DE69926230T2

DE69926230T2 - Optische sensorvorrichtung mit evaneszenter felddetektion

Info

Publication number: DE69926230T2
Application number: DE69926230T
Authority: DE
Inventors: Emilio Alfredo BRUNO-RAIMONDI; Reinhard VÖLKEL; Ludwig Gert DUVENECK; Stefan Carlo EFFENHAUSER; Hans-Peter Herzig; Rene DÄNDLIKER
Original assignee: Zeptosens AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1998-05-14
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2019-05-13
Also published as: EP1078248B1; WO1999058963A1; EP1078248A1; ATE300042T1; US6437345B1; DE69926230D1; AU4143099A; GB9810350D0

Description

Diese Erfindung betrifft eine optische Abtasteinheit; insbesondere betrifft sie eine chemische und biochemische optische Abtasteinheit auf Lumineszenzbasis und deren Verwendungen.
Bei der humanmedizinischen Diagnose hat ein zunehmender Bedarf für den Nachweis von äußerst niedrigen Konzentrationen von biochemisch relevanten Molekülen in kleinen Probenvolumina Forschungsanstrengungen in Richtung empfindlicherer und selektiverer Sensoren ausgelöst. Optische Sensoren sind aufgrund ihrer chemischen Stabilität und leichten Herstellung favorisiert. Bioaffinitätssensoren, die auf Lumineszenzanregungsschemata basieren, kombinieren die (bio)chemische Selektivität aufgrund der Anwendung von Erkennungselementen, die die Analytenmoleküle spezifisch binden, mit räumlicher Selektivität, die von evanescenten Feldabtastverfahren stammt. Den verschiedenen evanescenten Feldanregungsverfahren, die entwickelt wurden, gemeinsam ist, dass die Wechselwirkung mit den Analytenmolekülen auf die Eindringtiefe des evanescenten Feldes eingeschränkt ist, wodurch folglich die Vorgänge betont werden, die an der Abtastoberfläche oder innerhalb der Abtastschicht stattfinden, und die Vorgänge im Mediumvolumen benachteiligt werden.
Die Kombination von faserförmigen evanescenten Feldsensoren mit Bioaffinitätsassays unter Verwendung von fluoreszenten Tracersonden zur Signalerzeugung hat Fähigkeit bewiesen und wird umfangreich verwendet. Eine Nachweisgrenze von 7,5 × 10^–14 M von mit Fluorescein markierter komplementärer DNA in einem DNA-Hybridisierungsassay unter Verwendung von Mehrmodenfasern wurde berichtet. Andererseits wurden in den letzten Jahren evanescente Feldsensoren mit Planaren Wandlergeometrien für den Nachweis von Biomolekülen unter Verwendung des Prinzips von effektiven Brechungsindexänderungen angepasst, wie Oberflächenplasmonresonanz, Gitterkoppler und Interferometer. Sie stehen mit dem attraktiven Merkmal direkter Abtastung ohne die Notwendigkeit für die Verwendung irgendwelcher Marker in Zusammenhang. Die Signale dieser Vorrichtungen stehen jedoch direkt mit der adsorbierten Molekülmasse in Zusammenhang, die die Empfindlichkeit dieser Konfigurationen begrenzt. Im Allgemeinen liegen nachgewiesene Konzentrationen kaum im Bereich von unterhalb 10^–10 M.
Um das Ziel von äußerst niedrigen Nachweisgrenzen, die für die Gensondenanalyse sowie die Diagnose von Krankheiten und Infektionen erforderlich sind, zu erreichen, wurde vorgeschlagen, Einmoden-Metalloxid-Wellenleiter als Wandler für Bioaffinitätssensoren auf Lumineszenzbasis zu verwenden. Diese Wandlergeometrie bietet Vorteile aufgrund der leichten Herstellung von Planaren Chips, der Sensorhandhabung, der erhöhten Anregungseffizienz der Lumineszenzmarker und der Fluidhandhabung von winzigen Probenvolumina. Die Merkmale eines Planaren evanescenten Feldwandlers für ein Lumineszenznachweisschema und die Konstruktion eines Sensorsystems auf der Basis solcher Wellenleiter sind in einem Dokument von D. Neuschäfer et al. mit dem Titel "Planar waveguides as efficient transducers for bioaffinity sensors", Proc. SPIE, Band 2836 (1996), beschrieben. Der beschriebene Sensor verwendet einen Planaren Einmoden-Wellenleiter, der aus einem Tantalpentoxid-Wellenleitungsfilm besteht, der auf einem Glassubstrat abgeschieden ist. Zum Lumineszenznachweis wird im All-gemeinen eine "Volumennachweis"-Konfiguration, die in 1 gezeigt ist, verwendet. In diesem Fall wird der untere Halbkugelteil des Lumineszenzlichts, das durch das evanescente Feld angeregt und dann isotrop emittiert wird, unter dem Sensorchip unter Verwendung einer Linse oder eines Linsensystems mit hoher numerischer Apertur gesammelt. Zwei identische Interferenzfilter werden zur Unterscheidung von Anregungslicht verwendet. Die Signalerfassung wird unter Verwendung von entweder Photodioden in Kombination mit Verstärkern mit hoher Verstärkung oder eines ausgewählten Photovervielfachers in Kombination mit einer Photonenzähleinheit durchgeführt. Als Alternative kann der Teil des Lumineszenzsignals, der in den Wellenleitungsfilm zurückgekoppelt wird, unter Verwendung eines zweiten, auskoppelnden Gitters (nicht dargestellt) gesammelt werden. Dies ist als "Gitternachweis" bekannt. Der Winkelabstand des ausgekoppelten Lichts mit verschiedenen Wellenlängen bietet das zusätzliche Merkmal der gleichzeitigen Bestimmung der Intensitäten des übertragenen Anregungslichts und des emittierten Lumineszenzlichts. Es ist auch möglich, die zwei Verfahren in einer Vorrichtung zu kombinieren, um einen gleichzeitigen "Volumen"- und "Gitter"-Nachweis bereitzustellen. Ein genauerer Vergleich der zwei Verfahren ist von G.L. Duveneck et al. in einem Dokument mit dem Titel "A novel generation of luminescence-based biosensors: singlemode planar waveguide sensors", Proc. SPIE, Band 2928 (1996), erörtert.
WO 96/23213 beschreibt eine Gelelektrophoresevorrichtung. Keine Wechselwirkung mit einem evanescenten Feld ist erwähnt. Die Anregung von Fluoreszenz wird mit einem Laserstrahl, der durch das Trennmedium oder Gel in der vertikalen Richtung geführt wird, erreicht, welcher gleichzeitig in einer Richtung des Gels mehr als 1 getrennten und markierten Analytenpunkt angeht. Die Vorrichtung umfasst ferner optische Kopplungselemente zum Einkoppeln von Anregungslicht in das Gel und sie umfasst eine photoelektrische Detektoranordnung und ein Mittel zum Richten von Lumineszenzlicht auf einen jeweiligen Teil der Detektoranordnung.
In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich der Begriff "Messfeld" auf den kleinsten Bereich eines Sensorfeldes, der zu einer Unterscheidung durch einen photoelektrischen Detektor, der zum Nachweis von Lumineszenz verwendet wird, fähig ist. Die vorliegende Erfindung wendet sich dem Bedarf für eine gleichzeitige, räumlich selektive Anregung und den hochempfindlichen Nachweis von Lumineszenzsignalen von einer Anordnung von Messfeldern zu. Herkömmliche Bioaffinitätssensoren beruhen im Allgemeinen auf einer makroskopischen Abbildung von emittierter Lumineszenz von einem einzigen, großen Messfeld. Eine direkte Übertragung dieses Verfahrens auf Anordnungen von Messfeldern leidet unter innewohnender optischer Überlagerung und optischer Aufnahme von Hintergrundstrahlung in dem Umfang, dass die Nachweisgrenze häufig für viele Anwendungen nicht ausreichend niedrig ist. Wenn makroskopische optische Elemente verwendet werden, um einen Grad an seitlicher Auflösung bereitzustellen, muss ferner der Abstand zwischen dem Messfeld und der Detektoranordnung ziemlich beträchtlich sein, wodurch die Gesamtgröße des Systems erhöht wird. Zum Lumineszenznachweis in äußerst kleinen Messfeldern und -volumina ist die Fluoreszenzmikroskopie mit einem konfokalen Laser ein sehr empfindliches Verfahren. Der Nachweis von einzelnen Molekülen wurde mit Anregungsbereichen von nicht größer als dem durch die Beugung begrenzten Brennpunkt des Laseranregungslichts demonstriert, d.h. in der Größenordnung von einer Wellenlänge. Die Anregung und der Nachweis einer großen Anzahl von Messzellen in einer Anordnung erfordert jedoch eine seitliche Parallelverschiebung der Probe in Bezug auf die Messanordnung, um eine sequentielle Messung jeder Messzelle in der Anordnung zu ermöglichen. Folglich wird die Zeit, die erforderlich ist, um die Signale einer beträchtlichen Anordnung von Messfeldern zu empfangen, verlängert und die relativen Kosten dieser Art von System selbst sind aufgrund der Größe und Komplexität des Instruments teuer.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine optische Abtasteinheit für chemische oder biochemische Messungen bereitgestellt, umfassend:
einen planaren optischen Wellenleiter (1, 2) in Kombination mit einem Durchflusszellengehäuse (20), das sich unterhalb des planaren Wellenleiters befindet und das unterteilt ist, um eine Anordnung von Fluidkanälen (21) zu bilden, damit flüssige Proben evanescentem Licht vom planaren Wellen- 1eiter ausgesetzt werden, wobei somit eine Vielzahl von evanescenten Sensorfeldern erzeugt werden, die in der Anzahl und im Abstand den Fluidkanälen entsprechen; oder
eine Anordnung von Wellenleitern, die auf einem einzigen Substrat integriert ist, in Kombination mit einem Durchflusszellengehäuse (20), das sich unterhalb der Anordnung befindet und das unterteilt ist, um eine Anordnung von Fluidkanälen (21) zu bilden, damit flüssige Proben evanescentem Licht von der Anordnung von Wellenleitern ausgesetzt werden, wobei somit eine Vielzahl von evanescenten Sensorfeldern erzeugt wird, die in der Anzahl und im Abstand den Fluidkanälen entsprechen;
optische Kopplungselemente (3) zum Einkoppeln von Anregungslicht in den planaren Wellenleiter bzw. in die Anordnung von Wellenleitern;
eine Vielzahl von Anregungslichtquellen oder eine einzelne Anregungslichtquelle, die im Multiplexbetrieb in die optischen Kopplungselemente eingespeist wird, wobei Anregungslicht in den planaren Wellenleiter bzw. in die Anordnung von Wellenleitern über die Kopplungselemente (3) emittiert wird, wobei das Licht somit auf flüssige Proben in den Fluidkanälen durch evanescente Feldanregung von Lumineszenz innerhalb von Messfeldern als kleine Bereiche einwirkt, die durch jeweilige Teile einer photoelektrischen Detektoranordnung unterschieden werden sollen;
eine photoelektrische Detektoranordnung (17) zum Erfassen der Intensität von Lumineszenzlicht, das von jedem Messfeld als Reaktion auf Anregungslicht emittiert wird; und
Mittel (14 und 18) zum Lenken von Lumineszenzlicht, das von jedem Messfeld emittiert wird, auf einen jeweiligen Teil der photoelektrischen Detektoranordnung,
wobei die Vielzahl von Anregungslichtquellen oder die einzelne Anregungslichtquelle, die im Multiplexbetrieb in das optische Kopplungselement eingespeist wird, eine Anordnung von parallelen Lichtstrahlen bereitstellt, die Lumineszenzlicht in jedem Messfeld separat anregen.
Die vorliegende Erfindung wendet sich dem Bedarf zu, das Verhältnis eines nachgewiesenen Lumineszenzsignals zum Hintergrund-"Rauschen" in einem Messverfahren auf Lumineszenzbasis zu verbessern. Sie erreicht dies durch Bereitstellung einer Form von Strahlführung für Licht, das von einer Anordnung von relativ kleinen Messfeldern emittiert wird, die einer Anzahl von Abtastfeldern zugeordnet sind, um optische Überlagerung zu beseitigen, die gewöhnlich mit der herkömmlichen makroskopischen Abbildung von benachbarten Messfeldern verbunden ist. In den bevorzugten Beispielen wird eine Anordnung von Wellenleitern oder Kanälen mit separater Strahlführung des Anregungslichts und Emissionslichts für jeden Wellenleiter oder Kanal verwendet.
In einem bevorzugten Beispiel der vorliegenden Erfindung wird oder werden das eine oder die mehreren Sensorfelder unter Verwendung einer Anzahl von planaren evanescenten Feldwandlern bereitgestellt. Vorzugsweise umfassen die Sensorfelder eine Anzahl von beabstandeten optischen Wellenleitern, die in parallelen Segmenten angeordnet sind. Das Anregungslicht wird in die Anordnung von optischen Wellenleitern eingekoppelt, um eine Anzahl von räumlich getrennten evanescenten Sensorfeldern herzustellen.
Vorzugsweise ist der oder jeder Wellenleiter ein planarer Einmoden-Metalloxid-Wandler. Wenn eine Anordnung von Wellenleitern bereitgestellt wird, können sie auf einem einzelnen Substrat integriert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die räumlich getrennten evanescenten Sensorfelder hergestellt, indem eine kontinuierliche Metalloxid-Wellenleitungsschicht, die über dem ganzen Substrat abgeschieden ist, mit einer strukturierten Absorptionsfläche mit einer geometrischen Anordnung entsprechend der Anzahl und dem Abstand der Sensorfelder in Kontakt gebracht wird.
Die oder jede Messzelle wirkt als Kanal oder Mulde für eine flüssige Probe. In der vorliegenden Erfindung wird ein Durchflusszellengehäuse bereitgestellt, das unterteilt ist, um eine Anordnung von Fluidkanälen mit einer geometri schen Anordnung entsprechend der Anzahl und dem Abstand der Sensorfelder zu bilden. Eine bevorzugte Form von Durchflusszelle ist die sogenannte Gegenstrom-Durchflusszelle, die in Proceedings on the μ-TAS '96 in Basel, Spezialausgabe 1996 von Analytical Methods & Instrumentation, S. 158–162, beschrieben ist. Diese spezielle Durchflusszelle ist dazu ausgelegt, mit einem planaren Wandlersubstrat zusammenzuwirken, um eine fluiddichte Kammer zu bilden.
Die optische Abtasteinheit umfasst eine Vielzahl von optischen Kopplungselementen zum Einkoppeln von Anregungslicht in die Wellenleitungsschicht. Vorzugsweise umfassen die Kopplungselemente eine Vielzahl von Beugungsgittern. Die optische Abtasteinheit kann auch optische Kopplungselemente zum Auskoppeln von Licht aus den Messzellen umfassen. Insbesondere wird in einem planaren evanescenten Feldwandler, der zum Gitternachweis ausgelegt ist, ein zweites Beugungsgitter verwendet, um zurückgekoppelte Lumineszenz auf die Detektoranordnung auszukoppeln. Alternativ oder zusätzlich kann ein zweites Beugungsgitter verwendet werden, um übertragenes Anregungslicht auf einen anderen Detektor für Bezugszwecke auszukoppeln.
Obwohl eine Vielzahl von Anregungslichtquellen verwendet werden kann, eine für jede Messzelle, wird vorzugsweise eine einzige Anregungslichtquelle bereitgestellt, die, falls erforderlich, im Multiplexbetrieb in die einkoppelnden Elemente eingespeist wird, um eine Anordnung von parallelen Lichtstrahlen bereitzustellen. Eine bevorzugte Form eines optischen Multiplexers ist ein Dammann-Beugungsgitter, das in Kombination mit einem geeigneten optischen Element, wie einer Linse, verwendet wird, um einen parallelen Satz von Lichtstrahlen zur Herstellung einer Vielzahl von Sensorfeldern bereitzustellen. Andere geeignete optische Multiplexer umfassen Reflexionsgitter, Brechungselemente, Mikrolinsenanordnungen, Mikroprismenanordnungen und Fresnel-Linsenanordnungen.
Ein Laser ist eine geeignete Anregungslichtquelle mit der geeigneten ausgewählten Wellenlänge, ob in Form einer Laserdiode, eines Festkörperlasers oder eines Gaslasers.
Ein oder mehrere Sätze von optischen Verschlüssen können bereitgestellt werden, um selektiv Anregungslicht für eine Anzahl der Messzellen zu blockieren. Ferner kann der Anregungslichtweg umgelenkt werden, um die Größe des optischen Sensors zu verringern.
In noch einem weiteren bevorzugten Beispiel der vorliegenden Erfindung sind der Anregungs- und der Nachweisbereich oder das Anregungs- und das Nachweisvolumen der Messfelder identisch und vorzugsweise in einer Konfiguration im Multiplexbetrieb eines konfokalen optischen Anregungs- und Nachweissystems mit einem separaten konfokalen Anregungs- und Nachweisweg für jedes Messfeld angeordnet.
In der optischen Nachweisanordnung der vorliegenden Erfindung können die Größe und der Abstand jedes Messfeldes der Größe und dem Abstand der photoelektrischen Detektoranordnung entsprechen. In der Praxis ist jedoch die Größe jedes Messfeldes im Allgemeinen etwas größer als die Größe des jeweiligen Teils der Detektoranordnung, die diesem zugeordnet ist. Im letzteren Fall wird das von jedem Messfeld emittierte Licht auf den jeweiligen Teil der Detektoranordnung fokussiert.
Vorzugsweise ist die photoelektrische Detektoranordnung in einer "Volumennachweiskonfiguration" unmittelbar über oder unter der Messzelle angeordnet, um eine Komponente von Lumineszenzlicht aufzunehmen, die isotrop von den Messfeldern in den Raum abgestrahlt wird.
Vorzugsweise umfasst die optische Abtasteinheit eine Anordnung von Mikrolinsen, die zwischen der Ebene der Messzelle und jener der Detektoranordnung angeordnet sind, um von jedem Messfeld emittiertes Licht auf einen jeweiligen Teil der Detektoranordnung zu fokussieren. Die Anordnung von Mikrolinsen kann vorteilhafterweise in ein Substrat der optischen Abtasteinheit integriert sein.
Vorzugsweise umfasst der optische Detektor ferner eine Anordnung von Aperturblenden, die an die Geometrie der Messfelder angepasst sind, um eine optische Isolation von emittiertem Licht zwischen benachbarten Messfeldern bereitzustellen. Die Aperturblenden können im Wesentlichen planar sein oder können sich senkrecht zur Ebene der Detektoranordnung erstrecken.
Vorzugsweise umfasst der optische Sensor ferner ein optisches Filter oder eine Anordnung von optischen Filtern, die in einer Ebene zwischen den Messfeldern und der Detektoranordnung liegen, um eine Signalunterscheidung bereitzustellen.
Beispiele von geeigneten photoelektrischen Detektoren umfassen Mehrkanal-Photovervielfacher, CCD-Anordnungen, CCD-Kameras und CMOS-Bauelemente.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Bestimmen eines Analyten unter Verwendung der optischen Abtasteinheit nach Anspruch 1 bereitgestellt, umfassend die Schritte von:
Einleiten einer flüssigen Probe in die Fluidkanäle (21);
Einkoppeln von Anregungslicht einer Vielzahl von Lichtquellen oder von im Multiplexbetrieb eingespeisten parallelen Lichtstrahlen einer einzelnen Lichtquelle in die Kanäle (21) durch evanescente Feldanregung;
Leiten von Lumineszenzlicht, das von jedem der Messfelder emittiert wird, zu einem jeweiligen Teil der Detektoranordnung (17); und
Erfassen der Intensität von Lumineszenzlicht, das von jedem Messfeld emittiert wird.
Wie für Fachleute zu erkennen ist, findet der vorliegende optische Sensor eine breite Vielfalt von Anwendungen unter den auf dem Gebiet bekannten. Bevorzugte Beispiele umfassen optische Bestimmungen von absorbiertem oder angeregtem Licht in miniaturisierten oder multiplexierten Anordnungen von chemischen oder biochemischen Sensoren.
Der erfindungsgemäße optische Sensor ist besonders geeignet für die quantitative Bestimmung von biochemischen Substanzen in einem Bioaffinitätssensorsystem. Er kann verwendet werden, um Proben zu testen, die so verschieden sind, wie Eigelb, Blut, Serum, Plasma, Lymphe, Urin, Oberflächenwasser, Boden oder Pflanzenextrakte, und für einen Bio- oder Synthesevorgang oder beide. Er kann auch beispielsweise bei der quantitativen oder qualitativen Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen, Rezeptoren oder ihren Liganden, Oligonukleotiden, DNA- oder RNA-Stämmen, DNA- oder RNA-Analogen, Enzymen, Enzymsubstraten, Enzymcofaktoren oder -inhibitoren, Lectinen und/oder Kohlenhydraten verwendet werden.
Beispiele der vorliegenden Erfindung werden nun im Einzelnen mit Bezug auf die zugehörigen Zeichnungen beschrieben:
1 ist eine vereinfachte schematische Ansicht eines planaren Wellenleiterwandlers für einen Bioaffinitätssensor und eines optischen Anregungsweges im Multiplexbetrieb unter Verwendung eines Dammann-Gitters;
2 ist ein Blockdiagramm eines optischen Aufbaus für die Anordnung von 1;
3 ist eine vereinfachte Vorderansicht eines Beispiels eines Nachweissystems für einen Bioaffinitätssensor;
4 ist eine vereinfachte Vorderansicht des Nachweissystems von 3.
Ein erstes Beispiel der vorliegenden Erfindung ist in den 1 bis 4 dargestellt. Ein Dünnschicht-Wellenleiter 1 (150 nm Tantalpentoxid, Brechungsindex n = 2,26 bei 633 nm) auf einem Glasträger 2 (16 mm × 48 mm äußere Abmessungen, 0,5 mm dick, C7059-Glas) wird als Wandler für einen Bioaffinitätssensor verwendet. Zwei Sätze von rechteckigen Reliefbeugungsgittern 3 und 4 (zwei Gitter mit identischer Periode von 320 nm in einem Abstand von 20 mm, 15 nm Gittertiefe) werden photolithographisch im Substrat hergestellt und in die Wellenleitungsschicht bei ihrer Abscheidung auf dem strukturier ten Substrat überführt. Das erste Gitter 3 wird für die Einkopplung des Anregungslichts verwendet, während das zweite Gitter 4 für die Auskopplung des übertragenen Anregungslichts aus dem Wellenleiter verwendet wird. Das zweite Gitter 4 kann auch zum Auskoppeln von zurückgekoppeltem Lumineszenzlicht aus dem Wellenleiter verwendet werden. Wie nachstehend beschrieben wird, wird in der vorliegenden Erfindung Fluoreszenzlicht, das im evanescenten Feld einer Anzahl von angeregten Messfeldern des Wellenleiters 1 angeregt wird und isotrop in den Raum abgestrahlt wird, unter Verwendung einer neuen Nachweisanordnung nachgewiesen.
Die Anregungslichtwege sind in 1 schematisch gezeigt. Das Anregungslicht eines HeNe-Lasers 5 (10 mW) wird durch eine Linse 6 aufgeweitet und fällt auf ein Dammann-Gitter 7 als optisches Beugungselement ein. Die (ungleichmäßige) Periodizität des Dammann-Gitters 7 ist optimiert, um die Intensität aller geraden Beugungsordnungen, insbesondere der nullten, d.h. nicht abgelenkten Ordnung, zu minimieren und eine Intensität zu erzeugen, die in den anderen Beugungsordnungen so identisch wie möglich ist. In diesem Beispiel werden 16 Komponentenstrahlen in dieser Weise erzeugt, die sich in ihrer Intensität um nicht mehr als etwa 5 % unterscheiden. Eine achromatische Linse 8 (Brennweite 160 mm), in deren Brennpunkt das Dammann-Gitter 7 steht, wird verwendet, um ein Bündel von 16 parallelen Komponentenstrahlen zu erzeugen. Die Divergenz der Komponentenstrahlen, die das Dammann-Gitter 7 verlassen, und die Brennweite der Linse 8 sind miteinander koordiniert, um einen gewünschten Abstand (Periodizität) der parallelen Komponentenstrahlen zu erhalten, die auf die einkoppelnden Gitter 3 des Wellenleiters 1 wirken. Ein geeigneter Abstand ist beispielsweise ungefähr 1 mm. 1 stellt auch die parallelen Wege, denen die Komponentenstrahlen im Wellenleiter folgen, und die Auskopplung der übertragenen Komponentenstrahlen am zweiten Gitter 4 dar.
2 zeigt die räumliche Anordnung der verschiedenen optischen Komponenten. Eine Blende 9 befindet sich zwi schen dem HeNe-Laser 5, der als Anregungslichtquelle verwendet wird, und dem Dammann-Gitter 7, welches verwendet wird, um den Anregungslichtweg periodisch zu blockieren und ihn nur freizugeben, wenn die Fluoreszenzintensitäten der Probe gemessen werden sollen. Der Anregungslichtweg wird mittels zwei Spiegeln 10 und 11 umgelenkt, um die Gesamtabmessungen der optischen Anordnung zu verringern. Eine zweite Blende 12 mit 16 Kanälen gibt abwechselnd den weiteren Anregungslichtweg der geraden (2, 4, 6 ...) und ungeraden (1, 3, 5 ...) Komponentenstrahlen frei. Diese Anordnung verringert die optoelektronische Überlagerung zwischen aneinandergrenzenden Nachweiskanälen bzw. Detektionskanälen, die durch die 16 evanescenten Sensorfelder in der Messanordnung definiert sind. Das Anregungslicht wird auf ein Prisma (nicht dargestellt) abgelenkt, aus dem es dann auf das einkoppelnde Gitter oder die einkoppelnden Gitter 3 des Wellenleiterchips gerichtet wird. Die Einstellung des Einkopplungswinkels und der Auftreffstelle der Anregungslaser-Komponentenstrahlen findet bei dieser Anordnung an der Stelle des letzten Umlenkspiegels 13 statt. Die Nachweiseinheit ist auf der Glassubstrat-Rückseite des Wellenleiterchips angeordnet und wird nachstehend im Einzelnen beschrieben.
Das allgemeine Prinzip, dass das Emissionslicht, das die separaten Messfelder für einen Wellenlängenkanal (Sensorfeld) verlässt, über separate Strahlwege geführt wird, um Nachweiselemente in einer Detektoranordnung zu trennen, ist in 3 dargestellt. Auf der Glassubstrat-Rückseite befindet sich in nur einem kurzen Abstand eine Anordnung von Mikrolinsen 14. Anschließend tritt das Emissionslicht durch eine Interferenzfilteranordnung 15 oder ein kontinuierliches Interferenzfilter für die Unterscheidung von Streulicht mit der Anregungswellenlänge von der Emissionswellenlänge hindurch. Wenn in dieser Anordnung ein kontinuierliches Filter verwendet wird, insbesondere für die Verringerung von optischer Überlagerung im Filter, kann es gegen eine durch optische Sperren getrennte Filteranordnung ausgetauscht werden.
Nach dem Durchtritt durch eine oder mehrere Aperturblendenanordnungen 16 wird das Nachweislicht über eine weitere Mikrolinsenanordnung 18 auf eine Detektoranordnung 17 fokussiert. Die Detektoranordnung 17 ist in 4 genauer gezeigt und umfasst einen Photovervielfacher (PMT) mit 16 Kanälen mit einem Abstand von 1 mm. Blenden 19 können bereitgestellt sein, die sich zwischen dem Interferenzfilter 15 und dem PMT 17 mit 16 Kanälen erstrecken. Die Probendurchflusszelle 20 mit ihrer Anordnung von Kanälen 21 befindet sich unterhalb des planaren Wandlers.
Beispiel
Als Experiment werden 22-Mer-Oligonukleotide, die als biochemische Erkennungs- oder Erfassungselemente dienen, durch kovalente Bindung an den reaktiven Gruppen eines Epoxysilans fixiert, mit dem die gereinigten Wandlerplattformen (150 nm Tantalpentoxid auf 0,5 mm C7059-Glas) in der flüssigen Phase silanisiert wurden. Wie nachstehend beschrieben wird, sind komplementäre mit Fluoreszenz markierte Oligonukleotide in wiederholbaren Zyklen eines Hybridisierungsassays nachweisbar.
Ein Zyklus des Hybridisierungsassays beinhaltet:

1. Gleichgewichtseinstellung des Sensors in Pufferlösung (pH 7,75)/Aufnahme des Hintergrundsignals;
2. Zufuhr der den Analyten (komplementäres 22-Mer-Oligonukleotid 22*-c-Cy5, markiert mit Cyaninfarbstoff Cy5, in einer Konzentration von 1 Nanomol/Liter, in Pufferlösung) enthaltenden Probe/Aufnahme des Fluoreszenzsignals während der Bindungs- (Hybridisierungs-) Phase;
3. Waschen mit Pufferlösung/Bestimmung der Zerfallsrate der gebildeten DNA-Hybride;
4. Regeneration der Sensoroberfläche mit 10 mM NaOH/Rückführung des Fluoreszenzsignals zur Grundlinie; und
5. erneute Gleichgewichtseinstellung des Sensors in Pufferlösung/Prüfen der Vollständigkeit der Regeneration durch Vergleich der Grundlinien am Beginn und am Ende des Assayzyklus.

Die Zufuhr von Reagenzien findet mit Hilfe einer Gegenstromzelle statt, wie sie in Proceedings on the μ-TAS '96 in Basel, Spezialausgabe 1996 von Analytical Methods & Instrumentation, S. 158–162, beschrieben ist. Die Ein- und Auskopplungsgitter des Biosensors werden nach Montage der Durchflusszelle, deren Deckel durch die Wandleroberfläche zusammen mit den fixierten Identifikationselementen gebildet ist, innerhalb eines Durchflusskanals angeordnet, der durch einen O-Ring abgedichtet wird. Der Einlass für die Probe und die während des Assayzyklus verwendeten verschiedenen Reagenzien wird auf der rechten Seite des Auskopplungsgitters, außerhalb des Wellenleitungsbereichs zwischen den Kopplungsgittern, zwischen denen die Messflächen angeordnet sind, bereitgestellt. Ein Puffergegenstrom wird in Richtung des Probenstroms gelenkt, der in der Richtung des Einkopplungsgitters strömt, welcher auf der linken Seite des Einkopplungsgitters, d.h. ebenso außerhalb des Bereichs der Messflächen, eingelassen wird, und ist dazu ausgelegt, einen Kontakt zwischen der Probe und dem Einkopplungsgitter zu verhindern. Der gemeinsame Auslass für beide Ströme befindet sich zwischen den zwei Einlässen auf der rechten Seite des Einkopplungsgitters.
Der vom Durchflusskanal auf der Wandlerplattform eingeschlossene Bereich reicht aus, um 8 der 16 Komponentenstrahlen, die vom Dammann-Gitter erzeugt werden, mit einem Abstand von 1 mm innerhalb des Bereichs der Durchflusszelle anzuregen, um zu ermöglichen, dass das eingekoppelte Laserlicht in separaten Streifen durch den Bereich bis zum Auskopplungsgitter durchtritt und Lumineszenzen im evanescenten Feld entlang getrennter Bahnen der geführten Anregungsstrahlen, die im Wellenleiter übertragen werden, anzuregen. Die isotrop entlang der 8 Segmente abgestrahlte Fluoreszenz wird während des Verfahrens mit der vorstehend beschriebenen optischen Nachweisvorrichtung gemessen. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1: Ergebnisse eines Oligonukleotid-Hybridisierungsassays, das an 8 gleichzeitig angeregten Segmenten der planaren Wellenleiterwandlerplattform durchgeführt wird: Maximale Fluoreszenzsignale bei Hybridisierung mit einer 1 nanomolaren Analytlösung (22*-c-Cy5) gemessen, Rauschen von Hintergrundsignal, Rauschabstand und abgeschätzte Nachweisgrenze für jedes Segment.
Abgesehen von veränderlichen Graden an Streuung der Daten zeigten die 8 Messkurven im Wesentlichen dieselbe zeitliche Entwicklung. Die maximalen Fluoreszenzintensitäten für jedes Segment sind in Tabelle 1 aufgelistet. Unterschiede in den Ergebnissen können zumindest teilweise durch die veränderliche lineare Geschwindigkeit des Analyten während seines Durchlaufs durch die Zelle und durch die veränderliche Dichte der fixierten Erfassungselemente erklärt werden. Außerdem weisen mögliche Variationen in der Kopplungseffizienz des Einkopplungsgitters für die Einkopplung der verschiedenen Komponentenstrahlen einen starken Einfluss auf den Pegel der zu beobachtenden Lumineszenzsignale auf.
Die Intensität der beobachteten Lumineszenzsignale ist hoch und aus den bestimmten Rauschabständen kann abgeschätzt werden, dass für diese miniaturisierte optische Nachweisvorrichtung die Nachweisgrenze, die durch das Verhältnis des maximalen Signals und des Signalrauschens bestimmt wird, mit Pikomolkonzentrationen erreicht wird (Nachweisgrenze als extrapolierte Fluoreszenzintensität bei dreifachem Rauschpegel festgelegt).

Claims

Optische Abtasteinheit für chemische oder biochemische Messungen, umfassend: einen planaren optischen Wellenleiter (1, 2) in Kombination mit einem Durchflusszellengehäuse (20), das sich unterhalb des planaren Wellenleiters befindet und das unterteilt ist, um eine Anordnung von Fluidkanälen (21) zu bilden, damit flüssige Proben evanescentem Licht vom planaren Wellenleiter ausgesetzt werden, wobei somit eine Vielzahl von evanescenten Sensorfeldern erzeugt werden, die in der Anzahl und im Abstand den Fluidkanälen entsprechen; oder eine Anordnung von Wellenleitern, die auf einem einzigen Substrat integriert ist, in Kombination mit einem Durchflusszellengehäuse (20), das sich unterhalb der Anordnung befindet und das unterteilt ist, um eine Anordnung von Fluidkanälen (21) zu bilden, damit flüssige Proben evanescentem Licht von der Anordnung von Wellenleitern ausgesetzt werden, wobei somit eine Vielzahl von evanescenten Sensorfeldern erzeugt wird, die in der Anzahl und im Abstand den Fluidkanälen entsprechen; optische Kopplungselemente (3) zum Einkoppeln von Anregungslicht in den planaren Wellenleiter bzw. in die Anordnung von Wellenleitern; eine Vielzahl von Anregungslichtquellen oder eine einzelne Anregungslichtquelle, die im Multiplexbetrieb in die optischen Kopplungselemente eingespeist wird, wobei Anregungslicht in den planaren Wellenleiter bzw. in die Anordnung von Wellenleitern über die Kopplungselemente (3) emittiert wird, wobei das Licht somit auf flüssige Proben in den Fluidkanälen durch evanescente Feldanregung von Lumineszenz innerhalb von Messfeldern als kleine Bereiche einwirkt, die durch jeweilige Teile einer photoelektrischen Detektoranordnung unterschieden werden sollen; eine photoelektrische Detektoranordnung (17) zum Erfassen der Intensität von Lumineszenzlicht, das von jedem Messfeld als Reaktion auf Anregungslicht emittiert wird; und Mittel (14 und 18) zum Lenken von Lumineszenzlicht, das von jedem Messfeld emittiert wird, auf einen jeweiligen Teil der photoelektrischen Detektoranordnung, wobei die Vielzahl von Anregungslichtquellen oder die einzelne Anregungslichtquelle, die im Multiplexbetrieb in das optische Kopplungselement eingespeist wird, eine Anordnung von parallelen Lichtstrahlen bereitstellt, die Lumineszenzlicht in jedem Messfeld separat anregen.
Optische Abtasteinheit nach Anspruch 1, welche weiterhin eine Anordnung von Mikrolinsen (14) umfasst, die zwischen dem planaren Wellenleiter bzw. der Anordnung von Wellenleitern und der Detektoranordnung (17) angeordnet sind, Licht, das von jedem Messfeld emittiert wird, auf einen jeweiligen Teil der Detektoranordnung fokussierend.
Optische Abtasteinheit nach Anspruch 1, welche weiterhin eine Anordnung von Aperturblenden (16) umfasst, die an die Geometrie der Messfelder angepasst sind, um eine optische Isolation von emittiertem Licht zwischen benachbarten Messfeldern bereitzustellen.
Optische Abtasteinheit nach Anspruch 1, welche weiterhin eine Anordnung (15) von optischen Filtern umfasst, die sich in einer Ebene zwischen den Messfeldern und der Detektoranordnung (17) befinden, um eine Signalunterscheidung bereitzustellen.
Optische Abtasteinheit nach Anspruch 1, welche Beugungsgitter (3) als optische Kopplungselemente umfasst.
Optische Abtasteinheit nach Anspruch 1, welche ein zweites Beugungsgitter (4) zum Auskoppeln von rückgekoppelter Lumineszenz umfasst.
Optische Abtasteinheit nach Anspruch 1, welche weiterhin ein Dammann-Beugungsgitter (7) zwischen der einzelnen Anregungslichtquelle und dem optischen Kopplungselement umfasst.
Optische Abtasteinheit nach Anspruch 1, welche einen Laser (5) als Anregungslichtquelle umfasst.
Verfahren zum Bestimmen eines Analyten unter Verwendung der optischen Abtasteinheit nach Anspruch 1, umfassend die Schritte von: Einleiten einer flüssigen Probe in die Fluidkanäle (21); Einkoppeln von Anregungslicht einer Vielzahl von Lichtquellen oder von im Multiplexbetrieb eingespeisten parallelen Lichtstrahlen einer einzelnen Lichtquelle in die Kanäle (21) durch evanescente Feldanregung; Leiten von Lumineszenzlicht, das von jedem der Messfelder emittiert wird, zu einem jeweiligen Teil der Detektoranordnung (17); und Erfassen der Intensität von Lumineszenzlicht, das von jedem Messfeld emittiert wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die parallelen Lichtstrahlen mit einem Dammann-Gitter (7) und einer Kanalblende (12), die sich zwischen dem Dammann-Gitter und dem optischen Kopplungselement (3) der Abtasteinheit befindet, erzeugt werden, wobei die Kanalblende abwechselnd gerade und ungerade Komponentenstrahlen der parallelen Lichtstrahlen freigibt, sodass optoelektronische Überlagerung zwischen aneinandergrenzenden Messfeldern vermieden wird.