DE69926260T2

DE69926260T2 - Kompositmatrix mit mikrokugeln

Info

Publication number: DE69926260T2
Application number: DE69926260T
Authority: DE
Inventors: S. Mark CHEE; R. Steven AUGER; R. John STUELPNAGEL
Original assignee: Illumina Inc
Current assignee: Illumina Inc
Priority date: 1998-12-28
Filing date: 1999-12-28
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2019-12-29
Also published as: EP1593967B1; EP1141712B1; ATE435423T1; DE69926260D1; EP2083271A3; CA2729739A1; JP3566653B2; EP1141712B2; DE69941068D1; DE69926260T3; AU775056B2; DE29925020U1; EP2083271A2; JP2004226415A; ATE300047T1; WO2000039587A1; EP1141712A1; AU2391600A; CA2353868A1; CA2729739C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Sensoranordnungen, die einen Feldverbund mit einzelnen Feldern umfassen, um eine gleichzeitige Verarbeitung einer Anzahl von Proben zuzulassen. Die Erfindung stellt zudem Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Feldverbünden bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zur Detektion der Gegenwart und/oder Konzentration von spezifischen Substanzen in Flüssigkeiten und Gasen steht eine Reihe von Tests und Sensoren zur Verfügung. Davon ziehen viele als Detektionsmechanismus spezifische Liganden-/Antiliganden-Reaktionen heran. Diese beruhen auf der Kenntnis, dass sich Substanzpaare (d.h. Bindungspaare oder Liganden/Antiliganden) aneinander binden, während sie sich nur wenig oder gar nicht an andere Substanzen binden. Dieser Umstand stellte den Schwerpunkt einer Reihe von Verfahren dar, die diese Bindungspaare zur Detektion von Komplexen einsetzen. Diese werden im Allgemeinen durchgeführt, indem eine Komponente eines Komplexes irgendwie unter Verwendung von z.B. Radioisotopen, fluoreszierenden und anderen optisch aktiven Molekülen, Enzymen und dergleichen markiert wird, sodass der gesamte Komplex detektierbar wird.
Bei diesen Sensoren kommen insbesondere Detektionsmechanismen zum Einsatz, die Gebrauch von Lumineszenz machen. In jüngster Zeit hat die Verwendung von optischen Fasern (Glasfasern) und optischen Fasersträngen (Glasfasersträngen) in Kombination mit lichtabsorbierenden Farbstoffen für chemisch-analytische Bestimmungen eine rasante Entwicklung erfahren, insbesondere innerhalb der letzten 10 Jahre. Die Verwendung von optischen Fasern für solche Zwecke und Verfahren sind in nachstehender Literatur beschrieben: Milanovich et al., "Novel Optical Fiber Techniques For Medical Application", Preceedings of the SPIE 28th Annual International Technical Symposium On Optics and Electro-Optics, Band 494 (1980); Seitz, W.R., "Chemical Sensors Based On Immobilized Indicators and Fiber Optics", in C.R.C. Critical Reviews In Analytical Chemistry, Band 19, 135–173 (1988); Wolfbeis, O.S., "Fiber Optical Fluorosensors In Analytical Chemistry", in Molecular Luminescence Spectroscopy, Methods and Applications (S.G. Schulman, Hg.), Wiley & Sons, New York (1988); Angel, S.M., Spectroscopy 2(4), 38 (1987); Walt et al., "Chemical Sensors and Microinstrumentation", ACS Symposium Series, Band 403, S. 252 (1989); und Wolfbeis, O.S., Fiber Optic Chemical Sensors, hrsg. von CRC Press, Boca Raton FL, Band 2 (1991).
Vor kurzem sind Glasfasersensoren hergestellt worden, die die Verwendung von mehrfachen Farbstoffen mit einem einzigen, diskreten Glasfaserbündel zulassen. In den an Walt et al. ausgegebenen US-Patenten Nr. 5.244.636 und 5.250.264 werden Systeme offenbart, die mehrfache, verschiedene Farbstoffe am distalen Ende des Bündels anbringen. Die offenbarten Zusammenstellungen ermöglichen separaten optischen Fasern eines Bündels den optischen Zugang zu einzelnen Farbstoffen. Dies verhindert das Problem der Dekonvolution der separaten Signale im zurückkommenden Licht jedes einzelnen Farbstoffs, wozu es kommt, wenn die Signale von zwei oder mehr Farbstoffen kombiniert werden, wobei jeder Farbstoff auf einen unterschiedlichen Analyten anspricht, und zudem gibt es im Emissionsspektrum der Farbstoffe signifikante Überlappungen.
In der US-Anmeldung Nr. 19970818199, die als Priorität für WO 98/50782 dient, sind Feldanordnungen beschrieben, die auf der Oberfläche eines Substrats, z.B. an der Endstelle eines optischen Faserbündels, Mikrokügelchen oder Perlen verwenden, wobei jede einzelne optische Faser eine Perle umfasst, die eine optische Signatur aufweist. Da die Perlen statistisch verteilt fallen, wird eine einmalige optische Signatur erforderlich, um das Feld zu "dekodieren"; das heißt, dass, nachdem das Feld erstellt wurde, eine Korrelation zwischen der Position einer einzelnen Stelle auf dem Feld und der Perle oder dem bioaktiven Wirkstoff an der bestimmten Stelle hergestellt werden kann. Dies bedeutet, dass die Perlen auf dem Feld statistisch verteilt sein können, was, verglichen mit der In-situ-Synthese oder dem Spotting-Verfahren nach dem Stand der Technik, ein rasches und kostengünstiges Verfahren darstellt. Nachdem das Feld mit den Perlen beladen wurde, kann das Feld dekodiert oder verwendet werden, wobei es nach dem Testen zu einem vollständigen oder teilweisen Dekodieren kommt, wie nachstehend detaillierter beschrieben wird.
Zudem sind im US-Patent 5.545.531 Zusammensetzungen beschrieben, die Siliciumwafer umfassen, die eine Vielzahl von Sondenfeldern in Mikrotiterplatten aufweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß den obigen Zielen stellt die vorliegende Erfindung Feldverbund-Anordnungen bereit, die ein erstes Substrat mit einer Oberfläche umfassen, die eine Vielzahl von Testpositionen aufweist, wobei jede Testposition eine Vielzahl von diskreten Stellen umfasst. Das Substrat umfasst zudem eine Mikrokügelchen-Population, die zumindest eine erste und eine zweite Unterpopulation umfasst, worin jede Unterpopulation einen bioaktiven Wirkstoff aufweist. Die Mikrokügelchen sind auf jede der Testpositionen verteilt.
In einem weitere Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Feldverbund-Anordnungen bereit, die ein erstes Substrat mit einer Oberfläche umfassen, die eine Vielzahl von Testpositionen aufweist, und ein zweites Substrat umfassen, das eine Vielzahl von Feldpositionen umfasst, wobei jede Feldposition diskrete Stellen umfasst. Die Anordnungen umfassen zudem eine Mikrokügelchenpopulation, die zumindest eine erste und eine zweite Unterpopulation umfasst, worin jede Unterpopulation einen bioaktiven Wirkstoff aufweist. Die Mikrokügelchen sind auf jede der Testpositionen verteilt.
In einem zusätzlichen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Dekodieren einer Feldanordnung bereit, die die Bereitstellung einer wie oben dargelegten Feldanordnung und das Zusetzen einer Vielzahl von dekodierenden Bindungsliganden zur Feldverbund-Anordnung umfassen, um die Position von zumindest einer Vielzahl der bioaktiven Wirkstoffe zu identifizieren.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines oder mehrerer Zielanalyten in einer oder mehreren Proben bereit, die das Kontaktieren der Probe mit einer wie hier dargelegten Anordnung und das Nachweisen der Gegenwart oder der Abwesenheit des Zielanalyten umfassen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die 1A, 1B, 1C, 1D und 1E stellen mehrere verschiedene erfindungsgemäße Ausführungsformen des "Zweikomponenten"-Systems dar. 1A stellt ein Perlenfeld dar. Das erste Substrat 10 weist die Feldpositionen 20 mit den Wells 25 und den Perlen 30 auf. Das zweite Substrat 40 weist die Testpositionen 45 auf. Eine optionale Linse oder ein optionaler Filter 60 ist ebenfalls angeführt; Fachleuten ist klar, dass diese auch intern im Substrat enthalten sein können. Die 1Bist ähnlich, mit der Ausnahme, dass keine Perlen eingesetzt werden; dafür weisen die Feldpositionen 20 die diskreten Stellen 21, 22, 23 etc. auf, die mittels Spotting-, Druck-, Photolithographieverfahren und dergleichen gebildet werden können. Die 1C bis 1F stellen die Verwendung einer Vielzahl von ersten Substraten dar. Die 1C stellt eine "Perle aus Perlen" dar, die über eine zusätzliche Vermischungsfunktion verfügen kann. Die 1D stellt eine Vielzahl von Perlenfeldern und die 1E eine Vielzahl von Nicht-Perlenfeldern dar. Die 1F stellt die Verwendung von Bindungsfunktionalitäten zur "Abzielung auf" die ersten Substrate 10 auf Positionen des zweiten Substrats 40; Fachleuten ist klar, dass dies auf flachen zweiten Substraten oder abgeteilten zweiten Substraten vorgenommen werden kann. Die 1F verwendet die Bindungsligandenpaare 70/70', 71/71', 72/72' etc. Diese können entweder chemische Funktionalitäten oder biologische umfassen, wie sie für IBL/DBL-Paare, wie z.B. Oligonucleotide und dergleichen, beschrieben sind.
Die 2A und 2B stellen zwei verschiedene "Einkomponenten"-Systeme dar. Die 2A stellt ein Perlenfeld dar, wobei das Substrat 50 die Testpositionen 45 mit den Wells 25 umfasst, die die Perlen 30 aufweisen. Die 2B stellt eine Nicht-Perlen-Felder dar; jede Testposition 45 weist die diskreten Stellen 21, 22, 23 etc. auf.
Die 3 stellt Clustering in einem hyperspektralen Alpha-Raum (α₁ = I₁/ΣI₁, α₂ = I₂/ΣI_i, α₃ = I₃/ΣI_i etc.) dar. Eine Gruppe von 128 verschiedenen, auf einem Faserbündel vorliegenden Perlentypen wurden mittels einer Hybridisierungsgruppe aus komplementären Oligonucleotiden dekodiert, die mit vier Farbstoffen markiert waren: Bodipy-493, Bodipy-R6G, Bodipy-TXR und Bod-564 (nur ein Farbstoff pro Oligonucleotid). Es wird die zweite Stufe einer vierstufigen Dekodierung gezeigt, worin 4.013 Perlen dekodiert wurden. Die Zonen mit farbgetönten Clustern wurden oval eingerahmt.
Die 4 stellt ein Zweifarben-Dekodierungsverfahren dar, worin entweder FAM-markierte oder Cy3-markierte Oligo-Komplemente eingesetzt werden, um die verschiedenen Perlentypen auf dem Feld "anzumalen" (zu markieren).
Die 5 stellt das Dekodieren von 128 verschiedenen Perlentypen mit vier Farben und vier Dekodierungsstufen dar (die Einfügung stellt einen einzelnen Dekodierungsschritt dar, bei dem vier verschiedene Farbstoffe zur Dekodierung von 16 Perlentypen eingesetzt werden).
Die 6 stellt eine Grauwertskala zur Dekodierung von 16 verschiedenen Perlentypen dar: (A) umfasst ein kombinatorisches Pooling-Schema für komplementäre Dekodierungs-Oligos. Bei (B) wurden zwei voneinander unabhängige Normierungsbilder erworben und die resultierenden Perlenintensitäten verglichen. In (C) werden die Alpha-Werte (Verhältnis zwischen Perlenintensität im angeführten Dekodierungsschritt und Intensität im Normierungsbild) für drei in (A) beschriebene Dekodierungsstufen geplottet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bildung von Feldern mit sehr hoher Dichte, die eine gleichzeitige Analyse, und zwar eher eine parallele als eine aufeinander folgende Verarbeitung, auf einer Anzahl von Proben ermöglicht. Dies wird durch Bildung eines "Feldes aus Feldern" erzielt, nämlich mittels eines Feldverbundes, der eine Vielzahl von einzelnen Feldern umfasst und so angeordnet ist, dass eine Verarbeitung mehrerer Proben ermöglicht wird. Beispielsweise liegt jedes einzelne Feld in jedem einzelnen Well einer Mikrotiterplatte vor. Folglich kann je nach Größe der Mikrotiterplatte und Größe des einzelnen Feldes eine sehr große Anzahl an Tests gleichzeitig durchgeführt werden. Beispielsweise können unter Verwendung einzelner Felder mit 2.000 unterschiedlichen Spezies (mit hohen eingebauten Redundanzwerten) und einer Mikrotiterplatte mit 96 Wells 192.000 Versuche gleichzeitig durchgeführt werden. Die gleichen Felder in einer Mikrotiterplatte mit 384 Wells ergeben 768.000 gleichzeitige Versuche und eine Mikrotiterplatte mit 1.536 Wells 3.072.000 Versuche.
Im Allgemeinen können die erfindungsgemäßen Feldanordnungen auf mehrere Arten hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform, die nachstehend detaillierter beschrieben wird, wird ein "Einkomponenten"-System verwendet. Das bedeutet, dass ein erstes Substrat, das eine Vielzahl von Testpositionen (hierin mitunter auch als "Test-Wells" bezeichnet), wie z.B. eine Mikrotiterplatte, umfasst, so angeordnet wird, dass jede Testposition ein einzelnes Feld umfasst. Testposition und Feldposition sind somit gleich. Das Kunststoffmaterial der Mikrotiterplatte kann beispielsweise so ausgebildet sein, dass auf dem Boden jedes einzelnen Test-Wells eine Vielzahl von "Perlen-Wells" enthalten sind. Bioaktive Wirkstoffe enthaltende Perlen können sodann, wie nachstehend detailliert beschrieben, in die Perlen-Wells jeder einzelnen Testposition gefüllt werden. Es wird angemerkt, dass, während die vorliegende Offenbarung die Verwendung von Perlen betont, in keiner der erfindungsgemäßen Ausführungsformen Perlen eingesetzt werden müssen; die bioaktiven Wirkstoffe können direkt an die Feldpositionen gebunden werden. Andere Feldtypen sind beispielsweise allgemein bekannt und können in diesem Format verwendet werden; durch Spotting-, Druck- oder Photolithographie ausgebildete Felder sind allgemein bekannt; siehe beispielsweise WO 95/25113; WO 95/35505; PCT US98/09163; die US-Patente Nr. 5.700.637; 5.807.522 und 5.445.934; und US-Anmeldung Nr. 19970851203, die als Priorität für WO 98/50782 dient. Bei Einkomponentensystemen ohne Einsatz von Perlen werden in bevorzugten Ausführungsformen Nicht-Siliciumwafer-Substrate eingesetzt.
Alternativ dazu kann ein "Zweikomponenten"-System verwendet werden. In dieser Ausführungsform werden die einzelnen Felder auf einem zweiten Substrat ausgebildet, die dann in das erste Mikrotiterplatten-Substrat eingepasst oder "eingetaucht" werden können. Fachleuten ist klar, dass eine Reihe von Feldformaten und Anordnungen eingesetzt werden kann. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet als einzelne Felder optische Faserbündel, die im Allgemeinen auf der Oberfläche jeder einzelnen Faser einen "Perlen-Well" geätzt haben, sodass die bioaktiven Wirkstoff enthaltenden Perlen auf das Ende des optischen Faserbündels beladen werden. Der Feldverbund umfasst somit eine Anzahl an einzelnen Feldern, die so angeordnet sind, dass sie in die Wells einer Mikrotiterplatte passen. Alternativ dazu können in einem Zweikomponentensystem andere Typen von Feldformaten verwendet werden. Geordnete Felder, wie z.B. jene durch Spotting-, Druck- oder Photolithographieverfahren erhaltene, können, wie oben dargelegt, auf das zweite Substrat platziert werden. Zudem können, wie in den 1C bis 1F angeführt, "Teile" von Feldern, die statistisch verteilt oder geordnet sind, als erstes Substrat verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung basiert im Allgemeinen auf vorherigen Arbeiten, die ein analytisches Chemiesystem auf Perlenbasis umfassen, worin die Perlen, auch als Mikrokügelchen bezeichnet, die unterschiedliche chemische Funktionalitäten aufweisen, auf einem Substrat verteilt sind, das eine strukturierte Oberfläche aus diskreten Stellen umfasst, die die einzelnen Mikrokügelchen binden kann. Die Perlen sind im Allgemeinen statistisch auf dem Substrat verteilt, womit mehrere verschiedene Verfahren zum "Dekodieren" der Felder angewandt werden können. In einer Ausführungsform werden einmalige optische Signaturen in die Perlen eingeführt, im Allgemeinen fluoreszierende Farbstoffe, die dazu verwendet werden könnten, die chemische Funktionalität auf einer bestimmten Perle zu identifizieren. Dies ermöglicht, dass die Synthese der Kandidatenstoffe (das sind Verbindungen wie z.B. Nucleinsäuren und Antikörper) von deren Platzierung auf einem Feld getrennt werden können; das bedeutet, dass die Kandidatenstoffe auf den Perlen synthetisiert werden können und die Perlen anschließend auf einer strukturierten Oberfläche statistisch verteilt werden. Da die Perlen zuerst mit einer optischen Signatur kodiert werden, kann das Feld später "dekodiert" werden, d.h. nachdem das Feld hergestellt worden ist, kann eine Korrelation zwischen der Position einer einzelnen Stelle auf dem Feld mit der Perle oder dem Kandidatenstoff an der bestimmten Stelle hergestellt werden. Dies bedeutet, dass die Perlen auf dem Feld statistisch verteilt werden können, was, verglichen mit der In-situ-Synthese oder dem Spotting-Verfahren nach dem Stand der Technik, ein rasches und kostengünstiges Verfahren darstellt. Diese Verfahren sind im Allgemeinen in der PCT US98/05025; PCT US98/21193; PCT US99/20914; PCT US99/14387; und in US 19970818199 , die als Priorität für WO 98/50782 dient, dargelegt. Während die vorliegende Diskussion im Allgemeinen die Verwendung von Perlen betrifft, können die gleichen Anordnungen zudem bei Zellen und anderen Teilchen angewandt werden; siehe beispielsweise PCT US99/04473.
In diesen Systemen sind die bioaktiven Wirkstoffe im Allgemeinen statistisch verteilt, wodurch ein Kodierungs-/Dekodierungssystem zur Identifizierung der bioaktiven Wirkstoffe an jeder Position im Feld erforderlich wird. Dies kann, wie nachstehend detaillierter beschrieben, auf verschiedene Arten durchgeführt werden und umfasst im Allgemeinen: a) die Verwendung eines dekodierenden Bindungsliganden (DBL), der im Allgemeinen direkt markiert ist und sich an den bioaktiven Wirkstoff oder den Identifikator-Bindungsliganden (IBL) bindet, der an die Perlen gebunden sind; b) das positionelle Dekodieren durch beispielsweise Targeting auf die Platzierung von Perlen (z.B. unter Verwendung von fotoaktivierbaren oder fotoabspaltbaren Gruppierungen, um die selektive Zugabe von Perlen zu einer bestimmten Position zuzulassen) oder indem, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, entweder Unterbündel verwendet werden oder die selektive Beladung von Stellen stattfindet; c) das selektive Dekodieren, worin nur jene Perlen dekodiert werden, die sich an ein Target binden; oder d) Kombinationen aus allen davon. In manchen Fällen kann dieses Dekodieren, wie nachstehend dargelegt, bei jeder der einzelnen Perlen stattfinden oder nur bei jenen, die sich an einen bestimmten Zielanalyten binden. Dies kann wiederum entweder vor oder nach der Zugabe eines Zielanalyten erfolgen.
Nachdem die Identität (d.h. der eigentliche Wirkstoff) und die Position jedes Mikrokügelchens im Feld bestimmt worden ist, wird das Feld Proben ausgesetzt, die die Zielanalyten enthalten, obwohl dies auch, wie nachstehend dargelegt, vor oder wäh rend der Analyse stattfinden kann. Die Zielanalyten binden sich an die bioaktiven Wirkstoffe, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, was zu einer Veränderung des optischen Signals einer bestimmten Perle führt.
In der vorliegenden Erfindung kann das "Dekodieren" die Verwendung von optischen Signaturen, von Dekodierungs-Bindungsliganden, die während des Dekodierens zugesetzt werden, oder eine Kombination dieser Verfahren umfassen. Die Dekodierungs-Bindungsliganden binden sich entweder an einen bestimmten Identifikator-Bindungsligandenpartner, der auf den Perlen vorliegt, oder an den bioaktiven Wirkstoff selbst, wenn die Perlen als bioaktive Wirkstoffe beispielsweise einzelsträngige Nucleinsäuren umfassen. Die Dekodierungs-Bindungsliganden sind entweder direkt oder indirekt markiert, wodurch das Dekodieren durch die Detektion der Gegenwart der Markierung erfolgt. Indem Pools von Dekodierungs-Bindungsliganden auf sequentielle Weise verwendet werden, ist es möglich, die Anzahl der erforderlichen Dekodierungsschritte stark zu reduzieren.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung Feldverbund-Anordnungen bereit, die zumindest ein erstes Substrat mit einer Oberfläche umfassen, die eine Vielzahl von Testpositionen umfasst. Mit "Feld" ist hierin eine Vielzahl von Kandidatenstoffen in einem Feldformat bezeichnet; die Größe des Feldes hängt von der Anordnung und der Endverwendung des Feldes ab. Es können Felder hergestellt werden, die etwa 2 unterschiedliche bioaktive Wirkstoffe (d.h. unterschiedliche Perlen) bis viele Millionen unterschiedliche Wirkstoffe aufweisen, wobei sehr große Glasfaserfelder möglich sind. Im Allgemeinen umfasst das Feld zwei bis zu einer Milliarde oder mehr Wirkstoffe, je nach Größe der Perlen und des Substrats sowie der Endverwendung des Feldes, wodurch Felder mit sehr hohen Dichten, hohen Dichten, mäßigen Dichten, geringen Dichten und sehr geringen Dichten hergestellt werden können. Die bevorzugten Bereiche für Felder mit sehr hohen Dichten liegen etwa bei 10.000.000 bis etwa 2.000.000.000 (wobei alle Zahlen pro Quadratzentimeter sind), wobei ein Bereich von etwa 100.000.000 bis etwa 1.000.000.000 bevorzugt wird. Felder mit einer hohen Dichte liegen in einem Bereich von etwa 100.000 bis etwa 10.000.000, wobei ein Bereich von etwa 1.000.000 bis etwa 5.000.000 insbesondere bevorzugt wird.
Felder mit einer mäßigen Dichte liegen vorzugsweise in einem Bereich von etwa 10.000 bis etwa 100.000 und insbesondere in einem Bereich von etwa 20.000 bis etwa 50.000. Felder mit einer geringen Dichte liegen im Allgemeinen in einem Bereich von weniger als 10.000, wobei ein Bereich von etwa 1.000 bis etwa 5.000 bevorzugt wird. Felder mit einer sehr geringen Dichte liegen in einem Bereich von weniger als 1.000, wobei ein Bereich von etwa 10 bis etwa 1.000 bevorzugt wird und ein Bereich von etwa 100 bis etwa 500 insbesondere bevorzugt wird. In einigen Ausführungsformen kommen die erfindungsgemäßen Anordnungen nicht als Feldformat vor; das bedeutet, dass für einige Ausführungsformen auch Anordnungen erstellt werden können, die einen einzigen bioaktiven Wirkstoff enthalten. Zudem können in einigen Feldern mehrfache Substrate verwendet werden, die entweder unterschiedliche oder gleiche Anordnungen aufweisen. Folglich können große Felder beispielsweise eine Vielzahl kleinerer Substrate umfassen.
Darüber hinaus ist ein Vorteil der vorliegenden Anordnung, dass insbesondere durch die Verwendung von Faseroptiktechnologien Felder mit extrem hohen Dichten hergestellt werden können. Da z.B. Perlen mit einer Größe von 200 μm oder weniger (wobei Perlen mit 200 nm möglich sind) verwendet werden können und sehr kleine Fasern bekannt sind, ist es möglich, dass 40.000 bis 50.000 oder mehr (in manchen Fällen 1 Million) unterschiedliche Fasern und Perlen in einem 1 mm² großen optischen Faserbündel vorliegen, wobei eine Dichte von mehr als 15.000.000 einzelnen Perlen und Fasern (in einigen Fällen sogar 25 bis 50 Millionen) pro 0,5 cm² erhältlich ist.
Mit "Feldverbund" oder "Kombinationsfeld" oder grammatikalischen Entsprechungen davon wird hierin, wie oben dargelegt, eine Vielzahl an einzelnen Feldern bezeichnet. Im Allgemeinen wird die Anzahl der einzelnen Felder durch die Größe der verwendeten Mikrotiterplatte bestimmt; folglich verwenden Mikrotiterplatten mit 96 Wells, 384 Wells und 1.536 Wells Feldverbünde, die 96, 384 und 1.536 einzelne Felder umfassen, wobei, wie Fachleuten klar sein wird, nicht jeder Mikrotiter-Well ein einzelnes Feld aufweisen muss. Es wird angemerkt, dass die Feldverbünde einzelne Felder umfassen können, die gleich, ähnlich oder unterschiedlich sind. Das bedeutet, dass es in manchen Ausführungsformen erwünscht sein kann, die gleichen 2.000 Tests auf 96 unterschiedlichen Proben durchzuführen. Alternativ dazu kann es erwünscht sein, 192.000 Versuche auf der gleichen Probe (d.h. die gleiche Probe in jedem der 96 Wells) durchzuführen. Alternativ dazu könnte jede Reihe oder Spalte des Feldverbunds zur Redundanz- oder Qualitätskontrolle gleich sein. Wie Fachleute verstehen werden, gibt es eine Vielzahl an Wegen, das System zu konfigurieren. Darüber hinaus kann die statistische Natur der Felder bedeuten, dass die gleiche Perlenpopulation zu zwei unterschiedlichen Oberflächen zugesetzt werden kann, was zu im Wesentlichen ähnlichen, jedoch mitunter nicht identischen Feldern führt.
Mit "Substrat" oder "fester Träger" oder anderen grammatikalischen Entsprechungen wird hierin jedes beliebige Material bezeichnet, das modifiziert werden kann, um einzelne diskrete Stellen zu enthalten, die sich zur Bindung oder Assoziation von Perlen eignen, und welches auf zumindest ein Detektionsverfahren anspricht. Für Fachleute ist es klar, dass die Anzahl der möglichen Substrate sehr groß ist. Mögliche Substrate umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Glas und modifiziertes oder funktionalisiertes Glas, Kunststoffe (einschließlich Acryle, Polystyrol und Copolymere von Styrol und anderen Materialien, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polyurethane, TeflonJ etc.), Polysaccharide, Nylon oder Nitrocellulose, Harze, Silica oder Silica-basierte Materialien, einschließlich Silicium und modifiziertes Silicium, Kohlenstoff, Metalle, anorganisches Glas, Kunststoffe, optische Faserbündel und eine Reihe von anderen Polymeren. Im Allgemeinen ermöglichen die Substrate die optische Detektion and fluoreszieren selber nicht merklich.
Im Allgemeinen ist das Substrat flach (planar), wobei Fachleuten klar ist, dass andere Anordnungen von Substraten ebenfalls verwendet werden können. Beispielsweise können dreidimensionale Anordnungen verwendet werden, indem z.B. die Perlen in einen porösen Block aus Kunststoff eingebettet werden, der einen Probenzugang zu den Perlen ermöglicht, und zur Detektion ein Konfokalmikroskop verwendet wird. Auf ähnliche Weise können die Perlen zur Durchflussprobenanalyse auf die Innenoberfläche eines Rohrs platziert werden, um das Probenvolumen zu minimieren. Bevor zugte Substrate umfassen wie nachstehend erläutert optische Faserbündel und flache planare Substrate, wie z.B. Glas, Polystyrol sowie andere Kunststoffe und Acrylstoffe. In einigen Ausführungsformen werden Siliciumwafer-Substrate nicht bevorzugt.
Das erste Substrat umfasst eine Oberfläche, die eine Vielzahl von Testpositionen umfasst, und zwar jene Position, bei welcher der Test zur Detektion eines Zielanalyten stattfindet. Die Testpositionen sind im Allgemeinen physisch voneinander getrennt, z.B. als Test-Wells in einer Mikrotiterplatte, wobei andere Anordnungen (Hydrophobie/Hydrophilie etc.) zur Trennung der Testpositionen verwendet werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das zweite Substrat, wie in den US-Anmeldungen mit der Seriennummer 08/944.850 und 08/519.062 sowie in PCT US98/05025 und PCT US98/09163 beschrieben, ein optisches Faserbündel oder ein Feld. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden vorgeformte einheitliche Glasfaser-Felder. Mit "vorgeformtem einheitlichem Faseroptik-Feld" wird hierin ein Feld einzelner diskreter Faseroptik-Stränge bezeichnet, die koaxial angeordnet und ihrer Länge nach verbunden sind. Die Faserstränge sind im Allgemeinen einzeln verkleidet. Was jedoch ein vorgeformtes einheitliches Feld von anderen Faseroptik-Formaten unterschied, war die Tatsache, dass die Fasern nicht einzeln physisch manipulierbar waren; und zwar kann ein Strang an seiner Länge entlang für gewöhnlich an keiner Stelle physisch von einem anderen Faserstrang getrennt werden.
In einigen "Zweikomponenten"-Ausführungsformen ist das zweite Substrat jedoch kein Faseroptik-Feld.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Testpositionen (des "Einkomponenten-Systems") oder die Feldpositionen (des "Zweikomponenten-Systems") eine Vielzahl von diskreten Stellen. Folglich ist die Testposition in ersterem Fall, wie hierin beschrieben, die gleiche wie die Feldposition. In letzterem Fall wird die Feldposition getrennt in die Testposition eingepasst. In diesen Ausführungsformen wird zumindest eine Oberfläche des Substrats modifiziert, damit einzelne diskrete Stellen zur späteren Assoziation von Mikrokügelchen (oder, wenn keine Mikrokügelchen verwendet werden, zur Bindung von bioaktiven Wirkstoffen) vorliegen. Diese Stellen können physisch veränderte Stellen umfassen, und zwar physische Anordnungen, wie z.B. Wells oder kleine Vertiefungen im Substrat, welche die Perlen so aufbewahren können, dass ein Mikrokügelchen im Well zum Liegen kommt, oder die Verwendung von anderen Kräften (magnetische Kräfte oder Druckkräfte) sowie chemisch veränderte oder chemisch aktive Stellen umfassen, wie z.B. chemisch funktionalisierte Stellen, elektrostatisch veränderte Stellen, hydrophob oder hydrophil funktionalisierte Stellen, Haftmittelstellen etc.
Die Stellen können ein Muster sein, und zwar ein regelmäßiges Baumuster oder eine regelmäßige Anordnung oder eine statistische Anordnung. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet ein regelmäßiges Muster von Stellen, und zwar so, dass die Stellen in einer XY-Koordinatenebene angesprochen werden können. Die Bezeichnung "Muster" umfasst in diesem Sinne eine Grundeinheitszelle, vorzugsweise eine, die auf dem Substrat Perlen mit hoher Dichte ermöglicht. Es wird jedoch angemerkt, dass diese Stellen mitunter keine diskreten Stellen sind. Das bedeutet, dass es möglich ist, eine einheitliche Oberfläche von haftenden oder chemischen Funktionalitäten zu verwenden, die z.B. die Bindung von Perlen an jeder beliebigen Position ermöglicht; und zwar wird die Substratoberfläche modifiziert, um die Bindung von Mikrokügelchen an einzelnen Stellen zu ermöglichen, unabhängig davon, ob diese Stellen an andere Stellen angrenzen oder nicht. Folglich kann die Substratoberfläche so modifiziert werden, dass diskrete Stellen ausgebildet werden, die nur eine einzige assoziierte Perle enthalten, oder alternativ dazu wird die Substratoberfläche so modifiziert, dass die Perlen beliebig fallen, wobei sie jedoch an den diskreten Stellen aufgefangen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Substratoberfläche modifiziert, damit Wells, nämlich Vertiefungen in der Substratoberfläche, vorliegen. Dies wird dadurch erreicht, indem, wie allgemein auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, eine Reihe von Verfahren, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Photolithographie, Stanz verfahren, Formverfahren und Mikroätzverfahren angewandt werden. Fachleuten ist klar, dass die verwendeten Verfahren von der Anordnung und Form des Substrats abhängen. Wenn das erste Substrat sowohl die Testpositionen als auch die einzelnen Felder umfasst, wird in einem bevorzugten Verfahren ein Formverfahren herangezogen, das die Perlen-Wells auf dem Boden der Test-Wells in einer Mikrotiterplatte ausbildet. Auf ähnliche Weise wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein formgepresstes zweites Substrat verwendet, das "Finger" bzw. Projektionen in einem Feldformat umfasst, wobei jeder der Finger Perlen-Wells umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden auf einer Substratoberfläche zur Herstellung der Stellen physische Veränderungen vorgenommen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Substratoberfläche, wie in der US-Anmeldung Nr. 19970818199, die als Priorität für WO 98/50782 dient, allgemein beschrieben, ein terminales Ende des Faserbündels, wenn beispielsweise das zweite Substrat ein optisches Faserbündel ist. In dieser Ausführungsform werden an einem endständigen oder distalen Ende des optischen Faserbündels, das einzelne Fasern umfasst, Wells erstellt. In dieser Ausführungsform werden die Kerne der einzelnen Fasern unter Rücksichtnahme auf die Verkleidung geätzt, sodass an einem Ende der Fasern kleine Wells oder Vertiefungen entstehen. Die erforderliche Tiefe der Wells hängt von der Größe der den Wells zuzusetzenden Perlen ab.
In dieser Ausführungsform sind die Mikrokügelchen in den Wells im Allgemeinen nichtkovalent assoziiert, obwohl die Wells, wie nachstehend allgemein beschrieben, zusätzlich chemisch funktionalisiert sein können, Vernetzer eingesetzt werden können oder eine physische Barriere, nämlich ein Film oder eine Membran über den Perlen, verwendet werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Substratoberfläche modifiziert, um modifizierte Stellen aufzuweisen, insbesondere chemisch modifizierte Stellen, die dazu verwendet werden können, die erfindungsgemäßen Mikrokügelchen an die diskreten Stellen oder Positionen auf dem Substrat entweder kovalent oder nichtkovalent zu binden. Der Ausdruck "chemisch modifizierte Stellen" umfasst in diesem Zusam menhang, jedoch nicht ausschließlich, die Zugabe einer Struktur aus chemischen funktionellen Gruppen, einschließlich Aminogruppen, Carboxygruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen, die dazu verwendet werden können, die Mikrokügelchen kovalent anzubinden, die im Allgemeinen auch entsprechende reaktive funktionelle Gruppen aufweisen; das Hinzufügen einer Haftmittelstruktur, die dazu verwendet werden kann, die Mikrokügelchen (entweder durch vorherige chemische Funktionalisierung zur Zugabe des Haftmittels oder durch direkte Zugabe des Haftmittels) zu binden; das Hinzufügen einer Struktur aus geladenen Gruppen (ähnlich den chemischen Funktionalitäten) zur elektrostatischen Bindung der Mikrokügelchen, nämlich wenn die Mikrokügelchen geladene Gruppen aufweisen, die den Stellen gegenüber liegen; das Hinzufügen einer Struktur von chemischen funktionellen Gruppen, die die Stellen differentiell hydrophob oder hydrophil machen, sodass die Zugabe von ähnlich hydrophoben oder hydrophilen Mikrokügelchen unter geeigneten Versuchsbedingungen basierend auf Wasseraffinität zur Assoziation der Mikrokügelchen an die Stellen führt. Die Verwendung von hydrophoben Stellen mit hydrophoben Perlen in einem wässrigen System ergibt beispielsweise, dass die Bindung der Perlen vorzugsweise an die Stellen geführt wird.
Zudem können zur Bindung der Perlen an das Substrat biologisch modifizierte Stellen verwendet werden. Beispielsweise können hierin allgemein beschriebene Bindungsligandenpaare eingesetzt werden; dabei liegt ein Partner auf der Perle und der auf dem Substrat vor. Insbesondere bevorzugt werden in dieser Ausführungsform komplementäre Nucleinsäurestränge und Antigen/Antikörper-Paare.
Darüber hinaus ermöglicht diese Art der Verwendung von biologischen Gruppierungen auch die Bildung von Feldverbünden. Dies entspricht dem in 1F dargestellten System, mit der Ausnahme, dass das Substrat 10 fehlt. In dieser Ausführungsform umfassen Perlen-Populationen einen einzigen Bindungspartner, und Unterpopulationen dieser Population weisen unterschiedliche bioaktive Wirkstoffe auf. Indem unterschiedliche Populationen mit unterschiedlichen Bindungspartnern und ein Substrat, das unterschiedliche Test- oder Feldpositionen mit räumlich getrennten Bindungspartnern aufweist, verwendet werden, kann ein Feldverbund erzielt werden. In dieser Ausführungsform kommt es auch zu Wiederverwendungen von Codes, wie nachstehend allgemein beschrieben, da jedes einzelne Feld des Feldverbundes die gleichen Codes verwenden kann.
Wie oben erläutert, umfasst der Ausdruck "Muster" in diesem Zusammenhang die Verwendung einer einheitlichen Behandlung der Oberfläche, um die Bindung von Perlen an diskrete Stellen sowie die Behandlung der Oberfläche zu ermöglichen, was zu diskreten Stellen führt. Fachleuten ist klar, dass dies auf verschiedene Arten durchgeführt werden kann.
Fachleuten ist klar, dass es eine Anzahl an möglichen Systemanordnungen gibt, wie allgemein in den Figuren dargestellt. Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Standardformaten kann eine Reihe von anderen Formaten verwendet werden. Beispielsweise können, wie in den 1C bis 1F dargestellt, "Teile" von Substraten verwendet werden, die nicht miteinander verbunden sind. Diese können wiederum die gleichen oder unterschiedliche Felder umfassen. Diese Teile können einzeln oder als große Einheit auf einem einzigen Substrat erstellt werden, wonach das Substrat geschnitten oder in unterschiedliche einzelne Substrate geteilt wird. Die 1C und 1D beispielsweise stellen somit eine Vielzahl von Perlen-Feldern dar, die zu den Wells des zweiten Substrats zugesetzt werden; 1C stellt eine "Perle aus Perlen" dar, die zur Maximierung der Vermischung angeordnet ist. 1D verwendet eine Vielzahl von planaren ersten Substraten; Fachleuten ist klar, dass diese an das zweite Substrat gebunden oder nicht gebunden sein können. In einer Ausführungsform wird kein bestimmtes Bindungsverfahren angewandt; alternativ dazu wird eine Reihe von Bindungsverfahren eingesetzt. Wie beispielsweise zur Bindung von Perlen an Substrate dargelegt, können kovalente oder nichtkovalente Kräfte eingesetzt werden, einschließlich Haftmittel, Chemie, hydrophobe/hydrophile Wechselwirkungen etc. Zudem kann das Substrat magnetisch sein und auch magnetisch an der Stelle gehalten (und optional gemischt) werden. Folglich können, wie in 1F dargestellt, beispielsweise Bindungsgruppierungen verwendet werden; diese können kovalente oder nichtkovalente Bindungen umfassen. Sie können einfach nur zur Bindung oder zum Targeting der ersten Substratfelder auf bestimmte Positionen im oder auf dem zweiten Substrat verwendet werden. Somit können beispielsweise verschiedene Oligonucleotide zum Targeting auf und Binden des ersten Substrats an das zweite verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat zur Bilderzeugung mit optischen Eigenschaften versehen. Folglich kann das Substrat beispielsweise über "Linsen"-Eigenschaften, entweder in einem Einkomponenten- oder Zweikomponentensystem, verfügen. Beispielsweise kann in einem Einkomponentensystem der Boden einer oder mehrerer Testpositionen mit einmaligen oder speziellen optischen Komponenten, wie z.B. Linsen, Filter etc., versehen sein.
Darüber hinaus verwenden bevorzugte Ausführungsformen Anordnungen, die das Vermischen der Testreaktion erleichtern.
Beispielsweise verwenden bevorzugte Ausführungsformen Zweikomponentensysteme, die das Vermischen ermöglichen. Das bedeutet, dass in manchen Ausführungsformen die Felder aus dem Block hervorstehen und als "Stäbe" zum Rühren der Reaktion verwendet werden können, um ein gutes Vermischen der Testkomponenten zu erleichtern, die Kinetik der Reaktion zu erhöhen etc. Fachleuten ist klar, dass dies auf verschiedene Arten vorgenommen werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die ersten und zweiten Substrate so angeordnet, dass diese in Bezug zueinander bewegt werden können, entweder in einer X-Y-Koordinatenebene, einer X-Z-Koordinatenebene, einer Y-Z-Koordinatenebene oder in drei Dimensionen (X-Y-Z). In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Blockhaltevorrichtung verwendet, die es ermöglicht, den Block entweder in der Ebene der Platte oder im rechten Winkel dazu frei zu bewegen. Dies ist insbesondere nützlich, wenn die Reaktionsvolumina gering sind, da Standardmischungsbedingungen in solchen Situationen häufig nicht gut funktionieren.
Zusätzlich dazu oder stattdessen können zusätzliche Mischkomponenten als Teil des Systems vorliegen. Beispielsweise können exogene Mischteilchen zugesetzt werden; in einer Ausführungsform werden beispielsweise magnetische Teilchen ver wendet, die über einen Magneten verfügen, der bewegt wird, um das Vermischen zu bewirken; es können beispielsweise kleine magnetische Mischstäbe und magnetische Rührplatten eingesetzt werden.
Alternativ dazu kann das Vermischen in Einkomponenten- oder Zweikomponentensystemen durch Versiegelung des Systems und anschließendes Schütteln unter Verwendung von Standardverfahren, gegebenenfalls unter Verwendung von Mischteilchen, erzielt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Anordnungen eine Population von Mikrokügelchen. Mit "Population" wird hierin, wie oben für die Felder dargelegt, eine Vielzahl von Perlen bezeichnet. Innerhalb der Population liegen getrennte Unterpopulationen vor, die ein einziges Mikrokügelchen oder mehrere idente Mikrokügelchen umfassen können. Das bedeutet, dass, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, im Feld für jeden Wirkstoff nur eine einzige Perle vorliegt; in bevorzugten Ausführungsformen wird eine Vielzahl von Perlen von jedem dieser Typen verwendet.
Mit "Mikrokügelchen" oder "Perlen" oder "Teilchen" oder grammatikalischen Entsprechungen werden hierin kleine diskrete Teilchen bezeichnet. Die Anordnung der Perlen ändert sich je nach Wirkstoffklasse und Syntheseverfahren. Geeignete Perlenzusammensetzungen umfassen jene, die zur Synthese von Peptiden, Nucleinsäuren und organischen Gruppierungen verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Kunststoffe, Keramiken, Glas, Polystyrol, Methylstyrol, Acrylpolymere, paramagnetische Materialien, Thoriumdioxidsol, Kohlenstoffgraphit, Titandioxid, Latex oder vernetzte Dextrane, wie z.B. Sepharose, Cellulose, Nylon, vernetzte Mizellen und Teflon. "Microsphere Detection Guide" von Bangs Laboratories, Fishers, IN, dient hierbei als nützliches Nachschlagewerk.
Die Perlen müssen nicht kugelförmig sein. Es können auch unregelmäßige Teilchen verwendet werden. Außerdem können die Perlen porös sein, wodurch die Oberfläche der Perle, die entweder zur Bindung von bioaktiven Wirkstoffen oder zur IBL- Bindung verfügbar ist, erhöht wird. Die Perlengrößen reichen vom Nanometerbereich, nämlich 100 nm, bis zum Millimeterbereich, d.h. 1 mm, wobei Perlen mit etwa 0,2 μm bis etwa 200 μm bevorzugt und Perlen mit etwa 0,5 μm bis etwa 5 μm insbesondere bevorzugt werden, wobei jedoch in manchen Ausführungsformen kleinere Perlen verwendet werden können.
Es wird angemerkt, dass eine Hauptkomponente der Erfindung die Verwendung einer Substrat/Perlen-Paarung darstellt, die die Assoziation oder Bindung der Perlen an diskrete Stellen auf der Substratoberfläche so ermöglicht, dass sich die Perlen während des Tests nicht bewegen.
Jedes Mikrokügelchen umfasst einen bioaktiven Wirkstoff, wobei es auch, wie Fachleuten klar ist, je nach Syntheseverfahren einige Mikrokügelchen gibt, die keinen bioaktiven Wirkstoff enthalten. Mit "Kandidatwirkstoffen" oder "bioaktiven Wirkstoffen" oder "chemischer Funktionalität" oder "Bindungsligand" wird hierin jedes beliebige Molekül bezeichnet, z.B. Proteine, Oligopeptide, kleine organische Moleküle, Koordinationskomplexe, Polysaccharide, Polynucleotide etc., die an erfindungsgemäße Mikrokügelchen gebunden werden können. Es versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zwei Hauptverwendungen umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden, wie nachstehend genauer beschrieben, die Zusammensetzungen zur Detektion der Gegenwart eines bestimmten Zielanalyten verwendet; beispielsweise zur Detektion der Gegenwart oder der Abwesenheit einer bestimmten Nucleotidsequenz eines bestimmten Proteins, wie z.B. eines Enzyms, eines Antikörpers oder eines Antigens. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen zum Screenen von bioaktiven Wirkstoffen, d.h. Arzneimittelkandidaten, zum Binden an einen bestimmten Zielanalyten verwendet.
Bioaktive Wirkstoffe umfassen unzählige chemische Klassen, wobei sie üblicherweise organische Moleküle, vorzugsweise kleine organische Verbindungen, sind, die ein Molekulargewicht von mehr als 100 und weniger als etwa 2.500 Dalton aufweisen.
Bioaktive Wirkstoffe umfassen funktionelle Gruppen, die für die strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen, insbesondere zur Wasserstoffbrückenbindung, erforderlich sind, und weisen üblicherweise zumindest eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe auf, vorzugsweise zumindest zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die bioaktiven Wirkstoffe umfassen häufig zyklische Kohlenstoffstrukturen oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren der obigen funktionellen Gruppen substituiert sind. Bioaktive Wirkstoffe finden sich unter auch Biomolekülen, einschließlich Peptiden, Nucleinsäuren, Sacchariden, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, Strukturanaloga oder Kombinationen davon. Insbesondere bevorzugt sind Nucleinsäuren und Proteine.
Bioaktive Wirkstoffe können aus einer Vielzahl von verschiedenen Quellen erhalten werden, einschließlich Sammlungen von synthetischen oder natürlichen Verbindungen. Beispielsweise gibt es unzählige Verfahren für Zufallssynthesen oder gerichtete Synthesen einer breiten Vielzahl von organischen Verbindungen und Biomolekülen, einschließlich Expression von randomisierten Oligonucleotiden. Alternativ dazu sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in Form von bakteriellen und pilzartigen Extrakten sowie Pflanzen- und Tierextrakten verfügbar oder leicht herzustellen. Darüber hinaus können natürliche oder synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen mittels herkömmlicher chemischer, physikalischer oder biochemischer Verfahren leicht modifiziert werden. Bekannte pharmakologische Wirkstoffe können gerichteten oder zufälligen chemischen Modifizierungen wie z.B. Acylierungen, Alkylierungen, Veresterungen und/oder Amidierungen unterzogen werden, um Strukturanaloga herzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Wirkstoffe Proteine. Mit "Protein" werden hierin zumindest zwei kovalent gebundene Aminosäuren bezeichnet, die Proteine, Polypeptide, Oligopeptide und Peptide umfassen. Das Protein kann aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Peptidbindungen oder synthetischen peptidomimetischen Strukturen bestehen. Folglich sind hierin unter "Aminosäure" oder "Peptidrest" sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Ami nosäuren zu verstehen. Beispielsweise werden Homophenylalanin, Citrullin und Norleucin für den Zeck der Erfindung als Aminosäuren angesehen. Die Seitenketten können entweder in (R)- oder in (S)-Konfiguration vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die Aminosäuren in (S)-Konfiguration oder in L-Konfiguration vor. Wenn nicht natürlich vorkommende Seitenketten verwendet werden, können Nichtaminosäure-Substituenten eingesetzt werden, um beispielsweise In-vivo-Abbau zu verhindern oder zu verlangsamen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Wirkstoffe natürlich vorkommende Proteine oder Fragmente natürlich vorkommender Proteine. Folglich können beispielsweise proteinhältige zelluläre Extrakte oder Zufallsverdaue oder gerichtete Verdaue von proteinhältigen zellulären Extrakten verwendet werden. Auf diese Weise können Bibliotheken prokaryotischer und eukaryotischer Proteine zum Screenen in den hierin beschriebenen Systemen erstellt werden. Insbesondere bevorzugt werden in dieser Ausführungsform Bibliotheken von bakteriellen, pilzlichen, viralen Proteinen und Säugetierproteinen, wobei die letzteren bevorzugt und menschliche Proteine insbesondere bevorzugt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Wirkstoffe Peptide mit etwa 5 bis etwa 30 Aminosäuren, wobei etwa 5 bis etwa 20 Aminosäuren bevorzugt und etwa 7 bis etwa 15 Aminosäuren insbesondere bevorzugt sind. Die Peptide können, wie oben dargelegt, Verdaue von natürlich vorkommenden Proteinen, Zufallspeptiden, oder "einseitigen" Zufallspeptiden sein. Unter "randomisiert" oder grammatikalischen Entsprechungen davon wird hierin verstanden, dass jede Nucleinsäure und jedes Peptid im Wesentlichen aus Zufallsnucleotiden bzw. Zufallsaminosäuren besteht. Da diese Zufallspeptide (oder, wie nachstehend erläutert, -Nucleinsäuren) chemisch synthetisiert werden, können sie an jeder Position jedes beliebige Nucleotid oder jede beliebige Aminosäure inkorporieren. Das Syntheseverfahren kann darauf abzielen, randomisierte Proteine oder Nucleinsäuren zu bilden, um über die Sequenzlänge die Bildung aller oder der meisten möglichen Kombinationen zu ermöglichen, wodurch eine Bibliothek von randomisierten proteinhältigen Wirkstoffen ausgebildet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek von bioaktiven Wirkstoffen eingesetzt. Die Bibliothek sollte eine ausreichend strukturell vielfältige Population von bioaktiven Wirkstoffen bereitstellen, um eine probabilistisch zufrieden stellende Anzahl an Bindungen an Zielanalyten zu bewirken. Folglich muss eine Wechselwirkungs-Bibliothek groß genug sein, damit zumindest eines ihrer Elemente eine Struktur aufweist, die dem Element eine Affinität zum Zielanalyten verleiht. Obwohl die Beurteilung der erforderlichen absoluten Größe einer Wechselwirkungs-Bibliothek schwierig ist, stellt die Natur anhand der Immunantwort einen Hinweis bereit: eine Diversität von 10⁷ bis 10⁸ unterschiedlichen Antikörpern stellt zumindest eine Kombination bereit, die über eine ausreichende Affinität zur Wechselwirkung mit den wirksamsten Antigenen verfügt, denen ein Organismus ausgesetzt ist. Veröffentlichte Invitro-Auswahlverfahren haben ebenfalls gezeigt, dass eine Bibliotheksgröße von 10⁷ bis 10⁸ ausreicht, um Strukturen mit einer Affinität zum Target zu finden. Folglich werden in einer bevorzugten Ausführungsform bei den vorliegenden Verfahren zumindest 10⁶, vorzugsweise zumindest 10⁷, noch bevorzugter zumindest 10⁸, insbesondere zumindest 10⁹, unterschiedliche bioaktive Wirkstoffe gleichzeitig analysiert. Bei bevorzugten Verfahren kommt es zu einer Maximierung der Bibliotheksgröße und -diversität.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Sammlung vollständig randomisiert, wobei an keiner Position Sequenzpräferenzen oder -konstanten vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Sammlung "einseitig". Das bedeutet, dass einige Positionen innerhalb der Sequenz entweder konstant gehalten werden oder aus einer eingeschränkten Anzahl an Möglichkeiten ausgewählt werden. Beispielsweise werden in einer bevorzugten Ausführungsform die Nucleotide oder Aminosäurereste innerhalb einer definierten Klasse von z.B. hydrophoben Aminosäuren, hydrophilen Resten, sterisch beeinflussten (entweder kleinen oder großen) Resten, zur Bildung von Cysteinen, zum Vernetzen, Proline für SH-3-Domänen, Serine, Threonine, Tyrosine oder Histidine für Phosphorlierungsstellen etc. oder an Purine etc. randomisiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Wirkstoffe Nucleinsäuren (allgemein als "DNA-Sonde" oder hierin als "Kandidatensonde" bezeichnet). Unter "Nucleinsäure" oder "Oligonucleotid" oder grammatikalischen Entsprechungen davon werden hierin zumindest zwei kovalent aneinander gebundene Nucleotide verstanden. Eine erfindungsgemäße Nucleinsäure weist im Allgemeinen Phosphodiesterbindungen auf, wobei in manchen Fällen, wie nachstehend erläutert, Nucleinsäureanaloga umfasst sind, die alternierende Hauptketten aufweisen können und beispielsweise Folgendes umfassen: Phosphoramid (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10), 1925 (1993), und Verweise darin; Letsinger, J. Org. Chem. 35, 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81, 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14, 3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988); und Pauwels et al., Chemica Scripta 26, 141 (1986)), Thiophosphat (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19, 1437 (1991); und das US-Patent Nr. 5.644.048), Dithiophosphat (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 2321 (1989)), O-Methylphosphoramiditbindungen (siehe Eckstein, Oligonucleotide und Analoga: A Practical Approach, Oxford University Press) und Peptidnucleinsäurehauptketten und -bindungen (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114, 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31, 1008 (1992); Nielsen, Nature 365, 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380, 207 (1996), wobei alle hierin durch Verweis aufgenommen sind). Andere analoge Nucleinsäuren umfassen jene mit positiven Hauptketten (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6097 (1995)); nichtionische Hauptketten (US-Patente Nr. 5.386.023; 5.637.684; 5.602.240; 5.216.141; und 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30, 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleosides & Nucleotides 13, 1597 (1994); Kapitel 2 und 3 aus der ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisene Research", hrsg. von Y.S. Sanghui und P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4, 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34, 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37, 743 (1996)) und Nichtribose-Hauptketten, einschließlich jener, die in den US-Patenten Nr. 5.235.033 und 5.034.506 und den Kapitel 6 und 7 aus der ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisene Research", hrsg. von Y.S. Sanghui und P. Dan Cook, beschrieben sind. Nucleinsäuren, die einen oder mehrere carbozyklische Zucker aufweisen, fallen eben falls in die Definition der Nucleinsäuren (siehe Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., S. 169–176 (1995)). Mehrere Nucleinsäureanaloga sind in Rawls, C & E News, 2. Juni 1997, S. 35, beschrieben. Diese Modifizierungen der Ribose-Phosphat-Hauptkette können stattfinden, um das Hinzufügen von zusätzlichen Gruppierungen, wie z.B. Markierungen, zu erleichtern oder die Stabilität und die Halbwertszeit solcher Moleküle in physiologischen Umgebungen zu erhöhen; beispielsweise wird PNA insbesondere bevorzugt. Darüber hinaus können Gemische aus natürlich vorkommenden Nucleinsäuren und Analoga erstellt werden.
Alternativ dazu können Gemische aus unterschiedlichen Nucleinsäureanaloga und Gemische aus natürlich vorkommenden Nucleinsäuren und Analoga erstellt werden. Die Nucleinsäuren können wie angeführt einzelsträngig oder doppelsträngig sein oder Abschnitte von sowohl einzelsträngigen als auch doppelsträngigen Sequenzen enthalten. Die Nucleinsäure kann eine DNA, sowohl eine genomische DNA als auch eine cDNA, RNA oder ein Hybrid sein, worin die Nucleinsäure jede beliebige Kombination von Desoxyribo- und Ribonucleotiden und jede beliebige Kombination aus Basen, einschließlich Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Inosin, Xanthanin, Hypoxanthanin, Isocytosin, Isoguanin und Basenanaloga, wie z.B. Nitropyrrol und Nitroindol etc., umfassen kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Wirkstoffe Bibliotheken von klonalen Nucleinsäuren, einschließlich DNA und RNA. In dieser Ausführungsform werden einzelne Nucleinsäuren hergestellt, indem im Allgemeinen herkömmliche Verfahren (einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Vermehrung in Plasmid- oder Phagenvektoren, Amplifikationsverfahren einschließlich PCR etc.) angewandt werden. Die Nucleinsäuren werden vorzugsweise in irgendeinem Format, wie z.B. in einem Mikrotiterplattenformat, angeordnet, und Perlen werden zur Bindung der Bibliotheken zugesetzt.
Die Bindung der klonalen Bibliotheken (oder jede der hierin dargelegten Nucleinsäuren) kann, wie Fachleuten klar ist, auf verschiedene Weisen erfolgen, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, mittels chemischen Einfangens oder Affinitätseinfangens (z.B. einschließlich Inkorporation derivatisierter Nucleotide, wie z.B. AminoLink, oder biotinylierte Nucleotide, die anschließend zur Bindung von Nucleinsäuren an eine Oberfläche verwendet werden können, sowie Affinitätseinfangen mittels Hybridisierung), Vernetzung und elektrostatischer Bindung etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Affinitätseinfangverfahren zur Bindung von klonalen Nucleinsäuren an die Perlen verwendet. Beispielsweise können klonierte Nucleinsäuren z.B. mit einem Element eines Bindungspaares und die Perlen mit einem anderen Element des Bindungspaares derivatisiert werden. Geeignete Bindungspaare sind wie hierin für IBL/DBL-Paare beschrieben. Beispielsweise können die klonierten Nucleinsäuren biotinyliert sein (z.B. unter Verwendung enzymatischer Inkorporation von biotinylierten Nucleotiden für das fotoaktivierte Vernetzen von Biotin). Biotinylierte Nucleinsäuren können dann, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, mit Streptavidin beschichteten Perlen eingefangen werden. Ähnlich können andere Hapten/Rezeptor-Kombinationen, wie z.B. Digoxigenin- und Anti-Digoxigenin-Antikörper, verwendet werden. Alternativ dazu können chemische Gruppen in Form von derivatisierten Nucleotiden zugesetzt werden, die sodann zum Hinzufügen der Nucleinsäure zur Oberfläche verwendet werden können.
Bevorzugte Bindungen sind kovalent, wobei jedoch relativ schwache Wechselwirkungen (d.h. nichtkovalent) ausreichen können, um eine Nucleinsäure an eine Oberfläche zu binden, wenn es für jede der Nucleinsäuren mehrfache Stellen zur Bindung gibt. Somit können beispielsweise elektrostatische Wechselwirkungen zur Bindung verwendet werden, indem z.B. Perlen die zum bioaktiven Wirkstoff entgegengesetzte Ladung aufweisen.
Ähnlich kann das Affinitätseinfangverfahren unter Verwendung von Hybridisierung dazu verwendet werden, klonierte Nucleinsäuren an Perlen zu binden. Beispielsweise wird, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, polyA+RNA gewöhnlich mittels Hybridisierung von den oligo-dT-Perlen eingefangen; dies kann ein oligo-dT-Einfangen, gefolgt von einer Vernetzung, wie z.B. Psoralen-Vernetzung, umfassen. Wenn die Nucleinsäuren von Interesse keinen polyA–Trakt aufweisen, kann einer mittels Polymerisation mit terminaler Transferase oder durch Ligation eines oligoA-Linkers gebunden werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Alternativ dazu kann eine chemische Vernetzung durchgeführt werden, beispielsweise, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, mittels fotoaktiviertem Vernetzen von Thymidin mit reaktiven Gruppen.
Im Allgemeinen werden zur Dekodierung von klonalen Feldern, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, spezielle Verfahren erfordert.
Wie oben allgemein für Proteine beschrieben, können Wirkstoffe natürlich vorkommende Nucleinsäuren, statische Nucleinsäuren oder "einseitige" statistische Nucleinsäuren sein. Beispielsweise können, wie oben für Proteine angeführt, Verdaue prokaryotischer oder eukaryotischer Genome verwendet werden.
Im Allgemeinen sind Sonden der vorliegenden Erfindung so konstruiert, dass sie zu einer Zielsequenz komplementär sind (entweder der Zielanalytensequenz der Probe oder zu anderen Sondensequenzen, wie hierin beschrieben), sodass es zu einer Hybridisierung des Ziels und der Sonden der vorliegenden Erfindung kommt. Dies muss hinsichtlich Komplementarität nicht perfekt sein; es kann zu beliebig vielen Basenfehlpaarungen kommen, die die Hybridisierung zwischen Zielsequenz und den einzelsträngigen Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung stören. Wenn die Anzahl an Mutationen jedoch so groß ist, dass unter sogar geringst stringenten Hybridisierungsbedingungen keine Hybridisierungen stattfinden, ist die Sequenz keine komplementäre Zielsequenz. Somit wird hierin unter "im Wesentlichen komplementär" verstanden, dass die Sonden ausreichend komplementär zu den Zielsequenzen sind, um unter den ausgewählten Reaktionsbedingungen zu hybridisieren. Hohe Stringenzbedingungen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt; siehe z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), und Short Protocols in Molecular Biology, hrsg. von Ausubel et al., die beide hierin durch Verweis aufgenommen sind. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und unterscheiden sich bei unterschiedlichen Bedingungen. Längere Sequenzen hybridisieren ins besondere bei höheren Temperaturen. Eine ausführliche Anleitung zur Hybridisierung von Nucleinsäuren findet sich in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Im Allgemeinen werden die stringenten Bedingungen so ausgewählt, dass sie etwa 5 bis 10 °C unter dem Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH liegen. Der T_m ist jene Temperatur (bei definierter Ionenstärke, definiertem pH und Nucleinsäurekonzentration), bei der 50 % der Sonden, die zum Ziel komplementär sind, an die Zielsequenz im Gleichgewicht hybridisieren (da die Zielsequenzen im Überschuss vorliegen, sind bei der T_m 50 % der Sonden bei Gleichgewicht besetzt). Stringente Bedingungen sind jene, worin die Salzkonzentration weniger als etwa 1,0 M Natriumion beträgt, üblicherweise eine Natriumionenkonzentration (oder andere Salze) von etwa 0,01 bis 1,0 M bei einem pH von 7,0 bis 8,3 aufweist, wobei die Temperatur für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) zumindest etwa 30 °C und für lange Sonden (z.B. länger als 50 Nucleotide) zumindest etwa 60 °C beträgt. Stringente Bedingungen können auch durch Zugabe von Destabilisatoren, wie z.B. Formamid, erzielt werden. In einer anderen Ausführungsform werden weniger stringente Hybridisierungsbedingungen verwendet; beispielsweise können wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt mäßig oder gering stringente Bedingungen ausgewählt werden; siehe Maniatis und Ausubel, oben, und Tijssen, oben.
Mit "Zielsequenz" oder grammatikalischen Entsprechungen davon wird hierin eine Nucleinsäuresequenz auf einer einzelsträngigen Nucleinsäure bezeichnet. Die Zielsequenz kann ein Abschnitt eines Gens, eine Regulationssequenz, eine genomische DNA, eine cDNA, eine RNA, einschließlich mRNA und rRNA, sowie andere umfassen. Diese kann jede beliebige Länge aufweisen, wobei klar ist, dass längere Sequenzen spezifischer sind. Für Fachleute versteht es sich, dass die komplementäre Zielsequenz jede beliebige Form aufweisen kann. Beispielsweise kann diese unter anderem in einer größeren Nucleinsäuresequenz, d.h. vollständig oder als Teil eines Gens oder einer mRNA, einem Restriktionsfragment eines Plasmids oder einer genomischen DNA enthalten sein. Wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, werden Sonden zur Hybridisierung an Zielsequenzen hergestellt, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Zielsequenzen in einer Probe festzustellen. Allgemein gesagt verstehen Fachleute, was mit dieser Bezeichnung gemeint ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die bioaktiven Wirkstoffe organisch-chemische Gruppierungen, wovon eine breite Vielfalt in der Literatur besprochen ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst jede der Perlen einen einzigen Wirkstofftyp, obwohl vorzugsweise eine Vielzahl von einzelnen bioaktiven Wirkstoffen an jede der Perlen gebunden ist. Ähnlich wird in bevorzugten Ausführungsformen mehr als ein Mikrokügelchen verwendet, das einen einmaligen bioaktiven Wirkstoff enthält; dies bedeutet, dass in das System unter Verwendung von Mikrokügelchen-Unterpopulationen Redundanzen eingeführt sind, wobei jedes der Mikrokügelchen in der Unterpopulation den gleichen bioaktiven Wirkstoff aufweist.
Fachleuten ist klar, dass die bioaktiven Wirkstoffe entweder direkt auf den Perlen synthetisiert werden können oder hergestellt und nach der Synthese gebunden werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zur Bindung der bioaktiven Wirkstoffe an die Perlen Linker verwendet, um sowohl eine gute Bindung als auch eine ausreichende Flexibilität für eine gute Wechselwirkung mit dem Zielmolekül zu ermöglichen und unerwünschte Bindungsreaktionen zu verhindern.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die bioaktiven Wirkstoffe direkt auf den Perlen synthetisiert. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, werden gegenwärtig viele chemische Verbindungsklassen, wie z.B. Peptide, organische Gruppierungen und Nucleinsäuren, auf festen Trägern einschließlich Perlen synthetisiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die bioaktiven Wirkstoffe zuerst synthetisiert und anschließend kovalent an die Perlen gebunden. Fachleuten ist klar, dass dies je nach Zusammensetzung der bioaktiven Wirkstoffe und der Perlen erfolgt. Die Funktionalisierung der festen Trägeroberflächen, wie z.B. bestimmter Po lymere, mit chemisch reaktiven Gruppen, wie z.B. Thiolen, Aminen, Carboxylen etc., ist auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Folglich können "leere" Mikrokügelchen verwendet werden, die über eine Oberflächenchemie verfügen, welche die Bindung der vom Verwender gewünschten Funktionalitäten erleichtert. Einige Beispiele für eine solche Oberflächenchemie bei leeren Mikrokügelchen umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Aminogruppen, einschließlich aliphatischer und aromatischer Amine, Carbonsäuren, Aldehyde, Amide, Chlormethylgruppen, Hydrazid, Hydroxylgruppen, Sulfonate und Sulfate.
Diese funktionellen Gruppen können dazu verwendet werden, zu den Perlen jede beliebige Anzahl an unterschiedlichen Kandidatenstoffen hinzuzufügen, wobei im Allgemeinen bekannte Chemien verwendet werden. Beispielsweise können kohlenhydrathältige Kandidatenstoffe an einen aminofunktionalisierten Träger gebunden werden, wobei der Aldehyd des Kohlenhydrats anhand von Standardverfahren hergestellt wird, wonach der Aldehyd mit einer Aminogruppe auf der Oberfläche umgesetzt wird. In einer alternativen Ausführungsform kann ein Sulfhydryl-Linker verwendet werden. Auf dem Gebiet der Erfindung sind eine Reihe von reaktiven Sulfhydryl-Linkern bekannt, wie z.B. SPDP, Maleinimide, α-Halogenacetyle und Pyridyldisulfide (siehe z.B. Katalog der Pierce Chemical Company, technischer Teil über Vernetzer, S. 155–200 (1994); hierin durch Verweis aufgenommen), die dazu verwendet werden können, Cystein enthaltende proteinhältige Wirkstoffe an den Träger zu binden. Alternativ dazu kann eine Aminogruppe auf dem Kandidatenstoff zur Bindung an eine Aminogruppe auf der Oberfläche verwendet werden. Beispielsweise ist auf dem Gebiet der Erfindung eine große Anzahl an stabilen bifunktionellen Gruppen bekannt, einschließlich homobifunktioneller und heterobifunktioneller Linker (siehe Katalog und Handbuch der Pierce Chemical Company, S. 155 bis 200). In einer zusätzlichen Ausführungsform können Carboxylgruppen (entweder aus der Oberfläche oder dem Kandidatenstoff) unter Verwendung allgemein bekannter Linker (siehe Pierce-Katalog) derivatisiert werden. Beispielsweise aktivieren Carbodiimide Carboxylgruppen zum Angriff durch gute Nucleophile, wie z.B. Amine (siehe Torchilin et al., Critical Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 7(4), 275–308 (1991); ausdrücklich hierin aufgenommen). Proteinhältige Kandidatenstoffe können auch unter Verwendung anderer auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren gebunden werden; zur Bindung von Antikörpern an Polymere siehe beispielsweise Slinkin et al., Bioconj. Chem. 2, 342–348 (1991); Torchilin et al., oben; Trubetskoy et al., Bioconj. Chem. 3, 323–327 (1992); King et al., Cancer Res. 54, 6176–6185 (1994); und Wilbur et al., Biconjugate Chem. 5, 220–235 (1994). Es versteht sich, dass die Kandidatenstoffe auf verschiedene Arten, einschließlich jener oben angeführten, gebunden werden können. Vorzugsweise ändert die Art der Bindung die Funktionalität des Kandidatenstoffes nicht signifikant; das bedeutet, dass der Kandidatenstoff in einer so flexiblen Art gebunden werden sollte, dass dessen Wechselwirkung mit einem Ziel ermöglicht wird. Zudem können diese Typen von chemischen oder biologischen Funktionalitäten verwendet werden, um, wie in 1F dargestellt, Feldpositionen an Testpositionen oder einzelne Reihen von Perlen zu binden.
Spezifische Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen auf Mikrokügelchen sind nach dem Stand der Technik bekannt. In einem Fall werden Mikrokügelchen mit einer NH₂-Oberfächenchemie verwendet. Die Oberflächenaktivierung wird mit einem 2,5%igen Glutaraldeyhd in phosphatgepufferter Salzlösung (10 mM) erzielt, was einen pH von 6,9 ergibt (138 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Dies wird auf einem Rührbett etwa 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mikrokügelchen werden sodann mit ultrareinem Wasser plus 0,01%igem bis 0,02%igem Tween 20 (Tensid) gespült und erneut mit einem PBS mit einem pH von 7,7 plus 0,01%igem Tween 20 gespült. Schließlich wird ein Enzym zur Lösung zugesetzt, vorzugsweise nach einer Vorfiltrierung unter Verwendung eines Amicon-Micropure-Filters mit 45 μm.
In manchen Ausführungsformen können die Mikrokügelchen zusätzlich Identifikator-Bindungsliganden zur Verwendung in bestimmten Dekodierungssystemen umfassen. Mit "Identifikator-Bindungsliganden" oder "IBL" ist hierin eine Verbindung gemeint, die sich spezifisch an einen entsprechenden Dekodierungs-Bindungsliganden (DBL) bindet, um die Aufklärung der Identität des an die Perle gebundenen Wirkstoffs zu erleichtern. Das bedeutet, dass der IBL und der entsprechende DBL Bindungspart nerpaare bilden. Mit "spezifisch binden" ist hierin gemeint, dass der IBL seinen DBL mit einer Spezifizität bindet, die ausreicht, um zwischen dem entsprechenden DBL und anderen DBL (nämlich DBL für andere IBL) oder anderen Komponenten oder Verunreinigern des Systems zu unterscheiden. Die Bindung sollte ausreichen, um unter den Bedingungen während des Dekodierens, einschließlich der Waschungsschritte zur Entfernung von nicht-spezifischen Bindungen, gebunden zu bleiben. In einigen Ausführungsformen, beispielsweise wenn die IBL und die entsprechenden DBL Protein oder Nucleinsäuren sind, betragen die Dissoziationskonstanten des IBL zu seinem DBL weniger als etwa 10^–4 bis 10^–6 M^–1, wobei weniger als etwa 10^–5 bis 10^–9 M^–1 bevorzugt und weniger als etwa 10^–7 bis 10^–9 M^–1 insbesondere bevorzugt wird.
IBL-DBL-Bindungspaare sind bekannt oder können unter Verwendung von bekannten Verfahren leicht gefunden werden. Wenn der IBL beispielsweise ein Protein ist, umfassen die DBL Proteine (insbesondere einschließlich Antikörper oder Fragmenten davon (FAbs etc.)) oder kleine Moleküle, oder umgekehrt (der IBL ist ein Antikörper und der DBL ein Protein). Metallionen-Metallionen-Liganden-Paare oder Chelatbildnerpaare sind ebenfalls geeignet. Antigen-Antikörper-Paare, Enzyme und Substrate oder Hemmer, andere Protein-Protein-Wechselwirkungspaare, Rezeptor-Liganden, komplementäre Nucleinsäuren (einschließlich Nucleinsäuremoleküle, die Tripelhelices bilden) sowie Kohlenhydrate und deren Bindungspartner sind ebenfalls geeignete Bindungspaare. Nucleinsäure-Nucleinsäure-Bindungsproteinpaare sind ebenfalls hilfreich, einschließlich einzelsträngiger oder doppelsträngiger Nucleinsäurebindungsproteine und niedermolekularer Nucleinsäurebindungsmittel. Ähnlich können, wie allgemein in den US-Patenten Nr. 5.270.163, 5.475.096, 5.567.588, 5.595.877, 5.637.459, 5.683.867, 5.705.337 und verwandten Patenten beschrieben, Nucleinsäure-"Aptamere" zum Binden an praktisch jedes beliebige Ziel entwickelt werden, wobei ein solches Aptamer-Ziel-Paar als IBL-DBL-Paar verwendet werden kann. Ähnlich gibt es einen großen Bestand an Literatur, die sich mit der Entwicklung von Bindungspaaren beschäftigt, die auf kombinatorischen Chemieverfahren beruhen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der IBL ein Molekül, dessen Farb- oder Lumineszenzeigenschaften sich in Gegenwart eines selektiv bindenden DBL verändern.
In einer Ausführungsform kann der DBL an eine Perle, nämlich eine "Dekodier-Perle", gebunden sein, die eine Markierung wie z.B. ein Fluorophor aufweisen kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das IBL-DBL-Paar im Wesentlichen die komplementären einzelsträngigen Nucleinsäuren. In dieser Ausführungsform können die Bindungsliganden als "Identifikator-Sonden" und "Dekodier-Sonden" bezeichnet werden. Im Allgemeinen liegen die Identifikator- und Dekodier-Sonden in einem Längenbereich von etwa 4 bis etwa 1.000 Basenpaaren, wobei etwa 6 bis etwa 100 bevorzugt und etwa 8 bis etwa 40 insbesondere bevorzugt werden. Wichtig ist, dass die Sonden lange genug sind, um spezifisch zu sein, d.h. um zwischen unterschiedlichen IBL-DBL-Paaren zu unterscheiden, jedoch kurz genug sind, um sowohl a) eine Dissoziation, wenn erforderlich, unter geeigneten Versuchsbedingungen und b) eine effiziente Hybridisierung zu ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform binden sich die IBL nicht an die DBL, wie nachstehend genauer dargelegt wird. Stattdessen werden die IBL eher als Identifikator-Gruppierungen ("IM") verwendet, die beispielsweise anhand von Massenspektroskopie direkt identifiziert werden.
Alternativ dazu weisen in einer bevorzugten Ausführungsform der IBL und der bioaktive Wirkstoff die gleiche Gruppierung auf; somit kann der bioaktive Wirkstoff, beispielsweise wie hierin dargelegt, insbesondere wenn keine optische Signatur verwendet wird, sowohl als Identifikator als auch als Wirkstoff dienen. Beispielsweise kann die Perlen-gebundene Sonde (die als bioaktiver Wirkstoff dient) im Fall von Nucleinsäuren auch Dekodier-Sonden binden, um die Sondensequenz auf der Perle zu identifizieren. Folglich binden sich die DBL in dieser Ausführungsform an die bioaktiven Wirkstoffe. Dies stellt sich als insbesondere geeignet heraus, da diese Ausführungsform zusätzlich zum Dekodieren Informationen über das Feld oder den Test liefern kann. Beispielsweise ermöglicht die Verwendung des DBL, wie nachstehend ausführlicher dargelegt, eine Feldkalibrierung sowie eine Testentwicklung. Dies kann erfolgen, auch wenn die DBL als solche nicht verwendet werden; beispielsweise kann die Verwendung dieser Sondenanordnungen bei nicht statistischen Feldern eine Feldkalibrierung und eine Testentwicklung ermöglichen, sogar wenn keine Dekodierung erforderlich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Mikrokügelchen keine optische Signatur auf. Das bedeutet, dass, wie in der US-Anmeldung Nr. 19970818199, die als Priorität für WO 98/50782 dient, dargelegt, bei vorherigen Arbeiten jede der Mikrokügelchen-Unterpopulationen eine einmalige optische Signatur oder eine optische Markierung aufwies, die dazu verwendet wurde, um den einmaligen bioaktiven Wirkstoff jener Mikrokügelchen-Unterpopulation zu identifizieren; das bedeutet, dass beim Dekodieren optische Eigenschaften der Perlen so verwendet werden, dass eine Perle mit einer einmaligen optischen Signatur von Perlen an anderen Positionen mit unterschiedlichen optischen Signaturen unterschieden werden kann. Folglich wurde bei vorherigen Arbeiten jedem bioaktiven Wirkstoff eine einmalige optische Signatur zugeschrieben, sodass jede der Mikrokügelchen mit jenem bioaktiven Wirkstoff aufgrund der Unterschrift identifizierbar war. Diese optischen Signaturen umfassten Farbstoffe, üblicherweise Chromophore oder Fluorophore, die von den Perlen eingefangen oder an die Perlen selbst gebunden waren. Zur Erzielung verschiedener optischer Signaturen wurden unterschiedliche Fluorochrome, unterschiedliche Verhältnisse der Fluorochromgemische und unterschiedliche Konzentrationen (Intensitäten) der Fluorochrome verwendet.
Folglich muss die vorliegende Erfindung nicht ausschließlich auf die Verwendung von optischen Eigenschaften zur Dekodierung der Felder vertrauen, obwohl dies in einigen Fällen vorkommen kann. Dennoch ist es in einigen Ausführungsformen möglich, wie Fachleuten klar ist, optische Signaturen als zusätzliches Kodierungsverfahren zusammen mit dem vorliegenden System zu verwenden. Folglich kann die Größe des Feldes, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, effektiv erhöht werden, während eine einzige Anordnung von Dekodier-Gruppierungen auf verschiedene Weisen verwendet wird, wobei eine die Verwendung in Kombination mit den optischen Signaturen auf Perlen darstellt. Somit ermöglicht beispielsweise die Verwendung einer "Anordnung" von Dekodier-Molekülen, die Verwendung von zwei Populationen von Perlen, eine mit und die andere ohne optische Signatur, die effektive Verdoppelung der Feldgröße. Die Verwendung von mehrfachen optischen Signaturen erhöht auf ähnliche Weise die mögliche Größe des Feldes.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst jede der Perlen-Unterpopulationen eine Vielzahl unterschiedlicher IBL. Unter Verwendung einer Vielzahl verschiedener IBL zur Kodierung der jeweiligen bioaktiven Wirkstoffe wird die Anzahl der möglichen einmaligen Codes wesentlich erhöht. Das bedeutet, dass unter Verwendung eines einmaligen IBL pro Wirkstoff die Größe des Feldes der Anzahl der einmaligen IBL (unter der Annahme, dass, wie nachstehend dargelegt, keine "Wiederverwendung" stattfindet) entspricht. Dennoch kann unter Verwendung einer Vielzahl unterschiedlicher IBL pro Perle, n, die Größe des Feldes auf 2ⁿ erhöht werden, wenn die Gegenwart oder Abwesenheit der jeweiligen IBL als Indikator herangezogen wird. Beispielsweise kommt es bei der Zuordnung von 10 IBL pro Perle zu einem binären Code mit 10 Bit, worin jedes der Bit als "1" (IBL liegt vor) oder "0" (IBL ist abwesend) bezeichnet werden kann. Ein binärer Code mit 10 Bit weist 2¹⁰ mögliche Varianten auf. Dennoch kann, wie nachstehend ausführlicher besprochen, die Feldgröße zusätzlich vergrößert werden, wenn ein anderer Parameter, wie z.B. Konzentration oder Intensität, miteingeschlossen wird; wenn somit z.B. zwei unterschiedliche Konzentrationen von IBL verwendet werden, wird die Feldgröße auf 3ⁿ erhöht. Folglich wird in dieser Ausführungsform jedem einzelnen bioaktiven Wirkstoff im Feld eine IBL-Kombination zugeordnet, die zu den Perlen vor der Zugabe eines bioaktiven Wirkstoffs, nach oder während der Synthese des bioaktiven Wirkstoffs zugesetzt werden kann, d.h. es kommt zu einer gleichzeitigen Zugabe von IBL und bioaktiven Wirkstoffkomponenten.
Alternativ dazu kann die Kombination unterschiedlicher IBL verwendet werden, um die Sequenz des Proteins oder der Nucleinsäure aufzuklären, wenn der bioaktive Wirkstoff ein Polymer mit unterschiedlichen Resten ist, d.h. wenn der Wirkstoff ein Protein oder eine Nucleinsäure ist.
Folglich kann beispielsweise durch Verwendung zweier unterschiedlicher IBL (IBL1 und IBL2) die erste Position einer Nucleinsäure aufgeklärt werden; Adenosin kann beispielsweise durch die Gegenwart von sowohl IBL1 als auch IBL2 dargestellt werden; Thymidin kann durch die Gegenwart von IBL1, jedoch nicht IBL2 dargestellt werden; Cytosin kann durch die Gegenwart von IBL2, jedoch nicht IBL1 dargestellt werden; und Guanin kann durch die Abwesenheit von beiden dargestellt werden. Die zweite Position der Nucleinsäure kann auf ähnliche Weise unter Verwendung von IBL3 und IBL4 aufgeklärt werden; folglich wird durch die Gegenwart von IBL1, IBL2, IBL3 und IBL4 die Sequenz von AA erhalten; IBL1, IBL2 und IBL3 weist auf die Sequenz AT; durch IBL1, IBL3 und IBL4 wird die Sequenz TA erhalten etc. Die dritte Position verwendet IBL5 und IBL6 etc. Auf diese Weise kann die Verwendung 20 unterschiedlicher Identifikatoren einen einmaligen Code für jedes mögliche 10-mer ergeben.
Das System ist für Proteine ähnlich, wobei dieses, je nach erlaubter Diversität an der jeweiligen Position, eine größere Anzahl unterschiedlicher IBL zur Identifizierung jeder der Positionen erfordert. Folglich werden fünf unterschiedliche IBL für die jeweilige Position erforderlich, wenn jede Aminosäure an jeder Position zugelassen wird. Wie jedoch oben angeführt, kann im System eine Einseitigkeit eingeführt werden, wenn beispielsweise statistisch verteilte Peptide als bioaktive Wirkstoffe verwendet werden; mitunter liegen nicht alle Aminosäuren an allen Positionen vor, und manche Positionen sind mitunter vorher festgelegt. Demzufolge ist es mitunter möglich, für jede der Aminosäuren vier unterschiedliche IBL zu verwenden.
Auf diese Weise kann für jede der Sequenzen eine Art "Barcode" erstellt werden, wobei die Gegenwart oder Abwesenheit jedes bestimmten IBL die Identifikation der einzelnen bioaktiven Wirkstoffe ermöglicht.
Zudem ermöglicht die Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen oder Dichten von IBL eine Art "Wiederverwendung" dieser. Wenn beispielsweise jene Perle, die einen ersten Wirkstoff aufweist, über eine 1-malige Konzentration von IBL verfügt und eine zweite Perle, die einen zweiten Wirkstoff aufweist, über eine 10-malige Konzentration von IBL verfügt, ermöglicht die Verwendung gesättigter Konzentrationen der entsprechenden markierten DBL den Verwendern eine Unterscheidung zwischen den zwei Perlen.
Nachdem die Mikrokügelchen, die die Kandidatenstoffe und die einmaligen IBL umfassen, gebildet wurden, werden diese zur Bildung eines Feldes dem Substrat zugesetzt. Es wird angemerkt, dass, während es in den meisten hierin beschriebenen Verfahren zu einer Zugabe der Perlen zum Substrat vor dem Test kommt, die Reihenfolge des Herstellens, Verwendens und Dekodierens des Feldes unterschiedlich sein kann. Beispielsweise kann das Feld hergestellt und dekodiert und erst dann dem Test unterzogen werden.
Alternativ dazu kann das Feld hergestellt, in einem Test verwendet und dann dekodiert werden; dies kann insbesondere dann vorkommen, wenn nur einige wenige Perlen dekodiert werden müssen. Alternativ dazu können die Perlen dem Testgemisch, und zwar der Probe, die die Zielanalyten aufweist, vor der Zugabe der Perlen zum Substrat zugesetzt werden; nach der Zugabe und dem Test kann das Feld dekodiert werden. Dies wird insbesondere bevorzugt, wenn die Probe, die die Perlen aufweist, gerührt oder gemischt wird; dies kann zu einer Erhöhung der Menge an Zielanalyten, die an die Perlen pro Zeiteinheit gebunden sind, führen und demzufolge (im Falle von Nucleinsäuretests) die Hybridisierungskinetik steigern. Dies kommt insbesondere in Fällen zum Tragen, worin die Konzentration des Zielanalyten in der Probe gering ist; im Allgemeinen müssen bei geringen Konzentrationen lange Bindungszeiten verwendet werden.
Zusätzlich kann die Zugabe der Perlen zum Testgemisch eine Sortierung oder Auswahl ermöglichen. Beispielsweise kann eine große Sammlung von Perlen zu einer Probe zugesetzt werden, wobei nur jene Perlen zum Substrat zugesetzt werden können, die die Probe binden. Wenn der Zielanalyt beispielsweise fluoreszierend markiert ist (entweder direkt (z.B. durch Aufnahme von Markierungen in die Nucleinsäureamplifikationsreaktionen) oder indirekt (beispielsweise durch die Verwendung von Sandwich-Tests)), können Perlen, die als Ergebnis der Zielanalytenbindung eine Fluoreszenz aufweisen, mittels fluoreszenzaktivierten Zellsortierern (FACS) sortiert werden, und nur diese Perlen zu einem Feld zugesetzt und anschließend dekodiert werden. Ähnlich kann die Sortierung durch Affinitätsverfahren erzielt werden; es können Affinitätssäulen erstellt werden, die die Zielanalyten umfassen, wobei nur bindende Perlen auf dem Feld verwendet werden können. Auf ähnliche Weise können Zwei-Perlen-Systeme verwendet werden; beispielsweise können magnetische Perlen, die die Zielanalyten aufweisen, verwendet werden, um jene Perlen "herauszuziehen", die sich an die Ziele binden, gefolgt von einer anschließenden Freisetzung der magnetischen Perlen (beispielsweise mittels Temperaturerhöhung) und einer Zugabe zu einem Feld.
Im Allgemeinen werden Verfahren zur Erstellung der Felder und Dekodieren der Felder durchgeführt, um die Anzahl der unterschiedlichen Kandidatenstoffe, die einmalig kodiert werden können, zu maximieren. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auf unterschiedliche Art und Weise hergestellt werden. Im Allgemeinen werden die Felder hergestellt, indem eine die Perlen enthaltende Lösung oder Aufschlämmung zu einer Oberfläche zugesetzt wird, die die Stellen zur Assoziation der Perlen enthält. Dies kann mittels unterschiedlicher Puffer, einschließlich wässriger und organischer Lösungsmittel, und Gemische erfolgen. Das Lösungsmittel kann verdampfen, und überschüssige Perlen können entfernt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein neuartiges Verfahren zur Beladung der Perlen auf ein Feld verwendet, wenn nichtkovalente Verfahren verwendet werden, um die Perlen an die Felder zu assoziieren. Dieses Verfahren umfasst das Aussetzen des Feldes gegenüber einer Lösung von Teilchen (einschließlich Mikrokügelchen und Zellen) und das anschließende Anlegen von Energie, z.B. durch Rühren oder Vibrierenlassen des Gemischs. Dies führt zu einem Feld, das dichter assoziierte Teilchen umfasst, da das Rühren mit einer Energie vorgenommen wird, die aus reicht, dass schwach assoziierte Perlen herunterfallen (oder im Falle der Wells herausfallen). Diese Stellen sind sodann verfügbar, um eine unterschiedliche Perle zu binden. Auf diese Weise werden Perlen ausgewählt, die eine hohe Affinität für die Stellen aufweisen. Auf diese Weise hergestellte Felder weisen, verglichen mit einer statischeren Beladung, zwei Hauptvorteile auf: zuerst eine höhere Prozentzahl an Stellen, die leicht zu füllen sind, und zweitens weisen die so beladenen Felder eine wesentliche Verringerung des Perlenverlusts während der Tests auf. Folglich werden in einer bevorzugten Ausführungsform diese Verfahren angewandt, um Felder zu erstellen, deren Stellen zu zumindest 50 % befüllt sind, wobei zumindest etwa 75 % bevorzugt und zumindest etwa 90 % insbesondere bevorzugt sind. Auf ähnliche Weise verlieren auf diese Weise hergestellte Felder vorzugsweise weniger als etwa 20 % an Perlen während eines Tests, wobei weniger als etwa 10 % bevorzugt und weniger als etwa 5 % insbesondere bevorzugt sind.
In dieser Ausführungsform wird das Substrat, das die Oberfläche mit den diskreten Stellen umfasst, in eine Lösung eingetaucht, die die Teilchen (Perlen, Zellen etc.) umfasst. Die Oberfläche kann, wie hierin beschrieben, Wells umfassen oder andere Typen von Stellen auf einer strukturierten Oberfläche, sodass es für die Stellen unterschiedliche Affinitäten gibt. Diese unterschiedliche Affinität führt zu einem kompetitiven Prozess, sodass die sich stärker assoziierenden Teilchen ausgewählt werden. Vorzugsweise ist die gesamte mit Perlen zu "beladende" Oberfläche in Fluid-Kontakt mit der Lösung. Diese Lösung ist im Allgemeinen eine Aufschlämmung, die in einem Bereich von etwa 10.000:1 Perlen:Lösung (Vol.:Vol.) bis 1:1 liegt. Im Allgemeinen kann die Lösung jede beliebige Anzahl an Reagenzien umfassen, einschließlich wässriger Puffer, organischer Lösungsmittel, Salzen, anderen Reagenskomponenten etc. Zudem umfasst die Lösung vorzugsweise einen Überschuss an Perlen; das bedeutet, es gibt mehr Perlen als Stellen auf dem Feld. In bevorzugten Ausführungsformen kommt ein zweifacher bis milliardenfacher Überschuss an Perlen zum Einsatz.
Das Eintauchen kann Testbedingungen nachahmen; wenn das Feld beispielsweise von oben in eine die Proben enthaltende Mikrotiterplatte "eingetaucht" werden soll, kann diese Anordnung für das Beladen wiederholt werden, wodurch jene Perlen minimiert werden, die aufgrund der Schwerkraft zum Herausfallen neigen.
Nachdem die Oberfläche eingetaucht worden ist, werden das Substrat, die Lösung oder beides einem kompetitiven Prozess unterzogen, wodurch die Teilchen mit geringer Affinität vom Substrat getrennt werden können und durch Teilchen mit höherer Affinität zur Stelle ersetzt werden. Dieser kompetitive Prozess findet mittels Einführung von Energie statt, und zwar in Form von Hitze, Beschallung, Rühren oder Mischen, Vibrierenlassen oder Schütteln der Lösung oder des Substrats oder beiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Rühren oder Vibrierenlassen eingesetzt. Im Allgemeinen wird die Anzahl der Manipulationen des Substrats minimiert, um das Feld vor Schädigungen zu schützen; folglich wird bei bevorzugten Ausführungsformen eher das Rühren der Lösung statt des Feldes ausgeführt, wobei beides funktioniert. Fachleuten ist klar, dass dieses Rühren auf verschiedene Arten erfolgen kann, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform Mikrotiterplatten verwendet werden, die Perlenlösungen enthalten, die unter Verwendung von Mikrotiterplattenschüttlern gerührt werden.
Das Rühren findet so lange statt, bis das Feld auf eine gewünschte Beladung gefüllt ist. Je nach Größe und Konzentration der Perlen und der Größe des Feldes kann diese Zeit von 1 Sekunde bis zu Tagen variieren, wobei ein Zeitraum von etwa 1 Minute bis etwa 24 Stunden bevorzugt ist.
Es wird angemerkt, dass nicht alle Stellen eines Feldes eine Perle enthalten; das bedeutet, es kann einige Stellen auf der Substratoberfläche geben, die leer sind. Zudem kann es einige Stellen geben, die mehr als eine Perle enthalten, wobei dies nicht bevorzugt wird.
In einigen Ausführungsformen, z.B. wenn eine chemische Bindung erfolgt ist, ist es möglich, die Perlen in einer nichtzufälligen Verteilung oder in geordneter Weise zu assoziieren. Unter Verwendung von beispielsweise fotoaktivierbaren Bindungs- Linkern oder fotoaktivierbaren Klebstoffen oder Masken können ausgewählte Stellen auf dem Feld nacheinander so gemacht werden, dass sie sich zum Binden eignen, sodass definierte Perlen-Populationen abgelegt werden.
Die Felder der vorliegenden Erfindung sind so angeordnet, dass Informationen über die Identität der Kandidatenstoffe in die Felder eingebaut sind, sodass die zufällige Anordnung der Perlen in den Faser-Wells "dekodiert" werden kann, um eine Identifikation der Kandidatenstoffe an allen Positionen zu ermöglichen. Dies kann auf verschiedene Weisen durchgeführt werden, und zwar entweder vor, während oder nach der Verwendung des Feldes zur Detektion von Zielmolekülen.
Folglich wird das Feld, nachdem es erstellt worden ist, "dekodiert", um die Stelle eines oder mehrerer bioaktiver Wirkstoffe, d.h. jede Perlen-Unterpopulation der Perlen, auf der Substratoberfläche zu identifizieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein selektives Dekodierungssystem verwendet. In diesem Fall werden nur jene Mikrokügelchen dekodiert, die, resultierend aus dem Binden eines Zielanalyten, eine Veränderung des optischen Signals aufweisen. Dies wird herkömmlich gemacht, wenn die Anzahl an "Treffern", d.h. die Anzahl der zu dekodierenden Stellen, im Allgemeinen gering ist. Das heißt, dass das Feld zuerst unter Versuchsbedingungen in Abwesenheit des Zielanalyten gescannt wird. Die Probe, welche die Zielanalyten enthält, wird zugesetzt, und es werden nur jene Stellen dekodiert, die eine Veränderung des optischen Signals aufweisen. Die Perlen an entweder den positiven oder negativen Signalstellen können beispielsweise entweder selektiv markiert oder aus dem Feld freigesetzt werden (beispielsweise indem fotoabspaltbare Linker verwendet werden) und anschließend sortiert oder in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) angereichert werden. Das bedeutet, dass entweder alle negativen Perlen freigesetzt werden und dann die positiven Perlen entweder freigesetzt oder in situ analysiert werden, oder alternativ dazu alle positiven Perlen freigesetzt und analysiert werden. Alternativ dazu können die Markierungen halogenierte aromatische Verbindungen umfassen, und die Detektion der Markierung wird vorgenommen, indem beispielsweise Gaschromatographie, chemi sche Markierungen, isotope Markierungen oder massenspektrometrische Markierungen angewendet werden.
Fachleuten ist klar, dass dies auch in Systemen erfolgen kann, worin das Feld nicht dekodiert ist; und zwar muss es nie eine Wechselbeziehung zwischen Perlenanordnung und Stelle geben. In dieser Ausführungsform werden die Perlen auf dem Feld angeordnet und der Test durchgeführt. Die "positiven", nämlich jene Perlen, die, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, eine Veränderung des optischen Signals aufweisen, werden sodann "markiert", um sie von den "negativen" Perlen zu unterscheiden oder zu trennen. Dies kann auf verschiedene Arten stattfinden, vorzugsweise unter Verwendung von Faseroptik-Feldern. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält jede der Perlen einen fluoreszierenden Farbstoff. Nach dem Test und der Identifikation der "positiven" oder "aktiven Perlen" wird entweder nur entlang der positiven Fasern oder nur entlang der negativen Fasern ein Licht angezeigt, im Allgemeinen in Gegenwart eines fotoaktivierten Reagens (üblicherweise gelöster Sauerstoff). In ersterem Fall werden alle aktiven Perlen fotogebleicht. Somit können die nichtfluoreszierenden aktiven Perlen aus den fluoreszierenden negativen Perlen sortiert werden, und zwar nach der nichtselektiven Freisetzung aller Perlen mit anschließendem Sortieren unter Verwendung von beispielsweise einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS). Alternativ dazu sind alle negativen nichtfluoreszierend und die positiven fluoreszierend, wenn entlang den negativen Fasern ein Licht angezeigt wird, und das Sortieren kann fortfahren. Die Charakterisierung des gebundenen bioaktiven Wirkstoffs kann direkt unter beispielsweise Einsatz von Massenspektroskopie erfolgen.
Alternativ dazu kann die Identifikation durch die Verwendung von Identifikator-Gruppierungen ("IM"), die den IBL ähnlich sind, sich jedoch nicht zwingend an DBL binden, erfolgen. Das bedeutet, dass statt einer direkten Aufklärung der Struktur des bioaktiven Wirkstoffs die Anordnung der IM als Identifikator dienen kann. Folglich kann beispielsweise eine spezifische Kombination von IM zur Kodierung der Perle dienen und dazu verwendet werden, den Wirkstoff auf der Perle nach der Freisetzung von der Perle zu identifizieren, gefolgt von einer anschließenden Analyse, bei spielsweise unter Verwendung eines Gaschromatographen oder eines Massenspektroskops.
Alternativ dazu umfasst jede der Perlen einen nichtfluoreszierenden Vorläufer zu einem fluoreszierenden Farbstoff, statt dass jede der Perlen einen fluoreszierenden Farbstoff aufweist. Beispielsweise kann eine Fotoaktivierung des Fluorochroms erfolgen, wenn beispielsweise fotoabspaltbare Schutzgruppen, wie bestimmte ortho-Nitrobenzylgruppen, auf einem fluoreszierenden Molekül verwendet werden. Nach dem Test zeigt sich wieder entlang der "positiven" oder "negativen" Fasern ein Licht, um diese Populationen zu unterscheiden. Die erleuchteten Vorläufer werden chemisch zu einem fluoreszierenden Farbstoff überführt. Jede der Perlen wird anschließend mittels Sortieren aus dem Feld freigesetzt, um Populationen von fluoreszierenden und nichtfluoreszierenden Perlen (entweder positive oder negative oder umgekehrt) zu bilden.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Assoziationsstellen der Perlen (z.B. die Wells) ein fotopolymerisierbares Reagens, oder der fotopolymerisierbare Wirkstoff wird zum zusammengestellten Feld zugesetzt. Nach der Durchführung des Tests zeigt sich wieder entlang der "positiven" oder "negativen" Fasern ein Licht, um diese Populationen zu unterscheiden. Als Ergebnis der Bestrahlung werden entweder alle positiven oder alle negativen polymerisiert und eingefangen oder an die Stellen gebunden, während die andere Perlen-Population aus dem Feld freigesetzt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Stelle jedes der bioaktiven Wirkstoffe unter Verwendung von Dekodierungs-Bindungsliganden (DBL) bestimmt. Wie oben dargelegt, umfassen DBL Bindungsliganden, die sich entweder an Identifikator-Bindungsliganden, wenn diese vorliegen, binden oder an die bioaktiven Wirkstoffe selbst, vorzugsweise wenn der bioaktive Wirkstoff eine Nucleinsäure oder ein Protein ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform bindet sich der DBL, wie oben dargelegt, an den IBL.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Wirkstoffe einzelsträngige Nucleinsäuren, und der DBL ist eine im Wesentlichen komplementäre einzelsträngige Nucleinsäure, die sich an den bioaktiven Wirkstoff bindet (hybridisiert) und hierein als Dekodier-Sonde bezeichnet wird. Es wird eine Dekodier-Sonde hergestellt und zur Dekodierung des Feldes verwendet, die im Wesentlichen komplementär zu jeder Kandidatensonde ist. In dieser Ausführungsform sollten die Kandidatensonden und die Dekodier-Sonden eine ausreichende Länge aufweisen (und das Dekodieren unter geeigneten Bedingungen stattfinden), um eine Spezifizität zu ermöglichen; und zwar bindet sich jede Kandidatensonde mit ausreichender Spezifizität an ihre entsprechende Dekodier-Sonde, um die Unterscheidung der jeweiligen Kandidatensonden zu ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die DBL entweder direkt oder indirekt markiert. Unter "markiert" wird hierin verstanden, dass eine Verbindung zumindest ein Element, Isotop oder eine chemische Verbindung aufweist, die gebunden sind, um die Detektion der Verbindung zu ermöglichen. Im Allgemeinen fallen Markierungen in drei Klassen: a) isotope Markierungen, die radioaktive oder schwere Isotope sein können; b) magnetische, elektrische und thermische Markierungen; und c) gefärbte oder lumineszierende Farbstoffe, wobei Markierungen Enzyme und Teilchen, wie z.B. magnetische Teilchen, ebenfalls umfassen. Bevorzugte Markierungen umfassen lumineszierende Markierungen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der DBL direkt markiert, d.h. der DBL umfasst eine Markierung. In einer weiteren Ausführungsform wir der DBL indirekt markiert, d.h. es wird ein Markierungs-Bindungsligand (LBL) verwendet, der sich an den DBL bindet. In dieser Ausführungsform kann das Markierungs-Bindungsligand-DBL-Paar das gleiche wie oben für IBL-DBL-Paare beschriebene sein. Geeignete Markierungen umfassen, jedoch nicht ausschließlich, fluoreszierende Lanthanoidkomplexe, einschließlich jene von Europium und Terbium, Fluorescein, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Eosin, Erythrosin, Cumarin, Methylcumarine, Pyren, Malachitgrün, Stilben, Lucifergelb, Cascade Blue^TM, Texasrot, FITC, PE, cy3, cy5 und andere, die in der hierin ausdrücklich als Verweis aufgenommen sechsten Auflage des Molecular Probes Handbook von Richard P. Haugland beschrieben sind.
In einer Ausführungsform umfasst die Markierung ein Molekül, dessen Farbe oder Lumineszenzeigenschaften sich in der Gegenwart des IBL aufgrund einer Veränderung der lokalen Umgebung verändern. Beispielsweise kann die Markierung Folgendes sein: (1) ein fluoreszierender pH-Indikator, dessen Emissionsintensität sich mit dem pH-Wert ändert; (2) ein fluoreszierender Ionen-Indikator, dessen Emissionseigenschaften sich mit der Ionenkonzentration ändern; oder (3) ein fluoreszierendes Molekül, wie z.B. ein Ethidiumsalz, dessen Fluoreszenzintensität sich in hydrophoben Umgebungen erhöht.
Demzufolge findet die Identifizierung der Stelle der einzelnen Perlen (oder Perlen-Unterpopulationen) unter Verwendung eines oder mehrerer Dekodierungsschritte statt, die eine Bindung zwischen dem markierten DBL und entweder dem IBL oder dem bioaktiven Wirkstoff (d.h. eine Hybridisierung zwischen der Kandidatensonde und der Dekodierungs-Sonde, wenn der bioaktive Wirkstoff eine Nucleinsäure ist) umfassen. Nach dem Dekodieren können die DBL entfernt und das Feld verwendet werden; unter manchen Umständen ist, wenn z.B. der DBL sich an den IBL und nicht an den bioaktiven Wirkstoff bindet, die Entfernung des DBL jedoch nicht erforderlich (obwohl dies unter manchen Bedingungen erwünscht sein kann). Zudem kann das Dekodieren, wie hierin dargelegt, entweder vor der Verwendung des Feldes in einem Test, während des Tests oder nach dem Test stattfinden.
In einer Ausführungsform wird ein einziger Dekodierungsschritt durchgeführt. In dieser Ausführungsform wird jeder der DBL mit einer einmaligen Markierung markiert, sodass die Anzahl der einmaligen Markierungen der Anzahl an bioaktiven Wirkstoffen entspricht oder größer ist (wobei in manchen Fällen, wie hierin beschrieben, eine "Wiederverwendung" der einmaligen Markierungen vorgenommen werden kann; ähnlich können kleinere Varianten von Kandidatensonden den gleichen Dekodierer aufweisen, wenn die Varianten in einer anderen Dimension, nämlich in Perlengröße oder Markierung, kodiert sind). Für jeden bioaktiven Wirkstoff oder IBL wird ein DBL hergestellt, der sich spezifisch daran bindet und eine einmalige Markierung aufweist, beispielsweise ein oder mehr Fluorochrome. Folglich ist die Identität der jeweiligen DBL, sowohl dessen Anordnung (d.h. dessen Sequenz, wenn es sich um eine Nucleinsäure handelt) als auch dessen Markierung bekannt. Anschließend kann die Stelle der jeweiligen DBL aufgeklärt werden, indem die DBL zum Feld zugesetzt werden, das die bioaktiven Wirkstoffe enthält, und zwar unter Bedingungen, die die Bildung von Komplexen (die als Hybridisierungskomplexe bezeichnet werden, wenn es sich bei den Komponenten um Nucleinsäuren handelt) zwischen den DBL und entweder den bioaktiven Wirkstoffen oder den IBL ermöglichen. Dies ermöglicht die Identifikation der Stelle jedes der bioaktiven Wirkstoffe, wobei das zufallsveränderte Feld dekodiert worden ist. Die DBL können sodann falls erforderlich entfernt und die Zielprobe angewandt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Anzahl einmaliger Markierungen weniger als die Anzahl einmaliger bioaktiver Wirkstoffe; folglich wird eine aufeinander folgende Reihe von Dekodierungsschritten angewandt. Zur leichteren Darlegung wird diese Ausführungsform für Nucleinsäuren erklärt, wobei andere Typen von bioaktiven Wirkstoffen und DBL ebenfalls geeignet sind. In dieser Ausführungsform werden die Dekodierungs-Sonden zum Dekodieren in n Gruppen unerteilt. Die Anzahl der Gruppen entspricht der Anzahl der einmaligen Markierungen. Jede der Dekodierungs-Sonden wird in n getrennten Reaktionen mit n bestimmten Markierungen markiert. Jede der Dekodierungs-Sonden weisen die gleichen n Markierungen auf. Jeder Pool an Dekodierern enthält nur eine Version der n Markierungen für jeden Dekodierer, wobei in sämtlichen Pools keine zwei Dekodierungs-Sonden die gleiche Markierungssequenz aufweisen. Die Anzahl an Pools, die erforderlich ist, damit dies stimmt, wird durch die Anzahl der Dekodierungs-Sonden und n bestimmt. Die Hybridisierung des jeweiligen Pools zum Feld erzeugt bei jeder Erkennungsstelle, die ein IBL umfasst, ein Signal. Die sequentielle Hybridisierung der jeweiligen Pools führt wiederum zu einem einmaligen sequenzspezifischen Code für jede Kandidatensonde. Dadurch wird die Kandidatensonde an jeder Erkennungsstelle im Feld identifi ziert. Wenn beispielsweise 4 Markierungen verwendet werden, dann können 4 × n Sequenzhybridisierungen idealerweise zwischen 4ⁿ-Sequenzen unterscheiden, wobei in manchen Fällen mehrere Schritte erforderlich sein können. Nach der Hybridisierung der jeweiligen Pools werden die Hybride denaturiert und die Dekodierungs-Sonden entfernt, sodass die Sonden für die nächste Hybridisierung einzelsträngig gemacht werden (wobei es auch möglich ist, limitierende Mengen von Zielen so zu hybridisieren, dass die verfügbare Sonde nicht gesättigt wird; sequenzielle Hybridisierung kann durchgeführt und analysiert werden, indem ein bereits bestehendes Signal von der vorigen Hybridisierung abgezogen wird).
Ein Beispiel zur Veranschaulichung: angenommen wird ein Feld mit 16 Sonden-Nucleinsäuren (Nummer 1 bis 16) und vier einmaligen Markierungen (z.B. vier unterschiedliche Fluophore; Markierungen A bis D). Es werden Dekodierungs-Sonden 1 bis 16 hergestellt, die den Sonden auf den Perlen entsprechen. Der erste Schritt umfasst die Markierung der Dekodierungs-Sonden 1 bis 4 mit Markierung A, der Dekodierungs-Sonden 5 bis 8 mit Markierung B, der Dekodierungs-Sonden 9 bis 12 mit Markierung C und der Dekodierungs-Sonden 13 bis 16 mit Markierung D. Die Sonden werden vermischt, und der Pool wird mit dem Feld kontaktiert, das die Perlen mit den gebundenen Kandidatensonden enthält. Sodann wird die Stelle für jede Markierung (und somit jedes Dekodierungs- und Kandidatensondenpaar) bestimmt. Die erste Gruppe Dekodierungs-Sonden wird anschließend entfernt. Eine zweite Gruppe wird zugesetzt, wobei dieses Mal die Dekodierungs-Sonden 1, 5, 9 und 13 mit der Markierung A, die Dekodierungs-Sonden 2, 6, 10 und 14 mit der Markierung B, die Dekodierungs-Sonden 3, 7, 11 und 15 mit der Markierung C und die Dekodierungs-Sonden 4, 8, 12 und 16 mit der Markierung D markiert werden. Somit enthalten jene Perlen, die die Markierung A in beiden Dekodierungsschritten aufweisen, die Kandidatensonde 1; die Markierung A aus dem ersten Dekodierungsschritt und die Markierung B aus dem zweiten Dekodierungsschritt enthalten die Kandidatensonde 2; die Markierung A aus dem ersten Dekodierungsschritt und die Markierung C aus dem zweiten Schritt enthalten die Kandidatensonde 3 etc. Fachleuten ist klar, dass die Dekodierungs-Sonden in jeder beliebigen Reihenfolge hergestellt und zugesetzt werden können.
In einer Ausführungsform werden die Dekodierungs-Sonden in situ markiert. Das bedeutet, dass diese vor der Dekodierungsreaktion nicht markiert werden müssen. In dieser Ausführungsform ist die ankommende Dekodierungs-Sonde kürzer als die Kandidatensonde, was zu einem 5'-"Überhang" auf der Dekodierungs-Sonde führt. Die Zugabe von markierten ddNTP (alle mittels einmaliger Markierung markiert) und einer Polymerase ermöglicht das Hinzufügen der Markierungen auf sequenzspezifische Weise, wodurch ein sequenzspezifisches Muster von Signalen erzeugt wird. Ähnlich können andere Modifikationen vorgenommen werden, einschließlich Ligierung etc.
Darüber hinaus ist es möglich, eine Gruppe einmaliger DBL "wiederzuverwenden", da die Größe des Feldes durch die Anzahl an einmaligen Dekodierungs-Bindungsliganden bestimmt wird, um eine größere Anzahl an Teststellen zu ermöglichen. Dies kann auf verschiedene Weisen erfolgen; beispielsweise indem einige Unterpopulationen verwendet werden, die optische Signaturen umfassen; auf ähnliche Weise, indem ein positionelles Kodierungsschema innerhalb eines Feldes verwendet wird, wobei unterschiedliche Unter-Bündel die Gruppe der DBL wiederverwenden können. Ähnlich wird in einer Ausführungsform die Perlengröße als Kodierungsmodalität verwendet, wodurch die Wiederverwendung der Gruppe einmaliger DBL für jede Perlengröße ermöglicht wird. Alternativ dazu kann das sequentielle teilweise Befüllen der Felder mit Perlen ebenfalls die Wiederverwendung von DBL ermöglichen. Zudem kann es zum "Teilen von Codes" kommen.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die DBL wiederverwendet werden, indem einigen Perlen-Unterpopulationen optische Signaturen verliehen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die optische Signatur im Allgemeinen ein Gemisch von, vorzugsweise fluoreszierenden, Reporterfarbstoffen. Indem sowohl die Zusammensetzung des Gemischs (nämlich das Verhältnis zwischen den Farbstoffen) als auch die Konzentration des Farbstoffs (was zu unterschiedlichen Signalintensitäten führt) verändert wird, können Matrizen mit einmaligen optischen Signaturen erzielt werden. Dies kann erfolgen, indem die Farbstoffe kovalent an die Perlenoberflächen gebunden werden, oder alternativ dazu, indem die Farbstoffe innerhalb der Perle eingeschlossen werden. Die Farbstoffe können Chromophore oder Phosphore sein, wobei sie vorzugsweise fluoreszierende Farbstoffe sind, die aufgrund der starken Signale ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zum Dekodieren bereitstellen. Als geeignete Farbstoffe zur Verwendung in vorliegender Erfindung kommen jene in Frage, die oben zum Markieren der DBL angeführt wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Kodieren in einem Verhältnis von zumindest zwei Farbstoffen erzielt werden, obgleich mehr Kodierungsdimensionen beispielsweise in Perlengröße zugesetzt werden können. Darüber hinaus unterscheiden sich die Markierungen voneinander, wodurch zwei unterschiedliche Markierungen unterschiedliche Moleküle (nämlich zwei unterschiedliche Fluophore) oder alternativ dazu eine Markierung mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen oder Intensitäten umfassen können.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Farbstoffe kovalent an die Perlenoberfläche gebunden. Dies kann, wie allgemein zur Bindung von bioaktiven Wirkstoffen dargelegt, durchgeführt werden, und zwar indem auf den Perlenoberflächen funktionelle Gruppen verwendet werden. Fachleuten ist klar, dass diese Bindungen zur Minimierung der Wirkung auf den Farbstoff gemacht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Farbstoffe nichtkovalent an die Perlen gebunden, im Allgemeinen indem die Farbstoffe in den Perlenporen eingeschlossen werden.
Zudem wird das Kodieren in Verhältnissen von zwei oder mehr Farbstoffen statt einer einzigen Farbstoffkonzentration bevorzugt, da dies Unempfindlichkeit gegenüber der Lichtintensität, die verwendet wird, um die Signatur der Reporterfarbstoffe zu erhalten, und Detektorempfindlichkeit bereitstellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein räumliches oder positionelles Kodierungssystem angewandt. In dieser Ausführungsform werden Unter-Bündel oder Unterfelder (nämlich Abschnitte des Gesamtfeldes) verwendet. Analog zum Telefonsys tem stellt jedes Unterfeld den "Ortscode" dar, das die gleichen Markierungen (d.h. Telefonnummern) anderer Unterfelder aufweisen kann, die aufgrund der Position des Unterfeldes getrennt sind. Folglich kann die Verwendung 50 einmaliger Markierungen in Kombination mit 100 unterschiedlichen Unterfeldern ein Feld mit 5.000 unterschiedlichen bioaktiven Wirkstoffen ausbilden. In dieser Ausführungsform ist es wichtig, ein Bündel von einem anderen zu unterscheiden. Im Allgemeinen erfolgt dies entweder manuell oder durch die Verwendung von Markierungsperlen; diese können Perlen, die für jedes Unterfeld einmalige Markierungen aufweisen, oder die Verwendung der gleichen Markierungsperle in unterschiedlichen Mengen oder die Verwendung zweier oder mehrerer Markierungsperlen in unterschiedlichen Verhältnissen umfassen.
In alternativen Ausführungsformen können zusätzliche Kodierungsparameter zugesetzt werden, wie z.B. Mikrokügelchengröße. Die Verwendung von Perlen mit unterschiedlichen Größen kann beispielsweise die Wiederverwendung von DBL-Gruppen ermöglichen. Das bedeutet, dass es möglich ist, Mikrokügelchen verschiedener Größen zu verwenden, um die Kodierungsdimensionen der Mikrokügelchen zu erweitern. Es können Glasfaser-Felder hergestellt werden, die Pixel mit unterschiedlichen Faserdurchmessern oder Querschnitten aufweisen. Alternativ dazu können zwei oder mehr optische Faserbündel, wobei jedes unterschiedliche Querschnitte der einzelnen Fasern aufweist, zugesetzt werden, um ein größeres Bündel zu bilden; oder es können optische Faserbündel mit Fasern der gleichen Querschnittsgröße, die unterschiedlich große Perlen aufweisen, verwendet werden. Aufgrund der unterschiedlichen Durchmesser können die größten Wells mit den größten Mikrokügelchen und nach und nach die kleineren Wells mit kleineren Mikrokügelchen befüllt werden, bis alle Wellgrößen befüllt sind. Auf diese Weise konnte das gleiche Farbstoffverhältnis verwendet werden, um die Mikrokügelchen mit unterschiedlichen Größen zu kodieren, wodurch die Anzahl der unterschiedlichen im Feld vorliegenden Oligonucleotidsequenzen oder chemischen Funktionalitäten erweitert wurde. Obwohl dieses sowie andere hierin angeführte Verfahren für Glasfasersubstrate dargelegt wurden, können diese mit anderen Substraten sowie mit anderen Bindungsmodalitäten verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Kodieren und Dekodieren durch sequentielles Befüllen der Mikrokügelchen in das Feld erzielt. Wie oben beim räumlichen Kodieren dargelegt, können die optischen Signaturen in dieser Ausführungsform "wiederverwendet" werden. In dieser Ausführungsform ist die Sammlung der Mikrokügelchen, die jeweils unterschiedliche bioaktive Wirkstoffe umfasst (oder die Unterpopulationen weisen jeweils unterschiedliche bioaktive Wirkstoffe auf), in eine Vielzahl von Unterbibliotheken geteilt. Beispielsweise können je nach Größe des gewünschten Feldes und der Anzahl an einmaligen Markierungen 10 Unterbibliotheken erstellt werden, die jeweils etwa 10 % der Gesamtbibliothek umfassen, wobei jede der Unterbibliotheken etwa die gleichen einmaligen Markierungen umfasst. Sodann wird die erste Unterbibliothek zum optischen Faserbündel, das die Wells enthält, zugesetzt und die Position der jeweiligen bioaktiven Wirkstoffe üblicherweise unter Verwendung von DBL bestimmt. Anschließend wird die zweite Unterbibliothek zugesetzt und die Position der jeweiligen bioaktiven Wirkstoffe erneut bestimmt. Das Signal umfasst in diesem Fall das Signal aus dem "ersten" DBL und dem "zweiten" DBL. Indem die zwei Matrizen verglichen werden, kann die Position der jeweiligen Perle in der jeweiligen Unterbibliothek bestimmt werden. Ähnlich ermöglicht die sequentielle Zugabe einer dritten, vierten etc. Unterbibliothek die Befüllung des Feldes.
In einer bevorzugten Ausführungsform können Codes auf verschiedene Weisen "geteilt" werden. In einer ersten Ausführungsform kann ein einziger Code (d.h. IBL-DBL-Paar) zwei oder mehr Wirkstoffen zugeordnet werden, wenn die Zielanalyten sich ausreichend in ihren Bindungsstärken unterscheiden. Zwei in einem mRNA-Mengenbestimmungstest verwendete Nucleinsäure-Sonden können beispielsweise den gleichen Code teilen, wenn sich die Bereiche ihrer Hybridisierungssignalintensitäten nicht überlappen. Dazu kann es kommen, wenn beispielsweise eine der Zielsequenzen immer in einer viel höheren Konzentration vorliegt als die andere. Alternativ dazu könnten die zwei Zielsequenzen immer in ähnlicher Konzentration, jedoch in unterschiedlichen Hybridisierungseffizienzen vorliegen.
Alternativ dazu kann ein einziger Code einer Vielzahl von Wirkstoffen zugeordnet werden, wenn die Wirkstoffe funktionell gleichwertig sind. Wenn beispielsweise eine Gruppe von Oligonucleotid-Sonden den gemeinsamen Zweck zur Detektion bestimmter Gene aufweisen, sind die Sonden funktionell gleichwertig, auch wenn diese eine unterschiedliche Sequenz aufweisen können. Ähnlich könnten alle Sonden unterschiedlicher Elemente einer Klasse, wie etwa Kinasen oder G-Protein-gebundene Rezeptoren einen Code teilen, wenn Klassen oder "Familien" von Analyten gewünscht sind. Ähnlich könnte ein Feld von diesem Typ verwendet werden, um Homologe bekannter Gene zu detektieren. In dieser Ausführungsform wird jedes Gen durch eine heterologe Gruppe von Sonden dargestellt, die an unterschiedliche Bereiche des Gens hybridisiert (und sich somit hinsichtlich Sequenz unterscheidet). Die Sondengruppe teilt einen gemeinsamen Code. Wenn ein Homolog vorliegt, kann dieses an einige, jedoch nicht alle Sonden hybridisieren. Der Anteil an hybridisierenden Sonden sowie die mittlere Hybridisierungsintensität könnten auf den Grad der Homologie hinweisen. Ähnlich könnten mehrere Antikörper gegen dasselbe Protein den gleichen Code teilen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Dekodierung der sich selbst organisierenden zufälligen Felder auf der Basis von pH-Titration durchgeführt. In dieser Ausführungsform umfassen die Perlen zusätzlich zu den bioaktiven Wirkstoffen optische Signaturen, worin die optischen Signaturen durch die Verwendung von auf pH reagierenden Farbstoffen (manchmal hierin als "pH-Farbstoffe" bezeichnet), wie etwa Fluorophore, erzeugt werden. Diese Ausführungsform gleicht der in PCT US98/05025 und der in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 09/151.877 dargelegten Ausführungsform, die beide ausdrücklich durch Verweis aufgenommen sind, mit der Ausnahme, dass die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Farbstoffe Änderungen der Fluoreszenzintensität (oder anderer Eigenschaften) aufweisen, wenn der pH der Lösung von unter dem pKa-Wert bis über den pKa-Wert (oder umgekehrt) eingestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Gruppe von pH-Farbstoffen verwendet, wobei jeder einen unterschiedlichen pKa-Wert aufweist, vorzugsweise durch zumindest 0,5 pH-Einheiten getrennt. In bevorzugten Ausführungsform wird eine pH-Farbstoffgruppe mit pKa-Werten von 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11 und 11,5 verwendet. Jede Perle kann jede beliebige Untergruppe von pH-Farbstoffen aufweisen, und auf diese Weise wird ein einmaliger Code für den bioaktiven Wirkstoff erzeugt. Folglich wird das Dekodieren eines Feldes durch Titration des Feldes von einem pH-Wert von 1 bis 13 und dem Messen des Fluoreszenzsignals aus jeder Perle als Funktion des pH-Werts der Lösung erzielt.
In einer bevorzugten Ausführungsform gibt es zusätzliche Möglichkeiten, die Anzahl an einmaligen oder bestimmten Markierungen zu erhöhen. Das bedeutet, der Einsatz von bestimmten Merkmalen auf jeder Perle kann dazu verwendet werden, die Anzahl der Codes zu erhöhen. Zudem ermöglicht das sequentielle Dekodieren eine Wiederverwendung der Codes auf neue Weise. Diese Merkmale sind unabhängig voneinander, was ein exponentielles Wachstum der Anzahl an Codes als Funktion der Anzahl an Dekodierungsschritten und der Anzahl an Merkmalen (z.B. bestimmte Codes) ermöglicht. Indem jedoch die Menge der in einem einzigen Dekodierungsschritt erhaltenen Dekodierungsinformation erhöht wird, kommt es zu einer deutlichen Verringerung der Anzahl an Dekodierungsschritten. Alternativ dazu wird die Anzahl an bestimmten Codes deutlich erhöht. Indem die Anzahl an Merkmalen pro Dekodierungsschritt erhöht wird, werden weniger Dekodierungsschritte für eine bestimmte Anzahl an Codes erforderlich. Somit werden in einer bevorzugten Ausführungsform eine Reihe von Verfahren verwendet, um eine Anzahl von Codes zur Verwendung bei der Dekodierung der Felder zu bilden, während die erforderlichen Dekodierungsschritte minimiert werden. Es kann beispielsweise eine Reihe von unterschiedlichen Kodierungsstrategien kombiniert werden: somit können unterschiedliche "Farben", Farbkombinationen ("Farbtöne"), unterschiedliche Intensitäten der Farben oder Farbtöne oder beides etc. kombiniert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform stützen sich die DBL auf die Bindung oder Einbettung einer quantitativen oder diskreten Gruppe physikalischer Merkmale an die Perle; d.h. Markierung der Perle. Bevorzugte physikalische Merkmale einer Perle umfassen, jedoch nicht ausschließlich: Oberflächen-"Glätte" oder -"Rauheit", Farbe (fluoreszierend oder anders), Farbintensität, Größe, detektierbare chemische Gruppierungen, chemisches Reaktionsvermögen, Magnetisierung, pH-Empfindlichkeit, Energietransfereffizienz zwischen vorliegenden Farbstoffen, Hydrophobie, Hydrophilie, Absorptionsvermögen, Ladung, pH-Empfindlichkeit etc.
Ein Perlendekodierungsschema umfasst das Zuweisen bzw. Verleihen eines einzigen quantifizierbaren Merkmals zu bzw. an jedem/jeden Perlentyp, worin sich jeder Perlentyp hinsichtlich quantifizierbarem Wert dieses Merkmals unterscheidet. Beispielsweise kann eine bestimmte Anzahl an Fluorophoren an eine Perle gebunden werden und die Anzahl an gebundenen Fluorophoren im Dekodierungsverfahren quantifiziert werden. In der Praxis erweist sich die Bindung einer "bestimmten Menge" eines Merkmals an eine Perle und das genaue Messen des Merkmals jedoch als problematisch. Im Allgemeinen ist das Ziel, den Variationskoeffizienten (CV) zu reduzieren. Unter Variationskoeffizient wird die Variabilität bei der Markierung einer Perle bei nacheinander stattfindenden Markierungen verstanden. Dieser CV kann bestimmt werden, indem Perlen mit einer definierten bestimmten Anzahl an Markierungen (z.B. Fluorophor) in mehrfachen Tests markiert werden und das von der Perle emittierte Signal gemessen wird. Ein hoher CV schränkt die Anzahl an verwendbaren und auflösbaren "Graden" für jedes beliebige Merkmale ein.
In einem robusteren Dekodierungsschema werden eher ratiometrische als absolute Messungen zur Segmentierung eines quantitativen Merkmals in Codes angewandt. Unter ratiometrischer Dekodierung wird das Markieren einer Perle mit einem Markierungsverhältnis (nämlich 1:10, 1:1 und 10:1) verstanden. Theoretisch kann eine beliebige Anzahl an Verhältnissen verwendet werden, sofern die Differenz der Signale zwischen den Verhältnissen detektierbar ist. Dieses Verfahren führte zu einem geringeren CV und ermöglichte eine höhere Merkmalssegmentierung innerhalb eines bestimmten dynamischen Bereichs. Somit reduziert in einer bevorzugten Ausführungsform die Verwendung von ratiometrischer Dekodierung den Variationskoeffizienten.
Darüber hinaus kann das ratiometrische Dekodieren, wie Fachleuten klar ist, auf unterschiedliche Weise durchgeführt werden. Statt eine bestimmte Anzahl an DBL mit einer ersten Farbstoffintensität (oder einer Farbstoffkombinationsintensität) in der ersten Dekodierungsreaktion und eine zweite Anzahl mit einer zweiten Farbstoffintensität in der sequentiellen zweiten Dekodierungsreaktion zuzusetzen, kann in dieser Ausführungsform diese ratiometrische Analyse unter Verwendung eines Verhältnisses von markierten:unmarkierten DBL erfolgen. Das bedeutet, dass bei einer vorbestimmten gesättigten Konzentration von Dekodierungs-Perlen, z.B. 100.000 DBL pro Reaktion, der erste Intensitätsdekodierungsschritt erfolgen kann, indem 100.000 markierte DBL zugesetzt werden, und der zweite Schritt wird durchgeführt, indem 10.000 markierte DBL und 90.000 unmarkierte DBL zugesetzt werden. Das Gleichgewicht bestimmt, dass der zweite Schritt ein Zehntel der Signalintensität ergeben wird.
Aufgrund der Streuung der Werte eines quantitativ gemessenen Merkmalswerts ist die Anzahl an bestimmten Codes praktisch auf weniger als ein Dutzend oder so Codes eingeschränkt. Indem eine Perle der Reihe nach mit unterschiedlichen Merkmalswerten "bemalt" (d.h. an die Perle wird temporär ein Merkmalsgrad gebunden) und "abgezogen" (Entfernung der Merkmalsgrade) wird, wächst die Anzahl an möglichen Codes exponentiell mit der Anzahl der sequentiellen Phasen im Dekodierungsverfahren.
Ein Beispiel zur Veranschaulichung: beispielsweise 9 unterschiedliche Perlentypen und drei unterscheidbare Merkmalsverteilungen (Tabelle 1). Das "Bemalen" (Markieren) der Perlen mit unterschiedlichen Merkmalswerten in einer bestimmten kombinatorischen Struktur in den zwei unterschiedlichen Phasen ergibt für jeden Perlentyp einen einmaligen Code, d.h. es kommt zu neun unterschiedlichen Codes. Somit werden in einer bevorzugten Ausführungsform die Perlen mit unterschiedlichen Merkmalen in einer bestimmten kombinatorischen Struktur in einer Vielzahl von Schritten markiert. Dies erzeugt einmalige Codes für jeden Perlentyp. Beispiele für die unterschiedlichen Merkmale sind oben beschrieben. Das Markieren der Perlen mit unterschiedlichen Merkmalen wird mittels Verfahren durchgeführt, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind.

Anzahl der einmaligen Codes = Anzahl der Merkmale^Anzahl der Phasen

Tabelle 1 Sequentielle Dekodierung führt zu einmaligen Codes unter Verwendung einer geringen Anzahl an Merkmalsgraden.
Fluoreszierende Farben stellen ein insbesondere geeignetes Merkmal bei der Verwendung in einem Dekodierungsschema dar. Fluoreszierende Farben können an jeden beliebigen Wirkstoff, der einen IBL erkennt, gebunden werden, um einen markierten DBL zu bilden. Die Diskussion richtet sich dabei auf Oligonucleotide (einschließlich Nucleinsäureanaloga) als DBL. Ein fluoreszierend markiertes Oligonucleotid ist ein insbesondere geeigneter DBL, da es jede beliebige gewünschte Perlen-Untergruppe mit einer bestimmten Farbe spezifisch und reversibel, einfach mittels Hybridisierung und Dehybridisierung (und zwar an den DBL mit einer komplementären Seguenz) "bemalen" kann. Zudem kann Fluoreszenz unter Verwendung von optischer Standardhardware und -software einfach sichtbar gemacht und quantifiziert werden. Um einen bestimmten Perlentyp mit einer bestimmten Farbe zu "bemalen", muss der Perlentyp mit einer einmaligen hybridisierbaren DNA-Sequenz (IBL) markiert werden, und die Dekodierungslösung muss das farbmarkierte Komplement jener Sequenz enthalten.
Eine Überlegung zur Durchführung eines Dekodierungsschemas umfasst die Minimierung der Anzahl an erhaltenen Abbildungen. In einem farbbasierten Schema stellt die Anzahl an erhaltenen Abbildungen das Produkt der Anzahl an Farben und der Anzahl an Phasen dar. Die Anzahl an Abbildungen kann reduziert werden, indem eine Perle für jede bestimmte Phase mit mehreren Farben "bemalt" wird. Indem einer Perle mehrere Farben zugewiesen werden, wird die Anzahl an effektiven Codes erhöht. Beispielsweise kann in einem bei Computern angewandten Farbverfahren mittels 24-Bit-Dreifarbenschema (z.B. rot, grün, blau) eine Gesamtzahl von 256·256·256 = 16,7 Millionen unterschiedlichen "Farbtönen" aus nur drei Farben (rot, grün, blau) erzielt werden.
Somit werden die DBL in einer bevorzugten Ausführungsform mit einer Kombination aus gefärbten Fluorophoren markiert. Als solches wird dieses Verfahren zur Erhöhung der Anzahl an verfügbaren Codes zur Markierung von DBL unter Verwendung von nur einer handvoll unterschiedlicher Farbstoffe (Farben) eingesetzt. Die Erhöhung der Anzahl an verfügbaren Codes bei jedem Dekodierungsschritt erhöht stark die Anzahl an Dekodierungsschritten, die in einem bestimmten Dekodierungsverfahren erforderlich ist.
In einer Ausführungsform wird die Oligonucleotid-Population, die für einen einzigen DBL kodiert, mit einem definierten Verhältnis von Farben so markiert, dass jede Perle, an die sich der DBL bindet, bezogen auf einen charakteristischen "Farbton", der aus der Kombination der gefärbten Fluorophore formuliert ist, identifiziert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zwei unterschiedliche Farben verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform sind drei oder mehr bestimmte Farbstoffe (Farben) zur Verwendung verfügbar. In diesem Fall beträgt die Anzahl an unterscheidbaren Codes, die durch Markieren einer Oligonucleotid-Population, die für einen einzelnen DBL kodiert, mit einer beliebigen Farbe gebildet werden, drei. Indem jedoch das Kombinieren von Farben und Farbgraden beim Markieren zugelassen wird, können viel mehr Codes hergestellt werden.
Zum Dekodieren mittels Hybridisierung beträgt die bevorzugte Anzahl an unterscheidbaren Farbschattierungen 2 bis 2.000, wobei eine bevorzugtere Anzahl an unterscheidbaren Farbschattierungen 2 bis 200 und eine insbesondere bevorzugte Anzahl an unterscheidbaren Farbschattierungen 2 bis 20 beträgt. Indem drei unter schiedliche Farbschattierungen (Intensitäten) und drei Farben verwendet werden, beträgt die Anzahl der unterschiedlichen Farbtöne 3⁴ = 81. Das Kombinieren des Farbstoffs mit sequentieller Dekodierung ermöglicht die Bildung einer praktisch uneingeschränkten Anzahl an Codes.
Wie zuvor beschrieben, kann der DBL jeder beliebigen Wirkstoff sein, der sich an den IBL bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein einziger DBL mit einem vorbestimmten Farbenverhältnis markiert. Dieses Verhältnis wird bei jedem DBL variiert, was einen einmaligen "Farbton" für jeden so markierten DBL ermöglicht. Nach Behandlung der Perlen mit dem DBL wird die Perle analysiert, um den mit jeder Perle assoziierten "Farbstoff' zu analysieren, wodurch die Perle mit ihrem assoziierten bioaktiven Wirkstoff identifiziert wird.
Beispielsweise sind mit vier Grundfarben und zwei Intensitätsgraden (Farbe ist anwesend oder abwesend) fünfzehn unterschiedliche Farbtöne bzw. Phasen möglich. Wenn vier Farbstoffe und drei unterschiedliche Intensitätsgrade verwendet werden (abwesend, halb anwesend, ganz anwesend), sind 73 unterschiedliche Farbtöne bzw. Phasen möglich. In diesem Fall reicht der Erhalt von 4 Farbabbildungen aus, um Informationen über 73 unterschiedliche Kodierungsfarbtöne zu erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Feldanordnungen bereit, die ein erstes Substrat enthalten, wobei eine Oberfläche diskrete Stellen aufweist. In bevorzugten Ausführungsformen wird eine auf den Stellen verteilte Mikrokügelchen-Population verwendet, wobei die Population zumindest eine erste und eine zweite Unterpopulation umfasst. Jede der Unterpopulationen umfasst einen bioaktiven Wirkstoff und zusätzlich zumindest einen optischen Farbstoff mit einem bestimmten pKa-Wert. Die pKa-Werte unterschiedlicher optischer Farbstoffe unterscheiden sich voneinander.
In einer bevorzugten Ausführungsform gibt es mehrere Verfahren, die zum Dekodieren der Felder herangezogen werden können, wenn das Feld beispielsweise klonierte Nucleinsäuren umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform können, wie hierin dargelegt, bei vorhandener Sequenzinformation über die klonierten Nucleinsäuren spezifische Dekodierungs-Sonden hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können "zufällige" Dekodierungs-Sonden hergestellt werden. Durch wie oben dargelegte sequentielle Hybridisierungen oder durch die Verwendung von mehreren Markierungen kann eine einmalige Hybridisierungsstruktur für jedes Sensorelement erzeugt werden. Dies ermöglicht, dass alle Perlen, die einen bestimmten Klon repräsentieren, als zur gleichen Gruppe gehörend identifiziert werden. Im Allgemeinen wird dies unter Verwendung von zufälligen oder teilweise degenerierten Dekodierungs-Sonden vorgenommen, die sich auf sequenzabhängige, jedoch nicht sonderlich sequenzspezifische Weise binden. Das Verfahren kann mehrere Male wiederholt werden, wobei jedes Mal eine unterschiedliche Markierungsentität verwendet wird, um eine unterschiedliche Signalstruktur, bezogen auf die quasispezifischen Wechselwirkungen, zu erzeugen. Auf diese Weise baut sich für jedes Sensorelement nach und nach eine einmalige optische Signatur auf. Indem die optischen Signaturen einer Strukturwiedererkennung oder Clustering-Algorithmen unterzogen werden, können die Perlen in Gruppen eingeteilt werden, die die gleiche Signatur aufweisen (d.h. die gleiche Sonde tragen).
Zur Identifizierung der eigentlichen Klonsequenz sind zusätzliche Verfahren erforderlich; beispielsweise kann eine direkte Sequenzierung durchgeführt werden. Indem ein geordnetes Feld verwendet wird, das die Klone aufweist, wie z.B. ein spotted-cDNA-Feld, kann ein "Schlüssel" erstellt werden, der eine Hybridisierungsstruktur mit einem spezifischen Klon verbindet, dessen Position in der Gruppe bekannt ist. Auf diese Weise kann der Klon gewonnen und weiter charakterisiert werden.
Alternativ dazu können Klonfelder unter Verwendung von binärem Dekodieren mit Vektormarkierungen dekodiert werden. Beispielsweise werden teilweise randomisierte Oligos in einen Nucleinsäurevektor (z.B. Plasmid, Phage etc.) kloniert. Jede Oligonucleotidsequenz besteht aus einer Untergruppe aus einer limitierten Gruppe von Sequenzen. Wenn beispielsweise die limitierte Gruppe 10 Sequenzen umfasst, kann jedes Oligonucleotid einige (oder ale 10) Untergruppensequenzen aufweisen. Somit kann im Oligonucleotid jede der 10 Sequenzen vorliegen oder abwesend sein. Deshalb gibt es 2¹⁰ oder 1.024 mögliche Kombinationen. Die Sequenzen können sich überlappen, und kleine Varianten können ebenfalls vorliegen (z.B. A-, C-, T- und G-Substitutionen), um die Anzahl an möglichen Kombinationen zu erhöhen. Eine Nucleinsäurebibliothek wird in einen Vektor kloniert, der die zufälligen Codesequenzen enthält. Alternativ dazu können zur Zugabe der Markierungen andere Verfahren, wie etwa PCR, angewandt werden. Auf diese Weise ist es möglich, eine geringe Anzahl Oligo-dekodierender Sonden zur Dekodierung eines Klonfeldes zu verwenden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Diskriminanzanalysen, Clusteralgorithmen und Computervorrichtungen zur Analyse der Dekodierungs-Daten aus den erfindungsgemäßen Feldern verwendet. Die potentiell große Anzahl an in dieser Erfindung verwendeten Codes erfordert zusammen mit der Verwendung unterschiedlicher Intensitäten und "Farbtönen" von Fluorophoren in Mehrschrittdekodierungsverfahren eine gute Klassifizierung der Daten. Die Daten, insbesondere die Intensitätsdaten, werden in einem Mehrschrittverfahren erhalten, bei dem die Perlen reversibel markiert werden (beispielsweise durch Hybridisieren von farbstoffmarkierten komplementären Dekodierungs-Oligonucleotiden an die IBL-Sonden auf den Perlen oder durch die Bildung von Bindungsligandenpaaren für Nichtnucleinsäure-IBL-DBL-Paare), wobei in jeder Phase unterschiedliche Farben oder Farbengemische ("Farbtöne") eingesetzt werden. Die Herausforderung liegt darin, eine Perle hinsichtlich der Farbe, mit der sie bei den jeweiligen Schritten bemalt wurde, genau zu klassifizieren. Je näher die Markierungen miteinander verwandt sind (wie mittels optischem Abbildungssystem bestimmt), desto schwieriger wird die Klassifizierung.
Die Nähe der Farbstoffe, wie durch das Abbildungssystem dargestellt, wird durch die spektralen Eigenschaften der Dekodierungs-Farbstoffe und die spektrale Kanaltrennung des Abbildungssystems bestimmt. Eine bessere Farbtrennung wird durch Anwendung fluoreszierender Farbstoffe mit engem Emissionsspektrum erzielt und indem ein optisches System mit engem Bandpassanregungs- und -emissionsfilter angewandt wird, der so konstruiert ist, dass der Farbstoff "auf dem Peak" angeregt und dessen Emission "auf dem Peak" gemessen wird. Das Verfahren der optischen Ab bildung der Farbstoffe auf den Perlen gleicht dem menschlichen Sehprozess, worin das Gehirn Farbe durch Messung des Anregungsverhältnisses in den drei unterschiedlichen Zapfentypen im Auge erfasst. Bei einem optischen Abbildungssystem ist die Anzahl an praktischen Farbkanälen jedoch viel größer als die drei im menschlichen Auge vorliegenden. Abbildungssysteme auf CCD-Basis können Farbe in einem Bereich von 350 nm bis 850 nm "sehen", während die Zapfen im Auge auf das sichtbare Spektrum von 500 bis 600 nm eingestellt sind.
Das Problem beim Dekodieren von Perlen-Feldern ist im Wesentlichen ein Problem, das die Diskriminanzanalyseklassifizierung umfasst. Folglich wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Varianzanalyse in einem hyperspektralen Alpha-Raum auf einer bekannten Gruppe von Perlenfarben oder -farbtönen durchgeführt. Das Zentrum der Perlen-Cluster im Alpha-Raum werden als Zentren der Cluster bezeichnet, und die Streuung der Punkte innerhalb eines Clusters bestimmt die Cluster-Streuung. Ein robustes Klassifizierungsschema erfordert, dass die Distanz zwischen den Zentren der unterschiedlichen Perlenklassen (Farbtöne) viel größer als die Streuung einer beliebigen Cluster-Klasse ist. Zudem sollte die Position der Zentren von Faser zu Faser und von Versuch zu Versuch invariant bleiben.
Folglich wird in einer bevorzugten Ausführungsform die Farbton-"Zone" als ein Bereich im Alpha-Raum definiert, der das Farbtonzentrum umgibt und sich auf den Streuungsradius des Clusters ausweitet. Durch Angabe einer Referenzgruppe von Farbtonzentren und Streuungsradien, die empirisch bestimmt werden, kann die Klassifizierung einer neuen Datengruppe vorgenommen werden, indem die Fragestellung lautet, ob ein bestimmter Perlenpunkt am nächsten zur oder in die "Zone" eines Farbton-Clusters fällt. Dies wird erreicht, indem die Mahalanobis-Distanz des Perlenpunkts aus den Zentren der unterschiedlichen Farbtonklassen berechnet wird (in diesem Fall einfach eine euklidische Distanzmetrik). Für die in 3 angeführten Daten ist die Position der Zentren und deren Distanzen voneinander in Tabelle 2 angeführf.
Zur Klassifizierung der unterschiedlichen Perlen in eine bestimmte Farbtonklasse wurde ein euklidischer Distanz-Cut-Off von 0,3 gewählt. Die am nähesten beieinander liegenden Zentren, Bod-R6G und Bod-564 (Distanz = 0,55), weisen in ihren Dekodierungs-Zonen bei der Verwendung einer euklidischen Distanz oder einer Mahalanobis-Distanz von 0,3 eine leichte Überlappung auf. Eine Verbesserung der Klassifizierung kann erzielt werden, indem diese Distanz verringert wird und indem die unterschiedlichen Koordinatenachsen passend gewichtet werden.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung Computerverfahren zur Analyse und Klassifizierung von Perlenfarben bereit. Die Klassifizierung der Farbe einer Perle wird durchgeführt, indem die Perle in einem hyperspektralen "Alpha"-Raum (a₁ = I₁/Sl₁, a₂ = I₂/Sl_i, a₃= I₃/Sl_i etc.) geprüft wird, worin jede Koordinatenachse den Abschnitt der Perlenintensität innerhalb eines bestimmten Abbildungskanals darstellt. Wenn beispielsweise vier Abbildungskanäle zur Abbildung der Perlen verwendet werden, kann die Farbe oder der Farbton einer Perle mittels eines Punktes im dreidimensionalen Alpha-Raum dargestellt werden (die vierte Dimension ist nicht erforderlich, da Sa_i = 1). Wenn eine Gruppe unterschiedlicher Grundfarbstoffe vorliegt, mit denen die Perlen markiert werden, ist die Anzahl der aus diesen Farbstoffen erzielten Farbtöne uneingeschränkt, da die Farbstoffe in veränderlichen Verhältnissen und in veränderlichen kombinatorischen Strukturen kombiniert werden können. Die Anzahl der geeigneten Farbtöne wird experimentell mittels Trennung der unterschiedlichen Farbton-Cluster im hyperspektralen Alpha-Raum bestimmt.
3 umfasst eine graphische Darstellung des hyperspektralen Alpha-Raums von Perlen, die mit vier unterschiedlichen Farbtönen markiert sind, die in vier getrennten Abbildungskanälen abgebildet sind. Es wird angemerkt, dass die Perlen vier unterschiedliche Cluster bilden. Die Tatsache, dass diese vier Cluster gut getrennt sind, ermöglicht die Durchführung eines robusten Dekodierungsklassifikationsschemas.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Qualitätskontrolle-Analyse des Dekodierungsverfahrens vorgenommen. Dies wird erreicht, indem in jeder Dekodierungsphase eine Cluster-Analyse des Alpha-Raums durchgeführt wird. Die Anzahl der bestimmten Cluster wird durch die erwartete Anzahl an Farbtönen fixiert. Die Positionen der Cluster-Zentren wird überwacht und jegliche Abweichungen von der erwarteten Position aufgezeichnet.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zum Dekodieren von erfindungsgemäßen Feldern bereit. Zusätzlich zu den hierin angeführten Anordnungen umfasst die Vorrichtung eine zentrale Verarbeitungseinheit, die mit einem Speicher und einer Gruppe von Eingabe/Ausgabegeräten (z.B. Tastatur, Maus, Monitor, Drucker etc.) mittels Bus kommuniziert. Die allgemeine Wechselwirkung zwischen einer CPU, einem Speicher, Eingabe/Ausgabegeräten und einem Bus ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft das im Speicher gespeicherte hyperspektrale "Alpha"-Raum-Klassifizierungssystem.
Das Klassifizierungssystemprogramm umfasst ein Datenerwerbsmodul, das Daten aus dem optischen Leser oder dem Konfokalmikroskop (oder anderen Abbildungssystem) erhält. Im Allgemeinen umfasst das Klassifizierungsprogramm auch ein Analysemodul, das die Varianz im hyperspektralen Alpha-Raum analysieren, die Zentren der Cluster berechnen, die Streuung der Cluster (Abweichung) berechnen sowie die Farbtonzone und den Distanz-Cut-Off definieren kann. Im Allgemeinen bestimmt das Analysemodul durch Ermittlung der Mahalanobis-Distanz außerdem, ob ein Datenpunkt in die Farbtonzone fällt.
Zuletzt analysiert das Analysemodul die unterschiedliche sequentielle Dekodierungsinformation, um der Perlenposition schließlich ihren bioaktiven Wirkstoff zuzuordnen.
Auf diese Weise werden sequentielle Dekodierungsschritte durchgeführt, wobei in jedem Schritt Diskriminanzanalyseberechnungen verwendet werden, um den jeweiligen Perlen im Feld in jedem Schritt einen Farbton-Cluster zuzuordnen. Der Aufbau der sequentiellen Dekodierungsinformation ermöglicht eine Wechselbeziehung zwischen der Perlen-Position und der darin enthaltenen Chemie.
Bei Fertigstellung werden die Anordnungen der vorliegenden Erfindung in einer Reihe von Anwendungen eingesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Anordnungen verwendet, um eine Probenlösung auf Gegenwart oder Abwesenheit eines Zielanalyten zu untersuchen, einschließlich der Quantifizierung der an Zielanalyten vorliegenden Menge. Unter "Zielanalyt" oder "Analyt" oder grammatikalischen Entsprechungen davon werden beliebige Atome, Moleküle, Ionen, Molekülionen, Verbindungen oder Teilchen verstanden, die entweder detektiert oder für Bindungspartner bewertet werden. Fachleuten ist klar, dass in der vorliegenden Erfindung eine große Anzahl an Analyten verwendet werden kann; im Grunde kann jeder beliebige Zielanalyt verwendet werden, der einen bioaktiven Wirkstoff bindet oder für den ein Bindungspartner (z.B. Arzneimittelkandidat) gesucht wird.
Geeignete Analyten umfassen organische und anorganische Moleküle, einschließlich Biomoleküle. Bei erfolgter Detektion eines Zielanalyten umfassen geeignete Zielanalyten, jedoch nicht ausschließlich, einen Umweltschadstoff (einschließlich Pestizide, Toxine etc.); eine Chemikalie (einschließlich Lösungsmittel, Polymere, organische Materialien etc.); therapeutische Moleküle (einschließlich Therapeutika und Drogen, Antibiotika etc.); Biomoleküle (einschließlich Hormone, Cytokine, Proteine, Nucleinsäuren, Lipide, Kohlenhydrate, Zellmembranantigene und -rezeptoren (neurale und hormonale Rezeptoren sowie Nährstoff- und Zelloberflächenrezeptoren) oder deren Liganden etc.); ganze Zellen (einschließlich prokaryotische (wie z.B. pathogene Bakterien) und eukaryotische Zellen, einschließlich Säugetiertumorzellen); Viren (einschließlich Retroviren, Herpesviren, Adenoviren, Lentiviren etc.); und Sporen; etc. Insbesondere bevorzugte Analyten umfassen Nucleinsäuren und Proteine.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt ein Protein. Fachleuten ist klar, dass es eine große Anzahl an möglichen proteinhältigen Zielanalyten gibt, die unter Verwendung vorliegender Erfindung für Bindungspartner detektiert oder überprüft werden können. Geeignete Proteinzielanalyten umfassen, jedoch nicht ausschließlich, (1) Immunoglobine; (2) Enzyme (und andere Proteine); (3) Hormone und Cytokine (wovon viele als Liganden für zelluläre Rezeptoren dienen); und (4) andere Proteine.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt eine Nucleinsäure. Diese Tests kommen in einer Vielzahl von Anwendungen zum Einsatz.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Sonden zur genetischen Diagnose verwendet. Sonden können beispielsweise unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren erstellt werden, und zwar zur Detektion von Zielsequenzen, wie z.B. des Gens für nicht-polypösen Dickdarmkrebs, des BRCA1-Brustkrebsgens, P53, ein mit einer Vielzahl von Krebsen in Verbindung gebrachtes Gen, des Apo-E4-Gens, das auf ein größeres Risiko für eine Alzheimer-Erkrankung hinweist, wodurch ein einfaches präsymptomatisches Screening von Patienten ermöglicht wird, sowie zur Detektion von Mutationen im Gen für zystische Fibrose, in Zytochromen-P-450 oder anderen auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten.
In einer zusätzlichen Ausführungsform erfolgt die virale und bakterielle Detektion unter Verwendung der erfindungsgemäßen Komplexe. In dieser Ausführungsform sind die Sonden so konstruiert, dass sie Zielsequenzen aus einer Vielzahl von Bakterien und Viren detektieren. Beispielsweise stützen sich gegenwärtige Blut-Screening-Verfahren auf die Detektion von Anti-HIV-Antikörpern. Die hierin offenbarten Verfahren ermöglichen ein direktes Screening von klinischen Proben, um HIV-Nucleinsäuresequenzen zu detektieren, insbesondere hochkonservierte HIV-Sequenzen. Zudem ermöglicht dies eine direkte Überwachung des zirkulierenden Virus in Patienten als verbessertes Verfahren zur Beurteilung der Wirksamkeit von antiviralen Therapien. Ähnlich können mit Leukämie in Verbindung gebrachte Viren, HTLV-I und HTLV-II, auf diese Weise detektiert werden. Bakterielle Infektionen, wie z.B. Tuber kulose, Chlamydia und andere sexuell übertragene Krankheiten, können ebenfalls detektiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kommen die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren als Sonden für toxische Bakterien beim Screening von Wasser und Lebensmittelproben zum Einsatz. Beispielsweise können Proben zur Lyse von Bakterien behandelt werden, um deren Nucleinsäure freizusetzen, und Sonden können zur Erkennung von bakteriellen Strängen konstruiert sein, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, solcher pathogener Stränge, wie z.B. Salmonella, Campylobacter, Vibrio cholerae, Leishmania, enterotoxischer Stränge von E. coli, und Bakterien der Legionärskrankheit. Auf ähnliche Weise können Strategien der biologischen Sanierung unter Verwendung von Zusammensetzungen der Erfindung beurteilt werden.
In einer weiteren Ausführungsform werden die Sonden für forensische "DNA-Fingerabdrücke" verwendet, um die DNA am Tatort mit den von Opfern und Verdächtigen entnommenen Proben zu vergleichen.
In einer zusätzlichen Ausführungsform werden die Sonden in einem Feld zur Sequenzierung mittels Hybridisierung verwendet.
Die vorliegende Erfindung findet auch Anwendung als Methodik zur Detektion von Mutationen oder fehlenden Übereinstimmungen bei Zielnucleinsäuresequenzen. In jüngster Zeit lag der Forschungsschwerpunkt in der Analyse der Beziehung zwischen genetischer Variabilität und Phänotyp, indem polymorphe DNA-Markierungen eingesetzt wurden. Bei vorherigen Arbeiten wurden kurze tandemartige Wiederholungen (STR) als polymorphe Positionsmarkierungen verwendet. Der gegenwärtige Schwerpunkt liegt jedoch in der Verwendung von einfachen Nukleotid-Polymorphismen (SNP), die bei einer mittleren Häufigkeit von mehr als 1 pro Kilobase in der menschlichen genomischen DNA auftreten. Einige SNP, insbesondere jene in und um die Kodierungssequenzen, können wahrscheinlich der direkte Grund therapeutisch relevanter Phänotyp-Varianten sein. Es gibt eine Reihe allgemein bekannter Polymorphismen, die klinisch wichtige Phänotypen verursachen; beispielsweise werden die apoE2/3/4-Varianten mit verschiedenen relativen Risiken für Alzheimer-Erkrankungen und andere Erkrankungen (siehe Cordor et al., Science, 261 (1993)) in Verbindung gebracht. Multiplex-PCR-Amplifikationen von SNP-Loci mit anschließender Hybridisierung an Oligonucleotid-Felder erwiesen sich als genaue und verlässliche Verfahren zur gleichzeitigen Genotypisierung von zumindest Hunderten von SNP; siehe Wang et al., Science 280, 1077 (1998); siehe auch Schafer et al., Nature Biotechnology 16, 33–39 (1998). Die Anordnungen der vorliegenden Erfindung können leicht für die Felder nach dem Stand der Technik substituiert werden; insbesondere sind Einbasenverlängerungen (SBE) und Pyrosequenzierungsverfahren insbesondere in den Anordnungen der vorliegenden Erfindung nützlich.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Anordnungen zum Screening von bioaktiven Wirkstoffen verwendet, um einen Wirkstoff zu finden, der sich an ein Zielmolekül bindet und vorzugsweise die Funktion eines Zielmoleküls modifiziert. Wie oben angeführt und für Fachleute klar ist, kann eine Vielzahl verschiedener Testformate durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird der Zielanalyt markiert, für den ein Bindungspartner erwünscht wird. Das Binden des Zielanalyten mittels bioaktiven Wirkstoffs führt, gefolgt von einer Detektion, zu einem Recruitment der Markierung zur Perle.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Binden des bioaktiven Wirkstoffes und des Zielanalyten spezifisch. Das bedeutet, dass der Wirkstoff sich spezifisch an den Zielanalyten bindet. Unter "spezifisch Binden" wird hierin verstanden, dass der Wirkstoff den Analyten binden, und zwar mit einer Spezifizität, die ausreicht, um zwischen dem Analyten und anderen Komponenten oder Verunreinigern der Testprobe zu unterscheiden. Wie Fachleuten klar ist, ist es jedoch möglich, Analyten unter Verwendung eines Bindungsverfahrens zu detektieren, das nicht hochspezifisch ist; beispielsweise können die Systeme unterschiedliche Bindungsliganden verwenden, z.B. ein Feld mit unterschiedlichen Liganden, und die Detektion jedes bestimmten Analyten erfolgt mittels dessen "Signatur" zum Binden an ein Feld aus Bindungsliganden, ähnlich der Funktionsweise von "elektronischen Nasen". Dies eignet sich insbesondere zur Detektion von chemischen Analyten. Das Binden sollte ausreichen, um unter den Testbedingungen gebunden zu bleiben, einschließlich der Waschschritte, um nichtspezifische Bindungen zu entfernen, obgleich in einigen Ausführungsformen die Waschschritte nicht erwünscht sind, und zwar bei der Detektion von Bindungspartnern mit geringer Affinität. In einigen Ausführungsformen, beispielsweise bei der Detektion von bestimmten Biomolekülen, betragen die Dissoziationskonstanten des Analyten zum Bindungsliganden weniger als etwa 10^–4 bis 10^–6 M^–1, wobei weniger als 10^–5 bis 10^–9 M^–1 bevorzugt und weniger als 10^–7 bis 10^–9 M^–1 insbesondere bevorzugt wird.
Im Allgemeinen wird dem Feld eine Probe zugesetzt, die einen Zielanalyten enthält (entweder zur Detektion des Zielanalyten oder zum Screening für Bindungspartner des Zielanalyten), und zwar unter Bedingungen, die sich zum Binden eines Zielanalyten an zumindest einen der bioaktiven Wirkstoffe eignen, d.h. im Allgemeinen physiologische Bedingungen. Die Gegenwart oder Abwesenheit von Zielanalyten wird sodann detektiert. Fachleuten ist klar, dass dies auf eine Reihe unterschiedlicher Arten, im Allgemeinen jedoch mittels einer Veränderung des optischen Signals, erfolgen kann. Diese Veränderung kann mittels vieler verschiedener Mechanismen stattfinden. Einige Beispiele umfassen das Binden eines farbstoffmarkierten Analyten an eine Perle, die Herstellung einer Farbstoffspezies auf oder in der Nähe von Perlen, die Zerstörung einer vorliegenden Farbstoffspezies, eine Veränderung der optischen Signatur nach einer Analytenwechselwirkung mit dem Farbstoff auf der Perle oder andere optische Abtastverfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform findet die Veränderung des optischen Signals als Ergebnis des Bindens eines entweder direkt oder indirekt markierten Zielanalyten mit einer detektierbaren Markierung statt, die vorzugsweise eine optische Markierung, wie z.B. ein Fluorochrom, ist. Somit kann bei Verwendung eines proteinhältigen Zielanalyten dieser beispielsweise entweder direkt mit einem Fluophor oder indirekt, z.B. durch die Verwendung eines markierten Antikörpers, markiert werden. Ähnlich werden Nucleinsäuren einfach mittels Fluorochromen markiert, beispielsweise, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, während der PCR-Amplifikation. Alternativ dazu kann nach dem Binden der Zielsequenzen ein Hybridisierungsindikator als Markierung verwendet werden. Hybridisierungsindikatoren binden sich vorzugsweise an doppelsträngige Nucleinsäuren, üblicherweise reversibel. Hybridisierungsindikatoren umfassen Interkalatoren und kleine Furche und/oder große Furche bindende Gruppierungen. In einer bevorzugten Ausführungsform können Interkalatoren verwendet werden. Da Interkalationen nur in Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuren stattfinden, leuchtet die Markierung in Gegenwart einer Zielhybridisierung auf. Nach dem Binden des Zielanalyten an einen bioaktiven Wirkstoff wird an dieser Stelle ein neues optisches Signal erzeugt, das dann detektiert werden kann.
Alternativ dazu bilden, wie oben erläutert, Zielanalyten wie z.B. Enzyme eine Spezies, die entweder direkt oder indirekt optisch detektierbar ist.
Zudem kann eine Veränderung der optischen Signatur in einigen Ausführungsform die Basis des optischen Signals darstellen. Beispielsweise kann die Wechselwirkung einiger chemischer Zielanalyten mit einigen fluoreszierenden Farbstoffen auf den Perlen das optische Signal verändern, wodurch ein unterschiedliches optische Signal erzeugt wird.
Fachleuten ist klar, dass die Gegenwart oder Abwesenheit von Zielanalyten in einigen Ausführungsformen durch Veränderungen anderer optischer oder nichtoptischer Signale erzielt werden kann, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, oberflächenverbesserter Raman-Spektroskopie, Oberflächen-Plasmonresonanz, Radioaktivität etc.
Die Tests können, wie Fachleuten klar ist, unter einer Reihe unterschiedlicher Versuchsbedingungen durchgeführt werden. Eine Vielzahl anderer Reagenzien kann in den Screeningtests enthalten sein. Diese umfassen Reagenzien wie Salz, neutrale Proteine, z.B. Albumin, Detergenzien etc., die verwendet werden können, um die optimale Protein-Protein-Bindung zu erleichtern und/oder nichtspezifische Wechselwirkungen oder Hintergrundwechselwirkungen zu reduzieren. Es können auch Reagenzien verwendet werden, die herkömmlich die Effizienz von Tests verbessern, wie z.B. Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren, antimikrobielle Mittel etc. Das Komponen tengemisch kann in einer beliebigen Reihenfolge zugesetzt werden, die das erforderliche Binden ermöglicht. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, können verschiedene Blockierungs- und Waschschritte angewandt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden kompetitive Zweifarben-Hybridisierungstests durchgeführt. Diese Tests können auf herkömmlichen Sandwich-Tests basieren. Die Perlen enthalten eine Einfangsequenz, die sich auf einer Seite (stromauf oder stromab) des SNP befindet, um die Zielsequenz einzufangen. Es werden zwei Allel-spezifische SNP-Sonden, die jeweils mit einem unterschiedlichen Fluorophor markiert sind, an die Zielsequenz hybridisiert. Der Genotyp kann aus dem Verhältnis der zwei Signale erhalten werden, wobei die korrekte Sequenz im Allgemeinen bessere Bindung aufweist. Dies hat den Vorteil, dass die Zielsequenz an sich nicht markiert werden muss. Zudem bedeutet dies, da die Sonden konkurrieren, dass die Bindungsbedingungen nicht optimiert werden müssen. Unter Bedingungen, bei denen eine fehlgepaarte Sonde stabil gebunden werden würde, könnte diese dennoch von einer gepaarten Sonde ersetzt werden. Deshalb kann ein kompetitiver Test unter diesen Bedingungen bessere Diskriminierungen bereitstellen. Da viele Tests parallel durchgeführt werden, können die Bedingungen nicht für jede Sonde gleichzeitig optimiert werden. Deshalb kann ein kompetitives Testsystem verwendet werden, um nichtoptimale Bedingungen bei Fehlpaarung-Unterscheidung auszugleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter Verwendung der erfindungsgemäßen Anordnungen eine Didesoxynucleotid-Kettenabbruchssequenzierung durchgeführt. In dieser Ausführungsform wird eine DNA-Polymerase zur Verlängerung eines Primers unter Einsatz von fluoreszierend markierten ddNTP verwendet. Das 3'-Ende des Primers befindet sich neben der SNP-Stelle. Auf diese Weise ist die Einbasenverlängerung komplementär zur Sequenz an der SNP-Stelle. Indem vier unterschiedliche Fluorophore, pro Base ein Fluorophor, verwendet werden, kann die SNP-Sequenz durch Vergleich der vier basenspezifischen Signale ermittelt werden. Dies kann auf mehrere Arten erfolgen. In einer ersten Ausführungsform kann die Einfangsonde verlängert werden. Bei dieser Herangehensweise muss die Sonde entweder 5' bis 3' an der Perle synthetisiert oder an das 5'-Ende gebunden werden, um eine freies 3'-Ende zur Polymerasen-Verlängerung bereitzustellen. Alternativ dazu kann ein Test vom Sandwich-Typ angewandt werden. In dieser Ausführungsform wird das Ziel auf der Perle mittels Sonde eingefangen, wonach ein Primer-Annealing und eine Primer-Verlängerung stattfinden. Wiederum muss die Zielsequenz in letzterem Fall nicht markiert sein. Da Sandwich-Tests zwei spezifische Wechselwirkungen erfordern, wird zudem erhöhte Stringenz bereitgestellt, was sich insbesondere zur Analyse der komplexen Proben eignet.
Darüber hinaus ist es möglich, wenn sowohl der Zielanalyt als auch der DBL an den Wirkstoff binden, eine Detektion von nichtmarkierten Zielanalyten mittels Dekodierungskonkurrenz durchzuführen.
In einer bevorzugten Ausführungsform eignen sich die erfindungsgemäßen Verfahren zur Qualitätskontrolle der Felder. Vor dieser Erfindung sind keine Verfahren beschrieben worden, die einen positiven Test der Leistung der einzelnen Sonden auf den jeweiligen Feldern bereitstellen. Das Dekodieren der Felder stellt nicht nur diesen Test bereit, sondern tut dies unter Verwendung der Daten, die während des Dekodierens selbst erhalten wurden. Deshalb ist keine zusätzliche Versuchsarbeit erforderlich. Die Erfindung benötigt nur eine Gruppe von Datenanalysealgorithmen, die Software-kodierbar sind.
Im Qualitätskontroll-Verfahren können eine Reihe unterschiedlicher systematischer und zufälliger Probleme in einem Feld identifiziert werden. Beispielsweise können zufällige Staubkörner oder andere Verunreiniger bei einigen Sensoren dazu führen, dass diese ein falsches Signal abgeben – dies kann während des Dekodierens detektiert werden. Das Weglassen eines oder mehrerer Wirkstoffe in mehreren Feldern kann ebenfalls detektiert werden. Ein Vorteil dieses Qualitätskontroll-Verfahrens liegt darin, dass dieses unmittelbar vor dem Test selbst durchgeführt werden kann und einen zuverlässigen funktionellen Test für jeden einzelnen Sensor darstellt. Deshalb kann jedes Problem, das zwischen der Feldzusammenstellung und der eigentlichen Verwendung auftreten kann, detektiert werden. Bei Anwendungen, worin sehr hohe Vertrauenswerte erforderlich sind und/oder bei denen während des Versuchverlaufs die signifikante Möglichkeit eines Sondendefekts besteht, kann das Dekodieren und die Qualitätskontrolle sowohl vor als auch nach der eigentlichen Probenanalyse durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Felder dazu verwendet werden, Reagenzienqualitätskontrollen durchzuführen. In vielen Fällen werden biologische Makromoleküle als Reagenzien verwendet und müssen einer Qualitätskontrolle unterzogen werden. Beispielsweise können große Gruppen von Oliognucleotid-Sonden als Reagenzien bereitgestellt sein. Es ist üblicherweise schwierig, bei einer großen Anzahl von unterschiedlichen biologischen Makromolekülen eine Qualitätskontrolle durchzuführen. Die hierin beschriebene Herangehensweise kann dazu verwendet werden, dies zu tun, indem die Reagenzien (als DBL formuliert) statt der Felder als Variable eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die hierin dargelegten Verfahren zur Feldkalibration verwendet. Bei vielen Anwendungen, z.B. bei einer mRNA-Quantifizierung, ist es erwünscht, über ein Signal zu verfügen, das eine lineare Antwort auf die Konzentration des Zielanalyten darstellt, oder alternativ dazu die Beziehung zwischen Konzentration und Signal bei Nichtlinearität zu bestimmen, sodass die Konzentration des Zielanalyten geschätzt werden kann. Folglich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur parallelen Schaffung von Kalibrierungskurven für mehrere Perlen in einem Feld bereit. Die Kalibrierungskurven können unter Bedingungen geschaffen werden, die die Komplexität der zu analysierenden Probe simulieren. Jede Kurve kann unabhängig von den anderen konstruiert werden (z.B. für einen unterschiedlichen Konzentrationsbereich), jedoch gleichzeitig wie alle anderen Kurven für das Feld. Somit wird das sequentielle Dekodierungsschema in dieser Ausführungsform mit unterschiedlichen Konzentrationen, die als Code-"Markierungen" dienen, durchgeführt, statt unterschiedliche Fluorophore zu verwenden. Auf diese Weise kann ein Signal als Antwort auf eine Konzentration für jede der Perlen gemessen werden. Diese Kalibrierung kann unmittelbar vor der Verwendung des Feldes durchgeführt werden, sodass jede Sonde auf jedem Feld je nach Bedarf einzeln kalibriert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verfahren auch zur Feldentwicklung herangezogen werden. Somit ermöglichen die Verfahren beispielsweise die Identifizierung von guten und schlechten Sonden. Wie Fachleuten klar ist, funktionieren manche Sonden nicht gut, weil sie nicht gut hybridisieren oder weil diese mit mehr als einer Sequenz kreuzhybridisieren. Diese Probleme können während des Dekodierens leicht detektiert werden. Die Fähigkeit, Sondenleistungen rasch zu erfassen, hat das Potenzial, Zeit und Kosten der Testentwicklung stark zu reduzieren.
Ähnlich eignen sich die erfindungsgemäßen Verfahren in einer bevorzugten Ausführungsform zur Quantifizierung der Testentwicklung. Eine große Herausforderung vieler Tests stellt die Fähigkeit dar, Unterschiede in Analytenkonzentrationen zwischen den Proben zu detektieren, die Fähigkeit, diese Unterschiede zu quantifizieren und absolute Konzentrationen von Analyten zu messen, und zwar in Gegenwart eines komplexen Gemischs von verwandten Analyten. Ein Beispiel dieses Problems umfasst die Quantifizierung einer spezifischen mRNA in Gegenwart der gesamten zellulären mRNA. Eine Herangehensweise, die als Basis zur mRNA-Quantifizierung entwickelt worden ist, wendet mehrfache Paarungs- und Fehlpaarungssondenpaare an (Lockhart et al., 1996), hierin vollständig als Verweis aufgenommen. Während diese Herangehensweise einfach ist, wird dabei eine relativ große Anzahl von Sonden benötigt. In dieser Herangehensweise wird eine quantitative Antwort auf die Konzentration erhalten, indem die Signale aus einer Gruppe unterschiedlicher Sonden auf das Gen oder die Sequenz von Interesse gemittelt werden. Dies ist erforderlich, weil nur einige Sonden quantitativ antworten, und es ist nicht möglich, diese Sonden mit Bestimmtheit vorauszusagen. Ohne vorherige Kenntnis wird nur die mittlere Antwort einer geeignet ausgewählten Gruppe von Sonden als quantitativ erachtet. Dies kann in der vorliegenden Erfindung jedoch im Allgemeinen auf Nucleinsäure-basierte Tests sowie auf andere Tests angewandt werden. Im Grunde dient diese Herangehensweise dazu, die Sonden, welche in einem bestimmten Test quantitativ antworten, zu identifizieren, statt diese mit anderen Sonden zu mitteln. Dies wird unter Verwendung des oben erläuterten Kalibrierungsschemas durchgeführt, worin konzentrationsbasierte Codes eingesetzt werden. Vorteile dieser Herangehensweise umfassen: weniger benötigte Sonden; die Genauigkeit der Messung hängt weniger von der Anzahl verwendeter Sonden ab; und die Antwort der Sensoren ist mit ziemlicher Sicherheit bekannt, da jede einzelne Sequenz auf effiziente Art und Weise getestet werden kann. Es ist zu beachten, dass leistungsstarke Sonden empirisch ausgewählt werden, womit Schwierigkeiten und Unsicherheiten hinsichtlich Vorhersage der Sondenleistung verhindert werden können, insbesondere bei komplexen Sequenzgemischen. Im Gegensatz dazu wird in bisher beschriebenen Versuchen mit geordneten Feldern eine relativ geringe Anzahl von Sequenzen mittels Durchführung quantitativer Spiking-Experimente überprüft, worin eine bekannte mRNA zu einem Gemisch zugesetzt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden cDNA-Felder zum Profiling für RNA-Expressionen erstellt. In dieser Ausführungsform werden einzelne cDNA-Klone aus cDNA-Bibliotheken amplifiziert (beispielsweise mittels PCR), die in einem Wirts-Vektor-System vermehrt werden. Jede amplifizierte DNA wird an eine Perlen-Population gebunden. Unterschiedliche Populationen werden miteinander vermischt, um eine Perlenkollektion zu bilden, die die cDNA-Bibliothek darstellt. Die Perlen werden angeordnet, wie oben erläutert dekodiert und in einem Test eingesetzt (wobei das Dekodieren, wie hierin dargelegt, auch nach dem Test stattfinden kann). Der Test wird unter Verwendung von RNA-Proben durchgeführt (Ganzzellen oder mRNA), die extrahiert, bei Bedarf markiert und an das Feld hybridisiert werden. Die vergleichende Analyse ermöglicht die Detektion von Unterschieden in den Expressionswerten einzelner RNA. Der Vergleich mit einer geeigneten Gruppe von Kalibrierungsstandards ermöglicht die Quantifizierung absoluter RNA-Mengen.
Das cDNA-Feld kann auch zur Kartierung verwendet werden, um beispielsweise Deletionen bzw. Insertionen oder Kopienzahlveränderungen im Genom zu kartieren, z.B. aus Tumoren oder anderen Gewebeproben. Dies kann mittels Hybridisierung genomischer DNA erfolgen. Statt cDNA (oder EST etc.) können auch andere STS (sequenzmarkierte Stellen), einschließlich zufälliger genomischer Fragmente, für diesen Zweck angeordnet werden.
Die nachstehenden Beispiele dienen zur ausführlicheren Beschreibung der Verwendungsweise oben beschriebener Erfindung sowie zur Darlegung der besten Art der Durchführung der verschiedenen erfindungsgemäßen Aspekte. Es versteht sich, dass diese Beispiele den wahren Umfang der vorliegenden Erfindung in keinster Weise einschränken, sondern für darstellerische Zwecke angeführt werden. Alle hierin zitierten Verweise sind hierin vollständig durch Verweise aufgenommen.
Beispiele
Beispiel 1
Es wurden sechzehn Mikrokügelchen (Perlen) kombinatorisch mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren (FAM und Cy3) markiert. In einem ersten Markierungsdurchgang wurden entweder FAM- oder Cy3-markierte Oligonucleotide, die auf dem Mikrokügelchen komplementär zum Oligonucleotid (IBL) waren, mit dem Mikrokügelchen hybridisiert. Das Markieren der Oligonucleotide wurde wie auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt durchgeführt. Die Hybridisierungsbedingungen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Nach einem ersten Hybridisierungsdurchgang wurden die zwei Mikrokügelchen-Pools in jeweils zwei Pools unterteilt und jeweils mit entweder FAM- oder Cy3-markierten Oligonucleotiden markiert. Dieses Verfahren wurde zwei zusätzliche Male wiederholt. Somit wurde jedes der Mikrokügelchen nach vier aufeinander folgenden Markierungsdurchgängen mit einem einmaligen Code markiert (siehe 1). Die Identität der einzelnen Mikrokügelchen wurde durch Bestimmung der Identität der einzelnen Fluorophore der Reihe nach aufgeklärt. Das Endfluorophor wurde bestimmt und anschließend entfernt, um die Identifizierung des nächsten Fluorophors zu ermöglichen. Auf diese Weise wurde in nur vier Dekodierungsschritten die Identität von sechzehn Mikrokügelchen bestimmt.
Beispiel 2
Zum Vierfarbendekodieren wurde ein dem in Beispiel 1 beschriebenen ähnliches Dekodierungsschema durchgeführt. In diesem Beispiel wurden die Perlen wie in Beispiel 1 beschrieben markiert, mit der Ausnahme, dass bei jedem Schritt vier Markierungen verwendet wurden. Es wurden 4.013 Perlen unter Verwendung von Bod-493-, Bod-R6G-, Bod-564- und Bod-TXR-markierten Oligonucleotiden markiert. Basierend auf der aufeinander folgenden Dekodierung der vier Farben wurden 128 unterschiedliche Perlentypen identifiziert.
Beispiel 3
Ein alternatives Verfahren zur Verwendung mehrfacher Farben umfasst die Verwendung ratiometrischer Intensitäten als Kodierungsschema. Ein Normierungsbild wurde erhalten, worin jede der Perlen ihre "vollständige" Intensität aufweist. Darauf folgende Dekodierungsschritte erzeugen Intensitätscodes durch Hybridisierung von Gemischen aus "markierten":"nichtmarkierten" komplementären Oligonucleotiden. Beispielsweise sind in 1 drei unterschiedliche Intensitätsabstufungen (gering, mittel, hoch) dargestellt, deren Verhältnis so auf eine Stufe eingestellt werden kann, bei der alle Komplementen in "hohen" Abstufungswerten vorliegen. In 3 wird ein Versuch dargestellt, bei dem eine Grauwertskala-Dekodierung auf sechzehn unterschiedlichen Perlentypen verwendet wurde.
3A zeigt das kombinatorische Pooling-Schema zum Markieren von Perlen mit unterschiedlichen Verhältnissen von markierten Oligonucleotiden. Ein bestimmtes Oligo liegt entweder in einem Anteil von 100 % Cy3-markiert, 40 % Cy3-markiert (60 unmarkiert) oder 10 % Cy3-markiert (90 % unmarkiert) vor. Dekodierungsoligos wurden 2 Minuten lang bei einer Konzentration von 50 nM an ein Feld hybridisiert. Anschließend wurden zwei voneinander unabhängige Normierungsbilder (alle Oligokomplemente liegen als 100 % Cy3-markierte Spezies vor) erhalten und die resultierenden Perlenintensitäten verglichen. Dies ist in 3B dargestellt, worin die normierten Werte gegeneinander geplottet sind. Schließlich werden zur Identifizierung oder Dekodierung der Perlen die Alphawerte (Verhältnis zwischen Perlenintensität in angeführtem Dekodierungsschritt und Intensität im Normierungsbild) für drei in (A) beschriebene Dekodierungsschritte geplottet. In Schritt 1 werden nur zwei Peaks im Alphawert-Histogramm beobachtet, da nur sechzehn Perlentypen im Feld vorliegen. Im zweiten und dritten Dekodierungsschritt werden drei unterscheidbare Peaks beobachtet, was auf die Durchführbarkeit der Grauwertskala-Dekodierung schließen lässt.
Physikalische Merkmale und unterschiedliche "Grade" von Merkmalen können als Codes verwendet werden, wodurch die Perlentypen voneinander unterschieden werden können. Sofern ein Merkmal als robuster Code gelten soll, sollte es möglich sein, einer Perle unterschiedliche "Grade" eines bestimmten Merkmals zu verleihen. Jeder der "Grade" eines Merkmals sollte quantitativ gut von anderen "Graden" getrennt sein. Ein wichtiger Punkt ist, den dynamischen Bereich der Merkmalsmessung zu maximieren und die Streuung der Messung zu minimieren.

Claims

Feldverbund-Anordnung, umfassend: a) ein Substrat mit einer Oberfläche, die eine Vielzahl von Testpositionen umfasst, welche so angeordnet sind, dass sie eine parallele Verarbeitung mehrerer Proben ermöglichen, wobei jede Testposition eine Feldposition umfasst, die eine Vielzahl von diskreten Stellen umfasst; und b) eine Mikrokügelchen-Population, die zumindest eine erste und eine zweite Unterpopulation umfasst, worin die erste Unterpopulation einen ersten Wirkstoff und die zweite Unterpopulation einen zweiten Wirkstoff umfasst; worin jede der diskreten Stellen in den Feldpositionen nur ein einziges Mikrokügelchen enthält.
Anordnung nach Anspruch 1, worin jede der Testpositionen eine Sammlung von Wirkstoffen umfasst.
Anordnung nach Anspruch 1, worin das Substrat eine Mikrotiterplatte und jede Testposition ein Mikrotiter-Well ist.
Anordnung nach Anspruch 1, worin jede diskrete Stelle ein Perlen-Well ist.
Anordnung nach Anspruch 1, worin jede der Unterpopulationen weiters eine optische Signatur umfasst, die den Wirkstoff identifizieren kann.
Anordnung nach Anspruch 1, worin jede der Unterpopulationen weiters einen Identifikator-Bindungsliganden umfassen, der einen Dekodierer-Bindungsliganden so bindet, dass die Identifikation des Wirkstoffs aufgeklärt werden kann.
Feldverbund-Anordnung, umfassend: a) ein erstes Substrat mit einer Oberfläche, die eine Vielzahl von Testpositionen umfasst, welche so angeordnet sind, dass sie eine parallele Verarbeitung mehrerer Proben ermöglichen; b) ein zweites Substrat, das eine Vielzahl von Feldpositionen umfasst, wobei jede Feldposition eine Vielzahl von diskreten Stellen umfasst; und c) eine Mikrokügelchen-Population, die zumindest eine erste und eine zweite Unterpopulation umfasst, worin die erste Unterpopulation einen ersten Wirkstoff und die zweite Unterpopulation einen zweiten Wirkstoff umfasst; worin jede der diskreten Stellen der Feldpositionen nur ein einziges Mikrokügelchen enthält und worin die Feldpositionen in entsprechende Testpositionen eingepasst sind.
Anordnung nach Anspruch 7, worin das erste Substrat eine Mikrotiterplatte ist.
Anordnung nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin das zweite Substrat eine Vielzahl von optischen Faserbündeln umfasst, die eine Vielzahl von einzelnen Fasern umfassen, wobei jedes Bündel eine Feldposition und jede einzelne Faser einen Perlen-Well umfasst.
Anordnung nach Anspruch 7, worin alle Unterpopulationen zudem eine optische Signatur umfassen, die den Wirkstoff identifizieren kann.
Anordnung nach Anspruch 7, worin alle Unterpopulationen zudem einen Identifikator-Bindungsliganden umfassen, der einen Dekodierer-Bindungsliganden so bindet, dass die Identifikation des Wirkstoffs aufgeklärt werden kann.
Verfahren zum Dekodieren einer Feldanordnung, umfassend: a) das Bereitstellen einer Feldanordnung, umfassend: i) ein Substrat mit einer Oberfläche, die eine Vielzahl von Testpositionen umfasst, welche so angeordnet sind, dass sie eine parallele Verarbeitung meh rerer Proben ermöglichen, wobei jede Testposition eine Feldposition umfasst, die eine Vielzahl von diskreten Stellen umfasst; und ii) eine Mikrokügelchen-Population, die zumindest eine erste und eine zweite Unterpopulation umfasst, worin die erste Unterpopulation einen ersten Wirkstoff und die zweite Unterpopulation einen zweiten Wirkstoff umfasst; worin jede der diskreten Stellen der Feldpositionen nur ein einziges Mikrokügelchen enthält; b) das Zusetzen einer Vielzahl von dekodierenden Bindungsliganden zur Feldanordnung, um die Position von zumindest einer Vielzahl der Wirkstoffe zu identifizieren.
Verfahren zum Dekodieren einer Feldanordnung, umfassend: a) das Bereitstellen einer Feldanordnung, umfassend: i) ein erstes Substrat mit einer Oberfläche, die eine Vielzahl von Feldpositionen umfasst, wobei jede Feldposition eine Vielzahl von diskreten Stellen umfasst; ii) ein zweites Substrat mit einer Oberfläche, die eine Vielzahl von Testpositionen umfasst, welche so angeordnet sind, dass sie eine parallele Verarbeitung mehrerer Proben ermöglichen, worin die Feldpositionen in die Testpositionen eingepasst werden können; und iii) eine Mikrokügelchen-Population, die zumindest eine erste und eine zweite Unterpopulation umfasst, worin die erste Unterpopulation einen ersten Wirkstoff und die zweite Unterpopulation einen zweiten Wirkstoff umfasst; worin jede der diskreten Stellen der Feldpositionen nur ein einziges Mikrokügelchen enthält; b) das Zusetzen einer Vielzahl von dekodierenden Bindungsliganden zur Feldanordnung, um die Position von zumindest einer Vielzahl von Wirkstoffen zu identifizieren.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin zumindest eine Unterpopulation von Mikrokügelchen einen Identifikator-Bindungsliganden umfasst, an den sich ein dekodierender Bindungsligand binden kann.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin sich die dekodierenden Bindungsliganden an die Wirkstoffe binden.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin die dekodierenden Bindungsliganden markiert sind.
Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin die Position jeder Unterpopulation bestimmt wird.
Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines oder mehrerer Zielanalyten in einer oder mehreren Proben, umfassend: a) das Kontaktieren einer oder mehrerer Proben mit einer Anordnung, die Folgendes umfasst: i) ein Substrat mit einer Oberfläche, die eine Vielzahl von Testpositionen umfasst, welche so angeordnet sind, dass sie eine parallele Verarbeitung mehrerer Proben ermöglichen, wobei jede Testposition eine Feldposition umfasst, die eine Vielzahl von diskreten Stellen umfasst; und ii) eine Mikrokügelchen-Population, die zumindest eine erste und eine zweite Unterpopulation umfasst, worin die erste Unterpopulation einen ersten Wirkstoff und die zweite Unterpopulation einen zweiten Wirkstoff umfasst; worin jede der diskreten Stellen der Feldpositionen nur ein einziges Mikrokügelchen enthält; und b) das Nachweisen der Gegenwart oder der Abwesenheit des Zielanalyten.
Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines oder mehrerer Zielanalyten in einer oder mehreren Proben, umfassend: a) das Zusetzen einer oder mehrerer Proben zu einem ersten Substrat, das eine Vielzahl von Testpositionen umfasst, welche so angeordnet sind, dass sie eine parallele Verarbeitung mehrerer Proben ermöglichen, so dass die eine oder mehreren Probe(n) in einer Vielzahl von Testpositionen enthalten ist/sind; b) das Kontaktieren der einen oder mehreren Probe(n) mit einem zweiten Substrat, das Folgendes umfasst: i) eine Vielzahl von Feldpositionen, wobei jede Feldposition eine Vielzahl von diskreten Stellen umfasst, worin zumindest eine Testposition in Flüssigkontakt mit zumindest einer Feldposition steht; und ii) eine Mikrokügelchen-Population, die zumindest eine erste und eine zweite Unterpopulation umfasst, worin die erste Unterpopulation einen ersten Wirkstoff und die zweite Unterpopulation einen zweiten Wirkstoff umfasst; worin jede der diskreten Stellen der Feldpositionen nur ein einziges Mikrokügelchen enthält; und c) das Nachweisen der Gegenwart oder der Abwesenheit des Zielanalyten.
Verfahren nach Anspruch 18, worin jede der Testpositionen eine Sammlung von Wirkstoffen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, worin das Substrat eine Mikrotiterplatte und jede Testposition ein Mikrotiter-Well ist.
Verfahren nach Anspruch 18, worin jede diskrete Stelle ein Perlen-Well ist.
Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin zumindest eine Unterpopulation von Mikrokügelchen weiters eine optische Signatur umfasst, die den Wirkstoff identifizieren kann.
Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin zumindest die erste und zweite Unterpopulation zudem einen Identifikator-Bindungsliganden umfassen, der einen Dekoder-Bindungsliganden bindet.
Verfahren nach Anspruch 19, worin das erste Substrat eine Mikrotiterplatte ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, worin das zweite Substrat eine Vielzahl von optischen Faserbündeln umfasst, die eine Vielzahl von einzelnen Fasern umfassen, wobei jedes Bündel eine Feldposition und jede einzelne Faser einen Perlen-Well umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin zumindest einer der Zielanalyten eine Nucleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin die Mikrokügelchen auf der Oberfläche statistisch verteilt sind.
Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin zumindest eine Unterpopulation von Mikrokügelchen einen Wirkstoff umfasst, der Nucleinsäuren umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin zumindest eine Unterpopulation von Mikrokügelchen einen Wirkstoff umfasst, der ein Protein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, worin zumindest eine erste und eine zweite der Testpositionen die gleiche Sammlung von Wirkstoffen umfassen.
Verfahren nach Anspruch 20, worin zumindest eine erste und eine zweite der Testpositionen unterschiedliche Sammlungen von Wirkstoffen umfassen.