DE69908658T2

DE69908658T2 - Testgerät und Verfahren zum Nachweis und Aufzählung von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE69908658T2
Application number: DE69908658T
Authority: DE
Inventors: D. Peter WICKERT; G. Michael WILLIAMS
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Current assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 1999-03-09
Filing date: 1999-06-10
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2019-06-11
Also published as: CA2363018A1; JP4488628B2; JP2002537827A; AU764361B2; EP1159399A1; AR022861A1; BR9917198A; US6174699B1; DE69908658D1; MXPA01009024A; BR9917198B1; AU4560099A; US6291202B1; WO2000053721A1; EP1159399B1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf scheibenförmige Anordnungen und Verfahren zum Nachweis bzw. zur Detektierung und zur Auszählung Detektierung und Auszählung von Mikroorganismen, die sich in einer Probe befinden.
Die Detektierung und die Auszählung von Mikroorganismen wird in einer großen Anzahl von Einsätzen durchgeführt, einschließlich der nahrungsmittelherstellenden Industrie (Kontaminationstests der Nahrung durch Mikroorganismen wie E. coli und S. aureus), der Industrie für die Herstellung von Artikeln für die Gesundheitspflege bzw. für die Hygiene (Untersuchung der Proben von Patienten und andere klinische Proben auf Infektion und Kontamination), der Industrie zur Herstellung von Testmethoden im Umweltschutz, der pharmazeutische Industrie und der Kosmetikindustrie.
Die wachstumsbezogene Detektierung und Auszählung von Mikroorganismen wird generell durchgeführt unter Verwendung von entweder flüssigen Nährmedien (zum Beispiel die Most-Propable-Number(MPN)-Methode) oder halbflüssigen Nährmedien (Agar-Petrischalen). Die Auszählung unter Verwendung der MPN-Methode zum Test von Flüssigkeiten wird typischerweise dadurch realisiert, daß serielle 10-fache Verdünnungen einer zu untersuchenden Probe in sich wiederholenden Röhrchenanordnungen, die selektive Medien und chemische Indikatoren enthalten, durchgeführt werden. Die Röhrchen werden 24 bis 48 Stunden lang bei erhöhten Temperaturen (30 bis 37°C) inkubiert und anschließend auf das Wachstum der Organismen untersucht. Eine statistische Formel, die auf dem getesteten Probenvolumen basiert, und die Anzahl der positiven und negativen Röhrchen jeder Anordnung, werden verwendet, um die Anzahl der Organismen, die sich in der Ausgangsprobe befinden, abzuschätzen.
Diese Methode zur Durchführung einer MPN-Analyse hat mehrere Nachteile. Sie ist arbeitsintensiv wegen der vielen Verdünnungs- und Pipettierungs-Schritte, die notwendig sind, um die Analyse durchzuführen. Bezeichnenderweise ist es nur praktikabel, sich wiederholende Anordnungen von etwa 3 bis 5 Röhrchen für jede Verdünnung zu verwenden. Daraus resultierend fallen die 95%-Vertrauensgrenzen für die MPN-Abschätzung der Konzentration von Mikroben extrem breit aus. Zum Beispiel besitzt eine MPN-Abschätzung mit drei Röhrchen von 20 95%-Vertrauensgrenzen im Bereich von 7 bis 89. Darüber hinaus können die Ergebnisse bezeichnenderweise in Zeiträumen von nicht unter 24 Stunden bestimmt werden.
Anordnungen mit vielen Reaktionsansätzen bzw. Wells wurden für den Gebrauch in Kombination mit der MPN-Analyse eingeführt. Ein Anwender impft die Anordnung durch Aufbringen einer Probe des zu untersuchenden Postens wie z. B. Nahrung, auf das Substrat, das die Reaktionsansätze bzw. Wells enthält. Bezeichnenderweise enthält die Probe Wachstumsmedien und Indikatoren. Nach der Impfung der Proben inkubiert der Anwender die Anordnung und berechnet den MPN-Wert basierend auf der Anzahl der „positiven" Reaktionsansätze.
EP-A-0 459 093 beschreibt eine Kapillar-Impfanordnung, zur Impfung einer Vielzahl von Testorten mit einem Träger, der eine Basis und Seitenwände enthält, welche ein Reservoir festlegen und eine Vielzahl an Kapillaren, die durch die Basis des besagten Trägerinnenraums durchragen und in flüssiger Wechselwirkung mit dem Reservoir stehen.
In der GB-A-1 437 404 wird eine Apparatur zur Durchführung von mikrobiologischen Analysen offenbart, die eine Ba siseinheit mit einer Vielzahl von Zonen verschiedener Volumina enthält, die gleichzeitig bzw. simultan Proben des zu analysierenden Systems aufnehmen können.
US-A-3,881,993 offenbart eine Anordnung zur Probenanalyse von Mikroorganismen, die geeignet ist, um die Impfung durch Eintauchen in eine flüssige Probe vorzunehmen und in einen versiegelbaren Behälter zu inkubieren, wobei die Anordnung eine absorbierende Matrix, die mit einem Nährmedium getränkt bzw. durchtränkt wird, ferner geeignete Reagenzien und ein Mittel zur Fixierung der Kulturen, um die Koloniebildung in der Matrix lokalisieren zu können, aufweist.
EP 0 795 600 offenbart ein Gerät für chemische und mikrobiologische Tests, das einen Probenbehälter zur temporären bzw. vorübergehenden Aufbewahrung einer flüssigen Probe, eine Vielzahl von Bereichen, die Proben aufnehmen können und die an der Unterseite des Probenbehälters angeordnet sind, und einen flüssigkeitsabsorbierenden Körper enthält, der in Kontakt mit der flüssigen Probe treten kann.
Anordnungen mit vielen Reaktionsansätzen bzw. Wells zeigen viele potentielle Probleme. Die Impfung kann durch Luftblasen, die sich in den Reaktionsansätzen bzw. Wells während des Einbringens der Probe bilden können, behindert werden. Es ist möglich, daß nicht jeder Reaktionsansatz bzw. Well das gleiche Probenvolumen bzw. die gleiche Probenmenge erhält. Darüber hinaus kann die Impfmethode oder die Anordnung eine Brückenbildung und Querkontamination zwischen den Reaktionsansätzen bzw. Wells fördern, wobei potentiell die MPN-Berechnung negativ beeinflußt wird.
Ein weiteres potentielles Problem mit Anordnungen mit vielen Reaktionsansätzen bzw. Wells ist, daß sie schwierig zu handhaben sind. Zum Beispiel werden die meisten Anordnungen mit vielen Reaktionsansätzen bzw. Wells dadurch geimpft, daß die Probe entweder direkt in die Reaktionsansätze bzw. Wells einpipettiert wird oder daß die Probe auf das Substrat mit den vielen Reaktionsansätzen bzw. Wells dadurch gegossen wird. Das Pipettieren ist arbeits- und zeitintensiv. Das Ausgießen verlangt ein gleichmäßiges Anfüllen der Reaktionsansätze bzw. Wells und ein Weggießen von überschüssigem Probenmaterial. In jedem Fall führen diese Anordnungen an sich zu Kontamination durch äußere Einflüsse während des Impfprozesses.
Diese Erfindung spricht viele der Nachteile des bisherigen Stands der Technik an. Die Erfindung liefert Anordnungen zur Probennahme und Verfahren zur raschen Detektierung und Auszählung von Mikroorganismen, wie es in den angefügten Patentansprüchen definiert ist. Die Anordnung besitzt ein Substrat, das absorbierende Scheiben enthält, die auf diesem befestigt sind, und einen Impfträger, der an der Anordnung befestigt ist und der so positioniert wird, daß die absorbierenden Scheiben geimpft werden können. Optional kann die Anordnung eine Deckplatte beinhalten.
In einem Aspekt dieser Erfindung enthält das Substrat zwei verschiedene Scheibengrößen. Vorzugsweise enthält das Substrat etwa 50 Scheiben einer bestimmten Größe und etwa 50 Scheiben einer anderen Größe. In einer speziell bevorzugten Ausführungsform enthält das Substrat Scheiben, die ca. 2 Mikroliter Probenvolumen aufnehmen können und Scheiben einer anderen Größe, die ca. 16 Mikroliter Probenvolumen aufnehmen können und die Scheiben, die 16 Mikroliter fassen umgeben zumindest partiell die Scheiben, die 2 Mikroliter fassen. Das Substrat sollte darüber hinaus hydrophob sein, um zu einer Verhinderung der Querkontamination zwischen den Scheiben beizutragen.
Die Anordnung kann optional eine äußere Kante oder einen äußeren Rand enthalten, der einen Bereich bzw. Zwischenraum zwischen den Scheiben und dem Substratende bzw. Substratrand definiert. Die äußere Kante oder der äußere Rand kann optio nal angehoben sein. Vorzugsweise ist die äußere Kante oder der äußere Rand in einer solchen Größe ausgelegt, die eine Abdichtung bzw. Versiegelung der Deckschicht mit dem Substrat ermöglicht, wenn die Anordnung in Gebrauch ist.
In einem anderen Aspekt der Erfindung ist der Impfträger ein absorbierendes Kissen, das mit einer Unterlage verbunden ist. Vorzugsweise ist die Unterlage ablösbar entlang einer Perforierung mit der Anordnung verbunden.
In einem anderen Aspekt der Erfindung ist die Deckschicht so am Substrat befestigt, daß diese ein Gelenk bzw. ein Scharnier bilden. Der Impfträger kann adhäsiv am Gelenk bzw. Scharnier befestigt sein, so daß die absorbierenden Scheiben mit dem Impfträger geimpft werden können.
In einem erfindungemäßen Verfahren dieser Erfindung wird eine, wie oben beschriebene Probenanordnung bereitgestellt. Der Anwender plaziert die zu untersuchende Probe auf dem Impfträger und positioniert den Impfträger auf den absorbierenden Scheiben, was zu einer Impfung der Scheiben mit dem Probenmaterial führt. Der Anwender entfernt und entsorgt den Impfträger und inkubiert die Probe. Dann leitet der Anwender die Detektierung jeglicher Ziel-Mikroorganismen, die sich während der Inkubation gebildet haben, ein und kann fortlaufend die Mikroorganismen auszählen. In der bevorzugten Ausführungsform kann die Methode innerhalb von 24 Stunden oder weniger durchgeführt werden.
Diese Erfindung überwindet viele der Nachteile der Anordnungen und Verfahren des Stands der Technik. Die Anordnung kann schnell und gleichmäßig und praktisch simultan geimpft werden, ohne das Problem der Luftblasenbildung. Der Einweg-Impfträger kann einfach abgelöst und entsorgt werden. Einmal abgelöst, verbleibt der Impfträger nicht an der Probe und stellt daher keine mögliche Quelle für eine Kontamination dar. Die Deckschicht stellt einen zusätzlichen Schutz vor Kontamination dar und beugt einer Austrocknung der Scheiben vor.
Im Falle einer MPN-Analyse zur Detektierung und Auszählung von Mikroorganismen ermöglichen die hier beschriebenen Ansätze die Verwendung von wasserlöslichen Indikatortypen und verringern oder verhindern die Notwendigkeit mehrerer Verdünnungen, wie sie typischerweise in den gängigen MPN-Analysen verwendet werden.
Andere Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden detaillierten Beschreibung und der Bilder deutlich.
1 ist eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemäßen Anordnung.
2 ist ein Querschnitt der Anordnung, der entlang der Linie 2-2 in 1 gezogen wurde, wobei die Anordnung um 180° gedreht wurde.
3 ist eine partielle Draufsicht auf eine erfindungsgemäße Anordnung, wobei ein Einweg-Impfträger detailliert dargestellt ist.
4 ist die Seitenansicht auf eine erfindungsgemäße Anordnung nachdem der Impfträger der Anordnung entfernt wurde.
5a ist eine Draufsicht auf eine Konfiguration einer erfindungsgemäßen Anordnung.
5b ist eine Draufsicht auf eine alternative Konfiguration einer erfindungsgemäßen Anordnung.
5c ist eine Draufsicht auf eine alternative Konfiguration einer erfindungsgemäßen Anordnung.
5d ist eine Draufsicht auf eine alternative Konfiguration einer erfindungsgemäßen Anordnung.
5e ist eine Draufsicht auf eine alternative Konfiguration einer erfindungsgemäßen Anordnung dieser Erfindung.
Diese Erfindung bezieht sich auf Scheibenanordnungen und Verfahren zur Anwendung bei fortlaufender auf Signalen basierender Detektierung und Auszählung von Mikroorganismen.
Für die Verwendung in dieser Erfindung sollen die folgenden Ausdrücke die im Folgenden definierten Bedeutungen haben:
„befestigen" soll das Anhaften der Scheiben am Substrat mit Hilfe jeglicher Verfahren oder Mittel, die entsprechend dem Stand der Dinge zur Zeit ihrer Herstellung bekannt sind, wobei die adhäsive Befestigung, die Befestigung durch Ultraschallverschweißen, die Befestigung durch Formstanzen oder die physikalische Befestigung mit eingeschlossen sind.
Der Ausdruck „bedecken" sollte, wenn er als Verb verwendet wird, nicht in seiner Bedeutung auf eine spezielle räumliche Anordnung, so wie das Bedecken einer Anordnungsoberseite, begrenzt sein.
„Scheibe" sollte nicht auf eine Form oder Konfiguration begrenzt sein. Die Scheiben können zum Beispiel eine runde, ovale, viereckige oder polygonale Form oder andere geeignete Formen besitzen.
„Hydrophob" und „hydrophil" haben hier die Bedeutungen, wie sie allgemein in der Technik verstanden werden. Ein „hydrophobes" Material hat somit eine relativ kleine oder gar keine Affinität zu Wasser oder wäßrigen Medien, wogegen ein „hydrophiles" Material eine relativ starke Affinität zu Wasser oder wäßrigen Medien besitzt.
„Impfung" soll bedeuten, daß eine absorbierende Scheibe oder absorbierende Scheiben der vorliegenden Erfindung mit Probenmaterial benetzt wird oder werden.
„Mikroorganismus" soll alle lebenden mikroskopischen Organismen und Zellen bedeuten, wobei ohne Einschränkung Bakterien, Mykoplasmen, Rickettsien, spiralförmige Bakterien, Hefen, Schimmelpilzkulturen und Protozoen, so wie mikroskopische Formen von eukariotischen bzw. eukariontischen Zellen, z. B. einzelne Zellen gezüchtet oder direkt von einem Gewebe oder einem Organ stammend) oder kleine Zellklumpen eingeschlossen sind. Die Mikroorganismen werden nicht nur detektiert und/oder ausgezählt, wenn ganze Zellen direkt detektiert werden, sondern auch wenn solche Zellen indirekt detektiert werden, wie z. B. durch Detektierung oder quantitative Bestimmung von Zellfragmenten, biologischen Molekülen, die von Zellen stammen, oder Nebenprodukten von Zellen.
Bezugnehmend auf 1 und 2 kann das Substrat 12 der Probenanordnung 10 aus jedem Material, das relativ hydrophob ist, hergestellt werden und liefert eine geeignete Oberfläche oder Stütze für die Scheiben 14, die nachfolgend beschrieben werden. Das Substrat 12 kann z. B. aus dünnen Polymerschichten oder anderen geeigneten Materialien hergestellt werden. Geeignete Polymere enthalten ohne Einschränkung Polyethylen, Polypropylen, Polyester, Polyimide, Fluoropolymere, Polykarbonate, Polyurethane und Polystyrene. Das Substrat 12 sollte vorzugsweise keine wesentlichen fluoreszierenden oder lichtabsorbierenden Eigenschaften, die mit jeglicher Art von Indikatorsystemen auf Fluoreszenzbasis oder Farbbasis, die für die Detektierung verwendet werden, Wechselwirken können. Vorzugsweise sollte das Substrat 12 keine Chemikalien durchsickern lassen, die in Kontakt mit der flüssigen Probe treten können.
Die Hydrophobie des Substrats 12 trägt dazu bei, daß eine Querkontamination der Scheiben 14 verhindert wird. In dieser Hinsicht kann das Substrat 12 so behandelt werden, daß es Hydrophobie zeigt. Eine dünne Schicht aus akryliertem Silikon oder einem anderen hydrophoben Material beispielsweise zum Substrat 12 zugegeben werden. Fachleute werden andere Mittel zur Erzeugung einer Oberflächen-Hydrophobie erkennen.
Die absorbierenden Scheiben 14 sind am Substrat 12 befestigt um die flüssige Probe aufzunehmen und zurückzuhalten.
Dementsprechend können die Scheiben 14 aus einer Vielzahl von absorbierenden Materialien, einschließlich Zellulosederivate, Polyolefine, Polyester und Polyamide, hergestellt bzw. konstruiert werden, wobei Zellulosederivate bevorzugt werden. Geeignete Zellulosederivate enthalten Papier, Holzstoff und Reyon und können chemisch veränderte Zellulosederivate, wie etwa Zelluloseester enthalten. Geeignete Polyolefine enthalten hydrophile Polyethylene oder hydrophile Polypropylenfasern. Geeignete Polyamide enthalten Nylon. Geeignete Polyester enthalten Polymilchsäure.
Die absorbierenden Scheiben 14 der Probenanordnung 10 haben vorzugsweise eine gleichförmige Form, und jede Scheibe besitzt eine Flüssigkeitsrückhalte-Kapazität von etwa 0,1 Mikroliter bis zu etwa 100 Mikroliter der flüssigen Probe. Im noch bevorzugteren Fall besitzt jede Scheibe eine Flüssigkeitsrückhalte-Kapazität von etwa 2 Mikroliter bis etwa 16 Mikroliter. Typischerweise ist, je höher das Rückhalte-Gesamtvolumen der Probe ist, die Höhe der Empfindlichkeit der Anordnung 10. Dementsprechend ist es wünschenswert, ein großes Probenvolumen zurückzuhalten. Die Anordnung 10 kann viele Scheiben 14 beinhalten. Die Probenanordnung 10 kann vorzugsweise zwischen einer und etwa 600 Scheiben enthalten, wobei 100 Scheiben besonders bevorzugt sind
Die Scheiben 14 können am Substrat 12 durch verschiedene Mittel entsprechend dem Stand der Technik befestigt werden, wobei die Verwendung eines adhäsiven 16 oder doppelseitigen Klebebandes ohne Einschränkungen eingeschlossen ist. Bevorzugte Klebemittel schließen wasserunlösliche Isooktyl-Akrylat-Kleber ein, wie im U.S.-Patent Nr. 5,409,838 offenbart. Ein Beispiel eines geeigneten doppelseitigen Klebebands ist unter der Produktnummer 1513 und der Bezeichnung „Double Stick Tape^TM", bei der Firma 3M Co., St. Paul, Minnesota, U.S.A. erhältlich. Die Scheiben 14 sind am Substrat 12 in ge nügender Entfernung befestigt, so daß die Probe, einmal auf eine Scheibe 14 geimpft, nicht direkt von dieser Scheibe auf eine andere verschmiert wird.
Die Anordnung 10 kann auch vorzugsweise Sätze der Scheiben 14 mit unterschiedlichen Volumina enthalten. Der Einsatz von Scheiben mit unterschiedlichen Volumina kann die effektive Zählrate der Anordnung bei einer MPN-Analyse erheblich verbreitern, was von Fachleuten begrüßt würde. In dieser bevorzugten Ausführungsform enthält die Anordnung 10 vorzugsweise etwa 100 Scheiben. Die Anordnung 10 enthält besonders bevorzugt etwa 50 Scheiben mit einem Flüssigkeitsrückhalte-Volumen von etwa 16 Mikroliter und etwa 50 Scheiben mit einem Flüssigkeitsrückhalte-Volumen von etwa 2 Mikroliter.
Wenn Scheiben 14 in mehr als einer Größe vorhanden sind, dann umgeben vorzugsweise die größeren Scheiben 14a im Wesentlichen die kleineren Scheiben 14b, wie in 1 dargestellt. Die größeren Scheiben 14a sind zwischen den kleineren Scheiben 14b und dem äußeren Rand 30 des Substrats 12 angeordnet. Man ist überzeugt, daß die Anordnung der Scheiben 14 in dieser Art sowohl zur Verhinderung der Austrocknung der kleineren Scheiben 14b beiträgt, weil die größeren Scheiben 14a sich so verhalten, daß sie den Bereich der kleineren Scheiben 14b feucht halten, als auch zur partiellen Abschirmung der kleineren Scheiben 14b vor dem Luftstrom, der die kleineren Scheiben 14b austrocknen kann, was bei einer Impfung bei höheren Temperaturen auftreten kann, beiträgt. Mit Bezug auf das Beispiel 3, siehe unten, ist es, um dieses Ergebnis zu erreichen, nicht notwendig, daß die größeren Scheiben 14a die Scheiben 14b komplett umgeben, zum einen im Bezug auf die kleinen Scheiben 14b selbst oder zum anderen auf den äußeren Rand.
Die Scheiben 14 können jegliche Größe, Form und Höhe haben. Vorzugsweise sind die Scheiben 14 gleichmäßig hoch. Die Höhe kann korrigiert werden, um die Versiegelung mit einer optionalen Deckschicht 18 mit dem Substrat, wie nachfolgend genauer beschrieben, zu gewährleisten.
Mit Bezug auf 1–3 enthält die Anordnung der vorliegenden Erfindung einen Impfträger 20. Der Impfträger 20 kann Probenmaterial für nachfolgende Impfungen der absorbierenden Scheiben 14 zurückhalten. Beispiele von möglichen Impfträgern 20 beinhalten absorbierende Kissen, warmgeformte Platten und Reservoires.
Mit Bezug auf 3 ist der Impfträger 20 so an der Anordnung befestigt, daß der Träger 20 in Kontakt mit den absorbierenden Scheiben 14 kommen kann. Eine bevorzugtes Verfahren ist die Befestigung des Impfträgers 20 entlang der Perforierung 22. In dieser Konfiguration kann der Impfträger 20 von der Anordnung 10 nach Gebrauch einfach durch Abreißen entlang der Perforierung 22 entfernt werden. Der Träger 20 bedeckt im Wesentlichen den Bereich des Substrats 12, der die Scheiben 14 beinhaltet.
Das Probenmaterial verteilt sich über den Träger 20 oder innerhalb des Trägers 20, wenn die Probe darauf angeordnet wird. Anschließend plaziert der Anwender den Impfträger 20 so, daß er in Kontakt mit den Scheiben 14 kommt. Die Probe wird gleichmäßig und praktisch simultan vom Träger 20 auf die Scheiben 14 übertragen.
Vorzugsweise ist der Impfträger 20 ein absorbierender Impfkissen 24, an der eine Unterlage 26 befestigt wurde. Das Kissen 24 kann aus jeder Anzahl von absorbierenden Materialien hergestellt werden, entsprechend denen, die oben für das Scheibenmaterial aufgelistet wurden. Wegen des Produktionsverfahrens ist es erwünscht, daß das Kissen 20 aus dem gleichen Material hergestellt wird, wie die Scheiben 14. Das Kissen 24 kann jede Größe oder Form besitzen. Vorzugsweise bedeckt das Kissen 24 mehr Fläche des Substrats 12 als von den Scheiben 14 bedeckt wird und bedeckt alle Scheiben 14, um sicherzugehen, daß alle Scheiben 14 geimpft werden können, wenn das Kissen 24 so positioniert wird, daß es in Kontakt mit den Scheiben 14 kommt.
Die Unterlage 26 ist am Substrat 12 befestigt. Vorzugsweise ist die Unterlage 26 ablösbar z. B. entlang einer Perforierung 22 befestigt. Bevorzugte Unterlagen 26 sind relativ dünn, und Chemikalien können nach Kontakt mit dem flüssigen Probenmaterial nicht durchsickern. Wegen des Produktionsverfahrens kann die Unterlage 26 aus dem gleichen Material hergestellt werden wie das Substrat 12.
Das Kissen 24 kann an der Unterlage 26 auf jedem in der Technik bekannten Weg z. B. mit einem Adhäsiv befestigt werden. Vorzugsweise ist die Unterlage 26 so befestigt, daß es nachdem Kontakt mit dem flüssigen Probenmaterial nicht zu einem Durchsickern der Chemikalien kommt.
Optional kann die Anordnung 10 eine Abdeckung bzw. Deckplatte 18 beinhalten, um die Scheiben 14 vor Kontamination oder Austrocknung zu schützen, nachdem Probenmaterial zur Anordnung 10 zugegeben wurde. Die Deckplatte 18 kann aus jeder Anzahl von Materialien hergestellt werden. Die Deckplatte 18 ist vorzugsweise flexibel, transparent bis zu dem Grad, daß eine Detektierung durch die Deckschicht 18 durchgeführt werden kann, kompatibel mit den wachsenden Mikroorganismen und dem System zur Detektierung, das in dieser Anordnung verwendet wird (sie zeigt z. B. keine Lumineszenz oder Opazität bis zu dem Grad, in dem sie wesentlich die Detektierung stört) und läßt keine unerwünschten Chemikalien durchsickern, nachdem sie mit der flüssigen Probe in Kontakt gekommen sind.
Mit Bezug auf 4 ist die Deckplatte 18 an der Anordnung 10 so befestigt, daß sie im Wesentlichen alle Scheiben 14 bedeckt und vorzugsweise alle Scheiben 14 bedeckt. Vorzugsweise ist die Deckplatte 18 und das Substrat 12 so di mensioniert, daß die Deckplatte 18 mit dem verwendeten Substrat 12 in Kontakt kommen und dieses versiegeln kann. Für diese Anwendung bedeutet der Ausdruck „versiegeln" nicht zwingend, daß die Verbindung zwischen dem Substrat 12 und der Deckschicht 18 luftdicht ist. Statt dessen überdeckt die Deckplatte 18 das Substrat 12 und steht in solidem Kontakt mit diesem, um zu einer Verhinderung der Kontamination während des Gebrauchs beizutragen und die Austrocknung der Scheiben 14 zu verhindern.
Mit Bezug auf 1 können die Deckplatte 18, das Substrat 12 und der Impfträger 20 aneinander am Ende der Anordnung befestigt werden, um ein Gelenk bzw. ein Scharnier 32 zu bilden. In dieser Konfiguration wird der Impfträger 20 vorzugsweise zwischen der Deckplatte 18 und dem Substrat 12 befestigt.
Die flüssige Testprobe kann jede, zu untersuchende Probe sein und von jedem Ausgangsmaterial bzw. jeder Quelle stammen. Die flüssige Testprobe kann selektive Nähr- und Wachstumsmedien für die zu untersuchenden Mikroorganismen und/oder eine Indikatorsubstanz, die ein Signal in Anwesenheit des Wachstums von Mikroorganismen produziert, enthalten. Optional kann das Nährmedium einen Schaumverfestiger enthalten, der zur „Einkapselung" der wachsenden Mikroorganismen beiträgt. Solche Schaumverfestiger sind den Fachleuten dieses Gebiets bekannt und beinhalten jegliches wasserabsorbierendes Material, das zu einem Gel wird, wenn eine wäßrige Flüssigkeit bzw. Flüssigkeit auf Wasserbasis zugegeben wird.
Vorzugsweise sind die Nähr- und Wachstumsmedien als Beschichtung oder einer anderen Ablagerung innerhalb oder auf den absorbierenden Scheiben vorhanden und zwar in Mengen, die ausreichen, um die gewünschten Konzentrationen zu erreichen, wenn ein bestimmtes Volumen der flüssigen Testprobe auf den Scheiben verteilt wird. So eine Beschichtung kann z. B. durch Anordnen oder Verteilen einer Lösung auf dem Nährmedium (mit oder ohne Schaumverfestiger) auf den Scheiben und Trocknen der Lösung, um eine Beschichtung oder Ablagerung des Nährmediums auf den Scheiben herzustellen, erreicht werden. Komponenten dieser Medien können in den Klebemitteln oder in anderen Substanzen, die die Scheiben mit dem Substrat verbinden (wenn anwendbar), vorhanden sein. Das Medium diffundiert letzten Endes in die Probe.
Eine große Auswahl von selektiven Nährmedien für eine große Auswahl von zu untersuchenden Mikroorganismen ist bekannt, sowie eine große Auswahl von Indikatorsubstanzen für eine große Auswahl von Mikroorganismen und jedes dieser Medien oder Indikatorsubstanzen ist für die Anwendung im Verfahren dieser Erfindung geeignet. Ein Vorteil der vorliegende Erfindung ist, daß lösliche Indikatoren verwendet werden können, da die Diffusion durch Einschließen der wäßrigen biologischen Probe in den absorbierenden Scheiben verhindert wird.
Andere Probenreagenzien können beschichtet oder innerhalb der absorbierenden Scheiben der Probenanordnungen anders abgelagert werden. Solche Probenreagenzien können, ohne Einschränkung, Schaumverfestiger und Indikatorsubstanzen wie chromogene, fluoreszierende, fluorogene, lumineszierende und elektrochemische Indikatoren sein. Die Probenreagenzien können auf den absorbierenden Scheiben durch jede der vielen Verfahren zur Fixierung von Probenreagenzien auf festen Substraten, die den Fachleuten bekannt sind, fixiert werden. Diese Verfahren schließen z. B. die Trocknung von Flüssigkeiten, die Probenreagenzien enthalten, in den Scheiben, sowie andere Methoden zur nichtkovalenten Bindung von Biomolekülen und anderen Probenreagenzien an ein festes Substrat, mit ein. Alternativ dazu können verschiedene Verfahren verwendet werden, um Probenreagenzien kovalent auf den Scheiben zu binden, mittels Verfahren, die den Fachleuten gut bekannt sind.
In der vorliegenden Erfindung werden fluorogene Indikatoren bevorzugt, weil sie schon in relativ niedrigen Konzentrationen detektiert werden können. Geeignete Indikatoren schließen 4-Methyl-Belliferyl-Phosphat und 4-Methyl-Belliferyl-B-D-Glucopyranosid, L-Phenylalanin-7-Amido-4-Methyl-Kumarin mit ein. Andere können 4-Methyl-Belliferyl-Acetat und 4-Methyl-Belliferyl-Sulfat enthalten.
Die Materialien dieser Erfindung sollten vorzugsweise biokompatibel sein und können mit Fluoreszenzindikatoren verwendet werden. Die Materialien zeigen keine signifikante, inhärente Fluoreszenz, die bei einer Verwendung von Indikatoren stören würde. Zusätzlich zeigen die Scheiben keine signifikante Absorption bei der Emissionswellenlänge der verwendeten Indikatoren.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine flüssige Probe zur Untersuchung vorbereitet. Zusätzlich zu der Nahrung, dem Wasser, etc., die getestet werden sollen, kann die Probe Indikatoren oder andere Reagenzien enthalten. Der Anwender wählt eine Anordnung 10 aus, die ein Wachstumsmedium selektiv für die zu untersuchenden Mikroorganismen enthält.
Mit Bezug auf 1 legt der Anwender, um den Prozeß zu beginnen, den Impfträger 20 frei und positioniert die Probe auf dem Träger 20. Das Probenmaterial kann auf den Träger durch Ausschütten, Pipettieren oder durch andere, geeignete Methoden aufgebracht werden.
Im Falle der Verwendung eines absorbierenden Trägers 20, ist das Aufbringen von genügend Probenmaterial auf dem Träger 20 bevorzugt, um im Wesentlichen beide, den Träger 20 und die absorbierenden Scheiben abzusättigen. Unter diesen Umständen hält der Träger 20 ein Flüssigkeitsvolumen über dem Flüssigkeits-Sättigungsgrad des absorbierenden Trägers 20 hinaus zurück. Dieses überschüssige Flüssigkeitsvolumen scheint dazu beizutragen, das Probenmaterial schnell über dem Kissen 24 vor der Impfung der Scheiben 14 zu verteilen.
Mit weiterem Bezug auf 1 plaziert der Anwender den Impfträger 20 so, daß er mit den Scheiben 14 in Kontakt kommt, so daß Probenmaterial vom Träger 20 zu den Scheiben 14 übertragen wird. Vorzugsweise ist der Träger 20 so dimensioniert, daß der Bereich des Substrats 12, der die Scheiben 14 enthält, bedeckt ist. Der Anwender übt Druck auf den Träger 20 aus, um zum Transfer der Probe vom Träger 20 auf die Scheiben 14 beizutragen. Es kann z. B. ein geringer Druck ausgeübt werden durch Herunterpressen der Außenseite der Anordnung mit einem plastischen Verteiler. Dieses Verfahren führt zu einer nahezu simultanen Impfung der Scheiben 14. Jede Scheibe 14 wird im Wesentlichen gesättigt und jede Scheibe 14 enthält, entsprechend ihrer Größe, annähernd die gleiche Probenmenge.
Diese Impfmethode verhindert zusammen mit der Konstruktion der Anordnung im Wesentlichen eine Querkontamination zwischen den Scheiben 14. Die Scheiben 14 absorbieren schnell das Probenmaterial, wobei sie das Volumen des Probenmaterials, das auf dem Substrat 12 verteilt wird, minimieren. Die Hydrophobie des Substrats 12 trägt dazu bei, daß das Probenmaterial beim Einleiten des Impfvorgangs nicht die Scheiben 14 querkontaminiert.
Nach der Impfung kann der Impfträger 20 entfernt und weggeworfen werden. In der bevorzugten Ausführungsform ist der Träger 20 ein absorbierendes Impfkissen 24 mit einer Unterlage 26. Die Unterlage 26 ist an der Anordnung entlang einer Perforierung 22 befestigt. Nach der Impfung wird die Unterlage 26 mit dem Kissen 24 einfach von der Anordnung 10 abgerissen und weggeworfen. Wenn eine Deckschicht 18 mit eingeschlossen ist, dann ist diese über den Scheiben 14 angeordnet und mit dem Substrat 12 versiegelt, wie in 4 darge stellt. Alternativ dazu kann die Anordnung 10 in einem Gehäuse, einer Tasche oder einem anderen Gefäß inkubiert werden, um ein Austrocknen und/oder eine Kontamination der Scheiben 14 zu verhindern.
Nach der Verteilung der Probe vom Träger 20 auf die Scheiben 14 können viele Proben, abhängig von den gewünschten Anwendungen, ausgeführt werden. Für die Detektierung und Auszählung von Mikroben muß die Probenanordnung in einem bestimmten Zeitraum, der ausreicht, daß mindestens ein Zellteilungszyklus der Mikroorganismen stattfinden kann, inkubiert werden. Zu diesem Zweck wird die Anordnung 10 im Allgemeinen bei etwa 25°C bis etwa 45°C inkubiert, bevorzugter bei etwa 30°C bis etwa 37°C. Die Inkubationszeit für die Detektierung von Mikroorganismen wird variabel sein. Die Zeit für die Detektierung wird auch, entsprechend der Wachstumsrate und der Anzahl der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen variieren. Werden diese Überlegungen in Betracht gezogen, dann kann der Zeitraum für die Detektierung für Auszählungszwecke nur 6–8 Stunden betragen. Diese relativ kurze Inkubationszeit stellt einen deutlichen Vorteil gegenüber den gebräuchlichen Methoden zur Detektierung, die typischerweise Inkubationszeiten von etwa 24 h und mehr erfordern, dar.
Nach der Inkubation der Probenanordnung wird die Anwesenheit oder Abwesenheit der Mikroorganismen in den Scheiben (und dementsprechend in der flüssigen Testprobe) detektiert. Die Art der Detektierung hängt von dem Typ der Indikatorsubstanz, die in diesem Verfahren verwendet wird, ab. Jede Indikatorsubstanz, die ein dektektierbares Signal liefern kann, kann verwendet werden. Solche Indikatoren schließen fluoreszierende, chromogene, lumineszente und elektrochemische Indikatoren mit ein, sind aber nicht auf diese begrenzt. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von Mikroorganismen in einer Scheibe kann mit visuellen Methoden detektiert werden, mit dem bloßen Auge oder mikroskopisch, falls ein chromogener oder lumineszenter Indikator verwendet wird. Der Indikator kann durch Beschichtung oder durch andere Arten in die Scheiben eingebracht werden. Die Indikatoren können auch den Klebemitteln oder anderen Substanzen, die die Scheiben mit dem Substrat verbinden (falls angewendet), beigemengt werden. In diesem Fall diffundiert der Indikator letztendlich in das flüssige Probenmaterial. Wenn eine fluoreszierende Indikatorsubstanz verwendet wird, dann können die Ausrüstung und die Verfahren zur Detektierung eines Fluoreszenzsignals für die Detektierung verwendet werden. Es gibt viele Indikatorsubstanzen und Systeme zur Signalerkennung, mit eingeschlossen sind die Systeme zur Detektierung von elektrochemischen Veränderungen, die nach dem Stand der Technik zur Detektierung von Mikroorganismen bekannt sind, und jede dieser Substanzen oder Systeme kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Detektierung von Mikroorganismen in der flüssigen Probe kann weiterhin die Auszählung der Anzahl an Mikroorganismen in einem flüssigen Testprobe beinhalten. Eine besonders nützliche Anwendung dieser Verfahren und Anordnungen ist die Auszählung von Mikroorganismen abhängig von deren Wachstum in flüssigen Testproben. Solch eine Auszählung ist sehr wichtig für das Untersuchen von Nahrungsproben, Proben für den Umweltschutz, klinischen Proben, pharmazeutischen Proben, Proben für die kosmetische Industrie und anderen Proben, auf Kontamination durch Mikroorganismen. Die Verfahren und Anordnungen dieser Erfindung gestatten eine effiziente, sehr genaue, bequeme und kostengünstige Untersuchung solcher Proben. Bevorzugte Anwendungen der Verfahren und Anordnungen dieser Erfindung in solchen mikrobiologischen Untersuchungen sind MPN-Auszähltechniken. In der herkömmlichen MPN-Analyse wird eine zu untersuchende Probe seriell verdünnt (10-fach) und in gleichen Mengen in sich wiederholende Röhrchenanordungen, die selektive Wachstumsmedien und chemische Indikatoren enthalten, einpipettiert. Die Röhrchen werden für etwa 24-48 Stunden bei höheren Temperaturen inkubiert und anschließend auf das Wachstum der Organismen untersucht. Eine statistische Formel, basierend auf dem Probenvolumen und der Anzahl von positiven und negativen Röhrchen jeder Anordnung, wird zur Abschätzung der Anzahl der vorhandenen Organismen (pro Volumeneinheit) in der ursprünglichen Probe herangezogen. Bei der gegenwärtigen Verwendung hat dieses herkömmliche Verfahren mehrere Nachteile. Es ist arbeitsintensiv wegen der vielen Verdünnungs- und Pipettierungsschritte, die notwendig sind, um die Analyse durchzuführen. Aus praktischen Gründen werden nur sich wiederholende Anordnungen bzw. Verdünnungsreihen von etwa 3 bis 5 Röhrchen für jede Verdünnung herkömmlicherweise verwendet. Als Ergebnis sind die 95%-Vertrauensgrenzen für die MPN-Abschätzung der Konzentration von Mikroben extrem breit. Zum Beispiel besitzt eine MPN-Abschätzung mit neun Röhrchen (drei 10-fache Verdünnungen) von 20 95%-Vertrauensgrenzen im Bereich von 7 bis 89.
Die Anwendung von Verfahren und Anordnungen der vorliegenden Erfindung in der MPN-Analyse überwindet mehrere der oben genannten Nachteile. Der Arbeitsaufwand wird drastisch reduziert weil kein Pipettieren in einzelne Röhrchen mehr nötig ist und sehr wenig oder gar keine Bewegung oder andere manuellen Bedienungen gebraucht werden. Statt dessen wird die flüssige Probe auf die absorbierenden Scheiben unter Verwendung eines Impfträgers aufgebracht. Zusätzlich fallen weniger Probenverdünnungen an, wenn sich große Mengen an absorbierenden Scheiben auf der Anordnung befinden. Die relativ große Anzahl an absorbierenden Scheiben liefert auch eine genauere Abschätzung der Mikrobenkonzentration. Dies resultiert aus der größeren korrespondierenden Anzahl von aliquoten Proben anteilen, die ein korrespondierendes schmaleres Vertrauensgrenzintervall liefert.
Die Verfahren dieser Erfindung können automatisiert werden und die Anordnungen können mittels eines automatisierten Systems analysiert werden.
Die folgenden Beispiele werden als Hilfe zum Verständnis dieser Erfindung angeboten bzw. dargestellt und sind nicht so ausgelegt, daß sie deren Schutzumfang begrenzen sollen. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Anteile und Prozentangaben Gewichtsangaben.
Beispiel 1
Absorbierende Scheiben-Probenanordnungen
Absorbierende Scheiben-Probenanordnungen, die einen Impfträger besitzen und für die Detektierung und Auszählung von Mikroorganismen in einer flüssigen Testprobe verwendet werden können, werden so wie in diesem Beispiel beschrieben konstruiert bzw. hergestellt.
Eine Lage aus absorbierendem, nicht gewebten Material aus Zellulosederivaten(Produktbezeichnung 10201, Dexter Windsor Locks, CT, U.S.A.) wurde an eine dünne silikonbeschichtete Polyesterschicht der Firma Rexam (Produktbezeichnung 15819, 2 Milliinch (mil) dick, Rexam Release, West Chicago, IL, U.S.A.) mit einem Isooktyl-Acrylat/Acrylamid-Kleber (Gewichtsverhältnis 96/4), der druckempfindlich ist (PSA), laminiert. Das Material wurde gesättigt mit einem wässrigen Gebräu, das die Nährsubstanzen für das Wachstum und die in Tab. 1 aufgelisteten Indikatorchemikalien enthielt. Überschüssige Flüssigkeit wurde entfernt und das Laminat wurde bei etwa 110°C 10 Minuten lang getrocknet. In das getrocknete Laminat wurden dann zirkulare Scheiben geschnitten, unter Verwendung einer Schneideform, die tiefengeregelt ist und die nur durch das absorbierende Material und die adhäsiven Schichten schneidet. Das Material, das nicht zu den Scheiben gehörte, wurde vom Laminat entfernt und weggeworfen, um eine Lage der dünnen Schicht, die eine Anordnung mit zirkularen Scheiben enthält, zu erhalten. Die Scheiben hatten zwei Größen: Kleine Scheiben mit einem Durchmesser von annähernd 4,1 mm und große Scheiben mit einem Durchmesser von annähernd 8,3 mm, und sie waren, wie in 1 dargestellt, zueinander gruppiert und beabstandet. Die kleinen und großen Scheiben hatten, basierend auf gravimetrischen Bestimmungen, Rückhaltekapazitäten von ca. 2 bzw. 16 Mikroliter Flüssigkeit. Die Lage, die die Scheiben enthielt, wurde für den Gebrauch zur Konstruktion der Probenanordnungen in Rechtecke mit den Ausmaßen 10,9 cm × 12,1 cm geschnitten. Jede einzelne rechteckige Lage enthielt 52 kleine Scheiben, die in parallelen Reihen innerhalb einer sie umgebenden Gruppe von 50 großen Scheiben in parallelen Reihen, wie in 1 dargestellt, angeordnet waren. Der Abstand von der äußeren Kante der großen Scheiben zur Kante der rechtwinkligen Lage lag bei etwa 1,4 cm.
Ein Impfträger wurde vorbereitet durch Verkleben eines Kissens des absorbierenden nicht gewebten Materials aus Zellulosederivaten (Produktbezeichnung 10201, Dexter), mit den Ausmaßen 8,9 cm × 9,5 cm, mit einer rechtwinkligen Lage einer silikonhaltigen Polyesterschicht der Firma Rexam unter Verwendung des oben beschriebenen PSA-Klebers auf Acrylatbasis. Die dünne Schichtunterlage war auf einer Seite perforiert (wie in 3 dargestellt), um die Entfernung des Kissens nach der Impfung zu vereinfachen.
Das 10,9 cm-Ende der Impfanordnung wurde mit dem 10,9 cm-Ende der Lage, die die Scheiben enthält, mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebandes (Produktbezeichnung 1513, 3M Co., St.Paul, MN, U.S.A.) verklebt, um ein Gelenk bzw. Scharnier zu bilden, so daß das absorbierende Kissen über und gegen die absorbierenden Scheiben positioniert wird. Eine Lage mit den Ausmaßen 10,9 cm × 13,2 cm einer biaxial orientierten Po lypropylen(BOPP)-Schicht (1,6 Milliinch (mil) dick, 3M Co.) wurde dann mit einem doppelt klebenden Band an der Gelenk- bzw. Scharnier-Ecke des Impfträgers befestigt, um als Deckplatte für die Anordnung zu dienen. In 1 bis 3 ist die gesamte Anordnung in fertiggestellter Form unter verschiedenen Blickwinkeln dargestellt. Nachdem die Konstruktion vollendet war, wurden die Probenanordnungen mit Gammastrahlen im Bereich von etwa 10 kGy bestrahlt.
Tabelle 1
Beispiel 2
Genaue Beschreibung des Impfschritts bzw. Impfvorgangs Ziel dieses Beispiels war es, die Reproduzierbarkeit des Übertragens einer flüssigen Probe vom absorbierenden Kissen des Impfträgers auf die Vielzahl von absorbierenden Scheiben einer Probenanordnung zu bestimmen.
Eine entsprechend Beispiel 1 konstruierte Probenanordnung wurde mit einer Probe (3,5 ml) einer Pufferlösung mit der Bezeichnung „Butterfields Buffer" (Weber Scientific, Hamilton, NJ, U.S.A.) wie folgt geimpft. Die Probenanordnung wurde auf einer harten, flachen, ebenen Oberfläche mit der Schicht, die die Scheiben enthält (Scheibenschicht) nach oben, angeordnet. Diese Schicht wurde mit einer Hand angehoben, während die flüssige Probe auf den Zentralbereich des Impfkissens pipettiert wurde. Nach einer Wartezeit von 2–5 Sekunden zum Absorbieren der Probe vom Kissen, wurde die Scheibenschicht losgelassen und auf die Schicht, die das Kissen enthält (Kissenschicht) fallengelassen. Ein klarer, flacher, plastischer Verteiler wurde gegen die Scheibenschicht gedrückt um den Übertrag des flüssigen Probenmaterials von dem Kissen auf die Scheiben zu unterstützen. Dieser Probentranfer wurde durch eine dunklere Färbung der Scheiben deutlich bzw. sichtbar. Nach der Impfung der Scheiben wurde das Impfkissen entfernt durch Abreißen (an der Perforierung) des Impfträger von der Gelenk- bzw. Scharnierecke und anschließendes Entsorgen des Kissens. Zwei andere Probenanordnungen wurden in identischer Weise geimpft, um insgesamt drei Wiederholungen durchzuführen.
Unmittelbar nach der Impfung der Probenanordnungen wurde das Lichtabsorptionsvermögen jeder Scheibe mit einem Densimeter der Typenbezeichnung Gretag AG Model D19C (Regensdorf, Schweiz) gemessen. Der Hintergrund für die Messungen des Lichtabsorptionsvermögens war ein Streifen aus schwarzem Elektroband (Scotch^TM Super33+, 1,9 cm breit, 3M Co., St.Paul, MN, U.S.A). Die Lichtabsorptionsmessungen wurden auch an den Scheiben von 5 nicht geimpften Probenanordnungen durchgeführt, um ein durchschnittliches Absorptionsvermögen für trockene Scheiben zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Tab. 2 dargestellt.
Tab. 2
Die relativ kleinen, in Tab. 2 dargestellten Standardabweichungen lassen den Schluß zu, daß der Transfer des flüssigen Probenmaterials vom absorbierenden Impfkissen zu den absorbierenden Scheiben eine relativ hohe Reproduzierbarkeit aufweist.
Beispiel 3
Verdampfung von Wasser bzw. Flüssigkeit von den kleinen Scheiben während des Impfvorgangs Ziel dieses Beispiels war es, den Effekt der Position der absorbierenden Scheiben auf die Wasserverdampfung während der Inkubation der Probenanordnung, zu bestimmen. Erwartungsgemäß sind die kleinen Scheiben besonders anfällig für den Verlust von Wasser während der Inkubation und stellen daher der Kernpunkt dieses Beispiels dar.
Es werden Probenanordnungen konstruiert, die je 50 große Scheiben und 52 kleine Scheiben, wie in Beispiel 1 beschrieben, enthalten, mit der Ausnahme, daß die Orientierung der großen im Verhältnis zu den kleinen Scheiben in fünf verschiedenen, wie in 5a (Anordnung A), 5b (Anordnung B), 5c (Anordnung C), 5d (Anordnung D), 5e (Anordnung E) dargestellten, Konfigurationen variiert wurde. Für jede Konfiguration wurden drei Probenanordnungen mit einer flüssigen Pufferprobe (3,5 ml) der Bezeichnung „Butterfields Buffer", entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2, geimpft. Unmittelbar nach der Impfung wurden Messungen des Lichtabsorptionsvermögens der kleinen Proben analog Beispiel 2 gemessen. Die Probenanordnungen wurden dann ca. 22 Stunden bei Raumtemperatur (ca. 23°C) inkubiert und dann wurden die Messungen des Lichtabsorptionsvermögens erneut durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den anfänglichen (t = 0) und den endgültigen (t = 22) Messungen lieferte eine Angabe des Wasserverlusts der kleinen Scheiben während der Inkubation. Die Ergebnisse sind in Tab. 3 dargestellt.
Tab. 3
Die Daten in Tab. 3 zeigen, daß es zu relativ großen Verlusten von Wasser auf den kleinen Scheiben, die sich in den Probenanordnungen A, B, C und D befanden, während des Inkubationsvorgangs kam, wobei es zu einem signifikant geringerem Wasserverlust auf der Probenanordnung E kam. Die Daten zeigen auch, wie die Standardabweichungen es verdeutlichen, viel höhere Schwankungen des Wasserverlustes, auf den Probenanordnungen A, B, C und D, im Vergleich zum Wasserverlust auf der Anordnung E.
Beispiel 4
Detektierung und Auszählung der Mikroorganismen in einer Milchprobe unter Verwendung der Probenanordnungen mit den absorbierenden Scheiben.
Ziel dieses Beispiels war es, eine Probenanordnung mit absorbierenden Scheiben dieser Erfindung zu verwenden, um die Anzahl von Mikroorganismen in einer Milchprobe zu detektieren und auszuzählen und die Ergebnisse mit denen zu vergleichen, die von einer Standard-PETRIFILM^TM-Platte stammen.
Es wurde eine Probenanordnung, wie in Beispiel 1 beschrieben, konstruiert, mit der Ausnahme, daß sich darauf 50 große Scheiben und 53 kleine Scheiben befanden, und mit einer Probe (etwa 3 ml) aus pasteurisierter Magermilch, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2, geimpft. Die gleiche Magermilch wurde als Referenzprobe separat auf zwei kommerziell erhältlichen Platten der Bezeichnung Aerobic Count PETRIFILM^TM (3M Co., St. Paul, MN, U.S.A.) aufgetragen. Die Probenanordnung und die PETRIFILM^TM-Platten wurden dann bei 35°C 24 Stunden bzw. 48 Stunden lang inkubiert. Die Probenanordnungen wurden während der Inkubationszeit in Aufbewahrungsbehältern mit der Bezeichnung GLADLOCK ZIPPER^TM (First Brands Corporation, Danbury, CT) eingeschlossen.
Die Probenanordnung wurde nach der Inkubation untersucht und zeigte Fluoreszenz bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht auf 40 (von 50) der großen Scheiben und auf 9 (von 53) der kleinen Scheiben. Das Auftreten von Fluoreszenz auf jeglicher Scheibe bedeutet die Anwesenheit von lebensfähigen Mikroorganismen auf dieser Scheibe. Unter Verwendung der Formel des abgeschätzten MPN-Werts, MPN = (N/V)·ln(N/(N-X)), wobei N die Gesamtanzahl der Scheiben, V das Gesamtvolumen aller Scheiben und X die Anzahl der Scheiben darstellt, deren Untersuchung auf die Präsenz von Mikroorganismen positiv ausfällt, so wird ein MPN-Wert von 93 koloniebildenden Einheiten (cfu)/ml für die kleinen Scheiben und ein MPN-Wert von 101 koloniebildenden Einheiten (cfu)/ml für die großen Scheiben berechnet. Die Übereinstimmung dieser MPN-Ergebnisse stützt bzw. unterstreicht den Nutzen der Probenanordnung zur Detektierung und Auszählung der Mikroorganismen in einer Nahrungsprobe. Die Ergebnisse stimmten auch mit den Auszähleinheiten von 88 und 98 cfu/ml, die mit Hilfe der zwei Platten der Bezeichnung Aerobic Count PETRIFILM^TM bestimmt wurden, überein.

Claims

Eine Probenanordnung zum Nachweis und zur Auszählung von Mikroorganismen mit: einem Substrat mit einem Bereich, an dem absorbierende Scheiben befestigt sind und einem absorbierenden Impfkissen, das im Wesentlichen den Substratbereich, der die Scheiben aufweist, bedeckt und das so angeordnet ist, daß es einen Anteil einer Probe auf die absorbierenden Scheiben bringt.
Die Probenanordnung nach Anspruch 1, die ferner eine Abdeckung aufweist, die am Substrat befestigt ist.
Die Probenanordnung nach Anspruch 1, wobei das absorbierende Impfkissen ferner eine Unterlage aufweist.
Die Probenanordnung nach Anspruch 3, wobei die Unterlage ablösbar mit dem Substrat verbunden ist.
Die Probenanordnung nach Anspruch 3, wobei die Unterlage mit einer perforierten Folie mit dem Substrat verbunden ist.
Die Probenanordnung nach Anspruch 1, wobei die absorbierenden Scheiben zwei verschiedene Größen aufweisen, die eine Aufnahme vcn unterschiedlichen Probenvolumina ermöglichen.
Eine Probenanordnung zum Nachweis und zur Auszählung von Mikroorganismen mit: einem Substrat, absorbierenden Scheiben, die am Substrat befestigt sind, einer Unterlage, die beweglich am Substrat durch ein Scharnier bzw. Gelenk befestigt ist, einem absorbierenden Impfkissen, das an einer Unterlage befestigt ist, und so angeordnet ist, daß es einen Anteil der Probe auf die absorbierenden Scheiben bringt und einer Abdeckung, die beweglich durch ein Scharnier bzw. Gelenk am Substrat befestigt ist.
Die Probenanordnung nach Anspruch 7, wobei die Unterlage mit einer perforierten Folie mit dem Substrat verbunden ist.
Die Probenanordnung nach Anspruch 7, wobei die absorbierenden Scheiben zellulosische Scheiben zweier verschiedener Größen aufweisen.
Die Probenanordnung nach Anspruch 7, wobei die absorbierenden Scheiben Scheiben, die etwa zwei Mikroliter der Probe aufnehmen können und Scheiben, die etwa sechzehn Mikroliter der Probe aufnehmen können, aufweisen.
Die Probenanordnung nach Anspruch 10, wobei das Substrat ferner einen äußeren Rahmen aufweist, und die absorbierenden Scheiben, die etwa sechzehn Mikroliter der Probe aufnehmen können, am Substrat zwischen den Scheiben, die etwa zwei Mikroliter aufnehmen können, und dem äußeren Rahmen befestigt sind.
Ein Verfahren zum Gebrauch der Probenanordnung mit den Schritten: Bereitstellen einer Probenanordnung, die ein Substrat mit einem Bereich, an dem absorbierende Scheiben befestigt sind, und ein absorbierendes Impfkissen, das im Wesentlichen den Bereich des Substrats bedeckt, der die Scheiben aufweist, und so angeordnet ist, daß er einen Anteil einer Probe auf die absorbierenden Scheiben bringt, aufweist, Plazieren einer Probe auf dem absorbierenden Impfkissen, Plazieren des absorbierenden Impfkissens, so daß es mit den absorbierenden Scheiben in Kontakt kommt, um die Probe vom absorbierenden Impfkissen auf die absorbierenden Scheiben zu übertragen und Entfernen des Impfkissens von der Anordnung.