EP1153282A2 - Verfahren und vorrichtungen zur erfassung optischer eigenschaften, insbesondere von lumineszenz-reaktionen und brechungsverhalten, von auf einem träger direkt oder indirekt gebundenen molekülen - Google Patents

Verfahren und vorrichtungen zur erfassung optischer eigenschaften, insbesondere von lumineszenz-reaktionen und brechungsverhalten, von auf einem träger direkt oder indirekt gebundenen molekülen

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EP1153282A2
EP1153282A2 EP99966859A EP99966859A EP1153282A2 EP 1153282 A2 EP1153282 A2 EP 1153282A2 EP 99966859 A EP99966859 A EP 99966859A EP 99966859 A EP99966859 A EP 99966859A EP 1153282 A2 EP1153282 A2 EP 1153282A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
carrier
molecules
detector
optical properties
light
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99966859A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Annemarie Poustka
Frank Breitling
Karl-Heinz Gross
Stefan Dübel
Rainer Saffrich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ, Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the invention relates to methods and devices for detecting optical properties, in particular luminescence reactions and refractive behavior, of molecules directly or indirectly bound on a carrier.
  • the term "properties” is understood in the broadest sense and is intended not only to include the properties which are characteristic of certain molecules, such as, for example, their mass spectrogram, but also, for example, the ability to perform a specific reaction at all - namely by the mere presence of them show, so that the invention also relates to methods and devices in which a certain optical reaction is initially only intended to infer the mere presence of a substance - but not its type (the type of substance then being determined, for example, from its position is determined on the carrier).
  • the examined molecules are part of biological structures bound on the carrier, such as in particular cells, molecules, cell parts, cell extensions or tissues, or they are bound to biological structures immobilized on the carrier.
  • the molecules to be examined are all types of molecules which are particularly relevant in biology, pharmacy and medicine, for example peptides, D-peptides, L-peptides and mixtures thereof, naturally occurring oligonucleotides, their mirror images and mixtures thereof, artificially derivatized oligonucleotides, such as those used to construct aptamers, oligosaccharides and modifications of the molecules mentioned.
  • modular oligomers that do not occur in nature can have particular pharmacological relevance.
  • Ligands of biological molecules can be used, in particular organic compounds, steroid derivatives, etc.
  • Specific binders for a naturally occurring molecule, which modify the activity of this molecule can be isolated from a large number of such molecules. However, since these binders can then often not be broken down by naturally occurring digestive enzymes, they are particularly suitable for use as a therapeutic agent.
  • the number of the maximum number of molecules or groups of molecules to be accommodated on a carrier is limited in the known methods and devices and is approximately in the order of some 10 5 molecule groups. In particular for certain blood serum or DNA analyzes, however, it would be desirable if approximately 10 8 to 10 9 molecules could be applied and examined on a carrier.
  • Lithographic methods are known for applying the molecules to the respective carriers, in particular on so-called “diagnostic chips”, but - as in the later investigation - the difficult exact assignment of the molecule and the repeatedly positionable carrier position to the number of the maximum molecules that can be applied limited, because it is not enough to arrange a large number of different molecules densely packed on a carrier, but without knowing repeatedly, which molecules are in which position on the carrier.
  • a sample carrier for the microscopic examination of a large number of samples by means of fluorescence spectroscopy is known from German Offenlegungsschrift 197 52 085 A1, in which a plurality of separate wells forming recesses are made in one of the side surfaces of a disk-shaped substrate.
  • sample carrier requires the ordered arrangement of the samples, since the position information cannot be read out simultaneously with the fluorescence signal in the same high resolution.
  • known sample carrier does not allow a cell lawn or irregular structures to be detected in a tissue section living on the sample carrier.
  • the object of the invention is to provide improved methods and devices for detecting optical properties, in particular luminescence reactions and refractive behavior of molecules bound on a carrier, in particular biological molecules, which are also inexpensive to manufacture or carry out. If possible, the methods and devices should also be able to be carried out particularly quickly or work particularly quickly.
  • the relative movement of carrier and detector is preferably generated by rotating the carrier.
  • the rotation of the carrier can even be used to make certain desired physical changes on the carrier in the manner of a centrifuge.
  • Such a movement can also be brought about by applying an electromagnetic field or a hydrodynamic or osmotic pressure instead of a rapid rotation of the carrier in the manner of the substances present on the carrier.
  • the invention advantageously allows the use of a preferably transparent CD, DVD, MOD or FMD, which is essentially commercially available with regard to the position markings.
  • This has the advantage that position detection systems can be used to detect the position of the carrier, which have already proven themselves in practice to be very reliable and which can also be produced inexpensively.
  • integrated position markings is understood to mean all types of markings which are firmly connected to the carrier and allow a clear determination of the position of the carrier relative to a detector.
  • these markings are integrated in the respective carrier, some of them not sitting on the surface on which the molecules to be examined are located, but in an underlying layer.
  • the use of carriers whose position markings can be detected optoelectronically has the further advantage that the laser light which is generally used for reading out the markings can simultaneously be used for examining the molecules, in particular for their luminescence excitation.
  • the method can advantageously be carried out in such a way that the optical properties are measured several times in succession at a specific location on the rotating carrier, in order, for example, to enable statistical evaluation at a low signal strength or to change the optical properties at a specific location over time to grasp on the carrier.
  • the process of exchanging or modifying molecules whose optical properties are to be recorded can be repeated as often as desired.
  • a characteristic profile can thus be created for a specific location of the material applied to the carrier, in particular cells or histological sections.
  • optical properties of several different molecules are preferably measured simultaneously at a specific location.
  • Detachment of the molecules of laser light can be used on the same source that also supplies the laser light used for the investigation of the optical properties.
  • a single light source can therefore perform three different tasks: scanning the position markers, stimulating luminescence reactions and detaching molecules.
  • the light source can also be used to trigger light-dependent reactions in the chemicals, biological structures or the substances bound to the carrier.
  • the principle of the convocal laser scanning microscope can be used to record the optical properties.
  • the fluorescence signals of individual pixels of an array of molecules are advantageously measured in different focusing levels.
  • an optical imaging system can be introduced between the excitation system and the carrier as well as between the carrier and the detection system.
  • Such an imaging system should include at least one lens system or an array of lens systems, an optical grating, an optical mirror or an array of optical mirrors, optical fibers or an array of optical fibers and / or a gradient index lens system or an array of gradient Index lens systems include.
  • the molecules can be detached from the support in various ways, for example via a photolabile linker, via ionization, by electromagnetic radiation, by applying an electrical voltage, by an enzymatic reaction, by changing the ion concentration, by changing the pH. Value or with the help of a catalyst.
  • the detached molecules can be a component of liposomes, virus particles, retroviruses, bacteriophages, litroids or cells, in particular D-lymphocytes, T-lymphocytes, leukocytes or bacteria, of complexes of nucleic acid and protein, in particular of ribosomal display complexes, of with DNA binding fusion proteins of loaded DNA, of complexes of nucleic acid and other molecules, in particular artificially produced complexes of DNA and a ligand.
  • a carrier can advantageously be used to which a preferably complete peptide library containing L-amino acids, in particular a 4-mer, 5-mer, 6-mer, 7-mer or 8-mer peptide library, has been applied.
  • a peptide library containing D-amino acids can also be applied to the support.
  • supports from which a peptide library of L- and D-amino acids, an aptamer library, an oligosaccharide library or an oligonucleotide library is applied.
  • Such libraries can preferably be applied by means of chemical combinatorics.
  • the individual monomers in the oligonucleotide library can be mirror images of the naturally occurring monomers.
  • the method advantageously allows a particularly rapid analysis of the luminescence behavior of the molecules under investigation.
  • a carrier can be used in which the samples are arranged as desired, since the position information can be read out simultaneously with the luminescence signal in the same high resolution. This makes it possible, for example, to detect cell turf or irregular structures, such as those present in a tissue section, on the examined carrier.
  • the method can be used particularly advantageously as an alternative for fluorescence-activated cell sorters or line scanners (FACS) in fluorescence-activated cell sorters or line scanners (FACS), which allows working with adherent cells and e.g. can be used in the screening of molecular libraries of bioactive substances. It is also possible to quickly and easily examine epithelia and other exclusively adherently growing cells arranged on the carrier used, so that apoptosis triggers and new malaria agents can be searched for. Adherent cells are particularly important when looking for new drugs.
  • the method according to the invention can also be used for neural
  • Quantify differentiation processes (the axon growth) that only take place on solid matrices and often require a special coating of the carrier.
  • the method thus also allows the repeated detection of each individual cell, while in known FACS the examined cell is lost after the measurement. Thanks to the position information contained in another layer of the carrier, for the first time it is also possible to measure different properties of one and the same cell in succession. Individual cells in tissue sections attached to the carrier used can also be counted after specific staining (for example of immigrated T lymthocytes in biopsies of inflammation spots in autoimmune patients). It is also possible to analyze tumor biopsies, if necessary after repeated staining. With a correspondingly fast rotation of the carrier, centrifugation can be carried out directly for analytical ultracentrifugation, in particular if the carrier is in a sealed compartment during rotation.
  • the term "light” is understood here to mean all types of electromagnetic waves, in particular also waves with wavelengths outside the sensitivity range of the human eye.
  • the term "detection" being understood here to mean the determination of a measurable quantity, including the generation of corresponding signals which can be used for the respective examination, so that the actual one Sensor of the respective detector can very well get light that does not result from a luminescence reaction, as long as only - for example, by switching off the detection devices downstream of the sensor, in particular thus the signal generation and evaluation during the irradiation of the electromagnetic excitation for luminescence. table waves - it is ensured that this light is not converted into disturbing signals.
  • the short-term excitation and the time-delayed reading of the luminescence reaction in the dark phases of the excitation can improve the signal-to-noise ratio for all types of fluorescence measurements, in particular for fluorescence measurements based on the principle of the confocal laser Scanning microscope, in the detection of chromatographically separated fluorescence-labeled molecules, especially when sequencing DNA, and in the fluorescence-activated cell sorter or cell scanner (FACS).
  • FACS fluorescence-activated cell sorter or cell scanner
  • Another approach to improve the signal-to-noise ratio of luminescence signals is based on the topography of a mixed array of individually controllable silicon elevations with light-emitting diodes.
  • the individually controllable light-emitting diodes are arranged in recesses, so that the light emitted by them only stimulates a luminescence reaction in the case of adjacent silicon elevations.
  • the topography of the mixed array described can also be associated with brief excitation of the luminescence reaction and reading out of the signals in the dark phase become.
  • the short-term excitation of fluorescence molecules also enables a particularly simple assignment of fluorescence signals to individual molecules in a molecule library when these are applied to an array of detectors.
  • the current generated in the dark phases of the excitation due to the luminescence of the molecules can be read out in parallel in the individual photodetectors and thus assigned to the individual members of the molecule library.
  • Decoupling of excitation and detection is advantageously achieved both by the described pulsed irradiation / pulsed detection and by the movement of the carrier and detector relative to one another and by the alternate operation of several light sources and detectors, which leads to a considerably clearer luminescence signal and the known methods thus leads to an improved signal-to-noise ratio.
  • the latter can be further improved if one or more wavelength filters are connected between the carrier and the detector or detectors, which also allows any stray light from the light used for excitation to be separated from the fluorescent light.
  • an advantageous method for detecting optical properties of molecules bound on a rotatable carrier, in particular of molecules bound to biological material it is provided that electromagnetic waves are radiated onto the carrier, the irradiated molecules are observed with a detector, and selected molecules are automatically detached from the carrier and a second detector for detecting further, not necessarily optical, properties are supplied.
  • This method has the advantage that after a first analysis step (for example a dyeing reaction known per se), in which certain molecules have been bound to molecules already bound to the support and new molecular complexes have been formed, these new molecular complexes are specifically investigated further can be, wherein the second detector can, for example, generate a mass spectrogram of the detached molecular complexes. It can be done in such a way that the selected molecules are detached from the support by irradiation of electromagnetic waves, in particular by irradiation of laser light, which can be implemented relatively simply and inexpensively for a very large number of samples.
  • a mixed array of individually controllable silicon elevations and light-emitting diodes can be used for the detachment of selected molecules.
  • the individually controllable light-emitting diodes serve to excite neighboring fluorescence-labeled molecules and, by identifying binding events, to preselect which molecules should be detached from the carrier and fed to a second detector. If these molecules are located on individually controllable silicon elevations, they can be detached from the carrier very easily, in particular by applying an electrical voltage.
  • the initially unknown binding partner is determined from a second molecule library to a member from the first molecule library that is already known from the position on the support, and also for several members in parallel.
  • the identity of the binding partner from the second molecule library is obtained e.g. by comparing the mass (or tryptic fragments of a bound protein) with the known sequences from an already sequenced genome.
  • Another example is the detachment of a recombinant phage antibody that has bound a known antigen through its surface-expressed Fv antibody. An E. coli bacterium can be infected with this phage antibody and the recombinant antibody can then be produced.
  • Another example is the sequencing of complex DNA by means of solid-phase-coupled oligos, in which a sequencing reaction takes place "in situ", ie in parallel with millions of different oligos.
  • the oligo originally coupled to the carrier is changed, it is extended using a polymerase and a template until a ddNTP incorporated by the polymerase leads to chain termination.
  • a group of somewhat longer oligos is obtained, which are terminated, for example, by a ddC.
  • This group of modified oligos has to be separated from the template (e.g.
  • the mass spectrometer determines the masses of the individual members of this group of ddC-terminated oligos and, by comparison with the expected masses, the sequence of the extension.
  • a carrier which is advantageously to be used according to the invention has integrated position markings which are as close as possible and can be detected by a detector, so that any inaccuracies in the respective travel mechanism no longer have to lead to incorrect test results, since the position markers integrated in the carrier control the actual position of the carrier relative to a detector allow.
  • the CDs and readers that can be used in the method according to the invention are, moreover, significantly cheaper than the known diagnostic chips.
  • a translucent support in the methods described above.
  • a CD with a wavelength filter integrated in the CD can be used, whereby a laser with known technology can be used for the exact, close-meshed position determination, the light of which does not reach the molecules applied or applied on the other side of the CD.
  • Another laser can then be used for the synthesis or for reading out the luminescence reaction, the light of which can penetrate the wavelength filter mentioned.
  • This second laser is fixed to the first laser, so that when the position of the first laser is determined, the positioning of the second laser beam on the CD is also automatically known.
  • the flat screens used in computers also have integrated position markings in such a way that the individual LED / LCD pixels are assigned very precisely to specific positions and can be controlled individually, so that a transparent support for biological materials attached in close proximity above the light-emitting diodes / liquid crystals at precisely defined points can be illuminated. This applies all the more if the liquid crystals used up to now are replaced by an array of miniaturized lasers or light-emitting diodes packed as densely as possible.
  • a particularly advantageous solution is based on the topography of a mixed array of individually controllable silicon elevations with the molecules with light-emitting diodes applied to them.
  • the individually controllable light-emitting diodes are arranged in recesses, so that the light emitted by them only stimulates a luminescence reaction in the case of adjacent silicon elevations.
  • a repeatable, exact assignment of excitation light and applied molecules is also possible with this.
  • an array of microlasers or light-emitting diodes or the use of the said mixed arrays offers the possibility of carrying the biological materials over a whole cycle - starting from the preferably lithographic or voltage-mediated synthesis of the molecular library, via the Color the library with a second one Molecular library up to the reading of the binding events - to keep fixed over the array.
  • This ensures a very simple, very fast and yet repeatedly extremely precise control of the individual pixels, the time-consuming control and focusing of the individual pixels being eliminated.
  • the possibility of imaging the array of light-emitting diodes or microlasers using a simple imaging system on the carrier in a reduced form also allows a very high packing density of the molecular libraries applied by lithographic synthesis.
  • the carrier and array can then be separated, after which the array can be used again.
  • detectors e.g. Arrays of photomultipliers, of PIN diodes, of avalanche diodes or a so-called multi-channel plate can be used.
  • the detectors can also be incorporated directly into the arrays of excitation light sources, resulting in mixed arrays of detectors and excitation light sources.
  • the exact position information results from the relative arrangement of the microlaser to one another, so that precisely defined points on a preferably transparent support of molecular libraries arranged parallel to the flat screen can be illuminated.
  • a preferably complete peptide library in particular a 4-, 5-, 6- or 7-mer peptide library, can be applied to the carrier, the carrier being able to be brought into contact with a blood serum to be examined, for example, after the peptide library has been applied.
  • oligonucleotide library in particular a 15-mer oligonucleotide library
  • the carrier after the application of the oligonucleotide library, for example, to be brought into contact with DNA to be examined, in particular fluorescence-labeled and amplified with the aid of random oligonucleotide primers.
  • the invention thus creates completely new diagnostic possibilities and in particular also increases the chances of finding diagnostic markers and therapeutic agents. If, for example, complete 6-mer peptide libraries are associated with a larger number of patient sera and, for example, a staining reaction is used to examine which peptides have contained constituents of the sera, correlations between the disease and the colored peptides will result. This is due to the fact that every person carries in their blood serum a very complex individual pattern of antibody reactivities, which in particular reflects the confrontation of their immune system with acute, chronic, hidden or already survived diseases.
  • a large part of the antibody reactivities can be defined by the specific binding to penta- or hexapeptides, whereby the above-mentioned individual pattern of antibody reactivities can be determined in an unprecedented complexity when analyzing the binding reactivities to a complete penta- or hexapeptide library.
  • Longer binding motifs in particular those that also occur frequently and have a helical structure, can be determined by libraries in which not every amino acid is random, but only those at certain positions derived from the structure. This enables new diagnostic markers and previously unknown correlations between illness and specific antibody reactivities to be found, including e.g. markers for tumor diseases, for cardiovascular diseases such as heart attacks, for multiple sclerosis and Parkinson's, for all types of autoimmune diseases and allergies and for all types of infectious diseases.
  • the resulting pattern of markers can make it possible to make a diagnostic statement even by correlating them to certain clinical pictures.
  • the newly found markers can also be applied separately to carriers and used in future investigations.
  • attempts can also be made to correlate diseases with binding patterns to other molecular libraries, such as D-peptide libraries or oligosaccharide libraries.
  • This method is not limited to human diseases, but is suitable for the investigation of forensic and veterinary questions as well as for the analysis of other liquids, from plant extracts to extracts from microorganisms.
  • potentially therapeutically interesting molecules such as D-peptides that cannot be broken down by human digestive enzymes are arranged on a support and then brought into contact with medically relevant molecules, in particular with pathogen-specific proteins or with mixtures of pathogen-specific proteins.
  • medically relevant molecules in particular with pathogen-specific proteins or with mixtures of pathogen-specific proteins.
  • This enables the targeted and quick search for binding partners to these medically relevant molecules.
  • the search for enzyme ligands, enzyme substrate analogs or enzyme inhibitors is also possible.
  • the binding to the medically relevant molecules can then be detected, for example by means of biotinylation or fluorescence labeling, so that the D-peptides or aptamers can be identified that bind at least parts of the pathogen.
  • These D-peptides or aptamers can then be tested successively to determine whether they inhibit the pathogen. If, for example, an enzyme of the pathogen (for example protease of HIV, reverse transcriptase etc.) is present in a suitable amount, this enzyme can be fluorescence-labeled (either directly or by the recombinant expression of a small peptide tag, which is carried out using a monoclonal Antibody can be stained). It can be used to determine which D-peptides the enzyme has bound to.
  • an enzyme of the pathogen for example protease of HIV, reverse transcriptase etc.
  • a further staining reaction is then carried out, which is caused by the enzyme activity.
  • the cleavage by the HIV protease precipitates a fluorescent peptide that can be detected. This gives D-peptides that not only bind the enzyme, but also inhibit it at the same time.
  • the blood serum or the DNA can, in particular after or before the carrier has been brought into contact with the blood serum or the DNA with one that reacts with the blood serum or the DNA Bindings incoming material are brought into contact.
  • the substance reacting with the blood serum or the DNA is expediently colored with a substance which can be excited to luminescence, in particular a dye which can be excited to fluorescence by irradiation of laser light, before being brought into contact with the serum or the DNA.
  • a dye which can be excited to fluorescence by irradiation of laser light before being brought into contact with the serum or the DNA.
  • Such dyes are e.g. commercially available under the names "Cy3", “Cy5", "FITC” or “TRITC", whereby a whole range of conjugates of these fluorescent dyes is advantageously already available (e.g. goat-anti-human-antibody-conjugated Cy5).
  • the invention enables the search for specific binding partners for a target molecule from a library of 10 8 to 10 10 different molecules and thus - by the simultaneous identification of many (differently binding) binding partners - according to the structural parameters responsible for the binding of the ligand to the target molecule .
  • a surface of the support can first be coated with a plastic layer that contains free amino groups for the solid phase synthesis of a peptide or oligonucleotide library (eg the derivatized polystyrene " CovaLink “from Nunc), are coated (for the introduction of primary amino groups into polystyrene, see FIG. 15).
  • a suitable spacer After inserting a suitable spacer, the free amino groups are then blocked with a protective group that can be removed by light.
  • a protective group that can be removed by light.
  • An example of many for an activated, i.e. protective group reactive with amino groups which can be removed from light is nitroveratryloxycarbonyl (NVOC).
  • the sophisticated conventional standard syntheses eg use of fMoc protective groups in peptide synthesis
  • the sophisticated conventional standard syntheses can be combined with the inclusion of the activated monomers in larger, photo- or electrolabile particles.
  • the radiated electromagnetic waves or an applied voltage then do not split off the photo- or electrolabile protective group on the growing oligomer, but only release the normal activated monomers as used for the standard syntheses.
  • the activated monomers are preferably dissolved at a higher temperature in a solvent, the melting point or transition of which to a gel-like state is close to 20 ° C., whereupon a laser-absorbing dye is added, the mixture is cooled and ground to small solid particles at low temperature which are atomized over the support for the lithographically synthesized molecular libraries.
  • the activated monomers are only released from these particles locally where a laser heats the particles due to the absorption of the included dye.
  • the particles liquefy or gel and the activated monomers can couple to the free amino groups in solution (or to free hydroxyl groups as in oligonucleotide synthesis).
  • the liquid solidifies right next to the heated place.
  • the heating of the solid particles takes place particularly advantageously with the aid of a repeatedly briefly illuminating light source, in particular a laser or a light-emitting diode, as a result of which particularly sharply delimited transitions between solid particles and substances released locally from the particles occur.
  • a repeatedly briefly illuminating light source in particular a laser or a light-emitting diode
  • a cage inclusion in particular in fullerenes, or another method of release which can be triggered, for example, by electromagnetic waves or an electrical voltage.
  • selected areas can also be heated by the repeated application of a voltage in rapid succession, in particular if a mixed array of individually controllable silicon elevations with light-emitting diodes is used.
  • activated monomers combinations of monomers can also be coupled, for example all 20 ⁇ 20 possible activated dimers of L-amino acids.
  • the uncoupled monomers, the undigested particles and / or the solidified particles are either simply blown away, or dissolved and washed away, again solid particles, which contain activated monomers, are applied to the support in selected areas, and this step is preferably carried out all available different activated monomers are carried out one after the other, then the standard protective groups newly introduced due to the couplings are split off using known techniques and the next cycle begins until, for example a complete peptide library was synthesized. Additional modifications of a different kind by means of other chemical reactions are also possible, in particular biologically relevant modifications such as glycosylations, phosphorylations, or alkylations.
  • Another option when using a mixed array of individually controllable silicon elevations with light-emitting diodes is to control the combinatorial molecular synthesis by applying a voltage in selected areas. Appropriately charged activated monomers for molecular synthesis in selected areas are thereby either repelled or attracted.
  • the procedure for applying an oligonucleotide library to one of the abovementioned supports can be carried out analogously to the synthesis of the peptide library, with the difference that instead of the 20 different activated amino acids, only 4 different activated nucleotides have to be used.
  • Four different 3'-O-phosphoramidite-activated deoxynucleosides are suitably used for this purpose, which carry a photolabile protective group at the 5 'end or at the 3' end or which, as described for the synthesis of a peptide library, are atomized in particles over the carrier and then made mobile by the radiation of electromagnetic waves.
  • the free hydroxyl groups usually used for oligonucleotide synthesis can be introduced simultaneously with the insertion of a suitable spacer.
  • Analogous methods can also be used for the production of aptamer libraries, i.e. for oligomers based on ribonucleotides and their derivatives.
  • reactive molecules of other types such as those e.g. are used in combinatorial chemistry, are included in the activatable particles and are released site-specifically.
  • nucleotides or amino acids a variety of other groups can also be used as monomeric combinable building blocks for oligomer synthesis.
  • a molecular library can also be applied to the support by one of numerous printing or spot methods, such as by means of a nozzle, similar to that used in an inkjet printer. Subsequently, selected areas of the support can be irradiated with laser light or with the aid of light-emitting diodes in such a way that the applied molecules are anchored in these areas on the support. This is particularly advantageous because it later excites and reads out a luminescence signal in exactly the same area in which the applied molecules were previously anchored due to the activity of the excitation laser.
  • a solid substance at the respective ambient temperatures can be placed on the support, which is then melted to anchor the molecules.
  • the procedure can be such that the surface of a support is activated (for example by uniform chemical coupling of streptavidin or of biotin on the entire support) is then at 40 ° C a solid at 10 ° C (possibly - if hydrophilic molecules are to be coupled - containing hydrophobic) dye molecules solvent is applied to the support and allowed to solidify there, whereupon those to be coupled to the support Molecules are applied, selected areas of the carrier are heated by means of lasers, light-emitting diodes or voltage, as a result of which the solvent liquefies or locally volatilizes and the attached molecule to be coupled can bind to the carrier.
  • the binding takes place preferably via biotin streptavidin. Then unbound molecules are washed away and the cycle can begin with a new spot or print process
  • a device suitable for solving the above-mentioned object is given in claim 10.
  • a carrier used to carry out the methods according to the invention is the subject of claims 12 to 15.
  • a particularly advantageous embodiment is based on the topography of a mixed array of individually controllable silicon elevations with the molecules with light-emitting diodes applied to them.
  • the individually controllable light-emitting diodes are arranged in recesses, so that the light emitted by them only stimulates a luminescence reaction in the case of adjacent silicon elevations. An exact, in particular short-term excitation of selected areas is thus repeatedly detectable.
  • This embodiment even offers the possibility of directly assigning a voltage change resulting from the luminescence signal to each individual silicon elevation, so that in this case the carrier of the molecules is identical to the detector.
  • the targeted luminescence excitation of selected areas can also be dispensed with if the different molecules of a molecule library are applied to an array of detectors.
  • the excitation can preferably be carried out by a pulsed laser, the light of which detects a larger number of detectors.
  • the current generated in the dark phases of the excitation due to the luminescence of the molecules can then be read out in parallel in the individual photodetectors and thus assigned to the individual members of the molecule library.
  • the spatial decoupling of excitation and detection can also be carried out very simply by means of an array of microlasers or light-emitting diodes a relatively coarse grid of detectors takes place, which detect the luminescence of the molecules excited by the excitation laser scattered in all spatial directions. To do this, only the one detector, which detects the light radiated by the excitation laser, has to be masked out.
  • the temporal decoupling of excitation and detection can also be combined with the spatial decoupling.
  • a device for detecting optical properties of molecules bound on a carrier in particular biological or biologically relevant molecules, with means for irradiating electromagnetic waves onto the carrier and a detector for observing the irradiated molecules
  • means for detaching selected molecules are provided, which makes it possible, in particular, to detach molecules from the carrier in a targeted manner if they have been noticed in a first analysis step.
  • the detached molecules can then be subjected to a further investigation, in particular a detector of the second type, e.g. a spectrometer, in particular a mass spectrometer, with which certain properties of the detached molecules can be detected.
  • the means for detaching can comprise a laser.
  • the use of an electrically controllable and chargeable carrier is particularly simple and advantageous for this purpose, the molecules bound to the carrier being able to be detached in selected areas very simply by applying a voltage.
  • supports according to the invention can be used which have a close-knit network of integrated position markings, so that it is possible to determine the position of a detector, for example by means of conventional mechanics to inspect the area to be examined that has been approached by the wearer.
  • the position markings are preferably designed such that they can be detected by an optoelectronic scanning system. If an essentially commercially available compact disc is used as the carrier, this has, in addition to cost advantages over the known diagnostic chips, the advantage that for reading the carrier for essentially commercially available devices, in particular the reading and reading devices provided in CD players and CD burners Writing laser can be used.
  • the light from the laser can not only be used for optoelectronic position detection, but also for stimulating luminescence reactions of molecules bound on the CD.
  • CDs or analog media can be used with a wavelength filter integrated in the CD, whereby a laser whose light cannot penetrate the wavelength filter is used for the exact positioning of the CD, while a second laser whose light can penetrate the wavelength filter due to its distance from the first laser can be used for the repeated location-specific synthesis or excitation of a luminescence reaction.
  • the exact position information results from the relative arrangement of the microlaser to one another, so that precisely defined points can be illuminated almost any number of times on a preferably transparent support of molecular libraries arranged in parallel above the array.
  • the carrier can consist of almost any materials, in particular glass derivatized for the synthesis of a molecular library.
  • the carrier of the molecular library can be fixed particularly advantageously above the array when using an array of microlasers or light-emitting diodes.
  • an array of detectors can also be attached to it, which in particular enables the individual signals obtained to be calibrated with a uniformly fluorescence-labeled carrier.
  • Such mixed arrays can also be fixed to a detector or an array of detectors, if not even the voltage change caused by a luminescence signal is directly assigned to each individual silicon elevation, so that in this case the carrier of the molecules is identical to the detector.
  • Highly complex molecular libraries e.g. a peptide library, in particular a preferably complete 4-, 5-, 6- or 7-mer peptide library, or an oligonucleotide library, in particular a preferably complete 12-, 13-, 14- or 15-mer oligonucleotide library or aptamer library, are applied such that the position of the individual Molecules or groups of molecules made up of several molecules of one type of molecule can be repeatedly approached precisely and thus can be specifically examined.
  • a peptide library in particular a preferably complete 4-, 5-, 6- or 7-mer peptide library
  • an oligonucleotide library in particular a preferably complete 12-, 13-, 14- or 15-mer oligonucleotide library or aptamer library
  • the invention proposes, on the one hand, a device which has means for rotatably holding the carrier about an axis of rotation essentially perpendicular to the surface of the carrier, means for applying various liquids to the surface of the carrier in the region of the axis of rotation and at least one laser that can be moved relative to the carrier for irradiating selected regions of the carrier with laser light.
  • a suitable, preferably transparent support is placed in the light beam of the light sources and fixed there.
  • the exact position information results from the relative arrangement of the microlaser or light emitting diodes with respect to one another, so that precisely defined points on the carrier can be illuminated repeatedly. This can be used in particular for the lithographic synthesis and the subsequent reading out of molecular libraries.
  • molecular libraries are applied to the support independently of the activity of the excitation laser (s), then regularly arranged, appropriately detectable "guide dots" in relation to the applied molecular library serve as a reference point for determining the position of the applied different molecules.
  • a device in which nozzle-like means for applying the smallest quantities of molecules to be anchored on the carrier, means for moving the means for applying the molecules and the carrier relative to one another, and at least one laser for irradiating selected regions of the carrier with laser light are.
  • molecules or molecule libraries can also be applied to the support used using various printing processes which are already known, for example using a modified screen printing process.
  • PCR fragments are currently printed on the principle of a fountain pen.
  • the individual spots must be adapted to the readout mechanism in printing processes, which is very time-consuming since each spot has to be approached and generally focused through until the setting that gives the maximum light output is finally selected , which is not necessary when using a CD or an array of microlasers or light-emitting diodes, since the individual pixels are particularly important in the case of an array of microlasers be irradiated with almost parallel light.
  • an array of detectors is used as the carrier of the molecules.
  • printed molecules can also be applied to the carrier due to a voltage applied in selected areas if the molecules to be applied carry a corresponding charge or with With the help of selectively controllable light sources in selected areas.
  • the invention thus advantageously allows the person skilled in the art to choose the device which is optimally suitable for applying the respective molecules to the respective supports, in which case he also combines both devices in individual cases and first a part of the molecules with one and then another part of the molecules with the other device can apply to the carrier.
  • the carrier 12 is an essentially commercially available CD, but is designed to be translucent and which is provided on its side opposite the top 10 with depressions, so-called "pits", which are indicated by the lines 20 and which are located under a transparent protective layer.
  • the pits form internal position markings which can be read by the optoelectronic detection system of a conventional CD player or CD burner, which is only indicated here.
  • the detection system essentially consists of a laser (not shown here) and - as indicated by the movement arrow 22 - an adjustable or movable focusing coil or lens 24, which allows the beams 26 generated by the laser to be advantageously used both for scanning the pits 20 and thus for position determination as well as - as at the point in time shown in the figure - through the CD for irradiation and eventual excitation of the molecules 14.
  • the location of the irradiation is followed by a light-sensitive detector 28 in the direction of movement of the CD, to which a lens 30 is assigned, which bundles light beams 32 emitted by possibly excited molecules and directs them onto the detector 28.
  • This arrangement ensures that the light from the laser does not interfere with the detection process through superimposition.
  • luminescence reactions of excited molecules can be detected while new molecules are already being irradiated, so that the analysis of the molecules arranged on the CD can advantageously be carried out at very high speed.
  • FIG. 2 shows the use of an array 40 of microlasers 42, 44 for the excitation of molecules 50, 52 bound on a flat side 46 of a carrier 48. Since the microlasers can be controlled individually and are arranged in a fixed position relative to one another, precisely defined points can be illuminated on the support 48, which is attached parallel to the array 40 in the example shown, and, if necessary, molecules located there can be excited to luminescence. At the time shown, the microlaser 42 is inactive, while the microlaser 44 is active and the light is on the molecular group 50 irradiates.
  • the carrier 48 is transparent in this exemplary embodiment, but that the carrier does not necessarily have to be transparent, since the exciting light source and detector can also be arranged on one and the same side of the carrier, namely on the side on which the molecules to be examined are located.
  • an array 54 comprising a number of detectors 56, 58 is provided to detect any luminescence reactions.
  • This allows a particularly simple separation of excitation and detection by "switching off” the detector (s) 58 located in the direct radiation range of an active laser 44, ie, an excitation of the molecules, at least during the emitting of the laser, e.g. in such a way that any radiation incident on the detector or detectors is no longer detected or signals from the respective detectors are not passed on or evaluated.
  • the other detectors 56 can also be switched off, preferably with pulsed radiation, for the duration of the excitation phase, but this is not absolutely necessary.
  • a wavelength filter 60 between the array 54 of detectors and the carrier 48, which filters out radiation 62 with the wavelength of the excitation laser or at least weakly attenuates it (as indicated by the rays 62 '), but allows luminescence radiation 64 to pass through , so that it can be detected by the active detectors 56 and converted into corresponding signals, which are then sent to a signal evaluation device known per se and therefore not described here, for example a computer that can be forwarded.
  • a carrier shown in Fig. 2 can, for example, if a very precise resolution of the individual pixels on the carrier is required for the synthesis and reading out of a highly complex molecule library, even before (e.g. ithographically synthesizing) a molecular library with the (but not insoluble) Array of microlasers are connected and this during the synthesis and staining with a second substance (for example the blood serum of patients) until the readout Luminescence response also remain.
  • the carrier can then be disposed of and a new carrier firmly connected to the array of microlasers.
  • an array of detectors can also be permanently connected to the array of microlasers, as shown in FIG. 10.
  • so-called “guide dots” can be inserted on the carrier at regular intervals, each of which gives a defined luminescence signal and thus takes over the function of the pits on the CD, i.e. submit an internal grid that serves for position information.
  • the decoupling of excitation and detection is even easier in these examples than in the example using a CD as a carrier, since one microlaser can be activated after the other.
  • a coarser grid of photodiodes can be built up over the array, the diode being switched off at the maximum intensity of the currently active excitation laser.
  • the laser (s) can also be used to detach selected molecules from the carrier, the detached molecules then being suitably sent to a further examination device, e.g. a mass spectrometer can be supplied.
  • a further examination device e.g. a mass spectrometer
  • FIGS. 9 and 10 schematically show how the physical environment, in particular the matrix layer 3 of substances 5 in locally narrowly limited areas 7 by the radiation of electromagnetic waves 13 (FIG. 9) or by the Applying a voltage 13 '(FIG. 10) can be changed so that the previously immobilized substances 9 are made movable (movable substances are indicated by 11) and can get close to the carrier 12. There they can couple to molecules 2 on the carrier (form bonds), form an aggregate or become part of another chemical reaction. 10 also shows that the carrier 12 can be embedded in a mixing array 17 comprising detectors 56 and sources of electromagnetic radiation, for example light-emitting diodes 19, which can be controlled in a targeted manner. Selected areas 7 of the carrier 12 are expediently separated from one another by a non-conductive insulator 21, which is also impermeable to the incident electromagnetic waves.
  • selected areas of a carrier fixed above the array can be repeatedly irradiated with pinpoint accuracy using an array of individually controllable microlasers.
  • molecules from a molecular library can be applied to selected areas of the support using lithographic methods.
  • the fluorescent molecules are stimulated in successively selected areas with a brief pulse of light.
  • the radiation generated between the excitation pulses by the fluorescence of the molecules is collected by the photodetectors and can be assigned to individual members of the molecule library, so that it can be determined exactly which molecules have caused the fluorescence reaction.
  • mixing array 17 consisting of individually controllable light sources 19 and detectors 56
  • the detectors 56 themselves can - as shown in FIG. 12 - be carriers 12 of different molecules 2, 4 and 8.
  • Such a mixing array 17 can e.g. to be used in selected areas
  • detectors 56 In particular, silicon carriers, light-emitting diodes or an independent array of detectors can be used.
  • a non-conductive insulator 21, which is impermeable to the incident electromagnetic waves, is provided to separate the regions 7 from one another.
  • FIG. 13 and 14 schematically show how an array 23 of individually controllable detectors 27 (FIG. 13), which can be carriers 12 of different molecules 2, 4 and 8, or an array of individually controllable light-emitting diodes 29 (Fig. 14), which can also be used as photodetectors, can be used to trigger combinatorial molecule synthesis in selected areas 7, to briefly excite larger areas 25 or selected areas 7 with electromagnetic waves 6 and those which may arise with such an excitation Measure luminescence reactions directly in the dark phases of the excitation.
  • Silicon carriers in particular can be used as detectors 27 (FIG. 13).
  • a non-conductive insulator 21, which is impermeable to the incident electromagnetic waves, is again provided to separate the regions 7 from one another.
  • the surface of a CD is covered with a plastic layer that contains free amino groups for solid-phase synthesis.
  • a suitable spacer of 2-3 amino acids in length using standard fMoc peptide synthesis free amino acids are then blocked with a protective group that can be removed by light.
  • the protective group to be coupled is fed through a hose to the inside of the rotating CD. It can be a slightly modified Synthesis program of a known peptide synthesizer can be used.
  • a program that controls the activity of a laser burns off the protective groups in the areas where the amino acid alanine is to be coupled in the first step.
  • the protective group is split off by means of two-photon activation with the aid of the combustion laser and a second laser which irradiates from above and is somewhat less focused.
  • the activated amino acid alanine is fed to the CD through the tube mentioned above.
  • the activated amino acid couples to the free amino groups, the amino group's own amino group having previously been blocked by the same protective group as mentioned above. This process is repeated for the other 19 amino acids and that
  • the protective groups are split off from all synthesized peptides.
  • a suitable flat, clear support that contains free amino groups is firmly fixed over the array of microlasers.
  • Particularly suitable are thin glass panes, which with conc. NaOH purified, then washed with water and derivatized for 2 hours at room temperature with 10% (vol / vol) bis (2-hydroxyethyl) aminopropyltriethoxysilane.
  • a suitable flat, transparent support can be coated with a plastic layer which contains free amino groups for the solid phase synthesis.
  • a suitable spacer of 2-3 amino acids in length is first synthesized on the free amino groups using standard fMoc peptide synthesis familiar to the person skilled in the art under anhydrous conditions.
  • the carrier is then divided parallel to the X axis into 20 separate areas, which are wetted by the 20 different activated fMoc derivatives of the amino acids, each of which is dissolved in DMF.
  • the activated amino acids are then coupled at room temperature for 30-60 minutes. After washing three times with dimethylformamide (DMF), the fMoc protective group is cleaved off using 20% piperidine in DMF and washed again with DMF.
  • DMF dimethylformamide
  • the beam is again divided into 20 separate areas, this time parallel to the Y axis. These areas are in turn wetted by the 20 different activated fMoc derivatives of the amino acids, each of which is dissolved in DMF, followed by the standard fMoc peptide synthesis described above and familiar to the person skilled in the art.
  • the carrier described above is divided into 400 regions separated from one another at this stage, each with one of 400 possible C-terminally coupled dipeptides to the carrier by a spacer whose N-terminus is free, i.e. is present without a protective group.
  • the activated amino acids described above are dissolved individually instead of in DMF in a suitable solvent which is liquid at 50 ° C. and solid at 4 ° C., a suitable additive which absorbs the laser light and is inert with respect to the activated amino acids, in particular a dye or Graphite particles, added, the solution frozen and ground into small particles.
  • a suitable solvent which is liquid at 50 ° C. and solid at 4 ° C.
  • a suitable additive which absorbs the laser light and is inert with respect to the activated amino acids, in particular a dye or Graphite particles, added, the solution frozen and ground into small particles.
  • This process is repeated a total of 20 times with all activated amino acids, so that the 400 delimited regions described above are divided into 20 x 400 defined regions, followed by the cleavage of the fMoc protective groups with 20% piperidine in DMF described above.
  • the peptides are then extended by a 4th and 5th amino acid analogously to the synthesis of the 3rd amino acid, with each area being divided into 20 areas in each synthesis step as described above.
  • the CD is stained with a patient's blood serum by first blocking non-specific bindings with a suitable aqueous solution, such as 2% milk powder in PBS, and diluting the blood serum in the same buffer, after which the surface of the CD is shaken gently for 60 Minutes with the serum.
  • a suitable aqueous solution such as 2% milk powder in PBS
  • the CD is washed three times.
  • the goat anti-human antibody coupled to the dye Cy5 is diluted in 2% milk powder in PBS; then the surface of the CD is shaken gently for 60 minutes wetted and then washed three times.
  • the compact disc stained with the second antibody is read out in a modified CD player.
  • a burning laser set to weak wattage scans the CD in the first pass. Any fluorescence signals are detected using the optics additionally built into the CD burner and assigned to the individual CD areas.
  • This additional optic consists of a focusing lens that images one or, if desired, several pits on a photomultiplier or a CCD camera. The lens forms a point in the running direction of the CD outside the maximum of the incident laser.
  • the laser scattered light is separated from the fluorescence signal by a suitable edge filter.
  • the areas of the CD that gave a signal in the first run are targeted in the subsequent runs and scanned several times. The signals read are added up and assigned to the positive pits.
  • the support which in this example is firmly mounted on an array of microlasers, is blocked with a lithographically synthesized complete pentapeptide library described in Example b) with a suitable aqueous solution, preferably 2% milk powder in PBS, with the diluted one Blood serum from patients was incubated and then stained with a goat anti-human antibody coupled with Cy5. Subsequently, one microlaser after the other is switched on sequentially and the light emitted by any bound fluorescence molecules is read out using a coarser grid of photodiodes over the array of microlasers, the diode being switched off at the maximum intensity of the currently active excitation laser (see FIG. 2 ). The scattered light caused by the excitation laser is additionally separated from the fluorescent light by a suitable wavelength filter.
  • the incident microlaser can be pulsed, the fluorescence signal being detected in the dark phases of the incident laser.
  • the fluorescence signals are divided into a total of 10 different brightness levels, which are assigned to the individual microlasers (i.e. in this case the different pentapeptides).
  • microlaser that gave the highest fluorescence signals in a first run can then be used several times in succession for excitation, after which the fluorescence signals obtained are averaged.
  • the free amino groups are added using standard synthesis familiar to the person skilled in the art under anhydrous conditions a suitable linker was synthesized, which in turn anchored free amino groups on the support, but this time around 22 atoms from the surface.
  • the carrier is then divided into 4 separate areas parallel to the X axis, which are wetted by 4 different activated nucleoside anhydrates with protective groups.
  • the nucleosides then couple to the free amino groups (FIG. 3).
  • a linker which is stable under these conditions can also be used.
  • DMTr for the 5 'end of the nucleosides (FIG. 3) benzoyl in the case of the bases adenine and cytosine (FIG. 4) isobutyryl in the case of the base guanine (FIG. 4) - methoxy - or betacyanoethyl - in the case of the phosphate groups (FIG 4)
  • the support is again divided into 4 separate areas, this time running parallel to the Y axis. This time, these areas are wetted by the 4 different phosphoramidite derivatives activated with the help of a weak acid such as tetrazole.
  • a weak acid such as tetrazole.
  • any remaining 5'-OH ends are provided with a "cap” so that they can no longer participate in later reactions (FIG. 6).
  • a final step in which trivalent phosphate groups are oxidized concludes the synthesis cycle (Fig. 7).
  • the synthesis described above corresponds to the standard of oligonucleotide synthesis familiar to the person skilled in the art.
  • the oligonucleotides are anchored on the solid support in such a way that after the protective groups have been completely cleaved off, they are not cleaved from the support but remain coupled to the support.
  • the DMTr protective group is then in turn cleaved from the 5'-OH end using TCA, so that there are 16 subdivided regions on the carrier described above at this stage, each with one of 16 possible regions via the 3 'end through a spacer the carrier-coupled dinucleotides whose 5 'end carries a free OH group.
  • the activated phosphoramidite derivatives described above are dissolved individually instead of in acetonitrile in a suitable solvent which is liquid at 50 ° C. and solid at 4 ° C., a suitable dye which absorbs the laser light and is inert with respect to the activated nucleosides, in particular graphite particles , added, the solution is frozen and ground into small particles.
  • This process is repeated a total of 4x with all activated phosphoramidite derivatives, so that the 16 delimited areas described above are divided into 4 x 16 defined areas, followed by the above-described "capping" of remaining free 5'-OH ends, the oxidation of the trivalent phosphate groups and renewed cleavage of the DMTr protective groups with TCA.
  • oligonucleotides are then extended by a further 9 bases analogously to the synthesis of the 3rd base, with each region being subdivided into 4 defined regions in each synthesis step as described above.
  • Example f The support described in Example f) with a complete oligonucleotide library fixed thereon is stained with patient DNA.
  • Non-specific bindings are e.g. saturated with DNA from herring sperm.
  • a tumor tissue sample and at the same time a sample of healthy tissue are taken from the patient and the genomic DNA contained therein is taken using one or more pairs of tumor gene-specific primers (specific, for example, for the genes of p53, pl6, ras, c-myc, n- myc) reproduced in a polymerase chain reaction.
  • FITC-labeled dNTPs are built into the tumor sample, or the normal sample is labeled with biotinylated dNTPs, the samples are mixed and placed on the Hybridized carrier. The hybridized sample is then re-stained with a chemically coupled protein from streptavidin and phycoerythrin, to which the fluorescent dye Cy5 was additionally coupled. As a result, 2 different fluorescences can be measured with one excitation wavelength.
  • one microlaser after the other is then switched on sequentially and the light emitted by any bound fluorescence molecules is read out using a coarser grid of photodiodes above the array of microlasers, the diode being switched off at the maximum intensity of the currently active excitation laser is.
  • the scattered light caused by the excitation laser is additionally separated from the fluorescent light by a suitable wavelength filter.
  • the wavelength filter is matched to the fluorescent dye FITC and the tandem dye phycorythrin-Cy5 (PE-Cy5).
  • the fluorescence signals are then divided into a total of 10 different brightness levels, which are assigned to the individual microlasers (i.e. in this case the different oligonucleotides).
  • microlasers which in a first run gave a strikingly different ratio of the FITC staining to the PE-Cy5 staining from the other pixels, are then used several times in succession for excitation, after which the fluorescence signals obtained are added up and the ratio of the FITC- Staining for PE-Cy5 staining is determined.
  • the fluorescence signals are then read out as described above. In this way, the entire genome is scanned for differences between normal and tumor tissue, whereby new diagnostic markers can be discovered that provide important information for tumor progression.
  • the fluorescence detector according to example d) or only the CD burner part without additional fluorescence optics is encased in an evacuable vessel.
  • the focal point of the laser In the place of the normal sample holder of a mass spectrometer is the focal point of the laser. The laser can drive to any point on the CD and blow away the molecules on it, which can then be examined using the mass spectrometer.
  • a device combined in this way allows the binding partners that form when two highly complex molecular libraries to be combined to be analyzed, whereas it is only possible with the techniques known to date to combine and analyze two molecular libraries that are several orders of magnitude less complex .
  • a mass spectrometer instead of a mass spectrometer, a movable device can also be attached, with which phages or DNA can be recovered from individual pits on the CD.
  • Example f The complete 12-mer oligonucleotide library described in Example f) is used.
  • the synthesis direction must be "reversed", i.e. the protective group which can be removed analogously to DMTr must be on the 3'-OH end for this, so that at the end there is a solid-phase-coupled oligonucleotide library with free 3'-ends.
  • the hybridization conditions are chosen so that there are very few, if any, mismatches between the oligonucleotides and the templates hybridized to them.
  • the complexity of the solid-phase-coupled oligonucleotides should exceed that of the DNA to be sequenced. Non-hybridized cDNA is washed away.
  • a sequence reaction according to Sanger with a comparatively large number of ddNTPs in the reaction solution is carried out, so that on average the oligoprimer is extended by an average of 20 nucleotides. Then the template is removed by heat. The sequence information is then read out in the combined CD burner mass spectrometer described in Example h), the combustion laser evaporating selected oligonucleotides which have been lengthened by the sequence reaction, so that the sequence information can then be detected by means of the mass spectrometer.
  • Lymphocytes are obtained from a person's blood serum using standard methods and fixed using standard methods (0.37% paraformaldehyde in PBS). Approximately 10 8 lymphocytes fixed in this way are distributed on the surface of a CD or a fluorescence multilayer disc (FMD) and fixed there on the surface. The FMD or CD is then placed in a tightly fitting rubber sleeve and non-specific bindings are blocked with 5% milk powder in PBS.
  • FMD fluorescence multilayer disc
  • monoclonal antibodies are individually conjugated with fluorescent labels, including e.g. B. Phycoerythrin, EGFP, EBFP, EYFP, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7.
  • the corresponding Fab fragments can therefore optionally be prepared beforehand.
  • the hallmark of the conjugated monoclonal antibodies is that they recognize different surface antigens of human lymphocytes, including CD antigens, receptors for growth hormones, apoptosis-associated proteins and homing receptors.
  • the lymphocytes fixed on the FMD or CD are then incubated with the fluorescence-labeled monoclonal antibodies (60 minutes at 37 ° C. in 5% milk powder in PBS and 0.5% Tween 20).
  • the fluorescence-labeled monoclonal antibodies 60 minutes at 37 ° C. in 5% milk powder in PBS and 0.5% Tween 20.
  • 2 to 5 antibodies conjugated with different fluorescences are used in each case.
  • the CD or FMD is inserted into an essentially commercially available CD or FMD drive and played. Due to the integrated position markings (repeatable and controllable), the playback time is divided into> 10 8 different time units.
  • the laser beam used for scanning detects any fluorescent molecules on the surface (ie antibodies that bind the lymphocytes).
  • the fluorescent light is broken down into different color fractions and preferably recorded according to the principle of the confocal laser microscope.
  • a fluorescence intensity is thus assigned (possibly repeatable) to each unit of time and stored, preferably several different fluorescences at the same time.
  • the FMD or CD is then removed, the fluorescence on it is bleached by irradiation with very intense light and, as described above, stained again with further fluorescence-labeled antibodies. How again the fluorescence intensities are assigned to the (unchanged) time units. Repeating this process several times assigns each time unit up to 150 different signal intensities corresponding to the monoclonal antibodies mentioned.
  • the signal intensities assigned to a unit of time are assigned to different cell categories and the number of the respective cell categories is determined (e.g. CD3 is characteristic of a T lymphocyte, CD4 defines T helper cells, CD8 cytotoxic T cells, CD 19 is characteristic of B lymphocytes a defined stage of differentiation, etc.).
  • the staining of lymphocytes described in Example j) is carried out with the blood cells of clinically unremarkable patients.
  • the signal patterns obtained in this way are compared with the signal patterns which are obtained when the blood cells of patients with diagnosed Crohn's disease, heart attack, Parkinson's disease, multiple sclerosis, lymphones, in particular preclinical lymphones or systemic lupus erythematosus, are stained.

Abstract

Bei einem Verfahren zur Erfassung optischer Eigenschaften, insbesondere von Lumineszenzreaktionen und Brechungsverhalten, von auf einem Träger (12) direkt oder indirekt gebundenen Molekülen (14) werden elektromagnetische Wellen, insbesondere Laserlicht (26), auf den Träger eingestrahlt. Von den Molekülen emittiertes oder gebrochenes Licht wird von einem Detektor (28) erfaßt. Während und nach dem Einstrahlen der elektromagnetischen Wellen werden Detektor und Träger relativ zueinander bewegt. Als Träger wird insbesondere ein transparenter Träger mit integrierten und von einem Detektor, insbesondere einem optoeletronischen Abtastsystem erfassbare Positionsmarkierungen (20) verwendet. Hierbei wird wenigstens eine der integrierten Positionsmarkierungen während oder nach der Relativbewegung von Träger und Detektor ausgelesen, so dass eine Zuordnung des von dem Detektor erfassten Lichts zu einem Ort auf dem Träger möglich wird. Bei einer Vorrichtung zur Durchfühnung des Verfahrens ist ein Detektor, insbesondere ein optoelektronisches Abtastsystem zur Erfassung von in dem Träger integrierten Positionsmarkierungen vorgesehen.

Description

Verfahren und Vorrichtungen zur Erfassung optischer Eigenschaften, insbesondere von Lumineszenz-Reaktionen und Brechungsverhalten, von auf einem Träger direkt oder indirekt gebundenen Molekülen
Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Erfassung optischer Eigenschaften, insbesondere von Lumineszenz-Reaktionen und Brechungsverhalten, von auf einem Träger direkt oder indirekt gebundenen Molekülen. Dabei wird hier der Begriff "Eigenschaften" im weitesten Sinne verstanden und soll nicht nur die für bestimmte Moleküle charakteristischen Eigenschaften, wie zum Beispiel deren Massenspektrogramm, umfassen, sondern zum Beispiel auch die Fähigkeit, überhaupt - nämlich durch das bloße Vorhandensein - eine bestimmte Reaktion zu zeigen, so daß die Erfindung also auch solche Verfahren und Vorrichtungen betrifft, bei denen aus einer bestimmten optischen Reaktion zunächst nur auf das bloße Vorhandensein eines Stoffes - nicht aber dessen Art - geschlossen werden soll (wobei dann die Art des Stoffes zum Beispiel aus dessen Position auf dem Träger ermittelt wird).
Die untersuchten Moleküle sind dabei Bestandteil von auf dem Träger gebundenen biologischen Strukturen, wie insbesondere Zellen, Moleküle, Zellteilen, Zellausläufern oder Geweben, oder sie sind an auf dem Träger immobilisierte biologische Strukturen gebunden. Bei den zu untersuchenden Molekülen handelt es sich um alle Arten von in der Biologie, der Pharmazie und der Medizin besonders relevanten Moleküle, also z.B. Peptide, D-Peptide, L-Peptide und Mischungen daraus, natürlich vorkommende Oligonukleotide, ihre Spiegelbilder und Mischungen daraus, künstlich derivatisierte Oligonukleotide, wie sie zum Aufbau von Aptameren eingesetzt werden, Oligosac- charide und Modifikationen der genannten Moleküle. Insbesondere modular aufgebaute Oligomere, die nicht in der Natur vorkommen, können dabei besondere pharmakologi- sche Relevanz besitzen. Besonders seien in diesem Zusammenhang auch mithilfe chemischer Kombinatorik herzustellende nichtnatürliche Substanzen erwähnt, die als Liganden von biologischen Molekülen eingesetzt werden können, insbesondere organische Verbindungen, Steroidderivate usw. Aus einer Vielzahl solcher Moleküle können spezifische Binder für ein natürlich vorkommendes Molekül isoliert werden, die die Aktivität dieses Moleküls modifizieren. Da diese Binder dann jedoch oft von natürlich vorkommenden Verdauungsenzymen nicht gespalten werden können, eignen sie sich in besonderem Maße für den Einsatz als Therapeutikum.
Solche Verfahren und Vorrichtungen sind in unterschiedlichster Form bekannt, weisen jedoch sämtlich bestimmte Nachteile auf. So benötigen die bekannten Verfahren zu ihrer Durchführung aufwendige und teure Spezialgeräte und sind vergleichsweise langsam im Auslesen eines Lumineszenzsignals. Insbesondere wenn - was, wie nachfolgend noch erläutert wird, aus unterschiedlichen Gründen vorteilhaft ist - sehr viele unterschiedliche Molekülgruppen auf einem gemeinsamen Träger angeordnet und einzeln zu untersuchen sind, muß zum Anfahren der einzelnen Molekülgruppen eine sehr aufwendige Mechanik verwendet werden, die nicht nur teuer und störanfällig ist, sondern die auch bei höchster Präzisionsarbeit immer Fertigungstoleranzen aufweist, die um etliche Größenordnungen höher liegen, als die für eine Untersuchung ausreichende minimale Größe der Molekülgruppen. Dadurch ist die Anzahl der auf einem Träger maximal unterzubringenden Moleküle bzw. Molekülgruppen bei den bekannten Verfahren und Vorrichtungen begrenzt und liegt etwa in der Größenordnung einiger 105 Molekülgruppen. Insbesondere für bestimmte Blutserums- oder DNA-Analysen wäre es jedoch wünschenswert, wenn auf einem Träger etwa 108 bis 109 Moleküle aufgebracht und untersucht werden könnten.
Zum Aufbringen der Moleküle auf die jeweiligen Träger, insbesondere auf sogenannte "Diagnostik-Chips", sind lithographische Methoden bekannt, wobei jedoch - ähnlich wie bei der späteren Untersuchung - die schwierige exakte Zuordnung von Molekül und wiederholbar gezielt anfahrbarer Trägerposition die Zahl der maximal aufbringbaren Moleküle begrenzt, denn es genügt nicht, sehr viele unterschiedliche Moleküle dicht gepackt auf einem Träger anzuordnen, ohne jedoch wiederholbar genau zu wissen, welche Moleküle sich an welcher Position auf dem Träger befinden. Insbesondere ist es bei den bekannten Verfahren und Vorrichtungen ein Problem, sehr viele Lumineszenzreaktionen auf einem Träger in angemessener Zeit und gleichzeitig auch sehr genau auszulesen. Bei den mit den hier betroffenen Verfahren und Vorrichtungen vorteilhaft durchführbaren Färbeuntersuchungen, bei denen ein zu untersuchender Stoff auf den Träger, auf dem zuvor bereits unterschiedliche Moleküle verankert worden sind, aufgebracht wird, sollen Rückschlüsse auf die in dem zu untersuchenden Stoff vorhandenen Substanzen, wie z.B. bestimmte Antikörper in einem Blutserum, daraus gezogen werden, mit welchen der auf dem Träger verankerten Moleküle der Stoff bzw. dessen Bestandteile Bindungen eingegangen sind, so daß man sehr genau wissen muß, welches Molekül sich wo auf dem Träger befindet.
Schließlich können bei den bekannten Vorrichtungen und Verfahren die einmal aufgebrachten Moleküle in der Regel gar nicht oder nur mit sehr großem Aufwand wieder abgelöst werden. Insbesondere wenn sich auf dem Träger eine sehr große Zahl von Molekülen (eine "Molekülbibliothek") befindet, die mit einem zu untersuchenden Stoff oder einem Gemisch von Stoffen (einer zweiten "Molekülbibliothek", zum Beispiel einem Proteingemisch) in Verbindung gebracht worden ist, wäre es oftmals wünschenswert, die Bindungspartner aus der zweiten Molekülbibliothek, also die Moleküle, die Bindungen mit Molekülen der ersten Molekülbibliothek eingegangen sind, gezielt von dem Träger ablösen und einer weiteren Untersuchung unterziehen zu können. Dies ermöglichte dann die parallele Identifizierung von Bindungspaaren aus den beiden Molekülbibliotheken, wobei der Bindungspartner aus der ersten Molekülbibliothek jeweils durch seine Position auf dem Träger bekannt ist, während der Bindungspartner aus der zweiten Molekülbibliothek nach der gezielten Ablösung von dem Träger identifiziert werden kann. Besonders vorteilhaft wäre es dabei, wenn zunächst diejenigen trägergebundenen Moleküle identifiziert werden könnten, die überhaupt Moleküle aus der zweiten Molekülbibliothek gebunden haben. Aus der deutschen Offenlegungsschrift 197 52 085 AI ist ein Probenträger für die mikroskopische Untersuchung einer Vielzahl von Proben mittels Fluoreszenz- Spektroskopie bekannt, bei welchem in einer der Seitenflächen eines scheibenförmigen Substrats eine Vielzahl von separaten Probeaufnahmeräume bildenden Vertiefungen eingebracht ist. Die Verwendung eines solchen Probenträgers erfordert jedoch die geordnete Anordnung der Proben, da die Positionsinformationen nicht simultan zum Fluoreszenz-Signal in gleich hoher Auflösung ausgelesen werden können. Insbesondere erlaubt es der bekannte Probenträger nicht, einen Zellrasen oder irreguläre Strukturen in einem auf dem Proben träger lebenden Gewebeschnitt zu erfassen.
Aus der EP 0 198 513 A2 ist eine Vorrichtung zur Erfassung von Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzreaktionen bekannt, bei welchem ein Probenträger nach der Anregung der auf ihm befindlichen Proben zur Vermeidung von Fehlmessungen durch Erfassen unerwünschter Hintergrund-Fluoreszenz derart gedreht werden muß, daß sich die zu untersuchenden Proben bei der Erfassung der Lumineszenz-Reaktionen an einem anderen Ort befinden, als bei der Anregung. Das gleichzeitige Anregen und Erfassen von Lumineszenz-Reaktionen ist gemäß der Lehre der genannten europäischen Patentanmeldung nicht möglich.
Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, verbesserte Verfahren und Vorrichtungen zur Erfassung optischer Eigenschaften, insbesondere von Lumineszenz- Reaktionen und Brechungsverhalten von auf einem Träger gebundenen Molekülen, insbesondere biologischen Molekülen anzugeben, die zudem preisgünstig herstell- bzw. durchführbar sind. Nach Möglichkeit sollen die Verfahren und Vorrichtungen auch noch besonders schnell durchführbar sein bzw. besonders schnell arbeiten.
Die Aufgabe wird gelöst von einem Verfahren gemäß Anspruch 1. Vorteilhafte Durchführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche. Bevorzugt wird die Relativbewegung von Träger und Detektor durch Drehen des Trägers erzeugt. Die Drehung des Trägers kann in vorteilhafter Weiterbildung sogar dazu verwendet werden, nach Art einer Zentrifuge bestimmte gewünschte physikalische Veränderungen auf dem Träger vorzunehmen. So ist es zum Beispiel möglich, die auf dem Träger vorgesehenen biologischen Strukturen oder Fluoreszenzfarb Stoffe entlang einer zur Drehachse im wesentlichen radialen Richtung wandern zu lassen und erst dann die optischen Eigenschaften auszulesen. Eine solche Bewegung kann anstelle von einer schnellen Rotation des Trägers nach Art der auf dem Träger befindlichen Substanzen auch durch Anlegen eines elektromagnetischen Feldes oder eines hydrodynamischen oder osmotischen Druckes bewirkt werden.
Die Erfindung erlaubt es vorteilhaft, als Träger eine vorzugsweise transparente, hinsichtlich der Positionsmarkierungen im wesentlichen handelsübliche CD, DVD, MOD oder FMD zu verwenden. Dies hat den Vorteil, daß zum Erfassen der Position des Trägers Positionserfassungssysteme verwendet werden können, die sich in der Praxis bereits als sehr zuverlässig bewährt haben und die zudem kostengünstig hergestellt werden können. Dabei sei an dieser Stelle betont, daß unter dem Begriff "integrierte Positionsmarkierungen" alle Arten von fest mit dem Träger verbundenen, eine eindeutige Bestimmung der Position des Trägers relativ zu einem Detektor erlaubenden Markierungen verstanden werden. Bei den beispielhaft genannten, als Träger in Frage kommenden CDs, MODs, DVDs und FMDs sind diese Markierungen in den jeweiligen Träger integriert, wobei sie teilweise nicht auf der Oberfläche sitzen, auf der sich die zu untersuchenden Moleküle befinden, sondern in einer darunterliegenden Schicht.
Die Verwendung von Trägern, deren Positionsmarkierungen optoelektronisch erfaßt werden können, hat den weiteren Vorteil, daß das in der Regel zum Auslesen der Markierungen verwendete Laserlicht gleichzeitig zur Untersuchung der Moleküle, insbesondere zu deren Lumineszenz- Anregung verwendet werden kann. Das Verfahren kann vorteilhaft so durchgeführt werden, daß die optischen Eigenschaften an einem bestimmten Ort auf dem rotierenden Träger mehrfach hintereinander gemessen werden, um so zum Beispiel bei niedriger Signalstärke eine statistische Auswertung zu ermöglichen, oder um eine zeitliche Veränderung der optischen Eigenschaften an einem bestimmten Ort auf dem Träger zu erfassen. Alternativ oder zusätzlich ist es auch möglich, zwischen zwei Messungen der optischen Eigenschaften ein und demselben Ort auf dem Träger die zur Einfärbung der auf dem Träger befindlichen Moleküle verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe auszubleichen oder auf andere Weise zu deaktivieren und die Moleküle danach erneut einzufärben, jedoch mit einem anderen Fluoreszenzfarb stof f.
Vorteilhaft ist es, wenn ein Austausch oder eine Modifikation der Moleküle, deren optischen Eigenschaften erfaßt werden sollen, an jedem Ort auf dem Träger erfolgen kann und insbesondere nach dem Austausch der Moleküle oder der Modifikation der Moleküle erneut gemessen werden kann.
Dabei kann der Vorgang des Austausches oder der Modifikation von Molekülen, deren optische Eigenschaften erfaßt werden sollen, beliebig oft wiederholt werden.
Somit kann ein charakteristisches Profil für einen bestimmten Ort des auf dem Träger aufgebrachten Materials, insbesondere Zellen oder histologische Schnitte, erstellt werden.
Hierbei werden vorzugsweise die optischen Eigenschaften von mehreren verschiedenen Molekülen an einem betimmten Ort gleichzeitig gemessen.
Werden die untersuchten Moleküle gemäß Anspruch 10 oder Anspruch 11 nach der
Erfassung optischer Eigenschaften von dem Träger gelöst, so kann vorteilhaft zur
Ablösung der Moleküle Laserlicht auf derselben Quelle verwendet werden, die auch das für die Untersuchung der optischen Eigenschaften verwendete Laserlicht liefert. Bei Verwendung entsprechender Träger kann also eine einzige Lichtquelle drei unterschiedliche Aufgaben übernehmen: Abtasten der Positionsmarkierungen, Anregen von Lumineszenz-Reaktionen und Ablösen von Molekülen. Je nach Art der auf dem Träger aufgebrachten Substanzen kann die Lichtquelle auch dazu eingesetzt werden, lichtabhängige Reaktionen in den auf dem Träger befindlichen Chemikalien, biologischen Strukturen oder den an sie gebundenen Substanzen auszulösen.
Da erfindungsgemäß das wiederholte Erfassen optischer Eigenschaften an exakt definierten Orten auf dem Träger möglich ist, können verschiedene Untersuchungen nacheinander durchgeführt werden, zwischen denen jeweils Oberflächenmodifϊkationen stattgefunden haben, beispielsweise durch Aufbringen von bioaktiven Substanzen, Mineralien, Bindemolekülen, Antikörpern, Liganden, Rezeptoren, Molekülen einer extrazellulären Matrix, Zeiladhäsionsmolekülen oder anderen biologischen Strukturen wie Membranen, Zellen, Zellteilen, Viren oder Geweben.
Bei der Erfassung der optischen Eigenschaften kann das Prinzip des konvokalen Laser- Scanning-Mikroskops angewandt werden. Vorteilhaft werden dabei die Fluoreszenzsignale einzelner Bildpunkte eines Arrays von Molekülen in unterschiedlichen Fokusie- rungsebenen gemessen.
Zur Erhöhung der Präzision und Erleichterung der Auswertung kann ein optisches Abbildungssystem sowohl zwischen das Anregungssystem und den Träger als auch zwischen den Träger und das Detektionssystem eingebracht werden. Ein solches Abbildungssystem sollte wenigstens ein Linsensystem oder ein Array von Linsensystemen, ein optisches Gitter, einen optischen Spiegel oder ein Array aus optischen Spiegeln, optische Fasern oder ein Array aus optischen Fasern und/oder ein Gradienten- Index-Linsensystem oder ein Array aus Gradienten-Index-Linsensystemen umfassen.
Werden ausgewählte Moleküle von dem Träger automatisch abgelöst, so kann vorteilhaft vorgesehen sein, daß die Moleküle vor der Erfassung weiterer, nicht notwendigerweise optischer Eigenschaften vervielfältigt werden, beispielsweise durch Polymerase-Kettenreaktion oder biologische Replikation.
Die Ablösung der Moleküle von dem Träger kann in verschiedener Weise erfolgen, beispielsweise über einen photolabilen Linker, über eine Ionisierung, durch elek- tromagnetische Strahlung, durch Anlegen einer elektrischen Spannung, über eine enzymatische Reaktion, durch Veränderung der Ionenkonzentration, über Veränderung des pH- Wertes oder mit Hilfe eines Katalysators.
Die abgelösten Moleküle können Bestandteil von Liposomen, Viruspartikeln, Retroviren, Bakteriophagen, Litroiden oder Zellen, insbesondere D-Lymphozyten, T- Lymphozyten, Leukozyten oder Bakterien, von Komplexen aus Nukleinsäure und Protein, insbesondere von Ribosomal-Display-Komplexen, von mit DNS-bindenden Fusionsproteinen beladener DNS, von Komplexen aus Nukleinsäure und anderen Molekülen, insbesondere künstlich hergestellten Komplexen aus DNS und einem Liganden sein.
Bei der weiteren Untersuchung kann insbesondere ein Massenspektrogramm der abgelösten Moleküle erzeugt werden. Vorteilhaft kann ein Träger verwendet werden, auf den eine vorzugsweise vollständige Peptidbibliothek, die L-Aminisäuren enthält, insbesondere eine 4mer, 5mer, 6mer, 7mer oder 8mer Peptidbibliothek aufgebracht sein. Alternativ kann auf dem Träger auch eine Peptidbibliothek aufgebracht sein, die D-Aminosäuren enthält. Es ist auch möglich, Träger zu verwenden, aus denen eine Peptidbibliothek aus L- und D- Aminosäuren, eine Aptamerbibliothek, eine Oligosac- charidbibliothek oder Oligonukleotidbibliothek aufgebracht ist. Solche Bibliotheken können vorzugsweise mittels chemischer Kombinatorik aufgebracht sein. Dabei können die einzelnen Monomere der Oligonukleotidbibliothek Spiegelbilder der natürlich vorkommenden Monomere sein. Das Verfahren erlaubt vorteilhaft eine besonders schnelle Analyse des Lumineszenz- Verhaltens der untersuchten Moleküle. Zudem kann ein Träger verwendet werden, bei dem die Proben beliebig angeordnet sind, da die Positionsinformation simultan zum Lumineszenz-Signal in gleich hoher Auflösung ausgelesen werden kann. Damit wird es z.B. möglich, auf dem untersuchten Träger befindliche Zellrasen oder irreguläre Strukturen, wie z.B. in einem Gewebeschnitt vorhanden, zu erfassen.
Das Verfahren kann besonders vorteilhaft als Alternative für fluoreszenz-aktivierte Zeil- Sorter oder Zeil-Scanner (FACS) bei fluoreszenz-aktivierten Zell-Sortern oder Zeil- Scannern (FACS) verwendet werden, wobei dies das Arbeiten mit adhärenten Zellen erlaubt und z.B. beim Screening von Molekülbibliotheken bioaktiver Substanzen verwendet werden kann. Auch ist es möglich, Epithelien und andere, ausschließlich adhärent wachsende, auf dem verwendeten Träger angeordnete Zellen schnell und einfach zu untersuchen, so daß nach Apoptoseauslösern und neuen Malaria-Mitteln gesucht werden kann. Dabei sind gerade adhärente Zellen wichtig bei der Suche neuer Arzneimittel. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich auch neuronale
Differenzierungsprozesse (das Axonwachstum), die nur auf festen Matritzen stattfinden und oft eine besondere Beschichtung des Trägers erfordern, problemlos quantifizieren.
Wird ein Impulsprozessor verwendet, so können auch Unterschiede in der Zellgeometrie gemessen werden. Das Verfahren erlaubt damit auch die wiederholte Erfassung jeder einzelnen Zelle, während bei bekannten FACS die untersuchte Zelle nach der Messung verloren geht. Dank der in einer anderen Schicht des Trägers enthaltenen Positionsinformationen, ist es erstmals auch möglich, verschiedene Eigenschaften ein und derselben Zelle nacheinander zu messen. Auch können einzelne Zellen in auf dem verwendeten Träger befestigten Gewebeschnitten nach spezifischer Färbung (z.B. von eingewanderten T-Lymthozyten in Biopsien von Entzündungsherden bei Autoimmun- Patienten) ausgezählt werden. Auch die Analyse von Tumorbiopsien, gegebenenfalls nach wiederholter Anfärbung, ist möglich. Bei entsprechend schneller Drehung des Trägers kann direkt eine Zentrifugation bishin zur analytischen Ultrazentrifugation vorgenommen werden, insbesondere wenn sich der Träger beim Drehen in einem abgedichteten Kompartiment befindet.
Bei einem Verfahren zur Erfassung einer Lumineszenz-Reaktion von auf einem Träger gebundenen Molekülen, wobei elektromagnetische Wellen, insbesondere Laserlicht, auf den Träger eingestrahlt werden, ist vorgesehen, daß im wesentlichen nur das von den Molekülen eventuell emittierte Licht von dem Detektor erfaßt wird. Dies hat gegenüber den bekannten Verfahren, die in der Regel nach dem Prinzip des konfokalen Laser- Scanning-Mikroskops arbeiten, bei welchen ein Teil des gestreuten Anregungslichts auch auf den Detektor gelangt, den Vorteil, daß tatsächlich nur das emittierte Licht erfaßt und damit ein wesentlich verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis erzielt wird.
Es sei an dieser Stelle betont, daß unter dem Begriff "Licht" hier alle Arten von elektromagnetischen Wellen verstanden werden, insbesondere also auch Wellen mit außerhalb des im Empfindlichkeitsbereich des menschlichen Auges liegenden Wellenlängen.
Um nun ohne aufwendige Blenden o. dgl. sicherzustellen, daß tatsächlich möglichst nur das emittierte Licht zum Detektor gelangt bzw. von diesem erfaßt wird, kann zum einen so vorgegangen werden, daß die elektromagnetischen Wellen nur kurzzeitig, insbesondere gepulst, auf den Träger eingestrahlt werden und daß der Detektor während des Einstrahlens eventuell von den bestrahlten Molekülen emittiertes Licht nicht erfaßt, wobei hier unter dem Begriff "Erfassen" das Feststellen einer meßbaren Größe einschließlich des Erzeugens entsprechender, für die jeweilige Untersuchung verwertbarer Signale verstanden wird, so daß also auf den eigentlichen Sensor des jeweiligen Detektors sehr wohl Licht gelangen kann, das nicht von einer Lumineszenz- Reaktion herrührt, solange nur - z.B. durch Abschalten der dem Sensor nachgeschalteten Detektion seinrichtungen, insbesondere also der Signalerzeugung und - auswertung während des Einstrahlens der zur Lumineszenz anregenden elektromagne- tischen Wellen - sichergestellt ist, daß dieses Licht nicht in störende Signale umgewandelt wird.
Es sei an dieser Stelle betont, daß durch das kurzzeitige Anregen und das zeitlich verzögerte Auslesen der Lumineszenzreaktion in den Dunkelphasen der Anregung, das Signal- Rauschen- Verhältnis für alle Arten von Fluoreszenzmessungen verbessert werden kann, insbesondere bei Fluoreszenzmessungen nach dem Prinzip des konfokalen Laser-Scanning Mikroskops, bei der Detektion von chromatographisch aufgetrennten fluoreszenzmarkierten Molekülen, insbesondere beim Sequenzieren von DNA, und beim Fluoreszenz-aktivierten Zeil-Sorter oder Zeil-Scanner (FACS). Dies kann alternativ oder zusätzlich zum gepulsten Einstrahlen der Wellen dadurch erzielt werden, daß der Detektor und der Träger nach dem Einstrahlen oder während des Einstrahlens der elektromagnetischen Wellen relativ zueinander bewegt werden, insbesondere relativ zueinander gedreht werden, so daß sich die mit den elektromagnetischen Wellen bestrahlten Moleküle in einem von dem Detektor erfaßbaren Bereich bewegen.
Schließlich können auch mehrere Lichtquellen und mehrere Detektoren verwendet werden, die wechselweise an- und abgeschaltet werden, so daß es vorteilhaft möglich wird, Moleküle in bestimmten Bereichen auf dem Träger durch Einstrahlen von elektromagnetischen Wellen zur Lumineszenz anzuregen und gleichzeitig oder zeitversetzt eventuelle Lumineszenzreaktion aus anderen, zuvor angeregten Bereichen des Trägers zu erfassen.
Ein weiterer Ansatz das Signal-Rausch-Verhältnis von Lumineszenzsignalen zu verbessern gründet auf die Topographie eines Mischarrays von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen mit Leuchtdioden. Die einzeln ansteuerbaren Leuchtdioden werden dabei in Vertiefungen angeordnet, so daß das von Ihnen abgestrahlte Licht nur bei benachbarten Siliziumerhebungen eine Lumineszenzreaktion anregt. Natürlich kann auch die Topographie des beschriebenen Mischarrays mit kurzzeitiger Anregung der Lumineszenzreaktion und einem Auslesen der Signale in der Dunkelphase verbunden werden. Die kurzzeitige Anregung von Fluoreszenzmolekülen ermöglicht darüber hinaus auch eine besonders einfache Zuordnung von Fluoreszenzsignalen an einzelne Moleküle einer Molekülbibliothek, wenn diese auf ein Array von Detektoren aufgebracht werden. Der in den Dunkelphasen der Anregung aufgrund der Lumineszenz der Moleküle ent- stehende Strom kann parallel in den einzelnen Photodetektoren ausgelesen werden und damit den einzelnen Mitgliedern der Molekülbibliothek zugeordnet werden.
Sowohl durch das beschriebene gepulste Einstrahlen/gepulste Detektieren als auch durch das Bewegen von Träger und Detektor relativ zueinander und durch das wechselweise Betreiben mehrerer Lichtquellen und Detektoren wird vorteilhaft eine Entkopplung von Anregung und Detektion erreicht, was gegenüber den bekannten Verfahren zu einem erheblich klareren Lumineszenzsignal und damit zu einem verbesserten Signal-Rausch- Verhältnis führt. Letzteres kann noch weiter verbessert werden, wenn zwischen den Träger und den Detektor bzw. die Detektoren ein oder mehrere Wellenlängenfilter geschaltet werden, was es erlaubt, auch eventuelles Streulicht des zur Anregung benutzten Lichts vom Fluoreszenzlicht zu trennen.
Bei einem vorteilhaften Verfahren zur Erfassung optischer Eigenschaften von auf einem drehbaren Träger gebundenen Molekülen, insbesondere von an biologisches Material gebundenen Molekülen, ist vorgesehen, daß elektromagnetische Wellen auf den Träger eingestrahlt, die bestrahlten Moleküle mit einem Detektor beobachtet, ausgewählte Moleküle von dem Träger automatisch abgelöst und einem zweiten Detektor zur Erfassung weiterer, nicht notwendigerweise optischer, Eigenschaften zugeführt werden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß nach einem ersten Analyseschritt (z.B. einer an sich bekannten Färbereaktion), bei dem bestimmte Moleküle mit auf dem Träger bereits zuvor gebundenen Molekülen Bindungen eingegangen sind und so neue Molekülkom- plexe gebildet wurden, diese neuen Molekülkomplexe gezielt weiter untersucht werden können, wobei vom zweiten Detektor z.B. ein Massenspektogramm der abgelösten Molekülkomplexe erzeugt werden kann. Dabei kann so vorgegangen werden, daß die ausgewählten Moleküle durch Einstrahlung elektromagnetischer Wellen, insbesondere durch Einstrahlung von Laserlicht, von dem Träger abgelöst werden, was für eine sehr große Zahl von Proben verhältnismäßig einfach und kostengünstig umgesetzt werden kann.
In besonders vorteilhafter Weise kann für die Ablösung von ausgewählten Molekülen ein Mischarray von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen und Leuchtdioden verwendet werden. Die einzeln ansteuerbaren Leuchtdioden dienen dabei zum anregen benachbarter fluoreszenzmarkierter Moleküle und mit der Identifizierung von Bindungsereignissen zur Vorauswahl, welche Moleküle von dem Träger abgelöst und einem zweiten Detektor zugeführt werden sollen. Befinden sich diese Moleküle auf einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen, so können diese sehr einfach, insbesondere durch das Anlegen einer elektrischen Spannung von dem Träger abgelöst werden.
So kann z.B. im Massenspektrometer der zunächst nicht bekannte Bindungspartner aus einer zweiten Molekülbibliothek an ein durch die Position auf dem Träger bereits bekanntes Mitglied aus der ersten Molekülbibliothek bestimmt werden, und zwar auch für mehrere Mitglieder parallel. Die Identität des Bindungspartners aus der zweiten Molekülbibliothek erhält man z.B. durch den Vergleich der Masse (oder tryptischer Spaltstücke eines gebundenen Proteins) mit den bekannten Sequenzen aus einem bereits sequenzierten Genom. Ein weiteres Beispiel ist die Ablösung eines rekombinanten Phagenantikörpers, der durch sein oberflächen-exprimierten Fv-Antikörper ein bekanntes Antigen gebunden hat. Mit diesem Phagenantikörper kann ein E.coli Bakterium infiziert und der rekombinante Antikörper anschließend produziert werden.
Ein weiteres Beispiel ist die Sequenzierung komplexer DNA mittels Fest-phasengekoppelter Oligos, bei der "in situ", d.h. parallel bei Millionen verschiedener Oligos eine Sequenzierungsreaktion stattfindet. Verändert wird dabei das ursprünglich auf den Träger gekoppelte Oligo, es wird mit Hilfe einer Polymerase und eines Templates verlängert, bis ein von der Polymerase eingebautes ddNTP zum Kettenabbruch führt. Anstelle des ursprünglich gekoppelten Oligos erhält man eine Schar von etwas längeren Oligos, die beispielsweise durch ein ddC terminiert sind. Diese Schar von veränderten Oligos muß man vom Template (z.B. durch Erhitzen) und dann noch vom Träger (beispielsweise durch den Einbau einer S =S-Brücke in das Verbindungsstück zum Träger, die mit Hilfe von reduzierenden Agenden wie Mercaptoethanol spaltbar ist) abtrennen. Das Massenspektrometer ermittelt dann die Massen der einzelnen Mitglieder dieser Schar von ddC terminierten Oligos und durch den Vergleich mit den erwarteten Massen die Sequenz der Verlängerung.
Ein erfindungsgemäß vorteilhaft zu verwendender Träger besitzt integrierte und von einem Detektor erfaßbare möglichst engmaschige Positionsmarkierungen, so daß eventuelle Ungenauigkeiten des jeweiligen Verfahrmechanismus nicht mehr zu falschen Untersuchungsergebnissen führen müssen, da die in den Träger integrierten Positionsmarkierungen eine Kontrolle der tatsächlichen Position des Trägers relativ zu einem Detektor erlauben. Besonders vorteilhaft kann dabei als Träger eine im wesentlichen handelsübliche Compact Disc (CD), eine Digital Versatile Disc (DVD), Magneto Optical Disc (MOD) oder insbesondere eine Fluorescence Multilayer Disc (FMD) verwendet werden, die bereits über engmaschige interne Positionsmarkierungen verfügen, was eine Positionsbestimmung auf Mikrometer genau erlaubt, wobei sich die Verfahren zum Lesen und Prüfen der Markierungen auf diesen bekannten Trägern bereits bestens bewährt haben. Aufgrund der Ähnlichkeit von CD, DVD, MOD und FMD in Bezug auf die hier benötigten Eigenschaften wird im folgenden der Einfachheit halber nur noch die CD genannt, womit immer auch DVD, MOD und FMD eingeschlossen sein sollen.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren CDs und Auslesegeräte sind im übrigen deutlich preisgünstiger als die bekannten Diagnostik-Chips.
Besonders vorteilhaft ist es, bei den oben beschriebenen Verfahren einen lichtdurchlässigen Träger zu verwenden. Dies erlaubt es nämlich, ein in an sich bekannter Weise zum Abtasten der Positionsmarkierungen verwendetes Laserlicht gleichzeitig zur Anregung von Lumineszenz-Reaktionen zu benutzen. Alternativ kann eine CD mit einem in die CD integrierten Wellenlängenfilter verwendet werden, wodurch ein Laser mit an sich bekannter Technik für die exakte engmaschige Positionsbestimmung eingesetzt werden kann, dessen Licht nicht auf die auf der anderen Seite der CD aufgebrachten oder aufzubringenden Moleküle gelangt. Für die Synthese bzw. für das Auslesen der Lumineszenzreaktion kann dann ein anderer Laser verwendet werden, dessen Licht den genannten Wellenlängenfilter durchdringen kann. Dieser zweite Laser ist am ersten Laser fixiert, so daß mit der Positionsbestimmung des ersten Lasers automatisch auch die Positionierung des zweiten Laserstrahls auf der CD bekannt ist.
Auch die bei Computern eingesetzten Flachbildschirme besitzen integrierte Positionsmarkierungen derart, daß die einzelnen LED/LCD Bildpunkte ganz genau bestimmten Positionen zugeordnet sind und einzeln ansteuerbar sind, so daß ein in nächster Nähe über den Leuchtdioden/Flüssigkristallen angebrachter durchsichtiger Träger für biologische Materialien an genau definierten Punkten beleuchtet werden kann. Dies gilt umso mehr, wenn die bisher eingesetzten Flüssigkristalle durch einen Array von möglichst dicht gepackten miniaturisierten Lasern oder Leuchtdioden ersetzt werden.
Eine besonders vorteilhafte Lösung gründet dabei auf die Topographie eines Mischarrays von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen mit den darauf aufgebrachten Molekülen mit Leuchtdioden. Die einzeln ansteuerbaren Leuchtdioden werden dabei in Vertiefungen angeordnet, so daß das von Ihnen abgestrahlte Licht nur bei benachbarten Siliziumerhebungen eine Lumineszenzreaktion anregt. Auch damit ist eine wiederholbare exakte Zuordnung von Anregungslicht und aufgebrachten Molekülen möglich.
Die Verwendung eines Arrays von Mikrolasern oder Leuchtdioden bzw. die Verwendung der genannten Mischarrays bietet die Möglichkeit, den Träger der biologi- sehen Materialien während eines ganzen Zyklus - von der vorzugsweise lithographischen oder durch das Anlegen von einer Spannung vermittelten Synthese der Molekülbibliothek angefangen, über das Färben der Bibliothek mit einer zweiten Molekülbibliothek bis hin zum Auslesen der Bindungsereignisse - über dem Array fixiert zu halten. Dies gewährleistet eine sehr einfache, sehr schnelle und dennoch wiederholt extrem genaue Ansteuerung der einzelnen Bildpunkte, wobei das zeitaufwendige Ansteuern und Fokussieren der einzelnen Bildpunkte entfällt. Die Möglichkeit, das Array von Leuchtdioden oder Mikrolasern mit Hilfe eines einfachen Abbildungssystems auf dem Träger in verkleinerter Form abzubilden, erlaubt darüber hinaus eine sehr hohe Packungsdichte der durch lithographische Synthesen aufgebrachten Molekülbibliotheken. Zudem können Träger und Array anschließend getrennt werden, worauf das Array erneut eingesetzt werden kann.
Als Detektoren können z.B. Array s von Photomultiplieren, von PIN-Dioden, von Avalanche-Dioden oder eine sog. Multi Channel Plate verwendet werden. Die Detektoren können auch direkt in die Arrays aus Anregungslichtquellen eingelagert werden, dabei entstehen Mischarrays von Detektoren und Anregungslichtquellen.
Werden die zu untersuchenden Moleküle auf der einen Seite und die Positions- markierungen auf der anderen Seite der Compact Disc aufgebracht, so erlaubt es dies, die Anzahl der pro Flächeneinheit auf einem Träger in genau definierter und vor allem wieder auffindbarer Position anordbarer Moleküle gegenüber den bekannten Verfahren enorm zu steigern - konnten bislang etwa 105 Moleküle so auf einem Träger einer der Größe einer CD vergleichbaren Größe so angeordnet werden, daß ihre Position exakt bestimmbar war, so können jetzt 108 bis 1010 auf einer CD angeordnet, exakt aufgefunden und gezielt untersucht werden. Ähnliches gilt beim Einsatz einer Art Flachbildschirm, insbesondere wenn die bisher gebräuchlichen Flüssigkristalle durch einen Array von Mikrolasern oder von Leuchtdioden ersetzt werden. Die genaue Positionsinformation ergibt sich in diesem Fall durch die relative Anordnung der Mikrolaser zueinander, so daß genau definierte Punkte auf einem parallel über dem Flachbildschirm angeordneten vorzugsweise durchsichtigen Träger von Molekülbibliotheken beleuchtet werden können. Damit wird es erstmals möglich, sehr große Molekülbibliotheken auf einem einzigen, sehr handlichen Träger anzuordnen. Z.B. kann auf dem Träger eine vorzugsweise vollständige Peptidbibliothek, insbesondere eine 4-, 5-, 6- oder 7mer Peptidbibliothek aufgebracht sein, wobei der Träger nach dem Aufbringen der Peptidbibliothek z.B. mit einem zu untersuchenden Blutserum in Kontakt gebracht werden kann. Ebenso ist es möglich, auf dem Träger eine vorzugs- weise vollständige Oligonukleotidbibliothek, insbesondere eine 15mer Oligonukleotidbibliothek aufzubringen, wobei der Träger nach dem Aufbringen der Oligonukleotidbibliothek z.B. mit zu untersuchender, insbesondere fluoreszenzmarkierter und mit Hilfe von Zufallsoligonukleotidprimern vervielfältigter DNA in Kontakt gebracht werden kann. Damit ist es erstmals möglich, in einer einzigen Färbereaktion eine Blutserums- oder DNA-Probe auf sehr viele Infektions-, Autoimmun- bzw. Erbkrankheiten zu testen, wobei der Nachweis eventueller an Molekülen der Peptidbibliothek gebundener Serumantikörper in an sich bekannter Weise durch fluoreszenz-markierte Anti-Human- Antikörper erfolgen kann.
Die Erfindung schafft damit völlig neue diagnostische Möglichkeiten und steigert insbesondere auch die Chancen, diagnostische Marker und Therapeutika zu finden. Werden z.B. vollständige 6mer Peptidbibliotheken mit einer größeren Anzahl von Patientenseren in Verbindung gebracht und z.B. mittels einer Färbereaktion daraufhin untersucht, an welchen Peptiden sich Bestandteile der Seren angelagert haben, so werden sich dabei Korrelationen zwischen Krankheit und gefärbten Peptiden ergeben. Dies liegt daran, daß jeder Mensch in seinem Blutserum ein sehr komplexes individuelles Muster von Antikörperreaktivitäten mit sich trägt, das insbesondere die Auseinandersetzung seines Immunsystems mit akuten, chronischen, verdeckten oder bereits überstandenen Krankheiten wiederspiegelt. Ein großer Teil der Antikörperreaktivitäten kann durch die spezifische Bindung an Penta- oder Hexapeptide definiert werden, wodurch bei der Analyse der Bindereaktivitäten an eine vollständige Penta- oder Hexapeptidbibliothek das o.g. individuelle Muster von Antikörperreaktivitäten in bisher nicht gekannter Komplexität bestimmt werden kann. Längere Bindemotive, insbesondere die ebenfalls häufig vorkommenden mit einer helikalen Struktur, können durch Bibliotheken ermittelt werden, in denen nicht jede Aminosäure zufällig ist, sondern nur jene an bestimmten, aus der Struktur abgeleiteten Positionen. Damit können neue diagnostische Marker und bisher unbekannte Korrelationen zwischen Krankheit und spezifischen Antikörperreaktivitäten gefunden werden, darunter z.B. Marker für Tumorerkrankungen, für Herz-Kreislauferkrankungen wie Herzinfarkt, für multiple Sklerose und Parkinson, für alle Arten von Autoimmunkrankheiten und Allergien und für alle Arten von Infektionskrankheiten.
Das entstehende Muster von Markern kann zum einen selbst durch die Korrelation zu bestimmten Krankheitsbildern die diagnostische Aussage ermöglichen. Die neu gefundenen Marker können aber auch gesondert auf Träger aufgebracht und bei künftigen Untersuchungen verwendet werden.
In analoger Weise kann auch versucht werden, Krankheiten zu Bindungsmustern an andere Molekülbibliotheken , wie D-Peptidbibliotheken oder Oligosaccharidbibliotheken , zu korrelieren. Diese Methode ist dabei nicht auf menschliche Krankheiten beschränkt, sondern eignet sich zur Untersuchung forensischer und veterinärmedizinischer Fragestellungen ebenso wie zur Analyse anderer Flüssigkeiten, von Pflanzenextrakten bis hin zu Extrakten aus Mikroorganismen.
Bei einer weiteren Anwendung werden potentiell therapeutisch interessante Moleküle, wie z.B. D-Peptide, die nicht von den menschlichen Verdauungsenzymen abgebaut werden können, auf einem Träger angeordnet und anschließend mit medizinisch relevanten Molekülen, insbesondere mit krankheitserreger-spezifischen Proteinen oder mit Mischungen von krankheitserreger-spezifischen Proteinen in Kontakt gebracht. Dies ermöglicht die gezielte und schnelle Suche nach Bindungspartnern an diese medizinisch relevanten Moleküle. Analog ist auch die Suche nach Enzymliganden, Enzymsubstrat- Analoga oder Enzyminhibitoren möglich.
Anschließend kann dann die Bindung an die medizinisch relevanten Moleküle detektiert werden, z.B. im Wege der Biotinylisation oder der Fluoreszenz-Markierung, so daß die D-Peptide oder Aptamere identifiziert werden können, die zumindest Teile des Krankheitserregers binden. Diese D-Peptide oder Aptamere können anschließend nacheinander daraufhin getestet werden, ob sie den Krankheitserreger hemmen. Hat man z.B. ein Enzym des Krankheitserregers (z.B. Protease von HIV, reverse Tran- scriptase etc.) in geeigneter Menge vorliegen, so kann dieses Enzym fluoreszenzmarkiert werden (entweder direkt oder durch die rekombinante Expression eines kleinen Peptid-tags, das mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers anfärbbar ist). Damit kann festgestellt werden, an welche D-Peptide das Enzym gebunden hat. Anschließend führt man eine weitere Färbereaktion durch, die durch die Enzymaktivität verursacht wird. Beispielsweise präzipitiert die Spaltung durch die HlV-Protease ein fluoresziierendes Peptid, das man nachweisen kann. So erhält man D-Peptide, die das Enzym nicht nur binden, sondern auch gleichzeitig hemmen.
Um nachzuweisen, an welchen der auf dem Träger gebundenen Moleküle sich Moleküle angelagert haben, kann das Blutserum oder die DNA nach oder vor dem In-Kontakt- Bringen des Trägers mit dem Blutserum oder der DNA mit einem mit dem Blutserum oder der DNA reagierenden, insbesondere Bindungen eingehenden Stoff in Kontakt gebracht werden. Zweckmäßigerweise wird dabei der mit dem Blutserum oder der DNA reagierende Stoff vor dem In-Kontakt-Bringen mit dem Serum oder der DNA mit einem zur Lumineszenz anregbaren Stoff, insbesondere einem durch Einstrahlung von Laserlicht zur Fluoreszenz anregbaren Farbstoff, eingefärbt. Solche Farbstoffe sind z.B. unter den Namen "Cy3", "Cy5", "FITC" oder "TRITC" im Handel erhältlich, wobei vorteilhaft bereits eine ganze Palette von Konjugaten dieser Fluoreszenz-Farbstoffe zur Verfügung steht (z.B. Ziege-Anti-Mensch-Antikörper konjugiertes Cy5).
Wird das zu untersuchende Blutserum mit einem für die Immunglobuline des Typs E spezifischen Nachweisreagenz in Kontakt gebracht, so lassen sich damit evtl. beim Patienten bestehende Allergien ermitteln, da die Immunglobuline des Typs E für die allergischen Reaktionen wie Asthma oder Heuschnupfen verantwortlich sind. NichtAllergiker haben praktisch keine IgEs in ihrem Blutserum, Allergiker unterschiedliche Mengen, die unterschiedliche Allergene erkennen lassen. Schließlich ermöglicht die Erfindung die Suche nach spezifischen Bindungspartnern für ein Zielmolekül aus einer Bibliothek von 108 bis 1010 unterschiedlichen Molekülen und damit - durch die gleichzeitige Identifizierung vieler (unterschiedlich stark bindender) Bindungspartner - nach den für die Bindung des Liganden an das Zielmolekül verantwortlichen Strukturparametern. Dadurch wird der Weg zu Leitstrukturen stark vereinfacht. Beispielsweise können dazu mit den oben genannten Methoden erhaltene Signalmuster automatisch mit Strukturparametern oder Strukturmodellen der identifizierten Liganden aus der benützten Bibliothek korreliert werden.
Um nun eine Peptidbibliothek auf einen Träger, insbesondere auf einen in einem der gerade beschriebenen Verfahren verwendbaren Träger, anzuordnen, kann zunächst eine Oberfläche des Trägers mit einer Kunststoffschicht, die freie Aminogruppen für die Festphasensynthese einer Peptid- oder Oligonukleotidbibliothek enthält (z.B. dem derivatisierten Polystyrol "CovaLink" der Firma Nunc), überzogen werden (zur Einführung von primären Aminogruppen in Polystyrol siehe Fig. 15). Nach dem Einfügen eines geeigneten Spacers werden anschließend die freien Aminogruppen mit einer durch Licht abspaltbaren Schutzgruppe abgeblockt. Ein Beispiel von vielen für eine aktivierte, d.h. mit Aminogruppen reaktive, lichtab spaltbare Schutzgruppe ist Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC).
Anschließend werden Schutzgruppen in bestimmten Bereichen des Trägers mittels eines
Lasers abgespalten, worauf eine aktivierte Aminosäure, deren eigene Aminogruppe durch eine durch Licht abspaltbare Schutzgruppe blockiert ist, auf den Träger aufgebracht und dort verteilt wird, so daß die Aminosäure an die freien Aminogruppen ankoppeln kann. Danach werden die Verfahrensschritte "Abspalten von Schutzgruppen in bestimmten Bereichen des Trägers" und "Zuführen einer aktivierten Aminosäure, deren eigene Aminogruppe durch die durch Licht abspaltbare Schutzgruppe blockiert ist", für verschiedene, vorzugsweise alle 20 Aminosäuren wiederholt, und schließlich werden die Schutzgruppen von allen synthetisierten Peptiden abgespalten. Alternativ kann auch eine andere lithographische Methode zum Aufbringen einer Peptidbibliothek angewandt werden. So können z.B. die ausgereiften konventionellen Standardsynthesen (z.B. Gebrauch von fMoc-Schutz-gruppen bei der Peptidsynthese) mit einem Einschluß der aktivierten Monomere in photo- oder elektrolabile größere Partikel kombiniert werden. Die eingestrahlten elektromagnetischen Wellen bzw. eine angelegte Spannung spaltet dann nicht die photo- bzw. elektrolabile Schutzgruppe auf dem wachsenden Oligomer ab, sondern setzen die normalen aktivierten Monomere, wie sie für die Standardsynthesen verwendet werden, nur frei. Die aktivierten Monomere werden dabei vorzugsweise bei höherer Temperatur in einem Lösungsmittel gelöst, dessen Schmelzpunkt oder dessen Übergang in einen gelartigen Zustand nahe bei 20 °C liegt, worauf ein Laserlicht absorbierender Farbstoff beigemengt, das Gemisch abgekühlt und bei tiefer Temperatur zu kleinen festen Partikeln zerrieben wird, die über dem Träger für die lithographisch synthetisierten Molekülbibliotheken zerstäubt werden. Die aktivierten Monomere werden aus diesen Partikeln lokal nur dort freigesetzt, wo ein Laser die Partikel aufgrund der Absorption des mit eingeschlossenen Farbstoffs erwärmt. Dadurch verflüssigen sich oder gelieren die Partikel und die aktivierten Monomere können in Lösung an die freien Aminogruppen (oder wie bei der Oligonu- cleotidsynthese an freie Hydroxylgruppen) koppeln. Direkt neben dem erwärmten Ort erstarrt die Flüssigkeit wieder.
Die Erwärmung der festen Partikel findet dabei besonders vorteilhaft mit Hilfe einer wiederholt kurzzeitig einstrahlenden Lichtquelle, insbesondere eines Lasers oder einer Leuchtdiode, statt, wodurch besonders scharf abgegrenzte Übergänge zwischen festen Partikeln und lokal aus den Partikeln freigesetzten Substanzen entstehen.
Alternativ zu schmelzenden Partikeln kann auch ein Cage-Einschluß, insbesondere in Fullerenen, oder eine andere Methode zur Freisetzung verwendet werden, die z.B. durch elektromagnetische Wellen oder eine elektrische Spannung auslösbar ist. Ferner können alternativ auch ausgewählte Bereiche durch die in schneller Abfolge wiederholte Anlegung einer Spannung erwärmt werden, insbesondere wenn ein Mischarray von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen mit Leuchtdioden verwendet werden. Anstelle von aktivierten Monomeren können auch Kombinationen von Monomeren gekoppelt werden, also beispielsweise alle 20 x 20 möglichen aktivierten Dimere von L-Aminosäuren.
Im nächsten Schritt werden die nicht gekoppelten Monomere, die nicht aufgeschlossenen Partikel und/oder die erstarrten Partikel entweder einfach weggeblasen, oder gelöst und weggewaschen, erneut feste Partikel, die aktivierte Monomere enthalten aufgebracht, in ausgewählten Bereichen an den Träger gekoppelt und dieser Schritt mit vorzugsweise allen zur Verfügung stehenden unterschiedlichen aktivierten Monomeren nacheinander durchgeführt, anschließend die aufgrund der erfolgten Kopplungen neu eingeführten Standardschutzgruppen mit bekannten Techniken abgespalten und der nächste Zyklus begonnen bis z.B. eine vollständige Peptidbibliothek synthetisiert wurde. Zusätzliche Modifikationen anderer Art durch andere chemische Reaktionen sind dabei auch möglich, insbesondere biologisch relevante Modifikationen wie Glykosylierungen, Phosphorylierungen, oder Alkylierungen.
Eine weitere Möglichkeit bei der Verwendung eines Mischarrays von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen mit Leuchtdioden, ist die Steuerung der kom- binatorischen Molekülsynthese durch das Anlegen einer Spannung in ausgewählten Bereichen. Dadurch werden entsprechend geladene aktivierte Monomere für die Molekülsynthese an ausgewählten Bereichen entweder abgestoßen oder angezogen.
Zum Aufbringen einer Oligonukleotidbibliothek auf einen der oben genannten Träger kann analog zur Synthese der Peptidbibliothek vorgegangen werden, mit dem Unterschied, daß anstelle der 20 verschiedenen aktivierten Aminosäuren nur 4 verschiedene aktivierte Nukleotide verwendet werden müssen. Geeigneterweise werden dafür vier verschiedene 3'-O- phospho-ramidite-aktivierte Deoxynucleoside verwendet, die am 5' Ende oder am 3' Ende eine photolabile Schutzgruppe tragen oder die, wie für die Synthese einer Peptidbibliothek beschrieben, in Partikel eingeschlossen über dem Träger zerstäubt und anschließend durch die Einstrahlung von elektromagnetischen Wellen beweglich gemacht werden. Die für die Oligonukleotidsynthese üblicherweise verwendeten freien Hydroxylgruppen können gleichzeitig mit dem Einfügen eines geeigneten Spacers eingeführt werden.
Analoge Methoden sind auch für die Herstellung von Aptamer-Bibliotheken einsetzbar, d.h. für auf Ribonukleotiden und ihren Derivaten beruhenden Oligomeren. Daneben können auch reaktive Moleküle anderer Art, wie sie z.B. in der kombinatorischen Chemie benutzt werden, in die aktivierbaren Partikel eingeschlossen werden und ortsspezifisch freigesetzt werden. Somit können neben Nukleotiden oder Aminosäuren auch vielfältige andere Gruppen als monomere kombinierbare Bausteine für die Oligomersynthese verwendet werden.
Alternativ kann eine Molekülbibliothek auch durch eines von zahlreichen Druck- oder Spotverfahren auf den Träger aufgebracht werden, wie beispielsweise mittels einer Düse, ähnlich wie sie bei einem Tintenstrahldrucker benutzt wird. Anschließend können ausgewählte Bereiche des Trägers mit Laserlicht oder mit Hilfe von Leuchtdioden derart bestrahlt werden, daß es in diesen Bereichen zu einer Verankerung der aufgebrachten Moleküle auf dem Träger kommt. Dies ist insbesondere deswegen vorteilhaft, weil dadurch später in genau demselben Bereich ein Lumineszenzsignal angeregt und ausgelesen wird, in dem vorher die aufgebrachten Moleküle aufgrund der Aktivität des Anregungslasers verankert wurden.
Um dies zu erreichen, kann z. B. vor dem Aufbringen der zu verankernden Molekülen eine bei den jeweiligen Umgebungstemperaturen feste Substanz auf den Träger gebracht werden, welche dann zur Verankerung der Moleküle geschmolzen wird. Dabei kann so vorgegangen werden, daß die Oberfläche eines Trägers (z.B. durch das gleichmäßige chemische Koppeln von Streptavidin oder von Biotin auf dem ganzen Träger) aktiviert wird, dann bei 40 °C gleichmäßig ein bei 10 °C festes (ggf. - wenn hydrophile Moleküle gekoppelt werden sollen - hydrophobes) Farbstoffmolekülen enthaltendes Lösungsmittel auf den Träger aufgebracht wird und man es dort erstarren läßt, worauf dann die an den Träger zu koppelnden Moleküle aufgebracht werden, mittels Laser, Leuchtdioden oder Spannung ausgewählte Bereiche des Trägers erhitzt werden , wodurch sich das Lösungsmittel verflüssigt oder lokal verflüchtigt und das aufgebrachte zu koppelnde Molekül an den Träger binden kann. Die Bindung findet dabei vorzugsweise über Biotin-Streptavidin statt. Anschließend werden ungebundene Moleküle weggewaschen und der Zyklus kann mit einem neuen Spot- oder Druckvorgang beginnen, bis schließlich eine dichtgepackte und komplexe Molekülbibliothek auf den Träger aufgebracht ist.
Das Aufbringen oder die Synthese einer Molekülbibliothek auf einen Träger ist jedoch nicht auf die beschriebenen Verfahren beschränkt; als weitere Verfahren seien beispielhaft erwähnt:
- das Spotten von Mikromengen von Molekülen mit Hilfe eines dem Füllfederhalter vergleichbaren Prinzips, insbesondere von PCR-Produkten vervielfältigter Gensequenzen;
das Spotten von Mikromengen mit Hilfe einer Art Siebdruckverfahren, insbesondere von aktivierten Monomeren für die Oligonukleotidsynthese, die Synthese von Peptiden oder die Synthese von PNAs;
das Spotten von Mikromengen mit Hilfe einer Art Tintenstrahldrucker, insbesondere von aktivierten Monomeren für die Oligonukleotidsynthese, die Synthese von Peptiden oder die Synthese von PNAs; die Synthese von PNAs, wobei an jeder Stelle der Polymerisationszyklen oder nach dem Aufdrucken der Moleküle auch noch andere Verbindungen angehängt oder die bereits gekoppelten Moleküle modifiziert werden können.
Eine zur Lösung der eingangs genannten Aufgabe geeignete Vorrichtung ist in Anspruch 10 gegeben. Ein zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren dienender Träger ist Gegenstand der Ansprüche 12 bis 15.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform gründet dabei auf die Topographie eines Mischarrays von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen mit den darauf aufgebrachten Molekülen mit Leuchtdioden. Die einzeln ansteuerbaren Leuchtdioden werden dabei in Vertiefungen angeordnet, so daß das von Ihnen abgestrahlte Licht nur bei benachbarten Siliziumerhebungen eine Lumineszenzreaktion anregt. Damit ist wiederholt detektierbar eine exakte, insbesondere kurzzeitige Anregung ausgewählter Bereiche möglich. Diese Ausführungsform bietet sogar die Möglichkeit, eine durch das Lumineszenzsignal entstandene Spannungsänderung direkt jeder einzelnen Silizium- erhebung zuzuordnen, so daß in diesem Fall der Träger der Moleküle identisch mit dem Detektor ist.
Durch die kurzzeitige Anregung von Fluoreszenzmolekülen kann darüber hinaus auf die gezielte Lumineszenzanregung ausgewählter Bereiche verzichtet werden, wenn die unterschiedlichen Moleküle einer Molekülbibliothek auf ein Array von Detektoren aufgebracht werden. Die Anregung kann in diesem Fall vorzugsweise durch einen gepulsten Laser erfolgen, dessen Licht eine größere Zahl von Detektoren erfaßt. Der in den Dunkelphasen der Anregung aufgrund der Lumineszenz der Moleküle entstehende Strom kann dann parallel in den einzelnen Photodetektoren ausgelesen werden und damit den einzelnen Mitgliedern der Molekülbibliothek zugeordnet werden.
Die räumliche Entkopplung von Anregung und Detektion kann des weiteren im Falle der Anregung durch ein Array von Mikrolasern oder Leuchtdioden sehr einfach durch ein relativ grobes Raster von Detektoren erfolgen, die die in alle Raumrichtungen gestreute Lumineszenz der von dem Anregungslaser angeregten Moleküle erfassen. Dazu muß nur der eine Detektor, der das von dem Anregungslaser eingestrahlte Licht erfaßt, ausgeblendet werden. Natürlich kann die zeitliche Entkopplung von Anregung und Detektion auch mit der räumlichen Entkoppelung kombiniert werden.
Bei einer anderen Ausführungsform einer Vorrichtung zur Erfassung optischer Eigenschaften von auf einem Träger gebundenen Molekülen, insbesondere biologischen oder biologisch relevanten Molekülen, mit Mitteln zum Einstrahlen von elektromagnetischen Wellen auf den Träger und einem Detektor zur Beobachtung der bestrahlten Moleküle sind Mittel zum Ablösen ausgewählter Moleküle vorgesehen, was es insbesondere dann vorteilhaft ermöglicht, Moleküle gezielt von dem Träger abzulösen, wenn diese bei einem ersten Analyseschritt aufgefallen sind. Die abgelösten Moleküle können anschließend einer weiteren Untersuchung, insbesondere einem Detektor zweiter Art, z.B. einem Spektrometer, insbesondere einem Massenspektrometer, zugeleitet werden, mit dem bestimmte Eigenschaften der abgelösten Moleküle erfaßbar sind.
Die Mittel zum Ablösen können in vorteilhafter Weiterbildung der genannten Vorrichtung einen Laser umfassen. Besonders einfach und vorteilhaft ist für diesen Zweck jedoch die Verwendung eines elektrisch ansteuerbaren und aufladbaren Trägers, wobei die an den Träger gebundenen Moleküle in ausgewählten Bereichen sehr einfach durch das Anlegen einer Spannung abgelöst werden können.
Als Träger für Moleküle, insbesondere biologische Moleküle, insbesondere zur Verwendung in einem der genannten Verfahren können erfindungsgemäß Träger Verwendung finden, die ein engmaschiges Netz von integrierten Positionsmarkierungen aufweisen, so daß es möglich wird, die Position einer z.B. mittels einer üblichen Mechanik mit einem Detektor auf dem Träger angefahrenen zu untersuchenden Stelle zu kontrollieren. Bevorzugt sind dabei die Positionsmarkierungen so ausgebildet, daß sie von einem optoelektronischen Abtastsystem erfaßbar sind. Wird als Träger eine im wesentlichen handelsübliche Compact Disc verwendet, so hat dies neben Kostenvorteilen gegenüber den bekannten Diagnostik-Chips den Vorteil, daß zur Untersuchung des Trägers auf im wesentlichen handelsübliche Geräte, insbesondere die in CD-Spielern und CD-Brennern vorgesehen Lese- und Schreiblaser zurückgegrif- fen werden kann. Wird dann noch die Compact Disc lichtdurchlässig ausgebildet, so kann das Licht des Lasers nicht nur zur optoelektronischen Positionserfassung, sondern gleichzeitig auch zur Anregung von Lumineszenz-Reaktionen von auf der CD gebundenen Molekülen verwendet werden. Alternativ können CDs oder analoge Medien mit einem in die CD integrierten Wellenlängenfilter verwendet werden, wobei ein Laser, dessen Licht den Wellenlängenfilter nicht durchdringen kann, für die ortsgenaue Positionierung der CD verwendet wird, während ein zweiter Laser, dessen Licht den Wellenlängenfilter durchdringen kann, aufgrund seines zu dem ersten Laser fixierten Abstandes zur wiederholten ortsgenauen Synthese oder Anregung einer Lumineszenreak- tion verwendet werden kann.
Ähnliche Vorteile werden durch die Verwendung eines Array s von Mikrolasern oder Leuchtdioden zur Anregung der Lumineszenz-Reaktion erzielt. Die genaue Positionsinformation ergibt sich in diesem Fall durch die relative Anordnung der Mikrolaser zueinander, so daß nahezu beliebig oft wiederholbar genau definierte Punkte auf einem parallel über dem Array angeordneten vorzugsweise durchsichtigen Träger von Molekülbibliotheken beleuchtet werden können. Der Träger kann dabei aus nahezu beliebigen Materialien bestehen, insbesondere aus für die Synthese einer Molekülbibliothek derivatisiertem Glas.
Insbesondere bei der lithographischen Synthese einer Molekülbibliothek kann bei der Verwendung eines Arrays von Mikrolasern oder Leuchtdioden der Träger der Molekülbibliothek besonders vorteilhaft über dem Array fixiert werden. Zusätzlich kann daran auch noch ein Array von Detektoren fixiert werden, was insbesondere eine Kalibirierung der erzielten Einzelsignale mit einem gleichmäßig fluoreszenzmarkierten Träger ermöglicht. Das gleiche gilt für den weiter oben beschriebenen Mischarray von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen (mit den darauf aufgebrachten Molekülen) mit Leuchtdioden. Auch solche Mischarrays können an einem Detektor oder einem Array von Detektoren fixiert werden, wenn nicht sogar die durch ein Lumineszenzsignal entstandene Spannungsänderung direkt jeder einzelnen Siliziumerhebung zugeordnet wird, so daß in diesem Fall der Träger der Moleküle identisch mit dem Detektor ist. Dies gewährleistet eine sehr einfache und dennoch extrem genaue, wiederholbare An- steuerung der einzelnen Bildpunkte während der lithographischen oder durch das Anlegen einer Spannung gesteuerten Synthese der Molekülbibliothek und den sich daran anschließenden Färbe- und Ausleseschritten, darüber hinaus entfällt das zeitaufwendige Ansteuern und Fokussieren der einzelnen Bildpunkte. Aufgrund des Fehlens jeglicher bewegter Teile ist eine solche Ausführungsform besonders robust und einfach in der Handhabung.
Auf einem solchen Träger können hochkomplexe Molekülbibliotheken, z.B. eine Peptidbibliothek, insbesondere eine vorzugsweise vollständige 4-, 5-, 6- oder 7mer Peptidbibliothek, oder eine Oligonukleotidbibliothek, insbesondere eine vorzugsweise vollständige 12-, 13-, 14- oder 15mer Oligonukleotidbibliothek oder Aptamerbibliothek, so aufgebracht werden, daß die Position der einzelnen Moleküle bzw. Molekülgruppen aus mehreren Molekülen einer Molekülart wiederholt exakt anfahrbar und damit gezielt untersuchbar ist.
Zum Aufbringen von Molekülen auf eine im wesentlichen ebene Oberfläche eines Trägers wird erfindungsgemäß zum einen eine Vorrichtung vorgeschlagen, die Mittel zur drehbaren Halterung des Trägers um eine zu der genannten Oberfläche des Trägers im wesentlichen senkrechte Drehachse, Mittel zum Aufbringen verschiedener Flüssigkeiten auf die Oberfläche des Trägers im Bereich der Drehachse und wenigstens einen relativ zum Träger verfahrbaren Laser zum Bestrahlen ausgewählter Bereiche des Trägers mit Laserlicht umfaßt. Bei der Verwendung eines Array s von Mikrolasern oder Leuchtdioden wird in den Lichtstrahl der Lichtquellen ein geeigneter vorzugsweise durchsichtiger Träger gebracht und dort fixiert. Die genaue Positionsinformation ergibt sich in diesem Fall durch die relative Anordnung der Mikrolaser bzw. Leuchtdioden zueinander, so daß genau definierte Punkte auf dem Träger wiederholt beleuchtet werden können. Dies kann insbesondere für die lithographische Synthese und das anschließende Auslesen von Molekülbibliotheken ausgenützt werden.
Wenn die Molekülbibliotheken unabhängig von der Aktivität des bzw. der Anregungslaser auf den Träger aufgebracht werden, so dienen in Bezug zu der aufgebrachten Molekülbibliothek regelmäßig angeordnete, in geeigneter Weise detektierbare "guide dots" als Bezugspunkt zur Positionsbestimmung der aufgebrachten unterschiedlichen Moleküle.
Alternativ kann dazu auch eine Vorrichtung dienen, bei der düsenartige Mittel zum Aufbringen kleinster Mengen auf dem Träger zu verankernder Moleküle, Mittel zum Verfahren der Mittel zum Aufbringen der Moleküle und des Trägers relativ zueinander und wenigstens ein Laser zur Bestrahlung ausgewählter Bereiche des Trägers mit Laserlicht vorgesehen sind.
Alternativ können Moleküle oder Molekülbibliotheken auch mit verschiedenen bereits bekannten Druckverfahren auf den verwendeten Träger aufgebracht werden, z.B. mit einem modifizierten Siebdruckverfahren. PCR-Fragmente werden beispielsweise momentan nach dem Prinzip des Füllfederhalters aufgedruckt. Letzteres erlaubt zwar die Synthese hochkomplexer Molekülbibliotheken, jedoch müssen bei Druckverfahren die einzelnen Spots an den Auslesemechanismus angepaßt werden, was sehr zeitaufwendig ist, da jeder Spot angefahren und in der Regel durchfokussiert werden muß, bis schließlich die Einstellung gewählt wird, die die maximale Lichtausbeute gibt, was sich bei Verwendung einer CD oder eines Arrays von Mikrolasern oder Leuchtdioden erübrigt, da insbesondere bei einem Array von Mikrolasern die einzelnen Bildpunkte mit nahezu parallelem Licht durchstrahlt werden. Gleiches gilt, wenn ein Array von Detektoren als Träger der Moleküle verwendet wird.
Auch bei einer CD oder analogen Trägern ist das genannte Problem aufgrund des extrem engmaschigen Netzes von Positionsinformationen sehr gemildert, da sich immer in nächster Nähe ein Pit findet, relativ zu dem die Moleküle auf dem Träger verankert und ausgelesen werden können.
Insbesondere wenn als Träger der Moleküle ein weiter oben beschriebener Array von einzeln ansteuerbaren Siliziumerhebungen oder ein Mischarray mit Leuchtdioden verwendet wird, können aufgedruckte Moleküle auch aufgrund einer in ausgewählten Bereichen angelegten Spannung auf den Träger aufgebracht werden, wenn die aufzubringenden Moleküle eine entsprechende Ladung tragen oder mit Hilfe der gezielt ansteuerbaren Lichtquellen in ausgewählten Bereichen ionisiert wurden.
Die Erfindung erlaubt es dem Fachmann also vorteilhaft, die zur Aufbringung der jeweiligen Moleküle auf die jeweiligen Träger optimal geeignete Vorrichtung zu wählen, wobei er im Einzelfall auch beide Vorrichtungen kombinieren und zunächst einen Teil der Moleküle mit der einen und dann einen anderen Teil der Moleküle mit der anderen Vorrichtung auf den Träger aufbringen kann.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der rein beispielhaften und nicht beschränkenden Beschreibung einiger Ausführungs- bzw. Durchführungsbeispiele in Verbindung mit der Zeichnung.
-In Fig. 1 ist das Funktionsprinzip einer Vorrichtung zur Erfassung einer Lumineszenz- Reaktion von auf der Oberseite 10 eines Trägers 12 gebundenen biologischen Molekülen 14 veranschaulicht, wobei der Träger 12 um eine zur Oberseite 10 senkrechte Achse 16 rotiert, wie durch den Pfeil 18 angedeutet. Dabei handelt es sich bei dem Träger 12 um eine im wesentlichen handelsübliche CD, die jedoch lichtdurchlässig ausgebildet ist und die auf ihrer der Oberseite 10 gegenüberliegenden Seite mit Vertiefungen, sog. "Pits" versehen ist, die durch die Striche 20 angedeutet sind und die sich unter einer transparenten Schutzschicht befinden.
Die Pits bilden interne Positionsmarkierungen, die von dem hier nur angedeuteten optoelektronischen Erfassungssystem eines üblichen CD-Spielers oder CD-Brenners gelesen werden können. Das Erfassungssystem besteht dabei bekannterweise im wesentlichen aus einem hier nicht gezeigten Laser und einer - wie durch den Bewegungspfeil 22 angedeutet - verstell- oder verfahrbaren Fokussierspule oder -linse 24, welche es erlaubt, die von dem Laser erzeugten Strahlen 26 vorteilhaft sowohl zum Abtasten der Pits 20 und damit zur Positionsbestimmung als auch - wie in dem in der Figur gezeigten Zeitpunkt - durch die CD hindurch zur Bestrahlung und eventuellen Anregung der Moleküle 14 zu verwenden.
Dem Ort der Bestrahlung ist in Bewegungsrichtung der CD ein lichtempfindlicher Detektor 28 nachgeordnet, dem eine Linse 30 zugeordnet ist, die von eventuell angeregten Molekülen emittierte Lichtstrahlen 32 bündelt und auf den Detektor 28 lenkt. Durch diese Anordnung ist sichergestellt, daß das Licht des Lasers nicht den Detektionsvorgang durch Überlagerung stört. Zudem können so Lumineszenz- Reaktionen angeregter Moleküle erfaßt werden, während gleichzeitig bereits neue Moleküle bestrahlt werden, so daß die Untersuchung der auf der CD angeordneten Moleküle vorteilhaft mit sehr hoher Geschwindigkeit durchgeführt werden kann.
In Fig. 2 ist die Verwendung eines Array s 40 von Mikrolasern 42, 44 zur Anregung von auf einer Flachseite 46 eines Trägers 48 gebundenen Molekülen 50, 52 dargestellt. Da die Mikrolaser einzeln ansteuerbar und relativ zueinander in festgelegter Position angeordnet sind, können genau definierte Punkte auf dem parallel über dem Array 40 befestigten im gezeigten Beispiel durchsichtigen Träger 48 beleuchtet und dort befindliche Moleküle ggf. zur Lumineszenz angeregt werden. So sind zum dargestellten Zeitpunkt die Mikrolaser 42 inaktiv, während der Mikrolaser 44 aktiv ist und Licht auf die Molekülgruppe 50 einstrahlt. Es sei an dieser Stelle betont, daß der Träger 48 zwar bei diesem Ausführungsbeispiel durchsichtig ist, daß der Träger aber nicht notwendigerweise durchsichtig sein muß, denn anregende Lichtquelle und Detektor können auch auf ein und derselben Seite des Trägers angeordnet werden, nämlich auf der Seite, auf der sich die zu untersuchenden Moleküle befinden.
Zur Erfassung eventueller Lumineszenz-Reaktionen ist bei diesem Ausführungsbeispiel ein Array 54 aus einer Anzahl von Detektoren 56, 58 vorgesehen. Dies erlaubt eine besonders einfache Trennung von Anregung und Detektion dadurch, daß der oder die im direkten Strahlenbereich eines aktiven, also eine Anregung der Moleküle bewirken- den Lasers 44 befindlichen Detektoren 58 zumindest während des Emittierens des Lasers "ausgeschaltet" werden, z.B. in der Weise, daß evtl. auf den Detektor oder die Detektoren einfallende Strahlung nicht weiter erfaßt oder Signale von den jeweiligen Detektoren nicht weitergeleitet oder ausgewertet werden. Die anderen Detektoren 56 können, vorzugsweise bei gepulster Einstrahlung, ebenfalls für die Dauer der Anregungsphase ausgeschaltet werden, was aber nicht zwingend notwendig ist. Insbesondere ist es möglich, zwischen dem Array 54 von Detektoren und dem Träger 48 einen Wellenlängenfilter 60 anzuordnen, der Strahlung 62 mit der Wellenlänge der Anregungslaser ausfiltert oder zumindest stark abschwächt (wie durch die Strahlen 62' angedeutet), Lumineszenz-Strahlung 64 dagegen passieren läßt, so daß diese von den aktiven Detektoren 56 erfaßt und in entsprechende Signale umgewandelt werden kann, welche dann an eine an sich bekannte und daher hier nicht weiter beschriebene Signalauswertungseinrichtung, z.B. einen Computer, weitergeleitet werden können.
Ein in Fig. 2 gezeigter Träger kann z.B. dann, wenn für die Synthese und das Auslesen einer hochkomplexen Molekülbibliothek eine sehr genaue Auflösung der einzelnen Bildpunkte auf dem Träger benötigt wird, bereits vor einer z.B. ithographischen Synthese einer Molekülbibliothek fest (aber nicht unlösbar) mit dem Array von Mikrolasern verbunden werden und dies während der Synthese und Färbung mit einer zweiten Substanz (beispielsweise dem Blutserum von Patienten) bis zum Auslesen der Lumineszenz-Reaktion auch bleiben. Anschließend kann der Träger entsorgt und ein neuer Träger fest mit dem Array von Mikrolasern verbunden werden. Zusätzlich kann auch ein Array von Detektoren fest mit dem Array von Mikrolasern verbunden werden, wie in Fig. 10 dargestellt.
Alternativ können auf dem Träger sogenannte "guide dots" in regelmäßigen Abständen eingefügt werden, die jeweils ein definiertes Lumineszenz-Signal ergeben und damit die Funktion der Pits auf der CD übernehmen, d.h. ein internes Raster abgeben, das zur Positionsinformation dient.
Das Entkoppeln von Anregung und Detektion ist bei diesen Beispieln noch einfacher als bei dem Beispiel mit Verwendung einer CD als Träger, da ein Mikrolaser nach dem anderen aktiviert werden kann. Beispielsweise kann man ein gröberes Raster von Photodioden über dem Array aufbauen, wobei jeweils die Diode im Intensitätsmaximum des gerade aktiven Anregungslasers ausgeschaltet ist.
Ist die Leistung des bzw. der Laser steuerbar, so kann/können der/die Laser auch zum Ablösen ausgewählter Moleküle von dem Träger verwendet werden, wobei die abgelösten Moleküle dann in geeigneter Weise einer weiteren Untersuchungseinrichtung, z.B. einem Massenspektrometer, zugeführt werden können.
In der Fig. 8 ist noch einmal beispielhaft das Grundprinzip des vorgestellten Untersuchungsverfahrens dargestellt: ausgewählte Bereiche 7 eines Trägers 12 mit daran gekoppelten Molekülen oder Aggregaten 4 an diese Moleküle oder mit Molekülen 8, die mit den gekoppelten Molekülen 2 oder mit den Agggregaten an diese Moleküle 4 in Wechselwirkung treten, werden mit elektromagnetischen Wellen 6 bestrahlt.
In den Fig. 9 und 10 ist schematisch gezeigt, wie die physikalische Umgebung, insbesondere die Matrixschicht 3 von Substanzen 5 in lokal eng begrenzten Bereichen 7 durch das Einstrahlen von elektromagnetischen Wellen 13 (Fig. 9) oder durch das Anlegen einer Spannung 13' (Fig. 10) verändert werden kann, so daß die vorher immobilisierten Substanzen 9 beweglich gemacht werden (bewegliche Substanzen sind durch 11 angedeutet) und in die Nähe des Trägers 12 gelangen können. Dort können sie an auf dem Träger befindliche Moleküle 2 ankoppeln (Bindungen eingehen), ein Aggregat bilden oder Teil einer sonstigen chemischen Reaktion werden. In Fig. 10 ist zudem gezeigt, daß der Träger 12 in ein Mischarray 17 aus Detektoren 56 und aus gezielt ansteuerbaren Quellen elektromagnetischer Strahlung, z.B. Leuchtdioden 19, eingebettet sein kann. Ausgewählte Bereiche 7 des Trägers 12 werden dabei zweckmäßigerweise durch einen nichtleitenden und auch für die eingestrahlten elektromagnetischen Wellen undurchlässigen Isolator 21 voneinander getrennt.
Wie in Fig. 11 veranschaulicht, können mit einem Array von einzeln ansteuerbaren Mikrolasern ausgewählte Bereiche eines über dem Array fixierten Trägers wiederholt punktgenau bestrahlt werden. Dadurch können Moleküle einer Molekülbibliothek mit lithographischen Methoden auf ausgewählte Bereiche des Trägers aufgebracht werden. Nach der Einfarbung der Molekülbibliothek mit einem Fluoreszenzfarbstoff werden die fluoreszierenden Moleküle in nacheinander ausgewählten Bereichen mit einem kurzzeitigen Lichtimpuls angeregt. Die zwischen den Anregungsimpulsen durch die Fluoreszenz der Moleküle erzeugte Strahlung wird von den Photodetektoren aufgefangen und kann einzelnen Mitgliedern der Molekülbibliothek zugeordnet werden, so daß genau ermittelt werden kann, bei welchen Molekülen Fluoreszenzreaktion hervorgerufen wurden.
Bei einem entsprechend ausgebildeten Mischarray 17 aus einzeln ansteuerbaren Lichtquellen 19 und Detektoren 56 können - wie in Fig. 12 gezeigt -die Detektoren 56 selbst Träger 12 von unterschiedlichen Molekülen 2, 4 und 8 sein. Ein solches Mischarray 17 kann z.B. dazu verwendet werden werden, in ausgewählten Bereichen
7 eine kombinatorische Molekülsynthese auszulösen, ausgewählte Bereiche 7 kurzzeitig mit elektromagnetischen Wellen 6 anzuregen und die bei einer solchen Anregung eventuell entstehenden Lumineszentreaktionen direkt zu messen. Als Detektoren 56 können dabei insbesondere Siliziumträger, Leuchtdioden oder ein davon unabhängiger Array aus Detektoren verwendet werden. Zur Trennung der Bereiche 7 voneinander ist ein nichtleitender, für die eingestrahlten elektromagnetischen Wellen undurchlässiger Isolator 21 vorgesehen.
In den Fig. 13 und 14 ist schematisch gezeigt, wie ein Array 23 aus einzeln ansteuerbaren Detektoren 27 (Fig. 13), die Träger 12 von unterschiedlichen Molekülen 2,4 und 8 sein können, bzw. ein Array aus einzeln an steuerbaren Leuchtdioden 29 (Fig. 14), die auch als Photodetektoren verwendet werden können, dazu verwendet werden kann, in ausgewählten Bereichen 7 eine kombinatorische Molekül synthese auszulösen, größere Bereiche 25 oder ausgewählte Bereiche 7 kurzzeitig mit elektromagnetischen Wellen 6 anzuregen und die bei einer solchen Anregung eventuell entstehenden Lumineszen- treaktionen in den Dunkelphasen der Anregung direkt zu messen. Als Detektoren 27 können dabei insbesondere Siliziumträger verwendet werden (Fig. 13). Zur Trennung der Bereiche 7 voneinander ist wiederum ein nichtleitender, für die eingestrahlten elektromagnetischen Wellen undurchlässiger Isolator 21 vorgesehen.
Nachfolgend sind einige Beispiele der Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren bzw. der Anwendung erfindungsgemäßer Vorrichtungen beschrieben:
a) Synthese einer vollständigen 6mer Peptidbibliothek auf einer CD unter wasserfreien Bedingungen
Die Oberfläche einer CD wird mit einer Kunststoffschicht überzogen, die freie Aminogruppen für die Festphasensynthese enthält. Nach der Kopplung eines geeigneten Spacers von 2-3 Aminosäuren Länge mit Hilfe von Standard fMoc-Peptidsynthese, werden freie Aminosäuren anschließend mit einer durch Licht abspaltbaren Schutzgruppe abgeblockt. Die Zuleitung der zu koppelnden Schutzgruppe erfolgt durch einen Schlauch auf das Innere der sich drehenden CD. Dabei kann ein leicht modifiziertes Syntheseprogramm eines an sich bekannten Peptidsynthesizers verwendet werden. Ein Programm, das die Aktivität eines Brennlasers steuert, spaltet die Schutzgruppen an den Bereichen ab, wo im ersten Schritt die Aminosäure Alanin gekoppelt werden soll. Die Abspaltung der Schutzgruppe erfolgt durch Zwei-Photonen-Aktivierung mit Hilfe des Brennlasers und eines von oben einstrahlenden, etwas weniger fokussierten zweiten Lasers. Nach der selektiven Abspaltung der Schutzgruppe wird die aktivierte Aminosäure Alanin durch den oben erwähnten Schlauch der CD zugeführt. Die aktivierte Aminosäure koppelt an die freien Aminogruppen, wobei die eigene Aminogruppe der Aminosäure zuvor durch die gleiche Schutzgruppe wie oben erwähnt blockiert worden ist. Dieser Vorgang wird für die anderen 19 Aminosäuren wiederholt und das
Ganze insgesamt sechs Mal wiederholt. Im letzten Schritt werden die Schutzgruppen von allen synthetisierten Peptiden abgespalten.
b) Synthese einer vollständigen 5mer Peptidbibliothek mit Hilfe eines Arrays von Mikrolasern
Ein geeigneter flacher, durchsichtiger Träger, der freie Aminogruppen enthält wird fest über dem Array von Mikrolasern fixiert. Geeignet sind dabei insbesondere dünne Glasscheiben, die mit konz. NaOH gereinigt, anschließend mit Wasser gewaschen und 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 10% (vol/vol) bis(2-hydroxyethyl) aminopropyl- triethoxysilan derivatisiert wurden. Alternativ kann ein geeigneter flacher, durch- sichtiger Träger mit einer Kunststoff Schicht überzogen werden, die freie Aminogruppen für die Festphasensynthese enthält.
An die freien Aminogruppen wird mithilfe von dem Fachmann geläufiger Standard fMoc-Peptidsynthese unter wasserfreien Bedingungen zunächst ein geeigneter Spacer von 2-3 Aminosäuren Länge synthetisiert. Anschließend wird der Träger parallel zur X-Achse in 20 voneinander getrennte Bereiche unterteilt, die von den 20 verschiedenen jeweils in DMF gelösten aktivierten fMoc-Derivaten der Aminosäuren benetzt werden.
Die Kopplung der aktivierten Aminosäuren findet anschließend bei Raumtemperatur für 30-60 Minuten statt. Nach 3 maligem Waschen mit Dimethylformamid (DMF) wird die fMoc-Schutzgruppe mithilfe von 20% Piperidin in DMF abgespalten und erneut mit DMF gewaschen.
Der Träger wird erneut in 20 voneinander getrennte Bereiche unterteilt, diesmal parallel zur Y-Achse. Diese Bereiche werden wiederum von den 20 verschiedenen jeweils in DMF gelösten aktivierten fMoc-Derivaten der Aminosäuren benetzt gefolgt von der oben beschriebenen dem Fachmann geläufigen Standard fMoc-Peptidsynthese.
Nach der wie oben beschriebenen Abspaltung der N-terminalen Schutzgruppe ist in diesem Stadium der oben beschriebene Träger in 400 voneinander abgegrenzte Bereiche unterteilt, mit jeweils einem von 400 möglichen C-terminal durch einen Spacer an den Träger gekoppelten Dipeptiden deren N-Terminus frei, d.h. ohne Schutzgruppe vorliegt.
Für die nächsten Kopplungsschritte werden die oben beschriebenen aktivierten Aminosäuren einzeln statt in DMF in einem geeigneten bei 50 °C flüssigen, bei 4 °C festen Lösungsmittel gelöst, ein geeigneter das Laserlicht absorbierender und in Bezug auf die aktivierten Aminosäuren inerter Zusatzstoff, insbesondere ein Farbstoff oder Graphitpartikel, zugegeben, die Lösung tiefgefroren und in kleine Partikel zerrieben.
Diese Partikel werden bei 4 - 10 °C auf den über einem Array von Mikrolasern fest montierten Träger gestäubt, eine Abdeckplatte darübergelegt und ausgewählte Bereiche für 20-30 Minuten mit den Mikrolasern bestrahlt. Die Absorption des Laserlichts durch den beigemengten Farbstoff erwärmt dabei lokal in den bestrahlten Bereichen das bei den gewählten Temperaturen gefrorene Lösungsmittel und ermöglicht damit die Kopplung der aktivierten Aminosäuren an die freien Aminogruppen ausschließlich in diesen Bereichen. Anschließend wird die Abdeckplatte entfernt, und die nicht gekoppelten Aminosäuren werden mit DMF weggewaschen, wobei dieser Waschvorgang mit erwärmtem DMF 2x wiederholt wird.
Dieser Vorgang wird insgesamt 20x mit allen aktivierten Aminosäuren wiederholt, sodaß die oben beschriebenen 400 voneinander abgegrenzten Bereiche in 20 x 400 definierte Bereiche unterteilt werden, gefolgt von der oben beschriebenen Abspaltung der fMoc-Schutzgruppen mit 20% Piperidin in DMF.
Die Verlängerung der Peptide um eine 4. und 5. Aminosäure erfolgt anschließend analog zur Synthese der 3. Aminosäure, wobei wie oben beschrieben bei jedem Syntheseschritt jeder Bereich in 20 Bereiche unterteilt wird.
Schließlich werden alle Schutzgruppen mit 10% Silan in konzentrierter Trifluoressig- säure abgespalten, der Träger mit DMF und Methanol gewaschen und getrocknet, sodaß im Endeffekt ein Träger mit 205 = 3.200.000 verschiedenen Bereichen entsteht, die jeweils eines von allen möglichen C-terminal gekoppelten Pentapeptiden repräsentieren.
c) Untersuchung von Blutserum unter Verwendung einer Compact Disc mit einer darauf fixierten Peptidbibliothek
Die CD wird mit dem Blutserum eines Patienten gefärbt, wozu zunächst unspezifische Bindungen mit einer geeigneten wäßrigen Lösung, wie zum Beispiel 2 % Milchpulver in PBS abgeblockt werden und das Blutserum im gleichen Puffer verdünnt wird, worauf dann die Oberfläche der CD unter leichtem Schütteln für 60 Minuten mit dem Serum benetzt wird. Die CD wird drei Mal gewaschen. Der an den Farbstoff Cy5 gekoppelte Ziege-Anti-Mensch-Antikörper wird in 2 % Milchpulver in PBS verdünnt; anschließend wird damit die Oberfläche der CD unter leichtem Schütteln für 60 Minuten benetzt und sodann drei Mal gewaschen. Die mit dem zweiten Antikörper gefärbte Compact Disc wird in einem abgewandelten CD-Spieler ausgelesen.
d) Auslesen einer gefärbten Compact Disc mittels eines umgebauten CD-Brenners
Ein auf schwache Wattstärke eingestellter Brennlaser rastert die CD im ersten Durchlauf ab. Dabei werden eventuelle Fluoreszenzsignale mit Hilfe der in den CD-Brenner zusätzlich eingebauten Optik detektiert und den einzelnen CD-Bereichen zugeordnet. Diese zusätzliche Optik besteht aus einer fokussierenden Linse, die einen oder, wenn gewünscht, mehrere Pits auf einen Photomultiplier oder eine CCD-Kamera abbildet. Die Linse bildet dabei einen Punkt in Laufrichtung der CD außerhalb des Maximums des einstrahlenden Lasers ab. Zusätzlich wird das Laserstreulicht durch einen geeigneten Kantenfilter von dem Fluoreszenzsignal abgetrennt. Die Bereiche der CD, die im ersten Durchlauf ein Signal ergaben, werden in den folgenden Durchgängen gezielt angesteuert und mehrfach abgerastert. Die dabei abgelesenen Signale werden aufaddiert und den positiven Pits zugeordnet.
e) Untersuchung von Blutserum unter Verwendung eines Trägers mit darauf fixierter Peptidbibliothek
Wie bei Beispiel c) beschrieben wird der in diesem Beispiel fest auf einem Array von Mikrolasern montierte Träger mit einer in Beispiel b) beschriebenen lithographisch synthetisierten vollständigen Pentapeptid-Bibliothek mit einer geeigneten wässrigen Lösung, vorzugsweise 2% Milchpulver in PBS, abgeblockt, mit dem verdünnten Blutserum von Patienten inkubiert und anschließend mit einem Cy5 gekoppelten Ziege- anti-Mensch-Antikörper gefärbt. Anschließend wird sequentiell jeweils ein Mikrolaser nach dem anderen angeschaltet und das von evtl. gebundenen Fluoreszenzmolekülen emitierte Licht mithilfe eines gröberen Rasters von Photodioden über dem Array von Mikrolasern ausgelesen, wobei jeweils die Diode im Intensitätsmaximum des gerade aktiven Anregungslasers ausgeschaltet ist (vgl. Fig. 2). Das von dem Anregungslaser verursachte Streulicht wird zusätzlich durch einen geeigneten Wellenlängenfilter von dem Fluoreszenzlicht abgetrennt.
Um das Signal / Rausch Verhältnis noch weiter zu verbessern, kann der einstrahlende Mikrolaser gepulst werden, wobei die Detektion des Fluoreszenzsignals in den Dunkelphasen des einstrahlenden Lasers erfolgt.
Die Fluoreszenzsignale werden in insgesamt 10 unterschiedliche Helligkeitsstufen unterteilt, die den einzelnen Mikrolasern (d.h. in diesem Fall den unterschiedlichen Pentapeptiden) zugeordnet werden.
Die Mikrolaser, die in einem ersten Durchlauf die höchsten Fluoreszenzsignale ergaben können anschließend mehrfach hintereinander zur Anregung verwendet werden, wonach die dabei erhaltenen Fluoreszenzsignale gemittelt werden.
f) Synthese einer vollständigen 12mer Oligonukleotidbibliothek auf einem Träger mit Hilfe eines Arrays von Mikrolasern
Wie in Beispiel b) für die Synthese einer vollständigen 5mer Peptidbibliothek beschrieben, wird ein geeigneter flacher durchsichtiger Träger mit freien Aminogruppen verwendet.
Falls nicht schon durch den ersten Schritt vorhanden, wird an die freien Aminogruppen mithilfe von dem Fachmann geläufiger Standardynthese unter wasserfreien Bedingungen ein geeigneter Linker synthetisiert, der wiederum freie Aminogruppen auf dem Träger verankert, die diesmal jedoch ca 22 Atome von der Oberfläche entfernt sind.
Anschließend wird der Träger parallel zur X-Achse in 4 voneinander getrennte Bereiche unterteilt, die von 4 verschiedenen aktivierten Nucleosidanhydraten mit Schutzgruppen benetzt werden. Die Nucleoside koppeln anschließend an die freien Aminogruppen (Fig. 3). Anstelle des im basischen abspaltbaren Linkers kann auch ein unter diesen Bedingungen stabiler Linker verwendet werden.
Die Kopplung der aktivierten Nucleoside (mit Schutzgruppen) an den festen Träger, das Abspalten der Schutzgruppen und die Waschschritte finden unter den dem Fachmann bekannten Standardbedingungen für die Oligonukleotidsynthese statt. Beispiele für die dabei verwendeten Schutzgruppen sind:
DMTr für das 5 '-Ende der Nucleoside (Fig. 3) Benzoyl im Falle der Basen Adenin und Cytosin (Fig. 4) Isobutyryl im Falle der Base Guanin (Fig. 4) - Methoxy - oder Betacyanoethyl - im Falle der Phosphatgruppen (Fig. 4)
Nach der Abspaltung der DMTr-Schutzgruppe von dem 5 '-Ende der Nucleoside wird im nächsten Schritt der Träger erneut in 4 voneinander getrennte Bereiche unterteilt, die diesmal parallel zur Y-Achse verlaufen. Diese Bereiche werden diesmal von den 4 verschiedenen, mit Hilfe einer schwachen Säure wie Tetrazol aktivierten Phosphorami- dit-Derivaten benetzt. Durch die Kopplung der aktivierten Phosphoramidite an das freie 5'-OH-Ende findet eine Kettenverlängerung um eine Base statt (Fig. 5).
Im nächsten Schritt werden evtl. verbliebene freie 5'-OH-Enden mit einem "Cap" versehen, sodaß sie an späteren Reaktionen nicht mehr teilnehmen können (Fig. 6).
Ein letzter Schritt, in dem trivalente Phosphatgruppen oxidiert werden beschließt den Synthesezyklus (Fig. 7). Die oben beschriebene Synthese entspricht dem dem Fachmann geläufigen Standard der Oligonukleotidsynthese. Im Unterschied zu der geläufigen Standardsynthese werden allerdings die Oligonukleotide derart auf dem festen Träger verankert, daß sie nach der abschließenden vollständigen Abspaltung der Schutzgruppen nicht von dem Träger abgespalten werden, sondern an den Träger gekoppelt verbleiben.
Anschließend wird die DMTr- Schutzgruppe wiederum mithilfe von TCA vom 5'-OH Ende abgespalten, sodaß sich auf dem oben beschriebenen Träger in diesem Stadium 16 unterteilte voneinander abgegrenzte Bereichebefinden, mit jeweils einem von 16 möglichen über das 3 '-Ende durch einen Spacer an den Träger gekoppelten Dinukleoti- den deren 5'-Ende eine freie OH-Gruppe trägt.
Für die nächsten Kopplungsschritte werden die oben beschriebenen aktivierten Phosphoramidit-Derivate einzeln statt in Acetonitril in einem geeigneten bei 50 °C flüssigen, bei 4 °C festen Lösungsmittel gelöst, ein geeigneter das Laserlicht absorbierender und in Bezug auf die aktivierten Nukleoside inerter Farbstoff, insbesondere Graphitpartikel, zugegeben, die Lösung tiefgefroren und in kleine Partikel zerrieben.
Diese Partikel werden bei 4 - 10 °C auf den über einem Array von Mikrolasern fest montierten Träger gestäubt, eine Abdeckplatte darüber gelegt und ausgewählte Bereiche für 20-30 Minuten mit den Mikrolasern bestrahlt. Die Absorption des Laserlichts durch den beigemengten Farbstoff erwärmt dabei lokal in den bestrahlten Bereichen das bei den gewählten Temperaturen gefrorene Lösungsmittel und ermöglicht damit die Kopplung der aktivierten Phosphoramidit-Derivate an die freien 5'-OH-Enden ausschließlich in diesen Bereichen. Anschließend wird die Abdeckplatte entfernt, und die nicht gekoppelten Phosphoramidit-Derivate werden mit kaltem Acetonitril weggewaschen. Anschließend wird dieser Waschvorgang mit erwärmtem Acetonitril 2x wiederholt. Dieser Vorgang wird insgesamt 4x mit allen aktivierten Phosphoramidit-Derivaten wiederholt, sodaß die oben beschriebenen 16 voneinander abgegrenzten Bereiche in 4 x 16 definierte Bereiche unterteilt werden, gefolgt von dem oben beschriebenen "Capping" verbliebener freier 5'-OH-Enden, der Oxidation der trivalenten Phosphat- gruppen und einer erneuten Abspaltung der DMTrSchutzgruppen mit TCA.
Die Verlängerung der Oligonukleotide um weitere 9 Basen erfolgt anschließend analog zur Synthese der 3. Base, wobei wie oben beschrieben bei jedem Syntheseschritt jeder Bereich in 4 definierte Bereiche unterteilt wird.
Schließlich werden alle Schutzgruppen mit Dichlormethan und Trichloressigsäure abgespalten, der Träger mit Acetonitril gewaschen und getrocknet, sodaß im Endeffekt ein Träger mit 412 = 16.777.216 verschiedenen Bereichen entsteht, die jeweils eines von allen möglichen über das 3 '-Ende gekoppelten 12mer Oligonukleotiden repräsentieren.
g) Untersuchung von Patienten-DNA unter Verwendung eines Arrays von Mikrolasern mit einer auf einem Träger fixierten 12mer Oligonukleotidbibliothek
Der unter Beispiel f) beschriebene Träger mit einer darauf fixierten vollständigen Oligonukleotid-Bibliothek wird mit Patienten-DNA gefärbt. Unspezifische Bindungen werden z.B. mit DNA aus Heringsspermien abgesättigt.
Dem Patienten wird eine Tumor-Gewebsprobe und gleichzeitig eine Probe mit gesundem Gewebe entnommen und die darin enthaltene genomische DNA mithilfe eines oder mehrerer Paare von Tumorgen-spezifischen Primern (spezifisch z.B. für die Gene von p53, pl6, ras, c-myc, n-myc) in einer Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt. Dabei werden FITC-markierte dNTPs in die Tumorprobe eingebaut, bzw. die Normalprobe mit biotinylierten dNTPs markiert, die Proben gemischt und auf den Träger hybridisiert. Anschließend wird die hybridisierte Probe nachgefärbt mit einem chemisch gekoppelten Protein aus Streptavidin und Phycoerythrin an das zusätzlich der Fluoreszenzfarbstoff Cy5 gekoppelt wurde. Dadurch kann mit einer Anregungswellenlänge 2 verschiedene Fluoreszenzen gemessen werden.
Wie in Beispiel e) beschrieben, wird anschließend sequentiell jeweils ein Mikrolaser nach dem anderen angeschaltet und das von evtl. gebundenen Fluoreszenzmolekülen emitierte Licht mithilfe eines gröberen Rasters von Photodioden über dem Array von Mikrolasern ausgelesen, wobei jeweils die Diode im Intensitätsmaximum des gerade aktiven Anregungslasers ausgeschaltet ist. Das von dem Anregungslaser verursachte Streulicht wird zusätzlich durch einen geeigneten Wellenlängenfilter von dem Fluoreszenzlicht abgetrennt. Der Wellenlängenfilter wird dabei einmal auf den Fluoreszenzfarbstoff FITC und zum anderen auf den Tandemfarbstoff Phycorythrin-Cy5 (PE- Cy5) abgestimmt.
Die Fluoreszenzsignale werden dann jeweils in insgesamt 10 unterschiedliche Helligkeitsstufen unterteilt, die den einzelnen Mikrolasern (d.h. in diesem Fall den unterschiedlichen Oligonukleotiden) zugeordnet werden.
Die Mikrolaser, die in einem ersten Durchlauf ein von den anderen Bildpunkten auffällig unterschiedliches Verhältnis der FITC-Färbung zur PE-Cy5-Färbung ergaben, werden anschließend mehrfach hintereinander zur Anregung verwendet, wonach die dabei erhaltenen Fluoreszenzsignale aufsummiert werden und erneut das Verhältnis der FITC-Färbung zur PE-Cy5 -Färbung bestimmt wird.
Auf diese Weise können Punktmutationen in Genen, die für die Prognose von Tumorerkrankungen wichtig sind, diagnostiziert werden. Im Unterschied zu den auf dem Markt befindlichen Systemen können mit einer vollständigen 12mer Oligonukleo- tidbibliothek viele Gene gleichzeitig analysiert werden. In einem alternativen Ansatz dient die dem Patienten entnommene DNA als Template für die Vervielfältigung mit sogenannten Alu-Primern, die an die Ränder von sehr häufig im Genom vorkommenden repetitiven Alu-Sequenzen hybridisieren und die zwischen 2 Alusequenzen liegende nicht- repititive DNA vervielfältigen. Wieder werden FITC-markierte dNTPs in die Tumorprobe bzw. biotinylierte dNTPs in die Normalprobe eingebaut, die Proben gemischt auf den Träger hybridisiert.
Das Auslesen der Fluoreszenzsignale erfolgt anschließend wie oben beschrieben. Auf diese Weise wird das gesamte Genom auf Unterschiede zwischen normalem und Tumorgewebe abgerastert, wodurch neue diagnostische Marker entdeckt werden können, die wichtige Informationen für die Tumorprogression liefern.
h) Kombination des Fluoreszenzdetektors gemäß Beispiel d) mit einem Massenspektrometer
Der Fluoreszenzdetektor gemäß Beispiel d) bzw. nur der CD-Brennerteil ohne zusätzliche Fluoreszenz-Optik wird mit einem evakuierbaren Gefäß umhüllt. An der Stelle des normalen Probenhalters eines Massen spektrometers befindet sich der Brennpunkt des Brennlasers. Der Brennlaser kann beliebige Punkte auf der CD ansteuern und die darauf befindlichen Moleküle wegsprengen, die dann mittels des Massenspektrometers untersucht werden können.
Ein solchermaßen kombiniertes Gerät erlaubt es, die Bindungspartner zu analysieren, die sich bei der Kombination von zwei hochkomplexen Molekülbibliotheken bilden, während es bei den bislang bekannten Techniken nur möglich ist, zwei Molekülbibliotheken miteinander zu kombinieren und zu analysieren, die um mehrere Größenordnungen weniger komplex sind. Statt einem Massenspektrometer kann im übrigen auch eine bewegliche Vorrichtung angebracht werden, mit der Phagen oder DNA von einzelnen Pits der CD zurückgewonnen werden können.
i) Sequenzierung komplexer DNA mittels festphasen-gekoppelter Oligos
Verwendet wird die in Beispiel f) beschriebene vollständige 12mer Oligonukleotidbibliothek. Im Unterschied zu Beispiel f) muß hierbei jedoch die Syntheserichtung "umgedreht" werden, d.h. die analog DMTr abspaltbare Schutzgruppe muß sich am dafür am 3'-OH-Ende befinden, so daß am Ende eine festphasengekoppelte Oligonukleotidbibliothek mit freien 3'-Enden vorliegt. Die Hybridisierungsbedingungen werden dabei so gewählt, daß es - wenn überhaupt - nur zu sehr wenigen Mismatches zwischen den Oligonukleotiden und den daran hybridisierten Templates kommt. Die Komplexität der festphasen-gekoppelten Oligonukleotide sollte die der zu sequenzierenden DNA übertreffen. Nicht hybridisierte cDNA wird weggewaschen. Eine Sequenzreaktion nach Sanger mit vergleichsweise vielen ddNTPs in der Reaktionslösung wird durchgeführt, so daß im Schnitt eine Verlängerung der Oligoprimer um durchschnittlich 20 Nukleotide stattfindet. Danach wird das Template durch Hitze wieder abgelöst. Anschließend wird die Sequenzinformation in dem in Beispiel h) beschriebenen kombinierten CD-Brenner- Massenspektrometer ausgelesen, wobei der Brennlaser ausgewählte, durch die Sequenzreaktion verlängerte Oligonukleotide verdampft, so daß die Sequenzinformation dann mittels des Massenspektrometers detektiert werden kann.
j) Wiederholtes Färben einer großen Anzahl definierter Lymphozyten
Aus dem Blutserum eines Menschen werden mit Standard methoden die Lymphocyten gewonnen und diese mit Standardmethoden (0,37% Paraformaldehyd in PBS) fixiert. Ca. 108 solcherart fixierter Lymphocyten werden auf der Oberfläche einer CD oder eine Fluorescence Multilayer Disc (FMD) verteilt und dort auf der Oberfläche fixiert. Die FMD oder CD wird anschließend in eine dicht schließende Gummimanschette gelegt und unspezifische Bindungen mit 5 % Milchpulver in PBS blockiert.
Etwa 150 unterschiedliche monoklonale Antikörper werden einzeln mit Fluoreszenzmarkierungen konjugiert, darunter z. B. Phycoerythrin, EGFP, EBFP, EYFP, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7. Optional können daher vorher die entsprechenden Fab-Fragmente hergestellt werden. Kennzeichen der konjungierten monoklonalen Antikörper ist, dass sie unterschiedliche Oberflächenantigene menschlicher Lymphocyten erkennen, darunter CD-Antigene, Rezeptoren für Wachstumshormone, Apoptose-assoziierte Proteine und homing-Rezeptoren .
Die auf der FMD oder CD fixierten Lymphocyten werden anschließend mit den Fluoreszenz- markierten monoklonalen Antikörpern inkubiert (60 Minuten bei 37 °C in 5 % Milchpulver in PBS und 0,5 % Tween 20). Für eine Färberation der fixierten Lymphocyten werden dabei vorzugsweise jeweils 2 bis 5 mit unterschiedlichen Fluoreszenzen konjugierte Antikörper verwendet. Nachdem ungebundene Antikörper durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt wurden, wird die CD oder FMD in ein im wesentlichen handelübliches CD oder FMD-Laufwerk eingelegt und abgespielt. Dabei wird die Abspielzeit aufgrund der integrierten Positionsmarkierungen (wiederholbar und ansteuerbar) in > 108 unterschiedliche Zeiteinheiten unterteilt. Während jeder dieser Zeiteinheiten erfaßt der zum Abtasten verwendete Laserstrahl eventuell auf der Oberfläche befindliche fluoreszierende Moleküle (d.h., die Lymphocyten bindende Antikörper). Das Fluoreszenzlicht wird in verschiedene Farbanteile zerlegt und vorzugsweise nach dem Prinzip des konfokalen Lasermikroskops erfaßt. Jeder Zeiteinheit wird somit (u. U. wiederholbar) eine Fluoreszenzintensität zugeordnet und abgespeichert, vozugsweise mehrere unterschiedliche Fluoreszenzen gleichzeitig.
Anschließend wird die FMD oder CD entnommen, die darauf befindlichen Fluoreszenzen durch die Bestrahlung mit sehr intensivem Licht ausgebleicht und wie oben beschrieben erneut mit weiteren Fluoreszenz-markierten Antikörpern gefärbt. Wie beschrieben werden erneut die Fluoreszenzintensitäten den (gleich gebliebenen) Zeiteinheiten zugeordnet. Eine mehrmalige Wiederholung dieses Vorgangs ordnet jeder Zeiteinheit bis zum 150 verschiedene, den genannten monoklonalen Antikörpern entsprechende Signalintensitäten zu.
Die einer Zeiteinheit zugeordneten Signalintensitäten werden unterschiedlichen Zellkategorien zugeordnet und die Zahl der jeweiligen Zellkategorien bestimmt (CD3 ist z. B. charakteristisch für einen T-Lymphocyten, CD4 definiert T-Helferzellen, CD8 cytotoxische T-Zellen, CD 19 ist charakteristisch für B-Lymphocyten eines definierten Differenzierungsstadiums usw.).
k) Diagnose von Lymphocyten
Die in Beispiel j) beschriebene Färbung von Lymphocyten wird mit den Blutzellen von klinisch unauffälligen Patienten durchgeführt. Die dabei erhaltenen Signalmuster werden mit den Signalmustern verglichen, die bei der Färbung der Blutzellen von Patienten mit diagnostizierten Morbus Crohn, Herzinfarkt, Parkinson, multipler Sklerorse, Lymphone, insbesondere präklinische Lymphone oder systemischem Lupus erytherma- todes erhalten werden.
Bezugszeichenliste
1 unbenutzt
2 an den Träger gekoppelte Moleküle
3 Matrixschicht 4 Aggregate, die an an den Träger gekoppelte Moleküle binden
5 Substanzen
6 elektromagnetische Wellen
7 lokal engbegrenzter, ausgewählter Bereich
8 andere Moleküle, die mit an den Träger gekoppelten Molekülen (2), oder die mit Aggregaten an diese Moleküle (4) in Wechselwirkung treten
9 immobilisierte Substanzen
10 Oberseite
11 beweglich gemachte Substanzen
12 Träger 13 elektromagnetische Wellen oder angelegte Spannung
14 Moleküle
15 unterschiedliche Substanzen
16 Achse
17 Mischarray 18 Bewegungspfeil
19 Quellen elektromagnetischer Strahlung
20 Pit
21 Isolator
22 Bewegungspfeil 23 Array von einzeln ansteuerbaren Detektoren
24 Fokussierlinse
25 größerer Bereich, der mehrere ausgewählte Bereiche (7) umfaßt
26 Laserstrahlen Detektor Detektor Leuchtdiode, die gleichzeitig als Detektor verwendet werden kann Linse emittierte Lichtstrahlen Array von Mikrolasern Mikrolaser Mikrolaser Oberseite eines Trägers Träger Moleküle/-gruppe Moleküle/-gruppe Array von Detektoren Detektor Detektor Wellenlängenfilter Anregungsstrahlung (Strahlung eines Miroklasers) Lumineszenzstrahlung

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Erfassung optischer Eigenschaften, insbesondere von Lumineszenz-Reaktionen und Brechungsverhalten, von auf einem Träger direkt oder indirekt gebundenen Molekülen, wobei elektromagnetische Wellen, insbesondere Laserlicht, auf den Träger eingestrahlt und von den Molekülen emitiertes oder gebrochenes Licht von einem Detektor erfasst wird und wobei Detektor und Träger während oder nach dem Einstrahlen der elektromagnetischen Wellen relativ zueinander bewegt werden, dadurch gekennzeichnet, daß ein Träger, insbesondere ein transparenter Träger mit integrierten und von einem Detektor, insbesondere einem optoelektronischen Abtastsystem, erfassbaren Positionsmarkierungen verwendet wird und daß wenigstens eine der integrierten Positionsmarkierungen während oder nach der Relativbewegung von Träger und Detektor ausgelesen wird, sodaß eine Zuordnung des von dem Detektor erfassten Lichts zu einem Ort auf dem Träger möglich wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Relativbewegung von Träger und Detektor durch Drehen des Trägers erzeugt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger eine entsprechend modifizierte, insbesondere transparent ausgebildete, hinsichtlich der Positionsmarkierungen jedoch handelsüblich gestaltete Compact Disc (CD), Digital Versatile Disc (DVD), Magneto Optical Disc (MOD) oder
Fluorescence Multilayer Disc (FMD) verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Träger verwendet wird, auf dem zumindest ein Element der Gruppe bestehend aus Molekülbibliothek, Zellen, Zellfragmenten, adhärent auf dem Träger gewachsenen Zellen oder Zellfragmenten, Geweben, Gewebeschnitte, durch Einbettung in eine gelartige Matrix, insbesondere Agar, Agarose, Polyacrylamid oder Gelantine, die auf dem Träger befestigt ist, befestigte Zellen oder Gewebestücke, aufgebracht ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Eigenschaften an einem bestimmten Ort auf dem Träger wiederholt gemessen werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Austausch oder eine Modifikation der Moleküle, deren optische Eigenschaften erfaßt werden sollen, an jedem Ort auf dem Träger erfolgen kann und insbesondere nach dem Austausch der Moleküle oder der Modifikation der
Moleküle erneut gemessen werden kann.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Vorgang des Austausches oder der Modifikation von Molekülen, deren optische Eigenschaften erfaßt werden sollen, beliebig oft wiederholt werden kann.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein charakteristisches Profil für einen bestimmten Ort des auf dem Träger aufgebrachten Materials, insbesondere Zellen oder histologische Schnitte, erstellt werden kann.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Eigenschaften von mehreren verschiedenen Molekülen an einem betimmten Ort gleichzeitig gemessen werden können.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das ausgewählte Moleküle oder die die ausgewählten Moleküle tragenden biologischen Strukturen, insbesondere Liposomen, Viruspartikel, Retroviren, Bakterio- vagen, Viroide, Zellfragmente, insbesondere B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, Leukozyten, Parasiten, Einzeller oder Bakterien, von dem Träger insbesondere durch Einstrahlung elektromagnetischer Wellen, insbesondere Laserlicht, abgelöst und einem Verfahren zur Erfassung weiterer, nicht notwendigerweise optischer Eigenschaften zugeführt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Ablösung der ausgewählten Moleküle oder der die ausgewählten Moleküle tragenden biologischen Strukturen durch Wechselwirkung der elektromagnetischen Wellen mit einer zwischen dem Träger und den Molekülen bzw. den biologischen Strukturen vorgesehenen, vorzugsweise aufschmelzbaren oder photosensitiven
Substanzen erfolgt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , wobei optische Eigenschaften der Moleküle durch Aufbringen eines an die Moleküle oder die Moleküle gegebenenfalls tragende biologische Strukturen koppelnden Farbstoffes erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiterer Farbstoff auf den Träger aufgebracht wird und das eine Änderung der optischen Eigenschaften der Moleküle durch Fluorescenc- Energietransfer von einem zum anderen Farbstoff erfolgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Träger gedreht wird, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Eigenschaften biologischen Strukturen, insbesondere von Molekülen, Zellfragmenten oder Zellen, oder sie gebundenen Farbstoffen ermittelt werden, nachdem eine Wanderung der biologischen Strukturen oder der Fluoreszenzfarbstoffe entlang einer im wesentlichen zu der Achse der Rotation des Trägers radialen Richtung erfolgt ist.
14. Vorrichtung zur Erfassung optischer Eigenschaften, insbesondere von Lumineszenz-Reaktionen und Brechungsverhalten, von auf einem Träger direkt oder indirekt gebundenen Molekülen, mit Mitteln zum Einstrahlen elektomagnetischer Wellen, insbesondere von Laserlicht auf den Träger und einem Detektor zum Erfassen von von den Molekülen emitiertem oder gebrochenem Licht sowie Mitteln zum Erzeugen einer Relativbewegung von Detektor und Träger während oder nach dem Einstrahlen elektromagnetischer Wellen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Detektor, insbesondere ein optoelektronisches Abtastsystem zur Erfassung von in dem Träger integrierten Positionsmarkierungen vorgesehen ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das optoelek- tronische Abtastsystem ein Positionserfassungssystem eines CD-, MOD-,DVD- oder FMD-Laufwerks ist.
16. Träger zur Verwendung bei einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13.
17. Täger nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger eine vorzugsweise transparent ausgebildete, hinsichtlich der Positionsmarkierungen jedoch im wesentlichen handelsübliche CD, DVD, MOD oder FMD ist.
18. Träger nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß auf ihm eine Molekülbibliothek, vorzugsweise adhärent gewachsene Zellen oder Zellfragmente, Gewebe oder Gewebeschnitte aufgebracht oder durch Einbettung in eine auf dem Träger befestigte gelartige Matrix, insbesondere Agar, Agarose,
Polyacrylamid oder Gelantine eingebettet sind.
20. Träger nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den zu untersuchenden Molekülen und dem eigentlichen Trägerkörper eine Beschichtung mit aufschmelzbaren und/oder photosensitiven Substanzen vorgesehen ist.
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