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Die
vorliegende Erfindung befasst sich mit einem drehbaren Temperaturwechselgerät und mit Verfahren
zur Verwendung dieses drehbaren Temperaturwechselgerätes, besonders
zur Verwendung bei biochemischen Reaktionen und im Speziellen zur Verwendung
bei Polymerasekettenreaktionen (PCR). In Ausführungsformen bezieht sich die
vorliegende Erfindung auf drehbare Temperaturwechselprozesse, in
denen Proben auf Filter oder andere Medien gegeben werden und auf
Platten in einer Reihenfolge bei vorgegebenen Temperaturen erwärmt werden und
die vorzugsweise zumindest einen Schritt umfassen, in dem die Probe
z.B. mit einem oder mehreren flüssigen
Reagenzien in jedem Zyklus bespritzt wird.
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Die
vorliegende Erfindung wird hierin besonders in Hinblick auf biochemische
Reaktionen beschrieben.
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Häufig ist
es notwendig oder wünschenswert,
die Gegenwart gewisser Nucleinsäuremoleküle oder
Mikroorganismen in Proben von Luft, Boden, Wasser, Nahrungsmittel,
Körperflüssigkeiten
und anderen Materialien quantifizieren und/oder detektieren zu können. Dies
könnte
in Bezug auf eine unmittelbare medizinische oder gesundheitliche
Situation oder in Tests zur Bestimmung der Sicherheit bei einer
Verwendung durch Mensch oder Tier notwendig sein. So ist es in vielen
Situationen wichtig, exakt und rasch die Gegenwart und Menge oder
auch die Abwesenheit bestimmter Mikroorganismen in Proben, und dies
auf eine automatisierte, verlässliche
und reproduzierbare Weise, bestätigen
zu können.
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Herkömmliche
quantitative Schätzungen
von Mikroorganismen in medizinischen, Nahrungsmittel-, Umwelt- oder
anderen Proben stützten
sich auf Lebendkeimzahlbestimmungen nach geeigneter Kultivierung
in verdünnten
Proben auf Nähragarplatten. Genauere
und rasche Detektion von Mikroorganismen in verschiedenen Arten
von Testproben wurde nun jedoch möglich.
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Genetische
Information in allen lebenden Organismen wird hauptsächlich in
Nucleinsäuren,
entweder in doppelsträngiger
Desoxyribonucleinsäuren (DNA)
oder in Ribo nucleinsäure
(RNA), getragen, und Detektion und Unterscheidung auf der Grundlage
spezifischer Nucleinsäuresequenzen
ermöglichten
die Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit eines bestimmten Organismus
innerhalb einer Testprobe. Die Entwicklung des Verfahrens der Polymerasekettenreaktion
(PCR) zur Amplifikation einer oder mehrerer Zielnucleinsäuresequenzen
innerhalb einer Probe hat Verfahren zur Detektion und Unterscheidung
spezifischer Nucleinsäuresequenzen
und somit spezifischer Organismen ungemein erleichtert.
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PCR-Verfahren
zur Detektion erfordern mehrere oder zyklische chemische Reaktionen,
um das gewünschte
Produkt zu bilden, und dies unter sorgsam kontrollierten Temperaturbedingungen,
um Genauigkeit und Reproduzierbarkeit sicherzustellen, um genügend Material
erzeugen zu können,
um die Detektion eines Mikroorganismus in der Probe zu ermöglichen
oder die Abwesenheit des Mikroorganismus aufzeigen zu können. Sowohl
Gerät als
auch Verfahren wurden entwickelt, um die genaue Kontrolle der Temperatur
der Reaktionsbehälter
zu ermöglichen,
in denen solche PCR-Amplifikationsreaktionen ausgeführt werden
können.
Es gibt zum Beispiel eine Reihe von Temperaturwechselgeräten, die
für die DNA-Amplifikation
und -Sequenzierung verwendet werden und in welchen ein oder mehrere
temperaturkontrollierte Elemente oder „Blöcke" Proben aufnehmen, die das Reaktionsgemisch
enthalten, wobei die Temperatur des Blocks über die Zeit hinweg verändert wird.
In anderen Systemen wird ein Roboterarm verwendet, um die Gemische
von einem Block zum anderen zu befördern. Diese Systeme umfassen
Eigenschaften, welche es dem Benutzer ermöglichen, Temperaturen und Temperaturprofile
des Blocks über ausgewählte Zeitperioden
so zu programmieren, dass verschiedene Prozesse wie z.B. DNA-Denaturierung,
-Anellierung und -Extension wirksam durchgeführt werden können.
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Polymerasekettenreaktion
(PCR) ist eine Technik, die mehrere Zyklen umfasst und zu einer
geometrischen Amplifikation gewisser Polynucleotidsequenzen bei
jedem Abschluss eines Zyklus führt.
Die Technik ist bereits weithin bekannt. Ein Beispiel für PCR umfasst
die Denaturierung eines doppelsträngigen Polynucleotids, gefolgt
vom Anellieren von zumindest einem Paar der Primer-Oligonucleotide
zu den resultierenden einzelsträngigen
Polynucleotiden. Nach dem Annealing-Schritt katalysiert ein Enzym mit
Polymerase-Aktivität
die Synthese eines neuen Polynucleotidstrangs, der die Primer-Oligonucleotide inkorporiert
und das ursprüngliche
denaturierte Polynucleotid als eine Synthesematrize verwendet, um ein
neues doppelsträngiges
Polynucleotidmolekül
zu bilden. Diese einzelnen Schritte (Denaturierung, Primer-Annealing
und Primer-Extension) stellen einen PCR-Zyklus dar. Da die Zyklen
wiederholt ablaufen, steigt die Menge neu synthetisierter Polynucleotide geometrisch
an, da die neu synthetisierten Polynucleotide aus einem früheren Zyklus
als Matrizen für
die Synthese in nachfolgenden Zyklen dienen können. Primer-Oligonucleotide
werden gewöhnlicherweise in
Paaren ausgewählt,
die an gegenüberliegenden Strängen einer
gegebenen doppelsträngigen
Polynucleotidsequenz anellieren, sodass die Region zwischen den
zwei anellierenden Stellen amplifiziert wird.
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Die
Temperatur des Reaktionsgemisches muss während jedes PCR-Zyklus und
folglich mehrere Male während
eines Tests verändert
werden. Die Denaturierung von DNA findet gewöhnlicherweise z.B. bei ungefähr 90°C–100°C statt,
das Primer-Annealing an die denaturierte DNA wird normalerweise bei
ungefähr
40°C–60°C durchgeführt, und
der Schritt der Extension der anellierten Primer mit einer thermostabilen
DNA-Polymerase wird normalerweise bei ungefähr 70°C–75°C durchgeführt. Jeder einzelne dieser
Schritte kann eine optimale Temperatur aufweisen.
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Das
Gerät,
in welchem ein Temperaturgradient über einen Gradientenblock erzeugt
wird, wird in
US 5.525.300 beschrieben.
Mehrere Reaktionsgemische können
in Vertiefungen des Gradientenblocks aufgenommen werden. In bevorzugten
Ausführungsformen
wird der Gradientenblock in einen für Nuclein-Amplifikationsreaktionen
verwendeten Temperaturwechsler integriert.
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US 4.981.801 beschreibt
ein Gerät
zur Durchführung
enzymatischer Kreislaufreaktionen, das mit einem Drehtisch, mehreren
auf dem Drehtisch entlang des Randes angeordneten Reaktionsbehälter und
einem Mittel zur Zirkulation einer Frostschutzflüssigkeit durch den Reaktionstank
ausgestattet ist. Heiz- und Kühlvorrichtungen
werden zur Temperaturveränderung
bereitgestellt.
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Ein
Gerät zur
Detektion und Abzählen
eines bestimmten Analyts in einer Flüssigkeitsprobe, das mit einem
Filterelement in einer Haltevorrichtung und einem Mittel zur Erwärmung und
Kontrolle der Temperatur des Filterelements ausgestattet ist, wird
in WO 94/21780 von R. G. L. Wheatcroft and W. B. Berndt offenbart.
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Ein
Verfahren zur Detektion und Unterscheidung mehrerer Analyte unter
Verwendung der Fluoreszenztechnik wird in
US 5.723.294 offenbart.
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EP 0 723 812 beschreibt
ein Temperaturwechselreaktionsgerät, das über einen Reaktor mit einem
Reaktorkörper
aus einer dünnen
wärmeleitenden
Platte und einen Hohlraum als Reaktionskammer verfügt.
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Zusätzliche
Geräte
und Verfahren, die zur Durchführung
von Temperaturwechselreaktionen, besonders Polymerasekettenreaktionen,
auf eine rasche, automatisierte und kontrollierte Weise dienen, wären von
Vorteil.
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Demgemäß stellt
ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein drehbares Temperaturwechselgerät, besonders
für biochemische
Reaktionen, bereit, umfassend:
- (a) mehrere
Stationen zum Aufnehmen von Proben in einem Flachbodenbehälter, wobei
jede Station eine flache Heizplatte, auf welcher der Behälter platziert
wird, und ein Mittel aufweist, um die Heizplatte unabhängig auf
eine vorgegebene Temperatur zu bringen;
- (b) Mittel zum Bewegen jedes Flachbodenbehälters von einer Station zu
einer anderen Station in vorgegebener Reihenfolge;
- (c) zumindest zwei dieser Stationen mit einem Heizelement, das
daran angepasst ist, über
einem auf der Station platzierten Behälter abgesenkt zu werden, wobei
jedes Heizelement einen Abschnitt mit einer flachen Unterseite umfasst,
die daran angepasst ist, in den Behälter abgesenkt zu werden, wo
sie sich nahe der Probe im Behälter befindet,
damit aber nicht in Kontakt kommt; und
- (d) zusätzlich
zu den Stationen gemäß (c) zumindest
eine Station, die ein Spritzelement aufweist, das daran angepasst
ist, ein oder mehrere flüssige
Reagenzien in einen Behälter
einzuspritzen, der sich an dieser einen Station befindet.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung ist die Station gemäß (d) daran angepasst, dass
ein Deckel von dem Behälter
entfernt werden kann, bevor das Spritzelement aktiviert wird, und
nach Beendigung des Spritzens dieser Deckel wieder aufgesetzt werden
kann.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist der Behälter
ein Flachbodenbehälter
mit kleineren Abmessungen als die Station.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst das Heizelement einen Abschnitt mit einer flachen Unterseite,
die daran angepasst ist, in den Behälter abgesenkt zu werden, wo
sie sich nahe der Probe im Behälter
befindet, damit aber nicht in Kontakt, besonders nicht in Kontakt
mit dem Deckel, kommt.
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Wiederum
in einer anderen Ausführungsform
umfasst das Gerät
einen Programmierer zur Kontrolle zumindest (i) der Temperatur in
jeder Station, (ii) der Verweilzeit in jeder Station, (iii) der
Dauer und zeitlichen Steuerung des Einspritzens und (iv) der Anzahl
der aufeinander folgenden Zyklen für biochemische Reaktionen.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist der Behälter
daran angepasst, ein Filter, auf dem sich die Probe befindet, und
einen Deckel über
diesem Filter aufzunehmen.
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In
wiederum einer anderen Ausführungsform ist
das Gerät
programmierbar und automatisiert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist das Gerät
daran angepasst, mehr als eine Probe gleichzeitig zu bearbeiten,
bis zu jeweils einer pro Station im Gerät.
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In
einer anderen Ausführungsform
befinden sich die Heizelemente auf Kolben, die in die Behälter abgesenkt
werden.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren
zur Durchführung
einer Reaktionsabfolge, insbesondere einer biochemischen Reaktionsabfolge
bei unterschiedlichen Temperaturen, bereit, Folgendes umfassend:
- (a) Platzieren einer Probe in einem Flachbodenbehälter;
- (b) sequenzielles Zyklieren der Probe durch vorgegebene Temperaturveränderungen,
indem der Flachbodenbehälter
bei jeder der Temperaturen für
einen vorgegebenen Zeitraum auf eine flache Heizplatte platziert
wird;
- (c) Bespritzen der Probe mit zumindest einem flüssigen Reagens;
- (d) Kontrollieren (i) der Temperatur jeder Station, (ii) der
Verweilzeit in jeder Station, (iii) der Dauer und zeitlichen Steuerung
des Einspritzens und (iv) der Anzahl der aufeinander folgenden Zyklen
für die
biochemische Reaktion, wobei die Kontrolle der Temperatur zumindest
an zwei Stationen erfolgt und den Schritt des Absenkens eines Heizelementes über den
Behältern
an zumindest zwei Stationen umfasst, wobei jedes Heizelement einen
Abschnitt mit einer flachen Unterseite aufweist, die daran angepasst
ist, in den Behälter
abgesenkt zu werden, wo sie sich nahe der Probe im Behälter befindet,
damit aber nicht in Kontakt kommt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
eines erfindungsgemäßen Verfahrens
wird eine biochemische Probe im Behälter auf einem Filter, einer
Membran, einem Mikrotiterbehälter
oder einem Objektträger
platziert, vor allem auf einem Filter.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist das Verfahren programmierbar und automatisiert.
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In
wiederum einer anderen Ausführungsform wird
die Probe vor dem Verfahren zur Durchführung der Reaktionsabfolge
einer Vorbehandlung unterzogen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
werden ein Abstandhalter auf dem Filter und ein Deckel auf den Abstandhalter
platziert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist die Reaktion eine Polymerasekettenreaktion.
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In
einer anderen Ausführungsform
dient die Reaktion zur Detektion von spezifischen DNA-Sequenzen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird die Probe in Folge einem photochemischen Detektionsverfahren,
insbesondere Fluoreszenz, um das Reaktionsprodukt zu detektieren,
und im Speziellen einer elektronischen Aufzeichnung, z.B. unter
Verwendung einer Videokamera, unterzogen.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein drehbares
Temperaturwechselgerät, das
speziell für
biochemische Reaktionen geeignet ist, bereit, Folgendes umfassend:
- (a) mehrere Stationen zur Erwärmung der
Proben in einem Flachbodenbehälter
bei vorgegebenen Temperaturen;
- (b) Mittel zum Bewegen des Flachbodenbehälters von einer Station zu
einer anderen Station in einer vorgegebenen Abfolge; und
- (c) zumindest eine Station, die ein Spritzelement aufweist,
das daran angepasst ist, ein flüssiges Reagens
oder flüssige
Reagenzien in einen Behälter,
der an der Station platziert ist, zu spritzen.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur
Durchführung
einer biochemischen Reaktionsabfolge bei unterschiedlichen Temperaturen
bereit und umfasst das Platzieren einer biochemischen Probe auf
einem Filter und das sequenzielle Zyklieren dieser biochemischen
Probe durch vorgegebene Temperaturveränderungen, wobei das Filter
in einer Reihenfolge auf flachen Heizplatten über eine vorgegebene Zeitspanne
erhitzt wird.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Durchführung einer
biochemischen Reaktionsabfolge bei unterschiedlichen Temperaturen
bereit und umfasst das Platzieren einer biochemischen Probe auf
einem Filter und das sequenzielle Zyklieren dieser biochemischen
Probe durch vorgegebene Temperaturveränderungen, wobei zumindest ein
Schritt in der Abfolge das Bespritzen der Probe mit einem flüssigen Reagens
oder flüssigen
Reagenzien umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die in den Zeichnungen dargestellten
Ausführungsformen veranschaulicht:
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1 ist
eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen drehbaren
Temperaturwechselgerätes
im Grundriss;
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2 ist
eine schematische Darstellung eines drehbaren Temperaturwechselgerätes aus 1 entlang
der Linie A-A gesehen;
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3 ist
eine schematische Darstellung eines Aufrisses des drehbaren Temperaturwechselgerätes aus 1;
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4 ist
eine schematische Darstellung eines Querschnittes eines Spritzelements;
und
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5 ist
eine schematische Darstellung eines Querschnittes einer Probe auf
einem Filter in einem Behälter.
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Die
vorliegende Erfindung wird hierin in Bezug auf ein drehbares Temperaturwechselgerät, das vier
Stationen, jede mit einer vorgegebenen Temperatur, umfasst, beschrieben.
Dies ist die bevorzugte Anzahl an Stationen, doch selbstverständlich könnte das
drehbare Temperaturwechselgerät
auch mehr oder weniger als vier Stationen mit vorgegebenen Temperaturen
aufweisen; dies hängt
von der speziellen Verwendung, die für das Gerät vorgesehenen ist, ab. Es
versteht sich, dass, sollten mehr als vier Stationen vorgesehen
sein, auch mehr als eine Station ein Spritzelement aufweisen kann.
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Aus
praktischen Gründen
wird der im Gerät verwendete
Behälter
allgemein als eine Schale bezeichnet. Es werden jedoch auch andere
Beispiele für
Behälter
in dieser Beschreibung offenbart.
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1 zeigt
ein drehbares Temperaturwechselgerät, das im Allgemeinen durch 1 bezeichnet wird.
Das drehbare Temperaturwechselgerät 1 weist einen Boden 2 auf,
auf dem der Drehtisch 3 platziert wird. Der Drehtisch 3 umfasst
vier Stationen, nämlich die
erste Station 4, zweite Station 5, dritte Station 6 und
vierte Station 7. Der Drehtisch 3 rotiert um eine Achse 14,
sodass eine Probe in einer Reihenfolge von einer Station zur nächsten bewegt
wird. Es versteht sich, dass die Probe geeigneterweise in einer Schale
oder einem anderen Trägergefäß platziert wird,
das in jeder Station mit der Heizplatte in Kontakt kommen soll.
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Jede
Stelle der Stationen weist eine Heizplatte auf, wobei jede Heizplatte über ein
Mittel zu unabhängigen
Kontrolle ihrer Temperatur auf dem Niveau der vorgegebenen Temperatur
verfügt.
Die vier Stationen werden symmetrisch rund um den Drehtisch 3,
d.h. in 90°-Abständen, platziert.
Die Heizplatten werden auf festgelegten Stellen auf dem Boden 2 platziert.
Die erste Station 4 weist die Heizplatte 10, die
zweite Station 5 die Heizplatte 11, die dritte
Station 6 die Heizplatte 18 und die vierte Station 7 die Heizplatte 19 auf.
Die Heizplatten rotieren nicht mit dem Drehtisch 3, sondern
der Drehtisch 3 rotiert viel eher so, dass jede Station über einer
Heizplatte platziert ist, wenn sich der Drehtisch in jeder Position
der Reihenfolge befindet. Der Drehtisch 3 rotiert nicht kontinuierlich,
sondern bewegt sich in Schritten mit einer Verweilzeit bei jedem
Schritt.
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Die
erste Station 4 ist eine offene Station, d.h. eine Station,
die für
das Platzieren von Proben auf der Station offen ist, und weist weder
ein Spritz- noch ein Heizelement auf, das mit der Station verbunden
ist, wie es für
die anderen drei Stationen der Fall ist und nachfolgend besprochen
wird.
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Die
zweite Station 5 weist ein Spritzelement 8 über der
Station auf. Das Spritzelement 8 wird in Bezug auf die
folgenden Zeichnungen noch genauer beschrieben. Der Deckelheber 9 befindet
sich angrenzend an die zweite Station 5. Der Deckelheber 9 weist
eine Deckelheberachse 17 auf, die sich um den Drehpunkt
des Deckelhebers 12 dreht. Das Ende der Deckelheberachse 17,
das gegenüber
dem Drehpunkt des Deckelhebers 12 liegt, hat einen Saugnapf zum
Deckelheben 13. Der Deckelheber 9 ist daran angepasst,
um die Deckelheberachse 17 zu rotieren, sodass der Saugnapf
zum Deckelheben 13 über
der zweiten Station 5 platziert ist. Zusätzlich dazu
ist der Deckelheber so ausgelegt, dass er sich hinunter in Richtung
der Station 5 bewegen kann. Die Arbeitsweise des Deckelhebers
wird nachstehend besprochen.
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Sowohl
die dritte Station 6 als auch die vierte Station 7 weisen
ein Heizelement, das mit den jeweiligen Station verbunden ist, auf,
das, wie hierin erörtert,
in diesen Stationen auf die Proben abgesenkt wird. Die Heizelemente
werden in 1 nicht dargestellt (siehe 2 und 3),
werden jedoch auf den Halterungen 28 bzw. 29 angebracht.
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Jede
der vier Stationen weist eine Heizplatte auf, die, wie voranstehend
besprochen, in der Position der Station platziert ist und auf einer
vorgegebenen Temperatur geregelt werden kann. Die Heizplatte wird
vorzugsweise elektrisch geheizt. Während die Temperatur jeder
der Stationen in einem weiten Temperaturbereich verändert und
auf einer solchen Temperatur geregelt werden kann, ist eine typische
Kombination aus Temperaturen der Heizplatten der vier Stationen
folgende: die erste Station mit 50°C, die zweite Station mit 50°C, die dritte
Station mit 72°C und
die vierte Station mit 96°C.
Solche Temperaturen sind typische Temperaturen bei der Anwendung
von Polymerasekettenreaktionen, die Temperaturen können jedoch
verändert
werden. Das Gerät
dieser Erfindung verfügt
vorzugsweise über
geeignete automatisierte Kontrollsysteme, die nachfolgend besprochen werden.
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2 bezieht
sich auf das Gerät
aus 1, gesehen entlang der Linie A-A. 2 stellt
das drehbare Temperaturwechselgerät 1 dar, das sich
in dem Gehäuse 20 befindet.
Das Gehäuse 20 weist
ein Gehäusefenster 21 entlang
der Stirnseite des Gerätes auf,
um das Temperaturwechselgerät
während
seiner Verwendung zu beobachten. Das Gehäuse 20 weist einen
Boden 2 auf, der von dem Unterteil des Gehäuses 20 abgehoben
ist, primär
aus praktischen Gründen
und um das Anbringen der Motoren und anderer Betriebsteile des Temperaturwechslers
unter dem Boden 2 zu ermöglichen. Die Achse 14 geht
an einer im Wesentlichen zentralen Stelle senkrecht durch den Boden 2 und
wird mit dem Antriebsmotor 22 verbunden, um die Achse 14 in
Rotation zu bringen. Der Drehtisch 3 wird mittels der Achse 14 gedreht.
Die Achse 14 könnte
daran angepasst werden, einen Träger,
mit geeigneten Lagern, für
jede der Heizelemente der dritten und vierten Station und die Spritzeinheit 8 bereit zustellen.
Normalerweise werden die Heizelemente jedoch mit den Trägern 15 und 16 verbunden.
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Die
zweite Station 5 und die dritte Station 6 werden
in der Abbildung als auf dem Drehtisch 3 platziert gezeigt.
Das Spritzelement 8 befindet sich über der zweiten Station 5,
und das erste Heizelement 31 befindet sich über der
dritten Station 6. Die zweite Station 5 weist
die Heizplatte 11 auf, welche auf dem Boden 2 platziert
ist und keinen Teil des Drehtisches 3 darstellt. Ähnlich dazu
weist die dritte Station 6 die Heizplatte 18 auf,
die ebenfalls auf dem Boden 2 platziert und nicht Teil
des Drehtisches 3 ist.
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Das
erste Heizelement 31 wird in einer teilweise abgesenkten
Position gezeigt, was auch an dem Träger 15 in der Position 15A ersichtlich
ist. Das erste Heizelement 31 weist an seiner Unterseite
einen Heizabschnitt 23 auf. Es gilt anzumerken, dass der
Heizabschnitt 23 so geformt ist, dass der Kernbereich 24 des
Heizabschnittes 23 in die dritte Station 6 eintritt,
während
der obere Teil des Heizabschnittes 23 noch über den
Umfang der dritten Station 6 hinausragt. Es ist beabsichtigt,
dass sich der Heizabschnitt 23 auf solch eine Position
absenkt, dass der Kernbereich 24 des Heizabschnittes 23 in
die dritte Station 6 eintritt. Der Zweck des Eintretens
des Kernbereiches 24 in die dritte Station 6 wird
nachstehend besprochen.
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Das
zweite Heizelement 32 wird, auf dieselbe Weise wie das
erste Heizelement 31 über
der dritten Station 6, über
der vierten Station 7 platziert.
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Das
Spritzelement 8 wird über
der zweiten Station 5 platziert. Mit dem Spritzelement 8 ist
der Deckelheber 9 verbunden. Der Deckelheber 9 weist einen
Saugnapf zum Deckelheben 13 auf, welcher über die
Deckelheberachse 17 mit dem Drehpunkt des Deckelhebers 12 verbunden
ist. Der Deckelheber 9 soll so um den Drehpunkt 12 rotieren,
dass der Saugnapf 13 über
der zweiten Station 5 platziert wird. Darüber hinaus
wird der Deckelheber 9 daran angepasst, dass er den Saugnapf 13 auf
die zweite Station 5 absenkt, um einen Deckel 25 (siehe 64 in 5) von
einer Probenschale zu heben, die in der zweiten Station 5 platziert
ist, wie nachstehend diskutiert wird. 2 zeigt
den Deckel 25, der auf dem Saugnapf 13 platziert
ist, dies jedoch in einer von der zweiten Station 5 entfernten
Position, damit so die Probe in der zweiten Station 5 mit
der Spritzflüssigkeit
aus dem Spritzelement 8 bespritzt werden kann.
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Das
Spritzelement 8 kann unterschiedlich aufgebaut sein, es
wird jedoch hier in Form eines Spritzbehälters 26, der eine
Spritzdüse 27 aufweist, dargestellt.
In dieser Ausführungsform
wird beabsichtigt, dass der Spritzbehälter 26 ein Aerosolbehälter oder
eine Pumpspritze oder eine andere Art von Spritzelement, das das
erforderliche flüssige
Reagens oder die erforderlichen flüssigen Reagenzien beinhaltet,
um damit die Probe zu bespritzen. Eine bevorzugte Ausführungsform
des Spritzelementes 8 wird in 4 gezeigt.
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3 zeigt
eine Vorderansicht des drehbaren Temperaturwechselgerätes 1.
Diese Ansicht zeigt die erste Station 4 und zweite Station 5 mit
dem ersten Heizelement 31 der dritten Station 6,
welche hinter der zweiten Station 5 platziert ist, und
dem zweiten Heizelement 32 der vierten Station 7,
welche hinter der ersten Station 4 platziert ist. Der Heizabschnitt 23 wird
mit der ersten Heizstation 31 und der Heizabschnitt 30 mit
der zweiten Heizstation 32 verbunden. Das Spritzelement 8 wird
in einer Position über
der zweiten Station 5 gezeigt. Der Deckelheber 9 wird
neben der zweiten Station 5 platziert.
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4 zeigt
einen Querschnitt einer Ausführungsform
eines Spritzelements. Das in 4 abgebildete
Spritzelement weist einen Spritzbehälter 40 auf, der mit
einem Spritzkopf 41, ein Teil dessen ist die Spritzdüse 42,
verbunden ist. Der Spritzbehälter 40 wird
zwischen den Kolben 43 und 44 platziert und durch
die Spritzhalterung 45 fixiert, welche mit den Kolben 43 und 44 verbunden
ist. Die Kolben 43 und 44 werden auf das Spritzgestell 46 aufgesetzt.
Die Kolbenstange 47 setzt an der Spritzhalterung 45 an und
endet an der Kolbenscheibe 48. Es gilt anzumerken, dass
die Spritzdüse 42 an
der Kolbenscheibe 48 anstößt. Das Spritzmittel 49 breitet
sich von der Spritzdüse 42 ausgehend
aus und kommt mit der Probe 50 in Kontakt. Es wird anerkannt, dass
mehrere Spritzelemente verwendet werden können; Beispiele hierzu werden
in den 1 und 2 und in 4 dargestellt.
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5 zeigt
einen Querschnitt einer Probe in einer Schale. Die Schale 60 beinhaltet
ein Salzkissen 61, das wie hierin erörtert optional ist. Das Filter 62 liegt
auf einem Salzkissen 61 und wird in dieser Position fixiert
und vom Deckel 64 durch einen Abstandshalter 63 getrennt.
Der Abstandshalter 63 hat günstigerweise die Form eines
O-Ringes. Es muss angemerkt werden, dass der Deckel 64 unterschiedliche
Formen aufweisen kann, auch die eines Deckels, der in oder auf eine
Schale gesteckt werden kann.
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In
der praktischen Anwendung wird eine Probe auf einen geeigneten Träger platziert,
um im Gerät verwendet
zu werden. Der Träger
ist insbesondere ein Filter, auf dem die Probe durch Standard-Filtrationstechniken
platziert wird. Ist das bestimmte zu testende Material zum Beispiel
eine Lösung,
z.B. eine Wasserprobe oder ein anderes Fluid, so könnte das Filter
in einen gewöhnlichen
Flachbodenfiltrationstrichter platziert werden und die Probe so
filtriert werden, dass sie auf dem Filter zurückbleibt. Dieser Vorgang würde zu einer
willkürlichen
Streuung der zu detektierenden Zellen bestimmter Spezies auf dem Filter
führen,
was die Detektion in einem späteren Stadium
erleichtern würde.
In alternativen Verfahren könnten
die Proben auf einer Membran, einem Objektträger, einer Mikrotiterschale
oder auf anderen geeigneten Formen platziert werden. Es versteht sich,
dass die Probe im Wesentlichen planar sein soll und von solcher
Größe, dass
sie in die im drehbaren Temperaturwechselgerät 1 verwendete Schale
passt. Es versteht sich, dass die erwähnte Schale jeglicher geeigneter
flachbödiger
Behälter
sein kann, der sich in die Stationen des Gerätes fügt und die Probe zu halten
vermag, zum Beispiel Deckplatten, Salzkissen oder jeglicher anderer
Gegenstand, der innerhalb der Schale platziert wird, welche mit
der durchgeführten Reaktion
verbunden ist.
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Um
die Polymerasekettenreaktion durchzuführen, werden Heizplatten, die
mit den Positionen des drehbaren Temperaturwechselgerätes verbunden
sind, auf vorgege bene Temperaturen erhitzt. Die erste Station könnte also
zum Beispiel eine Temperatur von 50°C aufweisen, die zweite Station
dieselbe Temperatur, die dritte Station 72°C und die vierte Station 96°C, wobei
die Temperaturen selbstverständlich hinsichtlich
der verschiedenen Reaktionstypen optimiert werden. Die Probe befindet
sich gut erreichbar in der ersten Station. Werden zwei Proben gleichzeitig
getestet, so würde
das Element manuell gedreht und die zweite Probe in die der ersten
Station gegenüberliegende
Station platziert werden. Werden vier Proben getestet, so wird das
Element manuell weiter gedreht und die Proben in jede der vier Stationen platziert
werden.
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Das
drehbare Temperaturwechselgerät
sollte vorzugsweise automatische Kontrollvorrichtungen aufweisen,
um sowohl die Temperaturen als auch andere, das Verfahren betreffende
Parameter zu kontrollieren, besonders die Verweilzeit in jeder Station, die
Dauer und zeitliche Steuerung jedes Bespritzens, das verwendet wird,
und die Anzahl der aufeinander folgenden Schritte im Reaktionsprozess.
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Die
Probe wird auf einen Drehtisch in der ersten Station platziert und
dann in die zweite Station gedreht. In der zweiten Station dreht
sich der Deckelheber 9 über
die zweite Station, und der Saugnapf zum Deckelheben 13 wird
abwärts
bewegt, um mit dem Deckel auf der Probe in Kontakt zu kommen. Der
Saugnapf 13 wird dann zurückgezogen und aus der Position
wegbewegt, wobei er den Deckel mitnimmt und so die Probe auf dem
Filter freilegt. Die Kolbenstange 47 des Spritzelements
(siehe 4) wird dann in den Kolben 43 zurückgezogen,
wobei die Kolbenscheibe 48 auf die Spritzdüse 42 drückt. Dies
aktiviert das Spritzelement, und ein flüssiges Reagens oder flüssige Reagenzien
wird auf das Filter aufgespritzt. Die Dauer des Bespritzens kann
beliebig lang sein, beträgt
normalerweise jedoch 0,5 bis 2 Sekunden, wonach das Verfahren umgekehrt
wird und der Deckel wieder auf das Filter aufgesetzt wird. Bei einer
geeigneten Zykluszeit dreht sich der Drehtisch 3 so, dass
die Probe in der dritten Station positioniert wird. In dieser Station
senkt sich das Heizelement 31 auf die Probe ab und kommt
so in Kontakt mit dem Deckel. Die Probe wird in diesem Moment von
unten durch die Heizplatte auf eine vorgegebene Temperatur, zum
Bei spiel 72°C,
und gleichzeitig von oben durch das Heizelement auf dieselbe Temperatur
erhitzt. Am Ende der Zykluszeit dreht sich der Drehtisch 3,
um die Probe in der vierten Station zu positionieren, wo sie von
unten durch die Heizplatte dieser Station auf eine vorgegebene Temperatur, zum
Beispiel 96°C,
und von oben durch das Heizelement 32 auf dieselbe Temperatur
erhitzt wird. Es versteht sich, dass die Temperaturen gemäß der jeweiligen
Reaktion optimiert werden.
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Die
Probe wird dann in die erste Station zurückgedreht und wird auf 50°C, was der
vorgegebenen Temperatur dieser Station entspricht, abgekühlt. Da
der Drehtisch 3 die Probe von der vierten in die erste
Station dreht, wird es bevorzugt, dass der Drehtisch die Probe auch
um z.B. 25–50° dreht. Dies
kann sehr einfach durch einen Klinkenschaltmechanismus an der Seite
des Drehtisches 3 erreicht werden (nicht abgebildet). Das
Drehen der Probe zur Veränderung der
Ausrichtung der Probe auf dem Drehtisch 3 gleicht jegliche
Unregelmäßigkeit
vor allem im Spritzelement, aber auch während des Erhitzens der Probe aus,
sodass nach einer Reihe von Zyklen alle Teile der Probe auf dem
Filter unter im Grunde den gleichen Bedingungen behandelt wurden.
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Beschleunigtes
Kühlen
der Probe zwischen der vierten Station, in der sich die Temperatur
zum Beispiel auf 96°C
beläuft,
und der ersten Station bei einer Temperatur von zum Beispiel 50°C kann wünschenswert
sein. Solch beschleunigtes Kühlen
könnte
die Verwendung von Kühlelementen,
Luftdüsen bzw.
Gebläsen
zwischen der vierten und ersten Station einschließen. Ein
bevorzugtes Verfahren zum Kühlen
ist die Verwendung einer Wirbelröhre
oder einer Ranque-Wirbelröhre,
um einen Strom kühlender Luft
auf die Probe zu richten. Ein Beispiel einer Wirbelröhre ist
ein EXAIRTM-Vortex von EXAIR Corporation
von Cincinatti, Ohio, die aus Edelstahl hergestellt ist.
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Das
Filter muss aus einem inerten Material, d.h. einem Material, das
unter den Einsatzbedingungen, vor allem unter der Temperatur, stabil
ist und das die Probe am Filter nicht beeinträchtigt, gefertigt sein. Ein
bevorzugtes Filter wird aus Nylon mit ei ner Porengröße von 0,2
mm hergestellt. Weist die verwendete Schale einen Durchmesser über 92 mm
auf, dann sollte das Filter geeigneterweise einen Durchmesser von
90 mm aufweisen. Bakterienproben oder andere Testobjekte werden
zwischen den Fasern des Filters (der Membran) eingefangen.
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Fremde
extrazelluläre
DNA würde
normalerweise von den Zellen durch Inkubation der Probe mit einer
Nucleaselösung,
die in einem feinen Spritzvorgang aufgetragen wird, entfernt werden.
Die Nuclease würde
dann hitzeinaktiviert und -denaturiert werden.
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Bakterienzellen
würden
normalerweise durch eine für
die erwartete Spezies geeignete Behandlung lysiert werden. Dies
könnte
einen oder mehrere der folgenden Schritte umfassen: Temperaturschock,
Enzymverdauung und Auftragen eines Detergens. Das Entfernen extrazellulärer DNA
und Lysieren von Bakterienzellen würden normalerweise durchgeführt werden,
bevor die Probe in das drehbare Temperaturwechselgerät platziert
wird.
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Es
wird bevorzugt, dass die Schale ein Salzkissen enthält, im Speziellen
eine Glasfaserfilterscheibe mit 89 mm Durchmesser, welche die für den PCR-Prozess
notwendigen gelösten
Substanzen beinhaltet. Der Abstandshalter ist geeigneterweise ein O-Ring aus Silikonkautschuk
mit einem äußeren Durchmesser
von 92 mm. Der Deckel ist vorzugsweise ein TeflonTM-Fluorpolymer-Deckel
mit einem Durchmesser von 89 mm in Form einer flachen Scheibe.
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Hierin
wird auf die Verwendung von Deckel auf den Proben Bezug genommen,
die vor dem Bespritzen mit einem Reagens entfernt und anschließend wieder
aufgesetzt werden. Hierbei können
verschiedenste Deckel, wie z.B. wie hierin bereits beschriebene
Scheiben und Deckel, die auf den Probenbehälter (die Schale) passen, verwendet
werden. Bevorzugte Deckel sind genau passend, werden jedoch in einem
gewissen Abstand zu den Proben z.B. durch die Verwendung von O-Ringen
angebracht, erlauben aber auch, dass die Heizelemente zum Kontakt
mit den Proben ab gesenkt werden, um dadurch rasche und einfache
Temperatureinstellung und Temperaturkontrolle der Probe gewährleisten
zu können. Alle
Arten von Deckel werden in dieser Beschreibung als Deckel bezeichnet,
was selbstverständlich
auch Scheiben oder andere Deckelarten umfasst.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung ist die Spritzeinheit ein kleiner Aerosolbehälter oder
eine Pumpspritze, welcher) das flüssige Reagens oder die flüssigen Reagenzien
für die
Reaktion enthält.
Ein kleiner Aerosolbehälter
für das
Reagens oder die Reagenzien ist zweckmäßig, da ein solcher Behälter einfach
durch einen anderen Behälter
mit denselben oder anderen Reagenzien zu ersetzen ist. Jedoch können auch
andere Arten von Spritzelementen in dem erfindungsgemäßen Gerät verwendet werden.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung hierin insbesondere mit Bezug auf die
Verwendung eines Spritzelementes beschrieben ist, könnten ebenfalls mehr
als ein Spritzelement in derselben oder in verschiedenen Stationen
verwendet werden. Eine programmierte Abfolge von zumindest zwei
verschiedenen Spritzmitteln könnte
zum Beispiel verwendet werden. Es versteht sich auch, dass unter
gewissen Umständen
das (die) Spritzmittel nicht in jedem der Zyklen des Gerätes verwendet
werden könnte(n).
Es kann auch mehr als ein flüssiges
Reagens verwendet werden, entweder als eine Kombination von Reagenzien
in einem Spritzelement oder als Reagenzien in getrennten Spritzelementen,
die gleichzeitig, in einer Reihenfolge in demselben Zyklus, in unterschiedlichen
Zyklen oder in einer anderer Weise aufgespritzt werden.
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Das
Gerät wurde
in dieser Beschreibung vor allem in Hinblick auf manuelles Einsetzen
und Entfernen der Flachbodenbehälter
in die und von der ersten Station beschrieben. Trotzdem versteht
es sich, dass Flachbodenbehälter
auch automatisch in die erste Station eingesetzt und davon entfernt
werden könnten,
um eine effizientere Verwendung des Gerätes und dessen Fähigkeit,
im im Wesentlichen unüberwachten
Betrieb, auch nachts, oder für
andere Gründe
zu arbeiten, zu ermöglichen.
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Das
Gerät wurde
hierin mit einer Achse 14 beschrieben, welche als Träger für Heizelemente, Spritzelemente
und dergleichen dienen könnte.
In einer bevorzugten Ausführungsform
(nicht abgebildet) wurde diese Achse 14 weggelassen, und
ein anderes Mittel wird bereitgestellt, um Heiz-, Spritz- oder andere
Elemente zu tragen. Die Auslassung der Achse 14 ermöglicht es,
dass der Drehtisch 3 ein abnehmbarer Tisch ist, wodurch
das Säubern
des Tisches selbst und unter dem Tisch sowie das Ersetzen des Tisches durch
einen anderen Tisch, z.B. einen mit Stationen von unterschiedlichen
Größen oder
Formen (z.B. rechteckige oder ovale Formen), ermöglicht wird oder auch die Anpassung
des Gerätes
an unterschiedliche Anzahlen an Stationen beschleunigt wird.
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Nach
Verwendung des drehbaren Temperaturwechselgerätes ist es notwendig, Schritte
einzuleiten, um die Reaktionsprodukte auf dem Filter zu detektieren.
In einem Beispiel solcher Schritte können Reaktionsprodukte einer
doppelsträngigen
DNA auf dem Filter mit dem SYBRTMDX-Reagens
von Molecular Probes, Inc., aus Eugene, Oregon, USA, oder einem
anderen Färbemittel,
das speziell für
doppelsträngige
DNA geeignet ist, bespritzt werden. Die gefärbten Klümpchen der doppelsträngigen DNA
fluoreszieren als Punkte auf einem dunklen Hintergrund unter ultraviolettem
(UV-) Licht. Ein Fotobild kann durch eine elektronische Kamera aufgenommen
werden und durch eine Computersoftware quantitativ analysiert werden,
um eine Zellzahl für
die Zielbakterien der ursprünglichen
Probe zu erlangen.
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Reaktionsprodukte
einzelsträngiger
DNA werden zum Hybridisieren mit einer einzelsträngigen DNA-Sequenzsonde, die
für das
erwartete Produkt spezifisch ist, untersucht. Solche Sonden können sehr
leicht durch die Verwendung von radioaktiven Markierungen oder Markierungen,
die photochemische Reaktionen wie z.B. Chemilumineszenz auslösen, oder
durch andere Verfahren detektiert werden. Dieser Test würde die
gleichzeitige Überprüfung der Echtheit
des PCR-Produkts mit der quantitativen Analyse ermöglichen.
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Es
versteht sich, dass eine große
Vielfalt an Schritten durchgeführt
werden können,
um Reaktionsprodukte auf dem Filter oder auf einem anderen verwendeten
Medium zu detektieren, identifizieren und quantifizieren.
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Die
ursprüngliche
Probe einer Suspension von Bakterienzellen oder eines anderen Materials, das
zum Testen erhalten wird, wird oft bereits vor dem Filtrieren der
Probe verdünnt.
Daher muss die erhaltene Zahlbestimmungen am Ende eines Tests, z.B.
unter Verwendung von Fluoreszenz, nachkorrigiert werden, um jegliche
Verdünnung
widerzuspiegeln.
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Unter
gewissen Bedingungen kann es wünschenswert
sein, einen oder mehrere Schritte im Vorfeld während der Herstellung einer
Probe durchzuführen,
bevor die PCR oder andere Tests in einem erfindungsgemäßen Gerät durchgeführt werden.
Eine Probe von Bakterienzellen auf einem Filter zum Beispiel könnte beispielsweise
auf Agar als Nährmedium
platziert und inkubiert werden. Die Zellen würden sich vervielfältigen,
und die daraus entstehenden Mikrokolonien würden leichter durch die PCR
in dem hier beschriebenen Gerät
detektiert werden können.
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Es
kann auch eine Mischpopulation von Zellen untersucht werden. In
einer Mischpopulation ist es möglich,
eine oder mehrere spezifische Zellarten zu detektieren, die die
Ziel-DNA beinhalten, sodass die Gegenwart oder Abwesenheit solcher
Zellarten detektiert werden kann, während andere Zellarten, die
keine Ziel-DNA beinhalten, nicht detektiert werden.
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Die
Spezifizität
der PCR hängt
erstrangig von der Wahl der Primer, die verwendet werden, um die
Ziel-DNA-Synthese zu primen, und der Strenge der Reaktionsbedingungen,
z.B. der Temperatur beim DNA-Annealing, der Konzentration der Reagenzien
und anderen Faktoren, ab. Dies könnte
die Detektion eines Trägers
eines bestimmten Gens oder auch nur jener Teile einer taxonomischen
Gruppe, die als Träger
einer DNA-Sequenzdiagnostik dieser Gruppe dienen, ermöglichen.
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Bei
der Verwendung des erfindungsgemäßen Gerätes, das
ein Spritzelement verwendet, wird ein DNA-Polymerase-Enzym in jedem
Zyklus, oder bei anderer Programmierung in der Abfolge der Verfahrensschritte
des Gerätes,
auf eine Probe gespritzt. Folglich ist es eventuell nicht mehr notwendig, ein
wärmestabiles
Enzym zu verwenden, das unter den Temperaturen, die bei der Denaturierung
verwendet werden, ausreichend stabil ist, um während des gesamten PCR-Prozesses
aktiv zu bleiben. Auch wenn das Enzym gänzlich oder teilweise bei den
Temperaturen der Denaturierung zerstört werden sollte, würde es in
der nächsten
Spritzphase erneuert werden. So könnte es nützlich sein, eher ein billigeres,
weniger wärmestabiles
Enzym und möglicherweise
mehr von solch einem Enzym zu verwenden als ein teureres Enzym,
das bei den Temperaturen der Denaturierung, die in jedem Zyklus
verwendet werden, stabil wäre.
Beispielsweise wäre
es möglich,
das Klenow-Enzym an Stelle der Taq-DNA-Polymerase in einem PCR-Prozess
unter geeigneter Anpassung der optimalen Temperatur zu verwenden und
akzeptable Ergebnisse zu erzielen.
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Während die
vorliegende Erfindung hier in besonderer Hinsicht auf die PCR erläutert wurde, könnten auch
andere Reaktionen, z.B. unter Einbindung von Bakterien, DNA-Fragmenten in Gelprofilblots,
Viren oder dergleichen, durchgeführt
werden, vorausgesetzt, dass die Proben in einer geeigneten Form
und, sofern notwendig, unter Einhaltung geeigneter Sicherheitsmaßnahmen
am Arbeitsplatz verfügbar
sind.
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Die
Heizelemente der Stationen 5 und 6 haben durch
das Verringern der zu erhitzenden Raumtiefe eine bedeutende Auswirkung
auf die Geschwindigkeit, mit der die Probe die erforderliche Temperatur
erreicht. So dehnt sich das zu erhitzende Volumen vom Deckel zum
Boden der Schüssel
aus, die gleichzeitig von unten erhitzt wird. In der vorliegenden
Erfindung ist das Volumen gering.
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Ein
wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, dass die Geschwindigkeit
des Zyklierens erhöht
werden kann, da jede Station ihre vorgegebene Temperatur beibehält, und
dass es nicht notwendig ist, die Temperatur eines Metallblocks in
jedem Zyklus häufig
zu wechseln.
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Das
Gerät und
das Verfahren der vorliegenden Erfindung können in einer Vielfalt von
Tests verwendet werden. Beispiele solcher Tests umfassen die Detektion
der Gegenwart von E. coli, Listeria, Salmonella und anderen Bakterien
unter Verwendung von Reagenzien, die für die Detektion solcher Bakterien
bekannt sind. Das Gerät
und die Verfahren der Erfindung können auch in anderen Testarten
verwendet werden, die das Zyklieren von Temperaturen und das Bespritzen
mit Reagenzien erfordern. Das Gerät und die Verfahren könnten zum
Beispiel für
manche Metallkatalysatorreaktionen, z.B. für Platin-katalysierte Reaktionen
unter Verwendung von Wasserstoffperoxid, für andere Reaktionen, die unter
Temperaturwechsel erfolgen, für
die Bildung von geschichteten Polymerstrukturen, in denen dünne Schichten eines
z.B. wärmehärtbaren
Polymers in jedem Zyklus polymerisiert werden, und für Detektionstechniken, die
mit Temperaturwechselverfahren arbeiten, verwendbar sein.