DE69933677T2

DE69933677T2 - Verfahren zur gewinnung von proteinen aus der interstitiellen flüssigkeit von pflanzen

Info

Publication number: DE69933677T2
Application number: DE69933677T
Authority: DE
Inventors: H. Thomas Vacaville TURPEN; J. Stephen Vacaville GARGER; J. Michael Vacaville MCCULLOCH; I. Terri Vacaville CAMERON; L. Michelle Davis SAMONEK-POTTER; Barry R. Vacaville HOLTZ
Original assignee: Biosource Technologies Inc
Current assignee: Kentucky Bioprocessing LLC
Priority date: 1998-08-11
Filing date: 1999-08-11
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2019-08-12
Also published as: US6441147B1; EP1104479B1; ZA200101100B; JP2002522559A; IL141312A0; DE69933677D1; US6284875B1; US20050059127A1; BR9912875A; EP1104479A2; ATE342994T1; NZ510358A; MXPA01001445A; US20030073209A1; AU5396799A; US6617435B2; US20040047923A1; AU759813B2; WO2000009725A2; WO2000009725A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Proteinherstellung und -reinigung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolation von großen Mengen hoch konzentrierter, aktiver Proteine aus interzellulären Pflanzenmaterial über ein Vakuum- und Zentrifugationsverfahren, das das Pflanzenmaterial nicht zerstört, so dass eine zusätzliche Proteinextraktion aus dem Pflanzenmaterial ermöglicht wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es gibt viele Beispiele für wertvolle Proteine, die in pharmazeutischen und industriellen Anwendungen von Nutzen sind. Oft werden diese Moleküle in großen Mengen und in teilweise oder stark gereinigten Formulierungen benötigt, um die Produktqualität und -leistung aufrechtzuerhalten. Pflanzen sind eine kostengünstige Quelle für Proteine, einschließlich rekombinante Proteine. Es ist oft gewünscht worden, Proteine in großen Mengen in Pflanzen herzustellen. Allerdings sind die Probleme, die mit der Extraktion und Verarbeitung von Produkten aus homogenisierten Pflanzengeweben sowie der Reinigung und Gewinnung des rekombinanten Proteinsprodukts in Verbindung stehen, als beträchtlich angesehen worden. Austin u.a. Annals New York Academy of Science, 721:234-244 (1994). Diese Probleme stellen die Haupthindernisse für eine erfolgreiche rekombinante Proteinherstellung in Pflanzen im großen und kommerziell wertvollen Umfang dar.
Pflanzenzellen sollen Proteine auf den Membranen des endoplasmatischen Retikulums synthetisieren und die synthetisierten Proteine zu den Zelloberflächen in sekretorischen Vesikeln, die beim Golgi-Apparat gebildet wurden, transportieren. Dieses Thema wird von Jones u.a., New Phytology, 111:567-597 (1989) erörtert. Eine wichtige Forschungsarbeit widmet sich dem Aufklären der spezifischen Mechanismen in Bezug auf die Proteinsekretion für mehrere bestimmte Proteine in speziellen Pflanzengeweben oder Zellkulturen. Beispiele für solche Bemühungen werden von Herbers u.a., Biotechnology 13:63-66 (1995), Denecke u.a., The Plant Cell 2:51-59 (1990), Melchers u.a., Plant Molecular Biology 21:583-593 (1993) und Sato u.a., Biochemical and Biophysical Research Communications 211(3):909-913 (1995) geliefert. Im Fall von Proteinen, die nicht in das Pflanzenzellapoplasma oder den interzellulären Raum sekretiert werden, muss ein Mechanismus zum Lysieren der Pflanzenzellwand verwendet werden, um das interessierende Protein freizusetzen und festzuhalten. Pflanzenzellen müssen sehr hohen Scherkräften ausgesetzt werden, um die Zellwände aufzubrechen und die zellulären Membranen zu lysieren und so den intrazellulären Inhalt freizugeben. Interessierende Proteine, ob rekombinant hergestellt oder natürlich durch die vorliegende Pflanze erzeugt, werden dadurch einer feindlichen chemischen Umgebung ausgesetzt und werden dadurch, dass das Produkt Enzymen und kleinen Molekülen, die vor der Homogenisierung des Gewebes in Abteilungen eingeteilt wurden, ausgesetzt wird, besonders oxidativ und proteolytisch geschädigt. Darüber hinaus wird das meiste andere gesamte zelluläre Protein mit dem interessierenden Protein gemischt, wodurch erhebliche Reinigungsprobleme entstehen, wenn ein solches Zelllyseverfahren durchgeführt wird. Um die biosynthetische Kapazität von Pflanzen für eine zuverlässige Proteinherstellung zu nutzen, ist ein Verfahren zum Erhalten von speziellen Proteinen, die in den interzellulären Raum (Apoplasma) von Pflanzengeweben sekretiert werden können, wünschenswert. Einem solchen Verfahren geht der Bedarf an einer Homo genisierung voraus. Wenn ein solches Verfahren durchgeführt wird, könnte der Pflanzenmaterialanteil, der ein oder mehr interessierende Proteine enthält, ohne Homogenisierung erhalten werden. Daher sieht ein solches Verfahren vor, dass der Pflanzenextrakt für das bestimmte, interessierende Protein angereichert wird, und das Protein wird vor einem gewissen chemischen und enzymatischen Abbau geschützt.
Da die wertvollen, interessierenden Proteine und Produkte unterteilt oder in den interstitiellen Raum sekretiert werden, erleichtert ein Vakuumdruck die Einführung des Infiltrationsmediums in den interstitiellen Raum. In ähnlicher Weise können verschiedene Kräfte angelegt werden, um die zurückgehaltene Flüssigkeit zu entfernen. Eine Zentrifugalkraft von 1.000 × G ist wirksam. Mittels der Schwerkraft kann die zurückgehaltene Flüssigkeit in einem Vakuumabscheider gesammelt werden. Mit oder ohne Vakuuminfiltration eines Puffers kann das Enzym durch Einfrieren des Gewebes, Auftauen und Anlegen eines physikalischen Drucks zur Gewinnung der Flüssigkeit gewonnen werden. Allerdings führt ein solches Verfahren zu einer unerwünschten verstärkten Zelllyse.
Genetisch modifizierte Pflanzen sind eine zuverlässige Quelle zur Herstellung von rekombinanten Proteinen. Weil das biologische Produkt unter nicht sterilen Wachstumsbedingungen angesammelt wird und die Herstellung auf die gewünschten Mengen in einer relativ kostengünstigen Weise heraufgesetzt werden kann, ist es durchführbar, eine verdünnte, aber angereicherte Quelle, wie beispielsweise die interstitielle Flüssigkeitsfraktion als Quelle zum Ernten der interessierenden Proteine in industriellen Umfang auszunutzen. Eine Auswahl von interessierenden Proteinen kann aus rekombinanten Pflanzenquellen geerntet werden, allerdings sind äußerst aktive, pharmazeutische Qualitätsenzyme, Zytokine und Antikörper besonders wertvolle Produkte, die durch dieses Verfahren entwickelt werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von stark konzentrierten, aktiven Proteinen aus dem interzellulären Raum von Tabakpflanzen. Der interzelluläre Raum besteht aus einer Matrix aus Flüssigkeit, Protein und Zellwandkohlenhydraten. Das Verfahren ist auf die große, kommerzielle Isolation von erwünschten Proteinen aus Pflanzenzellen anwendbar, egal ob solche Proteine natürlich auftreten oder durch eine rekombinante Technologie hergestellt werden. Das Vakuum- und Zentrifugationsverfahren, wie es nachfolgend beschrieben wird, ermöglicht die Proteinextraktion aus der interstitiellen Flüssigkeit der Pflanze, ohne das Pflanzenmaterial zu zerstören, so dass eine weitere Extraktion des gewünschten Proteins aus dem Pflanzenmaterial möglich wird.
Gemäß einem weiten Aspekt umfasst das Verfahren das Infiltrieren von Pflanzenblättern mit einer Pufferlösung durch Aussetzen der eingetauchten Tabakpflanzenblätter einer weitgehenden Vakuumumgebung, das Entfernen der überschüssigen Flüssigkeit aus den Pflanzenblättern nach dem Aussetzen der Blätter einer weitgehenden Vakuumumgebung und das Zentrifugieren der Blätter, um die interstitielle Flüssigkeit zu erhalten. Als Ergebnis eines solchen Verfahrens können große Mengen der gewünschten Proteine aus dem interzellulären Raum von Pflanzen entfernt werden, wodurch es möglich wird, natürlich vorkommende Proteine aus Tabakpflanzenblättern zu isolieren, und es auch möglich wird, rekombinant die gewünschten Proteine in Pflanzen zu erzeugen und dieselben in kommerziell wertvollen Mengen ohne Homogenisierung der Pflanzenblätter oder sonstiges signifikantes Lysieren der Pflanzenzellen selbst zu gewinnen. Dieses Material wird als interstitielle Flüssigkeit bezeichnet, nachfolgend „IF", IF Extrakt.
In den Ansprüchen sind Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung eines konzentrierten interessierenden Proteins oder Biomoleküls, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Lipiden, Kohlenhydraten, Lipoproteinen, Polysacchariden, Zuckern, Fettsäuren, Nukleinsäuren und Polynukleotiden, aus der interstitiellen Flüssigkeit eines Pflanzengewebes, umfassend:

(a) das Eintauchen des Pflanzengewebes in eine Pufferlösung;
(b) das Aussetzen des Pflanzengewebes und der Pufferlösung einer Vakuumumgebung;
(c) das Trennen des Pflanzengewebes von der Pufferlösung;
(d) das Zentrifugieren des Pflanzengewebes zur Entfernung der interstitiellen Flüssigkeit; und
(e) das Konzentrieren des interessierenden Proteins oder Biomoleküls aus der interstitiellen Flüssigkeit; dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Pflanzengewebe um ganze Tabakblätter handelt.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Blätter und die Pufferlösung einem Vakuumdruck von 200 bis 760 mm Hg ausgesetzt. Besonders bevorzugt werden die Blätter und die Pufferlösung einem Vakuumdruck von 400 bis 760 mm Hg ausgesetzt. Und optimalerweise werden die Blätter und die Pufferlösung einem Vakuumdruck von bis zu etwa 760 mm Hg ausgesetzt. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen werden die Blätter einer langsam laufenden Zentrifugation mit einem Beschleunigungskraftbereich von etwa 50 bis 5.000 × G oder weniger ausgesetzt, nachdem die überschüssige Pufferlösung entfernt ist. Am meisten bevorzugt ist es, wenn die Blätter einer Zentrifugation mit einer Beschleunigungskraft von etwa 2.000 × G ausgesetzt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
2 Losweise Kesselinfiltration
3 kontinuierliche Vakuuminfiltration
4 Plasmidkarte von TT01A 103L
5 virale cDNA Sequenz des Plasmids TT01A 103L
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Proteinen aus dem interzellulären Raum von Tabakpflanzen. Das Verfahren ist auf die groß angelegte kommerzielle Isolation von stark konzentrierten und aktiven, gewünschten Proteinen aus Pflanzenzellen anwendbar, egal ob solche Proteine natürlicherweise auftreten oder durch rekombinante Technologie, einschließlich die Verwendung von viralen Pflanzenvektoren oder die Verwendung von transgenen Pflanzen, hergestellt werden. Das Vakuum- und Zentrifugationsverfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt die Extraktion von Protein aus dem interzellulären Raum, ohne das Pflanzenmaterial zu zerstören, wodurch eine weitere zusätzliche Extraktion der gewünschten Proteine aus dem Pflanzenmaterial ermöglicht wird. Diese aus dem zusätzlichen Extraktionsverfahren stammenden Proteine können entweder dieselben sein oder sich von den aus der IF Flüssigkeit gereinigten Proteinen unterscheiden.
Das Verfahren umfasst allgemein die Schritte der Infiltration von Tabakpflanzenblättern mit einer Pufferlösung durch Aussetzen der eingetauchten Pflanzenblätter einer weitgehenden Vakuumumgebung, das Entfernen der überschüssigen Flüssigkeit aus den Pflanzenblättern nach dem Aussetzen der Blätter einer weitgehenden Vakuumumgebung und das Zentrifugieren der Blätter. Als Ergebnis eines solchen Verfahrens können große Mengen an gewünschten Proteinen aus dem interzellulären Raum von Pflanzen entfernt werden, wodurch es möglich wird, sowohl die natürlich auftretenden als auch rekombinant erzeugten Proteine aus den Pflanzenblättern in großen Mengen ohne Homogenisierung der Pflanzenzellen zu isolieren, wodurch eine zusätzliche Extraktion des gewünschten Proteins aus dem Pflanzenzellmaterial möglich wird.
Es wurde ein Arbeitsaufwand auf dem Gebiet der Entwicklung von geeigneten Vektoren zum Exprimieren von Fremd-DNA in Pflanzenwirten unternommen. Ahlquist, US-Patent 4,885,248 und US-Patent 5,173,410, beschreibt die vorbereitende Arbeit, die zum Entwickeln von Transfervektoren, die beim Übertragen von genetischem Fremdmaterial in einen Pflanzenwirt zum Zwecke der Expression darin von Nutzen sein könnte. Zusätzliche Aspekte von Hybrid-RNA-Viren und RNA Transformationsvektoren werden von Ahlquist u.a. in den US-Patenten 5,466,788, 5,602,242, 5,627,060 und 5,500,360 beschrieben. Donson u.a., US-Patent 5,316,931 und US-Patent 5,589,367 zeigen zum ersten Mal virale Pflanzenvektoren, die zur systemischen Expression von genetischem Fremdmaterial in Pflanzen geeignet sind. Donson u.a. beschreibt virale Pflanzenvektoren mit heterologen subgenomischen Promotoren zur stabilen systemischen Expression von fremden Genen. So ist nun die Verwendung von Pflanzen zur Erzeugung von rekombinanten Proteinen in großem Umfang möglich. Die vorliegende Anmeldung löst das Problem der Extraktion dieser interessierenden Proteine aus der interstitiellen Flüssigkeit von Pflanzenblättern.
Die Proteinsekretion in Pflanzen ist ein grundlegendes obwohl noch nicht vollständig verstandenes Verfahren. Es ist bekannt, dass sekretierte Proteine auf den Membranen des rauen endoplasmatischen Retikulums synthetisiert werden und durch sekretorische Vesikel, die auf dem Golgi Apparat gebildet werden, zur Zelloberfläche transportiert werden. Darüber hinaus ist bekannt, dass ein Signalpeptid für die Translokation der sekretierten Proteine über das endoplasmatische Retikulum notwendig ist. Proteine, die in die Lumen des endoplasmatischen Retikulums transportiert werden, können dann in den interstitiellen Raum sekretiert werden, vorausgesetzt sie werden durch die Zelle nicht zu einer anderen Abteilung, wie beispielsweise der Vakuole, ausgesondert. Da die Kenntnisse über dieses Verfahrens wachsen, kann es möglich sein, rekombinante Proteine zu entwickeln, die speziell für die Sekretion in den interstitiellen Raum von Pflanzenzellen, in denen sie erzeugt werden, gedacht sind.
Wenn ein signifikanter prozentualer Anteil (etwa 10 % oder mehr) des gesamten Produkts sekretiert wird, kann es bevorzugt sein, interessierende Proteine aus dem inteazellulären Raum der Pflanzen zu isolieren. Ansonsten muss ein Mechanismus zum Lysieren der Pflanzenzellwand verwendet werden, um das interessierende Protein freizusetzen und festzuhalten. Pflanzenzellen müssen sehr hohen Scherkräften ausgesetzt werden, um die Zellwände aufzubrechen und die zellulären Membranen zu lysieren und so die intrazellulären Inhalte freizusetzen. Interessierende Proteine, egal ob rekombinant hergestellt oder natürlich von der vorliegenden Pflanze erzeugt, werden dadurch einer feindlichen chemischen Umgebung ausgesetzt und unterliegen besonders einem oxidativen und proteolytischen Schaden, der oft enzymatisch katalysiert wird. Darüber hinaus wird das meiste des anderen gesamten zellulären Proteins mit dem interessierenden Protein gemischt, wodurch erhebliche Reinigungsprobleme auftreten, wenn ein solches Zelllyseverfahren durchgeführt wird.
Interzelluläre Flüssigkeitsextrakte wurden bisher aus vakuuminfiltrierten Blättern für eine Auswahl von experimentellen Zwecken hergestellt. Diese Extrakte umfassen Proteine, sowohl native als auch nicht native, sowie andere Moleküle. In Klement, Z. (1965) Phytopathologi cal Notes: 1033-1034 wurden die wachstumsfördernden Eigenschaften des Extrakts mittels einer pathogenen bakteriellen Pflanzenart dokumentiert. Unter Verwendung von Markerenzymen für die IF und zytosolischen Abteilungen der Pflanzenblattzelle bestätigten Rathmell und Sequera (1974), Plant Physiol. 53:317-318 die Anreicherung einer speziell sekretierten Proteinfraktion und beobachteten die Nützlichkeit dieser Extrakte in grundlegenden Forschungsstudien betreffend biochemische und physiologische Untersuchungen. Parent und Asselin (1984) Can. J. Bot. 62:564-569, charakterisierten eine Anzahl von Proteinen, die durch Pathogenstress hervorgerufen wurden und in die IF (pathogenesebezogen oder PR Proteine) sekretiert wurden, und das Verfahren wurde angewendet, um enzymatische Aktivitäten und Proteine für subzelluläre Abteilungen zu lokalisieren. Van den Blucke u.a. (1989) PNAS 86:2673-2677; Heitz u.a. (1991) Plant Physiol. 97:651-656. Regalado und Ricardo (1996) Plant Physiol. 110:227-232 beobachteten, dass bestimmte IF Proteine anscheinend konstitutiv exprimiert werden.
Abhängig von der Pufferzusammensetzung und Behandlung können verschiedene zusätzliche Komponenten in den IF Extrakten bestehen, einschließlich zum Beispiel Komponenten, die von dem rauen und glatten endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi Apparat, dem Nukleus, der Vakuole, der Plasmatransmembran, dem Zytosol, den Mitochondrien, den Chloroplasten, Peroxisomen, allen zugehörigen Membranen und Organellen stammen.
Bei genetisch modifizierten Pflanzen werden IF Extraktionsverfahren sowie andere Verfahren verwendet, um die subzelluläre Lokalisation eines Teils des rekombinanten Produkts zu zeigen. Sijomns u.a. (1990) Bio/Technology 8:217-221; Firek u.s. (1993) Plant Molecular Biology 23:861-870; Voss u.a. (1995) Molecular Breeding 1:39-50; De Wilde u.a. (1996) Plant Science 114:233-241. IF Extrakte werden als Ausgangsmaterial verwendet, um kleine Mengen von Pflanzen oder von Pflanzenerregern stammenden Proteinen für die biochemische Charakterisierung zu reinigen. Melchers u.a. (1993) Plant Molecular Biology 21:583-593; Sato u.a. (1995) BBRC 211:909-913; Kinai u.a. (1995) Plant Cell 7:677-688; Liu u.a. (1996) Plant Science 121:123-131; Maggio u.a. (1996) Plant Molecular Biology Reporter 14:249-259.
Daher gibt es einen Bedarf, ein extrahiertes Material mit einer höheren spezifischen Aktivität des aktiven Materials (E Aktivität/mg Protein) zu isolieren, wodurch ein Anreicherungsverfahren von IF Komponenten in großem Umfang vorgesehen wird.
Es wird im Stand der Technik nicht davon ausgegangen, dass IF Extrakte generell als Ausgangsmaterial für die groß angelegte Reinigung von hochaktiven und potenten biochemischen Substanzen nützlich sein könnten, die zum Beispiel als Quelle für menschliche therapeutische Mittel verwendet werden können. Oft werden andere Reinigungsverfahren angestrebt, selbst wenn sich gezeigt hat, dass das Produkt sekretiert wird (Herbers u.a. 1995, supra). Die fehlende Entwicklung des IF Verfahrens als kommerziell brauchbare Quelle für rekombinante Proteinprodukte beruht auf einer Kombination der folgenden Faktoren: 1) eine unvollständige Charakterisierung der Extrakte, d.h. eine Bestimmung des prozentualen Anteils des gesamten rekombinanten Proteins, der durch IF Verfahren bei welchem Anreicherungsniveau erhalten werden kann, 2) das Versagen anderer, eine geeignete Aktivität eines Produkts in einer stark gereinigten Form zu zeigen, und 3) eine mangelnde Beschreibung der Ausrüstung im industriellen Umfang, um vernünftige Mengen an Biomasse für diesen Zweck zu verarbeiten.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Vakuum- und Zentrifugationsverfahren, um eine Proteinextraktion aus Pflanzen im kommerziellen Umfang vorzusehen. Als Ergebnis der vorliegenden Erfindung können große Mengen an aktiven, interessierenden Proteinen aus dem interzel lulären Raum von Pflanzen entfernt und für eine weitere Reinigung konzentriert werden, wodurch es möglich wird, natürlich vorkommende und rekombinant erzeugte Proteine aus Pflanzenblättern in kommerziell wertvollen Mengen zu isolieren. Dieses Verfahren hat den zusätzlichen Vorteil, dass das sich ergebende Pflanzengewebe im Anschluss an eine IF Extraktion nicht zerstört wird und für die Gewinnung von anderen wertvollen Komponenten von anderen Einrichtungen verwendet werden kann.
Die Blätter können auf jede passende Weise geerntet werden. Die zugrunde liegenden Pflanzenblätter werden von der Pflanze entfernt, bevor sie einer Pufferlösung ausgesetzt werden.
Eine routinemäßige EDTA- oder Tris-Pufferlösung ist geeignet, obwohl der Fachmann zu würdigen weiß, dass jeder Puffer für eine bestimmte, interessierende Pflanze oder ein bestimmtes interessierendes Protein mehr oder weniger geeignet ist. In einigen Fällen kann Wasser als Lösung annehmbar oder sogar bevorzugt sein. Es wird nicht in Betracht gezogen, dass die Natur der Pufferlösung, der spezifische pH-Wert oder die Temperatur für die Ausführungsformen im Umfang der Erfindung wichtig sind. Allerdings wird es allgemein empfohlen, Bedingungen aufrechtzuerhalten, die eine Oxidation, Präzipitation, Proteolyse oder Denaturierung von einem oder mehr interessierenden Proteinen vermeiden. Daher sollte der pH-Wert, die Temperatur und andere derartige Variablen überwacht und nach Bedarf geändert werden.
Sobald die Pflanzenblätter in eine Pufferlösung gegeben wurden, werden sie einer weitgehenden Vakuumumgebung ausgesetzt. Es wird davon ausgegangen, dass der Vakuumdruck das Aufsaugen der Pufferlösung durch das Blatt beschleunigt. Bei einigen Ausführungsformen kann der Vakuumdruck etwa 200 bis 760 mm Hg betragen. Besonders bevorzugt werden die Blätter und die Pufferlösung einem Vakuumdruck von etwa 400 bis 760 mm Hg ausgesetzt. Der Betrag an Vakuumdruck kann im Rahmen der Erfindung variiert werden. Außerdem kann die Dauer im Rahmen der Erfindung variiert werden, allerdings hat sich das Aussetzen in einer Vakuumumgebung für Zeiträume von etwa einigen Sekunden bis 10 Minuten als besonders wirksam erwiesen. Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung werden die Blätter in der Pufferlösung wiederholt einer Vakuumumgebung ausgesetzt. Es wird davon ausgegangen, dass ein bis drei getrennte Aussetzungen besonders wirksam sein können. Allerdings können die Aussetzungsanzahl, die Aussetzungsdauer und der Betrag an Vakuumskraft gemäß den Vorlieben des Fachmanns und zur Übernahme der wirksamsten Ausführungsformen des Verfahrens angepasst werden, da es für bestimmte interessierende Pflanzen und Proteine zutrifft. Zusätzlich kann der Fachmann vorsehen, dass interessierende Moleküle oder Produkte, die keine Peptide und Proteine sind, aus der interstitiellen Flüssigkeit mittels Verfahren gewonnen werden könnten, die in der vorliegenden Erfindung allgemein beschrieben werden. Zum Beispiel können die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren verwendet werden, um Lipide, Kohlenhydrate, Lipoproteine, Zucker, Polysaccharide, Fettsäuren, Nukleinsäuren und Polynukleotide zu gewinnen.
Das Pflanzengewebe wird dann aus der Pufferlösung entfernt. Es kann einem Trocknungsschritt unterworfen werden oder auch nicht, um den Puffer nach Bedarf oder Wunsch zu entfernen. Die Blätter können dann in einer geeigneten geometrischen Anordnung für die Zentrifugation angeordnet werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Blätter von der Zentrifuge mittels eines diskontinuierlichen Abgabekorbzentrifugenrotors weitergeleitet. Wenn ein diskontinuierlicher Abgabekorbzentrifugenrotor verwendet wird, wird ein anfängliches Drehen durchgeführt, um die Biomasse zur Rotorwand zu bewegen, woraufhin dann die Drehung mit voller Geschwindigkeit durchgeführt wird. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen wird in Erwägung ge zogen, dass ein großes Blattvolumen den Vakuum- und Zentrifugationseinrichtungen gleichzeitig ausgesetzt wird. Daher wird vorweggenommen, dass große, im Handel erhältliche Vakuumpumpen und Korbzentrifugen, wie beispielsweise die von Heine^®, Ketna^® oder Sandborn^® hergestellten im vorliegenden Verfahren verwendet werden. Es ist besonders bevorzugt, die Blätter in Beuteln für eine Korbzentrifuge zu sammeln.
Die Blätter können dann einer Zentrifugation ausgesetzt werden, nachdem die überschüssige Pufferlösung weitgehend entfernt ist. In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit in Erwägung gezogen. Unter einer Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit versteht man etwa 5.000 × G oder weniger. Durch das Zentrifugationsverfahren wird die interstitielle Flüssigkeit aus der Pflanze entfernt. Die interstitielle Flüssigkeit kann in jeder geeigneten Sammeleinrichtung, z.B. einem Behälter, gesammelt oder zu einer zusätzlichen Reinigungsausrüstung, z.B. Chromatographie und Ultrafiltration, geleitet werden.
Sobald die interstitielle Flüssigkeit aus den Pflanzenblätter gesammelt ist, können die ein oder mehr interessierenden Proteine konzentriert und gemäß allen geeigneten Reinigungsverfahren gereinigt werden. Solche Verfahren können die Proteinpräzipitation, Expandierte-Bett-Chromatographie, Ultrafiltration, Anionenaustauschchromatographie, Kationenaustauschchromaotgraphie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, HPLC, FPLC und Affinitätschromatographie umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine allgemeine Erörterung von einigen Proteinreinigungstechniken wird von Jervis u.a., Journal of Biotechnology 11:161-198 (1989) vorgesehen.
Es wird in Erwägung gezogen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung mit allen Pflanzengeweben (wie beispielsweise Blättern, Wur zeln, Trieben, Stengeln, Blüten, Früchten, Embryonen, Setzlingen) nützlich ist, die nach einer Vakuuminfiltration als gesättigte Feststoffe behandelt werden können. Zum Beispiel kann dies das Keimen von Embryonen und Setzlingen umfassen. Allerdings können Pflanzen, die weitgehend symmetrische Blätter mit einer Mittelrippe besitzen, besonders nützlich für das vorliegende Verfahren sein, weil die interstitielle Flüssigkeit aufgrund der hohen geeigneten Morphologie leichter von solchen Blättern erhalten werden kann. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die verwendete Pflanze Tabak, weil, wie sich gezeigt hat, Tabak für die Herstellung von rekombinanten, interessierenden Proteinen im großen Umfang besonders nützlich ist. Allerdings, ist nicht beabsichtigt, die vorliegende Erfindung auf eine bestimmte Pflanzenart oder ein bestimmtes Pflanzengewebe zu beschränken.
Die folgenden Definitionen werden nur zur Verdeutlichung der vorliegenden Erfindung angegeben:
Unter „Vakuumumgebung" wird jede Umgebung verstanden, ungeachtet der diese definierenden Abgrenzungen und ungeachtet des dieselben erzeugenden Mechanismus, bei dem der atmosphärische Druck weitgehend gegenüber dem unter normalen Bedingungen auf Meeresniveau beobachteten reduziert wurde.
Unter „interessierendes Protein" versteht man jedes vollständige Protein oder Peptid oder Fragment davon, egal ob es natürlich in einer Zelle auftritt oder darin durch rekombinante Verfahren erzeugt wird. Der Begriff soll Aminosäuresequenzen umfassen, die glykosyliert werden, sowie diejenigen, die nicht glykosyliert werden. Der Begriff soll auch Sequenzen umfassen, die natürlich oder als Wild-Typ auftreten, und diejenigen, die modifiziert oder mutiert wurden, einschließlich eine Modifikation zum Umfassen eines Signalpeptidsequenz, die bewirkt, dass das Protein zu einer bestimmten Abteilung in der Zelle geleitet wird. Der Begriff soll auch Proteinfusionen umfassen.
Unter „interstitieller Flüssigkeit" versteht man den Extrakt, der aus dem ganzen Bereich einer Pflanze erhalten wird, die nicht vom Plasmalemma umfasst ist, d.h. der Zelloberflächenmembran. Der Begriff soll Fluid, Materialien sowie den Bereich oder Raum einer Pflanze umfassen, der nicht intrazellulär ist (wobei intrazellulär als synonym mit innerzellulär definiert ist), einschließlich Moleküle, die durch diese Behandlung aus dem Plasmalemma ohne signifikante Zelllyse freigesetzt werden können. Synonyme für diesen Begriff könnten Exoplasma oder Apoplasma oder interzelluläre Flüssigkeit oder extrazelluläre Flüssigkeit sein. Interstitielle Flüssigkeit wird in der vorliegenden Erfindung als IF abgekürzt.
BEISPIELE VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter. Diese Beispiele sollen nur die vorliegende Erfindung veranschaulichen und nicht als einschränkend ausgelegt werden.
Diese Experimente zeigen, dass ein signifikanter Teil des ganzen Proteins in dem Blatt einfach aus der interstitiellen Fraktion unter Anreicherung zwecks Reinheit gewonnen werden kann. Diese Experimente zeigen weiter, dass die Verfahren zur Isolation von hoch aktiven Produkten in sehr großem Umfang nützlich sind. Der Fachmann kann das Verfahren für zahlreiche Variable optimieren, die für jedes Protein, wie beispielsweise Pufferzusammensetzung und Temperatur usw., spezifisch sind.
BEISPIEL 4
Vogel (Hühner)-Interferon Typ II (gamma) wurde exprimiert und aktives Enzym aus dem interstitiellen Raum von Nicotiana benthamiana und Nicotiana tabacum extrahiert. Das Interferon konnte wirksam aus Pflanzen, die auf dem Feld oder im Gewächshaus entweder angepflanzt wurden, unter Verwendung von Grammmengen (Extraktion im Laborumfang) oder Kilogrammmengen (Extraktion im halbtechnischen Umfang) an Pflanzengewebe extrahiert werden.
Aktiv gezüchtetes N. benthamiana oder N. tabacum wurde entweder mit infektiösen Transkripten oder dem Virion eines rekombinanten Pflanzenkonstrukts inokuliert, wie von Donson u.a., supra, beschrieben, wobei das Hühner-Interferon-gamma-Gen beherbergt wurde. Vogel-Interferon wurde aus systemisch infizierten Blättern 10 Tage bis 3 Wochen nach der Inokulation extrahiert.
BEISPIEL 4a
Für Extraktionen im halbtechnischen Umfang wurden systemisch infizierte Blätter (3–80 Gramm) von der Pflanze an der Blattbasis abgetrennt, gewogen und in einen geeignet großen Becher gelegt. Das Blattmaterial wurde vollständig mit einer gepufferten Lösung (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, Puffer enthaltend 5 mM MgCl₂ und 2 mM EDTA) bedeckt. Die eingetauchten Blätter wurden mit einem Nalgene Vakuumgefäß bedeckt und ein Vakuum wurde gepumpt (720 mm Hg) und 2 Minuten lang gehalten und dann schnell abgelassen. Diese Vakuuminfiltration wurde dann für insgesamt zwei Zyklen wiederholt. Anschließend an die Vakuuminfiltrationen wurden die Blätter aus dem Becher entfernt und der Oberflächenpuffer wurde von der Blattoberfläche durch Blotting zwischen absorbierendes Papier entfernt. Die Blätter wurden in eine 250 ml Flasche mit einem Stütznetz gegeben, wodurch die Trennung und Gewinnung von IF aus dem Blattmaterial ermöglicht wird. Die interstitielle Flüssigkeit (IF) wurde aus den vakuuminfiltrierten Blättern durch Zentrifugation (3.000 × G, 15 Minuten) gewonnen.
BEISPIEL 4b
Für Extraktionen im halbtechnischen Umfang wurden systemisch infizierte Blätter von auf dem Feld gewachsenen Pflanzen von den Stengeln per Hand befreit und gewogen. Fünf kg Blätter wurde in Polyesternetzbeutel gegeben (Filtra-Spec^®, 12-2-1053) und zwei × 5 kg Beutel Blätter wurden in einen Metallkorb gelegt. Der Metallkorb, der das Blattmaterial enthielt, wurde in einen 200 I Mueller^® Vakuumbehälter mit ~ 50 Litern gepufferter Lösung gegeben (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, Puffer, enthaltend 5 mM MgCl₂ und 2 mM EDTA). Eine 32 kg schwere Platte aus rostfreiem Stahl wurde über die Blätter/Beutel gelegt, um ein vollständiges Eintauchen sicherzustellen. Ein Vakuum wurde auf 686 mm Hg gepumpt und 1 Minute lang gehalten und dann schnell abgelassen. Diese Vakuuminfiltration wurde dann für insgesamt zwei Zyklen wiederholt. Anschließend an die Vakuuminfiltrationen wurden die Blätter und der Korb aus dem Vakuumbehälter entfernt. Die Beutel, die die vakuuminfiltrierten Blätter enthielten, konnten für ~ 10 Minuten den Oberflächenpuffer vor der Zentrifugation über die Schwerkraft ablaufen lassen. Die interstitielle Flüssigkeit (IF) wurde aus den vakuuminfiltrierten Blättern durch Zentrifugation (1.800 × G, 30 Minuten) mittels einer Heine^® Korbzentrifuge (Behälterdimensionen 710 mm Durchmesser × 420 mm) gewonnen. Gesammelte IF wurde durch ein 25 μm Rosedal^® Sockenfilter und dann durch ein 5 μm Campbell Waterfilter^® Patronenfilter filtriert und vor der Analyse bei 4°C gelagert.
Die Menge an Interferonprotein in einem IF Extrakt wurde durch quantitative Immunblottingverfahren mittels bestimmter Antisera für Vogel-Interferon vom Typ II und mittels E. coli erzeugtem Interferon vom Typ II in bekannten Mengen als Standard bestimmt. Auf der Grundlage des quantitativen Immunblotting und der teilweisen Reinigung wird die spezielle Aktivität von Interferon in N. benthamiana IF bei oder nahe bei 10⁷ E/mg berechnet, die für Interferon, das aus nativen Quellen isoliert wurde, weitgehend gleich ist. Die biologische Aktivität wurde durch den Stickoxid (NO) Freisetzungsassay wie in Lowenthal, J.W., Digby, M.R. und York, J.J., Production of Interferon-Gamma by Chicken T Cells, J. Interferon and Cytokine Res. (1995) 15:933-938 beschrieben bestimmt. Eine Spezifitätsaktivität wurde durch Vorinkubation von IF Flüssigkeit mit einem neutralisierenden Antikörper und anschließende Messungsaktivität im NO Freisetzungsassay bestimmt.
Tabelle 4 Gewächshaus:
Tabelle 5 Feld

¹ Interferonproteinausbeute wurde durch quantitatives Immunblotting berechnet.
² Interferonaktivität wurde durch den NO Freisetzungsassay wie von Lowenthal u.a. supra beschrieben bestimmt.
* Nicht bestimmt
** Aktivitätsberechnungen enthielten eine gewisse mangelnde Spezifität (Aktivität nicht durch den spezifischen Antikörper neutralisiert) im NO Freisetzungsassay.

BEISPIEL 5
Extraktion von Maus scFv Protein
Aktiv wachsendes N. benthamiana wurden mit infektiösen Transkripten eines rekombinanten Pflanzenkonstrukts, wie von Donson u.a. supra beschrieben, konstruiert, wobei ein scFv Protein des 38C13 Mauslymphoms beherbergt wurde. Das Maus 38C13 scFv Protein wurde von systemisch infizierten Blättern 11–14 Tage nach der Inokulation extrahiert.
Systemisch infizierte Blätter (3–80 Gramm) wurden von der Pflanze an der Blattbasis abgetrennt, gewogen und in einen geeignet großen Becher gelegt. Das Blattmaterial wurde vollständig mit einer gepufferten Lösung (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, Puffer, enthaltend 10 mM MgCl₂ und 2 mM EDTA) bedeckt. Die eingetauchten Blätter wurden mit einem Nalgene Vakuumgefäß abgedeckt und ein Vakuum wurde auf 700 mm Hg gepumpt und 2 Minuten lang gehalten und dann schnell abgelassen. Diese Vakuuminfiltration wurde dann für insgesamt zwei Zyklen wiederholt. Anschließend an die Vakuuminfiltrationen wurden die Blätter aus dem Becher entnommen und der Oberflächenpuffer wurde von der Blattoberfläche durch Blotting zwischen absorbierendes Papier entfernt. Die interstitielle Flüssigkeit (IF) wurde von den vakuuminfiltrierten Blättern durch Zentrifugation (3.000 × G, 15 Minuten) gewonnen. Die Blätter wurden in einer 250 ml Flasche mit einem Stütznetz, das die Trennung und Gewinnung der IF aus dem Blattmaterial ermöglicht, zentrifugiert. Die das scFv Protein enthaltende IF Flüssigkeit wurde durch eine 0,2 μm Membran filtriert und bei –80°C gelagert.
Das Produkt und die Reinigung von 38C13 scFv Protein aus der IF Pflanzenflüssigkeit wurde durch Western Analyse mittels S1C5, einem monoklonalen anti-Idiotyp Antikörper, bestimmt, der das native 38C13 IgM Protein erkennt. Der S1C5 Antikörper kreuzreagierte mit einem 30 KD Protein der erwarteten Größe von 38C13 scFv und einem 60 KD Protein, das die richtige Größe für ein sich spontan aufbauendes scFv Dimer ist. Es wurde keine Kreuzreaktivität zu Pflanzenproteinen in IF Extrakten, die aus den kontrollinfizierten Pflanzen hergestellt wurden, beobachtet.
Die Menge an aus Pflanzen erzeugtem 38C13 scFv Protein, das aus IF Extrakten gewonnen wurde, wurde mittels S1C5 ELISA gemessen. IF-Blattextrakte wurden bestimmt und enthielten 20–60 μg 38C13 scFv Protein/ml IF Flüssigkeit oder 11–30 μg 38C13 scFv Protein/g Frischgewicht. Da die ELISA Bedingungen eine anti-Idiotyperkennung in Lösung begünstigen, wird geschlossen, dass die Hauptfraktion von 38C13 scFv, das aus dem IF-Pflanzenflüssigkeit isoliert wurde, löslich und richtig gefaltet ist.
BEISPIEL 6
Extraktion von sekretorischem Immunglobulin aus transgenem Tabak
Blätter von transgenen SIgA-G exprimierendem N. tabacum (15 Gramm), (Science, 268:716, 1995) wurden von der Pflanze an der Blattbasis abgetrennt, gewogen und in einen geeignet großen Becher gelegt. Das Blattmaterial wurde vollständig mit einer gepufferten Lö sung entweder von 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, Puffer, enthaltend 10 mM MgCl₂ und 2 mM EDTA und 14,3 mM 2-Mercaptoethanol oder 100 mM Kaliumphosphat, pH 6,0, 5 mM EDTA, 10,0 mM 2-Mercaptoethanol und 0,5 % Taurocholeinsäure) bedeckt. Die eingetauchten Blätter wurden mit einem Nalgene^® Vakuumgefäß abgedeckt und ein Vakuum wurde auf 750 mm Hg gepumpt und 1 Minute lang gehalten und dann schnell abgelassen. Anschließend an die Vakuuminfiltrationen wurden die Blätter aus dem Becher entnommen und der Oberflächenpuffer wurde von der Blattoberfläche durch Blotting zwischen absorbierendem Papier entfernt. Die interstitielle Flüssigkeit (IF) wurde von den vakuuminfiltrierten Blättern durch Zentrifugation (1.500 × G, 15 Minuten) gewonnen. Die Blätter wurden in einer 250 ml Flasche mit einem Stütznetz, das die Trennung und Gewinnung der IF aus dem Blattmaterial ermöglicht, zentrifugiert.
Proteinimmunoblots der IF Extrakte wurden unter reduzierenden Bedingungen hergestellt. Der Ig wurde in den Immunoblots mittels Ziegen anti-Maus IgA, konjugiert zu Meerrettich Peroxidase, festgestellt. Ungefähr 10 % des in der Pflanze vorhandenen IgA wurden in den IF Extrakten festgestellt. Es gab keinen sichtbaren Unterschied hinsichtlich der Ig Menge in den mittels der unterschiedlichen, oben beschriebenen Puffern erzeugten IF Fraktionen. Es wurde keine Kreuzreaktivität zu Pflanzenproteinen in IF Extrakten, die aus Kontrollpflanzen hergestellt wurden, beobachtet.
BEISPIEL 7
Reinigung von Glucocerebrosidase in halbtechnischem Umfang aus der interzellulären Flüssigkeit von Tabak
MD609 Blattgewebe (1–2 Kilogramm) von transgenem, das lysosomale Enzym Glucocerebrosidase exprimierendem Tabak wurde geerntet, die Mittelrippe entfernt und das Gewebe gewogen. Das Gewebe wurde mit 2–4 Volumen Puffer (0,1 M KPO₄ Puffer, pH 6,0, 5 mM EDTA, 0,5 % Taurocholinsäure, 10 mM 2-Mercaptoethanol) mittels eines Infiltrationskessels eingetaucht, der mehrere Kilogramm Blattgewebe auf einmal aufnimmt. Eine perforierte Metallplatte wurde oben auf das Gewebe gelegt, um das Gewebe nach unten zu drücken, und ein Vakuum wurde auf 620–695 mm Hg für 1–2 Minuten × 3 gepumpt. Das Vakuum wurde zwischen aufeinander folgenden Anwendungen abgelassen. Das Gewebe wurde gedreht und das Vakuum erneut angelegt, um eine vollständige Infiltration zu erzielen. Mehrere Anwendungen des Vakuums ohne Isolation der interstitiellen Flüssigkeit bilden ein einziges Infiltrationsverfahren. Ein Anzeichen für eine vollständige Infiltration ist ein deutliches farbliches Dunkelwerden der Unterseite des Blattgewebes. Ein überschüssiger Puffer auf dem Gewebe wurde abgelassen. Die interstitielle Flüssigkeit wurde aus dem Gewebe zur Zentrifugation des Gewebes in einem Korbrotor (254 mm × 108 mm, InterTest Equipment Services, San Jose, CA/Biosource Design 25-0611000) bei 4200 Umdrehungen pro Minute (2500 × G) über 10 Minuten freigesetzt. Die interstitielle Flüssigkeit wurde durch Aspiration gesammelt (IF-1). Alternativ kann das Pflanzengewebe durch Zurücklegen der Blätter in den Infiltrationskessel in denselben, oben verwendeten Puffer erneut infiltriert und das Verfahren wiederholt werden (IF-2). Die zweite Infiltration erfordert nicht so viele Zyklen an Vakuuminfiltration und Vakuumablassen. Darüber hinaus kann der Puffer aus dem Infiltrationskessel (verbrauchter Puffer) abgelassen und mit der 1. und 2. IF Fraktion gepoolt werden. Gemeinsam bilden IF-1, IF-2 und verbrauchter Puffer den IF Pool. Das Volumen an interstitieller Flüssigkeit, das vom infiltrierten Blattgewebe gesammelt wurde, lag zwischen 50–100 Gew.-% Blattgewebe, je nach der Zahl der durchgeführten Infiltrationen.
Rekombinantes GCB wurde durch Beladen einer Pharmacia Streamline 25^® Säule, enthaltend Phenyl Streamline^® Harz, mit der verdünnten IF (Zuführstrom) direkt gereinigt. Durch eine Expandierte-Bett-Chromatographie wurde es ermöglicht, das Protein in einem Schritt festzuhalten, zu klären und zu konzentrieren, ohne dass Zentrifugations- und/oder Mikrofiltrationsschritten notwendig wurden. Die Säule wurde äquilibriert und gewaschen, bis das UV Signal auf dem Rekorder mit 25 mM Citrat, 20 % Ethylenglycol, pH 5,0, zur Grundlinie zurückkehrte; gebundenes Enzym wurde mit 25 mM Citrat, 70 % Ethylenglycol eluiert. Das eluierte Material wurde weiter auf einem Kationenaustauschharz, SP Big Beads^® (Pharmacia), äquilibriert in 25 mM Citrat, 75 mM NaCl, pH 5,0, gereinigt. GCB wurde entweder mit einem Stufengradienten von 25 mM Citrat, 0,5 M NaCl, 10 % Ethylenglycol, pH 5,0, oder einem linearen Gradienten von 75 mM–0,4 M NaCl in 25 mM Citrat, pH 5,0, eluiert. Alle Chromatographieschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Mittels des Suizidsubstrats, Conduritol B Epoxid (CBE), wurde eine Hemmung einer rekombinanten Glucocerebrosidase (rGCB) Aktivität in Gegenwart von Pflanzenglucosidasen erzielt. Die Enzymaktivität wurde bei 37°C in einem Reaktionsgemisch, enthaltend 5 mM Methylumbelliferyl-ß-D-Glucosid, 0,1 M Kaliumphosphat, 0,15 % Triton-X100, 0,125 % Natriumtaurocholat, 0,1 % Rinderserumalbumin, pH 5,9, mit und ohne CBE, gemessen. Die Gesamtglucosidaseaktivität und rGCB Aktivität wurden mittels Hydrolyse des fluoreszierenden Substrats 4-Methylumbelliferylglucopyranosid gemessen. Eine Aktivitätseinheit wird als Menge an Enzym definiert, die erforderlich ist, um die Hydrolyse von 1 nmol Substrat pro Stunde zu katalysieren. Das Gesamtprotein wurde mittels des Bio-Rad Proteinassays auf der Grundlage des Bradford Verfahrens bestimmt (Bradford, M., Anal. Biochem. 72:248; 1976).
Wir erhielten typischerweise aus 1 Kilogramm Blättern, wo IF-1 allein gesammelt wurde, 4 Millionen Einheiten GCB bei einer spezifischen Ak tivität von 20.000. Die Einheiten/kg stiegen auf 6 Millionen bei einer niedrigeren spezifischen Aktivität von 10.000, wenn der IF Pool gesammelt wurde (IF-1, IF-2 und verbrauchter Puffer).
Die nachfolgende Tabelle 6 enthält Daten, die für mehrere Versuche repräsentativ sind.
BEISPIEL 8
Ultrafiltration/Konzentration von interzellulärer Flüssigkeit aus Glucocerebrosidase exprimierendem Tabak
2,3 Kilogramm MD609 Blattgewebe von transgenem Tabak, exprimierend das lysosomale Enzym Glucocerebrosidase, wurde geerntet, die Mittelrippe wurde entfernt und das Gewebe gewogen. Gewebe wurde mit 2–4 Volumen Puffer (0,1. M KPO₄ Puffer, pH 6,0, 5 mM EDTA, 0,5 % Taurocholinsäure, 10 mM 2-Mercaptoethanol) in einen Infiltrationskessel eingetaucht, der mehrere Kilogramm Blattgewebe gleichzeitig aufnimmt. Eine perforierte Metallplatte wurde oben auf das Gewebe gelegt, um das Gewebe nach unten zu drücken. Ein Vakuum wurde auf 620–695 mm Hg für 1–2 Minuten × 3 gepumpt. Das Vakuum wurde zwischen aufeinander folgenden Anwendungen abgelassen. Das Gewebe wurde gedreht und das Vakuum erneut angelegt, um eine vollständige Infiltration zu erzielen. Überschüssiger Puffer auf dem Gewebe wurde abgelassen. Die interstitielle Flüssigkeit wurde aus dem Gewebe durch Zentrifugation des Gewebes in einem Korbrotor (254 mm × 108 mm, Intertest Equipment Services, San Jose, CA/Biosource Design 25-0611000) bei 4200 Umdrehungen pro Minute (2500 × G) über 10 Minuten freigesetzt. Die interstitielle Flüssigkeit wurde durch Aspiration gesammelt (IF-1). Das Blattgewebe wurde durch Zurücklegen der Blätter in den Infiltrationskessel in denselben, oben verwendeten Puffer erneut infiltriert und das Verfahren wiederholt (IF-2). Der Puffer wurde aus dem Infiltrationskessel (verbrauchter Puffer) abgelassen und mit der 1. und 2. IF Fraktion gepoolt. Gemeinsam bilden IF-1, IF-2 und verbrauchter Puffer den IF Pool. Der IF Pool wurde durch Miracloth filtriert und dann 6-fach konzentriert, indem der IF Pool mittels eines Amicon RA 2000^® Konzentrierers, der mit einer LP-1 Pumpe ausgestattet war, durch eine 1 Quadratfuß [0,092903 m²] große Spiralmembran (30 K Molekulargewicht-Rückhaltevermögen) geleitet.
Unter Verwendung des Suizidsubstrats Conduritol B Epoxid (CBE) wurde die Hemmung von rekombinanter Glucocerebrosidase (rGCB) Aktivität in Gegenwart von Pflanzenglucosidasen erzielt. Die Enzymaktivität wurde bei 37°C in einem Reaktionsgemisch, enthaltend 5 mM Methylumbelliferyl-ß-D-glucosid, 0,1 M Kaliumphosphat, 0,15 % Triton-X100, 0,125 % Natriumtaurocholat, 0,1 % Rinderserumalbumin, pH 5,9 mit und ohne CBE gemessen. Die Gesamtglucosidaseaktivität und die rGCB Aktivität wurden durch Hydrolyse des fluoreszierenden Substrats 4-Methylumbelliferylglucopyranosid gemessen. Eine Aktivitätseinheit wird als Enzymmenge definiert, die erforderlich ist, um die Hydrolyse von 1 nmol Substrat pro Stunde zu katalysieren. Das Gesamtprotein wurde mittels des Bio-Rad Proteinassays^® beruhend auf dem Verfahren von Bradford (Bradford, M., Anal Biochem. 72:248; 1976) bestimmt. Siehe die nachfolgende Tabelle 7.
BEISPIEL 9
Die Reinigung von Gluoccerebrosidase im halbtechnischen Umfang aus der interzellulären Flüssigkeit von auf dem Feld gewachsenem Tabak
100 Kilogramm MD609 Blattgewebe von transgenem Tabak, der das lysosomale Enzym Glycocerebrosidase exprimiert, wurde jeden Tag für einen Zeitraum von zwei Wochen vom Feld geerntet. Das Gewebe wurde von den Stengeln per Hand abgestreift und gewogen. Fünf Kilogramm Blätter wurde in Polyesterbeutel (Filtra-Spec^®, 12-2-1053) gegeben und vier × 5 kg Beutel mit Blättern wurden in einen Metallkorb gelegt. Der Metallkorb mit dem Blattmaterial wurde in einen 200 Liter Mueller Vakuumbehälter, enthaltend ~ 100 Liter gepufferte Lösung (0,1 KPO₄ Puffer, pH 6,0, 5 mM EDTA, 0,5 % Taurocholinsäure, 10 mM 2-Mercaptoethanol), gegeben. Eine 32 kg Platte aus rostfreiem Stahl wurde über die Blätter/Beutel gelegt, um ein vollständiges Eintauchen sicherzustellen. Ein Vakuum wurde auf 695 mm Hg gepumpt, 1 Minute lang gehalten und dann schnell abgelassen. Diese Vakuuminfiltration wurde für insgesamt zwei Zyklen wiederholt. Mehrere Anwendungen des Vakuums ohne Isolation der interstitiellen Flüssigkeit bilden ein einzelnes Infiltrationsverfahren. Ein Anzeichen für eine vollständige Infiltration ist ein deutliches farbliches Dunkelwerden der Unterseite des Blattgewebes. Anschließend an die Vakuuminfiltrationen wurden die Blätter und der Korb aus dem Vakuumbehälter entfernt. Bei den Beuteln mit den vakuuminfiltrierten Blättern wurde der Oberflächenpuffer für ~ 10 Minuten vor der Zentrifugation mittels der Schwerkraft abgelassen. Die interstitielle Flüssigkeit (IF) wurde aus den vakuuminfiltrierten Blättern durch Zentrifugation (1.800 × G, 30 Minuten) mittels einer Heine^® Korbzentrifuge (Behälterabmessungen, 28,0 Zoll [71,12 cm] Durchmesser × 16,5 Zoll [41,91 cm]) gewonnen.
Gesammeltes IF wurde durch ein 50 μm Patronenfilter filtriert und dann bei 4°C gelagert, bis die ganzen 100 Kilogramm Gewebe infiltriert waren. Dieses Verfahren wurde mit der nächsten Reihe von vier 5 kg Beuteln (5 × 20 kg Zyklen insgesamt) wiederholt, bis alles Gewebe infiltriert war. Ein zusätzlicher Puffer wurde während jedes Infiltrationszyklus zugeführt, um das Gewebe vollständig einzutauchen. Alternativ kann das Blattgewebe erneut infiltriert werden, indem die Blätter zurück in den Infiltrationskessel in denselben, oben verwendeten Puffer gelegt werden und das Verfahren wiederholt wird (IF-2). Darüber hinaus kann der Puffer aus dem Infiltrationskessel (verbrauchter Puffer) abgelassen werden und kann mit der 1. und 2. Fraktion gepoolt werden. Gemeinsam bilden IF-1, IF-2 und der verbrauchte Puffer den IF Pool. Das Volumen an interstitieller Flüssigkeit, die vom infiltrierten Blattgewebe gesammelt wurde, war zwischen 42–170 Gew.-% Blattgewebe, je nach der Zahl der durchgeführten Infiltrationen.
Rekombinantes GCB wurde durch direktes Beladen einer Pharmacia Streamline 200^® Säule, enthaltend Phenyl Streamline^® Harz, mit der verdünnten interstitiellen Flüssigkeit (Zuführstrom) gereinigt. Durch eine Expandierte-Bett-Chromatographie wurde es ermöglicht, das Protein in einem Schritt festzuhalten, zu klären und zu konzentrieren, ohne dass Zentrifugations- und/oder Mikrofiltrationsschritte nötig wurden. Die Säule wurde äquilibriert und gewaschen, bis das UV Signal auf dem Rekorder mit 25 mM Citrat, 20 % Ethylenglycol, pH 5,0, zur Grundlinie zurückkehrte; gebundenes Enzym wurde mit 25 mM Citrat, 70 % Ethylenglycol eluiert. Das eluierte Material wurde sterilfiltriert, indem das eluierte Material durch eine 0,09 m² 0,8 μm Sartoclean GF^® Kapsel gefolgt von einem 0,09 m² 0,2 μm Sartobran P^® Sterilfilter (Sartorius, Corp.) geleitet und bei 4°C bis zum nächsten Chromatographieschritt gelagert wurde. Das eluierte Material aus 4–5 Tagen Phenyl Streamline^® Chromatographiedurchläufe wurde gemeinsam gepoolt und weiter auf einem Kationenaustauschharz, SP Big Beads^® (Pharmacia), äquilibriert in 25 mM Citrat, 75 mM NaCl, pH 5,0, gereinigt. GCB wurde mit einem Stufengradienten von 25 mM Citrat, 0,4 M NaCl, 10 % Ethylenglycol, pH 5,0, eluiert. Alle Chromatographieschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Das eluierte Material wurde sterilfiltriert, indem das eluierte Material durch eine 0,09 m² 0,8 μm Sartoclean GV^® Kapsel gefolgt von einem 0,09 m² 0,2 μm Sartobran P^® Sterilfilter (Sartorius, Corp.) geleitet und bei 4°C gelagert wurde.
Mittels des Suizidsubstrats, Conduritol B Epoxid (CBE), wurde eine Hemmung einer rekombinanten Glucocerebrosidase (rGCB) Aktivität in Gegenwart von Pflanzenglucosidasen erzielt. Die Enzymaktivität wurde bei 37°C in einem Reaktionsgemisch, enthaltend 5 mM Methylumbelliferyl-ß-D-Glucosid, 0,1 M Kaliumphosphat, 0,15 % Triton-X100, 0,125 % Natriumtaurocholat, 0,1 % Rinderserumalbumin, pH 5,9, mit und ohne CBE, gemessen. Die Gesamtglucosidaseaktivität und rGCB Aktivität wurden mittels Hydrolyse des fluoreszierenden Substrats 4-Methylumbelliferylglucopyranosid gemessen. Das Gesamtprotein wurde mittels des Bio-Rad Proteinassays^® auf der Grundlage des Bradford Verfahrens bestimmt (Bradford, M., Anal. Biochem. 72:248; 1976).
Es wurden typischerweise von 1 Kilogramm von auf dem Feld gewachsenen, GCB exprimierenden Tabakblättern, wo IF-1 allein gesammelt wurde, 435.000 Einheiten GCB bei einer spezifischen Aktivität von 2.745 erhalten. Die Einheit/kg stieg auf 755.000 bei einer spezifischen Aktivität von 3.400, wenn der IF Pool gesammelt wurde (IF-1, IF-2 und verbrauchter Puffer).
Die nachfolgende Tabelle 8 enthält Daten, die für einwöchige Experimente repräsentativ sind.
BEISPIEL 11
Reinigung von alpha-Galactosidase im halbtechnischen Umfang aus der interzellulären Flüssigkeit von Nicotiana benthamiana
Aktiv wachsende Nicotiana benthamiana Pflanzen wurden mit infektiösen Transkripten eines rekombinanten Pflanzenviruskonstrukts, enthaltend das lysosomale Enzym alpha-Galactosidase-Gen, inokuliert, wobei das α-Galactosidase-Gen eine carboxyterminale Modifikation zur Nukleotidsequenz enthält, um die Sekretion an den interstitiellen Raum zu ermöglichen. Systemisch infiziertes Blattgewebe (1–2 Kilogramm) wurde von Nicotiana benthamiana, das alpha-Galactosidase 14 Tage nach der Inokulation exprimierte, geerntet. Das Gewebe wurde gewogen und mit 2–4 Volumen Puffer (25 mM bis tris Propanpuffer, pH 6,0, 5 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol) in einen Infiltrationskessel eingetaucht, der mehrere Kilogramm Blattgewebe auf einmal aufnehmen kann. Eine perforierte Metallplatte wurde oben auf das Gewebe gelegt, um das Gewebe nach unten zu drücken. Ein Vakuum wurde für 30 Sekunden auf 620–695 mm Hg gepumpt und dann schnell abgelassen. Das Gewebe wurde gedreht und das Vakuum erneut angelegt, um eine vollständige Infiltration zu erzielen, die durch ein deutliches farbliches Dunkelwerden der Unterseite des Blattgewebes nachgewiesen wurde. Ein überschüssiger Puffer auf dem Gewebe wurde abgelassen. Die interstitielle Flüssigkeit wurde aus dem Gewebe zur Zentrifugation des Gewebes in einem Korbrotor (10 Zoll × 4,25 Zoll [254 mm × 108 mm] tief, InterTest Equipment Services, San Jose, CA/Biosource Design 25-0611000) bei 3800 Umdrehungen pro Minute (2100 × G) über 10–15 Minuten freigesetzt. Die interstitielle Flüssigkeit wurde durch Aspiration gesammelt. In einigen Fällen wurde nur infiziertes Blattgewebe geerntet. Alternativ wurden nur Blattstiel und Stengel zusammen mit dem Blattgewebe zur Infiltration geerntet. Die Mittelrippe wurde vor der Infiltration nicht aus dem Gewebe entfernt.
Alpha-Galactosidase wurde durch direktes Beladen einer Pharmacia Streamline 25^® Säule, enthaltend Butyl Streamline^® Harz, mit dem verdünnten intrazellulären (Zuführstrom) gereinigt. Eine Expandierte-Bett-Chromatographie ermöglichte das Festhalten, die Klärung und die Konzentration des Proteins in einem Schritt, ohne das Zentrifugations- und/oder Mikrofiltrationsschritte notwendig wurden. Die Säule wurde äquilibriert und gewaschen, bis das UV Signal auf dem Rekorder mit 25 mM bis Tris Propan, pH 6,0 20 % (NH₄)₂SO4 zur Grundlinie zurückkehrte, und dann mit 25 mM bis tris Propan, pH 6,0, eluiert. Das eluierte Material wurde weiter auf Hydroxyapatit gereinigt, das mit 1 mM NaPO₄ Puffer, 5 % Glycerin, pH 6,0 äquilibriert war, und entweder mit einem 1–250 mM NaPO₄ Puffer, 5 % Glycerin, pH 6,0 Lineargradient oder einem Stufengradient eluiert. Alle Chromatographieschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die alpha-Galactosidaseaktivität wurde durch Hydrolyse des fluoreszierenden Substrats 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranosid gemessen. Die Enzymaktivität wurde bei 37°C in einem Reaktionsgemisch, enthaltend 5 mM Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranosid, 0,1 M Kaliumphosphat, 0,15 % Triton-X100^®, 0,125 % Natriumtaurocholat, 0,1 % Rinderserumalbumin, pH 5,9, gemessen. Das Gesamtprotein wurde mittels des Bio-Rad Proteinassays^® beruhend auf dem Verfahren von Bradford (Bradford, M. Anal. Biochem. 72:248; 1976) bestimmt.
Aus 1 Kilogramm Blättern wurden typischerweise zwischen 140–160 Millionen Einheiten alpha-Galactosidase bei einer spezifischen Aktivität von 800.000 Einheiten im Anschluss an ein einzelnes Infiltrationsverfahren (IF-1) erhalten.
Die nachfolgende Tabelle 10 enthält Daten, die für mehrere Experimente repräsentativ sind.
BEISPIEL 12
Reinigung von Glucocerebrosidase im halbtechnischen Umfang aus der interstitiellen Blattflüssigkeit und von rekombinantem Virus aus dem Blatthomogenat von auf dem Feld gewachsenem Tabak
Transgener Tabak (MD609), der das lysosomale Enzym Glucocerebrosidase exprimiert, wurde mechanisch mit einem Tabakmosaikvirusderivat inokuliert, das eine Hüllprotein-Schleifenfusion, TMV291 enthielt (Turpen, u.a., 1995, Bio/Technology 13:23-57). Insgesamt 100 kg transgenes, transfiziertes Blattgewebe wurde vom Feld fünf Wochen nach der Inokulation geerntet. Das Gewebe wurde von den Strunken per Hand befreit und gewogen. Fünf Kilogramm Blätter wurden in Polyesterbeutel (Filtra-Spec^®, 12-2-1053) gelegt und vier × 5 kg Beutel mit Blättern wurden in einen Metallkorb gelegt. Der Metallkorb, der das Blattmaterial enthielt, wurde in einen 200 Liter Mueller^® Vakuumbehälter, enthaltend ~ 100 Liter gepufferte Lösung (0,1 KPO₄ Puffer, pH 6,0, 5 mM EDTA, 0,5 % Taurocholinsäure, 10 mM 2-Mercaptoethanol) gelegt. Eine 32 kg Platte aus rostfreiem Stahl wurde über die Blätter/Beutel gelegt, um ein vollständiges Eintauchen sicherzustellen. Ein Vakuum wurde auf 695 mm Hg gepumpt, für 1 Minute gehalten und dann schnell abgelassen. Diese Vakuuminfiltration wurde für insgesamt zwei Zyklen wiederholt. Mehrere Anwendungen des Vakuums ohne Isolation der interstitiellen Flüssigkeit bilden ein einzelnes Infiltrationsverfahren. Ein Hinweis auf eine vollständige Infiltration ist ein deutliches farbliches Dunkelwerden der Unterseite des Blattgewebes. Anschließend an die Vakuuminfiltrationen wurden die Blätter und der Korb aus dem Vakuumbehälter entfernt. Bei den Beuteln, die die vakuuminfiltrierten Blätter enthielten, wurde vor der Zentrifugation der Oberflächenpuffer für ~ 10 Minuten durch die Schwerkraft abgelassen. Die interstitielle Flüssigkeit (IF) wurde aus den vakuuminfiltrierten Blättern durch Zentrifugation (1.800 × G, 30 Minuten) mittels einer Heine^® Korbzentrifuge (Behälterabmessungen, 711 mm Durchmesser × 419 mm) gewonnen. Gesammelte IF wurde durch einen 50 μm Patronenfilter filtriert und dann bei 4°C gelagert, bis die ganzen 100 Kilogramm Gewebe infiltriert waren. Dieses Verfahren wurde mit der nächsten Reihe von vier 5 kg Beuteln (5 Zyklen × 20 kg insgesamt) wiederholt, bis das ganze Gewebe infiltriert war. Zusätzlicher Puffer wurde während jedes Infiltrationszyklus zugesetzt, um das Gewebe vollständig einzutauchen.
Rekombinantes GCB wurde durch direktes Beladen einer Pharmacia Streamline 200^® Säule, enthaltend Phenyl Streamline^® Harz, mit dem verdünnten interzellulären (Zuführstrom) gereinigt. Eine Expandierte-Bett-Chromatographie ermöglichte das Festhalten, die Klären und Konzentrieren des Proteins in einem Schritt, ohne dass Zentrifugations- und/oder Mikrofiltrationsschritte notwendig wurden. Die Säule wurde äquilibriert und gewaschen, bis das UV Signal auf dem Rekorder mit 25 mM Citrat, 20 % Ethylenglycol, pH 5,0, zur Grundlinie zurückkehrte; das gebundene Enzym wurde mit 25 mM Citrat, 70 % Ethylenglycol eluiert. Das eluierte Material wurde sterilfiltriert, indem das eluierte Material durch eine 0,09 m² 0,8 μm Sartoclean GF^® Kapsel gefolgt von 0,09 m² 0,2 μm Sartobran P^® Sterilfilter (Sartorius, Corp.) hindurchgeführt wurde, und bei 4°C bis zum nächsten Chromatographieschritt gelagert. Das eluierte Material von den 4–5 Tagen der Phenyl Streamline^® Chromatographiedurchläufe wurde miteinander gepoolt und auf einem Kationenaustauschharz, SP Big Beads^® (Pharmacia), äquilibriert in 25 mM Citrat, 75 mM NaCl, pH 5,0, weiter gereinigt. GCB wurde mit einem Stufengradient von 25 mM Citrat, 0,4 M NaCl, 10 % Ethylenglycol, pH 5,0, eluiert. Alle Chromatographieschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Das eluierte Material wurde sterilfiltriert, indem das eluierte Material durch eine 0,09 m² 0,8 μm Sartoclean GF^® Kapsel gefolgt von einem 0,09 m² 0,2 μm Sartobran P^® Sterilfilter (Sartorius, Corp.) hindurchgeführt wurde, und bei 4°C gelagert.
Mittels des Suizidsubstrats, Conduritol B Epoxid (CBE), wurde eine Hemmung einer rekombinanten Glucocerebrosidase (rGCB) Aktivität in Gegenwart von Pflanzenglucosidasen erzielt. Die Enzymaktivität wurde bei 37°C in einem Reaktionsgemisch, enthaltend 5 mM Methylumbelliferyl-ß-D-Glucosid, 0,1 M Kaliumphosphat, 0,15 % Triton-X100^®, 0,125 % Natriumtaurocholat, 0,1 % Rinderserumalbumin, pH 5,9, mit und ohne CBE gemessen. Die Gesamtglucosidaseaktivität und rGCB Aktivität wurden mittels Hydrolyse des fluoreszierenden Substrats 4- Methylumbelliferylglucopyranosid gemessen. Das Gesamtprotein wurde mittels des Bio-Rad Proteinassays^® auf der Grundlage des Bradford Verfahrens bestimmt (Bradford, M., Anal. Biochem. 72:248; 1976).
Die verbleibende, im IF-extrahierten Blattgewebe vorhandene Virusmenge wurde unter Anwendung einer Homogenisierung und von Polyethylenglycolpräzipitationsverfahren bestimmt. Darüber hinaus wurde die Menge an in der gepoolten, interstitiellen Flüssigkeit vorhandenem Virus durch eine direkte Polyethylenglycolpräzipitation bestimmt. Abschließende Virusausbeuten von präzipitierten Proben wurden spektrophotometrisch durch ein Absorptionsvermögen bei 260 nm bestimmt. (siehe Tabelle 11)
Tabelle 11
Die Tabelle 12 enthält die GCB Gewinnungsdaten aus dem TMV transfizierten Pflanzengewebe.
Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit, zwei unterschiedliche Produkte aus demselben Blattgewebe auf der Grundlage von Extraktionsverfahren zu extrahieren, die spezifisch auf im Apoplast und Zytosol lokalisierte Produkte abzielen.
BEISPIEL 13
Zentrifugation von IF Fraktionen in großem Umfang
Das folgende Beispiel veranschaulicht ein Scale-up-Verfahren zur Herstellung eines IF Extrakts mittels eines diskontinuierlichen Losverfahrens, das einen konstanten Strom an IF Extrakt zur nachgeschalteten Verarbeitung erzeugt. Dieses Verfahren besteht aus den folgenden Elementen:

1. automatisiertes Ganzblatternten
2. Kontinuierliche Infiltration in großem Umfang
3. Korbzentrifugation in großem Umfang.

Es sind mindestens zwei großtechnische ganze Ganzblatternteanordnungen verfügbar. Eine wurde von R.J. Reynolds Company entwickelt und wird in ihrem Avoca Werk in North Carolina verwendet. Die andere Ernteeinrichtung wurde von der Universität Kentucky, Abteilung Agrarwirtschaft entwickelt und ist seit drei Saisons in Daviess County Kentucky auf gewerblichen Tabakfeldern im Einsatz. Diese Ernteeinrichtungen sind in der Lage, unversehrte Pflanzen zu schneiden, ganze Blätter abzustreifen und die Blätter und das Stengelgewebe mit Raten über mehrere Acre (1 Acre = 4.046 m²) pro Stunde zu trennen. Die Blätter werden dann in Anhängern zu einer Extraktionsanlage transportiert.
Anschließend werden die Blätter durch eine mechanische Förderanlage und eine Dosierbandzuführeinrichtung in das Vakuuminfiltrationssystem entladen. Zwei Systeme wurden konstruiert. Bei dem System 1 (1) handelt es sich um einen Sammelbehälter. Dieser Behälter ist für ein volles Vakuum konstruiert und lässt sich mit niedriger (unter 50) Umdrehung pro Minute drehen, so dass alle Blätter in das Infiltrationsmedium eingetaucht werden. Ein Vakuum wird durch herkömmliche mechanische Vakuumpumpen oder durch einen Dampfauswerfer zu einem Vakuum aufgebaut, das gleich 533 mm Wassersäulendruck ist. Das Vakuum wird dann abgelassen, was zu einer Infiltration des Gewebes führt. Der Kessel wird dann in einen sekundären Behälter zur Pufferwiederverwendung entleert und das Blattgewebe wird aus dem Kessel über eine Einzugsschnecke im Boden des Behälters zu einer Ableitungsöffnung und auf eine Fördereinrichtung abgegeben. Diese Fördereinrichtung transportiert die Blätter über ein Dosierband zur Korbzentrifuge. Das Dosierband stellt sicher, dass eine abgemessene Materialmenge der Zentrifuge für jeden Zentrifugationszyklus zugesetzt wird. Das System 2 ist ein kontinuierliches Vakuuminfiltrationssystem. Dieses System besteht aus einer großen zylindrischen Röhre, die eine innere Einzugsschnecken-Fördereinrichtung aufweist (2). Der Zylinder wird in einem Winkel angeordnet. Der Zylinder ist teilweise mit der Infiltrationsflüssigkeit gefüllt. Der Zylinder steht unter Vakuum, das durch herkömmliche Vakuumpumpen oder einen Dampfauswerfer zu etwa 533 nm Wassersäulendruck vorgesehen ist. Das Blattgewebe wird durch ein Drehventil zugesetzt, das das Vakuum bei der Zugabe von Gewebe aufrechterhält. Das Blattgewebe wird dann für einen gewissen Zeitraum im Puffer eingetaucht, wenn es die Röhre hoch wandert, und zwar unter Förderung durch die Einzugsschnecke. Die infiltrierten Blätter werden am erhöhten Ende der Einzugsschnecke durch ein anderes Drehventil abgegeben. An diesem Punkt wird das Vakuum abgelassen. Diese Art Druckkessel, die mit Drehventilen und einem Einzugsschnecken-Transportgewindegang ausgestattet ist, wird von einem Druckkesselaufbau von Christian Engineering (San Francisco) angepasst, der für das kontinuierliche Kochen von Reis und anderen Dampfdruck verwendenden Materialien verwendet wird. Einmal abgegeben, werden die Blätter über ein Förderband zur Korbzentrifuge transportiert, das mit einem Dosierband ausgestattet ist. Das Dosierband funktioniert, wie oben angegeben, dahingehend, dass es die geeignete Materialfüllung für jeden Zyklus der Korbzentrifuge sicherstellt.
Die Korbzentrifuge ist eine Modifikation für einen grundlegenden Sanborn (UPE) Aufbau für die Gemüseindustrie zum Entwässern von Salaten nach dem Waschen. Bei der Zentrifuge handelt es sich um einen Korbaufbau mit einer konischen Spindel an der Innenseite des Korbs. Der Korb hat einen zweiteiligen Aufbau, der die Trennung der Bodenplatte vom Zylinder über einen hydraulischen Kolben bewerkstelligt. Die Zentrifuge wird bei sehr niedriger Geschwindigkeit (d.h. niedriger Umdrehung pro Minute oder niedriger Beschleunigungskraft) über ein Förderband beladen, das über den Mittelpunkt des Korbs, der mit der konischen Spindel ausgestattet ist, angeordnet ist. Wenn das Material vom Förderband fällt, wird es vom Konus gleichmäßig auf die Seite des perforierten Korbs umgeleitet. Wenn die Blattladung vollständig ist, hält die Einzugsschnecke an und der Korb wird auf 2000–2500 × G für etwa 5–60 min beschleunigt. Die IF Flüssigkeit wird aus der Zentrifuge gewonnen. Am Ende der Zentrifugation wird der Korb auf eine niedrige Umdrehungszahl pro Minute verlangsamt. Der Korbboden wird von den Seiten (Zylinder) durch die Wirkung des hydraulischen Kolbens getrennt. Das Blattgewebe wird an ein Förderband abgegeben, der Zentrifugenboden wird geschlossen und der Zyklus wiederholt. Dieser Aufbau erfordert, dass ein Rotor und ein Antrieb entwickelt werden, die für die höhere Beschleunigungskraft ausgelegt sein können. Typischerweise sind die Sanborn Maschinen nur für 600 bis 800 G ausgelegt. Es liegt aber innerhalb der normalen technischen Parameter, eine solche verbesserte Maschine für diese Einzelanwendung zu konstruieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Gewinnung eines konzentrierten interessierenden Proteins oder Biomoleküls, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Lipiden, Kohlenhydraten, Lipoproteinen, Polysacchariden, Zuckern, Fettsäuren, Nukleinsäuren und Polynukleotiden aus der interstitiellen Flüssigkeit eines Pflanzengewebes, umfassend: (a) das Eintauchen des Pflanzengewebes in eine Pufferlösung; (b) das Aussetzen des Pflanzengewebes und der Pufferlösung einer Vakuumumgebung; (c) das Trennen des Pflanzengewebes von der Pufferlösung; (d) das Zentrifugieren des Pflanzengewebes zur Entfernung der interstitiellen Flüssigkeit; und (e) das Konzentrieren des interessanten Proteins oder Biomoleküls aus der interstitiellen Flüssigkeit; dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzengewebe ganze Tabakblätter sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gewebe mittels einer Korbzentrifuge zentrifugiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein oder Biomolekül mittels Ultrafiltration konzentriert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein oder Biomolekül mittels einer Expandierte-Bett-Chromatographie konzentriert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pufferlösung aus der Gruppe bestehend aus Citrat, Phosphat und Tris ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Puffer Detergenzien enthält, die aus der Gruppe bestehend aus Natriumlaurocholat, SDS, Tritonen, Tween^®, Phospholipiden, Gallensalzen, Natriumdeoxycholat und Natriumlaurylsulfat ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Pufferlösung chelatbildende Verbindungen enthält, die aus der Gruppe bestehend aus EDTA, EGTA und Citrat ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Pufferlösung Antioxidationsmittel enthält, die aus der Gruppe bestehend aus 2-Mercaptoethanol, Ascorbat, Natriummetabisulfat und Dithiothreitol ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Pflanzenblatt und der Puffer einem Vakuumdruck von 200–760 mm Hg unterworfen werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Vakuumdruck 400–760 mm Hg ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Vakuumdruck 740–760 mm Hg ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Vakuumdruck etwa 760 mm Hg ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zentrifugation bei einem Beschleunigungskraftbereich von 50 bis 5.000 × G durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zentrifugation bei einem Beschleunigungskraftbereich von etwa 2.000 × G durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das interessierende Protein oder Biomolekül in der Pflanze durch einen rekombinanten Pflanzenvirusvektor erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das interessierende Protein oder Biomolekül durch eine transgene Pflanze erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das interessierende Protein oder Biomolekül in der Pflanze natürlich erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt des Ableitens oder Entfernens von überschüssigem Puffer aus dem Gewebe vor der Zentrifugation.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt des Übertragens des Gewebes von der Pufferlösung auf die Zentrifuge mittels eines diskontinuierlichen Chargenverfahrens.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt des Reinigens eines interessierenden Proteins oder Biomoleküls aus dem Gewebe, das nach dem Entfernen der interstitiellen Flüssigkeit mittels Zentrifugation übrig bleibt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein oder Biomolekül aus Zellkomponenten abgeleitet wird, die aus der Gruppe bestehend aus der Plasma-Transmembran, Peroxisomen, zugehörigen Membranen, anderen Organellen, dem Nukleus, dem Golgi-Apparat, dem Cytosol, dem rauen und glatten endoplasmatischen Retikulum, den Mitochondrien, den Vakuolen und dem Chloroplast ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das interessierende Protein ein das Ribosom inaktivierendes Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das interessierende Protein ein humanes lysosomales Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das interessierende Protein ein Cytokin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das interessierende Protein ein Antikörper oder Antikörperfragment ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das interessierende Protein α-Galactosidase oder ein Isozym von α-Galactosidase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das interessierende Protein Glucocerebrosidase oder ein Isozym von Glucocerebrosidase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das interessierende Protein auch ein Signalpeptid umfasst, um das Protein zu einer bestimmten Abteilung in der Zelle zu lenken.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mehr als eine Proteinart gleichzeitig gereinigt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Gewinnung eines interessierenden konzentrierten und aktiven Proteins oder Biomoleküls aus der interstitiellen Flüssigkeit von Pflanzengeweben, wobei das Pflanzengewebe von der Pufferlösung durch eine diskontinuierliche Abgabe des Puffers an das Pflanzengewebe mittels eines Massen-Vakuum-Infiltrations-Drehbehälters durchdrungen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Infiltration eine kontinuierliche Infiltration mittels eines großen Zylinderdruckkessels ist, der eine innere Einzugsschnecke mit einem drehbaren Einlass- und drehbaren Auslassventil enthält.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Korbzentrifuge in der Lage ist, bei niedriger Geschwindigkeit be- oder entladen zu werden und beschleunigt zu werden, um interstitielle Flüssigkeit (IF) bei 2.000–2.500 × G zu gewinnen, und Blattmaterial durch einen geteilten Rotoraufbau abgeführt wird.