DE69838815T2

DE69838815T2 - Biosensor basierend auf optischer beugung

Info

Publication number: DE69838815T2
Application number: DE69838815T
Authority: DE
Inventors: Dennis S. Alpharetta Everhart; Mark L. Atlanta JONES; Rosann Marie Cumming KAYLOR
Original assignee: Kimberly Clark Worldwide Inc; Kimberly Clark Corp
Current assignee: Kimberly Clark Worldwide Inc; Kimberly Clark Corp
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2008-04-03
Anticipated expiration: 2018-12-17
Also published as: EP1040338A1; ES2294826T3; AU1920599A; CA2309595C; US6060256A; WO1999031486A1; DE69838815D1; KR100568635B1; CA2309595A1; CN1171083C; US6436651B1; AU760500B2; CN1286753A; EP1040338B1; KR20010032322A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet von Analytensensoren und genauer gesagt liegt die vorliegende Erfindung auf dem Gebiet des Mikrokontaktdruckens von Bindemitteln auf Metallfilme, um optische Beugungs-Biosensoren herzustellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mikrokontaktdrucken ist eine Technik zum Bilden von Mustern aus organischen Monoschichten mit lateralen Dimensionen im Mikrometer- und Submikrometerbereich. Es bietet experimentelle Einfachheit und Flexibilität beim Bilden bestimmter Arten von Mustern. Bei der bisherigen Verfahrensweise wurde Mikrokontaktdrucken mit selbstorganisierten Monoschichten langkettiger Alkanthiolate verwendet, um auf Gold und anderen Metallen organische Strukturen zu bilden. Diese Muster wirkten durch Schützen des Trägermetalls vor Korrosion durch entsprechend formulierte Ätzmittel als Nanometer-Schutzlacke oder ermöglichten die selektive Anordnung von Flüssigkeiten auf hydrophilen Bereichen des Musters. Im Allgemeinen werden Muster selbstorganisierter Monoschichten mit Dimensionen, die geringer als 1 Mikrometer sein können, durch Verwendung des Alkanthiols als "Farbe" und indem sie unter Verwendung eines elastomeren "Stempels" auf den Metallträger gedruckt werden, gebildet. Der Stempel wird gefertigt, indem ein Silikonelastomer unter Verwendung einer durch optische oder Röntgen-Mikrolithographie oder durch andere Techniken hergestellten Vorlage geformt wird. (Siehe die US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 08/654,993 ; 08/769,594 ; 08/821,464 ; 08/707,456 und 08/768,449 ).
Das Mikrokontaktdrucken verleiht der Mikrofertigung etliche neue Fähigkeiten. Das Mikrokontaktdrucken macht es möglich, Muster zu bilden, die nur durch die einzelnen funktionellen Gruppen unterschieden werden; diese Fähigkeit gestattet die Kontrolle von Oberflächeneigenschaften, wie zum Beispiel der freien Grenzflächenenergien, mit hoher Genauigkeit. Bei der bisherigen Verfahrensweise beruht das Mikrokontaktdrucken auf molekularer Selbstorganisation. Unter Verwendung selbstorganisierender Monoschichten wird ein System erzeugt, das (zumindest lokal) einem thermodynamischen Minimum nahe ist und von sich aus fehlerabweisend und selbstheilend ist. Einfache Verfahren mit minimalem Schutz gegen eine Oberflächenverunreinigung durch adsorbierte Materialien oder durch Teilchen, können zu erstaunlich niedrigen Fehlerniveaus in den Endstrukturen führen. Das Verfahren, das selbstorganisierende Monoschichten verwendet, kann bei atmosphärischem Druck in einer ungeschützten Laboratmosphäre ausgeführt werden. Somit ist das Mikrokontaktdrucken, das selbstorganisierende Monoschichten verwendet, in Laboratorien nützlich, welche keinen routinemäßigen Zugang zu der Ausstattung haben, die normalerweise bei der Mikrofertigung verwendet wird, oder für welche die Kapitalkosten der Ausstattung ernsthafte Bedenken verursachen. Die gemusterten selbstorganisierten Monoschichten können so gestaltet werden, dass sie für etliche nasschemische Ätzmittel als Schutzlacke wirken.
Bei der bisherigen Verfahrensweise wird auch ein 5 bis 2000 Nanometer dicker Goldfilm normalerweise von einem mit Titan vorbehandelten Si/SiO₂-Wafer oder einer Glasplatte getragen. Das Titan dient als Adhäsionspromotor zwischen Gold und dem Träger. Der Siliciumwafer ist jedoch starr, spröde und kann kein Licht durchleiten. Diese Siliciumwafer sind auch nicht für einen kontinuierlichen Druckvorgang in großem Maßstab geeignet, wie zum Beispiel beim Buchdruck, Tiefdruck, Offsetdruck und Siebdruck (siehe Printing Fundamentals, A. Glassman, Hrsg. (Tappi Press Atlanta, GA 1981); Encyclopedia Britannica, Band 26, S. 76–92, 110–111 (Encyclopedia Brittanica, Inc. 1991)). Zusätzlich muss Silicium in einem getrennten Schritt mit einem Adhäsionspromotor, wie zum Beispiel Cr oder Ti, behandelt werden, sonst wird Au nicht adäquat anhaften, was die Bildung einer stabilen und wohlgeordneten Monoschicht verhindert. Schließlich ist Silicium für sichtbares Licht undurchlässig, so dass jedes Beugungsmuster mit reflektiertem Licht, nicht mit Durchlicht, erzeugt werden muss.
Benötigt wird ein leichtes, effizientes und einfaches Verfahren zum Kontaktdrucken eines gemusterten Rezeptors auf ein optisch transparentes, flexibles Substrat, das einer kontinuierlichen Verarbeitung zugänglich ist und keine selbstorganisierenden Monoschichten verwendet. Ein derartiges Verfahren und die sich aus einem derartigen Verfahren ergebende Vorrichtung ist einfacher, nicht auf die Begrenzungen selbstorganisierender Monoschichten beschränkt und ist leichter herzustellen.
US 5512131 offenbart ein Verfahren zur Musterbildung ebener oder nicht ebener Oberflächen mit selbstorganisierten molekularen Monoschichten (SAMs) auf Oberflächen-Metallschichten 32 unter Verwendung eines Mikrostempels 20 mit Vertiefungen 24, sowie dadurch hergestellte Gegenstände, zur Verwendung als biochemische Sensoren. Die SAM-Moleküle in den Bereichen 28 haben jeweils eine funktionelle Gruppe, wie zum Beispiel ein Thiol, die sich selektiv an einer Metalloberfläche 30 der Schicht 32 anheftet, wobei der Rest von jedem Molekül mit den benachbarten Molekülen in der Monoschicht in Wechselwirkung tritt, um eine relativ geordnete Anordnung zu bilden. Die SAM-Muster bilden sich aus einer exponierten molekularen Spezies, die das Befesti gen biologischer Spezies (z. B. Antikörper) gestattet, sowie einer Funktionalität für die Anheftung an eine Metalloberfläche und einem Abstandshaltungsteil in der Form R'-A-R'' dazwischen, wobei R' an die Oberfläche 30 bindet, A ein Abstandshalter ist und R'' eine Gruppe ist, die exponiert ist. Ein dünner Metallfilm 32 kann auf einem Substrat 34 liegen, das selbst in Form eines Films aus einem Material, wie zum Beispiel einem Kunststoff oder einem anderen organischen Polymer, vorliegt. Der Nachweis der Beendigung des Assays wird zum Beispiel unter Verwendung eines Analyten durchgeführt, der mit einer reflektiven Spezies, wie zum Beispiel Gold, markiert ist, so dass die Analyse bei der Bestrahlung durch einen Laser in den Bereichen 28 auf der Grundlage von Reflexion durchgeführt wird. Alternativ dazu kann ein großer Bereich der Bereiche 28 mit kohärenter elektromagnetischer Strahlung beleuchtet und ein Beugungsmuster beobachtet werden, wobei die Intensität des Beugungsmusters verwendet wird, um die Menge an immobilisierter Markierung zu quantifizieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine preiswerte und empfindliche Vorrichtung und ein preiswertes und empfindliches Verfahren zum Nachweisen und Quantifizieren von Analyten, die in einem Medium vorliegen, bereit. Die Vorrichtung umfasst einen metallisierten Film, auf den ein spezifisches, vorbestimmtes Muster eines analytenspezifischen Rezeptors gedruckt ist. Die vorliegende Erfindung verwendet keine selbstorganisierenden Monoschichten, sondern ist insofern allgemeiner, als jeder Rezeptor, der chemisch an eine Oberfläche gekoppelt werden kann, verwendet werden kann. Nach Anheftung eines Zielanalyten, der zur Lichtstreuung fähig ist, an ausgewählte Bereiche des Kunststofffilms, auf den der Rezeptor gedruckt ist, findet eine Beugung von Durchlicht und/oder reflektiertem Licht mittels der physikalischen Dimensionen, dem Brechungsindex und der definierten, genauen Anordnung des Analyten statt. Im Fall dass ein Analyt sichtbares Licht nicht streut, weil der Analyt zu klein ist oder keinen nennenswerten Brechungsindexunterschied im Vergleich zum umgebenden Medium aufweist, ist die Anheftung von mit dem Analyten gekoppelten Polymerkugeln an Rezeptoren ein anderes Verfahren zum Erzeugen einer Lichtbeugung. Ein Beugungsbild wird erzeugt, das leicht mit dem Auge oder gegebenenfalls mit einer sensorischen Vorrichtung gesehen werden kann. Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen Biosensor gemäß dem angefügten Patentanspruch 1.
Die vorliegende Erfindung verwendet Verfahren zum Kontaktdrucken gemusterter Monoschichten unter Verwendung von Derivaten von Bindemitteln für Mikroorganismen. Ein Beispiel für ein derartiges Derivat ist ein Thiol. Bei den erwünschten Bindemitteln kann es sich um thiolierte Antikörper oder Antikörperfragmente, Proteine, Nucleinsäuren, Zucker, Kohlenhydrate oder jede andere Funktionalität handeln, die fähig ist, einen Analyten zu binden. Die Derivate werden an Metalloberflächen, wie zum Beispiel metallisierte Polymerfilme, chemisorbiert.
Gemusterte Monoschichten ermöglichen die kontrollierte Anordnung von Analyten darauf mittels der Muster analytenspezifischer Rezeptoren. Die dadurch hergestellten erfindungsgemäßen biosensorischen Vorrichtungen werden verwendet, indem die biosensorische Vorrichtung zuerst einem Medium ausgesetzt wird, das den Analyten der Wahl enthält, und dann, nach einer entsprechenden Inkubationszeit, Licht, wie zum Beispiel von einem Laser oder einer Punktlichtquelle, durch den Film geleitet wird. Falls der Analyt im Medium vorliegt und an die Rezeptoren auf der gemusterten Monoschicht gebunden ist, wird das Licht auf eine solche Weise gebeugt, dass ein Bild im sichtbaren oder nahen Infrarot-Bereich erzeugt wird. Mit anderen Worten können die gemusterten Monoschichten mit dem daran gebundenen Analyten optische Beugungsmuster erzeugen, die sich je nach der Reaktion der Rezeptoren auf der Monoschicht mit dem Analyten von Interesse unterscheiden. Das Licht kann sich im sichtbaren Spektrum befinden und kann entweder von dem Film reflektiert oder durch ihn durchgeleitet werden, und bei dem Analyten kann es sich um jede Verbindung oder jedes Teilchen handeln, das mit der Monoschicht reagiert. Bei dem Licht kann es sich um ein weißes Licht oder um monochromatische elektromagnetische Strahlung, vorzugsweise im sichtbaren Bereich, handeln. Die vorliegende Anmeldung offenbart auch einen flexiblen Träger für eine Monoschicht auf Gold oder einem anderen geeigneten Metall oder einer anderen geeigneten Metalllegierung.
Die vorliegenden Anmeldung offenbart einen Träger für eine dünne Schicht aus Gold oder einem anderen geeigneten Material, der keinen Adhäsionspromotor für die Bildung einer wohlgeordneten Monoschicht oder dünnen Schicht des Bindemittels benötigt. Die vorliegende Anmeldung offenbart auch einen Träger für eine Schicht aus Gold oder einem anderen Material, der für eine Fertigung mit kontinuierlichem Drucken anstelle einer Chargenfertigung geeignet ist. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung einen preiswerten Wegwerf-Biosensor bereit, der massenproduziert werden kann. Die erfindungsgemäßen Biosensoren können als ein einzelner Test zum Nachweisen eines Analyten hergestellt werden oder er kann als eine Mehrfachtestvorrichtung formatiert werden. Die Verwendungen für die erfindungsgemäßen Biosensoren schließen den Nachweis einer chemischen oder biologischen Verunreinigung in Kleidungsstücken, wie zum Beispiel Windeln, allgemein den Nachweis einer Verunreinigung durch Mikororganismen in abgepackten Nahrungsmitteln, wie zum Beispiel Fruchtsäften oder anderen Getränken, und die Verwendung der erfindungsgemäßen Biosensoren bei gesundheitsdiagnostischen Anwendungen, wie zum Beispiel diagnostischen Kits zum Nachweis von Antigenen, Mikroorganismen und Blutbestandteilen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform können Nährstoffe für eine spezifische Klasse von Mikroorganismen in die Rezeptor-Monoschicht eingegliedert werden. Auf diese Weise können sehr geringe Konzentrationen von Mikroorganismen nachgewiesen werden, indem man den erfindungsgemäßen Biosensor zuerst mit den darin eingegliederten Nährstoffen in Kontakt bringt und den Biosensor dann unter Bedingungen inkubiert, die für das Wachstum des gebundenen Mikroorganismus angemessen sind. Man lässt den Mikroorganismus wachsen, bis es genügend Organismen gibt, um ein Beugungsmuster zu bilden.
Die vorliegende Erfindung kann auch auf Kontaktlinsen, Augengläsern, Fensterscheiben, pharmazeutischen Fläschchen, Lösungsmittelbehältern, Wasserflaschen, Wundpflaster und dergleichen verwendet werden, um eine Verunreinigung nachzuweisen.
Diese und andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach einer Durchsicht der folgenden ausführlichen Beschreibung der offenbarten Ausführungsformen ersichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Bei 1 handelt es sich um die schematische Darstellung eines metallbeschichteten MYLAR-Films mit einer Nährstoffunterlage.
2 zeigt einen Biosensor, der zum gleichzeitigen Messen mehrerer unterschiedlicher Analyte in einem Medium fähig ist.
Bei 3 handelt es sich um eine schematische Darstellung des Kontaktdruckens von Rezeptoren.
Bei 4 handelt es sich um einen enzymgekoppelten Immunadsorptionsassay (ELISA) der mit einem thiolierten Antikörper-Bindemittel bedruckten Oberfläche.
Bei 5 handelt es sich um eine Photographie, die mit Antigen beschichtete Ersatz-Polystyrolteilchen nach der Anheftung an den gedruckten Antikörper zeigt.
Bei 6 handelt es sich um ein Beugungsmuster, das durch die in 4 beschriebene Probe erzeugt wird.
Bei 7 handelt es sich um eine optische Mikroaufnahme von Candida albicans, die an einen gemusterten Antikörperrezeptor angeheftet ist.
Bei 8 handelt es sich um ein durch das Binden von Candida albicans an den gemusterten Rezeptor verursachtes Beugungsmuster.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung stellt verbesserte biosensorische Vorrichtungen und Verfahren zur Verwendung derartiger biosensorischer Vorrichtungen zum Nachweisen und Quantifizieren der Anwesenheit oder Menge eines Analyten von Interesse in einem Medium dar. Die Analyte, die durch die vorliegende Erfindung nachgewiesen werden können, schließen Mikroorganismen, wie zum Beispiel Bakterien, Hefen, Pilze und Viren, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Im Gegensatz zu bisherigen Vorrichtungen ermöglichen die erfindungsgemäßen den Nachweis von extrem kleinen Mengen eines Analyten in einem Medium in einem schnellen Assay, der nur wenige Minuten dauert. Zusätzlich sind außer einer Lichtquelle bei den erfindungsgemäßen biosensorischen Vorrichtungen keine signalgebenden oder damit zusammenhängenden elektronischen Komponenten erforderlich.
Die vorliegende Anmeldung offenbart das Mikrokontaktdrucken analytenspezifischer Rezeptoren (thiolierter Bindemittel) auf einen metallisierten Kunststofffilm, was die Entwicklung von Wegwerf-Biosensoren zur Einmalverwendung ermöglicht, die auf Lichtbeugung beruhen, um die Anwesenheit des Analyten anzuzeigen. Nach der Anheftung eines Zielanalyten an ausgewählte Bereiche des Kunststofffilms, die den Rezeptor enthalten, findet mittels der physikalischen Dimensionen und der definierten, genauen Anordnung des Analyten eine Beugung von Durchlicht und/oder reflektiertem Licht statt. Zum Beispiel sind Hefe, Pilze oder ein Bakterium groß genug, um als Beugungselemente für sichtbares Licht zu dienen, wenn sie in organisierten Mustern auf einer Oberfläche angeordnet sind.
Zusätzlich zum Erzeugen eines einfachen Beugungsbildes können Analytenmuster so beschaffen sein, dass sie die Entwicklung eines holographischen sensorischen Bildes und/oder eine Änderung der sichtbaren Farbe ermöglichen. Somit wird das Erscheinen eines Hologramms oder eine Änderung eines bestehenden Hologramms eine positive Reaktion anzeigen. Das durch die Beugung des Durchlichts erzeugte Muster kann jede Form haben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Umwandlung eines Musters von einem Muster in ein anderes nach dem Binden des Analyten an das aufnahmebereite Material. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das Beugungsmuster in weniger als einer Stunde nach dem Kontakt des Analyten mit der erfindungsgemäßen biosensorischen Vorrichtung erkennbar.
Das Beugungsgitter, das die Beugung von Licht nach einer Wechselwirkung mit dem Analyten erzeugt, muss eine minimale Periodizität von etwa ½ der Wellenlänge und real oder imaginär einen Brechungsindex aufweisen, der anders als der des umgebenden Mediums ist. Sehr kleine Analyte, wie zum Beispiel Viren oder Moleküle, können durch Verwenden eines größeren Teilchens, das für den kleinen Analyten spezifisch ist, indirekt nachgewiesen werden. Eine Ausführungsform, bei welcher der kleine Analyt nachgewiesen werden kann, umfasst das Beschichten des Teilchens, wie zum Beispiel einer Latexkugel oder einer Polystyrolkugel, mit einem aufnahmebereiten Material, wie zum Beispiel einem Antikörper, das spezifisch an den Analyten von Interesse bindet. Teilchen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Glas, Cellulose, synthetische Polymere oder Kunststoffe, Latex, Polystyrol, Polycarbonat, Proteine, Bakterien- oder Pilzzellen und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Teilchen sind wünschenswerterweise kugelförmig, aber die strukturelle und räumliche Konfiguration der Teilchen ist nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung. Zum Beispiel könnte es sich bei den Teilchen um Splitter, Ellipsoide, Würfel, eine Zufallsform und dergleichen handeln. Eine wünschenswerte Teilchengröße reicht von einem Durchmesser von ungefähr 0,2 μm bis 50 μm, wünschenswerterweise von ungefähr 0,4 μm bis 1 μm. Die Zusammensetzung des Teilchens ist nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung.
Es sollte selbstverständlich sein, dass die optimale Teilchengröße eine Funktion des Brechungsindexes des Teilchens und des Brechungsindexes des umgebenden Mediums ist. Ein Verfahren zum Analysieren der optimalen Teilchengröße zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung mit einem Transmissionsbild ist das Einsetzen der Gleichung: topt = λ/2(n2 – n1)wobei

t_opt: = die optimale Höhe des Teilchens
λ: = die Wellenlänge des einfallenden Lichts
n₂: = der Brechungsindex des Teilchens
n₁: = der Brechungsindex des umgebenden Mediums

Die Monoschicht auf dem metallisierten Film enthält ein aufnahmebereites Material oder ein Bindemittel, wie zum Beispiel einen Antikörper, das spezifisch an ein Epitop auf dem Analyten bindet, das sich von dem beim Binden an das Teilchen verwendeten Epitop unterscheidet. Somit wird zum Nachweisen eines Mediums mit einem kleinen Analyten, wie zum Beispiel Viruspartikeln, das Medium zuerst den Latex teilchen ausgesetzt, an welche die Viruspartikel gebunden werden. Dann werden die Latexteilchen gegebenenfalls gewaschen und dem metallisierten Film mit den Monoschichten, welche die virenspezifischen Antikörper enthalten, ausgesetzt. Die Antikörper binden dann an die Viruspartikel auf der Latexkugel, und dadurch immobilisieren sie die Latexkugeln im gleichen Muster wie die Monoschichten auf dem Film. Weil die gebundenen Latexkugeln eine Beugung des sichtbaren Lichts verursachen, wird ein Beugungsmuster gebildet, das die Anwesenheit des Viruspartikels in der Flüssigkeit anzeigt. Andere Kombinationen unter Verwendung von Teilchen sind Fachleuten wohlbekannt.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Rezeptoren, wie zum Beispiel Antikörper, wie hierin beschrieben an die Metallschicht angeheftet. Die Antikörper werden dann einer Umgebung ausgesetzt, die Analyte enthält, welche an den Rezeptor binden. Nachdem der Analyt an den Rezeptor gebunden ist, wird ein zweiter Rezeptor zugegeben, der das metallgebundenen Konjugat erkennt. An diesen zweiten Rezeptor ist ein Enzym oder eine anorganische Substanz gebunden, welche die Präzipitation einer festen Substanz verursacht, wenn das entsprechende Reagenz oder die entsprechenden Reagenzien zugegeben werden. Zum Beispiel handelt es sich bei Peroxidase um ein Enzym, das in Anwesenheit von Tetramethylbenzidin (siehe Beispiel 3 hierin) die Bildung eines Präzipitats verursachen kann. Ein anderes Beispiel ist die Verwendung von kolloidalem Gold in Anwesenheit eines Silberhalogenids. Elementares Silber präzipitiert auf die gemusterte Rezeptorschicht und erzeugt dadurch das Beugungsmuster.
Die Analyte, von denen in Betracht gezogen wird, dass sie unter Verwendung der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden, schließen Bakterien; Hefen; Pilze; Viren; den Rheumafaktor; Antikörper, einschließlich, aber nicht beschränkt auf IgG-, IgM-, IgA- und IgE-Antikörper; das carcinoembryonale Antigen; ein Streptococcus-Gruppe-A-Antigen; virale Antigene; mit Autoimmunerkrankungen zusammenhängende Antigene, Allergene, Tumorantigene; ein Streptococcus-Gruppe-B-Antigen, HIV-I- oder HIV-II-Antigen; oder eine Wirtsreaktion (Antikörper) gegen diese und andere Viren; für RSV spezifische Antigene oder eine Wirtsreaktion (Antikörper) gegen das Virus; ein Antigen; ein Enzym; ein Hormon; ein Polysaccharid; ein Protein; ein Lipid; ein Kohlenhydrat; einen Arzneistoff oder eine Nucleinsäure; eine Salmonella-Art; eine Candida-Art, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Candida albicans und Candida tropicalis; die Neisseria meningitides Gruppen A, B, C, Y und W, Untergruppe 135; Streptococcus pneumoniae, E. coli, Haemophilus influenzae des Typs B; ein von Mikroorganismen abgeleitetes Antigen; ein Hapten; ein Rauschgift; einen therapeutischen Arzneistoff; ein Umweltmittel und für Hepatitis spezifische Antigene ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform können Nährstoffe für eine spezifische Klasse von Mikroorganismen in die selbstorganisierende Monoschicht eingegliedert werden. Auf diese Weise können sehr geringe Konzentrationen von Mikroorganismen nachgewiesen werden, indem der erfindungsgemäße Biosensor zuerst mit den darin eingegliederten Nährstoffen in Kontakt gebracht wird und der Biosensor dann unter Bedingungen inkubiert wird, die für das Wachstum des gebundenen Mikroorganismus angemessen sind. In einer in 1 gezeigten Ausführungsform hat der MYLAR-Film 15 eine Unterlage aus Nährstoff 30, die in Kontakt mit der Rückseite des MYLAR-Films 15 ist. Auf der umgekehrten Seite des MYLAR-Films 15 befindet sich ein Metallfilm 20. Bei dem Metallfilm 20 handelt es sich vorzugsweise um Gold. An den Metallfilm 20 sind Rezeptoren 25 angeheftet, die für einen Mikroorganismus spezifisch sind. Bei der Verwendung diffundiert der Nährstoff langsam durch den MYLAR-Film. Wenn sich ein Mikroorganismus an den Rezeptor 25 anheftet, verbraucht der Mikroorganismus den Nährstoff und wächst. Während der Mikroorganismus wächst, beugt er auftreffendes Licht und bildet dadurch ein Beugungsmuster. Falls das Beugungsmuster gebildet wird, liegt es bei dieser Ausführungsform somit daran, dass der gebundene Mikroorganismus gewachsen ist. Natürlich kann sich der Mikroorganismus in manchen Fällen genügend vermehren, um ohne die Anwesenheit eines Nährstoffes auf der gemusterten Monoschicht ein Beugungsmuster zu bilden.
Ein Teil der vorliegenden Offenbarung ist ein aufnahmebereites Material, das auf den metallisierten Film mikrogedruckt werden kann und spezifisch an den Analyten von Interesse bindet. Somit wird das aufnahmebereite Material als ein Teil eines spezifischen Bindungspaares definiert und schließt Antigen/Antikörper, Enzym/Substrat, Oligonucleotid/DNA, Chelatbildner/Metall, Enzym/Inhibitor, Bakterien/Rezeptor, Virus/Rezeptor, Hormon/Rezeptor, DNA/RNA oder RNA/RNA, Oligonucleotid/RNA und Binden dieser Spezies an jede andere Spezies, sowie die Wechselwirkung dieser Spezies mit anorganischen Spezies ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
Das aufnahmebereite Material, das an die Befestigungsschicht gebunden ist, ist durch die Fähigkeit gekennzeichnet, den Analyten oder die Analyten von Interesse spezifisch zu binden. Die Vielfalt von Materialien, die als aufnahmebereites Material verwendet werden können, wird nur durch die Materialarten beschränkt, die sich selektiv (in Bezug auf jede gewählte Probe) an einen sekundären Partner anlagern. Unterklassen von Materialien, die in die Gesamtklasse von aufnahmebereiten Materialien fallen, schließen Toxine, Antikörper, Antikörperfragmente, Antigene, Hormonrezeptoren, Parasiten, Zellen, Haptene, Metaboliten, Allergene, Nucleinsäuren, Materialien aus dem Kern, Autoantikörper, Blutproteine, Zelltrümmer, Enzyme, Gewebeproteine, Enzymsubstrate, Coenzyme, Neurotransmitter, Viren, Viruspartikel, Mikroorganismen, Proteine, Polysaccharide, Chelatbildner, Arzneistoffe und jedes andere Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ein. Diese Liste schließt nur manche der vielen unterschiedlichen Materialien ein, die auf die Befestigungsschicht aufgeschichtet werden können, um ein dünnes Filmassaysystem herzustellen. Um welchen ausgewählten Analyten von Interesse es sich auch immer handelt, das aufnahmebereite Material wird so gestaltet, dass es an den Analyten von Interesse spezifisch bindet.
Bei der Matrix, die den Analyten von Interesse enthält, kann es sich um eine Flüssigkeit, einen Feststoff oder ein Gas handeln und sie kann eine Körperflüssigkeit, wie zum Beispiel Schleim, Speichel, Urin, fäkales Material, Gewebe, Mark, Liquor, Serum, Plasma, Vollblut, Sputum, gepufferte Lösungen, extrahierte Lösungen, Samen, Vaginalsekrete, Perikard-, Magen-, Peritoneal-, Pleura- oder andere Spülungen und dergleichen einschließen. Bei dem Analyten von Interesse kann es sich um ein Antigen, einen Antikörper, ein Enzym, ein DNA-Fragment, ein intaktes Gen, ein RNA-Fragment, ein kleines Molekül, ein Metall, ein Toxin, ein Umweltmittel, eine Nucleinsäure, eine Zytoplasmakomponente, eine Komponente von Pili oder Flagellen, ein Protein, ein Polysaccharid, einen Arzneistoff oder jedes andere Material, wie zum Beispiel die in Tabelle A aufgeführten, handeln. Zum Beispiel kann aufnahmebereites Material für Bakterien eine Oberflächenmembrankomponente, ein Protein oder Lipid, ein Polysaccharid, eine Nucleinsäure oder ein Enzym spezifisch binden. Bei dem Analyten, der für das Bakterium spezifisch ist, kann es sich um ein Polysaccharid, ein Enzym, eine Nucleinsäure, eine Membrankomponente oder einen durch den Wirt als Reaktion auf die Bakterien produzierten Antikörper handeln. Die Anwesenheit des Analyten kann eine (bakterielle oder virale) Infektionskrankheit, Krebs oder eine andere Stoffwechselstörung oder ein anderes Leiden anzeigen. Die Anwesenheit des Analyten kann ein Anzeichen für eine Lebensmittelvergiftung oder eine andere toxische Belastung sein. Der Analyt kann Drogenmissbrauch anzeigen oder kann Spiegel therapeutischer Mittel überwachen.
Eines der Assayprotokolle, denen man am häufigsten begegnet, für das diese Technologie verwendet werden kann, ist ein Immunoassay. Die allgemeinen Betrachtungen betreffen jedoch Nucleinsäuresonden, Enzym/Substrat und andere Assayformate mit Ligand/Rezeptor. Für Immunoassays kann ein Antikörper als aufnahmebereites Material dienen oder er kann der Analyt von Interesse sein. Das aufnahmebereite Material, zum Beispiel ein Antikörper oder ein Antigen, muss eine stabile, dichte, reaktive Schicht auf der Befestigungsschicht der Testvorrichtung bilden. Falls ein Antigen nach gewiesen werden soll und ein Antikörper das aufnahmebereite Material ist, muss der Antikörper für das Antigen von Interesse spezifisch sein; und der Antikörper (das aufnahmebereite Material) muss das Antigen (den Analyten) mit ausreichendem Drang binden, damit das Antigen an der Testoberfläche zurückgehalten wird. In manchen Fällen bindet der Analyt das aufnahmebereite Material vielleicht nicht einfach, sondern kann verursachen, dass eine nachweisbare Modifikation des aufnahmebereiten Materials stattfindet. Diese Wechselwirkung könnte eine Erhöhung der Masse an der Testoberfläche verursachen oder eine Abnahme der Menge des aufnahmebereiten Materials auf der Testoberfläche. Ein Beispiel für letzteres ist die Wechselwirkung eines abbauenden Enzyms oder Materials mit einem spezifischen, immobilisierten Substrat. In diesem Fall würde man vor einer Wechselwirkung mit dem Analyten von Interesse ein Beugungsmuster sehen, aber das Beugungsmuster würde verschwinden, wenn der Analyt vorläge. Der spezifische Mechanismus, durch den Bindung, Hybridisierung oder Wechselwirkung des Analyten mit dem aufnahmebereiten Material stattfindet, ist für diese Erfindung nicht wichtig, kann aber die im endgültigen Assayprotokoll verwendeten Reaktionsbedingungen beeinflussen.
Im Allgemeinen kann das aufnahmebereite Material in einem Muster, das ein Beugungsmuster erzeugt, passiv an die Befestigungsschicht angeheftet werden. Falls erforderlich können die freien funktionellen Gruppen, die durch die Befestigungsschicht auf der Testoberfläche eingeführt worden sind, für eine kovalente Befestigung des aufnahmebereiten Materials an der Testoberfläche verwendet werden. Chemische Verfahren, die zur Befestigung von aufnahmebereiten Materialien zur Verfügung stehen, sind Fachleuten wohlbekannt.
Eine große Auswahl von Techniken kann verwendet werden, um das aufnahmebereite Material in einem Muster an der Befestigungsschicht anzuheften, so dass es, wenn es an den Analyten von Interesse gebunden ist, ein Beugungsmuster bildet, wenn Licht durch die Befestigungsschicht geleitet wird. Testoberflächen können durch Auftragen von Lösung in diskreten Anordnungen oder Mustern; Sprühen, Tintenstrahl, oder andere Aufdruckverfahren; oder durch Rotationsbeschichtung aus einem geeigneten Lösungsmittelsystem mit aufnahmebereitem Material beschichtet werden. Die ausgewählte Technik sollte die Menge an aufnahmebereitem Material minimieren, die zum Beschichten einer großen Anzahl von Testoberflächen erforderlich ist, und die Stabilität/Funktionalität des aufnahmebereiten Materials während des Auftragens aufrechterhalten. Die Technik muss das aufnahmebereite Material auch in einer sehr gleichmäßigen und reproduzierbaren Weise auf die Befestigungsschicht auftragen oder an sie anheften.
Die Rezeptorschicht wird aus Material gebildet, das aus der Gruppe, bestehend aus Antigenen, Antikörpern, Oligonucleotiden, Chelatbildnern, Enzymen, Bakterien, Bakterienpili, Material aus bakteriellen Flagellen, Nucleinsäuren, Polysacchariden, Lipiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Metallen, Viren, Hormonen und Rezeptoren für diese Materialien, ausgewählt wird. In den bevorzugten Ausführungsformen wird die biosensorische Vorrichtung konfiguriert und angeordnet, um als Reaktion auf das Durchleiten von polychromatischem Licht ein durch das Auge nachweisbares Muster bereitzustellen, wenn der Analyt von Interesse zwischen das aufnahmebereite Material und ein sekundäres Bindungsreagenz eingeschoben wird.
Das Medium, in dem sich der Analyt befinden kann, kann fest, gelartig, flüssig oder ein Gas sein. Für die Zwecke des Nachweisens eines Analyten in einer Körperflüssigkeit wird die Flüssigkeit aus der Gruppe, bestehend aus Urin, Serum, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit, Sputum, Vollblut, Speichel, urogenitalen Sekreten, Extrakten aus Fäzes, Perikard-, Magen-, Peritoneal-, Pleuraspülungen, Vaginalsekreten und einem Halsabstrich, ausgewählt; und das Verfahren schließt gegebenenfalls das Verwenden eines Beugungsmessgerätes ein, um das Auftauchen des Beugungsmusters zu messen. Das häufigste Gas, das zur Verwendung mit der erfindungsgemäßen biosensorischen Vorrichtung in Betracht gezogen wird, ist Luft.
Die erfindungsgemäße biosensorische Vorrichtung benutzt Verfahren zum Kon taktdrucken gemusterter Monoschichten auf metallisierte Polymerfilme, wünschenswerterweise thermoplastische Polymerfilme, die dadurch hergestellten Zusammensetzungen und die Verwendung dieser Zusammensetzungen. Gemusterte Monoschichten ermöglichen die kontrollierte Anordnung von Flüssigkeiten darauf, die einen Analytenrezeptor enthalten können. Der Begriff "gemusterte Monoschichten darauf", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet die Monoschichten in jedem Muster auf den metallisierten Polymerfilmen, einschließlich eines festen Musters.
Wenn der Film mit den Monoschichten darauf einem Analyten ausgesetzt wird, der fähig ist, mit der Monoschicht zu reagieren, erzeugt der Film optische Beugungsmuster, die sich je nach der Reaktion der Monoschicht mit dem Analyten von Interesse unterscheiden. Bei der Flüssigkeit kann es sich um eine Flüssigkeit mit hoher Oberflächenspannung, wie zum Beispiel Wasser, handeln. Das Licht kann sich im sichtbaren Spektrum befinden und entweder von dem Film reflektiert werden oder durch ihn durchgeleitet werden, und bei dem Analyten kann es sich um jede Verbindung handeln, die mit der selbstorganisierenden Monoschicht reagiert.
In bevorzugten Ausführungsformen bezieht das Verfahren das In-Kontakt-Bringen des Substrats mit einer Testprobe, die möglicherweise den Analyten enthält, unter Bedingungen ein, bei denen das Substrat eine Änderung des Brechungsindexes der Monoschicht verursacht. Wenn Licht durch das metallisierte thermoplastische Polymer mit der selbstorganisierenden Monoschicht durchgeleitet wird, wird ein sichtbares Muster gebildet und kann durch Richten des Lichts auf eine Oberfläche oder durch direktes Schauen durch das Substrat sichtbar gemacht werden.
In einer Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung in Form eines Messstabes in Betracht gezogen, wobei der mikrokontaktbedruckte metallisierte Film an das Ende des Messstabes montiert wird. Bei der Verwendung wird der Messstab in die Flüssigkeit getaucht, in welcher der vermutete Analyt vorliegen kann, und man lässt ihn über einige Minuten hinweg dort bleiben. Der Messstab wird dann entfernt und dann wird entweder ein Licht durch den metallisierten Film projiziert oder der Film wird mit einem Licht hinter dem Film beobachtet. Wenn ein Muster beobachtet wird, dann liegt der Analyt in der Flüssigkeit vor.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Mehrfachanalytentest auf dem gleichen Träger konstruiert. Wie in 2 gezeigt wird, wird ein Streifen 50 mit einigen mikrokontaktbedruckten metallisierten Filmen 70, 75, 80 und 85 bereitgestellt, wobei auf jedem Film ein Monoschichtmuster 60 aufgedruckt ist. Jeder der mikrokontaktbedruckten metallisierten Filme 70, 75, 80 und 85 hat ein anderes aufnahmebereites Material, das für unterschiedliche Analyten unterschiedlich ist. Man kann sehen, dass die vorliegende Erfindung in jeder Anordnung mit einer Vielfalt von mikrokontaktbedruckten metallisierten Filmen formatiert werden kann, wodurch dem Anwender der erfindungsgemäßen biosensorischen Vorrichtung ermöglicht wird, die Anwesenheit mehrerer Analyte in einem Medium unter Verwendung eines einzelnen Tests nachzuweisen.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Biosensor an einem selbstklebenden Aufkleber oder Plättchen befestigt werden, der/das dann auf einer harten Oberfläche oder der Wand eines Behälters angebracht werden kann. Der Biosensor kann auf der inneren Oberfläche eines Behälters, wie zum Beispiel einer Lebensmittelverpackung oder eines Glasfläschchens, angebracht werden. Der Biosensor kann dann sichtbar gemacht werden, um zu bestimmen, ob es eine mikrobielle Verunreinigung gibt.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform hat die Rezeptorschicht die folgende allgemeine Formel: X-R-Y X reagiert leicht mit Metall oder Metalloxid. Bei X kann es sich zum Beispiel um ein asymmetrisches oder symmetrisches Disulfid (-R'SSR, -RSSR), Sulfid (-R'SR, -RSR), Diselenid (-R'Se-SeR), Selenid (-R'SeR, -RSeR), Thiol (-SH), Nitril (-CN), Isonitril, Nitro (-NO₂), Selenol (-SeH), dreiwertige Phosphorverbindungen, Isothiocyanat, Xanthat, Thiocarbamat, Phosphin, Thiosäure oder Dithiosäure, Carbonsäuren, Hydroxysäuren und Hydroxamsäuren handeln.
Bei R handelt es sich um einen Linker, der gegebenenfalls durch Heteroatome unterbrochen sein kann und der vorzugsweise um der dichtesten Packung willen nicht verzweigt ist. Der Linker hilft, eine sterische Hinderung zu verhindern und/oder die Aktivität von Y zu erhöhen.
Bei Y handelt es sich um das Molekül, das der Rezeptorschicht Funktionalität verleiht. Bei Y kann es sich um jedes Molekül handeln, das den Analyten von Interesse vorzugsweise bindet. Bei Y kann es sich um Toxine, Antikörper, Antikörperfragmente, Antigene, Hormonrezeptoren, Parasiten, Zellen, Haptene, Metaboliten, Allergene, Nucleinsäuren, Materialien aus dem Kern, Autoantikörper, Blutproteine, Zelltrümmer, Enzyme, Gewebeproteine, Enzymsubstrate, Coenzyme, Neurotransmitter, Viren, Viruspartikel, Mikroorganismen, Proteine, Polysaccharide, Chelatbildner, Arzneistoffe und jedes andere Mitglied eines spezifischen Bindungspaares handeln.
Ein erwünschtes Reagenz, das mit potenziellen Bindemitteln, wie zum Beispiel Antikörpern oder Antikörperfragmenten umgesetzt werden kann, um X Funktionalität zu verleihen, schließt Sulfo-LC-SPDP (Pierce Chemical Co. Rockford, IL) mit der folgenden Formel ein, ist aber nicht darauf beschränkt:
Das Sulfo-LC-SPDP reagiert leicht mit Sulfhydryl- und Aminogruppen und ist deshalb zur Reaktion mit Proteinen, wie zum Beispiel Antikörpern oder anderen Proteinrezeptoren, Proteoglycanen, Lipoproteinen, Glycoproteinen oder Aminozuckern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Glucosamine oder Galaktosamine, ideal geeignet.
In einem typischen experimentellen Verfahren, das in 3 schematisch gezeigt wird, wird eine photolithographisch hergestellte Vorlage in eine Petrischale aus Glas oder Kunststoff gelegt und ein Gemisch aus SYLGARD^® Silikonelastomer 184 und SYLGARD^® Silikonelastomer 184 Härtungsmittel (Dow Corning Corporation) im Verhält nis 10:1 (Gew.:Gew. oder Vol.:Vol.) wird darüber gegossen. Man lässt das Elastomer ungefähr 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und Unterdruck zum Entgasen ruhen, dann wird es 4–16 Stunden lang bei 60°C gehärtet und vorsichtig von der Vorlage abgezogen.
Eine "Einfärbung" des elastomeren Stempels wird durch ungefähr 10 Sekunden bis 10 Minuten langes Eintauchen des elastomeren Stempels in eine Konzentration der Rezeptor-"Farbe" von ungefähr 0,1 mg/ml bis ungefähr 0,5 mg/ml erreicht, gefolgt von Trocknen des Stempels unter Stickstoffgas. Man lässt den Stempel trocknen, bis mit dem Auge auf der Oberfläche des Stempels keine Flüssigkeit zu sehen ist (normalerweise etwa 60 Sekunden), entweder unter Umgebungsbedingungen oder indem man ihn einem Strom von Stickstoffgas aussetzt. Nach dem Einfärben wird der Stempel (normalerweise von Hand) auf eine metallisierte Oberfläche aufgebracht. Ein sehr leichter Druck der Hand wird verwendet, um beim vollständigen Kontakt zwischen dem Stempel und der Oberfläche zu helfen. Der Stempel sollte wünschenswerterweise ungefähr 10 Sekunden bis ungefähr 200 Sekunden lang auf der Oberfläche bleiben. Die tatsächliche Zeit, die der Stempel auf der Oberfläche bleiben sollte, wird je nach der verwendeten Farbe variieren. Der Stempel wird dann sanft von der Oberfläche abgezogen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dem Rezeptordrucken ein Passivierungsschritt folgen, um die gesamte Oberfläche des Metalls, die keinen gebundenen Rezeptor enthält, zu bedecken. Eine Passivierung hilft beim Eliminieren des unspezifischen Bindens von Analyt.
Die elastomere Charakteristik des Stempels ist für den Erfolg des Verfahrens wichtig. Wenn Polydimethylsiloxan (PDMS) gehärtet ist, ist es ausreichend elastomer, um einen guten konformen Kontakt des Stempels und der Oberfläche zu ermöglichen, sogar für Oberflächen mit erheblichem Relief; dieser Kontakt ist unentbehrlich für eine effiziente Kontaktübertragung der Rezeptor-"Farbe" auf den Goldfilm. Die elastomeren Eigenschaften von PDMS sind auch wichtig, wenn der Stempel von der Vorlage entfernt wird: wenn der Stempel starr wäre (wie es die Vorlage ist), wäre es schwierig, den Stempel und die Vorlage nach dem Härten zu trennen, ohne eines der beiden Substrate zu beschädigen. PDMS ist auch ausreichend starr, um die Form beizubehalten, sogar in Bezug auf Merkmale mit Größenordnungen unterhalb eines Mikrometers; Muster mit so kleinen Linien wie 200 nm in der Breite sind erfolgreich erzeugt worden. Die Oberfläche von PDMS hat eine niedrige freie Grenzflächenenergie (y = 22,1 Dyn/cm) und der Stempel haftet nicht stark an dem metallisierten Film. Der Stempel ist insofern haltbar, als der gleiche Stempel über einen Zeitraum von mehreren Monaten hinweg ohne wesentlichen Leistungsabbau bis zu hundertmal verwendet werden kann. Die polymere Beschaffenheit von PDMS spielt auch eine entscheidende Rolle bei dem Färbeverfahren, indem sie dem Stempel ermöglicht, die Alkanthiolfarbe ohne wesentliche Schwellung zu absorbieren. Der Stempel kann auf einer Druckrolle hergestellt werden, um einen kontinuierlichen Druckvorgang zu ermöglichen.
Eine ausführlichere Beschreibung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen folgt.
Jeder thermoplastische Film, auf den ein Metallsubstrat abgeschieden werden kann, ist für die vorliegende Erfindung geeignet. Diese schließen Polymere, wie zum Beispiel Polyethylenterephthalat (MYLAR^®), Acrylnitril-Butadien-Styrol, Acrylnitril-Methylacrylat-Copolymer, Cellophan, cellulosehaltige Polymere wie zum Beispiel Ethylcellulose, Celluloseacetat, Celluloseacetatbutyrat, Cellulosepropionat, Cellulosetriacetat, Cellulosetriacetat, Polyethylen, Polyethylen-Vinylacetat-Copolymere, Ionomere (Ethylenpolymere), Polyethylen-Nylon-Copolymere, Polypropylen, Methylpentenpolymere, Polyvinylfluorid und aromatische Polysulfone ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Der Kunststofffilm weist vorzugsweise eine optische Transparenz von mehr als 80% auf. Andere geeignete Thermoplasten und Lieferanten können zum Beispiel in Referenzwerken, wie zum Beispiel der Modern Plastics Encyclopedia (McGraw-Hill Publishing Co., New York 1923–1996), gefunden werden.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform weist der thermoplastische Film mit der Metallbeschichtung darauf eine optische Transparenz von zwischen ungefähr 5% und 95% auf. Eine wünschenswertere optische Transparenz für den in der vorliegenden Erfindung verwendeten thermoplastischen Film beträgt zwischen ungefähr 20% und 80%. In einer erwünschten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist der thermoplastische Film mindestens eine optische Transparenz von ungefähr 80% auf und die Dicke der Metallbeschichtung ist derart, dass eine optische Transparenz von mehr als etwas 20% aufrechterhalten wird, so dass Beugungsmuster durch entweder reflektiertes Licht oder Durchlicht hergestellt werden können. Dies entspricht einer Dicke der Metallbeschichtung von etwa 20 nm. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann die Golddicke jedoch zwischen ungefähr 1 nm und 1000 nm betragen.
Das bevorzugte Metall für die Abscheidung auf den Film ist Gold. Silber, Aluminium, Chrom, Kupfer, Eisen, Zirkonium, Platin und Nickel, sowie Oxide dieser Metalle können jedoch verwendet werden. Chromoxid kann verwendet werden, um metallisierte Schichten herzustellen.
Im Prinzip könnte jede Oberfläche mit Riffelungen der geeigneten Größe als Vorlage verwendet werden. Das Verfahren des Mikrokontaktdruckens beginnt mit einer geeigneten Reliefstruktur, von der ein elastomerer Stempel abgegossen wird. Diese 'Vorlagen'-Matrize kann photolithographisch oder durch andere Verfahren, wie zum Beispiel im Handel erhältliche Beugungsgitter, hergestellt werden. In einer Ausführungsform kann der Stempel aus Polydimethylsiloxan hergestellt werden.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine optische Assayvorrichtung mit einer optisch aktiven aufnahmebereiten Oberfläche, die konfiguriert und angeordnet ist, um den gleichzeitigen Assay einer Vielzahl von Proben auf der Oberfläche auf einen Analyten von Interesse hin zu ermöglichen, und ein automatisiertes Gerät zur Handhabung von Flüssigkeit (z. B. eine Pipettiervorrichtung) dar, das konfiguriert und angeordnet ist, um Proben- und Reagenzlösungen auf der Oberfläche zu verteilen.
Die vorliegende Erfindung hat einen großen Anwendungsbereich und kann bei einer Vielfalt von Assayverfahren mit spezifischen Bindungspaaren benutzt werden. Zum Beispiel können die Vorrichtungen dieser Erfindung in Immunoassayverfahren zum Nachweis von entweder Antigen oder Antikörper verwendet werden. Die Vorrichtungen können zur Verwendung bei direkten, indirekten oder kompetitiven Nachweisregimes, zur Bestimmung von enzymatischer Aktivität und zum Nachweis kleiner organischer Moleküle (z. B. Rauschgifte, therapeutische Arzneistoffe, Umweltmittel) sowie zum Nachweis von Nucleinsäuren angepasst werden.
Der Stempel kann in Luft oder unter einer Flüssigkeit, wie zum Beispiel Wasser, angewendet werden, um eine übermäßige Diffusion des Alkanthiols zu verhindern. Für Druckverfahren in großem Maßstab oder kontinuierliche Druckverfahren ist es äußerst wünschenswert, in Luft zu drucken, da kürzere Kontaktzeiten für diese Verfahren wünschenswert sind.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das Muster auf dem metallisierten thermoplastischen Polymer mit der Rezeptorschicht gebildet. In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das Relief des Musters mit der Rezeptorschicht gebildet. Nach dem Stempelverfahren können die metallisierten Bereiche auf dem Kunststoff gegebenenfalls passiviert werden, zum Beispiel mit einer Monoschicht mit endständigem Methyl, wie zum Beispiel Hexadecylmercaptan.
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, die in keiner Weise so ausgelegt werden sollen, als ob sie deren Umfang Beschränkungen auferlegen. Im Gegenteil, es sollte selbstverständlich sein, dass man auf verschiedene andere Ausführungsformen, Modifikationen und Äquivalente davon zurückgreifen kann, die sich nach dem Lesen der hierin vorgelegten Beschreibung dem Fachmann nahelegen, ohne von der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
BEISPIEL 1
Eine beispielhafte Derivatisierung eines Antikörpers gegen E. coli 0157:H7 (Kirkegaard & Perry Labs) folgt: Zu 1 mg Antikörper wurden 450 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 50 μl einer 10 mM wässrigen Lösung von Sulfo-LC-SPDP (Pierce Katalognr. 21650) gegeben. Nach 60 Minuten bei Raumtemperatur wird die Lösung in einer D-Salt^TM Polyacrylamid-Entsalzungssäule (Pierce, Rockford, IL) entsalzt. Ein Acetatpuffer, pH 4,5, wurde verwendet, wenn eine anschließende Reduktion der Disulfidbindung durchgeführt wurde, während ein PBS-Puffer, pH 7,5, verwendet wurde, wenn das Antikörperderivat als Disulfid verbleiben sollte. Fraktionen von 500 μl wurden von der Säule gesammelt und die Fraktion mit dem Antikörperderivat wurde unter Verwendung eines Coomassie^® Plus Proteinassays bestimmt.
BEISPIEL 2
Der sich ergebende thiolierte Antikörper aus Beispiel 1, entweder als Disulfid oder Thiol, wird auf goldbeschichtetes MYLAR^® kontaktgedruckt. Der elastomere Stempel wird 10 Minuten lang in eine Konzentration des thiolierten Antikörpers von 0,5 mg/ml eingetaucht, gefolgt von Trocknen des Stempels unter Stickstoffgas, und dann mit einem goldbeschichteten MYLAR^®-Film 10–120 Sekunden lang in Kontakt gebracht.
BEISPIEL 3
In diesem Beispiel wird eine Kondensationsfigur erzeugt. Die nach dem wie in Beispiel 2 beschriebenen Drucken nicht gemusterten Bereiche werden mit einem anderen Thiol, wie zum Beispiel Hexadecanthiol, umgesetzt. Die Kondensationsfigur blieb, was anzeigte, dass der thiolierte Antikörper chemisorbiert ist und nicht verdrängt wird. Ein enzymgekoppelter Immunadsorptionsassay (ELISA) der bedruckten Oberfläche war in den gemusterten Bereichen positiv, was die Anwesenheit von aktivem Antikörper in dem Muster bestätigte (4). Der ELISA verwendete eine Peroxidase, die mit einem für den in Beispiel 1 verwendeten E. coli Antikörper spezifischen Antikörper konjugiert war. Eine Tetramethylbenzidin-Präzipitation auf dem gemusterten Antikörper-Sandwich erzeugte das Beugungsmuster. Die mit Antigen modifizierte Oberfläche von Ersatz-Polystyrolteilchen erzeugte auch eine gemusterte Adsorption an die Rezeptorschicht. Das durch die Tetramethylbenzidin-Präzipitation erzeugte Beugungsmuster wird in 6 gezeigt.
BEISPIEL 4
Ein Ersatz-Polystyrolteilchen wurde durch Carbodiimid-Kopplung des E. coli Antigens 0157:H7 (Kirkegaard & Perry Labs, Katalognr. 50-95-90) an ein Mikrometer große Polystyrol-Latexkugeln durch herkömmliche Techniken mit Ethyldimethylaminodicarbodiimid (EDAC – Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) hergestellt. Eine Lösung des Diimids mit 2 Gew.-% wurde mit carboxylatmodifiziertem PS-Latex (Bangs: 10¹⁰ Teilchen/ml) 4 Stunden lang umgesetzt, anschließend wurden diese aktivierten Teilchen einer Antigenlösung von 400 μg/ml ausgesetzt. Dieser Ersatz, verdünnt auf 10⁸ Teilchen/ml, wurde 60 Minuten lang einem Sensor ausgesetzt, der einen wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellten gemusterten Antikörper gegen E. coli 0157:H7 enthielt. Nach dem Waschen mit Phosphatpuffer wurde die Probe getrocknet, photographiert (5) und es wurde gezeigt, dass sie ein wie in Beispiel 3 beschriebenes Beugungsmuster erzeugte.
BEISPIEL 5
Es ist gut etabliert, dass ein Kriterium für die Anwesenheit einer selbstorganisierenden Monoschicht (SAM) eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen chemische Ätzmittel ist, und dass selbstorganisierte Monoschichten aus Alkanthiol eine Widerstandsfähigkeit von Gold gegen eine Cyanidätzung bereitstellen. Eine Cyanidätzung wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob das thiolierte Protein oder die Oligonucleotid-Bindemittel eine schützende SAM auf Gold bilden. Goldbeschichteter Polyesterfilm (Golddicke 35 nm) wurde wässrigen Lösungen von entweder einem thiolierten Antikörper gegen Candida albicans (0,5 mg/ml), thioliertem Protein G (0,5 mg/ml), thioliertem Oligonucleotid (10 μM) oder nicht derivatisiertem Antikörper gegen Candida albicans (nur Physisorption; 0,5 mg/ml) ausgesetzt; eine Ethanollösung von Hexadecanthiol (HDT; 5,7 mM), von dem bekannt ist, dass es auf Gold eine SAM bildet, wurde als positive Kontrolle verwendet. Nachdem sie 16 Stunden lang den thiolhaltigen Bindemitteln ausgesetzt worden waren, wurden die beschichteten Goldproben entnommen, sorgfältig mit Lösungsmittel (Wasser oder Ethanol) gewaschen und unter einem Stickstoffstrom getrocknet.

Mit Bindemittel beschichtete Proben wurden in eine Kaliumhydroxid (0,5 M) enthaltende wässrige Lösung von Kaliumcyanid (100 mM) eingetaucht, während Luft (Sauerstoff) in die Lösung gesprudelt wurde. Nach 11 Minuten langem Ätzen wurden die Proben entnommen, mit Wasser gespült und visuell auf die Menge an verbleibendem Gold ausgewertet. Tabelle 1 fasst die Beobachtungen zusammen. Die HDT-Probe war die einzige Probe, bei der das meiste Gold auf der Oberfläche verblieb. Der thiolierte Antikörper hatte eine sehr geringe Menge an Gold (≈ 5% Abdeckung), während die anderen Proben nach dem Ätzen kein verbleibendes Gold aufwiesen. Dies demonstrierte, dass die zum Herstellen der optischen Beugungs-Biosensoren verwendeten thiolierten Bindemittel im Gegensatz zu HDT keine schützende SAM bilden. Tabelle 1 – Zusammenfassung der Cyanidätzungs-Experimente

Probe	Beobachtungen nach dem Ätzen
Hexadecanthiol (HDT)	70–80%
Thiolierter Antikörper	~5% (zufällige Flecken)
Antikörper (an die Oberfläche physisorbiert)	kein verbleibendes Gold
Thioliertes Protein G	kein verbleibendes Gold
Thioliertes Oligonucleotid	kein verbleibendes Gold

BEISPIEL 6
Proben mit gemustertem Antikörper gegen Candida albicans wurden folgendermaßen hergestellt: Gold/Polyester (Golddicke 10 nm) wurde durch Eintauchen in eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH 7,2) mit 5 mg/ml beta-Casein (Sigma Katalognr. C6905) 10 Minuten lang vorbehandelt. Die Probe wurde sorgfältig mit destilliertem Wasser gespült und unter einem starken Stickstoffstrom getrocknet. Das Kontaktdrucken wurde unter Verwendung eines Polydimethylsiloxanstempels mit einer x,y-Anordnung von Kreisen mit 10 Mikrometer Durchmesser durchgeführt. Der Stempel wurde mit einem thiolierten Antikörper gegen Candida albicans (bei dem ursprünglichen polyklonalen Antikörper handelte es sich um die Katalognr. 20-CR04 von Fitzgerald Industries international, Inc., Concord, MA) durch Eintauchen des Stempels in eine wässrige Lösung des Antikörperderivats von 0,5 mg/ml hergestellt. Nach 10 Minuten wurde der Stempel entnommen und unter Verwendung eines starken Stickstoffstroms sorgfältig getrocknet. Das Kontaktdrucken wurde auf die Casein-behandelte Probe durchgeführt, wobei Kontaktzeiten von 1 Sekunde bis 2 Minuten adäquat waren. Die bevorzugte Kontaktzeit betrug zwei Minuten. Nach dem Drucken wurde die Probe wieder mit destilliertem Wasser gespült und getrocknet.
Die Sensorprobe wurde Zellen von Candida albicans mit Keimfäden ausgesetzt, indem mit Klebestreifen abgezogene Unterarmhaut eines Erwachsenen mit einer Konzentration von 10⁶ Hefezellen pro Milliliter angeimpft wurde und der Sensor oben auf den Hefe enthaltenden Klebestreifen platziert wurde. Die Übertragung der Hefezellen auf den Sensor wurde nach nur wenigen Sekunden Kontakt erreicht (7). Eine gemusterte Adhäsion der Hefezellen an den Sensor wurde durch eine mikroskopische Analyse bestätigt und ergab nach Bestrahlung mit einem Laser ein Beugungsbild (8).
Bei anderen Oberflächen, die mit Zellen von Candida albicans mit Keimfäden angeimpft worden sind, handelte es sich um eine Agarplatte und um ein HUGGIES^®-Babywischtuch. Wenn man diese Oberflächen den auf Antikörper beruhenden Sensoren aussetzte, ergab dies auch eine gemusterte Anheftung der Zellen und Beugungsbilder.
Fachleute werden nun sehen, dass bestimmte Modifikationen der hierin offenbarten Erfindung in Bezug auf die veranschaulichten Ausführungsformen vorgenommen werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen. Und während die Erfindung vorstehend in Bezug auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist selbstverständlich, dass die Erfindung an zahlreiche Umgestaltungen, Modifikationen und Veränderungen angepasst ist, wobei sich alle derartigen Gestaltungen, Modifikationen und Veränderungen innerhalb des Umfangs der angefügten Ansprüche befinden sollen.

Claims

Biosensor, umfassend: einen mit Metall beschichteten Polymerfilm und eine auf den metallisierten Polymerfilm gedruckte gemusterte Rezeptorschicht, wobei sich auf der Rezeptorschicht ein aufnahmebereites Material befindet, das einen Analyten spezifisch bindet, wobei es sich bei der Rezeptorschicht nicht um eine selbstorganisierende Monoschicht handelt.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die gemusterte Rezeptorschicht derart in einem Muster gedruckt ist, dass der Biosensor, wenn der Biosensor den Analyten bindet, Durchlicht oder reflektiertes Licht beugt, so dass ein Beugungsmuster gebildet wird.
Biosensor nach Anspruch 2, wobei das Beugungsmuster sichtbar ist.
Biosensor nach Anspruch 3, wobei das Beugungsmuster für das Auge ohne Unterstützung sichtbar ist.
Biosensor nach Anspruch 2, wobei das Beugungsmuster ein Hologramm bildet.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem Metall um Gold, Silber, Chrom, Nickel, Platin, Aluminium, Eisen, Kupfer, Chromoxid oder Zirkonium handelt.
Biosensor nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Metall um Gold handelt.
Biosensor nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei die Metallbeschichtung eine Dicke zwischen ungefähr 1 Nanometer und 1000 Nanometer aufweist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei dem Polymerfilm um einen thermoplastischen Film handelt.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich bei dem Polymerfilm um Polyethylenterephthalat, Acrylnitril-Butadien-Styrol, Acrylnitril-Methylacrylat-Copolymer, Cellophan, cellulosehaltige Polymere wie zum Beispiel Ethylcellulose, Celluloseacetat, Celluloseacetatbutyrat, Cellulosepropionat, Cellulosetriacetat, Polyethylen, Polyethylen-Vinylacetat-Copolymere, Ionomere (Ethylenpolymere), Polyethylen-Nylon-Copolymere, Polypropylen, Methylpentenpolymere, Polyvinylfluorid und aromatische Polysulfone handelt.
Biosensor nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Polymerfilm um Polyethylenterephthalat handelt.
Biosensor nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei der thermoplastische Film optisch durchsichtig ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei der thermoplastische Film eine optische Transparenz von zwischen 5% und 95% aufweist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei der thermoplastische Film eine optische Transparenz von zwischen ungefähr 20% und 80% aufweist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die gemusterte Rezeptorschicht aus Verbindungen mit der folgenden allgemeinen Formel X-R-Y gebildet ist, wobei: X leicht mit dem Metall oder Metalloxid auf dem Polymerfilm reagiert; es sich bei R um einen optionalen Linker handelt und es sich bei Y um eine Verbindung mit einer beliebigen Eigenschaft von Interesse handelt.
Biosensor nach Anspruch 15, wobei R eine Länge von zwischen 0 und 12 Kohlenstoffatomen aufweist.
Biosensor nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, wobei R abwesend ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei X aus einer Verbindung erzeugt wird, welche die folgende Formel umfasst:
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei es sich bei dem Analyten um Bakterien, Hefe, einen Pilz, ein Virus, den Rheumafaktor, IgG-, IgM-, IgA- und IgE-Antikörper, das carcinoembryonale Antigen, ein Streptococcus Gruppe A-Antigen, virale Antigene, mit einer Autoimmunerkrankung zusammenhängende Antigene, Allergene, Tumorantigene, ein Streptococcus Gruppe B-Antigen, ein HIV-I- oder HIV-II-Antigen, Antikörper, Viren, für RSV spezifische Antigene, einen Antikörper, ein Antigen, ein Enzym, ein Hormon, ein Polysaccharid, ein Protein, ein Lipid, ein Kohlenhydrat, einen Arzneistoff oder eine Nucleinsäure, die Neisseria meningitides-Gruppen A, B, C, Y und W, Untergruppe 135, Streptococcus pneumoniae, E. coli K1, Haemophilus influenzae Typ B, ein von Mikroorganismen abgeleitetes Antigen, ein Hapten, ein Rauschgift, einen therapeutischen Arzneistoff, ein Umweltmittel oder für Hepatitis spezifische Antigene handelt.
Biosensor nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem Analyten um Bakterien, Hefe, einen Pilz oder ein Virus handelt.
Biosensor nach Anspruch 20, wobei es sich bei dem Pilz um eine Candida-Art handelt.
Biosensor nach Anspruch 20, wobei es sich bei dem Bakterium um eine Salmonelle-Art handelt.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei es sich bei dem Rezeptormaterial um Antigene, Antikörper, Nucleotide, Chelatbildner, Enzyme, Bakterien, Hefen, Pilze, Viren, Bakterienpili, Materialien aus bakteriellen Flagellen, Nucleinsäuren, Polysaccharide, Lipide, Proteine, Kohlenhydrate, Metalle, Hormone und Rezeptoren für diese Materialien handelt.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei das aufnahmebereite Material aus Toxinen, Antikörperfragmenten, Parasiten, Zellen, Haptenen, Metaboliten, Allergenen, Materialien aus dem Kern, Autoantikörpern, Blutproteinen, Zelltrüm mern, Gewebeproteinen, Enzymsubstraten, Coenzymen, Neurotransmittern, Viruspartikeln, Mikroorganismen und Arzneistoffen ausgewählt ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Rezeptorschicht ein thioliertes aufnahmebereites Material umfasst.
Biosensor nach Anspruch 25, wobei die Rezeptorschicht einen thiolierten Antikörper oder ein thioliertes Antikörperfragment, ein thioliertes Protein, eine thiolierte Nucleinsäure, einen thiolierten Zucker oder ein thioliertes Kohlenhydrat umfasst.
Behälter, wobei der Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 26 an der inneren Wand des Behälters befestigt ist.
Behälter nach Anspruch 27, wobei es sich bei dem Behälter um ein Fläschchen handelt.
Behälter nach Anspruch 27, wobei es sich bei dem Behälter um einen Lebensmittelbehälter handelt.
Kleidungsstück, wobei der Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 26 an der inneren Wand des Kleidungsstückes befestigt ist.
Kleidungsstück nach Anspruch 30, wobei es sich bei dem Kleidungsstück um eine Windel handelt.
Verfahren zum Nachweisen eines Analyten, umfassend: In-Kontakt-Bringen des Analyten mit einem wie in einem der Ansprüche 1 bis 26 definierten Biosensor, Durchleiten von Licht durch den Biosensor mit dem an die gemusterte Rezeptorschicht gebundenen Analyten, wodurch ein Beugungsmuster gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Licht von dem Biosensor reflektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, wobei das Beugungsmuster sichtbar ist.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Beugungsmuster für das Auge ohne Unterstützung sichtbar ist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Beugungsmuster ein Hologramm bildet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 36, wobei es sich bei dem Analyten um Bakterien, Hefe, einen Pilz, ein Virus, den Rheumafaktor, IgG-, IgM-, IgA- und IgE-Antikörper, das carcinoembryonale Antigen, ein Streptococcus Gruppe A-Antigen, virale Antigene, mit einer Autoimmunerkrankung zusammenhängende Antigene, Allergene, Tumorantigene, ein Streptococcus Gruppe B-Antigen, ein HIV-I- oder HIV-II-Antigen, Antikörper, Viren, für RSV spezifische Antigene, einen Antikörper, ein Antigen, ein Enzym, ein Hormon, ein Polysaccharid, ein Protein, ein Lipid, ein Kohlenhydrat, einen Arzneistoff oder eine Nucleinsäure, die Neisseria meningitides-Gruppen A, B, C, Y und W, Untergruppe 135, Streptococcus pneumoniae, E. coli K1, Haemophilus influenzae Typ B, ein von Mikroorganismen abgeleitetes Antigen, ein Hapten, ein Rauschgift, einen therapeutischen Arzneistoff, ein Umweltmittel oder für Hepatitis spezifische Antigene handelt.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei es sich bei dem Analyten um Bakterien, Hefe, einen Pilz oder ein Virus handelt.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Pilz um eine Candida-Art handelt.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei es sich bei dem Bakterium um eine Salmonella-Art handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 40, wobei der Biosensor an der inneren Wand eines Behälters befestigt ist.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei es sich bei dem Behälter um ein Fläschchen handelt.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei es sich bei dem Behälter um einen Lebensmittelbehälter handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 40, wobei der Biosensor an der inneren Wand eines Kleidungsstückes befestigt ist.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei es sich bei dem Kleidungsstück um eine Windel handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 45, wobei der Analyt an einem Teilchen befestigt ist.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei das Teilchen aus Glas, Cellulose, Latex, Polystyrol, Polycarbonat, Protein oder mikrobiellen Zellen besteht.
Verfahren nach Anspruch 46 oder 47, wobei das Teilchen zwischen ungefähr 0,2 nm und 50 nm groß ist.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Teilchen zwischen ungefähr 0,4 μm und 1 μm groß ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 46 bis 49, wobei die Teilchengröße durch die folgende Formel bestimmt wird: topf = λ/2(n2 – n1)wobei t_opf = die optimale Höhe des Teilchens λ = die Wellenlänge des einfallenden Lichts n₂ = der Brechungsindex des Teilchens n₁ = der Brechungsindex des umgebenden Mediums.
Verfahren zum Herstellen eines wie in Anspruch 1 definierten Biosensors, wobei das Verfahren das Auftragen einer Rezeptorschicht, bei der es sich nicht um eine selbstorganisierende Monoschicht handelt, auf einen mit Metall beschichteten Polymerfilm in einem Muster umfasst, so dass die gemusterte Rezeptorschicht, nachdem ein Analyt an die gemusterte Rezeptorschicht bindet, fähig ist, Durchlicht oder reflektiertes Licht zu beugen, so dass ein Beugungsbild gebildet wird.
Verfahren zum Nachweisen eines Analyten, umfassend: a. In-Kontakt-Bringen des Analyten mit einem wie in einem der Ansprüche 1 bis 26 definierten Biosensor, wobei das aufnahmebereite Material den Analyten spezifisch bindet, so dass ein Konjugat aus Analyt/erstem aufnahmebereitem Material gebildet wird; b. In-Kontakt-Bringen des Biosensors mit dem Konjugat aus Analyt/erstem aufnahmebereitem Material mit einem zweiten Rezeptormaterial, welches das Konjugat aus Analyt/erstem aufnahmebereitem Material spezifisch bindet, wobei das zweite Rezeptormaterial mit einem Präzipitat bildenden Material konjugiert ist; c. In-Kontakt-Bringen des Biosensors von Schritt b mit einem Reagenz, dass die Bildung eines Präzipitats verursacht; d. Durchleiten von Licht durch den Biosensor mit dem an die gemusterte Rezeptorschicht gebundenen Analyten, wodurch ein Beugungsmuster gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 52, wobei es sich bei dem Präzipitat bildenden Material um ein Peroxidaseenzym oder kolloidales Gold handelt.
Verfahren nach Anspruch 52 oder 53, wobei es sich bei dem Reagenz um Tetramethylbenzidin oder ein Silberhalogenid handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 52 bis 54, wobei das zweite Rezeptormaterial für das erste Rezeptormaterial spezifisch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 52 bis 55, wobei es sich bei dem ersten Rezeptormaterial um einen mit einem Enzym konjugierten Antikörper handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 52 bis 56, wobei es sich bei dem zweiten Rezeptormaterial um einen Antikörper handelt.