DE69929886T2

DE69929886T2 - Überexpression von phytase-genen in hefesystemen

Info

Publication number: DE69929886T2
Application number: DE69929886T
Authority: DE
Inventors: Xingen Ithaca LEI
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1999-06-23
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2019-06-24
Also published as: US8455232B2; JP2002518052A; ES2560661T3; CA2332180C; DE69929886T3; AU5083799A; KR100870886B1; US7026150B2; US20060153902A1; ATE317904T1; HUP0102800A2; MXPA00012794A; WO1999067398A2; DK1090129T4; WO1999067398A3; EP1090129B1; PL345408A1; EP1688500A2; CZ20004805A3; DE69929886C5

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, wobei Phytasen in Hefen erzeugt werden sollen, auf Hefestämme, welche die heterologe Phytase expressieren, sowie auf die heterologe Phytase, die durch Hefe erzeugt wird.
HINTERGRÜNDE DER ERFINDUNG
Die Phytasen, eine spezifische Gruppe der Monoester Phosphatasen, sind notwendig um die Freisetzung von Phosphat ("P") aus Phytat (Myoinositol Hexaphosphat) in Gang zu setzen, die wichtigste Speicherform von P in Lebensmittel oder Futter auf Getreidebasis (Reddy, N. R. et al., "Phytates in Legumes and Cereals" Advances in Food Research, 28: 1 (1982)). Da Tiere mit einfachem Magen wie Schweine oder Geflügel, ebenso wie der Mensch eine geringe Phytase Aktivität in ihrem Verdauungstrakt aufweisen, wird praktisch das gesamte aufgenommene P Phytat schwer verdaut. Dies bedingt die Notwendigkeit, mit anorganischem P zu ergänzen, ein teueres und nicht wiedererneuerbares Nahrungsmittel im Futter dieser Tiere. Noch unerfreulicher ist die Verschmutzung der Umwelt mit P durch das nicht verwertete P Phytat, das diese Tiere in ihrem Mist ausscheiden. (Cromwell, G. L., et al., "P-A Key Essential Nutrient, Yet a Possible Major Pollutant – Its Central Role in Animal Nutrition," Biotechnology In the Feed Industry; Proceedings Alltech 7th Annual Symposium, S. 133 (1991)). Außerdem chelieren die Phytate mit essenziellen Spurenelementen wie Zink und verursachen Mängel in Nahrungsmittel, welche das Zurückbleiben im Wachstum oder in der geistigen Entwicklung bei Kindern zeigt, die hauptsächlich pflanzliche Nahrungsmittel zu sich nehmen, bei denen das Phytat nicht entfernt wurde.
Es wurden zwei Phytasen geklont und sequenziert, phyA und phyB, von Aspergillus niger NRRL3135 (Erlich, K. C. et al., "Identification and Cloning of a Second Phytase Gene (phys) from Aspergillus niger (ficuum)" Biochem. Biophys. Res. Commun., 195: 53–57 (1993); Piddington, C. S. et al., "The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2.5-optimun Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. awamori," Gene, 133: 56–62 (1993)). Neuerdings wurden neue Phytase-Gene isoliert und zwar aus Aspergillus terreus und Myceliophthora thermophila (Mitchell et al., "The Phytase Subfamily of Histidine Acid Phosphatases: Isolation of Genes for Two Novel Phytases From the Fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila." Microbiology 143: 245–252 (1997)), Aspergillus fumigatus (Pasamontes et al., "Gene Cloning, Purification and Characterization of a Heat-Stable Phytase from the Fungus Aspergillus fumigatus" Appl. Environ Microbiol. 63: 1696–1700 (1997)). Emericella nidulans und Talaromyces thermophilus (Pasamontes et al., "Cloning of the Phytase from Emericella nidulans and the Thermophilic Fungus Talaromyces thermophilus. "Biochim. Biophys. Acta., 1353: 217–223 (1997)) und Mais (Maugenest et al., "Cloning and Characterization of a cDNA Encoding a Maize Seedling Phytase," Biochem. J. 322: 511–517, 1997)). Es wurden diverse Phytase Enzym Arten isoliert und/oder purifiziert und zwar aus Enterobacter sp. 4 (Yoon et al., "Isolation and Identification of Phytase-Producing Bacterium. Enterobacter sp. 4 and Enzymatic Properties of Phytase Enzyme." Enzyme and Microbial Technology 18: 449–454 (1996)), Klebsiella terrigena (Greiner et al., "Purification and Characterization of a Phytase from Klebsiella terrigena." Arch. Biochem. Biophys. 341: 201–206 (1997)) sowie Bacillus sp. DS11 (Kim et al., "Purification and Properties of a Thermostable Phytase from Bacillus sp. DS11" Enzyme and Microbial Technology 22: 2–7 (1998). Es wurden die Eigenschaften dieser Enzyme untersucht. Außerdem hat man über die kristalline Struktur der phyA von Aspergillus ficumm (Kostrewa et al., "Crystal Structure of Phytase from Aspergillus ficuum at 2,5 A Resolution," Nature Structure Biology 4: 185–190 (1997)) informiert.
Hartingsveldt et al. haben das Gen von phyA in A. niger eingeführt und erhielten eine Steigerung um das Zehnfache in Bezug auf die Phytase-Aktivität verglichen mit der wilden Form ("Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger.," Gene 127: 87–94 (1993)). Es konnte gezeigt werden, dass die suplementäre mikrobielle Phytase dieser Quelle bei der Kost von Schweinen und Geflügel wirksam ist, um die Verwertung vom P Phytat und von Zink zu verbessern. (Simons et al., "Improvement of phosphorus Availability By Microbial Phytase in Broilers and Pigs," Br. J. Nutr. 64: 525 (1990); Lei, X. G. et al., "Supplementing Corn-Soybean Meal Diets With Microbial Phytase Linearly Improves Phytate P Utilization by Weaning Pigs." J. Anim. Sci., 71: 3359 (1993); Lei, X. G. et al., "Supplementing Corn-Soybean Meal Diets With Microbial Phytase Maximizes Phytate P Utilization by Weaning Pigs" J. Anim. Sci. 17: 3368 (1993); Cromwell, G. L: et al., "P-A Key Essential Nutrient, Yet a Possible Major Pollutant – Its Central Role in Animal Nutrition," Biotechnology In the Feed Industry: Proceedings Alltech 7th Annual Symposium, S. 133 (1991)). Die Kosten der begrenzten Verfügbarkeit im Handel jedoch, sowie die instabile Aktivität der ergänzten Phytase bei der Erhitzung während der Granulierung des Futters verhindert die praktische Anwendung in der Tierindustrie (Jongbloed, A. W. et al., "Effect of Pelleting Mixed Feeds on Phytase Activity and Apparent Absorbability of Phosphorus and Calcium in Pigs," Animal Feed Science and Technology, 28: 233–242 (1990). Außerdem stellt die Phytase, die aus A. niger erzeugt wird, vermutlich nicht die verlässlichste Quelle dar, um Nahrungsmittel für Menschen herzustellen.
Es kann Hefe verwendet werden, um in effizienter Weise Enzyme herzustellen, während man sie in einfachen und preisgünstigen Mitteln ansetzt. Mit einer geeigneten Signalsequenz kann das Enzym in den Mitteln abgeschieden werden um angemessen eingesammelt zu werden.
Einige Expressionssysteme von Hefe haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie in der Lebensmittelindustrie gut angenommen werden und wirksame und verlässliche Erzeuger von Lebensmitteln sind.
Pichia pastoris ist eine methylotrophe Hefe, die in der Lage ist, Methanol als einzige Kohlenstoff-Quelle zu metabolisieren. Dieses System ist gut bekannt durch seine Fähigkeit der Expression hoher Mengen an heterologen Proteinen. Angesichts der Tatsache, dass es eine Eukariote ist, weist Pichia viele der Vorteile der Expressionssysteme der höheren Eukarioten auf, so wie die Verarbeitung, Faltung und posttranskriptionelle Veränderung des Proteins.
Auf diese Weise wird es notwendig, ein effizientes und einfaches System zu entwickeln, um Phytase preiswert für ihre Anwendung in der Lebensmittel- und Futterindustrie herzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, um Phytase in Hefe zu erzeugen und besteht im Hervorbringen eines von bakteriellen Zellen isolierten appA Genes, dessen appA Gen ein Protein mit Phytase-Aktivität kodiert, Expression dieses appA Gens in einem Hefestamm und Isolierung des expressierten Proteins oder Polypeptids, wobei dieses Protein oder Polypeptid eine im Vergleich zu diesem, in einer Wirtszelle, die nicht aus Hefe besteht, expressierten Protein oder Polypeptid erhöhte Thermostabilität aufweisen soll.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Protein oder Polypeptid, das über dieses Verfahren gewonnen wird und Phytase-Aktivität aufweist, mit einer optimalen Aktivität in einem Temperatur Intervall von 57–65°C mit einem pH von 2,5 bis 3,5 oder von 5,5. Ein optimaler pH von 2,5 bis 3,5 ist besonders wichtig für die Phytase, da dies der pH des Magens der Tiere ist.
Die Erfindung bringt außerdem einen Hefestamm hervor, der in einem appA Gen besteht, das aus bakteriellen Zellen isoliert wurde, dessen appA Gen ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität kodiert, und welches funktionell an einen Promotor gebunden ist, der in der Lage ist, die Phytase in Hefe zu expressieren, wobei dieses Protein oder Polypeptid eine erhöhte Thermostabilität aufweist wenn es in einer Wirtzelle aus Hefe expressiert wird, im Vergleich zu diesem expressierten Protein oder Polypeptid in einer Wirtzelle, die nicht aus Hefe ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Vektor bestehend aus einem appA Gen, das aus bakteriellen Zellen isoliert wurde, dessen Gen ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität kodiert; einem Promotor, der auf funktionelle Weise mit dem appA Gen verbunden ist, wobei dieser Promotor in der Lage ist, die Transkription bei Hefe in Gang zu setzen, sowie einem Replizierungsursprung, der in der Lage ist, den Vektor bei Hefe zu halten, wobei dieses Protein oder Polypeptid eine erhöhte Thermostabilität aufweisen soll im Vergleich zu diesem expressierten Protein oder Polypeptid in einer Wirtzelle, die nicht aus Hefe ist.
Die Erfindung sieht auch ein Verfahren vor, um ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität zu erzeugen, das darin besteht, ein aus bakteriellen Zellen isoliertes appA Gen hervorzubringen, dessen Gen ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität kodiert; dieses Gen in einer Wirtszelle zu expressieren, wobei diese Wirtszelle ein Hefe Stamm ist sowie das expressierte Protein oder Polypeptid zu isolieren.
Die Erfindung sieht auch ein Verfahren vor, um Phytat in Inositol und anorganisches Phosphat umzuwandeln. Das aus bakteriellen Zellen isolierte appA Gen expressiert ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität in einer Wirtszelle. Anschließend tritt das Protein oder Polypeptid mit der Phytase in Kontakt, um die Umwandlung des Phytats in Inositol und anorganisches Phosphat zu katalysieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER BILDER
Die 1 zeigt eine Analyse in SDS-PAGE des löslichen Proteins angesetzt aus E. coli transformiert mit dem GEN der mit ITPG induzierten Phytase. Die Zellen wurden vor dem Einsammeln 4 Stunden lang angesetzt. Spur 1: Marker, Spuren 2 und 3: Transformanten von pEP1 (das expressierte Protein hatte ca. 55 kDa); Spur 4: Transformant nur mit dem Expressionsvektor pET25b(+).
Die 2 zeigt die Analyse durch Transfer des Typs Western des Phytase Proteins expressiert in E. coli. Den Antikörper gewann man gegenüber der purifizierten Nativ Phytase aus A. niger. Jede Spur enthielt 50 μg intrazellulären Proteins. Spuren 1 und 2: Rekombinant vor und nach der Induktion. Spuren 3 und 4: Kontrolle (nur des Expressions Vektors) nach und vor der Induktion.
Die 3 ist ein Scanner Bild der Analyse des Transfers des Typs Northern des mRNA von PhyA in E. coli. Es wurde eine PhyA Sonde von 1,4 kb verwendet. Jede Spur enthielt 20 μg RNA gesamt. Spuren 1 und 2: RNA isoliert aus Kontroll-Zellen (nur mit dem Expressions-Vektor) vor und nach der Induktion. Spuren 3 und 4: RNA isoliert aus den Rekombinanten, welche PhyA vor und nach der Induktion enthalten.
Die 4 Ist eine Zeitkurve der induzierten Expression von Phytase (pEP1) in E. coli BL21(DE3). Die Zellen wurden induziert als die DO₆₀₀ 0,5 erreicht hat. Das lösliche Protein, das zu jedem Zeitpunkt gezüchtet wurde, wurde über Analyse in SDS-PAGE quantifiziert.
Die 5 zeigt eine Analyse in SDS-PAGE des extrazellulären Phytase Proteins, expressiert durch S. lividans mit Phytase transformiert nach dem Züchten während 72 Stunden. Die Zellen wurden 15 Minuten lang mit 8.000 × g zentrifugiert, und der Überstand einem Elektropherose-Gel unterzogen. Spur 1: Marker; Spur 2: Kontrolle nur mit dem Expressions-Vektor; Spur 3: Phytase expressiert durch eine positive Kolonie, wobei die Größe ca. 57 kDa betrug.
Die 6 zeigt die Analyse durch Transfer des Typs Western der durch S. lividans ausgedrückten Phytase, wobei ein Antikörper verwendet wurde, gewonnen gegenüber der purifizierten Nativ Phytase von A. niger. Jede Spur wurde mit 20 μg Protein des Mittels (überstehend/aufschwimmend) beladen. Spur 1: Überstand der Zucht von Kontroll Zellen, die mit dem Vektor transformiert wurden; Spur 2: Überstand der Kulturen, denen die positive Kolonie eingeimpft wurde.
Die 7 zeigt eine Analyse in SDS-PAGE der extrazellulären Phytase expressiert durch or S. cerevisiae. Jede Spur wurde mit 50 μg Protein des Mittels (überstehend/aufschwimmend) beladen. Spuren 1 bis 3: Überstand der Kultur, der die positive Kolonie eingeimpft wurde, eingesammelt jeweils nach 5, 10 und 25 Stunden nach der Induktion; Spuren 4 bis 6: Überstand der Zucht der Kontroll-Zellen, welche mit dem Vektor transformiert wurden, eingesammelt jeweils nach 5, 10 und 25 Stunden nach der Induktion; Spur 7: Marker (kDa). Die expressierte Phytase hatte ca. 110 kDa (bestätigt durch Transfer des Typs Western).
Die 8 Ist eine Zeitkurve der extrazellulären Phytase-Aktivität, expressiert durch S. cerevisiae transformiert durch das Konstrukt pYPP1 nach der Induktion mit Galaktose. Die Aktivität wurde in dem Überstand des eingesammelt Mittels analysiert.
Die 9 zeigt die Analyse durch Transfer des Typs Western der extrazellulären Phytase expressiert durch S. cerevisiae vor und nach der Deglykosylierung (Endo H), wobei ein Antikörper für Phytase verwendet wurde, gewonnen gegenüber der purifizierten Nativ Phytase von A. niger. Spur 1: SDS-PAGE Standards vorgefärbt (kDa) aus BioRad; Spuren 2 und 3: 10 und 20 μg jeweils deglykosyliertes Phytase Protein; Spur 4: glykosilierte Phytase (20 μg Protein).
Die 10 Ist ein Scanner Bild der Analyse durch Transfer des Typs Northern des gesamten RNA, isoliert aus Zellen von transformierter S. cerevisiae. Spur 1: Kontrolle (nur mit dem Expressions-Vektor pYES2); Spuren 2 und 3: Transformanten von pYPP1.
Die 11 ist eine Zeitkurve der extrazellulären PhyA Phytase, erzeugt durch Transformanten von Pichia pastoris von Mut^s(KM71) und Mut+(X33) nach der Induktion.
Die 12 zeigt eine Analyse in SDS-PAGE der über-expressierten Phytase in Pichia, mit dem Konstrukt von pPICZαA-PhyA in KM71 (MUT^s). Spur 1: proteinische Marker. Spur 2: 40 μl des Überstand von AK1 (eine Kolonie, die 21.700 mU/ml an extrazellulärer Phytase aufwies), eingesammelt 108 Stunden nach der Induktion. Spur 3: 40 μl des Überstand eines Kontroll-Stammes, der ein Albumin menschlichen Serums über-expressierte (HAS 6,7 kDa) zu 1 g/l. Spur 4: 40 μl des Überstand der Kontrolle KM71.
Die 13 zeigt die Wirkungen der Deglykolisierung durch Endo H in der Thermostabilität der in Pichia expressierten Phytase. Die Phytase Aktivität wurde gemessen, nachdem die Enzyme 15 Minuten lang auf 37 oder 80°C erhitzt wurden, und zwar in einem Zitrat Puffer von 0,2 M, pH 5,5.
Die 14 ist ein Scanner Bild der Analyse des Typs Northern des mRNA von phyA, expressiert durch die transformierten Stämme von Pichia pastoris (KM71 und X33). Für den Transfer wurde eine Sonde phyA von 1,3 kb verwendet. Spuren 1 und 2: Der Transformant von KM71 vor und nach der Induktion; Spuren 3 und 4: der Transformant von X33 nach und vor der Induktion.
Die 15 zeigt den optimalen pH der extrazellulären Phytase expressiert durch Pichia (X33). Es wurden die HCl-Glyzin von 0,2 M für die pH 1,5, 2,5 und 3,5 verwendet; natriumhaltiges Zitrat von 0,2 M für die pH 4,5, 5,5 und 6,5 sowie Tris-HCl 0,2 M für pH 7,5 und 8,5.
Die 16 zeigt die optimale Temperatur der extrazellulären Phytase expressiert durch Pichia (X33). Der Versuch wurde im Zitrat Puffer von 0,2 M, pH 5,5 durchgeführt.
Die 17 zeigt die Freisetzung von freiem Phosphor aus Soja durch die Phytase expressiert in Pichia (X33). Es wurden fünf Gramm Soja in 25 ml des Zitrat Puffers von 0,2 M, pH 5,5, suspendiert, und zwar mit unterschiedlichen Mengen des Enzyms. Die Inkubation erfolgte während 4 Stunden zu 37°C und die Freisetzung des freien Phosphors wurde auf dem Überstand bestimmt.
Die 18 zeigt eine Zeitkurve der Expression der extrazellulären Phytase Aktivität ausgehend von fünf Transformanten von Pichia pastoris, welche das appA Gen von E. coli enhalten.
Die 19 zeigt auf graphische Weise das Verhältnis zwischen dem pH des Mittels und der Expression der Phytase Aktivität in Pichia pastoris.
Die 20 ist eine Analyse in SDS-PAGE der Phytase von E. coli überexpressiert in Pichia pastoris. Spur 1: proteinischer Marker; Spuren 2 bis 4: Überstand, eingesammelt jeweils aus den Kulturen der positiven Kolonien 23, 22 und 11, 118 Stunden nach der Induktion.
Die 21 zeigt auf graphische Weise den optimalen pH der Phytase von E. coli überexpressiert in Pichia pastoris.
Die 22 zeigt auf graphische Weise die optimale Temperatur der Phytase von E. coli überexpressiert in Pichia pastoris.
Die 23 zeigt die Menge an freiem Phosphor, freigesetzt ausgehend von Sojamehl durch die Phytase von E. coli, welche aus Pichia pastoris nach vier Stunden Aufbereitung überexpressiert wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren für die Erzeugung von Phytase in Hefe. Gemäß diesem Verfahren, wird ein von bakteriellen Zellen isoliertes appA Gen, dessen appA Gen ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität kodiert, Expression in einem Hefestamm und Isolierung des Proteins oder Polypeptids, wobei dieses isolierte Protein oder Polypeptid eine im Vergleich zu diesem, in einer Wirtszelle, die nicht aus Hefe besteht, expressierten Protein oder Polypeptid erhöhte Thermostabilität aufweisen soll.
Im Allgemeinen kennt man die Enzyme, welche die Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganisches Phosphor katalysieren, als Phytasen. Jene Microorganismen, die Phytasen erzeugen, bestehen aus Bakterien wie Bacillus subtilis (Paver et al., J. Bacteriol. 151, 1102 (1982) die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) sowie Pseudomonen (Cosgrove, Austral. J. Biol. Sci. 23: 1207 (1070), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird); Hefen wie Saccharomyces cerevisiae (Nayini et al., Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17: 24 (1984), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird); ebenso Pilze Aspergillus terreus (Yamada et al., Agric. Biol. Chem. 32: 1275 (1986), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) und Aspergillus ficuum (van Gorcom et al., Europäische Patentanmeldung 89/202.436, die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird).
Phytasen kommen in endogener Form in vielen Pflanzenarten vor. Loewus, In: Plant Biology vol. 9: "Inositol Metabolism in Plants" (D. J. Morre, W. F. Boss, F. A. Loewus Editores) 13 (1990); und Gellatly, et al., Plant Physiology (Beilage) 93: 562 (1990), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird, beziehen sich auf die Isolierung und Charakterisierung eines Phytase cDNA Klons, gewonnen aus Kartoffelknollen. Gibson, et al., J. Cell Biochem., 12C: L407 (1988) und Christen, et al., J. Cell Biochem., 12C: L402 (1988), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden werden, beziehen sich auf die Synthese von endogener Phytase während der Keimzeit von Sojasamen. Vorzugsweise scheidet die Zelle das Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität in den Nährboden ab. Dies ermöglicht höhere Expressionspegel und eine leichtere Isolierung des Produkts. Das Protein oder Polypetpid mit Phytase-Aktivität verbindet sich mit einer Signalsequenz, die in der Lage ist, das Protein ausserhalb der Zelle zu leiten. Vorzugsweise wird die Signalsequenz vom Protein abgespalten.
Das appA Gen kann im Rahmen verbunden werden mit einem Trasnkriptionsverstärkungselement.
Das appA Gen, das Proteine mit Phytase-Aktivität kodiert, isoliert man aus einer bakteriellen Zelle. Ein bevorzugtes appA Gen ist das appA Gen, welches aus E. coli isoliert wird. Das Gen, ursprünglich definiert als Gen der periplasmischen Phosphoanhydrid Phosphorhydrolase (appA) aus E. coli, enthält 1.298 Nukleotiden (Zugangs Nummer zu GeneBank: M58708). Zu Beginn fand man heraus, dass das Gen in E. coli ein saures Phosphatase Protein mit optimalem pH von 2,5 (EcAP) kodierte. Die saure Phosphatase ist ein Monomer mit einer Molekularmasse von 44.644 Dalton. Die reife EcAP enthält Aminosäuren (Dassa, J. et al., "The Complete Nucleotide Sequence of the Escherichia coli Gene AppA Reveals Significant Homology Between pH 2,5 Acid Phosphatase and Glucose-1-Phosphatase," J. Bacteriology, 172: 5497–5500 (1990), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Ostanin et al. haben appA en E. coli BL21 überexpressiert indem sie einen pT7 Vektor benutzten und es erhöhte sich die Phosphatase-Aktivität um das ca. 400-fache (440 mU/mg Protein) (Ostanin, K. et al., "Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase," J. Biol. Chem., 267: 22830–22836 (1992), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Es war vorher nicht bekannt, dass das Produkt des appA Gens Phytase-Aktivität besitzt.
Das appA Gen kann in einem prokaryotischen Expressionssystem System expressiert werden. Es kann eine Vielfalt an Wirts-Vektor-Systemen verwendet um die Sequenz oder Sequenzen zu expressieren, die das Protein kodieren. Die bevorzugten Vektoren enthalten einen viralen Vektor, ein Plasmid, ein Kosmid oder ein Oligonukleotid. Vor allem aber muß das Vektorsystem kompatibel mit der verwendeten Wirtszelle sein. Die Wirt-Vektor-Systeme enthalten folgende, beschränken sich aber nicht ausschließlich auf diese: Bakterien, transformiert mit bakteriophager DNA, Plasmid DNA oder Kosmid DNA; Mikroorganismen wie Hefe, die Hefe-Vektoren enthalten; Zellsysteme von Säugetieren, die mit einem Virus infiziert sind (z.B. Vaccinia-Virus, Adenovirus, usw.); Zellsysteme von Insekten, die mit einem Virus infiziert sind (z.B. Baculovirus) sowie Zellen aus Pflanzen, die mit Bakterien infiziert sind. Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren in ihrer Potenz und Spezifizität. Abhängig vom verwendeten Wirt-Vektor-System kann man irgendeines der vielen geeigneten Transkriptions- und Traduktionselemente verwenden. Die bevorzugten Wirte für die Expression von appA enthalten Hefearten, die als Wirtszellen für die vorliegende Erfindung verwendet werden können. Die bevorzugten Hefe Wirtszellen enthalten verschiedene Stämme von Saccharomyces cerevisiae. Es können auch andere Hefen verwendet werden wie Kluyveromyces, Torulaspora und Schizosaccharomyces. In einer bevorzugten Ausführung ist der verwendete Hefestamm für die Überexpression des Proteins das Saccharomyces cerevisiae.
In einer anderen bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung ist der Hefestamm ein methylotropher Hefestamm. Die methylotrophen Hefen sind jene Arten von Hefe, die in der Lage sind, Methanol als Kohlenstoff-Quelle für die Erzeugung von jenen energetischen Ressourcen zu verwenden, die nötig sind um die Zellfunktion beizubehalten und sie enthalten ein Gen für die Expression von Oxydase Alkohol. Die typischen methylotrophen Hefen enthalten Teile der Gattungen Pichia, Hansenula, Torulopsis, Candida und Karwinskia. Diese Gattungen von Hefen sind in der Lage, Methanol als einzige Kohlenstoff-Quelle zu verwenden. In einer bevorzugten Ausführung ist der methylotrophe Hefestamm Pichia pastoris.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität. Das appA Gen wird in Pichia und in Saccharomyces cerevisiae expressiert mit einem daraus resultierenden Protein, das eine viel höhere extrazelluläre Aktivität mit einem bevorzugt optimaleren pH von 2,5 bis 3,5 aufweist.
Eine bevorzugte Ausführung der Erfindung ist ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität mit einer optimalen Aktivität in einem Temperaturbereich zwischen 57 und 65°C. Eine noch bevorzugtere Ausführung ist ein Protein oder Polypeptid, welches Phytase-Aktivität hat, wo der optimale Temperaturbereich zwischen 58 und 62°C liegt.
Eine weitere bevorzugte Ausführung ist ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität, wobei das Protein mindestens 40% seiner Aktivität hält, nachdem das Protein 15 Minuten lang auf 80°C erhitzt wurde. Noch bevorzugter ist ein Protein, das Phytase-Aktivität aufweist, wobei das Protein mindestens 60% seiner Aktivität hält, nachdem man es 15 Minuten lang auf 60°C erhitzt hat.
Das Protein kann man über mehrere Verfahren purifizieren. Das Protein oder Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise durch konventionelle Verfahren in purifizierter Form erzeugt (vorzugsweise mindestens ca. 80%, besser noch 90%, pur). Typischerweise wird das Protein oder Polypeptid der vorliegenden Erfindung in den Nährboden der rekombinanten Wirtszellen abgesondert. Alternativ dazu wird das Protein oder Polypeptid der vorliegenden Erfindung erzeugt jedoch nicht in den Nährboden abgesondert. In diesen Fällen verbreitet man, um das Protein zu isolieren, die Wirtszelle, welche ein rekombinantes Plasmid enthält, lysiert es durch Sonikation, Hitze oder chemische Behandlung und das Homogenisat wird zentrifugiert, um die Zellreste zu entfernen. Anschließend wird das Überstand einer sequenziellen Fällung mit Ammoniumsulfat unterzogen. Jener Teil, der das Polypeptid oder Protein der vorliegenden Erfindung enthält, wird der Filterung in Gel in einer Dextran- oder Polyacrylamid-Säule von geeigneter Größe unterzogen, um die Proteine zu separieren. Sollte es notwendig sein, kann der proteinische Teil zusätzlich durch HPLC purifiziert werden.
Die vorliegende Erfindung liefert auch einen Hefestamm, der ein aus bakteriellen Zellen isoliertes appA Gen enthält, dessen appA Gen ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität kodiert und welches auf funktionelle Weise mit einem Promotor verbunden ist, der in der Lage ist, die Pytase in Hefe zu expressieren, wobei dieses Protein oder Polypeptid eine erhöhte Thermostabilität aufweisen soll, wenn es in einer Wirtszelle aus Hefe expressiert wird, im Vergleich zu diesem expressierten Protein oder Polypeptid in einer Wirtzelle, die nicht aus Hefe ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Vektor um Phytase in Hefe zu expressieren. Der Vektor trägt ein aus bakteriellen Zellen isoliertes appA Gen, dessen Gen ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität kodiert. Das appA Gen kann auf jedem Vektor geklont werden, der sich selbständig repliziert oder sich in das Genom von Hefen integriert. Die Anzahl der Kopien an Plasmiden, die sich selbständig replizieren, zum Beispiel das Plasmid YEp, kann höher sein, aber seine mitotische Stabilität, kann unzureichend sein (Bitter et al., "Expression and Secretion Vectors for Yeast," Meth. Enzymol., 153: 516–44 (1987), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Sie können die Sequenz des Plasmids 2-mu enthalten, das für die selbständige Replizierung verantwortlich ist, sowie eine Sequenz von E. coli, verantwortlich für eine Replizierung in E. coli. Vorzugsweise enthalten die Vektoren einen genetischen Marker für die Selektion an Transformanten von Hefen sowie ein Antibiotikum-resistentes Gen für die Selektion in E. coli. Die episomalen Vektoren, welche die Sequenzen ARS und CEN enthalten, erscheinen als eine einzige Kopie pro Zelle und sind stabiler als die YEp Vektoren. Es werden Integrations-Vektoren verwendet, wenn eine oder mehrere Kopien eines DNA Fragments in ein Hefe-Genom integriert werden. In diesem Fall ist die rekombinante DNA stabil und man benötigt keine Selektion (Struhl et al., "High-Frequency Transformation of Yeast: Autonomous Replication of Hybrid DNA Molecules," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035–39 (1979); Powels et al., Cloning Vectors, I–IV und folgende. Elsevier, (1985); Sakai et al., "Enhanced Secretion of Human Nerve Growth Factor from Saccharomyces cerevisiae Using an Advanced δ-Integration System; Biotechnology 9: 1382–85 (1991), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden werden). Einige Vektoren haben einen Replizierungsursprung, der in der selektierten Wirtszelle funktioniert. Die geeigneten Replizierungsursprünge enthalten 2 μ, ARS1 und 25 μM. Die Vektoren haben Plätze für Restriktions-Endonukleasen für das Einfügen des Verschmelzungs-Gens sowie der Promotoren und Marker der Selektion. Die Vektoren können modifiziert werden indem Restriktionsplätze eliminiert oder hinzugefügt werden oder andere nicht erwünschte Nukleotiden eliminiert werden.
Das appA Gen kann unter die Kontrolle eines jeden Promotors gestellt werden (Stetler et al., "Secretion of Active, Full- and Half-Length Human Secretory Leukocyte Protease Inhibitor by Saccharomyces cerevisiae," Biotechnology, 7: 55–60 (1989), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Es kann ein konstitutiver oder regulierter Hefe Promotor gewählt werden. Die geeigneten Promotor-Sequenzen für Hefe-Vektoren enthalten, unter anderem, Promotoren für Metallthionein, 3-Phosphoglycerat Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) oder andere glykolythische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); sowie Holland et al., Biochem., 17: 4900 (1978), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden werden), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Hexokinase, Pyrovat Decarboxylase, Phosphofruktokinase, Glukose-6-Phosphat Isomerase, 3-Phosphoglycerat Mutase, Pyrovat Kinase, Triosephosphat Isomerase, Phosphoglukose Isomerase sowie Glukokinase. Andere geeignete Vektoren und Promotoren für ihre Anwendung in der Expression von Hefe werden noch detaillierter im Dokument EP A-73.657 von Hitzemann beschrieben, welches in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird. Eine andere Alternative ist der Glukose-repressible Promotor ADH2, beschrieben durch Russell et al.; J. Biol. Chem., 258: 2674 (1982) sowie Beier et al., Nature, 300: 724 (1982), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden werden.
Es kann ein konstitutiver oder regulierter Hefe-Promotor gewählt werden. Die starken Promotoren wie zum Beispiel das Gen der Phosphoglycerat Kinase (PGK), andere Gene, die glykolythische Enzyme kodifizieren und das Gen des Alpha-Faktors sind konstitutiv. Wenn ein konstitutiver Promotor angewendet wird, wird das Produkt während des Zellwachstums synthetisiert. Der ADH2 Promotor wird mit Ethanol und Glukose reguliert, Die GAL-1-10 y GAL7 Promotoren mit Galaktose und Glukose, der PHO5 Promotor mit Phosphat und der Metallothionein Promotor mit Kupfer. Die Hitzeschock-Promotoren, zu denen der HSP150 Promotor gehört, werden durch die Temperatur geregelt. Es können auch Hybrid-Promotoren angewendet werden. Man verwendet einen regulierten Promotor, wenn eine ununterbrochene Expression des gewünschten Produktes für die Wirtszellen schädlich ist.
Anstatt von Hefe-Promotoren kann ein starker prokariotischer Promotor verwendet werden wie der T7 Promotor, aber in diesem Fall ist der Hefestamm zu transformieren und zwar mit einem Gen, das die jeweilige Polymerase kodiert. Für die Beendigung der Transkription benützt man den HSP150 Terminator oder jeden anderen funktionellen Terminator. Hier werden die Promotoren und Terminatoren als Kontrollelemente bezeichnet. Die vorliegende Erfindung ist auf keinen spezifischen Vektor, Promotor oder Terminator beschränkt.
Der Vektor kann auch einen selektierbaren Marker enthalten. Die selektierbaren Marker sind häufig Gene, die Antibiotika-resistent sind oder Gene, die in der Lage sind, jene Hefestämme zu ergänzen, welche gut charakterisierte metabolische Mängel aufweisen, solche wie z.B. mangelhafte Mutanten in Triptophan oder Histidin. Die bevorzugten selektierbaren Marker inkludieren URA3, LEU2, HIS3, TRP1, HIS4, ARG4 oder Gene, die Antibiotika-resistent sind. Der Vektor kann auch einen Replizierungsursprung haben, der in der Lage ist in einer bakteriellen Zelle zu replizieren. Die Manipulation von Vektoren ist in Bakterienstämmen wirksamer. Die bevorzugten Ursprünge von bakterieller Replizierung sind CoIE1, Ori oder oriT.
Es kann eine Leitsequenz der Hefe-Gene oder der Phytase-Gene verwendet werden, oder von anderen Quellen um die Abscheidung des im Mittel expressierten Phytase-Enzyms zu unterstützen. Die vorliegende Erfindung beschränkt sich auf keine spezifische Art der Leitsequenz oder des Signal-Peptids.
Die geeigneten Leitsequenzen inkludieren die Leitsequenz des Alpha-Faktors von Hefen, anwendbar für die direkte Abscheidung der Phytase. Die Leitsequenz des Alpha-Faktors wird häufig zwischen die Promotor-Sequenz und die Sequenz des Struktur-Gens eingefügt. (Kurjan et al., Cell 30; 933, (1982); Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, (1984); Patent der USA: Nr. 4.546.082 und veröffentlichte Europäische Patentanmeldung Nr. 324.274, die in dieses Dokument als Referenz eingebunden werden). Eine andere geeignete Leitsequenz ist die MF alfa I (Alpha Faktor) von S. cerevisiae, welche in prepro-Form von 165 Aminosäuren synthetisiert wird, wobei das Signal oder Prepeptid von 19 Aminosäuren enthalten ist, gefolgt von einem „Leiter" oder Propeptid von 64 Aminosäuren, der drei Plätze von N-Glycolsilierung umfasst, gefolgt von (LysArg(Asp/Glu,Ala)2-3 Alpha Faktor)4 (Kurjan et al., Cell 30; 933–43, (1982) die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Der Teil des Leitsignals von preproMF Alpha-1 wurde weitgehend eingesetzt um die Synthese und Abscheidung der heterologen Proteine in S. cerevisiae zu gewinnen. Man kennt die Anwendung von Leitsignal-Peptiden homolog zu Hefe aus dem Patent der USA Nr. 4.546.082, aus den Europäischen Patentanmeldungen Nr. 116.201; 123.294; 123.544; 163.529 und 123.289 sowie aus der Patentanmeldung DK Nr. 3614/83, die in dieses Dokument als Referenz eingebunden werden). In der Europäischen Patentanmeldung Nr. 123.289, die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird, wird die Verwendung des S. cerevisiae a-Faktor Vorläufers beschrieben, hingegen wird im Dokument WO 84/01153, welches in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird, die Verwendung des Signal-Peptids der Invertase von Saccharomyces cerevisiae aufgezeigt und die deutsche Patentanmeldung DK 3614/83, die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird, zeigt die Verwendung des Signal Peptids PHO5 der Saccharomyces cerevisiae für die Abscheidung von fremden Proteinen auf.
Das Leitsignal des Alpha-Faktors der Saccharomyces cerevisiae (MF Alpha 1 oder MF Alpha 2) kann auch im Abscheidungsprozess von heterologen Proteinen verwendet werden, die in Hefe expressiert werden (Patent der USA Nr. 4.546.082, Europäische Patentanmeldungen Nr. 16.201; 123.294; 123.544 und 163.529, die in dieses Dokument als Referenz eingebunden werden). Mittels Verschmelzung einer DNA Sequenz, welche die Leitsignal-Sequenz von MF Alpha 1 von S. cerevisiae am 5'-Ende des Gens kodiert, hat sich die Abscheidung und Verarbeitung des gewünschten Proteins gezeigt. Die Verwendung des Amylase Signal-Peptids der Speicheldrüse der Maus (oder ein Mutant dessen) um die Abscheidung von heterologen Proteinen zu gewährleisten, die in Hefe expressiert sind, wurde in den veröffentlichten Patentanmeldungen PCT Nr. WO 89/02463 und WO 90/10075, die in dieses Dokument als Referenz eingebunden werden, beschrieben.
Das Patent der USA Nr. 5.726.038 beschreibt die Verwendung des Signal Peptids der aspartischen Protease 3 von Hefe, die imstande ist, eine verbesserte Abscheidung der Proteine, die in Hefe expressiert sind, zu gewährleisten. Die Fachleute dieser Materie kennen andere geeignete Leitsequenzen um die Abscheidung der rekombinanten Polypeptide aus Hefe-Wirtszellen zu erleichtern. Eine Leitsequenz kann nahe ihres 3'-Endes modifiziert werden, um einen oder mehrere Restriktions-Plätze zu enthalten. Dies erleichtert die Verschmelzung der Leitsequenz mit dem Struktur-Gen.
Die Fachleute der Materie kennen Protokolle zur Transformation von Hefe. Eines dieser Protokolle wird in Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929 (1978) beschrieben, das in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird. Das Protokoll von Hinnen et al. wählt Trp Transformanten in einem selektiven Mittel, wobei dieses selektive Mittel zu 0,67% aus Hefe-Stickstoff, zu 0,5% aus Kasaminosäuren, zu 2% aus Glukose, zu 10 μg/ml aus Adenin und zu 20 μg/ml aus Uracil besteht.
Das appA Gen kann sich in einem stabilen Expressions-Vektor, in einem künstlichen Chromosom oder durch Integration in das Chromosom der Hefe Wirtszelle halten. Die Integration in das Chromosom kann erreicht werden, indem man das appA Gen klont und zwar in einem Vektor, der sich mit dem Chromosom der Hefe rekombiniert. Die geeigneten Vektoren können nukleotide Sequenzen enthalten, die mit nukleotiden Sequenzen des Hefe-Chromosoms homolog sind. Alternativ dazu kann man das appA Gen zwischen Plätzen der Rekombination lokalisieren, wie z.B. transposable Elemente, die das Gen innerhalb des Chromosoms bewegen können.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Erzeugung von Phytase, wobei ein aus bakteriellen Zellen isoliertes appA Gen hervorgebracht wird, das ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität kodiert und das Gen in einer Wirtszelle expressiert werden kann, die ein Hefestamm ist. Vorzugsweise wird das appA Gen aus Escherichia coli isoliert. Die bevorzugten Hefestämme sind Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora und Schizosaccharomyces, besonders der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae.
Es wird auch ein Verfahren geliefert, um Phytat in Inositol und anorganisches Phosphor umzuwandeln. Es wird ein appA Gen aus bakteriellen Zellen isoliert, wobei man Verfahren anwendet die in diesem Fachbereich bestens bekannt sind. Anschließend wird ein Protein oder Polypeptid mit Phytase Aktivität in der Wirtszelle ausgehend vom Gen expressiert. Das daraus resultierende Protein oder Polypeptid mischt sich oder tritt mit dem Phytat in Kontakt. Dieses Verfahren ist besonders für die Bearbeitung des Phytats in Speisen oder Tierfutter nützlich.
Das bevorzugte appA Gen wird aus Escherichia coli isoliert. Obwohl das Phytase Enzym, das in einem Hefesystem erzeugt wurde, Phytat-P aus Mais und Soja genauso effizient freigesetzt hat wie die derzeit am Markt befindliche Phytase, so scheint diese allerdings thermostabiler zu sein. Dieses System der Überexpression von Phytase in Hefe kann angewendet werden, um thermostabile Phytase hervorzubringen, die in der Lebensmittel- und Tierfutterindustrie Verwendung findet.
BEISPIELE
Beispiel 1. Stoffe und Verfahren um PhyA in E. coli, S. lividans und in einem Saccharomyces System zu überexpressieren.
Phytase Gen, Wirt-Stämme sowie Expressionsplasmide. Das Phytase Gen phyA wurde freundlicherweise von Herrn Dr. E. J. Mullaney des USDA zur Verfügung gestellt. Das Gen (Zugangsnummer zu GenBank M94550) war im Plasmid pMD4.21 im Stamm HB101 von E. coli enthalten. Ein Fragment SphI von 2,7 kb von A. niger DNA enthielt die Kodierungs-Region der deglykosylierten Phytase und ihre flankierenden Sequenzen 5' und 3'. Ein Plasmid, welches die Sequenz des Signal-Peptids SpxY enthielt, des Gens der aktiven Xylanase von Aureobasidum pullulans (Zugangsnummer zu GenBank U10298) wurde freundlicherweise durch Herrn Dr. X. L. Li der Universität Georgia zur Verfügung gestellt. Der Stamm von E. coli DH5α wurde als Initial-Wirt für alle rekombinanten Plasmide verwendet. Um phyA in E. coli zu expressieren wurden der Expressions- Vektor pET25b(+) (Novagen, Madison, WI) und der Expressions-Wirt BL21 (DE3)pLysS verwendet. Um phyA in S. lividans TK 24 zu expressieren, wurde das Plasmid pSES1 (Jung, E. D. et al., "DNA Sequences and Expression in Streptomyces Lividansoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene from Thermomonospora fusca," Appl. Environ. Microbiol., 59: 30302–42 (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) für die Konstruktion vom Shuttle-Plasmid verwendet (von Dr. D. B. Wilson der Universität Cornell, der es seinerseits von Dr. D. A. Hopwood, John Innes Institute, Norwich, England erhielt). Um phyA in Hefen zu expressieren, wurde der Expressions-Vektor pYES2 sowie der Wirt-Stamm von S. cerevisiae, INVSc1 (Invitrogen, San Diego, CA) verwendet.
Konstruktionen und Transformationen der Plasmid Kassette. Alle konstruierten Plasmide sowie die entsprechenden Wirte werden in Tabelle 1 aufgezählt. Ein 1,4 kB PCR Fragment des phyA Gens wurde aus pMD4.21 vergrößert, wobei zwei Primer dafür verwendet wurden: Sequenz oben 5'-CGG AAT TCG TCA CCT CCG GAC T-3' (SEQ ID Nr. 1) und Sequenz unten 5'-CCC AAG CTT CTA AGC AAA ACA CTC-3' (SEQ ID Nr. 2). Das daraus resultierende Fragment enthielt die Kodier-Sequenz der deglykosylierten Phytase von A. niger, PhyA, sowie die Restriktions-Plätze von EcoRI und HindIII Sequenz oben bzw. unten. Nach der Purifikation mit dem Kit Geneclean II (Bio101, Inc., La Jolla, CA), wurde das Fragment in pET25b(+)eingefügt und das daraus resultierende pEP1 (6893 pb) Konstrukt transformierte sich in BL21(DE3)pLysS nachdem es anfänglich in DH5α Zellen bestätigt wurde. Die Expression wurde vom Promotor T7 kontrolliert, gefolgt von der Leitsequenz (pel B), die 21 Aminosäuren und phyA kodiert. Der mit dem Vektor pET25(+) transformierte Wirt wurde nur als Kontrolle verwendet. Tabelle 1. Expressions-Vektoren, Konstruktionen und ihre Wirt-Stämme, die in der Studie verwendet wurden.

1 Spe2 ist das Signal-Peptid für die Endoglucanase E2 von T. fusca (Wilson, D. B., "Biochemistry and Genetics of Actinomycete Cellulases," Crit. Rev. Biotechnol., 12: 45–63 (1992), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird); Spxy ist das Signal-Peptid der Xylanase von A. pullulans (Li und Ljungdahl, "Cloning, Sequencing, and Regulation of a Xylanase Gene from the Fungus Aureobasidium pullulans Y-2331-1", Appl. Environ. Microbiol. 60: 3160–66 (1994); Li und Ljungdahl, "Expression of Aureobasidium pullulans xynA in. and Secretion of the Xylanase from Saccharomyces cerevisiae," Appl. Environ. Microbiol, 62: 209–13 (1996), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird); und Sphy ist das Signal-Peptid von phyA von A. niger (Hartingsveldt et al., "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger," Gene 127: 87–94 (1993) die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird).
2 Jung, E. D. et al., "DNA Sequences and Expression in Streptomyces Lividansoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene from Thermomonospora fusca," Appl. Environ. Microbiol., 59: 3032–43 (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird.

Die Konstruktion des Plasmids für die Expression von phyA in S. lividans begann mit der Synthese eines Fragments, das den pLT1 Promotor und das Spe2 Signal-Peptid enthielt (Lao, G. et al., "DNA Sequences of Three Beta-1,4-endoglucanase Genes From Thermomonospora fusca," J. Bacteriol., 173: 3397–407 (1991), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Ein Sequenzprimer oben, 5'-CAG CTA TGA CCA TGA TTA CGC C-3' (SEQ ID Nr. 3) und ein Sequenzprimer unten 5'-CCT AGA ACG GGA ATT CAT TGG CCG CC-3' (SEQ ID Nr. 4), enthielten die Restriktions-Plätze PstI bzw. EcoRI. Das Fragment wurde aus pBW2 vergrößert (Jung, E. D. et al., "DNA Sequences and Expression in Streptomyces lividans of an Exoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene From Thermomonospora fusca," Appl. Environ. Microbiol., 59: 3032–43 (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) und anschließend wurde mit PstI und EcoRI verdaut, während das pEP1 Konstrukt und das Plasmid pBluescript SK⁺ (Stratagene, La Jolla, CA) mit EcoRI und HindIII bzw. mit PstI und HindIII verdaut wurden. Danach wurden alle drei verdauten Fragmente purifiziert, indem man das Kit Geneclean II verwendete und sie verknüpften sich zu einem einzigen rekombinanten Konstrukt, das die gewünschten Restriktions-Plätze von PstI und KpnI (aus pBluescript SK*) enthielt, den pLT1 Promotor und das Spe2-Leit-Peptid der Endoglukanase E2 (551 pb, Lao, G et al., "DNA Sequences of Three Beta-1,4-endoglucanase Genes From Thermomonospora fusca," J. Bacteriol., 173: 3397–407 (1991), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) sowie das phyA Gen (1365 pb). Nachdem das Konstrukt mit PstI und KpnI verdaut wurde, wurde das daraus resultierende Fragment in den Expressions-Vektor pSES1 eingefügt und das geformte Shuttle-Plasmid (pSPP1, 9131 pb) verwandelte sich in die Protoplaste des Wirts S. lividans laut Hopwood et al. (Hopwood, D. A. et al., Genetic Manipulation of Streptomyces – A Laboratory Manual, Gesellschaft John Innes, Norwich, England (1985), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Auf diese Weise präparierte man eine transformierte S. lividans Kontrolle, wobei mit dem Expressionsvektor pSES2 transformiert wurde.
Es wurden drei Shuttle-Plasmide mit drei Sequenzen von unterschiedlichen Signal-Peptiden konstruiert, um phyA im Hefe-System zu expressieren (siehe Tabelle 2). Das erste Plasmid entstand aus einem Fragment von pSPp1, das mit HindIII verdaut wurde und folgendes enthielt: den pLT1-Promotor, die Leitsequenz Spe2 und die Sequenz der Kodier-Region von phyA. Das Fragment verknüpfte sich am Platz HindIII von pYES2, das mit intestinaler alkaliner Phosphatase des Kalbes behandelt wurde, wobei man das Plasmid pYEP1 (7783 pb) benannte, nachdem die korrekte Orientierung bestätigt wurde. Das zweite Plasmid enthielt Spxy, eine Signal-Peptid-Sequenz des Xylanase Gens von A. pullulans (Li, X. L. et al., "Cloning, Sequencing and Regulation of a Xylanase Gene From the Fungus Aureobasidium pullulans Y-2311-1," Appl. Environ. Microbiol., 60: 3260–166 (1994); Li, X. L. et al. "Expression of Aureobasidium pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From Saccharomyces cerevisiae," Appl. Environ. Microbiol., 62: 209–13 (1996), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) sowie das phyA Gen. Spxy verband sich mit phyA durch überlappende Extension (Horton, R. M. "In Vitro Recombination and Mutagenesis of DNA: SOEing Together Tailor-Made Genes," PCR Protocols: Current Methods and Applications, 251–61 (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) mit zwei aufeinanderfolgenden Schritten von PCR. Ein war für die Vergrößerung der Sequenz Spxy aus pCE4 (Li, X. L. et al., "Expression of Aureobasidium pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From Saccharomyces cerevisiae," Appl. Environ. Microbiol., 62: 209–213 (1996), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) unter Verwendung eines Sequenzprimers oben (5'-CCC AAG CTT GAT CAC ATC CAT TAC-3') (SEQ ID Nr. 5) mit einem Restriktions-Platz HindIII (Primer 1) und einem Sequenzprimer überlappend unten (5'-CGG GGA CTG CTA GCG CAC GTT CGA T-3', Primer 2) (SEQ ID Nr. 6). Die andere PCR war für die Vergrößerung der Kodier-Region von phyA aus pEP1 unter Verwendung eines Sequenzprimers überlappend oben (5'-ATC GAA CGT GCG CTA GCA GCA GTC CCC G-3', Primer 3) (SEQ ID Nr. 7) sowie ein Sequenzprimer unten (5'-GCT CTA GAC TAA GCA AAA CAC TCC-3', Primer 4) (SEQ ID Nr. 8) mit Restriktions-Platz XbaI. Der zweite Schritt von PCR wurde durchgeführt, um die zwei, aus den vorherigen PCR entstandenen, Fragmente zu verbinden, indem die zwei purifizierten Fragmente als Vorlagen und Primer 1 und 4 verwendet wurden. Das daraus resultierende Fragment enthielt Restriktions-Plätze HindIII und XbaI und es wurde in pSES2 geklont. Dieses Plasmid wurde pYXP1 (7219 pb) benannt. Das dritte Plasmid enthielt die Signal-Peptid-Sequenz (Sphy) von phyA sowie die Kodier-Region von phyA, wobei das Intron zwischen ihnen ausgeschlossen war (Hartingsveldt, W. van., et al., "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger," Gene 127: 87–94 (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Es wurden zwei Primer verwendet, einen Sequenzprimer oben von 70 pb, der das Signal-Peptid mit einem Restriktions-Platz KpnI enthielt, der durch genetische Manipulation inkludiert wurde sowie einen Sequenzprimer unten, derselbe, der auch beim Konstrukt pYXP1 verwendet wurde (Primer 4) um das gewünschte Fragment aus pEP1 zu vergrößern. Das Produkt von PCR wurde mit KpnI y XbaI verdaut und wurde in pSES2 geklont, woraus ein Plasmid benannt als pYPP1 (7176 pb) resultierte. Die drei vorherigen Konstruktionen wurden in S. cerevisiae transformiert, und zwar durch das Verfahren von Ito et al., "Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations,", J. Bacteriol., 153: 163–68 (1983), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird. Tabelle 2. Signal-Peptide, die für die Expression von phyA in S. cerevisiae verwendet werden

1 Die Phytase-Aktivität wurde auf dem Überstand der Zellkultur erkannt, auf Sabouraud-Raffinose-Nährboden, 15 Stunden nach der Induktion unter Beigabe von Galaktose. Siehe die Definition der Phytase Einheiten im Text.
2. Expressionsvektor für S. cerevisiae, als Kontrolle verwendet.

Nährboden und Induktion der Gen-Expression. Im E. coli-System wurden die Transformanten in 50 ml des LB-Mittels gezüchtet, welches 50 μg/ml Ampicillin bei 30°C enthielt. Nachdem der OD₆₀₀ Wert des Mittels 0,5 bis 0,6, erreicht hatte, wurde die Expression des Phytase-Gens in den Nährboden unter Beigabe von IPTG (Isopropyl b-D-thiogalaktopyranosid) induziert bis am Ende eine Konzentration von 1 mM erreicht wurde. Drei Stunden nach der Induktion wurden die Zellen eingesammelt, wobei 15 Minuten lang zu 8000 × g zentrifugiert wurde, weiterhin wurden sie mit 1 × PBS gewaschen sowie mit Lysozym lysiert. Die lösliche sowie die nicht lösliche Fraktion der Zellen wurden präpariert und ein Muster, das insgesamt 500 μg Protein enthielt (Lowry, O. H. et al., "Protein Measurement With the Folin Phenol Reagent," J. Biol. Chem., 193: 265–75 (1951), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) wurde im selben Volumen des Puffers 2 × SDS suspendiert und in SDS-PAGE analysiert (Laemmli, U. K., "Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4," Nature (London), 227: 680–85 (1970), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird).
Das rekombinante S. lividans wurde im Mittel TSB mit 5 μg/ml thiostrepton bei 30°C gezüchtet (Jung, E. D. et al., "DNA Sequences and Expression in Streptomyces lividans of an Exoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene from Thermomonospora fusca," Appl. Environ Microbiol. 59: 3032–43 (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Nach 72 Stunden Inkubationszeit wurden die Zellen und die Mittel eingesammelt und für SDS-PAGE präpariert (Wilson, D. B., "Biochemistry and Genetics of Actinomycete Cellulases," Crit. Rev. Biotechnol. 12: 45–63 (1992), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird).
Die Transformanten von S. cerevisiae wurden zu Beginn im Mittel (100 ml) Sabouraud-Raffinose (4%), ohne Uracil, 48 Stunden lang gezüchtet, anschließend wurde dem Mittel sterile Galaktose (2%) hinzugefügt, um die Expression in Phytase zu induzieren. Es wurden die Muster der Mittel eingesammelt sowie der Zellen zu verschiedenen Zeit-Intervallen eingesammelt und es wurden extra- und intrazelluläre Muster präpariert, wie beschrieben in: Li und Ljungdahl, "Expression of Aureobasidium pullulans xynA in, and Secretion of the Xylanase from Saccharomyces cerevisiae," Appl. Environ. Microbiol., 62: 209–13 (1996), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird. Bei Bedarf, wurde der Überstand der expressierten Fraktionen von Zellkulturen mit Agitations-Zellen von Amicon (Beverly, MA) konzentriert, wobei die Membranen YM10 (MF Cutoff von 10.000) verwendet wurde. Auf die gleiche Weise wurden andere Mittel untersucht.
Enzym-Protein und Aktivitätsversuch. Mengen an Phytase-Protein, die unter unterschiedlichen Bedingungen expressiert wurden, sind mittels relativer Densitometrie von spezifischen Bändern in SDS-PAGE quantifiziert worden, wobei ein Digitales Immaging System IS-1000 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) verwendet wurde. Die Phytase-Aktivität in den Mustern der Mittel sowie der Zellen wurde so bestimmt, wie vorhin beschrieben (Piddington, C. S. et al., "The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2.5-optimum Acid Phosphatate (aph) from Aspergillus niger var. awamori," Gene, 133: 56–62 (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) und das freigesetze anorganische Phosphat wurde durch das Verfahren von Chen, P. S. et al., "Microdetermination of P," Anal. Chem. 28: 1756–58 (1956), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird), untersucht. Eine Phytase-Einheit (PU) wurde als die Enzymmenge definiert, die ein μmol anorganisches Phosphat aus Natrium-Phytat pro Minute bei 37°C freisetzt.
Analyse durch Transfer des Typs Western (Immunotransfer) Die lösliche Fraktion der Zellmasse des E. coli, welche mit der Phytase und dem Überstand des Mittels der Transformanten von S. lividans und S. cerevisiae transformiert wurde, wurde für SDS-PAGE eingesammelt. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf eine Membran aus Protran^® Nitrozellulose transferiert (Schleicher und Schuell, Keene, NH, USA) und zwar in Tris-HCl 20 mM (pH 8,3), Methanol zu 20% und SDS zu 0,1%, wobei eine Einheit von Mini-Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories) verwendet wurde. Der Transfer wurde eine Nacht lang bei konstanten 50 V durchgeführt und die Temperatur des Initial-Puffers betrug 4°C. Anschließend wurden die Membranen der Analyse durch Transfer des Typs Western unterzogen. Als erster Antikörper wurde eine polyklonale IgG von Hasen verwendet (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. A. H. J. Ullah des USDA. Auflösungsverhältnis 1:5.000) gegenüber der purifizierten Nativ-Phytase von A. niger. Der Transfer wurde beendet, indem man ein Immunotransfer-Versuchs-Kit (Bio-Rad Laboratories) verwendete, das einen sekundären Antikörper enthielt, der mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert wurde.
Analyse und Isolation der gesamten RNA. Die gesamte RNA wurde mit dem Reagenten TRIzol^TM (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) isoliert aus Transformanten der E. coli und S. cerevisiae 3 bzw. 15 Stunden nach der Induktion. Anschließend wurden die RNA Muster (10 μg pro Spur) durch Formaldehyd Agarose (1,5% gew/vol) Gel-Elektrophorese separiert und auf Hyblot Membranen transferiert (National Labnet, Woodbridge, NJ) (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 2. Auflage, Appleton und Lange, Norwalle, Ct. (1994), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Es wurde ein Fragment EcoRI-HindIII von 1,4 kb im Plasmid pEP1 präpariert und mittels Zufalls-Zündung mit ³²P markiert, indem ein DNA-markier-Kit verwendet wurde, gefolgt durch die Purifizierung in einer G-50 Säule (Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ) und danach hybridisiert mit den geblotteten RNA Membranen in einem Hybridisier-Ofen (Hybaid, Middlesex, UK). Die hybridierten Membranen wurden auf Schirme in Fuji Imaging Platten ausgesetzt und wurden in einem Bio-Imaging Analyser (Kohshin Graphic Systems, Fuji, Japan) analysiert.
Beispiel 2 – Expression von PhyA in E. coli.
Vier Stunden nach der Induktion, wurde in SDS-PAGE (12,5%) ein spezifisches Band (~55 kDa) des löslichen Zell-Teils, im Vergleich zur Kontrolle des nur mit dem Expressions-Vektor transformierten (Siehe Bilder 1 und 2) beobachtet. Dieses Band stellt 3,8% des Totals des löslichen Proteins dieses Teils dar. Dementsprechend zeigte die Analyse des Typs Northern eine Überexpression der mRNA von phyA in diesen Transformanten mit dem Gen der Phytase und man beobachtete kein Signal in den Kontroll-Zellen (Siehe Bild 3).
Um die Expression des Phytase-Proteins zu optimieren, untersuchte man die Zeitkurve sowie die Auswirkungen einer Reihe von Fakoren in der Expression. Diese Faktoren enthielten die Inkubations-Temperatur (30 und 37°C), pH des Mittels (4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 und 9,0), Anaerobiose (indem man auf den oberen Teil der Zellzucht steriles Mineralöl zugibt), Pegel des anorganischen Phosphats im Mittel (Dassa E., et al., "The Acid Phosphatases with Optimum pH of 2.5 of Escherichia coli," J. Biol. Chem. 257: 6669–76 (1982), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) und Natrium-Phytat (0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 und 0,5 mM). Die Resultate zeigten, dass sich das expressierte Phytase-Protein die ersten sechs Stunden nach der Induktion linear zur Zeit sammelte (Siehe Bild 4). Danach blieb die Expression relativ unverändert, obwohl die bakteriellen Zellen weiter wuchsen. Lediglich der pH des Mittels sowie die Konzentration des Natrium-Phytats hatten bedeutenden Einfluß auf die Expression des Phytase-Proteins. Das maximale Protein zeigte sich bei pH 6,0 und bei 0,3 mM Natrium-Phytat, wobei das Phytase-Protein von 3,8% auf 9,6% des gesamten löslichen Proteins zunahm.
Es wurde keine extra- oder intrazelluläre Phytase-Aktivität beobachtet. Dies könnte nicht ganz unerwartet sein, denn die Nativ-Phytase von A. niger ist ein Glykoprotein mit einer Größe von 70–80 kDa (Hartingsveldt et al., "Cloning Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger," Gene 127: 87–94 (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Das im E. coli System dieser Studie expressierte Protein wies eine Größe von ca. 55 kDa auf. Vermutlich könnte das Fehlen von Glykosilierung des Proteins sowie andere, während des Abscheidens notwendige, post-translatorische Modifizierungen die Phytase-Aktivität verhindern.
Beispiel 3 – Expression von PhyA in S. lividans.
Es wurden heterologe Gene in S. lividans expressiert wobei sich die daraus resultierenden Produkte mit enzymatischer Aktivität auf den Nährboden abschieden. (Ghangas, G. S. et al., "Cloning of the Thermomonospora fusca Endoglucanase E2 Gene in Streptomyces lividans: Affinity Purification and Functional Domains of the Cloned Gene Product," Appl. Environ. Microbiol., 54: 2521–26 (1988); Wilson, D. B., "Biochemistry and Genetics of Actinomycete Cellulases," Crit. Rev. Biotechnol., 12: 45–63 (1992); Jung, E. D. et al., "DNA Sequences and Expression in Streptomyces lividans of an Exoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene from Thermomonospora fusca," Environ. Microbiol., 59: 3032–43 (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden werden). In ähnlicher Weise expressierte sich das phyA Gen in S. lividans und das Protein wurde in das Mittel eingefügt, wie auf einem spezifischem Band der Muster der in SDS-PAGE analysierten Mittel zeigt (Siehe Bilder 5 und 6). Dies legt nahe, dass das Signal-Peptid des Gens der Endoglukanase E2 aus T. fusca in der Lage war, das Phytase-Protein aus der Zelle hinauszuleiten. Dieses Protein wies 57 kDa auf und stellte 16,2% des gesamten Proteins im Mittel dar. Wenn der pH des Mittels auf 6,0 geändert wurde und dem Mittel 0,3 mM Natrium-Phytat zugegeben wurden, dann verbesserte sich der Ertrag an Protein auf 20,3% des gesamten Proteins. Bedingt dadurch, dass das Phytase-Protein auf den Nährboden in so hohen Mengen abgeschieden wurde, müsste es leicht sein, es zu purifizieren und für eine Vielzahl von Zwecken effektiv anzuwenden, wie z.B. die Herstellung von Phytase-Antikörpern. Wiederum fand man keine Steigerung in der Phytase-Aktivität, weder im Mittel, noch auf den lysierten Zellen. Obwohl die Größe des Proteins etwas zunahm (2– 3%) verglichen mit dem in E. coli expressierten Protein, fehlte nach wie vor die Phytase-Aktivität vermutlich aufgrund der Glykosilierung des Phytase-Proteins in diesem Expressionsystem.
Beispiel 4 – Expression von PhyA in S. cerevisiae.
Es wurden drei verschiedene Signal-Peptide verwendet, um die Wirksamkeit in Bezug auf das Hinausleiten des expressierten Proteins aus den Zellen zu vergleichen (Siehe Tabelle 2). Die Phytase-Aktivität nahm im Mittel Sabouraud-Raffinose, in welchem die Transformanten pYEP1 und pYPP1, nicht aber pYXP1 gezüchtet wurden, wesentlich zu. Das sichtbare Phytase-Protein zeigte sich in SDS-PAGE 20 Stunden nach der Induktion (Bild 7).
Die Expression der Transformanten von pYEP1 und pYPP1 wurde in drei verschiedenen Sorten von Mitteln bestimmt: Sabouraud-Raffinose (Li, X. L. et al., "Expression of Aureobasidium pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From, Saccharomyces cerevisiae," Appl. Environ. Microbiol., 62: 209–13 (1996), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird) Sabouraud-Glycerol sowie ein modifiziertes YEPD Mittel für den allgemeinen Gebrauch. Für die Transformanten von pYEP1, wurde eine ähnliche Aktivität in den Mitteln Sabouraud-Raffinose und Sabouraud-Glycerol expressiert, jedoch wurde keine Aktivität im YEPD Mittel erkannt. Im Gegensatz dazu variierte die Phytase-Aktivität im Mittel, das mit Transformanten von pYPP1 gezüchtet wurde, beachtlich mit den anderen Mitteln. Bei Verwendung des Mittels Sabouraud-Glycerol potenzierte sich die Aktivität bis 375 mU/ml. Zusätzlich nahm die Aktivität bis 1675 mU/ml zu, wenn man auf das YEPD Mittel wechselte (Siehe Tabelle 3). Obwohl das YEPD Mittel viel billiger als das Mittel Sabouraud-Raffinose war, steigerte sich der Ertrag an Phytase um mehr als das zehnfache. So erreichte das Signal-Peptid des Genes der Pilz-Phytase die effektivste Expression der extrazellulären Phytase-Aktivität. Es wurde praktisch die gesamte Produktion an Protein im YEPD Mittel abgeschieden, da man in den Hefe-Zellen sehr wenig Aktivität feststellte. Die Zeitkurve der Phytase-Expression zeigt das Bild 8. Tabelle 3. Phytase-Aktivität aus Transfomanten mit pYPP1 in unterschiedlichen Mitteln. Stunden nach der Induktion (mPU/ml)¹

¹ Die Phytase Aktivität wurde im Überstand der Zellkultur in den drei Mitteln 0, 10 und 15 Stunden nach der Induktion, unter Zugabe von Galaktose, festgestellt.
Siehe die Definition der Phytase-Einheiten im Text.

Eine Vielfalt an Microorganismen, darunter Bazillen, Hefen und Fadenpilze, weisen Phytase-Aktivität auf, während der A. niger NRRL3135 Stamm die höchste Aktivität produziert (340 mU/ml, Shieh, T. R. et al., "Survey of Microorganisms for the Production of Extracelullar Phytase," Appl. Environ. Microbiol., 16: 1348–51 (1968), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird), Schwanniomyces castellii CBS 2863 hat die höchste Phytase-Aktivität unter 21 Hefestämmen (140 mU/ml, Lambrechts, C. et al., "Utilization of Phytate by Some Yeasts," Biotechnology Letters, 14: 61–6 (1992), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Offensichtlich produzierte der rekombinante Hefestamm, der in der vorliegenden Studie mit pYPP1 transformiert wurde, eine viele höhere Phytase-Aktivität (1675 mU/ml) als A. niger (4 Mal) und S. castellii CBS 2863 (11 Mal). Die maximale Phytase-Produktion im System kann erreicht werden, indem man die Inkubationsbedingungen optimiert und die Plasmid-Kasseten modifiziert. (Demolder, J. W. et al., "Efficient Synthesis of Secreted Murine Interleukin-2 by Saccharomyces cerevisiae: Influence of 3'-Untranslated Regions and Codon Usage," Gene, 111: 207–13 (1992), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird).
Der hohe Expressionspegel an Phytase-Aktivität in S. cerevisiae war nach größter Wahrscheinlichkeit durch die ausreichende Glykosilierung des Phytase-Proteins sowie andere Modifizierungen bedingt, die post-translatorisch durch Hefe durchgeführt wurden. Danach wurde der Überstand des Mittels konzentriert und einer Analyse in SDS-PAGE unterzogen, wo ein Band von ca. 110 kDa vorahanden war (Siehe Bilder 7 und 9), das größer war als das Nativ-Protein von A. niger (Hartingsveldt, W. van et al., "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger," Gene 127: 87–94 (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Die Analyse des Typs Northern hat die spezifische Überexpression des mRNA von phyA bestätigt (Siehe Bild 10). Diese Resultate zeigten, dass das Hefe-System wirksam war, um aktiv ein extrazelluläres Phytase-Enzym zu überexpressieren. Das Hefe-System hat gegenüber Bakterien-Systemen oder anderen Systemen wie z.B. A. niger mehrere Vorteile (Hartingsveldt, W. van. et al., "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger," Gene 127: 87–94 (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Es führt post-translatorische Modifizierungen aus, die eine geeignete Faltung, Glykosilierung, die Entstehung von Disulfid-Bindern, sowie Protheolyse während der Translokation von Proteinen durch das endoplasmische Raster und durch die Zellmembrane. Die Abscheidung von Proteinen wird begünstigt durch kurze hydrophobe Signal-Peptide in den N-terminal-Regionen der proteinischen Vorläufer (Li, X. L. et al., "Expression of Aureobasidium pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From Saccharomyces cerevisiae" Appl. Environ. Microbiol., 62: 209–13 (1996), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird).
Die durch die Hefe-Zellen abgeschiedenen Proteine schützen sich vor Aggregation und vor Degradierung durch Protease. Am wichtigsten ist, dass die Enzym-Proteine, die durch S. cerevisiae erzeugt wurden, sich leicht purifizieren, da sie nur einige wenige Proteine abscheiden. Wenn man die wohl bekannte Sicherheit der Hefeprodukte, sowohl für den Menschen wie auch für die Tiere berücksichtigt, dann birgt dieses System ein großes Potential für die Lebensmittel- und Tierfutterindustrie.
Beispiel 5 – Eigenschaften der PhyA Phytase, die in Saccharomyces cerevisiae überexpressiert wird.
Phytase, die aus Transformanten des pYPP1 Plasmids überexpressiert wurde, hat man konzentriert und diente für Untersuchungszwecke (Siehe Tabelle 4). Das Enzym zeigte zwei optimale pH Intervalle: 2 bis 2,5 und 5,0 bis 5,5. Die Enzym-Aktivität bei einem pH von 2 bis 2,5 betrug allerdings nur 60% der Aktivität bei 5 bis 5,5. Es wurde weder bei pH 1 noch bei 8 eine Aktivität festgestellt. Der optimale pH war virtuell derselbe als der von der Phytase von A. niger (Simons et al., "Improvement of Phosphorus Availability by Microbial Phytase in Broilers and Pigs," Br. J. Nutr., 64: 525 (1990), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird), infolgedessen kann mit Sicherheit eine aktive Funktion in der Hydrolyse des P-Phytats in den Verdauungstrakten erwartet werden. Die optimale Temperatur des Enzyms war bei 60°C, während das Enzym das aktuell am Markt durch Gist-Brocades erzeugt wird bei 55°C ist (BASF, 1996). Über 80% der Aktivität blieb bei 50 bis 55°C bestehen, es wurde jedoch nur eine kleine Aktivität bei 75 oder 80°C festgestellt. Bei Erhitzung des Enzyms bei 37 und 80°C während 15 Minuten lang, betrug die verbleibende Aktivität der expressierten Hefe-Phytase der vorliegenden Erfindung 100% bzw. 63%, und die Aktivität der BAST-Phytase von Gist-Brocades betrug 100% bzw. 52%. Die Unterschiede zwischen den beiden Enzym-Quellen waren bei jeder Temperatur beachtlich (Siehe Tabelle 5). Dem entsprechend schien die Hefe-Phytase hitzebeständiger zu sein, als jenes im Handel befindliche Phytase-Produkt. Tabelle 4. Eigenschaften der in Hefen¹ expressierten Phytase

¹ Die Daten sind Mittelwerte der relativen Aktivität ± die typische Abweichung (n = 4). Die Mittelwerte in einer Reihe mit unterschiedlichen hochgestellten Buchstaben unterscheiden sich beträchtlich voneinander (P < 0,05). Es wurde das allgemeine lineare Modell des Statistik-Analyse-Systems (1988) verwendet, um die wichtigsten Auswirkungen der Behandlung als zufällige komplette Designs zu untersuchen und es wurde die t-Probe von Bonferroni verwendet, um die Werte der mehrfachen Behandlung zu vergleichen. Der signifikative Pegel wurde auf P < 0,05 festgelegt.
² Aktivität wurde bei 37°C versucht (siehe den Kontext betreffend Definition der Phytase-Einheit). Es wurden unterschiedliche Puffer verwendet: Glycerin-HCl 0,2 mM für pH 1,0 bis 3,5; Natrium Zitrat Puffer 0,2 mM für pH 4,0 bis 6,5 sowie Puffer Tris-HCl 0,2 mM für pH größer 7.
³ Die optimale Temperatur wurde bei pH 5,5 festgelegt (Natrium Zitrat Puffer 0,2 mM).

^1,2

¹ Die Daten sind Mittelwerte der relativen Aktivität ± die typische Abweichung (n = 3). Die Mittelwerte in einer Reihe mit unterschiedlichen hochgestellten Buchstaben unterscheiden sich beträchtlich voneinander (P < 0,05). Es wurde das allgemeine lineare Modell des Statistik-Analyse-Systems (1988) verwendet, um die wichtigsten Auswirkungen der Behandlung als zufällige komplette Designs zu untersuchen und es wurde die t-Probe von Bonferroni verwendet, um die Werte der mehrfachen Behandlung zu vergleichen. Der signifikative Pegel wurde auf P < 0,05 festgelegt.
² Enzym wurde vor seiner Reaktion bei 37°C und bei pH 5,5 15 Minuten lang auf verschiedene Temperaturen erhitzt.
³ Bedeutung (P-Werte) der t-Probe zwischen der Aktivität beider Phytasen bei jeder der festgelegten Temperaturen.

Obwohl nicht klar ist, wie diese Verbesserung bei der Thermostabilität mit den verschiedenen post-translatorischen Modifizierungen (Faltung, Aufspaltung, Glykosilierung, usw.) in Verbindung steht, (Li, X. L. et al., "Expression of Aureobasidium Pullulans XynA in, and Secretion of the Xylanase From, Saccharomyces Ceverisiae," Appl. Environ. Microbiol., 62: 209–13 (1996) die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird), ist es mit Sicherheit von Vorteil ein thermostabileres Phytase-Enzym zu haben, welches während des Granuliervorgangs des Tierfutters hitzebeständiger ist, was ja ein Problem bei der derzeitigen Phytase von Gist-Brocades darstellt.
Beispiel 6 In vitro Hydrolyse von P-Phytat aus Mais-Soja- und Weizen-Kleie durch die in Hefe expressierte Phytase.
Die in Hefe expressierte Phytase setzt Phytat P aus Mais- und Sojamehl frei, und zwar genauso effektiv wie die Phytase von Gist-Brocades basierend auf der pro Einheit-Aktivität (siehe Tabelle 6). Wie erwartet war die Hydrolyse des P-Phytats eine Funktion aus Zeit und Dosierung der Aktivität. Die in Hefe expressierte Phytase setzte auch auf effektive Weise P-Phytat aus Weizenkleie frei, was auf ihr großes Potential hinsichtlich der Brot-Fermentation schließen lässt. Da die in dieser Studie verwendete Weizenkleie eine viel höhere innerliche Phytase-Aktivität aufwies, als das herkömmlich verwendete Weizenmehl, konnte man eine viel größere Effektivität der in Hefe expressierten Phytase in Bezug auf die Verbesserung der Hydrolyse des P-Phytats des Mehls und in Bezug auf die Freisetzung von Spurenelementen erwarten, wenn man dies im Bäckereibetrieb anwendet. (Hall, M. N. et al., "The Early Days of Yeast Genetics," Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Tabelle 6. Freies Phosphor, freigesetzt aus Mais, Sojamehl (SBM) und Weizenkleie durch die in Hefe überexpressierte Phytase sowie die Pilz-Phytase A niger in vitro¹.

¹ Jede Probe zu 5 g wurde in 20 ml Natrium Zitrat Puffer 0,2 mM bei 37°C 1 oder 4 Stunden lang geschüttelt. Der Überstand wurde durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 8000 g gewonnen. Nach dem Filtern durch ein Filterpapier 541 von Whatman, unterzog man die Probe einem Versuch von freiem P durch das Verfahren von Chen, P. S. et al., "Microdetermination of P," Anal. Chem., 28: 1756–58 (1956), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Die Daten sind Mittelwerte der relativen Aktivität ± die typische Abweichung (n = 4). Es wurde das allgemeine lineare Modell des Statistik-Analyse-Systems (1988) verwendet, um die wichtigsten Auswirkungen der Behandlung als zufällige komplette Designs zu untersuchen und es wurde die t-Probe von Bonferroni verwendet, um die Werte der mehrfachen Behandlung zu vergleichen. Der signifikative Pegel wurde auf P < 0,05 festgelegt. Es gab einen beachtlichen Unterschied zwischen 1 und 4 Stunden für jedes Futter bei jeder Dosis des Enzyms, wie durch die t-Probe analysiert. Die Mittelwerte in einer Reihe mit unterschiedlichen hochgestellten Buchstaben unterscheiden sich beträchtlich voneinander (P < 0,05).
² n = 2

Man verglich die Überexpression der Phytase von Aspergillus niger (phyA) in Escherichia coli, Streptomyces lividans sowie Saccharomyces cerevisiae um ein effizientes und einfaches System zur Erzeugung von preisgünstiger Phytase zu entwickeln. Bei Verwendung des Systems pET25b(+), expressierte sich in E. coli ein intrazelluläres Protein von 55 kDa, welches 9,6% des gesamten löslichen Proteins darstellte. Ein 57 kDa extrazelluläres Protein, welches 20,3% des gesamten im Mittel befindlichen Proteins darstellte, wurde in S. lividans expressiert, indem ein Shuttle-Plasmid verwendet wurde, das den pLT1-Promotor sowie das Signal-Peptid Spell der Endoglukanase E2 enthielt. Es wurde in keinem der Expressions-Systeme eine Vermehrung der Phytase-Aktivität festgestellt, vermutlich aufgrund des Fehlens von Glykosilierung und einer weiteren notwendigen post-translatorischen Modifizierung. Im Gegensatz dazu entstand eine erhöhte extrazelluläre Phytase-Aktivität in S. cerevisiae, welche mit dem phyA Gen transformiert wurde. Es wurden drei unterschiedliche Signal-Peptide und drei unterschiedliche Mittel miteinander verglichen, um den besten Vektor und die beste Bedingung für die Expression herauszufinden. Die Verwendung vom Signal-Peptid Sphy des phyA-Gens und des Mittels YEPD erzeugte die höchste extrazelluläre Phytase-Aktivität. Die in Hefe überexpressierte Phytase betrug ca. 110 kDa, sie hatte zwei optimale pH: von 2,0 bis 2,5 sowie von 5,5, bis 6,0 und die optimale Temperatur lag bei 60°C.
Beispiel 7 – Verfahren und Materialien für die Expression von phyA in Pichia.
Wirt und Vektor. Ein EasySelect^TM-Pichia-Expressions-Kit wurde von Invitrogen (San Diego, CA) bezogen. Das Kit liefert Wirte und Vektoren um das Gen intra- oder extrazellulär zu expressieren und zwar auf Stämmen Mut⁺ oder Mut^s (langsame oder normale Anwendung des Methanols). Man verwendete X33 als Mut⁺-Stamm und KM71 als Mut^s-Stamm. Man verwendete zwei Vektoren, pPICZ B (3,3 kb) und pPICZαA (3,6 kb), beide verwenden den Promotor AOX1.
Aufbau der Expressions-Vektoren. Um die Auswirkung von verschiedenen Signal-Peptiden bei der Expression von PhyA im Pichia-System zu vergleichen, wurden zwei Konstrukte präpariert. Erstens wurde ein EcoRI-KpnI-Fragment von 1,4 kb, das die Phya-Sequenz enthielt, welche das reife Phytase-Protein kodierte in pPICzαA verbunden. In diesem Plasmid (pPICZa-phyA), war PhyA durch einen Alpha-Faktor geleitet, einem sehr gebräuchlichen Signal-Peptid der Saccharomyces cerevisiae. Zweitens wurde ein KpnI-Xbal Fragment von pYPP1 von 1,4 kb in den Vektor verbunden (die Kodier-Region von PhyA ist durch ihr eigenes Signal-Peptid geleitet, welches sehr effizient für die Abscheidung der in Saccharomyces cerevisiae expressierten Phytase war).
Transformation und Expression. Die bestätigten Konstrukte wurden mit Pmel linearisiert und wurden in GS115 und in KM71 durch das im Kit mitgelieferte EasyComp^TM umgewandelt. Man verwendete Neocin^TM um die positiven Kolonien zu selektieren. Nach dem Einimpfen einer einzigen Kolonie in 10 ml des Mittels MGY und ihrer Züchtung bis DO₆₀₀ von 2–6 bei 30°C, wurden die Zellen durch Zentrifugieren eingesammelt und wieder in 10 ml des Mittels MMY suspendiert (welches Methanol 0,5% enthielt). Die Proben wurden alle 12 oder 24 Stunden nach der Induktion eingesammelt. Die Zellen wurden vom Überstand separiert und mit Glasperlen in einem Bruch-Puffer lysiert. Die Phytase-Aktivität wurde im Überstand bestimmt sowie in Zellen, die vorhin beschrieben wurden. Es wurden SDS-PAGE-Gels durchgeführt sowie Transferierungen des Typs Western um die Größe und die relative Menge an expressiertem Protein zu bestimmen.
Beispiel 8 – Aktivität der PhyA-Phytase in Pichia
Das Expressions-Konstrukt, das den Alpha-Faktor als Signal-Peptid für phyA verwendete, verwandelte sich in zwei Pichia-Stämme. KM71 ist ein Stamm von langsamer Verwertung aus Methanol, während X33 ein Stamm von Pichia des wilden Typs ist, der Methanol wirksam verwertet. Die Selektierung und Inkubation wurden in Rührkolben von 10 ml bei 29–30°C durchgeführt. Für die Transformanten von KM71, hatten 19 der 20 selektierten Kolonien eine extrazelluläre Phytase-Aktivität, die nach der Induktion für 24 Stunden größer als 6 Einheiten/ml des Überstandes der Zucht war. Die Kolonie Nr. 13 zeigte die größte Aktivität, 26 Einheiten/ml nach Inkubation während 108 Stunden. Alle Kolonien (20/20) der Transformanten X33 hatten mehr als 10 Einheiten/ml nach der Induktion während 24 Stunden. Eine der Kolonien (Nr. 101) erzeugte eine Phytase-Aktivität von 65 Einheiten/ml des Überstandes. Auf Bild 11 wird eine Studie des Verlaufs der Phytase-Expression in KM71 und X33 zusammengefasst. Trotz des Unterschiedes dieser zwei Stämme unter Verwendung von Methanol, und dem zufolge der Fähigkeit Phytase zu expressieren, hat man befunden, dass die Hefe-Zellen den Alpha-Faktor richtig verarbeiteten. Außerdem schied sich praktisch das gesamte expressierte Protein im Mittel ab, da nicht mehr als 5% der gesamten expressierten Aktivität intrazellulär vorhanden war.
Man untersuchte die Auswirkungen des anorganischen Phosphors und des pH der Mittel an der Phytase-Expression in den Mitteln (BMGY und BMMY) unter Verwendung eines rekombinanten phyA von X33 (Nr. 101). Indem man 50 mM Phosphat in das Mittel einfügte, untersuchte man die Auswirkung verschiedener pH dieses Puffers (3, 4, 5, 6, 7 und 8) auf die Expression. Bei pH 6 erzeugte dieser Transformant von X33 75 Phytase-Einheiten/ml des Überstandes. Basierend auf der Konzentration und der SDS-PAGE Analyse, schätzte man den Ertrag der Expression des Phytase-Proteins auf zwischen 3 und 4 mg/ml.
Beispiel 9 – Eigenschaften der PhyA Phytase, expressiert in Pichia
Molekulare Größe sowie Deglykosylierung der expressierten Phytase. Als der Überstand des mit dem Transformanten PhyA eingeimpften Mittels dem SDS-PAGE unterzogen wurde, sah man ein kräftiges Band von ca. 95 kDa (Bild 12). Das war fast das einzige ersichtliche Protein im Überstand. Die expressierte Phytase reagierte effizient mit dem gewonnenen polykonalen Antikörper des Hasen gegenüber der von A. niger purifizierten nativen Phytase. Das weist darauf hin, dass die Immunreaktion der expressierten Phytase im Wesentlichen dieselbe war als jene der nativen Phytase von A. niger. Die Größe wurde durch Deklykosylierung unter Verwendung von Endo H auf 50 kDa verringert. Der phyA-Antikörper reagierte auch mit der deglykosylierten Phytase. Außerdem verringerte die Deglykosylierung, welche unter nativen Bedingungen durchgeführt wurde, die Phytase-Aktivität um ca. 15%, was zeigte, dass die Glykosylierung für die Aktivität der Phytasen von Wichtigkeit war. Außerdem beeinflusste die Glykosylierung die Thermostabilität der Enzyme (Bild 13).
Northern Analyse. Wie Bild 14 zeigt, hybridisierte eine DNA Sonde von phyA von 1,3 kb mit dem mRNA der Transformanten, die sowohl aus KM71 (Nr. 13) wie aus X33 (Nr. 101) induziert wurden. Man sah auch eine Erwiderung seitens der Transformanten vor der Induktion. Vermutlich ist die Expression von phyA in diesem System nicht strikt auf dem Level der Transkription kontrolliert worden.
Optimaler pH und optimale Temperatur sowie Hydrolyse des Phytat-Phosphors. Ähnlich wie bei der Phytase von A. niger, hatte die expressierte Phytase zwei optimale pH, 2,5 und 5,5 (Bild 15). Die optimale Temperatur der expressierten Phytase war 60°C (Bild 16). Wenn die expressierte Phytase mit Sojaproben zu 100, 200, 400 und 800 mU/g Probe bei 37°C inkubiert wurde, dann wurde Phosphor linear mit der Phytase-Dosis freigesetzt (Bild 17).
Beispiel 10 – Verfahren und Materialien für die Überexpression vom E. coli-appA-Gen in Saccharomyces cerevisiae
Gen und Protein. Dieses Gen, ursprünglich definiert als das Gen der periplasmischen Phophoranhydrid Phosphorhydrolase (appA) von E. coli, enthält 1.298 Nukleotiden (Zugangsnummer zu GeneBank: M58708). In erster Linie fand man heraus, dass das Gen in E. coli ein saures Phosphatase-Protein von einem optimalen pH zu 2,5 (EcAP) kodierte. Die saure Phosphatase ist ein Monomer mit einer Molekularmasse von 44.644 Dalton. Die reife EcAP enthält 410 Aminosäuren (Dassa, J. et al., "The Complete Nucleotide Sequence of the Escherichia coli Gene appA Reveals Significant Homology Between pH 2.5 Acid Phosphatase and Glucose-1-Phosphatase," J. Bacteriology, 172: 5497–5500 (1990), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Ostanin K. et al. haben appA in E. coli BL21 überexpressiert indem sie einen pT7 Vektor verwendeten und dabei erhöhte sich die Phosphatase-Aktivität um das ca. 400-fache (440 mU/mg Protein) (Ostanin, K. et al., "Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase," J. Biol. Chem., 267: 22830–22836 (1992), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird).
Das Gen und der Wirt-Stamm von E. coli CU 1869 (Nr. 47092) wurden aus der ATCC gewonnen. Das Gen, eine Einlage von 1,3 kb, verwandelte sich in den Stamm BL21 von E. coli (Nr. 87441) indem ein Expressions-Vektor pAPPA1 verwendet wurde (Ostanin, K. et al., "Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase," J. Biol. Chem., 267: 22830–36 (1992), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird).
Wirt und Vektor. Der Vektor für die Überexpression des appA Gens in Saccharomyces cerevisiae war pYES2 und der Wirt war INVScI (Invitrogen, San Diego, CA).
Aufbau des Expressions-Vektors. Zuerst isolierte man ein XbaI Fragment von 1,3 kb aus pAPPA1. Dieses Fragment enthielt das appA Gen mit seinem eigenen Signal-Peptid. Nach Verbinden in den XbaI Platz von pYES2, verwandelte sich das Konstrukt (PYES2-appA) in Saccharomyces cerevisiae. Jedoch, verglichen mit den Kontrollen, vermehrte sich die Phytase-Aktivität weder im extrazellulären Teil noch im intrazellulären. pAPPA1 und pYPP1 (PhyA und sein Signal-Peptid in pYES2) verwandelten sich zusammen im Hefestamm). Abermals stellte man keine Zunahme der Phytase-Aktivität aufgrund von pAPPA1 in den Mitteln oder in den Hefe-Zellen fest.
Man hat zwei Primer synthetisiert um das Signal-Peptid des PhyA-Gens mit der Kodier-Region des appA Gens aufzubauen. Eines war 80 pb lang und enthielt das Signal-Peptid aus PhyA und einen Platz KpnI am 5'-Ende: GGG GTA CCA TGG GCG TCT CTG CTG TTC TAC TTC CTT TGT ATC TCC TGT CTG GAG TCA CCT CCG GAC AGA GTG AGC CGG AG (SEQ ID Nr. 9). Der andere Primer war 24 pb lang, mit einem Platz EcoRI an seinem 3'-Ende: GGG AAT TCA TTA CAA ACT GCA GGC (SEQ ID Nr. 10).
Es wurden 25 PCR Zyklen durchgeführt, mit einer 1-minütigen Denaturalisierung bei 95°C, 1 Minute Hybridisierung bei 58°C und 1 Minute Extension der Kette bei 72°C. Es wurde ein Fragment von 1,3 kb vergrößert, es wurde in pYES2 verdaut und verbunden. Nach Bestätigung des Einfügens. Nachdem das Einfügen durch "restriction mapping" bestätigt wurde, verwandelte sich das Konstrukt (pYES2-SphyA-appA) INVScI durch das Lithium-Acetat Verfahren.
Expression. Die selektierten Transformanten wurden in das Mittel YEPD eingeimpft. Die Expression wurde, unter Zugabe von Galaktose in die Zucht, und zwar nachdem die DO₆₀₀ einen Wert von 2 erreicht hatte, induziert. Die Zellen wurden 15 oder 20 Stunden nach der Induktion eingesammelt.
Aktivitäts-Versuch. Die saure Phosphatase-Aktivität wurde bei 37°C in einem Glycin-HCl 25 mM-Puffer (pH 2,5) untersucht, wobei als Substrat p-Nitrophenyl-Phosphat verwendet wurde (Zucht-Lösung von 250 mM). Es wurden 1,7 ml Puffer der Reaktion in Proben von 0,1 ml zugegeben. Nachdem man sie 5 Minuten lang in einem 37°C warmen Wasserbad inkubiert hatte, fügte man 0,2 ml vorgewärmtes Substrat hinzu und mischte sie. Die Reaktions-Lösung wurde in ein vorgewärmtes Gefäß transferiert und 2 Minuten lang in einem spectrophotometrischen Abteil bei 37°C inkubiert. Das freigesetzte p-Nitrophenol wurde durchgehend während 5 Minuten lang bei 405 nm abgelesen, um die Enzym-Aktivität zu berechnen.
in vitro-Studie Sojamehl (5,0 g) wurde in 20 ml des 20 mM-Zitrat-Puffers suspendiert, pH 5,5, man mischte es mit 200 mU Phytase und inkubierte es bei 37°C 4 Stunden lang unter dauerndem Rühren. Nach dem Erkalten zu Eis während 10 Minuten, wurde die Suspension in ein Zentrifugenrohr transferiert und 15 Minuten lang zu 15.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde für die Bestimmung von freiem Phosphor verwendet.
Beispiel 11 – Quantifizierung der Phytase-Aktivität aus der Überexpression des E.coli-appA-Gens in Saccharomyces cerevisiae
Die saure intrazelluläre Phosphatase-Aktivität in der überexpressierten appA von E. coli (pAPPA1) betrug 440 mU/mg Protein. Als etwas noch nie da Gewesenes, fand man eine intrazelluläre Phytase-Aktivität von mehr als 4900 mU/mg Protein im umgewandelten Stamm. Es gab jedoch nur eine minimale Phytase-Aktivität in der Kontrolle (BL21). Dementsprechend kodiert dieses Gen aus saurer Phosphatase auch eine Phytase. Die Sequenz des appA Gens wurde nach der Sequenz von PhyA ausgerichtet und man fand heraus, dass sich diese beiden Gene 23% Identität teilten.
Indem man INVScI mit dem Konstrukt von pYES2-Sphy-appA (geleitet durch das Signal-Peptid von PhyA) umwandelt, erzeugte es eine extrazelluläre Phytase-Aktivität im Überstand, die 2.000 mal größer war, als jene des wilden Typs oder jene des Transformanten, welcher das appA Gen enthielt plus das eigene Signal-Peptid (Siehe Tabelle 7).
Tabelle 7. Extrazelluläre Phytase-Aktivität in Transformanten des appA Gens mit unterschiedlichen Signal-Peptiden.
In Tabelle 8 sind die Auswirkungen des Mittels (YEDP) des anorganischen Phosphors, sowie des Phytats, pH und Temperatur in der Expression von Phytase-Aktivität durch pYES2-Sphy-A-appA dargestellt. Die höchste Phytase-Aktivität betrug 2.286 mU/ml (633 mU/mg Protein) bei optimalen Bedingungen.
Tabelle 8. Auswirkungen unterschiedlicher Bedingungen im YEPD-Mittel auf die Expression der Phytase-Aktivität von pYES2-SphyA-appA in Hefe.
Die Thermostabilität der überexpressierten, extrazellulären Phytase-Aktivität, welche durch den Hefe-Transformanten erzeugt wurde, war größer als jene der intrazellulären Phytase, welche durch E. coli erzeugt und durch pAPPA1 transformiert wurde (Siehe Tabelle 9). Erhitz man die extrazelluläre Phytase während 15 Minuten auf 80°C, verliert sich 30% ihrer Phytase-Aktivität, während unter gleichen Bedingungen fast die gesamte Phytase-Aktivität von E. coli verloren geht.
Tabelle 9. Auswirkung der Erhitzung verschiedener Phytase-Quellen auf 8A°C während 15 Minuten auf deren Aktivitäten
In Tabelle 10 wird die Auswirkung auf die Freisetzung von Phosphor aus Sojamehl durch Phytasen 200 mU) von E. coli, AppA überexpressiert in Hefen, und BASF verglichen.
Tabelle 10. Freisetzung von freiem Phosphor aus Sojamehl durch verschiedene Phytase-Quellen
Wenn das appA Gen (saure Phosphatase) von E. coli sich in Saccharomyces cerevisiae expressierte, dann erzeugte es in den Mitteln eine extrazelluläre Phytase-Aktivität, die um das 2.000-fache größer war, als die Kontrolle. Die überexpressierte Phytase setzt auf wirksame Weise Phytat-Phosphor aus Sojamehl frei und schien thermostabiler zu sein, als die derzeit am Markt erhältliche Phytase oder die durch dasselbe (appA)-Gen in E. coli erzeugte intrazelluläre Phytase.
Beispiel 12 – Verfahren und Materialien für die Überexpression des E.coli-appA-Gens, welches eine saure Phosphatase/Phytase in Pichia pastoris kodiert.
Gen und Protein. Das appA Gen und den Wirt-Stamm von E. coli CU1867 (Nr. 47092) gewann man aus der ATCC. Das Gen, eine Insertion von 1,3 kb, verwandte sich in den Stamm BL21 von E. coli (Nr. 87441), wobei ein Expressions-Vektor pAPPA1 verwendet wurde (Ostanin, K. et al., "Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase," J. Biol. Chem., 267: 22830–36 (1992), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird).
Wirt und Vektor. Ein EasySelect^TM-Pichia-Expressions-Kit wurde von Invitrogen (San Diego, CA) bezogen. Das Kit liefert Wirte und Vektoren um das Gen intra- oder extrazellulär zu expressieren und zwar auf einem Stamm des wilden Typs (X33). Man verwendete zwei Vektoren, pPICZ B (3,3 kb) und pPICZαA (3,6 kb), beide verwenden den Promotor AOX1.
Aufbau des Expressions-Vektors. Es wurden zwei Primer verwendet, um das appA Gen aus pAPPA1 zu vergrößern und es bildeten sich zwei Restriktions-Plätze, EcoRI und KpnI an den Enden 5' bzw. 3'.
Sequenz-Primer oben: GGA ATT CCA GAG TGA GCC GGA (SEQ ID Nr. 11)
Sequenz-Primer unten: GGG GTA CCT TAC AAA CTG CAC G (SEQ ID Nr. 12)
Schablone: pAPPA1 DNA isoliert aus ATCC 87441
Es wurden 30 PCR Zyklen durchgeführt, mit einer 1-minütigen Denaturalisierung bei 94°C, 1 Minute Hybridisierung bei 55°C und 1 Minute Extension der Kette bei 72°C. Es wurde ein Fragment von 1.245 Basen-Paaren vergrößert, es wurde mit EcoRI und KpnI verdaut und in pPICZ B (3,3 kb) und pPICZαA (3,6 kb) (bei 16°C eine Nacht lang) verbunden. Die Verbindung wurde durch "restriction mapping" nach der Umwandlung der Konstrukte in DH5α bestätigt.
Umwandlung des Konstruktes in Pichia (X33). Für jede Umwandlung präparierte man 100 μg von DNA Plasmid und linearisierte sie durch Verdauung mit Pmel. Nach der Linearisierung purifizierte man die DNA und suspendierte sie erneut in 10 μl sterilem, desionisiertem Wasser. Tatsächlich wurde die Hälfte der DNA für jede Umwandlung verwendet. Es wurde sowohl die Elektroporation wie das Chemie-Kit EasyComp (Invitrogen) um die DNA in X33 umzuwandeln. Im Falle der Elektroporation verwendete man einen Zellen-Elektromanipulator (ECM 600, Gentromics, BTX Instrument Division, San Diego, CA 92121) sowie Schalen mit 2 mm. Der Widerstand betrug 186 Ohm, die Ladespannung betrug 1,5 Kilovolt und die reelle Ladelänge betrug 7 Millisekunden. Die elektroporierten Zellen wurden in YPDS Agar Platten, die 100 mg/ml Zeozin enthielten, bei 30°C 2–4 Tage lang zwecks Wachstum der Kolonien inkubiert. Im Falle der chemischen Umwandlung wurden die Zellen auf YPDS Agar Platten, welche 100 mg/ml Zeozin enthielten, gezüchtet. Das chemische Verfahren hatte im Vergleich zur Elektroporation eine geringere Wirksamkeit bei der Umwandlung.
Expression. Die individuellen Kolonien wurden in 10 ml des Mittels MGY (30 ml über Röhre) eingeimpft und gezüchtet (16–18 Stunden) bis zu einer DO₆₀₀ von 5–6 bei 28–30°C in einem Agitations-Inkubator (200 U/min.). Die Zellen wurden durch Zentrifugierung eingesammelt (2.000 U/min) und in 10 ml des Mittels BMMY (welches Methanol zu 0,5% enthielt) erneut suspendiert, um die Expression zu induzieren. Die Proben (200 μl) wurden alle 12 oder 24 Stunden nach der Induktion eingesammelt. Methanol (100%) wurde zu 100 μl alle 24 Stunden hinzugefügt, um eine Konzentration von 0,5–1% in den Mitteln zu erhalten.
Versuch. Die Zellen wurden aus den Mitteln (dem Überstand) separiert und mit Glasperlen in einem Bruchpuffer lysiert. Es wurde die extrazelluläre Phytase-Aktivität im überstehenden/aufschwimmenden untersucht, und die intrazelluläre Phytase-Aktivität in den lysierten Zellen, wie bereits zuvor geschrieben (Zitrat-Puffer 0,2 M, pH 5,5 bei 37°C bei Verwendung von Natrium-Phytat 10 mM). Die saure Phosphatase-Aktivität wurde bei 37°C im Glycin-HCl Puffer von 25 mM (pH 2,5) untersucht, wobei als Substrat p-nitrophenol-Phosphat (Zucht-Lösung von 250 mM) verwendet wurde. Es wurden 1,7 ml Reaktions-Puffer zu 0,1 ml Proben hinzugefügt. Das p-nitrophenol wurde durchgehend während 5 Minuten bei 405 nm abgelesen, um die Enzym-Aktivität zu berechnen. Es wurde eine Elektrophorese in SDS-PAGE (12%) durchgeführt, um die relative Größe und Menge des expressierten Proteins zu bestimmen. Der optimale pH sowie die optimale Temperatur der expressierten Phytase wurden, wie in den Resultaten beschrieben, bestimmt.
In vitro Studie. Sojamehl (5,0 g) wurde in 20 ml eines 20 mM Zitrat-Puffers suspendiert, pH 5,5, es wurde mit verschiedenen Mengen an Phytase gemischt und bei 37°C 4 Stunden lang bei ständiger Rührung inkubiert. Nach dem Erkalten zu Eis während 10 Minuten, wurde die Suspension in ein Zentrifugenrohr transferiert und 15 Minuten lang zu 15.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde für die Bestimmung von freiem Phosphor verwendet.
Beispiel 13 – Selektierung von Kolonien mit Phytase-Aktivität von Pichia pastoris, die das E.coli-appA-Gen überexpressiert.
Der Stamm des wilden Typus von Pichia X33 erzeugt eine minimale intra- (< 0,03 U/mg Protein) bzw. extrazelluläre (< 0,05 U/ml) Phytase- Aktivität. Die X33 Zellen, die mit dem appA Gen umgewandelt wurden, welches in pPICZB eingefügt wurde (ohne den Faktor α und vermutlich erzeugt es intrazelluläre Phytase) zeigen keine keinerlei Vermehrung bei der Phytase-Aktivität (extrazellulär, 0,2 U/ml und intrazellulär, 0,05 U/mg Protein).
Indem man X33 Zellen mit dem Konstrukt pPIZαA-appA (geleitet durch das Signal-Peptid des Faktors α) umwandelte, wurde in den Mitteln extrazelluläre Phytase-Aktivität erzeugt. Zuerst wurden 72 Kolonien analysiert. Nur zwei Kolonien wiesen eine Aktivität < 1 U/ml 40 Stunden nach der Induktion auf. Die meisten der Kolonien hatten eine Aktivität, die zwischen 10 und 20 U/ml 40 Stunden nach der Induktion schwankte. Diese 70 Kolonien wiesen eine Phytase-Aktivität > 80 U/ml, 118 Stunden nach der Induktion auf. Die größte so weit festgestellte Phytase-Aktivität war 215 U/ml, 192 Stunden nach der Induktion (Siehe Tabelle 11).
Tabelle 11. Bereich der extrazellulären Phytase-Aktivität in X33 Kolonien, umgewandelt mit pPIZαA-appA 40 und 118 Stunden nach der Induktion.
Die Aktivitäten der Phytase sowie der sauren Phosphatase im Transformanten, der 215U an Phytase-Aktivität/ml expressierte, verglich man mit jenen des wilden Typs von X33 (192 Stunden nach der Induktion) (Siehe Tabelle 12). Das gesamte expressierte Phytase-Protein schied sich aus den Zellen ab, was ein Hinweis darauf war, dass der Faktor α ein sehr wirksames Signal-Peptid für die Abscheidung von Phytase ist.
Tabelle 12. Aktivitäten der Phytase und sauren Phosphatase im Transformanten pPIZαA-appA sowie im wilden Stamm von X33 192 Stunden nach der Induktion.
Die Transformanten von E. coli hatten mit demselben appA Gen der sauren Phosphatase eine intrazelluläre Phytase-Aktivität von 5 U/mg Protein (Ostanin, K. et al., "Overexpression, Site-Directed Mutagenesis, and Mechanism of Escherichia coli Acid Phosphatase," J. Biol. Chem., 267: 22830–36 (1992), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Die Umwandlung des PhyA-Gens in A. niger erzeugte eine extrazelluläre Phytase-Aktivität von 7,6 U/ml (Hartingsveldt et al., "Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus niger," Gene 127: 87–94 (1993), die in dieses Dokument als Referenz eingebunden wird). Verglichen mit diesen Resultaten, ist das Expressions-System der Phytase in Pichia ein sehr effizientes Expressions-System.
Beispiel 14 – Zeitkurve der Phytase-Expression
Es gab eine lineare Mehrung der extrazellulären Phytase-Aktivität in den Mitteln in fast allen selektierten Kolonien bis 192 Stunden nach der Induktion. Bild 18 fasst die Veränderungen in der Aktivität von fünf selektierten Kolonien von 24 bis 163 Stunden nach der Induktion.
Beispiel 15 – Auswirkungen des Mittel-pH auf die Phytase-Expression (Kolonie Nr. 23, Aktivität 136 U/ml bei 186 h)
Unter Anwendung von 0,1 M Phosphat gepufferten Mitteln, untersuchte man die Auswirkungen von unterschiedlichen pH auf die extrazelluläre Phytase-Erzeugung in den Transformanten gegen ein Kontroll-Mittel ohne Puffer (pH 7,0). Das gepufferte Mittel mit pH 6 erzeugte die höchste Phytase-Aktivität (siehe Bild 19).
Beispiel 16 – Größe der expressierten extrazellulären Phytase.
Unter Anwendung einer Analyse in SDS-PAGE (Gel zu 12%), beobachtete man ein klares Band im Überstand des mit drei verschiedenen Kolonien eingeimpften Nährbodens (Siehe Bild 20). Die Größe betrug ca. 55 kDa, vermutlich teilweise glykosiliert. Da das expressierte Protein fast das einzige sichtbare Band im Überstand darstellte, könnte es angebracht sein, das Enzym-Produkt ohne der Notwendigkeit einer mühevollen Purifizierung, einzusammeln.
Beispiel 17 – Optimaler pH sowie optimale Temperatur der expressierten extrazellulären Phytase (Kolonie Nr. 23)
Der optimale pH der abgeschiedenen Phytase lag zwischen 2,5 und 3,5 (Siehe Bild 21). Dies ist wesentlich anders als bei der phyA-Phytase entweder aus A. niger (BASF) oder aus einem anderen unserer Expressions-Systeme. Es ist ideal für die Phytase-Funktion des Magen-pH.
Die optimale Temperatur des expressierten Enzyms betrug 60°C (Siehe Bild 22).
Beispiel 18 – Auswirkung der expressierten Phytase auf die Phytat-Phosphor Hydrolyse aus Sojamehl.
Diese überexpressierte Phytase von E. coli (Kolonie Nr. 23) hydrolysierte auf wirksame Weise das Phosphor des Phytats aus Sojamehl (Siehe Bild 23). Die Freisetzung von freiem Phosphor in der Mixtur verlief linear von 0 bis 800 mU an Phytase/g Futter.
Beispiel 19 – Auswirkungen der expressierten E. Coli-AppA-Phytase durch Pichia pastoris auf die PhytatPhosphor-Bioverfügbarkeit für entwöhnte junge Schweine.
Um die Nährwerte der expressierten E. coli-Phytase durch Pichia in der Schweinefütterung zu bestimmen, verglich man die Wirksamkeit dieser neuen Phytase mit jener des anorganischen Phosphors oder der am Markt erhältlichen mikrobiellen Phytase (Natuphos^TM, BASF Corp. Mt. Olive, NJ). Es wurden 48 entwöhnte junge Schweine, die von mehrgebährenden Säuen der Cornell Swine Research Farm. stammten, selektiert. Die Jungschweine wurden am 21. Lebenstag entwöhnt und mit einem im Handel allgemein gebräuchlichen Futter gefüttert, und zwar bis zum 28. Lebenstag. Es wurden zwei Schweine pro Stall plaziert, wobei sechs Ställe pro Behandlung nach dem Zufallsprinzip zugeteilt wurden. Man ließ den Schweinen zwei Wochen Anpassungszeit, um sich an die Basis-Diät aus Mais-Sojamehl zu gewöhnen (Tabelle 13). Tabelle 13. Formulierung der Experiment-Diäten für Schweine

Hinweis: Alle Fertigmischungen benützen Mais als Träger.

Die Fertigmischung aus Vitaminen und Mineralien liefert: 2.540 IU an Vit. A, 660 IU an Vit. D, 15 IU an Vit E, 2,2 mg an Vit. K, 3,3 mg Riboflavin, 13,2 mg Panthothensäure, 17,6 mg Niacin, 110,1 mg Cholin, 1,98 μg B-12, 37,4 mg Mn, 0,6 mg I, 10 mg Cu, 0,3 mg Se, 100 mg Zn und 100 mg Fe pro kg Futter.
Dann erhielt jeder Stall eine der 4 Diäten der Behandlung. Die positive Kontroll-Gruppe (+C) erhielt die Basis Diät, welche mit Dikalcid Phosphat angereichert war. Die negative Kontroll-Gruppe (–C) erhielt nur die Basis Diät. Die Gruppe der Hefe-Phytase (YP = Yeast Phytase) erhielt die Basis Diät, angereichert mit der expressierten E. coli-Phytase zu 1.200 U/kg Futter. Die Gruppe der mikrobiellen Phytase (MP = microbian Phytase) erhielt die Bais Diät, angereichert mit der Phytase von BASF zu 1.200 U/kg Futter. Die Schweine hatten freien Zugang zum, Futter und zum Wasser. Wöchentlich wurde die Gewichtszunahme der einzelnen Schweine aufgezeichnet. Täglich zeichnete man den Futterverzehr jedes einzelnen Stalles auf. Man entnahm den einzelnen Schweinen wöchentlich Blutproben, um die Konzentrationen an anorganischem Phosphor im Plasma zu untersuchen. Die Resultate aus Körpergewicht (BW = body weight), die durchschnittlliche tägliche Zunahme (ADG = average daily gain), die durchschnittliche Futteraufnahme (ADFI = average daily feed intake), das Verhältnis Futter/Gewichtszunahme (F:G = feed/gain) sowie das anorganische Phosphor im Plasma (PP) werden in Tabelle 14 dargestellt. Tabelle 14. Zusammenfassung der Auswirkung der Phytase in der Diät auf PP, BW, ADG, ADFI und F:G bei Schweinen¹.

¹ Die Zahlen in ein und derselben Reihe, die keinen gemeinsamen hochgestellten Buchstaben teilen, sind beträchtlich unterschiedlich. Die Analyse des Unterschieds wurde mit t-Proben von Bonferroni (Dunn) mit Alpha = 0,05 und df = 20 durchgeführt.

Es gab außerdem gravierende Unterschiede beim Phosphor in der negativen Kontroll-Gruppe am Ende der 4. Woche des Experiments. Es gab hingegen keine Anzeichen für Phosphormangel in den anderen drei Gruppen. Klarerweise war die expressierte E. coli-Phytase durch Pichia mindestens, wenn nicht mehr, wirksam als die handelsübliche mikrobielle Phytase, um die Bioverfügbarkeit von Phytat-Phosphor aus der Mais-Sojamehl-Diät bei jungen, entwöhnten Schweinen zu verbessern. Sie kann verwendet werden, um die Zugabe von anorganischem Phosphor bei jungen entwöhnten Schweinen zu ersetzen.
Beispiel 20 – Auswirkungen der expressierten E. coli-AppA-Phytase durch Pichia pastoris auf die Bioverfügbarkeit von Eisen (Fe) und Phytat-Phosphor bei jungen, entwähnten Schweinen.
Um die Auswirkung der überexpressierten E. coli-Phytase durch Pichia in Bezug auf die Bioverfügbarkeit von an Phytat gebundenes Fe für junge entwöhnte Schweine zu bestimmen, selektierte man 20 anämische Schweine (21 Tage alt und 7,3 g Hämoglobin (Hb)/dl Blut). Die Schweine ernährten sich 7 Tage lang mit üblichem Futter, welches Fe-Mangel aufwies und wurden am 28. Lebenstag in metabolische Käfige untergebracht. Danach, ab dem 35. Lebenstag, ernährten sich die Schweine für 5 Wochen lang mit den experimentalen Diäten. Die Diäten der Behandlung waren folgende: Basis Diät mit Fe-Mangel (–C, mit anorganischem Phosphor angereichert), eine mit FE angereicherte Diät (+C), eine Diät mit Mangel an Fe und Phosphor, angereichert mit der expressierten E. coli Phytase (YP) oder der handelsüblichen mikrobiellen Phytase (BASF, MP) zu 1.200 U/kg Futter. Wöchentlich wurde das Körpergewicht (BW) bestimmt, das Zellvolumen (PCV = packed cell volume), Hb und anorganisches Phosphor im Plasma (PP). Die Resultate werden in Tabelle 15 präsentiert. Tabelle 15. Zusammenfassung der Auswirkung der Phytase in der Diät auf PCV, Hb, BW und PP bei Schweinen¹

¹ Dies sind Mittelwerte (n = 5). Die Mittelwerte innerhalb ein und derselben Reihe, die keinen gemeinsamen hochgestellten Buchstaben teilen sind beträchtlich unterschiedlich (P < 0,10).

Abschließend kann gesagt werden, dass die überexpressierte E. coli Phytase durch Pichia mindestens so wirksam war wie die BASF Phytase in Bezug auf die Verbesserung der Verwertung von Phytat-Phosphor und Fe in den Mais-Soja Diäten für junge, entwöhnte Schweine.
Obwohl in diesem Dokument die bevorzugten Ausführungen dargestellt und beschrieben wurden, wird es für die Fachleute des relevanten Sachgebiets offensichtlich sein, dass auch mehrere Modifizierungen, Zusätze, Substituierungen, und dgl. vorgenommen werden können, ohne den Geist dieser Erfindung zu verlassen und solche deshalb innerhalb des Spektrums dieser Erfindung anzusiedeln sind, wie es in den folgenden Patentansprüchen definiert wird.
LISTE DER SEQUENZEN

Claims

Ein Verfahren zur Erzeugung einer Phytase in Hefen, umfassend: Hervorbringen eines von bakteriellen Zellen isolierten appA Genes, ein appA Gen, das ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität kodiert, Expression dieses appA Gens in einem Hefestamm und Isolierung des expressierten Proteins oder Polypeptids, wobei dieses Protein oder Polypeptid eine im Vergleich zu diesem, in einer Wirtszelle, die nicht aus Hefe besteht, expressierten Protein oder Polypeptid erhöhte Thermostabilität aufweisen soll.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle das Protein oder Polypeptid absondert, das durch ein Signal-Peptid bis zum Nährboden geleitet wird oder aber das Protein oder Polypeptid einfach intrazellulär expressiert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Protein oder Polypeptid auf den Nährboden abgesondert wird und eine Konzentration von mehr als 300 Einheiten/ml aufweist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei sich das appA Gen am Rahmen mit einem Transkriptionsverstärkungselement verbindet.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das appA Gen auf einem stabilen Vektor transportiert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das appA Gen auf einem künstlichen Chromosom transportiert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei sich das appA Gen in das Chromosom des Hefestammes integriert.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Hefestamm innerhalb der Gruppe bestehend aus Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora und Schizosaccharomyces ausgewählt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae ist.
Das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das appA Gen von Escherichia coli aus isoliert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Hefestamm ein Stamm der methylotrophen Hefe ist.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Stamm der methylotrophen Hefe Pichia pastoris ist.
Das Protein oder das Polypeptid, das über ein Verfahren nach Anspruch 1 erhältlich ist, welches Phytase-Aktivität aufweist, mit einer optimalen Aktivität in einem Temperatur-Intervall von 57–65°C und mit einem pH von 2,5 bis 3,5 oder von 5 bis 5,5.
Das Protein oder das Polypeptid nach Anspruch 13, wobei der Temperatur Intervall der optimalen Aktivität 58 bis 62°C beträgt.
Das Protein oder Polypeptid nach Anspruch 13, welches Phytase-Aktivität aufweist, wobei das Protein mindestens 40% seiner Aktivität zurückhält, nachdem das Protein über 15 Minuten lang auf 90°C erhitzt wurde.
Das Protein oder Polypeptid nach Anspruch 15, wobei das Protein zwischen 40% und 60% seiner Aktivität zurückhält, nachdem das Protein über 15 Minuten lang auf 90°C erhitzt wurde.
Das Protein oder Polypeptid nach Anspruch 13, welches Phytase-Aktivität aufweist, wobei das Protein mindestens 60% seiner Aktivität zurückhält, nachdem das Protein über 15 Minuten lang auf 60°C erhitzt wurde.
Ein Hefestamm umfassend: einem appA Gen, das ausgehend von bakteriellen Zellen isoliert wurde, appA Gen, das ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität kodiert, und welches funktionell an einen Promotor gebunden ist, der in der Lage ist, die Phytase in Hefe zu expressieren und wobei dieses Protein oder Polypeptid eine im Vergleich zu diesem, in einer Wirtszelle, die nicht aus Hefe besteht, expressierten Protein oder Polypeptid erhöhte Thermostabilität aufweisen soll.
Der Hefestamm nach Anspruch 18, wobei das appA Gen ausgehend von Escherichia coli isoliert wird.
Der Hefestamm nach Anspruch 18, wobei der Hefestamm innerhalb der Gruppe bestehend aus Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora und Schizosaccharomyces ausgewählt wird.
Der Hefestamm nach Anspruch 20, wobei der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae ist.
Der Hefestamm nach Anspruch 19, wobei der Hefestamm ein methylotropher Hefestamm ist.
Der Hefestamm nach Anspruch 22, wobei der methylotrophe Hefestamm Pichia pastoris ist.
Ein Vektor umfassend: einem appA Gen, das ausgehend von bakteriellen Zellen isoliert wurde, dessen Gen ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität kodiert einem Promotor, der auf funktionelle Weise mit dem appA Gen verbunden ist, wobei dieser Promotor in der Lage ist, die Transkription bei Hefe in Gang zu setzen, sowie einem Replizierungsursprung, der in der Lage ist den Vektor bei der Hefe zu halten, wobei dieses Protein oder Polypeptid eine im Vergleich zu diesem, in einer Wirtszelle, die nicht aus Hefe besteht, expressierten Protein oder Polypeptid erhöhte Thermostabilität aufweisen soll.
Der Vektor nach Anspruch 24, welcher außerdem einen selektierbaren Marker beinhaltet.
Der Vektor nach Anspruch 25, wobei der selektierbare Marker innerhalb der Gruppe bestehend aus URA3, LEU2, TRP1, HIS3, HIS4, ARG4 sowie einem Gen, das gegen Antibiotika resistent ist, ausgewählt wird.
Der Vektor nach Anspruch 24, welcher außerdem einen Replizierungsursprung enthält, der in der Lage ist, in einer bakteriellen Zelle zu replizieren.
Der Vektor nach Anspruch 27, wobei der Replizierungsursprung innerhalb der Gruppe bestehend aus CoIE1, Ori und oriT ausgewählt wird.
Der Vektor nach Anspruch 24, wobei das appA Gen ausgehend von Escherichia coli isoliert wird.
Ein Verfahren, um ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität herzustellen, das umfassen soll: ein von bakteriellen Zellen ausgehend isoliertes appA Gen, das ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität kodiert, dieses Gen in einer Wirtszelle zu expressieren, wobei diese Wirtszelle ein Hefestamm ist, sowie das expressierte Protein oder Polypeptid zu isolieren.
Das Verfahren nach Anspruch 30, wobei das appA Gen ausgehend von Escherichia coli isoliert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 30, wobei der Hefestamm innerhalb der Gruppe bestehend aus Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora und Schizosaccharomyces ausgewählt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae ist.
Das Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Zelle das Protein oder Polypeptid absondert, das durch ein Signal-Peptid bis zum Nährboden geleitet wird oder aber das Protein oder Polypeptid einfach intrazellulär expressiert wird.
Ein Verfahren um Phytat in Inositol und anorganisches Phosphor zu verwandeln, welches umfassen soll: ein appA Gen hervorzubringen, das ausgehend von bakteriellen Zellen isoliert wurde. Das Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität ausgehend von diesem Gen in einer Wirtszelle aus Hefe zu expressieren; sowie Das Protein oder Polypeptid mit Phytat in Kontakt zu bringen, um die Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganisches Phosphor zu katalysieren.
Das Verfahren nach Anspruch 35, wobei das Phytat in Speisen oder Futter enthalten ist.
Das Verfahren nach Anspruch 35, wobei das appA Gen von Escherichia coli aus isoliert wird.