DE69917888T2 - Biosensoranordnung mit zellpopulationen in räumlich begrenzten mikrohohlräume - Google Patents

Biosensoranordnung mit zellpopulationen in räumlich begrenzten mikrohohlräume Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Biosensoren, Biosensoranordnungen und Messgeräte sowie Messverfahren zur Analyse von chemischen und biologischen Materialien. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Biosensoren, Biosensoranordnungen, Messgeräte und Messverfahren, bei denen Zellen und Mischpopulationen von Zellen zur Analyse von chemischen und biologischen Materialien verwendet werden.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es ist allgemein anerkannt, dass wichtige technische Fortschritte in der Chemie, Biologie und Medizin durch die Möglichkeit begünstigt werden, winzige Probenmengen einer Mikroanalyse zu unterziehen. Die Durchführung von analytischen Messungen an winzigen Mengen war jedoch aufgrund von Schwierigkeiten bei der Handhabung von kleinen Probenvolumina, Isolierung von Analyten und Mikroanalyse von einzelliger Physiologie lange Zeit sehr schwierig.
  • Untersuchungen an Nanoliter-, Picoliter- und Femtoliter-Volumina sind bei verschiedensten Anwendungen durchgeführt worden, die In-vitro- und In-vivo-Zelluntersuchungen [R.M. Wightman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 10754 (1991); R.H. Chow et al., Nature 356, 60 (1992); T.K. Chen et al., Anal. Chem. 66, 3031 (1994); S.E. Zerby et al., Neurochem. 66, 651 (1996); P.A. Garis et al., J. Neurosci. 14, 6084 (1994); G. Chen et al., J. Neurosci. 15, 7747 (1995)], Elektrochemie [R.A. Clark et al., Anal. Chem. 69(2), 259 (1997)], matrixbasierte Laser-Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie [S. Jespersen et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 8, 851 (1994)], Mikrosäulen-Flüssigchromatographie [I.A. Holland et al., Anal. Chem. 67, 3275 (1995); M.D. Oates et al., Anal. Chem. 62, 1573 (1990)], Mikrotitration [M. Gratzl et al., Anal. Chem. 65, 2085 (1993); C. Yi et al., Anal. Chem. 66, 1976 (1994)] und Kapillarelektrophorese [M. Jansson et al., J. Chromatogr. 626, 310 (1992); P. Beyer Hietpas et al., J. Liq. Chromatogr. 18, 3557 (1995)] umfassen.
  • Clark et al. [Anal. Chem. 69(2), 259 (1997)] offenbarten ein Verfahren zur Herstellung von Picoliter-Mikrophiolen für elektrochemische Mikroanalysen unter Verwendung herkömmlicher photolithographischer Maskierung und Photoresistverfahren, um Polystyrol-Mikrophiolen auf Siliciumwafermatrizen transferzupressen. Diese Mikrophiolen weisen aufgrund der Schwierigkeit bei der Regelung der Resistätzung der Formoberfläche und des Transferpressverfahrens typischerweise ungleichförmige Größe und Gestalt auf.
  • Park et al. [Science 276, 1401 (1997)] offenbarten ein modifiziertes lithographisches Verfahren zur Herstellung von Anordnungen von Löchern in Nanometergröße unter Verwendung von geordneten Polystyrol-Polybutadien-Diblockcopolymeren als Masken beim reaktiven Ionenätzen von Siliciumnitrid. Dieses Mehrschrittverfahren ermöglicht die Herstellung von Anordnungen von Löchern in Picolitergröße, die typischerweise einen Durchmesser von 20 nm und eine Tiefe von 20 nm aufweisen, in einem Abstand von 40 nm. Lochdichten von bis zu 1011 Löchern/cm2 sind offenbart. Der Größen- und Abstandsbereich der durch dieses Verfahren hergestellten Löcher ist durch die Größe der Copolymer-Mikrodomänen beschränkt. Gleichförmige Lochgrößen und Abstände können bei diesem Verfahren aufgrund von Schwierigkeiten bei der Regelung des zum Ausbilden der Löcher eingesetzten Ätzverfahrens nur schwer aufrecht erhalten werden.
  • Deutsch et al. [Cytometry 16, 214 (1994)] haben eine poröse galvanisierte Nickel-Mikroanordnung offenbart, die aus konischen Löchern in Mikrometergröße in einer geschwärzten Nickelplatte besteht. Die Lochgrößen reichen von einem oberen Durchmesser von 7 μm bis zu einem unteren Durchmesser von 3 μm bei einer Tiefe von 8 μm. Die Anordnung wird als Zellträger zum Einfangen von einzelnen Zellen verwendet, wobei die Reaktionen einzelner Zellen auf Veränderungen in ihrer Mikroumgebung untersucht werden. Im US-Patent 4.772540 haben Deutsch et al. auch ein Verfahren zur Herstellung solch einer Anordnung unter Verwendung eines kombinierten Photoresist- und Galvanisierungsverfahrens offenbart.
  • Corning Incorporated (Corning, NY, USA) (FR-A-2 741 357) offenbart ein Verfahren zur Herstellung und Anwendung einer Trägerplatte für ein dichtes zweidimensionales Netz von Mikrovertiefungen mit sehr kleinen Abmessungen aus einem thermoformbaren Material, wie beispielsweise Kunststoff oder Glas. Die Mikrovertiefungen sind in einem Abstand von etwa 100 μm mit einer Dichte von 104 Vertiefungen/cm2 angebracht und weisen eine Tiefe von 20 μm und einen unteren Durchmesser von 40 μm auf.
  • Corning Costar Corp. (Acton, MA, USA) stellt unter dem Markennamen PixWellTM kommerziell eine Anordnung von Mikrovertiefungen für miniaturisierte Tests her. Diese Anordnungen bestehen aus winzigen geformten Glasplatten und umfassen 20 μm tiefe verjüngte Vertiefungen mit einem Durchmesser von 40 μm in einer Dichte von 4356 Vertiefungen/cm2.
  • Mikrovertiefungsanordnungen sind besonders bei der Untersuchung von lebenden Zellen nützlich. In der Zellforschung ist es wünschenswert, die Reaktionen einzelner Zellen auf Veränderungen oder Manipulationen ihrer lokalen Umgebung zu messen. Jedes Verfahren oder Gerät, das für solche Untersuchungen bestimmt ist, muss die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechterhalten, die Position einzelner Zellen identifizieren und Reaktionsmessungen mit einzelnen Zellen korrelieren können.
  • Aufgrund der Verfügbarkeit von lebensfähigen fluoreszierenden Sonden für intrazelluläre Untersuchungen sind Fluoreszenzmessungen an lebenden Zellen von bedeutendem Nutzen bei der Untersuchung von Zellfunktionen. Somit werden optische Fluoreszenzmessungen häufig bei Zelluntersuchungen eingesetzt, wobei drei generische Messverfahren für Zellen zur Verfügung stehen: Massenmessungen an Zellpopulationen, dynamische Messungen an Zellpopulationen oder einzelnen Zellen und statische Messungen an einzelnen Zellen.
  • Die Eigenschaften einer gesamten Zellpopulation als Ganzes kann mithilfe von Massenmessungen an Probenvolumina untersucht werden, die mehrere Zellen umfassen. Dieses Verfahren wird bevorzugt, wenn Zellpopulationen sehr homogen sind. Eine im Allgemeinen anerkannte Einschränkung dieses Verfahrens besteht in der Gegenwart von Hintergrundfluoreszenz, welche die Empfindlichkeit von Messungen verringert, und der Unmöglichkeit, Unterschiede oder Heterogenität innerhalb einer Zellpopulation zu unterscheiden.
  • Durchflusszytometrieverfahren werden häufig eingesetzt, um Probleme mit Hintergrundfluoreszenz zu verringern, die bei Massenzellpopulationsmessungen auftreten [M.R. Gauci et al., Cytometry 25, 388 (1996); R.C. Boltz et al., Cytometry 17, 128 (1994)]. Bei diesen Verfahren wird die Fluoreszenzemission einer Zelle gemessen, während Zellen mithilfe eines laminar fließendem Fluids durch einen Anregungslichtstrahl befördert werden. Durchflusszytometrieverfahren können mit statischen Verfahren kombiniert werden, um eine kleine Anzahl an Zellen zuerst auf einem Substrat zu sortieren und abzuscheiden, um danach statische Zellmessungen durchzuführen [US-Patent Nr. 4.009.435 von Hogg et al.; Kanz et al., Cytometry 7, 491 (1986); Schildkraut et al., J. Histochem. Cytochem. 27, 289 (1979)].
  • Gauci et al. offenbaren ein Verfahren, bei dem Zellgröße, -form und -volumen durch Lichtstreuung gemessen werden, und Fluoreszenzfarbstoffe werden verwendet, um den Proteingehalt und den gesamten Nucleinsäuregehalt von Zellen zu bestimmen. Dieses Verfahren ermöglicht außerdem die Zählung und Größenbestimmung verschiedener Zellen mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 Zellen pro Sekunde.
  • Durchflusszytometrieverfahren sind im Allgemeinen auf kurzzeitige einzelne Messungen an einzelnen Zellen beschränkt. Wiederholte Messungen an derselben Zelle über einen längeren Zeitraum sind bei diesem Verfahren nicht möglich, da typische Verweilzeiten einer Zelle im Anregungslichtstrahl bei einigen wenigen Mikrosekunden liegen. Außerdem verringert die geringe kumulative Intensität von Fluoreszenzemis sionen einer einzelnen Zelle während solch kurzer Messzeiten die Genauigkeit und schränkt die Verlässlichkeit solcher Messungen ein.
  • Regnier et al. [Trends in Anal. Chem. 14(4), 177 (1995)] offenbaren ein invasives, elektrophoretisch vermitteltes Mikroanalyseverfahren für Untersuchungen an einzelnen Zellen. Das Verfahren verwendet einen verjüngten Mikroinjektor am Injektionsende einer Kapillarelektrophoresesäule, um die Membran einer einzelnen Zelle zu durchstechen und eine Zytoplasmaprobe zu entnehmen. Mithilfe des Verfahrens kann der Zellgehalt jeweils einer Zelle gemessen werden. Das Verfahren ist im Allgemeinen auf die Detektion von leicht oxidierten Spezies beschränkt.
  • Hogan et al. [Trends in Anal. Chem. 12(1), 4 (1993)] offenbaren ein Mikrosäulen-Trennverfahren, das in Kombination mit entweder einem herkömmlichen Gaschromatographie-Massenspektrometer, Mikrodünnschichtchromatographie oder Hochdruckflüssigkeitsmanipulation an kleinen Zellvolumina verwendet werden kann. Die Empfindlichkeit des Verfahrens ist begrenzt und kann eventuell die Vorauswahl von Zielverbindungen für eine Detektion erfordern.
  • Im Allgemeinen werden statische Verfahren für Messungen an einzelnen Zellen bevorzugt. Messverfahren reichen von der Beobachtung einzelner Zellen mithilfe eines herkömmlichen optischen Mikroskops bis zur Verwendung von Laserrastermikroskopen mit computergestützten Bildanalysesystemen [siehe L. Hart et al., Anal. Quant. Cytol. Histol. 12, 127 (1990)]. Solche Verfahren erfordern normalerweise die Aufbringung einzelner Zellen auf ein Substrat, bevor die eigentlichen Messungen durchgeführt werden. Üblicherweise treten Probleme beim Binden einzelner Zellen oder einzelner Zellschichten an Substrate und beim Halten der Zellen an einer fixen Position während einer Analyse oder Manipulation der Mikroumgebung der Zelle auf. Außerdem erfordern wiederholte Messungen an einzelnen Zellen typischerweise ein physikalisches schrittweises Indexieren einzelner Zellen und die Bereitstellung eines Mechanismus zum aufeinanderfolgenden Scannen einer jeden Zelle und zum Zurückführen der indexierten Zellen für eine erneute Analyse einzelner Zellen.
  • Huang et al. [Trends in Anal. Chem. 14(4), 158 (1995)] offenbaren ein statisches elektrochemisches Verfahren und eine Elektrode zur Überwachung der biochemischen Umgebung einzelner Zellen. Das Verfahren erfordert die Herstellung und die manuelle Positionierung eines Mikrobezugselektrode und einer Arbeitselektrode innerhalb der Zelle. Das Verfahren wurde verwendet, um Insulin, Stickstoffoxid und Glucose in einzelnen Zellen oder außerhalb der Zellen zu detektieren. Seine Verwendung ist im Allgemeinen auf die Untersuchung von Redoxreaktionen in Zellen beschränkt.
  • Ince et al. [J. Immunol. Methods 128, 227 (1990)] offenbaren eine aus einer geschlossenen Kammer bestehende Vorrichtung zur Untersuchung einzelner Zellen unter kontrollierten Umgebungen. Dieses Verfahren verwendet eine Mikroperfusionskammer, die extreme Umgebungsbedingungen für Zelluntersuchungen schaffen kann. Einzelne Zellen werden mithilfe zweier Deckgläser am Platz gehalten, während verschiedene Lösungen durch die Kammer geleitet werden. Eine Beschränkung des Verfahrens besteht in der Schwierigkeit, eingeschlossene Gasbläschen zu entfernen, die einen hohen Grad an Autofluoreszenz verursachen und so die Empfindlichkeit der Messungen aufgrund von Hintergrundfluoreszenz verringern.
  • In einem Versuch, die Einschränkungen herkömmlicher statischer Verfahren zu überwinden, haben Deutsch et al. [Cytometry 16, 214 (1994)] und Weinreb und Deutsch in den US-Patenten Nr. 4.729.949, 5.272.081, 5.310.674 und 5.506.141 ein Gerät und ein Verfahren für wiederholte optische Messungen an einzelnen Zellen innerhalb einer Zellpopulation offenbart, bei dem die Position jeder Zelle während einer Manipulation der Zellenmikroumgebung beibehalten wird.
  • Ein zentrales Merkmal des von Deutsch et al. offenbarten Geräts ist ein Zellträger, der eine zweidimensionale Anordnung von Öffnungen oder Auffangbehältern umfasst, die konisch geformt sind, um einzelne Zellen durch Anlegen eines Unterdrucks aufzunehmen und zu halten. Der Zellträger wird typischerweise mithilfe des im US- Patent 4.772540 von Deutsch et al. offenbarten kombinierten Galvanisierungs-Photoresist-Verfahrens hergestellt. Der Zweck des Zellträgers besteht in der Bereitstellung eines Mittels, um die Zellen an fixen Positionen der Anordnung zu halten, während die Zellumgebung manipuliert wird. Einzelne Zellen werden durch Saugung in Zellträgerlöcher gedrängt, wonach die Vertiefungen mit einem polarisierten Lichtstrahl mit geringer Intensität beleuchtet werden, der rückgestrahlte Polarisation und Intensität liest. Messungen werden verglichen, wenn zwei unterschiedliche Reagenzien nacheinander mit den Zellen zur Reaktion gebracht werden. Das offenbarte Verfahren erfordert zwei separate Zellträger für eine Grundlinienkontrolle und eine Analytenmessung.
  • Das Verfahren und die Vorrichtung von Deutsch et al. wurden von Pathologen in Diagnosetests verwendet, um die Gesundheit und Lebensfähigkeit von Zellproben zu bestimmen, die von Patienten entnommen wurden. Das Verfahren und die Vorrichtung wurden sowohl bei Krebs-Screening [Deutsch et al., Cytometry 16, 214 (1994), Cytometry 23, 159 (1996), und European J. Cancer 32A(10), 1758 (1996)] als auch bei rheumatoider Arthritis [Zurgil et al., Isr. J. Med. Sci. 33, 273 (1997)] verwendet, bei denen Fluoreszenzpolarisationsmessungen verwendet werden, um Lymphozyten von malignen und gesunden Zellen aufgrund von Veränderung der Eigenviskosität und der Strukturiertheit der Zytoplasmamatrix, die durch Tumorantigene und Mitogene induziert werden, zu unterscheiden.
  • Das Verfahren und die Vorrichtung von Deutsch et al. erfordern den Einsatz eines Scanning-Tischs, der von drei Schrittmotoren und einem Computerregelsystem zum Kartieren, schrittweisen Indexieren und Positionieren einzelner Zellen im Zellträger betrieben wird. Die Verwendung solcher mechanischer Scanning-Verfahren bringt aufgrund herkömmlicher mechanischer Probleme mit Totgang und der reproduzierbaren Positionierung einzelner Zellen für wiederholte Messungen Einschränkungen in Bezug auf die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit von Messungen mit sich. Außerdem verlängert das mechanische Scannen der gesamten Anordnung die Messdauer jeder Zelle in der Anordnung.
  • Das von Deutsch et al. offenbarte Verfahren ist außerdem durch die Verwendung von Fluoreszenz-Polarisationsmessungen beschränkt, die aufgrund des bedeutenden Einflusses verschiedener Komponenten des optischen Systems auf die Polarisation, wenn die Fluoreszenzemissionsreaktion vom Zellträger zu den optischen Detektoren geleitet wird, bestimmte immanente Einschränkungen mit sich bringen. Birindelli et al. [European J. Cancer 33(8), 1333 (1997)] haben ebenfalls Einschränkungen dieses Verfahrens identifiziert, die auf Fluktuationen von Elektropolarisationswerten zurückzuführen sind, weshalb Mittelwerte von zumindest drei Massscans für jede Bedingung genommen werden müssen, um verlässliche Messungen zu erhalten. Darüber hinaus sind Polarisationsmessungen bei Zelluntersuchungen im Allgemeinen auf Zellreaktionen beschränkt, die ausreichende Veränderungen in der Zytoplasmaviskosität hervorrufen, um eine detektierbare Veränderung der Polarisation zu erzeugen. Da nicht alle Zellreaktionen von detektierbaren Viskositätsveränderungen begleitet werden, ist das Verfahren weiters auf Zellaktivitäten beschränkt, die solche Viskositätsveränderungen im Zytoplasma verursachen.
  • Zare et al. [Science 267, 74 (1995); Biophotonics International, März-April, S. 17 (1995)] offenbaren ein Biosensorsystem, das auf der Reaktion von lebenden Zellen auf komplexe biologische Materialien basiert, die durch ein Mikrosäulentrennverfahren fraktioniert wurden. Zellen, die auf einem Deckglas positioniert wurden, wurden mit einer Fluoreszenzsonde behandelt, wonach sie gegenüber einer Reihe von biologischen Verbindungen, einschließlich Acetylcholin, Bradykinin und Adenosintriphosphat, sowie Veränderungen von intrazellulären Calciumwerten empfindlich waren.
  • Yeung et al. [Acc. Chem. Res. 27, 409 (1994)] haben eine Reihe von Verfahren für Untersuchungen von Reaktionen einzelner Zellen beschrieben und basierend auf Analytenmessungen eine bedeutende Variation und Heterogenität innerhalb von Zellpopulationen beobachtet. Sie offenbaren beispielsweise ein Kapillarelektrophoreseverfahren, um Zellen biologisch reaktiven Verbindungen auszusetzen, die intrazelluläre Flüssigkeit einzelner Zellen, die als Reaktion auf solche Verbindungen produ ziert wurden, zu extrahieren und Analyten von Migrationszeiten in der Kapillarsäule zu identifizieren. Andere auf Fluoreszenz basierende Tests sind ebenfalls offenbart. Bedeutende Zell-Zell-Variationen und Heterogenität bei Reaktionen einzelner Zellen innerhalb einer Zellpopulation wurden beobachtet, und diese Unterschiede könnten ein Mittel zur Unterscheidung zwischen biologischen und chemischen Verbindungen in Kontakt mit einzelnen Zellen sein.
  • Shimadzu Corporation (Japan) (EP-A-0 539 888) offenbart eine Vorrichtung zur Selektion von körnigen Zellen („granular cells") oder Mikroorganismen unter Verwendung eines Detektors zur Messung der optischen Dichte der Zellen. Die gespeicherten Informationen werden von einer Regelvorrichtung verwendet, um ein Aufnahmeelement zu bewegen, das die gewünschten Zellen aufnimmt. Die ausgewählten Zellen können dann für weitere Analysen oder Bearbeitungen abgegeben werden.
  • McConnell et al. [Science 257, 1906 (1992)] offenbaren eine Mikrophysiometervorrichtung, die als "Cytosensor" bekannt ist und einen lichtadressierbaren Potentiometersensor umfasst, um die Geschwindigkeit zu messen, mit der Zellen ihre Umgebung acidifizieren. Dieser Sensor dient als miniaturisierte pH-Elektrode zur Überwachung von Zellreaktionen, die detektierbare Veränderungen des lokalen pH auslösen. Die offenbarte Vorrichtung ist auf die Messung von Protonenabgaben von Zellen beschränkt und somit nur zur Detektion von sauren Zellreaktionen auf Analyten fähig.
  • Das US-Patent Nr. 5.177.012 von Kim et al. offenbart einen Biosensor zur Bestimmung von Glucose und Fructose. Der Biosensor wird durch die Behandlung ganzer Zellen mit einem organischen Lösungsmittel und die Immobilisierung der behandelten Zellreste auf einem Träger hergestellt, um eine Ganzzellenmembran zu bilden, die auf eine pH-Elektrode aufgetragen wird.
  • Treuhänder des Tufts-College (USA) (WO 99/18434) offenbaren ein auf Mikrokügelchen basierendes Analysesystem. Selbskodierende Mikrokügelchen mit unterschied lichen optischen Reaktionen auf spezifische Zielanalyte können miteinander vermischt werden, wobei das Vermögen, die Art und Position der Mikrokügelchen zu identifizieren, beibehalten wird. Außerdem ist ein Lichtwellenleiterbündelsensor offenbart, in dem einzelne Mikrokügelchensensoren in Mikrovertiefungen am distalen Ende des Faserbündels positioniert und mit einzelnen Fasern oder Fasergruppen innerhalb des Bündels optisch gekoppelt sind. Dieses Dokument fällt unter Art. 54(3) EPÜ.
  • Das US-Patent Nr. 5.690.894 von Pinkel et al. offenbart einen Biosensor, der biologische "Bindungspartner", also Materialien, wie beispielsweise Nucleinsäuren, Antikörper, Proteine, Lectine und andere von Zellen, Geweben, natürlichen oder genetisch veränderten Organismen stammende Materialien verwendet. Diese Stoffe werden zusammen mit einer Faseroptikanordnung verwendet, in der jede Bindungspartnerspezies auf einzigartige Weise von einer Fasergruppe innerhalb des Faseroptikbündels adressiert wird, das an einen optischen Detektor gekoppelt ist. Die Anordnung wurde zum Screenen umfassender Anordnungen von biologischen Bindungspartnern entworfen.
  • Während viele der Verfahren gemäß dem Stand der Technik die Analyse von entweder einzelnen Zellen oder Zellpopulationen bereitstellen und einige dieser Verfahren die Überwachung von Zellreaktionen auf Zielanalyten ermöglichen, ist bei keinem der offenbarten Verfahren die Verwendung großer Monokulturpopulationen oder gemischter Populationen von lebenden Zellen zur gleichzeitigen Überwachung der Reaktionen einzelner Zellen auf biologische Stimuli von chemischen und biologischen Analyten möglich. Somit besteht Bedarf an einer Biosensoranordnung und einem Verfahren, welche die Fähigkeit von Populationen von lebenden Zellen effizient nutzen, auf biologisch bedeutende Verbindung auf einzigartige und detektierbare Weise zu reagieren. Da die Selektivität von lebenden Zellen in Bezug auf solche Verbindungen beim Screenen von Arzneimitteln und bei der Analyse von komplexen biologischen Fluiden sehr wertvoll und nützlich ist, würde ein Biosensor, der die einzigartigen Eigenschaften von Populationen lebender Zellen nutzt, bedeutende Vorteile beim Hochdurchsatzscreening von kombinatorischen Bibliotheken mit sich bringen, bei dem hunderttausende mögliche pharmazeutische Verbindungen evaluiert werden müssen. Außerdem wäre solch ein Sensor auch bei der Überwachung von Bioprozessen und Umweltverschmutzung nützlich, wobei die erhöhte Empfindlichkeit von lebenden Zellen gegenüber ihrer Umwelt genutzt werden kann.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Im Allgemeinen stellt die Erfindung einen Biosensor und eine Biosensoranordnung gemäß den Ansprüchen zur Analyse von chemischen und biologischen Materialien bereit. Genauer gesagt stellt die Erfindung Biosensoren und Biosensoranordnungen, Messgeräte und Messverfahren bereit, bei denen lebende Zellen und Mischpopulationen von lebenden Zellen zur Analyse von chemischen und biologischen Materialien verwendet werden.
  • Die Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung umfasst entweder eine Monokultur von lebenden Zellen oder willkürlich gemischte Populationen von lebenden Zellen, worin jede einzelne Zelle in der Anordnung an einer optisch adressierbaren, einzelnen Stelle auf einem Substrat positioniert ist, welche die Größe und Form der einzelnen Zellen akkommodiert. In einer Ausführungsform umfasst die einzelne Stelle eine Mikrovertiefung oder einen Mikrohohlraum, die/der so ausgebildet ist, dass sie/er die Größe und Gestalt der einzelnen Zellen aufnehmen kann. Das Messverfahren der Biosensoranordnung basiert auf der allgemein bekannten Tatsache, dass einzelne Zellen, die durch die Gegenwart eines biologischen oder chemischen Materials in der Zellumgebung chemisch oder biologisch stimuliert werden, reagieren, indem sie eine Veränderung in der Zelle oder Zellumgebung auslösen, die in der Zelle selbst oder von einer Indikatorverbindung, beispielsweise einem Fluorophor, Chromophor oder Farbstoff, der entweder an die Zelle gebunden ist, von der Zelle aufgenommen ist oder zur lokalen Zellumgebung zugesetzt wurde, optisch abgefragt und detektiert werden kann. Der Biosensor der vorliegenden Erfindung macht sich so die Fähigkeit lebender Zellen zunutze, auf biologisch bedeutende Verbindungen zu rea gieren. Da die Selektivität von lebenden Zellen für solche Verbindungen beim Screenen vom Arzneimitteln und bei der Analyse von komplexen biologischen Fluiden sehr wertvoll und nützlich ist, bietet der Biosensor der vorliegenden Erfindung bedeutende Vorteile beim Hochdurchsatzscreening von kombinatorischen Bibliotheken, bei dem hunderttausende mögliche Verbindungen evaluiert werden müssen.
  • Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sein wird, können verschiedenste Substratmaterialien und Substratkonfigurationen für die Biosensoranordnung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Jedes Substrat oder Material, das so angepasst werden kann, dass es einzelne Stellen bereitstellt, die zur Bindung oder Aufnahme von einzelnen Zellen geeignet sind, und das eine optische Abfrage der Zellenanordnung und eine Detektion von Zellreaktionen ermöglicht, wäre hervorragend als Substrat für die Anordnung geeignet. Mögliche Substratmaterialien umfassen Glas, Polymere, Keramiken, Metalle und Verbundstoffe aus diesen Materialien, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die Oberflächengeometrie des Substrats kann eben, kugelförmig, konkav, konvex und strukturiert sein. Vorzugsweise wäre ein geeignetes Substrat so konfiguriert, dass es eine optische Abfrage der Anordnung und eine Detektion der Zellreaktionen auf Analyten von Interesse ermöglicht.
  • Die Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung ist in eine Faseroptikanordnung inkorporiert, die als Substrat zur Platzierung der Zellen dient. Mit "Faseroptikanordnung" oder grammatischen Äquivalenten sind hierin mehrere einzelne Fasern oder Faserstränge gemeint, die entweder als diskrete, einzelne Fasern in einem Faserbündel zusammengefasst oder alternativ dazu entlang ihrer axialen Abmessungen als vorgebildete einheitliche Faseroptikanordnung zusammengefügt sind. Die einzelnen Fasern in solch einer Anordnung können in einer einheitlichen oder kohärenten Konfiguration angeordnet, beispielsweise in einer Abbildungsfaser, oder willkürlich ausgerichtet und inkohärent sein. Wenn eine Faseroptikanordnung als Sensorsubstrat verwendet wird, wird das distale Ende jeder Faser in einem Faseroptikbündel oder einer Faseroptikanordnung chemisch geätzt, um einen Hohlraum oder eine Mikrovertiefung zu schaffen. Eine schematische Darstellung des Konzepts der Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung ist in 1 zu sehen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden einzelne lebende Zellen aus entweder einer Monokultur von Zellen oder einer Mischpopulation von Zelllinien in den Mikrovertiefungen eingesetzt. Die Mikrovertiefungen werden durch anisotropes Ätzen der Kerne der einzelnen Fasern im Faserbündel oder in der Faseranordnung ausgebildet. Die Mikrovertiefungen werden gebildet, indem das Ätzverfahren so geregelt wird, dass ein zentraler Kernabschnitt der einzelnen Faserstränge entfernt wird, während die äußere Hülle intakt bleibt. Der resultierende geätzte Hohlraum ist so bemessen, dass eine einzelne Zelle darin aufgenommen werden kann. Durch die Auswahl eines Faseroptikbündels oder einer Faseroptikanordnung, worin die einzelnen Faserkerne eine angemessene Größe aufweisen, und durch eine exakte Kontrolle der Ätzbedingungen können der Durchmesser und die Größe der Mikrovertiefungen innerhalb jedes beliebigen geeigneten Abmessungsbereichs geregelt werden, so dass sie mit der Größe jeder gewünschten Zellart abgestimmt sind.
  • In einer Ausführungsform können entweder einzelne Substratstellen oder die inneren Oberflächen der Mikrovertiefungen mit einem dünnen Film aus biologisch verträglichen Material, wie z.B. Collagen, Fibronectin, Polylysin, Polyethylenglykol, Polystyrol, oder einem Metall, wie z.B. Gold, Platin oder Palladium, beschichtet sein. In einer alternativen Ausführungsform kann eine Indikatorverbindung, wie beispielsweise ein Fluorophor, ein Chromophor oder ein Farbstoff, an die Oberfläche der Mikrovertiefung gebunden sein, um Zellreaktionen auf chemische oder biologische Stimulation zu detektieren.
  • Indem ein Biosensor in eine Faseroptikanordnung aufgenommen wird, stellt die vorliegende Erfindung die Innovation einer optischen Kopplung einzelner Zellen an einzelnen Substratstellen oder in Mikrovertiefungen mit diskreten Detektorelementen, CCD-Kameras oder einzelnen optischen Fasern in einer Faseroptikanordnung oder einem Bündel, die in optischer Kommunikation mit solchen Vorrichtungen sind, bereit. Mit "optischer Kopplung", "optischer Kommunikation" oder "optischer Kooperati on" oder grammatikalischen Äquivalenten ist hierin die Fähigkeit gemeint, entweder einzelne Zellen innerhalb der Biosensoranordnung mit Anregungslicht optisch zu stimulieren oder die optische Reaktion einzelner Zellen in der Anordnung auf Analyten optisch abzufragen, indem Licht unter Verwendung entweder herkömmlicher Lichtwegelemente oder optischer Fasern zu und von einzelnen Zellen an diskreten Stellen innerhalb der Anordnung geleitet wird. Da typische Faseroptikanordnungen tausende diskrete einzelne Faserstränge enthalten, ermöglicht die Erfindung somit die individuelle optische Kopplung und Abfrage von tausenden Zellen innerhalb einer Anordnung, wodurch sie die Messung sehr vieler unabhängiger Zellreaktionen innerhalb einer Zellpopulation in einer Anordnung erlaubt. Aufgrund sowohl der Anzahl an verfügbaren Zellpopulationen als auch der entsprechend großen Anzahl an einzelnen Zellen innerhalb jeder Zellpopulation besteht eine bedeutende Innovation der vorliegenden Erfindung in der Möglichkeit, die charakteristischen optischen Reaktionssignaturen mehrerer unabhängiger Messungen an Zellen innerhalb jeder Zellpopulation zu summieren und zu amplifizieren, wodurch die Detektionslimit und die Empfindlichkeit des Biosensors verbessert werden.
  • Eine weitere Innovation der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass durch den Einsatz einer großen Anzahl an Zellpopulationen innerhalb der Anordnung und durch die Bereitstellung einer großen Anzahl an einzelnen Zellen in jeder Population die Unterscheidungsfähigkeiten der Biosensoranordnung gegenüber biologischer und chemischer Analyten durch die Bereitstellung tausender Zellreaktionen von einer großen Anzahl an Zellpopulationen bedeutend verbessert wird. Dieses Merkmal ahmt direkt das tatsächliche Verhalten des menschlichen Geruchssystems nach, bei dem die kombinierten Signale von tausenden Rezeptorzellen, wobei in jeder Gruppe in der Epithelschicht fast tausend unterschiedliche Rezeptorzelltypen vorhanden sind, von denen keine von sich aus besonders empfindlich ist, zu einer weitaus verstärkten Sinnesreaktion auf Gerüche führen [siehe Kauer et al., Trends Neurosci. 14, 79 (1991)]. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ahmt so den evolutionären Geruchsverstäkungsvorgang nach, der im menschlichen Geruchssystem gefunden wurde, um die Empfindlichkeit der Biosensoranordnung gegenüber Analyten bedeutend zu verbessern, indem die schwachen Reaktionen einer großen Anzahl an Zellen in der Biosensoranordnung summiert werden. Durch das Summieren der Reaktionen mehrerer Zellen bei geringen Analytenkonzentrationen kann eine bedeutende Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses erreicht werden und eine entsprechende Verringerung des Detektionslimits der Biosensoranordnung erhalten werden.
  • Ein einzigartiges Merkmal der Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung besteht darin, dass jede einzelne Zelle und Zellpopulation in der Anordnung kodiert werden kann, um die Zelltypidentität und Position beizubehalten, wenn willkürlich vermischte Zellpopulationen verwendet werden. Zellen können kodiert werden, bevor sie in Mikrovertiefungen gegeben werden, oder nach der Platzierung in den Mikrovertiefungen. Die Erfindung stellt entweder eine Kodierung von willkürlich vermischten einzelnen Zellen und Zellpopulationen mit einer fluorophoren oder chromophoren Farbstoffverbindung oder alternativ dazu die Verwendung von selbstkodierenden Zellen bereit, die entweder von Natur aus fluoreszieren oder genetisch verändert wurden, um zu fluoreszieren. Obwohl Zellpopulationen willkürlich miteinander vermischt werden können, ermöglicht dieses neue Merkmal die Bestimmung der Identität und Position jedes Zelltyps mithilfe einer charakteristischen optischen Reaktionssignatur, wenn die Zellanordnung entweder mit Anregungslichtenergie angestrahlt oder alternativ dazu biologischen Stimuli ausgesetzt wird.
  • In einer Ausführungsform können Zellen oder Zellpopulationen durch die Auswahl von Zellpopulationen, wie beispielsweise grünfluoreszierenden Proteinmutanten, die entweder Chemilumineszenz oder Biolumineszenz aufweisen oder deren optische Reaktion auf biologische Stimuli ein einzigartiges detektierbares Fluoreszenzsignal erzeugen, selbstkodiert werden. Andere Zellpopulationen können verwendet werden, wenn Zellen innerhalb einer Population eine einzigartige vorübergehende optische Reaktion auf Stimuli erzeugen. Verwendet werden können entweder natürlich vorkommende oder genetisch veränderte Zelllinien.
  • In verschiedenen alternativen Ausführungsformen können Zellen mit Farbstoffverbindungen kodiert werden, die an Zellen gebunden sind, von Zellen aufgenommen werden oder in der lokalen Zellumgebung bereitgestellt sind. Beispiele für nützliche Kodierungsfarbstoffe umfassen Fluorophore, Chromophore, Färbemittel oder Farbstoffverbindungen. Beispielsweise können herkömmliche Zellfluorophorsonden, wie z.B. Fluoresceine, Rhodamine, Naphthalimide, Phycobiliproteine, Nitrobenzoxadiazol, verwendet werden. Eine besonders nützliche Literaturangabe zur Auswahl geeigneter Kodierungsfarbstoffe ist R.P. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6. Ausg.), Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, USA, 1996).
  • Wenn Farbstoffverbindungen zum Kodieren verwendet werden, können Zellpopulationen innerhalb der Biosensoranordnung leicht dekodiert werden, indem die Anordnung mit Anregungslicht angeregt wird und Zelltypen innerhalb willkürlich verteilter Populationen basierend auf ihrer Reaktion auf die Anregung indexiert werden. In einer Ausführungsform wird ein einzelnes fluorophores oder chromophores Material oder ein Farbstoff zum Kodieren der Zellen verwendet. In einer alternativen Ausführungsform können zwei oder mehr Kodierungsmaterialien oder -farbstoffe verwendet werden, um für Zellpopulationen zu kodieren, und die optischen Reaktionsintensitätsverhältnisse für Farbstoffe, die durch Bestrahlung mit der Anregungslichtenergie erzeugt werden, werden verwendet, um für Elemente der Zellpopulation innerhalb der Anordnung zu kodieren und sie zu identifizieren. In einer alternativen Ausführungsform können Zellen durch Anregungslicht dekodiert werden, wenn sie einem herkömmlichen Analyten ausgesetzt werden. In einer weiteren Ausführungsform können kodierte Zellen durch ihre Reaktion auf einen generischen Zellaktivator unter Verwendung entweder eines pH- oder eines Ca+2-Indikators dekodiert werden.
  • Das innovative Zellkodierungsmerkmal der vorliegenden Erfindung überwindet bestimmte Einschränkungen von Vorrichtungen nach dem Stand der Technik, indem die Notwendigkeit mechanischen Scannens der Anordnung, mechanischen Indexierens der Position von Zellen und mechanischen Positionierens der Anordnung zur Durchführung von Messungen an einzelnen Zellen innerhalb der Anordnung aufge hoben wird. Die Erfindung ermöglicht somit die Durchführung rascher, gleichzeitiger Messungen an allen Zellen und Zellpopulationen innerhalb der Anordnung, ohne dass die Anordnung mechanisch gescannt werden müsste, um aufeinanderfolgende Reihenmessungen an einer Zelle durchzuführen. Somit findet die Überwachung und Messung der Reaktionen aller Zellen in der Anordnung gleichzeitig ohne Verzögerung zwischen der ersten Zellmessung und der letzten Zellmessung statt. Die Fähigkeit, alle Zellreaktionen gleichzeitig zu messen, ermöglicht so die Überwachung sowohl kurzfristiger Zellreaktionen als auch langfristiger Zellreaktionen. Dieses innovative Merkmal ermöglicht so die Überwachung rascher biologisch signifikanter Zellprozesse und Zellreaktionen in kurzer Zeit. Außerdem können aufgrund der gleichzeitigen Messung von Zellreaktionen über einen kurzen Zeitraum die Reaktionsgeschwindigkeiten von einzelnen Zellen und von Zellpopulationen auf Veränderungen in der Umgebung der Biosensoranordnung gemessen werden. Dieses Merkmal ermöglicht so eine weitere Unterscheidung von Reaktionsinformationen, was für die Detektion von biologischen oder chemischen Analyten nützlich ist.
  • Die Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung kann entweder natürlich vorkommende Zellen und Zellpopulationen oder genetisch veränderte Zelllinien verwenden. Praktisch jeder Zelltyp und jede Zellgröße kann durch Anpassung der Zellgröße an einzelne optische Faseroptikkerndurchmesser und Ätzbedingungen verwendet werden. In einer Ausführungsform wurden NIH-3T3-Mäusefibroblastenzellen verwendet. In alternativen Ausführungsformen können auch andere Zelltypen, wie z.B. E.-coli-Bakterien, Staphylococcus-Bakterien, Myoblastenvorläufer von Skelettmuskelzellen, neutrophile weiße Blutkörperchen, lymphozytische weiße Blutkörperchen, erythroblastöse rote Blutkörperchen, osteoblastöse Knochenzellen, chondrozytische Knorpelzellen, basophile weiße Blutkörperchen, eosinophile weiße Blutkörperchen, adipozytische Fettzellen, Neuronen von wirbellosen Tieren (Helix aspera), Neuronen von Säugetieren oder adrenomedulläre Zellen, verwendet werden. Jeder Zelltyp oder jedes Gemisch aus Zellpopulationstypen kann ebenfalls verwendet werden, sofern die Mikrovertiefungen die einzelnen Zellgrößen aufnehmen können.
  • Die optischen Reaktionen von einzelnen Zellen und Zellpopulationen auf chemische oder biologische Stimuli werden typischerweise abgefragt und detektiert, indem einzelne Zellen mit geeigneten Indikatoren gekoppelt werden, die entweder Fluorophore, Chromophore, Färbemittel oder Farbstoffverbindungen sein können. Beispielsweise können herkömmliche Zellfluorophorsonden, wie z.B. Fluoresceine, Rhodamine, Naphthalimide, Phycobiliproteine, Nitrobenzoxadiazol, verwendet werden. Alternativ dazu können permeante oder impermeante Zellmembranpotentialindikatoren, Ionenindikatoren, reaktive Sauerstoffindikatoren und pH-Indikatoren verwendet werden. Eine besonders nützliche Literaturstelle zur Auswahl geeigneter Indikatoren ist R.P. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6. Ausg.), Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, USA, 1996). Jeder geeignete Indikator oder jede geeignete Kombination von Indikatoren kann verwendet werden, solange der Indikator die Zellreaktion nicht beeinträchtigt. Bei verschiedenen alternativen Ausführungsformen können Indikatoren entweder direkt in die Zelle aufgenommen, beispielsweise durch Bindung an die Zellmembran, durch Absorption oder Injektion in das Zytoplasma einer Zelle, oder zur externen Umgebung der Zelle, beispielsweise einem Fluid in den Mikrovertiefungen, zugesetzt werden. In einer alternativen Ausführungsform können Indikatoren an die Oberfläche der Mikrovertiefungen gebunden werden.
  • Einzelne Zellen oder Anordnungen von Zellen und Zellpopulationen können optisch abgefragt werden, und Zellreaktionen auf Analyten können mithilfe herkömmlicher optischer Verfahren und Geräte gemessen werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Zellen können mit jeder beliebigen Anregungslicht-Energiequelle, wie z.B. Lichtbogenlampen, Laser oder Leuchtdioden, abgefragt werden, die zur Erzeugung von Licht mit geeigneter Wellenlänge fähig sind, um Farbstoffindikatoren anzuregen, die zur Kodierung von Zellpopulationen oder für Reaktionen auf Analyten von Interesse eingesetzt werden können. Die optischen Reaktionen von einzelnen Zellen oder Zellpopulationen können mithilfe beliebiger optischer Detektionsmittel, wie beispielsweise Filmen oder herkömmlichen optischen Detektoren, wie z.B. Photowiderstände, Photovervielfacherröhren, Photodioden oder ladungsgekop pelte (CCD-) Kameras, wobei die Beispiele nicht auf diese beschränkt sind, überwacht und gemessen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden CCD-Kameras verwendet, um fluoreszierende Abbildungen der Biosensoranordnung einzufangen, um Reaktionen der einzelnen Zellen und verschiedener Zellsubpopulationen auf Analyten zu detektieren. In dieser Ausführungsform können sowohl Reaktionen einzelner Zellen als auch ein aufgenommenes Bild der Reaktion der Anordnung zur Detektion von Analyten verwendet werden.
  • Zusammengefasst bieten die Biosensoranordnung und das Messverfahren der vorliegenden Erfindung viele Vorteile, indem sie die Einschränkungen von Vorrichtungen nach dem Stand der Technik überwinden. Die Sensoranordnungen können leicht aus handelsüblichen optischen Abbildungsfasern hergestellt werden, um eine kosteneffektive, hochdichte, exakt geformte Biosensoranordnung zu erhalten, ohne dass komplizierte Bearbeitungs- oder Formverfahren notwendig wären. Da Lichtwellenleiter und Faseroptikanordnungen mit verschiedensten Faserkerndurchmessern erhältlich sind, können die meisten Zelltypen und -größen durch die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung akkommodiert werden. Außerdem können Zellen aufgrund des innovativen Zellkodierungsverfahrens leicht nach dem Zufallsprinzip in der Mikrovertiefungsanordnung verteilt werden, ohne dass physikalisches Indexieren oder Scannen notwendig wäre, um einzelne Zellen oder Zellpopulationen zu lokalisieren. Messverfahren und Messsysteme, welche die Biosensor- und Sensoranordnung der vorliegenden Erfindung verwenden, überwinden viele der Einschränkungen bei der Handhabung von Zellen, die bei Vorrichtungen nach dem Stand der Technik auftreten. Sobald Zellen in den Mikrovertiefungen der Anordnungen platziert wurden, können mithilfe herkömmlicher Abbildungssysteme und -verfahren, die eine Abbildungskamera und herkömmliche Optik verwenden, die Reaktionen tausender Zellen gleichzeitig überwacht werden, wodurch keine mechanische Scanning-Mechanismen mehr erforderlich sind. Die Analyse von Messdaten wird durch den Einsatz handelsüblicher Abbildungssoftware weiter vereinfacht, mithilfe derer Abbildungen der Biosensoranordnung unter Verwendung von Mustererken nungsverfahren zusammen mit neuralen Netzwerken und anderen statistischen Verfahren verarbeitet werden.
  • Die Biosensoranordnung und das Messverfahren gemäß vorliegender Erfindung können für eine Reihe nützlicher Analyseanwendungen eingesetzt werden, bei denen einzelne Zellen, die durch die Gegenwart eines biologischen oder chemischen Materials in der lokalen Zellumgebung chemisch oder biologisch stimuliert werden, auf ihre Umgebung reagieren, indem sie eine optisch detektierbare Reaktion erzeugen, entweder aufgrund der Gegenwart eines geeigneten Indikators oder aufgrund der charakteristischen optischen Reaktion von bestimmten Zelltypen, die entweder natürliche oder gentechnisch erzeugte Chemilumineszenz oder Biolumineszenz aufweisen. Die Biosensoranordnung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung machen sich so die Fähigkeit lebender Zellen zunutze, auf biologisch signifikante Verbindungen zu reagieren. Da die Selektivität von lebenden Zellen für solche Verbindungen beim Screenen von Arzneimitteln und bei der Analyse von komplexen biologischen Fluiden sehr wichtig und nützlich ist, bietet der Biosensor der vorliegenden Erfindung deutliche Vorteile beim Hochdurchsatzscreening von kombinatorischen Bibliotheken, bei dem hunderttausende mögliche pharmazeutische Verbindungen evaluiert werden müssen.
  • Die oben genannten und andere Merkmale der Erfindung, einschließlich verschiedener neuartiger Details in Bezug auf den Aufbau und die Verfahren, sowie weitere Vorteile werden nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Abbildungen und Ansprüche genauer erläutert. Für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ist offensichtlich, dass die speziellen Ausführungsformen der Vorrichtung und des Verfahrens der Erfindung lediglich zur Veranschaulichung dienen und nicht als Einschränkung der Erfindung zu verstehen sind. Die Prinzipien und Merkmale der Erfindung können in zahlreichen verschiedenen Ausführungsformen eingesetzt werden, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • Die Erfindung ist in den beiliegenden Ansprüchen ausführlich dargelegt. Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der Beschreibung und in den folgenden Abbildungen genauer erläutert, worin:
  • 1 eine schematische Darstellung des Konzepts der Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung ist;
  • 2a und 2b Rasterkraftmikroskop-Mikroaufnahmen einer Mikrovertiefungsanordnung sind, die in einer Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung verwendet wird;
  • 3 eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Einbringung von Zellen in Mikrovertiefungen ist, die für eine Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden;
  • 4 eine REM-Mikroaufnahme einer einzelnen NIH-3T3-Mäusefibroblastenzelle in einer Mikrovertiefung ist;
  • 5 eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen einer Zellpopulation in der Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung ist;
  • 6 ein charakteristisches Fluoreszenzabbildungsmuster ist, das die Position von Zellen identifiziert, die in einem Test für die Lebensfähigkeit von Zellen in einer Biosensoranordnung gemäß vorliegende Erfindung positive Ergebnisse liefern;
  • 7 die zeitliche Entwicklung der Reaktion der kombinierten Fluoreszenzintensität der lebensfähigen Zellpopulation, die in 6 identifiziert ist, zeigt;
  • 8 eine optische Fluoreszenzabbildung einer kodierten Zellpopulation in einer Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung ist;
  • 9 ein schematisches Diagramm des Messsystems ist, das für optische Messungen der Mikrovertiefungssensoranordnung verwendet wird;
  • 10 ein Diagramm ist, das die mittlere BCECF-Fluoreszenz von neun Zellen der Biosensoranordnung in Bezug auf die Zeit zeigt; und
  • 11a und 11b die Lebensfähigkeit von Zellen, die in Mikrovertiefungen eingebracht wurden, mit und ohne Vorbehandlung für die Befüllung der Mikrovertiefungen mit einem Nährmedium vergleicht.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • A. Herstellung von Mikrovertiefungsanordnungen
  • Die vorliegende Erfindung stellt Anordnungen bereit, die zumindest ein erstes Substrat mit einer mehrere einzelne Stellen umfassenden Oberfläche umfassen. Mit "Anordnung" sind hierin mehrere Zellen in einem Anordnungsformat gemeint; die Größe der Anordnung hängt von der Zusammensetzung und der Endanwendung der Anordnung ab. Hergestellt werden können Anordnungen, die von etwa 2 bis mehrere Millionen verschiedene Zellen umfassen, wobei sehr große Faseroptikanordnungen möglich sind. Im Allgemeinen umfasst eine Anordnung zwei bis eine Milliarde oder mehr, abhängig von der Größe der Zellen und des Substrats sowie der Endanwendung der Anordnung, weshalb Anordnungen mit sehr hoher Dichte, mit hoher Dichte, mit mäßiger Dichte, mit geringer Dichte und mit sehr geringer Dichte hergestellt werden können. Bevorzugte Bereiche für Anordnungen mit sehr hoher Dichte betragen etwa 10.000.000 bis etwa 2.000.000.000 (alle Zahlen hierin sind pro cm2), vorzugsweise etwa 100.000.000 bis etwa 1.000.000.000. Anordnungen mit hoher Dichte reichen von etwa 100.000 bis etwa 10.000.000, insbesondere bevorzugterweise etwa 1.000.000 bis etwa 5.000.000. Anordnungen mit mäßiger Dichte reichen vorzugsweise von etwa 10.000 bis etwa 100.000, insbesondere von etwa 20.000 bis etwa 50.000. Anordnungen mit geringer Dichte umfassen im Allgemeinen weniger als 10.000, vorzugsweise etwa 1.000 bis etwa 5.000. Anordnungen mit sehr geringer Dichte umfassen weniger als 1.000, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 1.000, insbesondere etwa 100 bis etwa 500. In manchen Ausführungsform liegen die Zusammensetzungen der Erfindung nicht in Form einer Anordnung vor; d.h. bei manchen Ausführungsformen können Zusammensetzungen, die nur eine einzelne Zelle umfassen, ebenfalls hergestellt werden. Außerdem können in manchen Anordnungen mehrere Substrate verwendet werden, die entweder aus unterschiedlichen oder identen Zusammensetzungen bestehen. So können größere Anordnungen beispielsweise mehrere kleine Substrate umfassen.
  • Ein Vorteil der vorliegenden Zusammensetzungen besteht zusätzlich darin, dass durch die Verwendung der Faseroptiktechnologie Anordnungen mit extrem hohen Dichten erreicht werden können. So können beispielsweise, da Zellen häufig 200 fm oder kleiner sind und sehr kleine Fasern bekannt sind, bis zu 250.000 oder mehr (in manchen Fällen 1 Million) verschiedene Fasern und Zellen in einem 1 mm2 großen Faseroptikbündel vorhanden sein, wobei Dichten von mehr als 15.000.000 einzelnen Zellen und Fasern (in manchen Fällen wieder 25 bis 50 Millionen) pro 0,5 cm2 erreicht werden können.
  • "Substrat" oder "fester Träger" oder grammatikalische Äquivalente stehen hierin für jedes beliebige Material, das so modifiziert werden kann, dass es einzelne diskrete Stellen, die zur Bindung oder Assoziation von Zellen geeignet sind, enthält und für zumindest ein Detektionsverfahren zugänglich ist. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich ist, ist die Anzahl an möglichen Substraten sehr groß. Mögliche Substrate umfassen Glas und modifiziertes oder funktionalisiertes Glas, Kunststoffe (einschließlich Acryle, Polystyrol und Copolymere aus Styrol und anderen Materialien, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polyurethane, TeflonJ usw.), Polysaccharide, Nylon oder Nitrocellulose, Harze, Silica und auf Silica basierende Materialien, einschließlich Silicium und modifiziertes Silicium, Kohlenstoff, Metalle, anorganische Gläser, Kunststoffe, Lichtwellenleiterbündel und verschiedene andere Polymere, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Im Allgemeinen erlauben die Substrate optische Detektion und fluoreszieren selbst nicht stark.
  • Normalerweise ist das Substrat flach (plan), obwohl, wie Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wissen, auch andere Substratkonfigurationen verwendet werden können; beispielsweise können dreidimensionale Konfigurationen verwendet werden, beispielsweise indem die Zellen in einen porösen Kunststoffblock eingebettet werden, der den Zutritt von Proben zu den Zellen erlaubt, und ein konfokales Mikroskop zur Detektion verwendet wird. Auf ähnliche Weise können die Zellen für eine Durchflussprobenanalyse auf der Innenseite einer Röhre platziert werden, um das Probenvolumen zu minimieren. Bevorzugte Substrate umfassen Lichtwellenleiterbündel, wie nachstehend erläutert, und flache, plane Substrate, wie beispielsweise Glas, Polystyrol und andere Kunststoffe und Acryle.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat ein Lichtwellenleiterbündel oder eine -anordnung, wie in der WO 99/18434, im US-Patent 6200737, in der WO 98/40726 und in der WO 98/50782 allgemein beschrieben ist. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden vorgeformte einheitliche Faseroptikanordnungen. Mit "vorgeformten einheitlichen Faseroptikanordnungen" sind hierin Anordnungen aus diskreten, einzelnen Faseroptiksträngen gemeint, die koaxial angeordnet und in Längsrichtung verbunden sind. Die Faserstränge sind im Allgemeinen einzeln umhüllt. Eine Tatsache, die eine vorgeformte einheitliche Anordnung jedoch von anderen Faseroptikformaten unterscheidet, ist, dass die Fasern nicht einzeln physikalisch behandelt werden können; d.h. ein einzelner Strang kann nicht an einem beliebigen Punkt entlang seiner Länge physikalisch von einem anderen Faserstrang abgetrennt werden. Im Allgemeinen konzentriert sich die Diskussion hierin auf Faseroptikanordnungen, obwohl – wie Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung verstehen werden – in jeder hierin beschriebenen Ausführungsform auch andere oben beschriebene Substrate verwendet werden können.
  • Zumindest eine Oberfläche des Substrats ist so modifiziert, dass sie diskrete, einzelne Stellen für eine spätere Verbindung mit Zellen aufweist. Diese Stellen können physikalisch veränderte Stellen, d.h. physikalische Konfigurationen, wie beispielsweise Wells oder kleine Vertiefungen im Substrat, welche die Zellen aufnehmen können, so dass eine Zelle im Well liegen kann, die Verwendung anderer Kräfte (Magnet- oder Druckkraft) oder chemisch veränderte oder aktive Stellen, wie beispielsweise biologisch oder chemisch funktionalisierte Stellen, elektrostatisch veränderte Stellen, hydrophob/hydrophil funktionalisierte Stellen, Klebstoffpunkte usw., umfassen.
  • Die Stellen können in einem Muster angeordnet, d.h. ein/e regelmäßige/s Muster oder Konfiguration aufweisen, oder zufällig verteilt sein. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet ein regelmäßiges Muster der Stellen, so dass die Stellen in der X-Y-Koordinatenebene adressierbar sind. "Muster" in diesem Sinne umfasst eine Grundeinheitenzelle, vorzugsweise eine, die eine hohe Dichte von Zellen auf dem Substrat ermöglicht. Es gilt jedoch anzumerken, dass diese Stellen eventuell keine diskreten Stellen sind. D.h. es ist möglich, eine gleichförmige Oberfläche mit klebenden oder chemischen Funktionalitäten zu verwenden, die beispielsweise die Bindung der Zellen an jede Position ermöglicht. D.h. die Oberfläche des Substrats wird modifiziert, um die Bindung von Zellen an einzelne Stellen zu ermöglichen, egal ob diese Stellen an andere Stellen angrenzen oder nicht. So kann die Oberfläche des Substrats modifiziert werden, so dass diskrete Stellen gebildet werden, die nur eine einzelne gebundene Zelle aufweisen können, oder alternativ dazu kann die Oberfläche des Substrats modifiziert sein, und die Zellen können an beliebigen Stellen landen, aber doch an diskreten Stellen enden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche des Substrats so modifiziert, dass sie Mikrovertiefungen, d.h. Senken in der Oberfläche des Substrats, enthält. Dies kann, wie auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist, mithilfe verschiedener Verfahren erfolgen, einschließlich Photolithographie, Stanzverfahren, Pressen, Gießen, Formen, Mikroätzen, Galvanisieren, chemische oder physikalische Gasphasenabscheidung unter Verwendung von Masken oder Matrizen, elektrochemische Bearbeitung, Laserbearbeitung oder -ablation, Elektronenstrahlbearbeitung oder -ablation und herkömmliche Bearbeitung, nicht jedoch auf diese beschränkt. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich ist, hängt das verwendete Verfahren von der Zusammensetzung und Form des Substrats ab.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden physikalische Veränderungen auf einer Oberfläche des Substrats vorgenommen, um die Stellen herzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat ein Faseroptikbündel, und die Oberfläche des Substrats ist ein terminales Ende des Faserbündels, wie in der WO 98/40726 und der WO 00/16101 allgemein beschrieben ist. In dieser Ausführungsform werden an einem terminalen oder distalen Ende eines Faseroptikbündels, das einzelne Fasern umfasst, Vertiefungen ausgebildet. In dieser Ausführungsform werden die Kerne der einzelnen Fasern in Bezug auf die Umhüllung geätzt, so dass kleine Vertiefungen oder Senken an einem Ende der Fasern gebildet werden. Die erforderliche Tiefe der Vertiefungen hängt von der Größe der Zellen ab, die in die Vertiefungen eingebracht werden sollen.
  • Im Allgemeinen sind die Zellen in dieser Ausführungsform nichtkovalent in die Vertiefungen eingebracht, obwohl die Vertiefungen außerdem biologisch oder chemisch funktionalisiert sein können, wie nachstehend allgemein erläutert ist, und Vernetzer oder eine physikalische Barriere, d.h. ein Film oder eine Membran über den Zellen, können verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche des Substrats so modifiziert, dass sie biologisch oder chemisch modifizierte Stellen enthält, die verwendet werden können, um die Zellen der Erfindung kovalent oder nichtkovalent an die diskreten Stellen oder Positionen auf dem Substrat zu binden. "Chemisch modifizierte Stellen" umfassen in diesem Kontext den Zusatz eines Musters aus funktionellen chemischen Gruppen, einschließlich Aminogruppen, Carboxygruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen, die verwendet werden können, um Zellen zu binden, die im Allgemeinen auch entsprechende reaktive funktionelle Gruppen auf ihrer Oberfläche aufweisen, sind jedoch nicht darauf beschränkt; den Zusatz eines Musters aus einem Haftmittel, um die Zellen zu binden (entweder durch vorherige chemische Funktionalisierung für den Zusatz des Haftmittels oder durch direkten Zusatz des Haftmittels); den Zusatz eines Musters aus geladenen Gruppen (ähnlich den chemischen Funktionalitäten) für die elektrostatische Bindung der Zellen, d.h. wenn die Zellen den Stellen entgegengesetzt geladene Gruppen umfassen; den Zusatz eines Musters aus funktionellen chemischen Gruppen, welche die Stellen unterschiedlich hydrophob oder hydrophil machen, so dass der Zusatz ähnlich hydrophober oder hydrophiler Zellen unter geeigneten Versuchsbedingungen zur Bindung der Zellen an die Stellen aufgrund von Hydroaffinität führt. Alternativ dazu umfassen biologische Modifikationen die Verwendung von Bindungsliganden oder Bindungspartnerpaaren, wie beispielsweise Antigen-Antikörper-Paare, Enzym-Substrat- oder -Inhibitor-Paare, Rezeptor-Ligand-Paare, Kohlenhydrate und ihre Bindepartner (Lectine usw.), sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird mithilfe eines selektiven Ätzverfahrens, das den Unterschied der Ätzgeschwindigkeiten zwischen Kern und Überzugsmaterialien nutzt, eine Anordnung von Vertiefungen in Mikrometergröße am distalen Ende einer optischen Abbildungsfaser gebildet. Dieses Verfahren wurde von Pantano et al., Chem. Mater. 8, 2832 (1996), und Walt et al. in der WO 98/40726 offenbart. Die Reaktionszeit und Bedingungen des Ätzvorgangs werden so eingestellt, dass die Größe und das Volumen der resultierenden Mikrovertiefung wie gewünscht geregelt werden können. Die Größe der Mikrovertiefungen wird so geregelt, dass sie eine einzelne Zelle jedes gewünschten Zelltyps aufnehmen können, also einen Innendurchmesser von etwa 1 μm bis etwa 200 μm, eine Tiefe von etwa 0,25 μm bis etwa 200 μm und ein Volumen von etwa 1 fl bis etwa 5 nl aufweisen.
  • Die Sensoranordnung kann verschiedene Zellgrößen und -konfigurationen aufnehmen, wobei entweder im Handel erhältliche Lichtwellenleiter und Faseroptikanord nungen oder maßgefertigte Fasern oder Faseranordnungen Verwendung finden. Die wichtigste Anforderung bei der Auswahl der möglichen Fasern oder Faseroptikanordnungen für die Herstellung von Sensoren ist, dass die einzelnen Fasern ätzbare Kerne besitzen.
  • In einer Ausführungsform kann die Innenfläche der Mikrovertiefungen mit einem dünnen Film oder einer Passivierungsschicht aus biologisch verträglichem Material überzogen sein, was den oben dargelegten biologischen Modifikationen des Substrats ähnelt. Beispielsweise können Materialien verwendet werden, die bekannterweise Zellwachstum oder -haftung fördern, einschließlich Fibronectin, einer beliebigen Anzahl an bekannten Polymeren, einschließlich Collagen, Polylysin und anderen Polyaminosäuren, Polyethylenglykol und Polystyrol, Wachstumsfaktoren, Hormonen, Zytokinen usw., nicht jedoch auf diese beschränkt. Auf ähnliche Weise können Bindungsliganden wie oben dargelegt auf die Oberfläche der Vertiefungen aufgetragen werden. Außerdem können Beschichtungen oder Filme aus Metallen, wie beispielsweise Gold, Platin oder Palladium, eingesetzt werden. In einer alternativen Ausführungsform kann eine Indikatorverbindung, wie beispielsweise ein Fluorophor, ein Chromophor oder ein Farbstoff, auf die Mikrovertiefungsoberfläche aufgebracht werden, um Zellreaktionen auf chemische oder biologische Stimulation zu detektieren.
  • Das Verfahren zur Herstellung von Mikrovertiefungen kann für jede Fasergröße angepasst werden, um einen großen Bereich von Zellgrößen zur Inkorporation in geeignet große Mikrovertiefungen aufzunehmen. Beispielsweise sind Lichtwellenleiter mit Kerndurchmessern von 1,6 bis 100 μm im Handel erhältlich, entweder bei Galileo Electro-Optics Corp. (Sturbridge, MA, USA) oder Edmund Scientific (Barrington, NJ, USA). Außerdem sind bei Bestellung auch größere Größen verfügbar. Somit können geeignet große Fasern mit Kerndurchmessern von etwa 1 μm bis etwa 200 μm verwendet werden, um so verschiedene Zellen wie E. coli, mit einer typischen Zellgröße von 0,7 bis 1,5 μm, und Säugetierneuronen, mit einer Zellgröße von bis zu 150 μm, zu untersuchen.
  • In einer Ausführungsform wurde eine Faseroptikanordnung mit einem Außendurchmesser von 1 mm und Kerndurchmessern der einzelnen Fasern von 7 μm verwendet, die von Galileo Electro-Optics Corp. (Sturbridge, MA, USA) erhältlich ist. Ein Ende der Faseroptikanordnung wurde unter Verwendung einer Reihe von Aluminiumoxid-Läppfilmen mit 12, 9, 3, 1, 0,3 μm von Mark V Lab (East Granby, CT, USA) poliert. Die Fasern wurden dann etwa 1 Minute lang beschallt, um Reste des Polierverfahrens zu entfernen. Das Ätzverfahren wurde durchgeführt, indem die distale Fläche der Faser etwa 65 Sekunden lang im rechten Winkel in 700 μl einer gepufferten Flusssäure eingetaucht wurde, die 100 μl Flusssäure (50 %), 0,2 g Ammoniumfluorid und 600 μl entionisiertes Wasser enthielt. Dann wurde die Faser mit entionisiertem Wasser gespült und 1 Minute lang beschallt, um Salze zu entfernen, die sich eventuell während des Ätzverfahrens gebildet haben. In dieser Ausführungsform wurde die Ätzreaktion so angepasst, dass die Vertiefungen einen Durchmesser von 7 μm, eine Tiefe von 3 μm und ein Volumen von etwa 90 fl aufwiesen. Sowohl Rasterelektronenmikroskopie (REM) als auch Rasterkraftmikroskopie (AFM) können verwendet werden, um geätzte Mikrovertiefungen zu charakterisieren. In 2a ist eine AFM-Mikroaufnahme (Digital Instruments Nanoscope IIIa, Santa Barbara, CA, USA) einer typischen Mikrovertiefungsanordnung zu sehen, die durch das Ätzverfahren gebildet wurde. In 2 ist eine Schrägansicht der Mikrovertiefungsanordnung zu sehen. Wie in diesen Figuren zu sehen, sind die durch dieses Verfahren gebildeten Mikrovertiefungen aufgrund der gleichförmigen charakteristischen Struktur der Faseroptikanordnungen sehr gleichförmig.
  • B. Auswahl von Zelltypen
  • Praktisch alle Zelltypen und -größen können bei der Herstellung des Sensors der vorliegenden Erfindung akkommodiert werden, indem die Zellgröße auf die Kerndurchmesser einzelner Lichtwellenleiter angepasst wird. Praktisch jeder natürlich vorkommende oder genetisch veränderte (d.h. exogene Nucleinsäure enthaltende) eukaryotische oder prokaryotische Zelltyp, wobei Zellen von Pflanzen, wirbellosen Tieren, Bakterien und Säugetieren, einschließlich grünfluoreszierender Proteinmutan ten-, Primaten-, Nagetier- und Humanzellen und -zelllinien, nicht jedoch darauf beschränkt, bevorzugt sind, sowie Gemische von Zelltypen können verwendet werden.
  • In einer Ausführungsform wurden NIH-3T3-Mäusefibroblastenzellen verwendet. Diese Zellen sind typischerweise 15 bis 20 μm groß. Andere Zelltypen, wie beispielsweise E.-coli-Bakterien, 1 × 3 μm, Staphylococcus-Bakterien, etwa 1 μm, Myoblastenvorläufer von Skelettmuskelzellen, 15 bis 20 μm, neutrophile weiße Blutkörperchen, 10 μm, lymphozytische weiße Blutkörperchen, 10 μm, erythroblastöse rote Blutkörperchen, 5 μm, osteoblastöse Knochenzellen, 15 bis 20 μm, chondrozytische Knorpelzellen, 15 bis 20 μm, basophile weiße Blutkörperchen, 10 μm, eosinophile weiße Blutkörperchen, 10 μm, adipozytische Fettzellen, 20 μm, Neuronen von wirbellosen Tieren (Helix aspera), 125 μm, Neuronen von Säugetieren, 4 bis 140 μm, oder adrenomedulläre Zellen, 13 bis 16 μm, Melanozyten, 20 μm, Epithelzellen, 20 μm, oder Endothelzellen, 15 bis 20 μm, können ebenfalls verwendet werden. Weitere geeignete Zelltypen umfassen Tumorzellen aller Arten (insbesondere Melanome, myeloische Leukämie, Lungen-, Brust-, Eierstock-, Kolon-, Nieren-, Prostata-, Pankreas- und Hodenkarzinome), Kardiomyocyten, Endothelzellen, Epithelzellen, Lymphozyten (T-Zellen und B-Zellen), Mastzellen, Eosinophile, vaskuläre Intimazellen, Hepatozyten, Leukozyten, einschließlich mononuklearer Leukozyten, Stammzellen, wie z.B. hämopoetische, neurale, Haut-, Lungen-, Nieren-, Leber- und Myozyten-Stammzellen, Osteoklasten, Chondrozyten und andere Bindegewebezellen, Keratinozyten, Melanozyten, Leberzellen, Nierenzellen und Adipozyten, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Geeignete Zellen umfassen außerdem bekannte Forschungszellen, einschließlich Jurkat-T-Zellen, NIH3T3-Zellen, CHO, COS usw., sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Eine besonders nützliche Quelle für Zelllinien findet sich in ATCC Cell Lines and Hybridomas (8. Ausg., 1994), Bacteria and Bacteriophages (19. Ausg., 1996), Yeast (1995), Mycology and Botany (19. Ausg., 1996) und Protists: Algae and Protozoa (18. Ausg., 1993) von American Type Culture Co. (Rockville, MD).
  • C. Verteilung von Zellen in Mikrovertiefungen
  • Sobald die Mikrovertiefungsgröße so angepasst ist, dass spezifische Zellgrößen akkommodiert werden können, besteht der nächste Schritt bei der Schaffung einer Anordnung von Zellen in der zufälligen Verteilung von Zellen in die Mikrovertiefungen. 3 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Verteilung und Einbringung von Zellen in die Mikrovertiefungsanordnung. Zellpopulationen werden herkömmlicherweise mit Nährmedium kultiviert, das den Ansprüchen der Zellen genügt. Kulturmedien werden entweder gemäß den Angaben der Lieferanten der Zelllinien, gemäß Artikeln in Magazinen oder gemäß Referenztexten formuliert. Eine besonders nützliche Referenz zur Herstellung von Medien ist ATCC Quality Control Methods for Cell Lines (2. Ausg.), American Type Culture Co. (Rockville, MD, USA), die durch Verweis hierin aufgenommen ist. Nach der Kultivierung werden die Zellen typischerweise unter Verwendung von aseptischer Verfahren trypsiniert, um sie aus der Zellkulturschale zu entfernen und sie in einem Nährmedium zu suspendieren.
  • In einer Ausführungsform wurden NIH-3T3-Mäusefibroblastenzellen von der American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) verwendet. Die Zellen wurden zufällig in Vertiefungen verteilt, indem die anhaftenden Zellen mithilfe eines proteolytischen Enzyms, wie z.B. Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin, 0,53 mM EDTA.4Na) von Gibco BRL (Grand Island, NY, USA), und unter Verwendung von aseptischen Verfahren aus der Kulturschale entfernt wurden und die Zellen in eine Einzellensuspension in einem Nährmedium, wie z.B. Dulbeccos's Modified Eagle Medium mit 1 % PenicillinStreptomycin, 1 % L-Glutamin-200 mM und 10 % fötalem Kälberserum von Gibco BRL, gegeben wurden.
  • Um Zellen in den Vertiefungen zu verteilen, wurden etwa 1,5 ml der Zellsuspension durch eine 3,5-minütige Zentrifugation bei 2.000 U/min konzentriert. Der Überstand wurde entfernt, und an das Zentrifugenglas wurde leicht geklopft, um die Zellen zu resuspendieren. Dann wurde die Zellsuspension zu einem Kapillarrohr mit einem Durchmesser von 1,5 mm zugesetzt. Bevor die Zellen zu den Mikrovertiefungen zu gesetzt wurden, wurde das Ende der Faseroptikanordnung, welches die Mikrovertiefungen enthielt, unter Vakuum etwa 15 Minuten lang im Zellmedium beschallt, um die Mikrovertiefungen zu spülen und mit einem Medium zu befüllen. Die Mikrovertiefungsenden der Fasern wurden dann in das Kapillarrohr eingeführt und mithilfe eines dünnen Streifens Parafilm fixiert. Die Kapillarrohr-Faser-Anordnung wurde dann in der vertikalen Position 1 bis 2 Stunden lang inkubiert, wodurch sich die suspendierten Zellen in den Vertiefungen absetzen und an den Boden der Vertiefungen binden konnten. Die Zeit, die zur Füllung der Mikrovertiefungen erforderlich ist, hängt nur von der Dauer ab, die Zellen zur Bindung an den Boden der Mikrovertiefungen brauchen. Überschüssige Zellen, die nicht in einer Vertiefung aufgenommen wurden, wurden mithilfe eines mit Nährmedium befeuchteten Wattestäbchens weggewischt. 4 ist eine REM-Mikroaufnahme einer einzelnen Zelle in einer geätzten Mikrovertiefung.
  • Sobald sie in den Mikrovertiefungen platziert wurden, binden Zellen typischerweise durch Proteinkontakt innerhalb von 1 bis 2 Stunden an Oberflächen von Mikrovertiefungen. Zellnährmedien in den Mikrovertiefungen können regelmäßig nachgefüllt werden, indem die distale Oberfläche der Faseroptikanordnung frischem Nährmedium ausgesetzt wird und Nährstoffe in die Hohlräume der Mikrovertiefungen diffundieren gelassen werden. Typischerweise teilen sich Zellen alle zwölf bis fünfzehn Stunden. Während die Größe der Mikrovertiefungen normalerweise einzelne Zellen einschließt, erlaubt die Anordnung nur begrenzte Zellteilung im Laufe der Zeit. Das Volumen der Mikrovertiefungen schränkt die Zellteilung aufgrund des allgemein bekannten Zellphänomens der Kontakthemmung bei Berührung von Zellen ein.
  • D. Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen
  • In einer Ausführungsform wurde die Lebensfähigkeit der Zellen in den Vertiefungen unter Verwendung des pH-Indikators 2'-7'-Bis(2-carboxyethyl)-5- (und -6-) carboxyfluorescein (BCECF-AM) untersucht, der eine Anregungswellenlänge von 505 nm und eine Emissionswellenlänge von 535 nm aufweist und von Molecular Probes (Eugene, OR, USA) erhältlich ist. Die Acetoxymethyl- (AM-) Esterform von BCECF ist in Lösung nicht fluoreszierend. BCECF-AM ist in Zellmembranen permeant und tritt passiv in die Zelle ein, wo es, sobald es in der Zelle ist, die lipophilen Blockierungsgruppen durch nichtspezifische Esterasen spaltet, was zu einer Steigerung der Fluoreszenzintensität führt. Diese Steigerung der Fluoreszenzintensität zeigt die Lebensfähigkeit der Zelle an. 5 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines Verfahrens zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen in einer Sensoranordnung.
  • Bei Lebensfähigkeitstest wurde eine Anordnung von kodierten Zellen, die vorher in Mikrovertiefungen verteilt worden waren, 1 Minute lang in eine 1-μM-Lösung von BCECF-AM getaucht. Die Zellanordnung wurde entfernt und gründlich gespült, um jeglichen restlichen Farbstoff zu entfernen. Fluoreszenzabbildungen von Zellreaktionen wurden alle 30 Sekunden erfasst, wobei eine Erfassungsdauer von 1,0 Sekunden verwendet wurde, um die Steigerung der Fluoreszenzintensität aufgrund des pH von gesunden Zellen zu überwachen. Vor den Lebensfähigkeitsmessungen wurde eine Zellpositionsmatrize durch Anregung der kodierten Zellen erstellt, unter Verwendung des hierin beschriebenen Kodierungsverfahrens, und die Positionen einzelner Zellen wurden über Lebensfähigkeitsmessungsabbildungen gelegt, um die Position von gesunden Zellen in der Anordnung zu bestimmen. Eine Fluoreszenzabbildung der kodierten Zellen ist in 6 zu sehen. In 7 weist die Fluoreszenzintensitätsreaktion der Zellen auf eine allmähliche Steigerung hin, wenn die lipophilen Gruppen vom BCECF-AM-Farbstoff in der Zelle gespalten werden. Die Fluoreszenzintensitätsreaktion der Vertiefungen, die keine Zellen enthielten, war vernachlässigbar.
  • In einer alternativen Ausführungsform wurde BCECF-Dextran, das von Molecular Probes erhältlich ist, für Zelllebensfähigkeitsmessungen verwendet. Eine 0,1-μM-Lösung des Farbstoffs wurde zu einem Zellmedium in Mikrovertiefungen einer Anordnung zugesetzt. BCECF erfordert eine Anregung bei zwei Wellenlängen, 490 nm und 440 nm, und das Verhältnis der Emissionslichtintensität bei 530 nm ist bei jeder Wellenlänge proportional zum pH. Dieser Farbstoff wird mit einer großen Dextran-Grup pe konjugiert, um zu verhindern, dass er durch die Zellmembran in die Zelle eintritt. Somit können mithilfe von BCECF-Dextran aufgrund des Zellmetabolismus pH-Abnahmen innerhalb der externen Zellumgebung überwacht werden. 10 zeigt die mittlere Reaktion von neun Zellen in Bezug auf die Zeit, wobei der pH der Zellumgebung aufgrund des Zellmetabolismus allmählich abnimmt.
  • In einer weiteren Ausführungsform wurde ein im Handel erhältlicher Zelllebensfähigkeitstest, LIVE/DEAD® von Molecular Probes (Eugene, OR, USA), verwendet. Dieser Test stellt einen zweifärbigen Fluoreszenz-Zelllebensfähigkeitstest bereit, der auf intrazellulärer Esteraseaktivität und Plasmamembranintegrität basiert. Lebende Zellen werden durch die enzymatische Umsetzung des zellpermeanten nichtfluoreszierenden Calceins AM zu fluoreszierendem Calcein unterschieden, wobei die Anregungswellenlänge bei 495 nm und die Emissionswellenlänge bei 515 nm liegt. Tote Zellen werden unterschieden, wobei die Anregungswellenlänge bei 495 nm und die Emissionswellenlänge bei 635 nm liegt, indem Ethidiumhomodimer (EthD-1) an Nucleinsäuren gebunden wird, was von einer 40fachen Steigerung der Fluoreszenzintensität begleitet wird. EthD-1 wird durch die intakten Plasmamembranen von lebenden Zellen ausgeschlossen. Hintergrundfluoreszenzwerte sind bei diesem Testverfahren von Natur aus gering, weil die Farbstoffe praktisch nichtfluoreszierend sind, bevor sie mit Zellen wechselwirken.
  • Bei einem typischen Verfahren wurde eine Arbeitslösung aus 2 μM Calcein AM und 4 μM EthD-1 in einem serumfreien Medium hergestellt. Eine Anordnung von NIH-3T3-Mäusefibroblastenzellen wurde an der distalen Fläche einer Mikrovertiefungsanordnung kultiviert. Die proximate Fläche der Abbildungsfaser wurde auf das Abbildungssystem fokussiert. Die Zellanordnung auf der distalen Fläche der Abbildungsfaser wurde in ein serumfreies Medium ohne Farbstoff gegeben. Die Zellanordnung wurde mit 495 nm angeregt, und bei 515 nm (lebend) und 635 nm (tot) wurden 300 ms lange Emissionswerte von einer Population von 25 Zellen erhalten. Diese Werte dienen als Hintergundablesung für diese Messungen. Die Zellanordnung wurde dann in die Farbstofflösung gegeben, und die Zellanordnung wurde mit 495 nm angeregt, wobei 30 Minuten lang jede Minute bei 515 nm (lebend) und 635 nm (tot) 300 ms lange Emissionswerte von 25 Zellen erhalten wurden. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die mittlere Fluoreszenzintensität der Wellenlänge der lebenden und toten Zellen werden in Bezug auf die Zeit dargestellt, nachdem die Hintergrundfluoreszenzmessung bei jeder Emissionswellenlänge abgezogen worden ist.
  • Dieser Test wurde verwendet, um die Vorbehandlungsverfahren zum Befüllen der Mikrovertiefungen einer Biosensoranordnung mit einem Nährmedium zu evaluieren, bevor die Zellen eingebracht werden. Durch einen Vergleich der Lebensfähigkeit von Zellen, die nach verschiedenen Behandlungen in Mikrovertiefungen platziert wurden, wurde bestimmt, dass in einer bevorzugten Ausführungsform eine 15-minütige Beschallung der Mikrowellenanordnung unter Vakuum vor Einbringung der Zellen die Lebensfähigkeit verbessert, indem sichergestellt wird, dass die Mikrovertiefungen mit einem Nährmedium gefüllt sind. In 11a ist die mittlere Fluoreszenzintensität von toten und lebenden Zellen in Bezug auf die Zeit dargestellt, wobei keine Vorbehandlung stattfand. In 11b sind die Ergebnisse einer vorbehandelten Mikrovertiefungsanordnung zu sehen. Ein Vergleich der beiden Figuren zeigt den Vorteil einer vorherigen Befüllung von Mikrovertiefungen mit einem Nährmedium vor der Einbringung von Zellen auf. Bei diesem Beispiel starben, wenn die Mikrovertiefungsanordnung vor der Einbringung der Zellen nicht beschallt wurde, die Zellen sofort ab. Wenn in diesem Beispiel die Mikrovertiefungen unter Vakuum beschallt wurden, um die Anordnungen mit Nährmedien zu füllen, waren die Zellen etwa 20 Minuten lebensfähig.
  • E. Kodierung von Zellpopulationen
  • Ein einzigartiges Merkmal der Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung ist, dass Zellen in jeder Zellpopulation individuell kodiert werden, um die Zellidentität innerhalb der Anordnung aufrechtzuerhalten, wenn willkürlich vermischte Zellpopulationen verwendet werden. Zellen können mit einem einzelnen fluorophoren oder chromophoren Farbstoff oder Mischungen solcher Farbstoffe kodiert werden. Alternativ dazu können Zellen entweder durch Injektion einer nichttoxischen fluoreszierenden Verbindung in das Zellenzytoplasma oder durch Verwendung natürlicher oder genetisch veränderter Zelllinien kodiert werden, die Chemilumineszenz oder Biolumineszenz aufweisen, wie beispielsweise grünfluoreszierende Proteinmutanten. Obwohl in der Biosensoranordnung viele Zellpopulationen willkürlich vermischt sein können, wird die Identität und Position jedes Zelltyps mithilfe einer charakteristischen optischen Reaktionssignatur bestimmt, wenn die Anordnung mit Anregungslichtenergie bestrahlt wird. Zellen können kodiert werden, bevor sie in die Mikrovertiefungen gegeben werden oder, alternativ dazu, nachdem sie in den Mikrovertiefungen platziert wurden. In einer Ausführungsform wird ein einzelnes fluorophores oder chromophores Material oder ein solcher Farbstoff verwendet, um die Zellen zu kodieren. In einer alternativen Ausführungsform werden zwei oder mehr Kodierungsmaterialien oder -farbstoffe verwendet, um Zellpopulationen zu kodieren, und das Verhältnis zwischen den Lichtintensitäten der optischen Reaktionen der einzelnen Materialien oder Farbstoffe, die durch Anregungslichtenergie erzeugt werden, wird verwendet, um die Positionen einzelner Zellen innerhalb der Zellpopulation zu identifizieren und sie in der Anordnung zu lokalisieren. In verschiedenen alternativen Ausführungsform können Zellen mit Farbstoffverbindungen kodiert werden, die an Zellen gebunden sind, von Zellen aufgenommen werden oder in der lokalen Zellumgebung bereitgestellt sind.
  • Verschiedenste Fluorophore, Chromophore, Färbemittel oder Farbstoffverbindungen können zur Kodierung von Zellen verwendet werden. Kodierungsfarbstoffe können permeant oder impermeant in Bezug auf die Zellmembran sein. Impermeante Farbstoffe können mit Acetoxymethylester konjugiert sein, um eine Aufnahme durch die Zellen zu ermöglichen. In einer Ausführungsform können herkömmliche konjugierte oder reaktive Zellmembranfärbemittel, Zell-Tracer oder Zellsonden, wie z.B. Fluoresceine, Rhodamine, Eosinnaphthalimide, Phycobiliproteine, Nitrobenzoxadiazol, verwendet werden. In anderen Ausführungsformen können Cyaninfarbstoffe, wie beispielsweise SYTO® (Molecular Probes), aminreaktive Farbstoffe, thiolreaktive Farb stofte, lipophile Farbstoffe und DNA-Interkalatoren, wie z.B. Acridin-Orange, verwendet werden. In einer Ausführungsform können fluorogene oder chromogene Enzymsubstrate von den Zellen aufgenommen werden, mit intrazellulären Enzymen, wie z.B. Glycosidasen, Phosphatasen, Luciferase oder Chloramphenicolacetyltransferase, verarbeitet werden und Kodierung für Zellpopulationen bereitstellen. In einer alternativen Ausführungsform können Zellorganellenfarbstoffsonden zur Kodierung verwendet werden. In einer Ausführungsform können Zellmembransonden, wie beispielsweise Carbocyanine und lipophile Aminostyrole, zur Kodierung verwendet werden.
  • Als Beispiel ist in Tabelle 1 und 2 eine teilweise Auflistung verschiedener Arten von Farbstoffen und ihrer entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen angeführt, die zum Kodieren von Zellpopulationen in Sensoranordnungen gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden können. Eine besonders nützliche Literaturstelle zur Auswahl anderer Arten von Kodierungsfarbstoffen ist R.P. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6. Ausg.), Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, USA, 1996).
  • Eine Zellkodierung hebt die Notwendigkeit von mechanischem Scannen der Anordnung, mechanischem Indexieren der Position von Zellen und mechanischem Positionieren der Anordnung zur Messung von einzelnen Zellen auf. Außerdem sind durch die Kodierung aller Zellen innerhalb der Anordnung gleichzeitige Messungen der gesamten Anordnung möglich, da die Reaktionen einzelner Zellen leicht auf einen spezischen Zellpopulationstyp zurückgeführt werden können, weil jede Zelle kodiert ist. Die Kodierung von Zellen ermöglicht somit rasche, gleichzeitige Messungen aller Zellen und Zellpopulationen in der Anordnung, ohne dass die Anordnung mechanisch gescannt werden müsste, um eine Reihe von aufeinander folgenden Messungen der einzelnen Zelle durchzuführen. Da die Überwachung und Messungen der Reaktionen aller Zellen in der Anordnung gleichzeitig stattfinden, ohne dass zwischen der ersten Zellmessung und der letzten Zellmessung eine längere Verzögerungen auftreten würde, ermöglicht die Biosensoranordnung gemäß der vorliegenden Erfindung die Überwachung von sowohl kurzfristigen als auch langfristigen Zellreaktionen auf biologische Stimuli. Die Biosensoranordnung der vorliegenden Erfindung bietet somit die einzigartige Möglichkeit, sowohl Zellreaktionen als auch Reaktionsgeschwindigkeiten auf Analyte zu messen. Dieses Merkmal ermöglicht eine weitere Unterscheidung von Reaktionsinformationen, die zur Detektion von biologischen oder chemischen Analyten von Interesse nützlich sind.
  • TABELLE 1
    Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Während eine Reihe von Kodierungsfarbstoffen und -verfahren verfügbar ist, wurden in einer Ausführungsform externe fluoreszierende Zellmembranmarkierungen, PKH67 mit einer Anregungswellenlänge von 490 nm und einer Emissionswellenlänge von 502 nm und PKH26 mit einer Anregungswellenlänge von 551 nm und einer Emissionswellenlänge von 567 nm, verwendet. PKH26 und PKH67 gehören zu einer Gruppe von Farbstoffen, die von Zynaxis Cell Science (Malvern, PA) unter dem Markennamen Zyn-Linker® (Phanos Technologies Inc.) und nach dem Verfahren gemäß US-Patent 5.665.328 von Hogan et al. hergestellt wird und bei Sigma (St. Louis, MO, USA) erhältlich ist. In dieser Ausführungsform wurden beide Farbstoffe verwendet, um Fibroblastenzellen zu suspendieren und die Zellen vor ihrer Platzierung in der Sensoranordnung zu kodieren. Kodierte Zellen wurden in Mikrovertiefungen platziert, die mit Nährmedien gefüllt waren. Die kodierten Zellen wurden dann durch die Faseroptikanordnung mit Anregungslicht bestrahlt, und die resultierende Fluoreszenz-Emissionsreaktion der Zellen wurde durch die gleiche Faser aufgenommen und zum Detektionssystem geleitet. 6 zeigt eine typische optische Fluoreszenzabbildung einer mit PKH26 kodierten Zellpopulation in einer Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung. 8 zeigt eine typische Fluoreszenzabbildung einer mit PKH67 kodierten Zellpopulation in einer Biosensoranordnung. Es gilt anzumerken, dass bei Anregung bei der Kodierungsfarbstoffwellenlänge nur jene Mikrovertiefungen, die kodierte Zellen enthalten, ein Fluoreszenzsignal ergeben.
  • Bei einem typischen Kodierungsverfahren werden externe oder interne Kodierungsmarkierungen an suspendierte Zellpopulationen vor der Platzierung in der Sensoranordnung angebracht. Bei einer Ausführungsform wird eine externe Markierung an einer Zelle angebracht, indem die suspendierten Zellen zuerst mit einem serumfreien Medium gewaschen wurden und die Zellen dann 5 Minuten lang bei 2.000 U/min zu einem losen Pellet zentrifugiert wurden. Der Überstand wird entfernt, und an das Zentrifugenglas wird leicht geklopft, um die Zellen zu resuspendieren. Etwa 1 ml Diluent C, das als Farbstoffset von Sigma erhältlich ist, wurde zu den Zellen zugesetzt, und das Rohr wurde zum Vermischen umgedreht. Direkt vor der Kodierung wurde eine Lösung von 4 × 10–6 M Diluent C vorbereitet. Die suspendierten Zellen werden zur Farbstofflösung zugesetzt, durch Pipettieren der Zell/Farbstoff-Lösung vermischt und 5 Minuten lang inkubiert. Um die Kodierungsreaktion zu stoppen, wurden 2 ml fötales Kälberserum zu den Zellen zugesetzt, das Ganze wurde 1 Minute lang inkubiert und dann durch den Zusatz von 4 ml Nährmedium verdünnt. Die Zellen werden dann bei 2.000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert, um die Zellen von der Färbemittellösung zu entfernen. Der Überstand wurde entfernt, und die Zellen wurden in ein neues Glas transferiert. Schließlich werden die Zellen mindestens drei Waschgängen unterzogen, indem 10 ml Nährmedium zugesetzt, das Ganze zentrifugiert und die Zellen resuspendiert werden.
  • Figure 00410001
  • Um das Kodierungsverfahren mit PKH26- und PKH67-Farbstoffen zu demonstrieren, wurden kodierte NIH-3T3-Mäusefibroblastenzellen in Mikrovertiefungen einer Sensoranordnung verteilt, und die Position von kodierten Zellen innerhalb der Anordnung wurde durch Anregung der Zellen mit einer Wellenlänge von 551 nm bestimmt. Bei Anregung bilden die kodierten Zellen ein charakteristisches, detektierbares Fluoreszenzmuster in der Sensoranordnung, wobei das Muster eine Positionsmatrize für Zelllebensfähigkeitsmessungen unter Verwendung von BCECF und bei einer Anregungswellenlänge von 505 nm bereitstellt. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen der PKH26-Kodierungsmarkierung und des BCECF-AM-Farbstoffs sind ausreichend getrennt, so dass keine Interferenz zwischen den beiden Farbstoffen vorhanden ist. 6 ist ein charakteristisches Fluoreszenzabbildungsmuster, das die Position von PKH26-kodierten Zellen in der Biosensoranordnung identifiziert. Ein ähnliches Verfahren wurde bei der Kodierung der Mäusefibroblastenzellen mit PKH67 verwendet, deren entsprechendes charakteristisches Fluoreszenzabbildungsmuster in 8 zu sehen ist.
  • Neben der Kodierung einzelner Zellpopulationen mit einem einzelnen einzigartigen Farbstoff ist auch eine Kodierung jeder Zellpopulation in der Anordnung mit einzigartigen Farbstoffverhältnissen möglich, die ein charakteristisches Fluoreszenzintensitätsverhältnis in einem bestimmten Wellenlängenbereich ergeben. Ein Bereich von Farbstoffverhältnissen kann verwendet werden, wobei eine oder mehr Farbstoffkombinationen eine Reihe von Kodierungsverhältnissen erzeugen, die zur Identifikation einer großen Anzahl von Zellpopulationen nützlich sind. Das Fluoreszenzintensitätsverhältnis, das durch ein spezifisches Farbstoffverhältnis erzeugt wird, das zur Kodierung einer Zellpopulation verwendet wird, kann durch Subtraktion der Hintergrundintensität bei jeder Emissionswellenlänge von der mittleren Intensität und Dividieren der beiden Werte bestimmt werden, um den Bereich für das jeweilige Verhältnis zu erhalten.
  • In einer Ausführungsform wurden zwei separate Populationen von NIH-3T3-Mäusefibroblastenzellen durch die Markierung von Zellmembranen mit entweder einem 1:5- oder 5:1-Verhältnis von PHK67- und PHK26-Farbstoffen kodiert. Jede Zellpopulation umfasste etwa 125 kodierte Zellen. Die Zellpopulationen wurden bei Anregungswellenlängen von 490 nm und 551 nm bestrahlt, und emittierte Fluoreszenzintensitätsverhältnisse wurden bei 502 nm und 567 nm gemessen. Messungen des mittleren Intensitätsverhältnisses jedes einzelnen Farbstoffverhältnisses wurden über einen Zeitraum von zwei Tagen vorgenommen. Das anfängliche mittlere Intensitätsverhältnis für das 1:5-PKH67/PKH26-Verhältnis war 0,0863, und das Verhältnis für das 5:1-Farbstoffverhältnis war 0,7014. Das mittlere Intensitätsverhältnis für das 1:5-Verhältnis am Ende war 0,2655 und für das 5:1-Verhälntis 0,9090, was darauf hinweist, dass die Verhältnisse ziemlich stabil sind, auch wenn Zellteilung stattgefunden hat, und dass die durch das Farbstoffverhältnis kodierten Zellpopulationen im Laufe der Zeit unterscheidbar blieben. Somit können Farbstoffverhältnisse einen nützlichen alternativen Kodierungsmechanismus zur Identifizierung und Lokalisierung von Zellpopulationen bereitstellen, die willkürlich auf einer Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung verteilt sind.
  • F. Indikatorfarbstoffe
  • Die optischen Reaktionen der einzelnen Zellen und Zellpopulationen auf chemische oder biologische Stimuli werden typischerweise durch Kopplung einzelner Zellen mit geeigneten Indikatoren, die entweder Fluorophore, Chromophore, Färbemittel oder Farbstoffverbindungen sein können, abgefragt und detektiert. Jeder geeignete Indikator oder geeignete Kombinationen von Indikatoren können verwendet werden, solange der Indikator die Zellreaktion nicht beeinträchtigt.
  • Beispielsweise können herkömmliche Zellfluorophorsonden, wie z.B. Fluoresceine, Rhodamine, Naphthalimide, Phycobiliproteine, Nitrobenzoxadiazol, verwendet werden. Alternativ dazu können permeante oder impermeante Zellmembranpotentialindikatoren, Ionenindikatoren, reaktive Sauerstoffindikatoren und pH-Indikatoren verwendet werden. Als Beispiel ist in den Tabellen 3 bis 8 eine Reihe von Indikatoren, die besonders für die Biosensoranordnung der vorliegenden Erfindung geeignet wä ren, zusammen mit ihren charakteristischen Anregungs- und Emissionswellenlängen angeführt. Eine besonders nützliche Literaturstelle für die Auswahl von geeigneten Indikatoren ist R.P. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6. Ausg.), Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, 1996).
  • In einer Ausführungsform können Indikatoren durch Bindung an die Zellmembran, durch Absorption in das Zellzytoplasma durch membranpermeante Indikatoren oder durch Mikroinjektion in das Zellzytoplasma direkt in die Zelle inkorporiert werden. In einer alternativen Ausführungsform werden ultrafeine fluoreszierende Mikrokügelchen, wie z.B. FluoSpheresTM von Molecular Probes, von den Zellen aufgenommen und als Indikatoren eingesetzt. In einem weiteren Umfeld werden Indikatoren zum Nährmediumfluid zugesetzt, das in den Mikrovertiefungen enthalten ist. In einer alternativen Ausführungsform können Indikatoren an die Oberfläche der Mikrovertiefungen gebunden werden, und zwar mithilfe einer herkömmlichen Silanisierungsbehandlung zur Bindung des Indikators an die Glasoberfläche. In einer Ausführungsform werden natürliche oder genetisch veränderte Zelllinien, die Chemilumineszenz, Biolumineszenz oder Farbveränderungen bei Stimulation aufweisen, alleine verwendet, ohne dass ein separater Indikator notwendig wäre, da sie intrinsische optische Reaktionen erzeugen. Beispiele für solche Zellen umfassen grünfluoreszierende Proteinmutanten. In weiteren Ausführungsformen werden Zellen, die Enzyme exprimieren, mit einem Reagens verwendet, das eine optische Reaktion ermöglicht, wie beispielsweise die Bildung eines fluoreszierenden Produkts. Wenn beispielsweise Luciferase in Gegenwart von Luciferen durch eine Zelle exprimiert wird, erzeugt die Zelle eine Fluoreszenzreaktion, wenn sie biologisch stimuliert wird.
  • TABELLE 3 pH-Indikatorfamilien von Molecular Probes, um pKa zu verringern
    Figure 00450001
  • Zusammenfassung der pH-Reaktion unserer LysoSensorTM-Sonden
    Figure 00450002
  • Reaktive pH-Indikatorfarbstoffe
    Figure 00460001
  • TABELLE 4 pH-Indikatordextrane von Molacular Probes, um pKa zu verringern
    Figure 00470001
  • TABELLE 5 Zusammenfassung fluoreszierender Ca2+-Indikatoren, die von Molecular Probes erhältlich sind
    Figure 00480001
  • TABELLE 6
    Figure 00490001
  • TABELLE 7
    Figure 00500001
  • TABELLE 8
    Figure 00510001
  • In alternativen Ausführungsformen können mehrere Indikatoren innerhalb einer Zellanordnung, innerhalb einer Zellpopulation oder innerhalb einzelner Zellen verwendet werden, um eine gleichzeitige Überwachung von Zellreaktionen auf verschiedenste chemische oder biologische Materialien zu ermöglichen. Wenn zwei oder mehr Indikatoren verwendet werden, sind vor allem Farbstoffe mit spektraler Auftrennung von engen spektralen Bandbreiten nützlich, wie beispielsweise BODIPYTM-Farbstoffe von Molecular Probes.
  • G. Optische Messungen
  • Einzelne Zellen und Zellpopulationen innerhalb der Biosensoranordnung gemäß vorliegender Erfindung können optisch abgefragt werden, und Zellreaktionen können überwacht werden, indem herkömmliche optische Komponenten, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwendet werden. Wenn eine externe optische Stimulation von Zellen erforderlich ist, um eine optische Reaktion hervorzuru fen, können herkömmliche Lichtquellen wie beispielsweise Lichtbogenlampen, Photodioden oder Laser als Anregungslichtenergie verwendet werden. Zellreaktionen können mithilfe herkömmlicher Detektoren, wie beispielsweise Photovervielfacherröhren, Photodioden, Photowiderstände oder ladungsgekoppelte (CCD-) Kameras, überwacht werden. Herkömmliche Lichtwegkomponenten, wie beispielsweise Linsen, Filter, Strahlteiler, dichroitische Elemente, Prismen und Spiegel, können verwendet werden, um Licht von solch einer Lichtquelle und solchen Detektoren entweder zu diskreten Substratstellen oder durch Lichtwellenleiterstränge zu Mikrovertiefungen zu leiten, die einzelne Zellen enthalten. Die Hauptanforderung für jede spezielle optische Gerätekonfiguration, die für optischen Messungen verwendet wird, besteht darin, dass die Kombination von optischen Komponenten eine optische Kopplung der Zellen in der Anordnung an Detektoren und Lichtquellen ermöglicht. Während eine spezielle Gerätekonfiguration, die für experimentelle optische Messungen verwendet wurde, nachstehend beschrieben ist, können auch andere Konfigurationen eingesetzt werden, die funktionell gleichwertig und für eine bestimmte Messanforderung geeignet sind.
  • Bei der Apparatur, die für Fluoreszenzmessungen verwendet wird, handelt es sich um ein modifiziertes Auflichtfluoreszenzmikroskop von Olympus (Lake Success, NY, USA), das von einer vertikalen zu einer horizontalen Konfiguration umgewandelt wurde. Eine schematische Darstellung des Messsystems 100 ist in 9 zu sehen. Weißes Licht von einer 75-W-Xenonlampe 110 wird von einer Kondensorlinse 112 gebündelt, durch einen Anregungsfilter 120 geschickt, von einem dichroitischen Spiegel 130 reflektiert und mit einem Mikroskopobjektiv 140 auf das proximate Ende 210 einer Abbildungsfaser 200 fokussiert. Ein Neutralfilter 122 kann verwendet werden, um die Anregungslichtintensität einzustellen. Die Abbildungsfaser 200 wird mithilfe einer X-Y-Mikropositioniervorrichtung 150 von Spindler und Hoyer (Milford, MA, USA) und einem Z-Translationsmikroskopobjekttisch 152 exakt positioniert. Anregungslicht wird durch die Faser 200 zur Biosensoranordnung 300 am distalen Faserende 212 geleitet. Das emittierte Fluoreszenzlicht von der Biosensoranordnung wird durch die Faser 200 und durch den dichroitischen Spiegel 130 zurückgeleitet, durch einen Emissionsfilter 160 gefiltert und von einer ladungsgekoppelten (CCD-) Kamera PXLTM Photometrics (Tuscon, AZ, USA) 170 detektiert. Falls erforderlich kann eine Vergrößerungslinse 165 verwendet werden. Die Daten werden auf einem Desktop-Computer Apple Power Macintosh 440 (Sunnyvale, CA, USA) 180 unter Verwendung von IPLab 3.0 Bildverarbeitungssoftware, die im Handel von Signal Analytics (Vienna, VA, USA) erhältlich ist, verarbeitet.
  • Während ein Tischmesssystem für diese Messungen verwendet wurde, kann in einer Ausführungsform ein kompaktes tragbares Messsystem aus herkömmlichen optischen und elektronischen Komponenten zusammengestellt werden.
  • H. Anwendungen der Biosensoranordnung
  • Der Biosensor, die Biosensoranordnung, das Messgerät und das Messverfahren gemäß vorliegender Erfindung können für verschiedenste herkömmliche Tests für Screening- und Detektionszwecke verwendet werden. Der Biosensor kann für praktisch jeden Test angepasst werden und bietet einen großen Vorteil beim Hochdurchsatzscreening, bei dem viele kodierte Zellpopulationen, die in bestimmten Tests nützlich sein können oder genetisch veränderte Zellen sind, um einzigartige Reaktionen auf Analyten hervorzurufen, in einer Einzelsensoranordnung eingesetzt werden können, um viele Tests gleichzeitig auf einer kleinen Probe durchzuführen. Die Biosensoranordnung ermöglicht somit sowohl außerordentliche Effizienz beim Screenen von großen kombinatorischen Bibliotheken sowie die Durchführung vieler Tests auf extrem kleinen Probenvolumina, wie beispielsweise biologisch bedeutenden Molekülen, die auf Mikrometer kleinen Kügelchen synthetisiert wurden. Der Biosensor gemäß vorliegender Erfindung kann für praktisch jede Analytenmessung verwendet werden, bei der eine detektierbare Zellreaktion auf den Analyten aufgrund von biologischer Stimulation vorhanden ist.
  • Die Biosensoranordnung und das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung nutzt die einzigartige Fähigkeit von lebenden Zellpopulationen, auf biologisch signifikante Ver bindung auf charakteristische und detektierbare Weise zu reagieren. Da die Selektivität von lebenden Zellen für solche Verbindungen beim Screenen von Medikamenten und bei der Analyse von komplexen biologischen Fluiden sehr wichtig und nützlich ist, bietet ein Biosensor, der die einzigartigen Merkmale von lebenden Zellpopulationen nutzt, bedeutende Vorteile beim Hochdurchsatzscreening von kombinatorischen Bibliotheken, bei dem hunderttausende mögliche pharmazeutische Verbindungen evaluiert werden müssen. Außerdem können solch ein Biosensor und solch ein Messverfahren für entweder Off-line-Überwachung von Bioprozessen oder In-situ-Überwachung von Umweltschadstoffen verwendet werden, wobei die erhöhte Empfindlichkeit von lebenden Zellen gegenüber ihrem lokalen Umfeld ausgenutzt werden kann.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Detektion der Reaktionen von einzelnen Zellen auf Analyten von Interesse bereit. Mit "Analyten von Interesse" oder "Zielanalyten" oder "bioaktiven Wirkstoffkandidaten" oder "Arzneimittelkandidaten" oder grammatikalischen Äquivalenten sind hierin alle Moleküle gemeint, z.B. Proteine, Oligopeptide, kleine organische Moleküle, Polysaccharide, Polynucleotide usw., die auf ihre Fähigkeit, einen zellulären Phänotyp, einschließlich seiner optischen Eigenschaften, direkt oder indirekt zu verändern, getestet werden sollen. Im Allgemeinen werden mehrere Testgemische parallel mit unterschiedlichen Stoffkonzentrationen laufen gelassen, um eine unterschiedliche Reaktion auf die verschiedenen Konzentrationen zu erhalten. Typischerweise dient eine dieser Konzentrationen als negative Kontrolle, d.h. sie weist eine Konzentration von 0 oder eine Konzentration unter der Detektionsgrenze auf.
  • Analyten umfassen zahlreichen chemische Klassen, obwohl sie typischerweise organische Moleküle, vorzugsweise kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 und weniger als etwa 2.500 Dalton, sind. Analyten umfassen funktionelle Gruppen, die für strukturelle Interaktionen mit Proteinen, insbesondere Wasserstoffbindung, notwendig sind, und umfassen typischerweise zumindest eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxy- oder Carboxygruppe, vorzugsweise zumindest zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die Wirkstoffkandidaten umfassen oft zyklischen Kohlenstoff oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren der obigen funktionellen Gruppen substituiert sind. Wirkstoffkandidaten finden sich auch unter Biomolekülen, einschließlich Peptiden, Sacchariden, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, strukturellen Analoga oder Kombinationen davon. Insbesondere bevorzugt sind Peptide.
  • Wirkstoffkandidaten werden aus verschiedensten Quellen erhalten, wozu auch Bibliotheken von synthetischen oder natürlichen Verbindungen gehören. So sind beispielsweise zahlreiche Mittel zur statistischen und gerichteten Synthese verschiedenster organischer Verbindungen und Biomoleküle verfügbar, wie beispielsweise die Expression von randomisierten Oligonucleotiden. Alternativ dazu sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in Form von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten verfügbar oder können leicht hergestellt werden. Außerdem können natürliche oder synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen leicht durch herkömmliche chemische, physikalische und biochemische Mittel modifiziert werden. Bekannte pharmakologische Wirkstoffe können gerichtet oder willkürlichen chemischen Modifikationen, wie beispielsweise Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidierung, unterzogen werden, um strukturelle Analoga herzustellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Wirkstoffkandidaten natürlich vorkommende Proteine oder Fragmente von natürlich vorkommenden Proteinen. So könne beispielsweise Zellextrakte, die Proteine enthalten, oder willkürliche oder gerichtete Verdaue von proteinhältigen Zellextrakten verwendet werden. Auf diese Weise können Bibliotheken von prokaryotischen und eukaryotischen Proteinen zum Screenen gemäß den Verfahren der Erfindung hergestellt werden. Insbesondere bevorzugt in dieser Ausführungsform sind Bibliotheken von Bakterien-, Pilz-, Virus- und Säugetierproteinen, wobei Letztere bevorzugt sind und menschliche Proteine insbesondere bevorzugt sind.
  • Die Peptide können Verdaue von natürlich vorkommenden Proteinen, wie sie oben beschrieben sind, statistische Peptide oder "gerichtete" statistische Peptide sein. Unter "randomisiert" oder grammatikalischen Äquivalenten versteht man hierin, dass jede Nucleinsäure und jedes Peptid aus im Wesentlichen zufälligen Nucleotiden bzw. Aminosäuren besteht. Da diese statistischen Peptide (oder Nucleinsäuren, wie weiter unten dargelegt ist) im Allgemeinen chemisch synthetisiert sind, können sie jedes beliebige Nucleotid oder jede beliebige Aminosäure an jeder Position inkorporieren. Das Syntheseverfahren kann so aufgebaut sein, dass randomisierte Proteine oder Nucleinsäuren gebildet werden, um die Bildung alter oder der meisten der möglichen Kombinationen über die Sequenzlänge zu ermöglichen, wodurch eine Bibliothek von randomisierten bioaktiven proteinhältigen Wirkstoffkandidaten erstellt wird.
  • In einer Ausführungsform ist die Bibliothek vollständig randomisiert, ohne Sequenzpräferenzen oder Konstanten an irgendeiner Position. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bibliothek gerichtet. D.h. einige Positionen innerhalb der Sequenz werden entweder konstant gehalten oder aus einer begrenzten Anzahl an Möglichkeiten ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind beispielsweise die Nucleotide oder Aminosäurereste innerhalb einer definierten Klasse, beispielsweise von hydrophoben Aminosäuren, hydrophilen Resten, sterisch gerichteten (entweder kleinen oder großen) Resten, randomisiert, und zwar in Richtung der Bildung von Nucleinsäure bindenden Domänen, der Bildung von Cysteinen, für Vernetzungen, Proline für SH-3-Domänen, Serine, Threonine, Tyrosine oder Histidine für Phosphorylierungsstellen usw. oder Purine usw.
  • Wie weiter oben allgemein für Proteine beschrieben ist, können bioaktive Nucleinsäure-Wirkstoffkandidaten natürlich vorkommende Nucleinsäuren, statistische Nucleinsäuren oder "gerichtete" willkürliche Nucleinsäuren sein. Beispielsweise können Verdaue von prokaryotischen oder eukaryotischen Genomen so verwendet werden, wie es oben für Proteine beschrieben ist. "Nucleinsäuren" umfassen in diesem Kontext sowohl DNA als auch RNA, und Nucleinsäureanaloga umfassen PNA. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Wirkstoffkandidaten organische chemische Gruppierungen, wovon viele schon in der Literatur erläutert wurden.
  • Während die nachstehenden Beispiele verschiedene spezifische Tests aufzeigen, die bei der Konfiguration und der Verwendung der Biosensoranordnung und des Verfahrens der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, dienen diese weder zur Einschränkung des beabsichtigten Anwendungsumfangs noch des großen Bereichs der Messverfahren, welche die Verwendung des Biosensors der vorliegenden Erfindung mit verschiedensten Zellpopulationen vorsieht.
  • In einer Ausführungsform kann die Biosensoranordnung für eine Fernüberwachung von Redoxzuständen von einzelnen Zellen oder Zellpopulationen in Bioprozessen verwendet werden. Beispielsweise kann NADH-abhängige Fluoreszenz in Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- oder Tierzellen gemessen werden. NAD(P)/NAD(P)H kann gemessen werden, um Veränderungen von aeroben zu anaeroben Metabolismen in Fermentationsprozessen zu überwachen, wobei das von Luong et al. in Practical Fluorescence, G. Guilbault, Hrsg., Marcel Dekker, New York (1990), offenbarte Verfahren angewandt wird.
  • Alternativ dazu kann die Biosensoranordnung für In-situ-Überwachung von zellulären Prozessen als Reaktion auf Umweltschadstoffe verwendet werden, indem das von Hughes et al., Analytica Chimica Acta 307, 393 (1995), inkorporiert wird, um unterscheidbare Reaktionen einer Zellpopulation in einer Anordnung bereitzustellen. Bei diesem Verfahren werden Mikrometer kleine Kügelchen, die mit einem Fluorophor imprägniert und auf der Oberfläche mit einer fluorogenen Enzymsonde modifiziert wurden, von Zellen aufgenommen, wodurch enzymatische Aktivität auf der Oberfläche der Kügelchen auftritt, die ein detektierbares Fluoreszenzsignal erzeugt.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann die Biosensoranordnung mit genetisch veränderten biolumineszenten Bakterien zur In-situ-Überwachung und optischen Messung von Metallverbindungen verwendet werden. Beispielsweise können Reak tionen von Zellpopulationen auf Antimonit und Arsenit genutzt werden, indem das von Ramanathan et al., Anal. Chem. 69, 3380 (1997), offenbarte Verfahren in Zellpopulationen innerhalb der Biosensoranordnung inkorporiert wird. Mit diesem Verfahren reguliert ein Zellplasmid die Expression von bakterieller Luciferase, je nach Metallkonzentration.
  • In einer weiteren Ausführungsform können die Zellpopulationen innerhalb der Biosensoranordnung mit ATP-abhängigen lumineszenten Proteinen, wie beispielsweise Glühwürmchen-Luciferase, kodiert werden, die für pathologische Untersuchungen gemäß dem Verfahren von Koop et al., Biochem. J. 295, 165 (1993), in Ratten-Hepatozyten injiziert werden. Diese Zellen weisen einen Rückgang an zytoplasmatischem ATP auf, wenn sie pathologischen Schädigungen ausgesetzt werden, und Veränderungen der Fluoreszenz stehen in direktem Zusammenhang mit dem Gehalt an Stoffwechselgift in der Zelle.
  • In einer Ausführungsform können die Zellpopulationen innerhalb der Biosensoranordnung mit einem grünfluoreszierenden Protein kodiert werden [siehe T. Gura, Science 276, 1989 (1997); Niswender et al., J. Microscopy 180(2), 109 (1995); Cubitt et al., TIBS 20, 448 (1995); Miyawaki et al., Nature 388, 882 (1997)]. Verschiedene genetisch veränderte Mutanten von GFP sind verfügbar, die unterscheidbare Fluoreszenzemissionswellenlängen aufweisen. Diese Proteine sind außerdem als fluoreszierende Indikatoren von Genexpression und Ca+-Werten innerhalb von Zellen nützlich.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann die Biosensoranordnung bei Messungen von Zellproliferation durch In-situ-Überwachung von Calciumwerten und Calciumschwankungen in einzelnen Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern, wie beispielsweise Äquorin oder Fura-2, verwendet werden, wobei das von Cobbold et al., Cell Biology 1, 311 (1990), offenbarte Verfahren Anwendung findet.
  • Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich ist, können die Tests gemäß vorliegender Erfindung auf verschiedenste Weisen und für verschiedenste Zwecke durchgeführt werden. Die Zellen können beispielsweise als Detektionssystem für einen bestimmten Analyt verwendet werden; die Zellen durchlaufen eine charakteristische optisch detektierbare Veränderung in Gegenwart eines bestimmten Analyts. Alternativ dazu können die Zellen zum Screenen von Bibliotheken von Arzneimittelkandidaten auf die Fähigkeit, einen zellulären Phänotyp zu verändern, der optisch detektierbar ist, verwendet werden. Beispielsweise kann die Expression eines therapeutisch relevanten Zelloberflächenrezeptors so gesteigert werden, dass der Rezeptor an eine Fluoreszenzliganden binden kann; auf ähnliche Weise kann ein therapeutisch relevantes Enzym so aktiviert werden, dass ein fluoreszierendes Reaktionsprodukt gebildet wird. Auf diese Weise kann jede Modulation, einschließlich Steigerungen und Rückgängen, überwacht werden. Auf ähnliche Weise erleichtert die Verwendung von Reportergenen, wie beispielsweise grünfluoreszierenden Proteinen und Derivaten davon, Hochdurchsatzscreening für relevante Analytinteraktionen, indem beispielsweise induzierbare Promotoren verwendet werden.
  • Im Allgemeinen wird in einer bevorzugten Ausführungsform vor der Analyse ein bioaktiver Wirkstoffkandidat zu den Zellen zugesetzt, und die Zellen werden eine Zeit lang inkubieren gelassen. Mit "Verabreichung" oder "Kontaktieren" ist hierin gemeint, dass der Wirkstoffkandidat so zu den Zellen zugesetzt wird, dass der Wirkstoff auf die Zellen wirken kann, entweder durch Aufnahme und intrazelluläre Wirkung oder durch Wirkung auf der Zelloberfläche. In manchen Ausführungsformen kann eine Nucleinsäure, die für einen proteinartigen Wirkstoffkandidaten (d.h. ein Peptid) kodiert, in ein Viruskonstrukt, wie beispielsweise ein Retroviruskonstrukt, gegeben und zur Zelle zugesetzt werden, so dass die Expression des Peptidstoffs erreicht wird; siehe WO 97/27212.
  • Sobald der Wirkstoffkandidat den Zellen verabreicht wurde, können die Zellen falls gewünscht gewaschen werden und werden unter vorzugsweise physiologischen Bedingungen eine Zeit lang inkubieren gelassen.
  • Die hierin angeführten Reaktionen können auf verschiedene Arten durchgeführt werden, wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich ist. Komponenten der Reaktion können gleichzeitig oder nacheinander in beliebiger Reihenfolge zugesetzt werden. Außerdem kann die Reaktion eine Reihe anderer Reagenzien während des Tests umfassen. Diese umfassen Reagenzien, wie beispielsweise Salze, Puffer, neutrale Proteine, z.B. Albumin, Detergenzien usw., die zur Vereinfachung der optimalen Detektion und/oder Reduktion nichtspezifischer und Hintergrundwechselwirkungen eingesetzt werden können. Auch Reagenzien, welche die Effizienz des Tests auf andere Weise verbessern, wie beispielsweise Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren, antimikrobielle Wirkstoffe usw., können verwendet werden.
  • Im Allgemeinen ist zumindest eine Komponente des Tests markiert. Mit "markiert" ist hierin gemeint, dass die Verbindung entweder direkt oder indirekt mit einer Markierung ausgestattet ist, die ein detektierbares Signal erzeugt, wie beispielsweise Radioisotope, fluoreszierende Stoffe, Enzyme, Antikörper, Teilchen, wie beispielsweise magnetische Teilchen, chemilumineszenten Stoffen oder spezifischen Bindemolekülen usw. Spezifische Bindemoleküle umfassen Paare, wie beispielsweise Biotin und Streptavidin, Digoxin und Antidigoxin usw. Bei den spezifischen Bindeelementen wäre das komplementäre Element normalerweise mit einem Molekül markiert, das eine Detektion nach bekannten Verfahren ermöglicht, wie weiter oben dargelegt ist. Die Markierung kann direkt oder indirekt ein detektierbares Signal erzeugen.
  • Sobald der Test durchgeführt wird, werden die Daten analysiert, um die Ergebnisse des Versuchs zu erhalten, d.h. entweder die Gegenwart oder die Abwesenheit eines Zielanalyts, die Wirkung eines Wirkstoffkandidaten auf einen zellulären Phänotyp usw. zu bestimmen. Das erfolgt im Allgemeinen auf einem Computer.
  • Auf diese Weise werden bioaktive Wirkstoffe identifiziert. Verbindungen mit pharmakologischer Aktivität können einen zellulären Phänotyp verändern. Die Verbindungen mit der gewünschten pharmakologischen Aktivität können in einem physiologisch annehmbaren Träger an einen Wirt verabreicht werden, wie oben beschrieben ist. Die Wirkstoffe können auf verschiedene Arten verabreicht werden: oral, parenteral, z.B. subkutan, intraperitoneal, intravaskulär usw. Je nach Art der Einbringung können die Verbindungen auf unterschiedliche Arten formuliert werden. Die Konzentration der therapeutisch aktiven Verbindung in der Formulierung kann von etwa 0,1 bis 100 Gew.-% variieren.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in verschiedenen Formen hergestellt werden, beispielsweise als Körnchen, Tabletten, Pillen, Zäpfchen, Kapseln, Suspensionen, Salben, Lotionen und dergleichen. Organische oder anorganische Träger und/oder Verdünner pharmazeutischer Güte, die zur oralen und topischen Verwendung geeignet sind, können verwendet werden, um Zusammensetzungen herzustellen, welche die therapeutisch aktiven Verbindungen enthalten. Auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verdünner umfassen wässrige Medien, pflanzliche und tierische Öle und Fette. Stabilisatoren, Benetzungsmittel und Emulgiermittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks oder Puffer zur Sicherung eines geeigneten pH-Werts sowie Hautpenetrationsfördermittel können als Hilfsmittel eingesetzt werden.
  • Während diese Erfindung vor allem in Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen erläutert wurde, ist für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich, dass die Form und Details der Erfindung geändert werden können, die in den beiliegenden Ansprüchen dargelegt ist.

Claims (25)

  1. Biosensor zum Detektieren der Reaktion einzelner Zellen auf zumindest einen Analyten von Interesse, umfassend: a) ein Substrat, das eine Vielzahl von einzelnen Stellen umfasst; und b) eine Vielzahl von Zellen, die an einer der einzelnen Stellen verteilt sind, worin jede Zelle mit zumindest einem optisch abfragbaren Material kodiert ist; worin das Substrat eine Faseroptikanordnung umfasst, die aus einer Vielzahl von Fasern besteht, wobei jede Faser ein distales und ein proximales Ende aufweist, die einzelnen Stellen eine Vielzahl von Mikrovertiefungen umfassen, die jeweils auf einer Endfläche des distalen Endes ausgebildet sind, und die einzelnen Zellen in einer der Mikrovertiefungen verteilt sind, worin jede Zelle mit dem distalen Ende zumindest einer der Fasern in der Anordnung optisch gekoppelt und in optischer Kommunikation steht.
  2. Biosensor nach Anspruch 1, worin die Stellen einen Innendurchmesser von etwa 1 μm bis etwa 200 μm, eine Tiefe von etwa 0,25 μm bis etwa 200 μm und ein Volumen von etwa 1 fl bis etwa 5 nl aufweisen.
  3. Biosensor nach Anspruch 2, worin die Fasern außerdem einen Faserkern mit einem Durchmesser von etwa 1 μm bis etwa 200 μm umfassen.
  4. Biosensor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin eine Oberfläche der Stellen mit einem biologisch verträglichen Material beschichtet ist.
  5. Biosensor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin eine Indikatorverbindung an zumindest eine der Zellen gebunden ist oder in zumindest eine der Zellen eingeführt wird.
  6. Biosensor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Vielzahl von Zellen zumindest zwei Zellpopulationen umfasst.
  7. Biosensor nach Anspruch 6, worin jede Zellpopulation mit zumindest einem optisch abfragbaren Material kodiert ist, das aus der aus einem Farbstoff, einem Fluorophor, einem Chromophor, einer chemilumineszenten Verbindung und einer biolumineszenten Verbindung bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  8. Biosensor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin jede Zellpopulation mit zumindest einem optisch abfragbaren Material selbstkodiert ist.
  9. Biosensor nach Anspruch 8, worin das optisch abfragbare Material der einzelnen selbstkodierten Zellen von Natur aus fluoresziert.
  10. Biosensor nach Anspruch 8, worin das optisch abfragbare Material der einzelnen selbstkodierten Zellen gentechnisch so modifiziert ist, dass es fluoresziert.
  11. Biosensor nach einem der Ansprüche 8 bis 10, worin das optisch abfragbare Material der einzelnen selbstkodierten Zellen aus einer aus Fluorophoren, Chromophoren, Färbemitteln oder Farbstoffverbindungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  12. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die einzelnen Zellen direkt mit zumindest einem optisch abfragbaren Material kodiert sind.
  13. Gerät zum Detektieren der Reaktion von einzelnen Zellen auf zumindest einen Analyten von Interesse, umfassend: a) eine Biosensoranordnung, umfassend i) ein Substrat, das eine Vielzahl von einzelnen Stellen umfasst; und ii) eine Vielzahl von Zellen, wobei jede Zelle an einer der einzelnen Stellen verteilt ist, worin jede Zelle mit zumindest einem optisch abfragbaren Material kodiert ist; b) einen Detektor, der mit den einzelnen Stellen auf dem Substrat optisch gekoppelt und in optischer Kommunikation steht, wobei der Detektor zur Detektion einer optischen Reaktion der an den einzelnen Stellen verteilten Zellen auf einen Analyten fähig ist; worin: das Substrat eine Faseroptikanordnung umfasst, die aus einer Vielzahl von Fasern besteht, wobei jede Faser ein distales und ein proximales Ende aufweist; die einzelnen Stellen eine Vielzahl von Mikrovertiefungen umfassen, die jeweils auf einer Endfläche des distalen Endes der Fasern ausgebildet sind; die einzelnen Zellen in einer der Mikrovertiefungen verteilt sind; und das Detektormittel mit einem proximalen Ende der Fasern optisch gekoppelt und in optischer Kommunikation steht, um eine optische Reaktion der Zellen an den distalen Faserenden zu detektieren.
  14. Gerät nach Anspruch 13, worin jede Zellpopulation mit zumindest einem optisch abfragbaren Material selbstkodiert ist.
  15. Gerät nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, das außerdem ein Anregungslichtenergiemittel umfasst, das an ein Ende der Fasern gekoppelt ist.
  16. Gerät nach einem der Ansprüche 13 bis 15, das außerdem ein Abbildungsaufzeichnungsmittel zum Aufzeichnen von Abbildungen von detektierten optischen Reaktionen von einer Vielzahl von Zellen umfasst.
  17. Gerät nach Anspruch 16, worin das Abbildungsaufzeichnungsmittel eine ladungsgekoppelte (CCD-) Kamera umfasst.
  18. Verfahren zum Detektieren der Reaktion einzelner Zellen auf zumindest einen Analyten von Interesse, umfassend: a) das Bereitstellen einer Biosensoranordnung, umfassend: i) ein Substrat, das eine Vielzahl von einzelnen Stellen umfasst; und ii) eine Vielzahl von Zellen, die an den einzelnen Stellen verteilt sind, worin jede Zelle mit zumindest einem optisch abfragbaren Material kodiert ist; b) das Kontaktieren der Biosensoranordnung mit einem Analyten von Interesse; und c) das Detektieren einer optischen Reaktion der Zellen; worin: 1) das Bereitstellen einer Biosensoranordnung Folgendes umfasst: i) ein Substrat, das eine Faseroptikanordnung umfasst, die aus einer Vielzahl von Fasern besteht, wobei jede Faser ein distales und ein proximales Ende aufweist; ii) die einzelnen Stellen eine Vielzahl von Mikrovertiefungen umfassen, die jeweils auf einer Endfläche des distalen Endes der Fasern ausgebildet sind; iii) die Verteilung von einzelnen Zellen in einer der Mikrovertiefungen; und 2) das Detektieren das Bereitstellen eines Detektormittels umfasst, das mit einem proximalen Ende der Fasern optisch gekoppelt und in optischer Kommunikation steht, um eine optische Reaktion der Zellen am distalen Faserende zu detektieren.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, worin der Analyt von Interesse eine optisch detektierbare Markierung umfasst.
  20. Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin der Biosensor mit einer Vielzahl von Analyten in Kontakt gebracht wird.
  21. Verfahren zur Herstellung einer Biosensoranordnung zum Detektieren der Reaktion einzelner Zellen auf zumindest einen Analyten von Interesse, umfassend: a) das Bereitstellen eines Substrats, das eine Vielzahl von einzelnen Stellen umfasst; und b) das Kontaktieren des Substrats mit einer Vielzahl von Zellen, so dass die einzelnen Zellen an den einzelnen Stellen verteilt sind; worin: 1) das Bereitstellen eines Substrats eine Faseroptikanordnung umfasst, die Folgendes umfasst: i) eine Vielzahl von Fasern, wobei jede Faser ein distales Ende und ein proximales Ende aufweist; und ii) eine Vielzahl von Mikrovertiefungen, die jeweils auf einer Endfläche des distalen Endes ausgebildet sind; und 2) das Kontaktieren das Kontaktieren der Faseroptikanordnung mit einer Vielzahl von Zellen umfasst, so dass jede Zelle in eine der Mikrovertiefungen eingeführt wird.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, worin die Vielzahl von Zellen zumindest zwei Zellpopulationen umfasst.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 22, worin jede Zellpopulation mit zumindest einem optisch abfragbaren Material selbstkodiert ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, worin das zumindest eine optisch abfragbare. Material aus der aus einem Farbstoff, einem Fluorophor, einem Chromophor, einer chemilumineszenten Verbindung und einer biolumineszenten Verbindung bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, das außerdem das Indizieren des Aufenthaltsorts einzelner Zellen in der Anordnung umfasst, indem Lichtenergie ausgesandt wird, die durch Bestrahlen der selbstkodierten Zellen mit Anregungslichtenergie erzeugt wird.
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Families Citing this family (359)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19621312A1 (de) * 1996-05-28 1997-12-04 Bayer Ag Maskierung der Hintergrundfluoreszenz und Signalverstärkung bei der optischen Analyse biologisch medizinischer Assays
US5989835A (en) * 1997-02-27 1999-11-23 Cellomics, Inc. System for cell-based screening
US7117098B1 (en) 1997-02-27 2006-10-03 Cellomics, Inc. Machine-readable storage medium for analyzing distribution of macromolecules between the cell membrane and the cell cytoplasm
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US7622294B2 (en) * 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US7019827B2 (en) * 1997-06-16 2006-03-28 Diversa Corporation GigaMatrix holding tray having through-hole wells
US7348181B2 (en) 1997-10-06 2008-03-25 Trustees Of Tufts College Self-encoding sensor with microspheres
US6485905B2 (en) * 1998-02-02 2002-11-26 Signature Bioscience, Inc. Bio-assay device
US20060105357A1 (en) * 1998-02-18 2006-05-18 Myomics, Inc. Tissue sensor and uses thereof
EP1090293B2 (de) * 1998-06-24 2019-01-23 Illumina, Inc. Dekodierung von matrixartig-angeordneten Sensoren durch Mikropartikel
US6432364B1 (en) * 1998-07-06 2002-08-13 Suzuki Motor Corporation SPR sensor cell and immunoassay apparatus using the same
US6908770B1 (en) * 1998-07-16 2005-06-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Fluid based analysis of multiple analytes by a sensor array
WO2000026666A2 (en) * 1998-10-29 2000-05-11 Cell Works Inc. Multiple marker characterization of single cells
US7510841B2 (en) * 1998-12-28 2009-03-31 Illumina, Inc. Methods of making and using composite arrays for the detection of a plurality of target analytes
JP4454155B2 (ja) 1999-01-08 2010-04-21 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー 化学種を接触させるためのファイバーアレイならびにファイバーアレイを使用および作製する方法
US7595189B2 (en) 1999-01-08 2009-09-29 Applied Biosystems, Llc Integrated optics fiber array
US20030207249A1 (en) * 1999-04-15 2003-11-06 Beske Oren E. Connection of cells to substrates using association pairs
US20030166015A1 (en) * 1999-04-15 2003-09-04 Zarowitz Michael A. Multiplexed analysis of cell-substrate interactions
WO2002037944A2 (en) * 2000-10-18 2002-05-16 Virtual Arrays, Inc. Multiplexed cell analysis system
WO2000063419A1 (en) * 1999-04-15 2000-10-26 Virtual Arrays, Inc. Combinatorial chemical library supports having indicia at coding positions and methods of use
US6908737B2 (en) * 1999-04-15 2005-06-21 Vitra Bioscience, Inc. Systems and methods of conducting multiplexed experiments
US20030134330A1 (en) * 1999-04-15 2003-07-17 Ilya Ravkin Chemical-library composition and method
US20030129654A1 (en) * 1999-04-15 2003-07-10 Ilya Ravkin Coded particles for multiplexed analysis of biological samples
US7253435B2 (en) * 1999-04-15 2007-08-07 Millipore Corporation Particles with light-polarizing codes
EP1923472B1 (de) 1999-04-20 2012-04-11 Illumina, Inc. Erkennung von Nukleinsäurereaktionen auf Bead-Arrays
US20060275782A1 (en) * 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US8080380B2 (en) * 1999-05-21 2011-12-20 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US8481268B2 (en) 1999-05-21 2013-07-09 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
EP1204859B1 (de) 1999-07-16 2006-11-22 The Board Of Regents, The University Of Texas System Verfahren und vorrichtung zur zuführung von proben zu einer chemischen sensormatrix
US7179638B2 (en) 1999-07-30 2007-02-20 Large Scale Biology Corporation Microarrays and their manufacture by slicing
US20020015952A1 (en) * 1999-07-30 2002-02-07 Anderson Norman G. Microarrays and their manufacture by slicing
US6653151B2 (en) 1999-07-30 2003-11-25 Large Scale Proteomics Corporation Dry deposition of materials for microarrays using matrix displacement
US6713309B1 (en) * 1999-07-30 2004-03-30 Large Scale Proteomics Corporation Microarrays and their manufacture
DE19935433A1 (de) * 1999-08-01 2001-03-01 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Mikrofluidischer Reaktionsträger
US7211390B2 (en) * 1999-09-16 2007-05-01 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7244559B2 (en) * 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
AU4503201A (en) * 1999-10-14 2001-06-12 University Of Utah Research Foundation Resonant optical cavities for high-sensitivity, high-throughput biological sensors and methods
US6254830B1 (en) * 1999-11-05 2001-07-03 The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And Providence Plantations Magnetic focusing immunosensor for the detection of pathogens
US7167615B1 (en) 1999-11-05 2007-01-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Resonant waveguide-grating filters and sensors and methods for making and using same
US8111401B2 (en) * 1999-11-05 2012-02-07 Robert Magnusson Guided-mode resonance sensors employing angular, spectral, modal, and polarization diversity for high-precision sensing in compact formats
WO2001035072A2 (en) * 1999-11-09 2001-05-17 Cellomics, Inc. A system for cell-based screening
US10172730B2 (en) * 1999-11-19 2019-01-08 Vactronix Scientific, Llc Stents with metallic covers and methods of making same
US20020197656A1 (en) * 1999-12-17 2002-12-26 Ronghao Li Cell arrays and the uses thereof
US6406840B1 (en) * 1999-12-17 2002-06-18 Biomosaic Systems, Inc. Cell arrays and the uses thereof
WO2001055702A1 (en) * 2000-01-31 2001-08-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Portable sensor array system
EP1122535A3 (de) * 2000-01-31 2004-09-22 The Penn State Research Foundation Verfahren zur Prüfung des Inhalts eines verschlossenen Behälters
US7485454B1 (en) * 2000-03-10 2009-02-03 Bioprocessors Corp. Microreactor
US6362006B1 (en) * 2000-03-13 2002-03-26 General Electric Company Rapid parallel determination of non-volatile analytes in complex combinatorial samples
CN1430726A (zh) * 2000-03-21 2003-07-16 伊利诺伊大学受托管理委员会 具有染料阵列的比色人工鼻和用于人工嗅觉的方法
NZ521626A (en) 2000-03-29 2005-09-30 Cambia Methods for genotyping by hybridization analysis
JP2001282140A (ja) * 2000-03-31 2001-10-12 Sony Corp 情報受信表示装置
US7175811B2 (en) * 2000-04-28 2007-02-13 Edgelight Biosciences Micro-array evanescent wave fluorescence detection device
US6650919B2 (en) * 2000-05-03 2003-11-18 Cornell Research Foundation, Inc. Enhanced biologically based chronotropic biosensing
IL136232A0 (en) * 2000-05-18 2001-05-20 Bar Ilan University Res Author Measurements of enzymatic activity in a single, individual cell in population
WO2002010761A1 (en) * 2000-07-28 2002-02-07 Large Scale Proteomics Corporation Microarrays and their manufacture by slicing
JP2002139499A (ja) * 2000-08-23 2002-05-17 Sanyo Electric Co Ltd 化学物質センサおよび化学物質の検出方法
US6610499B1 (en) * 2000-08-31 2003-08-26 The Regents Of The University Of California Capillary array and related methods
AU2001288751A1 (en) * 2000-09-05 2002-03-22 Illumina, Inc. Cellular arrays comprising encoded cells
ATE425457T1 (de) * 2000-10-06 2009-03-15 Life Technologies Corp Zellen mit spektraler signatur sowie verfahren zu ihrer herstellung und nutzung
US20050059031A1 (en) * 2000-10-06 2005-03-17 Quantum Dot Corporation Method for enhancing transport of semiconductor nanocrystals across biological membranes
US7384797B1 (en) 2000-10-12 2008-06-10 University Of Utah Research Foundation Resonant optical cavities for high-sensitivity high-throughput biological sensors and methods
JP2004537712A (ja) * 2000-10-18 2004-12-16 バーチャル・アレイズ・インコーポレーテッド 多重細胞分析システム
US7875434B2 (en) * 2000-10-30 2011-01-25 Sru Biosystems, Inc. Label-free methods for performing assays using a colorimetric resonant reflectance optical biosensor
US7023544B2 (en) 2000-10-30 2006-04-04 Sru Biosystems, Inc. Method and instrument for detecting biomolecular interactions
US6951715B2 (en) * 2000-10-30 2005-10-04 Sru Biosystems, Inc. Optical detection of label-free biomolecular interactions using microreplicated plastic sensor elements
US7575939B2 (en) * 2000-10-30 2009-08-18 Sru Biosystems, Inc. Optical detection of label-free biomolecular interactions using microreplicated plastic sensor elements
US7264973B2 (en) * 2000-10-30 2007-09-04 Sru Biosystems, Inc. Label-free methods for performing assays using a colorimetric resonant optical biosensor
US7094595B2 (en) * 2000-10-30 2006-08-22 Sru Biosystems, Inc. Label-free high-throughput optical technique for detecting biomolecular interactions
US7142296B2 (en) * 2000-10-30 2006-11-28 Sru Biosystems, Inc. Method and apparatus for detecting biomolecular interactions
US20030113766A1 (en) * 2000-10-30 2003-06-19 Sru Biosystems, Llc Amine activated colorimetric resonant biosensor
US7153702B2 (en) * 2000-10-30 2006-12-26 Sru Biosystems, Inc. Label-free methods for performing assays using a colorimetric resonant reflectance optical biosensor
US7070987B2 (en) * 2000-10-30 2006-07-04 Sru Biosystems, Inc. Guided mode resonant filter biosensor using a linear grating surface structure
US20030092075A1 (en) * 2000-10-30 2003-05-15 Sru Biosystems, Llc Aldehyde chemical surface activation processes and test methods for colorimetric resonant sensors
US7217574B2 (en) * 2000-10-30 2007-05-15 Sru Biosystems, Inc. Method and apparatus for biosensor spectral shift detection
US7371562B2 (en) 2000-10-30 2008-05-13 Sru Biosystems, Inc. Guided mode resonant filter biosensor using a linear grating surface structure
US7175980B2 (en) * 2000-10-30 2007-02-13 Sru Biosystems, Inc. Method of making a plastic colorimetric resonant biosensor device with liquid handling capabilities
US7300803B2 (en) * 2000-10-30 2007-11-27 Sru Biosystems, Inc. Label-free methods for performing assays using a colorimetric resonant reflectance optical biosensor
US7615339B2 (en) * 2000-10-30 2009-11-10 Sru Biosystems, Inc. Method for producing a colorimetric resonant reflection biosensor on rigid surfaces
GB0029590D0 (en) * 2000-12-05 2001-01-17 Univ Heriot Watt Bio-strings
US6777244B2 (en) 2000-12-06 2004-08-17 Hrl Laboratories, Llc Compact sensor using microcavity structures
WO2002054969A1 (en) * 2001-01-10 2002-07-18 Blood Cell Storage Inc. System for growth, analysis, storage, validation and distribution of cells and tissues used for biomedical purposes
JP3525142B2 (ja) * 2001-01-12 2004-05-10 独立行政法人 科学技術振興機構 金属ナノウェルを用いた蛍光分析用素子及びその製造方法
US20020160363A1 (en) * 2001-01-31 2002-10-31 Mcdevitt John T. Magnetic-based placement and retention of sensor elements in a sensor array
JP2004529323A (ja) * 2001-01-31 2004-09-24 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム ミクロ機械加工した化学センサ・アレイ内に材料を閉じ込めるための方法および装置
US20030003436A1 (en) * 2001-02-05 2003-01-02 Willson C. Grant Use of mesoscale self-assembly and recognition to effect delivery of sensing reagent for arrayed sensors
WO2002073200A1 (en) * 2001-03-12 2002-09-19 Cellomics, Inc. Methods to increase the capacity of high content cell-based screening assays
DE10112505C1 (de) * 2001-03-15 2003-01-30 Iongate Biosciences Gmbh Sensoranordnung und Vorrichtung zur amperometrischen und/oder potentiometrischen, pharmakologischen Wirkort- und/oder Wirkstofftestung sowie Verfahren zur amperometrischen und/oder potentiometrischen, pharmakologischen Wirkort- und/oder Wirkstofftestung
WO2002077207A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-03 Surromed, Inc. Cell-based assays for the simultaneous and discrete analysis of multiple analytes
JP2004527247A (ja) * 2001-04-10 2004-09-09 バイオプロセッサーズ コーポレイション 微小発酵器デバイスおよび細胞ベースのスクリーニング法
US20050032204A1 (en) * 2001-04-10 2005-02-10 Bioprocessors Corp. Microreactor architecture and methods
US20040132166A1 (en) * 2001-04-10 2004-07-08 Bioprocessors Corp. Determination and/or control of reactor environmental conditions
US20040058407A1 (en) * 2001-04-10 2004-03-25 Miller Scott E. Reactor systems having a light-interacting component
US20040058437A1 (en) * 2001-04-10 2004-03-25 Rodgers Seth T. Materials and reactor systems having humidity and gas control
AU2002306634A1 (en) * 2001-05-24 2004-11-01 Virtual Arrays, Inc. Multiplexed cell analysis system
US20050009022A1 (en) * 2001-07-06 2005-01-13 Weiner Michael P. Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter
WO2003008943A1 (en) * 2001-07-19 2003-01-30 Tufts University Optical array device and methods of use thereof for screening, analysis and manipulation of particles
EP1420250A4 (de) * 2001-07-31 2006-03-22 Olympus Corp Geninspektionsvorrichtung und diese verwendendes zielnukleinsäure-extraktionsverfahren
US20030054396A1 (en) * 2001-09-07 2003-03-20 Weiner Michael P. Enzymatic light amplification
US7096053B2 (en) 2001-10-02 2006-08-22 Alfred E. Mann Institute For Biomedical Engineering At The University Of Southern California Internal biochemical sensing device
US20050267326A1 (en) * 2001-10-02 2005-12-01 Alfred E. Mann Institute For Biomedical Eng. At The University Of Southern California Percutaneous chemical sensor based on fluorescence resonant energy transfer (FRET)
AU2002368207A1 (en) * 2001-10-18 2004-05-04 Virtual Arrays, Inc. Coded particles for multiplexed analysis of biological samples
US20030219800A1 (en) * 2001-10-18 2003-11-27 Beske Oren E. Multiplexed cell transfection using coded carriers
WO2003035824A1 (en) * 2001-10-25 2003-05-01 Bar-Ilan University Interactive transparent individual cells biochip processor
US20050124022A1 (en) * 2001-10-30 2005-06-09 Maithreyan Srinivasan Novel sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
US6956114B2 (en) 2001-10-30 2005-10-18 '454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
US6902921B2 (en) * 2001-10-30 2005-06-07 454 Corporation Sulfurylase-luciferase fusion proteins and thermostable sulfurylase
US20030091976A1 (en) * 2001-11-14 2003-05-15 Ciphergen Biosystems, Inc. Methods for monitoring polypeptide production and purification using surface enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry
WO2003044484A2 (en) * 2001-11-16 2003-05-30 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research High-density cell microarrays for parallel functional determinations
US7499806B2 (en) * 2002-02-14 2009-03-03 Illumina, Inc. Image processing in microsphere arrays
KR20030068780A (ko) * 2002-02-18 2003-08-25 서울대학교병원 바이오-셀 칩
US7504364B2 (en) * 2002-03-01 2009-03-17 Receptors Llc Methods of making arrays and artificial receptors
US20030175818A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-18 Ross Amelia A. Devices and methods for isolating and recovering target cells
US7754155B2 (en) * 2002-03-15 2010-07-13 Ross Amelia A Devices and methods for isolating target cells
EP1348757A1 (de) * 2002-03-27 2003-10-01 Micronas GmbH Vorrichtung und Verfahren zur Detektion von zellulären Vorgängen mittels Lumineszenzmessungen
JP4033697B2 (ja) * 2002-04-01 2008-01-16 独立行政法人科学技術振興機構 細胞チップ作製方法と標的蛋白質スクリーニング方法
JP2003294736A (ja) * 2002-04-01 2003-10-15 Japan Science & Technology Corp 蛍光蛋白質融合プローブを用いたスクリーニング方法
US20050026134A1 (en) * 2002-04-10 2005-02-03 Bioprocessors Corp. Systems and methods for control of pH and other reactor environment conditions
AU2003228711C1 (en) 2002-04-26 2010-01-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and system for the detection of cardiac risk factors
US20060199260A1 (en) * 2002-05-01 2006-09-07 Zhiyu Zhang Microbioreactor for continuous cell culture
US8663909B2 (en) * 2002-05-09 2014-03-04 Nanologix, Inc. Device for rapid detection and identification of single microorganisms without preliminary growth
US7781159B2 (en) * 2002-05-09 2010-08-24 Nanologix, Inc. Micromethod and device for rapid detection, enumeration and identification of entities
US20030215815A1 (en) * 2002-05-20 2003-11-20 Clark William G. Screening method
US20040126773A1 (en) * 2002-05-23 2004-07-01 Beske Oren E. Assays with coded sensor particles to sense assay conditions
US20050106714A1 (en) * 2002-06-05 2005-05-19 Zarur Andrey J. Rotatable reactor systems and methods
EP1509593B1 (de) * 2002-06-05 2007-08-15 Bioprocessors Corporation Verfahren enhaltend reaktoren mit einem beleuchteten bauelement
GB0215878D0 (en) * 2002-07-09 2002-08-14 Smart Holograms Ltd Cell detection
US20040081985A1 (en) * 2002-07-12 2004-04-29 Affymetrix, Inc. Systems and method for examination of microarrays using scanning electron microscope
US20050009055A1 (en) * 2002-07-12 2005-01-13 Affymetrix, Inc. System and method for examination of microarrays using scanning electron microscope
FR2842604B1 (fr) * 2002-07-18 2004-10-08 Guillaume Herlem Systeme de detection d'au moins une substance chimique
JP2005533502A (ja) * 2002-07-24 2005-11-10 ボード オブ レジェンツ，ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム 膜法による微生物の捕捉と検出
ES2338111T3 (es) 2002-08-21 2010-05-04 Revivicor, Inc. Animales porcinos que carecen de cualquier expresion de alfa 1,3 galactosiltransferasa funcional.
JP4171775B2 (ja) * 2002-08-26 2008-10-29 賢二 安田 核酸分析装置
AU2003260116A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Mabgen L.L.C. Selecting therapeutic human monoclonal antibodies from disease-specific libraries
US7927822B2 (en) * 2002-09-09 2011-04-19 Sru Biosystems, Inc. Methods for screening cells and antibodies
US7429492B2 (en) * 2002-09-09 2008-09-30 Sru Biosystems, Inc. Multiwell plates with integrated biosensors and membranes
US20040137481A1 (en) * 2002-09-16 2004-07-15 Receptors Llc Artificial receptor building blocks, components, and kits
US7141414B2 (en) * 2002-09-16 2006-11-28 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Biosensor
US20050037429A1 (en) * 2003-03-28 2005-02-17 Receptors Llc Artificial receptors including reversibly immobilized building blocks and methods
WO2005003326A2 (en) * 2003-03-28 2005-01-13 Receptors Llc. Artificial receptors including reversibly immobilized building blocks and methods
US7595883B1 (en) * 2002-09-16 2009-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biological analysis arrangement and approach therefor
US20060057625A1 (en) * 2002-09-16 2006-03-16 Carlson Robert E Scaffold-based artificial receptors and methods
US20050136483A1 (en) * 2003-09-03 2005-06-23 Receptors Llc Nanodevices employing combinatorial artificial receptors
US7469076B2 (en) * 2003-09-03 2008-12-23 Receptors Llc Sensors employing combinatorial artificial receptors
US20050037381A1 (en) * 2002-09-16 2005-02-17 Receptors Llc Artificial receptors, building blocks, and methods
ES2375724T3 (es) 2002-09-27 2012-03-05 The General Hospital Corporation Dispositivo microflu�?dico para seperación de células y sus usos.
WO2006086578A1 (en) * 2002-10-02 2006-08-17 Alfred E. Mann Institute For Biomedical Engineering At The University Of Southern California Internal biochemical sensing device
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
US20040106163A1 (en) * 2002-11-12 2004-06-03 Workman Jerome James Non-invasive measurement of analytes
AU2003287735A1 (en) 2002-11-12 2004-06-03 Argose, Inc. Non-invasive measurement of analytes
EP1566635B1 (de) 2002-11-14 2011-12-07 Vivalis Mikrowell-array-chip zum nachweis eines antigenspezifischen lymphozyten, verfahren zum nachweis eines antigenspezifischen lymphozyten und verfahren zur klonierung eines antigenrezeptorgens eines antigenspezifischen lymphozyten
US7309614B1 (en) 2002-12-04 2007-12-18 Sru Biosystems, Inc. Self-referencing biodetection method and patterned bioassays
US20070141568A1 (en) * 2002-12-20 2007-06-21 Biodetection Systems B.V. Method for determining the presence of one or more ligands in a sample
US6822230B2 (en) * 2002-12-23 2004-11-23 Agilent Technologies, Inc. Matrix-assisted laser desorption/ionization sample holders and methods of using the same
CN1745179A (zh) * 2003-01-02 2006-03-08 拜澳富斯毫微科学有限公司 在小样品体积中分子分析的方法和装置
US7887752B2 (en) * 2003-01-21 2011-02-15 Illumina, Inc. Chemical reaction monitor
AU2004254552B2 (en) * 2003-01-29 2008-04-24 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US7575865B2 (en) * 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
IL154677A0 (en) * 2003-02-27 2003-09-17 Univ Bar Ilan A method and apparatus for manipulating an individual cell
WO2004078131A2 (en) * 2003-03-01 2004-09-16 Symyx Technologies, Inc. Evaluating effects of exposure conditions on drug samples over time
US20050003521A1 (en) * 2003-03-11 2005-01-06 O'connor David Addressable microarray device, methods of making, and uses thereof
US20040185448A1 (en) * 2003-03-20 2004-09-23 Viorica Lopez-Avila Methods and devices for performing matrix assisted laser desorption/lonization protocols
WO2004097371A2 (en) * 2003-04-25 2004-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System System and method for the detection of analytes
JP2004333404A (ja) * 2003-05-12 2004-11-25 Hitachi Ltd マイクロリアクタ及びその製造方法、並びに試料スクリーニング装置
US9317922B2 (en) 2003-05-16 2016-04-19 Board Of Regents The University Of Texas System Image and part recognition technology
US7651850B2 (en) * 2003-05-16 2010-01-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Image and part recognition technology
EP1628748A2 (de) * 2003-06-05 2006-03-01 Bioprocessors Corporation Reaktor mit speicherkomponente
US7413893B2 (en) * 2003-06-09 2008-08-19 Perkinelmer Las, Inc. Methods, apparatus and compositions for improved measurements with optical biosensors
US7888110B2 (en) 2003-06-26 2011-02-15 Seng Enterprises Ltd. Pico liter well holding device and method of making the same
US8597597B2 (en) * 2003-06-26 2013-12-03 Seng Enterprises Ltd. Picoliter well holding device and method of making the same
US20060240548A1 (en) * 2003-06-26 2006-10-26 Mordechai Deutsch Materials for constructing cell-chips, cell-chip covers, cell-chips coats, processed cell-chips and uses thereof
US9200245B2 (en) 2003-06-26 2015-12-01 Seng Enterprises Ltd. Multiwell plate
US7982751B2 (en) * 2003-07-11 2011-07-19 The University Of North Carolina Methods and systems for controlling a computer using a video image and for combining the video image with a computer desktop
US7524623B2 (en) * 2003-07-28 2009-04-28 Nanologix, Inc. Method and device for rapid detection of microorganisms by changing the shape of micro-colonies
US20050064524A1 (en) * 2003-08-11 2005-03-24 Mordechai Deutsch Population of cells utilizable for substance detection and methods and devices using same
US7280727B1 (en) * 2003-09-05 2007-10-09 Schott Corporation Micro-well and methods of fabricating and selectively blackening the same
US20090052850A1 (en) * 2003-09-05 2009-02-26 Loic Barbedette Micro-well plates and methods of fabricating and selectively blackening the same
EP1676133A4 (de) * 2003-09-15 2008-05-21 Millipore Corp Tests mit primärzellen
US7488451B2 (en) * 2003-09-15 2009-02-10 Millipore Corporation Systems for particle manipulation
US8298780B2 (en) * 2003-09-22 2012-10-30 X-Body, Inc. Methods of detection of changes in cells
WO2005069001A1 (ja) * 2003-09-25 2005-07-28 Toyama Prefecture マイクロウェルアレイチップ及びその製造方法
US6996317B2 (en) * 2003-10-23 2006-02-07 Fitel U.S.A. Corp. Optical devices including microstructured fiber sections disposed for transverse signal propagation
US7651868B2 (en) * 2003-12-11 2010-01-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Method and system for the analysis of saliva using a sensor array
WO2005065241A2 (en) * 2003-12-24 2005-07-21 Argose, Inc. Smmr (small molecule metabolite reporters) for use as in vivo glucose biosensors
EP1733265A4 (de) * 2004-01-22 2009-06-24 Incom Inc Interrogierte faseroptische mikrofluidische einrichtung
BRPI0506610A (pt) 2004-02-03 2007-05-02 Chemagis Ltd montelucaste sódico amorfo, processo de preparação de montelucaste sódico amorfo, composição farmacêutica, método de tratamento utilizando a administração de montelucaste sódico amorfo, co-precipitado amorfo de montelucaste sódico e processo de preparação de co-precipitado amorfo de montelucaste sódico
US20060257941A1 (en) * 2004-02-27 2006-11-16 Mcdevitt John T Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing particle and membrane sensor elements
US8101431B2 (en) 2004-02-27 2012-01-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems
US20060257854A1 (en) * 2004-02-27 2006-11-16 Mcdevitt John T Membrane assay system including preloaded particles
US7781226B2 (en) * 2004-02-27 2010-08-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Particle on membrane assay system
US20060257991A1 (en) * 2004-02-27 2006-11-16 Mcdevitt John T Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing particle-based sensor elements and membrane-based sensor elements
US8105849B2 (en) * 2004-02-27 2012-01-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements
WO2005108992A1 (en) * 2004-05-06 2005-11-17 Arizona Board Of Regents, Acting For And On Behalf Of Arizona State University Microarray of three-dimensional heteropolymer microstructures and method therefor
US20050277187A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-15 Bioprocessors Corp. Creation of shear in a reactor
US20050287673A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-29 Bioprocessors Corp. Reactor mixing
WO2005121307A2 (en) * 2004-06-07 2005-12-22 Bioprocessor Corp. Gas control in a microreactor
JP2008504845A (ja) * 2004-06-07 2008-02-21 バイオプロセッサーズ コーポレイション リアクター環境条件の制御
US7403647B2 (en) 2004-09-13 2008-07-22 Seng Enterprises Ltd. Method for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component
US20080063251A1 (en) * 2004-07-07 2008-03-13 Mordechai Deutsch Method and Device for Identifying an Image of a Well in an Image of a Well-Bearing
EP2412816B1 (de) 2004-07-26 2014-12-03 Pfenex Inc. Verfahren zur verbesserten Proteinexpression durch Strain-Engineering
US8183052B2 (en) * 2004-08-19 2012-05-22 Blood Cell Storage, Inc. Methods and apparatus for sterility testing
CN101036046B (zh) 2004-08-19 2012-02-22 血细胞保存公司 荧光pH检测器系统和相关方法
US8497134B2 (en) * 2004-08-19 2013-07-30 Blood Cell Storage, Inc. Fluorescent detector systems for the detection of chemical perturbations in sterile storage devices
US20080009051A1 (en) * 2004-08-25 2008-01-10 Seng Enterprises Ltd. Method and Device for Isolating Cells
US20070212681A1 (en) * 2004-08-30 2007-09-13 Benjamin Shapiro Cell canaries for biochemical pathogen detection
US7504365B2 (en) 2004-09-03 2009-03-17 Receptors Llc Combinatorial artificial receptors including tether building blocks
WO2006029383A2 (en) * 2004-09-11 2006-03-16 Receptors Llc Combinatorial artificial receptors including peptide building blocks
US7308164B1 (en) 2004-09-16 2007-12-11 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Method for texturing surfaces of optical fiber sensors used for blood glucose monitoring
WO2006047038A1 (en) * 2004-09-28 2006-05-04 Trustees Of Tufts College Apparatus and method for cell migration assays
US7185753B2 (en) * 2004-09-28 2007-03-06 Hartness International, Inc. Shuttle conveyor
US7229754B2 (en) * 2004-11-24 2007-06-12 Kish Laszlo B Sensing phage-triggered ion cascade (SEPTIC)
ES2352344T3 (es) 2005-01-25 2011-02-17 Seng Enterprises Limited Dispositivo de microfluido para estudio de células.
US20060166223A1 (en) * 2005-01-26 2006-07-27 Reed Michael W DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
US20060246576A1 (en) 2005-04-06 2006-11-02 Affymetrix, Inc. Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation
US7785862B2 (en) * 2005-04-07 2010-08-31 454 Life Sciences Corporation Thin film coated microwell arrays
US7682816B2 (en) 2005-04-07 2010-03-23 454 Life Sciences Corporation Thin film coated microwell arrays and methods of using same
US20060228804A1 (en) * 2005-04-08 2006-10-12 Rosemount Analytical Inc. Modified ruthenium complex luminescence dye for oxygen sensing
US20060241351A1 (en) * 2005-04-08 2006-10-26 Rosemount Analytical Inc. Integrated optical device for luminescence sensing
US7470544B2 (en) * 2005-05-26 2008-12-30 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Sensor array using sail
EP1910824A4 (de) 2005-05-31 2012-11-21 Labnow Inc Verfahren und zusammensetzungen in zusammenhang mit der erstellung und verwendung eines weissen blutbildes
US7718131B2 (en) * 2005-07-06 2010-05-18 Genetix Limited Methods and apparatus for imaging and processing of samples in biological sample containers
DE102005034043B4 (de) * 2005-07-18 2019-12-12 Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt Gemisch, enthaltend L-Carnitin und Trehalulose, sowie Produkt enthaltend das Gemisch
US8921102B2 (en) * 2005-07-29 2014-12-30 Gpb Scientific, Llc Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
CA2617930A1 (en) 2005-08-09 2007-03-29 Revivicor, Inc. Transgenic ungulates expressing ctla4-ig and uses thereof
US7996188B2 (en) 2005-08-22 2011-08-09 Accuri Cytometers, Inc. User interface for a flow cytometer system
WO2007035633A2 (en) 2005-09-16 2007-03-29 President & Fellows Of Harvard College Screening assays and methods
JP2009508534A (ja) * 2005-09-16 2009-03-05 ザ・チャールズ・スターク・ドレイパー・ラボラトリー・インコーポレイテッド 生細胞における反応の検出
US20070141555A1 (en) * 2005-10-11 2007-06-21 Mordechai Deutsch Current damper for the study of cells
US8303894B2 (en) 2005-10-13 2012-11-06 Accuri Cytometers, Inc. Detection and fluidic system of a flow cytometer
US8017402B2 (en) 2006-03-08 2011-09-13 Accuri Cytometers, Inc. Fluidic system for a flow cytometer
US20100028853A1 (en) * 2005-10-25 2010-02-04 Harold James Harmon Optical determination of living vs. non living cells
WO2007052245A1 (en) * 2005-11-03 2007-05-10 Seng Enterprises Ltd. Method and device for studying floating, living cells
JPWO2007055226A1 (ja) * 2005-11-10 2009-04-30 国立大学法人富山大学 抗原特異的リンパ球の検出方法および調製方法
US9096826B2 (en) 2005-11-22 2015-08-04 Covalent Materials Corporation Culture substrate and culture method for undifferentiated cell and undifferentiated cultured cell
US20070127863A1 (en) * 2005-12-07 2007-06-07 Accuri Instruments Inc. System and method for guiding light from an interrogation zone to a detector system
US20070154923A1 (en) * 2005-12-29 2007-07-05 Affymetrix, Inc. Method for Gridding and Quality Control of Polymer Arrays
US11237171B2 (en) 2006-02-21 2022-02-01 Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution
US8460879B2 (en) * 2006-02-21 2013-06-11 The Trustees Of Tufts College Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution
US8031340B2 (en) * 2006-02-22 2011-10-04 Accuri Cytometers, Inc. Optical system for a flow cytometer
US8149402B2 (en) * 2006-02-22 2012-04-03 Accuri Cytometers, Inc. Optical system for a flow cytometer
US7780916B2 (en) * 2006-03-08 2010-08-24 Accuri Cytometers, Inc. Flow cytometer system with unclogging feature
US8283177B2 (en) * 2006-03-08 2012-10-09 Accuri Cytometers, Inc. Fluidic system with washing capabilities for a flow cytometer
US20070224684A1 (en) * 2006-03-22 2007-09-27 Olson David C Transportable flow cytometer
US20060223999A1 (en) * 2006-05-10 2006-10-05 Chemagis Ltd. Process for preparing montelukast and precursors thereof
US20080003667A1 (en) * 2006-05-19 2008-01-03 Affymetrix, Inc. Consumable elements for use with fluid processing and detection systems
US8372584B2 (en) 2006-06-14 2013-02-12 The General Hospital Corporation Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
US20080090239A1 (en) * 2006-06-14 2008-04-17 Daniel Shoemaker Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
EP2041318A2 (de) * 2006-06-26 2009-04-01 Blood Cell Storage, Inc. Vorrichtung und verfahren zur extraktion und analyse von nukleinsäuren aus biologischen proben
US8163535B2 (en) * 2006-06-26 2012-04-24 Blood Cell Storage, Inc. Devices and processes for nucleic acid extraction
US7382944B1 (en) 2006-07-14 2008-06-03 The United States Of America As Represented By The Administration Of The National Aeronautics And Space Administration Protective coating and hyperthermal atomic oxygen texturing of optical fibers used for blood glucose monitoring
US20080044879A1 (en) 2006-08-17 2008-02-21 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Systems and methods of voltage-gated ion channel assays
US8715573B2 (en) 2006-10-13 2014-05-06 Accuri Cytometers, Inc. Fluidic system for a flow cytometer with temporal processing
AU2007313830A1 (en) * 2006-10-31 2008-05-08 Sru Biosystems, Inc. Method for blocking non-specific protein binding on a functionalized surface
US8445286B2 (en) * 2006-11-07 2013-05-21 Accuri Cytometers, Inc. Flow cell for a flow cytometer system
US9428728B2 (en) * 2006-11-21 2016-08-30 Coorstek Kk Carrier for undifferentiated cell culture and subculture method thereof
GB0625595D0 (en) * 2006-12-21 2007-01-31 Oxford Gene Tech Ip Ltd Sample analyser
US7739060B2 (en) * 2006-12-22 2010-06-15 Accuri Cytometers, Inc. Detection system and user interface for a flow cytometer system
JP4912908B2 (ja) * 2007-02-13 2012-04-11 国立大学法人浜松医科大学 バイオセンサ形イメージングファイバ装置
US9063117B2 (en) 2007-02-21 2015-06-23 Paul L. Gourley Micro-optical cavity with fluidic transport chip for bioparticle analysis
CN101743465A (zh) * 2007-04-19 2010-06-16 Sru生物系统公司 应用生物传感器检测与固定化靶标分子直接结合的小分子的方法
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
JP5444553B2 (ja) 2007-04-27 2014-03-19 フェネックス インコーポレイテッド 微生物宿主を迅速にスクリーニングして、異種タンパク質発現の収率および／または質が改善されている特定の株を同定する方法
US20090061513A1 (en) * 2007-05-15 2009-03-05 Picovitro Ab Cell sorting and cell cultivation methods
WO2009002537A1 (en) * 2007-06-25 2008-12-31 Tufts University Optical array device and methods of use thereof for screening, analysis and manipulation of particles
US9134307B2 (en) * 2007-07-11 2015-09-15 X-Body, Inc. Method for determining ion channel modulating properties of a test reagent
WO2009009718A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Sru Biosystems, Inc. Methods of identifying modulators of ion channels
JP4148367B1 (ja) 2007-08-02 2008-09-10 富山県 細胞のスクリーニング方法
ES2556627T3 (es) * 2007-08-30 2016-01-19 Trustees Of Tufts College Métodos para determinar la concentración de un analito en solución
WO2009036070A1 (en) * 2007-09-10 2009-03-19 University Of Kentucky Research Foundation Spores for the stabilization and on-site application of bacterial whole-cell biosensing systems
US20090247984A1 (en) * 2007-10-24 2009-10-01 Masimo Laboratories, Inc. Use of microneedles for small molecule metabolite reporter delivery
US7871571B2 (en) * 2007-10-25 2011-01-18 Parker John A Biomolecule analyzing system
US9145540B1 (en) 2007-11-15 2015-09-29 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
US8432541B2 (en) * 2007-12-17 2013-04-30 Accuri Cytometers, Inc. Optical system for a flow cytometer with an interrogation zone
US7843561B2 (en) * 2007-12-17 2010-11-30 Accuri Cytometers, Inc. Optical system for a flow cytometer with an interrogation zone
EP2237887A2 (de) 2007-12-26 2010-10-13 Seng Enterprises Ltd. Vorrichtung zur untersuchung von lebenden zellen
US8257936B2 (en) 2008-04-09 2012-09-04 X-Body Inc. High resolution label free analysis of cellular properties
WO2009134612A2 (en) 2008-04-11 2009-11-05 University Of Utah Research Foundation Methods and compositions related to quantitative array based methylation analysis
US8983581B2 (en) 2008-05-27 2015-03-17 Massachusetts Institute Of Technology System and method for large field of view, single cell analysis
US20110124520A1 (en) * 2008-05-30 2011-05-26 Massachuesetts Institute Of Technology Compositions and Methods for Spatial Separation and Screening of Cells
EP2304500A1 (de) * 2008-06-04 2011-04-06 SRU Biosystems, Inc. Detektion von promiskuitiven kleinen submikrometeraggregaten
US20110149292A1 (en) * 2008-08-31 2011-06-23 Fujirebio Inc. Apparatus and method for analyzing optical cavity modes
US8470300B2 (en) 2008-09-08 2013-06-25 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Coated sensors and methods related thereto
US20100075439A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules by capture-and-release using reducing agents followed by quantification
US20100075862A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Quanterix Corporation High sensitivity determination of the concentration of analyte molecules or particles in a fluid sample
US8222047B2 (en) * 2008-09-23 2012-07-17 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules on single molecule arrays
EP2350013A4 (de) * 2008-10-13 2012-10-17 San Diego State University Res Foundation Zusammensetzungen zur markierung und identifizierung von autophagosomen sowie verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
WO2010054004A2 (en) * 2008-11-04 2010-05-14 Blood Cell Storage, Inc. Nucleic acid extraction on curved glass surfaces
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
US8748103B2 (en) * 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US8691510B2 (en) * 2008-11-07 2014-04-08 Sequenta, Inc. Sequence analysis of complex amplicons
WO2010053587A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Mlc Dx Incorporated Methods of monitoring conditions by sequence analysis
CA2745437C (en) 2008-12-04 2015-10-20 Massachusetts Institute Of Technology Method for diagnosing allergic reactions
US9404924B2 (en) * 2008-12-04 2016-08-02 Massachusetts Institute Of Technology Method of performing one-step, single cell RT-PCR
EP2387627B1 (de) 2009-01-15 2016-03-30 Adaptive Biotechnologies Corporation Adaptive immunitätsprofilierung und verfahren zur erzeugung monoklonaler antikörper
JP2012515548A (ja) 2009-01-21 2012-07-12 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 単一細胞の細胞傷害性を査定するための組成物および方法
EP2221606A3 (de) * 2009-02-11 2012-06-06 Samsung Electronics Co., Ltd. Integrierter Biochip und Verfahren zur Herstellung des integrierten Biochips
EP2404162B1 (de) 2009-03-03 2017-12-27 Access Medical System Co., Ltd. Nachweissystem und verfahren für hochsensitive fluoreszenztests
US20100273185A1 (en) * 2009-04-27 2010-10-28 Sru Biosystems, Inc. Detection of Biased Agonist Activation
US8599383B2 (en) 2009-05-06 2013-12-03 The Regents Of The University Of California Optical cytometry
AU2010248784A1 (en) * 2009-05-15 2011-12-01 Sru Biosystems, Inc Detection of changes in cell populations and mixed cell populations
US9155471B2 (en) 2009-05-27 2015-10-13 Lumicell, Inc'. Methods and systems for spatially identifying abnormal cells
US8507279B2 (en) 2009-06-02 2013-08-13 Accuri Cytometers, Inc. System and method of verification of a prepared sample for a flow cytometer
US20110061471A1 (en) * 2009-06-02 2011-03-17 Rich Collin A System and method of verification of a sample for a flow cytometer
RU2539032C2 (ru) 2009-06-25 2015-01-10 Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер Способ измерения искусственного иммунитета
DE102009043537B4 (de) * 2009-09-30 2012-03-22 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren und Anordnung zur Bestimmung von Zell-Vitalitäten
US9043160B1 (en) 2009-11-09 2015-05-26 Sequenta, Inc. Method of determining clonotypes and clonotype profiles
EP2504103A2 (de) 2009-11-23 2012-10-03 3M Innovative Properties Company Mikrowellenarrayartikel und verfahren zu ihrer verwendung
WO2011083478A2 (en) 2010-01-11 2011-07-14 Seng Enterprises Ltd. Methods of loading cells
WO2011106402A1 (en) * 2010-02-23 2011-09-01 Accuri Cytometers, Inc. Method and system for detecting fluorochromes in a flow cytometer
US8415171B2 (en) 2010-03-01 2013-04-09 Quanterix Corporation Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles
ES2544635T3 (es) 2010-03-01 2015-09-02 Quanterix Corporation Métodos para extender el rango dinámico en ensayos para la detección de moléculas o partículas
US9678068B2 (en) * 2010-03-01 2017-06-13 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules using dual detection methods
US8236574B2 (en) * 2010-03-01 2012-08-07 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects
WO2011120042A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 Sru Biosystems, Inc. Use of induced pluripotent cells and other cells for screening compound libraries
US9551600B2 (en) 2010-06-14 2017-01-24 Accuri Cytometers, Inc. System and method for creating a flow cytometer network
CN103168225B (zh) 2010-10-25 2015-11-25 阿库里赛托梅特斯公司 用于收集流式细胞仪中的数据集的系统和用户接口
US9314304B2 (en) 2010-12-08 2016-04-19 Lumicell, Inc. Methods and system for image guided cell ablation with microscopic resolution
US9952237B2 (en) 2011-01-28 2018-04-24 Quanterix Corporation Systems, devices, and methods for ultra-sensitive detection of molecules or particles
WO2012142301A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Quanterix Corporation Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patients recovery from a brain injury
CN103608675B (zh) 2011-04-20 2015-07-22 万迈医疗仪器有限公司 发光聚合物循环扩增
US8629264B2 (en) 2011-05-19 2014-01-14 Blood Cell Storage, Inc. Gravity flow fluidic device for nucleic acid extraction
US9040307B2 (en) 2011-05-27 2015-05-26 Blood Cell Storage, Inc. Fluorescent pH detector system and related methods
KR101950339B1 (ko) 2011-08-02 2019-02-20 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 살아있는 세포의 간섭법을 통한 신속한, 대용량 병렬 단일-세포 약물 반응 측정방법
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
EP2768982A4 (de) 2011-10-21 2015-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp Quantifizierung von adaptiven immunzellgenomen in einer komplexen mischung von zellen
AU2012347460B2 (en) 2011-12-09 2017-05-25 Adaptive Biotechnologies Corporation Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
US9701959B2 (en) 2012-02-02 2017-07-11 Invenra Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
WO2013134162A2 (en) 2012-03-05 2013-09-12 Sequenta, Inc. Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits
US9568431B2 (en) 2012-04-16 2017-02-14 Access Medical Systems, Ltd. Luminescent immunoassays for quantitating analytes having a wide concentration range
SG10201507700VA (en) 2012-05-08 2015-10-29 Adaptive Biotechnologies Corp Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed pcr reactions
CN104884605B (zh) * 2012-08-24 2018-05-18 耶鲁大学 用于高通量多重检测的系统、装置和方法
CN105189779B (zh) 2012-10-01 2018-05-11 适应生物技术公司 通过适应性免疫受体多样性和克隆性表征进行的免疫能力评估
US10150996B2 (en) 2012-10-19 2018-12-11 Adaptive Biotechnologies Corp. Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
US9932626B2 (en) 2013-01-15 2018-04-03 Quanterix Corporation Detection of DNA or RNA using single molecule arrays and other techniques
US10813554B2 (en) 2013-03-14 2020-10-27 Lumicell, Inc. Medical imaging device and methods of use
CA2912842C (en) 2013-05-24 2019-03-19 The Regents Of The University Of California Identifying desirable t lymphocytes by change in mass responses
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
AU2015227054A1 (en) 2014-03-05 2016-09-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
US20160124163A1 (en) * 2014-10-29 2016-05-05 Compass Electro Optical Systems Ltd. Vacuum gripper
AU2015339191A1 (en) 2014-10-29 2017-05-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
JP6767978B2 (ja) 2014-12-03 2020-10-14 アイソプレキシス コーポレイション 細胞分泌プロファイルの分析およびスクリーニング
US11353448B2 (en) 2015-02-13 2022-06-07 California Institute Of Technology Methods and compositions for quantifying metabolites and proteins from single cells
EP4036578A1 (de) 2016-11-11 2022-08-03 Isoplexis Corporation Zusammensetzungen und verfahren zur gleichzeitigen genomischen, transkriptomischen und proteomischen analyse von einzelzellen
WO2018098372A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 IsoPlexis Corporation Systems, devices and methods for cell capture and methods of manufacture thereof
EP3551745A4 (de) 2016-12-12 2020-07-15 Xcella Biosciences, Inc. Verfahren und systeme zum screening unter verwendung von mikrokapillaren arrays
US11085039B2 (en) 2016-12-12 2021-08-10 xCella Biosciences, Inc. Methods and systems for screening using microcapillary arrays
JP7208902B2 (ja) 2016-12-30 2023-01-19 エクセラ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド マルチステージサンプル回収システム
DE102018002269B4 (de) * 2018-03-20 2024-03-07 Bex-Biotec Gmbh & Co. Kg Screeningverfahren für biostimulanzien
EP3814014A2 (de) * 2018-06-27 2021-05-05 Qcdx, Llc Halter für biologische proben und handler
RU2705593C1 (ru) * 2019-06-28 2019-11-11 Общество с ограниченной ответственностью Владикавказский Технологический центр "Баспик" (ООО ВТЦ "Баспик") Способ изготовления волоконно-оптической матрицы для биочипа (варианты)
DE102019220017A1 (de) * 2019-12-18 2021-06-24 Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung Aufnahmeeinheit zum Aufnehmen eines Fluids, Verfahren und Vorrichtung zum Herstellen einer Aufnahmeeinheit, Verfahren und Vorrichtung zum Betreiben einer Aufnahmeeinheit und Aufnahmeeinrichtung
TWI793671B (zh) * 2021-07-09 2023-02-21 中國醫藥大學 細胞治療用生物晶片及其製造方法

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4200110A (en) 1977-11-28 1980-04-29 United States Of America Fiber optic pH probe
DE3018425A1 (de) 1980-05-14 1981-11-19 Schloemann-Siemag AG, 4000 Düsseldorf Arbeitsverfahren und einrichtung zum abfoerdern von gruppen von profilstaeben verschiedener querschnittsform bzw. querschnittsgroesse hinter einer kaltschere
US5272081A (en) 1982-05-10 1993-12-21 Bar-Ilan University System and methods for cell selection
IL68507A (en) 1982-05-10 1986-01-31 Univ Bar Ilan System and methods for cell selection
US5310674A (en) 1982-05-10 1994-05-10 Bar-Ilan University Apertured cell carrier
US4499052A (en) 1982-08-30 1985-02-12 Becton, Dickinson And Company Apparatus for distinguishing multiple subpopulations of cells
US4682895A (en) 1985-08-06 1987-07-28 Texas A&M University Fiber optic probe for quantification of colorimetric reactions
US4772540A (en) 1985-08-30 1988-09-20 Bar Ilan University Manufacture of microsieves and the resulting microsieves
US4798738A (en) 1986-10-10 1989-01-17 Cardiovascular Devices, Inc. Micro sensor
US4824789B1 (en) 1986-10-10 1996-08-13 Minnesota Mining & Mfg Gas sensor
US5254477A (en) 1986-06-25 1993-10-19 Trustees Of Tufts College Flourescence intramolecular energy transfer conjugate compositions and detection methods
US5252494A (en) 1986-06-25 1993-10-12 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensors, apparatus, and detection methods using controlled release polymers and reagent formulations held within a polymeric reaction matrix
US5114864A (en) 1986-06-25 1992-05-19 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensors, apparatus, and detection methods using fluid erodible controlled release polymers for delivery of reagent formulations
US5143853A (en) 1986-06-25 1992-09-01 Trustees Of Tufts College Absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors
US4822746A (en) 1986-06-25 1989-04-18 Trustees Of Tufts College Radiative and non-radiative energy transfer and absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors
JP2662215B2 (ja) 1986-11-19 1997-10-08 株式会社日立製作所 細胞保持装置
DE3681176D1 (de) 1986-12-01 1991-10-02 Molecular Biosystems Inc Verfahren zur erhoehung der empfindlichkeit von nukleinsaeure-hybridisierungstesten.
SE458968B (sv) 1987-06-16 1989-05-22 Wallac Oy Biospecifikt analysfoerfarande foer flera analyter i vilket ingaar partikelraekning och maerkning med fluorescerande maerksubstanser
US5132242A (en) 1987-07-15 1992-07-21 Cheung Sau W Fluorescent microspheres and methods of using them
US5194300A (en) 1987-07-15 1993-03-16 Cheung Sau W Methods of making fluorescent microspheres
US4785814A (en) 1987-08-11 1988-11-22 Cordis Corporation Optical probe for measuring pH and oxygen in blood and employing a composite membrane
JP2559760B2 (ja) 1987-08-31 1996-12-04 株式会社日立製作所 細胞搬送方法
US5002867A (en) 1988-04-25 1991-03-26 Macevicz Stephen C Nucleic acid sequence determination by multiple mixed oligonucleotide probes
NO164622C (no) 1988-05-11 1990-10-24 Tore Lindmo Binaer immunometrisk partikkelbasert metode for maaling av spesifikke serum-antigener ved hjelp av vaeskestroemsmikrofotometri og et ferdigpreparert maaloppsett derav.
US5575849A (en) 1988-11-25 1996-11-19 Canon Kabushiki Kaisha Apparatus for producing a substrate having a surface with a plurality of spherical dimples for photoconductive members
JPH02299598A (ja) 1989-04-14 1990-12-11 Ro Inst For Molecular Genetics & Geneteic Res 微視的サイズの別個の粒子と結合している核酸試料中のごく短い配列の全部または一部のオリゴヌクレチドプローブとのハイブリダイゼーションによる決定法
US5177013A (en) 1989-07-31 1993-01-05 Ajinomoto Co., Inc. Preparation of an immobilized lipase having a low water content without drying
US5302509A (en) 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
KR910007824B1 (ko) 1989-10-25 1991-10-02 한국과학기술원 포도당과 과당측정용 바이오센서의 제조방법
US5326692B1 (en) 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
EP0478319B1 (de) 1990-09-28 1997-04-02 Kabushiki Kaisha Toshiba Verfahren zum Gennachweis
US5105305A (en) 1991-01-10 1992-04-14 At&T Bell Laboratories Near-field scanning optical microscope using a fluorescent probe
US5250264A (en) 1991-01-25 1993-10-05 Trustees Of Tufts College Method of making imaging fiber optic sensors to concurrently detect multiple analytes of interest in a fluid sample
US5320814A (en) 1991-01-25 1994-06-14 Trustees Of Tufts College Fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently visualizing and chemically detecting multiple analytes of interest in a fluid sample
US5244636A (en) 1991-01-25 1993-09-14 Trustees Of Tufts College Imaging fiber optic array sensors, apparatus, and methods for concurrently detecting multiple analytes of interest in a fluid sample
US5244813A (en) 1991-01-25 1993-09-14 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor, apparatus, and methods for detecting an organic analyte in a fluid or vapor sample
US5380489A (en) 1992-02-18 1995-01-10 Eastman Kodak Company Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes
AU2348092A (en) 1991-07-16 1993-02-23 Transmed Biotech Incorporated Methods and compositions for simultaneous analysis of multiple analytes
US5639603A (en) 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
WO1993008472A1 (en) 1991-10-15 1993-04-29 Multilyte Limited Binding assay employing labelled reagent
JP3067347B2 (ja) * 1991-10-30 2000-07-17 株式会社島津製作所 ゲル状ビーズの選別装置
US5888723A (en) 1992-02-18 1999-03-30 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes
EP0565999A2 (de) 1992-04-16 1993-10-20 Siemens Aktiengesellschaft Anordnung zur optischen Kopplung von zwei Gruppen von Wellenleitern
GB9212302D0 (en) * 1992-06-10 1992-07-22 Applied Research Systems Method for improving measurement precision in evanescent wave optical biosensor assays
DE69313611T2 (de) 1992-07-02 1998-01-08 Erkki Soini Biospezifisches multiparameter-analyseverfahren
JP3420765B2 (ja) 1992-09-14 2003-06-30 エス・アール・アイ・インターナシヨナル レーザー励起技術を用いる生物学的および他の分析のためのアップコンバート性レポータ
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5298741A (en) 1993-01-13 1994-03-29 Trustees Of Tufts College Thin film fiber optic sensor array and apparatus for concurrent viewing and chemical sensing of a sample
CA2102884A1 (en) 1993-03-04 1994-09-05 James J. Wynne Dental procedures and apparatus using ultraviolet radiation
JPH06311879A (ja) 1993-03-15 1994-11-08 Nec Corp バイオセンサ
US5677196A (en) * 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
US5512492A (en) * 1993-05-18 1996-04-30 University Of Utah Research Foundation Waveguide immunosensor with coating chemistry providing enhanced sensitivity
JP3302458B2 (ja) 1993-08-31 2002-07-15 富士通株式会社 集積化光装置及び製造方法
US5494798A (en) 1993-12-09 1996-02-27 Gerdt; David W. Fiber optic evanscent wave sensor for immunoassay
US5496997A (en) 1994-01-03 1996-03-05 Pope; Edward J. A. Sensor incorporating an optical fiber and a solid porous inorganic microsphere
US5512490A (en) 1994-08-11 1996-04-30 Trustees Of Tufts College Optical sensor, optical sensing apparatus, and methods for detecting an analyte of interest using spectral recognition patterns
US5585069A (en) 1994-11-10 1996-12-17 David Sarnoff Research Center, Inc. Partitioned microelectronic and fluidic device array for clinical diagnostics and chemical synthesis
US5690894A (en) 1995-05-23 1997-11-25 The Regents Of The University Of California High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor
US5656241A (en) 1995-09-07 1997-08-12 Optical Sensors Incorporated Method for manufacturing fiber optic sensors
DE69638321D1 (de) 1995-10-11 2011-03-03 Luminex Corp Gleichzeitige mehrfachanalyse klinischer proben
GB9521159D0 (en) 1995-10-16 1995-12-20 Brint Norman T A weapon
FR2741357B1 (fr) 1995-11-22 1998-01-16 Corning Inc Procede de fabrication d'une plaquette de support d'un reseau bidimensionnel de micropuits, notamment pour essais ou cultures biologiques
US5633972A (en) 1995-11-29 1997-05-27 Trustees Of Tufts College Superresolution imaging fiber for subwavelength light energy generation and near-field optical microscopy
US5814524A (en) 1995-12-14 1998-09-29 Trustees Of Tufts College Optical sensor apparatus for far-field viewing and making optical analytical measurements at remote locations
US5671303A (en) * 1996-04-17 1997-09-23 Motorola, Inc. Molecular detection apparatus and method using optical waveguide detection
ES2288760T3 (es) 1996-04-25 2008-01-16 Bioarray Solutions Ltd. Ensamblaje electrocinetico controlado por luz de particulas proximas a superficies.
US5900481A (en) 1996-11-06 1999-05-04 Sequenom, Inc. Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports
US6023540A (en) * 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
EP0985142A4 (de) 1997-05-23 2006-09-13 Lynx Therapeutics Inc System und gerät zur sequentiellen behandlung von analyten
EP1003904B1 (de) 1997-05-23 2007-07-11 BioArray Solutions Ltd. Farbkodierung und in situ abfrage von matrix-gekoppelten chemischen verbindungen
US7115884B1 (en) 1997-10-06 2006-10-03 Trustees Of Tufts College Self-encoding fiber optic sensor
US6087114A (en) * 1997-12-09 2000-07-11 Massachusetts Institute Of Technology Optoelectronic sensor
WO1999067414A1 (en) 1998-06-24 1999-12-29 Glaxo Group Limited Nucleotide detection method
US6908770B1 (en) 1998-07-16 2005-06-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Fluid based analysis of multiple analytes by a sensor array
US6429027B1 (en) 1998-12-28 2002-08-06 Illumina, Inc. Composite arrays utilizing microspheres

Also Published As

Publication number Publication date
US6667159B1 (en) 2003-12-23
JP2002506200A (ja) 2002-02-26
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