oder wenigen Molekülen gleicher Sorte.
Die vorliegende Erfindung kann vorteilhaft im Bereich der klinischen Analytik, insbesondere im Bereich der Immunologie oder Nukleinsaureanalytik, angewandt werden. Analytmolekule können demgemäß Antigene, Antikörper, Nukleinsäuren oder Fragmente davon sein. Allgemein kommen als Analytmolekule jegliche Substanzen in Betracht, an die spezifisch Detektionsmoleküle gebunden werden können. Andererseits können auch die Analytmolekule selbst erfindungsgemäß nachweisbare fluoreszierende Molekulgruppen enthalten oder an diese gebunden sein. Letzterer Fall tritt insbesondere bei einer Sequenzanalyse von Nukleinsäuren auf. Beispielsweise ist in diesem Zusammenhang die nach Sanger benannte Methode der Sequenzanalyse zu nennen. Bei dieser Methode wird durch enzymatische Synthese der Gegenstrang zu einer zu sequenzierenden Nukleinsaure aufgebaut. Hierzu wird an eine einzelsträngige Nukleinsaure ein Primer hybridisiert, der unter Einbau von Mononukleotiden elongiert wird. Bei der Sequenzanalyse nach Sanger werden neben den gewöhnlichen Mononukleosid-Triphosphaten auch Mononukleotid-Analoga eingesetzt, die einen Kettenabbruch bewirken, d. h. daß nach ihrem Einbau eine weitere Elongation des Stranges unterbunden wird. Im Rahmen der Sequenzanalyse unter Zuhilfenahme der Fluoreszenzanalytik werden für den Kettenabbruch Mononukleotid-Analoga eingesetzt, die ein Fluoreszenzlabel enthalten. Dabei werden zur Unterscheidung der vier möglichen Mononukleotide unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe verwendet. Im Rahmen der Erfindung werden diese Fluoreszenzfarbstoffe durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung unterschieden und somit festgestellt, durch welche Base der jeweilige Nukleinsaurestrang terminiert ist.
Weiterhin kann die vorliegende Erfindung zur Durchführung von Nukleinsaurehybridisie- rungs-Assays eingesetzt werden. Bei einem bevorzugten Testformat wird zunächst eine unmarkierte Fangsonde, in der Regel ein Oligonukleotid, auf einer Oberfläche immobilisiert. Durch Inkubation mit einer Probeflüssigkeit findet eine Hybridisierung zwischen Fangsonde und Analyt (beispielsweise ein PCR-Produkt) statt. Im Falle eines fluoreszenzmarkierten Analyten kann dieser direkt nachgewiesen werden oder der Analyt wird seinerseits wiederum mit einer fluoreszenzmarkierten Nachweissonde detektiert.
Die vorliegende Erfindung kann weiterhin sehr vorteilhaft zum Nachweis und zur Unterscheidung fluoreszierender Moleküle in Kapillaren eingesetzt werden. Beispielsweise können Mikrokapillaren mit einem Innendurchmesser von 1 bis 2 μm eingesetzt werden, durch die die zu untersuchende Flüssigkeit strömt. Zur Untersuchung wird eine Optik eingesetzt, die in einem Bereich der Mikrokapillare deren gesamten Querschnitt oder zumindest einen großen Teil davon erfaßt, so daß das Hindurchtreten eines fluoreszierenden Moleküls durch die Kapillare sicher erkannt wird. Mit einer derartigen Anordnung ist es beispielsweise möglich, einzelne Nukleinsäurestränge zu sequenzieren, indem Basen von einem Ende des Nukleinsäurestranges nacheinander abgespalten und unter Beibehaltung der Reihenfolge durch die Kapillare transportiert werden. Eine Verwendung des erfindungsge- mäßen Systems ist weiterhin auch in Verbindung mit konventiellen Techniken, wie HPLC oder CGE, möglich.
Weiterhin unterscheiden sich die Farbstoffe, die voneinander unterschieden werden sollen, in ihrer Fluoreszenzlebensdauer. .Als Fluoreszenzlebensdauer wird, wie allgemein üblich, die durchschnittliche Zeit bezeichnet, mit der sich ein angeregter Fluoreszenzfarbstoff im angeregten Zustand befindet. Der Übergang von diesem angeregten Zustand in einen energetisch tiefer liegenden Zustand erfolgt spontan und liegt in der Regel im Bereich von Nanosekun- den. Da es sich bei dem energetischen Übergang des Moleküls um einen quantenmechanischen Prozeß handelt, ist die Fluoreszenzlebensdauer eines einzelnen Moleküls unbestimmt und der Bereich experimentell auftretender Fluoreszenzlebensdauern ist durch die Heisenbergsche Unschärferelation gegeben. Zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer einer Molekülsorte wird im Stand der Technik so verfahren, daß ein ausreichend großes Molekulensemble mit Licht geeigneter Wellenlänge bestrahlt und eine große Anzahl von Molekülen in den angeregten Zustand gebracht wird. Der Übergang der Moleküle in den Grundzustand verläuft im Regelfall nach einer Kinetik erster Ordnung, so daß ein expo- nentielles Zerfallsgesetz vorliegt. Durch Integration der zugrunde liegenden Differentialgleichung erhält man die Signalintensität in Abhängigkeit von der Zeit. Durch Auswertung des gemessenen Signal-Zeitverlaufes kann auf die Fluoreszenzlebensdauer zurückgeschlossen werden. Diese ist, sofern eine Kinetik erster Ordnung vorliegt, die Zeit, nach der die Fluoreszenzintensität auf 1/e abgefallen ist. Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß eine Ermittlung der Fluoreszenzlebensdauer auch für einzelne Moleküle möglich ist, wenn die Vorgehensweise geeignet gewählt wird. Eine Bestimmung der mittleren Fluoreszenzlebensdauer erfolgt, indem ein und dasselbe Probenvolumen mindestens lOOOfach innerhalb einer Millisekunde mit Licht bestrahlt wird, das geeignet ist, die fluoreszierende Molekül- gruppe(n) anzuregen. Bei einer Auswertung der emittierten Fluoreszenzsignale wird davon ausgegangen, daß sich in dem bestrahlten Probevolumen wahrend jeder der Messungen Moleküle der gleichen Sorte befinden. Dies wird erfindungsgemaß dadurch erreicht, daß ein kleines Probevolumen vorzugsweise zwischen 0,05 und 10 Femtoliter untersucht wird und durch eine geeignete Verfahrensführung sichergestellt wird, daß sich im bestrahlten Probevolumen im wesentlichen nur Moleküle gleicher Fluoreszenzlebensdauer befinden. Erfindungsgemäß ist es weiterhin wichtig, daß die Messungen an dem Probevolumen inner- halb einer kurzen Zeitspanne, vorzugsweise innerhalb weniger als 50 Millisekunden, stattfinden, damit sich Difϊüsionsprozesse nicht störend auswirken
Fluoreszenzfarbstoffe, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, besitzen weiterhin eine ausreichend hohe Photostabilitat, d h die Farbstoffe überstehen eine hohe Zahl von Anregungs- und Zerfallszyklen, ohne sich zu zersetzen Als besonders geeignet haben sich die in der EP-A-0 563 998 genannten Farbstoffe erwiesen Geeignete Farbstoffe können insbesondere aus der Klasse der Rhodaminderivate, Oxazin und Carbocya ine ausgewählt werden. Vorteilhaft werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung mindestens 2 Arten von fluoreszierenden Molekülen eingesetzt, deren Fluoreszenzlebensdauer verschieden ist. Im Regelfall bedeutet dies, daß die fluoreszierenden Molekulgruppen als solche unterschiedlich sind Es sind erfindungsgemaß jedoch auch Unterscheidungen möglich, bei denen die fluoreszierenden Molekulgruppen identisch sind, jedoch durch die Wechselwirkung von fluoreszierender Molekulgruppe und dem Molekül, an das sie gebunden ist, eine detektierbare Veränderung der Fluoreszenzlebensdauer erfolgt
Ein System zur Unterscheidung von Fluoreszenzfarbstoffen durch zeitaufgeloste Fluoreszenzmessung besitzt eine Lichtquelle, mit der ein erstes Probevolumen bestrahlt wird Geeignete Lichtquellen sind insbesondere Laser, vorzugsweise Diodenlaser und auch Blitzlampen. Die Lichtquellen müssen ausreichend leistungsstark und mit hoher Frequenz repetierbar sein. Letztere Eigenschaft ist dann gegeben, wenn die Lichtquelle sowohl kurzzeitig aktiviert als auch geloscht werden kann Vorzugsweise liegt die Repetitionsfrequenz der verwendeten Lichtquellen oberhalb 10 MHz und besitzt Pulshalbwertszeiten von weniger als 1 Nanosekunde. Der Emissionsbereich verwendeter Lichtquellen wird so gewählt, daß im Absoφtionsbereich der Fluoreszenzfarbstoffe eine ausreichende Lichtleistung, vorzugsweise oberhalb 100 mW, vorhanden ist Andererseits können auch bei Vorhandensein einer geeigneten Lichtquelle die Fluoreszenzfarbstoffe so ausgewählt werden, daß ihr Absorptionsbereich geeignet ist
Aufgrund der hauptsachlichen Verwendung des erfindungsgemaß en Systems für waßπge Losungen sind Lichtquellen mit Emissionswellenlangen oberhalb 600 nm bevorzugt Insbesondere hat sich eine .Anwendung der vorliegenden Erfindung im nahen Infrarotgebiet als vorteilhaft erwiesen, da hier einerseits geringe Fluoreszenzhintergrundstrahlungen durch die Probe auftreten als auch geeignete Farbstoffe mit unterschiedlichen Fluoreszenzlebensdauern vorhanden sind. In dem besonders bevorzugten Well enlangenb er eich von 630 bis 670 nm gibt es nur sehr wenige Moleküle, die zur Fluoreszenz angeregt werden können, daher ist in diesem Bereich die natürliche Untergrundfluoreszenz besonders gering.
Die Bestrahlung des ersten Probevolumens mit der Lichtquelle kann direkt, d h. ohne eine zwischengeschaltete Optik, erfolgen, wenn der von der Lichtquelle ausgesandte Lichtstrahl bereits ausreichend stark fokussiert ist, um das erfindungsgemäß verwendete, sehr kleine Probevolumen zu gewährleisten. Vorzugsweise wird jedoch der Anregungslichtstrahl durch eine mikroskopische Optik auf einen Probenbereich fokussiert Es ist vorteilhaft, von der Probe emittierte Fluoreszenzstrahlung durch dieselbe Mikroskopoptik aufzufangen und auf einen Detektor zu leiten. Durch die Verwendung der selben Optik für die Einkoppelung des Anregungslichtes und Auskoppelung der Fluoreszenzstrahlung kann gewahrleistet werden, daß die detektierten Signale aus einem eng begrenzen Raumbereich stammen. Bei Verwendung einer mikroskopischen Optik ist der Raumbereich in Richtung des Strahles durch die abnehmende Schärfe mit räumlicher Entfernung von der Fokalebene durch eine Blende begrenzt. In der Ebene senkrecht zum Lichtstrahl ist das Probevolumen durch die Güte der Fokussierung und der Blende begrenzt.
Bestrahlung der Probe und Detektion von Fluoreszenzstrahlung wird erfindungsgemaß so vorgenommen, daß ein erstes Probevolumen bestrahlt wird und Fluoreszenzstrahlung aus einem zweiten Probevolumen detektiert wird, das zumindest teilweise mit dem ersten Probevolumen überlappt. Eine besonders gute Überlappung von bestrahltem und ausgewertetem Probenbereich kann erzielt werden, wenn sowohl Einkoppelung des Anregungslichtes als auch Auskoppelung der Fluoreszenzstrahlung durch die gleiche Optik erfolgt
Alternativ zu der vorstehend genannten Ausführungsform kann die Bestrahlung der Probe in einer ersten Richtung mit der Lichtquelle erfolgen und emittierte Fluoreszenzstrahlung davon unabhängig aus einer zweiten Richtung mit einer Mikroskopoptik aufgefangen werden. Vorzugsweise wird hierbei in einer sogenannten 90°-.Anordnung gearbeitet, d. h. An- regungs- und Detektionsstrahl bilden einen rechten Winkel zueinander
Von der Probe ausgehende Fluoreszenzstrahlung wird durch ein optisches System, vorzugsweise eine Mikroskopoptik, auf den Detektor geleitet. Im Detektionsstrahlengang können gegebenenfalls optische Filter eingebracht werden, die Hintergrundstrahlung herausfiltern Es ist jedoch ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß auf optische Filter verzichtet werden kann. Bei Verwendung einer Mikroskopoptik zur Aufnahme emittierter Fluoreszenz wird das von der Mikroskopoptik ausgehende Strahlenbundel durch ein weiteres optisches System auf den Detektor folcussiert. Bei dieser sogenannten konfokalen Anordnung ist es möglich, Detektoren mit kleiner aktiver Flache einzusetzen Der Querschnitt der Detektorflache liegt dabei vorzugsweise unterhalb 500 μm Geeignete Detektoren verfügen ferner über eine hohe Photonenachweisempfindlichkeit, um mit den bei der gewählten Anordnung auftretenden geringen Intensitäten eine Auswertung zu ermöglichen Geeignet sind besonders Halbleiter Silizium-Detektoren aufgrund ihrer hohen Quanteneffizienz von bis zu 80 % im NIR-Bereich Werden hingegen Photomultiplier eingesetzt, die eine verhältnismäßig große aktive Detektorflache aufweisen, so wird die Flachenbegrenzung durch einen Raumfilter (Pinhole) im Strahlengang vorgenommen
Der Detektor wird aktiviert, nachdem die Lichtquelle aktiviert war und eine Karenzzeit T2 verstrichen ist Die Aktivierungszeit des Detektors liegt im Bereich von 1 ns wahrend die Zeitauflosung der detektierten Signale bei etwa 300 ps liegt Die Deaktivierung des Detektors kann längere Zeit in Anspruch nehmen, sollte jedoch 10 ns nicht überschreiten
Die Signale des Detektors werden durch eine Aufnahmeeinheit aufgenommen Eine Aufnahmeeinheit besitzt einen sehr schnellen Konverter zur Umwandlung analoger Detektorsignale in digitale Werte, die gespeichert werden. Eine Auswertung der digitalen Werte wird vorzugsweise in Echtzeit vorgenommen, kann jedoch auch zeitlich verzögert erfolgen Zur Auswertung der digitalen Werte kann ein gewohnlicher Mikroprozessor verwendet werden
Die im Zeitintervall T3 erhaltenen Detektorsignale werden, gegebenenfalls nach Digitalisierung und weiterer elektronischer Bearbeitung, in Speicherzellen abgelegt, die einzelnen Zeitintervallen zugeordnet sind. Ein derartiger Speicher besitzt beispielsweise 100 oder mehr Speicherzellen, die aufeinanderfolgenden Zeitintervallen zugeordnet sind Ein solches Zeitintervall liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 1 Nanosekunden Findet die Detektion eines Fluoreszenzsprozesses beispielsweise 5 Nanosekunden nach Bestrahlung statt, so wird in der Speicherzelle, die eine Zerfallszeit von 5 Nanosekunden mit umfaßt, ein Wert gespeichert Der Wert kann zu der detektierten Signalhohe proportional sein, vorzugsweise wird jedoch ein Einheitswert abgespeichert, der anzeigt, daß ein Fluoreszenzprozeß mit einer Lebensdauer in dem von der Speicherzelle abgebildeten Lebensdauerintervall aufgetreten ist. Besonders bevorzugt kann das vom Detektor erhaltene Signal auch bezüglich der Signalintensität analysiert und festgestellt werden, von wievielen Einzelmolekülen das Signal ausgegangen ist. In der Speicherzelle wird nunmehr das der Molekülzahl entsprechende Vielfache des Einheitswertes abgespeichert.
Der vorangehend beschriebene Speicheφrozeß erfolgt für jede der Einzelmessungen erneut, wobei eine Summation vorgenommen wird. Das heißt, der nach einer Messung in einer bestimmten Speicherzelle abzuspeichernde Einheitswert, oder gegebenenfalls ein Vielfaches davon, wird dem in der Zelle bereits vorhandenen Wert zugeschlagen. Die Summenkurve, die auf diese Weise mit den Messungen für ein bestimmtes Probevolumen erhalten wird, kann ausgewertet werden, um zu ermitteln, welche fluoreszierende(n) Molekülgruppe(n) im Probevolumen enthalten sind. Auf die Summenlcurve können prinzipiell solche Auswerteverfahren angewandt werden, wie sie auch für Signalkurven eingesetzt werden, die mit einem großen Molekülensemble erhalten wurden. Eine absolute Erfassung der Fluoreszenzereignisse auf wenige zehn Picosekunden genau, erlaubt eine globale Analyse der Photonenstatistik. Es können charakteristische Häufungen oder Pausen in der globalen Photonenverteilung erkannt und ermittelt werden. Es wird dadurch die Messung der Triplettlebensdauer eines Systems sowie die Ermittlung von Reaktionskinetiken möglich. Ebenso lassen sich auf diese Weise Diffüsionszeiten durch das Detektionsvolumen messen, die einen Rückschluß auf die Größe des Analytmoleküls ermöglichen. Bevorzugte Auswerteverfahren für die mit erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Summenkurven werden im Folgenden beschrieben.
Mit einem erfindungsgemäßen System kann eine Gesamt-Photonensammeleffizienz von 5 bis 10 % bezogen auf die eingestrahlte Photenenzahl erreicht werden. Dies ergibt sich aus einer Absoφtionseffizienz der Fluoreszenzfarbstoffe von etwa 80 %, einer Emissionswahrscheinlichkeit von etwa 90 % und einer Detektorempfindlichkeit von bis zu 70 %. Es wurde gefunden, daß etwa 200 detektierte Fluoreszenzereignisse ausreichen, um die Unsicherheit der Unterscheidung unterhalb 10^ zu drücken. Bei Konzentrationen von 10"9 bis 10'12 mol 1 sind dafür 5.000, besser 10.000 Messungen am gleichen Probevolumen ausreichend. Daraus ergibt sich, daß ein Probevolumen mit Meßzyklen im MHz-Bereich erfindungsgemäß innerhalb weniger Millisekunden oder darunter untersucht werden kann. Es wurde gefunden, daß für das Auftreten eines Fluoreszenzereignisses der folgende Zusammenhang zwischen Konzentration c[mol/l], Meßdauer T[s] und Detektionsvolumen V[l] besteht:
c = l/(v - T) - lO^ mol - s
Unter Meßdauer T wird T3 • A verstanden, wobei A die Zahl der Zyklen ist, mit der .Aktivierung und Detektion erfolgen.
Bei Kenntnis der zu erwartenden Konzentration können Detektionsvolumen und/oder Meßdauer so gewählt werden, daß eine zur Auswertung ausreichende Zahl von Fluoreszenzereignissen erhalten wird.
Ein System gemäß der Erfindung beinhaltet weiterhin eine Steuereinheit, die dazu ausgelegt ist, die Lichtquelle für ein Zeitintervall Ti zu aktivieren und nach Verstreichen eines Zeitintervalls T2 den Detektor für ein Zeitintervall T3 zu aktivieren. Eine derartige Steuereinheit ist geeignet, eine zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung zu ermöglichen. Das Zeitintervall Ti, zu dem die Lichtquelle aktiviert ist, dient dazu, Analytmolekule in einen angeregten Zustand zu überfuhren, aus dem sie unter Aussendung von Fluoreszenzlicht in einen energetisch tieferen Zustand übergehen. Die Zeit Tj liegt vorzugsweise im Bereich von 100 ps. Die Karenzzeit T2 dient dazu, spontane Fluoreszenz der Probe, die nicht von den zu detektierenden Molekülgruppen ausgeht, aus der Messung auszuschließen. Vorzugsweise liegt die Zeit T2 im Bereich zwischen 0,1 und 10 ns. Während des Zeitintervalles T3 ist der Detektor aktiviert und empfangt von der Probe ausgehende Fluoreszenzstrahlung. Die Zeit T3 wird vorzugsweise zwischen 20 und 100 ns gewählt. Während dieser Zeit T3 werden die Detektorsignale bezüglich Signalhöhe und Zeitpunkt durch eine Aufnahmeeinheit aufgenommen. Da die Messung an einzelnen oder zumindest sehr wenigen Molekülen durchgeführt wird, erhält man im Zeitintervall T3 keine klassische Abklingkurve der Fluoreszenz, sondern im Falle eines einzelnen Moleküls einen Signalpeak, der den Zeitpunkt bzw. das Zeitintervall, in dem das individuelle Molekül Strahlung aussendet, kennzeichnet. Dadurch, daß die Messung wiederholt durchgeführt wird, kann eine statistische Auswertung erfolgen, aus der die Fluoreszenzlebensdauer ermittelt werden kann. Die Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer an einem oder wenigen Molekülen ist zunächst problematisch, da viele Moleküle bei wiederholter Anregung zerfallen und daher nicht geeignet sind, die notwendige Zahl von Meßzyklen zu überdauern, die notwendig sind, um eine Auswertung zu ermöglichen Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden daher bevorzugt solche fluoreszierenden Molekulgruppen eingesetzt, die mindestens 1000 Fluoreszenzzyklen überdauern Aufgrund der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten kleinen Probenvolumina, vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 10 Femtoliter, muß dafür gesorgt werden, daß das untersuchte Molekül bzw das Molekulensemble wahrend der Meßdauer nicht durch Stromungs- oder Diffüsionsprozesse aus dem untersuchten Probevolumen hinauswandert Diesem Umstand wurde erfindungsgemaß damit Rechnung getragen, daß pro Millisekunde mindestens 1000 Meßzyklen durchgeführt werden Weiterhin müssen zur Auswertung der Meßergebnisse geeignete statistische Verfahren herangezogen werden
Als zur statistischen Auswertung im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders geeignet haben sich die sogenannten Maximum-Likelihood-Methode sowie die Mustererkennung erwiesen Die wahrend der Detektionszyklen T3 erhaltenen Signale werden zur statistischen Auswertung zeitaufgelost im Speicher aufsummiert Das bedeutet, die in verschiedenen Meßzyklen gemessene Intensität zu einem bestimmten Zeitintervall innerhalb T3 wird addiert. Dies erfolgt für eine ausreichend große Zahl unterschiedlicher Zeitintervalle (beispielsweise 1000). Die in den einzelnen Speicherzellen enthaltenen Intensitatssummen sind proportional zur Wahrscheinlichkeit, daß das untersuchte Molekulensemble innerhalb des jeweiligen Zeitintervalles Fluroszenzstrahlung aussendet
Bei der Maximun-Likelihood-Methode wird nunmehr eine Fluoreszenzlebensdauer geschätzt und die Wahrscheinlichkeit berechnet, mit der die expenmentell gemessene Wahrscheinlichkeitsverteilung mit dieser Fluoreszenzlebensdauer erhalten worden wäre Die Fluoreszenzlebensdauer, die zu der höchsten Wahrscheinlichkeit führt, wird als Maximum- Likelihood-Schatzer bezeichnet und ist das Ergebnis der statistischen Auswertung Der Maximum-Likelihood-Schatzer wird mit den Fluoreszenzlebensdauern der unterschiedlichen Arten fluoreszierender Molekulgruppen verglichen, die bei der Untersuchung eingesetzt wurden Die Art fluoreszierender Molekulgruppe, die möglichst nahe an dem Maximum- Likelihood-Schatzer liegt, war im untersuchten Probevolumen vorhanden Bei der zweiten statistischen Methode, der Mustererkennung, werden wie bereits beschrieben die Intensitäten summiert, die in einem bestimmten Zeitintervall innerhalb T3 erhalten werden Die Mustererkennung erfolgt mit der folgenden mathematischen Formel
Figure imgf000015_0001
Hierbei ist N die Summe aller über den Zeitraum T3 gezahlten Photonen Die in einem Zeitintervall i gezahlten Photonen werden mit n, bezeichnet. Die Große p, (j) gibt die Wahrscheinlichkeit dafür an, daß ein Fluoreszenzereignis in das Zeitintervall i fallt, wenn die gemessene Substanz vom Typ j ist Die Photo nenzahlen n, stellen demnach den Signalverlauf der durchgeführten Messung dar, wahrend die p, Q) das Muster des Signalverlaufes für eine bestimmte Substanz angeben Mit obiger Formel wird das Molekül bzw werden die Moleküle im vermessenen Probevolumen der Art fluoreszierender Molekulgruppe zugeordnet, für die bei Zugrundelegung des zugehörigen p, (j) der Wert I* am kleinsten ist
Die vorliegende Erfindung wird anhand einiger Figuren naher erläutert
Figur 1 : Darstellung einer optischen Anordnung
Figur 2- Der der Auswertung zugrundeliegende Volumenbereich
Figur 3 Zeitlicher Verlauf des Meßverfahrens
Figur 4: Meßergebnisse aus Einzelmessungen
Figur 5: Summenkurve aus den Einzelmessungen
Figur 6: Summenkurve aus einer Vielzahl von Einzelmessungen an einem einzelnen Molekül
Figur 1 zeigt prinzipiell den optischen Aufbau eines Systems gemäß der vorliegenden Erfindung Die Probenflüssigkeit befindet sich im dargestellten Beispiel in einer den Kapillare (10), von der ein Teil des Innenraumes über eine Mikroskopoptik (1) auf einen Detektor (2) abgebildet wird. Vor dem Detektor befindet sich eine Blende (3), um Hintergrundstrahlung auszuschließen. Zwischen Mikroskopoptik (1) und Detektor (2) befindet sich ein Strahlteiler (4), über den Licht aus einer Anregungslichtquelle (5) in die Mikroskopoptik (1) ein- gekoppelt wird. Bei der Anregungslichtquelle handelt es sich im dargestellten Beispiel um einen Diodenlaser Typ PLP 01 von Hamamatsu. Mit diesem Diodenlaser können Repeti- tionsraten von 10 MHz bei Pulsbreiten von < 100 pSek. und Pulsspitzenleistungen von über 50 mWatt realisiert werden.
Dadurch, daß die Anregungsstrahlung über die gleiche Optik eingekoppelt wird, mit der auch die Fluoreszenzstrahlung aufgefangen wird, kann erreicht werden, daß selektiv ein sehr kleiner Bereich des Probevolumens bestrahlt und von diesem Bereich ausgehende Fluoreszenzstrahlung ausgewertet wird. Durch diese Vorgehensweise ist das untersuchte Probevolumen sehr genau räumlich definiert und eine Störung der Messung durch Fluoreszenz von außerhalb des untersuchten Bereiches kann verhindert werden.
Bei dem in Figur 1 dargestellten Detektor (2) handelt es sich um einen zeitkorrelierten Einzelphotonenzähler in Form einer Avalanche-Photodiode. Auf dem Gebiet der zeitaufgelösten Fluoreszenzspektroskopie können Avalanche-Photodioden vorteilhaft eingesetzt werden, da sie im Vergleich zu Photomultipliern eine geringe Detektionsfläche aufweisen. Avalanche-Photodioden können daher insbesondere in einer konfokalen Optik eingesetzt werden, bei der sich der zu untersuchende Raumbereich des Probevolumens im Brennpunkt eines ersten Linsensystems befindet, während sich die Detektionsfläche der Photodiode im Brennpunkt eines zweiten Linsensystems befindet. Bei dieser Anordnung gelangt nur Licht aus dem gewünschten Raumbereich auf die Photodiode, womit der Untergrundanteil der Messung stark reduziert werden kann.
In der Figur 1 ist weiterhin zu erkennen, daß die Enden der Kapillare (10) in Fluidkontakt mit zwei Reservoirs stehen, in denen sich Probeflüssigkeit befindet. Die Probeflüssigkeiten sind ihrerseits mit jeweils einem Pol einer Spannungsquelle (nicht dargestellt) verbunden, so daß Analytmolekule elektrophoretisch durch die Kapillare transportiert werden können.
Figur 2 zeigt eine Darstellung des mit der Anregungslichtquelle bestrahlten Probevolumens (erstes Probevolumen) und des zugehörigen Probevolumens (zweites Probevolumen), aus dem die Detektion vorgenommen wird. Im Idealfall überlappen die dargestellten Bereiche vollständig. Im praktisch realisierbaren Fall sind die Bereiche jedoch etwas gegeneinander verschoben, so daß sich das überlappende Probevolumen, aus dem die Messung vorgenommen wird, als Schnittmenge der beiden Volumina ergibt. Die dargestellten Verhältnisse treten dann auf, wenn sowohl ein fokussierter Anregungslichtstrahl verwendet als auch eine konfokale Detektion vorgenommen wird. Die Begrenzung der in Figur 2 skizzierten Volumenbereiche erfolgt lateral durch den Aufbau der Abbildungsoptiken und Blenden bzw die als Blende wirkende Diodenflache. Transversal erfolgt die Begrenzung durch den Scharfebereich der Optik in Zusammenwirken mit einer Blende, die unscharfe Strahlen ausblendet
Figur 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzintensitat über die Zeit, wie er durch Erstellung einer Summenkurve aus vielen Einzelmessungen mit erfindungsgemaßen Verfahren erhalten werden kann Im Zeitintervall Ti erfolgt ein Anregungslichtimpuls, der eine hohe Flankensteilheit besitzt. Beim erfindungsgemaßen System kommt es nicht nur darauf an, daß die Anstiegsflanke des Anregungspulses steil ist, sondern auch daß die Loschung der Lichtquelle mit sehr hoher Geschwindigkeit erfolgt Insbesondere soll der Zeitraum Ti klein sein im Verhältnis zur Fluoreszenzlebensdauer Auf den Anregungslichtpuls folgt die Zeit T2, in der weder Lichtquelle noch Detektor aktiviert sind, um spontane Untergrundfluoreszenz, die in diesen Zeitraum fallt, auszublenden. Die Summenkurve im Zeitintervall T3 gibt statistisch das Abklingen der Fluoreszenzemission über die Zeit wieder Aus der Summenkurve kann die Fluoreszenzlebensdauer der fluoreszierenden Molekulgruppen ermittelt werden
Figur 4 zeigt Meßergebnisse, die an demselben Molekül gewonnnen wurden Auf der X- Achse der Einzelabbilduπgen ist die Zeit dargestellt, die nach Bestrahlung des Moleküls mit der Lichtquelle vergangen ist. Auf der Y-Achse wird ein Einheitswert für ein erhaltenes Detektionssignal abgetragen. Das in den Einzelabbildungen jeweils dargestellte grau unterlegte Kästchen gibt an, in welchem Zeitintervall nach Bestrahlung des Moleküls die von dem Molekül imitierte Fluoreszenzstrahlung gemessen wurde. Da es sich bei der Fluoreszenzemission um einen statistischen Vorgang handelt, wird die Fluoreszenzemission bei den einzelnen Experimenten auch für dasselbe Molekül nach unterschiedlichen Zeiten detektiert
Figur 5 zeigt eine Zusammenstellung der Einzelmessungen aus Figur 4 Die bei den Einzelmessungen erhaltenen Einheitswerte werden für die einzelnen Zeiträume summiert, so daß sich ein Diagramm ergibt, das anzeigt, wie häufig ein bestimmter Bereich der Fluoreszenzlebensdauer bei den Messungen erhalten wurde Figur 6 zeigt eine der Figur 5 entsprechende Darstellung jedoch mit einer weiter höheren Zahl von Einzelmessungen. Die in der Figur dargestellten Punkte geben an, wie häufig ein bestimmtes Intervall der Fluoreszenzlebensdauer bei den Messungen erhalten wurde. Auf der X-Achse ist wiederum die Zeiten von Bestrahlung des Moleküls bis zur Aussendung der Fluoreszenzstrahlulng aufgetragen. Die in der Figur dargestellte durchgezogene Linie stellt statistisch das Abklingen der Fluoreszenzintensität dar. Im konkreten Experiment ergibt sich die statistisch ermittelte Fluoreszenzlebensdauer zu 3,7 ns.

Claims

Patentansprüche
1. System zur Unterscheidung von mindestens zwei unterschiedlich fluoreszierenden Arten von Molekülgruppen, die an Analytmolekule gebunden sind, durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung mit
- einer Lichtquelle, die ein erstes Probevolumen mit Licht bestrahlt, das geeignet ist, die mindestens zwei Arten von Molekülgruppen zur Fluoreszenz anzuregen,
- einem Detektor zur Detektion von aus einem zweiten mit dem ersten Probevolumen zumindest teilweise überlappenden Probevolumen emittierter Fluoreszenzstrahlung,
- einer Steuereinheit, die dazu ausgelegt ist,
a) die Lichtquelle für ein Zeitintervall Ti zu aktivieren und b) nach Verstreichen eines Zeitintervalles T2 den Detektor für ein Zeitintervall T3 zu aktivieren,
wobei die Schritte a) und b) mindestens lOOOfach pro Millisekunde durchgeführt werden, die während der Zeitintervalle T3 erhaltenen Detektorsignale durch eine Aufnahmeeinheit aufgenommen und durch eine Auswerteeinheit ausgewertet werden und aus den zeitlichen Signalverläufen im Zeitintervall T3 ermittelt wird, welche der mindestens zwei Molekulgruppen im überlappenden Probevolumen enthalten ist.
2. System gemäß Anspruch 1, bei dem das überlappende Probevolumen 0,05 bis 10 Femtoliter beträgt.
3. System gemäß Anspruch 1, bei dem die Schritte a) und b) für das bestrahlte Probevolumen mindestens 5000fach pro Millisekunde durchgeführt werden.
4. System gemäß .Anspruch 1, bei dem die Konzentration der Analytmolekule in der Pro- benflüssigkeit 10'9 bis 10'12 mol/1 beträgt.
5. System gemäß Anspruch 1, bei dem sich im bestrahlten Probevolumen 1 bis 10 gleichartige Moleküle befinden.
6. System gemäß Anspruch 1, bei dem die Analytmolekule Nukleinsäuren oder Fragmente davon sind.
7. System gemäß Anspruch 1 oder 6, bei dem vier verschiedene Arten fluoreszierender Molekülgruppen verwendet werden, die jeweils an eine Art von Nukleotid gebunden sind.
8. System gemäß Anspruch 1 oder 6, bei dem eine Art fluoreszierende Molekülgruppe verwendet wird, deren Fluoreszenzlebensdauer durch Wechselwirkung mit dem jeweiligen .Analytmolekul bestimmt wird.
9. System gemäß Anspruch 1, bei dem die Bestrahlung des Probevolumens durch eine Mikroskopoptik erfolgt.
10. System gemäß Anspruch 1 oder 9 mit einer konfokalen optischen Abbildung zur Bestrahlung des Probevolumens und Detektion emittierter Fluoreszenz.
11. System gemäß Anspruch 1, bei dem sich das Probevolumen innerhalb eines Zylinders befindet, dessen Querschnitt kleiner als 50 μm ist.
12. System gemäß Anspruch 1 oder 11, bei dem sich die Probe mit einer Lineargeschwindigkeit von weniger als 10 m/s bewegt.
13. System gemäß Anspruch 1, 11 oder 12, bei dem die Probe durch einen Zylinder strömt, dessen Wandung das untersuchte Probevolumen in zwei Raumrichtungen begrenzt.
14. System gemäß Anspruch 1, bei dem T2 im Bereich zwischen 0, 1 und 10 ns liegt.
15. System gemäß Anspruch 1, bei dem T3 im Bereich zwischen 20 und 1000 ns liegt.
16. System gemäß Anspruch 1, bei dem die Lichtquelle ein Halbleiterlaser mit einer Wellenlänge im Bereich von 620 bis 900 nm ist.
17. Verwendung eines Systems gemäß Anspruch 1 zur Sequenzierung von Nukleinsäuren.
18. Verfahren zur Unterscheidung von mindestens zwei unterschiedlich fluoreszierenden Arten von Molekülgruppen, die an Analytmolekule gebunden sind, durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung, bei dem
- mit einer Lichtquelle ein erstes Probevolumen mit Licht bestrahlt wird, das geeignet ist, die mindestens zwei Arten von Molekülgruppen zur Fluoreszenz anzuregen,
- mit einem Detektor, aus einem zweiten, mit dem ersten Probevolumen zumindest teilweise überlappenden Probevolumen emittierte Fluoreszenzstrahlung detektiert wird,
- mit einer Steuereinheit
a) die Lichtquelle für ein Zeitintervall Ti aktiviert wird, b) nach Verstreichen eines Zeitintervalles T2 der Detektor für ein Zeitintervall T3 aktiviert wird,
und bei dem die Schritte a) und b) mindestens lOOOfach pro Millisekunde durchgeführt werden, die im Zeitintervall T3 durch die Aufhahmeeinheit aufgenommenen Detektorsignale durch eine Ausweiteeinheit ausgewertet werden und aus den zeitlichen Signalverläufen im Zeitintervall T3 ermittelt wird, welche der mindestens zwei Arten von Molekülgruppen im überlappenden Probevolumen enthalten ist.
19. Verfahren gemäß Anspruch 18 zur Durchführung von Immunoassays.
20. Verfahren gemäß Anspruch 18 zur Durchführung von Nukleinsäure-Hybridisie- rungsassays.
21. Verfahren gemäß Anspruch 18, bei dem die Auswertung der Detektorsignale im Zeitintervall T3 erfolgt.
22. Verfahren gemäß Ansprach 18, bei dem an demselben Probevolumen mindestens 5.000 Einzelmessungen mit den Schritten a) und b) durchgeführt werden.
23. Verfahren gemäß Anspruch 18, bei dem die im Zeitintervall T3 aufgenommenen Detektorsignale in einem Speicher gespeichert werden, wobei der Speicher eine Vielzahl von Speicherzellen besitzt, die aufeinanderfolgenden Zeitintervallen zugeordnet sind und die Speicherung in der Speicherzelle erfolgt, die ein Zeitintervall umfaßt, in die die bei der Messung detektierte Zeit zwischen Bestrahlung und Emission fällt.
24. Verfahren gemäß Anspruch 23, bei dem ein Einheitswert oder ein Vielfaches eines Einheitswertes abgespeichert wird.
25. Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24, bei dem in dem Speicher eine Summation der abgespeicherten Werte vorgenommen wird, so daß sich für die in einem Probevolumen durchgeführten Einzelmessungen eine Summenkurve ergibt.
26. Verfahren gemäß Anspruch 25, bei dem die Summenkurve statistisch ausgewertet wird, um eine Fluoreszenzlebensdauer zu ermitteln und damit die im Probevolumen vorliegende Molekülgruppe zu identifizieren.
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