EP1409721A2 - Nachweis von nukleinsäure-polymorphismen - Google Patents

Nachweis von nukleinsäure-polymorphismen

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Publication number
EP1409721A2
EP1409721A2 EP01993709A EP01993709A EP1409721A2 EP 1409721 A2 EP1409721 A2 EP 1409721A2 EP 01993709 A EP01993709 A EP 01993709A EP 01993709 A EP01993709 A EP 01993709A EP 1409721 A2 EP1409721 A2 EP 1409721A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
primer
nucleic acid
molecule
block
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01993709A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rudolf Rigler
Lars Edman
Zeno Clinical Immunology FÖLDES-PAPP
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gnothis Holding SA
Original Assignee
Gnothis Holding SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10065631A external-priority patent/DE10065631A1/de
Application filed by Gnothis Holding SA filed Critical Gnothis Holding SA
Publication of EP1409721A2 publication Critical patent/EP1409721A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of single or multiple nucleic acid polymorphisms by detection of individual fluorescence-labeled deoxyribonucleic acid molecules.
  • sequence deviations between the genomes of the individuals of a species due to nucleic acid insertions and deletions differences in the number of repetitions of short, recurring sequence motifs (so-called microsatellites and minisatellites) and deviations in individual base pairs, which act as single nucleotide polymorphisms (SNPs, English: Single nucleotide fiolymorphisms ) are referred to and occur most frequently in humans with about one base pair per 1000 base pairs (see WO 00/18960).
  • Such variations in the genome can in many cases be linked to the occurrence of hereditary diseases.
  • Classic examples are HD, cystic fibrosis, Duchenne muscular dystrophy and certain forms of breast cancer (see WO 00/18960). More recently, diseases such as Alzheimer's and Parkinson's have also been linked to individual mutations at the molecular level.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • miniaturized oligonucleotide arrays of high density were produced by photolithographic synthesis. There is a complementary probe for each possible allele on these arrays. With prototypes of such chips for genotyping, up to 3000 SNPs can be examined simultaneously (Sapolsky et al, Genet. Anal., 1999, 14: 187-192).
  • a similar method is also based on the hybridization of the allele to lower • examined with a complementary oligonucleotide probe was developed by Axys Pharmaceuticals. This method uses oligonucleotide probes that are coupled to fluorescence-labeled microspheres. These probes are hybridized directly with also fluorescence-labeled polymerase chain reaction (PCR) products. The detection is then carried out in a conventional flow cytometer. In this way, up to eight polymorphic genes could be examined simultaneously (Armstrong et al, Cytometry, 2000, 40: 102-108).
  • a very elegant method for characterizing SNPs does not use complete PCR, but only the extension of a primer by a single, fluorescence-labeled dideoxyribonucleic acid molecule (ddNTP), which is complementary to the nucleotide to be examined.
  • ddNTP dideoxyribonucleic acid molecule
  • the nucleotide at the polymorphic site can be deduced from the detection of the base extended and thus fluorescence-labeled (Kobayashi et al, Mol. Cell. Probes, 1995, 9: 175-182).
  • a disadvantage of this method is that only a single polymorphism can be examined in a reaction.
  • a possible solution to this problem is to incorporate a clearly identifiable sequence called ZipCode into the primer.
  • This ZipCode is recognized by a complementary ZipCode (the cZipCode) that is covalently bound to a fluorescent microsphere. Microbead decoding and SNP typing then takes place in a conventional flow cytometer.
  • the ZipCode system allows analysis of a large number of SNPs with a limited amount of M-microspheres coupled to ZipCode (Chen et al, Genome Res., 2000, 10: 549-557).
  • Fluorescence-labeled dideoxynucleotides which are optimized for high fluorescence yields and for incorporation into DNA by naturally occurring or genetically modified polymerases, are because of their use for the Sanger's method of DNA sequencing by chain termination (Sanger et al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1977, 74: 5463) is available at low cost.
  • the latter two methods which are based on the extension of a primer with a fluorescence-labeled dideoxynucleotide, are complex to carry out.
  • the process with ZipCode eliminates the manual labor-intensive work steps, but a technically complex flow cytometer that covers a large wavelength range is required. There is also the risk of misinterpreting signals because the spectra of the different fluorescent dyes overlap at least partially.
  • the object of the present invention is to provide methods for characterizing nucleic acid polymorphisms which do not have these disadvantages of the prior art.
  • the nucleic acid polymorphism is a single nucleotide polymorphism (single nucleotide polymorphism, SNP).
  • the polymorphism can also relate to several nucleotides, for example up to 20 consecutive nucleotides or even several groups from one or more consecutive nucleotides.
  • DNA of any origin for example from prokaryotes, in particular pathogenic prokaryotes, archaea or eukaryotes, in particular mammals, in particular humans, can be used as the nucleic acid template. However, it can also be recombinantly produced DNA or synthetic DNA. The DNA is preferably used in single-stranded form. Such DNA can be produced, for example, by reverse transcription of an RNA molecule using a reverse transcriptase, for example the reverse transcriptase from AMV (Avian Myeloblastosis Virus) or MMLV (Moloney Murine Leucemia Virus).
  • AMV Allevian Myeloblastosis Virus
  • MMLV Moloney Murine Leucemia Virus
  • RNA or DNA is preferably a mixture that is as homogeneous as possible.
  • start primer has specificity for the DNA to be examined, it is also possible to work with heterogeneous mixtures.
  • the start primer preferably consists of single-stranded DNA.
  • the start primer can also be a nucleic acid analog, for example a peptide nucleic acid, the phosphate-sugar backbone of the nucleic acids being replaced by a peptide-like backbone, for example consisting of 2-aminoethylene glycine (Nielsen et al., Science, 254: 1497-1500 ) as a carrier of the individual bases A, T, G, C.
  • a peptide nucleic acid primer must have a 3 'end which permits elongation.
  • the start primer preferably binds immediately upstream of the SNP to be characterized. If with deoxynucleotides and not with chain fraction molecules is worked, it is also possible to use a start primer which is further upstream, preferably not more than 5 nucleotides upstream of the. binding polymorphism site to be examined.
  • the fluorescence-labeled nucleotide can be both a deoxynucleotide and a chain termination molecule.
  • the fluorescent labeling groups can be selected from the known ones for labeling biopolymers, e.g. Nucleic acids, fluorescent labeling groups used, such as fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, Cy3, Cy5 or derivatives thereof, etc. are selected.
  • the differentiation of the dyes can be done via the wavelength •; ge, over the life of the excited states or a combination thereof.
  • nucleotides with different fluorescent labels can be distinguished by the wavelength of the exciting light, the emitted light or a combination thereof.
  • a distinction between the fluorescent dyes can also be made by measuring the lifetime of the excited state. It is advisable to combine the methods. For example, four fluorescent labels can be selected for the four different bases, all of which can be excited at the same wavelength and which emit at two different wavelengths, the lifetimes of the excited states differing for the labels whose emission wavelength is the same ,
  • the primer can be extended using methods of nucleic acid chemistry which are known from oligonucleotide synthesis. However, the extension reaction is preferably carried out by enzymatic catalysis.
  • the polymerase is selected depending on whether RNA or DNA is used as the template. A polymerase without exonuclease activity is preferably selected. Examples of possible polymerases are T7 polymerase or thermostable polymerases such as Taq, Pfu, Pwo and the like, which are usually used for PCR reactions.
  • the detection of the fluorescence of a single molecule can be done with any measurement method, e.g. done with location and / or time-resolved fluorescence spectroscopy, which is able to detect fluorescence signals down to single photon counting in a very small volume element, such as is present in a microchannel.
  • the detection can be carried out by means of confocal single-molecule detection, such as by fluorescence correlation spectroscopy,
  • a very small, preferably a confocal volume element for example 0.1 x 10 "15 to 20 x 10'12 I, of the sample liquid flowing through the microchannel being exposed to an excitation light from a laser, which emits the fluorescent markings in this measurement volume for the emission of fluorescent light stimulates, wherein the emitted fluorescent light from the measurement volume is measured by means of a photodetector, and a correlation is created between the change over time of the measured emission and the relative flow rate of the molecules involved, so that individual molecules can be identified in the measurement volume if they are diluted sufficiently
  • European patent 0 679 251 for details of the implementation of the method and apparatus details for the devices used for the detection.
  • the detection can also be carried out by a time-resolved decay measurement, a so-called time gating, as described, for example, by Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence
  • Determination also include measuring a cross-correlated signal, that of at least one, 2 different markings, in particular
  • Fluorescence labels nucleic acid molecule or • nucleic acid molecule complex containing, where several labeled
  • Nucleotides, primers and / or nucleic acid matrices with different labels can be used. This cross-correlation determination is, for example, by Schwüle et. al.
  • Detection of built-in nucleotides preferably includes separation of the extended start primer from non-built-in nucleotides.
  • the separation can take place, for example, as described in patent application DE 100 23 423.2 due to the different migration speeds of built-in and non-built-in nucleotides in the electrical field. In this way, enrichments of three powers of ten or more can typically be achieved.
  • this particle can be captured using an infrared laser, for example. Then a washing step in a directional flow can be electroosmotic or hydrodynamic may happen. Because of the more favorable flow profile and the higher flow rates, hydrodynamic flow is preferred.
  • nucleic acid matrix or, more preferably, the start primer is coupled to a carrier particle.
  • the single molecule sequence determination preferably comprises the steps:
  • the detection and manipulation of loaded carrier particles can, for example, according to the in Holm et al. (Analytical Methods and Instrumentation, Special Issue TAS 96, 85-87), Eigen and Rigler (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994), 5740-5747) or Rigler (J. Biotech. 41 (1995), 177-186) described methods that involve detection with a confocal microscope.
  • the manipulation of the loaded carrier particles in microchannel structures is preferably carried out with the aid of a capture laser, e.g. an infrared laser. Suitable methods are, for example, by Ashkin et al. (Nature 330 (198_7), 24-31) and Chu (Science 253 (1991), 861-866).
  • the carrier particle is preferably held in place by an automated process.
  • the carrier particles are passed through the microchannel in the hydrodynamic flow, passing through a detection element.
  • the detector in the detection window is set in such a way that it recognizes a marked sphere on the basis of the fluorescence-marked DNA and / or an additional fluorescence-marked probe, and then automatically activates the capture laser in the measuring room.
  • exonuclease is used to cleave off individual nucleotides from the extended start primer molecule, for example T7 DNA polymerase as exonuclease, E. coli exonuclease I or E. coli exonuclease III.
  • start primers which bind to the matrix at different points.
  • the start primers are then preferably coded differently, for example by different fluorescent labels or by different combinations of fluorescent labels.
  • fluorescence-labeled dNTPs can be built into the start primer to identify the start primer. If a different fluorescence label is used for each nucleotide, 4 ⁇ different start primers can be distinguished with n fluorescence-labeled positions. An even larger number results if different fluorescence-labeled analogs are used at different positions for the same nucleotide.
  • the extension reaction takes place by adding a single, fluorescence-labeled chain termination molecule to the start primer (s) (see Figure 1 a for an example).
  • the dideoxynucleotides are preferably used as chain termination molecules.
  • a plurality of nucleotides lying one behind the other can be characterized.
  • the termination of the extension reaction is not forced by the incorporation of a suitable chain termination molecule, but by a block primer (see Figure 1 b for an example).
  • the block primer is bound to the nucleic acid matrix downstream of the polymorphism to be investigated and is itself protected against elongation at its 3 'end by suitable chemical modification.
  • the most downstream nucleotide of the block primer can be a chain termination molecule.
  • Blocking of the block primers may be reversible, except for blocking the most downstream binding primer.
  • a removable protective group for example a photolabile protective group, can be used for reversible blocking.
  • the block primers at the 3 'end particularly preferably carry a phosphate group at the 3' position of the sugar. This phosphate group at the 3'-end prevents the elongation by polymerase and can be easily split off with a 3'-phosphatase for deblocking.
  • the gap (s) between pairs of a start primer extended by fluorescent nucleotides and the respectively downstream block primer after removal of the 3 'blocking of the block primers are filled in by deoxyribonucleotides and covalent bonds between the extended block primer and the immediately downstream start primer are closed (see Figure 1 d for an example).
  • the block primers preferably carry a 5'-phosphate. In this embodiment, it is not absolutely necessary to provide the various start / block primer pairs with codes.
  • Another object of the invention is the combination of the chain termination marker with detection in completely or partially transparent microwells (see patent application DE 100 23 421 .6). This • process includes the steps:
  • the excitation or / and the detection of the fluorescence can take place, for example, by means of a semiconductor laser and / or semiconductor detector integrated in the microwave (see Figure 2 for an example).
  • the excitation light source and / or the detector can, however, also lie outside the microstructure.
  • the method is ideal for automation, since a large number of reactions can be carried out in parallel or sequentially on a microwave plate. If the amount of start primer and the amount of labeled nucleotide used is kept low (nM), the distinction between incorporated and non-incorporated chain termination molecules can be made, for example, by FCS (fluorescence correlation spectroscopy) as explained above. Alternatively, as also explained above, energy transfer processes can be used.
  • ⁇ W ⁇ concentrations of primer and chain termination molecules are used because the incubation time can then be kept shorter. At least the chain termination molecules must then be removed again after the primer extension reaction by a washing step.
  • microwells with one or more small holes or a size exclusion membrane can be used, which hold back the labeled DNA bound to a carrier particle and let the unlabelled chain termination molecules through (see eg Figure 2).
  • start primer and chain termination molecules are conceivable.
  • two or more (up to four) wells are loaded with only one fluorescence-labeled chain termination molecule and the start primer, the 3 'end of which hybridizes immediately before the nucleotide to be examined.
  • An elongation reaction only occurs in one of the wells. Since it is known which well contains which chain termination molecule, the same fluorescent label can be used for all chain termination molecules. Since the extension reaction stops if the correct nucleotide for the extension is not available, deoxynucleotides can also be used in this case.
  • a chain termination molecule is preferably provided as described above, for example selected from the group consisting of ddATP, ddUTP, ddTTP, ddCTP and ddGTP.
  • a solid phase with a large number of wells is preferably used. In one single approach, a large number of SNPs can be examined in parallel. A parallel detection of 4 wells is preferably carried out here.
  • a start primer together with several, preferably four, different chain termination molecules corresponding to the four nucleobases.
  • the chain termination molecules then have to carry different labeling groups.
  • a distinction between the marker groups is based on the wavelength of the exciting and / or emitted light or on the lifetime of the excited
  • the lifetime of the excited state is measured by measuring the fluorescence decay time (FD, fluorescence decay).
  • the molecule to be examined is excited by a pulsed laser (e.g. a mode locked laser).
  • a pulsed laser e.g. a mode locked laser.
  • the detection of the emitted fluorescence photons takes place as a function of the time since the laser pulse has decayed, the duration of which must be short compared to the lifetime of the excited state to be examined.
  • SNPs can also be examined simultaneously, even if all four nucleotides must be expected at the polymorphism sites.
  • a start is made for each polymorphism primer used, the 3 'end of which is located immediately upstream of the nucleotide to be characterized in each case.
  • the extension reaction with the labeled chain termination molecules then takes place.
  • complementary start primers are then added to selected restriction sites, so that the nucleic acid matrix can be digested in fragments of characteristic length.
  • Sequence-specific ligation can be achieved, for example, by "reverse” operated restrictases. Since the hydrolysis reaction consumes one molecule of water and the ligation reaction releases one molecule of water, the equilibrium can be shifted in the direction of the ligation by using a reaction medium which is as anhydrous as possible. In the analogous case of proteases, "reverse operation" of the enzyme was successfully implemented by adding large amounts of polyethylene glycol or organic solvents to the reaction buffer.
  • the carrier particle preferably has a size in the range from 0.5 to 10 ⁇ m and particularly preferably from 1 to 3 // m.
  • suitable materials for carrier particles are plastics such as polystyrene, glass, quartz, metals or semimetals such as silicon, metal oxides such as silicon dioxide or composite materials which contain several of the aforementioned components.
  • Optically transparent carrier particles for example made of plastics or particles with a plastic core and a silicon dioxide shell, are particularly preferably used.
  • the immobilization to a carrier particle can either take place via the matrix or via the start primer. The time at which the immobilization step takes place is irrelevant to the method.
  • This step is possible i) before the hybridization step, ii) after the hybridization step, but before the start primer is extended by the chain termination molecule, and preferably, iii) after the extension reaction.
  • the advantage of late immobilization is that a potentially disruptive influence of the carrier on the hybridization and extension reaction is avoided.
  • the binding of the polynucleotides to the support can be achieved through high affinity interactions between the partners of a specific binding pair, e.g. Biotin / streptavidin or avidin, hapten / anti-hapten-. Antibodies, sugar / lectin etc. can be conveyed.
  • a specific binding pair e.g. Biotin / streptavidin or avidin, hapten / anti-hapten-.
  • Antibodies, sugar / lectin etc. can be conveyed.
  • biotinylated nucleic acid molecules can be coupled to streptavidin-coated supports.
  • the nucleic acid molecules can also be bound to the support by adsorption.
  • binding of nucleic acid molecules modified by incorporation of alkanethiol groups to metallic supports e.g. Gold bearer.
  • Yet another alternative is covalent immobilization, where the binding of the polynucleotides can be mediated via reactive silane groups on a silica surface. If a mixture of two or more DNA molecules different at the site of the single nucleotide polymorphism is present as a template, it is expedient, as in the case of single molecule sequencing, to bind only at most one molecule of the template or of the start primer to a single carrier particle. This can easily be achieved by a sufficiently high molar excess of carrier particles compared to the matrix or the primer.
  • the DNA molecules used as the template are all uniform, it is particularly important for the embodiment of the invention in micro- wells even cheap to bind several molecules of matrix or primer to a carrier particle.
  • the exonuclease digestion then leads to the cleavage of several identical fluorescence-labeled chain termination molecules, so that the fluorescence signal and thus the signal-to-noise ratio improve.
  • the problem arises of separating the different labels effectively. As described above, this can be done, among other things, by using different wavelengths in the excitation and emission of fluorescent light.
  • the spectral splitting takes place according to the prior art with dichroic mirrors. The disadvantage of this procedure is the comparatively high losses, in particular in the spectral splitting of the photons emitted by the fluorophore.
  • the losses can be reduced if the spectral splitting is carried out with a dispersion element such as a grating, for example a holographic or scratched grating or a prism instead of with a dichroic mirror (see Figure 3). It is advantageous to suppress the reflections as completely as possible when the light enters the dispersion element and / or when the light exits the dispersion element, for example by suitable coating of the glass surfaces in a prism.
  • the use of a dispersion element instead of a dichroic mirror is not limited to use in the characterization of nucleotide polymorphisms. It is also possible for the direct detection of single molecules (see e.g.
  • application DE 100 23 423.2 for single molecule sequencing methods (see e.g. application DE 100 31 840.1), for methods for selecting particles (see e.g. application DE 100 31 842.8), for methods for Detection of polynucleotides (see, for example, application DE 100 23 421 .6) in the case of methods for the separation of labeled biopolymers (see, for example, application DE 100 23 422.4) and in multiplex sequencing methods (see, for example, application DE 100 31 842.8)
  • Fig. 1 shows different embodiments of the polymorphism characterization.
  • the start primer is extended by a single fluorescence-labeled chain termination molecule.
  • the start primer is extended to the 3 'end of a downstream-binding block primer by differently fluorescently labeled deoxynucleotides. The block primer itself is blocked at its 3 'end so that it is not extended.
  • several start / block primer pairs are used. In this case it is necessary to encode the start primers using fluorescent markers.
  • several start / block primer pairs are also used, in addition the blocking of the block primers (with the exception of the blocking of the most downstream block primer) at the 3 'end is reversible, for example a 3'-phosphate block.
  • fluorescent nucleotides are incorporated in the presence of the 3 'blocking.
  • the gap between block primer and subsequent start primer is then filled in a second step after removal of the 3 'block by unlabelled deoxynucleotides.
  • the missing covalent bonds of successive nucleotides are linked by ligase. This is shown
  • Figure 2 (a) shows a top view
  • Fig. 3 (a) shows the one previously used for single molecule determination
  • the determination can be made via the fluorescence intensities (A ⁇ ) at different wavelengths and / or via fluorescence decay times (r) at different wavelengths using several detectors.

Abstract

Es werden Verfahren auf Einzelmolekülebene funktionierende Verfahren zur Charakterisierung von Nukleotidpolymorphismen beschrieben.

Description

Nachweis von IMukleinsäure-Polymorphismen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von einzelnen oder multiplen Nukleinsäurepolymorphismen durch Detektion einzelner fluoreszenzmarkierter Desoxyribonucleinsäuremoleküle.
Zwischen den Genomen der Individuen einer Spezies gibt es Sequenzabweichungen durch Nukleinsäure-Insertionen und Deletionen, Unterschiede in der Zahl der Wiederholungen kurzer, wiederkehrender Sequenzmotive (sogenannte Mikrosatelliten und Minisatelliten) und Abweichungen bei einzelnen Basenpaaren, die als Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, engl. Single nucleotide fiolymorphisms) bezeichnet werden und mit etwa einem Basenpaar pro 1000 Basenpaaren beim Menschen (siehe WO 00/18960) am häufigsten vorkommen.
Solche Variationen im Genom können in vielen Fällen mit dem Auftreten erblicher Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Klassische Beispiele sind Huntington, cystische Fibröse, Duchenne muskuläre Dystrophie und bestimmte Formen von Brustkrebs (siehe WO 00/18960). In jüngerer Zeit wurden auch Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson mit einzelnen Mutationen auf molekularer Ebene in Verbindung gebracht.
In der Regel handelt es sich bei diesen Mutationen um Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs). Am Auffinden neuer Positionen im Genom, an denen SNPs auftreten, besteht daher ein erhebliches Interesse der medizinischen Forschung. An der Untersuchung von SNPs, deren Position im Ge- nom auf das Nukleotid genau bekannt ist, besteht dagegen vor allem ein Interesse für die Diagnostik von molekular bedingten Krankheiten. Eine Reihe von Verfahren zur routinemäßigen Untersuchung solcher SNPs an bekannter Position im Genom sind daher in den vergangenen Jahren entwickelt worden.
So wurden durch photolitographische Synthese miniaturisierte Oligonukleo- tidarrays hoher Dichte hergestellt. Auf diesen Arrays existiert für jedes mögliche Allel eine komplementäre Sonde. Mit Prototypen solcher Chips zur Genotypisierung können bis zu 3000 SNPs gleichzeitig untersucht werden (Sapolsky et al, Genet. Anal., 1999, 14:187-192).
Ein ähnliches Verfahren, das ebenfalls auf der Hybridisierung des zu unter- • suchenden Alleis mit einer komplementären Oligonukleotidsonde basiert, wurde von Axys Pharmaceuticals entwickelt. Dieses Verfahren verwendet Oligonukleotidsonden, die an fluoreszenzmarkierte Mikrokügelchen gekop- pelt sind. Diese Sonden werden direkt mit ebenfalls fluoreszenzmarkierten Polymeraseketten-reaktions(PCR)-Produkten hybridisiert. Die Detektion erfolgt dann in einem üblichen Durchflußzytometer. Auf diese Weise konnten bis zu acht polymorphe Gene gleichzeitig untersucht werden (Armstrong et al, Cytometry, 2000, 40:102-108).
Während bei diesen Verfahren die Hybridisierung nach einem möglichen DNA-Amplifikationsschritt mit PCR erfolgt, gehen See et al. den umgekehrten Weg. Ihr Verfahren verwendet Primer mit verschiedenen Fluorophoren an den 5'-Nukleotiden, deren 3'-Ende bei dem zu untersuchenden Nukleotid liegt. Nur mit dem Primer, der auch am 3'-Ende zu dem zu untersuchenden .Nukleotid komplementär ist, entseht ein PCR-Produkt. Die Proben werden dann durch Elektrophorese nach Größe und Fluoreszenz analysiert (See et al, Biotechniques, 2000, 28:710-714).
Ein sehr elegantes Verfahren zur Charakterisierung von SNPs verwendet keine komplette PCR, sondern lediglich die Verlängerung eines Primers um ein einzelnes, fluoreszenzmarkiertes Didesoxyribonucleinsäuremolekül (ddNTP), das zu dem zu untersuchenden Nukleotid komplementär ist. Durch Detektion des um eine Base verlängerten und damit fluoreszenzmarkierten Primers läßt sich auf das Nukleotid an der polymorphen Stelle schließen (Kobayashi et al, Mol. Cell. Probes, 1995, 9:175-182). Ein Nach- teil dieses Verfahrens ist allerdings, dass in einer Reaktion immer nur ein einzelner Polymorphismus untersucht werden kann.
Eine mögliche Lösung dieses Problems besteht im Einbau einer als ZipCode bezeichneten eindeutig identifizierbaren Sequenz in den Primer. Dieser ZipCode wird von einem komplementären ZipCode (dem cZipCode) erkannt, der kovalent an ein fluoreszierendes Mikrokügelchen gebunden ist. Die • • Mikrokügelchendecodierung und SNP-Typisierung erfolgt dann in einem üblichen Durchflußzytometer. Das ZipCode System erlaubt die Analyse einer großen Zahl von SNPs mit einer begrenzten Menge an ZipCode gekoppelten M-krokügelchen (Chen et al, Genome Res., 2000, 10:549-557).
Die beiden letztgenannten Verfahren, die auf der Verlängerung eines Primers mit einem fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotid aufbauen, besitzen einen wesentlichen Vorteil: Fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide, die für hohe Fluoreszenzausbeute und für den Einbau in DNA durch natürlich vorkommende oder genetisch veränderte Polymerasen optimiert sind, sind wegen ihrer Verwendung für die Sangersche Methode der DNA-Sequenzierung durch Kettenabbruch (Sanger et al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1977, 74:5463) preisgünstig verfügbar. Ebenso wie die übrigen Verfahren sind aber auch die beiden letztgenannten Verfahren, die auf der Verlängerung eines Primers mit einem fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotid aufbauen, in der Durchführung aufwendig.
Bei dem weiter oben erläuterten Verfahren ohne ZipCode ist es zur Erzie- lung eines klaren Signals erforderlich, die Probe vor dem Auftrag auf ein denaturierendes Gel vorzureinigen. Zur Abtrennung des Überschusses an nicht in den Primer eingebauten Didesoxynukleotid wird empfohlen, die Probe mit alkalischer Phosphatase zu behandeln und den Primer anschließend mit Isopropanol zu fällen. Besonders der Fällungsschritt läßt sich schlecht automatisieren.
Bei dem Verfahren mit ZipCode entfallen die handarbeitsintensiven Arbeitsschritte, dafür ist aber ein technisch aufwendiges Durchflußzytometer, das einen großen Wellenlängenbereich abdeckt, erforderlich. Außerdem besteht die Gefahr, Signale falsch zu interpretieren, weil sich die Spektren der verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe zumindest teilweise überschneiden.
Außerdem besteht bei der Verwendung von DNA von Spendern, die zwei verschiedene Allele des zu untersuchenden polymorphen DNA-Abschnitts besitzen, die Schwierigkeit, dass die beiden Allele entweder zunächst einzeln isoliert oder selektiv amplifiziert werden müssen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen bereitzustellen, die diese Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Nukleinsäurematrize,
(b) Anlagern von .mindestens einem Startprimer an die Nukleinsäurematrize, wobei das 3'-Ende des Primers stromaufwärts eines zu untersuchenden Nukleinsäurepolymorphismus liegt,
(c) Verlängern des Startprimers mit mindestens einem fluoreszenzmarkierten Nukleotid und
(d) Nachweisen von in den Startprimer eingebauten Nukleotiden durch Einzelmolekülbestimmung.
Bei dem Nukleinsäurepolymorphismus handelt es sich im einfachsten Fall um einen Einzelnukleotidpolymorphismus (single nucleotide polymorphism, SNP). Der Polymorphismus kann aber auch mehrere Nukleotide, zum Beispiel bis zu 20 aufeinanderfolgende Nukleotide oder sogar mehrere Gruppen aus einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden betreffen.
Als Nukleinsäurematrize kann DNA beliebiger Herkunft, beipielsweise von Prokaryonten, insbesondere pathogenen Prokaryonten, Archaeaen oder Eu- karyonten, insbesondere Säugetieren, insbesondere Mensch verwendet werden. Es kann sich aber auch um rekombinant hergestellte DNA oder um synthetische DNA handeln. Die DNA wird bevorzugt in einzelsträngiger Form verwendet. Solche DNA kann beispielsweise durch reverse Transkription eines RNA-Moleküls durch eine Reverse Transkriptase, etwa die ■ Reverse Transkriptase von AMV (Avian Myeloblastosis Virus) oder MMLV (Moloney Murine Leucaemia Virus) hergestellt werden. Es ist aber auch möglich, doppelsträngige DNA, etwa genomische DNA, DNA eines Plas- mids oder eines episomalen genetischen Elements durch Erhitzen in einzel- strängige DNA aufzutrennen, gegebenenfalls einen Strang aufzureinigen oder anzureichern, und dann den Primer annealen zu lassen. Bei der RNA oder DNA handelt es sich bevorzugt um eine möglichst homogene Mischung. Da der Startprimer aber Spezifität für die zu untersuchende DNA besitzt, kann auch mit heterogenen Gemischen gearbeitet werden.
Der Startprimer besteht bevorzugt aus einzelsträngiger DNA. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, mit RNA-Molekülen zu arbeiten. Der Startprimer kann auch ein Nukleinsäureanalog, zum Beispiel eine Peptid- nukleinsäure sein, wobei das Phosphat-Zucker-Rückgrat der Nukleinsäuren ersetzt wird durch ein peptidartiges Rückgrat, beispielsweise bestehend aus 2-Aminoethylenglycin (Nielsen et al., Science, 254:1497-1500) als Träger der einzelnen Basen A, T, G, C. Ein solcher Peptidnukleinsäureprimer muss ein 3'-Ende besitzen, das eine Elongation zulässt.
Bevorzugt bindet der Startprimer unmittelbar stromaufwärts des zu charakterisierenden SNPs. Falls mit Desoxynukleotiden und nicht mit Kettenab- bruchmolekülen gearbeitet wird, ist es aber auch möglich, einen Startprimer zu verwenden, der weiter stromaufwärts, vorzugsweise nicht mehr als 5 Nukleotide stromaufwärts von der. zu untersuchenden Polymorphismus- stelle bindet.
Das fluoreszenzmarkierte Nukleotid kann sowohl ein Desoxynukleotid als auch ein Kettenabbruchmolekül sein. Die Fluoreszenzmarkierungsgruppen können aus den bekannten zur Markierung von Biopolymeren, z.B. Nukleinsäuren, verwendeten Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wie etwa Fluores- cein, Rhodamin, Phycoerythrin, Cy3, Cy5 oder Derivaten davon etc. ausgewählt werden. Die Unterscheidung der Farbstoffe kann über die Wellenlän- • ; ge, über die Lebensdauer der angeregten Zustände oder über eine Kombination davon erfolgen.
Falls mehrere, -mit verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen versehene Nukleotide verwendet werden, können diese durch die Wellenlänge des anregenden Lichts, des emittierten Lichts oder eine Kombination daraus unterschieden werden. Eine Unterscheidung der Fluorezenzfarbstoffe kann auch durch eine Messung der Lebensdauer des angeregten Zustands erfol- gen. Es bietet sich an, die Verfahren zu kombinieren. So können beispielsweise vier Fluoreszenzmarkierungen für die vier verschienden Basen ausgewählt werden, die alle bei der gleichen Wellenlänge angeregt werden können, und die bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, wobei sich für die Markierungen, deren Emissionswellenlänge gleich ist, die Le- bensdauern der angeregten Zustände unterscheiden.
Die Verlängerung des Primers kann mit Methoden der Nukleinsäurechemie, die aus der Oligonukleotidsynthese bekannt sind, erfolgen. Bevorzugt erfolgt die Verlängerungsreaktion aber durch enzymatische Katalyse. Die Polymerase wird abhängig davon gewählt, ob als Matrize RNA oder DNA verwendet wird. Bevorzugt wird eine Polymerase ohne Exonukleaseaktivität ausgewählt. Beispiele für mögliche Polymerasen sind T7-Polymerase oder thermostabile Polymerasen wie Taq, Pfu, Pwo und Ähnliche, die üblicherweise für PCR-Reaktionen Verwendung finden.
Der Nachweis der Fluoreszenz eines einzelnen Moleküls kann mit einer beliebigen Messmethode, z.B. mit orts- oder/und zeitaufgelöster Fluoreszenz-Spektroskopie erfolgen, die in der Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement, wie es in einem Mikrokanal vorliegt, Fluoreszenzsignale bis hinunter zu Einzelphotonenzählung zu erfassen.
Beispielsweise kann die Detektion mittels konfokaler Einzelmoleküldetek- tion, wie etwa durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, erfolgen,
• wobei ein sehr kleines, vorzugsweise ein konfokales Volumenelement, beispielsweise 0,1 x 10"15 bis 20 x 10'12 I der durch den Mikrokanal strömenden Probefiüssigkeit einem Anregungslicht eines Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem Messvolumen befindlichen Fluoreszenzmarkierungen zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen mittels eines Fotodetektors gemessen wird, und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der relativen Flussgeschwindig- keit der beteiligten Moleküle erstellt wird, sodass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können. Auf Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des europäischen Patentes 0 679 251 verwiesen. Die konfokale Einzelmolekülbestimmung ist weiterhin bei Rigler und Mets (Soc. Photo-Opt.lnstrum.Eng. 1921 (1993), 239 ff.) und Mets und Rigler (J. Fluoresc. 4 (1994), 259-264) beschrieben.
Alternativ bzw. zusätzlich kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time Gating erfolgen, wie beispielsweise von Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence
Spetroscopy of Nucleic Acids", in: "Ultrafast Phenomena", D.H. Auston, Ed., Springer 1984, beschrieben. Dabei erfolgt die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend - vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von > 100 ps - das Öffnen eines Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch Raman-Effekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten werden, um eine im Wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermöglichen.
In . einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens kann die
Bestimmung auch die Messung eines kreuzkorrellierten Signals umfassen, das von mindestens einem, 2 unterschiedliche Markierungen, insbesondere
Fluoreszenzmarkierungen, enthaltenden Nukleinsäuremolekül oder • Nukleinsäuremolekül-Komplex stammt, wobei mehrere markierte
Nukleotide, Primer oder/und Nukleinsäurematrizen mit jeweils unterschiedlichen Markierungen eingesetzt werden können. Diese Kreuzkorrelationsbestimmung ist beispielsweise bei Schwüle et. al.
(Biophys.J. 72 (1997), 1878-1886) und Rigler et. al. (J. Biotechnol. 63
(1998), 97-109) beschrieben.
Der Nachweis von eingebauten Nukleotiden umfaßt bevorzugt eine Separa- tion des verlängerten Startprimers von nicht eingebauten Nukleotiden.
Die Trennung kann beispielsweise wie in der Patentanmeldung DE 100 23 423.2 beschrieben aufgrund der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit eingebauter und nicht eingebauter Nukleotide im elek- trischen Feld erfolgen. Auf diese Weise können typischerweise Anreicherungen um drei Zehnerpotenzen oder mehr erreicht werden.
Falls der Primer oder die Nukleinsäurematrize an einem Trägerpartikel immobilisisert ist, kann dieses Partikel beispielsweise mit Hilfe eines In- frarotlasers eingefangen werden. Anschließend kann dann ein Waschschritt in einem gerichteten Fluss, der elektroosmotisch oder hydrodynamisch sein kann, erfolgen. Wegen des günstigeren Flussprofils und der höheren Flussraten wird hydrodynamischer Fluss bevorzugt.
Es ist möglich, bei der Detektion zusätzlich zu prüfen, ob tatsächlich einge- baute Nukleotide beobachtet werden, oder ob noch kontaminierende, freie Nukleotide vorhanden sind. Dies ist zum Beispiel durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie möglich. Bei diesem Verfahren nutzt man aus, das der verlängerte Startprimer wesentlich langsamer diffundiert als die freien Kettenabbruchmoleküle un daher länger in dem von einem konfokalen Mikroskop beleuchteten Bereich verweilt, so dass emittiertes Fluoreszenzlicht vom verlängerten Startprimer eine wesentliche längere Korrelationszeit ■ .' besitzt als Fluoreszenzlicht von einem freien Kettenabbruchmolekül. Für die Messung der diffusionsbegrenzten Korrelationszeit genügen technisch wenig aufwendige Korrelatoren, da die Korrelationszeiten im Bereich von ms bis einigen 100 ms liegen.
Eine weitere Möglichkeit zur optischen Unterscheidung von eingebauten und nicht eingebauten Kettenmolekülen liegt in der Ausnutzung von Energietransferprozessen. So wurde beispielsweise von Edman et al (Edman, L., Mets, Ü. und Rigler, R., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 93, 6710-6715 (1996)) gezeigt, dass die Lebensdauer eines angeregten Zustands von Tetramethyl- rhodamin durch große räumliche Nähe drastisch verkürzt wird, die bei hoher Verdünnung des Kettenabbruchmoleküls nur dann eintritt, wenn das Molekül tatsächlich kovalent mit dem Startprimer verbunden wurde.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es aber auch möglich, die eingebauten Nukleotide beispielsweise durch eine Exonuklease wieder abzudauen und einzeln nachzuweisen. In diesem Fall erfolgt eine zumindest teilweise Sequenzbestimmung des verlängerten Startprimers. Dabei können Verfahren verwendet werden, wie sie in der Patentanmeldung DE 100 31 840.1 und in der Publikation Dörre et al., Bioimaging 5, 139-152 beschrieben sind. Für die Durchführung der Sequenzierungsreaktion wird die Nukleinsäure- matrix oder stärker bevorzugt der Startprimer an ein Trägerpartikel gekoppelt.
Die Einzelmolekülsequenzbestimmung umfasst vorzugsweise die Schritte:
(a) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, umfassend einen Mikrokanal,
(b) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,
(c) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül,
(d) zumindest teilweises Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsäure- moleküls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
Die Detektion und Manipulation beladener Trägerpartikel kann beispielsweise nach den in Holm et al. (Analytical Methods and Instrumentation, Special Issue TAS 96, 85-87), Eigen und Rigler (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994), 5740-5747) oder Rigler (J. Biotech. 41 (1995), 177-186) beschriebenen Methoden erfolgen, die eine Detektion mit einem konfokalen Mikroskop beinhalten. Die Manipulation der beladenen Trägerpartikel in Mikrokanalstrukturen erfolgt bevorzugt mit Hilfe eines Einfanglasers, z.B. eines Infrarotlasers. Geeignete Methoden sind zum Beispiel von Ashkin et al. (Nature 330 (198_7), 24-31 ) und Chu (Science 253 (1991 ), 861-866) beschrieben.
Vorzugsweise erfolgt das Festhalten des Trägerpartikels durch einen automatisierten Prozess. Hierzu werden die Trägerpartikel im hydrodynamischen Fluss durch den Mikrokanal geleitet, wobei sie ein Detektionselement passieren. Der Detektor im Detektionsfenster wird so eingestellt, dass er eine markierte Kugel aufgrund der darauf befindlichen fluoreszenzmarkierten DNA und/oder einer zusätzlichen fluoreszenzmarkierten Sonde erkennt, und daraufhin automatisch das Aktivieren des Einfanglasers im Messraum bewirkt.
Zur Abspaltung einzelner Nukleotide von dem verlängerten Startprimer- molekül wird eine Exonuklease verwendet, zum Beispiel T7-DNA-Polyme- rase als Exonuklease, E. coli Exonuklease I oder E. coli Exonuklease III.
Im einfachsten Fall wird nur ein einziger Startprimer für die Verlängerungsreaktion eingesetzt. Es ist aber auch möglich, mehrere, an verschiedenen Stellen an die Matrize bindende Startprimer einzusetzen und zu verlängern. Die Startprimer sind dann bevorzugt unterschiedlich kodiert, beispielsweise • • durch unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungen oder durch unterschiedliche Kombinationen von Fluoreszenzmarkierungen. Insbesondere können zur Identifikation des Startprimers fluoreszenzmarkierte dNTPs in den Start- primer eingebaut werden. Wenn für jedes Nukleotid eine unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung verwendet wird, lassen sich mit n fluoreszenzmarkierten Positionen 4π verschiedene Startprimer unterscheiden. Eine noch größere Zahl ergibt sich, wenn an verschiedenen Positionen für das gleiche Nukleotid unterschiedliche fluoreszenzmarkierte Analoga eingesetzt wer- den.
Gemäß einer ersten Ausführungsform erfolgt die Verlängerungsreaktion durch Anfügen eines einzelnen, fluoreszenzmarkierten Kettenabbruchmole- küls an den oder die Startprimer (siehe Abbildung 1 a für ein Beispiel). Als Kettenabbruchmoleküle werden bevorzugt die Didesoxynukleotide verwendet. Es ist aber auch möglich, anders modifizierte Desoxyribonukleinsäuren zu verwenden, sofern diese noch von den verwendeten Enzymen erkannt werden. Denkbar ist beispielsweise, die 3'-Position des Desox- yribosemoleküls durch ein Halogenatom oder einen Alkyl- oder Alkoxyrest zu modifizieren. Gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können mehrere hintereinander liegende Nukleotide charakterisiert werden. In diesem Fall wird die Beendigung der Verlängerungsreaktion nicht durch den Einbau eines geeigneten Kettenabbruchmoleküls, sondern durch einen Blockprimer erzwungen (siehe Abbildung 1 b für ein Beispiel). Der Blockprimer ist stromabwärts des zu untersuchenden Polymorphismus an die Nukleinsäurematrize gebunden und ist selbst gegen Verlängerung an seinem 3'-Ende durch geeignete chemische Modifikation geschützt. Beispielsweise kann das am weitesten stromabwärts gelegene Nukleotid des Block- primers ein Kettenabbruchmolekül sein. Auch bei dieser Ausführungsform ist es möglich, mehrere unterschiedlich kodierte Start/Blockprimerpaare, die an verschiedenen Stellen an die Matrize binden können, einzusetzen (siehe Abbildung 1 c für ein Beispiel).
Die Blockierung der Blockprimer kann, gegebenfalls mit Ausnahme der Blockierung des am weitesten stromabwärts bindenden Blockprimers, reversibel sein. Zur reversiblen Blockierung kann eine abspaltbare Schutzgruppe, beispielsweise eine photolabile Schutzgruppe verwendet werden. Besonders bevorzugt tragen die Blockprimer am 3'-Ende eine Phosphat- gruppe an der 3'-Position des Zuckers. Diese Phosphatgruppe am 3'-Ende verhindert die Elongation durch Polymerase und kann zur Deblockierung ohne weiteres mit einer 3'-Phosphatase abgespalten werden.
Nach der Verlängerungsreaktion des Startprimers besteht noch keine kova- lente Bindung zum unmittelbar stromabwärts liegenden Blockprimer. Diese Bindung kann aber geknüpft werden, zum Beispiel enzymatisch mit einer Ligase. Die Ligation läuft wesentlich leichter ab, wenn die Blockprimer an ihrem 5'-Ende eine Phosphatgruppe tragen.
Gemäß einer dritten Ausführungsform kann/körinen die Lücke(n) zwischen Paaren aus einem durch fluoreszierende Nukleotide verlängerten Startprimer und dem jeweils stromabwärts liegenden Blockprimer nach Entfernung der 3'-Blockierung der Blockprimer durch Desoxyribonukleotide aufgefüllt werden und kovalente Bindungen zwischen den verlängerten Blockprimem und den unmittelbar stromabwärts liegenden Startprimem geschlossen werden (siehe Abbildung 1 d für ein Beispiel). Dazu tragen die Blockprimer bevorzugt ein 5'-Phosphat. Bei dieser Ausführungsform ist es nicht unbedingt erforderlich, die verschiedenen Start/Blockprimerpaare mit Kodierungen zu versehen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Kombination der Ketten- abbruchmarkierung mit einem Nachweis in vollständig oder teilweise transparenten Mikrowells (siehe Patentanmeldung DE 100 23 421 .6). Dieses • - Verfahren umfasst die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekül, bestehend aus einer einzelsträngigen Nuklein- säurematrize und einem Startprimer,
(b) Verlängern des Startprimers durch ein fluoreszenzmarkiertes Kettenabbruchmolekül,
(c) gegebenenfalls Waschen des Wells zur Abtrennung von nicht eingebauten Markierungen und (d) Nachweisen der in den Startprimer eingebauten Fluoreszenzmarkierung.
Je nach Anordnung der die Fluoreszenz anregenden Lichtquelle und des Detektors ist die Verwendung ganz oder teilweise transparenter Mikrowells erforderlich. Die Anregung oder/und der Nachweis der Fluoreszenz kann beispielsweise durch einen in den Mikrowell integrierten Halbleiterlaser oder/und Halbleiterdetektor erfolgen (siehe Abbildung 2 für ein Beispiel). Die Anregungslichtquelle oder/und der Detektor können aber auch außerhalb der Mikrostruktur liegen. Das Verfahren eignet sich hervorragend zur Automatisierung, da eine Vielzahl von Reaktionen auf einer Mikrowellplatte parallel oder sequenziell durchgeführt werden können. Falls die Menge an Startprimer und die Menge an eingesetztem markiertem Nukleotid gering (nM) gehalten wird, kann die Unterscheidung von eingebauten und nicht eingebauten Kettenabbruchmolekülen beispielsweise durch FCS (Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie) wie weiter oben erläutert erfolgen. Alternativ können, wie ebenfalls oben erläutert, Energietransferprozesse ausgenützt werden.
Alternativ und bevorzugt werden höhere, z.B. μWΛ Konzentrationen an Primer und Kettenabbruchmolekülen eingesetzt, weil die Inkubationszeit dann geringer gehalten werden kann. Zumindest die Kettenabbruchmoleküle müssen dann allerdings nach der Primerverlängerungsreaktion durch - einen Waschschritt wieder entfernt werden. Dazu können Mikrowells mit einem oder mehreren kleinen Löchern oder einer Größenausschlussmem- bran verwendet werden, welche die markierte, an ein Trägerpartikel gebun- dene DNA zurückhalten und die unmarkierten Kettenabbruchmoleküle durchlassen (siehe z. B. Abbildung 2).
Verschiedene Kombinationen von Startprimem und Kettenabbruchmolekülen sind denkbar. Im einfachsten Fall werden für die Charakterisierung eines SNPs zwei oder mehr (bis zu vier) Wells mit nur jeweils einem fluoreszenzmarkiertes Kettenabbruchmolekül und dem Startprimer, dessen 3'-Ende unmittelbar vor dem zu untersuchenden Nukleotid hybridisiert, beladen. Nur in einem der Wells kommt es zu einer Elongationsreaktion. Da bekannt ist, welcher Well welches Kettenabbruchmolekül enthält, kann für alle Ketten- abbruchmoleküle die gleiche Fluoreszenzmarkierung verwendet werden. Da die Verlängerungsreaktion abbricht, wenn nicht das richtige Nukleotid für die Verlängerung vorhanden ist, können in diesem Fall auch Desoxynukleo- tide verwendet werden. Bevorzugt wird aber ein Kettenabbruchmolekül wie zuvor beschrieben, zum Beispiel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ddATP, ddUTP, ddTTP, ddCTP und ddGTP zur Verfügung gestellt. Bevorzugt wird eine Festphase mit einer Vielzahl von Wells wie beispielsweise in Patentanmeldung DE 100 23 421.6 beschrieben, verwendet. In einem einzigen Ansatz können auf diese Weise eine Vielzahl von SNPs parallel untersucht werden. Vorzugsweise erfolgt hier eine parallele Detektion von jeweils 4 Wells.
Es ist aber auch möglich, einen Startprimer zusammen mit mehreren, vorzugsweise vier verschiedenen Kettenabbruchmolekülen entsprechend den vier Nukleobasen einzusetzen. Die Kettenabbruchmoleküle müssen dann allerdings verschiedene Markierungsgruppen tragen. Eine Unterscheidung der Markierungsgruppen ist über die Wellenlänge des anregenden und/oder emittierten Lichts oder über die Lebensdauer des angeregten
Zustands möglich. Die Messung der Lebensdauer des angeregten Zustands erfolgt durch Messung der Fluoreszenzabklingzeit (FD, fluorescence decay) .
Bei dieser Messmethode wird das zu untersuchende Molekül durch einen gepulsten Laser (z.B. einen mode locked laser) angeregt. Die Detektion der emittierten Fluoreszenzphotonen erfolgt als Funktion der Zeit seit dem Abklingen des Laserpulses, dessen zeitliche Dauer klein gegenüber der zeitlichen Lebensdauer des zu untersuchenden angeregten Zustands sein muss.
In speziellen Fällen ist es möglich, mit mehreren Startprimem und mehreren Kettenabbruchmolekülen im einem Well zu arbeiten. Ist beispielsweise von einem SNP bekannt, dass nur eine der Basen A oder T zu erwarten ist, und ist von einem weiteren SNP bekannt, dass nur entweder G oder C auftreten, so können die beiden Polymorphismen parallel untersucht werden. Weitere Situationen, in denen aufgrund zusätzlicher Information über die Polymorphismen mehrere Nukleotidpositionen gleichzeitig untersucht werden können, sind für den Fachmann leicht ersichtlich.
Mit noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können auch mehrere SNPs gleichzeitig untersucht werden, selbst wenn an den Polymorphismusstellen mit dem Auftreten aller vier Nukleotide gerechnet werden muss. Dazu wird für jede Polymorphismusstelle ein Start- primer eingesetzt, dessen 3'-Ende unmittelbar stromaufwärts von dem jeweils zu charakterisierenden Nukleotid liegt. Anschließend erfolgt die Verlängerungsreaktion mit den markierten Kettenabbruchmolekülen. In einem weiteren Schritt werden dann zu ausgewählten Restriktionsschnittstellen komplementäre Startprimer zugegeben, so dass ein Verdau der Nukleinsäurematrix in Fragmente charakteristischer Länge erfolgen kann. Durch Untersuchung des Diffusionsverhaltens der Fragmente mittels FCS können die Fluoreszenzsignale dann den einzelnen polymorphen Nuklein- säurepositionen zugeordnet werden.
Ein prinzipiell analoges Vorgehen ist möglich, wenn statt der Restriktase • • eine sequenzspezifische Ligase verwendet wird. Sequenzspezifische Liga- tion läßt sich beispielsweise durch "rückwärts" betriebene Restriktasen erreichen. Da die Hydrolysereaktion ein Molekül Wasser verbraucht und die Ligationsreaktion ein Molekül Wasser freisetzt, läßt sich das Gleichgewicht in Richtung der Ligation verschieben, indem man ein möglichst wasserfreies Reaktionsmedium verwendet. Im analogen Fall von Proteasen wurde "Rückwärtsbetrieb" des Enzyms erfolgreich realisiert durch den Zusatz großer Mengen von Polyethylenglycol oder organsichen Lösungsmitteln zum Reaktionspuffer.
Für alle beschriebenen Ausführungsformen besitzt das Trägerpartikel bevorzugt eine Größe im Bereich von 0,5 bis 10 μm und besonders bevorzugt von 1 bis 3//m. Beispiele für geeignete Materialien von Trägerpartikeln sind Kunststoffe wie Polystyrol, Glas, Quarz, Metalle oder Halbmetalle wie Silicium, Metalloxide wie Siliciumdioxid oder Verbundmaterialien, die mehrere der zuvor genannten Komponenten enthalten. Besonders bevorzugt werden optisch transparente Trägerpartikel, beispielsweise aus Kunststoffen oder Partikel mit einem Kunststoff kern und einer Siliciumdioxidhülle eingesetzt. Die Immobilisierung an ein Trägerpartikel kann entweder über die Matrize oder über den Startprimer erfolgen. Für das Verfahren ist es dabei unerheblich, zu welchem Zeitpunkt der Immobilisierungsschritt erfolgt. Dieser Schritt ist möglich i) vor dem Hybridisierungsschritt, ii) nach dem Hybridis- ierungsschritt, aber vor Verlängerung des Startprimers durch das Kettenabbruchmolekül, und bevorzugt, iii) nach der Verlängerungsreaktion. Der Vorteil der späten Immobilisierung besteht darin, dass ein möglicherweise störender Einfluss der Trägers auf die Hybridisierungs- und Verlängerungsreaktion vermieden wird.
Die Bindung des Startprimers oder der Nukleinsäurematrize an den Träger
•; kann durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen erfolgen.
Beispielsweise kann die Bindung der Polynukleotide an den Träger durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, z.B. Biotin/Streptavidin oder Avidin, Hapten/Anti-Hapten- . Antikörper, Zucker/Lectin etc., vermittelt werden. So können biotinylierte Nukleinsäuremoleküle an Streptavidin-beschichtete Träger gekoppelt werden. Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle auch adsorptiv an den Träger gebunden werden. So kann eine Bindung von durch Einbau von Alkanthiolgruppen modifizierten Nukleinsäuremolekülen an metallische Träger, z.B. Goldträger, erfolgen. Noch eine weitere Alternative ist die kovalente Immobilisierung, wobei die Bindung der Polynukleotide über reaktive Silangruppen auf einer Silika-Oberf lache vermittelt werden kann. Falls ein Gemisch aus zwei oder mehr an der Stelle des Einzelnukleotidpoly- morphismus verschiedenen DNA-Molekülen als Matrize vorliegt, ist es wie bei der Einzelmolekülsequenzierung günstig, nur höchstens ein Molekül der Matrize oder des Startprimers an ein einzelnes Trägerpartikel zu binden. Dies läßt sich durch einen hinreichend hohen molaren Überschuß an Trägerpartikel gegenüber der Matrize oder dem Startprimer leicht erreichen.
Falls die als Matrize verwendeten DNA-Moleküle dagegen alle einheitlich sind, ist es insbesondere für die Ausführungsform der Erfindung in Mikro- wells sogar günstig, mehrere Moleküle Matrize oder Startprimer an ein Trägerpartikel zu binden. Der Exonukleaseverdau führt dann zur Abspaltung mehrerer identischer fluoreszenzmarkierter Kettenabbruchmoleküle, so dass sich das Fluoreszenzsignal und damit das Signal- zu Rauschverhältnis verbessert.
Bei der Verwendung mehrerer fluoreszenzmarkierter Komponenten bei den erfindungsgemäßen Polymorphismuscharakterisierungen entstehtdas Problem, die verschiedenen Markierungen wirksam zu trennen. Wie weiter oben beschrieben kann dies unter anderem durch die Verwendung verschiedener Wellenlängen bei der Anregung und Emission von Fluoreszenzlicht erfolgen. Die spektrale Aufspaltung erfolgt dabei gemäß dem Stand der Technik mit dichroischen Spiegeln. Nachteil bei diesem Vorgehen sind die vergleichsweise hohen Verluste, insbesondere bei der spektalen Aufspaltung der vom Fluorophor emittierten Photonen. Überraschend wurde gefunden, dass die Verluste verringert werden können, wenn die spektrale Aufspaltung statt mit einem dichroischen Spiegel mit einem Dispersionselement wie etwa einem Gitter, z.B. einem holographischen oder geritzten Gitter oder einem Prisma erfolgt (siehe Abbildung 3). Dabei ist es günstig, die Reflexionen beim Eintritt des Lichts in das Dispersionselement oder/und beim Austritt des Lichts aus dem Dispersionselement z.B. durch geeignete Beschichtung der Glasoberflächen bei einem Prisma möglichst vollständig unterdrückt werden. Die Verwendung eines Dispersionselements statt eines dichroischen Spiegels ist nicht auf die Verwendung bei der Charakterisierung von Nukleotidpolymorphismen beschränkt. Sie ist ebenfalls möglich beim direkten Nachweis von Einzelmolekülen (siehe z.B. Anmeldung DE 100 23 423.2), bei Einzelmolekülsequenzierungsverfahren (siehe z.B. Anmeldung DE 100 31 840.1 ), bei Verfahren zur Selektion von Partikeln (siehe z.B. Anmeldung DE 100 31 842.8), bei Verfahren zum Nachweis von Polynukleotiden (siehe z.B. Anmeldung DE 100 23 421 .6), bei Verfahren zur Auftrennung von markierten Biopolymeren (siehe z.B. Anmeldung DE 100 23 422.4) und bei Multiplexsequenzierverfahren (siehe z.B. Anmeldung DE 100 31 842.8)
Abb. 1 zeigt verschiedene Ausführungsformen der Polymorphismus- Charakterisierung. In (a) erfolgt die Verlängerung des Startprimers um ein einziges fluoreszenzmarkiertes Kettenabbruchmolekül. In (b) wird der Startprimer durch unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Desoxynukleotide bis zum 3'-Ende eines stromabwärts bindenden Blockprimers verlängert. Der Block- primer selbst ist an seinem 3'-Ende blockiert, so dass er nicht verlängert wird. In (c) werden mehrere Start/Blockprimerpaare eingesetzt. In diesem Fall ist es erforderlich, die Startprimer durch Fluoreszenzmarker zu kodieren. In (d) werden ebenfalls mehrere Start/Blockprimerpaare eingesetzt, zusätzlich ist die Blockierung der Blockprimer (mit Ausnahme der Blockierung des am weitesten stromabwärts gelegenen Blockprimers) am 3'-Ende reversibel, also beispielsweise eine 3'-PhosphatblocK- kierung. In einem ersten Schritt werden in Gegenwart der 3'- Blockierung fluoreszierende Nukleotide eingebaut. Nach einem Waschschritt zum Entfernen nicht eingebauter Nukleotide wird dann in einem zweiten Schritt nach Entfernung der 3'-Blockie- rung die Lücke zwischen Blockprimer und folgendem Startprimer durch unmarkierte Desoxynukleotide aufgefüllt. Die noch fehlenden kovalenten Bindungen aufeinanderfolgender Nukleotide werden durch Ligase geknüpft. Dargestellt ist das
Ergebnis dieses Vorgehens.
Abb. 2 (a) zeigt eine Draufsicht, (b) eine Seitenansicht eines Mikrowells, der sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignet. Abb. 3 (a) zeigt die zur Einzelmolekülbestimmung bisher verwendete
Optik, (b) zeigt die erfindungsgemäße Optik unter Verwendung eines Dispersionselements zur Auftrennung der verschiedenen Wellenlängen.
Die Bestimmung kann über die Fluoreszenzintensitäten (Aλ) bei verschiedenen Wellenlängen oder/und über Fluoreszenz- Abklingzeiten (r) bei verschiedenen Wellenlängen unter Verwendung mehrerer Detektoren erfolgen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen, u u mf a sse n d die Schritte:
(a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Nukleinsäurematrize,
(b) Anlagern von mindestens einem Startprimer an die Nukleinsäurematrize, wobei das 3'-Ende des Startprimers stromaufwärts eines zu untersuchenden Nukleinsäurepolymorphismus liegt,
(c) Verlängern des Startprimers mit mindestens einem fluoreszenzmarkierten Nukleotid und
(d) Nachweisen von in den Startprimer eingebauten Nukleotiden durch Einzelmolekülbestimmung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d ad u rc h ge ken n zeic h n et, dass der Nachweis von eingebauten Nukleotiden eine Separation des verlängerten Startprimers von nicht eingebauten Nukleotiden umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d ad u rc h ..g e ken nzeic h n et, dass der Nachweis des eingebauten Nukleotids eine zumindest teilweise Sequenzbestimmung des verlängerten Startprimers umfasst.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rch ge ken n zeic h n et, dass zur Durchführung der Einzelmolekülbestimmung der Startprimer an ein Trägerpartikel gekoppelt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, d ad u rch geken nzeich net, dass die Einzelmolekülsequenzbestimmung die Schritte umfasst:
(a) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, umfassend einen Mikrokanal,
(b) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,
(c) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül,
(d) zumindest teilweises Bestimmen der Basenfolge des Nuklein- säuremoleküls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d adurch gekennzeichnet, dass eine enzymatische Abspaltung von an den Startprimer angehängten Nukleotiden durch eine Exonuklease, insbesondere durch T7-DNA-Polymerase als Exonuklease, E. coli Exonuklease I oder E. coli Exonuklease III erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rch gekenn zeic hnet, dass ein einziger Startprimer verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, d ad u rch g e ken nze ich n et, dass mehrere Startprimer verwendet werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, d ad u rch ge ken n zeich net, dass die Verlängerungsreaktion das Anfügen eines einzigen fluoreszenzmarkierten Kettenabbruchmoleküls umfasst.
10. Verfahren nach Anspruch 9, d ad u rch geken nzeic h net, dass es sich bei dem Kettenabbruchmolekül um ein Didesoxynukleotid handelt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, d ad u rc h ge ken nzeichnet, dass die Verlängerungsreaktion das Anfügen mehrerer fluoreszenzmarkierter Nukleinsäurebausteine umfasst.
12. Verfahren nach Anspruch 11, d ad u rch g ekennzeichn et, dass ein oder mehrere Paare von Start- und Blockprimern eingesetzt werden, wobei das 5'-Ende jedes Blockprimers in einem vorbestimmten Abstand stromabwärts des 3'-Endes des zugehörigen
Startprimers an die Nukleinsäurematrize bindet, wobei das 3'-Ende des Blockprimers blockiert ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, d ad u rch gekennzeich net, dass mehrere Paare von Start- und Blockprimern eingesetzt werden und die Start/Blockprimerpaare anhand unterschiedlicher Kodierungen identifiziert werden können.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, d ad u rch ge ken nzeic hnet, dass die Blockierung des 3'-Endes der Blockprimer, gegebenenfalls mit Ausnahme des am weitesten stromabwärts bindenden Blockprimers reversibel ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, d adu rch g eken n zeich n et, dass Blockprimer verwendet werden, die eine 3'-Phosphatgruppe tragen.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, d ad u rch ge kennzeich n et, dass eine kovalente Bindung zwischen dem durch fluoreszierende Nukleotide verlängerten Startprimer und dem Blockprimer geschlossen wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, d ad u rch g e ken nzeich n et, dass die kovalente Bindung enzymatisch, zum Beispiel unter Verwendung einer Ligase geschlossen wird.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Blockprimer eine δ'-Phosphatgruppe trägt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, d ad u rch geken n zeichnet, dass die Lücke(n) zwischen den durch fluoreszierende Nukleotide verlängerten Startprimern und den jeweils stromabwärts liegenden Blockprimern nach Entfernung der 3'-Blockierung der Blockprimer durch Desoxyribonukleotide aufgefüllt werden und kovalente Bindungen zwischen den verlängerten Blockprimern und den unmittelbar stromabwärts liegenden Startprimern geschlossen werden.
20. Verfahren zur Charakterisierung von Nukleinsäurepolymorphismen in einem Mikrowell, u mf assend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immo- bilisierten Nukleinsäuremolekül, bestehend aus einer erstrangigen Nukleinsäurematrize und einem Startprimer,
(b) Verlängern des Startprimers durch ein fluoreszenzmarkiertes Kettenabbruchmolekül,
(c) gegebenenfalls Waschen des Wells zur Abtrennung von nicht eingebauten Markierungen und
(d) Nachweisen der in den Startprimer eingebauten Fluoreszenzmarkierung.
21. Verfahren nach Anspruch 20, d ad u rc h ge kennzeich net, dass zur Anregung oder/und zum Nachweis der Fluoreszenz ein in den Mikrowell integrierter Halbleiterlaser oder/und Halbleiterdetektor verwendet wird.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, d ad u rch gekennzeich n et, dass eine Vielzahl von Reaktionen auf einer Mikrowellplatte parallel oder sequenziell durchgeführt wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, d ad urch gekenn zeichnet, dass zur Verlängerung des Startprimers nur eine Art von markiertem Nukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ddATP, ddUTP, ddTTP, ddCTP, ddGTP zur Verfügung steht.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass zur Verlängerung des Startprimers mehrere, durch ihre Fluoreszenzmarkierung unterscheidbare Kettenabbruchmoleküle zur Verfügung stehen.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e ke n n zei c h n et, dass man ein Trägerpartikel aus Kunststoff, Glas, Quarz, Metallen, Halbmetallen, Metalloxiden oder aus einem Verbundmaterial verwendet.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e ke n nze ic h n et, dass das Trägerpartikel einen Durchmesser von 1 nm bis 10 μm aufweist.
27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e ken nzei c h n et, dass das die Nukleinsäurematrix auf dem Trägerpartikel über ihren
5'-Terminus oder der Startprimer über seinen 3'-Terminus mittels bioaffiner Wechselwirkungen immobilisiert wird.
28. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et, dass ein biotinyliertes Nukleinsäuremolekül an ein Avidin- oder Streptavidin-beschich.tetes Trägerpartikel immobilisiert wird.
29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rch geken nzeich net, dass die Unterscheidung verschiedener Fluoreszenzmarkierungen aufgrund der Wellenlänge, der Lebensdauer des angeregten Zustands oder einer Kombination daraus erfolgt.
30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rch geken nzeich net, dass die Bestimmung durch konfokale Einzelmoleküldetektion oder/und durch zeitaufgelöste Abklingmessung erfolgt.
31. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d ad u rch gekennzeichnet, dass die Bestimmung die Messung eines kreuzkorrelierten Signals umfasst, das von einem, mindestens 2 unterschiedliche
Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, enthaltenden Nukleinsäuremolekül oder Nukleinsäuremolekül-Komplex stammt.
32. Verfahren zur Steigerug der Detektionseffizienz beim Nachweis der Fluoreszenz von Einzelmolekülen, d ad u rc h g e ke n nzeich n et, dass zur Trennung des Lichts verschiedener Wellenlängen ein
Dispersionselement verwendet wird.
33. Verfahren nach Anspruch 32, d a d u rc h geken nzeich net, dass als Dispersionselement ein Prisma oder Gitter verwendet wird.
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