DE69938579T2

DE69938579T2 - Extrazelluläre Matrixproteine mit modifizierten Aminosäuren

Info

Publication number: DE69938579T2
Application number: DE69938579T
Authority: DE
Inventors: Elliott A. Killingworth Gruskin; Douglas D. Wallingford Buechter; Guanghui Guilford Zhang; Kevin Los Angeles Connolly
Original assignee: United States Surgical Corp
Current assignee: United States Surgical Corp
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-07
Publication date: 2009-06-04
Anticipated expiration: 2019-10-08
Also published as: EP1914311A1; US6958223B2; US20040086961A1; ES2303364T3; CA2639620A1; DE69938579D1; EP0992586B1; CA2639637A1; US20050196830A1; CA2284397C; EP0992586A3; CA2639757A1; CA2284397A1; US6492508B1; EP0992586A2

Description

Hintergrund
1. Technisches Gebiet
Technisch hergestellte Polypeptide und chimäre Polypeptide mit eingebauten Aminosäuren, die die Eigenschaften dieser Polypeptide verbessern oder in anderer Weise modifizieren.
2. Beschreibung im Zusammenhang stehender Techniken
Die Gentechnik ermöglicht die Herstellung von Polypeptiden, die von einem Organismus in einen anderen überführt werden. Wenn dies getan wird, wird ein Teil des Produktionsapparats, der dem ursprünglichen Wirt eigen ist, in einen Empfänger überführt. Häufig hat der ursprüngliche Wirt im Zusammenhang mit der Polypeptidherstellung einige einzigartige Prozessierungswege hervorgebracht, die in dem Empfänger nicht enthalten sind oder überführt wurden. Beispielsweise ist allseits bekannt, daß Säugerzellen eine komplexe Anordnung posttranslationaler Enzymsysteme enthalten, die Proteinprodukten dieser Systeme einzigartige Eigenschaften verleihen. Wenn ein Gen, das ein Protein codiert, normalerweise in Säugerzellen hergestellt wird, in eine bakterielle oder Hefezelle überführt wird, kann das Protein nicht einer derartigen posttranslationalen Modifizierung unterworfen werden, und das Protein kann nicht so funktionieren, wie ursprünglich beabsichtigt.
Normalerweise schließt der Prozeß der Polypeptid- oder Proteinsynthese in lebenden Zellen die Transkription von DNA in RNA und die Translation von RNA in Protein ein. Drei Formen von RNA sind an der Proteinsynthese beteiligt: Messenger-RNA (mRNA), welche die genetische Information zu den Ribosomen trägt, welche aus ribosomaler RNA (rRNA) bestehen, während die Transfer-RNA (tRNA) freie Aminosäuren in dem Pool einer Zelle verbindet. Aminosäuren/tRNA-Komplexe reihen sich neben den Codons der mRNA auf, wobei die tatsächliche Erkennung und die Bindung durch die tRNA vermittelt wird. Zellen können bis zu 20 Aminosäuren enthalten, die in Sequenzen mit verschiedenen Abfolgen in Proteinen kombiniert und eingebaut werden. Jede Aminosäure ist von den anderen 19 Aminosäuren verschieden und wird durch Enzyme, die als Aminoacyl-tRNA-Synthetasen bekannt sind, mit der tRNA beladen. Nach einer allgemeinen Regel sind Aminosäure/tRNA-Komplexe ziemlich spezifisch und normalerweise wird auf ein Molekül mit einer exakten stereochemischen Konfiguration nur durch eine besondere Aminoacyl-tRNA-Synthetase eingewirkt.
In vielen lebenden Zellen werden einige Aminosäuren von der umliegenden Umgebung aufgenommen, und einige werden innerhalb der Zelle aus Vorläufern synthetisiert, welche wiederum von außerhalb der Zelle assimiliert worden sind. Unter einigen Umständen ist eine Zelle auxotroph, d. h. sie benötigt eine spezifische Wachstumssubstanz neben dem Minimum, das für den normalen Metabolismus und Reproduktion benötigt wird, welche sie aus der umliegenden Umgebung gewinnen muß. Einige Auxotrophe hängen von der externen Umgebung an, einige Aminosäuren verabreicht zu bekommen. Dieses Merkmal ermöglicht ein Aminosäure-Analogon in Proteine, die von Auxotrophen hergestellt werden, eingebaut zu werden, indem von den relativ seltenen Ausnahmen der oben erwähnten Regel hinsichtlich der stereochemischen Spezifität von Aminoacyl-tRNA-Synthetasen profitiert wird. Beispielsweise ist Prolin eine derartige Ausnahme, d. h. die auf die Aminosäure einwirkenden Enzyme, die für die Synthese des Prolyl-tRNA-Komplex verantwortlich sind, sind nicht so spezifisch wie andere. Infolgedessen sind einige Prolin-Analoga in bakterielle, pflanzliche und Tierzellsysteme eingebaut worden. Siehe Tan et al., Proline Analogues Inhibit Human Skin Fibroblast Growth and Kollagen Produktion in Culture, Journal of Investigative Dermatology, 80: 261–267 (1983).
Ein Verfahren zum Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren in Proteine wird beispielsweise in Noren et al., A General Method For Site-Specific Incorporation of Unnatural Amino Acids Into Proteins, Science, Bd. 244, S. 182–188 (1989) beschrieben, wobei chemisch acylierte Suppressor-tRNA verwendet wird, um eine Aminosäure infolge eines Stopp-Codons einzubauen, der ein Codon substituiert, der einen Rest von Interesse codiert. Siehe ebenfalls Dougherty et al., Synthesis of a Genetically Engineered Repetitive Polypeptide Containing Periodic Selenomethionin Residues, Macromelecules, Bd. 26, Nr. 7. S. 1779–1871 (1993), welche das Unterwerfen von Methionin-auxotrophen E. coli gegenüber einem Selenomethionin-haltigen Medium beschreibt, und auf der Grundlage experimenteller Daten beschreibt, daß Selenomethionin Methionin vollständig in allen durch die Zelle hergestellten Proteinen ersetzen kann.
cis-Hydroxy-L-prolin ist verwendet worden, um dessen Auswirkungen auf Kollagen durch Einbau in eukaryontische Zellen, wie beispielsweise kultivierte normale Hautfibroblasten (siehe Tan et al., oben) und in Sehnenzellen aus Hühnerembryonen (siehe z. B. Uitto et al., Prokollagen Polypeptides Containing cis-4-Hydroxy-L-prolin are Overglycosylated and Secreted as Nonheclical Pro-γ-Chains, Archives of Biochemistry and Biophysics, 182: 1: 214–221 (1978)) zu untersuchen. Jedoch haben Forscher herausgefunden, daß trans-4-Hydroxyprolin sich nicht mit der Prolin- spezifischen tRNA prokaryontischer E. coli verbindet. Siehe Papas et al., Analysis of the Amino Acid Binding to the Prolin Transfer Ribonucleic Acid Synthetase of Escherichia coli, Journal of Biological Chemistry, 245: 7: 1588–1595 (1970). Ein weiterer nicht erfolgreicher Versuch, trans-4-Hydroxyprolin in Prokaryonten einzubauen, wird von Deming et al. beschrieben. In Vitro Incorporation of Proline Analogs into Artificial Proteins, Poly. Mater. Sci. Engin. Proceed., Bd. 71, S. 673–674 (1994). Deming et al. berichten über die Überwachung des Potentials zum Einbau bestimmter Prolin-Analoga, d. h. L-Azetidin-2-carbonsäure, L-γ-Thiaprolin, 3,4-Dihydroprolin und L-trans-4-Hydroxyprolin, in künstliche Proteine, die in E. coli-Zellen exprimiert werden. Nur L-Azetidin-2-carbonsäure, L-γ-Thioprolin und 3,4-Dehydroprolin werden als in Proteine in E. coli in vivo eingebaut, beschrieben.
Extrazelluläre Matrix-Proteine ("EMPs") werden in den Räumen um und nahe den Zellen multizellulärere Organismen gefunden und sind typischerweise fibröse Proteine zweier funktionaler Typen: hauptsächlich strukturell, z. B. Kollagen und Elastin und hauptsächlich adhäsiv, z. B. Fibronektin und Laminin. Kollagene sind eine Familie fibröser Proteine, die typischerweise von Bindegewebszellen sezerniert werden. 20 verschiedene Kollagen-Ketten sind identifiziert worden, die sich aus insgesamt ungefähr 10 verschiedenen Kollagen-Molekülen zusammenbauen. Eine allgemeine Diskussion von Kollagen wird von Alberts et al., The Cell, Garland Publishing, S. 802–823 (1989) bereitgestellt. Andere fibröse oder filamentöse Proteine schließen Typ I IF-Proteine, z. B. Keratine; Typ II-IF-Proteine, z. B. Vimentin, Desmin und gliales fibrilläres saures Protein; Typ III IF-Proteine, z. B. Neurofilament-Proteine; und Typ IV IF-Proteine, z. B. nukleare Laminine ein.
Typ I-Kollagen ist die häufigste Form der fibrillären, interstitiellen Kollagene und ist der Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix. Kollagen-Monomere bestehen aus ungefähr 1000 Aminosäureresten in einer sich wiederholenden Anordnung aus Gly-X-Y-Tripletts. Ungefähr 35% der X- und Y-Positionen werden durch Prolin und trans-4-Hydroxyprolin besetzt. Kollagen-Monomere verbinden sich in Dreifach-Helices, die aus einer α2- und zwei α1-Ketten bestehen. Die Dreifach-Helices verbinden sich in Fribrillen, die in festen Bündeln angeordnet sind. Bündel aus Kollagen-Fibrillen sind ferner so angeordnet, daß sie ein Gerüst für die extrazelluläre Matrix bilden.
In Säugerzellen hat die posttranslationale Modifizierung von Kollagen an den endgültigen chemischen und physikalischen Eigenschaften teil und schließt den proteolytischen Verdau von Pro-Regionen, die Hydroxylierung von Lysin und Prolin und die Glycosylierung hydroxylierten Lysins ein. Der proteolytische Verdau von Kollagen schließt das Abspalten der Pro-Region der N- und C-Termini ein. Es ist bekannt, daß die Hydroxylierung von Prolin für die mechanischen Eigenschaften von Kollagen wesentlich ist. Kollagen mit niedrigem Gehalt an 4-Hydroxyprolin hat schlechte mechanische Eigenschaften, wie durch die Folgen, die mit Skorbut verbunden sind, hervorgehoben wird. 4-Hydroxyprolin verleiht der Dreifachhelix durch eine Wasserstoffbindung und durch die Beschränkung der Rotation der C-N-Bindungen in dem Polypeptid-Rückgrat Stabilität. In Abwesenheit einer stabilen Struktur haben natürlich auftretende zelluläre Enzyme daran teil, das Kollagen-Polypeptid zu degradieren.
Die strukturellen Eigenschaften von Typ I-Kollagen zusammen mit dessen allgemein wahrgenommener Biokompatibilität machen es zu einem beliebten chirurgischen Implantatmaterial. Kollagen wird aus Rinderhaut oder -sehnen gereinigt und verwendet, um eine Vielzahl medizinischer Hilfsmittel zu modellieren, einschließlich Hämostaten, implantierbare Gele, Medikamentenverabreichungsvehikel und Knochenersatz. Wenn es jedoch in Menschen implantiert wird, kann Rinderkollagen akute und verzögerte Immunreaktionen verursachen.
Infolgedessen haben Forscher versucht, menschliches rekombinantes Kollagen mit allen seinen strukturellen Eigenschaften mit Hilfe der Gentechnik in kommerziellen Mengen herzustellen. Unglücklicherweise war die Produktion von Kollagen durch kommerzielle Massenproduzenten von Proteinen, wie beispielsweise E. coli, nicht erfolgreich. Ein Hauptproblem liegt darin, daß die umfangreiche posttranslationale Modifizierung von Kollagen durch Enzyme erfolgt, die in E. coli nicht vorhanden sind. Da E. coli-Zellen es nicht schaffen, eine Prolinhydroxylierung nicht-hydroxylierten Kollagens bereitzustellen, verhindert die Herstellung strukturell einwandfreien Kollagen in kommerziellen Mengen.
Ein weiteres Problem bei dem Versuch E. coli zu verwenden, um menschliches Kollagen herzustellen liegt darin, daß E. coli bestimmte Codons bei der Herstellung von Polypeptiden bevorzugen. Obwohl der genetische Code sowohl in prokaryontischen und eukaryontischen Organismen identisch ist, variiert der jeweilige Codon (von den mehreren, die für die meisten Aminosäuren möglich sind), welcher am häufigsten verwendet wird zwischen Prokaryonten und Eukaryonten beachtlich. Siehe K.-N. Wada, Y. Wada, F. Ishibashi, T. Gojobori und T. Ikemura. Nucleic Acids Res. 20. Supplement: 2111–2118, 1992. Die effiziente Expression heterologer (z. B. Säuger-)Gene in Prokaryonten, wie beispielsweise E. coli, kann durch das Vorhandensein von Codons in dem Gen, die von E. coli selten verwendet werden, negativ beeinflußt werden, und die Expressionsniveaus des heterologen Proteins steigen häufig an, wenn seltene Codons durch häufigere Codons ausgetauscht werden. Siehe z. B. D. P. Williams, D. Regier, D. Akiyoshi, F. Genbauffe und J. R. Murphy. Nucleic Acids Res. 16: 10453–10467, 1988 und J.-O. Höög, H. v. Bahr-Lindström, H. Jörnvall und A. Holmgren. Gene 43: 13–21, 1986. Man vermutet, daß dieses Phänomen mindestens teilweise mit der Beobachtung zusammenhängt, daß eine geringere Häufigkeit des Auftretens eines besonderen Codons mit einer geringen zellulären Konzentration der Transfer-RNA für diesen Codon zusammenhängt. Siehe T. J. Ikemura, Mol. Biol. 158: 573–597, 1982 und T: J. Ikemura, Mol. Biol. 146: 1–21, 1–81. So kann die zelluläre tRNA-Konzentration die Translationsrate des Codons limitieren, und dadurch die Gesamttranslationsrate des Proteins vollständiger Länge beeinflussen. Siehe T. J. Ikemura, Biol. 146: 1–21, 1981, F. Bonekamp und F. K. Jensen. Nucleic Acids Res. 16: 3013–3024, 1988; R. Misra und P. Reeves, Eur. J. Biochem. 152: 151–155, 1985; und L. E. Post, G. D. Strycharz, M. Nomura, H. Lewis und P. P. Lewis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1697–1701, 1979. Als Stütze dieser Hypothese dient die Beobachtung, daß Gene für häufige E. coli-Proteine allgemein eine Neigung zu gewöhnlich verwendeten Codons zeigen, welche häufige tRNAs darstellen. Siehe T. J. Ikemura, Mol. Biol. 146: 1–21, 1981: F. Bonekamp und F. K. Jensen, Nucleic Acids Res. 16: 3013–3024, 1988; R. Misra und P. Reeves, Eur. J. Biochem. 152: 151–155, 1985; und L. E. Post, G. D. Strycharz, M. Nomura, H. Lewis und P. P. Lewis, Proc. Natl. Acad. Sci USA 76: 1697–1701, 1979. Zusätzlich zur Codonhäufigkeit kann auch das Codonumfeld (d. h. die umliegenden Nukleotide) die Expression beeinflussen.
Obwohl es scheinen sollte, daß die Substituierung bevorzugter Codons für seltene Codons die Expression heterologer Proteine in Wirtsorganismen den Erwartungen nach steigern sollte, ist dies nicht der Fall. Tatsächlich "ist es nicht möglich gewesen, allgemeine und unzweideutige Regeln zu formulieren, um vorherzusagen, ob der Gehalt an selten verwendeten Codons in einem spezifischen Gen gegenteilig die Effizienz dessen Expression in E. coli beeinflussen kann". Siehe Seite 524 von S. C. Makrides (1996), Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli. Microbiological Reviews 60, 512–538. So wurden beispielsweise in einem Fall zahlreiche Genfusionen zwischen dem Hefe-α-Faktor und Somatomedin C gemacht, die nur in der codierenden Sequenz verschieden waren. In diesen Experimenten wurden keine Korrelation zwischen der Neigung der Codons und den Expressionsniveaus in E. coli gefunden. J. F. Ernst und E. Kawashima (10988), J. Biotechnology, 7, 1–10. In einem anderen Fall wurde gezeigt, daß trotz der größeren Häufigkeit optimaler Codons in einem synthetischen β-Globin-Gen, verglichen mit der nativen Sequenz, kein Unterschied in der Protein-Expression bei diesen zwei Konstrukten gefunden wurde, wenn sie hinter dem T7-Promotor plaziert wurden. Hernan et al. (1992), Biochemistry, 31, 8619–8628. Andererseits gibt es viele Beispiele für Proteine mit relativ hohem Prozentsatz seltener Codons, die gut in E. coli exprimiert werden. Eine Tabelle, die einige dieser Beispiele auflistet und eine allgemeine Diskussion kann in A. J. Makoff et al. (1989), Nucleic Acids Research, 17, 10191–10202 gefunden werden. In einem Fall hat sogar die Einschleusung nicht-optimaler, seltener Arginin-Codons am 3'-Ende eines Gens die Ausbeute des exprimierten Proteins erhöht. Y. G. Gursky und R. Sh. Beabealashvilli, Gene 148, 15–21.
Wenn man es nicht schafft posttranslationale Modifizierungen, wie eine Hydroxylierung von Prolin bereitzustellen, kann das Vorhandensein von seltenen Codons für E. coli im menschlichen Kollagen an den Schwierigkeiten teilhaben, die bei der Expression menschlicher Kollagen-Gene in E. coli vorgefunden werden.
Zusammenfassung
Ein Verfahren zum Einbau eines Aminosäure-Analogons in ein Polypeptid, das von einer Zelle hergestellt wird, wird bereitgestellt, welches das Bereitstellen einer Zelle einschließt, die aus der Gruppe der prokaryontischen Zellen und eukaryontischen Zellen besteht, wobei hypertones Wachstumsmedium verwendet wird, das mindestens ein Aminosäure-Analogon enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus trans-4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyprolin und Kombinationen daraus besteht, und das Inkontaktbringen der Zelle mit dem Wachstumsmedium, wobei das mindestens eine Aminosäure-Analogon in der Zelle assimiliert wird und in mindestens ein Polypeptid eingebaut wird.
Die internationale PTC-Anmeldung WO 97/38710 beschäftigt sich mit der Synthese menschlichen Prokollagens und der Kollagene in rekombinanten DNA-Systemen. Die europäische Patentanmeldung EP 0 704 532 A2 beschäftigt sich mit rekombinanten chimären Proteinen und Verfahren hierfür. M. Haardt et al., Mol. Gen. Genet. (1995) 246: 783–786 beschäftigt sich mit osmoprotektivem Prolinbetain als Hauptsubstrat für das Bindungsprotein-abhängige Transportsystem ProU von Escherichia coli K-12.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren der Substituierung eines Aminosäure-Analogons einer Aminosäure in einem Polypeptid, das in einer Zelle hergestellt wird, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer prokaryontischen Zelle und eukaryontischen Zelle besteht, welches das Bereitstellen einer Zelle einschließt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer prokaryontischen Zelle und einer eukaryontischen Zell besteht, das Bereitstellen eines hypertonen Wachstumsmediums, das mindestens ein Aminosäure-Analogon enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus trans-f-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyprolin und Kombinationen daraus besteht, und das Inkontaktbringen der Zelle mit dem Wachstumsmedium, wobei das mindestens eine Aminosäure-Analogon in die Zelle assimiliert wird und als Substituent für mindestens eine natürlich auftretende Aminosäure in mindestens einem Polypeptid eingebaut wird.
Ein Verfahren zum Kontrollieren der Menge des in ein Polypeptid eingebauten Aminosäuresequenzanalogons wird ebenfalls bereitgestellt, welches das Bereitstellen mindestens einer ersten Zelle einschließt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer prokaryontischen Zelle und einer eukaryontischen Zelle besteht, das Bereitstellen eines ersten hypertonen Wachstumsmediums, das eine erste vorherbestimmte Menge mindestens eines Aminosäure-Analogons enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus trans-4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyprolin und Kombinationen daraus besteht, und das Kontaktieren der ersten Zelle mit dem ersten Wachstumsmedium, wobei eine erste Menge eines Aminosäure-Analogons in die erste Zelle assimiliert wird und in mindestens ein Polypeptid eingebaut wird. Mindestens eine zweite Zelle, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer prokaryontischen Zelle und einer eukaryontischen Zelle besteht, wird ebenfalls zusammen mit einem zweiten hypertonen Wachstumsmedium bereitgestellt, welches mindestens eine zweite vorherbestimmte Menge eines Aminosäure-Analogons enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus trans-4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyprolin und Kombinationen daraus besteht, und die mindestens zweite Zelle wird mit dem zweiten Wachstumsmedium in Kontakt gebracht, wobei eine zweite Menge eines Aminosäure-Analogons durch die zweite Zelle assimiliert wird und in mindestens ein Polypeptid eingebaut wird.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zum Erhöhen der Stabilität eines rekombinanten Polypeptids, das von einer Zelle hergestellt wird, welches das Bereitstellen einer Zelle einschließt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer prokaryontischen und einer eukaryontischen Zelle besteht, und das Bereitstellen eines hypertonen Wachstumsmediums, das ein Aminosäure-Analogon enthält, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus trans-4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyprolin und Kombinationen daraus besteht und das Inkontaktbringen der Zelle mit dem Wachstumsmedium, wobei das Aminosäure-Analogon durch die Zelle assimiliert wird und in ein rekombinantes Polypeptid eingebaut wird, wodurch das Polypeptid stabilisiert wird.
Ein Verfahren zur Erhöhung der Aufnahme eines Aminosäure-Analogons durch eine Zelle und die Verursachung der Bildung eines Aminosäuresequenzanalogons/tRNA-Komplexes wird ebenfalls bereitgestellt, welches das Bereitstellen einer Zelle einschließt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer prokaryontischen und einer eukaryontischen Zelle besteht, das Bereitstellen eines hypertonen Wachstumsmediums, das ein Aminosäure-Analogon enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus trans-4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyprolin und Kombinationen daraus besteht, und das Kontaktieren der Zelle mit dem hypertonen Wachstumsmedium, wobei das Aminosäure-Analogon durch die Zelle assimiliert wird und in einen Aminosäure-Analogon/tRNA-Komplex eingebaut wird. In irgendeiner der oben erwähnten Verfahren kann ein hypertones Wachstumsmedium gegebenenfalls eingebaut werden, um die Aufnahme eines Aminosäure-Analogons in eine Zelle zu erhöhen.
Eine Zusammensetzung wird beschrieben, die eine Zelle einschließt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer prokaryontischen Zelle und einer eukaryontischen Zelle besteht, und ein hypertones Medium einschließlich eines Aminosäure-Analogons, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus trans-4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyprolin und Kombinationen daraus besteht.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrix-Proteins (EMP) oder eines Fragments davon, das in der Lage ist, ein Selbstaggregat in einer Zelle bereitzustellen, welche gewöhnlicherweise Prolin nicht hydroxyliert, welches das Bereitstellen einer Nukleinsäuresequenz einschließt, die das EMP oder ein Fragment davon codiert, welches hinsichtlich der Expression in der Zelle durch Substituierung von durch die Zelle bevorzugte Codons für natürlicherweise vorkommende Codons, die von der Zelle nicht bevorzugt werden, optimiert worden ist, das Einbauen der Nukleinsäuresequenz in der Zelle, das Bereitstellen eines hypertonen Wachstumsmediums, das mindestens eine Aminosäure enthält, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus trans-4-Hydroxyprolin und 3-Hydroxyprolin besteht, und das Kontaktieren der Zelle mit dem Wachstumsmedium, wobei die mindestens eine Aminosäure durch die Zelle assimiliert wird und in das EMP oder Fragment davon eingebaut wird.
Eine Nukleinsäure, die ein chimäres Protein codiert, wird beschrieben, welches eine Domäne einschließt, die aus einem physiologisch aktiven Peptid stammt, und eine Domäne eines extrazellulären Matrixproteins (EMP), welches in der Lage ist, selbst zu aggregieren. Die Nukleinsäure kann in einen Klonierungsvektor eingebaut werden, welcher dann in die Zelle eingebaut werden kann.
Ebenfalls beschrieben ist ein chimäres Protein, das eine Domäne eines physiologisch aktiven Peptids und eine Domäne eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) einschließt, welches in der Lage ist, ein Selbstaggregat bereitzustellen.
Ebenfalls beschrieben ist menschliches Kollagen, das von einer prokaryontischen Zelle hergestellt wird, wobei das menschliche Kollagen in der Lage ist, ein Selbstaggregat bereitzustellen.
Ebenfalls beschrieben wird eine Nukleinsäure, welche ein menschliches extrazelluläres Matrixprotein (EMP) codiert, wobei die Codonverwendung in der Nukleinsäuresequenz die bevorzugte Codonverwendung in einer prokaryontischen Zelle widerspiegelt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Plasmidkarte, die pMAL-c2 darstellt.
2 ist eine graphische Darstellung der Konzentration des intrazellulären Hydroxyprolins, auf Grundlage der Konzentration von trans-4-Hydroxyprolin in einer Wachstumskultur über die Zeit.
2A ist eine graphische Darstellung der Konzentration des intrazellulären Hydroxyprolins als Funktion der Natriumchlorid-Konzentration.
3A und 3B spiegeln die DNA-Sequenz wider, welche menschliches Typ 1 (α₁)-Kollagen codiert (SEQ ID NO: 1).
4 ist eine Plasmidkarte, die pHuCol darstellt.
5 stellt eine DNA-Sequenz dar, welche ein Fragment des menschlichen Typ 1 (α₁)-Kollagens codiert (SEQ ID NO: 2).
6 ist eine Plasmidkarte, die pHuCol-Fl darstellt.
7 gibt eine DNA-Sequenz wider, welche ein Kollagen-artiges Peptid codiert, wobei die Region die für das Kollagen-Gen-artige Peptid codiert unterstrichen ist (SEQ ID NO: 3).
8 gibt eine Aminosäuresequenz eines Kollagen-artigen Peptids (SEQ ID NO: 4) wider.
9 ist eine Plasmidkarte, die pCLP darstellt.
10 gibt die DNA-Sequenz wider, die reifes Knochenmorphogenese-Protein codiert (SEQ ID NO: 5).
11 ist eine Plasmidkarte, die pCBC darstellt.
12 ist eine graphische Darstellung des prozentualen Einbaus von Prolin und trans-4-Hydroxyprolin in das Maltose-bindende Protein unter verschiedenen Bedingungen.
13 gibt die Kollagen I (α1)/BMP-2B chimäre Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6) wider.
14A bis 14C geben eine chimäre Kollagen I (α1)/BMP-2B-Nukleotidsequenz wider (SEQ ID NO: 7).
15 gibt die Kollagen I (α1)/TGF-β₁-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 8) wider.
16A bis 16C geben die Kollagen I (αa)-TGF-β₁-Nukleotidsequenz wider. Die kleinen Buchstaben zeigen die nicht-codierende Sequenz an.
17A bis 17B geben eine Kollagen I (αa)/Decorin-Aminosäure-Sequenz (SEQ ID NO: 10) wider.
18 gibt eine Kollagen I (α1)/Decorin-Peptidaminosäure-Sequenz (SEQ ID NO: 11) wider.
19A bis 19D geben eine Kollagen I (α1)/Decorin-Nukleotid-Sequenz wider (SEQ ID NO: 12).
20A bis 20C geben eine Kollagen/Decorin-Peptidnukleotid-Sequenz (SEQ ID NO: 13) wider. Kleine Buchstaben geben die nicht-codierende Sequenz an.
21 gibt den pMal-Klonierungsvektor und die Polylinker-Klonierungsstelle wider.
22 gibt eine Polylinker-Klonierungsstelle wider, die im pMal-Klonierungsvektor der 21 enthalten ist (SEQ ID NO: 14).
23 gibt den pMal-Klonierungsvektor, der ein BMP/Kollagennukleotid-chimären Konstrukt enthält, wider.
24 gibt den pMal-Klonierungsvektor wider, der ein chimäres Konstrukt aus TGF-β₁/Kollagen-Nukleotid enthält.
25 gibt den pMal-Klonierungsvektor wider, der ein chimäres Konstrukt aus Decorin/Kollagen-Nukleotiden enthält.
26 gibt einen pMal-Klonierungsvektor wider, der ein chimäres Konstrukt aus Decorin-Peptid/Kollagen-Nukleotiden enthält.
27A bis 27E geben die menschliche Kollagen-Typ I (α₁)-Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 15) und die entsprechende Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 16) wider.
28 ist eine schematische Darstellung der Herstellung des menschlichen Kollagen-Gens aus synthetischen Oligonukleotiden.
29 ist eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenz der chimären Proteine GST-ColECol (SEQ ID NO: 17) und GST-D4 (SEQ ID NO: 18).
30 ist eine Tabelle, die das Auftreten von vier Prolin- und vier Glycin-Codons in menschlichem Kollagen-Typ I (α₁)-Gen mit der optimierten Codonverwendung (ColECol) wiedergibt.
31 gibt ein Gel wider, das die Expression und Abhängigkeit der Expression von GST-D4 von Hydroxyprolin widerspiegelt.
32 stellt ein Gel dar, welches die Expression von GST-D4 in hypertonem Medium zeigt.
33 ist ein Graph, welcher das zirkuläre Dichroismus-Spektrum von nativem und denaturiertem D4 in neutralem Phosphatpuffer zeigt.
34 stellt ein Gel dar, welches den Verdau von D4 mit Rinderpepsin wiedergibt.
35 stellt ein Gel dar, welches die Expression von GS-H Col und GST-ColEcol unter angegebenen Bedingungen darstellt.
36 stellt ein Gel dar, das die Expression von GST-CM4 im Medium mit oder ohne NaCl und entweder Prolin oder Hydroxyprolin darstellt.
37 stellt ein Gel mit Proben 6 Stunden nach der Induktion von GST-CM4 dar, welches in E. coli mit variierenden Konzentrationen von NaCl exprimiert wird.
38 stellt ein Gel 4 Stunden nach der Induktion der Proben von GST-CM4 dar, welche in E. coli mit konstanten Mengen an Hydroxyprolin und variierenden Mengen an Prolin exprimiert werden.
Die 39A–39E geben die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 19) und Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 20) von HuCol^Ec, den helikalen Bereich von menschlichen Typ I (α₁)-Kollagen plus der 17 Amino-terminalen extrahelikalen Aminosäuren und 26 Carboxy-terminalen extrahelikalen Aminosäuren wieder, wobei die Codonverwendung für E. coli optimiert wurde.
40 stellt die Sequenz und die Restriktionskarten synthetischer Oligos wieder, die für die Rekonstruierung der ersten 243 Basenpaare des menschlichen Typ I (α₁)-Kollagen-Gens mit der optimierten E. coli-Codon-Verwendung verwendet wurden. Die synthetischen Oligos werden als N1-1 (SEQ ID NO: 21), N1-2 (SEQ ID NO: 22), N1-3 (SEQ ID NO: 23) und N1-4 (SEQ ID NO: 24) bezeichnet.
41 stellt eine Plasmidkarte von pBSN1-1 dar, welches ein 114 Basenpaarfragment des menschlichen Kollagens vom Typ I (α₁) mit optimierter E. coli-Codonverwendung enthält.
42 stellt die Nukleotid (SEQ ID NO: 25)- und Aminosäure (SEQ ID NO: 26)-SEQ ID NO: eines Fragments des menschlichen Kollagens Typ I (α₁)-Gens mit optimierter E. coli-Codonverwendung dar, welches vom Plasmid pBSN1-1 codiert wird.
43 stellt eine Plasmidkarte von pBSN1-2 dar, welches ein 243 Basenpaare großes Fragment des menschlichen Kollagens Typ I (α₁) mit optimierter E. coli-Codonverwendung enthält.
44 stellt die Nukleotid (SEQ ID NO: 27)- und Aminosäure (SEQ ID NO: 28)-Sequenz eines Fragments des menschlichen Kollagens vom Typ I (α₁)-Gens mit optimierter E. coli-Codonverwendung dar, welches vom Plasmid pBSN1-2 codiert wird.
45 stellt eine Plasmidkarte von pHuCol^Ec dar, welches menschliches Kollagen Typ I (α₁) mit optimierter E. coli-Codonverwendung enthält.
46 stellt eine Plasmidkarte von pTrcN1-2 dar, welches ein 234 Nukleotide großes Fragment des menschlichen Kollagens vom Typ I (α₁) mit optimierter E-coli-Codonverwendung enthält.
47 stellt eine Plasmidkarte von pN1-3 dar, welches ein Fraktion aus 360 Nukleotiden des menschlichen Kollagens vom Typ I (α₁) mit optimierter E. coli-Codonverwendung enthält.
48 stellt eine Plasmidkarte von pD4 dar, welches ein 3'-Fragment aus 657 Nukleotiden des menschlichen Kollagens vom Typ I (α₁) mit optimierter E. coli-Codonverwendung enthält.
49A–49E stellen die Nukleotid (SEQ ID NO: 29)- und Aminosäure (SEQ ID NO: 30)-Sequenz eines helikalen Bereichs des menschlichen Typ I (α₂)-Kollagens plus 11 Amino-terminaler extrahelikaler Aminosäuren und 12 Carboxy-terminaler extrahelikaler Aminosäuren enthält.
50A bis 50E stellen den Nukleotid (SEQ ID NO: 31) und Aminosäure (SEQ ID NO: 32) von HuCol(α₂)^Ec dar, der helikalen Region des menschlichen Typ I (α₂)-Kollagens plus 11 Amino-terminaler extrahelikaler Aminosäuren und 12 Carboxy-terminaler extrahelikaler Aminosäuren mit der Codonverwendung, die für E. coli optimiert wurde.
51 stellt die Sequenz und Restriktionskarten synthetischer Oligos, die für die Rekonstruierung der ersten 240 Basenpaare des menschlichen Typ I (α₂)-Kollagen-Gens verwendet wurden, unter optimierter E. coli-Codonverwendung dar. Die synthetischen Oligos werden N1-1 (α2) (SEQ ID NO: 33), N1-2 (α2) (SEQ ID NO: 34), N1-3 (α2) (SEQ ID NO: 35 und N1-4 (α2) (SEQ ID NO: 36) bezeichnet.
52 stellt eine Plasmidkarte von pBSN1-1(α₂) dar, welches ein 117 Basenpaare-Fragment des menschlichen Kollagen-Typ I (α₂) mit optimierter E. coli-Codonverwendung enthält.
53 stellt eine Plasmidkarte von pBSN1-2(α₂) dar, welches ein 240 Basenpaare langes Fragment des menschlichen Kollagens vom Typ I (α₂) mit optimierter E. coli-Codonverwendung enthält.
54 stellt die Nukleotid (SEQ ID NO: 37)- und Aminosäure (SEQ ID NO: 38)-Sequenz eines Fragments des menschlichen Kollagens vom Typ I (α₂)-Gens mit optimierter E. coli-Verwendung dar, welches vom Plasmid pBSN1-2(α₂) codiert wird.
55 stellt eine Plasmidkarte vom pHuCol(α₂)^Ec dar, welches das gesamte Gen des menschlichen Kollagens vom Typ I (α₂) mit optimierter E. coli-Codonverwendung enthält.
56 stellt eine Plasmidkarte von pN1-2(α₂) dar, welches ein 240 Basenpaare langes Fragment des menschlichen Kollagens vom Typ I (α₂) mit optimierter E. coli-Codonverwendung enthält.
57 stellt ein Gel dar, welches die Expression von GST und TGF-β₁ unter angegebenen Bedingungen widerspiegelt.
58 stellt ein Gel dar, welches die Expression von MBP, FN-BMP-2A, FN-TGF-β₁ und FN unter angegebenen Bedingungen widerspiegelt.
59 stellt ein Gel dar, das die Expression von GST-Coll unter angegebenen Bedingungen widerspiegelt.
60 stellt eine Plasmidkarte von pGST-CM4 dar, welches das Gen für Glutathion-S-Transferase enthält, das mit dem Gen für das Kollagen-Mimetikum 4 fusioniert ist.
61 stellt die Nukleotid (SEQ ID NO: 39)- und Aminosäure (SEQ ID NO: 40)-SEQ ID NO: des Kollagen-Mimetikums 4 dar.
62A stellt ein Chromatogramm der Eluierung von Hydroxyprolin-haltigem Kollagen-Mimetikum 4 von einer Poros RP2-Säule dar. Der Pfeil gibt den Peak an, der das Hydroxyprolin-haltige Kollagen-Mimetikum 4 enthält.
62B stellt ein Chromatogramm der Eluierung von Prolin-haltigem Kollagen-Mimetikum 4 von einer Poros RP2-Säule dar. Der Pfeil gibt den Peak an, der das Prolin-haltige Mimetikum 4 enthält.
63A gibt ein Chromatogramm eine Prolinaminosäure-Standards (250 pmol) wider.
63B gibt ein Chromatogramm eines Hydroxyprolinaminosäure-Standards (250 pmol) wider.
63C gibt ein Aminosäure-Analysechromatogramm des Prolin-haltigen Kollagen-Mimetikums 4 wider.
63D gibt das Aminosäure-Analysechromatogramm der Hydrolyse des Hydroxyprolin-haltigen Kollagen-Mimetikums 4 wider.
64 ist ein Graph bei OD600 gegenüber der Zeit für Kulturen von E. coli JM109 (F^–), die bis zum Plateau gezüchtet wurden und dann mit zahlreichen Aminosäuren ergänzt wurden.
65 stellt eine Plasmidkarte von pcEc-α1 dar, welche das Gen für HuCol(α1)^Ec enthält.
66 stellt eine Plasmidkarte von pcEc-α2 dar, welche das Gen für HuCol(α2)^Ec enthält.
67 gibt eine Plasmidkarte von pD4-α1 wider, welche das Gen für ein C-terminales Fragment aus 219 Aminosäuren des menschlichen Kollagens vom Typ I (α1) mit optimierter E. coli-Codonverwendung wider, das mit dem Gen der Glutathion-S-Transferase fusioniert ist.
68 gibt eine Plasmid-Karte von pD4-α2 wider, welche das Gen für ein C-terminales Fragment aus 207 Aminosäuren des menschlichen Kollagens Typ I (α2) mit optimierter E. coli-Codonverwendung wider, welche mit dem Gen von Glutathion-S-Transfersase fusioniert ist.
69 gibt die vorhergesagte Aminosäuresequenz der DNA-Sequenz der ersten 13 Aminosäuren des Proteins D4-α1 (SEQ ID NO: 41) und der Aminosäuresequenz wider, die experimentell bestimmt wurde (SEQ ID NO: 42).
70 gibt das Massenspektrum von Hydroxyprolin-haltigem D4-α1 wider.
71 gibt die Nukleotidsequenz eines 657 Nukleotide langen Fragments vom menschlichen Kollagen von Typ I (α1)3' mit optimierter E. coli-Codonverwendung wider, welche als D4 bezeichnet wird (SEQ ID NO: 43).
72 gibt die Aminosäuresequenz eines C-terminalen 219 Aminosäuren langen Fragments des menschlichen Kollagens vom Typ I (α1) wider, welches als D4 bezeichnet wird (SEQ ID NO: 44).
73 ist eine Plasmidkarte, die pGEX-4T.1 darstellt, welches das Gen für Glutathion-S-Transferase enthält.
74 ist eine Plasmidkarte, die pTrc-TGF darstellt, welches das Gen für das reife menschliche TGF-β1-Gen Polypeptid enthält.
75 ist eine Plasmidkarte, die pTrc-Fn darstellt, welches das Gen für ein 70 kDa-Fragment vom menschlichen Fibronectin enthält.
76 ist eine Plasmidkarte, die pTrc-Fn-TGF darstellt, welches das Gen für ein Fusionsprotein aus einem 70 kDa-Fragment des menschlichen Fibronectins und des reifen menschlichen TGF-β1 Polypeptid enthält.
77 ist eine Plasmidkarte, die pTrc-Fn-BMP darstellt, welches das Gen eines Fusionsproteins eines 70 kDa-Fragments des menschlichen Fibronectins und des menschlichen Knochenmorphogenese-Proteins 2A enthält.
78 ist eine Plasmidkarte, die pGEX-HuCol1^Ec darstellt, welches das Gen für ein Fusionsprotein zwischen Glutathion-S-Transferase und Typ I (α1) menschlichen Kollagen mit optimierter E. coli-Codonverwendung enthält.
79 gibt die Nukleotidsequenz eines 3'-Fragments aus 627 Nukleotiden des menschlichen Kollagens vom Typ I (α2)3'-Fragments mit optimierter E. coli-Codonverwendung (SEQ ID NO: 45) wider.
80 gibt die Aminosäuresequenz eines C-terminalen 209 Aminosäure langen Fragments des menschlichen Kollagens vom Typ I (α2) (SEQ ID NO: 46) wider.
81 gibt die Sequenz synthetischer Oligos wider, die verwendet wurden, um die ersten 282 Basenpaare des Gens für die Carboxy-terminalen 219 Aminosäuren vom menschlichen Typ I (α1)-Kollagen mit optimierter E. coli-Codonverwendung zu rekonstruieren, welche als N4-1 (SEQ ID NO: 47), N4-2 (SEQ ID NO: 48), N4-3 (SEQ ID NO: 49) und N4-4 (SEQ ID NO: 50) bezeichnet werden.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Prokaryontische Zellen und eukaryontische Zellen können unerwarteterweise dazu gebracht werden trans-4-Hydroxyprolin in Proteine zu assimilieren und einzubauen, entgegen von sowohl Papas et al. als auch Deming et al., oben. Eine derartige Assimilierung und der Einbau ist besonders nützlich, wenn die Struktur und Funktion eines Polypeptids von einer posttranslationalen Hydroxylierung von Prolin abhängt, welche durch das native Protein-Produktionssystem eines rekombinanten Wirts nicht bereitgestellt wird. So können prokaryontische Bakterien, wie beispielsweise E. coli und eukaryontische Zellen wie beispielsweise Saccharomyces cervesiae, Saccharomyces carlsbergensis und Schizosaccharomyces pombe, die für gewöhnlich nicht Prolin hydroxylieren und zusätzliche Eukaryonten wie beispielsweise Insektenzellen, einschließlich Lepidoptera-Zelllinien einschließlich Spodoptera frugiperda, Trichoplasia ni, Heliothis virescens, Bombyx mori, die mit einem Baculovirus infiziert sind; CHO-Zellen, COS-Zellen und NIH 3T3-Zellen, die es nicht schaffen, einige Polypeptide adäquat herzustellen, deren Strukturen und Funktion von einer derartigen Hydroxylierung abhängt, dazu gebracht werden, Polypeptide mit hydroxylierten Prolinen herzustellen. Der Einbau schließt die Addition von trans-4-Hydroxyprolin in einem Polypeptid ein, beispielsweise zunächst durch das Ändern einer Aminosäure in Prolin, wodurch eine neue Prolin-Position erzeugt wird, die wiederum mit trans-4-Hydroxyprolin substituiert werden kann, oder das Substituieren eines natürlich auftretenden Prolins in einem Polypeptid durch trans-4-Hydroxyprolin.
Das Verfahren zur Herstellung rekombinanter Polypeptide in Massen produzierenden Organismen ist gut bekannt. Replizierbare Expressionsvektoren, wie beispielsweise Plasmide, Viren, Cosmide und künstliche Chromosomen werden für gewöhnlich verwendet, um Gene, die gewünschte Proteine codieren, von einem Wirt in einen anderen zu überführen. Es wird in Erwägung gezogen, daß jedes bekannte Verfahren zur Klonierung eines Gens, das Ligieren des Gens in einen Expressionsvektor und das Transformieren einer Wirtszelle mit einem derartigen Expressionsvektor nachfolgend in der vorliegenden Offenbarung verwendet werden kann.
Der Einbau von trans-4-Hydroxyprolin in Polypeptide, die von trans-4-Hydroxyprolin bezüglich ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften abhängen, ist nicht nur nützlich bei Produktionssystemen, die nicht die geeigneten Systeme zur Umwandlung von Prolin in trans-4-Hydroxyprolin haben, sondern auch nützlich zum Untersuchen der Struktur und Funktion von Polypeptiden, die normalerweise kein trans-4-Hydroxyprolin enthalten. Es wird in Erwägung gezogen, daß die folgenden Aminosäure-Analoga ebenfalls in Übereinstimmung der vorliegenden Offenbarung eingebaut werden können: trans-4-Hydroxyprolin, 3-Hydroxyprolin und Kombinationen daraus (nachfolgend bezeichnet als "Aminosäure-Analoga"). Die Verwendung von Prokaryonten und Eukaryonten ist wünschenswert, da sie eine relativ günstige Massenproduktion ermöglichen. Es wird in Erwägung gezogen, daß die Aminosäure-Analoga in jedes gewünschte Polypeptid eingebaut werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die prokaryontischen Zellen und eukaryontischen Zellen hinsichtlich Prolin hungern gelassen, indem die Menge an Prolin im Wachstumsmedium vor der Zugabe eines Aminosäure-Analogons dazu abgesenkt oder es entfernt wird.
Expressionsvektoren, die das Gen für das Maltose-bindende Protein (MBP) enthalten, z. B. siehe 1, welche das Plasmid pMAL-c2 darstellt, welches kommerziell von New England Bio-Labs erhältlich ist, werden in Prokaryonten wie beispielsweise E. coli Prolin-Auxotrophe oder Eukaryonten wie beispielsweise S. cerevisiae-Auxotrophe transformiert, die vom extern zugeführten Prolin für die Proteinsynthese und den Anabolismus abhängen. Andere bevorzugte Expressionsvektoren zur Verwendung in Prokayronten sind die kommerziell erhältlichen Plasmide, wie pKK-223 (Pharmacia), pTRC (Invitrogen), pGEX (Pharmacia), pET (Novagen) und pQE (Quiagen). Es ist klar, daß jeder geeignete Expressionsvektor von Fachleuten auf dem Gebiet verwendet werden kann.
Die Substituierung der Aminosäure-Analoga für Prolin in der Proteinsynthese tritt auf, da Prolyl-tRNA-Synthetase hinreichend promiskuotiv ist, und eine Mißacylierung von Prolin-tRNA mit irgendeinem der Aminosäure-Analoga ermöglicht. Eine ausreichende Menge, d. h. typischerweise von 0,001 M bis ungefähr 1,0 M reichen, aber mehr bevorzugt von ungefähr 0,005 M bis ungefähr 0,5 M der Aminosäure-Analoga wird zu dem Wachstumsmedium der transformierten Zelle hinzugegeben, um mit dem Prolin bei der zellulären Aufnahme zu wetteifern. Nach ausreichender Dauer, im allgemeinen von ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 24 Stunden oder mehr, sind die Aminosäure-Analoga durch die Zelle assimiliert und in die Proteinsynthesewege eingebaut worden. Wie aus 2 und 2A erkannt werden kann, steigt die intrazelluläre Konzentration von trans-4-Hydroxyprolin durch den Anstieg der Konzentration von Natriumchlorid im Wachstumsmedium an. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die prokaryontischen Zellen und/oder eukaryontischen Zellen hinsichtlich Prolin hungern lassen, indem die Menge an Prolin im Wachstumsmedium vor der Zugabe eines Aminosäure-Analogons dazu gesenkt oder es eliminiert wird.
Expressionsvektoren, die das Gen für menschliches Kollagen vom Typ I (α1) enthalten (DNA-Sequenz, die in den 3 und 3A dargestellt ist; Plasmidkarte, die in 4 dargestellt ist), werden in prokaryontische oder eukaryontische Prolin-Auxotrophe transformiert, die vom extern zugeführten Prolin für die Proteinsynthese und den Anabolismus abhängen. Wie oben erwähnt, tritt die Substituierung der Aminosäure-Analoga auf, da Prolyl-tRNA-Synthetase hinreichend promiskuitiv ist, um eine Mißacylierung der Prolin-tRNA mit den Aminosäure-Analoga zu ermöglichen. Die Menge der Aminosäure-Analoga im Medium, die oben angegeben wurde, ist ebenfalls anwendbar.
Expressionsvektoren, die DNA enthalten, welche Fragmente des menschlichen Kollagens vom Typ I (α1) codieren (z. B. die DNA-Sequenz, die in 5 dargestellt ist, und die Plasmidkarte, die in 6 dargestellt ist), werden in prokaryontische oder eukaryontische Auxotrophe, wie oben erwähnt, transformiert. Gleichermaßen können Expressionsvektoren, die DNA enthalten, welche das Kollagen-artige Polypeptid codieren (z. B. die DNA-Sequenz, die in 7 dargestellt ist, die Aminosäuresequenz, die in 8 dargestellt ist sowie die Plasmidkarte, die in 9 dargestellt ist) verwendet werden, um prokaryontische oder eukaryontische Auxotrope, wie oben angegeben, zu transformieren. Kollagen-artige Peptide sind solche, die mindestens eine Teilhomologie mit Kollagen aufweisen und ähnliche chemische und physikalische Eigenschaften wie Kollagen aufweisen. So bestehen Kollagen-artige Peptide beispielsweise aus sich wiederholenden Anordnungen von Gly-X-Y-Tripletts, in denen ungefähr 35% der X- und Y-Positionen durch Prolin und 4-Hydroxyprolin besetzt sind. Kollagen-artige Peptide werden hier austauschbar als Kollagen-artige Proteine, Kollagen-artige Polypeptide, Kollagen-mimetische Polypeptid und Kollagen-Mimetika bezeichnet. Bevorzugte Kollagen-Fragmente und Kollagen-artige Peptide in Übereinstimmung hiermit, sind in der Lage, sich in einer extrazellulären Matrix zusammenzufinden. Sowohl in Kollagen-freien Fragmenten und Kollagen-artigen Peptiden, die oben beschrieben wurden, tritt eine Substituierung durch Aminosäure-Analoga auf, da Prolyl-tRNA-Synthetase hinreichend promiskuitiv ist, um eine Mißacylierung der Prolin-tRNA durch ein oder mehrere der Aminosäure-Analoga zu ermöglichen. Die Menge der Aminosäure-Analoga, die oben angegeben wurde, ist ebenfalls anwendbar.
Es wird in Erwägung gezogen, daß jedes Polypeptid, das eine extrazelluläre Matrix-Proteindomäne hat, wie beispielsweise Kollagen, Kollagen-Fragmente oder eine Kollagen-artige Peptiddomäne dazu gebracht werden kann, Aminosäure-Analoga gemäß der Offenbarung hierin einzubauen. Diese Polypeptide schließen Kollagen, ein Kollagen-Fragment oder eine Kollagen-artige Peptiddomäne ein sowie eine Domäne mit einem Bereich, der ein oder mehrere physiologisch wirksame Mittel einbaut, wie beispielsweise Glycoproteine, Proteine, Peptide und Proteoglycane. So wie es hier verwendet wird, üben physiologisch aktive Mittel Kontrolle aus oder modifizieren vorhandene physiologische Eigenschaften lebender Dinge. Physiologisch aktive Mittel schließen Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme, Liganden und Rezeptoren ein. Viele aktive Domänen physiologisch aktiver Mittel sind definiert und isoliert worden. Es wird beschrieben, daß Polypeptide mit einem Kollagen, einem Kollagen-Fragment oder einer Kollagen-artigen Peptiddomäne ebenfalls eine Domäne haben können, die ein oder mehrere physiologisch aktive Domänen einschließt, welche aktive Fragmente dieser physiologisch wirksamen Mittel sind. So wie es hier verwendet wird, bedeutet physiologisch wirksames Mittel vollständige Peptide, Polypeptide, Proteine, Glycoproteine, Proteoglycane und aktive Fragmente irgendeines davon. So können chimäre Proteine dazu gebracht werden, durch Transformierung eines prokaryontischen Prolin-Auxotrophen oder eines eukaryontischen Prolin-Auxotrophen mit einem geeigneten Expressionsvektor, und das Kontaktieren des transformierten Auxotrophen mit einem Wachstumsmedium, das mindestens eins der Aminosäure-Analoga enthält Aminosäure-Analoga einzubauen. Beispielsweise kann ein chimäres Kollagen/Knochenmorphogenese-Protein(BMP)-Konstrukt oder verschiedene chimäre Kollagen/Wachstumsfaktor-Konstrukte erfindungsgemäß nützlich sein. Derartige Wachstumsfaktoren sind gut bekannt und schließen Insulin-artigen Wachstumsfaktor, transformierenden Wachstumsfaktor, aus Plättchen-stammender Wachstumsfaktor und ähnliche ein. 10 stellt die DNA von BMP dar, welche mit dem 3'-Terminus der DNA, welche Kollagen codiert, DNA, die ein Kollagen-Fragment codiert, oder DNA, die ein Kollagen-artiges Peptid codiert fusioniert werden kann. 11 stellt eine Karte des Plasmids pCBC dar, welche ein Kollagen/BMP-Konstrukt enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform fügen sich Proteine mit einem Kollagen, Kollagen-Fragment oder einer Kollagen-artigen Peptiddomäne zusammen oder aggregieren, um eine extrazelluläre Matrix zu bilden, die als chirurgisches Implantat verwendet werden kann. Die Eigenschaft der Selbstaggregierung, die hier verwendet wird, schließt die Fähigkeit ein, mit den gleichen oder ähnlichen Molekülen ein Aggregat zu bilden, oder ein Aggregat mit anderen Molekülen zu bilden, die die Eigenschaft der Aggregierung teilen, um beispielsweise eine Doppel- oder Tripelhelix zu bilden. Ein Beispiel einer derartigen Aggregierung ist die Struktur aneinandergelagerter Kollagen-Matrizes.
So können chimäre Polypeptide, die hier ebenfalls als chimäre Proteine bezeichnet werden können, eine integrierte Zusammensetzung aus einer therapeutisch wirksamen Domäne eines physiologisch wirksamen Mittels und einem oder mehreren EMP-Resten bereitstellen. Die EMP-Domäne stellt ein integrales Vehikel zur Verabreichung des therapeutisch wirksamen Restes an einen Zielort bereit. Die zwei Domänen sind durch eine oder mehrere Peptidbindungen, die in einer Linkerregion enthalten sind, kovalent verbunden. So wie es hier verwendet wird, bedeutet integriert oder integral Eigenschaften, die aus der kovalenten Verbindung einer oder mehrerer Domänen des chimären Proteins hervorgehen. Die therapeutisch wirksamen Reste, die hier offenbart sind, bestehen typischerweise aus Aminosäuren, die verbunden sind, um Peptide, Polypeptide, Proteine, Glycoproteine oder Proteoglycane zu bilden. So wie es hier verwendet wird, umfaßt "Peptid" Polypeptide und Proteine.
Die inhärenten Eigenschaften von EMPs sind ideal zur Verwendung als Vehikel für den therapeutischen Rest. Eine derartige Eigenschaft ist die Fähigkeit der EMPs, das Selbstaggregat zu bilden. Beispiele für geeignete EMPs sind Kollagen, Elastin, Fibronectin, Fibrinogen und Fibrin. Fibrilläre Kollagene (Typ I, II und III) lagern sich in geordneten Polymeren zusammen und aggregieren häufiger zu größeren Bündeln. Typ IV-Kollagen setzt sich in schichtartigen Netzwerken zusammen. Elastin-Moleküle bilden Filamente und Schichten, in denen die Elastin-Moleküle miteinander stark vernetzt sind, um eine gute Elastizität und eine hohe Reißstärke bereitzustellen. Die vernetzte, zufallsmäßig verknäuelte Struktur des Fasernetzwerks ermöglicht es, wie ein Gummiband gedehnt zu werden und sich wieder zusammenzuziehen. Fibronectin ist ein großes Fibrillen-bildendes Glycoprotein, welches in einer seiner Formen aus stark unlöslichen Fibrillen besteht, die miteinander durch Disulfid-Bindungen verbunden sind. Fibrin ist ein unlösliches Protein, das aus Fibrinogen durch proteolytische Einwirkung von Thrombin während der normalen Verklumpung von Blut gebildet wird.
Die molekulare und makromolekulare Morphologie der oben erwähnten EMPs definiert Netzwerke oder Matrizes, um ein Substrat oder ein Gerüst in integraler kovalenter Verbindung mit dem therapeutisch wirksamen Rest bereitzustellen. Die Netzwerke oder Matrizes, die durch die EMP-Domäne gebildet werden, stellen eine Umgebung bereit, die besonders gut für das Einwachsen autologer Zellen geeignet ist, die am Wachstum, der Reparatur und dem Austausch von vorhandenem Gewebe beteiligt sind. Die integralen therapeutisch wirksamen Reste, die kovalent in die Netzwerke oder Matrizes gebunden sind, stellen eine maximale Exposition der wirksamen Mittel an ihrem Ziel bereit, um eine gewünschte Reaktion auszulösen.
Implantate, die aus oder von den vorliegenden chimären Proteinen gebildet werden, stellen die Wirkung der verzögerten Freisetzung in oder am gewünschten Ort oder einer Zielstelle bereit. Da sie an eine EMP-Domäne gebunden sind, ist die therapeutisch wirksame Domäne des vorliegenden chimären Proteins nicht frei um getrennt zu diffundieren oder in sonstiger Weise von dem Träger, die es trägt, fort transportiert zu werden, ausgenommen von der Abspaltung der Peptidbindungen. Infolgedessen stellen die hierin bereitgestellten chimären Proteine eine wirksame Verankerung für eine therapeutische Wirkung bereit, welche ermöglicht, daß die Aktivität an einem Zielort für einen verlängerten Zeitraum beschränkt ist. Da die Zufuhr des therapeutisch wirksamen Mittels nicht so häufig wieder aufgefüllt werden muß, wenn es mit nicht-verzögerten Freisetzungsdosierungsformen verglichen wird, können geringere Mengen eines therapeutisch wirksamen Mittels im Verlaufe der Therapie verwendet werden. Infolgedessen sind einige Vorteile, die durch die vorliegenden chimären Proteine bereitgestellt werden, die Absenkung oder die Eliminierung lokaler und systemischer Nebenwirkungen, die geringere Potenzierung oder Reduzierung der therapeutischen Wirkung bei chronischer Verwendung, und die Minimierung der Medikamentenanhäufung in einem Körpergewebe bei chronischer Dosierung.
Die Verwendung der rekombinanten Technologie ermöglicht die Herstellung nicht-immunogener chimärer Proteine. Die DNA, die sowohl den therapeutisch wirksamen Rest und den EMP-Rest codiert, sollte vorzugsweise von der gleichen Art stammen, wie der Patient, der zu behandeln ist, um eine immunogene Reaktion zu vermeiden. Beispielsweise wird, wenn der Patient ein Mensch ist, der therapeutische wirksame Rest wie auch der EMP-Rest vorzugsweise aus menschlicher DNA stammen.
Chimäre osteogene/EMP Proteine stellen biodegradierbare und biokompatible Mittel zur Induzierung der Knochenbildung an einer gewünschten Stelle bereit. Wie oben erwähnt, ist in einer Ausführungsform ein BMP-Rest kovalent mit einem EMP verbunden, um ein chimäres Protein zu bilden. Der BMP-Rest induziert die Osteogenese, und der Proteinrest der extrazellulären Matrix stellt ein integrales Substrat oder Gerüst für den BMP-Rest und Zellen, die an der Rekonstruktion und dem Wachstum beteiligt sind, bereit. Zusammensetzungen, die das chimäre BMP/EMP-Protein enthalten, stellen die wirksame verzögerte Freisetzungsverabreichung des BMP-Restes an gewünschte Zielorte bereit. Das Verfahren zur Herstellung eines solchen osteogenen Mittels ist effizient, da die Notwendigkeit für zusätzliche zeitaufwendige Schritte wie die Reinigung von EMP und dann die Vermischung desselben mit dem gereinigten BMP ausgeschaltet ist. Ein zusätzlicher Vorteil des chimären BMP/EMP-Proteins stammt aus der Stabilität, die durch die kovalente Bindung zwischen BMP und dem EMP gebildet wird, d. h. der BMP-Teil ist nicht frei in der Lage separat vom EMP weg zu diffundieren, wodurch ein stabileres therapeutisches Mittel bereitgestellt wird.
Knochenmorphogenese-Proteine sind eine Klasse, die als BMP-1 bis BMP-9 identifiziert wurden. Ein bevorzugtes osteogenes Protein zur Verwendung in menschlichen Patienten ist menschliches BMP-2B. Ein chimäres BMP-2B/Kollagen IA-Protein ist in 13 (SEQ ID NO: 6) dargestellt. Die Proteinsequenz, die in 15 dargestellt ist (SEQ ID NO: 8) schließt eine helikale Kollagen-Domäne ein, die in den Aminosäuren 1 bis 1057 widergegeben ist und eine reife Form von BMP-2B in den Aminosäuren 1060 bis 1169. Die physikalischen Eigenschaften des chimären Proteins werden teilweise durch den EMP-Anteil bestimmt. Im Fall eines Kollagen-Restes, hat eine konzentrierte Lösung des chimären Proteins eine gelatineartige Konsistenz, die die leichte Handhabung durch den Mediziner ermöglicht. Der EMP-Rest wirkt als Sequestrierungsmittel, um die schnelle Desorption des BMP-Restes von der gewünschten Stelle zu verhindern, und um eine verzögerte Freisetzung der BMP-Aktivität bereitzustellen. Infolge dessen bleibt der BMP-Rest an der gewünschten Stelle und stellt einer verlängerte Freisetzung der BMP-Aktivität an der gewünschten Stelle für einen notwendigen Zeitraum bereit, um die Knochenbildung wirksam zu induzieren. Der EMP-Rest stellt ebenfalls eine Matrix bereit, welche ermöglicht, daß die autologen Zellen des Patienten, z. B. Chondrozyten und ähnliche, die normalerweise an der Osteogenese beteiligt sind, sich hierin zu sammeln, um ein autologes Netzwerk für neues Gewebewachstum zu bilden. Die gelatineartige Konsistenz des chimären Proteins stellt auch eine günstige und nützliche therapeutische Art der Immobilisierung von aktivem BMP auf einem geeigneten Vehikel oder Implantat zur Verabreichung des BMP-Restes an einer Stelle bereit, an der das Knochenwachstum gewünscht ist.
Der BMP-Rest und der EMP-Rest werden gegebenenfalls zusammen durch Linkersequenzen aus Aminosäuren verbunden. Beispiele für Linkersequenzen, die verwendet werden, liegen innerhalb der Sequenz, die in 14A bis 14C (SEQ ID NO: 7), 14A bis 16C (SEQ ID NO: 9), 19A bis 19C (SEQ ID NO: 12) und 20A bis 20C (SEQ ID NO: 13) widergegeben sind und werden im genaueren Detail unten beschrieben. Linkersequenzen können auf Grundlage bestimmter Eigenschaften ausgewählt werden, die sie dem chimären Protein verleihen. Beispielsweise werden Aminosäuresequenzen wie beispielsweise Ile-Glu-Gly-Arg und Leu-Val-Pro-Arg durch Faktor XA und Thrombin-Enzyme gespalten. Der Einbau von Sequenzen, die von proteolytischen Enzymen gespalten werden, in chimäre Proteine stellt hier die Spaltung an der Linkerstelle nach Exposition gegenüber einem geeigneten Enzym, und die Trennung der zwei Domänen in getrennte Einheiten bereit. Es wird in Erwägung gezogen, daß verschiedene Linkersequenzen in irgendeines der chimären Proteine eingebaut werden können.
Ein chimäres DNA-Konstrukt schließt ein Gen ein, das ein Osteogenese-Protein oder ein Fragment davon einschlißt, das mit einem Gen verbunden ist, das ein EMP oder ein Fragment davon codiert. Die Gensequenz verschiedener BMPs sind bekannt, siehe z. B. US-Patent Nrn. 4,294,753 , 4,761,471 , 5,106,748 , 5,187,076 , 5,141,905 , 5,108,922 , 5,116,738 und 5,168,050 . Das BMP-2B-Gen zur Verwendung hierin wird durch Ligieren von Oligonukleotiden, die ein BMP-Protein codieren, synthetisiert. Die Oligonukleotide, die BMP-2B codieren, werden unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesegerätes (Beckmen Oligo-1000) synthetisiert. Die Nukleotidsequenz, die das BMP codiert, wird zur Expression in E. coli maximiert. Dies wird durch die Verwendung der E. coli-Verwendungstabellen erreicht, um die Sequenz der Aminosäuren von BMP in Codons zu transportieren, die am häufigsten durch E. coli verwendet werden. Alternativ dazu kann native DNA, die BMP codiert, welche aus Säugern, einschließlich Menschen, isoliert wurde, gereinigt und verwendet werden.
Das BMP-Gen und die DNA-Sequenz, die ein extrazelluläres Matrixprotein codiert, wird durch Standard-Gentechnikverfahren kloniert, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1989 beschrieben sind.
Die DNA-Sequenz, die der helikalen und Telepeptid-Region von Kollagen I (α1) entspricht wird aus einer menschlichen Fibroblasten-Zelllinie kloniert. Zwei Ansätze der Polymerasekettenreaktion werden unter Verwendung von cDNA durchgeführt, die durch Standardverfahren aus AG02261A-Zellen präpariert wurde. Das erste PCR-Primerpaar schließt einen 5'-Primer ein, der eine XmnI-Linkersequenz trägt und einen 3'-Primer, der die BsmI-Stelle an der Nukleotidposition 1722 trägt. Das daraus hervorgehende PCR-Produkt besteht aus einer Sequenz von der Position 1 bis 1722. Das zweite Primerpaar schließt die BsmI-Schnittstelle bei 1722 ein, und eine Linkersequenz am 3'-Ende welche eine BglII-Schnittstelle trägt. Das erhaltene PCR-Produkt besteht aus einer Sequenz von Position 1722 bis 3196. Die vollständige Sequenz wird durch Standard-Klonierungstechniken zusammengebaut. Die zwei PCR-Produkte werden an der BsmI-Schnittstelle ligiert, und der kombinierte Klon wird in irgendeinen Vektor mit einer mit XmnI-BglII-Schnittstellen inseriert, wie beispielsweise den pMal-c2-Vektor.
Um das BMP-2B-Gen zu klonieren, wird die gesamte zelluläre RNA aus menschlichen Osteosarkom-Zellen (U-2OS) durch das von Robert E. Farrel Jr. (Academic Press, CA, 1993, S. 68–69) beschriebene Verfahren isoliert. Die Integrität der RNA wird mittels spektrophotometrischer Analyse und Elektrophorese mit Agarosegelen überprüft. Typische Ausbeuten an Gesamt-RNA sind 50 μg aus 100 mm konfluenten Gewebekulturschälchen. Die RNA wird verwendet, um cDNA durch reverse Transkription unter Verwendung des Superscript-Präamplifizierungssystem von Gibco BRL zu erzeugen. Die cDNA wird als Matrize für die PCR-Amplifizierung unter Verwendung von stromaufwärts und stromabwärts liegenden Primern verwendet, die spezifisch für BMP-2B (GenBank HUMBMP2B, Zugangs-Nr. #M22490) sind. Das daraus hervorgehende PCR-Produkt besteht aus der BMP-2B-Sequenz von Position 1289 bis 1619. Das PCR-Produkt wird mittels Elektrophorese durch Agarosegele gelöst, mit gene clean (BIO 101) gereinigt und in den pMal-c2-Vektor (New England Biolabs) ligiert. Die Domäne der menschlichen Kollagen I (21)-Kette wird in ähnlicher Weise kloniert. Jedoch wird die gesamte zelluläre RNA aus einer menschlichen Fibroblasten-Zelllinie isoliert (AG02261A menschliche Hautfibroblasten).
Ein chimäres BMP/EMP-DNA-Konstrukt wird durch Ligieren des synthetischen BMP-Gens an eine DNA-Sequenz, die ein EMP wie beispielsweise Kollagen, Fibrinogen, Fibrin, Fibronectin, Elastin oder Laminin codiert, gewonnen. Jedoch sind die chimären Polypeptide hier nicht auf diese bestimmten Protein limitiert. Die 14A bis 14C (se17) stellen ein DNA-Konstrukt dar, welches ein BMP-2B/Kollagen I (α1)-chimäres Protein darstellt. Die codierende Sequenz eines EMP kann stromaufwärts und/oder stromabwärts und im Leseraster mit einer codieren Sequenz für das BMP ligiert werden. Die DNA, welche ein EMP codiert, kann ein Teil des Gens des gesamten EMP-Gens sein. Außerdem können zwei verschiedene EMPs stromaufwärts und stromabwärts von BMP ligiert werden.
Das chimäre BMP-2/Kollagen I (α1)-Protein, das in den 14A bis 14C dargestellt ist, schließt eine XmnI-Linkersequenz an den Basenpaaren (bp) 1–19,. eine Kollagen-Domäne (bp 20–3190), eine BglII/BamII-Linkersequenz (bp 3191–3196), die reife Form von BMP2b (bp 3197–3529) und eine HindIII-Linkersequenz (bp 3530–3535) ein.
Jede Kombination aus Wachstumsfaktor-Matrixproteinsequenzen wird beschrieben, einschließlich sich wiederholender Einheiten, oder multipler Anordnungen jedes Segments in irgendeiner Reihenfolge.
Der Einbau von Fragmenten von sowohl Matrix- und Wachstumsfaktor-Proteinen wird ebenfalls beschrieben. Beispielsweise kann im Fall von Kollagen nur die helikale Domäne eingeschlossen sein. Andere Matrix-Proteine habe definierte Domänen, wie beispielsweise Laminin, welches EGF-artige Domänen hat. In diesen Fällen können spezifische Funktionalitäten ausgewählt werden, um gewünschte Wirkungen zu erzielen. Außerdem kann es nützlich sein, Domänen verschiedener Matrixproteine zu kombinieren, beispielsweise die helikale Region von Kollagen und die Zellanhaftungsregionen von Fibronectin. Im Falle von Wachstumsfaktoren ist bei spezifischen Segmenten gezeigt worden, daß sie durch posttranslationale Prozessierung vom reifen Protein entfernt werden. Chimäre Proteine können entworfen werden, um nur den reifen biologisch wirksamen Bereich einzuschließen. Beispielsweise werden im Fall von BMP-2B nur die letzten 110 Aminosäuren in dem aktiven Protein gefunden.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Rest des transformierenden Wachstumsfaktors (TGF) kovalent mit einem EMP verbunden, um ein chimäres Protein zu bilden. Der TGF-Rest erhöht die Wirksamkeit der normalen Reparaturantwort von Weichteilgeweben im Körper, und induziert ebenfalls die Osteogenese. Infolgedessen können chimäre TGF/EMP-Proteine für irgendeine oder beide Funktionen verwendet werden. Eine der fundamentalen Eigenschaften der TGF-βs ist deren Fähigkeit, zahlreiche Aktivitäten anzuschalten, die zur Synthese neuen Bindegewebes führen. Siehe Piez und Sporn Hrsg., Transforming Growth Factor-βs Chemistry, Biology and Therapeutics, Annals of the New York Academy of Sciences, Bd. 593 (1990). TGF-β ist dafür bekannt, daß er in mindestens fünf verschiedenen Isoformen vorliegt. Die DNA-Sequenz für menschliches TGF-β₁ ist bekannt und ist kloniert worden. Siehe Derynck et al., Human Transforming Growth Bactor-Beta cDNA Sequence and Expression in Tomour Cell Lines, Nature, Bd. 316, S. 701–705 (1985). TGF-β₂ ist aus Rinderknochen, menschlichen Glioblastom-Zellen und Plättchen des Schweins isoliert worden. TGF-β₃ ist ebenfalls kloniert worden. Siehe ten Dijke et al., Identification of a New Member of the Transforming Growth Factor-β Gene Family, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 85, S. 4715–4719.
Ein chimäres TGF-β/EMP-Protein hat die bekannten Aktivitäten von TGF-βs und stellt die integrale Gerüstfunktion als Substrat des EMPs dar, das oben beschrieben wurde, um eine Zusammensetzung bereitzustellen, die ferner die verzögerte Freisetzung in einer fokalen Verabreichung an Zielorten ermöglicht.
Das TGF-β-Rest und der EMP-Rest sind gegebenenfalls durch Linkersequenz-Aminosäuren verbunden. Linkersequenzen können auf Grundlage ihrer besonderen Eigenschaften, die sie dem chimären Protein verleihen, ausgewählt werden. Beispielsweise werden Aminosäuresequenzen wie Ile-Glu-Gly-Arg und Leu-Val-Pro-Arg durch Faktor XA und Thrombin-Enzyme gespalten. Der Einbau von Sequenzen, die durch proteolytische Enzyme gespalten werden in das chimäre Protein stellt eine Spaltung an der Bindungsstelle nach Exposition gegenüber dem geeigneten Enzym und die Trennung der Domänen in getrennte Einheiten bereit. 15 stellt eine Aminosäuresequenz für ein TGF-β₁/Kollagen IA-chimäres Protein (SEQ ID NO: 8) dar. Die dargestellte Aminosäuresequenz schließt die Kollagen-Domäne (1–1057) und eine reife Form von TGF-β₁ (1060–1171) ein.
Ein chimäres DNA-Konstrukt schließt ein Gen ein, das TGF-β₁ codiert oder ein Fragment davon, oder ein Gen, das TGF-β₂ oder ein Fragment davon codiert, oder ein Gen, das TGF-β₃ oder ein Fragment davon codiert, welches mit einer DNA-Sequenz, welche ein EMP-Protein codiert, ligiert ist, wie beispielsweise Kollagen (I–IV), Fibrin, Fibrinogen, Fibronectin, Elasin oder Laminin. Ein bevorzugtes chimäres DNA-Konstrukt kombiniert/DNA, die TGF-β₁ codiert, eine DNA-Linkersequenz, und eine DNA, die Kollagen IA codiert. Ein chimäres DNA-Konstrukt, das das TGF-β₁-Gen und ein Kollagen I (α)-Gen codiert, ist in den 16A bis 16C (SEQ ID NO: 9) gezeigt. Das dargestellte Konstrukt schließt eine XmnI-Linkersequenz (bp 1–19) ein, DNA, die eine Kollagen-Domäne codiert (bp 20–3190), eine BglII-Linkersequenz (bp 3191–3196), eine DNA, die die reife Form von TGF-β₁ codiert (3197–3535) und eine XbaI-Linkersequenz (bp 3536–3541).
Die für EMP codierende Sequenz kann stromaufwärts und/oder stromabwärts und im Leseraster mit einer codierenden Sequenz für den TGF-β ligiert sein. Die DNA, die das extrazelluläre Matrixprotein codiert, kann einen Teil eines Fragments des EMP codieren oder das gesamte EMP codieren. Gleichermaßen kann die DNA, die das TGF-β codiert, eines oder mehr Fragmente davon oder das gesamte Gen sein. Außerdem können zwei oder mehr verschiedene TGF-βs oder zwei oder mehr verschiedene EMPs stromaufwärts oder stromabwärts abwechselnder Reste ligiert sein.
In einer weiteren Ausführungsform ist ein Dermatansulfaproteoglycan-Rest, ebenfalls als Decorin oder Proteoglycan II bekannt, kovalent mit einem EMP verbunden, um ein chimäres Protein zu bilden. Decorin ist dafür bekannt, daß es an Typ I-Kollagen bindet, und daher die Fibrillenbildung beeinflußt, und die Zellanhaftungs-fördernde Aktivität von Kollagen und Fibrinogen durch Bindung an derartige Moleküle in der Nähe der Zellbindungsstellen inhibiert. Chimäre Proteine, die einen Decorin-Rest enthalten, wirken so, daß sie die Vernarbung heilenden Gewebes induzieren. Die Primärstruktur des Kernproteins von Decorin ist von der klonierten cDNA abgeleitet worden. Siehe Krusius et al., Primary Structure of an Extracellular Matrix Proteoglycan Core Protein-Deduced from Clones cDNA, Natl. Acad. Scil (USA), Bd. 83, S. 7683–7687 (1986).
Ein chimäres Decorin/(EMP-Protein schließt die bekannten Aktivitäten von Decorin ein, und stellt ein integrales Gerüst oder ein Substrat des EMPs, das oben beschrieben wurde, bereit, um eine Zusammensetzung hervorzubringen, die eine verzögerte Freisetzung durch fokale Verabreichung an Zielorte ermöglicht. 17A bis 17B stellen ein chimäres Decorin/Kollagen 1A-Protein (SEQ ID NO: 10) dar, bei dem die Kollagen-Domäne die Aminosäuren 1–1057 einschließt und das reife Decorin-Protein die Aminosäuren 1060–1388 einschließt. 18 stellt ein chimäres Decorin-Peptid/Kollagen IA-Protein (SEQ ID NO: 11) dar, in dem die helikale Domäne die Aminosäuren 1–1057 einschließt, und das Decorin-Peptidfragment die Aminosäuren 1060–1107 einschließt. Das Decorin-Peptidfragment setzt sich aus P46 bis G93 der reifen Form des Decorins zusammen.
Außerdem wird ein chimäres DNA-Konstrukt bereitgestellt, das ein Gen einschließt, das Decorin oder ein oder mehrere Fragmente davon codiert, welches gegebenenfalls über einen DNA-Linker mit einer DNA-Sequenz verbunden ist, die ein EMP codiert, wie beispielsweise Kollagen (I–IV), Fibrin, Fibrinogen, Fibronectin, Elastin oder Laminin. Ein bevorzugtes chimäres DNA-Konstrukt, kombiniert DNA, die Decorin codiert, eine DNA-Linkersequenz und DNA, die Kollagen I (α1) codiert. Ein chimäres DNA-Konstrukt, das ein Decorin-Gen und ein Kollagen I (α1)-Gen enthält, ist in 19A bis 19D (SEQ ID NO: 12) gezeigt. Das dargestellte Konstrukt schließt eine XmnI-Linkersequenz (bp 1–19), DNA, die eine Kollagen-Domäne codiert (bp 20–3190), ein BglII-Linkersequenz (bp 3191–3196), DNA, die eine reife Form von Decorin codiert (bp 3197–4186) und eine PstI-Linkersequenz an. Ein chimäres DNA-Konstrukt, das ein Decorin-Peptidgen und ein Kollagen I (α1)-Gen enthält, ist in den 20A bis 20C (SEQ ID NO: 13) gezeigt. Das dargestellte Konstrukt schließt eine XmnI-Linkersequenz (bp 1–19), DNA, die eine Kollagen-Domäne codiert (bp 20–3190), eine BglII-Linkersequenz (bp 3191–3196), DNA, die ein Peptid-Fragment von Decorin codiert (bp 3197–3343) und eine PstI-Linkersequenz (bp 3344–3349) ein.
Die codierende Sequenz für ein EMP kann stromaufwärts und/oder stromabwärts und im Leseraster mit einer codierenden Sequenz für Decorin ligiert sein. Die DNA, welche EMP codiert, kann ein Teil oder ein Fragment von EMP codieren oder das gesamte EMP codieren. Gleichermaßen kann die DNA, die Decorin codiert, ein Fragment davon sein oder das gesamte Gen. Außerdem können zwei oder mehr verschiedene EMPs stromaufwärts und/oder stromabwärts der DNA, die den Decorin-Rest codiert, ligiert sein.
Jedes der oben beschriebenen chimären DNA-Konstrukte kann in einen geeigneten Klonierungsvektor eingeschlossen sein. 21 stellt einen pMal-Klonierungsvektor dar, welcher eine Polylinker-Klonierungsstelle enthält. Beispiele derartiger Klonierungsvektoren sind die Plasmide pMal-p2 und pMal-c2 (kommerziell erhältlich von New England Biolabs). Das gewünschte Chimäre DNA-Konstrukt wird in eine Polylinkersequenz des Plasmids eingebaut, welche bestimmte nützliche Restriktionsendonuklease-Schnittstellen enthält, welche in 22 dargestellt sind (SEQ ID NO: 14). Die pMalp2-Polylinkersequenz hat XmnI-, EcoRI-, BamHI-, HindII-, XbaI-, SalI- und PstI-Restriktionsendonuklease-Schnittstellen, welche in 22 dargestellt sind. Die Polylinkersequenz wird mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease verdaut und das chimäre Konstrukt wird in den Klonierungsvektor durch Ligieren derselben mit DNA-Sequenzen des Plasmids eingebaut. Das chimäre DNA-Konstrukt kann mit dem Plasmid durch Verdauen der Enden des DNA-Konstrukts und dem Plasmid mit dem gleichen Restriktionendonukleasen verbunden werden, um "klebrige Enden" mit 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxyl-Gruppen zu erzeugen, die ermöglichen, daß das DNA-Konstrukt sich in dem Klonierungsvektor aneinander lagert. Lücken zwischen dem insertierten DNA-Konstrukt und dem Plasmid werden dann mit einer DNA-Ligase versiegelt. Andere Techniken zum Einbau des DNA-Konstruktes in Plasmid-DNA schließen die Ligierung über glatte Enden, Poly(dA.dT)-Schwanztechniken und die Verwendung chemisch synthetisierter Linker ein. Ein alternatives Verfahren zum Einschleusen des chimären DNA-Konstruktes in einen Klonierungsvektor ist der Einbau der DNA, welcher das extrazelluläre Matrixprotein codiert, in einen Klonierungsvektor, der bereits ein Gen enthält, welches einen therapeutisch wirksamen Rest codiert.
Die Klonierungsstellen in der oben angegebenen Polylinker-Schnittstelle ermöglichen der cDNA für chimäres Kollagen I (α1)/BMP-2B Protein, welches in den 14A–14C (SEQ ID NO: 7) dargestellt ist in die XmnI- und die HindIII-Schnittstellen inseriert zu werden. Die cDNA, welche das Kollagen I (21)(TGF-β₁)-Protein codiert, welches in den 16A bis 16C dargestellt ist (SEQ ID NO: 9) wird zwischen die XmnI- und die XbaI-Schnittstellen inseriert. cDNA, welche das Kollagen 1 (α1)/Decorin-Protein codiert, welches in den 19A bis 19D dargestellt ist (SEQ ID NO: 12), wird zwischen die XmnI- und die PstI-Schnittstellen inseriert. Die cDNA, die das Kollagen I (α1)/Decorin-Peptid codiert, ist in den 20A bis 20C (SEQ ID NO: 13) dargestellt, und ist zwischen die XmnI- und PstI-Schnittstellen inseriert.
Plasmide, die das chimäre DNA-Konstrukt enthalten, werden durch Standardtechniken, wie Gel-Elektrophorese, identifiziert. Verfahren und Materialien zur Herstellung rekombinanter Vektoren, die Transformation von Wirtszellen mit den Vektoren und die Wirtszellexpression von Polypeptiden sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, oben beschrieben. Allgemein können prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Plasmiden transformiert werden. Transformierte Wirtszellen können durch Phänotyp-Selektionsgene des Klonierungsvektors lokalisiert werden, welche eine Resistenz gegenüber einem bestimmten Antibiotikum ermöglichen, wenn die Wirtszellen in einem Kulturmedium gezüchtet werden, welches das Antibiotikum enthält.
Transformierte Wirtszellen werden isoliert und kultiviert, um die Expression des chimären Proteins zu fördern. Das chimäre Protein kann dann aus dem Kulturmedium isoliert werden und mit verschiedenen Verfahren wie Dialyse, Dichtegradientenzentrifugation, Flüssigsäulenchromatographie, isoelektrische Präzipitation, Lösungsmittelfraktionierung und Elektrophorese gereinigt werden. Jedoch ist die Reinigung des chimären Proteins durch Affinitätschromatographie bevorzugt, wodurch das chimäre Protein gereinigt wird, indem es an ein bindendes Protein ligiert wird, und indem es mit einem Liganden oder einem Substrat kontaktiert wird, für das das bindende Protein eine spezifische Affinität besitzt.
Um eine effizienterer Expression von Säuger- oder menschlichen eukaryontischen Genen in Bakterien (Prokaryonten) zu erzielen, kann das Säuger- oder menschliche Gen unter Kontrolle eines bakteriellen Promotors plaziert sein. Ein Proteinfusions- und ein Reinigungssystem wird verwendet, um das chimäre Protein zu gewinnen. Vorzugsweise wird jedes der oben erwähnten chimären DNA-Konstrukte in einen pMal-Vektor an eine Stelle in der Polylinkersequenz des Vektors kloniert. Infolgedessen wird das chimäre DNA-Konstrukt operativ mit dem malE-Gen des pMal-Vektors fusioniert. Das malE-Gen codiert das Maltose-bindende Protein (MBP). 23 stellt den pMal-Klonierungsvektor dar, der ein BMP/Kollagen-DNA-Konstrukt enthält. Eine Spacersequenz, die 10 Asparagin-Reste codiert, ist zwischen der malE-Sequenz und der Polylinkersequenz lokalisiert. Diese Spacersequenz isoliert MBP vom Protein von Interesse. 24, 25 und 26 stellen pMal-Klonierungsvektoren dar, die DNA enthalten, welche Kollagen-Chimären mit TGF-β₁, Decorin und einem Decorin-Peptid enthalten. Der pMal-Vektor, welcher irgendeines der chimären DNA-Konstrukte enthält, das mit malE-Gen fusioniert ist, wird in E. coli transformiert.
Die E. coli werden in einem Medium kultiviert, welches dazu führt, daß die Bakterien Maltose-bindendes Protein fusioniert an das chimäre Protein produzieren. Diese Technik verwendet den P_tac-Promotor des pMal-Vektors. MBP enthält eine 26 Aminosäuren lange N-terminale Signalsequenz, welche das chimäre MBP-Protein durch die Cytoplasma-Membran von E. coli leitet. Das Protein kann dann aus dem Periplasma gereinigt werden. Alternativ dazu kann der pMal-c2-Klonierungsvektor in diesem Proteinfusions- und dem Reinigungssystem verwendet werden. Der pMal-c2-Vektor enthält eine exakte Deletion der malE-Signalsequenz, welche zu einer cytoplasmatischen Expression des Fusionsproteins führt. Ein Rohzellextrakt, welcher das Fusionsprotein enthält wird hergestellt und über eine Säule aus Amyloseharz geschüttet. Da MBP eine Affinität für die Amylose besitzt, bindet es an das Harz. Alternativ dazu kann die Säule jedes Substrat einschließen, für das MBP eine spezifische Affinität besitzt. Unerwünschte Proteine, welche in dem Rohextrakt vorhanden sind, werden durch die Säule durchgewaschen. Das MBP, welches an das chimäre Protein fusioniert ist, wird von der Säule mit einem neutralen Puffer eluiert, der Maltose oder eine andere verdünnte Lösung eines Desorptionsmittels zum Austauschen des Hybridpolypeptids enthält. Das gereinigte chimäre MBP-Protein wird mit einer Protease gespalten, wie beispielsweise Faktor Xa-Protease, um MBP von dem chimären Protein abzuspalten. Das pMal-p2-Plasmid hat eine Sequenz, welche die Erkennungsstelle für den Proteasefaktor Xa codiert, welcher nach der Aminosäuresequenz Isoleucin-Glutaminsäure-Glycin-Arginin der Polylinkersequenz spaltet.
Das chimäre Protein wird dann von dem abgespaltenen MBP durch Durchleiten der Mischung durch eine Amylosesäule getrennt. Ein alternatives Verfahren zur Abtrennung des MBPs vom chimären Protein läuft mittels Ionenaustauschchromatographie. Dieses System bringt bis zu 100 mg MBP-chimäres Protein pro Liter Kulturflüssigkeit. Siehe P. Riggs, in F. M. Ausebel, R. E. Klingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Hrsg.) Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 19 (16.6.1–16.6.10) (1990) Green Associates/Wiley Interscience, New York, New England Biolabs (Kat. # 800-65S 9pMALc2) pMal Protein and purification system (siehe auch europäisches Patent Nr. 286 239 ), welches ein ähnliches Verfahren zur Herstellung und Reinigung des Proteins, wie Kollagen, offenbart.)
Andere Protein-Fusions- und -Reinigungssysteme können verwendet werden, um chimäre Proteine herzustellen. Prokaryonten, wie E. coli, sind die bevorzugten Wirtszellen zur Expression des chimären Proteins. Jedoch sind Systeme, die eukaryontische Wirtszelllinien benutzen, ebenfalls annehmbar, wie beispielsweise Hefe, menschliche, Maus-, Ratten-, Hamster-, Affen-, Amphibien-, Insekten-, Algen- und Pflanzenzelllinien. Beispielsweise HeLa (menschliches Epithel), 3T3 (Mausfibroblasten), CHO (Ovarzellen des Chinesischen Hamsters) und SP 2 (Mausplasmazellen) sind annehmbare Zelllinien. Die jeweiligen Wirtszellen, die ausgewählt werden, sollten mit dem jeweiligen Klonierungsvektor, der ausgewählt wird, kompatibel sein.
Ein anderes annehmbares Protein-Expressionssystem ist das Baculovirus-Expressionssystem, das von Invitrogen, San Diego, Californien, hergestellt wird. Baculoviren bilden auffällige Kristalleinschlußkörperchen innerhalb der Kerne der Zellen, die die infizieren. Jedes Kristalleinschlußkörperchen besteht aus zahlreichen Viruspartikeln, die in ein Protein eingehüllt sind, welches als Polyhedrin bezeichnet wird. In dem Baculovirus-Expressionssystem wird das native Gen, welches Polyhedrin codiert, durch ein DNA-Konstrukt substituiert, welches ein Protein oder Peptid mit einer gewünschten Aktivität codiert. Das Virus stellt dann große Mengen des Proteins her, welches durch das fremde DNA-Konstrukt codiert wird. Der bevorzugte Klonierungsvektor zur Verwendung innerhalb dieses Systems ist pBlueBac III (erhältlich von Invitrogen, San Diego, Californien). Das Baculovirussystem verwendet das Autograph califormica multiple nukleare Polyhydrose-Virus (ACMNPV) reguliert Polyhedrin-Promotorsystem, um die Expression fremder Gene zu regulieren. Das chimäre Gen, d. h. das DNA-Konstrukt, welches das chimäre Protein codiert, wird in den pBlueBac III-Vektor direkt stromabwärts des Baculoviruspolyhedrin-Promotors inseriert.
Der pBlueBac III-Transfervektor enthält einen B-Galactosidase-Reportergen, welches die Identifizierung des rekombinanten Virus ermöglicht. Das B-Galactosidase-Gen wird durch den Baculovirus ETL-Promotor (P_ETL) angetrieben, welcher in entgegengesetzter Richtung zum Polyhedrin-Promotor (P_PH) und der multiplen Klonierungsstelle des Vektors angeordnet ist. Dadurch co-exprimiert das rekombinante Virus B-Galactosidase und das chimäre Gen.
Spodoptera frugiperda (Sf9)-Insektenzellen werden kann mit der viralen DNA des Wildtyps und dem pBlueBac III-Vektor co-transfiziert, welcher das chimäre Gen enthält. Die Rekombinationssequenzen in dem pBlueBac III-Vektor steuern die Integration des Vektors in das Genom des Wildtyp-Baculovirus. Eine homologe Rekombination tritt auf, welche zum Austausch des nativen Polyhedrin-Gens des Baculovirus durch das DNA-Konstrukt führt, welches das chimäre Protein codiert. Wildtyp-Baculovirus, welches nicht fremde DNA codiert, exprimiert das Polyhedrin-Protein im Kern der infizierten Insektenzellen. Jedoch produzieren die Rekombinanten das Polyhedrin-Protein nicht und produzieren keine viralen Einschlußkörperchen. Statt dessen produzieren die Rekombinanten das chimäre Protein.
Alternative Insektenwirtszellen zur Verwendung mit diesem Expressionssystem sind die Sf21-Zelllinie, die von Spodoptera frugiperda stammt und High Five-Zellinien, die von Trichoplusia ni stammen.
Andere annehmbare Klonierungsvektoren schließen Phagen, Cosmide oder künstliche Chromosomen ein. Beispielsweise ist der Bakteriophage Lambda ein nützlicher Klonierungsvektor. Dieser Phage kann Stücke fremder DNA mit bis zu ungefähr 20 000 Basenpaaren Länge aufnehmen. Das Lambda-Phagengenom ist ein lineares doppelsträngiges DNA-Molekül mit einzelsträngigen komplementären (kohäsiven) Enden, die miteinander hybridisieren können, wenn sie innerhalb einer infizierten Wirtszelle vorliegen. Die Lambda-DNA wird mit einer Restriktionsendonuklease ausgeschnitten, und die fremde DNA, z. B. die DNA die kloniert werden soll, wird mit den Phagen-DNA-Fragmenten ligiert. Das erhaltene rekombinante Molekül wird dann in infektiöse Phagenpartikel verpackt. Wirtszellen werden mit den Phagenpartikeln infiziert, welche die rekombinante DNA enthalten. Die Phagen-DNA repliziert sich in der Wirtszelle, um viele Kopien der gewünschten DNA-Sequenz herzustellen.
Cosmide sind Hybrid-Plasmid/Bacteriophagen-Vektoren, die verwendet werden können, um DNA-Fragmente von ungefähr 40 000 Basenpaaren zu klonieren. Cosmide sind Plasmide, die ein oder mehrere DNA-Sequenzen haben, die als "cos"-Stellen bezeichnet werden, welche aus dem Bacteriophagen Lambda stammen, um Lambda-DNA in infektiöse Phagenpartikel zu verpacken. Zwei Cosmide werden mit der zu klonierenden DNA ligiert. Das erhaltene Molekül wird in infektiöse Lambda-Phagenpartikel verpackt und in Bakterien-Wirtszellen transfiziert. Wenn die Cosmide innerhalb der Wirtszelle sind, verhalten sie sich wie Plasmide und multiplizieren sich unter der Kontrolle eines Replikationsursprungs des Plasmids. Der Replikationsursprung ist eine DNA-Sequenz, die einem Plasmid ermöglicht, sich innerhalb einer Wirtszelle zu multiplizieren.
Künstliche Chromosomenvektoren der Hefe ähneln Plasmiden, ermöglichen aber den Einbau viel größerer DNA-Sequenzen von ungefähr 400 000 Basenpaaren. Die künstlichen Hefe-Chromosomen enthalten Sequenzen zur Replikation in Hefe. Das künstliche Hefe-Chromosom enthält die DNA, die in Hefezellen zu klonieren und zu transformieren ist, wo sie sich repliziert, wodurch viele Kopien der gewünschten DNA-Sequenz hergestellt werden. Wenn Phagen, Cosmide oder künstliche Hefe-Chromosome als Klonierungsvektoren verwendet werden, kann die Expression des chimären Proteins durch Kultivierung von Wirtszellen, die mit dem Klonierungsvektor transfiziert oder transformiert worden sind, in einem geeigneten Kulturmedium gewonnen werden.
Chimäre Proteine, die hier offenbart werden, sind zur Verwendung in der Behandlung von Säugern oder anderen Tieren beabsichtigt. Die therapeutisch wirksamen Reste, die oben beschrieben wurden, zum Beispiel osteogene Mittel wie beispielsweise BMPs, TGFs, Decorin und/oder Fragmente davon sind alle so anzusehen, daß sie von physiologisch aktiven Mitteln für Zwecke dieser Beschreibung fungieren oder davon stammen. Die chimären Proteine und DNA-Konstrukte, die eine Domäne einschließen, welche von einem oder mehreren zellulären physiologisch aktiven Mitteln stammen, können für die therapeutische Behandlung in vivo, für die Forschung in vitro und/oder für diagnostische Zwecke im allgemeinen verwendet werden.
Wenn sie in vivo verwendet werden, können Formulierungen, die die vorliegenden chimären Proteine enthalten in direktem Kontakt mit lebendem Gewebe plaziert werden, einschließlich des Knochens, um das Wachstum, die Reparatur und/oder den Austausch derartigen Gewebes zu induzieren oder zu verstärken. Dies kann durch die Anwendung des chimären Proteins direkt an die Zielstelle während eines chirurgischen Eingriffs erreicht werden. Es wird in Erwägung gezogen, daß minimal invasive Techniken wie beispielsweise die Endoskopie verwendet werden sollen, um ein chimäres Protein an einem gewünschten Ort zu applizieren. Formulierungen, die chimäre Proteine enthalten, welche hier offenbart sind, können einfach aus einem oder mehreren chimären Proteinen bestehen, oder sie können ein oder mehr pharmazeutisch annehmbare Adjuvantien einschließen.
Jedes der oben beschriebenen chimären Proteine kann mit einem Implantat in Kontakt gebracht werden, daran angeheftet werden oder sonstwie eingebaut werden, wie beispielsweise in eine Vorrichtung zur Verabreichung von Medikamenten oder eine Prothesenvorrichtung. Chimäre Proteine können durch Liposomen oder andere Membran-bildende Materialien wie Alginsäure-Derivate vor dem Implantieren mikroverkapselt oder makroverkapselt werden und dann in Form eines taschenartigen Implantats implantiert werden. Das chimäre Protein kann in Strukturen in Form von Kugeln, Aggregaten aus Kernmaterial, welche in einem Kontinuum aus Wandmaterial oder kapillarer Formen eingebaut ist, mikroverkapselt werden. Mikroverkapselungstechniken sind im Fachgebiet gut bekannt und sind in der Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Bd. 9, S. 724 et. seq. (1980) beschrieben.
Chimäre Proteine können ebenfalls auf medizinisch nützliche Materialien geschichtet werden oder darin eingebaut werden, wie beispielsweise Netze, Tupfer, Wundbedeckung- oder Prothesevorrichtungen wie Stäbchen, Nägel, Knochen-Platten, künstliche Gelenke, künstliche Gliedmaßen oder Knochenverbesserungs-Implantate eingebaut sein. Die Implantate können teilweise aus biokompatiblen Materialien wie Glas, Metall, Keramik, Calciumphosphat oder auf Calciumcarbonat basierenden Materialien hergestellt sein. Implantate mit biokompatiblen Biomaterialien sind im Fachgebiet gut bekannt und sind alle für die Verwendung hiernach geeignet. Implantierte Biomaterialien, die aus natürlichen Quellen stammen, wie beispielsweise Proteinfasern. Polysaccharide und behandelte natürlich gewonnene Gewebe werden in der Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Bd. 2, S. 267 et seq. (1989) beschrieben. Synthetische biokompatible Polymere sind im Fachgebiet gut bekannt und sind ebenfalls geeignete Implantatmaterialien. Beispiele solcher geeigneter synthetischen Polymere schließen Urethane, Olefine, Terephthalate, Acrylate, Polyester und ähnliche ein. Andere annehmbare Implantatmaterialien sind biologisch abbaubare Hydrogele oder Aggregate aus dicht verpackten Partikeln wie Polymethylmethacrylat-Kügelchen, die eine polymerisierte Hydroxyethylmethacrylat-Beschichtung haben. Siehe Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Bd. 2, S. 267 et seq. (1989).
Das hier beschriebene chimäre Protein stellt einen nützlichen Weg zur Immobilisierung oder Beschichtung physiologisch annehmbarer Mittel oder eines pharmakologisch annehmbaren Vehikels zur Verabreichung des physiologisch wirksamen Mittels an gewünschte Stellen im lebenden Gewebe bereit. Geeignete Vehikel schließen solche ein, die aus biologisch absorbierbaren Polymeren, biologisch kompatiblen nicht-absorbierbaren Polymeren, Lacton-Masse und gebrannten Gips hergestellt sind. Beispiele geeigneter biologisch absorbierbarer und biologisch kompatibler Polymere schließen Homopolymere, Copolymere und Mischungen aus Hydroxysäuren wie Lactide und Glycolide ein, andere absorbierbare Polymere, die alleine oder in Kombination mit Hydroxysäuren verwendet werden können, schließen Dioxanone, Carbonate wie Trimethylencarbonat, Lactone wie Caprolacton, Polyoxyalkylene und Oxylate ein. Siehe Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Bd. 2, S. 230, et seq. (1989).
Diese Vehikel können in Form von Kügelchen, Partikel, Masse, Beschichtungen oder schichtbildenden Trägern vorliegen. Diffusionssysteme in denen ein Kern des chimären Proteins durch eine poröse Membranschicht umhüllt ist, sind andere annehmbare Vehikel.
In einem weiteren Aspekt kann die Menge des Transports des Aminosäureanalogons in eine Zielzelle durch Kontrollieren der Tonizität des Wachstumsmediums reguliert werden. Eine hypertones Wachstumsmedium erhöht die Aufnahme von trans-4-Hydroxyprolin in E. coli, wie in 2A dargestellt ist. Alle bekannten Verfahren zur Erhöhung der Osmolalität von Wachstumsmedium sind für die Verwendung hier geeignet, einschließlich der Zugabe von Salzen, wie Natriumchlorid, KCl, MgCl₂ und ähnliche, und von Zuckern, wie Saccharose, Glucose, Maltose etc. und Polymeren wie Polyethylenglykol (PEG), Dextran, Cellulose, etc. und anderen Aminosäuren wie Glycin. Die Erhöhung der Osmolalität von Wachstumsmedium führt zu einer größeren intrazellulären Konzentration an Säureanaloga und einem höheren Ausmaß der Komplexierung von Aminosäure-Analoga mit tRNA. Infolgedessen erzielen Proteine, die durch die Zelle hergestellt werden, eine höhere Einbaurate von Aminosäure-Analoga. 12 stellt den Prozentsatz des Einbaus von Prolin und Hydroxyprolin in MBP unter isotonischen und hypertonischen Medien-Bedingungen im Vergleich mit Prolin im ursprünglichem MBP dar. Das heißt, daß die Manipulierung der Osmolalität zusätzlich zum Einstellen der Konzentration der Aminosäure-Analoga im Wachstumsmedium einen zweiseitigen Einsatz ermöglicht, um deren Aufnahme in prokaryontische Zellen und eukaryontische Zellen zu regulieren, wie oben beschrieben wurde, und infolgedessen den Einbau in die Zielpolypeptide.
Jedes Wachstumsmedium kann hier verwendet werden, einschließlich kommerziell verfügbaren Wachstumsmediums wie M9-Minimalmedium (erhältlich von Gibco Life Technologies, Inc.), LB-Medium, NZCYM-Medium, "terrific broth", SOB-Medium und anderer, die im Fachgebiet gut bekannt sind.
Kollagen für verschiedene Gewebe kann verschiedene Mengen an trans-4-Hydroxyprolin enthalten. Beispielsweise enthalten die Gewebe, die eine größere Festigkeit benötigen, wie beispielsweise Knochen, eine größere Anzahl an trans-4-Hydroxyprolin-Resten als Kollagen in Geweben, die weniger Stärke benötigen, zum Beispiel Haut. Das vorliegende System stellt ein Verfahren zum Einstellen der Menge an trans-4-Hydroxyprolin in Kollagen, Kollagen-Fragmenten, Kollagen-artigen Peptiden und chimären Peptiden mit einer Kollagen-Domäne, einem Fragment einer Kollagen-Domäne oder einer Domäne eines Kollagen-artigen Peptids, das mit einer physiologisch wirksamen Domäne fusioniert ist, da durch Erhöhung oder Senkung der Konzentration an trans-4-Hydroxyprolin im Wachstumsmedium die Menge an trans-4-Hydroxyprolin, welche in derartige Polypeptide eingebaut wird, erhöht oder entsprechend gesenkt wird. Das Kollagen, Kollagen-Fragmente, Kollagen-artige Peptide und die oben erwähnten chimären Peptide können mit Hilfe vorherbestimmter Mengen an trans-4-Hydroxyprolin exprimiert werden. Auf diese Weise können die physikalischen Eigenschaften einer extrazellulären Matrix auf Grundlage der Anforderung für die endgültige Verwendung eingestellt werden. Ohne die Absicht an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird davon ausgegangen, daß der Einbau von trans-4-Hydroxyprolin in die EMP-Reste hier eine Grundlage der Selbstaggregierung, die hier beschrieben ist, bereitstellt.
Nach einem weiteren Aspekt spiegelt die Kombination des Einbaus von trans-4-Hydroxypolin in Kollagen und Fragmente davon unter Verwendung von hyperosmotischen Medien und Genen, die verändert worden sind, so daß die Codon-Verwendung stärker die wieder angibt, die in E. coli gefunden wird, als die Aminosäuresequenz, die im nativen menschlichen Kollagen gefunden wird, überraschend die Produktion menschlichen Kollagens und Fragmenten davon durch E. coli wieder, welche in der Lage waren, sich selbst zu aggregieren.

Die menschliche Kollagen-Typ I (α₁)-Gen-Sequenz (27A–27E) (SEQ ID NO: 15) enthält eine große Anzahl an Glycin- und Prolin-Codons (347 Glycin und 240 Prolin-Codons), welche in einer stark repetitiven Weise angeordnet sind. Tabelle I unten ist eine tabellenartige Darstellung der Codon-Frequenz für menschliches Typ I (α₁)-Kollagen-Gen. Von besonderer Bedeutung ist, daß der GGA-Glycin-Codon 64-mal auftritt und der CCC-Codon für Prolin 93-mal auftritt. Diese beiden Codons werden als seltene Codons in E. coli angesehen. Siehe P. M. Sharp und W.-H. Li, Nucleic Acids Res. 14: 7737–7749, 1986. Diese und ähnliche Erwägungen anderer menschlicher Kollagen-Gene, die hier gezeigt werden, sind für die Schwierigkeit, menschliche Kollagen-Gene in E. coli zu exprimieren, verantwortlich. Tabelle I

Codon	Anzahl	Prozentsatz	Codon	Anzahl	Prozentsatz
TTT-Phe	1	0,09	TCT-Ser	18	1,70
TTC-Phe	14	1,32	TCC-Ser	4	0,37
TTA-Leu	0	0,00	TCA-Ser	2	0,18
TTG-Leu	3	0,28	TCG-Ser	0	0,00
CTT-Leu	4	0,37	CCT-Pro	141	13,33
CTC-Leu	7	0,66	CCC-Pro	93	8,79
CTA-Leu	0	0,00	CCA-Pro	6	0,56
CTG-Leu	7	0,66	CCG-Pro	0	0,00
ATT-Ile	6	0,56	ACT-Thr	11	1,04
ATC-Ile	0	0,00	ACC-Thr	4	0,37
ATA-Ile	1	0,09	ACA-Thr	2	0,18
ATG-Met	7	0,66	ACG-Thr	0	0,00
GTT-Val	10	0,94	GCT-Ala	93	8,79
GTC-Val	5	0,47	GCC-Ala	24	2,27
GTA-Val	0	0,00	GCA-Ala	6	0,56
GTG-Val	5	0,47	GCG-Ala	0	0,00

Tabelle I (Fortsetzung)

Codon	Anzahl	Prozentsatz	Codon	Anzahl	Prozentsatz
TAT-Tyr	2	0,18	TGT-Cys	0	0,00
TAC-Tyr	2	0,18	TGC-Cys	0	0,00
TAA-***	0	0,00	TGA-***	0	0,00
TAG-***	0	0,00	TGG-Trp	0	0,00
CAT-His	0	0,00	CGT-Arg	26	2,45
CAC-His	3	0,28	CGC-Arg	6	0,56
CAA-Gln	13	1,22	CGA-Arg	11	1,04
CAG-Gln	17	1,60	CGG-Arg	1	0,09
AAT-Asn	6	0,56	AGT-Ser	4	0,37
AAC-Asn	5	0,47	AGC-Ser	11	1,04
AAA-Lys	19	1,79	AGA-Arg	9	0,85
AAG-Lys	19	1,79	AGG-Arg	0	0,00
GAT-Asp	23	2,17	GGT-Gly	174	16,46
GAC-Asp	11	1,04	GGC-Gly	97	9,17
GAA-Glu	24	2,27	GGA-Gly	64	6,05
GAG-Glu	25	2,36	GGG-Gly	11	1,04

In einem ersten Schritt wird die Sequenz des heterologen Kollagen-Gens geändert, um die Codon-Neigung in E. coli, die in den Codon-Verwendungstabellen (siehe z. B. Ausubel et al. (1995), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, New York; Wada et al., 1992, oben) widerzuspiegeln. Seltene E. coli-Codons (siehe P. M. Sharp und W.-H. Li, Nucleic Acids Res. 14: 7737–7749, 1986) werden vermieden. Zum Zweiten werden einzigartige Restriktionsenzym-Schnittstellen ausgewählt, die ungefähr alle 120 bis 150 Basenpaare in der Sequenz vorkommen. In einigen Fällen setzt dies die Änderung der Nukleotidsequenz voraus, aber es ändert die Aminosäuresequenz nicht. Drittens werden Oligos aus ungefähr 80 Nukleotiden so synthetisiert, daß wenn zwei derartige Oligos miteinander verbunden werden und durch eine DNA-Polymerase verlängert werden, sie einen ungefähr 120–150 Basenpaare langen Abschnitt des Gens rekonstruieren (28). Der Abschnitt des Gens, welcher den ganz am Aminoterminus liegenden Anteil des Proteins codiert, hat einen Methionin(ATG)-Startcodon am 5'-Ende und eine einzigartige Restriktionsschnittstelle, der ein Stopp(TAAT)-Signal am 3'-Ende folgt. Die verbliebenen Abschnitte haben einzigartige Restriktionsschnittstellen an den 5'-Enden und einzigartige Restriktionsschnittstellen, gefolgt durch ein TAAT-Stopp-Signal am 3'-Ende. Das Gen wird durch sequentielle Zufügung jedes Abschnitts zum vorhergehenden 5'-Abschnitt zusammengebaut. Auf diese Weise kann jeder sukzessive größere Abschnitt unabhängig konstruiert und exprimiert werden. 28 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des menschlichen Kollagen-Gens, ausgehend von synthetischen Oligos.
Ein Fragment der menschlichen Typ 1 α1-Kollagen-Kette, welche an den C-Terminus der Glutathion-S-Transferase (GST-D4, 29) (SEQ ID NO: 18) fusioniert ist, wurde hergestellt und hinsichtlich der Expression in dem E. coli-Stamm JM109 (F^–) unter Bedingungen eines hyperosmotischen Schocks getestet. Das Kollagen-Fragment schloß die C-terminalen 193 Aminosäuren der dreifach-helikalen Region ein und die 26 Aminosäuren des C-terminalen Telopeptids ein. 29 ist ein Schema der Aminosäuresequenz von GST-ColECol (SEQ ID NO: 17) und GST-D4 (SEQ ID NO: 18) Fusionsproteinen. ColECol umfaßt 17 Aminosäuren des N-terminalen Telopeptids, 338 sich wiederholende Gly-X-Y Tripeptide und das 26 Aminosäure lange C-terminale Telopeptid. Es gibt ein einzigartiges Methionin an der Verbindung zwischen GST und D4, gefolgt von 64 Gyl-X-Y-Wiederholungen und dem 26 Aminosäure langen Telopeptid. Der Rest (Phel99) in dem C-terminalen Telopeptid von D4, wo Pepsin spaltet, ist angegeben. Das Gen wurde für das Kollagen-Fragment synthetisiert, von dem synthetische Oligonukleotide entworfen wurden, um die optimale Verwendung durch E. coli widerzuspiegeln. 30 ist eine Tabelle, die das Auftreten der vier Prolin- und vier Glycin-Codons im menschlichen Typ I α1-Gen (HCol) und dem Typ 1 α1-Gen mit optimierter E. coli-Codonverwendung (ColECol) darstellt. Die Verwendung der verbliebenen Codons in ColECol wurde ebenfalls für die E. coli-Expression nach Warda et al., oben, optimiert. Wie in Wada et al. beschrieben wird, sind die Eigenschaften der Codon-Verwendung eines breiteren Bereichs an Organismen wie auch Viren und Organellen, die Häufigkeit (pro Tausend) der Codon-Verwendung in jedem Organismus, für die mehr als 20 Gene verfügbar sind auf Grundlage der Summierung der Anzahl der Codon-Verbindungen zu berechnen. Das Protein GST-D4 wurde effizient in JM109 (F^–) in Minimalmedium, das kein Prolin enthält, das aber mit Hyp und NaCl supplementiert ist (siehe 31 und 32) exprimiert. Die Expression war von der Induktion mit Isopropyl-1-thio-β-galactopyranosid (IPTG), trans-4-Hydroxyprolin und NaCl abhängig. Bei einer festgelegten NaCl-Konzentration von 500 mM war die Expression bei trans-4-Hydroxyprolin-Konzentrationen unter ~20 mM minimal, während das Expressionsniveau bei trans-4-Hydroxyprolin-Konzentrationen über 40 mM ein Plateau erreichte. Siehe 31, welche ein Gel darstellt, das die Expression und Abhängigkeit der Expression von GST-D4 von Hydroxyprolin zeigt. Die Konzentration von Hydroxyprolin ist über jeder Spur angegeben. Das Osmolyt (NaCl) wurde zu 500 mM in jede Kultur gegeben und jede wurde mit 1,5 mM IPTG induziert. Der Pfeil gibt die Position von GST-D4 an. Gleichermaßen führten bei einer festgelegten trans-4-Hydroxyprolin-Konzentration von 40 mM NaCl Konzentrationen unter 300 mM zu einer geringen Proteinanhäufung und die Expression sank bei über 700 bis 800 mM NaCl. Siehe 32, welche ein Gel zeigt, daß die Expression von GST-D4 in hyperosmotischem Medium zeigt. Die Spuren 2 und 3 sind nicht-induzierte bzw. induzierte Proben, jeweils ohne zugegebenes Osmolyt. Die Identität und Menge des Osmolyts ist über jeder der anderen Spuren angegeben. trans-4-Hydroxyprolin wurde zu 40 mM in jeder Kultur gegeben, und die Kulturen, ausgenommen der in Spur 1, wurden mit 1,5 mm IPTG induziert. Der Pfeil gibt die Position von GST-D4 an.
Sowohl Saccharose oder KCl kann NaCl als Osmolyt substituieren (siehe 32). So war die durch den osmotischen Schock vermittelte intrazelluläre Anhäufung von trans-4-Hydroxyprolin eher eine kritische Determinante der Expression als die präzise chemische Identität des Osmolyts. Trotz der großen Anzahl an Prolinen (66) in GST-D4, seiner Größe (46 kDa) und der nicht-optimalen Wachstumsbedingungen wurde es zu ungefähr 10% des gesamten zellulären Proteins exprimiert. Exprimierte Proteine von geringerer als der vollständigen Länge, welche ein Hinweis auf eine abgebrochene Transkription, Translation oder mRNA Instabilität sind, wurden nicht nachgewiesen.
Das Gen für Protein D4 enthält 52 Prolin-Codons. In Expressionsexperimenten, die in den 31 und 32 widergespiegelt sind, wurde erwartet, daß trans-4-Hydroxyprolin an jedem dieser Codons inseriert werden würde, was zu einem Protein führen würde, in dem trans-4-Hydroxyprolin alle Proline substituiert worden ist. Um das zu bestätigen, wurde GST-D4 mit BrCN in 0,1 N HCl an den Methioninen innerhalb von GST und an den einzigartigem Methionin am N-Terminus des D4 gespalten, und D4 wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Unbehandeltes GST-D4 wurde in 0,1 M HCl in einer Rundbodenflasche unter Rühren gelöst. Nach der Zugabe eines 2- bis 10-fachen molaren Überschusses an reinem, kristallinem BrCN, wurde die Flasche geleert und mit Stickstoff gefüllt. Die Spaltung wurde für 24 Stunden ablaufen lassen, worauf das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde. Der Rest wurde in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) gelöst und durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac C4 RP-HPLC-Säule (10 × 250 mm, 5 μ, 300 Å) auf einem BioCad Sprint-System (Perceptive Biosystems, Framingham, MA) gereinigt. D4 wurde mit einem Gradienten aus 15 zu 40% Acetonitril/0,1% TFA über einen Zeitraum von 45 Minuten eluiert. D4 eluierte als einzelner Gipfel bei 25% Acetonitril/0,1% TFA. Standard-BrCN-Spaltbedingungen/70% Ameisensäure) führten zu einer umfassenden Formylierung von D4, vermutlich an den Hydroxyl-Gruppen der trans-4-Hydroxyprolin-Reste. Die Formylierung von BrCN/Ameisensäure-gespaltenen Proteinen ist zuvor beschrieben worden (Beavis et al., Anal. Chem., 62, 1836 (1990)). Die Aminosäure-Analyse wurde auf einem Beckman-Ionenaustausch-Instrument mit Post-Säulen-Derivatisierung durchgeführt. Die N-terminale Sequenzierung wurde auf einem Applied Biosystems-Sequenziergerät durchgeführt, das mit einem on-line HPLC-System ausgerüstet ist. Elektrospray-Massenspektren wurden mit einem VG Biotech BIO-Q-Quadropol-Analysegerät von M-Scan Inc. (West Chester, PA) gewonnen. Für CD-Temperaturschmelzen wurde die Temperatur in 0,5°C-Anstiegen von 4°C auf 85°C mit einer 4-minütigen Äquilibrierung zwischen den Schritten erhöht. Die Daten wurden bei 221,5 nm aufgezeichnet. Die thermische Umwandlung wurde unter Verwendung des Programms ThermoDyne (MORE) berechnet. Die Elektrospray-Massenspektroskopie dieses Proteins ergab ein einzelnes molekulares Ion, das einer Masse von 20,807 Da entspricht. Diese Masse liegt innerhalb von 0,05% dessen, was für D4 erwartet würde, falls es 100% trans-4-Hydroxyprolin anstelle von Prolin enthält. Prolin wurde in der Aminosäure-Analyse des gereinigten D4 nicht entdeckt, das wiederum mit einer kompletten Substituierung von trans-4-Hydroxyprolin für Prolin übereinstimmt. Um ferner zu bestätigen, daß die trans-4-Hydroxyprolin-Substituierung nur an den Prolin-Codons aufgetreten ist, wurden die die 13 N-terminalen Aminosäuren von D4 wie oben sequenziert. Die ersten 13 Codons von D4 geben die Proteinsequenz H₂N-Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Pro-Gly-Glu-Ser-Gly (SEQ ID NO: 41) an. Die Sequenz, die gefunden wurde, war H₂N-Gly-Hyp-Hyp-Gly-Leu-Ala-Gly-Hyp-Hyp-Gly-Glu-Der-Gly (SEQ ID NO: 42) siehe 69. Zusammengefaßt zeigen diese Ergebnisse, daß trans-4-Hydroxyprolin (Hyp) nur an den Prolin-Codons inseriert war, und daß die Zuverlässigkeit der Translationsmaschinerie von E. coli in sonstiger Weise weder durch die hohen intrazellulären Konzentrationen von trans-4-Hydroxyprolin oder durch hyperosmotische Kulturbedingungen geändert war.
Um zu bestimmen, ob D4, welches trans-4-Hydroxyprolin sowohl an den X- und Y-Positionen enthält, homotrimere Helices bildet und um die Stabilität des nativen Kollagens damit zu vergleichen, wurde folgendes bemerkt: In Phosphatpuffer mit neutralen pH weist D4 ein zirkuläres Dichroismus(CD)-Spektrum auf, das charakteristisch für eine Tripelhelix ist (siehe 33 und Bhatnagar et al., Circular Dichoism and the Conformational Analysis of Biomolecules, G. D. Fasman, Hrsg. Plenun Press, New York (1966, S. 183). 33 stellt die zirkulären Dichoismus-Spektren von nativem und wärme-denaturiertem D4 in neutralem Phosphatpuffer dar. HPLC-gereinigtes D4 wurde in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0, auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml gelöst (E²⁸⁰ = 3628 M^–1·cm^–1). Die Lösung wurde bei 4°C für 2 Tage inkubiert, um zu ermöglichen, daß sich vor der Analyse Tripelhelices bilden. Die Spektren wurden auf einem Aviv-Modell 62DS-Spektropolarimeter (Yale University, Molecular Biophysics und Biochemistry Department) gewonnen. Eine 1 mm-Weglänge Quarz-Suprasil-Fluorimeterzelle wurde verwendet. Nach einer 10-minütigen Inkubationsdauer bei 4°C wurden Standard-Wellenspektren von 260 bis 190 nm unter Verwendung von 10-sekündigen Akquisitions-Zeiträumen und 0,5 nm Scan-Schritten aufgezeichnet. Dieses Spektrum wird durch eine negative Elliptizität bei 198 nm und positive Elliptizität bei 221 nm gekennzeichnet. Die Größenordnungen beider dieser Absorptionen waren in neutralem pH-Puffer größer, wenn es mit sauren Bedingungen verglichen wurde. Eine vergleichbare Abhängigkeit der Stabilität vom pH-Wert ist für Kollagen-artige Dreifach-Helices bemerkt worden. Siehe z. B. Venugopal et al., Biochemistry 33, 7948 (1994). Die Erwärmung auf 85°C für 5 Minuten vor dem Gewinnen des CD-Spektrums senkte das Ausmaß der Absorption bei 198 nm und verhinderte die Absorption bei 221 nm (33). Dieses Verhalten ist ebenfalls typisch für die Tripelhelix-Struktur von Kollagen. Siehe R. S. Bhatnagar et al., Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules, G. D. Gasman Hrsg. oben. Ein thermisches Schmelzprofil von D4, das wie oben angegeben in Phosphatpuffer durchgeführt wurde, ergab eine Schmelztemperatur von 29°C. Ein Fragment der C-terminalen Region der Kollagen-Kette von Typ α1 vom Rind, welche mit der Länge von D4 vergleichbar ist, bildet homotrimere Helices mit einer Schmelztemperatur von 26°C. (Siehe A. Rossi et al., Biochemistry 35, 6048 (1996)).
Die Resistenz gegenüber einem Pepsinverdau ist ein zweiter häufig verwendeter Hinweis auf die Dreifachhelix-Struktur. Bei 4°C wird der größte Teil von D4 schnell durch Pepsin in ein Protein von etwas geringerem Molekulargewicht verdaut. 34 ist ein Gen, das das Ergebnis des Verdaus von D4 mit Rinderpepsin zeigt. Gereinigtes D4 wurde in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0 auf 1,6 μg/μl gelöst und für 7 Tage bei 4°C inkubiert. Aliquots (10 μl) wurden in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen plaziert und mit Wasser und mit 1 M Essigsäure-Lösungen auf ein Endvolumen von 25 μl auf 20 mM endgültige Essigsäure-Konzentration eingestellt. Jedes Röhrchen wurde dann für 20 Minuten bei der angegebenen Temperatur inkubiert und Pepsin (0,5 μl einer 0,25 μg/μl-Lösung) wurde zu jedem Röhrchen hinzugegeben und der Verdau wurde für 45 Minuten ablaufen gelassen. Nach dem Verdau wurden Proben mit Beladungspuffer abgeschreckt und mittels SDS-PAGE analysiert. Jedoch ist das anfängliche Pepsin-Spaltprodukt gegenüber einem weiteren Verdau bis zu ungefähr 30°C resistent. Die aminoterminale Sequenzierung des ursprünglichen Pepsin-Spaltprodukts, wie oben zeigte daß der N-Terminus mit dem des D4 vollständiger Länge identisch war. Die obige Massenspektrumsanalyse des Verdauprodukts ergab ein Eltern-Ion mit einem Molekulargewicht, das mit der Spaltung des C-terminalen Telopeptids auf der N-terminalen Seite von Phe119 übereinstimmt (siehe 29), was vermuten läßt, daß dieser Teil des Proteins entweder kugelförmig ist oder von schlecht definierter Struktur und durch Pepsin leicht gespalten wird, wobei die tripelhelikale Region gegenüber einem Verdau resistent ist. So wurden trotz einer umfassenden trans-4-Hydroxyprolin für Prolin-Substituierung sowohl an den X- und Y-Positionen von D4 Tripelhelices gebildet, die eine ähnliche Stabilität wie Fragmente von Rinderkollagen vergleichbarer Größe haben, welche Hyp im normalen Prozentbereich haben und nur an der Y-Position.
Die Kollagen-Kette vollständiger Länge des menschlichen Typ I α1, obwohl sie mehr als viermal größer ist als D4, wurde ebenfalls als N-terminale Fusion mit GST (GST-ColECol, 29) in JM108 (F^–) in Hyp/NaCl-Medium exprimiert. 35 ist ein Gel, das die Expression von GST-HCol und GST-ColECol darstellt. trans-4-Hydroxyprolin wurde zu 40 mM zugegeben und NaCl zu 500 mM. Die Expression wurde mit 1,5 mM IPTG induziert. Der Pfeil gibt die Position von GST-ColECol an. In den Verfahren, die zu den Gelen führen, die in den 31, 32 und 35 gezeigt sind, wurden 5 ml-Kulturen von JM109 (F^–), welche das Expressionsplasmid beherbergen in LB-Medium, welches 100 μg/ml Ampicillin enthält, über Nacht gezüchtet. Die Kulturen wurden zentrifugiert und die Zellpellets wurden zweimal mit 5 ml M9/Amp-Medium (siehe J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989)) gewaschen, welches 0,5 Glucose und 100 μg/ml aller Aminosäuren ausgenommen Glycin und Alanin ergänzt war, welche zu 200 μg/ml vorlagen und kein Prolin enthielt. Die Zellen wurden endgültig in 5 ml den oben erwähnten Mediums resuspendiert. Nach einer Inkubation bei 37°C für 30 min wurden Hydroxyprolin, Osmolyt oder IPTG, wie angegeben zugegeben. Nach 4 Stunden wurden Aliquots der Kulturen mittels SDS-PAGE analysiert.
Wie bei D4 wurde das Gen für Protein ColECol aus synthetischen Oligonukleotiden konstruiert, welche so entworfen wurden, um die Codon-Verwendung in hoch-exprimierenden E. coli-Genen zu emittieren. Im Gegensatz zu GST-ColECol, konnte eine Expression der GST-menschlichen Typ I α1-Kollagen-Genfusion (pHCol), welche mit GST-ColECol in der codierten Aminosäuresequenz identisch ist, welche hier nicht die menschliche Codon-Verteilung enthält, in Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gels von Gesamtzelllysaten induzierter JM109 (F^–)/pHCol-Kulturen (35) nicht nachgewiesen werden. Das Gen für das Kollagen-Polypeptid vom Typ I α1 wurde durch die Polymerasekettenreaktion des Gens aus mRNA kloniert, die aus menschlichen Vorhautzellen (HS27, ATCC 1634) mit Primern, die nach der veröffentlichten Gensequenz (GenBank Z74615) entworfen wurden isoliert wurde. Der 5'-Primer fügte eine flankierende EcoRI-Erkennungsstelle hinzu und der 3'-Primer, eine flankierende HindIII-Erkennungsstelle. Das Gen wurde in die EcoRI/HindIII-Schnittstelle des Plasmids pBSKS⁺ (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert, vier Mutationen wurden unter Verwendung des ExSite-Mutagenese-Kits korrigiert (Stratagene, La Jolla, CA), die Sequenz wurde durch Didesoxy-Sequenzierung bestätigt, und schließlich wurde das EcoRI/XhoI-Fragment in das Plasmid pGEX-4T.1 (Pharmacia, Piscataway, NJ) subkloniert. Das GST-HCol-Gen ist Expressions-kompetent, da ein Protein des gleichen Molekulargewichts wie GST-ColECol nachgewiesen wird, wenn Immunblots von Gesamtzelllysaten mit einem Anti-Typ-I-Kollagen-Antikörper untersucht werden. So sind Sequenzen oder strukturelle Unterschiede zwischen den Genen für ColECol und HCol kritische Determinanten der Expressionseffizienz in E. coli. Dies liegt wahrscheinlich an der Codon-Verteilung in diesen Genen und schließlich der Unterschiede in den tRNA-Isoakzeptor-Niveaus in E. coli verglichen mit Menschen.
GST-ColECol, GST-D4 und GST-HCol reichern sich im Medium für den hyperosmotischen Schock nicht an, wenn Prolin für Hydroxyprolin substituiert ist oder in angereichertem Medium. Eine mögliche Erklärung liegt darin, daß die trans-4-Hydroxyprolin-haltigen Proteine gegenüber einem Abbau resistent sein können, da sie sich in Protease-resistente Dreifach-Helices falten, währen die Prolin-haltigen Proteine diese Struktur nicht annehmen. Die größere Anzahl an Codons, die für E. coli nicht optimal sind, welche im menschlichen Gen gefunden werden, und die Instabilität von Prolin-haltigem Kollagen in E. coli kann teilweise erklären, warum die Expression von menschlichem Kollagen in E. coli zuvor nicht beschrieben worden ist.
Wie oben diskutiert worden ist, werden Kollagen-mimetische Polypeptide, d. h. künstlich entworfene Polypeptide, die mit Kollagen einige Zusammensetzungs- und Strukturmerkmale gemeinsam haben, hierin ebenfalls bereitgestellt. Solche Kollagen-mimetischen Polypeptide können ebenfalls dazu veranlaßt werden, Aminosäure-Analoga einzubauen, wie oben beschrieben wurde. GST-CM4 besteht aus Glutathion-S-Transferase, welche an 30 Wiederholungen der Gly-X-Y-Sequenz fusioniert ist. Die sich wiederholenden Gly-X-Y-Sektion macht die sich wiederholende Gly-X-Y-Einheit des menschlichen nach und wird als Kollagenmimetikum 4 oder hier als CM4 bezeichnet. So wurde gezeigt, daß die Hydroxyprolin-Einbautechnik ebenfalls mit einer Protein und einer DNA-Sequenz funktioniert, die analog ist zu der, die im menschlichen Kollagen gefunden wird. Die Analyse der Aminosäure von gereinigtem CM4-Protein, das in dem E. coli-Stamm JM109 (F^–) unter Hydroxyprolin-Einbaubedingungen exprimiert wird, verglichen mit der Analyse des gleichen Proteins, das unter Prolin-Einbaubedingungen exprimiert wurde zeigt, daß die Techniken hierin zu einer im wesentlichen vollständigen Substituierung mit Hydroxyprolin für Prolin führen. Die Aminosäureanalyse wurde anhand von CM4-Protein durchgeführt, welches vom GST abgespalten und gereinigt wurde. Dies entfernt jegliche möglichen Unklarheiten, die mit dem Fusionsprotein verbunden sind.
Die Expression in Medien, die mindestens ungefähr 200 mM NaCl enthalten, ist bevorzugt, um signifikante Mengen eines Proteins anzuhäufen, welches Hydroxyprolin enthält. Eine Konzentration von ungefähr 400–500 mM NaCl scheint optimal zu sein. Entweder KCl, Saccharose oder Kombinationen daraus können zur Substituierung von oder mit NaCl verwendet werden. Jedoch führt die Expression in Medien ohne zugegebenes Osmolyt (d. h. unter Bedingungen, die stärker die von Deming et al., In Vivo Incorporation of Prolin Analogs into Artificial Protein, Poly. Mater. Sci. Engin. Proceed., oben, nachmachen) nicht zu einer signifikanten Expression von Hydroxyprolin-haltigen Proteinen in JM109 (F^–). Dies wird in 36 dargestellt, welche ein Scan eines SDS-PAGE-Gels ist, welches die Expression von GST-CM4 in Medien mit oder ohne 500 mM NaCl und die entweder Prolin oder Hydroxyprolin enthalten, zeigt. Das SDS-PAGE-Gel stellt Proben 5 Stunden nach der Induktion von GST-CM4 dar, welches In JM109 (F^–) exprimiert wurde. Gleiche Mengen, basierend auf der OD von 600 nm, jeder Kultur wurden in jede Spur geladen. Die Gele wurden mit Coomasie Blue gefärbt, entfärbt und auf einem PDI 420 oe-Scanner gescannt. Spur 1: 2,5 mM Prolin/0 mM NaCl. Spur 2: 2,5 mM Prolin/500 mM NaCl. Spur 3: 80 mM Hydroxyprolin/0 mM NaCl. Spur 4: 80 mM Hydroxyprolin/500 mM NaCl. Spur 5: Molekulargewichtsmarker. Der untere Pfeil gibt die Migrationsposition von Prolin-haltigem GST-CM4 in Spuren 1 und 2 wider. Der obere Pfeil gibt die Migrationsposition von Hydroxyprolin-haltigem GST-CM4 in Spuren 3 und 4 an. Anzumerken ist, das GST-CM4, welches in Gegenwart von Hydroxyprolin exprimiert wird, bei einem höheren augenscheinlichen Molekulargewicht läuft (vergleiche Spuren 1 und 4). Dies ist zu erwarten, da Hydroxyprolin ein höheres Molekulargewicht hat als Prolin. Wenn alle Proline in GST-CM4 durch Hydroxyprolin substituiert wurden, beträgt der Molekulargewichtsanstieg 671 Da (+2%). Zu bemerken ist ebenfalls, daß das Protein, das in Gegenwart von Prolin exprimiert wird, sich in Kulturen unabhängig von der NaCl-Konzentration anhäuft (vergleiche Spuren 1 und 2). Im Vergleich dazu tritt eine signifikante Expression in Gegenwart von Hydroxyprolin nur in der Kultur auf, die 500 mM NaCl enthält (vergleiche Spuren 3 und 4). 37 stellt ferner die Abhängigkeit der Expression von der NaCl-Konzentration dar, indem gezeigt wird, daß eine signifikante Expression von GST-CM4 nur bei einer NaCl-Konzentration von größer als 200 mM auftritt. Das SDS-PAGE-Gel spiegelt 6 Stunden nach Induktion Proben von GST-CM4 wider, welche in JM109 (F^–) bei verschiedenen Konzentrationen an NaCl exprimiert wurden. Alle Kulturen enthielten 80 mM Hydroxyprolin. Spur 1: 500 mM NaCl, nicht induziert. Spuren 2–6: 500 mM, 400 mM, 300 mM, 200 mM bzw. 100 mM NaCl. Alle wurden mit 1,5 mM IPTG induziert. Spur 7: Molekulargewichtsmarker. Der Pfeil zeigt die Migrationsposition von Hydroxyprolin-haltigem GST-CM4 an. 38 ist ein Scan eines SDS-PAGE-Gels der Expression von GST-CM4 in entweder 400 mM NaCl oder 800 mM Saccharose. Das SDS-PAGE-Gel zeigt Proben von GST-CM4, welche in JM109 (F^–) exprimiert worden sind, 4 Stunden nach der Induktion. Alle Kulturen enthielten 80 mM Hydroxyprolin und alle, außer, die in Spur 2 elektrophoretisch aufgetrennt wurde, enthielten 400 mM NaCl. Spur 2 zeigt die Expression in Saccharose statt in NaCl. Spur 1: Molekülsmarker. Spur 2: 800 mM Saccharose (kein NaCl). Spuren 3 bis 9: 0 mM, 0,028 mM, 0,1 mM, 0,4 mM, 0,8 mM, 1,25 mM, 2,5 mM Prolin. Der obere Pfeil zeigt die Migrationsposition von Hydroxyprolin-haltigem GST-CM4 an und der untere Pfeil zeigt die Migrationsposition von Prolin-haltigem GST-CM4 an. Die Expression ist in beiden Fällen erkennbar (vergleiche Spuren 2 und 3).
Wenn die Expression von GST-CM4, wie in Beispiel 17 unten beschrieben, bei verschiedenen Verhältnissen von Hydroxyprolin und Prolin durchgeführt wird, scheint das exprimierte Protein verschiedene Mengen an Hydroxyprolin zu enthalten. So ist, wenn nur Hydroxyprolin während der Expression vorhanden ist, ein einziges exprimiertes Protein des erwarteten Molekulargewichts auf einem SDS-PAGE-Gel sichtbar (38, Spur 3). Wenn mehr als ungefähr 1 mM Prolin vorhanden ist, ist wieder ein einzelnes exprimiertes Protein sichtbar, aber bei einem niedrigeren offensichtlichen Molekulargewicht als für ein Protein erwartet werde, das nur Prolin enthält (38, Spuren 7–9). Wenn geringere Prolin-Mengen während der Expression verwendet werden, sind Arten mit offensichtlichen Molekulargewichten, die zwischen diesen Extremen liegen, sichtbar. Dieses Phänomen, welches als "Schmier" oder "Leiter" aus Proteinen, die zwischen den zwei Molekulargewichtsextremen auf einem SDS-PAGE-Gel laufen, sichtbar ist, wird in Spuren 3–9 der 38 dargestellt. Spuren 3–9 auf diesem Gel sind Proteine der Expression einer festgelegten Konzentration an 80 mM Hydroxyprolin und 400 mM NaCl. Jedoch steigt beim Voranschreiten von Spur 3 bis 9 die Prolin-Konzentration von keiner (Spur 3) bis 2,5 mM (Spur 9) und die Expression ändert sich von einem Protein mit höherem Molekulargewicht (Hydroxyprolin-haltiges GST-CM4) zu einem niedrigeren Molekulargewicht (Prolin-haltiges GST-CM4). Bei Prolin-Konzentrationen von 0,025 mM und 0,1 mM sind Arten von dazwischenliegenden Molekulargewicht erkennbar (Spuren 4 und 5). Dies stellt klar dar, daß der prozentuale Einbau von Hydroxyprolin in ein exprimiertes Protein durch Expression in verschiedenen Verhältnissen des Analogons zur Aminosäure kontrolliert werden kann.
Das Hungern nach Prolin vor dem Eingau von Hydroxyprolin ist eine wichtige hier verwendete Technik. Sie stellt sicher, daß kein restliches Prolin während der Expression vorhanden ist, welches mit Hydroxyprolin wetteifern könnte. Dies ermöglicht eine im wesentlichen 100%ige Substituierung durch das Analogon. Wie in 38 gezeigt ist, ermöglichen die Hungerbedingungen die Expression bei präzise kontrollierten Verhältnissen von Prolin und Hydroxyprolin. Die Menge an Hydroxyprolin gegenüber Prolin, welches in das rekombinante Protein eingebaut wird, kann dadurch kontrolliert werden. So können bestimmte Eigenschaften des rekombinanten Proteins, die von der relativen Menge des Analogons, das eingebaut wird, abhängen, durch die vorliegende Methode maßgeschneidert werden, um Polypeptide mit einzigartigen und günstigen Eigenschaften herzustellen.
Menschliches Kollagen, Kollagen-Fragmente, Kollagen-artige Peptide (Kollagen-Mimetika) und die oben erwähnten chimären Polypeptide, die durch rekombinante Verfahren hergestellt werden, haben merkliche Vorteile gegenüber Kollagen und dessen Derivaten, welche aus nicht-menschlichen Tieren gewonnen werden. Falls ein menschliches Gen verwendet wird, wird Kollagen im Zusammenhang eines medizinischen Implantats nicht als Xenograft wirken. Außerdem kann entgegen dem natürlich auftretenden Kollagen das Ausmaß der Prolin-Hydroxylierung vorherbestimmt werden. Dieser nicht zuvor gemachte Grad an Kontrolle ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Beteiligung von trans-4-Hydroxyprolin an der Stabilisierung der Dreifachhelix, der Fibrillenbildung und der biologischen Aktivität. Zusätzlich wird der Entwurf medizinischer Implantate, welche auf der gewünschten Stärke der Kollagen-Fibrillen beruhen, ermöglicht.
Die folgenden Beispiele sind zum Zwecke der Darstellung enthalten und sollten nicht als Beschränkungen hiervon verstanden werden.
Beispiel 1
Transmembrantransport
Eine 5 ml-Kultur des E. coli-Stamms DH5α (supE44 ΔlacU169 (ϕ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1), welcher ein Plasmid enthält, das eine Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht (pMal-c2, 1) wurde in Luria-Nährflüssigkeit bis zur Konfluenz gezüchtet (ungefähr 16 Stunden nach der Inokulierung). Diese Zellen wurden verwendet, um eine 1 l-Schüttelflasche zu inokulieren, die 500 ml M9-Minimalmedium enthält (M9-Salze, 2% Glucose, 0,01 mg/ml Thiamin, 100 μg/ml Ampicillin, welches mit allen Aminosäuren zu 20 μg/ml ergänzt ist), welches bis zu einer optischen Dichte von AU₆₀₀ von 1,0 gezüchtet wurde (18–20 Stunden). Die Kultur wurde in der Hälfte geteilt, die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet. Die Zellen einer Kultur wurden in 250 ml M9-Medium resuspendiert und die anderen in 250 ml M9-Medium, das 0,5 M NaCl enthält. Die Kulturen wurden in einem Luftschüttler für 20 Minuten bei 37°C (225 Upm) äquilibriert und in zehn 25 ml-Aliquots geteilt. Die Kulturen wurden auf den Schüttler zurückgegeben und 125 μl an 1 M Hydroxyprolin in destilliertem H₂O wurde in jedes Röhrchen gegeben. Nach 2, 4, 8, 12 und 20 Minuten wurden 4 Kulturröhrchen (2 isotone, 4 hypertone) auf 1 μm Polycarbonat-Filter vakuumfiltriert, welche direkt in 2 ml Mikrofugenröhrchen gegeben wurden, die 1,2 ml 0,2 M NaOH/2% SDS in destilliertem Wasser enthalten. Nach Lyse über Nacht wurden die Filter vorsichtig aus den Röhrchen entfernt, und der Überstandspuffer wurde hinsichtlich des Hydroxyprolins gemäß dem Verfahren von Grant, Journal of Clinical Pathology, 17: 685 (1964) untersucht. Die intrazelluläre Konzentration an trans-4-Hydroxyprolin gegen die Zeit ist graphisch in 2 dargestellt.
Beispiel 2
Auswirkungen der Salzkonzentration auf den Transmembrantransport
Um die Auswirkungen der Salzkonzentration auf den Transmembrantransport zu bestimmen, wurde ein ähnlicher Ansatz wie in Beispiel 1 verwendet. Eine 5 ml-Kultur des E. coli-Stamms DH5α (supE44 ΔlacU169 (ϕ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 ental gyrA96 thi-1 relA1), welcher ein Plasmid enthält, das eine Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht (pMal-c2, 1) wurde in Luria-Nährflüssigkeit bis zur Konfluenz gezüchtet (ungefähr 16 Stunden nach der Inokulierung). Diese Zellen wurden verwendet, um eine 1 l-Schüttelflasche zu inokulieren, die 500 ml des M9-Minimalmediums enthält (M9-Salze, 2% Glucose, 0,01 mg/ml Thiamin, 100 μg/ml Ampicillin ergänzt mit allen Aminosäuren zu 20 μg/ml), welche dann bis zu einer AU₆₀₀ von 0,6 gezüchtet wurden. Die Kultur wurde in drei gleiche Teile geteilt, die Zellen in jedem wurden mittels Zentrifugieren eingesammelt und in 150 ml M9-Medium, 150 ml M9-Medium, das 0,5 M NaCl enthält und 150 ml M9-Medium, das 1,0 M NaCl enthält, resuspendiert. Die Kulturen wurden für 20 Minuten auf einem Schüttler bei 37°C äquilibriert (225 Upm) und dann in sechs 25 ml-Aliquots aufgeteilt. Die Kulturen wurden auf den Schüttler zurückgegeben und 125 μl an 1 M Hydroxyprolin in destilliertem H₂O wurden in jedes Röhrchen gegeben. Nach 5 und 15 Minuten wurden 9 Kulturröhrchen (3 isotone, 3 × 0,5 M NaCl und 3 × 1,0 M NaCl) auf 1 μm Polycarbonat-Filter vakuumfiltriert, die sofort in 2 ml Mikrofugenröhrchen gegeben wurden, die 1,2 ml 0,2 M NaOH/2% SDS in Destillation H₂O enthalten. Nach einer Lyse über Nacht wurden die Filter aus den Röhrchen entfernt und der Puffer im Überstand wurde hinsichtlich des Hydroxyprolins nach dem Verfahren von Grant, oben, untersucht.
Beispiel 2A
Auswirkung der Salzkonzentration auf den Transmembrantransport
Um die Auswirkungen von Salzkonzentration auf den Transmembrantransport zu bestimmen wurde ein Ansatz der Beispiel 1 ähnelt, verwendet. Eine gesättigte Kultur von JM109 (F^–), welche das Plasmid pD4 (48) beherbergen, die in Luria-Nährflüssigkeit (LB) gezüchtet wurden, die 100 μg/ml Ampicillin (Amp) enthält, wurden verwendet um 20 ml-Kulturen aus LB/Amp bis zu einer OD bei 600 nm von 0,1 AU zu inokulieren. Die Kulturen wurden unter Schütteln bei 37°C bis zu einer OD von 600 nm zwischen 0,7 und 1,0 AU gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren eingesammelt und mit 10 ml M9-Medium gewaschen. Jedes Zellpellet wurde in 20 ml M9/Amp-Medium resuspendiert, das mit 0,5% Glucose und 100 μg/ml aller Aminosäuren, ausgenommen Prolin, ergänzt war. Die Kulturen wurden bei 37°C für 30 Minuten gezüchtet, um endogenes Prolin zu entfernen. Nach dem Auswachsen wurde NaCl in den angegebenen Konzentrationen hinzugegeben, Hyp wurde zu 40 mM zugegeben, und IPTG in einer Menge von 1,5 mM. Nach 3 Stunden bei 37°C wurden Zellen aus drei 5 ml-Aliquots jeder Kultur separat auf Polycarbonat-Filtern eingesammelt und zweimal mit 5 ml M9-Medium gewaschen, das 0,5% Glucose und die geeignete Konzentration an NaCl enthält. Die Zellen wurden in 1 ml 70% Ethanol durch Vortexen für 30 min bei Raumtemperatur lysiert. Die Zelllyse-Überstände wurden bis zur Trockenheit gebracht, in 100 μl 2,5 N NaOH resuspendiert und auf Hyp durch das Verfahren von Neuman und Logan, R. E. Neuman und M. A. Logan, Journal of Biological Chemistry, 184: 299 (1950) untersucht. Das Gesamtprotein wurde durch den BCA-Kit (Pierce, Rockford II) nach der Zelllyse durch drei Beschallungs/Einfrier-Auftau-Zyklen bestimmt. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei-getrennten Experimenten. Die intrazelluläre Konzentration an trans-4-Hydroxyprolin gegenüber der NaCl-Konzentration ist graphisch in 2A dargestellt.
Beispiel 3
Bestimmung der Prolin-Hungerbedingungen in E. coli
Der Prolin-auxotrophe E. coli-Stamm NM519(pro^–), welcher das Plasmid pMal-c2 einschließt, das eine Ampicillin-Resistenz verleiht, wurde in M9-Minimalmedium gezüchtet (M9-Salze, 2% Glucose, 0,01 mg/ml Thiamin, 100 μg/ml Ampicillin, ergänzt mit allen Aminosäuren zu 20 μg/ml, ausgenommen Prolin, welches zu 12,5 mg/l supplementiert wurde) bis zu einer konstanten AU₆₀₀ von 0,53 AU (17 Stunden nach Inokulierung). Hydroxyprolin wurde zu 0,08 M zugegeben und Hydroxyprolin-abhängiges Wachstum wurde durch Zunahme der OD₆₀₀ auf 0,61 AU über einen einstündigen Zeitraum nachgewiesen.
Beispiel 4
Hydroxyprolin-Einbau in Protein in E. coli unter Prolin-Hungerbedingungen
Das Plasmid pMal-c2 (kommerziell erhältlich von New England Biolabs), welches DNA enthält, die das Maltose-bindende Protein (MBP) codiert, wurde verwendet, um den Prolin-auxotrophen E. coli-Stamm NM519(pro^–) zu transformieren. Zwei 1 l-Kulturen der transformierten NM519(pro^–) in M9-Minimalmedium (M9-Salze, 2% Glucose, 0,01 mg/ml Thiamin, 100 μg/ml Ampicillin ergänzt mit allen Aminosäuren zu 20 μg/ml, ausgenommen Prolin, welches zu 12,5 mg/l supplementiert wurde) wurden bis zu einer AU₆₀₀ von 0,53 gezüchtet (ungefähr 17 Stunden nach Inokulierung). Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet, das Medium in einer Kultur wurde durch ein gleiches Volumen an M9-Medium ersetzt, das 0,08 M Hydroxyprolin enthält und das Medium in der zweiten Kultur wurde durch ein gleiches Volumen an M9-Medium ersetzt, das 0,08 M Hydroxyprolin und 0,5 M NaCl enthält. Nach einer Äquilibrierung für eine Stunde wurden die Kulturen mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid induziert. Nach dem Züchten für zusätzliche 3,25 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet, in 10 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl (TEN-Puffer) resuspendiert und durch Auftauen und Beschallen lysiert. MBP wurde durch Passagieren der Lysate über 4 ml Amyloseharz-Spin-Säulen gereinigt, durch Waschen der Säulen mit 10 ml TEN-Puffer, gefolgt von der Eluierung des gebundenen MBPs mit 2 ml TEN-Puffer, enthaltend 10 mM Maltose. Die eluierten Proben wurden unter Stickstoff in Ampullen mit dem gleichen Volumen konzentrierter HCl (11,7 M) versiegelt und für 12 Stunden bei 120°C hydrolysiert. Nach der Klärung mit Aktivkohle, wurde der Hydroxyprolin-Gehalt in den Proben mittels HPLC und das Verfahren von Grant, oben, bestimmt. Der prozentuale Einbau von trans-4-Hydroxyprolin verglichen mit Prolin in MBP ist graphisch in 12 gezeigt.
Beispiel 5
Hydroxyprolin-Einbau in Protein in S. cerevisiae über Integrierungsvektoren unter Prolin-Hungerbedingungen
Das in Beispiel 4 oben beschriebene Verfahren wird in Hefe unter Verwendung eines integrierenden Vektors durchgeführt, welcher den Prolin-Biosyntheseweg stört. Ein Gen, welches menschliches Typ I (α₁)-Kollagen codiert, wird in einen speziellen Shuttle-Vektor hinter dem induzierbaren GAL10-Promotor inseriert. Diese Promotor/Genkassette wird von 5'- und 3'-terminalen Sequenzen flankiert, die aus einem S. cerevisiae-Prolin-Synthetase-Gen stammen. Das Plasmid wird durch Restriktionsverdau sowohl an den 5'- und 3'-terminalen Bereichen linearisiert und verwendet, um einen Prolin prototrophen S. cerevisiae-Stamm zu transformieren. Die Transformationsmischung wird auf Selektionsmedium ausplattiert und die Transformanten werden ausgewählt. Durch homologe Rekombination und Gen-Zerstörung bildet das Konstrukt gleichzeitig eine stabile Integration und wandelt den S. cerevisiae-Stamm in einen Prolin-auxotrophen um. Eine einzelne Transformante wird ausgewählt und bei 30°C in YPD-Medium bis zu einer OD₆₀₀ von 2 AU gezüchtet. Die Kultur wird zentrifugiert und die Zellen werden in Hefe-Dropout-Medium suspendiert, das mit allen Aminosäuren, ausgenommen Prolin, ergänzt ist, und bis zu einer konstanten OD₆₀₀ bezüchtet, welche Prolin-Hungerbedingungen anzeigt. 0,08 M L-Hydroxyprolin und 2% (G/V) Galactose werden dann zugegeben. Die Kulturen werden für zusätzliche 6 bis 48 Stunden gezüchtet. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (5000 Upm, 10 Minuten) geerntet und durch mechanischen Aufschluß lysiert. Hydroxyprolin-haltiges menschliches Typ I (α₁)-Kollagen wird mittels Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Säulenchromatographie gereinigt.
Beispiel 6
Hydroxyprolin-Einbau in Protein in S. cerevisiae durch nicht-integrierende Vektoren unter Prolin-Hungerbedingungen
Das oben in Beispiel 4 beschriebene Verfahren wird in Hefe-Prolin Auxotrophen unter Verwendung eines nicht-integrierenden Vektors durchgeführt. Ein Gen, das menschliches Typ I (α₁)-Kollagen codiert, wird nach dem induzierbaren GAL10-Promotor in den YEp24-Shuttle-Vektor inseriert, welcher den selektierbaren Ura⁺-Marker enthält. Das daraus hervorgehende Plasmid wird in Prolin-auxotrophe S. cerevisiae durch Sphäroblasten-Transformierung transformiert. Die Transformationsmischung wird auf Selektionsmedium ausplattiert und die Transformanten werden ausgewählt. Eine einzelne Transformante wird bei 30°C in YPD-Medium bis zu einer OD₆₀₀ von 2 AU gezüchtet. Die Kultur wird zentrifugiert und die Zellen werden in Hefe-Dropout-Medium resuspendiert, das mit allen Aminosäuren ergänzt ist, ausgenommen Prolin, und bis einer konstanten OD₆₀₀ gezüchtet wird, was Prolin-Hungerbedingungen anzeigt. Dann werden 0,08 M L-Hydroxyprolin und 2% (G/V) Galactose zugegeben. Die Kulturen werden für zusätzliche 6 bis 48 Stunden gezüchtet. Die Zellen werden mittels Zentrifugation (5000 Upm, 10 Minuten) geerntet und durch mechanisches Aufschließen lysiert. Hydroxyprolin-haltiges menschliches Typ I (α₁)-Kollagen wurde mittels Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Säulenchromatographie gereinigt.
Beispiel 7
Hydroxyprolin-Einbau in Protein in einem Baculovirus-Expressionssystem
Ein Gen, das menschliches Typ I (α₁)-Kollagen codiert, wird in den pBacPAK8-Baculovirus-Expressionsvektor hinter dem AcMNPV-Polyhedron-Promotor inseriert. Dieses Konstrukt wird zusammen mit linearisierter AcMNPV-DNA durch Standard-Calciumphosphat-Co-Präzipitierung in SF9 co-transfiziert. Transfektanten werden für 4 Tage bei 37°C in TNM-FH-Medium kultiviert, das mit 10% FBS ergänzt ist. Das Medium wird geerntet und rekombinante Viruspartikel werden mittels Plaque-Assay isoliert. Rekombinante Viren werden verwendet, um 1 l SF9-Zellen zu infizieren, die in Grace's-Medium ohne Prolin wachsen, welches mit 10% FBS und 0,08 M Hydroxyprolin ergänzt ist. Nach dem Wachstum bei 27°C für 2 bis 10 Tage werden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet und durch mechanisches Aufschließen lysiert.
Hydroxyprolin-haltiges menschliches Typ I (α₁)-Kollagen wird durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Säulenchromatographie gereinigt.
Beispiel 8
Hydroxyprolin-Einbau in menschliches Kollagen-Protein in Escherichia coli unter Prolin-Hungerbedingungen
Ein Plasmid (pHuCol, 4), welches die Gensequenz von menschlichem Typ I (α₁)-Kollagen (3A und 3B) (SEQ ID NO: 1) codiert, wird hinter dem Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid(IPTG)-induzierbaren Tac-Promotor plaziert, der ebenfalls β-Lactamase codiert, und in dem Prolin-auxotrophen Escherichia coli-Stamm NM519(pro^–) durch Standard-Hitzeschock-Transformierung transformiert. Die Transformationskulturen werden auf Luria-Nährflüssigkeit (LB) ausplattiert, die 100 μg/ml Ampicillin enthält, und nach dem Wachstum über Nacht wird eine einzige Ampicillin-resistente Kolonie verwendet, um 5 ml LB zu inokulieren, das 100 μg/ml Ampicillin enthält. Nach dem Wachstum für 10 bis 16 Stunden unter Schütteln (225 Upm) bei 37°C wird diese Kultur verwendet, um 1 l M9-Minimalmedium (M9-Salze, 2% Glucose, 0,01 mg/ml Thiamin, 100 μg/ml Ampicillin, ergänzt mit allen Aminosäuren zu 20 μg/ml, ausgenommen Prolin, welches zu 12,5 mg/l ergänzt ist) in einer 1,5 l-Schüttelflasche zu inokulieren. Nach dem Wachstum bei 37°C, 225 Upm für 15 bis 20 Stunden nach der Inokulierung ist der optische Durchmesser bei 600 nm bei ungefähr 0,5 OD/ml konstant. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (5000 Upm, 5 Minuten) geerntet, und das Medium dekantiert und die Zellen in 1 l M9-Minimalmedium resuspendiert, das 100 μg/ml Ampicillin, 0,08 M L-Hydroxyprolin und 0,5 M NaCl enthält. Nach dem Wachstum für 1 Stunde bei 37°C, 225 Upm, wird IPTG zu 1 mM zugegeben und die Kulturen werden für zusätzliche 5 bis 15 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (5000 Upm, 10 Minuten) geerntet und durch mechanisches Aufschließen lysiert. Das Hydroxyprolin-haltige Kollagen wird mittels Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Säulenchromatographie gereinigt.
Beispiel 9
Hydroxyprolin-Einbau in Fragmente menschlichen Kollagen-Proteins in Escherichia coli unter Prolin-Hungerbedingungen
Ein Plasmid (pHuCol-Fl, 6), das die Gensequenz der ersten 80 Aminosäuren vom menschlichen Typ I (α₁)-Kollagen (5) (SEQ ID NO: 2) codiert, welches hinter den Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid(IPTG)-induzierbaren Tac-Promotor plaziert ist und ebenfalls β-Lactamase codiert, wird in den Prolin-auxotrophen Escherichia coli-Stamm NM519(pro^–) durch Standard-Hitzeschockverfahren transformiert. Die Transformationskulturen werden auf Luria-Nährflüssigkeit (LB) ausplattiert, die 100 μg/ml Ampicillin enthält und nach dem Wachstum über Nacht wird eine einzelne Ampicillin-resistente Kolonie verwendet, um 5 ml LB zu inokulieren, das 100 μg/ml Ampicillin enthält. Nach dem Wachstum für 10 bis 16 Stunden unter Schütteln (bei 225 Upm) bei 37°C wird diese Kultur verwendet, um 1 l M9-Minimalmedium (M9-Salze, 2% Glucose, 0,01 mg/ml Thiamin, 100 μg/ml Ampicillin, ergänzt mit allen Aminosäuren zu 20 μg/ml, ausgenommen Prolin, welches zu 12,5 mg/l ergänzt ist) in einer 1,5 l-Schüttelflasche zu inokulieren. Nach dem Wachstum bei 37°C, 225 Upm, für 15 bis 20 Stunden nach der Inokulierung, ist die optische Dichte bei 600 nm bei ungefähr 0,5 OD/ml konstant. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (5000 Upm, 5 Minuten) geerntet, das Medium dekantiert und die Zellen werden in 1 l M9-Minimalmedium resuspendiert, das 100 μg/ml Ampicillin, 0,08 M L-Hydroxyprolin und 0,5 M NaCl enthält. Nach dem Wachstum für 1 Stunde bei 37°C, 225 Upm, wird IPTG in einer Menge von 1 mM zugegeben und die Kulturen werden für zusätzliche 5 bis 15 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (5000 Upm, 10 Minuten) geerntet und mittels mechanischem Aufschließen lysiert. Das Hydroxyprolin-haltige Kollagen-Fragment wird durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Säulenchromatographie gereinigt.
Beispiel 10
Konstruktion und Expression in E. coli des menschlichen Kollagen-Typ I (α₁)-Gens mit optimierter E. coli-Codon-Verwendung
A. Konstruktion des Gens:

Die Nukleotidsequenz der helikalen Region von menschlichem Kollagen Typ I (α₁)-Gen flankiert von 17 Aminosäuren der Amino-terminalen extrahelikalen und 26 Aminosäuren der C-terminalen extrahelikalen Region ist in 27 (SEQ ID NO: 15) gezeigt. Eine tabellarische Auflistung der Codonhäufigkeit dieses Gens ist in Tabelle 1 angegeben. Die Gensequenz, die in 27 gezeigt ist, wurde zuerst geändert, um die Neigung für die E. coli-Codons widerzuspiegeln. Ein Startmethionin wurde am 5'-Ende des Gens inseriert und eine TAAT-Stoppsequenz am 3'-Ende. Die einzigartigen Restriktionsschnittstellen wurden identifiziert oder ungefähr alle 150 Basenpaare erzeugt. Das daraus resultierende Gen (HuCol^Ec, 39A–39E) (SEQ ID NO: 20) hat die Codonverwendung, die in Tabelle II angegeben ist, die unten gezeigt ist. Andere Sequenzen, die sich dem E. coli-Codon Bias nähern, sind ebenfalls annehmbar. Tabelle II

Codon	Anzahl	Prozentsatz	Codon	Anzahl	Prozentsatz
TTT-Phe	6	0,56	TCT-Ser	3	0,28
TTC-Phe	9	0,86	TCC-Ser	3	0,28
TTA-Leu	0	0,00	TCA-Ser	0	0,00
TTG-Leu	0	0,00	TCG-Ser	0	0,00
CTT-Leu	0	0,00	CCT-Pro	13	1,22
CTC-Leu	1	0,08	CCC-Pro	12	1,13
CTA-Leu	1	0,08	CCA-Pro	29	2,74
CTG-Leu	19	1,79	CCG-Pro	186	17,58
ATT-Ile	3	0,28	ACT-Thr	2	0,18
ATC-Ile	4	0,37	ACC-Thr	11	1,08
ATA-Ile	0	0,00	ACA-Thr	0	0,00
ATG-Met	8	0,75	ACG-Thr	4	0,37
GTT-Val	3	0,28	GCT-Ala	10	0,94
GTC-Val	5	0,47	GCC-Ala	24	2,26
GTA-Val	0	0,00	GCA-Ala	8	0,75
GTG-Val	12	1,13	GCG-Ala	80	7,56

Tabelle II (Fortsetzung)

Codon	Anzahl	Prozentsatz	Codon	Anzahl	Prozentsatz
TAT-Tyr	2	0,18	TGT-Cys	0	0,00
TAC-Tyr	2	0,18	TGC-Cys	0	0,00
TAA-***	0	0,00	TGA-***	0	0,00
TAG-***	0	0,00	TGG-Trp	0	0,00
CAT-His	0	0,00	CGT-Arg	26	2,45
CAC-His	3	0,28	CGC-Arg	26	2,45
CAA-Gln	5	0,47	CGA-Arg	0	0,00
CAG-Gln	25	2,36	CGG-Arg	1	0,09
AAT-Asn	0	0,00	AGT-Ser	1	0,09
AAC-Asn	11	1,03	AGC-Ser	32	3,02
AAA-Lys	38	3,59	AGA-Arg	0	0,00
AAG-Lys	0	0,00	AGG-Arg	0	0,00
GAT-Asp	20	1,89	GGT-Gly	148	13,98
GAC-Asp	14	1,32	GGC-Gly	178	16,82
GAA-Glu	40	3,78	GGA-Gly	9	0,85
GAG-Glu	9	0,85	GGG-Gly	12	1,13

Oligos aus ungefähr 80 Nukleotiden wurden auf einem Beckman Oligo 1000 DNA-Synthesegerät synthetisiert, gespalten und mit wäßriger NH₄OH entschützt und durch Elektrophorese in einem 7 M-Harnstoff/12% Polyacrylamid-Gel gereinigt. Jeder Satz an Oligos wurde so entworfen, daß er eine EcoRI Restriktionsenzymstelle am 5'-Ende hat, eine einzigartige Restriktionsschnittstelle nahe dem 3'-Ende, gefolgt von einer TAAT-Stopp-Sequenz und einer HindIII-Restriktionsenzymschnittstelle ganz am 3'-Ende. Die ersten vier Oligos, die die ersten 81 Aminosäuren des menschlichen Kollagen Typ I (α₁)-Gens umfassen, sind in 40 angegeben, welche die Sequenz die Restriktionskarten der synthetischen Oligos zeigt, die verwendet wurden, um die ersten 243 Basenpaare des menschlichen Typ I (α₁)-Kollagen- Gens mit optimierter E. coli-Codonverwendung zu konstruieren. Oligos N1-1 (SEQ ID NO: 21) und N1-2 (SEQ ID NO: 22) wurden entworfen, um einen Start-Methionin-(ATG)-Codon am 5'-Ende des Gens zu inserieren.
In einem Fall wurden die Oligos N1-1 und N1-2 (1 μg jeweils) in 20 μl T7-DNA-Polymerasepuffer (40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 0,05 mg/ml Rinderserumalbumin) durch Erwärmen bei 90°C für 5 Minuten angelagert, gefolgt von der langsamen Abkühlung auf Raumtemperatur. Nach einer kurzen Zentrifugierung bei 14 000 Upm wurden 10 Einheiten T7-DNA-Polymerase und 2 μl einer Lösung aller vier dNTPs (jeweils 2,5 mM dART, dGTP, dCTP, dTTP) zu den aneinandergelagerten Oligos zugegeben. Die Verlängerungsreaktionen wurden bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und dann für 10 Minuten auf 70°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde HindII-Puffer (5 μl einer 10-fach-Konzentration), 20 μl H₂O und 10 Einheiten HindIII-Restriktionsenzym hinzugegeben und die Röhrchen wurden bei 37°C für 10 Stunden inkubiert. HindIII-Puffer (2 μl eine 10-fach-Konzentration), 13,5 μl, 0,5 M Tris·HCl (pH 7,5), 1,8 μl 1% Triton X100, 5,6 μl H₂O und 20 U EcoRI wurden zu jedem Röhrchen zugegeben und die Inkubation wurde für 2 Stunden bei 37°C fortgesetzt. Die Verdaus wurden einmal mit einem gleichen Volumen an Phenol extrahiert, einmal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und einmal mit Chloroform/Isoamylalkohol. Nach einer Ethanol-Präzipitierung wurde das Pellet in 10 μl TE-Puffer (10 mM Tris·HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) resuspendiert. Resuspendierte Pellets (4 μl) wurden über Nacht bei 16°C mit Agarosegel gereinigt im EcoRI/HindIII-verdauten pBSKS⁺-Vektor (1 μg) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (100 Einheiten) ligiert. Eine Hälfte der Transformationsmischung wurde durch einen Wärmeschock in DH5α-Zellen transformiert und 100 μl der 1,0 ml-Transformationsmischung wurden auf Luria-Nährflüssigkeit (LB)-Agarplatten ausplattiert, die 70 μg/ml Ampicillin enthalten. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Ampicillin-resistente Kolonien (6–12) wurden herausgepickt und über Nacht in LB-Medium, enthaltend 70 mg/ml Ampicillin gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde aus jeder Kultur durch Wizard-Minipreps (Promega Corporation, Madison WI) isoliert und auf das Vorhandensein der ungefähr 120 Basenpaare großen Insertion durch einen Verdau mit EcoRI und HindIII und das Laufenlassen der Produkte des Verdaus auf Agarose-Elektrophesegelen durchmustert. Klone mit Insertionen wurden durch Standard-Didesoxy-Terminierungs-DNA-Sequenzierung bestätigt. Der korrekte Klon wurde pBSN1-1 (41) bezeichnet und das Kollagenfragment hat die Nukleotidsequenz, die in 42 (SEQ ID NO: 25) angegeben ist.
Oligos N1-3 (SEQ ID NO: 23) und N1-4 (SEQ ID NO: 24) (40) wurden synthetisiert, gereinigt, aneinandergelagert, verlängert und nach dem gleichen Verfahren, das oben für die Oligos N1-1 und N1-2 angegeben ist, in pBSKS⁺ kloniert. Das erhalten Plasmid wurde als pBSN1-2A bezeichnet. Um gemeinsam die Sektionen des Kollagen-Gens von pBSN1-1- und pBSN1-2A zu klonieren, wurde das Plasmid pBSN1-1 (1 μg) für 2 Stunden bei 37°C mit RsrII und HindIII verdaut. Der verdaute Vektor wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt. Plasmid pBSN1-2A (3 μg) wurde für 2 Stunde bei 37°C mit RsrII/HindIII verdaut und die Insertion wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt. RsrII/HindIII-verdautes pBSN1-1 wurde mit diesem Insert über Nacht bei 16°C durch T4-DNA-Ligase ligiert. Eine Hälfte der Ligationsmischung wurde in DH5α-Zellen transformiert und 1/10 des Transformationsgemisches wurde auf LB-Agarplatten, die 70 μg/ml Ampicillin enthalten, ausplattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurden Ampicillin-resistente Klone herausgepickt und auf das Vorhandensein der inserierten DNA, wie oben beschrieben, durchmustert. Klone wurden mittels Didesoxy-Terminierungssequenzierung überprüft. Der korrekte Klon wurde als pBSN1-2 (43) bezeichnet und das Kollagen-Fragment hat die in 44 angegebene Sequenz.
In ähnlicher Weise wurde der Rest des Kollagengens konstruiert, so daß die endgültige DNA-Sequenz die ist, die in 39A–39E (SEQ ID NO: 19) angegeben ist.
B) Expression des Gens in E. coli:
Nach der Konstruktion des gesamten menschlichen Kollagen-Typ I (α₁)-Gens mit der Codonverwendung, die für E. coli optimiert worden ist, wurde das klonierte Gen in E. coli exprimiert. Ein Plasmid (pHuCol^Ec, 45), das das gesamte synthetische Kollagen-Gen (39A–39E) codiert, wurde hinter den Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid-(IPTG)-induzierbaren Tac-Promotor plaziert, das ebenfalls β-Lactamase codiert, und in den Escherichia coli-Stamm DH5α (supE44 ΔlacU169 (ϕ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) transformiert, indem eine Standard-Wärmeschock-Transformation durchgeführt wurde. Transformationskulturen werden auf Luria-Nährflüssigkeit (LB) ausplattiert, 19 100 μg/ml Ampicillin enthält und nach einem Wachstum über Nacht wird eine einzige Ampicillin-resistente Kolonie verwendet, um 10 ml LB, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, zu inokulieren. Nach dem Wachstum für 10 bis 16 Stunden unter Schütteln (225 Upm) bei 37°C wird diese Kultur verwendet, um 1 l LB, der 100 μg/ml Ampicillin enthält in einer 1,5 l-Schüttelflasche zu inokulieren. Nach dem Wachstum bei 37°C, bei 225 Upm, für 2 Stunden nach der Inokulierung ist die optische Dichte bei 600 nm ungefähr 0,5 OD/ml. IPTG wird zu 1 mM hinzugegeben und die Kultur wird für zusätzliche 5 bis 10 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (5000 Upm, 10 Minuten) geerntet und mittels mechanischem Aufschluß lysiert. Rekombinantes menschliches Kollagen wird mittels Ammoniumsulfatfraktionierung und Säulenchromatographie gereinigt. Die Ausbeute beträgt typischerweise 15 bis 25 mg/l Kultur.
Beispiel 11
Expression eines 81 Aminosäuren-Fragments von menschlichem Kollagen-Typ I (α₁) mit optimierter E. coli-Codonverwendung in E. coli
Ein Plasmid (pTrcN1-2, 46) welches die Gensequenz der ersten 81 Aminosäuren des menschlichen Typ I (α₁)-Kollagens mit optimierter E. coli-Codonverwendung codiert, welches in einer Phase mit einem 6-Histidin-Anhang am 5'-Ende des Gens kloniert ist und hinter den Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid(IPTG)-induzierbaren Trc-Promotor plaziert ist, das auch β-Lactamase codiert, wurde durch Subklonieren des EcoRI/HindIII-Isertionen aus pBSN1-2 in die EcoRI/HindIII-Schnittstelle des Plasmid pTrcB (Invitrogen, San Diego, CA) konstruiert. Plasmid pTrcN1-2 wurde in den Escherichia coli-Stamm DH5α transformiert (supE44 ΔlacU169 (ϕ80lacIZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1), indem eine Standard-Wärmeschock-Transformation durchgeführt wurde. Die Transformationskulturen wurden auf Luria-Nährflüssigkeit (LB) ausplattiert, die 100 μg/ml Ampicillin enthält und nach dem Wachstum über Nacht wurde eine einzige Ampicillin-resistente Kolonie verwendet, um 5 ml LB zu inokulieren, das 100 μg/ml Ampicillin enthält. Nach dem Wachstum für 10–16 Stunden unter Schütteln (225 Upm) bei 37°C wurde diese Kultur verwendet, um 50 ml LB, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, in einer 250 ml-Schüttelflasche zu inokulieren. Nach dem Wachstum bei 37°C, 225 Upm, für 2 Stunden nach der Inokulierung, betrug die optische Dichte bei 600 nm ungefähr 0,5 OD/ml. IPTG wurde zu 1 mM zugegeben und die Kultur wurde für zusätzliche 5 bis 10 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (5000 Upm, 10 Minuten) geerntet und bei –20°C gelagert. Die 6 Histin-Anhang- Kollagenfragmentfusion wurde auf Nickelharzsäulen gereinigt. Zellpellets wurden in 10 ml 6 M Guanidinhydrochlorid/20 mM Natriumphosphat/500 mM NaCl (pH 7,8) resuspendiert und in zwei 5 ml-Batches an das Nickelharz gebunden. Die Säulen wurden zweimal mit 4 ml Bindungspuffer (8 M Harnstoff/20 mM Natriumphosphat/500 mM NaCl (pH 7,8)) gewaschen, zweimal mit Waschpuffer 1 (8 M Harnstoff/20 mM Natriumphosphat/500 mM NaCl (pH 6,0)) und zweimal mit Waschpuffer 2 (8 M Harnstoff/20 mM Natriumphosphat (500 mM NaCl (pH 5,3)). Die 6 Histidin-Anhang-Kollagenfragmentfusion wurde von der Säule mit 5 ml Elutionspuffer (8 M Harnstoff/20 mM Natriumphosphat/500 mM NaCl (pH 4,0)) in 1 ml Fraktionen eluiert. Die Fraktionen wurden mittels Gel-Elektrophorese auf Protein untersucht und Fusionen-haltige Fraktionen wurden aufkonzentriert und bei –20°C gelagert. Die Ausbeute betrug typischerweise 15 bis 25 mg/l Kultur.
Das Kollagen wird vom 6 Histidin-Anhang durch Enterokinase abgespalten. Fusionen-haltige Fraktionen werden gegen Spaltpuffer (50 mm Tris·HCl, pH 8,0/5 mM CaCl₂) dialysiert. Nach Zugabe von Enterokinase zu 1 μg Enzym je 100 μg Fusion wird die Lösung bei 37°C für 4 bis 10 Stunden inkubiert. Das Voranschreiten der Spaltung wird durch Gel-Elektrophorese überwacht. Der abgespaltene 6 Histidin-Anhang kann von dem Kollagen-Fragment durch Durchleiten über eine Nickelharzsäule, wie oben angegeben, abgetrennt werden.
Beispiel 12
Expression in E. coli von Fragmenten des menschlichen Kollagen-Typ I (α₁) mit optimierter E. coli-Codonverwendung
Ein Plasmid (pN1-3, 47), das das Gen für die Amino-terminalen 120 Aminosäuren des menschlichen Kollagen-Typ I (α₁) mit optimierter E. coli-Codonverwendung codiert, welches hinter dem Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid(IPTG)- induzierbaren Tac-Promotor plaziert ist, und ebenfalls β-Lactamase codiert, wird in Escherichia coli-Stamm DH5α (supE44 ΔlacU169 (ϕ80lacIZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) durch Standardwärmeschocktransformation transformiert. Die Transformationskulturen werden auf Luria-Nährflüssigkeit (LB) ausplattiert, die 100 μg/ml Ampicillin enthalten und nach einem Wachstum über Nacht wird eine einzelne Ampicillin-resistente Kolonie verwendet, um 10 ml LB zu inokulieren, das 100 μg/ml Ampicillin enthält. Nach dem Wachstum für 10 bis 16 Stunden unter Schütteln (225 Upm) bei 37°C, wird diese Kultur verwendet, um 1 l LB zu inokulieren, der 100 μg/ml Ampicillin in 1,5 l-Schüttelflasche enthält. Nach dem Wachstum bei 37°C, 225 Upm, für 2 Stunden nach der Inokulierung, wird die optische Dichte bei 600 nm ungefähr 0,5 OD/ml betragen. IPTG wird zu 1 mM zugegeben, und die Kultur wird für weitere 5 bis 10 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (5000 Upm, 10 Minuten) geerntet und mittels mechanischem Aufschließen lysiert. Rekombinantes menschliches Kollagen wird durch Ammoniumsulfatfraktionierung und Säulenchromatographie gereinigt. Die Ausbeute beträgt typischerweise 15 bis 25 mg/l der Kultur.
Beispiel 13
Expression eines C-terminalen Fragments des menschlichen Kollagen-Typ I (α₁) mit optimierter E. coli-Codonverwendung in E. coli
Ein Plasmid (pD4, 48), welches das Gen für die Carboxy-terminalen 219 Aminosäuren des menschlichen Kollagen-Typ I (α₁) mit optimierter E. coli-Codonverwendung codiert, welches hinter dem Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid(IPTG)-induzierbaren Tac-Promotor plaziert ist und ebenfalls β-Lactamase codiert, wird in Escherichia coli-Stamm DH5α (supE44 ΔlacU169 (ϕ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) durch Standard-Wärmeschocktransformierung transformiert. Die Transformationskulturen werden auf Luria-Nährflüssigkeit (LB) ausplattiert, welche 100 μg/ml Ampicillin enthalten und nach dem Wachstum über Nacht wird eine einzelne Ampicillin-resistente Kolonie verwendet, um 10 ml LB zu inokulieren, das 100 μg/ml Ampicillin enthält. Nach dem Wachstum für 10 bis 16 Stunden unter Schütteln (225 Upm) bei 37°C wird diese Kultur verwendet, um 1 l LB, welches 100 μg/ml Ampicillin in einer 1,5 l-Schüttelflasche enthält zu inokulieren. Nach dem Wachstum bei 37°C, 225 Upm, für 2 Stunden nach der Inokulierung beträgt die optische Dichte bei 600 nm ungefähr 0,5 OD/ml. IPTG wird zu 1 mM zugegeben und die Kultur wird für zusätzliche 5 bis 10 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (5000 Upm, 10 Minuten) geerntet, durch mechanisches Aufschließen lysiert. Rekombinantes menschliches Kollagenfragment wird durch Ammoniumsulfatfraktionierung und Säulenchromatographie gereinigt. Die Ausbeute beträgt typischerweise 15 bis 25 mg/l Kultur.
Beispiel 14
Konstruktion und Expression des menschlichen Kollagen-Typ I (α₂)-Gens mit optimierter E. coli-Codon-Verwendung in Escherichia coli
A) Konstruktion des Gens:

Die Nukleotidsequenz des helikalen Bereichs des menschlichen Kollagen-Typ I (α₂)-Gens, welches von 11 Aminosäuren der Amino-terminalen extrahelikalen 12 Aminosäure des C-terminalen extrahelikalen Bereichs flankiert wird, ist in den 49A–49E (SEQ ID NO: 29) gezeigt. Eine tabellarische Auflistung der Codonhäufigkeit dieses Gens ist in Tabelle III unten gezeigt. Die Gensequenz, die in den 49A bis 49E gezeigt ist, wurde zuerst geändert, um die Neigung des E. coli-Codons widerzuspiegeln. Ein Initiator-Methionin wurde am 5'-Ende des Gens inseriert und eine TAAT-Stoppsequenz am 3'-Ende. Einzigartige Restriktionsschnittstellen werden identifiziert oder ungefähr alle 150 Basenpaare erzeugt. Das daraus hervorgehende Gen (HuCol(α₂)^Ec, 50A bis 50E) (SEQ ID NO: 31) hat die Codonverwendung, die in der Tabelle IV unten angegeben ist. Andere Sequenzen, die sich der E. coli-Codonneigung annähern, sind ebenfalls annehmbar. Tabelle III

Codon	Anzahl	Prozentsatz	Codon	Anzahl	Prozentsatz
TTT-Phe	3	0,28	TCT-Ser	11	1,06
TTC-Phe	10	0,96	TCC-Ser	4	0,38
TTA-Leu	1	0,09	TCA-Ser	1	0,09
TTG-Leu	2	0,19	TCG-Ser	1	0,09
CTT-Leu	16	1,54	CCT-Pro	125	12,06
CTC-Leu	9	0,86	CCC-Pro	42	4,05
CTA-Leu	2	0,19	CCA-Pro	30	2,89
CTG-Leu	5	0,48	CCG-Pro	3	0,28
ATT-Ile	14	1,35	ACT-Thr	14	1,35
ATC-Ile	3	0,28	ACC-Thr	0	0,00
ATA-Ile	1	0,09	ACA-Thr	3	0,28
ATG-Met	5	0,48	ACG-Thr	1	0,09
GTT-Val	20	1,93	GCT-Ala	82	7,91
GTC-Val	5	0,48	GCC-Ala	17	1,64
GTA-Val	3	0,28	GCA-Ala	9	0,86
GTG-Val	10	0,96	GCG-Ala	0	0,00

Tabelle III (Fortsetzung)

Codon	Anzahl	Prozentsatz	Codon	Anzahl	Prozentsatz
TAT-Tyr	2	0,19	TGT-Cys	0	0,00
TAC-Tyr	3	0,28	TGC-Cys	0	0,00
TAA-***	0	0,00	TGA-***	0	0,00
TAG-***	0	0,00	TGG-Trp	0	0,00
CAT-His	7	0,67	CGT-Arg	17	1,64
CAC-His	6	0,57	CGC-Arg	6	0,57
CAA-Gln	13	1,25	CGA-Arg	6	0,57
CAG-Gln	9	0,86	CGG-Arg	4	0,38
AAT-Asn	10	0,96	AGT-Ser	11	1,06
AAC-Asn	14	1,35	AGC-Ser	4	0,38
AAA-Lys	15	1,44	AGA-Arg	16	1,54
AAG-Lys	16	1,54	AGG-Arg	6	0,57
GAT-Asp	20	1,93	GGT-Gly	179	17,27
GAC-Asp	5	0,48	GGC-Gly	74	7,14
GAA-Glu	29	2,79	GGA-Gly	80	7,72
GAG-Glu	16	1,54	GGG-Gly	16	1,54

Tabelle IV

Codon	Anzahl	Prozentsatz	Codon	Anzahl	Prozentsatz
TTT-Phe	5	0,48	TCT-Ser	7	0,67
TTC-Phe	7	0,67	TCC-Ser	12	1,15
TTA-Leu	0	0,00	TCA-Ser	0	0,00
TTG-Leu	0	0,00	TCG-Ser	0	0,00
CTT-Leu	1	0,09	CCT-Pro	10	0,96
CTC-Leu	1	0,09	CCC-Pro	0	0,00
CTA-Leu	0	0,00	CCA-Pro	15	1,44
CTG-Leu	32	3,07	CCG-Pro	177	17,00
ATT-Ile	11	1,05	ACT-Thr	3	0,28
ATC-Ile	7	0,67	ACC-Thr	6	0,57
ATA-Ile	0	0,00	ACA-Thr	0	0,00
ATG-Met	6	0,57	ACG-Thr	10	0,96
GTT-Val	18	1,72	GCT-Ala	30	2,88
GTC-Val	7	0,67	GCC-Ala	21	2,01
GTA-Val	9	0,85	GCA-Ala	20	1,92
GTG-Val	6	0,57	GCG-Ala	38	3,65

Tabelle IV (Fortsetzung)

Codon	Anzahl	Prozentsatz	Codon	Anzahl	Prozentsatz
TAT-Tyr	3	0,28	TGT-Cys	0	0,00
TAC-Tyr	2	0,19	TGC-Cys	0	0,00
TAA-***	0	0,00	TGA-***	0	0,00
TAG-***	0	0,00	TGG-Trp	0	0,00
CAT-His	2	0,19	CGT-Arg	37	3,55
CAC-His	11	1,05	CGC-Arg	18	1,72
CAA-Gln	7	0,67	CGA-Arg	0	0,00
CAG-Gln	15	1,44	CGG-Arg	0	0,00
AAT-Asn	6	0,57	AGT-Ser	0	0,00
AAC-Asn	18	1,72	AGC-Ser	13	1,24
AAA-Lys	25	2,40	AGA-Arg	0	0,00
AAG-Lys	6	0,57	AGG-Arg	0	0,00
GAT-Asp	11	1,05	GGT-Gly	209	20,07
GAC-Asp	13	1,24	GGC-Gly	141	13,54
GAA-Glu	33	3,17	GGA-Gly	0	0,00
GAG-Glu	12	1,15	GGG-Gly	0	0,00

Oligos aus ungefähr 80 Nukleotiden werden auf einem Beckman Oliga 1000 DNA-Synthesegerät synthetisiert, gespalten und mit wäßriger NH₄OH entschützt und mittels Elektrophorese in einem 7 M-Harnstoff/12% Polyacrylamid-Gel gereinigt. Jeder Satz an Oligos wird so entworfen, daß er eine EcoRI-Restriktionsenzymstelle am 5'-Ende hat, eine einzigartige Restriktionsschnittstelle nahe dem 3'-Ende; gefolgt von einer TAAT-Stopp-Sequenz und einer HindIII-Restriktionsenzymschnittstelle ganz am 3'-Ende. Oligos N1-1 (α₂) und N1-2 (α₂) werden entworfen, um an Initiationsmethionin(ATG)-Codon am 5'-Ende des Gens einzufügen.
In einem Fall wurden die Oligos N1-2 (α₂) und N1-2 (α₂) (jeweils 1 μg) (51 stellt die Sequenz und Restriktionskarten der synthetischen Oligos dar, die verwendet wurden, um die ersten 240 Basenpaare des menschlichen Typ I (α₂)-Kollagen-Gens mit optimierter E. coli-Codonverwendung zu konstruieren) in 20 μl T7-DNA-Polymerasepuffer (40 mM Tris·HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 0,05 mg/ml Rinderserumalbumin) aneinandergelagert, indem sie bei 90°C für 5 Minuten erwärmt werden, gefolgt vom langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur. Nach einem kurzen Zentrifugationsschritt bei 14 000 Upm werden 10 Einheiten T7-DNA-Polymerase und 2 μl einer Lösung aus allen vier dNTPs (jeweils 2,5 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) zu den aneinandergelagerten Oligos zugegeben. Die Verlängerungsreaktionen werden bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und dann für 10 Minuten auf 70°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird HindIII-Puffer (5 μl einer 10-fach-Konzentration), 20 μl H₂O und 10 Einheiten HindIII-Restriktionsenzym hinzugegeben und die Röhrchen werden bei 37°C für 10 bis 16 Stunden inkubiert. HindIII-Puffer (2 μl einer 10-fach-Konzentration), 13,5 μl, 0,5 M Tris·HCl (pH 7,5), 1,8 μl von 1% Triton X100, 5,6 μl H₂O und 20 U EcoRI werden zu jedem Röhrchen gegeben und die Inkubation wird für 2 Stunden bei 37°C fortgesetzt. Die Verdaus werden einmal mit einem gleichen Volumen an Phenol extrahiert, dann einmal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und einmal mit Chloroform/Isoamylalkohol. Nach der Ethanol-Präzipitierung wird das Pellet in 10 μl TE-Puffer (10 mM Tris·HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) resuspendiert. Das resuspendierte Pellet (4 μl) wird über Nacht bei 16°C mit Aragrosegel gereinigtem EcoRI/HindIII-verdauten pBSKS⁺-Vektor (1 μg) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (100 Einheiten) ligiert. Eine Hälfte der Transformationsmischung wird durch einen Wärmeschock in DH5α-Zellen transformiert und 100 μl der 1,0 ml-Transformationsmischung wird auf Luria-Nährflüssigkeit(LB)-Agarplatten, die 70 μg/ml Ampicillin enthalten, ausplattiert.
Die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Ampicillin-resistente Kolonien (6–12) werden herausgepickt und über Nacht in LB-Medium gezüchtet, welches 70 mg/ml Ampicillin enthält. Die Plasmid-DNA wird aus jeder Kultur durch Wizard-Minipreps (Promega Corporation, Madison WI) isoliert und auf das Vorhandensein des ungefähr 120 Basenpaare langen Insertionen durch einen Verdau mit EcoRI und HindIII und das Laufenlassen der Produkte des Verdaus auf Agarose-Elektrophesegelen durchmustert. Klone mit Insertionen wurden durch Standard-Didesoxy-Terminations-DNA-Sequenzierung überprüft. Der korrekte Klon wird als pBSN1-1 (α₂) (52) bezeichnet.
Oligos N1-3 (α₂) und N-1-4 (α₂) werden synthetisiert, gereinigt, aneinandergelagert, verlängert und in pBSKS⁺ unter Verfolgung des gleichen Verfahrens, das oben für die Oligos N1-1 (α₂) und N1-2 (α₂) angegeben wurde, kloniert. Das erhalten Plasmid wird als pBSN1-2A bezeichnet. Um die Abschnitte des Kollagen-Gens von pBSN1-1 (α₂) (1 μg) zusammenzuklonieren, wird selbiges für 2 Stunden bei 37°C BsrFI und HindIII verdaut. Der verdaute Vektor wird durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Plasmid pBSN1-2 (α₂) (3 μg) wird für 2 Stunden bei 37°C mit BrsFI und HindIII verdaut und das Insert durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. BsrFI/HindIII-verdautes pBSN1-1 wird mit dieser Insertion über Nacht bei 16°C mittels T4-DNA-Ligase ligiert. Eine Hälfte des Ligationsgemischs wird in DH5α-Zellen transformiert und ein Zehntel der Transformationsmischung wird auf LB-Agarplatten, die 70 μg/ml Ampicillin enthalten, ausplattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C werden Ampicillin-resistente Klone herausgepickt und auf das Vorhandensein eines DNA-Isertionen wie oben beschrieben, durchmustert. Klone werden mittels Didesoxy-Terminationssequenzierung kontrolliert. Der korrekte Klon wird als pBSN1-2 (α₂) (53) bezeichnet und das Kollagenfragment hat die Sequenz, die in 54 (SEQ ID NO: 37) angegeben ist.
In ähnlicher Weise wird der Rest des Kollagen-Gens konstruiert, so daß die endgültige DNA-Sequenz die ist, die in den 50A bis 50E (SEQ ID NO: 31) angegeben ist.
B) Expression des Gens in E. coli:
Nach der Konstruktion des gesamten menschlichen Kollagen-Typ I (α₂)-Gens unter Codonverwendung, die für E. coli optimiert ist, wird das klonierte Gen in E. coli exprimiert. Das Plasmid (pHuCol(α₂)^Ec, (55), welches das gesamte synthetische Kollagen-Gen (50A–50E) codiert, das hinter den Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid-(IPTG)-induzierbaren Tac-Promotor plaziert ist und ebenfalls β-Lactamase codiert in Escherichia coli-Stamm DH5α (supE44 ΔlacU169 (ϕ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) durch Standard-Wärmeschocktransformation transformiert. Die Transformationskulturen werden auf Luria-Nährflüssigkeit (LB), die 100 μg/ml Ampicillin enthalten, ausplattiert und nach dem Wachstum über Nacht wird eine einzige Ampicillin-resistente Kolonie verwendet, um 10 ml LB zu inokulieren, welches 100 μg/ml Ampicillin enthält und nach Über-Nacht-Wachstum wird eine einzige Ampicillin-resistente Kolonie verwendet, um 10 ml LB, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, zu inokulieren. Nach dem Wachstum für 10 bis 16 Stunden unter Rühren (225 Upm) bei 37°C wird diese Kultur verwendet, um 1 l LB, welche 100 μg/ml Ampicillin enthält, in einer 1,5 l-Schüttelflasche zu inokulieren. Nach dem Wachstum bei 37°C, 225 Upm, bei 2 Stunden nach der Inokulierung, ist die optische Dichte bei 600 nm ungefähr 0,5 OD/ml. IPTG wird zu 1 mM zugegeben und die Kultur wird für zusätzliche 5 bis 10 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (5000 Upm, 10 Minuten) geerntet und durch mechanisches Aufschließen lysiert. Rekombinantes menschliche Kollagen wird durch Ammoniumsulfatfraktionierung und Säulenchromatographie gereinigt. Die Ausbeute beträgt typischerweise 15 bis 25 mg/l Kultur
Beispiel 14A
Alternative Konstruktion und Expression des menschlichen Kollagen-Typ I (α₂)-Gens mit optimierter E. coli-Codonverwendung in E. coli
A) Konstruktion des Gens:
Die Nukleotidsequenz des helikalen Bereich des menschlichen Kollagen-Typ I (α₂)-Gens, das von 112 Aminosäuren des Amino-terminalen extrahelikalen und 12 Aminosäuren des C-terminalen extrahelikalen Bereichs flankiert ist, wird in den 49A bis 49E (SEQ ID NO: 29) gezeigt. Eine tabellarische Auflistung der Codonhäufigkeit dieses Gens ist in Tabelle III angegeben. Die Gensequenz, die in den 49A bis 49E gezeigt ist, wurde zuerst geändert, um eine Neigung in Richtung der E. coli-Codons widerzuspiegeln. Ein Initiatormethionin wurde am 5'-Ende des Gens inseriert und eint TAAT-Stoppsequenz am 3'-Ende. Einzigartige Restriktionsschnittstellen wurden identifiziert oder an geeigneten Positionen in dem Gen erzeugt (ungefähr alle 150 Basenpaare). Das daraus resultierende Gen (HuCol(α2)^Ecm hat die Codonverwendung, die in Tabelle IV widergegeben ist. Andere Sequenzen, die sich der Neigung der E. coli-Codons annähern, sind ebenfalls annehmbar.
Oligonukleotide wurden auf einem Beckman Oligo 1000 DNA-Synthesegerät synthetisiert, gespalten und mit wäßriger NH₄OH entschützt und mittels Elektrophorese in 7 M Harnstoff/12 Polyacrylamid-Gelen gereinigt. Gereinigte Oligos (32,5 pmol) wurden in 20 μl Ligationspuffer (Boehringer Mannheim, Kat. Nr. 1635379) und Erwärmen auf 95°C, gefolgt von einer langsamen Abkühlung auf 20°C über 45 Minuten aneinandergelagert. Die aneinandergelagerten Oligonukleotide wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit verdautem Vektor (1 μg) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (5 Einheiten) ligiert. Eine Hälfte des Transformationsgemischs wurde durch Wärmeschock in DH5α-Zellen transformiert und 100 μl der 1,0 ml-Transformationsmischung werden auf Luria-Nährflüssigkeit(LB)-Agarplatten ausplattiert, die 70 μg/ml Ampicillin enthalten. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Ampicillin-resistenten Kolonien (6–12) wurden herausgepickt und über Nacht in LB-Medium gezüchtet, das 70 μg/ml Ampicillin enthält. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kultur durch QIAprep Miniprep (Qiagen, Valencia, CA) isoliert und auf das Vorhandensein eines Isertionen durch Verdau mit den flankierenden Restriktionsenzymen durchmustert und durch Laufenlassen der verdauten Produkte auf Agaroseelektrophoresegels. Die Klone mit Isertionen wurden durch Standard-Didesoxy-Terminations-DNA-Sequenzierung überprüft. Um die Abschnitte des Kollagen-Gens zusammenzuklonieren, wurde ein Insert, das die flankierenden Bereiche des Gens abdeckt in den Vektor, welcher den benachbarten Gen-Anteil enthält, ligiert. Isertionen wurden aus Plasmiden isoliert und die Vektoren wurden durch Doppelverdau für 2 Stunden bei 37°C mit den geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten. Der verdaute Vektor und das Insert wurden durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Insert und Vektor wurden 5 Minuten bei Raumtemperatur nach dem Verfahren in dem Rapid-DNA-Ligation-Kit (Boehringer Mannheim) ligiert. Eine Hälfte des Ligationsgemischs wurde in DH5α-Zellen transformiert und 1/10 des Transformationsgemischs wurde auf LB-Agarplatten, die 70 μg/ml Ampicillin enthalten, ausplattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurden Ampicillin-resistente Kolonien herausgepickt und auf das Vorhandensein von Insert-DNAs, wie oben beschrieben, durchmustert. Klone wurden durch Didesoxy-Terminationssequenzierung überprüft.
In ähnlicher Weise wurde der Rest des Kollagen-Gens hergestellt, so daß die endgültige DNA-Sequenz die ist, die in den 50A bis 50E (SEQ ID NO: 31) ist.
B) Expression des Gens in E. coli:
Nach der Konstruktion des gesamten menschlichen Kollagen-Typ I (α₂)-Gens unter Codonverwendung, die für E. coli optimiert ist, wird das klonierte Gen in E. coli exprimiert. Das Plasmid (pHuCol(α₂)^Ec, (55), welches das gesamte synthetische Kollagen-Gen (50A–50E) codiert, das hinter dem Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid-(IPTG)-induzierbaren Tac-Promotor plaziert ist und ebenfalls β-Lactamase codiert in den Escherichia coli-Stamm DH5α (supE44 ΔlacU169 (ϕ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) durch Standard-Wärmeschocktransformation transformiert. Die Transformationskulturen werden auf Luria-Nährflüssigkeit (LB), die 100 μg/ml Ampicillin enthalten, ausplattiert und nach dem Wachstum über Nacht wird eine einzige Ampicillin-resistente Kolonie verwendet, um 10 ml LB zu inokulieren, welches 100 μg/ml Ampicillin enthält und nach Über-Nacht-Wachstum wird eine einzige Ampicillin-resistente Kolonie verwendet, um 10 ml LB, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, zu inokulieren. Nach dem Wachstum für 10 bis 16 Stunden unter Rühren (225 Upm) bei 37°C wird diese Kultur verwendet, um 1 l LB, welche 100 μg/ml Ampicillin enthält, in einer 1,5 l-Schüttelflasche zu inokulieren. Nach dem Wachstum bei 37°C, 225 Upm, bei 2 Stunden nach der Inokulierung, ist die optische Dichte bei 600 nm ungefähr 0,5 OD/ml. IPTG wird zu 1 mM zugegeben und die Kultur wird für zusätzliche 5 bis 10 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (5000 Upm, 10 Minuten) geerntet und durch mechanisches Aufschließen lysiert. Rekombinantes menschliche Kollagen wird durch Ammoniumsulfatfraktionierung und Säulenchromatographie gereinigt. Die Ausbeute beträgt typischerweise 15 bis 25 mg/l Kultur
Beispiel 15
Expression von menschlichem Kollagen-Typ I (α₂) mit optimierter E. coli-Verwendung in E. coli
Ein Plasmid (pN1-2, 56), welches das Gen für die Amino-terminalen 80 Aminosäuren des menschlichen Kollagen-Typ I (α₂) (SEQ ID NO: 31, 54) mit optimierter E. coli-Codonverwendung codiert, ist hinter dem Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid(IPTG)-induzierbaren Tac-Promotor plaziert und codiert ebenfalls β-Lactamase und wird in Escherichia coli-Stamm DH5α (supE44 ΔlacU169 (ϕ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) durch Standard-Wärmeschocktransformation transformiert. Die Transformationskulturen werden auf Luria-Nährflüssigkeit (LB), die 100 μg/ml Ampicillin enthalten, ausplattiert und nach dem Wachstum über Nacht wird eine einzige Ampicillin-resistente Kolonie verwendet, um 10 ml LB zu inokulieren, welches 100 μg/ml Ampicillin enthält und nach Über-Nacht-Wachstum wird eine einzige Ampicillin-resistente Kolonie verwendet, um 10 ml LB, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, zu inokulieren. Nach dem Wachstum für 10 bis 16 Stunden unter Rühren (225 Upm) bei 37°C wird diese Kultur verwendet, um 1 l LB, welche 100 μg/ml Ampicillin enthält, in einer 1,5 l-Schüttelflasche zu inokulieren. Nach dem Wachstum bei 37°C, 225 Upm, bei 2 Stunden nach der Inokulierung, ist die optische Dichte bei 600 nm ungefähr 0,5 OD/ml. IPTG wird zu 1 mM zugegeben und die Kultur wird für zusätzliche 5 bis 10 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (5000 Upm, 10 Minuten) geerntet und durch mechanisches Aufschließen lysiert. Rekombinantes menschliche Kollagen wird durch Ammoniumsulfatfraktionierung und Säulenchromatographie gereinigt. Die Ausbeute beträgt typischerweise 15 bis 25 mg/l Kultur
Beispiel 16
Hydroxyprolin-Einbau in Proteine in E. coli unter Hungerbedingungen für Prolin
7 Plasmide pGEX-4T.1 (73), pTrc-TGF (74), pMal-C2 (1), pTrc-FN (75), pTrc-Fn-TGF (76), pTrc-FN-Bmp (77 und pGEX-HuColl^Ec, die jeweils getrennt Gene enthalten, die die folgenden Proteine codieren: Glutathion-S-Transferase (GST), das reife menschliche TGF-β₁-Polypeptid (TGF-β₁), Mannose-bindendes Protein (MBP), ein 70 kDa-Fragment von menschlichem Fibronectin (FN), eine Fusion aus FN und TGF-β₁ (FN-TGF-β₁), eine Fusion von FN und menschlichem Knochenmorphogenese-Protein 2A (FN-BMP-2A) und eine Fusion aus GST und Kollagen (GST-Coll), wurden jeweils individuell verwendet, um den Prolin-auxotrophen E. coli-Stamm JM109 (F^–) zu transformieren. Transformationskulturen wurden auf LB-Agar, der 100 μg/ml Ampicillin enthält, ausplattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurde eine einzige Kolonie von einer frischen Transformationsplatte verwendet, um 5 ml LB-Medium zu inokulieren, das 400 mg Ampicillin enthält. Nach Über-Nacht-Wachstum bei 37°C wurde diese Kultur zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellpellets wurden zweimal mit 5 ml M9-Medium (1 × M9-Salze, 0,5% Glucose, 1 mM MgCl₂MgCl₂, 0,01% Thiamin, 200 μg/ml Glycin, 200 μg/ml Alanin 100 μg/ml der anderen Aminosäuren ausgenommen Prolin und 400 μg/ml Ampicillin) gewaschen. Die Zellen wurden schließlich in 500 ml M9-Medium resuspendiert. Nach einer Inkubation unter Schütteln bei 37°C für 30 Minuten wurde trans-4-Hydroxyprolin zu 40 mM zugegeben, NaCl zu 0,5 M und Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid zu 1,5 mM. In einigen der Kulturen wurde eine dieser Zugaben nicht durchgeführt, wie sie an den Markierungen für die Spuren der Gele angegeben ist. Nach der Zugabe wurde die Inkubation unter Schütteln bei 37°C fortgesetzt. Nach 4 Stunden wurden die Kulturen zentrifugiert, die Überstände verworfen und die Zellpellets in SDS-PAGE-Probenpuffer resuspendiert (300 mM Tris (pH 6,8)/0,5% SDS/10% Glycerin/0,4 M β-Mercaptoethanol/0,2% Bromphenolblau) auf 15 OD 600 nm AU/ml, in ein kochendes Wasserbad für 5 Minuten gestellt und in denaturierenden Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proteine in den Gelen wurden durch Färben mit Coomassie Blue R250 visualisiert. Die Ergebnisse der Gele werden in den Scans, die in 57 bis 59 gezeigt sind, widergegeben. Die Scans beziehen sich auf GST, TGF-β₁, MBP, FN, FN-TGF-β₁ und FN-BMP-2A (57 und 58), welche drei Spuren zeigen, die jedes Peptid betreffen, d. h. eine Spur, die +NaCl/+Hyp anzeigt, worin NaCl (hyperosmotisch) und trans-4-Hydroxyprolin vorhanden sind; eine Spur, die –NaCl angibt, worin trans-4-Hydroxyprolin vorhanden ist, aber NaCl nicht; und eine Spur, die –Hyp anzeigt, welche +NaCl ist, aber ohne trans-4-Hydroxyprolin. Die Sternchen auf den Scans markieren die Proteinbanden, die dem entsprechenden Zielprotein entsprechen. Die Fälle, in denen Zielprotein exprimiert war, schließen alle +NaCl ein in Verbindung mit +Hyp, wodurch die +NaCl- und +Hyp-Abhängigkeit gezeigt wird.
Der Scan, der in 59 gezeigt ist, welcher GST-Kollagen betrifft, zeigt vier Spuren, die GST-Coll betreffen, d. h. eine Spur die +Hyp/+NaCl/–IPTG zeigt, wobei trans-4-Hydroxyprolin und NaCl vorhanden sind, aber IPTG (der Protein-Expressionsinduktor) nicht, und da es dort keinen Induktor gibt, gibt es keine Zielprotein-Bande; eine Spur, die +NaCl/+IPTG/–Hyp angibt, worin NaCl und IPTG vorhanden sind, aber trans-4-Hydroxyprolin nicht, und da trans-4-Hydroxyprolin nicht vorhanden ist, keine Zielprotein-Bande vorhanden ist; eine Spur, die +NaCl/+Pro/+IPTG anzeigt, worin NaCl, Prolin und IPTG vorhanden sind, aber da das Zielprotein nicht stabil ist, wenn es Prolin enthält, gibt es keine Zielprotein-Bande; und eine Spur, die als +IPTG/+NaCl/+Hyp bezeichnet wird, worin IPTG, NaCl und trans-4-Hydroxyprolin vorhanden sind, und da dieses Protein durch die Anwesenheit von trans-4-Hydroxyprolin stabilisiert wird, ist eine durch einen Stern markierte Proteinbande sichtbar.
Beispiel 17
Hydroxyprolin-Einbau in ein Kollagen-artiges Peptid in E. coli
Ein Plasmid (pGST-CM4, 60), das das Gen für Kollagen-Mimetikum 4 (CM 4, 61) (SEQ ID NO: 39) enthält, welches genetisch mit dem 3'-Ende des Gens für S. japanicum-Glutathion-S-Transferase verbunden ist, wurde verwendet, um durch Elektroporierung den Prolin-auxotrophen E. coli-Stamm JM109 (F^–) zu transformieren. Transformationskulturen wurden auf LB-Agar ausplattiert, der 100 μg/ml Ampicillin enthält. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurde eine einzelne Kolonie einer frischen Transformationsplatte verwendet, um 5 ml LB-Medium zu inokulieren, welche 100 μg/ml Ampicillin enthält. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37°C wurden 500 μl dieser Kultur zentrifugiert, der Überstand verworfen, und das Zellpellet wurde einmal mit 500 μl M9-Medium (1 × M9-Salze, 0,5% Glucose, 1 mM MgCl₂, 0,1% Thiamin, 20 μg/ml Glycin, 200 μg/ml Alanin, 100 μg/ml der anderen Aminosäuren ausgenommen Prolin und 400 μg/ml Ampicillin) gewaschen. Die Zellen wurden schlußendlich in 5 ml M9-Medium suspendiert, das 10 μg/ml Prolin enthält und 2 ml hiervon wurde verwendet, um 30 ml M9-Medium zu inokulieren, das 10 μg/ml Prolin enthält. Nach der Inkubation unter Schütteln bei 37°C für 8 Stunden wurde die Kultur zentrifugiert und das Zellpellet wurde einmal mit M9-Medium gewaschen, das 5 μg/ml Prolin enthält. Das Pellet wurde in 15 ml M9-Medium resuspendiert, das 5 μg/ml Prolin enthält und diese Kultur wurde verwendet, um 1 l M9-Medium zu inokulieren, das 5 μg/ml Prolin enthält.
Diese Kultur wurde für 18 Stunden bei 37°C nach hungernd Prolin gezüchtet. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Kultur zentrifugiert, die Zellen wurden einmal mit M9-Medium (ohne Prolin) gewaschen und die Zellen wurden in 1 l M9-Medium resuspendiert, das 80 mM Hydroxyprolin, 0,5 M NaCl und 1,5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid enthält, resuspendiert. Die Inkubation wurde bei 37°C unter Schütteln für 22 Stunden fortgesetzt. Die Kulturen wurden zentrifugiert und die Zellpellets wurden bei –20°C gelagert bis sie weiterverarbeitet wurden.
Beispiel 18
Prolin-Einbau in ein Kollagen-artiges Peptid in E. coli
Ein Plasmid (pGST-CM4, 60), das das Gen für Kollagen-Mimetikum 4 (CM 4, 61) (SEQ ID NO: 39) enthält, welches genetisch mit dem 3'-Ende des Gens für S. japanicum-Glutathion-S-Transferase verbunden ist, wurde verwendet, um durch Elektroporierung den Prolin-auxotrophen E. coli-Stamm JM109 (F^–) zu transformieren. Transformationskulturen wurden auf LB-Agar ausplattiert, der 100 μg/ml Ampicillin enthält. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurde eine einzelne Kolonie einer frischen Transformationsplatte verwendet, um 5 ml LB-Medium zu inokulieren, welche 100 μg/ml Ampicillin enthält. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37°C wurden 500 μl dieser Kultur zentrifugiert, der Überstand verworfen, und das Zellpellet wurde einmal mit 500 μl M9-Medium (1 × M9-Salze, 0,5% Glucose, 1 mM MgCl₂, 0,1% Thiamin, 20 μg/ml Glycin, 200 μg/ml Alanin, 100 μg/ml der anderen Aminosäuren ausgenommen Prolin und 400 μg/ml Ampicillin) gewaschen. Die Zellen wurden schlußendlich in 5 ml M9-Medium suspendiert, das 10 μg/ml Prolin enthält und 2 ml hiervon wurden verwendet, um 30 ml M9-Medium zu inokulieren, das 10 μg/ml Prolin enthält. Nach der Inkubation unter Schütteln bei 37°C für 8 Stunden wurde die Kultur zentrifugiert und das Zellpellet wurde einmal mit M9-Medium gewaschen, das 5 μg/ml Prolin enthält. Das Pellet wurde in 15 ml M9-Medium resuspendiert, das 5 μg/ml Prolin enthält und diese Kultur wurde verwendet, um 1 l M9-Medium zu inokulieren, das 5 μg/ml Prolin enthält. Diese Kultur wurde für 18 Stunden bei 37°C nach Prolin hungernd gezüchtet. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Kultur zentrifugiert, die Zellen wurden einmal mit M9-Medium (ohne Prolin) gewaschen und die Zellen wurden in 1 l M9-Medium resuspendiert, das 80 mM Hydroxyprolin, 0,5 M NaCl und 1,5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid enthält, resuspendiert. Die Inkubation wurde bei 37°C unter Schütteln für 22 Stunden fortgesetzt. Die Kulturen wurden zentrifugiert und die Zellpellets wurden bei –20°C gelagert bis sie weiterverarbeitet wurden.
Beispiel 19
Reinigung von Hydroxyprolin-haltigem Kollagen-artigen Peptid aus E. coli
Das Zellpellet aus 1 l Fermentationskultur, welche wie in Beispiel 17 oben beschrieben hergestellt wurde, wurde in 20 ml Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,1) (PBS), welche 1 mM EDTA, 100 μM PMSF, 0,5 μg/ml E64 und 0,7 μg/ml Pepstatin (Resuspensionspuffer) enthält, resuspendiert. Die Zellen wurden lysiert, indem sie zweimal durch eine French-Presse passiert wurden. Nach der Lyse wurde die Suspension für 30 Minuten bei 30 000 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde einmal mit 5 ml Resuspensionspuffer, welcher 1 M Harnstoff enthält und mit 0,5% Triton X100 gewaschen, gefolgt von einem Waschschritt mit 7 ml mit Resuspensionspuffer ohne Harnstoff oder Triton X100. Das Pellet wurde schließlich in 5 ml 6 M Guanidinhydrochlorids in Dulbeccos-Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,1) resuspendiert, die 1 mM EDTA und 2 mM β-Mercaptoethanol enthält und für 3 × 60 Sekunden auf Eis mit Ultraschall behandelt (Mikrotip, Stärke = 3,5, Heat Systems XL-2020 model sonicator). Die beschallte Suspension wurde bei 4°C für 18 Stunden inkubiert und dann bei 14 000 Upm in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand (6 ml) wurde gegen 4 × 4 l destillierten Wassers bei 4°C dialysiert (10 000 MWCO). Die Inhalte der Dialyseröhrchen wurden in eine 150 ml-Rundbodenflasche überführt und bis zur Trockenheit lyophilisiert. Der Rest (~30 mg) wurde in 3 ml 70%iger Ameisensäure gelöst und 40 mg Cyanogenbromid wurde zugegeben. Die Flasche wurde einmal mit Stickstoff ausgespült, geleert und es wurde ihr ermöglicht für 18 Stunden bei Raumtemperatur zu Rühren. Der Inhalt der Flasche wurde im Vakuum bei Raumtemperatur bis zur Trockenheit gebracht, der Rest wurde in 5 ml destilliertem Wasser resuspendiert und wieder bis zur Trockenheit verdampft. Dies wurde zweimal wiederholt. Der Rest wurde schließlich in 2 ml 0,2%iger Trifluoressigsäure (TFA) gelöst. Das Trifluoressigsäure-lösliche Material wurde in 100 μl-Aliquots auf eine Roros R2-Säule (4,6 mm × 100 mm) aufgetragen, welche bei 5 ml/min mit einem Ausgangspuffer von 98% 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser/2% 0,1% TFA in Acetonitril läuft. Das Hydroxyprolin-haltige Protein wurde mit einem Gradienten aus 2% zu 0,1%igem TFA/Acetonitril bis 40% zu 0,1% TFA/Acetonitril über 25 Säulenvolumina eluiert (62A). Das Kollagen-Mimetikum eluierte zwischen 18 und 23%/0,1% TFA/Acetonitril. 62A ist ein Chromatogramm der Eluierung des Hydroxyprolin-haltigen CM4 von einer Poros RP2-Säule (erhältlich von Perseptive Biosystems, Framingham, MA). Der Pfeil zeigt den Peak an, welcher das Hydroxyprolin-haltige CM4 enthält. Die Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE untersucht und die Kollagen-Mimetikum-haltigen Fraktionen wurden gepoolt und lyophilisiert. Lyophilisiertes Material wurde bei –20°C gelagert.
Beispiel 20
Reinigung von Prolin-haltigem Kollagen-artigen Peptid aus E. coli
Das Zellpellet aus 500 ml Fermentationskultur, welches wie oben in Beispiel 18 beschrieben hergestellt wurde, wurde in 20 ml Dulbeccos-Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,1) (PBS) resuspendiert, welche 10 mM EDTA, 100 μM PMSF, 0,5 μg/ml E64 und 0,06 μg/ml Aprotinin enthält. Lysozym (2 mg) wurde zu der Suspension zugegeben, die bei 4°C für 60 Minuten inkubiert wurde. Die Suspension wurde für 5 × 60 Sekunden beschallt (Mikrotip, Power = 3,5, Heat Systems XL-2020 model Sonicator). Die beschallte Suspension wurde bei 20 000 xg für 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde auf 1% Triton X100 eingestellt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 7 ml Glutathionsepharose 4B prääquilibriert in PBS inkubiert. Die Suspension wurde für 3 Minuten bei 500 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Harz wurde dreimal mit 8 ml PBS gewaschen. Gebundene Proteine wurden mit 3 Aliquots (2 ml jeweils, 10 Minuten leichtes Schwenken bei Raumtemperatur) aus 10 mM Glutathion 50 mM Tris (pH 8,0) eluiert. Die Eluate wurden kombiniert und dialysiert (10 000 MWCO), gegen 3 × 4 l destillierten Wassers bei 4°C. Die Inhalte der Dialyseröhrchen wurden in eine 150 ml-Rundbodenflasche überführt und bis zur Trockenheit lyophilisiert. Der Rest wurde in 3 ml 70%iger Ameisensäure gelöst und 4 mg Cyanogenbromid wurde zugegeben. Die Flasche wurde einmal mit Stickstoff ausgespült, geleert und es wurde ihr ermöglicht für 18 Stunden bei Raumtemperatur zu Rühren. Der Inhalt der Flasche wurde im Vakuum bei Raumtemperatur bis zur Trockenheit gebracht, der Rest wurde in 5 ml destilliertem Wasser resuspendiert und wieder bis zur Trockenheit verdampft. Dies wurde zweimal wiederholt. Der Rest wurde schließlich in 2 ml 0,2%iger Trifluoressigsäure (TFA) gelöst.
Das Trifluoressigsäure-lösliche Material wurde in 100 μl-Aliquots auf eine Roros R2-Säule (4,6 mm × 100 mm) aufgetragen, welche bei 5 ml/min mit einem Ausgangspuffer von 98% 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser/2% 0,1% TFA in Acetonitril läuft. Das Hydroxyprolin-haltige Protein wurde mit einem Gradienten aus 2% 0,1%igem TFA/Acetonitril zu 40% 0,1% TFA/Acetonitril über 25 Säulenvolumina eluiert (62A). Das Kollagen-Mimetikum eluierte zwischen 18 und 23% 0,1% TFA/Acetonitril. 62A ist ein Chromatogramm der Eluierung des Hydroxyprolin-haltigen CM4 von einer Poros RP2-Säule (erhältlich von Perseptive Biosystems, Framingham, MA). Der Pfeil zeigt den Peak an, welcher das Hydroxyprolin-haltige CM4 enthält. Die Fraktionen wurden aus SDS-PAGE untersucht und die Kollagen-Mimetikum-haltigen Fraktionen wurden gepoolt und lyophilisiert. Lyophilisiertes Material wurde bei –20°C gelagert.
Beispiel 21
Aminosäureanalyse des Hydroxyprolin-haltigen Kollagenmimetikums und des Protein-haltigen Kollagenmimitikums
Ungefähr 30 μg des gereinigten Hydroxyprolin-haltigen Kollagenmimetikums und des Prolin-haltigen Kollagenmimetikums, die hergestellt wurden wie in den Beispielen 19 bzw. 20 beschrieben, wurden in 250 μl 6 N Salzsäure in Glasampullen gelöst. Die Ampullen wurden zweimal mit Stickstoff gespült, unter Vakuum versiegelt und bei 110°C für 23 Stunden inkubiert. Nach der Hydrolyse wurden die Proben aus den Ampullen entfernt und im Vakuum bis zur Trockenheit gebracht. Die Proben wurden in 15 μl 0,1 N Salzsäure gelöst und eine Aminosäureanalyse auf einem Hewlett Packard AminoQuant 1090 Aminosäure-Analysegerät unter Verwendung von Standard-OPA und FMOC-Derivatisierungschemie unterworfen. Beispiele der Ergebnisse der Aminosäureanalyse, die den Bereich der Chromatogramme darstellen, wo die sekundären Aminosäuren (Prolin und Hydroxyprolin) eluieren, sind in den 63A bis 63D gezeigt. Diese Figuren zeigen auch Chromatogramme von Prolin- und Hydroxyprolin-Aminosäurestandards. Genauer gesagt zeigt 63A ein Chromatogramm eines Prolin-Aminosäurestandards (250 pmol). * zeigt einen kontaminierenden Peak an; 63B zeigt ein Chromatogramm eine Hydroxyprolin-Aminosäurestandards (250 Pool). * zeigt einen kontaminierenden Peak an. 63C stellt ein Aminosäure-Analysechromatogramm der Hydrolyse von Prolin-haltigem CM4 dar. Nur der Bereich des Chromatogramms, in dem Prolin und Hydroxyprolin eluieren, ist gezeigt. * zeigt einen kontaminierenden Peak an. 63D stellt ein Aminosäure-Analysechromatogramm der Hydrolyse von Hydroxyprolin-haltigem CM4 dar. Nur der Bereich des Chromatogramms, wo Prolin und Hydroxyprolin eluieren, ist gezeigt. Das * zeigt einen kontaminierenden Peak an.
Beispiel 22
Bestimmung der Prolin-Hungerbedingungen in E. coli (Stamm JM109 (F^–))
Ein Plasmid (pGST-CM4, 60), das das Gen für Kollagen-Mimetikum 4 (CM4, 61) enthält, das genetisch mit dem 3'-Ende des Gens für S. japonicum-Glutathion-S-Transferase verbunden ist, wurde verwendet, um durch Elektroporation den Prolin-auxotrophen E. coli-Stamm JM106 (F^–) zu transformieren. Die Transformationskulturen wurden auf LB-Agar ausplattiert, welcher 100 μg/ml Ampicillin enthält. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wird eine einzelne Kolonie von einer frischen Transformationsplatte verwendet, um 2 ml M9-Medium zu inokulieren (1 × M9-Salze, 0,5% Glucose, 1 mM MgCl₂, 0,01% Thiamin, 200 μg/ml Glycin, 200 μg/ml Alanin, 100 μg/ml der anderen Aminosäuren ausgenommen Prolin und 200 μg/ml Carbenicillin) und welches 20 μg/ml Prolin enthält. Nach dem Wachstum bei 37°C unter Schütteln für 8 Stunden wurden 1,5 ml verwendet, um 27 ml M9-Medium zu inokulieren, das 45 μg/ml Prolin enthält. Nach der Inkubation bei 37°C unter Schütteln für 7 Stunden wurde die Kultur zentrifugiert, das Zellpellet wurde mit 7 ml M9-Medium ohne Prolin gewaschen und schließlich in 17 ml M9-Medium ohne Prolin resuspendiert. Diese Kultur wurde verwendet, um vier 35 ml-Kulturen M9-Medium zu inokulieren, welche 4 μg/ml Prolin enthalten bei einer OD600 von 0,028. Kulturen wurden unter Schütteln bei 37°C inkubiert und die OD600 wurde überwacht. Nach 13,5 Stunden Wachstum hatte die OD600 ein Plateau erreicht. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine Kultur mit 15 μg/ml Prolin supplementiert, eine mit 15 μg/ml Hydroxyprolin, eine mit 15 μg/ml aller Aminosäuren ausgenommen Prolin und Hydroxyprolin, und eine Kultur mit gar nichts. Die Inkubation wurde fortgesetzt und die OD600 für insgesamt 24 Stunden überwacht. 64 ist ein Graph der OD600 gegenüber der Zeit für Kulturen von JM109 (F^–), welche bis zum Plateau gezüchtet wurden und dann mit verschiedenen Aminosäuren supplementiert wurden. Der Punkt, an dem die Kulturen ergänzt wurden, ist mit einem Pfeil angegeben. Das Hungern nach Prolin ist erkennbar, da nur die Kultur, die mit Prolin supplementiert wurde, über das Plateau hinaus wuchs.
Beispiel 23
Hydroxyprolin-Einbau in Typ I (α₁)-Kollagen in E. coli
Ein Plasmid (pHuCol(α1)^Ec, 65), welches das Gen für Typ I (α₁)-Kollagen mit optimierter E. coli-Codonverwendung (39A–39E) (SEQ ID NO: 19) unter Kontrolle des Tac-Promotors enthält und das Gen für Chloramphenicol-Resistenz enthält, wurde verwendet, um durch Elektroporation den Prolin-auxotrophen E. coli-Stamm JM109 (F^–) zu transformieren. Die Transformationskulturen wurden auf LB-Agar ausplattiert, welcher 20 μg/ml Chloramphenicol enthält.
Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurde eine einzelne Kolonie einer frischen Transformationsplatte verwendet, um 100 ml LB-Medium zu inokulieren, das 20 μg/ml Chloramphenicol enthält. Diese Kultur wurde bis zu einer OD600 nm von 0,5 gezüchtet und 100 μl-Aliquots wurden in 1,5 ml-Röhrchen überführt. Die Röhrchen wurden bei –80°C gelagert. Zur Expression wurde ein Röhrchen auf Eis aufgetaut und verwendet, um 25 ml LB-Medium zu inokulieren, das 20 μg/ml Chloramphenicol enthält. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37°C wurde ein 4 ml-Aliquot entfernt, zentrifugiert, und das Zellpellet wurde einmal mit 1 ml 2 × YT-Medium gewaschen, das 20 μg/ml Chloramphenicol enthält, und die gewaschenen Zellen wurden verwendet, um 1 l 2 × YT-Medium zu inokulieren, das 20 μg/ml Chloramphenicol enthält. Diese Kultur wurde bei 37°C bis zu einer OD 600 nm von 0,8 gezüchtet. Die Kultur wurde zentrifugiert und das Zellpellet wurde einmal mit 100 ml M9-Medium gewaschen (1 × M9-Salze, 0,5% Glucose, 1 mM MgCl₂, 0,01% Thiamin, 200 μg/ml Glycin, 200 μg/ml Alanin, 100 μg/ml der anderen Aminosäuren ausgenommen Prolin und 20 μg/ml Chloramphenicol). Die Zellen wurden in 910 ml M9-Medium (1 × M9-Salze, 0,5% Glucose, 1 mM MgCl₂, 0,01% Thiamin, 200 μg/ml Glycin, 200 μg/ml Alanin, 100 μg/ml der anderen Aminosäuren ausgenommen Prolin und 20 μg/ml Chloramphenicol) resuspendiert und für 30 Minuten bei 37°C wachsen gelassen. NaCl (80 ml, 5 M), Hydroxyprolin (7,5 ml, 2 M) und IPTG (500 μl 1 M) wurde zugegeben und das Wachstum wurde für 3 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und bei –20°C gelagert.
Beispiel 24
Hydroxyprolin-Einbau in Typ I (α₂)-Kollagen in E. coli
Ein Plasmid (pHuCol(α2)^Ec, 66), welches das Gen für Typ I (α₂)-Kollagen mit optimierter E. coli-Codonverwendung (50A–50E) (SEQ ID NO: 31) unter Kontrolle des Tac- Promotors enthält, und das das Gen für Chloramphenicolresistenz enthält, wurde verwendet, um durch Elektroporation den Prolin-auxotrophen E. coli-Stamm JM109 (F^–) zu transformieren. Die Transformationskulturen wurden auf LB-Agar ausplattiert, welcher 20 μg/ml Chloramphenicol enthält. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurde eine einzelne Kolonie einer frischen Transformationsplatte verwendet, um 100 ml LB-Medium zu inokulieren, das 20 μg/ml Chloramphenicol enthält. Diese Kultur wurde bis zu einer OD600 nm von 0,5 gezüchtet und 100 μl-Aliquots wurden in 1,5 ml-Röhrchen überführt. Die Röhrchen wurden bei –80°C gelagert. Zur Expression wurde ein Röhrchen auf Eis aufgetaut und verwendet, um 25 ml LB-Medium zu inokulieren, das 20 μg/ml Chloramphenicol enthält. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37°C wurde ein 4 ml-Aliquot entfernt, zentrifugiert, und das Zellpellet wurde einmal mit 1 ml 2 × YT-Medium gewaschen, das 20 μg/ml Chloramphenicol enthält, und die gewaschenen Zellen wurden verwendet, um 1 l 2 × YT-Medium zu inokulieren, das 20 μg/ml Chloramphenicol enthält. Diese Kultur wurde bei 37°C bis zu einer OD 600 nm von 0,8 gezüchtet. Die Kultur wurde zentrifugiert und das Zellpellet wurde einmal mit 100 ml M9-Medium gewaschen (1 × M9-Salze, 0,5% Glucose, 1 mM MgCl₂, 0,01% Thiamin, 200 μg/ml Glycin, 200 μg/ml Alanin, 100 μg/ml der anderen Aminosäuren ausgenommen Prolin und 20 μg/ml Chloramphenicol). Die Zellen wurden in 910 ml M9-Medium (1 × M9-Salze, 0,5% Glucose, 1 mM MgCl₂, 0,01% Thiamin, 200 μg/ml Glycin, 200 μg/ml Alanin, 100 μg/ml der anderen Aminosäuren ausgenommen Prolin und 20 μg/ml Chloramphenicol) resuspendiert und für 30 Minuten bei 37°C wachsen gelassen. NaCl (80 ml, 5 M), Hydroxyprolin (7,5 ml, 2 M) und IPTG (500 μl 1 M) wurde zugegeben und das Wachstum wurde für 3 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und bei –20°C gelagert.
Beispiel 25
Hydroxyprolin-Einbau in ein C-terminales Fragment vom Typ I (α₁)-Kollagen in E. coli
Ein Plasmid (pD4-α1, 67), welches das Gen für die Carboxy-terminalen 219 Aminosäuren des menschlichen Typ I (α₁)-Kollagens mit optimierter E. coli-Codonverwendung codiert, welches an das 3'-Ende des Gens für Glutathion-S-Transferase fusioniert ist und unter Kontrolle des Tac-Promotors ist, und das ein Gen für Ampicillin-Resistenz enthält, wurde verwendet, um durch Elektroporation den Prolin-auxotrophen E. coli-Stamm JM109 (F^–) zu transformieren. Die Transformationskulturen wurden auf LB-Agar ausplattiert, welcher 100 μg/ml Ampicillin enthält. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurde eine einzelne Kolonie einer frischen Transformationsplatte verwendet, um 100 ml LB-Medium zu inokulieren, das 100 μg/ml Ampicillin enthält. Diese Kultur wurde bis zu einer OD600 nm von 0,5 gezüchtet und 100 μl-Aliquots wurden in 1,5 ml-Röhrchen überführt. Die Röhrchen wurden bei –80°C gelagert. Zur Expression wurde ein Röhrchen auf Eis aufgetaut und verwendet, um 25 ml LB-Medium zu inokulieren, das 400 μg/ml Ampicillin enthält. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37°C wurde ein 4 ml-Aliquot entfernt, zentrifugiert, und das Zellpellet wurde einmal mit 1 ml 2 × YT-Medium gewaschen, das 400 μg/ml Ampicillin enthält, und die gewaschenen Zellen wurden verwendet, um 1 l 2 × YT-Medium zu inokulieren, das 400 μg/ml Ampicillin enthält. Diese Kultur wurde bei 37°C bis zu einer OD 600 nm von 0,8 gezüchtet. Die Kultur wurde zentrifugiert und das Zellpellet wurde einmal mit 100 ml M9-Medium gewaschen (1 × M9-Salze, 0,5% Glucose, 1 mM MgCl₂, 0,01% Thiamin, 200 μg/ml Glycin, 200 μg/ml Alanin, 100 μg/ml der anderen Aminosäuren ausgenommen Prolin und 400 μg/ml Ampicillin). Die Zellen wurden in 910 ml M9-Medium (1 × M9-Salze, 0,5% Glucose, 1 mM MgCl₂, 0,01% Thiamin, 200 μg/ml Glycin, 200 μg/ml Alanin, 100 μg/ml der anderen Aminosäuren ausgenommen Prolin und 400 μg/ml Ampicillin) resuspendiert und für 30 Minuten bei 37°C wachsen gelassen. NaCl (80 ml, 5 M), Hydroxyprolin (7,5 ml, 2 M) und IPTG (500 μl 1 M) wurde zugegeben und das Wachstum wurde für 3 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und bei –20°C gelagert.
Beispiel 26
Hydroxyprolin-Einbau in ein C-terminales Fragment von Typ I (α₁)-Kollagen in E. coli
Ein Plasmid (pD4-α2, 68), welches das Gen für die Carboxy-terminalen 219 Aminosäuren des menschlichen Typ I (α₂)-Kollagens mit optimierter E. coli-Codonverwendung codiert, welches an das 3'-Ende des Gens für Glutathion-S-Transferase fusioniert ist und unter Kontrolle des Tac-Promotors ist, und das das Gen für Ampicillin-Resistenz enthält, wurde verwendet, um durch Elektroporation den Prolin-auxotrophen E. coli-Stamm JM109 (F^–) zu transformieren. Die Transformationskulturen wurden auf LB-Agar ausplattiert, welcher 100 μg/ml Ampicillin enthält. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurde eine einzelne Kolonie einer frischen Transformationsplatte verwendet, um 100 ml LB-Medium zu inokulieren, das 100 μg/ml Ampicillin enthält. Diese Kultur wurde bis zu einer OD600 nm von 0,5 gezüchtet und 100 μl-Aliquots wurden in 1,5 ml-Röhrchen überführt. Die Röhrchen wurden bei –80°C gelagert. Zur Expression wurde ein Röhrchen auf Eis aufgetaut und verwendet, um 25 ml LB-Medium zu inokulieren, das 400 μg/ml Ampicillin enthält. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37°C wurde ein 4 ml-Aliquot entfernt, zentrifugiert, und das Zellpellet wurde einmal mit 1 ml 2 × YT-Medium gewaschen, das 400 μg/ml Ampicillin enthält, und die gewaschenen Zellen wurden verwendet, um 1 l 2 × YT-Medium zu inokulieren, das 400 μg/ml Ampicillin enthält. Diese Kultur wurde bei 37°C bis zu einer OD 600 nm von 0,8 gezüchtet. Die Kultur wurde zentrifugiert und das Zellpellet wurde einmal mit 100 ml M9-Medium gewaschen (1 × M9-Salze, 0,5% Glucose, 1 mM MgCl₂, 0,01% Thiamin, 200 μg/ml Glycin, 200 μg/ml Alanin, 100 μg/ml der anderen Aminosäuren ausgenommen Prolin und 400 μg/ml Ampicillin). Die Zellen wurden in 910 ml M9-Medium (1 × M9-Salze, 0,5% Glucose, 1 mM MgCl₂, 0,01% Thiamin, 200 μg/ml Glycin, 200 μg/ml Alanin, 100 μg/ml der anderen Aminosäuren ausgenommen Prolin und 400 μg/ml Ampicillin) resuspendiert und für 30 Minuten bei 37°C wachsen gelassen. NaCl (80 ml, 5 M), Hydroxyprolin (7,5 ml, 2 M) und IPTG (500 μl 1 M) wurde zugegeben und das Wachstum wurde für 3 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und bei –20°C gelagert.
Beispiel 27
Reinigung von Hydroxyprolin-haltigem C-terminalen Fragment vom Typ I (α₁)-Kollagen
Zellmasse, die aus einer 1 l-Kultur geerntet wurde, welche wie in Beispiel 25 gezüchtet wurde, wurde in 30 ml Lysepuffer resuspendiert (2 M Harnstoff, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄, 10 mM EDTA, 10 mM βME, 0,1% Triton X-100, pH 7,4) bei 4°C. Lysozym (Hühnereiweiß) wurde zu 100 μg/l zugegeben und die Lösung wurde bei 4°C für 30 Minuten inkubiert. Die Lösung wurde zweimal durch eine Zellaufschluß-Presse (SLM Instruments, Rochester, NY) passiert und dann bei 30 000 xg für 30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 30 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, resuspendiert, bei 30 000 xg für 30 Minuten zentrifugiert, und das Pellet wurde in 25 ml Lösungspuffer (8 M Harnstoff, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄, 5 mM βME) aufgelöst. Die Lösung wurde bei 30 000 xg für 30 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde gegen zwei Wechsel aus 4 l destillierten Wassers bei 4°C dialysiert. Nach der Dialyse wurde die gesamte Mischung lyophilisiert. Der lyophilisierte Feststoff wurde in 0,1 M HCl in einer Flasche unter Rühren gelöst. Nach der Zugabe eines 5-fachen Überschusses aus kristallinem BrCN wurde die Flasche geleert und mit Stickstoff gefüllt. Die Spaltung wurde für 24 Stunden ablaufen gelassen, worauf das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde. Der Rest wurde in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) gelöst und mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac C4 RP-HPLC-Säule (10 × 250 mm, 5 μ, 300 Å) auf einem BioCad Sprint System (Perceptive Biosystems, Framingham, MA) gereinigt. Hydroxyprolin-haltiges D4-Protein wurde mit einem Gradienten auf 15 bis 40% Acetonitril/0,1% TFA über einen 45-minütigen Zeitraum eluiert. Protein D4-αa eluierte bei 26% Acetonitril/0,1% TFA.
Beispiel 28
Reinigung eines Hydroxyprolin-haltigen C-terminalen Fragments vom Typ I (α₂)-Kollagen
Zellmasse, die aus 1 l Kultur stammte, welche wie in Beispiel 26 gezüchtet wurde, wurde in 30 ml Lysepuffer resuspendiert (2 M Harnstoff, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄, 10 mM EDTA, 10 mM βME, 0,1% Triton X-100, pH 7,4) bei 4°C. Lysozym (Hühnereieiweiß) wurde zu 100 μg/l zugegeben und die Lösung wurde bei 4°C für 30 Minuten inkubiert. Die Lösung wurde zweimal durch eine Zellaufschluß-Presse (SLM Instruments, Rochester, NY) passiert und dann bei 30 000 xg für 30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 30 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, resuspendiert, bei 30 000 xg für 30 Minuten zentrifugiert, und das Pellet wurde in 25 ml Lösungspuffer (8 M Harnstoff, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄, 5 mM βME) aufgelöst. Die Lösung wurde bei 30 000 xg für 30 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde gegen zwei Wechsel aus 4 l destillierten Wassers bei 4°C dialysiert. Nach der Dialyse wurde die gesamte Mischung lyophilisiert. Der lyophilisierte Feststoff wurde in 0,1 M HCl in einer Flasche unter Rühren gelöst. Nach der Zugabe eines 5-fachen Überschusses aus kristallinem BrCN wurde die Flasche geleert und mit Stickstoff gefüllt. Die Spaltung wurde für 24 Stunden ablaufen gelassen, worauf das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde. Der Rest wurde in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) gelöst und mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac C4 RP-HPLC-Säule (10 × 250 mm, 5 μ, 300 Å) auf einem BioCad Sprint System (Perceptive Biosystems, Framingham, MA) gereinigt. Hydroxyprolin-haltiges D4-Protein wurde mit einem Gradienten auf 15 bis 40% Acetonitril/0,1% TFA über einen 45-minütigen Zeitraum eluiert. Protein D4-αa eluierte bei 25% Acetonitril/0,1% TFA.
Beispiel 29
Aminosäure-Zusammensetzungsanalyse eines Hydroxyprolin-haltigen C-terminalen Fragments vom Typ I (α₁)-Kollagen
Protein D4-αa (10 μg), welches in Beispiel 27 gereinigt wurde, wurde bis zur Trockenheit in vacuo in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen gebracht. Eine Probe wurde einer Aminosäureanalyse im W. M. Keck-Foundation Biotechnology Resource Laboratory (New Haven, CT) auf einem Applied Biosystems-Sequenziergerät, das mit einem On-line-HPLC-System ausgerüstet ist, unterworfen. Die experimentell bestimmte Sequenz der ersten 13 Aminosäuren (SEQ ID NO: 41) und die Sequenz die aufgrund der DNA-Sequenz vorhergesagt wurde (SEQ ID NO: 42) ist in 69 gezeigt. Eine Probe des Proteins D4-α1 wurde einer Massenspektrumsanalyse auf einem VG Biotech BIO-Q-Quadropole-Analysegerät bei M-Scan, Inc. (West Chester, PA) unterworfen. Das Massenspektrum und das vorhergesagte Molekulargewicht des Proteins D4-α1, wenn es 100% Hydroxyprolin anstelle von Prolin enthält, ist in 70 angegeben. Das vorhergesagte Molekulargewicht des Proteins D4-α1, das 100% Hydroxyprolin anstelle von Prolin enthält, beträgt 20 807,8 Da. Das experimentell bestimmte Molekulargewicht war 20 807,5 Da.
Beispiel 30
Konstruktion der Carboxy-terminalen 219 Aminosäuren des menschlichen Collagen-Typ I (α₁)-Fragment-Gens mit optimierter E. coli-Codonverwendung
Die Nukleotidsequenz des 657 Nukleotide langen Gens der Carboxy-terminalen 219 Aminosäuren des menschlichen Typ I (α₁)-Kollagens mit optimierter E. coli-Codonverwendung ist in 71 gezeigt. Zur Synthese dieses Gens wurden einzigartige Restriktionsschnittstellen identifiziert oder ungefähr alle 150 Basenpaare erzeugt. Oligos aus ungefähr 80 Nukleotiden wurden auf einem Beckman Oligo 1000 DNA-Synthesegerät synthetisiert, gespalten und mit wäßriger NH₄OH entschützt und mittels Elektrophorese in 7 M Harnstoff/12% Polyacrylamidgelen gereinigt. Jeder Satz an Oligos wurde so entworfen, daß er eine EcoRI-Restriktionsenzymschnittstelle am 5'-Ende hat, eine einzigartige Restriktionsenzymschnittstelle nahe dem 3'-Ende, gefolgt von der TAAT-Stoppsequenz und einer HindIII-Restriktionsenzymschnittstelle ganz am 3'-Ende. Die ersten vier Oligos, welche die ersten 84 Aminosäuren der Carboxy-terminalen 219 Aminosäuren des menschlichen Typ I (α₁)-Kollagens mit optimierter E. coli-Codonverwendung umfassen, sind in 81 angegeben (SEQ ID NO: 47–50).
Oligos N4-1 (SEQ ID NO: 47) und N4-2 (SEQ ID NO: 48) (1 μg jeweils), wurden in 20 μl T7-DNA-Polymerase-Puffer (40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 0,05 mg/ml Rinderserumalbumin) durch Erwärmen bei 90°C für 5 Minuten, gefolgt von langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur aneinandergelagert. Nach einer kurzen Zentrifugierung bei 14 000 Upm, wurden 10 Einheiten T7-DNA-Polymerase und 2 μl einer Lösung aus allen vier dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, jeweils 2,5 mM) zu den aneinandergelagerten Oligos gegeben. Die Verlängerungsreaktionen wurden bei 37°C für 30 min inkubiert und dann bei 70°C für 10 Minuten erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur, wurde HindIII-Puffer (5 μl einer 10-fach Konzentration), 20 μl H₂O und 10 Einheit HindIII-Restriktionsenzym hinzugegeben und die Röhrchen wurden bei 37°C für 10 Stunden inkubiert. HindIII-Puffer (2 μl einer 10-fach Konzentration), 13,5 μl 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5), 1,8 μl 1% Triton X100, 5,6 μl H₂O und 20 U EcoRI wurden zu jedem Röhrchen hinzugegeben und die Inkubation wurde bei 37°C für 2 Stunden fortgesetzt. Die Verdaus wurden einmal mit einem gleichen Volumen an Phenol, einmal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und einmal mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Nach einer Ethanol-Präzipitation wurde das Pellet in 10 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) resuspendiert. Vom resuspendierten Pellet wurde 4 μl über Nacht bei 16°C mit Agarosegel gereinigtem EcoRI/HindIII-verdautem pBSKS⁺-Vektor (1 μg) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (100 Einheiten) ligiert. Eine Hälfte des Transformationsgemisches wurde durch Wärmeschock in DH5α-Zellen transformiert und 100 μl der 1,0 ml-Transformationsmischung wurden auf Luria-Nährflüssigkeit(LB)-Agarplatten ausplattiert, welche 70 μg/ml Ampicillin enthalten. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Ampicillin-resistenten Kolonien (6–12) wurden herausgepickt und über Nacht in LB-Medium gezüchtet, welche 70 μg/ml Ampicillin enthalten. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kultur durch Wizard Minipreps (Promega Corporation, Madison WI) isoliert und auf das Vorhandensein des ungefähr 120 Basenpaaren langen Isertionen durch Verdau mit EcoRI und HindIII durchmustert und durch Laufenlassen der verdauten Produkte auf Agarose-Elektrophoresegelen. Klone mit Insertionen wurde mittels Standard-Didesoxyterminations-DNA- Sequenzierung überprüft. Der korrekte Klon wurde als pBSN4-1 bezeichnet.
Oligos N4-3 (SEQ ID NO: 49) und N4-4 (SEQ ID NO: 50) (81) wurden synthetisiert, gereinigt, aneinandergelagert, verlängert und nach genau dem gleichen Verfahren, das oben für die Oligos N4-1 und N4-2 angegeben ist, in pBSKS⁺ kloniert. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde als pBSN4-2A bezeichnet. Um die Abschnitte des Kollagen-Gens von pBSN4-1 und pBSN4-2A zusammenzuklonieren, wurde das Plasmid pBSN4-1 (1 μg) für 2 Stunden bei 37°C mit ApaLI und HindIII verdaut. Der verdaute Vektor wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt. Plasmid pBSN4-2A (3 μg) wurde für 2 Stunden bei 37°C mit ApaLI und HindIII verdaut und das Insert wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt. ApaLI/HindIII-verdautes pBSN4-1 wurde mit dieser Insertion über Nacht bei 16°C mit T4-DNA-Ligase ligiert. Eine Hälfte der Ligationsmischung wurde in DH5α-Zellen transformiert und 1/10 des Transformationsgemisches wurde auf LB-Agarplatten ausplattiert, die 70 μg/ml Ampicillin enthalten. Nach einer Über-Nacht-Inkubation bei 37°C wurden Ampicillin-resistente Klone herausgepickt und auf das Vorhandensein der Insert-DNA, die oben beschrieben wurde, durchmustert. Klone wurde mittels Didesoxy-Terminationssequenzierung überprüft. Der korrekte Klon wurde als pBSN4-2 bezeichnet.
In ähnlicher Weise wurde der Rest des Gens für die Carboxy-terminalen 219 Aminosäuren des menschlichen Typ I (α₁)-Kollagens mit optimierter E. coli-Codonverwendung hergestellt, so daß die endgültige DNA-Sequenz die ist, die in 71 (SEQ ID NO: 43) angegeben ist.
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von extrazellulärem Matrixprotein (EMP) oder einem Fragment davon, umfassend Hydroxyprolin, das in der Lage ist, ein Selbstaggregat in einer Zelle zur Verfügung zu stellen, welche üblicherweise Prolin nicht hydroxyliert, umfassend Zurverfügungstellen einer Nukleinsäuresequenz codierend für das EMP oder Fragment davon, welche optimiert worden ist für die Expression der Zelle durch Substitution von natürlich auftretenden Codons, die von der Zelle nicht bevorzugt werden, durch Codons, die von Zelle bevorzugt werden; Inkorporieren der Nukleinsäuresequenz in die Zelle; Zurverfügungstellen von hypertonischem Wachstumsmedium enthaltend zumindest eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus trans-4-Hydroxyprolin und 3-Hydroxyprolin; und Kontaktieren der Zelle mit dem Wachstumsmedium, worin die zumindest eine Aminosäure in die Zelle assimiliert wird und in das EMP oder Fragment davon inkorporiert wird.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß Anspruch 1, worin das EMP ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus menschlichem Kollagen, Fibrinogen, Fibronektin und kollagenähnlichem Peptid.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Zelle ein Prokaryont ist.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß Anspruch 3, worin der Prokaryont E. coli ist.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, worin das menschliche Kollagen vom Typ I α1 ist.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß Anspruch 5, worin die Nukleinsäure, die menschliches Kollagen Typ I α1 codiert, die Sequenz, die in SEQ ID Nr. 19 gezeigt wird, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, worin das menschliche Kollagen vom Typ I α2 ist.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß Anspruch 7, worin die Nukleinsäure, die menschliches Kollagen Typ I α2 codiert, die Sequenz, die in SEQ ID Nr. 31 gezeigt wird, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die für das EMP codierende Nukleinsäure die Sequenz, die in SEQ ID Nr. 43 gezeigt wird, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die für das EMP codierende Nukleinsäure die Sequenz, die in SEQ ID Nr. 45 gezeigt wird, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäure umfaßt, die für ein physiologisch aktives Peptid codiert.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß Anspruch 11, worin das physiologisch aktive Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus knochenmorphogenem Protein, transformierendem Wachstumsfaktor-β oder Decorin.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das EMP oder Fragment davon ein kollagenähnliches Peptid ist.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß Anspruch 13, worin das EMP oder Fragment davon die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 4 gezeigt wird, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß Anspruch 13, worin das EMP die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 40 gezeigt wird, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß Anspruch 1, worin das EMP die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 44 gezeigt wird, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß Anspruch 1, worin das EMP ein Kollagenfragment umfassend die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 26 gezeigt wird, ist.
Verfahren zur Herstellung eines extrazellulären Matrixproteins (EMP) oder Fragments davon gemäß Anspruch 1, worin das EMP ein Kollagenfragment umfassend die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 46 gezeigt wird, ist.