DE69932273T2

DE69932273T2 - Befestigung von Biomolekülen an Oberflächen von medizinischen Geräten

Info

Publication number: DE69932273T2
Application number: DE69932273T
Authority: DE
Inventors: Marc Hendriks; Michel Verhoeven; Patrick Cahalan; Linda Cahalan; Edouard Koulik; Mirian Gillissen
Original assignee: Medtronic Inc
Current assignee: Medtronic Inc
Priority date: 1998-03-13
Filing date: 1999-03-15
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2019-03-16
Also published as: EP0941740A3; EP0941740B1; DE69932273D1; EP0941740A2; US6024918A

Description

Diese Erfindung betrifft biokompatible Materialien und vorzugsweise blutkompatible Materialien. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen, vorzugsweise blutkompatiblen, Materialien, bei denen die Oberfläche eines Biomaterials mit dem Reaktionsprodukt eines aminofunktionellen Polysiloxans und eines Biomoleküls beschichtet ist.
Die Entwicklung von Gefäßprothesen und medizinischen Geräten, die im Kontakt mit Körperflüssigkeiten stehen, insbesondere mit Blut, ist ein sich schnell entwickelndes Gebiet der Medizin. Dies ist bislang jedoch durch einen Mangel an geeigneten synthetischen Materialien, die beim Kontakt mit solchen Flüssigkeiten stabil sind, behindert worden.
Schädliche Reaktionen zwischen den Materialien und Blutkomponenten sind die vorherrschenden Faktoren, die die Verwendung synthetischer Materialien begrenzen, die in Kontakt mit Körperflüssigkeiten kommen. Zum Beispiel tendieren Katheter, Gefäßprothesen und dergleichen dazu, als Nest oder Fokus für die Bildung von Thromben (Blutgerinnseln) zu dienen. Der erste Kontakt solcher Materialien mit dem Blut führt zur Ablagerung von Plasmaproteinen wie z. B. Albumin, Fibrinogen, Immunglobulin, Gerinnungsfaktoren und Komplementbestandteilen. Die Adsorption von Fibrinogen auf die Oberfläche des Materials verursacht Thrombozytenadhäsion, -aktivierung und -aggregation. Auch andere Zelladhäsionsproteine wie z. B. Fibronektin, Vitronektin und der von-Willebrand-Faktor (vWF), fördern die Thrombozytenadhäsion. Als Ergebnis hiervon ist die fortgesetzte Verwendung von Antikoagulantien im Zusammenhang mit dem Einbringen solcher Materialien in den Körper oftmals notwendig.
Weiterhin tritt Komplementaktivierung ein, wenn Materialien in das Blut eingebracht werden. Die Adsorption großer Mengen von IgG, IgM und C3b auf Oberflächen verursacht die Aktivierung. Anschließend können Komplexe gebildet werden, die zu einer unerwünschten Immunantwort beitragen, wie z. B. Proteolyse, Zelllyse, Opsonisierung, Anaphylaxis und Chemotaxis. Als Ergebnis hiervon machen diese Reaktionen solche Materialien mit dem lebenden Körper inkompatibel.
Es wurde eine Reihe von Ansätzen vorgeschlagen, um die Biokompatibilität und sogar die Blutkompatibilität medizinischer Geräte zu verbessern. Ein Ansatz besteht darin, die Oberfläche des Materials zu modifizieren, um eine unerwünschte Proteinadhäsion zu verhindern, indem man das Material mit einer Oberfläche mit niedriger Polarität, mit einer Oberfläche mit negativer Ladung, oder mit einer mit biologischen Materialien wie z. B. Enzymen, Endothelzellen und Proteinen beschichteten Oberfläche versieht. Ein anderer Ansatz war, Antikoagulantien an die Oberfläche biologisch inerter Materialien zu binden, um den Materialien antithrombogene Eigenschaften zu vermitteln. US-A-5 053 048 beschreibt z. B. die Bildung einer thromboresistenten Beschichtung, umfassend eine in hohem Maße quervernetzte dreidimensionale Matrix mit Ami nogruppen, die eine Verknüpfung mit einem antithrombogenen Mittel erlauben, auf einem medizinischen Gerät. Ein weiterer im Stand der Technik verwendeter Ansatz ist die Copolymerisation verschiedener Phospholipide, die als Beschichtungsmaterialien für unterschiedliche Substrate verwendet werden. Auch Beschichtungen mit partiellen Polymerrückgraten wurden auf ähnliche Weise verwendet. Jedoch können viele dieser Verfahren zu einem Auslaugen oder „Abbeizen" der Beschichtung führen.
Einige Ansätze erfordern die Aminierung der Substratoberfläche. Zum Beispiel lehrt US-A-5 342 693 (Winters et al.), dass eine Siloxanoberfläche zuerst funktionalisiert (z. B. mit Amingruppen) werden muss, um Biomoleküle daran zu befestigen. Weiterhin hat man quaternäre Amine an Polymeroberflächen gebunden und dann Heparin daran gebunden. Umgekehrt wurde Heparin mit einem quaternären Amin komplexiert, bevor der Komplex als Beschichtung auf eine polymere Oberfläche aufgetragen wurde. Beide dieser Verfahren haben den Nachteil, dass die Systeme nicht-permanent sind oder ausgewaschen werden können, d. h., dass das Heparin allmählich von dem Polymermaterial in das umgebende Medium verloren geht. Weiterhin haben beschichtete Systeme infolge der Instabilität des Antikoagulans eine allgemein begrenzte Lebensdauer.
Somit besteht ein Bedürfnis nach einem blutkompatiblen Material zur Verwendung in medizinischen Geräten, dass über einen verlängerten Zeitraum hinweg antithrombogene Eigenschaften, d. h. verringerte Thrombozytenadhäsion und Aktivierung, beibehält.
Es wurde jetzt gefunden, dass Artikel, die bei ihrer Verwendung in Kontakt mit Körperflüssigkeiten oder Geweben stehen, in dieser Hinsicht verbesserte Eigenschaften haben, wenn sie ein Substrat mit einem über ein aminofunktionelles Polysiloxan auf die Oberfläche immobilisierten Biomolekül umfassen.
Gemäß einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines medizinischen Gerätes mit einem auf einer Substratoberfläche immobilisierten Biomolekül bereit, wobei man:

(a) die Substratoberfläche mit einer Lösung eines aminofunktionellen Polysiloxans beschichtet; und die aminofunktionelle Polysiloxanlösung durch Spülen der Oberfläche mit feuchter Luft trocknet, wobei man eine beschichtete Oberfläche mit Amin-Funktionen erhält; und
(b) die beschichtete Oberfläche mit einem Biomolekül in Kontakt bringt, wobei man eine bioverträgliche Oberfläche erhält.

Durch erfindungsgemäße Verfahren erhältliche medizinische Geräte stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Als Ergebnis der vorliegenden Erfindung, die zu einem aminofunktionellen Polysiloxan auf einer Substratoberfläche führt, ist das Substrat blutkompatibel, und vorzugsweise auch biokompatibel.
Ein „medizinisches Gerät" kann als ein Gerät definiert werden, das Oberflächen besitzt, die im Verlauf ihres Betriebs mit Gewebe, Blut oder anderen Körperflüssigkeiten in Kontakt kommen, welche Flüssigkeiten nachfolgend in Patienten verwendet werden. Hierzu können z. B. extrakorporale Geräte zur Verwendung in der Chirurgie wie z. B. Blut-Oxygenatoren, Blutpumpen, Blutsensoren, Röhren zur Beförderung von Blut und dergleichen, die mit Blut in Kontakt kommen, das dann in den Patienten zurückgeführt wird, gehören. Hierzu können auch Endoprothesen gehören, die in Kontakt mit Blut in einen menschlichen oder tierischen Körper implantiert werden, wie z. B. Gefäßprothesen, Stents, Schrittmacherkontakte, Herzklappen und dergleichen, die in Blutgefäße oder in das Herz implantiert werden. Dies kann auch Geräte zur vorübergehenden intravaskulären Verwendung wie z. B. Katheter, Führungsdrähte und dergleichen umfassen, die zu Zwecken der Überwachung oder Reparatur in den Blutgefäßen oder im Herzen platziert werden.
Ein „Biomolekül" ist als ein biologisch aktives Molekül definiert.
Ein „biokompatibles" Material ist eines, das im Körper generell keine schädlichen Reaktionen (z. B. toxische oder antigene Reaktionen) hervorruft, ob es nun im Körper abgebaut wird, für längere Zeiträume darin verbleibt oder als Ganzes (d. h. unverändert) ausgeschieden wird. Idealerweise ruft ein biokompatibles Material als Ergebnis seines Kontaktes mit Körperflüssigkeiten oder Geweben keine unerwünschten Reaktionen im Körper hervor, wie z. B. Gewebstod, Tumorbildung, allergische Reaktion, Reaktion auf Fremdkörper (Abstoßung) oder Entzündung.
Ein „blutkompatibles" Material ist eines, das im Körper als Ergebnis seines Kontaktes mit Blut keine unerwünschten Reaktionen wie z. B. Blutgerinnung hervorruft. Dies kann z. B. durch verringerte Thrombozytenadhäsion demonstriert werden.
Die Biokompatibilität von in medizinischen Geräten verwendeten Materialien, wozu implantierbare Materialien und Materialien gehören, die nicht notwendigerweise implantiert werden, aber die in Kontakt mit Körpergeweben oder -flüssigkeiten (z. B. Blut) kommen, kann erfindungsgemäß verbessert werden, z. B. durch kovalente Anheftung eines Biomoleküls, vorzugsweise von Heparin, unter Verwendung eines aminofunktionellen Polysiloxans. Unter Verwendung dieses Verfahrens werden Ausmaß und Stärke schädlicher Reaktionen zwischen dem Substrat und den Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, verringert.
Die Blutkompatibilität ist erheblich komplexer als die Kompatibilität eines Materials mit anderen Körperflüssigkeiten oder -geweben. Dies ist eine Folge des komplexen Gemisches roter Blutkörperchen, weißer Blutkörperchen, Thrombozyten, anorganischer Ionen und Plasmaproteine wie z. B. Albumin, Fibrinogenen und Globulinen im Blut. Das Blut bildet ein Gerinnsel oder einen Thrombus, wenn eine Verletzung erfolgt oder wenn es in Kontakt mit einer fremden Substanz kommt. Fast alle Materialien setzen diesen Gerinnselbildungsprozess in Gang, und im Allgemeinen werden sie bald darauf von einem irreversiblen Gerinnsel unterschiedlicher Größe überzogen. Solche Gerinnsel können eine negative Wirkung auf die Verwendbarkeit solcher Materialien haben. Somit sind besonders bevorzugte Materialien der vorliegenden Erfindung solche, die keine nennenswerte Gerinnung oder Reaktion natürlicher Blutbestandteile, wie sie in vivo eintreten, auslösen, wie z. B. Thrombozytenadhäsion und Aktivierung.
Die erfindungsgemäßen Geräte umfassen ein Substrat und ein Biomolekül, das über ein aminofunktionelles Polysiloxan auf eine Weise und in einer Orientierung angeheftet ist, die dahingehend wirken, dass sie ein relativ zum Substrat ohne das Biomolekül und das aminofunktionelle Polysiloxan verbesserte nicht-thrombogene Oberfläche bereitstellen. Der Kontakt zwischen dem Blut und einer fremden Oberfläche initiiert einen komplexen Vorgang der Thrombogenese, an dem Thrombozytenadhäsion, Aggregation und Granulenfreisetzung; Thrombinbildung; und Fibrinbildung beteiligt sind. Infolgedessen existieren eine Reihe von Parametern, die als Maß der Thrombogenizität eines Gerätes ausgewählt werden können. Somit umfasst die Evaluation der Reaktionen an der Berührungsfläche zwischen Blut und Gerät typischerweise einen Multi-Parameter-Ansatz (d. h. Multi-Assay-Ansatz), obwohl schon eines der Assays (z. B. Elektronenmikroskopie für die Thrombozytenadhäsion, Plättchenfaktor 4 (PF4)-Messung für die Thrombozytenaktivierung, Thrombin-Antithrobin (TAT)-Assay), die hier verwendet werden, als ausreichend gilt, um die Verbesserungen zu zeigen, die sich aus dem erfindungsgemäßen Verfahren ergeben.
Die Blutkompatibilität des erfindungsgemäßen Gerätes zeigt sich hier an einer verringerten Thrombozytenadhäsion bei der Interaktion mit Blut im Vergleich zu einem Gerät ohne das über ein aminofunktionelles Polysiloxan angeheftetes Biomolekül. Dies bedeutet, dass es bei einem Substrat, an das ein Biomolekül wie z. B. Heparin über ein aminofunktionelles Polysiloxan angeheftet ist, eine Verringerung der Anzahl der an die Substratoberfläche angehefteten Thrombozyten pro Flächeneinheit im Verhältnis zu dem gleichen Substrat ohne das daran angeheftete Polysiloxan und Biomolekül gibt, wenn es gemäß dem in den Beispielen umrissenen Verfahren mit menschlichem Blut in Kontakt gebracht wird. Die erfindungsgemäße Substratoberfläche ist vorzugsweise im Wesentlichen nicht-thrombogen, d. h. sie verursacht wenig oder keine Thrombozytenadhäsion. Hier ist bei einem im Wesentlichen nicht-thrombogenen Substrat weniger als 1 % der Substratoberfläche mit Thrombozyten bedeckt. Im Gegensatz hierzu können bei Substraten ohne daran angeheftetes Polysiloxan und Biomolekül unter den gleichen Bedingungen bis zu 10–15 % der Oberfläche mit Thrombozyten bedeckt sein. Dies kann unter Verwendung von Elektronenmikroskopie gezeigt werden.
Das erfindungsgemäße Gerät verursacht vorzugsweise wenig oder keine Thrombozytenaktivation zusätzlich zu der geringen Thrombozytenadhäsion, wie anhand der Thrombozytenausbreitung gezeigt werden kann. Das heißt, bei Substraten, an welche die Thrombozyten adhärieren, bleiben die Thrombozyten im Allgemeinen abgerundet und zeigen wenig oder keine Ausbreitung. Die Thrombozytenaktivierung kann auch anhand der Freisetzung des Plättchenfaktors 4 bestimmt werden. Bei einem erfindungsgemäßen Substrat, an das ein Biomolekül wie z. B. Heparin über ein aminofunktionelles Polysiloxan angeheftet ist, gibt es eine Verringerung der Menge des freigesetzten Plättchenfaktors 4 im Verhältnis zu dem gleichen Substrat ohne daran angeheftetes Polysiloxan und Biomolekül, wenn es gemäß dem in den Beispielen umrissenen Verfahren mit menschlichem Blut in Kontakt gebracht wird. Diese Verringerung ist vorzugsweise in der Größenordnung von mindestens 15 %, und besonders bevorzugt von mindestens 20 %.
Die Blutkompatibilität des erfindungsgemäßen Geräts zeigt sich auch an einer verringerten Thrombin-Antithrombin-Bildung (TAT) bei der Interaktion mit Blut im Vergleich zu dem Gerät ohne das über ein aminofunktionelles Polysiloxan angeheftetes Biomolekül. Das heißt, dass es bei einem erfindungsgemäßen Substrat, an das ein Biomolekül wie z. B. Heparin über ein aminofunktionelles Polysiloxan angeheftet ist, im Verhältnis zu dem gleichen Substrat ohne das daran angeheftete Polysiloxan und Biomolekül bei Kontakt mit menschlichem Blut gemäß dem in den Beispielen umrissenen Verfahren eine Verringerung der Anzahl der gebildeten Thrombin-Antithrombin-Komplexe (TAT) gibt. Diese Verringerung liegt vorzugsweise in der Größenordnung von mindestens 10 %, und besonders bevorzugt von mindestens ungefähr 25 %.
Die Blutkompatibilität des erfindungsgemäßen Geräts zeigt sich auch an einer verringerten Bildung des terminalen Komplementkomplexes bei der Interaktion mit Blut im Vergleich zu dem Gerät ohne das über ein aminofunktionelles Polysiloxan angeheftetes Biomolekül. Das heißt, dass es bei einem erfindungsgemäßen Substrat, an das ein Biomolekül wie z. B. Heparin über ein aminofunktionelles Siloxan angeheftet ist, im Verhältnis zu dem gleichen Substrat ohne das daran angeheftete Polysiloxan und Biomolekül eine Verringerung der Anzahl terminaler Komplementkomplexe gibt, wenn sie in Übereinstimmung mit dem in den Beispielen umrissenen Verfahren mit menschlichem Blut in Kontakt gebracht werden. Diese Verringerung liegt vorzugsweise in der Größenordnung von mindestens etwa 40 %, und besonders bevorzugt von mindestens etwa 70 %.
Die Blutkompatibilität des erfindungsgemäßen Geräts zeigt sich auch an einer verringerten Elastasebildung bei der Interaktion mit dem Blut im Vergleich zu dem Gerät ohne das über ein aminofunktionelles Polysiloxan angeheftetes Biomolekül. Das heißt, dass es bei einem erfindungsgemäßen Substrat, an das ein Biomolekül wie z. B. Heparin über ein aminofunktionelles Polysiloxan angeheftet ist, eine Verringerung der Menge der gebildeten Elastase relativ zu dem gleichen Substrat ohne daran angeheftetes Polysiloxan und Biomolekül gibt, wenn es gemäß dem in den Beispielen umrissenen Verfahren mit menschlichem Blut in Kontakt gebracht wird. Diese Verringerung liegt vorzugsweise in der Größenordnung von mindestens etwa 20 %, und besonders bevorzugt von mindestens etwa 25 %.
Erfindungsgemäß wird die Substratoberfläche zuerst mit einem aminofunktionellen Polysiloxan (nachfolgend auch als Silikon bezeichnet) überzogen, typischerweise in einem flüssigen Träger (z. B. einem organischen Lösungsmittel). Beispiele für geeignete aminofunktionelle Polysiloxane sind z. B. in US-A-3 574 673 (Schwelger) offenbart. Ein bevorzugtes solches Material ist ein von Dow Corning unter dem Handelsnamen „MDX4-4159" erhältliches aminofunktionelles Polydimethylsiloxan-Copolymer. Dieses Material ist als eine Lösung, die 50 % eines aminofunktionellen Polydimethylsiloxan-Copolymers in gemischten aliphatischen (z. B. Hexan) und Isopropanol-Lösungsmitteln enthält, erhältlich.
Das aminofunktionelle Polydimethylsiloxan wird typischerweise so verwendet, wie es erhalten wird, oftmals in einem flüssigen Träger, und es wird durch Beschichtung auf ein Substrat aufgetragen. Die Oberfläche wird dann getrocknet (d. h., dass man die flüssigen Träger und einen etwaigen Überschuss an Siloxan entfernt), und das Siloxan wird gehärtet, indem man die Oberfläche des Substrates mit feuchter Luft (d. h. mit mehr als 50 % relativer Luftfeuchte) spült. Die Luft trocknet den flüssigen Träger und entfernt das überschüssige Siloxan. Die Luftfeuchtigkeit erzeugt Si-OH-Gruppen in dem Siloxan, die dann Kondensation und Härtungsreaktionen in der Beschichtung auslösen.
Das mit dem aminofunktionellen Polydimethylsiloxan beschichtete Substrat wird dann mit einem Biomolekül, das daran angeheftet werden soll, in Kontakt gebracht. Dies kann durch eine Reihe von dem Fachmann bekannten Verfahren geschehen.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist ein Oxidationsverfahren, das die Verwendung von Periodat umfasst. Das Biomolekül, vorzugsweise Heparin, wird mit einem Periodat in einer gepufferten wässrigen Lösung in Kontakt gebracht, und man lässt es reagieren, wodurch ein aldehydfunktionalisiertes Heparin gebildet wird. Diese kontrollierte Oxidation stellt eine begrenzte Anzahl reaktiver Aldehydgruppen pro Molekül bereit. Das Periodat ist vorzugsweise ein wasserlösliches Periodat, z. B. ein Alkalimetallperiodat, wie z. B. Natriumperiodat. Wenn das Biomolekül Heparin ist, ist die verwendete Periodatmenge im Allgemeinen ausreichend, um mit nicht mehr als zwei der Zuckereinheiten in dem Heparinmolekül (d. h. den basischen Disaccharid resten, die die Struktur des Glycosaminoglycans bilden) zu reagieren. Wenn das verwendete Periodat Natriumperiodat ist und das verwendete Heparin eine kommerziell verfügbare injizierbare Form des Heparins ist (d. h., sein Natriumsalz mit einer Aktivität von 160 Einheiten/Milligramm), dann sollte das Gewichtsverhältnis von Heparin zu Periodat ungefähr 30:1 oder weniger betragen, damit nicht mehr als zwei der Zuckereinheiten in dem Heparinmolekül reagieren. Der Fachmann erkennt, dass die für andere Periodatverbindungen und andere Heparinformen benötigten Periodatmengen durch herkömmliche Berechnung und empirische Tests bestimmt werden können.
Die Reaktion zwischen dem Heparin und dem Periodat findet in einer wässrigen Pufferlösung statt. Im Allgemeinen können Puffer mit einem pH-Wert in einem neutralen bis schwach sauren Bereich von ungefähr 4,5 bis ungefähr 8 verwendet werden. Ein niedriger pH-Wert (z. B. ein Acetatpuffer mit pH 4,5) ist bevorzugt, wenn eine schnelle Reaktion erwünscht wird, während ein eher neutraler pH-Wert (z. B. ein Phosphatpuffer mit pH 6,88) für eine langsamere Reaktion mit einer längeren Lagerstabilität bevorzugt wird. In dem Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,5 sollte die Reaktion ungefähr 3 Stunden lang stattfinden. In einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,88 sollte die Reaktion ungefähr 16 Stunden lang stattfinden. Gewünschtenfalls kann das Reaktionsgemisch dann vor der Verwendung bei ungefähr 5 °C gelagert werden.
Das Gemisch wird nach der Reaktion verdünnt, und der pH-Wert wird eingestellt, um den pH-Wert des Gemischs auf einen pH-Wert einzustellen, der für die Kopplungsreaktion zwischen dem Biomolekül und dem aminofunktionellen Polysiloxan günstig ist. Typischerweise wird ein mildes Reduktionsmittel, wie z. B. Natriumcyanoborwasserstoff, dem verdünnten Gemisch zugesetzt, um die Reduktion der zwischen den reaktiven Aldehydgruppen auf dem oxidierten Biomolekül und den aminofunktionellen Gruppen auf dem Polysiloxanüberzug auf der Substratoberfläche zu bewirken. Die zu behandelnde Substratoberfläche wird dann mit dem verdünnten Gemisch über eine geeignete Zeit und bei einer geeigneten Temperatur, um die Reaktion abzuschließen, (d. h. zur Anheftung des Biomoleküls) in Kontakt gebracht (z. B. darin eingetaucht oder damit gespült). Diese Zeit kann im Bereich von ungefähr 30 Sekunden bis ungefähr 2 Stunden bei Temperaturen im Bereich von ungefähr 20 °C bis ungefähr 60 °C liegen. Zum Beispiel kann bei Raumtemperatur (d. h. ungefähr 20 °C bis ungefähr 25 °C) das mit dem aminofunktionellen Polydimethylsiloxan beschichtete Substrat zur effektiven Anheftung von Biomolekülen über einen Zeitraum von 30 Sekunden bis 5 Minuten hinweg mit einer Biomoleküllösung gespült werden.
Im Allgemeinen können zu den erfindungsgemäß verwendeten Biomolekülen z. B. gehören: antibakterielle und antimikrobielle Mittel; gerinnungshemmende und antithrombotische Mittel; Thrombozytenmittel; Antiinflammatorika; Enzyme; Katalysatoren; Hormone; Wachstumsfakto ren; Medikamente; Vitamine; Antikörper; Antigene; Nukleinsäuren; Farbstoffe (die als biologische Liganden fungieren); DNA- und RNA-Abschnitte; Proteine und Peptide. Die Biomoleküle können synthetisch hergestellt oder in der Natur vorkommend sein. Zu diesen Biomolekülen gehören Heparin, Prostaglandin E₁ (PGE1), Ticlopidin, Plasmin, Urokinase, TPA, Polyethylenoxid (PEO) und FUT-175. Heparin behindert die Blutgerinnung, indem es mit Antithrombin III und Thrombin interagiert und so die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin hemmt. Ticlopidin und Prostaglandin E₁ inhibieren die Thrombozytenaktivierung. Plasmin, Urokinase und TPA sind Serinproteasen, die Proteinablagerungen und -netzwerke auflösen. Polyethylenoxid minimiert die Proteinadsorption, und FUT-175 inhibiert die Kontaktaktivierung.
Zu den Substraten, die durch das erfindungsgemäße Verfahren modifiziert werden können, gehören Materialien, die in den Körperflüssigkeiten im Wesentlichen unlöslich sind, und die im Allgemeinen so konstruiert und entworten sind, dass sie im oder auf dem Körper oder im Kontakt mit Körperflüssigkeiten platziert werden. Die Substrate haben vorzugsweise diejenigen physikalischen Eigenschaften wie Stärke, Elastizität, Permeabilität und Flexibilität, die erforderlich sind, um gemäß dem beabsichtigen Zweck zu funktionieren; sie können leicht gereinigt, hergestellt und sterilisiert werden; und sie behalten ihre physikalischen Eigenschaften und Funktionen während des Zeitraums, währenddessen sie in dem Körper implantiert sind oder in Kontakt mit ihm stehen, im Wesentlichen bei. Zu den Beispielen solcher Substrate gehören: Metalle wie Titan und Titanlegierungen, TiNi (Formgedächtnislegierung, Superelastizität), Aluminiumoxid, Platin und Platinlegierungen, rostfreie Stähle, MP35n, Elgiloy, Haynes 25, Stellit, pyrolytischer Kohlenstoff, Silber oder glasiger Kohlenstoff; Polymere wie z. B. Polyurethane, Polycarbonate, Silikonkautschuk, Polyolefine einschließlich von Polyethylenen oder Polypropylenen, Polyvinylchloride, Polyether, Polyester, Nylons, Polyvinylpyrrolidone, Polyacrylate und Polymethacrylate wie z. B. Polymethylmethacrylate (PMMA), n-Butylcyanoacrylat, Polyvinylalkohol, Polyisoprene, Gummi, Zellulosederivate, Polyvinylidenfluorid (PVDF), Polytetrafluorethylen, Ethylentetrafluorethylencopolymer (ETFE), Acrylnitrilbutadienethylen, Polyamid, Polyimid, Styrol, Acrylnitril und dergleichen; Minerale oder Keramiken wie z. B. Hydroxyapatit; menschliches oder tierisches Protein oder Gewebe wie z. B. Knochen, Haut, Zähne, Kollagen, Laminin, Elastin oder Fibrin; organische Materialien wie z. B. Holz, Zellulose oder komprimierter Kohlenstoff; und andere Materialien wie z. B. Glas oder dergleichen. Unter Verwendung dieser Materialien hergestellte Substrate können beschichtet oder unbeschichtet, derivatisiert oder nichtderivatisiert sein, bevor sie mit dem aminofunktionellen Polysiloxan beschichtet werden.
Zu den medizinischen Geräten, in die das erfindungsgemäße biokompatible Material integriert werden kann, gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, chirurgische Implantate, Prothesen und beliebige Teile oder Geräte, die einen Teil eines lebenden Körpers ersetzen oder erweitern oder die mit Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, in Kontakt kommen. Die Substrate können jede beliebige Form oder Gestalt haben, einschließlich von Röhren, Platten, Stäben und passend geformten Artikeln. Verschiedenartige erfindungsgemäß verwendbare medizinische Geräte und Ausrüstungsgegenstände sind aus dem Stand der Technik bekannt. Zu den Beispielen für Geräte gehören Katheter, Nahtmaterial, Röhren- und Fasermembranen. Zu den Beispielen für Katheter gehören Zentralvenenkatheter, Thoraxableitungskatheter und Ballonkatheter für die Angioplastie. Zu den Beispielen von Röhren gehören die für den extrakorporalen Blutkreislauf verwendeten Röhrensysteme, wie z. B. Blut-Oxygenatoren. Zu den Beispielen für Membranen gehören Polykarbonatmembranen, Hämodialysemembranen und zur Diagnose oder in biosensorischen Geräten verwendete Membranen. Es gehören auch Geräte hierzu, die bei der Diagnose verwendet werden, ebenso Polyestergarn-Nahtmaterial wie Polyethylenband und Polypropylen-Hohlfasermembranen.
Zu den weiteren Illustrationen medizinischer Geräte gehören folgende: Autotransfusionsgeräte, Blutfilter, Blutpumpen, Bluttemperatursonden, Knochenwachstumsstimulatoren, Atmungskreislaufanschlüsse, Bulldog-Klammern, Kanülen, Transplantate, implantierbare Pumpen, Implantate für Impotenz und Inkontinenz, intraokuläre Linsen, Anschlüsse, Anschlussadapter, Anschlussverbindungen, Nasenknöpfe, Augapfelimplantate, Herzisolationspolster, Herzumhüllungen, Klemmen, Abdeckungen, Dialatoren, Dialysevorrichtungen, Einweg-Temperatursonden, Kuppeln, Drainageprodukte, Draperien, Ohrdochte, Elektroden, Emboliegeräte, Ösophagus-Stethoskope, Vorrichtungen zur Fixierung von Brüchen, Handschuhe, Führungsdrähte, Hämofiltrationsgeräte, Naben, intraarterielle Blutgassensoren, intrakardiäre Sauggeräte, intrauterine Druckgeräte, Nasenscheidewandschienen, Nasentampons, Nadeln, ophthalmische Geräte, PAP-Abstrichbürsten, periodontale Faseradhäsiva, Pessarien, Retentionsmanschetten, Platten, Klammern, Magenzugänge, chirurgische Instrumente, Messfühlerprotektoren, Harnröhrenstents, vaginale Kontrazeptiva, Klappen, Gefäßschleifen, Wasser- und Salzwasserblasen, Hüftgelenkskapseln, Annuloplastieringe, Aorta- und Herzkranzgefäß-Lokatoren, künstliche Bauchspeicheldrüsen, Batterien, Knochenzement, Brustimplantate, Herzmaterialien wie Gewebe, Filze, Geflechte, Flicken, Zement-Platzhalter, Cochlearimplantate, Defibrillatoren, Generatoren, orthopädische Implante, Schrittmacher, Patellaknöpfe, Penisimplantate, Pledgets, Stecker, Zugänge, prothetische Herzklappen, Platten, Shunts, Nabelband, mit Klappen versehene Leitungen und Gefäßzugänge.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in besonderem Maße auf Stents anwendbar. Zum Beispiel kann ein Stent, der ein dem Lumen exponierte Oberfläche hat, bereitgestellt werden, wobei diese Oberfläche eine Beschichtung besitzt, die das Reaktionsprodukt eines aminofunktionellen Polysiloxans und eines Biomoleküls umfasst.
Der Ausdruck „Stent" bezeichnet ein beliebiges Gerät, das durch einen Katheter abgegeben werden kann. 1 ist eine Illustration eines Stents 10 (um einen Ballon 15 herum darge stellt), der erfindungsgemäß mit dem aminofunktionellen Polysiloxan und Biomolekül behandelt worden ist. Der Stent 10 umfasst die die Gefäßwand kontaktierende Oberfläche 12 und eine dem Lumen exponierte Oberfläche (nicht dargestellt). Wo der Stent insgesamt als röhrenartige Struktur geformt ist, einschließlich einer diskontinuierlichen Röhre oder einer ringartigen Struktur, ist die die Gefäßwand kontaktierende Oberfläche die äußere Oberfläche der Röhre, und die dem Lumen exponierte Oberfläche ist die innere Oberfläche der Röhre. Wenn der Stent an seinem Platz ist, steht die äußere Oberfläche in Kontakt mit einem Teil einer Wand eines Gefäßes, und die innere Oberfläche steht mit Blut in Kontakt. Der Stent 10 ist mit dem aminofunktionellen Polysiloxan, mit einem Biomolekül verbunden, beschichtet, wodurch die blutkompatible Oberfläche 14 gebildet wird. Typischerweise sind sowohl die die Gefäßwand kontaktierende Oberfläche 12 als auch die dem Lumen exponierte Oberfläche mit dem aminofunktionellen Polysiloxan und Biomolekülen beschichtet, obwohl es in Abhängigkeit von den zur Herstellung des Stents verwendeten Materialien lediglich notwendig sein kann, die dem Lumen exponierte Oberfläche zu beschichten. Der Ballon 15 wird angrenzend an die dem Lumen exponierte Oberfläche des Stents positioniert, um die Abgabe des Stents zu ermöglichen.
Zu anderen geeigneten Stents gehören ein verformbarer Metalldraht-Stent, der als Stent-Rahmen verwendbar ist, wie z. B. der in US-A-4 886 062, wo bevorzugte Verfahren zur Herstellung eines Draht-Stents offenbart werden, beschriebene Stent (Wiktor). Zu anderen verwendbaren metallischen Stents gehören die in US-A-4 733 655 (Palmaz) und US-A-4 800 882 (Gianturco) beschriebenen Stents. Zu anderen geeigneten Stents gehören der Palmaz-Schatz-Herzkranzgefäß-Stent (Johnson & Johnson Interventional, Warren, NJ) und aus Formgedächtnismetallen hergestellte Stents wie z. B. selbstexpandierende Nitinostents, einschließlich des unter dem Handelsnamen CARDIOCOIL von Medtronic, Eden Prairie, MN erhältlichen und in US-A-5 372 600 offenbarten Stents. Zur erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugte Stents sollten flexibel sein, um während des Einsetzens Gefäße zu durchqueren, ferner biokompatibel und imstande, sich verlässlich auszudehnen und in die Gefäßwand einzubetten.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch in besonderem Maße auf Blutgasaustauschgeräte anwendbar, z. B. auf Oxygenatoren. Hierzu gehören sowohl die Blatt- als auch die Röhrenform von Membranoxygenatoren, wie sie aus dem Stand der Technik wohlbekannt sind. In einem Membranoxygenator wird das Blut vom direkten Kontakt mit dem Sauerstoff spendenden Gas durch eine Membran getrennt, die in einem hohlen Gehäuse untergebracht ist. Diese Membran ist mikroporös oder semipermeabel, d. h. imstande, den Durchtritt von Kohlendioxid und Sauerstoff zu erlauben, während sie gleichzeitig das Blut daran hindert, selber hindurch zu treten.
Gegenwärtig existieren zwei Arten von Membranoxygenatoren. Eine Art, als Flachplatten-Membranoxygenator bezeichnet, verwendet eine oder mehrere dünne, flache Blätter mikroporöser Membran. In der einfachsten Form besitzt der Flachplattenoxygenator ein einzelnes Blatt mik roporöser Membran, das in einem Gehäuse eingesiegelt ist, so dass es in dem Gehäuse ein erstes Kompartiment (das „Blutkompartiment") für den Blutstrom und ein zweites Kompartiment (das „Gaskompartiment") für den Durchstrom eines oxygenierenden Gases bereitstellt. Jedes der Kompartimente ist mit einer Zustromöffnung und einer Ausstromöffnung versehen. Das Blut strömt in das Blutkompartiment hinein und aus ihm hinaus, und das oxygenierende Gas fließt in das Gaskompartiment hinein und aus ihm hinaus. Sauerstoff geht von dem oxygenierenden Gas über die Membran in das durch das Blutkompartiment fließende Blut über. Kohlendioxid geht von dem einströmenden Blut über die Membran über, um von dem oxygenierenden Gas mitgerissen zu werden. Das ausströmende Blut, jetzt an Kohlendioxid verringert und mit Sauerstoff angereichert, wird in den Patienten zurückgeleitet. Die Membran kann dadurch blutkompatibel gemacht werden, dass man die gesamte Oberfläche der Membran einer geeigneten aminofunktionellen Polysiloxanverbindung aussetzt; sie durch Spülen dieser Oberfläche mit feuchter Luft zur Entfernung von Lösungsmitteln und überschüssiger Verbindung trocknet; und sodann über einen Zeitraum einem Biomolekül aussetzt, der ausreichend ist, das Biomolekül an das Silikon zu koppeln und eine biokompatible Membran zu bilden.
Die andere Art eines Membranoxygenators wird als Hohlfaseroxygenator bezeichnet und ist in US-A-4 239 729 (Hasegawa et al.) dargestellt. Ein Hohlfaseroxygenator verwendet eine große Anzahl (typischerweise mehrere Tausend) von mikroporösen oder semipermeablen Hohlfasern, die in einem Gehäuse untergebracht sind. Diese Hohlfasern sind in die abschließenden Wände des Gehäuses eingebettet; die abschließenden Wände sind dann mit Verschlusskappen mit Dichtlippen ausgestattet. Eine Endkappe ist mit einer Einströmöffnung und die andere mit einer Ausströmöffnung versehen. In dem Oxygenator nach Hasegawa et al. sind die Hohlfasern so in dem Gehäuse angeordnet, dass ihre Längsachsen insgesamt parallel zur Längsachse des Gehäuses verlaufen. Bei diesem Gerät tritt das Blut durch die Einlassöffnung der Kappe am einen Ende ein, strömt durch die Lumina der Hohlfasern und verlässt das Gerät durch die Kappe am anderen Ende. Das oxygenierte Gas tritt in das Gerät durch die Einlassöffnung in der Außenwand in der Nähe eines Endes des Geräts ein, strömt über die äußeren Oberflächen der Hohlfasern und verlässt das Gerät durch die Auslassöffnung in der Außenwand in der Nähe des anderen Endes des Gerätes. Es ist ersichtlich, dass Kohlendioxid von dem in den Hohl-fasern strömenden Blut durch die Faserwände in den Strom des oxygenierenden Gases diffundiert. Gleichzeitig diffundiert Sauerstoff aus dem oxygenierenden Gas, das über die äußeren Oberflächen der Hohlfasern strömt, durch die Wände der Hohlfasern in deren Lumina, um das durch sie fließende Blut zu oxygenieren.
Seit der Entwicklung dieser Art von Oxygenator wurden andere Oxygenatoren, die Hohlfasern umfassen, entwickelt. Diese Oxygenatoren umfassen typischerweise eine Vielzahl von Hohlfasern, die in einem hohlen Gehäuse untergebracht und so angeordnet sind, dass das Blut typischerweise über die Hohlfasern strömt und die Gase typischerweise durch die Hohlfasern strö men. Im Hinblick auf die Richtung des Flüssigkeitsstromes und die Anordnung der Fasern sind viele Konfigurationen möglich. Die Fasern können z. B. linear, kreisförmig oder spiralförmig angeordnet sein, oder sie können in verschiedenen Konfigurationen um ein Kernteil gewunden oder gewickelt sein. Hohlfaser-Membranoxygenatoren sind z. B. in US-A-4 975 247 (Badolato et al.) und US-A-5 395 468 (Juliar et al.) beschrieben.
Zur Verwendung in Oxygenatoren geeignete Hohlfasern werden typischerweise blutkompatibel gemacht, indem man die gesamte Oberfläche (d. h. die innere und die äußere Oberfläche) der Hohlfasern einem geeigneten aminofunktionellen Polysiloxan aussetzt; mit feuchter Luft spült, um das Lösungsmittel und überschüssige Verbindungen zu entfernen; und sie dann über einen Zeitraum hinweg einem Biomolekül aussetzt, der ausreichend ist, das Biomolekül an das Silikon zu koppeln und blutkompatible Hohlfasern zu bilden.
Somit kann auch ein Gerät zur Behandlung von Blut, umfassend:
ein hohles Gehäuse; und
eine in dem Gehäuse untergebrachte Membran;
wobei die Membran mit einer das Reaktionsprodukt eines aminofunktionellen Polysiloxans und eines Biomoleküls umfassenden Beschichtung bereitgestellt wird,
bereitgestellt werden.
Des Weiteren kann ein Gerät zur Behandlung von Blut, umfassend:
ein hohles Gehäuse; und
eine Vielzahl von hohlen Fasern, die in dem Gehäuse untergebracht sind;
wobei die Hohlfasern mit einer das Reaktionsprodukt eines aminofunktionellen Polysiloxans und eines Biomoleküls umfassenden Beschichtung bereitgestellt werden,
bereitgestellt werden.
2A illustriert ein vereinfachtes Diagramm eines Blut-Oxygenators 20, in dem eine Vielzahl von Hohlfasern 22 in dem hohlen Gehäuse 24 untergebracht sind. Dies ist so zu verstehen, dass die Fasern, obwohl in einer linearen Anordnung dargestellt, in einer Vielzahl von Konfigurationen angeordnet sein könnten, einschließlich einer kreisförmigen oder spiralförmige Anordnung, und ebenso auch um einen Kern oder dergleichen gewunden sein könnten. Die Fasern werden von dem Gehäuse 24 gestützt. Die Blutstromeinlassöffnung 28 erlaubt den Durchstrom von Blut durch die Fasern 22. Das Blut strömt durch die Fasern und durch die Blutstrom-Auslassöffnung 29 hinaus. Obwohl diese Figur den Blutstrom durch die Fasern darstellt, ist es so zu verstehen, dass, in Abhängigkeit von den gewünschten Merkmalen des Oxygenators, das Blut entweder durch die Hohlfasern hindurch oder über sie hinweg strömen kann. 2B illustriert schematisch die durch die oder über die erfindungsgemäß mit einer Beschichtung 36 versehenen Hohlfasern möglichen Blutstrommuster. Gas (z. B. Sauerstoff) strömt über die Gas einlassöffnung 31 in das Gehäuse 24. Das Gas strömt über die Fasern und aus dem Gehäuse 24 durch die Gasauslassöffnung 32 hinaus.
Das Verfahren und die Materialien der Erfindung werden jetzt weiter durch Illustration unter Bezug auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele und die sie begleitenden Zeichnungen dargestellt, wobei:
1 eine schematische Illustration eines Stents ist;
2 eine schematische Illustration eines Blut-Oxygenators ist;
3 ein Diagramm der TAT-Komplex-Bildung (in ng/ml; n = 3) zeigt, nachdem heparinisiertes (1 IU/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang verschiedenen behandelten und unbehandelten LDPE-Oberflächen ausgesetzt worden war;
4 ein Diagramm der Freisetzung von Plättchenfaktor 4 zeigt (in IU/ml), nachdem heparinisiertes (1 IU/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang verschiedenen behandelten und unbehandelten LDPE-Oberflächen ausgesetzt worden war;
5 elektronenmikroskopische Aufnahmen von blutexponierten Polyethylenoberflächen zeigt: (a) unmodifizierte Oberfläche; (b) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtete Oberfläche; (c) mit aminofunktionalisierten Polysiloxan beschichtete und mit Heparin gekoppelte Oberfläche;
6 die Bildung von SC5b-9-Komplexen (in ng/ml; n = 3) zeigt, nachdem heparinisiertes (1 IU/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang verschiedenen behandelten und unbehandelten LDPE-Oberflächen ausgesetzt worden war;
7 die Bildung von PMN-Elastase (in ng/ml) zeigt, nachdem heparinisiertes (1 IU/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang verschiedenen behandelten und unbehandelten LDPE-Oberflächen ausgesetzt worden war.
Obwohl die nachfolgend beschriebenen Beispiele eine Behandlung auf Polymerfilm oder Gewebekulturplatten als Substratoberflächen involvieren, ist die Erfindung nicht als hierauf beschränkt zu verstehen.
Beispiele
Immobilisierung eines Biomoleküls
Unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe wurden die Innenoberflächen einer Röhre aus Niederdruckpolyethylen (LDPE) (Goodfellow, Cambridge, England; Länge 5 m, Wandstärke 1,1 mm, Außendurchmesser 6,4 mm) fünf Minuten lang durch Rezirkulation von 100 ml Isopropylalkohol (IPA) gereinigt. Nachdem der IPA aus der Röhre abgesaugt worden war, wurde das Innenlumen ungefähr 10 Minuten lang vorsichtig mit Luft gespült.
Das Beschichtungsverfahren wurde fortgesetzt, indem man 100 ml einer Lösung von 1,5 Gew.-% von aminofunktionellem Polydimethylsiloxan (MDX4-4159, von Dow Corning, Midland, Michigan, USA, erhältlich) in Hexan (Merck, Darmstadt, Deutschland) 60 Sekunden lang durch die Röhre pumpte. Das Innenlumen der Röhre wurde zwei Stunden lang unter Umgebungsbedingungen mit feuchter Luft (relative Luftfeuchte = 50 ± 10 %) gespült.
Eine Periodat-Heparin-Stammlösung wurde am Tag, bevor die Heparinkopplung durchgeführt wurde (mindestens 16 Stunden zuvor), hergestellt. Licht wurde aus dem Reaktionsgefäß ausgeschlossen. Heparin-Natrium (5 mg/ml) (von Diosynth, Oss, Niederlande, erhältlich) wurde mit 0,165 mg/ml NaIO₄ (von Aldrich, Bornem, Belgien) in einem 0,05 M Phosphatpuffer (pH = 6,88; 0,025 M Na₂HPO₄ und 0,025 M KH₂PO₄; beide von Merck erhältlich) gemischt.
Die Heparinkopplung erfolgte, indem man 100 ml einer aus 40 Vol.-% der Periodat-Heparin-Stammlösung und 60 Vol.-% eines 0,4 M Azetatpuffers, pH = 4,66 (0,2 M Eisessigsäure, 0,2 M Natriumazetat; beide von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA, erhältlich) hindurchpumpte. Nach einer ungefähr 10 Minuten langen Rezirkulation wurde 0,1 mg/ml NaCNBH₃ (Aldrich) zugesetzt. Die Kopplung erfolgte 2 Stunden lang bei 50 °C. Danach wurde das Innenlumen mit deionisiertem Wasser gespült, wonach eine 1 M NaCl (Merck)-Lösung 10 Minuten lang durchgepumpt wurde, wonach das Innenlumen abermals mit deionisiertem Wasser gespült wurde. Schließlich wurde überschüssiges Wasser aus der Röhre abgesaugt, und die Röhre wurde unter Umgebungsbedingungen 16 Stunden lang mit Luft durchspült.
Überprüfung mit Blut
Überprüfung mit Blut in einer dynamischen Schleife
Kontroll- und oberflächenmodifizierte LDPE-Rohrstücke von jeweils 50 cm wurden einzeln zu Schleifen geschlossen, indem die Enden mit einem 2 cm langen Tygon-Rohr (Cole Palmer Nr. 6408-03) verbunden wurden; das Tygon-Rohr wurde so montiert, dass es nicht in Kontakt mit dem Blut kam. Danach wurden die Schleifen mit einer 0,9 Gew.-% NaCl-Lösung gefüllt.
Eine 10 ml Spritze wurde mit frisch abgenommenem menschlichem Blut (1 IU/ml Heparin) gefüllt, und danach wurde das Blut in die Schleife gefüllt (das Endvolumen der Schleife beträgt ungefähr 6,3 ml), wodurch die Salzlösung verdrängt wurde. Die geschlossenen Schleifen wurden auf horizontal ausgerichteten Acrylscheiben in einen gewärmtes (37 °C) 0,9 Gew.-% NaCl enthaltenden Tank fixiert. Der Blutstrom wurde durch motorisierte schrittweise Rotation (in der horizontalen Ebene) der Acrylscheiben ausgelöst. Nach 90 Minuten wurde das Blut in EDTA enthaltende Gefäße abgenommen. Die Gefäße wurden 10 Minuten lang bei 1500 g (bei 4 °C) zentrifugiert, um das Plasma zu erhalten, wonach Aliquots von 100 μl bis zur weiteren Analyse bei –20 °C eingefroren wurden.
Untersuchung mit dem Rasterelektronenmikroskop
Nach der Untersuchung mit Blut wurde ein 2 cm-Stück von der Röhre entfernt und 3 mal mit Phosphatpuffer, pH = 7,4, gespült, wonach die Röhrenstücke in 2 ml Polypropylengefäßen, enthaltend 2,5 % Glutaraldehyd, bei ungefähr 4 °C gelagert wurden. Die abschließende Präparation der Probe umfasste es, die Rohrproben einer Reihe abgestufter Ethanol/Wasser-Gemische auszusetzen, um das Wasser zu entfernen, wonach sie nach dem Critical-Point-Verfahren getrocknet und mit Gold überzogen wurden. Die Elektronenmikroskopie fand unter Verwendung eines JEOL JSM 6301F statt. In allen Proben wurde eine Oberfläche von ungefähr 1 cm² untersucht.
Untersuchung der Bildung des Thrombin-Antithrombin III-Komplexes (TAT)
Typischerweise wurde das Blut auf gebildeten TAT-Komplex gemäß dem mit dem Reagenzien-Kit zur Bestimmung von menschlichem Thrombin/Antithrombin III-Komplex bereitgestellten Protokoll (ENZYGNOST TAT Micro; Behringwerke AG Diagnostica, Marburg, Deutschland, Produkt Nr. OWMG 15) untersucht. In diesem Protokoll wurde das Blut nach der Inkubation abgezapft und den Näpfen einer Mikrotiterplatte zugesetzt, die mit dem Antikörper gegen Thrombin beschichtet waren; in der Probe vorliegendes TAT bindet dann an die Antikörper. In einer zweiten Reaktion binden sich Peroxidase-konjugierte Antikörper gegen menschliches AT III an das AT III des Komplexes. Danach werden das Chromogen o-Phenyldiaminhydrochlorid und dann Wasserstoffperoxid zugesetzt. Die enzymatische Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und dem Chromogen wird durch die Zugabe verdünnter schwefliger Säure beendet, nach welcher die optische Dichte bei 492 Nanometern (nm) gemessen wird.
Enzym-Immunassay für SC5b-9 (TCC)
Typischerweise wurde das Blut gemäß dem mit dem Reagenzien-Kit zur Bestimmung des SC5b-9-Komplexes (QUIDEL SC5b-9 (TCC) Enzymimmunoassay; Quidel, San Diego, CA, USA) bereitgestellten Protokoll auf gebildeten terminalen Komplementkomplex (TCC) untersucht. In diesem Protokoll wird das Blut nach der Inkubation abgezapft und Mikrotiterplatten zugesetzt, die mit dem monoklonalen Antikörper gegen den SC5b-9-Komplex beschichtet wa ren. Das eingefangene SCSb-9 wird anschließend mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Antikörpern detektiert, die an die Antigene des SC5b-9-Komplexes binden. In einem dritten Schritt wird ein chromogenes Enzymsubstrat (2-2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolen-Sulfonsäure)-Diammoniumsalz) zugesetzt; dieses Salz reagiert mit dem HRP-Konjugat und bildet eine grüne Farbe. Die enzymatische Reaktion wird durch die Zugabe von Oxalsäure beendet, und anschließend wird die optische Dichte bei 405 nm gemessen.
Messung der Elastasebildung
Typischerweise wurde das Blut gemäß dem mit dem Reagenzien-Kit zur Bestimmung von PMN-Elastase (Merck, Darmstadt, Deutschland; Produkt Nr. 12589) bereitgestellten Protokoll auf gebildete Elastase untersucht. In diesem Protokoll wird Blut nach der Inkubation abgezapft und in Näpfen von Mikrotiterplatten zugesetzt, die mit dem Antikörper gegen menschliche granulozytische Elastase beschichtet waren; der vorliegende PMN Elastase-α₁-Proteinaseinhibitor-Komplex bindet dann an die Antikörper. In einem zweiten Schritt werden mit alkalischer Phosphatase markierte Antikörper zugesetzt, die an das α₁-PI-Ende des Komplexes binden. Danach wird das Chromogen 4-Nitrophenylphosphat zugesetzt. Die enzymatische Reaktion wird durch die Zugabe von NaOH beendet, wonach die optische Dichte bei 405 nm gemessen wird.
Enzym-Immunoassay des Plättchenfaktors 4
Typischerweise wurde das Blut gemäß den mit dem Reagenzien-Kit (ASSERACHROM PF4 Enzymimmunoassay, Diagnostica Stago, Asnières-sur-Seine, Frankreich) bereitgestellten Protokoll auf gebildetem Plättchenfaktor 4 (PF4) untersucht. In diesem Protokoll wird Blut nach der Inkubation abgezapft und in Näpfen von Mikrotiterplatten zugesetzt, die mit dem Antikörper gegen den PF4 beschichtet waren. Das eingefangene PF4 wird anschließend mit Anti-PF4-Peroxidase detektiert, die an die freien Antigene der Terminanten des PF4 binden. In einem dritten Schritt wird ein Chromogen des Enzymsubstrats (Ortho-phenylendiaminhydrochlorid) zugesetzt, dann Wasserstoffperoxid. Die enzymatische Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und dem Chromogen wird durch die Zugabe von verdünnter schwefliger Säure beendet, wonach die optische Dichte bei 492 nm gemessen wird.
Ergebnisse
Die heparinisierte aminofunktionelle polysiloxanbeschichtete PE-Oberfläche erhöht eindeutig die Hämokompatibilität der Oberfläche und verringert ihre Entzündungsneigung.
3 zeigt ein Diagramm der Thrombin-Antithrombin (TAT)-Komplexbildung (in ng/ml; n = 3), nachdem heparinisiertes (1 IU/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang LDPE-Oberflächen ausgesetzt worden war: (a) nicht-modifiziert; (b) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtet; und (c) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtet und mit Heparin gekoppelt. Die Thrombinbildung ist die Folge einer Serie von Reaktionen, die von dem Kontakt zwischen dem Blut und einer fremden Oberfläche in Gang gesetzt wird. Thrombin selbst wird durch den Proteaseinhibitor Antithrombin III schnell deaktiviert, so dass es nicht detektierbar sein kann; jedoch zeigt die Menge des stabilen Thrombin-Antithrombin III (TAT)-Komplexes, wie viel Thrombin gebildet worden ist. Die heparinisierte aminofunktionelle Polydimethylsiloxan-beschichtete Oberfläche der vorliegenden Erfindung zeigte eine erhebliche Verringerung der Thrombinbildung, wie durch das TAT-Assay gemessen.
4 zeigt ein Diagramm der Freisetzung von Plättchenfaktor 4 (in IU/ml), nachdem heparinisiertes (1 IU/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang LDPE-Oberflächen ausgesetzt worden war: (a) nicht-modifiziert; (b) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtet; und (c) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtet und mit Heparin gekoppelt. Die Thrombozyten-Hyperaktivität führt zur Freisetzung der Inhaltsstoffe der α-Granulen, insbesondere der thrombozytenspezifischen Proteine: β-Thromboglobulin und Plättchenfaktor 4 (PF4). Diese Thrombozytenaktivierung kann sich aus der Interaktion mit künstlichen Oberflächen ergeben, aber auch gebildetes Thrombin spielt bei der Aktivierung der Thrombozyten eine wichtige Rolle. PF4 unterstützt wiederum das gebildete Thrombin bei der Verhinderung der Zusammenlagerung von Heparin mit Antithrombin III, wodurch es einer wirksamen Inaktivierung des Thrombins im Wege steht. Es wurde gezeigt, dass die beschichteten Oberflächen weniger stark thrombozytenaktivierend waren, wie im PF4-Assay gemessen, wobei die heparinisierte Oberfläche die thrombozytenfreundlichste Oberfläche war.
5 zeigt elektronenmikroskopische Bilder blutexponierter Polyethylenoberflächen: (a) nicht-modifiziert; (b) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtet; und (c) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtet und mit Heparin gekoppelt. Die Thrombozytenadhäsion ist das erste Ereignis, das bei der Thrombusbildung stattfindet. Die adhärierenden Thrombozyten werden prokoagulant, d. h. die äußere Membran dient als ein Ort, an dem sich die enzymatischen Gerinnungskomplexe zusammensetzen. In Abwesenheit solcher Oberflächen setzt sich die Blutgerinnung nicht fort. Daher ist die Thrombozytenadhäsion ein empfindlicher Parameter bei der Bewertung der thrombogenen Eigenschaften einer künstlichen Oberfläche. Die Thrombozytenadhäsion wurde durch eine elektronenmikrospkopische Analyse der blutexponierten Oberflächen untersucht. Während die Kontroll-LDPE-Oberfläche ungefähr 15 % Oberflächenbedeckung mit Thrombozyten (was weniger als üblich ist) zeigte, mit offenbarer Gegenwart aktivierter und ausgebreiteter Thrombozyten (5a); verringerte die aminofunktionalisierte polysiloxanbeschichtete LDPE-Oberfläche die Thrombozytenadhäsion in erheblichem Maß: Es wurde weniger als 1 % Oberflächenbedeckung beobachtet, ohne erkennbare aktivierte oder ausgebreitete Thrombozyten (5b). Eine zusätzliche Kopplung mit Heparin zeigte die gleichen günstigen Ergebnisse (5c). Die beobachtete Senkung adhärierender Thrombozyten zeigt, dass die mit heparinisierten Polysiloxan beschichteten Oberflächen weniger thrombogen sind, was wiederum mit den Befunden der anderen Tests übereinstimmt.
6 zeigt ein Diagramm der Bildung von SC5b-9-Komplexen (in ng/ml; n = 3), nachdem heparinisiertes (1 IU/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang LDPE-Oberflächen ausgesetzt worden war: (a) nicht-modifiziert; (b) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtet; und (c) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtet und mit Heparin gekoppelt. Das Komplementsystem umfasst ungefähr 20 Proteine, die im Blutstrom zirkulieren. Der terminate Komplementkomplex (TCC) wird durch die Zusammenlagerung von C5 bis C9 infolge der Aktivierung des Komplementsystems entweder durch den klassischen oder durch den alternativen Weg gebildet. Der Membranangriffskomplex (MAC), der eine Form des TCC ist, ist ein stabiler Komplex und vermittelt den irreversiblen Schaden an den Zielzellmembranen, der mit der Komplementaktivierung einhergeht. In Abwesenheit einer Zielmembran gebildete Komplexe binden an ein natürlich vorkommendes S-Protein. Das S-Protein bindet an die entstehenden C5b-9-Komplexe im C5b-7-Schritt der Zusammenlagerung. Der SC5b-9-Komplex ist die lösliche, nicht-lytische Form des TCC. Die Resultate, die erhalten wurden, nachdem Blut den (nicht-) modifizierten LDPE-Oberflächen ausgesetzt worden war, zeigen, dass die Oberflächenmodifikation als solche die Komplementaktivierung verringert hatte; jedoch in erheblich größerem Maße mit der zusätzlichen Heparinkopplung (siehe 6). Diese Ergebnisse sind in Anbetracht der möglichen Produktanwendung dieser Beschichtung, z. B. in kardiopulmonären Bypass-Systemen, als sehr günstig anzusehen.
7 zeigt ein Diagramm der PMN-Elastase-Bildung (in ng/ml), nachdem heparinisiertes (1 l U/ml) menschliches Blut 90 Minuten lang verschiedenen behandelten und unbehandelten LDPE-Oberflächen ausgesetzt worden war: (a) nicht-modifiziert; (b) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtet; und (c) mit aminofunktionalisiertem Polysiloxan beschichtet und mit Heparin gekoppelt. Elastase, eine neutrale Proteinase, die in peripheren Granulozyten enthalten ist, ist ein weiterer Marker, der mit der materialbezogenen entzündlichen Antwort in einem engen Verhältnis steht. Es ist bekannt, dass eine starke und andauernde entzündliche Reaktion einen Anstieg der stationären mRNA-Spiegel für IL-1, TNF und bestimmte andere Zytokine in den peripheren Blutmonozyten auslöst, was potentiell zum Versagen entfernter Organe oder sogar zum Tode führen kann. In diesem Hinblick ist die beobachtete Senkung der Elastase-Bildung bei den MDX-Oberflächen einschließlich der heparinisierten MDX-Oberflächen als sehr günstig anzusehen (7).

Claims

Verfahren zur Herstellung eines medizinischen Gerätes mit einem auf einer Substrat-Oberfläche immobilisierten Biomolekül, wobei man: (a) die Substrat-Oberfläche mit einer Lösung eines aminofunktionellen Polysiloxans beschichtet und die aminofunktionelle Polysiloxan-Lösung durch Spülen der Oberfläche mit feuchter Luft trocknet, wobei man eine beschichtete Oberfläche mit Amin-Funktionen erhält; und (b) die beschichtete Oberfläche mit einem Biomolekül in Kontakt bringt, wobei man eine bioverträgliche Oberfläche erhält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei man im Schritt (a): die Substrat-Oberfläche mit einem aminofunktionellen Polysiloxan in einem flüssigen Träger beschichtet; den flüssigen Träger entfernt, wobei man eine aminofunktionelle Polysiloxan-Beschichtung erhält; und die Beschichtung mit Wasser in Kontakt bringt, wodurch die Beschichtung gehärtet wird, wobei man den flüssigen Träger entfernt und die Beschichtung mit Wasser in Kontakt bringt, indem man die Substrat-Oberfläche mit feuchter Luft spült.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei man im Schritt (b) die mit dem aminofunktionellen Polysiloxan beschichtete Oberfläche mit einem Biomolekül in einem flüssigen Träger bei einer Temperatur von mindestens 20° C für mindestens 30 Sekunden in Kontakt bringt.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der flüssige Träger ein Periodat in einer gepufferten wässrigen Lösung umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das Periodat ein Alkalimetall-Periodat umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei die gepufferte wässrige Lösung einen pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 8 hat.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Biomolekül Heparin umfasst und das Periodat in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um Aldehydgruppen am Heparin zu erzeugen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Biomolekül ein antibakterielles Mittel, ein antimikrobielles Mittel, ein Gerinnungshemmer, ein Antithrombosemittel, ein Thrombozyten-Mittel, ein Entzündungshemmer, ein Enzym, ein Katalysator, ein Hormon, ein Wachstumsfaktor, ein Medikament, ein Vitamin, ein Antikörper, ein Antigen, eine Nukleinsäure, ein Farbstoff, ein DNS-Segment, ein RNS-Segment, ein Protein oder ein Peptid ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und 8, wobei das Biomolekül ein synthetisch derivatisiertes oder natürlich vorkommendes ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Substrat ein Metall, ein Polymer, eine Keramik oder Glas ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das medizinische Gerät ein Stent oder Blut-Oxygenator ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das medizinische Gerät ein Blut-Oxygenator ist und das beschichtete Substrat Hohlfasern umfasst.
Medizinisches Gerät, erhältlich durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12.