DE69837913T2 - Verfahren zur vervielfältigung von nukleinsäure - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich unter anderem auf die Amplifikation von Nukleinsäuren.
  • Die Molekularbiologie und die pharmazeutische Wirkstoffentwicklung verwenden nun intensiv die Nukleinsäureanalyse (Friedrich, G.A. Moving beyond the genome projects, Nature Biotechnology 14, 1234 (1996)). Die herausfordernsten Bereiche sind die Sequenzierung ganzer Genome, die Detektion von einzelnen Nukleotidpolymorphismen, das Screening und die Genexpressionsüberwachung. Derzeit werden bis zu Hunderttausenden an Proben in einzelnen DNA-Sequenzierungsprojekten bearbeitet (Venter, J.C., H.O Smith, L. Hood, A new strategy for genome sequencing, Nature 381, 364 (1996)). Diese Kapazität wird durch die verfügbare Technologie beschränkt. Projekte, wie das „human genome project" (Genkartierung und DNA-Sequenzierung) und die Identifikation aller Polymorphismen in den exprimierten Genen, die mit häufigen Krankheiten in Verbindung gebracht werden, setzen die Sequenzierung von Millionen an DNA-Proben voraus.
  • Mit den meisten der derzeitigen DNA-Sequenzierungstechniken ist es einfach nicht möglich, die Zeit unbegrenzt zu verringern, die für die Verarbeitung einer einzelnen Probe benötigt wird. Eine Möglichkeit, um den Durchsatz zu erhöhen, ist es, viele Prozesse parallel durchzuführen. Die Einführung von robotischer Probenaufbereitung und -zuführung, 96- und 384-Wellplatten, Hochdichte-Rastermaschinen (Maier, E., S. Meierewer, A.R. Ahmadi, J. Curtis, H. Lehrach, Application of robotic technology to automated sequence fingerprint analysis by oligonucleotide hybridization, Journal Of Biotechnology 35,191 (1994)) und kürzlich die Entwicklung von Hochdichte-Oligonukleotidarrays (Chee, M., R. Yang, E. Hubbell, A. Berno, X.C. Huang, D. Stern, J. Winkler, D.J. Lockhart, M.S. Morris, und S.P.A. Fodor, Accessing genetic information with high-density DNA arrays, Science 274(5287):610–614, (1996)) beginnen, Antworten auf die Anforderungen für immer höheren Durchsatz zu geben. Solche Technologien erlauben es, bis zu 50.000–100.000 Proben gleichzeitig innerhalb von Tagen und sogar Stunden zu verarbeiten (Maier, E., Robotic technology in library screening, Laborstory Robotics and Automation 7, 123 (1995)).
  • Bei den meisten bekannten Verfahren zur Durchführung einer Nukleinsäureanalyse ist es nötig, zunächst die interessierenden Nukleinsäuren aus einem Organismus zu extrahieren (z.B. genomische oder mitochondriale DNA oder Messenger-RNA (mRNA)). Danach ist es nötig, die interessierenden Nukleinsäuren aus der Mischung aller Nukleinsäuren zu isolieren und, normalerweise, diese Nukleinsäuren zu amplifizieren, um Mengen zu erhalten, die für deren Charakterisierung und/oder Detektion geeignet sind. Die Isolation der Nukleinsäurefragmente wurde sogar dann für notwendig befunden, wenn man an einem repräsentativen, jedoch zufälligen Satz an all den unterschiedlichen Nukleinsäuren interessiert ist, zum Beispiel ein Satz aller mRNAs, die in einer Zelle vorhanden sind, oder aller Fragmente, die erhalten werden, nachdem die genomische DNA zufällig in kleine Stücke zerschnitten wurde.
  • Verschiedene Verfahren können verwendet werden, um DNA mit biologischen Mitteln zu amplifizieren, und diese sind dem Fachmann wohlbekannt. Im Allgemeinen werden die DNA-Fragmente zunächst unter Verwendung von Restriktionsenzymen und DNA-Ligasen in Vektoren eingebracht. Ein Vektor, der ein interessierendes Fragment enthält, kann dann in einen biologischen Wirt eingeführt und mittels gut etablierter Protokolle amplifiziert werden. Gewöhnlich sind die Wirte zufällig über ein Wachstumsmedium verteilt (z.B. Agarplatten). Sie können sich dann replizieren, um Kolonien bereitzustellen, die von individuellen Wirtszellen abstammen.
  • Bis zu Millionen von gleichzeitigen Amplifikationen klonierter DNA-Fragmente können in solchen Wirten simultan durchgeführt werden. Die Dichte der Kolonien liegt in der Größenordnung von 1 Kolonie/mm2. Eine Möglichkeit, um DNA aus solchen Kolonien zu erhalten ist es, die Kolonien auf eine Membran zu transferieren und dann die DNA aus den biologischen Wirten direkt auf der Membran zu immobilisieren (Grunstein, M. und D.S. Hogness, Colony Hybridization: A method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene, Proceedings of the National Academy of Science, USA, 72:3961 (1975)). Bei diesen Möglichkeiten ist jedoch die Menge an transferierter DNA begrenzt und häufig ungenügend für die nicht-radioaktive Detektion.
  • Eine andere Möglichkeit ist es, jede Kolonie mittels Steriltechnik in einem Behälter (z.B. 96-Wellplatten) zu transferieren, in dem eine weitere Wirtszellenvermehrung stattfinden kann, so dass mehr DNA aus den Kolonien erhalten werden kann. Amplifizierte Nukleinsäuren können mit einem geeigneten Aufreinigungsprozess aus den Wirtszellen erhalten werden. Jedoch ist eine solche Prozedur im Allgemeinen zeit- und arbeitsaufwendig und schwer zu automatisieren.
  • Die revolutionäre Technik zur DNA-Amplifikation unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde 1985 von Mullis et al. vorgeschlagen (Saiki, R., S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlich und N. Arnheim, Science 230, 1350–1354 (1985)) und ist nun dem Fachmann wohlbekannt. Bei diesem Amplifikationsprozess kann ein DNA-Fragment von Interesse unter Verwendung von zwei kurzen (typischerweise ungefähr 20 Basen langen) Oligonukleotiden, die eine zu amplifizierende Region flankieren und die gewöhnlich als „Primer" bezeichnet werden, amplifiziert werden. Die Amplifikation tritt während des PCR-Zyklierens auf, das einen Schritt beinhaltet, während dessen doppelsträngige DNA-Moleküle denaturiert werden (typischerweise wird eine Reaktionsmischung erhitzt, z.B. auf 95°C, um die doppelsträngigen DNA-Moleküle in zwei einzelsträngige Fragmente zu trennen), einen Annealingschritt (in dem die Reaktion auf z.B. 45°C gebracht wird, um es den Primern zu erlauben, sich an die einzelsträngigen Matrizen anzulagern) und einen Verlängerungsschritt (DNA, die komplementär ist zu dem einzelsträngigen Fragment, wird über den sequentiellen Nukleotideinbau an den Enden der Primer mittels des DNA-Polymeraseenzyms synthetisiert).
  • Die obige Prozedur wird gewöhnlich in Lösung durchgeführt, wobei weder die Primer noch ein Template an irgendeine feste Matrix gebunden sind.
  • Vor kurzem wurde jedoch vorgeschlagen, einen Primer, der in eine Oberfläche eingebaut ist, zusammen mit freien, in Lösung befindlichen Primer zu verwenden, um simultan ein PCR-Produkt auf der Oberfläche zu amplifizieren und einzubauen (Oroskar, A.A., S.E. Rasmussen, H.N. Rasmussen, S.R., Rasmussen, B.M. Sullivan, und A. Johansson, Detection of immobilised amplicons by ELISA-like techniques, Clinical Chemistry 42:1547 (1996)). (Der Begriff „einbauen" wird hierin verwendet um anzuzeigen, dass ein Teil an eine Oberfläche angelagert wird und dort verbleibt, wenn nicht und bis es gewünscht wird, es zu entfernen). Die Amplifikation wird gewöhnlich so in Behältern (z.B. in 96-Wellformatplatten) durchgeführt, dass jeder Behälter das/die PCR-Produkt(e) einer Reaktion enthält. Bei solchen Verfahren werden einige der PCR-Produkte in eine Oberfläche des Behälters mit darin befindlichen Primern eingebaut, der während des PCR-Zyklierens in Kontakt mit dem Reaktionspartner gekommen ist. Der Einbau in die Oberfläche erleichtert anschließende Assays und erlaubt eine effiziente Automatisierung.
  • Die Array-Anordnung von DNA-Proben wird klassischer auf Membranen (z.B. Nylon- oder Nitrozellulosemembranen) durchgeführt. Bei Verwendung geeigneter Roboter (z.B. Q-botTM Genetix Itd, Dorset BH23 3TG UK) ist es möglich, eine Dichte von bis zu 10 Proben/mm2 zu erreichen. Hierbei wird die DNA kovalent durch physikalische Mittel an die Membran gebunden (z.B. UV-Bestrahlung). Diese Technologien erlauben die Array-Anordnung von großen DNA-Molekülen (z.B. Moleküle, die über 100 Nukleotide lang sind), sowie kleineren DNA-Molekülen. Daher können sowohl Matrizen als auch Sonden in Array-Anordnung gebracht werden.
  • Neue Ansätze, die auf zuvor in Array-Anordnung gebrachte Glasträger (Arrays reaktiver Bereiche, die durch Tintenstrahltechnologie erhalten wurden (Blanchard, A.P. und L. Hood, Oligonucleotide array synthesis using ink jets, Microbial and Comparative Genomics, 1:225 (1996)), oder auf Arrays reaktiver Polyacrylamidgele basieren (Yershov, G. et al., DNA analysis and diagnostics an oligonucleotide microchips, Proceedings of the National Academy of Science, USA, 93:4913–4918 (1996)), erlauben die Array-Anordnung von bis zu 100 Proben/mm2. Bei diesen Technologien wurde lediglich über den Einbau von Sonde (Oligonukleotid) berichtet. Die berichtete Anzahl der Proben/mm2 ist immer noch ziemlich niedrig (25 bis 64).
  • Höhere Probendichten können durch die Verwendung von DNA-Chips erzielt werden, die Arrays von Oligonukleotiden sein können, welche kovalent an eine Oberfläche gebunden sind und die durch Verwendung der mikrolithographischen Techniken erhalten werden können (Fodor, S.P.A. et al., Light directed, spatially addressable parallel chemical synthesis, Science 251:767(1991)). Gegenwärtig werden Chips mit 625 Sonden/mm2 in molekularbiologischen Anwendungen verwendet (Lockhart, D.J. et al., Expression monitoring by hybridisation to highdensity oligonucleotide arrays, Nature Biotechnology 14:1675 (1996)). Es wird behauptet, bis zu 250.000 Proben/cm2 erreichen zu können (Chee, M. et al., Accessing genetic information with high-density DNA arrays, Science 274:610 (1996)). Gegenwärtig können bis zu 132000 verschiedene Oligonukleotide auf einem einzelnen Chip von ungefähr 2,5 cm2 in Array-Anordnung gebracht werden. Derzeit werden diese Chips mittels direkter Festphasen-Oligonukleotidsynthese hergestellt, wobei das 3'-OH Ende des Oligos an die Oberfläche angebracht wird. Somit wurden diese Chips verwendet, um Oligonokleotid-Sonden bereitzustellen, die nicht als Primer in einem DNA-Polymerase-vermittelten Verlängerungsschritt fungieren können.
  • Wenn PCR-Produkte mit dem Gefäß verbunden werden, in welchem die PCR-Amplifikation stattfindet, kann dies als ein direkter Array-Anordnungsprozess betrachtet werden. Die Dichte des resultierenden Arrays von PCR-Produkten wird dann durch das verfügbare Gefäß begrenzt. Gegenwärtig verfügbare Gefäße sind lediglich im 96-Well Mikrotiterplattenformat. Diese erlauben, dass nur ungefähr ~0,02 Proben des PCR-Produkts/mm2 der Oberfläche erhalten werden können.
  • Unter Verwendung des kommerziell erhältlichen NucleolinkTM-Systems, das von Nunc A/S (Roskilde, Dänemark) erhältlich ist, ist es möglich, die simultane Amplifikation und Array-Anordnung von Proben in Behältern zu erzielen, auf deren Oberfläche Oligonukleotidprimer eingebaut wurden. Jedoch wird in diesem Fall die Dichte des Arrays der Proben durch die Größe des Behälters festgesetzt. Derzeit ist beim 96-Well-Plattenformat eine Dichte von 0,02 Proben/mm2 erreichbar. Es ist schwierig, diese Dichte zu erhöhen. Dies liegt auf der Hand, da, zum Beispiel, die Verfügbarkeit von 384-Well-Platten (0,08 Proben/mm2), die für die PCR geeignet sind, wegen technischer Probleme verzögert wurde (z.B. Wärmetransfer und Kapillareffekte während der Befüllung). Daher ist es unwahrscheinlich, dass Verbesserungen in der Dichte von Proben im Bereich von Größenordnungen, die mittels dieser Technik in Array-Anordnung gebracht wurden, in der absehbaren Zukunft erreicht werden können.
  • WO9604404 bietet Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung von Nukleinsäurehybridisierungs- und Aplifikationsprozessen auf einem Träger. Solche Verfahren und solch eine Vorrichtung sind nützlich bei der Synthese von Nukleinsäuren und bei der Detektion von Ziel-Nukleinsäuren für Diagnostik und Therapeutik.
  • Yershov und Mitarbeiter haben eine weitere Weiterentwicklung in der Sequenzierungstechnik durch Hybridisierung an Oligonukleotid-Mikrochips (SHOM) und deren Anwendung für die Diagnostik von genetischen Erkrankungen vorgestellt (Yershov, G et al., 1996, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 93(19):4913–8). Die Autoren entwickelten einen Roboter, um Sequenzierungs-„Mikrochips” zu fertigen. Der Mikrochip ist ein Array von in Gelelementen immobilisierten Oligonukleotiden, die auf einer Glassplatte fixiert sind. Hybridisierung des Mikrochips mit fluoreszenzmarkierter DNA wurde in Echtzeit gleichzeitig für alle Mikrochipelemente mit einem Zwei-Wellenlängen-Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Ladungstransportspeicherkamera ausgestattet war, überwacht. SHOM wurde verwendet, um mittels Hybridisierung von PCR-amplifizierter DNA an die Mikrochips Betathalassämiemutationen bei Patienten zu detektieren. Eine zusammenhängende Aufschichtungs-Hybridisierungstechnik wurde für die Detektion der Mutationen verwendet; diese kann die medizinische Diagnostik erleichtern und deren Verlässlichkeit verbessern. Die Verwendung von Mehrfarbenüberwachung der zusammenhängenden Aufschichtungs-Hybridisierung wird von den Autoren für großangelegte Diagnostik und Gen-Polymorphismus-Studien vorgeschlagen. Andere Anwendungen der SHOM Technologie werden ebenfalls von den Autoren diskutiert.
  • WO9106678 bezieht sich auf ein Instrument und eine Vorrichtung, um die Nukleotidsequenz eines DNA-Moleküls ohne die Verwendung eines Gelelektrophoreseschritts zu bestimmen. Das Verfahren setzt eine unbekannte, geprimte einzelsträngige DNA-Sequenz ein, die innerhalb einer Kammer mit einer Polymerase immobilisiert oder gefangen ist, so dass die sequentiell gebildete cDNA bei jeder Zugabe eines blockierten Nukleotids über die Messung des Vorhandenseins eines harmlosen Markers auf vorgegebenen Desoxyribonukleotiden überwacht werden kann. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Bestimmung der unbekannten DNA-Nukleotidsequenz unter Verwendung von Desoxynukleotiden. Das blockierte dNTP weist einen ungefährlichen Marker auf, so dass seine Identität einfach bestimmt werden kann. Das Instrument und das Verfahren stellen eine schnelle und akkurate Bestimmung einer DNA-Nukleotidsequenz ohne die Verwendung der Gelelektrophorese bereit.
  • Fu und Mitarbeiter beschreiben, dass Duplex-Sonden mit einzelsträngigen Überhängen von fünf Basen dsDNA-Ziele aus Typ-IIS-Restriktionsnukleasen-Verdaus einfangen können (Fu, DJ et al., 1997, Nucleic Acids Research 125(3):677–679). Die Ligation erzeugt eine zuvor entworfene Nick-Stelle, an der die DNA-Polymerase in der Gegenwart von Spuren von Didesoxynukleotiden durch Strangverdrängung oder Nick-Translation Sequenzierungsleitern erzeugen kann. Dies erlaubt es, die dsDNA-Ziele aus Mischungen einzufangen und direkt und ohne Subklonierung, Aufreinigung oder Denaturierung zu sequenzieren.
  • Lockhart und Kollegen haben einen Ansatz entwickelt, der auf Hybridisierung an kleine, hochdichte Arrays basiert, die Zehntausende synthetischer Oligonukleotide enthalten. Die Arrays werden lediglich basierend auf Sequenzinformationen entworfen und in situ unter Verwendung einer Kombination von Photolithographie und Oligonukleotidchemie synthetisiert (Lockhart, DJ et al., 1996, Nature Biotechnology 18(13):1675–80). RNAs, die mit einer Häufigkeit von 1:300.000 vorhanden sind, werden eindeutig detektiert und die Detektion erwies sich als quantitativ über mehr als drei Größenordnungen. Die Autoren erwägen, dass dieser Ansatz eine Möglichkeit darstellt, die wachsende Masse an Sequenzinformation direkt für hochparallele experimentelle Untersuchungen zu verwenden. Wegen der kombinatorischen Natur der Chemie und der Fähigkeit, kleine Arrays, die Hunderttausende an spezifisch ausgewählten Oligonukleotiden enthalten, zu synthetisieren, erwägen die Autoren, dass das Verfahren leicht auf die simultane Überwachung von Zehntausenden Genen skalierbar ist.
  • Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, einige der Nachteile der Nukleinsäureamplifikationsverfahren des Standes der Technik zu überkommen oder wenigstens zu verringern.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren bereitgestellt, umfassend die Schritte:
    • A. Bereitstellen einer Vielzahl von immobilisierten Primern, bei denen jedoch ein Ende exponiert ist, um eine Primer-Verlängerung zu ermöglichen;
    • B. Ermöglichen, dass sich ein einzelsträngiges Ziel-Nukleinsäuremolekül an einen der Vielzahl von Primern über einen Teil der Gesamtlänge des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls anlagert und anschließende Verlängerung des Primers unter Verwendung des angelagerten einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls als Matrize, so dass ein verlängerter immobilisierter Nukleinsäure-Strang bereitgestellt wird;
    • C. Auftrennen des Ziel-Nukleinsäuremoleküls von dem verlängerten immobilisierten Nukleinsäurestrang;
    • D. Ermöglichen, dass der verlängerte immobilisierte Nukleinsäurestrang sich an einen der in Schritt A) erwähnten Vielzahl von Primern anlagert und anschließende Verlängerung des Primers unter Verwendung des verlängerten immobilisierten Nukleinsäurestranges als Matrize, so dass ein weiterer verlängerter immobilisierter Nukleinsäure-Strang bereitgestellt wird und gegebenenfalls,
    • E. Auftrennen der angelagerten verlängerten immobilisierten Nukleinsäurestränge voneinander, wobei die einzelsträngige Ziel-Nukleinsäure hergestellt wird, indem eine gegebene, zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz bereitgestellt wird (deren Sequenz bekannt oder unbekannt sein kann) und an dieser eine erste Nukleinsäuresequenz und eine zweite Nukleinsäuresequenz angeknüpft wird; wobei die erste Nukleinsäuresequenz an einen der Vielzahl von Primern hybridisiert und die zweite Nukleinsäuresequenz komplementär zu einer Sequenz ist, die an einen der Vielzahl von Primern hybridisiert. Vorzugsweise umfasst das Verfahren ebenfalls den Schritt:
    • F. Verwendung von wenigstens einem verlängerten immobilisierten Nukleinsäurestrang zur Wiederholung der Schritte D) und E), so dass weitere verlängerte immobilisierte Nukleinsäurestränge bereitgestellt werden, und gegebenenfalls,
    • G. Ein- oder mehrmaliges Wiederholen von Schritt F).
  • Die zweite Nukleinsäuresequenz kann eine Sequenz sein, die die gleiche ist wie die Sequenz eines der Vielzahl von Primern. Daher kann die einzelsträngige Ziel-Nukleinsäuresequenz mittels eines Verfahrens bereitgestellt werden, in dem besagte einzelsträngige Ziel-Nukleinsäure durch Bereitstellen einer gegebenen Nukleinsäuresequenz hergestellt wird, die amplifiziert werden soll (deren Sequenz bekannt oder unbekannt sein kann) und durch Zugabe einer ersten und einer zweiten Nukleinsäuresequenz dazu; wobei besagte erste Nukleinsäuresequenz an einen besagter Vielzahl von Primern hybridisiert und besagte zweite Nukleinsäuresequenz dieselbe ist wie die Sequenz eines besagter Vielzahl von Primern.
  • Die erste und zweite Nukleinsäuresequenz können an den ersten und zweiten Enden der einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure bereitgestellt werden, obwohl dies nicht essentiell ist.
  • Falls gewünscht, kann ein Tag bereitgestellt werden, um die Identifikation der Amplifikationsprodukte einer gegebenen Nukleinsäuresequenz zu ermöglichen.
  • Kolonien
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt es, eine oder mehrere eindeutige Bereiche zur Verfügung zu stellen, wobei jeder eindeutige Bereich eine Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuresträngen umfasst (hierin im Folgenden „Kolonien" genannt). Diese Bereiche können eine große Anzahl an amplifizierten Nukleinsäuremolekülen enthalten. Diese Moleküle können DNA- und/oder RNA-Moleküle sein und können in einzel- oder doppelsträngiger Form bereitgestellt werden. Sowohl ein gegebener Strang als auch sein komplementärer Strang können in amplifizierter Form in einer einzelnen Kolonie bereitgestellt werden.
  • Kolonien jeglicher bestimmter Größe können bereitgestellt werden.
  • Bevorzugte Kolonien sind jedoch über ihre größte Abmessung von 10nm bis zu 100μm groß, bevorzugter von 100nm bis 10μm über ihre größte Abmessung. Wünschenswerterweise hat die Mehrzahl der Kolonien (d.h. wenigstens 50% davon), die auf einer Oberfläche vorhanden sind, Abmessungen in den oben angegebenen Bereichen.
  • Kolonien können auf eine zuvor bestimmte Art und Weise oder zufällig angeordnet werden. Zwei- oder dreidimensionale Koloniekonfigurationen sind möglich. Die Konfiguration kann regelmäßig (z.B. eine polygonale oder eine im Allgemeinen kreisförmige Kontur habend) oder unregelmäßig sein.
  • Die Kolonien können mit hohen Dichten bereitgestellt werden. Dichten von mehr als einer Kolonie/mm2 Oberfläche können erreicht werden. Tatsächlich sind Dichten von mehr als 102, mehr als 103 oder sogar mehr als 104 Kolonien/mm2 unter Verwendung der vorliegenden Erfindung erreichbar. In bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Koloniedichten von 104-5 Kolonien/mm2, bevorzugter Dichten von 106-7 Kolonien/mm2 zur Verfügung und bietet damit eine Verbesserung von 3 bis 4 Größenordnungen relativ zu den Dichten, die unter Verwendung vieler der Verfahren des Stands der Technik erreichbar sind. Es ist diese Eigenschaft der Erfindung, die einen großen Vorteil über den Stand der Technik zulässt, da die hohe Dichte der DNA-Kolonien eine große Anzahl von verschiedenen DNA-Matrizen (bis zu 106-7 Kolonien/mm2) zulässt, die zufällig angeordnet und amplifiziert werden können.
  • Primer
  • Die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung immobilisierten Primer können mittels jeglicher geeigneter Mittel bereitgestellt werden, solange ein freies 3'-OH Ende für die Primerverlängerung verfügbar ist. Wenn viele verschiedene Nukleinsäuremoleküle amplifiziert werden sollen, können verschiedene Primer bereitgestellt werden. Alternativ können „universelle" Primer verwendet werden, wobei lediglich ein oder zwei verschiedene Arten von Primern (abhängig von der Ausführungsform der Erfindung) verwendet werden können, um die verschiedenen Nukleinsäuremoleküle zu amplifizieren. Universelle Primer können verwendet werden, wo die zu amplifizierenden Moleküle, wie zuvor beschrieben, eine erste und eine zweite Sequenz umfassen. Die Bereitstellung von universellen Primern ist gegenüber Verfahren, wie sie in WO96/04404 (Mosaic Technologies, Inc.) beschrieben werden, vorteilhaft, in denen spezifische Primer für jede bestimmte Sequenz, die amplifiziert werden soll, hergestellt werden müssen.
  • Synthetische OligoDesoxynukleotid-Primer sind kommerziell von vielen Anbietern verfügbar (z.B. Microsynth, Schweiz, Eurogentech, Belgien).
  • Der Einbau von Primern in silanisiertes Glas oder Quarz und der Einbau von Primern in Silizium-Wafer oder Goldoberflächen wurde beschrieben (Maskos, U. und E.M Southern, Oligonucleotide hybridizations an glass supports: a novel linker for oligonucleotide synthesis and hybridization properties of oligonucleotides synthesised in situ, Nucleic Acids Research 20(7):1679–84, 1992; Lamture, J.B., et al. Direct-detection of nucleic-acid hybridization an the surface of a charge-coupled-device, Nucleic Acids Research 22(11):2121–2125, 1994; Chrisey, L.A., G.U. Lee, und C.E. Oferrall, Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayer films, Nucleic Acids Research 24(15):3031–3039, 1996).
  • Der Einbau von biotinylierten Primern in Träger, die mit Streptavidin beschichtet sind, ist eine weitere Alternative. Dieses Einbauverfahren wird im Allgemeinen geläufig für Bio-Makromoleküle verwendet.
  • Der nicht-kovalente Einbau von Primern in die Grenzphase zwischen einer wässrigen Phase und einer hydrophoben Phase mittels eines hydrophoben Ankers ist ebenfalls für die vorliegende Erfindung möglich. Solch eine Verankerung wird im Allgemeinen geläufig für Bio-Makromoleküle verwendet (S. Terrettaz et al.: Protein binding to supported lipid membranes, Langmuir 9,1361 (1993)). Bevorzugte Formen solcher Grenzphasen wären Liposomen, Lipidvesikel, Emulsionen, gestaltete Bilayer, Langmuir- oder Langmuir-Blodgett-Filme. Die Gestaltungen können mittels direkter Gestaltung auf Matrizen, z.B. Siliziumchips, die mittels mikrolithographischer Verfahren gestaltet wurden (Goves, J.T. et al., Micropatterning Fluid Bilayers an Solid Supports, in Science 275,651 (1997)) erhalten werden. Die Gestaltungen können ebenfalls durch die Selbst-Zusammensetzungs-Eigenschaften von „Kolloiden", z.B. Emulsionen oder Latexpartikel erhalten werden (Larsen, A.E. und D.G. Grier, Like charge attractions in metastable colloidal crystallites, Nature 385,230 (1997)).
  • Mit den obigen Verfahren können ein, zwei oder mehrere verschiedene Primer in eine Oberfläche eingebaut werden. Die Primer können homogen und simultan über die Oberfläche eingebaut werden.
  • Unter Verwendung von mikrolithographischen Verfahren ist es möglich, die immobilisierten Primer auf eine kontrollierte Weise bereit zu stellen. Wenn die gerichtete Synthese von Oligonukleotiden mit einem freien 3'-OH Ende auf einen festen Träger gewünscht ist, können mikrolithographische Verfahren verwendet werden, um simultan viele verschiedene Oligonukleotidprimer zu synthetisieren (Pirrung, M.C. und Bradley, J.C. Comparison of methods for photochemical phosphoramidite-based DNA- synthesis. Journal Of Organic Chemistry 60(20):6270–6276, 1995). Diese können in bestimmten Bereichen bereitgestellt werden, die hinsichtlich ihrer Konfiguration mit den zu bildenden Kolonien korrespondieren (z.B. können sie einige Nanometer oder Mikrometer im Durchmesser sein). Innerhalb jeden Bereichs braucht lediglich ein einzelner Typ von Primer-Oligonukleotid bereitgestellt werden. Alternativ kann eine Mischung, die eine Vielzahl von unterschiedlichen Primern umfasst, bereitgestellt werden. In jedem Fall können die Primer homogen innerhalb jedes Bereichs verteilt werden. Sie können in der Form eines gleichmäßigen Arrays bereitgestellt werden.
  • Wenn Bereiche anfänglich lediglich einen Typ von immobilisierten Primern umfassen, können sie, falls gewünscht, modifiziert werden, zwei oder mehrere verschiedene Typen von Primern zu tragen. Eine Möglichkeit, dieses zu erreichen, ist es, Moleküle, die 3'-Enden haben, die mit einem einzelnen Typ von Primer hybridisieren, der anfänglich vorhanden ist, und die 5'-Enden haben, die über die 3'-Enden besagter Primer hinaus reichen, als Matrizen für die Primerverlängerung zu verwenden. Durch das Bereitstellen einer Mischung von Matrizen, die unterschiedliche Sequenzen zueinander haben, wird eine Primerverlängerung von einem Typ von Primer unter Verwendung der Mischung solcher Matrizen, gefolgt von Strangtrennung, in verschiedenen unterschiedlich modifizierten Primern resultieren. (Die modifizierten Primer werden hierin als „verlängerte" Primer bezeichnet, um sie von den „primären" Primern zu unterscheiden, die ursprünglich auf einer Oberfläche vorhanden waren).
  • Ein, zwei oder mehrere Typen von verlängerten Primern können auf diese Weise in jeglichem Bereich bereitgestellt werden, in dem ursprünglich primäre Primer lokalisiert sind. Wenn gewünscht, können im Wesentlichen gleiche Mengen von verschiedenen Matrizen verwendet werden, um im Wesentlichen gleiche Proportionen von verschiedenen Typen von immobilisierten, verlängerten Primern über einen gegebenen Bereich bereitzustellen. Falls verschiedene Proportionen an verschiedenen immobilisierten, verlängerten Primern gewünscht werden, kann dies dementsprechend durch Anpassung der Proportionen der verschiedenen Matrizenmoleküle, die anfänglich verwendet werden, erreicht werden.
  • Eine Restriktionsendonuklease-Spaltungsstelle kann innerhalb des Primers lokalisiert sein. Ein Primer kann ebenfalls mit einer Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle bereitgestellt werden, die eine DNA-Spaltung einige Basen entfernt regelt (Typ II Restriktionsendonukleasen). (Zur Vermeidung von Zweifeln werden solche Stellen als vorhanden erachtet, sogar wenn der Primer und sein Komplement in einem doppelsträngigen Molekül vorhanden sein müssen, damit die Erkennung und/oder Spaltung auftritt). Alternativ kann eine Spaltungs- und/oder Erkennungsstelle erzeugt werden, wenn ein Primer verlängert wird. In jedem Fall können Restriktionsendonukleasen dazu nützlich sein, es zu erlauben, dass ein immobilisiertes Nukleinsäuremolekül innerhalb einer Kolonie gespalten wird, um wenigstens einen Teil davon freizusetzen. Als eine Alternative zur Verwendung von anderen Restriktionsendonukleasen können Ribozyme verwendet werden, um wenigstens Teile der Nukleinsäuremoleküle aus einer Oberfläche freizusetzen (wenn solche Moleküle RNA-Moleküle sind). Andere Verfahren sind möglich. Zum Beispiel kann, wenn eine kovalente Bindung verwendet wird, um einen Primer mit einer Oberfläche zu verbinden, diese Bindung gebrochen werden (z.B. durch chemische, physikalische oder enzymatische Mittel).
  • Primer für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise wenigstens fünf Basen lang. Normalerweise sind sie weniger als 100 oder weniger als 50 Basen lang. Jedoch ist dies nicht essentiell. Natürlich vorkommende und/oder nicht natürlich vorkommende Basen können in den Primern vorhanden sein.
  • Ziel-Nukleinsäuremoleküle
  • Sich nun den Ziel-Nukleinsäuremolekülen (hierin auch als „Matrizen" bezeichnet) für die Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung zuwendend, können diese durch jegliche geeignete Mittel bereitgestellt werden. Ein Zielmolekül (wenn in einzelsträngiger Form) umfasst einen ersten Teil mit einer Sequenz, die sich an einen ersten Primer anlagern kann und einen zweiten Teil mit einer Sequenz, die komplementär zu der Sequenz ist, die sich an einen zweiten Primer anlagern kann. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der zweite Teil dieselbe Sequenz wie der zweite Primer.
  • Der zweite Primer kann eine Sequenz haben, die identisch oder unterschiedlich zu der Sequenz des ersten Primers ist.
  • Die ersten und zweiten Teile des Ziel-Nukleinsäuremoleküls sind vorzugsweise an den 3'-beziehungsweise 5'-Enden davon lokalisiert. Jedoch ist dies nicht essentiell. Das Zielmolekül wird gewöhnlich ebenfalls einen dritten Teil umfassen, der zwischen dem ersten und dem zweiten Teil lokalisiert ist. Dieser Teil des Moleküls umfasst eine bestimmte Sequenz, die repliziert werden soll. Sie kann aus jeglicher gewünschten Quelle stammen und eine bekannte oder unbekannte (manchmal als „anonyme" bezeichnet) Sequenz haben. Sie kann zum Beispiel aus einer zufälligen Fraktionierung durch mechanische Mittel oder durch einen eingeschränkten Restriktionsenzym-Verdau einer Nukleinsäureprobe abgeleitet sein.
  • Weitere Teile des Zielmoleküls können, falls gewünscht, bereitgestellt werden. Zum Beispiel können Teile, die konstruiert sind, als Tags zu fungieren, bereitgestellt werden. Ein „Tag" wird durch seine Funktion definiert, die es ermöglicht, ein bestimmtes Nukleinsäuremolekül (oder dessen Komplement) zu identifizieren.
  • Gleich welche Teile vorhanden sind, können Ziel-Nukleinsäuremoleküle mittels dem Fachmann für Nukleinsäuremanipulation bekannter Techniken bereitgestellt werden. Zum Beispiel können zwei oder mehr Teile durch Ligation verbunden werden. Falls nötig, können vor der Ligation angemessene Modifikationen durchgeführt werden, um Moleküle in einer Form bereitzustellen, die für die Ligation bereit ist. Wenn zum Beispiel eine stumpf-endige Ligation gewünscht ist, könnte eine Einzelstrang-spezifische Exonuklease, wie eine S1 Nuklease, verwendet werden, um vor der Ligation einzelsträngige Teile der Moleküle zu entfernen. Linker und/oder Adapter können ebenfalls bei der Nukleinsäuremanipulation verwendet werden. (Nützliche Techniken für die Nukleinsäuremanipulation werden zum Beispiel in Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989) offenbart).
  • Sobald ein Matrizenmolekül synthetisiert wurde, kann es in einen Vektor kloniert und in einem geeigneten Wirt amplifiziert werden, bevor es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Es kann alternativ mittels PCR amplifiziert werden. Als eine weitere Alternative können Sätze von Matrizenmolekülen unter Verwendung von automatischen DNA-Synthesizern (z.B. von Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA) chemisch synthetisiert werden.
  • Es ist jedoch wichtig festzustellen, dass die vorliegende Erfindung die Bereitstellung einer großen Anzahl von in der Sequenz identischen Nukleinsäuremolekülen in einer Kolonie, die aus einem einzelnen Matrixmolekül entsteht, erlaubt. Weiterhin kann die Matrize wiederverwendet werden, um weitere Kolonien zu erzeugen. Daher ist es nicht essentiell, dass große Anzahlen von Matrizenmolekülen bereitgestellt werden, die für die Koloniebildung verwendet werden.
  • Die Matrize kann jede beliebige Länge haben, vorausgesetzt, dass sie am Verfahren der vorliegenden Erfindung teilhaben kann. Vorzugsweise ist sie wenigsten 10, bevorzugter wenigstens 20 Basen lang. Bevorzugter ist sie wenigstens 100 oder wenigstens 1000 Basen lang. Wie es auch für die Primer für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung der Fall ist, können Matrizen natürlich vorkommende und/oder nicht natürlich vorkommende Basen umfassen.
  • Reaktionsbedingungen
  • Sich nun den Reaktionsbedingungen, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, zuwendend, wird es eingesehen werden, dass die vorliegende Erfindung wiederholte Schritte der Anlagerung von Primern an Matrizen, Primerverlängerung und Trennung der verlängerten Primer von den Matrizen verwendet. Diese Schritte können im Allgemeinen unter Verwendung von Reagenzien und Bedingungen durchgeführt werden, die dem Fachmann für PCR- (oder Reverser-Transkriptase plus PCR) Techniken bekannt sind. PCR-Techniken werden zum Beispiel in „PCR: Clinical Diagnostics and Research", veröffentlicht 1992 vom Springer Verlag, offenbart.
  • Daher kann eine Nukleinsäure-Polymerase zusammen mit einem Vorrat an Nukleosidtriphosphat-Molekülen (oder anderen Molekülen, die als Vorläufer von Nukleotiden, die in DNA/RNA vorhanden sind, fungieren, wie modifizierte Nukleosidtriphosphate) verwendet werden, um Primer in der Gegenwart einer geeigneten Matrize zu verlängern.
  • Desoxyribonukleosidtriphosphate werden wünschenswerter Weise im Überschuss bereitgestellt. Bevorzugte Desoxyribonukleosidtriphosphate werden abgekürzt als: dTTP (Desoxythymidinnukleosidtriphosphat), dATP (Desoxyadenosinnukleosidtriphosphat), dCTP (Desoxycytosinnukleosidtriphosphat) und dGTP (Desoxyguanosinnukleosidtriphosphat). Bevorzugte Ribonukleosidtriphosphate sind UTP, ATP, CTP und GTP. Jedoch sind Alternativen möglich. Diese können natürlich oder nicht natürlich vorkommen. Ein Puffer vom Typ, der im Allgemeinen bei PCR-Reaktionen verwendet wird, kann ebenfalls bereitgestellt werden.
  • Vorzugsweise ist eine Nukleinsäure-Polymerase, die verwendet wird, um Nukleotide während der Primerverlängerung einzubauen, unter den betreffenden Reaktionsbedingungen stabil, damit sie mehrere Male verwendet werden kann. (Dies ist besonders nützlich bei automatisierten Amplifikationsprozeduren). Daher ist die Nukleinsäure-Polymerase, wenn Hitze verwendet wird, um den neu-synthetisierten Nukleinsäurestrang von seiner Matrize zu trennen, vorzugsweise bei der verwendeten Temperatur hitzestabil. Solche hitzestabilen Polymerasen sind dem Fachmann bekannt. Sie können von thermophilen Mikroorganismen erhalten werden. Sie schließen die DNA-abhängige DNA-Polymerase, die als Taq Polymerase bekannt ist, und thermostabile Derivate davon ein. (Jedoch muss die Nukleinsäure-Polymerase nicht DNA-abhängig sein. Sie kann RNA-abhängig sein. Daher kann sie eine Reverse-Transkriptase, d.h. eine RNA-abhängige DNA-Polymerase sein.)
  • Typischerweise findet die Anlagerung eines Primers an seine Matrize bei einer Temperatur von 25 bis 90°C statt. Ein solcher Temperaturbereich wird normalerweise während der Primerverlängerung beibehalten werden. Sobald eine ausreichende Zeit verstrichen ist, um eine Anlagerung und auch ein gewünschtes Maß an Primerverlängerung zu erlauben, kann die Temperatur, falls gewünscht, erhöht werden, um die Strangtrennung zu erlauben. In dieser Phase wird die Temperatur typischerweise auf eine Temperatur von 60 bis 100°C erhöht. [Hohe Temperaturen können ebenfalls verwendet werden, um nicht-spezifische Priming-Probleme vor der Anlagerung zu reduzieren. Sie können verwendet werden, um das Timing der Kolonie-Initiierung zu kontrollieren, z.B. um die Kolonie-Initiierung für eine Anzahl von Proben zu synchronisieren.] Alternativ können die Stränge mittels Behandlung mit einer Niedrigsalzlösung mit hohem pH (> 12) oder unter Verwendung eines chaotropen Salzes (z.B. Guanidiniumhydrochlorid) oder mittels eines organischen Lösungsmittels (z.B. Formamid) getrennt werden.
  • Im Anschluss an die Strangtrennung (z.B. durch Erhitzung) wird vorzugsweise ein Waschschritt durchgeführt. Der Waschschritt kann zwischen den anfänglichen Runden von Anlagerung, Primerverlängerung und Strangtrennung weggelassen werden, wenn es gewünscht wird, dass dieselben Matrizen in der Nähe der immobilisierten Primer belassen werden. Dies erlaubt es, dass Matrizen mehrere Male verwendet werden können, um die Koloniebildung zu initiieren. (Es wird bevorzugt, eingangs eine hohe Konzentration an Matrizenmolekülen bereitzustellen, so dass viele Kolonien in einer Stufe initiiert werden.)
  • Die Größe der Kolonien kann z.B. kontrolliert werden durch Kontrolle der Anzahl der Zyklen von Anlagerung, Primerverlängerung und Strangtrennung, die auftreten. Andere Faktoren, die die Größe der Kolonien beeinflussen, können ebenfalls kontrolliert werden. Diese schließen ein die Anzahl und die Anordnung von immobilisierten Primern auf einer Oberfläche, die Gestaltung des Trägers, auf dem die Primer immobilisiert sind, die Länge und Steifigkeit der Matrize und/oder der Primermoleküle, die Temperatur und Ionenstärke und die Viskosität einer Flüssigkeit, in der die obengenannten Zyklen durchgeführt werden können.
  • Verwendungen von Kolonien
  • Sobald Kolonien gebildet wurden, können sie für jeden gewünschten Zweck verwendet werden.
  • Zum Beispiel können sie für die (sowohl teilweise als auch komplette) Nukleinsäure-Sequenzierung, die Diagnose, das Screening, als Träger für andere Komponenten und/oder für Forschungszwecke verwendet werden (bevorzugte Verwendungen werden später in größerem Detail beschrieben). Falls gewünscht, können die Kolonien modifiziert werden, um verschiedene Kolonien bereitzustellen (hierin als „sekundäre Kolonien" bezeichnet, um sie von den „primären Kolonien", die ursprünglich gebildet wurden, zu unterscheiden).
  • Oberflächen, die immobilisierte Nukleinsäurestränge umfassen
  • Eine Oberfläche, die immobilisierte Nukleinsäurestränge in der Form von Kolonien von einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen umfasst, ist ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
  • Normalerweise ist jeder immobilisierte Nukleinsäurestrang innerhalb einer Kolonie auf der Oberfläche lokalisiert, so dass ein immobilisierter und dazu komplementärer Nukleinsäurestrang innerhalb einer Entfernung von der Länge besagten immobilisierten Nukleinsäurestrangs auf der Oberfläche lokalisiert ist (d.h. innerhalb der Länge von einem Molekül). Dies erlaubt sehr hohe Dichten von in immobilisierter Form bereitgestellten Nukleinsäuresträngen und deren Komplemente. Vorzugsweise befinden sich innerhalb einer Kolonie im Wesentlichen gleiche Mengenverhältnisse eines gegebenen Nukleinsäurestrangs und seines Komplements. Ein Nukleinsäurestrang und sein Komplement sind vorzugsweise im Wesentlichen homogen innerhalb der Kolonie verteilt.
  • Es ist ebenfalls möglich, eine Oberfläche bereitzustellen, die einzelsträngige Nukleinsäurestränge in der Form von Kolonien umfasst, wobei in jeder Kolonie die sense und antisense Einzelstränge in einer solchen Form bereitgestellt werden, dass die zwei Stränge überhaupt nicht mehr komplementär oder einfach teilweise komplementär sind. Normalerweise werden solche Oberflächen durch die Behandlung primärer Kolonien erhalten, z.B. mittels teilweisen Verdaus durch Restriktionsenzyme oder mittels teilweisen Verdaus nach der Strangtrennung (z.B. nach dem Erhitzen) durch ein Enzym, das einzelsträngige DNA verdaut), oder durch chemische oder physikalische Mittel (z.B. durch Lichtbestrahlung von Kolonien, die mit einem interkalierenden Farbstoff, z.B. Ethidiumbromid, angefärbt wurden).
  • Sobald einzelsträngige Kolonien bereitgestellt wurden, können diese verwendet werden, um doppelsträngige Moleküle bereitzustellen. Dies kann z.B. durch Bereitstellen eines geeigneten Primers (vorzugsweise in Lösung) erreicht werden, der mit dem 3'-Ende der einzelsträngigen, immobilisierten Moleküle hybridisiert und einer folgenden Verlängerung dieses Primers unter Verwendung einer Nukleinsäure-Polymerase und eines Vorrats an Nukleosidtriphosphaten (oder anderen Nukleotid-Vorläufern).
  • Daher sind Oberflächen, die Kolonien nicht-überbrückter, doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle umfassen, ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. (Der Begriff „nicht-überbrückt" wird hierin verwendet, um anzuzeigen, dass die Moleküle nicht in der Form von brückenähnlichen Strukturen, wie in z.B. 1h gezeigt, vorliegen.)
  • Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung können kleine Moleküle bereitgestellt werden, die eine große Anzahl von Nukleinsäuremolekülen enthalten (entweder einzel- oder doppelsträngig). Viele Kolonien können daher auf einer Oberfläche lokalisiert werden, die eine kleine Fläche hat. Daher können die Kolonie-Dichten, die erreicht werden können, wie oben diskutiert sehr hoch sein.
  • Verschiedene Kolonien bestehen aus verschiedenen amplifizierten Nukleinsäuresträngen und dazu komplementären, amplifizierten Strängen. Daher erlaubt die vorliegende Erfindung die Lokalisierung vieler verschiedener Populationen von amplifizierten Nukleinsäurestrangmolekülen und deren Komplemente auf einer einzigen Oberfläche mit einem relativ kleinen Oberflächenbereich. Die Oberfläche ist gewöhnlich planar, obwohl dies nicht essentiell ist.
  • Vorrichtungen
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Vorrichtung bereit zur Bereitstellung einer Oberfläche, die Kolonien der oben diskutierten immobilisierten Nukleinsäuremoleküle umfasst.
  • Eine solche Vorrichtung kann ein oder mehr der folgenden umfassen:
    • a) Mittel zur immobilisierung von Primern auf einer Oberfläche (obwohl dies nicht benötigt wird, wenn immobilisierte Primer bereits bereitgestellt werden);
    • b) Einen Vorrat einer Nukleinsäure-Polymerase;
    • c) Einen Vorrat an Vorläufern der Nukleotide, die in eine Nukleinsäure eingebaut werden sollen (z.B. einen Vorrat an Nukleosidtriphosphaten);
    • d) Mittel zur Trennung von aneinander gelagerten Nukleinsäuren (z.B. Heizvorrichtung); und
    • e) Kontrollmittel für die Koordination der verschiedenen Schritte, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung benötigt werden.
  • Andere Vorrichtungen werden vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst. Diese erlauben die Analyse von immobilisierten Nukleinsäuren, die mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung produziert wurden. Sie können eine Quelle von Reaktionspartnern und Detektionsmitteln zur Detektion einen Signals einschließen, das erzeugt werden kann, sobald einer oder mehrere der Reaktionspartner auf die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle angewendet wurde(n). Sie können ebenfalls mit einer Oberfläche bereitgestellt werden, die immobilisierte Nukleinsäuremoleküle in der Form von Kolonien umfasst, wie oben beschrieben.
  • Wünschenswerterweise hat das Detektionsmittel eine ausreichende Auflösung, um es ihm zu ermöglichen, zwischen Signalen zu unterscheiden, die von verschiedenen Kolonien erzeugt wurden.
  • Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung (gleich welcher Art) werden vorzugsweise in einer automatisierten Form bereitgestellt, so dass, sobald sie aktiviert sind, die individuellen Prozessschritte automatisch wiederholt werden können.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun ohne Einschränkung derselben unten in den Abschnitten A bis I mit Bezug zu den begleitenden Zeichnungen beschrieben.
  • Es sollte eingesehen werden, dass die Prozeduren unter Verwendung von DNA-Molekülen, auf die sich in diesen Abschnitten bezogen wird, mutatis mutandis auf RNA-Moleküle anwendbar sind, wenn nicht der Zusammenhang auf anderes hindeutet.
  • Es sollte ebenfalls erkannt werden, dass, wenn in der folgenden Beschreibung Sequenzen zur Verfügung gestellt werden, diese von 5' nach 3' geschrieben sind (von links nach rechts gehend), wenn nicht der Zusammenhang auf anderes hindeutet.
  • Die bereitgestellten Figuren sind unten zusammengefasst:
  • 1 illustriert ein Verfahren für die simultane Amplifikation und Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung eines einzelnen Typs von Primer.
  • 2 illustriert, wie Koloniewachstum unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung auftreten kann.
  • 3 illustriert das Prinzip des Verfahrens, das verwendet wurde, um DNA-Kolonien unter Verwendung der vorliegenden Erfindung zu produzieren. Es illustriert weiterhin die Anlagerungs-, die Verlängerungs- und Denaturierungsschritte, die verwendet werden, um solche Kolonien bereitzustellen.
  • 4 ist ein Beispiel für DNA-Kolonien, die durch Amplifikation einer spezifischen Matrize mit einzelnen Primern, die in eine Oberfläche eingebaut sind, gebildet wurden.
  • 5 illustriert ein Verfahren für die simultane Amplifikation und Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung von zwei Typen von Primern.
  • 6 zeigt tatsächliche DNA-Kolonien, die mittels der vorliegenden Erfindung produziert wurden.
  • 7 illustriert ein Verfahren der simultanen Amplifikation von Nukleinsäuremolekülen, wenn ein Zielmolekül als Matrize verwendet wird, das interne Sequenzen hat, welche sich an Primer anlagern.
  • 8 illustriert ein Verfahren zur Synthese zusätzlicher Kopien der originalen Nukleinsäurestränge unter Verwendung von Nukleinsäuresträngen, die in Kolonien vorhanden sind. Die neu synthetisierten Stränge werden in Lösung gezeigt, können jedoch in immobilisierter Form bereitgestellt werden, wenn gewünscht.
  • 9 zeigt die PCR-Amplifikation von DNA aus DNA, die in vorgefertigten DNA-Kolonien gefunden wird.
  • 10 illustriert, wie sekundäre Primer aus DNA-Kolonien generiert werden können.
  • 11 illustriert, wie sekundäre DNA-Kolonien aus sekundären Primern erzeugt werden können.
  • 12 illustriert, wie Primer mit unterschiedlichen Sequenzen mit einer Oberfläche erzeugt werden können, die mit existierenden Primern funktionalisiert wurde.
  • 13 zeigt Verfahren zur Herstellung von DNA-Fragmenten, die für die Erzeugung von DNA-Kolonien geeignet sind.
  • 14 illustriert ein Verfahren zur Synthese von cRNA unter Verwendung der DNA-Kolonie als Substrat für die RNA-Polymerase.
  • 15 illustriert ein bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der DNA-Sequenz der DNA, die in individuellen Kolonien vorhanden ist.
  • 16 illustriert ein Verfahren zur de novo Bestimmung der Sequenz einer DNA-Kolonie.
  • 17 illustriert die Brauchbarkeit von sekundären DNA-Kolonien für den mRNA-Expressionslevel-Assay.
  • 18 und 19 illustrieren die Verwendung von sekundären DNA-Kolonien bei der Isolation und Identifikation von neuen und selten exprimierten Genen.
  • A) Schema, das die simultane Amplifikation und Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung eines einzelnen Primertyps zeigt
  • Mit Bezug auf 1a) wird eine Oberfläche bereitgestellt, die eine daran befestigte Vielzahl von Primern aufweist (der Einfachheit halber wird lediglich ein Primer gezeigt). Jeder Primer (1) ist mittels einer Verbindung, die durch einen dunklen Block angezeigt wird, an der Oberfläche befestigt. Dies kann eine kovalente oder nicht-kovalente Verbindung sein, sie sollte jedoch ausreichend stark sein, den Primer auf der Oberfläche an seinem Platz zu halten. Die Primer werden mit einer kurzen Nukleotidsequenz (5'-ATT) gezeigt. In der Praxis würden jedoch im Allgemeinen längerer Sequenzen bereitgestellt werden.
  • 1b) zeigt ein Zielmolekül (II), das sich an einen Primer angelagert hat. Das Zielmolekül umfasst an seinem 3'-Ende eine Sequenz (5'-ATT), die komplementär zu der Primer-Sequenz (5'-ATT) ist. An seinem 5'-Ende umfasst das Zielmolekül eine Sequenz (5'-ATT), die dieselbe ist wie die Primer-Sequenz (obwohl exakte Identität nicht nötig ist).
  • Zwischen den beiden Enden kann jede zu amplifizierende Sequenz (oder das Komplement jeder zu amplifizierenden Sequenz) bereitgestellt werden. Als Beispiel wurde ein Teil der Sequenz, die amplifiziert werden soll, als 5'-CCG dargestellt.
  • In 1c) wird die Primerverlängerung gezeigt. Hier wird eine DNA-Polymerase zusammen mit dATP, dTTP, dGTP und dCTP verwendet, um den Primer (5'ATT) von seinem 3'Ende aus unter Verwendung des Zielmoleküls als Matrize zu verlängern.
  • Wenn die Primerverlängerung wie in 1d) gezeigt abgeschlossen ist, kann erkannt werden, dass ein verlängerter, immobilisierter Strang (III) bereitgestellt wird, der komplementär zum Zielmolekül ist. Das Zielmolekül kann dann vom verlängerten, immobilisierten Strang getrennt werden (z.B. durch Erhitzen, wie in 1e) gezeigt). Dieser Trennschritt setzt den verlängerten, immobilisierten Strang frei, so dass er dann, wie in den 1f) und 1g) gezeigt, zur Initiierung einer anschließenden Runde der Primerverlängerung verwendet werden kann. Hier beugt sich der verlängerte, immobilisierte Strang über, so dass ein Ende des Strangs (mit der terminalen Sequenz 5-,AAT) sich, wie in 1f) gezeigt, an einen anderen Primer (2, 5'-ATT) anlagert. Dieser Primer stellt ein 3'-Ende zur Verfügung, von dem aus die Primerverlängerung stattfinden kann, dieses Mal unter Verwendung des verlängerten, immobilisierten Strangs als Matrize. Die Primerverlängerung wird in 1g) stattfindend und in 1h) abgeschlossen dargestellt.
  • 1i) zeigt die zwei verlängerten, immobilisierten Stränge, die in 1h) gezeigt wurden, nach der Trennung voneinander (z.B. durch Erhitzen). Jeder dieser Stränge kann dann selbst wieder als Matrize in weiteren Runden der Primerverlängerung, die von neuen Primern (3 und 4) wie in 1j) und 1k) gezeigt initiiert wird, verwendet werden. Vier einzelsträngige, immobilisierte Stränge können nach zwei Amplifikationsrunden, gefolgt von einem Strangtrennungsschritt (z.B. durch Erhitzen) wie in 1l) gezeigt, bereitgestellt werden. Zwei von diesen haben Sequenzen, die mit der Sequenz des Zielmoleküls, das anfänglich als Matrize verwendet wurde, korrespondieren. Die anderen beiden haben Sequenzen, die komplementär zu der Sequenz des Zielmoleküls sind, das ursprünglich als Matrize verwendet wurde. (In der Praxis können sich ein gegebener immobilisierter Strang und sein immobilisiertes Komplement einmal anlagern.)
  • Daher wird eingesehen werden, dass eine gegebene Sequenz und ihr Komplement in gleicher Anzahl und immobilisierter Form bereitgestellt werden können und dass diese im Wesentlichen homogen innerhalb einer Kolonie verteilt sein können.
  • Weitere Amplifikationsrunden, über die in 1 gezeigten hinaus, können natürlich durchgeführt werden, so dass die Kolonien, die eine große Anzahl eines gegebenen einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls und eines dazu komplementären Strangs bereitgestellt werden können. Es muss lediglich eine einzige Matrize verwendet werden, um eine Kolonie zu initiieren, obwohl, falls gewünscht, eine Matrize zur Initiierung mehrerer Kolonien wiederverwendet werden kann.
  • Es wird eingesehen werden, dass die vorliegende Erfindung die Bereitstellung sehr hoher Dichten von immobilisierten, verlängerten Nukleinsäuremolekülen erlaubt. Innerhalb einer Kolonie ist jedes verlängerte, immobilisierte Molekül auf einer Oberfläche innerhalb der Länge eines anderen verlängerten, immobilisierten Moleküls lokalisiert. Daher ist die in 1l) gezeigte Position 3 innerhalb einer Moleküllänge von Position 1; Position 1 ist innerhalb einer Moleküllänge von Position 2; und Position 2 ist innerhalb einer Moleküllänge von Position 4.
  • 2 wird bereitgestellt, um zu illustrieren, wie Koloniewachstum auftreten kann (unter Verwendung des mit Bezug auf 1 bis 6 beschriebenen Verfahrens oder jeglichen anderen Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Bereitstellung von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen).
  • Eine flache Platte mit darauf immobilisierten Primern wird schematisch in einem quadratischen Gittermuster in der Aufsicht gezeigt (die Primer werden durch kleine Punkt angezeigt). Ein gleichmäßiges Gitter wird lediglich der Einfachheit halber verwendet: in vielen realen Fällen kann die Position der Primer tatsächlich weniger geordnet oder zufällig sein.
  • An der durch den Pfeil X angegebenen Position hat sich ein Matrizenmolekül an einen Primer angelagert und eine anfängliche Runde der Primerverlängerung hat stattgefunden, um einen immobilisierten, verlängerten Nukleinsäurestrang bereitzustellen. Nach der Strangtrennung wird ein Ende dieses Strangs freigesetzt, um sich an weitere Primer anzulagern, so dass zusätzliche immobilisierte, verlängerte Nukleinsäurestränge produziert werden können. Dies ist an den mit dem Buchstaben Y angegebenen Positionen als folgend stattgefunden gezeigt. Der Einfachheit halber ist der für die Anlagerung ausgewählte Primer neben dem Primer positioniert, der den Nukleinsäurestrang trägt: in realen Fällen könnte der Nukleinsäurestrang sich an einen Primer anlagern, der nicht sein nächster Nachbar ist. Jedoch wird dieser Primer offensichtlich innerhalb einer Entfernung sein, die der Länge des Nukleinsäurestrangs entspricht.
  • Es wird eingesehen werden, dass die Anlagerung lediglich an einer (anstatt an allen) dieser Positionen für das Auftreten eines Koloniezellenwachstums nötig ist.
  • Nachdem immobilisierte, verlängerte, einzelsträngige Nukleinsäuremolekülen an den durch den Buchstaben Y gekennzeichneten Positionen bereitgestellt wurden, können die resultierenden Moleküle selbst sich an andere Primer anlagern und der Prozess kann fortgesetzt werden, um eine Kolonie bereitzustellen, die eine große Anzahl an immobilisierten Nukleinsäuremolekülen in einem relativ kleinen Bereich umfasst.
  • 3 zeigt eine vereinfachte Version des Anlagerungs-, Verlängerungs- und Denaturierungszyklus. Sie zeigt weiterhin die typischen Beobachtungen, die gemacht werden können, wie aus den Beispielen, die in 4 und 6 gezeigt sind, gesehen werden kann. Die simultane Amplifikation und Immobilisierung von Nukleinsäuren unter Verwendung von Festphasenprimern wurde erfolgreich unter Verwendung der unten in den Beispielen 1, 2 und 3 beschriebenen Prozedur erreicht:
  • BEISPIEL 1
  • Oligonukleotide, die an ihren 5'-Termini phosphoryliert waren (Microsynth GmbH, Schweiz) wurden in Nucleolink Kunststoff-Mikrotiterwells (Nunc, Roskilde, Dänemark) eingebaut. Die Sequenz des Oligonukleotids p57 entsprach der Sequenz 5'-TTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCAAACC und p58 entsprach der Sequenz 5'-TTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG. Die Mikrotiterwells mit p57 oder p58 wurden wie folgt hergestellt. In jedes Nukleolink-Well wurden 30 μl einer 160 nM Lösung des Oligonukleotids in 10 mM 1-Methylimidazol (pH 7.0) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) gegeben. Jedem Well wurden 10 μl von 40 mM 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid (pH 7.0) (Sigma Chemicals) in 10 mM 1-Methylimidazol zu der Lösung von Oligonukleotiden hinzugegeben. Die Wells wurden versiegelt und bei 50° C über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Wells zweimal mit 200 μl RS (0.4 N NaOH, 0.25% Tween 20 (Fluka Chemicals, Schweiz)) abgespült, 15 Minuten mit 200 μl RS inkubiert, zweimal mit 200 μl RS und zweimal mit 200 μl TNT (100 mM TrisHCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) gewaschen. Die Röhrchen wurden bei 50° C getrocknet und in einem versiegelten Kunststoffbeutel bei 4° C gelagert.
  • Die Kolonieerzeugung wurde in jedem Well mit 15 μl der Priming-Mischung initiiert; 1 Nanogramm Matrizen-DNA (wobei die Matrizen-DNA mit der Sequenz 5'-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG begann und am 3'-End mit der Sequenz CCCTTTCCCTTTCCTTCTCCTTCT-3' endete), den vier dNTPs (0.2 mM), 0.1% BSA (bovines Serumalbumin, Boehringer-Mannheim, Germany), 0.1% Tween 20, 8% DMSO (Dimethylsulfoxid, Fluka Chemicals, Schweiz), 1 X Amplitaq PCR-Puffer und 0.025 units/μl AmpliTaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA). Die Priming-Reaktion war eine einzelne PCR-Runde unter folgenden Bedingungen; 94° C für 4 Minuten, 60° C für 30 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden in einem Thermocycler (PTC 200, MJ Research, Watertown, MA). Dann wurden 100 μl TE Puffer (10 mM TrisHCl, pH 7.5, 1 mM EDTA) in drei aufeinanderfolgenden, einminütigen Waschschritten bei 94°C verwendet. Die DNA-Kolonien wurden dann durch Zugabe von 20 μl der Polymerisationsmischung, die identisch zu der Priming-Mischung war, jedoch nicht die Matrizen-DNA enthielt, zu jedem Well gebildet. Die Wells wurden dann in den PTC 200 Thermocycler platziert und das Kolonien-Wachstum wurde durch Inkubation der versiegelten Wells für 4 Minuten bei 94° C und Zyklierung der folgenden Bedingungen für 50 Wiederholungen durchgeführt: 94° C für 45 Sekunden, 65° C für 2 Minuten, 72° C für 45 Sekunden. Nach der Fertigstellung dieses Programms wurden die Wells bis zur weiteren Verwendung bei 8° C gehalten. Ein 640 Basenpaarfragment, das zu der zentralen Sequenz der Matrize korrespondierte (jedoch nicht die 5'-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG Sequenz enthielt) wurde mittels PCR amplifiziert. Das isolierte Fragment wurde mit Biotin-N4-dCTP (NEN Life Sciences, Boston, MA) und einer Spur von [α-32P]dCTP (Amersham, GB) unter Verwendung des Prime-it II Markierungskits (Stratagene, San Diego, USA) markiert, um eine biotinylierte Sonde zu erzeugen.
  • Die biotinylierte Sonde wurde auf eine Konzentration von 2.5 nM in EasyHyb (Boehringer-Mannheim, Deutschland) verdünnt und 15 μl wurden mit jeder Probe mit dem folgenden Temperaturschema (PCT 200 Thermocycler) hybridisiert: 94°C für 5 Minuten, gefolgt von 500 Schritten einer 0.1°C Temperaturerniedrigung alle 12 Sekunden (in anderen Worten wird die Temperatur in 100 Minuten auf 45° C verringert). Die Proben werden dann wie folgt gewaschen; einmal mit 2 X SSC/0.1% SDS (2 X SSC; 0.3 M NaCl/0.03 M Natriumcitrat pH 7.0/0.001 mg/ml Natriumdodecylsulfat) bei Raumtemperatur, einmal mit 2 X SSC/0.1 % SDS bei 37° C und einmal mit 0.2 X SSC/0.1 % SDS bei 50° C. Die Wells werden dann für 30 Minuten mit 50 μl rotfluoreszenten, neutravidin-beschichteten, 40 nM FluoSpheres® (580 nm Excitation und 605 nm Emission, Molecular Probes Inc., Eugene, OR) in TNT/0.1% BSA inkubiert. (Die Lösung der Mikrosphären wird aus 2 μl der Stammlösung der Mikrosphären in 1 ml TNT/0.1% BSA hergestellt, die dann für 5 Minuten in einem 50 W Ultraschall-Wasserbad (Elgasonic, Schweiz) beschallt wird, gefolgt von einer Filtration durch ein 0.22 μm Filter (Millex GV4). Die Wells werden dann auf einem Microbeta Platten-Szintillationszähler (WALLAC, Turku, Finnlan) ausgezählt (Cherenkov).
  • Überschüssige FluoroSpheres® werden durch Waschen in TNT/0.1 % ☐SA für 30 Minuten bei Raumtemperatur entfernt. Bilder der gefärbten Proben werden unter Verwendung eines 20X Objektivs mit einem invertierten Mikroskop (Axiovert S100TV, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland), das mit einer Micromax 512x768 CCD Kamera (Princeton Instruments, Trenton, NJ) ausgestattet ist, durch einen XF43 Filtersatz (PB546/FT580/LP590, Omega Optical, Brattleboro, VT) mit einer 5-sekündigen Exponierung beobachtet.
  • 4 zeigt die Hybridisierungsresultate für die Kolonienerzeugung auf Röhrchen, die entweder mit (a) Oligonukleotid p57 oder (b) Oligonukleotid p58 funktionalisiert wurden. Die Kontrollreaktion zeigt nur einige wenige fluoreszierende Flecken, da die Sequenzen der flankierenden Regionen der Matrize nicht mit der Primer-Sequenz korrespondieren, die in das Well eingebaut wurde. Im Gegensatz dazu zeigt 4b die Anzahl der fluoreszierenden Flecken, die detektiert wurden, wenn die Primer, die in die Wells eingebaut wurden, auf die flankierenden Sequenzen der anfänglichen DNA-Matrize passen. Unter Berechnung der Anzahl der detektierten fluoreszierenden Flecken und die Vergrößerung mitberücksichtigend, können wir abschätzen, dass es zwischen 3 und 5 × 107 Kolonien/cm2 gibt. Die Fotos werden mittels des Programms Winview 1.6.2 (Princeton Instruments, Trenton, NJ) mit auf dieselben Werte normalisierten Hintergründen und Intensitäten erzeugt.
  • B) Schema, das die simultane Amplifikation und Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung zweier verschiedener Primertypen zeigt.
  • Sich nun auf 5 beziehend, wird eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung illustriert. Hier werden zwei verschiedene immobilisierte Primer verwendet, um die Primerverlängerung bereitzustellen.
  • In dieser Ausführungsform wird das gezeigte Zielmolekül mit einer Nukleotidsequenz an seinem 3'-Ende (AAT-3') bereitgestellt, die komplementär ist zu der Sequenz des ersten Primers, (5'-ATT, I), der in die Oberfläche eingebaut ist, so dass eine Anlagerung mit diesem Primer stattfinden kann. Die Sequenz (5'-GGT) am 5'-Ende des Zielmoleküls, III, korrespondiert mit der Sequenz (5'-GGT) eines zweiten Primers, II, der ebenfalls in die Oberfläche eingebaut ist, so dass die Sequenz, die komplementär zu der Sequenz am 5'-Ende ist, sich an diesen besagten zweiten Primer anlagern kann. Allgemein gesagt, wird die komplementäre Sequenz (5'-ACC) so ausgewählt, dass sie sich nicht an den ersten Primer (5'-ATT) anlagern wird. Im Unterschied zu der in Abschnitt A beschriebenen Situation wird, sobald das 3'-Ende eines neu synthetisierten Strangs sich an einen Primer auf der Oberfläche anlagert, es einen Primer finden müssen, dessen Sequenz unterschiedlich von der Sequenz ist, den es an seinem 5'-Ende trägt (siehe die Unterschiede zwischen 1f und 5f).
  • Die in 5 gezeigte Ausführungsform hat einen Vorteil über die in 1 illustrierte Ausführungsform, da die Möglichkeit der Anlagerung eines Endes des einzelsträngigen Moleküls mit einem anderem Ende desselben Moleküls in Lösung vermieden werden kann und damit die Amplifikation fortschreiten kann. Ebenfalls kann die Möglichkeit des Auftretens der Anlagerung zwischen zwei Enden eines immobilisierten Komplements an ein Zielmolekül vermieden werden.
  • BEISPIEL 2
  • Eine Mischung von zwei Oligonukleotiden, die am 5'-Ende phosphoryliert sind (Microsynth GmbH, Balgach, Schweiz) wurden in 96-Well Nucleolink-Platten (Nunc, Dänemark), wie vom Hersteller angeraten, eingebaut. Die resultierenden Platten wurden trocken bei 4° C gelagert. Die Sequenz des Primers P1 war 5'-GCGCGTAATACGACTCACTA, die Sequenz des anderen Primers, P2, war 5'-CGCAATTAACCCTCACTAAA. Diese Platten sind spezifisch von Nunc entworfen worden und erlauben den kovalenten Einbau von 5'-phosphorylierten DNA-Fragmenten mittels einer Standardprozedur.
  • Eine Matrize wurde in einen Vektor (pBlueScript Skminus, Stratagene Inc., San Diego, CA) mit der angemessenen DNA-Sequenz an der Klonierungsstelle (d.h. zu P1 und P2 an der Position 621 bzw. 794 korrespondierend) kloniert und eine 174 bp lange, lineare, doppelsträngige DNA-Matrize wurde mittels PCR-Amplifikation unter Verwendung von P1 und P2 erhalten. Das Matrizen PCR-Produkt wurde auf Qiagen Qia-quick Säulen (Qiagen, GmbH, Hilden, Germany) aufgereinigt, um die Nukleotide und die Primer zu entfernen, die während der PCR-Amplifikation verwendet wurden.
  • Die aufgereinigte Matrize (in 50 μl Lösung, enthaltend 1 X PCR-Puffer (Perkin Elmer, Foster City, CA) mit den vier Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs) bei 0.2 mM (Pharmacia, Uppsala, Schweden) und 2.5 Einheiten der AmpliTaq Gold DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA)) wurde auf dem Träger verteilt, d.h. auf den Nucleolink-Platten, in die P1 und P2 eingebaut waren (die Platten wurden mit einer Lösung enthaltend 100 mM TRIS-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl und 0.1% Tween 20 (Fluka, Schweiz) für 15 Minuten bei Raumtemperatur abgespült). Diese Lösung wurde bei 93° C für 9 Minuten inkubiert, um die DNA-Polymerase zu aktivieren und dann wurden 60 Zyklen (94° C/30 Sek., 48° C/30 Sek., 72°C/30 Sek.) auf einem PTC 200 Thermocycler durchgeführt. Einige verschiedene Konzentrationen der PCR-Matrize wurden ausgetestet (ungefähr 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 ng/μl) und für jede Probe wurde eine Kontrollreaktion ohne Taq-Polymerase durchgeführt (gleiche Bedingungen wie oben, aber ohne DNA-Polymerase).
  • Jede Probe wurde mit YO-PRO (Molecular Probes, Portland, OR), einem hochempfindlichen Färbemittel für doppelsträngige DNA, angefärbt. Die resultierenden Produkte wurden auf einem konfokalen Mikroskop unter Verwendung eines 40 X Objektivs (LSM 410, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland) mit geeigneten Excitations- (ein 488 Argonlaser) und Detektionsfiltern (510 Tiefpassfilter) beobachtet (Hinweis: der Boden jedes Wells ist flach und erlaubt die Untersuchung mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop).
  • In 6A zeigt das Kontroll-Well (ohne zugegebene DNA-Matrize, Panel a) lediglich selten Objekte, die auf einer leeren Oberfläche beobachtet werden können (diese Objekte waren in dieser Phase dazu nützlich, anzuzeigen, dass der Fokus korrekt war). Diese Objekte haben eine ungleichmäßige Form, sind 20 bis 100 Mikrometer groß und haben eine Dicke, die viel größer ist als der Tiefenschärfebereich der Beobachtung. In einem Well, in dem DNA-Polymerase vorhanden war (6A, Panel ii) kann, zusätzlich zu den im Kontroll-Well beobachteten Objekten ungleichmäßiger Form, eine große Anzahl von fluoreszierenden Flecken beobachtet werden. Diese zeigen eine kreisförmige Form, sind 1 bis 5 Mikrometer groß und erstrecken sich nicht über das Bildfeld. Die Anzahl der Flecken hängt von der Konzentration der Matrize ab, die für die Initiierung der Koloniebildung verwendet wurde. Man kann aus der beobachteten Größe der Kolonien abschätzen, dass mehr als 10,000 individuelle Kolonien innerhalb von 1 mm2 Träger angeordnet werden können.
  • BEISPIEL 3
  • Oligonukleotide (Microsynth GmbH, Schweiz) wurden in Nucleolink-Wells (Nunc, Dänemark), eingebaut. Oligonukleotid P1 entspricht der Sequenz 5'-TTTTTTCTCACTATAGGGCGAATTGG und Oligonukleotid P2 entspricht 5'-TTTTTTCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGG. Jedem Nucleolink-Well wurden 45 μl einer 10 mM 1-Methylimidazol (pH 7.0) (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) Lösung, enthaltend 360 fmol von P1 und 360 fmol von P2, hinzugegeben. Jedem Well wurden 15 μl 40 mM 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid (pH 7.0) (Sigma Chemicals) in 10 mM 1-Methylimidazol zu der Oligonukleotidlösung hinzugegeben. Die Wells wurden dann versiegelt und bei 50° C für 16 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Wells zweimal mit 200 μl TNT (100 mM TRIS/HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 % Tween 20) abgespült, bevor sie zum Trocknen bei 50° C in einen Ofen gestellt wurden. Die getrockneten Röhrchen wurden in einem versiegelten Kunststoffbeutel bei 4° C gelagert.
  • Das Koloniewachstum wurde in jedem Well mit 5 μl der Initiationsmischung (1 X PCR-Puffer, 0.2 mM dNTPs und 0.75 Einheiten AmpliTaq Gold DNA-Polymerase, 20 Nanogramm Matrizen-DNA) initiiert, wobei die Matrizen-DNA entweder S1-DNA oder S2-DNA, oder eine Mischung verschiedener Verhältnisse von S1-DNA und S2-DNA, wie in der Diskussion zu 6B angegeben, war. S1 und S2 sind 704 Basenpaar, bzw. 658 bp Fragmente, die in pBlueScript Skminus Plasmide kloniert wurden und anschließend mittels PCR unter Verwendung von P1 und P2 als Primer amplifiziert wurden. Die Fragmente wurden auf Qiagen Qia-quick Säulen (Qiagen GmbH, Deutschland) aufgereinigt, um die Nukleotide und Primer zu entfernen.
  • Jedes Well wurde mit CyclesealTM (Robbins Scientific Corp., Sunnyvale, CA) versiegelt und bei 93° C für 9 Minuten, 65° C für 5 Minuten und 72° C für 2 Minuten und zurück auf 93° C inkubiert. Dann wurden 200 μl TNT-Lösung in drei aufeinanderfolgenden, einminütigen Waschschritten bei 93° C verwendet. Die Initiationsmischung wurde durch 15 μl Wachstumsmischung (wie die Initiationsmischung, aber ohne Matrizen-DNA) ersetzt und das Wachstum wurde durch Inkubation der versiegelten Wells bei 93° C für 9 Minuten und 40-maligem wiederholen der folgenden Bedingungen durchgeführt: 93° C für 45 Sekunden, 65° C für 3 Minuten, 72° C für 2 Minuten. Nach Abschluss dieses Programms wurden die Wells bis zur weiteren Verwendung bei 6° C aufbewahrt. Die Temperaturkontrolle wurde in einem PTC 200 Thermocycler unter Verwendung des im Nucleolink-Kit bereitgestellten Silikonpolsters und dem erhitzten Deckel (104° C) des PTC 200 durchgeführt.
  • Ein 640-Basenpaarfragment, das mit der zentralen Sequenz des S1-Fragments übereinstimmte, aber nicht die P1- oder P2-Sequenz einschloss, wurde mittels PCR wie zuvor beschrieben amplifiziert. Die Sonde wurde mit Biotin-16-dUTp (Boehringer-Mannheim, Deutschland) unter Verwendung des Prime-it II random Primer labelling kit (Stratagene, San Diego, CA) gemäß den Angaben des Herstellers markiert.
  • Die biotinylierten Sonden wurden mit den Proben in EasyHyb-Puffer (Boehringer-Mannheim, Deutschland) unter Verwendung des folgenden Temperaturschemas (im PTC 200 Thermocycler) hybridisiert: 94° C für 5 Minuten, gefolgt von 68 Schritten von 0.5° C Verringerung der Temperatur alle 30 Sekunden (in anderen Worten wird die Temperatur innerhalb von 34 Minuten auf 60° C verringert) unter Verwendung von versiegelten Wells. Die Proben werden dann dreimal mit 200 μl TNT bei Raumtemperatur gewaschen. Die Wells werden dann für 30 Minuten mit 50 μl TNT, enthaltend 0.1 mg/ml BSA, inkubiert. Dann werden die Wells 5 Minuten mit 15 μl einer Lösung von rotfluoreszierenden, neutravidin-beschichteten 40 nm Fluorospheres® (580 nm Excitation und 605 nm Emission, Molecular Probes, Portland, OR) inkubiert. Die Lösung der Mikrosphären wird aus 2 μl der Stammlösung der Mikrosphären hergestellt, die für 5 Minuten in einem 50 W Ultraschall-Wasserbad (Elgasonic, Bienne, Schweiz) beschallt wurden, verdünnt in 1 ml TNT Lösung enthaltend 0.1 mg/ml BSA und gefiltert mit einem Millex GV4 Filter mit 0.22 μm Porengröße (Millipore, Redford, MA).
  • Die angefärbten Proben werden unter Verwendung eines invertierten Axiovert 10 Mikroskop unter Verwendung eines 20 X Objektivs (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland), ausgestattet mit einer Micromax 512x768 CCD Kamera (Princeton Instruments, Trenton, NJ) unter Verwendung eines XF43 Filtersatzes (PB546/FT580/LP590, Omega Optical, Brattleboro, VT) und 10 Sekunden Lichtsammlung beobachtet. Die Dateien werden in das TIFF-Format umgewandelt und mittels der geeigneten Software (PhotoPaint, Corel Corp., Ottawa, Kanada) verarbeitet. Das Verarbeiten bestand aus Inversion und linearer Kontrastverbesserung, um ein Bild für den Schwarz-Weiß-Ausdruck auf einem Laserdrucker bereitzustellen.
  • 6B zeigt die Ergebnisse für 3 unterschiedliche Verhältnisse der S1/S2-Matrizen, die in der Initiationsreaktion verwendet wurden: i) 51/52 ist 1/0, viele Flecken können beobachtet werden, ii) S1/52 ist 1/10 und die Anzahl der Flecken ist ungefähr 1/10 der Anzahl der Flecken, die, wie erwartet, in Bild i) beobachtet werden kann und iii) S1/S2 ist 0/1 und lediglich einige seltenen Flecken können gesehen werden.
  • C) Schema, das die simultane Amplifikation und Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen zeigt, wenn das Zielmolekül interne Sequenzen enthält, die komplementär zu den immobilisierten Primern sind
  • 7 wird bereitgestellt um zu zeigen, dass die in an den 5'- und 3'-Enden der Zielmoleküle gezeigten Sequenzen, die in 1 und 5 dargestellt sind, nicht an den Enden der Zielmoleküle lokalisiert sein müssen.
  • Ein Ziel-Nukleinsäuremolekül (II) kann eine Sequenz an jedem (oder einem der beiden) Ende(n) haben, die weder in die Anlagerung an einen Primer noch in die Funktion als eine Matrize involviert ist, um eine komplementäre Sequenz bereitzustellen, die sich an einen Primer anlagert (Sequenz 5'-AAA und Sequenz 5'-CCC). Wie aus 7(a) bis 7(e) klar wird, wird eine der internen Sequenzen (5'-AAT) als Matrize verwendet, um eine dazu komplementäre Sequenz, III, (5'-TTT) zu synthetisieren.
  • Wie aus 7(f) bis 7(k) klar wird, wird jedoch die Sequenz 5'-TTT selbst nicht verwendet, um eine dazu komplementäre Sequenz bereitzustellen. Es kann aus 7(I) entnommen werden, dass lediglich einer der vier immobilisierten Stränge, gezeigt nach zwei Runden der Primerverlängerung und eines Strangtrennungsschritts, die zusätzliche Sequenz 5'-TTT umfasst und kein Strang vorhanden ist, der eine komplementäre Sequenz (5'-AAA) zu dieser Sequenz umfasst (d.h. es ist lediglich ein Strang vorhanden, der signifikant länger ist, als die anderen). Nach einigen Runden der Amplifikation, repräsentiert der Strang, der die Sequenz 5'-TTT umfasst, einen insignifikanten Anteil an der Gesamtzahl der verlängerten, immobilisierten Nukleinsäuremoleküle, die vorhanden sind.
  • D) Verwendung von Nukleinsäuresträngen, die in Kolonien vorhanden sind, um zusätzliche Kopien von Nukleinsäuresträngen zu synthetisieren
  • Durch die Kolonien der vorliegenden Erfindung bereitgestellte amplifizierte einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle können ihrerseits als Matrizen zur Synthese zusätzlicher Nukleinsäurestränge verwendet werden.
  • 8 illustriert ein Verfahren zur Synthese zusätzlicher Nukleinsäuren unter Verwendung immobilisierter Nukleinsäuren als Ausgangspunkt.
  • Kolonien werden gewöhnlich sowohl einen gegebenen Nukleinsäurestrang als auch sein Komplement in immobilisierter Form umfassen (8a). Daher können sie verwendet werden, um nicht nur zusätzliche Kopien eines gegebenen Nukleinsäurestrangs, sondern auch seines Komplements bereitzustellen.
  • Ein Weg, dies zu tun, ist es, einen oder mehrere Primer (Primer TTA und TGG) in Lösung bereitzustellen, die sich an amplifizierte, immobilisierte Nukleinsäurestränge anlagern, die in den durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Kolonien vorhanden sind (8c). (Diese Primer können, abgesehen davon, dass sie in freier anstatt immobilisierter Form bereitgestellt werden, dieselben sein wie die Primer, die ursprünglich verwendet wurden, um die immobilisierten Kolonien bereitzustellen). Die ursprüngliche DNA-Kolonie wird mittels Hitze in ihre einzelsträngige Form denaturiert (8b), was es den Primern TTA und TGG erlaubt, sich an das verfügbare 3'-Ende eines jeden DNA-Strangs anzulagern. Die Primerverlängerung unter Verwendung von AmpliTaq DNA-Polymerase und den vier Desoxyribonukleotidtriphosphaten (markiert oder unmarkiert) kann dann verwendet werden, um komplementäre Stränge zu den immobilisierten Nukleinsäuresträngen oder wenigstens Teilen davon zu synthetisieren (Schritt (iii)).
  • Sobald mittels der oben beschriebenen Prozesse neu synthetisierte Stränge synthetisiert wurden (8d), können diese von den immobilisierten Strängen getrennt werden, an die diese hybridisiert sind (z.B. durch Erhitzen). Der Prozess kann dann, falls gewünscht, unter Verwendung der PCR-Reaktion wiederholt werden, um eine große Anzahl solcher Stränge in Lösung bereitzustellen (8e).
  • Auf diese Weise synthetisierte Stränge können, wenn gewünscht, nach der Trennung von den immobilisierten Strängen aneinander angelagert werden (d.h. ein gegebener Strang und sein Komplement können sich aneinander anlagern), um doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle in Lösung bereitzustellen. Alternativ können sie voneinander getrennt werden, um homogene Populationen von einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen in Lösung bereitzustellen.
  • Es sollte auch erwähnt werden, dass, sobald einzelsträngige Moleküle in Lösung bereitgestellt wurden, diese als Matrizen für die PCR (oder reverse PCR) verwendet werden können. Daher ist es essentiell, die Verwendung der immobilisierten Nukleinsäurestränge fortzuführen, um eine weitere Amplifikation der gegebenen oder dazu komplementären Stränge zu erhalten.
  • Es sollte erwähnt werden, dass, wenn eine Vielzahl von Kolonien bereitgestellt wird und Nukleinsäurestränge in verschiedenen Kolonien verschiedene Sequenzen haben, es möglich ist, lediglich bestimmte Kolonien für die Verwendung als Matrize bei der Synthese von zusätzlichen Nukleinsäuremolekülen auszuwählen. Dies kann durch Verwendung von Primern für die Primerverlängerung erreicht werden, die spezifisch für die Moleküle sind, die in den ausgewählten Kolonien vorhanden sind.
  • Alternativ können Primer bereitgestellt werden, die es erlauben, einige oder alle der Kolonien als Matrize zu verwenden. Solche Primer können eine Mischung vieler verschiedener Primer sein (z.B. eine Mischung aller Primer, die ursprünglich verwendet wurden, alle Kolonien bereitzustellen, wobei jedoch die Primer in löslicher anstelle von immobilisierter Form bereitgestellt werden).
  • BEISPIEL 4
  • Oligonukleotide (Microsynth GmbH Balgach, Schweiz) wurden in Nucleolink-Wells (Nunc, Dänemark) eingebaut. Oligonukleotid P1 entspricht der Sequenz 5'-TTTTTTTTTTCACCAACCCAAACCAACCCAAACC und Oligonukleotid P2 entspricht 5'-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG. Zu jedem Nucleolink-Well wurden 45 μl einer 10 mM 1-Methylimidazol (pH 7.0) (Sigma Chemicals) Lösung, enthaltend 360 fmol P1 und 360 fmol P2 hinzugegeben. Jedem Well wurden 15 μl 40 mM 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid (pH 7.0) (Sigma Chemicals) in 10 mM 1-Methylimidazol zu der Oligonukleotidlösung hinzugegeben. Die Wells wurden dann versiegelt und bei 50° C für 16 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Wells zweimal mit 200 μl RS (0.4 N NaOH, 0.25% Tween 20) abgespült, 15 Minuten mit 200 μl RS inkubiert, zweimal mit 200 μl RS und zweimal mit 200 μl TNT (100 mM Tris/HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) gewaschen, bevor sie zum Trocknen bei 50° C in einen Ofen gestellt wurden. Die getrockneten Röhrchen wurden in versiegelten Kunststoffbeuteln bei 4° C gelagert.
  • Das Koloniewachstum wurde in jedem Well mit 15 μl der Initiationsmischung (1 X PCR-Puffer, 0.2 mM dNTPs und 0.75 Einheiten AmpliTaq Gold DNA-Polymerase, 20 Nanogramm Matrizen-DNA) initiiert, wobei die Matrizen-DNA entweder S1-DNA oder S2-DNA, oder eine 1/1 Mischung von S1-DNA und S2-DNA, wie in der Diskussion zu Beispiel 3 angegeben, war. S1 und S2 sind 658 Basenpaar, bzw. 704 bp Fragmente, die wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurden..
  • Jedes Well wurde mit CyclesealTM (Robbins Scientific Corp., Sunnyvale, CA) versiegelt und bei 93° C für 9 Minuten, 65° C für 5 Minuten und 72° C für 2 Minuten und zurück auf 93° C inkubiert. Dann wurden 200 μl TNT-Lösung in drei aufeinanderfolgenden, einminütigen Waschschritten bei 93° C verwendet. Die Initiationsmischung wurde durch 15 μl Wachstumsmischung (wie die Initiationsmischung, aber ohne Matrizen-DNA) ersetzt und das Wachstum wurde durch Inkubation der versiegelten Wells bei 93° C für 9 Minuten und 40-maligem Wiederholen der folgenden Bedingungen durchgeführt: 93° C für 45 Sekunden, 65° C für 3 Minuten, 72° C für 2 Minuten. Nach Abschluss dieses Programms wurden die Wells bis zur weiteren Verwendung bei 6° C aufbewahrt. Die Temperaturkontrolle wurde in einem PTC 200 Thermocycler durchgeführt.
  • Verschiedene Behandlungen wurden auf 6 Sätze (A, B, C, D, E und F) von 3 Wells (1, 2, 3) angewendet, wobei eines mit Matrize S1, eines mit Matrize S2 und Matrize S2 und eines mit Matrize S2 alleine vorbereitet war (was A1, A2, A3, ..., F1, F2, F3 ergab). Satz A wurde unbehandelt belassen, Satz B wurde für 10 Minuten mit BAL-31-Exonuklease (New England Biolabs, Beverly, MA) bei 37° C in BAL-31-Puffer inkubiert (BAL-31 verdaut im Wesentlichen doppelsträngige DNA, bei der beide Enden frei sind), Satz C wurde für 10 Minuten mit S1-Nuklease (Pharmacia, Uppsala, Schweden) bei 37° C in S1-Puffer inkubiert (S1-Nuklease verdaut im Wesentlichen einzelsträngige DNA), Satz D, E und F wurden sowohl mit BAL-31- als auch S1-Nuklease inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Spülen der Wells mit TNT-Puffer gestoppt.
  • PCR (25 Zyklen, 30 sec. bei 94° C, 45 sec. bei 60° C, 45 sec. bei 72° C) wurde in Sätzen A, B, C und D in den Nucleolink-Wells mit 0.25 μM von den in Lösung befindlichen Primern P70 (5'-CACCAACCCAAACCAACCCAAACCACGACTCACTATAGGGCGAA) und P71 (5'-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGTAAAGGGAACAAAAGCTGGA) durchgeführt. P70 und P71 sind geeignet für die Amplifikation von sowohl S1 als auch S2, da Primer P70 die Sequenz von Primer P1 enthält und P71 P2 enthält. In den Wells von Satz E wurde die PCR mit einem Satz von forward (P150, 5'-GGTGCTGGTCCTCAGTCTGT) and reverse (P151, 5'-CCCGCTTACCAGTTTCCATT) Primern durchgeführt, die innerhalb von S1 und nicht innerhalb von S2 sind, um ein 321 bp PCR-Produkt zu erzeugen, und in den Wells des F Satzes wurde die PCR mit einem Satz von forward (P152, 5'-CTGGCCTTATCCCTAACAGC) and reverse (P153, 5'-CGATCTTGGCTCATCACAAT) Primern durchgeführt, die innerhalb von S2 und nicht innerhalb von S1 sind, um ein 390 bp PCR-Produkt zu erzeugen. Für jede der 18 PCR-Reaktionen wurden 3 μl der Lösung für eine Gelelektrophorese auf 1% Agarose in der Gegenwart von 0.1 μg/ml Ethidiumbromid verwendet. Die Bilder der Gele werden in 9 gezeigt. Diese Bilder zeigen, dass die DNA in den Kolonien vor dem Exonuklease-Verdau geschützt ist (Sätze B, C und D verglichen mit Satz A) und, dass sowohl S1 als auch S2 entweder simultan unter Verwendung von P1 und P2 (Sätze A, B, C und D) oder spezifisch (Sätze E, F) zurück erhalten werden kann. In Sätzen E und F, in denen die kürzeren PCR-Produkte effizienter amplifiziert werden, als die längeren PCR-Produkte in Sätzen A, B, C, D, ist eine Kreuzkontamination zwischen den S1- und S2-Matrizen detektierbar (siehe Spur E2 und F1).
  • E) Bereitstellung von sekundären Kolonien
  • Es ist ebenfalls möglich, ursprünglich gebildete Kolonien zu modifizieren, um verschiedene Kolonien bereitzustellen (d.h. um Kolonien bereitzustellen, die immobilisierte Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzen umfassen, die unterschiedlich sind von denjenigen Molekülen, die in den ursprünglich gebildeten Kolonien vorhanden sind). Hierin werden die ursprünglich gebildeten Kolonien als „primäre Kolonien" und die später gebildeten Kolonien als „sekundäre Kolonien" bezeichnet. Eine vorbereitende Prozedur ist erforderlich, um die primären Kolonien in „sekundäre Primer" umzuwandeln, die für die Bildung von sekundären Kolonien geeignet sind.
  • 10 zeigt, wie ,sekundäre Primer' unter Verwendung bestehender primärer Kolonien erzeugt werden. Als Ausgangspunkt wird die primäre Kolonie (10a) in der voll hybridisierten, doppelsträngigen Form belassen. Eine Einzelstrang-spezifische DNA-Exonuklease kann verwendet werden, um alle Primer zu entfernen, die nicht verlängert wurden. Man könnte auch alle freien 3'-OH Enden der Primer mit Didesoxyribonukleotidtriphosphaten unter Verwendung einer DNA-Terminal-Transferase (Schritt (i), 10b) cappen.
  • Zweitens und unabhängig davon können die DNA-Moleküle, die die Kolonien bilden, unter Verwendung von Endonukleasen gespalten werden, zum Beispiel einem Restriktionsenzym, das eine spezifische Stelle innerhalb der Kolonie erkennt (gezeigt durch den ,RE'-Pfeil in 10c) und die DNA-Kolonie schneidet (Schritt (ii), 10). Wenn gewünscht, kann dann die enzymatisch gespaltene Kolonie (10d) partiell mit einer 3'-5' doppelstrang-spezifischen Exonuklease (z.B. E. coli Exonuklease III, dargestellt durch ,N', Schritt (iii), 10d) verdaut werden. In jedem Fall sind die sekundären Primer nach der Denaturierung (z.B. durch Hitze) und Waschen (10e) verfügbar.
  • Alternativ kann die doppelsträngige DNA, die die Kolonien bildet (10f), mit der doppelstrang-spezifischen 3'-5' Exonuklease, die einen Strang der doppelsträngigen DNA verdaut, verdaut werden. Ein wichtiger Fall ist es, wenn die Exonuklease lediglich einige wenige Basen des DNA-Moleküls verdaut, bevor es in Lösung freigesetzt wird und wenn der Verdau fortgesetzt werden kann, wenn ein anderes Enzym an das DNA-Molekül bindet (10g). In diesem Fall wird der Exonuklease-Verdau fortschreiten, bis lediglich einzelsträngige Moleküle verbleiben, die im Mittel halb so lang sind, wie das Ausgangsmaterial und ohne jegliche komplementäre Teile (die partielle Duplexe bilden könnten) in den einzelsträngigen Molekülen in einer Kolonie verbleiben (10h).
  • In allen Fällen resultieren diese Behandlungen in einzelsträngigen, in einen Träger eingebaute Fragmente, die zu der Sequenz der Originalmatrize korrespondieren und die für das Wachstum einer neuen DNA-Kolonie verwendet werden können, wenn eine geeignete neue Matrize für die Kolonie-Initiierung bereitgestellt wird (10e und 10h).
  • Das Ergebnis einer solchen Behandlung, also ein Träger beinhaltend sekundäre Primer, wird als „Träger für das sekundäre Koloniewachstum" bezeichnet. Matrizen, die für das sekundäre Koloniewachstum nützlich sind, können Moleküle einschließen, die bekannte Sequenzen haben (oder Komplemente solcher Sequenzen). Alternativ können Matrizen von unsequenzierten Molekülen abgeleitet werden (z.B. zufällig Fragmente). In jedem Fall sollten die Matrizen mit einer oder mehreren Region(en) für das Anlagern an Nukleinsäurestränge bereitgestellt werden, die in den primären Kolonien vorhanden sind.
  • 11a–e zeigt, wie eine sekundäre Kolonie erzeugt werden kann, wenn eine geeignete Matrize (TP, 11a) für eine zweite Runde der DNA-Kolonieerzeugung auf einem Träger, der sekundäre Primer beinhaltet, für das sekundäre Kolonienwachstum bereitgestellt wird. In diesem Beispiel hat die Behandlung der primären Kolonien wie oben beschrieben die sekundären Primer SP1 und SP2 erzeugt (11a). Die Matrize TP wird an ihren komplementären, sekundären Primer SP1 hybridisieren und nach einer Verlängerungsreaktion unter Verwendung einer DNA-Polymerase, wie beschrieben, wie gezeigt verlängert werden (12b). Nach einem Denaturierungs- (Schritt ii), Wiederanlagerungs- (Schritt iii) und DNA-Polymerase- (Schritt iv) Zyklus wird ein Replikat der ursprünglichen primären Kolonie gebildet sein (11e).
  • Die maximale Größe einer durch diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bereitgestellten sekundären Kolonie wird durch die Größe der primären Kolonie eingeschränkt, auf der sie wächst. Verschiedene sekundäre Wachstumsprozesse können sequentiell verwendet werden, um Kolonien für spezifische Anwendungen zu erzeugen (d.h. eine erste Kolonie kann mit einer zweiten Kolonie ersetzt werden, die zweite Kolonie kann mit einer dritte Kolonie ersetzt werden, etc.)
  • F) Bereitstellung von verlängerten Primern
  • 12 zeigt, wie verlängerte Primer auf einem Array von Oligonukleotiden erzeugt werden können. Dieselbe Prozedur könnte auf einen Träger angewendet werden, der, wie in Abschnitt E beschrieben, mit Kolonien oder sekundären Primern bedeckt ist.
  • In 12a) wird ein Träger bereitgestellt, worauf eine Vielzahl von immobilisierten Primern dargestellt ist. Verschiedene immobilisierte Primer werden gezeigt, in verschiedenen Bereichen des Trägers vorhanden zu sein (durch Quadrate repräsentiert). Primer mit der Sequenz 5'-AAA sind in einem Quadrat vorhanden und Primer mit der Sequenz 5'-GGG sind in einem anderen Quadrat vorhanden.
  • 12b) bis 12d) zeigen, wie die ursprünglich vorhandenen Primer (ursprüngliche Primer) modifiziert werden, um unterschiedliche Primer zu ergeben (verlängerte Primer). In diesem Beispiel werden diejenigen ursprünglichen Primer mit der Sequenz 5'-AAA modifiziert, um zwei unterschiedliche Arten von verlängerten Primern zu erzeugen, die die Sequenzen 5'-AAAGCC bzw. 5'-AAATAC haben. Dies wird durch Hybridisierung von Oligonukleotid-Matrizen, 5'-GTATTT und 5'-GGCTTT an die auf der Oberfläche immobilisierten Primer erreicht (12b), gefolgt von der DNA-Polymerasereaktion. Diejenigen ursprünglichen Primer mit der Sequenz 5'-GGG werden auf eine ähnliche Weise modifiziert, um zwei unterschiedliche Typen von verlängerten Primern zu erzeugen, die die Sequenzen 5'-GGGTAT und 5'-GGGTA haben (12d).
  • Die Technik zur Produktion von verlängerten Primern ist für die Transformation auf einem DNA-Chip oder einer anderen Oberfläche bereitgestellter immobilisierter Oligonukleotide in immobilisierte Primer nützlich, die für die Amplifikation einer bestimmten Ziel-Nukleinsäuresequenz und/oder die Amplifikation eines dazu komplementären Strangs nützlich sind.
  • G) Herstellung von Nukleinsäurefragmenten
  • Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können für verschiedene Prozeduren verwendet werden, von denen einige später beschrieben werden. Nukleinsäure-Fragmente für die Verwendung in der Kolonieherstellung können unterschiedlich für die unterschiedlichen Prozeduren vorbereitet werden (hierin als „vorbereitete Nukleinsäuren" bezeichnet). Verschiedene Vorbereitungsprozeduren werden unten beschrieben:
  • (i) Vorbereitung von zufälligen DNA-Fragmenten
  • Hier wird ein Verfahren beschrieben, um DNA, die von einer biologischen Probe stammt (oder von einer Vielzahl von Proben) für die Amplifikation vorzubereiten, für die Fälle, in denen es nicht nötig ist, die Übersicht über die Herkunft der DNA zu behalten, wenn sie innerhalb einer Kolonie eingebaut ist.
  • Die interessierende DNA wird zunächst aus der biologischen Probe extrahiert und zufällig in „kleine" Stücke zerschnitten (z.B. 50 bis 10,000 Basen lang, aber vorzugsweise 500 bis 1000 Basenpaare lang, durch Balken ,I' in 13a repräsentiert). (Dies kann z.B. durch Phenol- Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ultraschallbehandlung, mechanischem Scheren, durch partiellen Verdau mit häufig schneidenden Restriktionsendonukleasen oder anderen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, erreicht werden). Um die experimentellen Bedingungen zu standardisieren, können die extrahierten und geschnittenen DNA-Fragmente größenfraktionert werden, z.B. durch Agarosegelelektrophorese, Saccharosegradientenzentrifugation oder Gelchromatographie. Innerhalb einer einzelnen Fraktion erhaltene Fragmente können verwendet werden Matrizen bereitzustellen, um die Variabilität in der Größe der Matrizen zu reduzieren.
  • Zweitens können die extrahierten, geschnittenen und (optional) sortierten Matrizen-DNA-Fragmente mit Oligonukleotidlinkern (IIa und IIb, 13a) ligiert werden, die die Sequenz des/der Primer enthalten, der/die zuvor in einen Träger eingebaut wurde(n). Dies kann zum Beispiel durch Verwendung der „blunt-end"-Ligation erreicht werden. Alternativ können die Matrizen-DNA-Fragmente in einen biologischen Vektor an einer Stelle eingeführt werden, die von der Sequenz der Primer flankiert wird, die in den Träger eingebaut sind. Diese klonierte DNA kann innerhalb eines biologischen Wirts amplifiziert und extrahiert werden. Offensichtlich stellt, wenn man mit einem einzelnen für die DNA-Koloniebildung in den festen Träger eingebauten Primer arbeitet, die Aufreinigung der Fragmente, die sowohl P1 als auch P2 Primer enthalten, kein Problem dar.
  • Hiernach werden die DNA-Fragmente, die nach einem solchen geeigneten Prozess erhalten werden, mit dem Ausdruck: „vorbereitete genomische DNA" (III, 13a) bezeichnet.
  • (ii) Vorbereitung von zufälligen DNA-Fragmenten, die von einer Vielzahl von Proben abstammen.
  • Hier wird beschrieben, wie DNA, die von einer Vielzahl von biologischen Proben stammt, in den Fällen vorbereitet werden kann, in denen es notwendig ist, die Übersicht über den Ursprung der DNA zu behalten, wenn sie in eine Kolonie eingebaut ist.
  • Die Prozedur ist dieselbe wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben, nur dass in diesem Fall die Oligonukleotidlinker, die an die zufällig geschnittenen DNA-Fragmente angehängt werden, nun aus zwei Teilen aufgebaut sind; der Sequenz der Primer, die in die Oberfläche eingebaut sind (P1 und P2, 13b) und einer „Tag"-Sequenz, die für jede Probe unterschiedlich ist und die für die Identifizierung der Herkunft der DNA-Kolonie verwendet wird. Es ist zu beachten, dass für jede Probe der Tag nicht einzigartig zu sein braucht und eine Vielzahl von Tags verwendet werden könnte. Hiernach werden wir die DNA-Fragmente, die nach einem solchen geeigneten Prozess erhalten werden, mit dem Ausdruck: „getaggte genomische DNA" bezeichnen (III, 13b).
  • Diese Tag-Prozedur kann verwendet werden, um Kolonien bereitzustellen, die Mittel zur Identifizierung tragen, die unabhängig von der Sequenz sind, die die Matrize selbst trägt. Dies könnte ebenfalls nützlich sein, falls einige Kolonien spezifisch wiedererlangt werden sollen (unter Verwendung der in Abschnitt D angegebenen Prozedur). Dies könnte ebenfalls in dem Fall nützlich sein, wenn die wiedererlangten Kolonien weiterverarbeitet werden, z.B. durch Herstellung neuer primärer Kolonien, und eine Kreuzreferenz zwischen den ursprünglichen Kolonien und den neuen Kolonien gewünscht wird.
  • (iii) Vorbereitung von DNA-Fragmenten, die mit einer Vielzahl von DNA-Sequenzen korrespondieren, die aus einer Probe stammen
  • Die interessierende DNA kann zunächst mittels jeglicher dem Fachmann bekannter Mittel aus einer biologischen Probe extrahiert werden (wie oben erwähnt). Danach können die spezifischen interessierenden Sequenzen mittels PCR unter Verwendung der Primer (IIa und IIb), die aus zwei Teilen bestehen; 1) am 5'-Ende die Sequenz, die mit der Sequenz von Primer-Oligonukleotid(en) übereinstimmt, das/die in die Oberfläche eingebaut wurde (P1 und P2) und 2) am 3'-Ende Primer-Sequenzen, die spezifisch für die interessierende Sequenz sind (S1 und S2), amplifiziert werden (Schritt (i), 13c). Hiernach werden wir die DNA-Fragmente, die nach einem solchen geeigneten Prozess erhalten werden mit dem Ausdruck: „vorbereitete DNA" bezeichnet (III, 13c).
  • (iv) Herstellung einer Vielzahl von DNA-Fragmenten, die von einer Vielzahl von Proben abstammen
  • Die Prozedur ist dieselbe wie im vorhergehenden Abschnitt, mit Ausnahme, dass in diesem Fall die DNA-Primer (IIa und IIb), die für die Durchführung des PCR-Amplifikationsschritts verwendet werden (Stepp (i), 13d), nun aus drei Teilen bestehen; 1) der Sequenz, der in die Oberfläche eingebauten Primer (P1 und P2), 2) einer „Tag"-Sequenz, die für jede Probe unterschiedlich ist und die zur Identifizierung der Herkunft der DNA-Kolonie verwendet wird und 3) Primersequenzen, die die spezifische, interessierende Sequenz umgeben (S1 und S2). Es ist zu beachten, dass für jede Probe eine Vielzahl von Tags verwendet werden kann, wie in (ii) oben.
  • Hiernach werden wir die DNA-Fragmente, die nach einem solchen geeigneten Prozess erhalten werden, mit dem Ausdruck „getaggte DNA" (III, 13d) bezeichnen. Potentielle Verwendungen von Tags sind dieselben wie in (ii) oben.
  • (v) Vorbereitung von mRNA
  • Die Prozedur ist ähnlich zu den Prozeduren, die für die Vorbereitung von DNA-Fragmenten in den vorhergehenden Abschnitten beschrieben wurden, mit der Ausnahme, dass der Ausgangspunkt die Extraktion von mRNA mittels jeglicher dem Fachmann bekannter Mittel ist (z.B. mittels Verwendung kommerziell erhältlicher mRNA-Präparationskits). Die mRNA kann mittels jeglicher dem Fachmann bekannter Mittel in doppelsträngige cDNA kopiert werden (z.B. unter Verwendung einer Reversen-Transkriptase und einer DNA-Polymerase). Die oben beschriebenen Primer und Tags können sicherlich zusammen mit dem Prozess der Doppelstrang-cDNA-Synthese verwendet werden, um deren Einbau in die Matrize zu erlauben. Hiernach werden wir die mRNA-Fragmente, die nach geeigneten Prozessen erhalten werden, mit den Ausdrücken: „vorbereitete totale mRNA" (vgl. „vorbereitete genomische DNA", wie in Abschnitt (I) oben beschrieben), „getaggte totale mRNA" (vgl. „getaggte genomische DNA", wie oben in Abschnitt (ii) beschrieben), „vorbereitete mRNA" (vgl. „vorbereitete DNA", wie oben in Abschnitt (iii) beschrieben) und „getaggte mRNA" (vgl. „getaggte DNA", wie oben in Abschnitt (iv) beschrieben) bezeichnen.
  • H) Bevorzugte Detektions-Assays
  • Bei den Assay-Prozeduren der vorliegenden Erfindung können Markierungen verwendet werden, um detektierbare Signale bereitzustellen. Beispiele schließen ein:
    • a) eine fluoreszierende Gruppe oder ein energietransfer-basiertes Fluoreszenzsystem.
    • b) Ein biotin-basiertes System. In diesem Fall könne die Kolonien mit Streptavidin inkubiert werden, das mit einer fluoreszierenden Gruppe oder einem Enzym markiert ist (z.B. fluoreszierende Latexkügelchen, die mit Streptavidin beschichtet sind; Streptavidin, das mit fluoreszierenden Gruppen markiert ist; Enzyme zur Verwendung mit dem korrespondierenden Fluoreszenz-Assay).
    • c) Ein System, das auf der Detektion von Antigenen oder Fragmenten davon basiert – z.B.
    • ein Hapten (einschließlich Biotin und fluoreszierende Gruppen). In diesem Fall können Kolonien mit Antikörpern inkubiert werden (z.B. spezifisch für ein Hapten). Die Antikörper können mit einer fluoreszierenden Gruppe oder mit einem Enzym markiert sein (z.B. fluoreszierende Latexkügelchen, dir mit dem Antikörper beschichtet sind; Antikörper, die mir fluoreszierenden Gruppen markiert sind; Antikörper, die mit einem Enzym für die Verwendung mit einem korrespondierenden Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Assay, etc. verbunden sind).
    • d) Eine Radiomarkierung (eingebaut durch z.B. Verwendung von 5'-Polynukleotidkinase und [γ-32P]Adenosintriphosphat oder einer DNA-Polymerase und [α-32P oder α-33P] Deoxiribonukleosidtriphosphaten, um (eine) radioaktive Phosphatgruppe(n) einer Nukleinsäure hinzuzufügen). Hier können die Kolonien mit einer Szintillationsflüssigkeit inkubiert werden.
    • e) Ein Farbstoff oder anderes Färbemittel
  • Markierungen zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise angebracht:
    • a) an Nukleinsäuren
    • b) an Proteinen, die spezifisch an doppelsträngige DNA binden (z.B. Histone, Repressoren, Enhancer) und/oder
    • c) an Proteine, die spezifisch an einzelsträngige DNA binden (z.B. Bindeproteinen einzelsträngiger Nukleinsäuren).
  • Markierte Kolonien werden vorzugsweise detektiert mittels:
    • a) Messung der Fluoreszenz.
    • b) Messung der Lumineszenz.
    • c) Messung der Radioaktivität.
    • d) Messung des Flusses oder des elektrischen Felds, das durch Fluoreszenzanisotropie induziert wird und/oder
    • e) Messung der Dicke der Polymerschicht.
  • Färbemittel können mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Daher können DNA-Kolonien mit einem geeigneten DNA-spezifischen Färbemittel inkubiert werden, wie interkalierende Farbstoffe, Ethidiumbromid, YO-YO, YO-PRO (Molekular Probes, Eugene, OR).
  • Bei bestimmten Färbemitteln können die Ergebnisse mit einer geeigneten Fluoreszenz-Imaging-Vorrichtung beobachtet werden.
  • Beispiele für bestimmte Assays/Prozeduren werden nun in größerem Detail beschrieben:
  • I) Bevorzugte Ausführungsformen der Assays der vorliegenden Erfindung
  • (i) Nukleinsäuresonden-Hybridisierungs-Assays
  • DNA-Kolonien werden zunächst für die Hybridisierung vorbereitet. Danach werden sie mit einer Sonde (markiert oder unmarkiert) hybridisiert. Falls erforderlich, wird die hybridisierte Sonde einem Assay unterzogen und die Resultate beobachtet. Dies kann mit einer Vorrichtung der vorliegenden Erfindung erreicht werden (z.B. wie oben beschrieben).
  • Vorbereitung für die Hybridisierung
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Kolonien mit einer DNA-Restriktionsendonuklease behandelt, die entweder spezifisch für eine Sequenz ist, die von einer doppelsträngigen Form eines der Primer bereitgestellt wird, der ursprünglich in die Oberfläche eingebaut wurde, wo Kolonien gebildet werden, oder für eine andere in einem Matrizen-DNA-Molekül vorhandene Sequenz (siehe z.B. 16c).
  • Nach dem Verdau durch das Restriktionsenzym können die Kolonien auf eine Temperatur erhitzt werden, die hoch genug ist, um die doppelsträngigen Moleküle zu trennen. Nach diesem thermalen Denaturierungsschritt können die Kolonien gewaschen werden, um nicht-hybridisierte, abgelöste DNA-Stränge zu entfernen, was zurückbleibende angeheftete einzelsträngige DNA zurücklässt.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Kolonien partiell mit einer doppelstrangspezifischen 3'-5'-DNA-Exonuklease (siehe Abschnitt E, 10f) verdaut werden, was einen Strang von DNA-Duplexen ausgehend vom 3'-Ende entfernt und damit einen Teil der DNA-Moleküle in einzelsträngiger Form zurücklässt.
  • Alternativ kann die DNA in den Kolonien zuerst mittels Hitze denaturiert und dann partiell mit einer einzelstrangspezifischen 3'-5'-DNA-Exonuklease verdaut werden, die einzelsträngige DNA ausgehend vom 3'-Ende verdaut.
  • Eine weitere Alternative ist es, die Kolonien einfach mittels Hitze zu denaturieren.
  • Hybridisierung der Sonde
  • Einzelsträngige Nukleinsäuresonden (markiert oder unmarkiert) können an einzelsträngige DNA in Kolonien bei geeigneten Temperatur- und Pufferbedingungen hybridisiert werden (welche von der Sequenz jeder Sonde abhängen und die unter Verwendung von Protokollen bestimmt werden können, die dem Fachmann bekannt sind).
  • Assay auf unmarkierte, hybridisierte Sonden
  • Eine hybridisierte Sonde, die ursprünglich in unmarkierter Form bereitgestellt wurde, kann als ein Primer für den Einbau von unterschiedlichen (oder einer Teilmenge der verschiedenen) markierten (oder einer Mischung von markierten und unmarkierten) Desoxyribonukleosidtriphosphaten mit einer DNA-Polymerase verwendet werden. Die eingebauten, markierten Nukleotide können dann wie oben beschrieben detektiert werden.
  • Zyklischer Assay auf markierte oder unmarkierte Sonden
  • Zunächst können DNA-Kolonien mittels der oben beschriebenen Verfahren für die Hybridisierung hergestellt werden. Sie können dann mit einer Sonde (markiert oder unmarkiert) hybridisiert werden. Wenn erforderlich, werden die hybridisierten, markierten Sonden einem Assay unterzogen und das Resultat wird, wie zuvor beschrieben, mit einer Vorrichtung beobachtet. Die Sonde kann dann mittels Hitze-Denaturierung entfernt werden und eine Sonde für eine zweite DNA-Sequenz kann hybridisiert und detektiert werden. Diese Schritte können mit neuen Sonden so oft wie gewünscht wiederholt werden.
  • Zweitens können die Sonden wie oben beschrieben auf unmarkierte Sonden hin einem Assay unterzogen werden mit der Ausnahme, dass lediglich eine Untermenge (vorzugsweise nur 1) der unterschiedlichen (markierten oder unmarkierten) Nukleotide in jedem Zyklus verwendet wird. Die Kolonien können dann zur Überwachung des Einbaus der Nukleotide einem Assay unterzogen werden. Dieser zweite Prozess kann wiederholt werden, bis eine Sequenz mit der gewünschten Länge bestimmt wurde.
  • (ii) In situ RNA-Synthese-Assay
  • In dieser Ausführungsform können DNA-Kolonien, wie in 14 gezeigt, als Matrizen für die in situ RNA-Synthese verwendet werden. DNA-Kolonien können so aus Matrizen und Primer erzeugt werden, dass eine RNA-Polymerase-Promotorsequenz an einem Ende der doppelsträngigen DNA in der Kolonie positioniert ist. DNA-Kolonien können dann mit RNA-Polymerase inkubiert werden und die neu synthetisierten RNA (cRNA) wie gewünscht einem Assay unterzogen werden. Die Detektion kann nicht-spezifisch (z.B. Anfärbung) oder in einer sequenz-abhängigen Weise (z.B. Hybridisierung) durchgeführt werden.
  • Die DNA-Matrize (I, 14a), die in eine Kolonie amplifiziert werden soll, wird mittels PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer (IIa und IIb) erzeugt, die die folgenden vier Teile haben; 1) Sequenz, die identisch zu den Sequenzen der in die Oberfläche eingebauten Primer (,P1' und ,P2') ist, 2) eine „Tag"-Sequenz, die für jede Probe unterschiedlich ist, eine Sequenz, die zu einem RNA-Polymerasepromotor, d.h. den T3, T7 und SP6 RNA-Promotoren, korrespondiert (,RPP', 14a) und 4) Primersequenzen, die die spezifische interessierende Sequenz umgeben (,S1 und ,S2'). Hiernach werden wir die DNA-Fragmente, die nach einem solchen Prozess erhalten werden mit dem Begriff: „getaggte RNA-Synthese-DNA" (III, 14b) bezeichnen.
  • Nach Amplifikation der DNA-Matrize aus der ursprünglichen DNA-Probe werden diese Matrizen verwendet, um DNA-Kolonien zu erzeugen. Die DNA-Kolonien (IV, 14c) werden dann mit der RNA-Polymerase inkubiert, die spezifisch ist für den RNA-Polymerasepromotor (,RPP', 14c). Dies wird eine Kopie der RNA erzeugen, die für die DNA-Kolonie-Matrize spezifisch ist (Matrizen-cDNA, V, 14d).
  • So synthetisierte cDNA kann isoliert werden und als Hybridisierungssonden, als Messenger-RNA (mRNA)-Matrizen für die in vitro Proteinsynthese oder als Matrize für in situ RNA-Sequenzanalyse verwendet werden.
  • (iii) Verfahren für die Sequenzierung
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Kolonien analysiert werden, um die Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle, die die Kolonien bilden, zu bestimmen. Da sehr große Anzahlen desselben Nukleinsäuremoleküls innerhalb jeder Kolonie bereitgestellt werden können, ist die Verlässlichkeit der erhaltenen Sequenzdaten wahrscheinlich sehr groß.
  • Die bestimmten Sequenzen können ganz oder teilweise sein. Sequenzen können für Nukleinsäuren bestimmt werden, die in einer oder mehreren Kolonien vorhanden sind. Eine Vielzahl von Sequenzen kann gleichzeitig bestimmt werden.
  • In einigen Ausführungsformen kann eingangs die Sequenz eines zu einem Nukleinsäurestrang, der sequenziert werden soll, komplementären Strangs (oder eines Teils davon) erhalten werden. Jedoch kann diese Sequenz unter Verwendung von Basenpaarungsregeln konvertiert werden, um die gewünschte Sequenz (oder einen Teil davon) zu erhalten. Diese Umwandlung kann mittels eines Computers oder durch eine Person ausgeführt werden. Sie kann nach jedem Schritt der Primerverlängerung ausgeführt werden, oder zu einem späteren Zeitpunkt.
  • Die Sequenzierung kann mittels verschiedener Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel können Verfahren, die auf sequentiellem Verdau durch Restriktionsendonukleasen und Linkerligation beruhen, verwendet werden. Ein solches Verfahren wird zum Beispiel in WO95/27080 offenbart. Dieses Verfahren umfasst die Schritte: Ligation einer Sonde an das Ende eines Polynukleotids, wobei die Sonde eine Nukleasen-Erkennungsstelle hat; Identifizierung eines oder mehrerer Nukleotide am Ende des Polynukleotids; und Spaltung des Polynukleotids mit einer Nuklease, die die Nukleasen-Erkennungstelle der Sonde erkennt, so dass das Polynukleotid um ein oder mehrere Nukleotide verkürzt wird.
  • In einem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung werden jedoch amplifizierte Nukleinsäuremoleküle (vorzugsweise in der Form von Kolonien, wie hierin offenbart) sequenziert, wobei es ermöglicht wird, dass Primer mit den Nukleinsäuremolekülen hybridisieren, die Primer zu verlängern und die bei der Primerverlängerung verwendeten Nukleotide zu detektieren. Vorzugsweise wird das Nukleotid nach der Verlängerung eines Primers durch ein einzelnes Nukleotid detektiert, bevor ein weiteres Nukleotid für die Primerverlängerung verwendet wird (Schritt-für-Schritt-Sequenzierung).
  • Ein oder mehrere Nukleotid(e), die bei der Primerverlängerung verwendet werden, können markiert sein. Die Verwendung von markierten Nukleotiden während der Primerverlängerung ermöglicht die Detektion. (Der Begriff „Markierung" wird in seinem weiten Sinn verwendet, um jegliche Gruppe anzugeben, die unter Verwendung eines geeigneten Detektionssystems identifiziert werden kann. Vorzugsweise ist die Markierung nicht in natürlich vorkommenden Nukleotiden vorhanden.). Idealerweise sind Markierungen, wie Fluorophore, nicht-radioaktiv. Jedoch können radioaktive Markierungen verwendet werden.
  • Wenn Nukleotide in markierter Form bereitgestellt werden, können die Markierungen für unterschiedliche Nukleotide dieselben sein. Wenn dieselbe Markierung verwendet wird, kann jeder Nukleotideinbau verwendet werden, um eine kumulative Zunahme desselben Signals bereitzustellen (z.B. eines Signals, das bei einer bestimmten Wellenlänge detektiert wird). Alternativ können verschiedene Markierungen für jeden Typ von Nukleotid verwendet werden (die bei unterschiedlichen Wellenlängen detektiert werden können).
  • Daher können vier unterschiedliche Markierungen für dATP, dTTP, dCTP und dGTP bereitgestellt werden, oder dieselbe Markierung kann für alle bereitgestellt werden. Gleichsam können vier verschiedene Markierungen für ATP, UTP, CTP und GTP bereitgestellt werden, oder dieselbe Markierung kann für alle bereitgestellt werden. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann eine Mischung von markierten und unmarkierten Nukleotiden bereitgestellt werden, wie später in größerem Detail beschrieben werden wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen, die in wenigstens 2 unterschiedlichen Kolonien vorhanden sind, simultan durchgeführt. Bevorzugter wird die Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen, die in über 10, über 100, über 1000 oder sogar über 1,000,000 unterschiedlichen Kolonien vorhanden ist, simultan durchgeführt. Daher können, wenn Kolonien bereitgestellt werden, die unterschiedliche Nukleinsäuremoleküle aufweisen, viele verschiedene Sequenzen (ganz oder teilweise) simultan bestimmt werden – d.h. über 10, über 100, über 1000 oder sogar über 1,000,000 verschiedene Sequenzen können simultan bestimmt werden.
  • Falls gewünscht, können Kontrollen bereitgestellt werden, wobei eine Vielzahl von Kolonien bereitgestellt wird, die dieselben Nukleinsäuremoleküle umfassen. Mittels Bestimmung, ob dieselben Sequenzen für die Nukleinsäuremoleküle in diesen Kolonien erhalten werden oder nicht kann sichergestellt werden, ob die Sequenzierungsprozedur verlässlich ist oder nicht.
  • Ein Sequenzierungsverfahren der vorliegenden Erfindung wird in 17 illustriert, welche mit „In situ Sequenzierung" betitelt ist. Die zyklische Zugabe der individuellen Desoxyribonukleosidtriphosphate und DNA-Polymerase auf vorbereitete DNA-Kolonien, die mit einem geeigneten Sequenzierungsprimer hybridisiert wurden, erlaubt die Bestimmung der DNA-Sequenz unmittelbar 3' zum Sequenzierungsprimer. Im in 17 dargestellten Beispiel erlaubt die Zugabe von dGTP die Bestimmung, dass Kolonie 1 ein ,G' enthält. In der zweiten Zyklus-Zugabe wird dATP in beiden Kolonien detektiert, was bestimmt, dass beide Kolonien ein ,A' an der nächsten Position haben. Nach einigen Wiederholungen der Zugabe von einzelnen Desoxyribonukleosidtriphosphaten ist es möglich, jegliche Sequenz zu bestimmen. Zum Beispiel können Sequenzen von wenigstens 10, wenigstens 20, wenigstens 50 oder wenigstens 100 Basen bestimmt werden.
  • Wenn Kolonien anfänglich in einer Form bereitgestellt werden, die doppelsträngige Moleküle umfasset, können die Kolonien verarbeitet werden, um einzelsträngige Moleküle für die Verwendung in der oben beschriebenen Sequenzierung bereitzustellen. (Es sollte jedoch erwähnt werden, dass doppelsträngige Moleküle für die Sequenzierung ohne eine solche Verarbeitung verwendet werden können. Zum Beispiel kann ein doppelsträngiges DNA-Molekül mit einer Promotorsequenz bereitgestellt werden und eine Schritt-für-Schritt-Sequenzierung kann dann unter Verwendung einer RNA-Polymerase und markierter Ribonukleotide (vgl. 16d)) durchgeführt werden. Eine andere Alternative ist die Einführung eines Nicks in ein doppelsträngiges DNA-Molekül, so dass eine Nick-Translation unter Verwendung von markierten Desoxyribonukleotiden durchgeführt werden kann und eine DNA Polymerase mit 5'-3' Exonukleaseaktivität.)
  • Eine Möglichkeit zur Verarbeitung von doppelsträngigen Molekülen, die in Kolonien vorhanden sind, um einzelsträngige Kolonien bereitzustellen, wird später mit Bezug auf 19 beschrieben. Hier werden doppelsträngige, immobilisierte Moleküle, die in einer Kolonie vorhanden sind (die in der Form einer brückenähnlichen Struktur vorliegen können) gespalten, und dies wird von einem Denaturierungsschritt gefolgt. (Alternativ könnte eingangs ein Denaturierungsschritt verwendet werden und von einem Spaltungsschritt gefolgt werden). Vorzugsweise wird die Spaltung enzymatisch durchgeführt. Jedoch sind andere Mittel zur Spaltung, wie chemische Spaltung, möglich. (Eine geeignete Spaltungsstelle kann in besagtem Molekül bereitgestellt werden). Die Denaturierung kann mittels jedes beliebigen Verfahrens durchgeführt werden. Zum Beispiel kann sie durch Erhitzen und/oder Änderung der Ionenstärke eines Mediums in der Nähe des Nukleinsäuremoleküls durchgeführt werden.
  • Sobald einzelsträngige Moleküle bereitgestellt sind, die sequenziert werden sollen, können daran geeignete Primer für die Primerverlängerung hybridisiert werden. Als Primer werden Oligonukleotide bevorzugt. Diese sind Nukleinsäuremoleküle, die typischerweise 6 bis 60, z.B. 15 bis 25 Nukleotide lang sind. Sie können natürliche und/oder nicht natürlich vorkommende Nukleotide umfassen. (Jedoch können, wenn gewünscht, andere Moleküle, z.B. längere Nukleinsäurestränge alternativ als Primer verwendet werden.) Die Primer für die Verwendung bei der Sequenzierung hybridisieren vorzugsweise an dieselben Sequenzen, die in den amplifizierten Nukleinsäuremolekülen vorhanden sind wie die Primer, die verwendet wurden, um besagte amplifizierte Nukleinsäuren bereitzustellen. (Primer, die dieselben/ähnliche Sequenzen haben, können sowohl für Amplifikations- als auch Sequenzierungszwecke verwendet werden).
  • Wenn Primer in Lösung bereitgestellt werden und an Nukleinsäuremoleküle angelagert (hybridisiert) werden, die in Kolonien vorhanden sind, die sequenziert werden sollen, können diejenigen Primer, die in Lösung bleiben oder die sich nicht spezifisch anlagern, nach der Anlagerung entfernt werden. Bevorzugte Anlagerungsbedingungen (Temperatur- und Pufferbedingungen) bei einer gegebenen Salzkonzentration verhindern die nicht-spezifische Hybridisierung. Diese können stringente Bedingungen sein. Solche Bedingungen würden typischerweise Anlagerungsbedingungen sein, die nahe des Tm (Schmelztemperatur) eines Primers bei einer gegebenen Salzkonzentration liegen (z.B. 50 nM Primer in 200 mM NaCl Puffer bei 55° C für ein 20-mer Oligonukleotid mit 50% GC-Gehalt). (Stringente Bedingungen für ein gegebenes System können vom Fachmann bestimmt werden). Sie werden von der Basenzusammensetzung, dem GC-Gehalt, der Länge der verwendeten Primer und der Salzkonzentration abhängen. Für ein 20-Basen-Oligonukleotid mit 50% GC ist die berechnete Anlagerungstemperatur 55–60°C, kann jedoch in der Praxis zwischen 35 bis 70°C variieren).
  • Primer, die für die Primerverlängerung verwendet werden, müssen nicht in Lösung vorliegen, da sie in immobilisierter Form bereitgestellt werden können. In dieser Ausführungsform sollten die Primer in der Nähe der immobilisierten Moleküle, an welche sie angelagert werden sollen, bereitgestellt werden. (Solche Primer können in der Tat bereits als im Überschuss immobilisierte Primer vorhanden sein, die nicht während der Bildung von Kolonien bei der Amplifikation der Nukleinsäuremoleküle verwendet wurden.)
  • Die in den Kolonien vorhandenen Nukleinsäuremoleküle, die sequenziert werden sollen, werden eine Sequenz enthalten, die an die Primer hybridisiert, die bei der Sequenzierung verwendet werden sollen (vorzugsweise unter „stringenten" Bedingungen). Dieser Teil kann einem gegebenen Molekül vor der Amplifikation unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken hinzugefügt werden (wobei das Molekül eine vollkommen/teilweise unbekannte Sequenz haben kann). Zum Beispiel kann es künstlich synthetisiert werden und unter Verwendung einer Ligase einem gegebenen Molekül hinzugefügt werden.
  • Sobald ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt ist, das an einen Primer angelagert ist, kann die Primerverlängerung durchgeführt werden. RNA- oder DNA-Polymerase können verwendet werden. DNA-Polymerasen sind jedoch für bevorzugten Ausführungsformen die Enzyme der Wahl. Einige von diesen sind kommerziell erhältlich. Polymerasen, die keine 3'-5'-Exonukleaseaktivität besitzen, wie T7 DNA-Polymerase oder das kleine (Klenow) Fragment der DNA-Polymerase I, können verwendet werden [z.B. die modifizierte T7 DNA-Polymerase SequenaseTM 2.0 (Amersham) oder das Klenow-Fragment (3'-5' exo-, New England Biolabs)]. Jedoch ist es nicht essentiell, solche Polymerasen zu verwenden. In der Tat würden, wenn es erforderlich ist, dass Polymerasen eine Kontrollleseaktivität haben, Polymerasen, die keine 3'-5'-Exonukleaseaktivität haben, nicht verwendet werden. Bestimmte Anwendungen können die Verwendung von thermostabilen Polymerasen wie ThermoSequenaseTM (Amersham) oder TaquenaseTM (ScienTech, St Louis, MO) erfordern. Jedes Nukleotid kann für die Primerverlängerungs-Reaktion verwendet werden (ob natürlich vorkommend oder nicht natürlich vorkommend). Bevorzugte Nukleotide sind Desoxyribonukleotide; dATP, dTTP, dGTP und dCTP (obwohl für einige Anwendungen das dTTP-Analog dUTP bevorzugt wird) oder Ribonukleotide ATP, UTP, GTP, CTP; wobei wenigsten einige davon in markierter Form bereitgestellt werden.
  • Vorzugsweise wird nach jeder Primerverlängerung ein Waschschritt eingefügt, um nicht eingebaute Nukleotide, die folgende Schritte stören können, zu entfernen. Die bevorzugte Waschlösung sollte mit der Polymeraseaktivität kompatibel sein und eine Salzkonzentration aufweisen, die nicht mit der Anlagerung der Primermoleküle an die zu sequenzierenden Nukleinsäuremoleküle interferiert. (In weniger bevorzugten Ausführungsformen kann die Waschlösung die Polymeraseaktivität stören). Hier würde die Waschlösung vor einer weiteren Primerverlängerung entfernt werden müssen).
  • In Anbetracht dessen, dass viele Kopien von zu sequenzierenden Molekülen in einer gegebenen Kolonie bereitgestellt werden können, kann eine Kombination von markierten und unmarkierten Nukleotiden verwendet werden. In diesem Fall kann, sogar wenn ein kleines Verhältnis der Nukleotide markiert ist (z.B. fluoreszenzmarkiert), die Anzahl der Markierungen, die während der Primerverlängerung in jede Kolonie eingebaut wird, ausreichend sein, um von einer Detektionsvorrichtung detektiert zu werden. Zum Beispiel kann das Verhältnis von markierten zu nicht markierten Nukleotiden so ausgewählt sein, dass durchschnittlich in weniger als 50%, weniger als 20%, weniger als 10% oder sogar weniger als 1% der Zeit markierte Nukleotide bei der Primerverlängerung verwendet werden (d.h. in einem gegebenen Primerverlängerungsschritt wird ein Nukleotid in markierter Form durchschnittlich in weniger als 50%, weniger als 20%, weniger als 10% oder weniger als 1% der verlängerten Primer eingebaut.)
  • Daher wird in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen bereitgestellt, die in einer Kolonie der vorliegenden Erfindung vorhanden sind, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • a) Bereitstellen von wenigstens einer Kolonie enthaltend eine Vielzahl von einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen, die untereinander dieselben Sequenzen haben und die in einer Weise an Primer hybridisiert sind, um Primerverlängerung in der Gegenwart von Nukleotiden und einer Nukleinsäurepolymerase zu erlauben;
    • b) Bereitstellen besagter wenigstens einer Kolonie mit einer Nukleinsäurepolymerase und einem gegebenen Nukleotid in markierter und unmarkierter Form unter Bedingungen, die die Verlängerung des Primers erlauben, wenn eine komplementäre Base oder eine Vielzahl solcher Basen an der angemessenen Position in dem einzelsträngigen Nukleinsäuremolekül ist, das in besagter wenigsten einer Kolonie vorhanden ist;
    • c) Detektion, ob besagtes markiertes Nukleotid für die Primerverlängerung verwendet wurde oder nicht mittels Bestimmung, ob die an besagtem Molekül vorhandene Markierung in die verlängerten Primer eingebaut wurde;
    Schritte b) und c) können ein oder mehrere Male wiederholt werden. Vorzugsweise wird eine Vielzahl von verschiedenen Kolonien bereitgestellt und einige verschiedene Sequenzen werden simultan bestimmt.
  • Diese weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um Kosten zu reduzieren, da relativ wenige markierte Nukleotide benötigt werden. Es kann ebenfalls zur Reduktion von Quenching-Effekten verwendet werden.
  • Es ist jedoch ebenfalls möglich, nur markierte Nukleotide für die Primerverlängerung zu verwenden oder einen Großteil davon zu verwenden (z.B. können über 50%, über 70%, oder über 90% der verwendeten Nukleotide markiert sein). Dies kann zum Beispiel durchgeführt werden, wenn die Markierungen so ausgewählt sind, um Quenching-Effekte zu verhindern oder zu reduzieren. Alternativ können Markierungen in verschiedenen Stufen entfernt oder neutralisiert werden, falls Quenching-Effekte problematisch werden sollten (z.B. kann ein Laser-Bleichen von Fluorophoren durchgeführt werden). Jedoch kann dies die Anzahl der Schritte erhöhen, die benötigt werden, und daher werden die Markierungen in bevorzugter Weise nicht entfernt (oder wenigstens werden sie nicht entfernt, nachdem jedes Nukleotid eingebaut wurde, sondern sie werden nur periodisch entfernt). In anderen weniger bevorzugten Ausführungsformen können der Primer selbst und sein Verlängerungsprodukt entfernt werden und mit einem anderen Primer ersetzt werden. Wenn erforderlich, können einige Schritte der sequentiellen Zugabe von markierungsfreien Nukleotiden durchgeführt werden, bevor die eigentliche Sequenzierung in der Gegenwart von markierten Nukleotiden fortgeführt wird. Eine weitere Alternative ist die Verwendung eines vom anfangs verwendeten unterschiedlichen Typs von Markierung (z.B. durch Umschalten von Fluorescein zu Rhodamin), wenn Quenching-Effekte problematisch werden sollten.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine Vielzahl von markierten Basen während des Sequenzierens in einen verlängerten Primer eingebaut. Dies ist vorteilhaft, da es die Sequenzierungsprozedur relativ zu Verfahren beschleunigen kann, in denen, sobald eine markierte Base in einen verlängerten Primer eingebaut wurde, die Markierung entfernt werden muss, bevor eine weitere markierte Base eingeführt werden kann.
  • (Die Vielzahl der markierten Basen kann in der Form von einem oder mehreren zusammenhängenden Strecken vorliegen, obwohl dies nicht essentiell ist).
  • Die vorliegende Erfindung schließt daher ebenfalls ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen in ihrem Umfang ein, das die Schritte umfasst:
    • a) Verwendung einer ersten Kolonie, um eine Vielzahl von einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen bereitzustellen, die untereinander dieselbe Sequenz haben und die in einer Weise an Primer hybridisiert sind, die Primerverlängerung in der Gegenwart von Nukleotiden und einer Nukleinsäurepolymerase erlauben;
    • b) Verwendung einer zweiten Kolonie, um eine Vielzahl von einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen bereitzustellen, die untereinander dieselbe Sequenz haben und die ebenfalls in einer Weise an Primer hybridisiert sind, die Primerverlängerung in der Gegenwart von Nukleotiden und einer Nukleinsäurepolymerase erlauben;
    • c) Bereitstellen einer Nukleinsäurepolymerase und eines gegebenen markierten Nukleotids an jede Kolonie unter Bedingungen, die die Verlängerung der Primer erlaubt, wenn eine komplementäre Base oder eine Vielzahl von solchen Basen an der angemessenen Position in den einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen vorhanden ist;
    • d) Detektion, ob besagtes markiertes Nukleotid für die Primerverlängerung bei jeder Kolonieverwendet wurde oder nicht durch Bestimmung, ob die an besagtem Nukleotid vorhandene Markierung in die verlängerten Primer eingebaut wurde oder nicht; Wiederholung der Schritte c) und d) für ein oder mehrere Mal(e), so dass verlängerte Primer bereitgestellt werden, die eine Vielzahl von Markierungen umfassen.
  • Vorzugsweise sind die Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle, die an besagter erster und besagten Stellen vorhanden sind, unterschiedlich voneinander – d.h. es wird eine Vielzahl von Kolonien sequenziert, die verschiedene Nukleinsäuremoleküle umfassen.
  • In Anbetracht der vorstehenden Beschreibung wird eingesehen werden, dass eine große Anzahl von verschiedenen Sequenzierverfahren unter Verwendung der Kolonien der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Verschiedene Detektionssysteme können verwendet werden, um Markierungen, die beim Sequenzieren in diesen Verfahren verwendet werden, zu detektieren (obwohl in bestimmten Ausführungsformen die Detektion durch alleinige Betrachtung möglich ist, so dass kein Detektionssystem benötigt wird). Ein bevorzugtes Detektionssystem für fluoreszierende Markierungen ist eine Kamera mit Ladungsspeicherbaustein (CCD), die optional an eine Vergrößerungseinrichtung gekoppelt werden kann. Jede andere Vorrichtung, die die Detektion und, vorzugsweise, die Quantifizierung von Fluoreszenz auf einer Oberfläche ermöglicht, kann verwendet werden. Vorrichtungen wie Fluoreszenzimager oder konfokale Mikroskope können ausgewählt werden.
  • In weniger bevorzugten Ausführungsformen können die Markierungen radioaktiv sein und eine Vorrichtung zur Detektion von Radioaktivität würde dann benötigt. Idealerweise wären solche Vorrichtungen Echtzeit-Bildgebungssysteme für Radioaktivität. Weiterhin weniger bevorzugt sind andere Vorrichtungen, die auf Phosphorschirmen (Molecular Dynamics) oder Autoradiographiefilmen für die Detektion beruhen.
  • Abhängig von der Anzahl der Kolonien, die überwacht werden sollen, kann ein Scann-System für die Datensammlung bevorzugt werden. (Obwohl es eine Alternative ist, eine Vielzahl von Detektoren bereitzustellen, um es zu ermöglichen, alle Kolonien abzudecken). Solch ein System erlaubt es, dass sich ein Detektor relativ zu einer Vielzahl von Kolonien, die analysiert werden sollen, bewegt. Dies ist nützlich, wenn alle Kolonien, die Signale bereitstellen, sich nicht innerhalb des Sichtfelds eines Detektors befinden. Der Detektor kann in einer fixierten Position gehalten werden und die zu analysierenden Kolonien können in das Sichtfeld des Detektors bewegt werden (z.B. mittels einer bewegbaren Plattform). Alternativ können die Kolonien in einer fixierten Position gehalten werden und die Detektionsvorrichtung kann bewegt werden, um diese in ihr Sichtfeld zu bringen.
  • Das Detektionssystem wird vorzugsweise in Kombination mit einem Analysesystem verwendet, um die Anzahl (und vorzugsweise auch die Art) der Basen zu bestimmen, die durch die Primerverlängerung nach jedem Schritt in jede Kolonie eingebaut wurden. Diese Analyse kann direkt nach jedem Schritt oder später unter Verwendung aufgezeichneter Daten durchgeführt werden. Die Sequenz der Nukleinsäuremoleküle, die innerhalb einer gegebenen Kolonie vorhanden sind, kann dann aus der Anzahl und dem Typ der hinzugefügten Nukleotide nach jedem Schritt abgeleitet werden.
  • Vorzugsweise ist das Detektionssystem Teil einer Vorrichtung, die andere Komponenten umfasst. Die vorliegende Erfindung schließt eine Vorrichtung ein, die eine Vielzahl von markierten Nukleotiden, eine Nukleinsäure-Polymerase und Detektionsmittel für die Detektion von markierten Nukleotiden umfasst, wenn diese mittels Primerverlängerung in ein Nukleinsäuremolekül eingebaut wurden, wobei die Detektionsmittel daran angepasst sind, zwischen Signalen zu unterscheiden, die von markierten Nukleotiden bereitgestellt werden, die in verschiedene Kolonien eingebaut wurden.
  • Die Vorrichtung kann ebenfalls Mittel zur Temperaturkontrolle, zur Lösungsmittelzuleitung und zum Waschen einschließen. Sie kann automatisiert sein.
  • Verfahren und Vorrichtungen, die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind, können verwendet werden beim Sequenzieren von:
    • • Unidentifizierten Nukleinsäuremolekülen (d.h. de novo Sequenzierung) und
    • • Nukleinsäuremolekülen, die sequenziert werden sollen, um zu überprüfen, ob ein oder mehrere Unterschied(e) relativ zu einer bekannten Sequenz vorhanden sind (z.B. Identifizierung von Polymorphismen). Dies wird manchmal als „Re-Sequenzierung" bezeichnet
  • Sowohl die de novo Sequenzierung als auch das Re-Sequenzieren werden später in größerem Detail diskutiert (siehe die folgenden Sektionen (v) und (vi)).
  • Für Anwendungen bei der de novo Sequenzierung kann die Reihenfolge der Nukleotide, die auf eine gegebene Stelle angewendet werden, wie gewünscht ausgewählt werden. Zum Beispiel kann man die sequentielle Zugabe der Nukleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP; dATP, dTTP, dGTP, dCTP und so weiter wählen. (Im Allgemeinen würde eine einzelne Reihenfolge von vier Nukleotiden wiederholt, obwohl dies nicht essentiell ist). Für die Re-Sequenzierungsanwendungen wird die Reihenfolge der Nukleotide, die bei jedem Schritt zugegeben werden, vorzugsweise gemäß der bekannten Sequenz ausgewählt.
  • Die Re-Sequenzierung kann für die Analyse einer großen Anzahl von ähnlichen Matrizenmolekülen besonders interessant sein, um Sequenzunterschiede zu detektieren und zu identifizieren (z.B. für die Analyse von rekombinanten Plasmiden bei Kandidatenklonen nach der stellengerichteten Mutagenese, oder noch wichtiger für das Screening einer Population auf Polymorphismen hin). Unterschiede zu einer gegebenen Sequenz können über das Fehlen des Einbaus von einem oder mehreren Nukleotiden detektiert werden, die in einer gegebenen Sequenz in bestimmten Phasen der Primerverlängerung vorhanden sind. Im Gegensatz zu am gewöhnlichsten verwendeten Techniken erlaubt die vorliegende Erfindung die Detektion jedes Mutationstyps wie Punktmutationen, Insertionen oder Deletionen. Weiterhin können nicht nur bekannte bestehende Mutationen, sondern auch zuvor unbekannte Mutationen durch die Bereitstellung der Sequenzinformation charakterisiert werden.
  • In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es nötig sein, lange Nukleinsäuremoleküle mittels mehrerer Sequenzierungsreaktionen zu sequenzieren, wobei jede die Bestimmung eines Teils der Gesamtsequenz erlaubt. Diese Reaktionen können bei verschiedenen Kolonien durchgeführt werden (wobei die verschiedenen Kolonien alle mit denselben Nukleinsäuremolekülen, die sequenziert werden sollen, aber mit unterschiedlichen Primern bereitgestellt werden), oder in aufeinanderfolgenden Zyklen mit dergleichen Kolonie (wobei zwischen jeden Zyklen die Primer und Verlängerungsprodukte heruntergespült und durch verschiedene Primer ersetzt werden).
  • (iv) DNA-Fingerprinting
  • Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zielt auf die Lösung des Problems des Screenings einer großen Population für die Identifikation von gegebenen Eigenschaften gegebener Gene, wie bei der Detektion von Polymorphismen einzelner Nukleotide.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform besteht sie in der Generation von getaggter genomischer DNA (siehe Abschnitt G(ii) oben). (Daher wurde jede Probe, die von einer gegebenen individuellen Probe abstammt, mit einem einzigartigen Tag markiert). Diese getaggte DNA kann für die Erzeugung von primären Kolonien auf einer geeigneten Oberfläche, die immobilisierte Primer umfasst, verwendet werden. Mehrere aufeinanderfolgende Sonden-Hybridisierungs-Assays können dann mit den Kolonien durchgeführt werden. Zwischen jedem Assay kann die vorhergehende Sonde, z.B. durch thermale Denaturierung und Waschen, entfernt werden.
  • Vorteile dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gegenüber anderen Ansätzen zur Lösung dieses Problems werden im folgenden Beispiel einer möglichen praktischen Anwendung illustriert.
  • Es soll detektiert werden, welcher Teil eines Gens (von z.B. 2000 Basen Größe), wenn überhaupt, mit einem Krankheitsphänotyp in einer Population von typischerweise 1,000 bis 10,000 Individuen verbunden ist. Für jedes Individuum kann eine PCR durchgeführt werden, um spezifisch das interessierende Gen zu amplifizieren und einen Tag und einen Kolonie-Erzeugungsprimer (siehe Abschnitt G(iv), Herstellung von „getaggter DNA") daran zu binden.
  • Um einen repräsentativen Proben-Array zu erhalten, könnte man zufällig 500,000 Kolonien (d.h. eine 10-fache Redundanz, um nur eine kleine Wahrscheinlichkeit zu haben, die Detektion einer Probe auszulassen) anordnen. Bei einer Koloniedichte von 10,000 Kolonien pro mm2 kann eine Oberfläche von –7 mm × 7 mm verwendet werden. Dies ist eine viel kleinere Oberfläche als bei jeder anderen derzeit verfügbaren Technik (z.B. verwendet der HySeq Ansatz 220 mm × 220 mm für dieselbe Anzahl von Proben (50,000) ohne Redundanz). Die Menge an Reaktionspartnern (ein Großteil der Kosten) ist proportional zu der durch den Proben-Array belegten Oberfläche. Daher kann die vorliegende Erfindung eine 800-fache Verbesserung gegenüber der derzeit verfügbare Technologie bereitstellen.
  • Unter Verwendung einer Vorrichtung, um das Resultat der ,in situ' Sequenzierung oder der Sonden-Hybridisierungs-Assays zu überwachen, sollte es im Bereich von 1 bis 10 Sekunden dauern, ein fluoreszierendes Signal von Kolonien darzustellen, die unter Verwendung von Fluoreszenz auf einer Oberfläche von –1 mm2 einem Assay unterzogen werden. Daher benötigt es unter der Annahme, dass der Engpass beim Verfahren die für die Darstellung des Resultats benötigte Zeit ist, im Bereich von 10 Minuten, um das Resultat eines Assays von 50,000 Proben (500,000 Kolonien) darzustellen. Um 200 Assays inklusive der Darstellung (auf einem oder mehreren 7 mm × 7 mm Oberflächen) unter Verwendung der vorliegenden Erfindung bereitzustellen, kann es weniger als 36 Stunden dauern. Dies repräsentiert eine 20-fache Verbesserung verglichen mit dem besten derzeit bekannten Verfahren (HySeq gibt 30 Tage an, um eine vergleichbare Aufgabe zu erreichen).
  • Verbesserungen (Koloniedichten, die zehnmal höher sind und eine Darstellungszeit von 1 Sekunde) könnten einen viel höheren Durchsatz ermöglichen und schließlich könnte der schlussendlich erwartete Durchsatz ungefähr 200-mal schneller sein als die beste, bisher noch nicht vollständig demonstrierte Technologie, die derzeit verfügbar ist.
  • Ein anderer Vorteil der Verwendung der vorliegenden Erfindung liegt in der Tatsache, dass sie das Problem überwindet, das bei Individuen auftritt, die heterozygote Mutationen für ein gegebenes Gen haben. Während dieses Problem mittels existierender Sequenzierungsverfahren angegangen werden kann, um allelische Polymorphiosmen zu bestimmen, können derzeitige Hochdurchsatz-Detektionsverfahren, die auf Oligonukleotidsondenhybridisierung basieren, zu Schwierigkeiten bei der Interpretation der Resultate wegen einer ungleichen Hybridisierung der Proben in den Fällen von allelischen Polymorphismen führen, wodurch Fehler auftreten können. In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entsteht jede Kolonie aus einer einzelnen Kopie eines amplifizierten, interessierenden Gens. Wenn ein Mittel von 10 Kolonien für jeden individuellen Locus erzeugt wird, gibt es ein Mittel von 5 Kolonien, die zu einer Version eines Gens korrespondieren und 5 Kolonien, die zu der anderen Version des Gens korrespondieren. Daher können heterozygote Mutationen anhand der Anzahl der Male ausgezählt werden, in denen ein einzelnes Allel pro individueller Genomprobe detektiert wird.
  • (v) DNA-Re-Sequenzierung
  • Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt eine Lösung für das Problem der Identifizierung und Charakterisierung neuer allelischer Polymorphismen innerhalb bekannter Gene in großen Populationen biologischer Proben bereit.
  • In seiner bevorzugten Ausführungsform besteht sie im Erhalten einer getaggten DNA (jede Probe, die von einem gegebenen Individuum abstammt, wurde mit einem einzigartigen Tag getaggt – siehe Abschnitt G(iv)). Diese kodierte DNA kann dann verwendet werden, um primäre Kolonien auf einer geeigneten Oberfläche zu erzeugen, die immobilisierte Primer umfasst. Mehrere sukzessive Assays auf die Hybridisierung der Sonde an die Kolonien hin können dann durchgeführt werden, wobei zwischen jedem zyklischen Assay die vorherige Sonde mittels thermaler Denaturierung und Waschen entfernt werden kann. Vorzugsweise kann die DNA Sequenz 3' zu einer spezifischen Sonde direkt mittels ,in situ Sequenzierung' bestimmt werden (Abschnitt I(iii), Verfahren der Sequenzierung).
  • Die Vorteile der vorliegenden Erfindung gegenüber anderen Ansätzen zur Lösung dieses Problems werden im folgenden Beispiel für die potentielle praktische Anwendung illustriert: Es soll die Variabilität der Sequenz eines Gens (von z.B. 2000 Basen-Größe), wenn vorhanden, in einer Population von typischerweise 4000 Individuen bestimmt werden. Es wird angenommen, dass eine Referenzsequenz des Gens bekannt ist. Für jedes Individuum kann eine PCR-Amplifikation durchgeführt werden, um das interessierende Gen spezifisch zu amplifizieren und einen Tag und einen Kolonie-Erzeugungsprimer daran zu binden. Um einen repräsentativen Probenarray zu erhalten, kann man zufällig 40000 Kolonien (d.h. eine 10-fache Redundanz, um nur eine kleine Wahrscheinlichkeit zu haben, die Detektion einer Probe auszulassen) anordnen. Bei einer Koloniedichte von 10,000 Kolonien pro mm2 kann eine Oberfläche von ~2 mm × 2 mm verwendet werden.
  • Unter Verwendung einer Vorrichtung mit einer CCD-Kamera (mit einem 2000 × 2000 Pixelchip), um die Ergebnisse des Assays zu überwachen, sollte es im Bereich von 10 Sekunden dauern, ein fluoreszierendes Signal von den Kolonien auf einer Oberfläche von 4 mm2 darzustellen. Wenn es als möglich angenommen wird, wenigstens 20 Basen während einer Runde des Assays auszulesen, benötigt dies 61 Darstellungsschritte (3n + 1 Darstellungsschritte sind für das Lesen von einer Anzahl von n Basen nötig). Wenn angenommen wird, dass der Engpass des Verfahrens die Zeit ist, das Resultat des Arrays darzustellen, dauert es im Bereich von 15 Minuten, um das Ergebnis eines Assays von 4000 Proben (40000 Kolonien) darzustellen. Um 100 Assays zu realisieren (eine oder mehrere 2 × 2mm2 Oberfläche(n)), um das gesamte interessierende Gen abzudecken, kann es die vorliegende Erfindung erlauben, das gesamte Screening-Experiment mit einer Vorrichtung in ungefähr einem Tag durchzuführen. Dies kann mit den leistungsfähigsten, derzeit betriebsfähigen Systemen verglichen werden.
  • In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung könnte bei konservativen Annahmen (Koloniedichte, Darstellungszeit, Größe des CCD-Chips) ein Durchsatz von 3.2 × 106 Basen pro Stunde erreicht werden, d.h. eine 400-fache Verbesserung verglichen mit den leistungsfähigsten derzeit am gebräuchlichsten verwendeten Systemen (derzeitige DNA-Sequenzierer haben typischerweise einen Durchsatz im Bereich von 8,000 Basen-Auslesungen/Stunde).
  • (vi) de novo DNA-Sequenzierung
  • Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zielt darauf ab, das Problem der Sequenzierung von neuen Genomen (oder Teilen davon) mit niedrigen Kosten und in kurzer Zeit zu lösen, wenn die DNA-Sequenz nicht bekannt ist. Genomische DNA kann entweder direkt aus der Gesamt-DNA eines interessierenden Organismus oder aus einem Vektor präpariert werden, in den DNA inseriert wurde. Die präparierte genomische DNA (aus welcher Quelle auch immer) kann verwendet werden, um DNA-Kolonien zu erzeugen. Die DNA-Kolonien können dann mit selten schneidenden Restriktionsenzymen verdaut werden, deren Stelle im Linker enthalten ist, denaturiert und sequenziert werden.
  • 16 stellt ein Beispiel der de novo DNA-Sequenzierung dar. In diesem Beispiel wird DNA in Teile von 100 bis 2000 Basenpaaren fragmentiert (siehe Vorbereitung von zufälligen DNA-Fragmenten, Abschnitt G(ii)). Diese Fragmente werden in die Oligonukleotid-Linker (IIa und IIb, 16a) ligiert, die Sequenzen enthalten, die spezifisch für die in die Oberfläche eingebauten Primer (,P1' und ,P2') sind, eine Sequenz, die von einer selten schneidenden Restriktionsendonuklease (,RE') erkannt wird und eine Sequenz, die zu einem Sequenzierungs-Primer (,SP') korrespondiert, was in Matrizen resultiert (III, 16b). Unter Verwendung dieser vorbereiteten DNA als Matrize für die DNA-Koloniebildung erhält man primäre Kolonien (IV, 16c). Diese Kolonien werden dann mit den korrespondierenden Restriktionsendonukleasen verdaut und denaturiert, um den nicht anhängenden DNA-Strang zu entfernen (V, 16d). Der Sequenzierungs-Primer (SP) wird dann an die anhängende einzelsträngige Matrize angelagert (16a). Der Einbau und die Detektion von markierten Nukleotiden kann dann wie zuvor beschrieben ausgeführt werden (seihe Abschnitt I(iii), Verfahren zur Sequenzierung).
  • In dieser Ausführungsform kann der erreichbare Durchsatz wenigstens 400-fach höher sein als bei derzeitig verfügbaren Verfahren.
  • (vii) mRNA Gen-Expressions-Überwachung
  • Diese Ausführungsform unserer Erfindung soll das Problem der gleichzeitigen Überwachung der Expression einer großen Anzahl von Genen lösen.
  • Ihre bevorzugte Ausführungsform wird in 17 gezeigt.
  • Als erstes werden primäre Kolonien wie in 3 gezeigt vorbereitet. In ihrer bevorzugten Ausführungsform ist die für diese Vorbereitung verwendete DNA vorbereitete genomische DNA' oder ,getaggte genomische DNA', wie in Abschnitt G(i) bzw. G(iii) beschrieben und wobei die DNA entweder aus dem gesamten Genom eines (oder verschiedener) Organismus/Organismen oder aus einer Untermenge davon stammt (z.B. aus einer Bibliothek zuvor isolierter Gene). Die Großbuchstaben „A", „B", und „D" in 17 repräsentieren Kolonien, die aus Genen entstanden sind, die hohe, mittlere bzw. niedrige Expressionslevel aufweisen und „E" repräsentiert Kolonien, die aus nicht-exprimierten Genen entstanden sind (in realen Fällen müssen alle diese Situationen nicht notwendigerweise simultan auftreten).
  • Zweitens werden die Kolonien behandelt, um sie dann, wie in Abschnitt E beschrieben, in Träger (d.h. sekundäre Primer) für das sekundäre Kolonienwachstum zu verwandeln (Schritt i in 17a). in dieser Phase (17b) werden die behandelten Kolonien durch unterstrichene Buchstaben (A, B, D, oder E) repräsentiert.
  • Drittens wird dieser Träger für das sekundäre Koloniewachstum verwendet, um, wie in Abschnitt C beschrieben, Kolonien aus mRNA- (oder cDNA-) Matrizen, die aus einer biologischen Probe extrahiert wurden, zu regenerieren (Schritt ii in 17b). Wenn die Matrize mRNA ist, wird der Primingschritt der Kolonieregeneration mit Reverser-Transkriptase durchgeführt werden. Nach einer gegebenen Anzahl von Kolonie-Amplifikationszyklen, vorzugsweise 1 bis 50, wird die Situation wie in (17c) dargestellt sein: die zu den hochexprimierten Genen korrespondierenden Kolonien (repräsentiert durch den Buchstaben „A") sind komplett regeneriert, da ihre Regeneration durch viele mRNA-Kopien initiiert wurde; die Kolonien, die zu den Genen mit mittleren Expressionslevels korrespondieren (repräsentiert durch die Buchstaben „b" und „B"), wurden nur teilweise regeneriert; nur wenige der Kolonien, die zu seltenen Genen (repräsentiert durch den Buchstaben „d") korrespondieren, wurden teilweise regeneriert; die Kolonien, die zu nicht-exprimierten Sequenzen (repräsentiert durch den Buchstaben „E") korrespondieren, wurden überhaupt nicht regeneriert.
  • Letztlich werden zusätzliche Zyklen des Koloniewachstums durchgeführt (Schritt iii in 17c) (vorzugsweise 2 bis 50) und die Kolonien, die noch nicht komplett während der vorigen Schritte regeneriert wurden, werden komplett regeneriert, „b" wird „B", „d" wird „D" (17d): die Kolonien, die zu Genen mit hoher und mittlerer Expression korrespondieren werden alle regeneriert „A" und „B" oder „B"; die Kolonien, die zu Genen mit niedrigen Expressionsleveln korrespondieren werden nicht alle regeneriert „D" und „D"; die Kolonien, die zu nicht-exprimierten Sequenzen korrespondieren, werden überhaupt nicht regeneriert „E".
  • Die relativen Expressionslevel der Gene können durch die folgenden bevorzugten Verfahren erhalten werden:
    • – Erstens können die Expressionslevel durch Verfolgen der Rate der Regeneration der Kolonien überwacht werden (d.h. durch Messung der Menge an DNA, die nach unterschiedlicher Anzahl von Koloniewachstumszyklen während Schritt (iii) innerhalb einer Kolonie vorhanden ist, da die Rate, mit der eine Kolonie regeneriert wird mit der Anzahl der mRNA- (oder cDNA-) Moleküle verbunden ist, die die Regeneration dieser Kolonie initiierte (bei einer ersten Annäherung sollte die Anzahl der DNA-Moleküle nach n Zyklen, geschrieben M(n), in einer Kolonie, die eine Regeneration durchmacht, durch M(n) = M0r(n-1) gegeben sein, wobei M0 die Anzahl der Moleküle ist, die die Regeneration der Kolonie initiierte, r die Wachstumsrate ist und n die Anzahl der Zyklen ist);
    • – Zweitens können die Expressionslevel durch Auszählen der Anzahl der Kolonien für jedes Gen, das regeneriert wurde, und Vergleichen dieser Anzahl mit der Gesamtzahl an Kolonien, die zu diesem Gen korrespondieren, überwacht werden. Diese Messungen werden im Allgemeinen Zugang zu den relativen Expressionslevel der durch die Kolonien repräsentierten Gene geben. Die Identifikation der Kolonien wird vorzugsweise durch Fingerprinting durchgeführt, in einer Weise, die im Wesentlichen ähnlich zu der Ausführungsform in Abschnitt I(iv) ist. Es ist zu beachten, dass ein Kodieren von DNA-Proben nicht erforderlich ist, aber als eine Alternative für die direkte Identifikation der DNA in den Kolonien in Betracht gezogen werden kann. Dies kann von praktischem Interesse sein, da mit dem Kodieren dieselben Kodierungen (daher dieselben Oligonukleotide, die in der Assay-Untersuchung der Kodierung involviert sind) für jeglichen Satz an Genen verwendet werden können, während ohne Kodierung ein unterschiedlicher Satz an Oligonukleotiden für jeden Satz von Genen verwendet werden muss.
  • Diese Ausführungsform unserer Erfindung hat viele Vorteile, wenn diese mit dem Stand der Technik verglichen wird, einschließlich: einen sehr hohen Durchsatz; kein Erfordernis für eine vorhergehende Amplifikation der mRNA (obwohl eine vorhergehende Amplifikation mit unserer Erfindung kompatibel ist); kleine Mengen an Proben und Reaktionspartnern werden wegen der hohen Dichte der Proben bei unserer Erfindung benötigt; das Vorhandensein von hochexprimierten Genen hat keinen Einfluss auf die Fähigkeit, Gene mit niedrigen Expressionsleveln zu überwachen; die Fähigkeit, simultan hohe und niedrige Expressionslevel innerhalb eines Satzes an interessierenden Genen zu überwachen.
  • Wenn die anfängliche DNA bei der Generation der primären DNA-Kolonie aus der DNA einer Gesamtgenoms hergestellt ist, kann diese Ausführungsform auch die folgenden Merkmale bereitstellen: es gibt keine Störung zwischen Genen, die mit hohen und niedrigen Levels exprimiert werden, obwohl man keine spezifische Amplifikation der interessierenden Gene durchgeführt hat. Dies ist ein einzigartiges Merkmal der Verwendung dieser Erfindung: die spezifische Amplifikation ist nicht möglich, da die anfängliche Vorraussetzung dieser Ausführungsform die Überwachung der exprimierten Gene ist, die noch nicht isoliert sein können und welche daher unbekannt sind und für welche daher keine spezifischen (einzigartigen) Sequenzen bekannt sind und wobei spezifische Sequenzen für die spezifische Gen-Amplifikation nötig sein würden. Die Fähigkeit unserer Erfindung, diesen Typ von mRNA-Expressions-Überwachung durchzuführen, liegt in der Tatsache begründet, dass, wenn die primären Kolonien vorbereitet werden, jedes Teil des anfänglichen Genoms statistisch gesehen durch die gleiche Anzahl von Kolonien repräsentiert sein wird. Daher wird häufige und seltene DNA die gleiche Anzahl von Kolonien initiieren (z.B. eine Kolonie pro zugegebenem DNA-Molekül). Quantitative Informationen können sowohl von häufigen als auch seltenen mRNAs durch Überwachung der Wachstumsrate der Kolonien erhältlich sein.
  • (viii) Isolierung und Charakterisierung neuer exprimierter Gene
  • Diese Ausführungsform unserer Erfindung soll das Problem der Isolierung der Gene lösen, die spezifisch unter gegebenen Bedingungen induziert werden, z.B. in spezifischen Geweben, verschiedenen Stämmen einer gegebenen Spezies oder bei spezifischer Aktivierung. Ein praktisches Beispiel ist die Identifizierung von Genen, die nach Wirkstoffverabreichung hoch- oder herunterreguliert sind.
  • Die bevorzugte Ausführungsform zur Isolierung von Genen aus einer spezifischen oder aktivierten biologischen Probe (hiernach Zielprobe genannt), die hochreguliert sind verglichen mit einer biologischen Referenzprobe (hiernach Referenzprobe genannt), wird in 18 gezeigt.
  • Erstens werden primäre Kolonien vorbereitet (18a). In ihrer bevorzugten Form ist die für diese Vorbereitung verwendete DNA vorbereitete genomische DNA oder getaggte genomische DNA, wie in Abschnitten G(i) bzw. G(iii) beschrieben, wobei die DNA entweder aus dem Gesamtgenom eines (oder mehrerer) Organismus/Organismen oder einer Untermenge davon stammt (z.B. aus einer Bibliothek von zuvor isolierten Genen) und wobei beide für die Kolonieerzeugung verwendeten Primer (hiernach P1 und P2 genannt) eine Endonuklease-Restriktionsstelle enthalten. In 18a repräsentiert „A" Kolonien, die aus Genen entstanden sind, die in sowohl der Referenzprobe als auch der Zielprobe enthalten sind, „B" repräsentiert Kolonien, die aus Genen entstanden sind, die nur in der Referenzprobe exprimiert werden, „C" repräsentiert Kolonien, die aus Genen entstanden sind, die nur in der Zielprobe exprimiert werden und „D" repräsentiert Kolonien, die aus nicht-exprimierten Genen entstehen (in realen Fällen müssen all diese Situationen nicht simultan auftreten).
  • Zweitens werden die primären Kolonien dann behandelt, um sekundäre Primer als Träger für das sekundäre Koloniewachstum zu erzeugen (Schritt i in 18a). In dieser Phase (b) werden die Kolonien durch unterstrichene Buchstaben (A, B, C, D) repräsentiert.
  • Drittens werden die sekundären Primer verwendet, um Kolonien unter Verwendung von mRNA oder cDNA (repräsentiert durch „mA + mB"), die aus der biologischen Referenzprobe, wie in G(v) beschrieben, als Matrize extrahiert wurden, zu regenerieren. Wenn die Matrize mRNA ist, wird der erste Verlängerungsschritt der Kolonieregeneration mit einer Reversen-Transkriptase durchgeführt. Nach genügend Koloniewachstumszyklen, vorzugsweise 5 bis 100, werden lediglich diejenigen Kolonien, die zu den in der Referenzprobe exprimierten Genen korrespondieren, wie in (18c) gezeigt, regeneriert.
  • In Schritt (iii) werden die Kolonien mit einem Restriktionsenzym (repräsentiert durch RE) verdaut, das eine Stelle in den flankierenden Primersequenzen P1 und P2 erkennt, die in den Träger eingebaut sind und die die Basis der primären Kolonieerzeugung darstellen. Wichtig ist es, dass nur die Kolonien, die während Schritt (ii) regeneriert wurden, verdaut werden. Dies ist so, da der Träger für das sekundäre Koloniewachstum aus einzelsträngigen Molekülen hergestellt ist, die nicht durch das Restriktionsenzym verdaut werden können. Nur die regenerierten Kolonien sind in der doppelsträngigen Form vorhanden und werden verdaut. Nach dem Verdau ist die Situation diejenige, die in 18d dargestellt ist. Die Kolonien, die zu den exprimierten Genen in der Referenzprobe korrespondieren, sind komplett verschwunden, d.h. sie sind noch nicht einmal als Träger für das sekundäre Koloniewachstum vorhanden und die Kolonien, die zu den Genen korrespondieren, die nur in der Zielprobe exprimiert werden „C" und die Kolonien, die zu den nicht-exprimierten Genen „D" korrespondieren, sind immer noch als Träger für die sekundäre Kolonieerzeugung vorhanden.
  • In Schritt (iv) wird mRNA (oder cDNA) (repräsentiert durch „mA + mC"), die aus der Zielprobe extrahiert wurde, verwendet, um die sekundären Kolonien zu erzeugen. Da es keine Kolonien mehr gibt, die zu mA oder mB korrespondieren, können lediglich die zu mC korrespondierenden Kolonien regeneriert werden (d.h. nur die mRNA, die spezifisch in der Zielprobe exprimiert wird). Nach einer ausreichenden Anzahl von Koloniewachstumszyklen (vorzugsweise 5 bis 100) ist die Situation so, dass nur diejenigen Kolonien, die zu Genen korrespondieren, die spezifisch in der Zielprobe exprimiert werden, regeneriert werden („C", 18e).
  • In Schritt (v) werden die regenerierten Kolonien „C" verwendet, um in der Gegenwart der Primer P1 und P2, wie in Sektion D der vorliegenden Erfindung beschrieben, mittels einiger (vorzugsweise 1 bis 20) Koloniewachstumszyklen Kopien der DNA zu erzeugen, die sie enthalten. Eine PCR-Amplifikation wird dann unter Verwendung der Primer P1 und P2 in Lösung durchgeführt (beschrieben in Abschnitt D) und die amplifizierte DNA wird mittels klassischer Verfahren charakterisiert.
  • Die bevorzugte Ausführungsform zur Isolierung von Genen aus einer spezifischen oder aktivierten biologischen Probe, die weniger exprimiert werden als in einer biologischen Referenzprobe, wird in 19 gezeigt. Die unterschiedlichen Schritte, die in diese Prozedur involviert sind, sind denen sehr ähnlich, die in die Isolierung eines Gens involviert sind, das stärker reguliert ist als in der Referenzprobe und die Notationen sind dieselben wie in 18. Der einzige Unterschied ist die umgekehrte Reihenfolge, die verwendet wird, um die Kolonien zu regenerieren: in Schritt (ii) ist die verwendete mRNA diejenige, die aus der biologischen Zielprobe extrahiert wurde („mA + mC") anstatt der mRNA, die aus der biologischen Referenzprobe („mA + mB") extrahiert wurde, und in Schritt (iv) ist die verwendete mRNA diejenige, die aus der biologischen Referenzprobe extrahiert wurde anstatt derjenigen, die aus der Zielprobe („mA + mC") extrahiert wurde. Als Ergebnis wird nur die DNA aus den Kolonien, die zu Genen korrespondieren, die in der Referenzprobe, aber nicht in der Zielprobe exprimiert werden, wiedergewonnen und amplifiziert („B", 19f). SEQUENZLISTE
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Claims (64)

  1. Verfahren zur Nukleinsäure-Amplifikation, umfassend die Schritte: A. Bereitstellen einer Vielzahl von immobilisierten Primern, bei denen jedoch ein Ende exponiert ist, um eine Primer-Verlängerung zu ermöglichen; B. Ermöglichen, dass sich ein einzelsträngiges Ziel-Nukleinsäuremolekül an einen der Vielzahl von Primern über einen Teil der Gesamtlänge des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls anlagert und anschließende Verlängerung des Primers unter Verwendung des angelagerten einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls als Matrize, so dass ein verlängerter immobilisierter Nukleinsäure-Strang bereitgestellt wird; C. Auftrennen des Ziel-Nukleinsäuremoleküls von dem verlängerten immobilisierten Nukleinsäurestrang; D. Ermöglichen, dass der verlängerte immobilisierte Nukleinsäurestrang sich an einen der in Schritt A) erwähnten Vielzahl von Primern anlagert und anschließende Verlängerung des Primers unter Verwendung des verlängerten immobilisierten Nukleinsäurestranges als Matrize, so dass ein weiterer verlängerter immobilisierter Nukleinsäure-Strang bereitgestellt wird und gegebenenfalls, E. Auftrennen der angelagerten verlängerten immobilisierten Nukleinsäurestränge voneinander, wobei die einzelsträngige Ziel-Nukleinsäure hergestellt wird, indem eine gegebene, zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz bereitgestellt wird (deren Sequenz bekannt oder unbekannt sein kann) und an dieser eine erste Nukleinsäuresequenz und eine zweite Nukleinsäuresequenz angeknüpft wird, wobei die erste Nukleinsäuresequenz an einen der Vielzahl von Primern hybridisiert und die zweite Nukleinsäuresequenz komplementär zu einer Sequenz ist, die an einen der Vielzahl von Primern hybridisiert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, zur Verwendung für die Amplifikation einer Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen.
  3. Verfahren zur Amplifikation unterschiedlicher Nukleinsäuremoleküle, umfassend die Schritte: A. Bereitstellen einer Vielzahl von zwei verschiedenartigen, immobilisierten Primern, bei denen jedoch ein Ende exponiert ist, um eine Primer-Verlängerung zu ermöglichen, wobei die Primer universelle Primer sind, die zur Amplifikation unterschiedlicher Nukleinsäuremoleküle verwendet werden können; B. Ermöglichen, dass sich ein einzelsträngiges Ziel-Nukleinsäuremolekül an einen der Primer über einen Teil der Länge des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls anlagert und anschließende Verlängerung des Primers unter Verwendung des angelagerten einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls als Matrize, so dass ein verlängerter immobilisierter Nukleinsäure-Strang bereitgestellt wird; C. Auftrennen des Ziel-Nukleinsäuremoleküls von dem verlängerten immobilisierten Nukleinsäurestrang; D. Ermöglichen, dass sich der verlängerte immobilisierte Nukleinsäurestrang an einen der in Schritt A) genannten Primer anlagert und anschließende Verlängerung des Primers unter Verwendung des verlängerten immobilisierten Nukleinsäurestranges als Matrize, so dass ein weiterer verlängerter immobilisierter Nukleinsäure-Strang bereitgestellt wird und gegebenenfalls, E. Auftrennen der angelagerten verlängerten immobilisierten Nukleinsäurestränge voneinander.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die einzelstränige Ziel-Nukleinsäure hergestellt wird, indem eine gegebene, zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz hergestellt wird (deren Sequenz bekannt oder unbekannt sein kann) und daran eine erste Nukleinsäuresequenz und eine zweite Nukleinsäuresequenz geknüpft wird, wobei die erste Nukleinsäuresequenz an den einen der Vielzahl von Primern hybridisiert und die zweite Nukleinsäuresequenz komplementär ist zu einer Sequenz, die an einen der Vielzahl von Primern hybridisiert.
  5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die unterschiedlichen Nukleinsäuremoleküle eine unbekannte Sequenz besitzen.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 4, wobei die erste Nukleinsäuresequenz an einen der Vielzahl von Primern hybridisiert und die zweite Nukleinsäuresequenz dieselbe ist wie die Sequenz von einem der Vielzahl von Primern.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 4 oder 6, wobei die ersten und zweiten Nukleinsäuresequenzen an den ersten und zweiten Enden der einzelsträngigen Ziel- Nukleinsäure bereitgestellt werden.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die einzelsträngige Ziel-Nukleinsäure hergestellt wird, indem DNA von einer biologischen Probe extrahiert, die DNA in Fragmente geschnitten und die Fragmente an Oligonukleotid-Linker ligiert werden, welche die Sequenz der in Schritt A) bereitgestellten Primer enthalten.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend: F. Verwendung von wenigstens einem verlängerten immobilisierten Nukleinsäurestrangs zur Wiederholung der Schritte D) und E), so dass weitere verlängerte immobilisierte Nukleinsäurestränge bereitgestellt werden, und gegebenenfalls, G. Ein- oder mehrmaliges Wiederholen von Schritt F).
  10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine tag-Markierung zu der gegebenen Nukleinsäuresequenz angefügt wird, wobei die tag-Markierung es erlaubt, dass die Amplifikationsprodukte der gegebenen Nukleinsäuresequenz identifiziert werden können.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Vielzahl von Primern eine Vielzahl von Primern ist, welche dieselbe Sequenz besitzen.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Vielzahl von Primern wenigstens zwei verschiedenartige Primer umfasst, wobei die eine Art eine andere Sequenz besitzt als die andere Art.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Vielzahl von Primern aus 2n unterschiedliche Arten von Primern besteht, wobei n eine ganze Zahl ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 12 oder 13, wobei die unterschiedlichen Arten von Primern in im Wesentlichen denselben Konzentrationen untereinander vorhanden sind.
  15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Primer im Wesentlichen homogen über einen gegebenen Bereich verteilt sind.
  16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Primer in einer vorbestimmten Anordnung lokalisiert sind (z.B. einem Raster).
  17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Vorrat an Nukleotiden und eine Nukleinsäure-Polymerase verwendet werden, um die Primer zu verlängern.
  18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die angelagerten Nukleinsäurestränge durch Erhitzen aufgetrennt werden.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem bei Abhängigkeit von Anspruch 17 die Nukleinsäure-Polymerase nicht durch die zur Auftrennung der angelagerten Nukleinsäurestränge verwendeten Erhitzungsbedingungen inaktiviert wird.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Nukleinsäure-Polymerase eine tag-Polymerase oder eine andere, von einem thermophilen Organismus stammende Polymerase oder ein thermostabiles Derivat davon ist.
  21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Primer-Verlängerung zum Einbau einer oder mehrerer nachweisbaren Markierungen in den verlängerten immobilisierten Nukleinsäuresträngen führt (z.B. Fluoreszenz-Markierungen oder radioaktive Markierungen).
  22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend den Schritt der Behandlung eines oder mehrerer verlängerten immobilisierten Nukleinsäurestränge, so dass ein Nukleinsäuremolekül oder ein Teil davon freigesetzt wird.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Behandlung aus einer Spaltung mit einer Restriktions-Endonuklease oder mit einem Ribozym besteht.
  24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei einer oder mehrere der Primer eine Restriktions-Endonuklease-Erkennungsstelle oder eine Ribozym-Erkennungsstelle oder einen Teil einer solchen Stelle besitzt, wobei dieser Teil vervollständigt wird, wenn eine Primer-Verlängerung durchgeführt wird.
  25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches automatisiert ist, um sich wiederholende Zyklen der Nukleinsäureamplifikation zu ermöglichen.
  26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zur Verwendung zur gleichzeitigen Amplifikation einer Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen.
  27. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 26, wobei die unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen jeweils mit einer ersten und zweiten wie in einem der Ansprüche 1, 4 oder 6 beschriebenen Nukleinsäuresequenz bereitgestellt werden, wobei die ersten und zweiten Nukleinsäuresequenzen für jede der unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen gleich sind.
  28. Verfahren nach Anspruch 26 oder Anspruch 27, wobei die unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen jeweils mit einer unterschiedlichen tag-Markierung versehen sind, so dass die unterschiedlichen Sequenzen voneinander unterschieden werden können.
  29. Getrennte Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuren in Form von getrennten Bereichen auf einer Oberfläche, wobei jeder Bereich eine Vielzahl von identischen Nukleinsäuresträngen und eine Vielzahl von identischen Komplementärsträngen dazu umfasst, wobei jeder Nukleinsäurestrang innerhalb eines solchen Bereichs so gelagert ist, dass ein weiterer Nukleinsäurestrang auf der Oberfläche mit einem der Länge des Stranges entsprechenden Abstand angeordnet ist, wobei verschiedene Bereiche aus verschiedenen amplifizierten Nukleinsäuresträngen und amplifizierten Komplementärsträngen dazu bestehen, wobei jedoch identische Sequenzen an den ersten und zweiten Enden jedes Nukleinsäurestranges in jedem Bereich bereitgestellt werden und identische Sequenzen an ersten und zweiten Enden der ersten komplementären Nukleinsäurestränge in jedem Bereich bereitgestellt werden.
  30. Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuren nach Anspruch 29, wobei es wenigstens einen getrennten Bereich pro mm2 Oberfläche gibt, auf dem die Nukleinsäuren immobilisiert sind.
  31. Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuren nach Anspruch 29, wobei die Anzahl der getrennten Bereiche/mm2 der Oberfläche, auf denen die Nukleinsäuren immobilisiert sind, größer als 1, größer als 102, größer als 103 oder größer als 104 ist.
  32. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder einer Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen nach einem der Ansprüche 29 bis 31 zur Bereitstellung von Nukleinsäuremolekülen zur Sequenzierung.
  33. Verwendung nach Anspruch 32, wobei die Sequenzierung durchgeführt wird durch Verlängerung von Primern, die an einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle hybridisiert sind und durch Nachweis der bei der Primer-Verlängerung verwendeten Nukleotiden.
  34. Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Sequenzierung stufenweise durchgeführt wird, wobei nach Verlängerung eines Primers durch ein einzelnes Nukleotid das Nukleotid nachgewiesen wird, bevor ein weiteres Nukleotid zur Primer-Verlängerung verwendet wird.
  35. Verwendung nach Anspruch 33 oder 34, wobei die Primer an dieselben Sequenzen hybridisieren wie die in dem Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 3 verwendeten Primer, so dass die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle zur Sequenzierung bereitgestellt werden.
  36. Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Primer dieselben Sequenzen besitzen wie die in dem Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 3 verwendeten Primer, um die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle zur Sequenzierung bereitzustellen.
  37. Verwendung nach Anspruch 32, wobei Nick-Stellen in den doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen bereitgestellt werden, eine Nick-Translation durchgeführt wird und die in der Nick-Translation verwendeten Nukleotide nachgewiesen werden.
  38. Verwendung nach Anspruch 32, wobei eine RNA-Polymerase verwendet wird, um einen RNA-Strang von einem DNA-Molekül zu synthetisieren und die zur Herstellung des RNA-Strangs verwendeten Nukleotide nachgewiesen werden.
  39. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 38, wobei alle oder wenigstens einige der Nukleotide markierte Nukleotide sind.
  40. Verwendung nach Anspruch 39, wobei die Nukleotide mit derselben Markierung markiert sind.
  41. Verwendung nach Anspruch 39 oder 40, wobei die markierten Nukleotide Fluoreszenzmarkiert sind.
  42. Verwendung nach einem der Ansprüche 39 bis 41, wobei ein Gemisch von markierten und nicht markierten Nukleotiden verwendet wird.
  43. Verwendung nach Anspruch 42, wobei die markierten Nukleotide weniger als 50 % der verwendeten Nukleotide umfassen.
  44. Verwendung nach Anspruch 43, wobei die markierten Nukleotide weniger als 10 % der verwendeten Nukleotide umfassen.
  45. Verwendung nach einem der Ansprüche 32 bis 44, wobei die Sequenzierung eine Parallel-Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen ist, die in wenigstens 2 unterschiedlichen getrennten Bereichen vorhanden sind.
  46. Verwendung nach einem der Ansprüche 32 bis 45, wobei die Sequenzierung eine Parallel-Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen ist, die in wenigstens 10 unterschiedlichen getrennten Bereichen vorhanden sind.
  47. Verwendung nach einem der Ansprüche 32 bis 45, wobei die Sequenzierung eine Parallel-Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen ist, die in wenigstens 100 unterschiedlichen getrennten Bereichen vorhanden sind.
  48. Verwendung nach einem der Ansprüche 32 bis 45, wobei die Sequenzierung eine Parallel-Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen ist, die in wenigstens 1000 unterschiedlichen getrennten Bereichen vorhanden sind.
  49. Verwendung nach einem der Ansprüche 32 bis 45, wobei die Sequenzierung eine Parallel-Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen ist, die in wenigstens 1000000 unterschiedlichen getrennten Bereichen vorhanden sind.
  50. Verwendung nach einem der Ansprüche 32 bis 45, wobei eine Vielzahl von unterschiedlichen Sequenzen parallel bestimmt wird.
  51. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder einer Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen nach einem der Ansprüche 29 bis 31 zur Bereitstellung von amplifizierten Nukleinsäuremolekülen zur Diagnose.
  52. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder einer Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen nach einem der Ansprüche 29 bis 31 zur Bereitstellung von amplifizierten Nukleinsäuremolekülen für ein Screening.
  53. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder einer Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen nach einem der Ansprüche 29 bis 31 zur Bereitstellung von amplifizierten Nukleinsäuremolekülen, die als Träger für andere Bestandteile verwendet werden.
  54. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder einer Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen nach einem der Ansprüche 29 bis 31 zur Herstellung weiterer Nukleinsäuremoleküle in freier (nicht immobilisierter) Form.
  55. Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 54 zur in situ – RNA-Synthese.
  56. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder einer Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen nach einem der Ansprüche 29 bis 31 zur Verfolgung der Genexpression.
  57. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder einer Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen nach einem der Ansprüche 29 bis 31 zur Identifizierung von Nukleinsäuremolekülen mit Genprodukten, die selten exprimiert werden.
  58. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder einer Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen nach einem der Ansprüche 29 bis 31 zur Identifizierung von heterozygoten Individuen.
  59. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder einer Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen nach einem der Ansprüche 29 bis 31 für einen Nukleinsäure-Fingerprint.
  60. Vorrichtung zur Analyse einer Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen nach einem der Ansprüche 29 bis 31, wobei die Vorrichtung eine Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 29 bis 31 eine Quelle von Recktanten und Nachweismittel zum Nachweis eines oder mehrerer Signale, die erzeugt wurden, nachdem die Recktanten auf die Nukleinsäuremoleküle angewendet wurden, umfasst.
  61. Vorrichtung nach Anspruch 60, wobei die Nachweismittel eine ausreichende Auflösung besitzen, um die in Anspruch 29 erwähnten getrennten Bereiche zu unterscheiden.
  62. Vorrichtung nach Anspruch 60 oder 61, umfassend einen ladungsgekoppelten Speicher (CCD).
  63. Vorrichtung nach Anspruch 62, wobei der ladungsgekoppelte Speicher (CCD) mit einer Vergrößerungsvorrichtung (z.B. einem Mikroskop) operabel verbunden ist.
  64. Kit zur Verwendung bei einem Screening, einer Diagnose oder zur Nukleinsäuresequenzierung, umfassend eine Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 29 bis 31.
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