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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung liegt auf dem Gebiet der spektralen Kalibrierung von Fluoreszcnz-basierten
automatisierten Instrumenten zur Bestimmung von Polynukleotidlängen.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
spektrale Kalibrierung soll Referenz-Spektralprofile (Referenzspektren)
von bestimmten fluoreszierenden Farbstoffen, unter Verwendung des
optischen Messsystems eines automatisierten DNA Sequenzierers oder
einer ähnlichen Auftrennungsvorrichtung
für fluoreszierende
Polynukleotide bei der bestimmte Farbstoffe verwendet werden, abschätzen. Die
bisherige Praxis der spektralen Kalibrierung ist auf die separate
Messung der spektralen Profile jedes einzelnen fluoreszierenden
Farbstoffes angewiesen. Dieser Ansatz zur spektralen Kalibrierung
von Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide
resultiert in einem reduzierten Durchsatz, da er N Spuren bei gel-basierten Instrumenten
benötigt
und N einzelne Läufe
bei Kapillar-basierten Instrumenten benötigt. Da weitere fluoreszierende
Farbstoffe routinemäßig entwickelt
und verwendet werden (es wird von einem ansteigendem N ausgegangen),
wird die spektrale Kalibrierung von Vorrichtungen zur Auftrennung
fluoreszierender Polynukleotide anspruchsvoller und, unter der bisherigen
Praxis, immer weniger effizient. Zusätzlich steigt der Umfang der
Computer Ressourcen, die der spektralen Kalibrierung gewidmet sind,
ebenfalls mit der Anzahl der Farbstoffe und der analysierten Auftrennungskanäle.
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Zusammenfassung
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Die
Erfindung bezieht sich auf Verfahren wie in den Ansprüchen definiert.
Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide, wie
automatisierte DNA Sequenzierer, müssen für die Verwendung mit den unterschiedlichen
fluoreszierenden Farbstoffen, die in Verbindung mit der Vorrichtung
zur Auftrennung verwendet werden, spektral kalibriert werden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 ist
ein Diagramm eines Beispiels eines Teils eines temporalen Profils,
welches markiert wurde um Beispiele einiger der hier verwendeten
Begriffe zu geben.
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Definitionen
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Der
Begriff „Vorrichtung
zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide", wie hier verwendet, bezeichnet eine
Vorrichtung zur Auftrennung Polynukleotidmischungen (z.B. durch
Elektrophorese) und Detektion der aufgetrennten Polynukleotide anhand der Fluoreszenzemission,
die durch Anregung des fluoreszierenden Farbstoffes erzeugt wird.
Beispiele für
Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide beinhalten
automatisierte DNA Sequenzierer, wie die PE Applied Biosystems 310
und 377 (Foster City, Kalifornien). Beispiele für Vorrichtungen zur Auftrennung
fluoreszierender Polynukleotide werden auch, unter anderen Stellen,
in den U.S. Patenten Nr. 4,971,677; 5,062,942; 5,213,673; 5,277,780;
5,307,148; 4,811,218; und 5,274,240 beschrieben. Der Begriff Vorrichtung
zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide beinhaltet ebenfalls ähnliche
Instrumente zur Analyse der Länge
von Polynukleotidfragmenten, welche zu der für die Erlangung der DNA Basen
Sequenzinformation benötigte Auflösung von
einzelnen Basenpaaren nicht fähig sind.
Die Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide
umfassen eine oder mehrere Auftrennungsregionen oder -kanäle, typischerweise der
Weg des elektrischen Stromflusses in elektrophoretischen Vorrichtungen
zur Auftrennung. Arten der Auftrennungskanäle beinhalten Kapillare, Mikrokanäle, Röhren, Scheibengele
und ähnliche.
Die Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide
sammeln während
ihres Betriebs verschiedene Typen von Daten. Diese Daten beinhalten
spektrale Daten und zeitliche Daten, die den fluoreszierenden Polynukleotiden,
welche von der Vorrichtung aufgetrennt wurden, zugeordnet sind.
Typischerweise werden solche Daten von einem Detektor (z.B. eine
regelmäßige CCD
Anordnung, eine Photovervielfacherröhre und ähnliche) detektiert, der dazu
ausgelegt ist, quantitative spektrale Daten über einer vorherbestimmte Region
oder Regionen der Auftrennungskanäle zu sammeln. Die von der
Vorrichtung gesammelten spektralen Daten beinhalten die Intensität der Fluoreszenz
bei einer Vielzahl von Wellenlängen.
Die unterschiedlichen abgetasteten Wellenlängen werden als Bins oder Kanäle bezeichnet.
Die Vorrichtung sammelt weiterhin zeitliche Daten, die mit den spektralen
Daten korreliert werden. Die zeitlichen Daten werden zu zahlreichen
verschiedenen Zeitpunkten gesammelt. Zum Beispiel wird ein an einer
festen Position befindlicher Detektor die Zu- und Abnahmen der Fluoreszenzintensität als eine
Funktion der Zeit messen, während
eine markierte Polynukleotidspitze am Detektor vorbeizieht. Diese
zeitlichen Daten können
als „Einzelbild-" oder „Abtastnummer" ausgedrückt werden,
um die unterschiedlichen zeitlichen Abtastpunkte auszudrücken.
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Ein
zeitliches Profil ist eine graphische Darstellung der Intensität eines
spektralen Signals als eine Funktion der Zeit oder Einzelbild-/Abtastnummer.
Ein zeitliches Profil besteht aus systematischen und zufälligen Schwankungen.
Systematische Schwankungen werden durch Höchstwerte, Spitzen und Hintergrunddriften
verursacht. Diese Schwankungen verursachen, dass die Form des Profils
spezifische und häufig
vorhersagbare Veränderungen durchmacht.
Im Gegensatz dazu verursachen zufällige Schwankungen keine spezifischen
oder vorhersagbaren Änderungen
im zeitlichen Profil. Ein zeitliches Profil besitzt Segmente, die
mit der Grundlinie (Grunliniensegment) korrespondieren und Segmente,
die mit Höchstwerten
(Höchstwertsegmente)
korrespondieren und Segmente, die mit Spitzen korrespondieren. Grundlininensegmente
bestehen aus zufälligen
Schwankungen die (einem) Versatzwert(en) überlagert sind.
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Ein
zeitliches Emissionsprofil ist eine graphische Darstellung der Intensität der Signale,
die von einem bestimmten spektralen Kanal/Bin erhalten wurden als
eine Funktion der Zeit oder Abtast-/Einzelbildnummer.
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Ein
totales zeitliches Emissionsprofil ist eine graphische Darstellung
der Summe der Intensitäten der
Signale, die von allen spektralen Kanälen/Bins erhalten wurden als
eine Funktion der Zeit oder Abtast-/Einzelbildnummer.
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Der
analytische Hintergrund eines zeitlichen Profils ist der Durchschnittswert
der entlang eines Segments des Profils erhaltenen Signale, wobei
das Segment keine Höchstwerte,
Spitzen und systematische Schwankungen enthält (z.B. ein Grundliniensegment).
Dieses wird schematisch in 1 veranschaulicht.
Das analytische Rauschen eines zeitlichen Profils ist die Standardabweichung
der entlang eines Segments des Profils erhaltenen Signale, wobei
das Segment keine Höchstwerte,
Spitzen und systematische Schwankungen enthält. Der/das analytische Hintergrund
und Rauschen können
sich als eine Funktion der Zeit entlang des zeitlichen Profils ändern. Dies
tritt dann auf, wenn Hintergrunddriften vorhanden sind.
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Der
Begriff reines analytisches Signal bezieht sich auf die Intensität an einem
beliebigen Punkt eines Profils nach einer Korrektur der Hintergrund-
und Grundlinienversatzwerte und/oder Driften. Das analytische Verhältnis von
Signal zu Rauschen (S/N) ist das Verhältnis des reinen analytischen
Signals zum analytischen Rauschen. Die reinen analytischen Signale
können
oder können
nicht, abhängig
von ihren 5/N's,
signifikant sein.
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Ein
Detektor für
Höchstwerte
ist eine mathematische Transformation eines Profils (z.B. eines zeitlichen
Profils), dessen Zweck es ist, die Höchstwere entlang des Profils
zu lokalisieren. Ein Detektor für
Höchstwerte
ist durch die Art der Transformation und die Detektionsparameter
die mit seiner Operation assoziiert sind definiert. Ein typischer
Detektor für Höchstwerte
unterscheidet aufgrund der Steigung des zeitlichen Profils zwischen
den Segmenten eines Profils, die die Grundlinie (ein Versatzwert
mit zufälligem
Rauschen) repräsentieren
und anderen Segmenten, welche Höchstwerte
und Spitzen repräsentieren.
Aus der Sicht des Detektors für
Höchstwerte ist
ein Grundliniensegment ein Satz von Datenpunkten entlang des zeitlichen
Profils, in dem der Absolutwert der Steigung des Profils nicht den
Schwellenwert des Detektors für
Höchstwerte überschreitet. Ein
idealer Detektor für
Höchstwerte
ignoriert Grundlinien- und Spitzensegmente und hält lediglich die für die Höchstwerte
relevanten Informationen (in unserem Fall die Polynukleotidbestandteile
des multiplen Farbkalibrierungsstandards) zurück.
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Der
Schwellenwert für
die Steigung von Höchstwerten
ist ein Wert welcher, wenn er durch die Steigung eines zeitlichen
Profils überschritten
wird, das Vorhandensein eines potentiellen Höchstwerts anzeigt. Auf diesen
Wert kann als der „Schwellenwert-" Parameter des Detektors
für Höchstwerte
verwiesen werden. Wenn gerade ein Höchstwert vorliegt, wird der
Schwellenwert ebenfalls dazu verwendet anzuzeigen, dass das zeitliche
Profil zu den Grundlinienwerten zurückgekehrt ist und der Höchstwert
vorbei ist.
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Der
Start des Höchstwerts
ist der erste Punkt entlang des Höchstwertsegments eines zeitlichen Profils.
Ein Start des Höchstwerts
kann in den Grundlinienwerten oder im Tal zwischen zwei Höchstwerten gefunden
werden. Das Ende des Höchstwerts
ist der letzte Punkt entlang des Höchstwertsegments eines zeitlichen
Profils. Ein Ende eines Höchstwerts
kann in den Grundlinienwerten oder im Tal zwischen zwei Höchstwerten
gefunden werden. Das Höchstwert Maximum
ist ein Punkt entlang des Höchstwert
Segments eines Profils, an dem die höchste Intensität gefunden
wird. Die Breite des Höchstwerts
ist die Anzahl von Datenpunkten zwischen Start des Höchstwerts
und Ende des Höchstwerts
(siehe 1). Das Attribut der Breite des Höchstwerts
ist zur Unterscheidung von Höchstwerten,
die zu markierten DNA Fragmenten und Spitzen korrespondieren, von
Hilfe. Die letzteren haben relativ kleinere Breiten des Höchstwerts.
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Die
Höhe des
Höchstwerts
am Maximum ist die Intensität
am Maximum des Höchstwerts,
die um den analytischen Hintergrund korrigiert wurde (siehe 1).
Das Höchstwert
S/N Verhältnis
bezieht sich auf das Verhältnis
der Höhe
des Höchstwerts
am Maximum zum analytischen Rauschen des zeitlichen Profils. Das
S/N Attribut eines Höchstwerts
ist ein effektiver Parameter, der verwendet wird, um die Höchstwertinformationen
der farbstoffmarkierten Fragmente oder des multiplen Farbkalibrierungsstandards
zurückzuhalten.
Die Migrationszeit eines Höchstwerts
ist die Zeit, die vom Start der Elektrophorese bis zum Maxinium
des Höchstwerts
vergeht. Ein bestimmter Höchstwert,
der zu einem bestimmten markierten Polynukleotid des multiplen Farbkalibrierungsstandards
korrespondiert, kann als Referenz-Höchstwert dienen, dessen Migrationszeit
einen Referenzpunkt darstellt, von dem aus die Migrationszeiten
von anderen Höchstwerten
gemessen werden.
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Der
Versatzwert der Migrationszeit ist der Unterschied zwischen der
Migrationszeit eines bestimmten Höchstwerts und der Migrationszeit
des Referenz-Höchstwerts
(siehe 1). Höchstwerte zur
linken Seite des Referenz-Höchstwerts
haben negative Versatzwerte der Migrationszeit, während jene
zur rechten Seite des Referenz-Höchstwerts
positive Versatzwerte der Migrationszeit haben. Die Referenz-Höchstwerte
werden basierend auf Rang oder Migrationszeit lokalisiert. In Folge
dessen werden die Versatzwerte der Migrationszeit dazu verwendet,
um alle anderen farbstoffmarkierte Fragmente zu lokalisieren.
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Die
Eingabeparameter sind Attribute, die von einer bestimmten Implementierung
des Algorithmus verwendet werden. Diese Parameter können sowohl spezifisch
für den
verwendeten multiple Farbkalibrierungsstandard sein, als auch für die verwendete Plattform.
Die Attribute der Implementierung können die Breite des Höchstwerts,
die Schwellenwert Variable, das Höchstwert S/N Verhältnis, den
Referenz-Höchstwert
Lokator (Migrationszeit vs Rang), die Versatzwerte der Migrationszeit
und, wenn nötig, die
angemessenen Toleranzen enthalten, um für instrumentelle und experimentelle
Schwankungen aufzukommen.
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Der
Begriff „Polynukleotid", wie hierin verwendet,
bezieht sich auf natürlich
vorkommende Polynukleotide, wie DNA und RNA und auf synthetische Analoge
von natürlich
vorkommender DNA, z.B. Phosphorothioate, Phosphoramidate, Peptid-Nukleinsäuren (PNAs)
und ähnliche.
Der Begriff „Polynukleotid" enthält keine
Limitierung der Länge
und sollte so verstanden werden, als er in vitro synthetisierte Oligonukleotide
mit einschließt.
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Spezifische Ausführungsformen
der Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich auf Verfahren wie in den Ansprüchen definiert.
Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide, wie
automatisierte DNA Sequenzierer, müssen für die Verwendung mit den unterschiedlichen
fluoreszierenden Farbstoffen, die in Verbindung mit der Vorrichtung
zur Auftrennung verwendet werden, spektral kalibriert werden. Eine
spektrale Kalibrierung kann ebenfalls dazu verwendet werden, Schwankungen
zwischen individuellen Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender
Polynukleotide zu berücksichtigen
und Veränderungen,
die sich innerhalb eines gegebenen Instruments über die Zeit ergeben zu berücksichtigen. Fluoreszierende
Farbstoffe haben charakteristische Emissionsspektren für eine gegeben
Excitations-Wellenlänge.
Wenn mehrere unterschiedliche Farbstoffe in einer aufzutrennenden
Mischung vorhanden sind, müssen
die individuellen Beiträge
der verschiedenen Farbstoffe an der ausgelesenen spektralen Detektion
von einander getrennt werden. Solch eine Trennung kann mittels Verwendung
einer Matrix, die die spektralen Emissionsdaten der verschiedenen
Farbstoffe, die für
die Analyse verwendet werden, erreicht werden, siehe Yin et al.,
Electrophoresis 17:1143-1150 (1996) und WO 97/46963. Die Erstellung
einer spektralen Datenmatrix für
die Kalibrierung einer Vorrichtung zur Auftrennung fluoreszierender
Polynukleotide beinhaltet typischerweise die Schritte des Einführens eines
fluoreszierenden Polynukleotid Kalibrierungsstandards in eine Vorrichtungen
zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide, Auftrennung der
markierten Polynukleotide voneinander und Detektion der aufgetrennten
Polynukleotide mit einem Detektor. Der Detektor sammelt spektrale
Informationen, die sich auf die Konzentration von markierten Polynukleotiden
an einer spezifischen Stelle (oder Stellen) in der Vorrichtung beziehen.
Die gesammelten Informationen sind die Fluoreszenzemissionen bei
einer Vielzahl von Wellenlängen
(z.B. Bins/Kanälen).
Die durch den Detektor erhaltenen Informationen beinhalten die Aufzeichnung von
zeitlichen Daten (z.B. Abtastnummer für eine Vorrichtung zur Auftrennung
fluoreszierender Polynukleotide, die einen Abtastdetektor verwendet)
korreliert mit den Daten für
die Spektralemission für
die gemessenen Zeitpunkte.
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Es
ist ein Aspekt der Erfindung ein totales zeitliches Emissionsprofil
für multiple
Farbkalibrierungsstandards für
die Verwendung bei der Kalibrierung von Vorrichtungen zur Auftrennung
fluoreszierender Polynukleotide zu erzeugen.
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Ein
totales zeitliches Emissionsprofil ist die Summe der Intensitäten des
Fluoreszenzsignals, das in allen Spektralkanälen erhalten wurde, als eine Funktion
der Zeit. Höchstwerte,
die zu den unterschiedlichen Oligonukleotiden des multiplen Farbkalibrierungsstandards
korrespondieren, können
dann durch Analyse des totalen zeitlichen Emissionsspektrums mit
einer Höchstwert
Detektionstransformation ermittelt werden. Ein Referenzspektrum
für jede
der im multiplen Farbkalibrierungsstandards verwendeten interessierenden
verwendeten fluoreszierenden Farbstoffe kann dann durch Auswahl
eines Referenzspektrums, welches im Wesentlichen mit dem relevanten
Höchstwert
des totalen zeitlichen Emissionsprofils korrespondiert, erzeugt
werden.
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Die
Erfindung verwendet multiple Farbkalibrierungsstandards. Ein multipler
Farbkalibrierungsstandard ist eine Mischung von wenigstens zwei
Polynukleotiden von unterschiedlicher Länge. (Es wird für den Fachmann
ersichtlich sein, dass jedes Polynukleotid in einer großen Anzahl
von im Wesentlichen identischen Kopien vorliegt, um nützliche
Mengen der gegenständlichen
Zusammensetzungen bereitzustellen). Vorzugsweise ist die Länge (als
Anzahl der Basen) eines jeden markierten Polynukleotids präzise bekannt,
um die Genauigkeit des Standards zu maximieren. Jedes der Polynukleotide
mit unterschiedlicher Länge
im Standard ist mit einem unterschiedlichen fluoreszierenden Farbstoff
markiert. Die vorherbestimmte Korrelation zwischen der Länge eines
gegebenen Polynukleotids und dem bestimmten fluoreszierenden Farbstoff,
der an dieses Polynukleotid angehängt ist, wird verwendet, um
die Polynukleotide des multiplen Farbkalibrierungsstandards während des
Kalibrierungsprozesses zu identifizieren. Die verschiedenen fluoreszierenden
Farbstoffe werden so ausgewählt,
dass sie charakteristische spektrale Profile (für die gleiche Excitationsfrequenz) aufweisen.
Vorzugsweise sind die Größen der
Polynukleotide im multiplen Farbkalibrierungsstandard so ausgewählt, um
eine genügende
Auftrennung zwischen den mit unterschiedlichen Farbstoffen markierten
Polynukleotiden sicherzustellen, damit die Höchstwerte des spektralen Profil
der fluoreszierenden Farbstoffe nicht signifikant überlappen.
Anders ausgedrückt
gibt es vorzugsweise einen genügenden Unterschied
zwischen den Längen
der enthaltenen Polynukleotide, so dass für jeden gegebenen Höchstwert
eines Polynukleotids, der detektiert wird, die Möglichkeit minimal ist, dass
der Messwert der Fluoreszenzintensität das Ergebnis von mehreren unterschiedlichen
Farbstoffe ist.
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Die
Größen der
Polynukleotide der multiplen Farbkalibrierungsstandards sind so
ausgewählt, dass
sie innerhalb des Auftrennungsbereichs für die bestimmte Vorrichtung
zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide, für dessen
Verwendung sie hergestellt wurden, liegen. Beispielhaft für einen
solchen Bereich ist eine Länge
von ungefähr
10-1500 Basen, vorzugsweise eine Länge von ungefähr 10-1000
Basen, noch bevorzugter eine Länge
von ungefähr
20-500 Basen. Vorzugsweise werden die Polynukleotide im Standard
durch eine Länge
von wenigstens 10 Basen getrennt. Verfahren zur Herstellung der
Polynukleotidkomponenten der gegenständlichen Standards sind dem
durchschnittlichen Fachmann wohlbekannt. Solche Methoden beinhalten
die komplette in vitro Synthese der Polynukleotide, z.B. durch die
Verwendung von Phosphoramiditchemie. Alternativ können die
Polynukleotide enzymatisch synthetisiert werden. Es kann zum Beispiel eine
PCR (Polymerasekettenreaktion) Amplifikation unter Verwendung von,
durch die gewünschte
Entfernung getrennten, Primern durchgeführt werden, wobei einer der
Amplifikationsprimer mit einem fluoreszierenden Farbstoff von Interesse
markiert ist.
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Der
multiple Farbkalibrierungsstandard umfasst wenigstens vier Polynukleotide
von verschiedener Länge
und jedes der Polynukleotide ist mit einem spektral charakteristischen
Farbstoff markiert. Die Verwendung von vier spektral charakteristischen Farbstoffen,
von denen jeder im Wesentlichen der selbe wie die Farbstoffe ist,
die in Sequenzierungen vom Typ des Kettenabbruchs mit vier Farben
verwendet werden, ist von besonderem Interesse für die Verwendung in Sequenzierungen
vom Typ des Kettenabbruchs mit vier Farben (die entweder fluoreszenzmarkierte
Kettenabbruchsnukleotide, oder fluoreszenzmarkierte Primer verwendet).
Der multiple Farbkalibrierungsstandard kann ein oder mehrere fluoreszierende
Molekül(e) zusätzlich zu
den Farbstoffen im Standard umfassen, welche mit den Farbstoffen
korrespondieren, die in Sequenzierungsreaktionen verwendet werden,
die für
die Verwendung mit dem bestimmten Standard entwickelt wurden. Diese zusätzlichen
Farbstoffe können „Signal
Farbstoffe" sein,
wie später
in dieser Anmeldung beschrieben. Diese zusätzlichen Farbstoffe, die vorzugsweise
an Polynukleotide angeheftet sind, können zur Überwachung des elektrischen
Stromflusses durch den Auftrennungskanal oder die Auftrennungskanäle einer Vorrichtung
zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide verwendet werden.
Während
die Detektion des elektrischen Stromflusses durch eine Vorrichtungen
zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide ohne die Verwendung
von zusätzlichen
Farbstoffen für
Vorrichtungen, die einen einzelnen Auftrennungskanal verwenden,
z.B. ein Scheibengel, relativ einfach ist, ist die Detektion des
Stromflusses durch ein Multikanalsystem, z.B. ein multiples Kapillarsystem,
ohne die Verwendung zusätzlicher
Farbstoffe schwierig. Die Bewegung dieser zusätzlichen Farbstoffe, welche
ebenfalls zu der zu analysierenden Probe gegeben werden sollten,
durch die Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide kann
detektiert werden um den Fluss von elektrischem Strom durch einen
Auftrennungskanal, z.B. einer individuellen Kapillare, zu überprüfen.
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Die
Erfindung verwendet Kits um die gegenständlichen Verfahren auszuführen. Die
Kits umfassen die individuell fluoreszenzmarkierten Polynukleotidkomponenten
des gegenständlichen
Spektralkalibrierungsstandards mit mehreren Farben. Durch zur Verfügung stellen
der individuellen Komponenten eines Standards können die Endanwender bequem ihre
eigenen Standards für
spezifische Anwendungen herstellen.
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Eine
große
Auswahl an fluoreszierenden Farbstoffen kann verwendet werden, um
die Polynukleotide in multiplen Farbkalibrierungsstandards zu markieren.
Fluoreszierende Farbstoffe sind dem Fachmann wohlbekannt. Beispiele
von fluoreszierenden Farbstoffen schließen Fluorescein, 6-Carboxyfluorescein,
2',4',5',7',-Tetrachloro-4,7-dichlorofluorescein,
2',7'-Dimethoxy-4',5'-6-Carboxirhodamin (JOE),
N',N',N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA)
und 6-Carboxy-X-Rhodamin (ROX) ein. Fluoreszierende Farbstoffe sind
in, unter anderem, U.S. Patent 4,855,225; Menchen et al, U.S. Patent 5,188,934;
Bergot et al, Internationale Anmeldung PCT/US90/05565; Haugland,
R.P. Handbook of Fluorescent Probe and Research Chemicals, 6. Edition (1996)
und ähnlichen
Referenzen beschrieben. Beispiele für solche Farbstoffe schließen Verfahren
zum Anbringen von fluoreszierenden Farbstoffen an Polynukleotiden
ein und sind dem Fachmann ebenfalls wohlbekannt. Beispiele für solche
Verfahren zur Anbringung können
in, unter anderem, U.S. Patent Nr. 4,789,737; 4,876,335; 4,820,812
und 4,667,025 gefunden werden.
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Die
multiplen Farbkalibrierungsstandards können ebenfalls verschiedene
andere Komponenten zusätzlich
zu den fluoreszenzmarkierten Polynukleotiden umfassen. Solche zusätzlichen
Komponenten können
verwendet werden, um die Bewegung des Polynukleotids durch den Auftrennungskanal
einer Vorrichtung zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide
zu verbessern. Beispiele für
zusätzliche Komponenten
beinhalten, ohne darauf beschränkt
zu sein, Puffer, denaturierenden Agenzien und ähnliche.
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Die
Erfindung beinhaltet zahlreiche Verfahren zur spektralen Kalibrierung
einer Vorrichtung zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide
mittels eines multiplen Farbkalibrierungsstandards. Ein multipler
Farbkalibrierungsstandard wird in eine Vorrichtung zur Auftrennung
fluoreszierender Polynukleotide eingebracht, d.h. geladen. Das Einbringen
eines multiplen Farbkalibrierungsstandards in eine Vorrichtung zur
Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide und die anschließende Auftrennung
der Bestandteile des Standards zusammen mit der Sammlung der spektralen
und zeitlichen Daten, die durch Detektion der aufgetrennten markierten
Polynukleotide erhalten wurden, kann bequemer Weise als Erstellung eines
spektralen Kalibrierungslaufs bezeichnet werden. Spektrale Kalibrierungsläufe können für einen einzelnen
Auftrennungskanal durchgeführt
werden, oder gleichzeitig für
mehrere Auftrennungskanäle durchgeführt werden.
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Ein
spektraler Kalibrierungslauf erzeugt Daten, die bequem in Form einer
Matrix D, mit R Zeilen und C Spalten, analysiert werden, die die
in jedem spektralen Kanal/Bin gemessenen Intensitäten (die Spalten
der Datenmatrix) als eine Funktion der Zeit oder der Einzelbild-/Abtastnummer (die
Zeilen der Datenmatrix) enthält.
Jede der Spalten C entspricht einem zeitlichen Emissionsprofil für den korrespondierenden
spektralen Kanal/Bin. Jede der Zeilen R entspricht dem während der
korrespondierenden Datensammlungs-/Akquisitionsperiode aufgenommenen
Spektrum. Der Fachmann kann zahlreiche äquivalente Darstellungsformen
der durch einen Kalibrierungslauf erhaltenen Daten entwickeln, anstatt
der spezifischen oben beschriebenen Matrix, z.B. können die
Inhalte der Zeilen und Spalten transponiert werden oder die Daten
ohne die Verwendung einer 2-D Matrix manipuliert werden. Jedes zeitliche
Profil enthält
Höchstwerte
von verschiedener Form, welche den Farbstoff-markierten Polynukleotiden
des multiplen Farbkalibrierungsstandards entsprechen. Die Form jedes
dieser Höchstwerte
hängt von
den Emissionscharakteristiken des entsprechenden Farbstoffs im spezifischen
Spektralkanal/Bin ab, die durch das zeitliche Profil repräsentiert
werden. Ein totales zeitliches Emissionsprofil kann dann durch Summierung der
für alle
Spektralkanäle/Bins
als eine Funktion des zeitlichen Parameters, z.B. Abtast-/Einzelbildnummer,
erhaltenen Intensitäten
der Signale erzeugt werden. Idealerweise sind die zeitlichen Emissionsprofile für die markierten
Polynukleotide eines multiplen Farbkalibrierungsstandards „parallel". In der Praxis jedoch
kann diese ideale Eigenschaft möglicherweise
Abweichungen aufweisen, die durch heterogene Emissionseffizienzen,
Grundliniendrifts, kleinere Anomalien und Abweichungen vom analytischen
linearen dynamischen Messbereich hervorgerufen werden. Die zeitlichen
Profile der individuellen Spektralkanäle/Bins können große Schwankungen in den S/N
Verhältnissen,
der Rauschverteilung, so wie den Formen der Höchstwerte aufweisen, ungeachtet
dessen, dass sie wichtige allgemeine Eigenschaften (Höchstwerte
der in multiplen Farbkalibrierungsstandards enthaltenen markierten
Polynukleotide, die durch Grundliniensegmente getrennt sind) teilen.
Um solche Probleme zu minimieren, können totale zeitliche Emissionsprofile
anstatt individueller zeitlicher Emissionsprofile für die Kalibrierung
verwendet werden. Ein Vorteil der totalen Emissionsprofile ist die Einbeziehung
aller Polynukleotidkomponenten des Standards, ungeachtet von Unterschieden
in den Emissionsintensitäten
zwischen den Spektralkanälen/Bins.
Daher stellt das totale Emissionsprofil ein zeitliches Profil zur
Verfügung,
das alle Höchstwerte der
markierten Polynukleotide der multiplen Farbkalibrierungsstandards
enthält,
und nur ein Satz von Detektions-Eingabeparametern ist nötig.
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Die
Höchstwerte,
welche zu den fluoreszenzmarkierten Polynukleotiden des totalen
zeitlichen Emissionsprofils korrespondieren, können mit Hilfe eines Höchstwertdetektors
detektiert werden, der durch Änderungen
in der Steigung im totalen zeitlichen Emissionsprofils angesteuert
wird. Wenn die Steigung des totalen zeitlichen Emissionsprofils
einen bestimmten Schwellenwert überschreitet
wird der Start eines potentiellen Höchstwerts detektiert. Der potentielle
Höchstwert
kann dann durch sein(en) Scheitelpunkt/Maximum verfolgt werden bis
der potentielle Höchstwert
entweder durch einen Rückgang des
totalen zeitlichen Emissionsprofils zu Hintergrundwerten oder Detektion
des Starts eines weiteren Höchstwerts
endet. Die Informationen hinsichtlich des Starts, des Maximums und
des Endes des Höchstwerts
können
dann ausgewertet werden, um die Signifikanz des Höchstwerts
abzuschätzen.
Lediglich die signifikanten Höchstwerte
(bezogen auf die minimalen Voraussetzungen, die durch die Eingabeparameter
der Breite des Höchstwerts
und des S/N Verhältnisses
des Höchstwerts
angegeben werden) werden verwendet um Referenzspektren auszuwählen. Dieses
Verfahren kann verwendet werden, um Spitzen und nichtsignifikante/nichtgewünschte Höchstwerte
zu verwerfen, während
die Höchstwerte,
die zu den Komponenten des multiplen Farbkalibrierungsstandards
korrespondieren zurückzubehalten
werden.
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Höchstwert
Detektionstransformation
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Die
Detektion von Höchstwerten
wird auf ein totales zeitliches Emissionsprofil angewendet. Eine bevorzugte
Transformation um Höchstwerte
zu detektieren ist die Steigung des totalen zeitlichen Profils und
ist gegeben als: Si = (Ii+1 – Ii) + (Ii+2 – Ii-1) (1)wobei
Si die Steigung (wie durch die die Detektionstransformation
abgeschätzt)
am Punkt i und Ik die Intensität des totalen
zeitlichen Emissionsprofils am Punkt k ist. Jedoch können auch
andere Höchstwert Detektionstransformation,
die auf Änderungen
der Intensitäten
beruhen, in den vorliegenden Verfahren verwendet werden.
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Statistische
Verteilung der Detektionstransformation und Fehleranalyse
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Der
Parameter für
den Schwellenwert, der für
den Höchstwertdetektor
verwendet wird, kann ein tatsächlicher
Wert für
die Steigung sein. Jedoch wird in einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung der Schwellenwert durch die Verteilung der Höchstwert
Detektionstransformation basierend auf einem Wahrscheinlichkeitsmodell
ermittelt. Eine Eingabevariable wird verwendet um den Schwellenwert
abzuschätzen.
Die Detektionstransformationen erzeugen einen Parameter, zum Beispiel
S in Gleichung 1, der für
die Detektion des Höchstwerts
verwendet wird. Die Leistungsfähigkeit
von S, um zwischen Grundliniensegmenten und Höchstwertsegmenten in einem zeitlichen
Profil zu unterscheiden, wird im höchsten Maße durch die Verteilung von
S beeinflusst, wenn I lediglich zufälligen Schwankungen ausgesetzt
ist. Die Varianz von S kann durch Anwendung einer Fehlerfortpflanzungstheorie
auf Gleichung 1 abgeschätzt werden
und ist gegeben gemäß: σ2(S) = Σ{[∂F(S)/∂Ik]2σ2(Ik)}wobei F(S) die Detektionstransformation
(Gleichung 1) ist. Für
unabhängige
Messungen reduziert sich oben angegebener Term zu: σ2(S)
= 4σ2(I) (2)
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Daher
ist zu erwarten, dass Segmente eines zeitlichen Profils, die zu
Grundlinien mit zufälligen Schwankungen
korrespondieren, nach der Detektionstransformation verstärkte Schwankungen
gemäß Gleichung
2 erzeugen.
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Der
Start eines Höchstwerts
wird als erster Datenpunkt entlang eines Höchstwertsegments des totalen
Emissionsprofils angesehen, das nicht zu der Grundlinienpopulation
gehört.
Die Population des Grundliniensegments erzeugt eine Transformationsverteilung
mit einer Varianz von 4δ2(I) (Gleichung 2). Die Varianz der Verteilung
von S kann daher verwendet werden, um einen Schwellenwert für die Detektion
mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit (ein fälschliches Klassifizieren eines
Datenpunkts aus der Grundlinienpopulation als den Start eines Höchstwertsegments)
verwendet werden, der gegeben ist als Pr[|Si – μ(S)| ≥ kσ(S)_] ≤ k–2 (3)wobei μ(S) der Mittelwert
der S Verteilung ist und von dem angenommen wird, dass er Null ist.
Zum Beispiel ist, wenn der Schwellenwert auf 3δ(S) gesetzt ist, die Wahrscheinlichkeit
einen Datenpunkt aus der Population des Grundliniensegments als
einen Startpunkt des Höchstwerts
auszuwählen,
gemäß Gleichung
3 100/9 oder ungefähr
11%. (Gleichung (3) nimmt weder eine Gauss- noch irgendeine andere Verteilung
der Population der Grundliniendatenpunkte an.) Um die Fehlerwahrscheinlichkeit
zu erniedrigen kann der Schwellenwert erhöht werden, oder der Start des
Höchstwerts
als zwei aufeinander folgende Datenpunkte angesehen betrachtet werden,
dessen Transformation den Schwellenwert überschreitet. Wenn der Schwellenwert
wiederum auf 3δ(S)
gesetzt ist, ist die Wahrscheinlichkeit, dass Si diesen
Wert bei zwei aufeinander folgenden Messungen überschreitet, wenn lediglich
zufällige
Schwankungen vorhanden sind, ungefähr 1 %. Es ist zu erwarten,
dass die Höchstwerte,
die zu den markierten Polynukleotiden der multiplen Farbkalibrierungsstandards
korrespondieren, sich unter den Höchstwerten mit der den größten Höchstwert
S/N Verhältnissen
befinden. Da alle detektierten Höchstwerte
zusätzlichen
Kriterien, wie einem minimalen Höchstwert
S/N Verhältnis
und einer minimalen Breite des Höchstwerts,
unterworfen werden können,
wird davon ausgegangen, dass falsche Starts des Höchstwertes
(detektiert mit einer Wahrscheinlichkeit von 1 %, wie oben ausgeführt) keine
signifikanten Probleme bei der Detektion und Zurückbehaltung der Höchstwerte,
die zu den markierten Polynukleotiden des multiplen Farbkalibrierungsstandards
korrespondieren, verursacht werden, während Spitzen und andere nicht
gewünschte Höchstwerte
verworfen werden.
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Das
Ergebnis des Prozesses der Detektion von Höchstwerten ist ein Satz von
Merkmalen für
alle Höchstwerte,
welcher die Voraussetzungen für
die minimale Breite des Höchstwerts
und für
das minimale Höchstwert
S/N Verhältnis
erfüllt.
Diese Informationen enthalten den Datenpunkt am Start des Höchstwerts,
den Datenpunkt am Ende des Höchstwerts. Während des
Prozesses der Höchstwertdetektion werden
weiterhin geeignete Deskriptoren zusammengestellt, die anzeigen
ob der Startpunkt des Höchstwerts
sich auf Grundlinienniveau befindet, oder in einem Tal zwischen
zwei Höchstwerten. Gleichsam
werden die Endpunkte eines Höchstwerts entweder
als auf Grundlinienniveau oder in einem Tal zwischen zwei Höchstwerten
befindlich markiert. Die Information zu den Höchstwerten beinhaltet außerdem den
Datenpunkt an dem der Höchstwert
maximal ist und die Intensität
am Maximum des Höchstwerts,
sowie ebenfalls die eigentliche Breite des Höchstwerts. Soweit verfügbar können außerdem die Positionen
der Grundliniensegmente zur Linken des Starts des Höchstwerts
und zur Rechten des Endes des Höchstwerts
zusammengetragen werden.
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Identifizierung
der Komponenten des multiplen Farbkalibrierungsstandards
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Die
Kalibrierung von Vorrichtungen zur Auftrennung fluoreszierender
Polynukleotide mittels verschiedener Ausführungsformen der Verfahren
der Erfindung beinhalten den Schritt der Identifizierung der markierten
Polynukleotide des multiplen Farbkalibrierungsstandards. Die Identifizierung
der farbigen Fragmente der Leiter bezeichnet die Zuordnung jedes
markierten Polynukleotids in einem multiplen Farbkalibrierungsstandard
zu einem der vom Höchstwertdetektor
zurückgehaltenen
Höchstwerte.
Die Zuordnung kann mittels einer Vielzahl von Verfahren erreicht
werden. Da die spektrale Kalibrierung der Vorrichtungen zur Auftrennung
fluoreszierender Polynukleotide unter kontrollierten Bedingungen
(bekannte und zuvor spezifizierte Materialien und experimentelle
Parameter) durchgeführt
wird, ist ein effizienter Weg zur Identifizierung der markierten
Polynukleotide des multiplen Farbkalibrierungsstandards Nutzen aus
den kontrollierten experimentellen Bedingungen und dem Design der
gefärbten
Leiter zu ziehen. Zum Beispiel kann das Design des Spektralkalibrierungsstandards
mit verschiedenen Farben so beschaffen sein, dass das Fragment,
welches im multiplen Farbkalibrierungsstandards mit dem Farbstoff
DR110 markiert ist, die größte Migrationszeit
aufweist. Unter optimierten und kontrollierten experimentellen Bedingungen,
unter denen die Parameter der Breite des Höchstwerts und des S/N Verhältnisses
des Höchstwerts
die Detektion und Zurückbehaltung
der im multiplen Farbkalibrierungsstandard enthaltenen Polynukleotide
erlaubt, wäre
der letzte Höchstwert
das DR110-markierte Fragment. Ein Höchstwert mit einer solch hohen
Wahrscheinlichkeit der Detektion kann als Referenz-Höchstwert dienen um die Höchstwerte zu
lokalisieren, die den anderen markierten Polynukleotiden des multiplen
Farbkalibrierungsstandards entsprechen. Da die Wanderung eines markierten DNA
Fragments primär
durch die Größe des DNA Fragments,
des Markierungsfarbstoffs und der Auftrennungsmatrix beeinflusst
wird, sind die Versatzwerte der Migrationszeit über ein kurzes Migrationsintervall
wirksame Parameter, die bei der Lokalisierung der Höchstwerte,
die zu den markierten Polynukleotiden des multiplen Farbkalibrierungsstandards korrespondieren,
verwendet werden können,
vorausgesetzt, dass die Position eines Referenz-Höchstwerts,
wie dem DR110-markierten Höchstwert,
bekannt ist. Wenn die Beweglichkeiten der markierten Polynukleotide
des Standards signifikante Nichtlinearitäten aufweisen und die Wanderung
der farbigen Leiterfragmente nicht einfach (und verlässlich) über einen
großen
Bereich von Migrationszeiten unter Verwendung von Versatzwerten
vom Referenz-Höchstwert
vorhersagbar ist, kann der Vorhersagebereich verkleinert werden,
indem die Versatzwerte der benachbarten Höchstwerte herangezogen werden.
Zum Beispiel kann ein mit DR110 markiertes Polynukleotid als Referenz-Höchstwert
verwendet werden, um die Polynukleotide (in derselben Mischung des
multiplen Farbkalibrierungsstandards), die mit DR6G markiert sind
zu lokalisieren. Anschließend
können
die Polynukleotide, die (im selben Standard) mit DR6G markiert sind
als Referenz-Höchstwerte
dienen, um die Polynukleotide, die mit DTAM markiert sind zu lokalisieren.
Die Polynukleotide, die (im selben Standard) mit DTAM markiert sind,
können
dann dazu dienen, die Polynukleotide, die mit DROX markiert sind
zu lokalisieren. Schließlich
können
die Polynukleotide, die (im selben Standard) mit DROX markiert sind
dazu dienen die Polynukleotide, die mit JAZ markiert sind zu lokalisieren.
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Parameter der Höchstwertdetektion
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Die
Eingabeparameter der markierten Polynukleotide des multiplen Farbkalibrierungsstandards für den Höchstwertdetektor
können
beinhalten, ohne darauf beschränkt
zu sein:
- (a) Den Startpunkt und die Probengröße, die
für die
Abschätzung
des analytischen Hintergrunds und des analytischen Rauschens im
totalen zeitlichen Emissionsprofil (δ(I) in Gleichung 2) verwendet
werden. Der analytische Hintergrund und das analytische Rauschen
werden verwendet um das Höchstwert
S/N Verhältnis
abzuschätzen.
- (b) Die Variable für
den Schwellenwert, die k in Gleichung 3 entspricht. Hierdurch wird
die Sensitivität
des Höchstwertdetektors
auf Schwankungen der Grundlinie festgelegt.
- (c) Die Variable für
den Schwellenwert, die zur Detektion der Grundliniensegmente zu
der Linken von Startpunkten der Höchstwerte und zu der Rechten
von Endpunkten der Höchstwerte
verwendet wird. Typischerweise wird hierbei ein Wert verwendet,
der niedriger ist, als derjenige der zur Detektion der Startpunkte
der Höchstwerte
verwendet wird.
- (d) Die Vorraussetzungen für
die minimale Breite des Höchstwerts
und des Höchstwert
S/N Verhältnisses.
Diese zwei Parameter werden so ausgewählt, dass Spitzen und nicht
gewünschte Höchstwerte
ignoriert werden. Idealerweise werden lediglich die Höchstwerte,
die zu den Fragmenten der farbigen Leiter korrespondieren vom Höchstwertdetektor
zurückgehalten.
- (e) Die Migrationszeit des Referenz-Höchstwerts und dessen Toleranz.
Falls dieser Parameter Null ist, ist der letzte ermittelte Höchstwert
per Voreinstellung der Referenz-Höchstwert.
- (f) Die Versatzwerte der Migrationszeiten für die Höchstwerte der farbigen Leiterfragmente
und deren Toleranzen.
- (g) Ein angemessenes Suchfenster für die Maxima- und Grundlinienwerte
der zeitlichen Emissionsprofile.
- (h) Die Anzahl der Höchstwerte
der farbigen Leiterfragmente und die maximale Anzahl an voraussichtlich
zu findenden Höchstwerten
im totalen zeitlichen Emissionsprofil. Diese Parameter werden für die Speicherverwaltung
verwendet.
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Einschätzung der Referenzspektren
der Farbstoffe
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Der
Vorgang der spektralen Kalibrierung einer Vorrichtung zur Auftrennung
fluoreszierender Polynukleotide unter Verwendung eines multiplen
Farbkalibrierungsstandards kann den Schritt der Einschätzung (Extraktion)
der Referenzspektren der Farbstoffe der erlangten Matrix, D, unter
Verwendung der Informationen aus dem Prozess der Detektion von Höchstwerten,
beinhalten. Wie zuvor beschrieben enthalten die Zeilen der Datenmatrix,
D, die spektralen Informationen. Jedes während jeder Datensammlungs-/Aufzeichnungsperiode
erlangte Spektrum kann aus dem reinen analytischen Signal, das im
Spektralkanal/Bin erhalten wurde, geschätzt werden. Daher ist ein Spektrum
eine Zeile von D, die Hintergrund-/Grundlinien-korrigiert ist.
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Die
Referenzspektren der Farbstoffe werden daher aus den korrigierten
Zeilen von D eingeschätzt, die
den Datenpunkten entlang des Höchtwertsegments
des totalen zeitlichen Emissionsprofils entsprechen. Das Maximum
des Höchstwerts
ist der Datenpunkt (Zeile von D), der für die Einschätzung der Referenzspektren
der Farbstoffe vorgeschlagen wird. Da nicht davon ausgegangen wird,
dass die zeitlichen Emissionsprofile der individuellen Spektralkanäle/Bins
perfekt parallel sind, wird eine Zeile von D korrigiert durch Einschätzung des
reinen analytischen Signals in jedem Spektralkanal/Bin unter Verwendung
der Informationen aus der Höchstwertbestimmung
aus dem totalen zeitlichen Emissionsprofils und eines angemessenen
Suchfensters. Auch die Referenzspektren der spektralen Kalibrierung
werden normalisiert, so dass die maximale spektrale Intensität in jedem
Spektrum gleich 1 gesetzt wird. Dieses wird durch Division aller
korrigierten spektraler Intensitäten
in jedem Spektrum durch die maximale korrigierte spektrale Intensität, die im
Spektrum gefunden wurde, erreicht.
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Unsicherheiten in den
Referenzspektren der Farbstoffe
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Die
spektrale Intensität
eines bestimmten Kanals/Bins eines normalisierten Referenzspektrums eines
Farbstoffs kann ausgedrückt
werden als: Ri = Ii/Im (4)wobei Ri die normalisierte spektrale Intensität im Referenzspektrum
im i-ten Spektralkanal/Bin,
Ii das
reine analytische Signal im i-ten Spektralkanal/Bin, und
Im das größte reine
analytische Signal im Spektrum ist.
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Die
Unsicherheit von Ri ist gegeben gemäß: σ2(Ri)Ri 2 =
(σ2/Ii 2)[1
+ m2) (5)wobei
m gegeben ist als Ii/Im und
δ2 die
Varianz in den spektralen Intensitäten ist und es angenommen wird,
dass diese äquivalent
in beiden Spektralkanälen/Bins
ist.
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Der
relative Fehler von Ri kann ausgedrückt werden
gemäß: σ(Ri)/Ri = [1/SNRi][1 +
m2] (6)wobei
SNRi das Signal-zu-Rauschen Verhältnis des reinen
analytischen Signals im i-ten Spektralkanal/Bin ist.
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Der
Term [1 + m2] in Gleichungen 5 und 6 überschreitet
niemals den Wert von 2, gemäß der in Gleichung
4 definierten Normalisierung. Der relative Fehler von Ri kann
deswegen ausgedrückt
werden als: σ(Ri)/Ri ≤ [1/SNRi)√2 (7)
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Wobei
SNRi das Signal-zu-Rauschen Verhältnis des
reinen analytischen Signals im i-ten Spektralkanal/Bin ist.
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Die
analytische Folge von Gleichung 6 (und Gleichung 7) ist, dass die
Qualität
der Referenzspektren der Farbstoffe erhöht wird (d.h., die relativen Fehler
in den spektralen Bins nehmen ab) da sich das Signal-zu-Rauschen
Verhältnis
des reinen analytischen Signals erhöht. Die Verlässlichkeit
der spektralen Einschätzung
ist primär
durch das Signal-zu-Rauschen Verhältnis bestimmt und nicht durch
die Anzahl der zum Erhalten einer durchschnittlichen Einschätzung verwendeten
Spektren. Da die Spektren, die an den Maxima des Höchstwertes
erhalten wurden das größte S/N
Verhältnis
besitzen, sind diese Spektren die Spektren, die vorzugsweise als
Referenzspektren ausgewählt
werden, da davon ausgegangen wird, dass diese die geringsten relativen
Fehler haben. Jedoch können
auch andere Spektren, die im Wesentlichen mit den Maxima von Höchstwerten
korrespondieren, als Referenzspektren verwendet werden.
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Die
Erfindung wird in Systemen zur Auftrennung und Detektion von fluoreszenzmarkierten
Polynukleotiden verwendet, wobei das System für die spektrale Kalibrierung
in Übereinstimmung
mit den gegenständlichen
Verfahren zur Kalibrierung unter Verwendung multipler Farbkalibrierungsstandards konzipiert
ist. Die vorliegenden Systeme umfassen eine Vorrichtung zur Auftrennung
fluoreszierender Polynukleotide und einen Computer in funktionaler Kombination
mit der Vorrichtung. Der Term „funktionale
Kombination" wird
verwendet, um anzuzeigen, dass Daten von der Vorrichtung zur Auftrennung
fluoreszierender Polynukleotide, solche Daten beinhalten Daten der
Fluoreszenzintensität über einen
Detektionsbereich von Wellenlängen
und die dazugehörigen
zeitlichen Daten, an den Computer transferiert werden, in einer
Form, dass der Computer die Daten für Zwecke der Berechnung nutzen
kann. Der Computer im System ist so programmiert, um die Verfahren
zur spektralen Kalibrierung der Erfindung unter Verwendung der durch
einen Lauf eines multiplen Farbkalibrierungsstandards erzeugten
Daten auszuführen.
Daher ist der Computer programmiert um ein totales zeitliches Emissionsprofil
aus den spektralen und zeitlichen Daten, die aus dem Kalibrierungslauf erhalten
wurden, zu erzeugen. Der Computer kann weiterhin programmiert sein,
um Höchstwerte
im totalen zeitlichen Emissionsprofil zu detektieren und die spektralen
Referenzprofile der Farbstoffe, die an die markierten Polynukleotide
angeheftet sind und die durch die Höchstwerte repräsentiert
werden, zu ermitteln. Eine große
Vielzahl von Computern kann im vorliegenden System verwendet werden.
Typischerweise ist der Computer ein Microcomputer sowie die begleitenden
Eingabe-, Ausgabe-, Speicher und anderen Komponenten, die Voraussetzung
sind, um die nötigen
Berechnungen durchzuführen.
Die Computer können
im Allgemeinen programmierbar sein, um Modifikationen zu ermöglichen,
oder die Vorrichtung des Computerprogramms kann in Form von „Firmware" vorliegen, die nicht
bereitwillig einer Modifikation unterworfen werden kann.
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Die
Erfindung wird in Systemen zur Kalibrierung einer Vorrichtung zur
Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide verwendet. Die Systeme
zur Kalibrierung schließen
Computercode, der eine Vielzahl an spektralen und zeitlichen Daten
von einer Vorrichtung zur Auftrennung fluoreszierender Polynukleotide
entgegennimmt, ein. Das System umfasst außerdem Computercode, der ein
totales zeitliches Emissionsprofil aus den spektralen und zeitlichen
Daten berechnet. Das System kann weiterhin zusätzlichen Computercode zur Ausführung der
gegenständlichen Verfahren
zur spektralen Kalibrierung umfassen. Solch zusätzlicher Code schließt Code
zur Detektion von Höchstwerten
und Code zur Bereitstellung von spektralen Profilen für jeden
der im Kalibrierungsstandard enthaltenen Farbstoffe ein. Da der
Computercode des vorliegenden Systems für die Funktion eine physikalische
Ausführungsform
benötigt,
umfasst das System auch einen Prozessor und ein computerlesbares
Medium (z.B. ein optischer oder magnetischer Datenträger) um
den Computerprogrammcode zu speichern. Das computerlesbare Medium
ist funktional mit dem Prozessor gekoppelt.