DE69833856T2

DE69833856T2 - Verfahren zur bestimmung von nukleinsäuresequenzen in urin

Info

Publication number: DE69833856T2
Application number: DE69833856T
Authority: DE
Inventors: Anatoly V. Moscow LICHTENSTEIN; S. Hovsep Albany MELKONYAN; R. Samuil Richmond UMANSKY
Original assignee: Xenomics Inc
Current assignee: Cardiff Oncology Inc
Priority date: 1997-05-30
Filing date: 1998-05-29
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2018-05-30
Also published as: ES2355631T3; ATE486958T1; ES2389055T3; ATE320505T1; AU7703998A; DE69833856D1; EP0920539B9; ATE557103T1; PT2216416E; EP2216416A1; EP0920539A4; DE69841989D1; EP0920539A1; US6287820B1; CY1113124T1; EP2216416B1; DK0920539T3; HK1088363A1; WO1998054364A1; EP0920539B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft nicht-invasive Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens spezifischer Nucleinsäure-Sequenzen durch Analysieren von Urinproben auf das Vorliegen von Nucleinsäuren, die die Nierenschranke durchquert haben, und sie betrifft insbesondere Verfahren zum Nachweisen spezifischer fetaler Nucleinsäure-Sequenzen durch Analysieren von mütterlichem Urin auf das Vorliegen fetaler Nucleinsäuren. Die Erfindung umfasst Verfahren zum Nachweisen spezifischer Nucleinsäure-Veränderungen zur Diagnose von Erkrankungen wie Krebs.
Menschliches genetisches Material ist eine Informationsquelle von unschätzbarem Wert. Im Laufe der letzten Jahrzehnte hat wissenschaftliches Bemühen viele Verfahren zum Analysieren und Manipulieren dieses genetischen Materials (Nucleinsäuren, DNA und RNA) für eine Vielfalt von Anwendungen entwickelt. Diese Anwendungen der Molekularbiologie waren der Kern zahlreicher moderner medizinischer Techniken zur Diagnose und Behandlung. Daher wurden Mittel zum Erhalten, Isolieren und Analysieren dieses genetischen Materials von herausragender Bedeutung.
Bis jetzt machte die fragile Natur von Nucleinsäuren und ihre innerhalb von Zellen eingekapselte Lage den Erwerb von genetischem Material zur Diagnose in bestimmten Fällen notwendigerweise intrusiv. Beispielsweise erfordert die Tumordiagnose oft einen chirurgischen Eingriff, um Tumorzellen zu erhalten. In ähnlicher Weise führen Ärzte Amniozentesen durch, um fetale DNA für eine Vielzahl diagnostischer Anwendungen zu erhalten. Dieses Verfahren erfordert das Einführen einer Nadel durch den Bauch einer schwangeren Frau und in die Fruchtblase. Derartige intrusive Praktiken bringen ein gewisses Risiko sowohl für den Fetus als auch für die Mutter mit sich. Zwar haben Entwicklungen beim Ultraschall weniger intrusive alternative Verfahren der fetalen Überwachung während der Schwangerschaft beigesteuert, aber diese Verfahren sind nicht geeignet zum Diagnostizieren gewisser genetischer Defekte und sind während der frühen Stadien der Schwangerschaft nicht wirkungsvoll, auch nicht zur Bestimmung des fetalen Geschlechts.
Kürzliche Studien verschiedener Mechanismen und Konsequenzen des Zelltods haben eine mögliche Alternative zur den oben beschriebenen invasiven Techniken eröffnet. Es ist wohl erwiesen, dass der apoptotische Zelltod häufig von einer spezifischen internucleosomalen Fragmentierung von Kern-DNA begleitet wird. Das Schicksal dieser Chromatin-Abbauprodukte im Organismus wurde jedoch nicht detailliert untersucht.
Auf der Basis der Morphologie sterbender Zellen geht man davon aus, dass es zwei unterschiedliche Arten von Zelltod gibt, Necrose und Apoptose. Kerr, J.F. et al., Br. J. Cancer 26:239-257, (1972). Zelltod ist ein wesentliches Ereignis bei der Entwicklung und Funktion multizellulärer Organismen. In erwachsenen Organismen spielt der Zelltod bei der Regulierung von Zellpopulationen eine komplementäre Rolle zur Mitose. Die Pathogenese zahlreicher Krankheiten beinhaltet ein Versagen der Gewebe-Homöostasie, wovon angenommen wird, dass es mit zytotoxischer Schädigung oder einem Verlust der normalen Kontrolle des Zelltods verbunden ist. Apoptose kann während der frühesten Stadien der Embryogenese bei der Bildung von Organen, dem Ersetzen eines Gewebes durch ein anderes und bei der Resorption temporärer Organe beobachtet werden.
Necrose ist allgemein durch ein frühes Anwachsen des Gesamtzellvolumens und des subzellulären Organellenvolumens, gefolgt von Autolyse, gekennzeichnet. Necrose wird als ein katastrophales metabolisches Versagen betrachtet, das sich unmittelbar aus einer schweren molekularen und/oder strukturellen Schädigung ergibt. Apoptose ist ein atraumatischer programmierter Zelltod, der bei der normalen Entwicklung und Bewahrung gesunder Gewebe und Organe natürlicherweise auftritt. Apoptose ist ein viel häufigeres biologisches Phänomen als Necrose. Kerr, J.F. et al., Br.J. Cancer 26:239-257, (1972). Umansky, S. Molecular Biology (übersetzt aus Molekulyarnaya Biologiya) 30:285-295, (1996). Vaux, D.L. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 93:2239-2244, (1996). Umansky, S., J. Theor. Biol. 97:591-602, (1982). Tomei, L.D. and Cope, F.D. Eds., Apoptosis: The Molecular Basis of Cell Death, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1991).
Apoptose ist auch eine kritische biologische Funktion, die während der Embryogenese, der positiven und negativen Selektion von T- und B-Lymphozyten, dem Glucocorticoid-induzierten Lymphozyten-Tod, dem durch Strahlung und Temperaturveränderungen induzierten Tod und dem Tod nach einem Entzug spezifischer Wachstumsfaktoren natürlich auftritt. Zusätzlich ist Apoptose ein wichtiger Teil der Verteidigung eines Organismus gegen Vireninfektion. Apoptose wurde in präneoplastischen Herden, die in der Leber nach Tumorpromotor-Phenobarbitalentzug gefunden wurden, in sich zurückbildenden Hormon-abhängigen Geweben und in Tumoren bei Hormonentzug beobachtet. Viele Antitumor-Arzneimittel, einschließlich Inhibitoren von Topoisomerase II, sowie Tumor-Necrosefaktoren induzieren apoptotischen Zelltod. Apoptotischer Zelltod ist gekennzeichnet durch morphologische Veränderungen wie zellulärer Schrumpfung, Chromatin-Verdichtung und -Margination, cytoplasmatischer Bläschenbildung und erhöhter Membranpermeabilität. Gerschenson et al. (1992) FASEB J. 6:2450-2455; und Cohen and Duke (1992) Ann. Rev. Immunol. 10:267-293. Spezifische internucleosomale DNA-Fragmentierung ist ein Kennzeichen für viele, aber wohlgemerkt nicht alle, Fälle von Apoptose.
In necrotischen Zellen wird DNA ebenfalls abgebaut, aber als ein Ergebnis der Aktivierung hydrolytischer Enzyme, die normalerweise Mono- und Oligonucleotid-DNA-Produkte ergeben. Afanasyev, V.N. et al., FEBS Letters. 194:347-350 (1986).
Kürzlich wurden frühere Stadien des Kern-DNA-Abbaus beschrieben. Es wurde gezeigt, dass nach pro-apoptotischen Behandlungen die DNA-Spaltung mit der Bildung von DNA-Fragmenten hohen Molekulargewichts im Bereich von 50 bis 300 Kilobasen, der Größe von DNA, die man in Chromosomschleifen findet, beginnt. Walker, P.R. et al., Cancer Res. 51:1078-1085 (1991). Brown, D.G. et al., J. Biol. Chem. 268:3037-3039 (1993). Diese großen Fragmente werden normalerweise zu Nucleosomen und ihren Oligomeren abgebaut. In manchen Fällen von apoptotischem Zelltod können jedoch nur DNA-Fragmente mit hohem Molekulargewicht beobachtet werden. Oberhammer, F. et al., EMBO J. 12:3679-3684 (1993). Es gibt auch Daten zum Auftreten derartiger Fragmente bei manchen Modellen des necrotischen Zelltods. Kataoka, A. et al., FEBS Lett. 364:264-267 (1995).
Verfügbare Daten zum Schicksal dieser Chromatin-Abbauprodukte in Organismen liefern wenig Anleitung. Veröffentlichte Ergebnisse zeigen an, dass in Blutplasma oder Blutserum nur kleine Mengen an DNA nachgewiesen werden können. Fournie, G.J. et al., Gerontology 39:215-221 (1993). Leon, S. et al., Cancer Research 37:646-650 (1977). Es kann schwierig sein, sicherzustellen, dass diese DNA nicht aus weißen Blutzellen als ein Ergebnis ihrer Lyse während der Probenbehandlung stammte.
Fetale DNA wurde in mütterlichem Peripherblut nachgewiesen und daraus isoliert und wurde zur pränatalen Geschlechtsbestimmung durch Polymerasekettenreaktion mit Y-Chromosom-spezifischen Primern verwendet (Lo et al. (1989), Lanscet 2:1363-1365). Die Verwendung von Blut oder Plasma als eine DNA-Quelle ist jedoch sowohl intrusiv für den Patienten als auch problematisch für den Diagnose-Techniker. Insbesondere eine hohe Konzentration an Proteinen (etwa 100 mg/ml) sowie die Anwesenheit von Verbindungen, die die Polymerasekettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) hemmen, machen eine DNA-Isolierung und -Analyse schwierig.
Was gebraucht wird, ist ein nicht-invasives Verfahren zum Erhalten von Nucleinsäure-Proben von fetalen Zellen zur Verwendung bei diagnostischen Anwendungen und Überwachungsanwendungen. Die Fähigkeit, auf eine nicht-invasive Weise spezifische Nucleinsäure-Sequenzen zu erhalten und zu analysieren, wäre wertvoll für Zwecke einschließlich, aber nicht begrenzt auf, die Bestimmung des Geschlechts eines Fetus in den frühen Stadien der Entwicklung und die Diagnose fetaler genetischer Krankheiten. Das Vorliegen von Y-Chromosom-Gensequenzen im Urin einer schwangeren Frau würde einen männlichen Fetus anzeigen. Das Vorliegen von Gensequenzen, die für einen bestimmten Tumortyp spezifisch sind, im Urin eines Patienten würde ein Kennzeichen für jenen Tumor sein. Daher wären solche Verfahren brauchbar, eine Diagnose nahe zu legen und/oder zu bestätigen.
Verfahren zum Analysieren hinsichtlich fetaler Nucleinsäuren, die die Nierenschranke durchquert haben und sich im Urin befinden, wurden früher nicht beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren bereitgestellt, wie es in Anspruch 1 unten beansprucht wird.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher nicht-invasive Verfahren zur fetalen Geschlechtsbestimmung und/oder Diagnose von Krankheiten durch Untersuchen einer Urinprobe auf die Anwesenheit spezifischer Nucleinsäure-Sequenzen, die die Nierenschranke durchquert haben. Genauer umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweisen spezifischer fetaler Nucleinsäure-Sequenzen durch Analysieren von mütterlichem Urin hinsichtlich Vorliegen fetaler Nucleinsäuren. Die Erfindung umfasst ferner Verfahren zum Nachweisen spezifischer Nucleinsäure-Veränderungen zur Diagnose einer Vielfalt von Krankheiten, die mit dem Vorliegen spezifischer genetischer Anomalien verbunden sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher Verfahren zum Analysieren eines Fragments fetaler DNA, das die Plazentaschranke und die Nierenschranke durchquert hat, aufweisend ein Prüfen auf das Vorliegen der fetalen polymeren DNA in einer Urinprobe, die von einer schwangeren Frau erhalten wurde, wobei von der Urinprobe vermutet wird, dass sie fetale polymere DNA, die die Nierenschranke durchquert hat, enthält.
Die fetale Ziel-DNA-Sequenz kann beispielsweise eine Sequenz sein, die nur auf dem Y-Chromosom vorliegt. Der Schritt des Prüfens auf das Vorliegen einer einzigartigen fetalen DNA-Sequenz kann durchgeführt werden unter Verwendung einer oder mehrerer einer Vielfalt von Techniken, wozu Hybridisierung, Cycling Probe-Reaktion, Spaltprodukt-Nachweis, Polymerasekettenreaktion, nested Polymerasekettenreaktion, Polymerasekettenreaktion-Einzelstrang-Konformationspolymorphismus, Ligasekettenreaktion, Strand Displacement-Amplifikation und Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein. Der Schritt des Durchführens der Polymerasekettenreaktion kann das Verwenden von Primern, die im Wesentlichen komplementär zu einem Teil der einzigartigen fetalen DNA-Sequenz sind, aufweisen, und die einzigartige fetale DNA-Sequenz kann eine Sequenz sein, die in dem väterlichen Genom vorliegt und in dem mütterlichen Genom nicht vorliegt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann den Schritt des Verringerns des DNA-Abbaus in der Urinprobe aufweisen. Das Verringern des DNA-Abbaus kann durch Behandlung mit Verbindungen erfolgen, die ausgewählt werden aus der Gruppe, die besteht aus: Ethylendiamintetraessigsäure, Guanidin-HCl, Guanidin-Isothiocyanat, N-Lauroylsarcosin und Na-Dodecylsulfat. Der DNA-Abbau kann weiter verringert werden, indem man eine Urinprobe nimmt, die weniger als 12 h lang in der Blase gehalten wurde.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann umfassen, dass vor dem Prüfen auf das Vorliegen einer einzigartigen fetalen DNA-Sequenz in der Urinprobe DNA in der Urinprobe im Wesentlichen isoliert wird. Im Wesentlichen Isolieren kann durch Ausfällen und durch Adsorption an einem Harz erfolgen, aber ohne darauf beschränkt zu sein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt das Vorliegen der bestimmten einzigartigen fetalen DNA-Sequenz eine genetische Krankheit an.
In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, die Urinprobe zu filtrieren, um verunreinigende Nucleinsäuren vor der Prüfung zu entfernen. In einer spezifischen Ausführungsform entfernt das Filtrieren DNA, die mehr als etwa 1000 Nucleotide aufweist.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher ein Verfahren zur Bestimmung des Geschlechts eines Fetus, aufweisend das Amplifizieren eines Teils fetaler männlicher DNA, die in einer von einer schwangeren Frau erhaltenen Urinprobe vorliegt, durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines Oligodeoxynucleotid-Primers mit Sequenzen, die für einen Teil des Y-Chromosoms spezifisch sind, um amplifizierte DNA zu erzeugen, und das Nachweisen des Vorliegens der amplifizierten DNA.
Geeignete Oligonucleotid-Primer für die Amplifikation von Sequenzen des Y-Chromosoms weisen SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 auf.
Oligonucleotid-Sonden werden ebenfalls offenbart, die SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 umfassen, die für den Nachweis männlicher Nucleinsäure verwendet werden können.
Diese Erfindung basiert auf der neuen Entdeckung, dass genetisches Material von Zellen des sich entwickelnden Embryos sowohl die Plazentaschranke als auch die Nierenschranke durchqueren kann und im Urin der schwangeren Mutter auftreten kann. Die vorliegende Erfindung umfasst nicht-invasive Verfahren der fetalen Geschlechtsbestimmung und/oder Diagnose von Krankheiten durch Untersuchen einer Urinprobe auf das Vorliegen spezifischer fetaler Nucleinsäure-Sequenzen, die die Nierenschranke durchquert haben. Genauer umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweisen spezifischer fetaler Nucleinsäure-Sequenzen durch Analysieren auf das Vorliegen fetaler Nucleinsäuren im mütterlichen Urin. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können für eine Vielfalt von Anwendungen verwendet werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, die folgenden Anwendungen. Die Verfahren können als diagnostische Techniken verwendet werden, um das Vorliegen spezifischer Indikator-Nucleinsäure-Sequenzen, wie Y-Chromosom-Sequenzen oder tumorspezifischer Sequenzen, zum Zwecke einer frühen Diagnose nachzuweisen.
Diese Erfindung kann neue Primer, YZ1 und YZ2, zur Verwendung bei Amplifikationstechniken der vorliegenden Erfindung, wie in Beispiel 3 unten dargelegt, benutzen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung bieten wegen ihrer inhärent nicht-invasiven Natur Verbesserungen gegenüber früheren Verfahren der Diagnose, des Nachweises und der Überwachung.
Zur Erleichterung des Verständnisses der Erfindung wird unten eine Anzahl von Begriffen definiert.
Der Begriff "Gen" betrifft eine DNA-Sequenz, die Kontrollsequenzen und codierende Sequenzen aufweist, die für die Transkription einer RNA-Sequenz erforderlich sind. Der Begriff "Genom" betrifft ein vollständiges Gen-Komplement eines Organismus, das bei Eukaryoten in einem Chromosomensatz enthalten ist.
Ein Gen oder eine Gensequenz vom "Wild-Typ" ist dasjenige (diejenige), das (die) in einer Population am häufigsten beobachtet wird und daher willkürlich als die "normale" oder "Wild-Typ"-Form des Gens bezeichnet wird. Im Gegensatz dazu betrifft der Begriff "modifiziert", "mutiert", "Anomalie" oder "verändert" ein Gen, eine Sequenz oder ein Genprodukt, das Veränderungen hinsichtlich der Sequenz oder der funktionellen Eigenschaften (d.h. veränderte Charakteristika) zeigt, wenn es mit dem Gen, der Sequenz oder dem Genprodukt vom Wild-Typ verglichen wird. Beispielsweise kann eine veränderte Sequenz, die im Urin eines Patienten gefunden wird, eine Veränderung zeigen, die in DNA-Sequenzen von Tumorzellen auftritt und die in den normalen (d.h. nicht krebsbefallenen) Zellen des Patienten nicht auftritt. Es wird festgestellt, dass natürlich vorkommende Mutanten isoliert werden können; diese werden durch die Tatsache identifiziert, dass sie im Vergleich zu dem Gen oder Genprodukt vom Wild-Typ veränderte Charakteristika haben. Ohne die Erfindung auf den Nachweis irgendeines spezifischen Typs von Anomalie zu beschränken, können Mutationen viele Formen annehmen, einschließlich Additions-, Addition-Deletions-, Deletions-, Rasterverschiebungs-, Falsch-Sinn-, Punkt-, Leserahmen-Verschiebungs-, Rück-, Transitions- und Transversions-Mutationen sowie Mikrosatelliten-Veränderungen.
Eine "mit einer Krankheit im Zusammenhang stehende genetische Anomalie" betrifft ein Gen, eine Sequenz oder ein Genprodukt, das verglichen mit dem Gen vom Wild-Typ Sequenz-Veränderungen zeigt, und das ein Indiz für die Neigung zur Entwicklung einer Krankheit oder für das Vorliegen einer Krankheit bei dem Träger der Anomalie ist. Eine mit einer Krankheit im Zusammenhang stehende genetische Anomalie umfasst, ohne Einschränkung, ererbte Anomalien sowie neue Mutationen.
Der Begriff "einzigartige fetale DNA-Sequenz" ist als eine Sequenz von Nucleinsäuren definiert, die in dem Genom des Fetus, aber nicht in dem mütterlichen Genom vorliegt.
Die Begriffe "Oliganucleotid" und "Polynucleotid" und "polymere" Nucleinsäure sind austauschbar und sind als ein Molekül definiert, das aus zwei oder mehr Deoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden, bevorzugt mehr als drei, und üblicherweise mehr als zehn, besteht. Die genaue Größe hängt von vielen Faktoren ab, die wiederum von der endgültigen Funktion oder Verwendung des Oligonucleotids abhängen. Das Oligonucleotid kann auf irgendeine Weise erzeugt werden, einschließlich chemischer Synthese, DNA-Replikation, reverser Transkription oder einer Kombination davon.
Weil Mononucleotide zur Herstellung von Oligonucleotiden in einer solchen Weise zur Reaktion gebracht werden, dass das 5'-Phosphat eines Mononucleotid-Pentose-Rings über eine Phosphordiester-Bindung an den 3'-Sauerstoff seines Nachbarn in einer Richtung gebunden wird, wird ein Ende eines Oligonucleotids als das "5'-Ende" bezeichnet, wenn sein 5'-Phosphat nicht an den 3'-Sauerstoff eines Mononucleotid-Pentose-Rings gebunden ist, und als das "3'-Ende", wenn sein 3'-Sauerstoff nicht an ein 5'-Phosphat eines nachfolgenden Mononucleotid-Pentose-Rings gebunden ist. Von einer Nucleinsäure-Sequenz, wie hierin verwendet, kann auch behauptet werden, dass sie 5'- und 3'-Enden hat, selbst wenn sie sich im Inneren eines größeren Oligonucleotids befindet.
Wenn zwei unterschiedliche, nicht-überlappende Oligonucleotide ein Annealing mit verschiedenen Bereichen derselben linearen komplementären Nucleinsäure-Sequenz eingehen und das 3'-Ende eines Oligonucleotids in Richtung auf das 5'-Ende des anderen weist, kann das erstere das "Stromauf-"Oligonucleotid und das letztere das "Stromab-"Oligonucleotid genannt werden.
Der Begriff "Primer" betrifft ein Oligonucleotid, das in der Lage ist, als ein Synthese-Initiierungspunkt zu wirken, wenn es Bedingungen ausgesetzt wird, unter denen eine Primer-Extension initiiert wird. Ein Oligonucleotid-"Primer" kann natürlich vorkommen, wie in einem gereinigten Restriktionsverdau, oder synthetisch hergestellt werden.
Ein Primer wird so gewählt, dass er "im Wesentlichen" komplementär zu einem Strang einer spezifischen Sequenz der Matrize ist. Damit eine Primer-Verlängerung auftritt, muss ein Primer ausreichend komplementär sein, um mit einem Matrizenstrang zu hybridisieren. Eine Primer-Sequenz braucht nicht die genaue Sequenz der Matrize widerzuspiegeln. Beispielsweise kann ein nichtkomplementäres Nucleotid-Fragment an das 5'-Ende des Primers gebunden sein, wobei der Rest der Primer-Sequenz im Wesentlichen komplementär zu dem Strang ist. Nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen können in den Primer eingefügt sein, vorausgesetzt, dass die Primer-Sequenz ausreichend komplementär zur Sequenz der Matrize ist, um zu hybridisieren und dadurch einen Matrize-Primer-Komplex zur Synthese des Extensionsprodukts des Primers zu bilden.
Eine "Ziel-"Nucleinsäure ist eine Nucleinsäure-Sequenz, die durch Hybridisierung, Amplifikation oder irgendein anderes Mittel zum Analysieren einer Nucleinsäure-Sequenz, einschließlich einer Kombination von Analyseverfahren, zu untersuchen ist.
"Hybridisierungs-"Verfahren beinhalten das Annealing einer komplementären Sequenz an die Ziel-Nucleinsäure (die zu analysierende Sequenz). Die Fähigkeit zweier Nucleinsäure-Polymere, die komplementäre Sequenzen enthalten, einander zu finden und durch Basenpaarungs-Wechselwirkung ein Annealing durchzumachen, ist ein wohl bekanntes Phänomen. Den anfänglichen Beobachtungen des "Hybridisierungs-"Prozesses von Marmur and Lane, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:453 (1960) und Doty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:461 (1960) folgte die Weiterentwicklung dieses Prozesses zu einem wesentlichen Werkzeug der modernen Biologie. Die Hybridisierung umfasst, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Slot-, Dot- und Blot-Hybridisierungstechniken.
Für manche diagnostische Anwendungen ist es wichtig, zu bestimmen, ob die Hybridisierung eine vollständige oder teilweise Komplementarität darstellt. Zum Nachweisen genetischer Polymorphismen kann es von Interesse sein, dass das Hybridisierungsverfahren zwischen teilweiser und vollständiger Komplementarität unterscheiden kann.
Verfahren, die sowohl im Falle einer teilweisen als auch einer vollständigen Komplementarität denselben Grad an Hybridisierung erlauben, sind für derartige Anwendungen typischerweise ungeeignet; die Sonde hybridisiert sowohl an die normale als auch an die abweichende Ziel-Sequenz. Die vorliegende Erfindung fasst ins Auge, dass für einige diagnostische Zwecke die Hybridisierung mit anderen Techniken (wie Restriktionsenzym-Analyse) kombiniert wird. Unabhängig von dem verwendeten Verfahren erfordert eine Hybridisierung einen gewissen Grad an Komplementarität zwischen der Sequenz, die analysiert wird (der Zielsequenz), und dem DNA-Fragment, das zur Durchführung des Tests verwendet wird (der Sonde). (Natürlich kann man ohne jegliche Komplementarität eine Bindung erhalten, aber diese Bindung ist nicht-spezifisch und zu vermeiden).
Das Komplement einer Nucleinsäure-Sequenz, wie hierin verwendet, betrifft ein Oligonucleotid, das sich, wenn es mit der Nucleinsäure-Sequenz so ausgerichtet wird, dass das 5'-Ende einer Sequenz mit dem 3'-Ende der anderen gepaart ist, in "antiparalleler Verknüpfung" befindet. In den Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können spezifische Basen, die in natürlichen Nucleinsäuren gewöhnlich nicht zu finden sind, enthalten sein, und dazu gehören beispielsweise Inosin und 7-Deazaguanin. Die Komplementarität braucht nicht perfekt zu sein; stabile Duplex-Sequenzen können fehlgepaarte Basenpaare oder ungepaarte Basen enthalten. Fachleute auf dem Gebiet der Nucleinsäure-Technologie können die Duplex-Stabilität empirisch unter Berücksichtigung einer Anzahl von Variablen bestimmen, wozu beispielsweise die Länge des Oligonucleotids, die Basen-Zusammensetzung und -sequenz des Oligonucleotids, die Ionenstärke und das Auftreten fehlgepaarter Basenpaare gehören.
Der Begriff "Tm", wie er hierin verwendet wird, wird in Beziehung zur "Schmelztemperatur" verwendet. Die Schmelztemperatur ist die Temperatur, bei der eine Population doppelsträngiger Nucleinsäure-Moleküle zur Hälfte in Einzelstränge dissoziiert wird. Die Gleichung zur Berechnung der Tm von Nucleinsäuren ist in der Technik wohl bekannt. Wie durch Standardquellen angegeben wird, kann eine einfache Bezifferung des Tm-Werts berechnet werden durch die Gleichung: Tm = 81,5 + 0,41 (% G + C), wenn sich eine Nucleinsäure in wässriger Lösung bei 1 M NaCl befindet (siehe z.B. Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridisation, in Nucleic Acid Hybridisation (1985)). Andere Quellen enthalten ausgefeiltere Berechnungen, die für die Berechnung von Tm strukturelle Charakteristika sowie Sequenz-Charakteristika berücksichtigen.
Der Begriff "Sonde", wie er hierin verwendet wird, betrifft ein Oligonucleotid (d.h. eine Sequenz von Nucleotiden), gleichgültig, ob natürlich vorkommend wie in einem gereinigten Restriktionsverdau, oder synthetisch hergestellt, das aufgrund von Komplementarität oder einem anderen Mittel reproduzierbarer anziehender Wechselwirkung mindestens einer Sequenz in der Sonde mit einer Sequenz in einer anderen Nucleinsäure eine Duplex-Struktur oder einen anderen Komplex mit der Sequenz in der anderen Nucleinsäure bildet. Sonden sind brauchbar beim Nachweis, der Identifizierung und Isolierung bestimmter Gensequenzen. Es wird ins Auge gefasst, dass jede Sonde, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, mit irgendeinem "Reporter-Molekül" markiert wird, so dass sie in irgendeinem Nachweissystem einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Enzym- (z.B. ELISA, sowie histochemische Tests auf Enzym-Basis), fluoreszierende, radioak tive und lumineszierende Systeme, nachweisbar ist. Es wird außerdem ins Auge gefasst, dass das Oligonucleotid von Interesse (d.h. das nachzuweisende) mit einem Reporter-Molekül markiert wird. Es wird auch ins Auge gefasst, dass sowohl die Sonde als auch das Oligonucleotid von Interesse markiert werden. Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf irgendein bestimmtes Nachweis-System oder irgendeine bestimmte Markierung beschränkt sein soll.
Der Begriff "Markierung", wie er hierin verwendet wird, betrifft irgendein Atom oder Molekül, das verwendet werden kann, um ein nachweisbares (bevorzugt quantifizierbares) Signal zu schaffen, und das an eine Nucleinsäure oder ein Protein gebunden werden kann. Markierungen liefern Signale, die durch eine Anzahl von Verfahren einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Fluoreszenz, Radioaktivität, Colorimetrie, Gravimetrie, Röntgen-Diffraktion oder -Absorption, Magnetismus und enzymatische Aktivität, nachweisbar sind.
Der Begriff "im Wesentlichen einzelsträngig" bedeutet, wenn er in Beziehung zu einem Nucleinsäure-Ziel verwendet wird, das das Zielmolekül in erster Linie als ein Nucleinsäure-Einzelstrang im Gegensatz zu einem doppelsträngigen Ziel, das als zwei Nucleinsäure-Stränge vorliegt, die durch Basenpaarungs-Wechselwirkungen zwischen den Strängen zusammengehalten werden, vorliegt.
Der Begriff "Sequenzvariation", wie er hierin verwendet wird, betrifft Unterschiede in den Nucleinsäure-Sequenzen zwischen zwei Nucleinsäure-Matrizen. Beispielsweise können ein Strukturgen vom Wild-Typ und eine mutierte Form dieses Strukturgens vom Wild-Typ durch das Vorliegen von Einzelbasen-Substitutionen und/oder -Deletionen oder von Insertionen von einem oder mehreren Nucleotiden in ihren Sequenzen variieren. Von diesen zwei Formen des Strukturgens sagt man, dass sie sich in ihren Sequenzen voneinander unterscheiden. Es kann eine zweite mutierte Form des Strukturgens geben. Von dieser zweiten mutierten Form sagt man, dass es sich in seiner Sequenz sowohl von dem Gen des Wild-Typs als auch von der ersten mutierten Form des Gens unterscheidet.
Die Begriffe "Struktur-Sondierungs-Signatur", "Hybridisierungs-Signatur" und "Hybridisierungs-Profil" werden hierin austauschbar verwendet, um den gemessenen Grad an Komplexbildung zwischen einer Ziel-Nucleinsäure und einer Sonde oder einem Sonden-Satz anzugeben, wobei derartige gemessene Grade für die Ziel- Nucleinsäure charakteristisch sind, wenn sie mit Komplexbildungs-Graden unter Beteiligung von Vergleichszielen oder Vergleichssonden verglichen werden.
"Oligonucleotid-Primer passend zu oder komplementär zu einer Gensequenz" betrifft Oligonucleotid-Primer, die in der Lage sind, die Matrizen-abhängige Synthese von einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nucleinsäuren zu erleichtern. Oligonucleotid-Primer, die zu einer Gensequenz passen oder komplementär sind, können in PCRs, RT-PCRs und dergleichen verwendet werden.
"Nucleinsäure-Sequenz", wie hierin verwendet, betrifft ein Oligonucleotid, Nucleotid oder Polynucleotid und Fragmente oder Teile davon, und DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, die einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann und den Sinn- oder Nicht-Sinn-Strang repräsentieren kann.
Eine "Deletion" ist definiert als eine Änderung in entweder einer Nucleotid- oder einer Aminosäure-Sequenz, in der ein oder mehrere Nucleotide bzw. Aminosäure-Reste fehlen.
Eine "Insertion" oder "Addition" ist die Änderung in einer Nucleotid- oder Aminosäure-Sequenz, die zur Hinzufügung eines oder mehrerer Nucleotide bzw. Aminosäure-Reste, verglichen mit natürlich vorkommenden Sequenzen, geführt hat.
Eine "Substitution" ergibt sich aus dem Ersetzen eines oder mehrerer Nucleotide oder Aminosäuren durch unterschiedliche Nucleotide bzw. Aminosäuren.
Eine "Veränderung" in einer Nucleinsäure-Sequenz betrifft jede Änderung einer Nucleinsäure-Sequenz einschließlich, aber nicht beschränkt auf, eine Deletion, eine Addition, eine Addition-Deletion, eine Substitution, eine Insertion, eine Reversion, eine Transversion, eine Punktmutation oder eine Mikrosatelliten-Veränderung.
Die Begriffe "gereinigt", "dekontaminiert" und "sterilisiert", wie hierin verwendet, betreffen die Entfernung einer Verunreinigung (von Verunreinigungen) aus einer Probe.
Die Begriffe "im Wesentlichen gereinigt" und "im Wesentlichen isoliert", wie hierin verwendet, betreffen Nucleinsäure-Sequenzen, die aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt, isoliert oder abgetrennt wurden und von anderen Bestandteilen, mit denen sie in der Natur vergesellschaftet sind, bevorzugt zu 60% frei, bevorzugter zu 75% frei, und am meisten bevorzugt zu 90% frei sind. Ein "isoliertes Polynucleotid" ist daher ein im Wesentlichen gereinigtes Polynucleotid. Es ist beabsichtigt, dass zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung Polynucleotide im Wesentlichen gereinigt sein können, aber nicht müssen. In der Technik ist eine Vielfalt von Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäure-Sequenzen in ungereinigter Form bekannt.
"Amplifikation" ist definiert als die Herstellung zusätzlicher Kopien einer Nucleinsäure-Sequenz, und sie wird im Allgemeinen unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion oder anderer in der Technik wohl bekannter Technologien ausgeführt (z.B. Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY [1995]). Der Begriff " Polymerasekettenreaktion" ("PCR", polymerase chain reaction), wie er hierin verwendet wird, betrifft das Verfahren von K.B. Mullis (US-Patente Nummern 4 683 195 und 4 683 202, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden), die ein Verfahren zur Erhöhung der Konzentration eines Abschnitts einer Zielsequenz in einem Gemisch genomischer DNA ohne Klonierung oder Reinigung beschreiben. Dieses Verfahren zum Amplifizieren der Zielsequenz besteht in einem Einbringen eines großen Überschusses von zwei Oligonucleotid-Primern in das DNA-Gemisch, das die gewünschte Zielsequenz enthält, gefolgt von einer präzisen Folge von Temperaturwechselzyklen in Anwesenheit einer DNA-Polymerase. Die zwei Primer sind komplementär zu ihren jeweiligen Strängen der doppelsträngigen Zielsequenz. Um eine Amplifizierung zu bewirken, wird das Gemisch denaturiert, und dann ein Annealing der Primer an ihre komplementären Sequenzen in dem Zielmolekül durchgeführt. Nach dem Annealing werden die Primer mit einer Polymerase verlängert, um ein neues Paar komplementärer Stränge zu bilden. Die Schritte der Denaturierung, des Primer-Annealing und der Polymerase-Extension können viele Male wiederholt werden (d.h. Denaturierung, Annealing und Extension stellen einen "Zyklus" dar; es kann zahlreiche "Zyklen" geben), um eine hohe Konzentration eines amplifizierten Abschnitts der gewünschten Zielsequenz zu erhalten. Die Länge des amplifizierten Abschnitts der gewünschten Zielsequenz wird durch die relativen Lagen der Primer zueinander bestimmt, und daher ist diese Länge ein kontrollierbarer Parameter. Wegen des Wiederholungsaspekts des Prozesses wird das Verfahren als die "Polymerasekettenreaktion" bezeichnet (hierin im Folgenden "PCR"). Weil die gewünschten amplifizieren Abschnitte der Zielsequenz die vorherrschenden Sequenzen (ausgedrückt als Konzentration) in dem Gemisch werden, werden sie als "PCR-amplifiziert" bezeichnet.
Der Begriff "Polymerase", wie hierin verwendet, betrifft jedes Enzym, das zur Verwendung bei der Amplifizierung von Nucleinsäuren von Interesse geeignet ist. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff derartige DNA-Polymerasen wie von Thermus aquaticus erhaltene Taq-DNA-Polymerase umfasst, obwohl andere Polymerasen, sowohl thermisch stabile als auch thermisch labile, ebenfalls von dieser Definition umfasst werden.
Mit PCR ist es möglich, eine einzige Kopie einer spezifischen Zielsequenz in genomischer DNA bis zu einer Konzentration zu amplifizieren, die mit mehreren verschiedenen Methoden (z.B. Färbung, Hybridisierung mit einer markierten Sonde; Einbau biotinylierter Primer, gefolgt von Avidin-Enzym-Konjugat-Nachweis; Einbau von 32P-markierten Deoxynucleotid-triphosphaten, wie dCTP oder dATP, in den amplifizierten Abschnitt) nachgewiesen werden kann. Zusätzlich zu genomischer DNA kann mit dem geeigneten Satz an Primer-Molekülen jede Oligonucleotid-Sequenz amplifiziert werden. Insbesondere sind die durch den PCR-Prozess selbst erzeugten amplifizierten Abschnitte selbst effiziente Matrizen für nachfolgende PCR-Amplifizierungen. Amplifizierte Zielsequenzen können verwendet werden, um DNA-Abschnitte (z.B. Gene) zur Insertion in rekombinante Vektoren zu erhalten.
Die Begriffe "PCR-Produkt" und "Amplifikations-Produkt", wie hierin verwendet, betreffen das sich ergebende Gemisch von Verbindungen, nachdem zwei oder mehr Zyklen der PCR-Schritte der Denaturierung, des Annealing und der Extension beendet sind. Diese Begriffe umfassen den Fall, bei dem es eine Amplifizierung von einem oder mehreren Abschnitten einer oder mehrerer Zielsequenzen gegeben hat.
Die Begriffe "Restriktions-Endonucleasen" und "Restriktions-Enzyme", wie hierin verwendet, betreffen bakterielle Enzyme, von denen jedes doppelsträngige DNA an oder nahe einer spezifischen Nucleotid-Sequenz schneidet.
Die Begriffe "komplementär" oder "Komplementarität", wie hierin verwendet, werden in Bezug auf Polynucleotide (d.h. eine Sequenz von Nucleotiden), die durch die Basenpaarungs-Regeln in Beziehung stehen, verwendet. Was beispielsweise die Sequenz "A-G-T" betrifft, ist sie komplementär zu der Sequenz "T-C-A". Komplementarität kann "teilweise" sein, bei der nur einige der Nucleinsäure-Basen entsprechend den Basenpaarungs-Regeln gepaart sind. Oder es kann eine "vollständige" oder "völlige" Komplementarität zwischen den Nucleinsäuren geben. Der Grad der Komplementarität zwischen Nucleinsäure-Strängen hat signifikante Auswirkungen auf die Effizienz und Festigkeit der Hybridisierung zwischen Nucleinsäure-Strängen. Dies ist von besonderer Wichtigkeit bei Amplifikationsreaktionen sowie bei Nachweisverfahren, die von der Bindung zwischen Nucleinsäuren abhängen.
Der Begriff "Homologie" betrifft einen Grad an Komplementarität. Es kann teilweise Homologie oder vollständige Homologie (d.h. Identität) geben. Eine teilweise komplementäre Sequenz ist eine, die eine vollständig komplementäre Sequenz zumindest teilweise an der Hybridisierung an eine Ziel-Nucleinsäure hindert, wird unter Verwendung des funktionellen Begriffs "im Wesentlichen homolog" bezeichnet. Die Hemmung der Hybridisierung der vollständig komplementären Sequenz an die Zielsequenz kann unter Verwendung eines Hybridisierungs-Tests (Southern oder Northern Blot, Lösungshybridisierung und dergleichen) unter Bedingungen geringer Stringenz untersucht werden. Eine im Wesentlichen homologe Sequenz oder Sonde konkurriert um und hemmt die Bindung (d.h. die Hybridisierung) einer vollständig homologen Sequenz an ein Ziel unter Bedingungen geringer Stringenz. Das heißt nicht, dass Bedingungen geringer Stringenz solche sind, dass eine nicht-spezifische Bindung erlaubt ist; Bedingungen geringer Stringenz erfordern, dass die Bindung von zwei Sequenzen aneinander eine spezifische (d.h. selektive) Wechselwirkung ist. Das Fehlen von nicht-spezifischer Bindung kann durch die Verwendung eines zweiten Ziels, dem selbst ein kleiner Grad an Komplementarität fehlt (z.B. weniger als etwa 30% Identität) getestet werden; beim Fehlen von nicht-spezifischer Bindung wird die Sonde nicht an das zweite nicht-komplementäre Ziel hybridisieren.
Es können zahlreiche äquivalente Bedingungen eingesetzt werden, um Bedingungen entweder geringer oder hoher Stringenz aufzuweisen; Faktoren wie die Länge und Art (DNA, RNA, Basenzusammensetzung) der Sonde und die Art des Ziels (DNA, RNA, Basenzusammensetzung, in Lösung oder immobilisiert vorliegend, etc.) und die Konzentration der Salze und anderer Bestandteile (z.B. die Anwesenheit oder Abwesenheit von Formamid, Dextransulfat, Polyethylenglycol) werden betrachtet, und die Hybridisierungs-Lösung kann variiert werden, um Hybridisierungsbedingungen entweder geringer oder hoher Stringenz, die verschieden, aber äquivalent zu den oben angegebenen Bedingungen sind, zu erzeugen. Der Begriff "Hybridisierung", wie er hierin verwendet wird, umfasst "jeden Prozess, durch den sich ein Nucleinsäure-Strang durch Basenpaarung mit einem komplementären Strang verbindet" (Coombs, Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY [1994].
"Stringenz" tritt typischerweise in einem Bereich von etwa Tm-5°C (5°C unterhalb des Tm der Sonde) bis etwa 20°C bis 25°C unter Tm auf. Wie es sich für Fachleute versteht, kann eine stringente Hybridisierung verwendet werden, um identische Polynucleotid-Sequenzen zu identifizieren oder nachzuweisen, oder um ähnliche oder verwandte Polynucleotid-Sequenzen zu identifizieren oder nachzuweisen.
Der Begriff "Hybridisierungs-Komplex", wie er hierin verwendet wird, betrifft einen Komplex, der zwischen zwei Nucleinsäure-Sequenzen aufgrund der Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basen G und C und zwischen komplementären Basen A und T gebildet wurde; diese Wasserstoffbindungen können durch Basen-Stapelungswechselwirkungen weiter stabilisiert werden. Die zwei komplementären Nucleinsäure-Sequenzen bilden die Wasserstoffbindung in antiparalleler Konfiguration. Ein Hybridisierungs-Komplex kann in Lösung (z.B. COt- oder ROt-Analyse) oder zwischen einer Nucleinsäure-Sequenz, die in Lösung vorliegt, und einer anderen Nucleinsäure-Sequenz, die auf einem festen Träger immobilisiert ist (z.B. einer Nylonmembran oder einem Nitrocellulose-Filter, wie er beim Southern und Northern Blotting, Dot-Blotting verwendet wird, oder einem Glas-Objektträger, wie er bei In-situ-Hybridisierung, einschließlich FISH [fluoreszierende In-situ-Hybridisierung] verwendet wird), gebildet werden.
Der Begriff "Nicht-Sinn", wie er hierin verwendet wird, wird bezüglich RNA-Sequenzen, die zu einer spezifischen RNA- (z.B. mRNA) oder DNA-Sequenz komplementär sind, verwendet. Nicht-Sinn-RNA kann durch irgendein Verfahren hergestellt werden, wozu die Synthese durch Splicen des Gens (der Gene) von Interesse in umgekehrter Orientierung an einen viralen Promotor, der die Synthese eines codierenden Strangs erlaubt, gehört. Wenn dieser transkribierte Strang einmal in eine Zelle eingebracht ist, vereinigt er sich mit natürlicher mRNA, die von der Zelle erzeugt wurde, unter Bildung von Duplex-Strängen. Diese Duplex-Stränge blockieren dann entweder die weitere Transkription der mRNA oder ihre Translation. Auf diese Weise können mutierte Phänotypen erzeugt werden. Der Begriff "Nicht-Sinn-Strang" wird bezüglich eines Nucleinsäure-Strangs, der komplementär zu dem "Sinn"-Strang ist, verwendet. Die Bezeichnung (-) (d.h. "negativ") wird manchmal bezüglich des Nicht-Sinn-Strangs verwendet, wobei die Bezeichnung (+) manchmal bezüglich des Sinn- (d.h. "positiven") Strangs verwendet wird.
Der Begriff "Probe", wie er hierin verwendet wird, wird in seinem breitesten Sinn verwendet. Eine biologische Probe, von der vermutet wird, dass sie Nucleinsäure enthält, kann genomische DNA (in Lösung oder an einen festen Träger wie für Southern Blot-Analyse gebunden), cDNA (in Lösung oder an einen festen Träger gebunden) und dergleichen aufweisen, aber ohne darauf beschränkt zu sein.
Der Begriff "Harntrakt", wie er hierin verwendet wird, betrifft die Organe und Kanäle, die an der Absonderung und Beseitigung von Urin aus dem Körper beteiligt sind.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Analysieren auf die Anwesenheit spezifischer fetaler Nucleinsäure-Sequenzen durch Nachweisen spezifischer fetaler Nucleinsäure-Sequenzen, die die Plazentaschranke und die Nierenschranke durchquert haben und im mütterlichen Urin vorliegen, bereit. Die Verfahren beinhalten allgemein das Unterziehen einer Urinprobe einer schwangeren Frau einem Verfahren des Nachweisens einer spezifischen fetalen Nucleinsäure-Sequenz von Interesse. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren außerdem, dass die in der Urinprobe vorliegenden Nucleinsäuren vor dem Nachweisen der spezifischen Nucleinsäure-Sequenz von Interesse im Wesentlichen gereinigt werden. Diese Verfahren haben eine Vielfalt diagnostischer Anwendungen, einschließlich der Bestimmung des Geschlechts des Fetus und der Identifizierung fetaler genetischer Krankheiten, wie den vom Vater ererbten, zu verschiedenen Zwecken, einschließlich Vaterschaftsbestimmungen.
Die hierin beschriebenen Erfindungen können beispielsweise verwendet werden, um irgendeine der mehr als 3000 genetischen Krankheiten, die gegenwärtig bekannt oder zu identifizieren sind (z.B. Hämophilie, Thalassämie, Duchenne-Muskeldystrophie, Chorea Huntington, Alzheimer-Krankheit und Mukoviszidose) zu diagnostizieren. Jede genetische Krankheit, für die die Mutationen) und die umgebende Nucleotid-Sequenz bekannt sind, kann durch Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert werden.
Außerdem gibt es zunehmende Beweise, dass manche DNA-Sequenzen ein Individuum für irgendeine einer Anzahl von Krankheiten wie Diabetes, Arteriosklerose, Fettsucht, verschiedene Autoimmunkrankheiten und Krebs (z.B. kolorektal, Brust, Eierstock, Lunge) oder eine chromosomale Abnormalität (entweder pränatal oder postnatal) prädisponieren können. Die Diagnose einer genetischen Krankheit, chromosomaler Aneuploidie oder genetischer Prädisponierung kann pränatal durch Sammeln von Urin von der schwangeren Mutter durchgeführt werden.
Techniken zur Nucleinsäure-Handhabung, die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind in einer Vielfalt von Quellen beschrieben, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Vol. 1-3, eds. Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); und Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York (1987) und regelmäßige Aktualisierungen. Spezifische Beschreibungen können, während sie den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken sollen, eine Leitschnur bei der Ausführung bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung liefern.
A. Verringerung des Abbaus durch DNase.
DNA unterliegt dem Abbau durch im Urin vorhandene DNasen. Die vorliegende Erfindung kann mehrere Verfahren benutzen, um den Abbau von DNA, während sie sich im Urin befindet, zu verhindern oder zu verringern, so dass ausreichend große Sequenzen zum Nachweis durch bekannte Verfahren des DNA-Nachweises, wie die unten beschriebenen, verfügbar sind. Urinproben können genom men werden, wenn der Urin weniger als 12 h lang in der Blase gehalten wurde; in einem spezifischen Fall wird der Urin weniger als 5 h lang, bevorzugter weniger als 2 h lang, in der Blase gehalten. Sammeln und Analysieren einer Urinprobe, bevor sie für eine zu lange Zeitdauer in der Blase gehalten wurde, verringert die Exposition der DNA zu jeglicher DNase, die in dem Urin vorliegt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Urinprobe nach dem Sammeln unter Verwendung eines oder mehrerer Verfahren zur Hemmung der DNase-Aktivität behandelt. Verfahren zur Hemmung der DNase-Aktivität umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, die Verwendung von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Guanidin-HCl, GITC (Guanidin-isothiocyanat), N-Lauroylsarcosin, Na-dodecylsulfat (SDS), eine hohe Salzkonzentration und Hitze-Inaktivierung von DNase.
In noch einer anderen Ausführungsform wird die Urinprobe nach dem Sammeln mit einem Adsorptionsmittel behandelt, das DNA einfängt, wonach das Adsorptionsmittel von der Probe entfernt, gespült und behandelt wird, um die eingefangene DNA zum Nachweis und zur Analyse freizusetzen. Dieses Verfahren isoliert die DNA nicht nur von der Urinprobe, sondern schützt die DNA, wenn es mit einigen Adsorptionsmitteln verwendet wird, wozu Hybond N-Membranen (Amersham Pharmacia Biotech Ltd., Piscataway, NJ) gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, vor einem Abbau durch DNase-Aktivität.
B. Erhöhen der Nachweisempfindlichkeit.
In manchen Fällen ist die Menge an DNA in einer Urinprobe begrenzt. Daher umfasst die vorliegende Erfindung für bestimmte Anwendungen Ausführungsformen, bei denen die Nachweisempfindlichkeit durch irgendein (irgendwelche) Verfahren, das (die) in der Technik bekannt ist (sind), erhöht wird, wozu ohne Einschränkung eines oder mehrere der folgenden Verfahren gehören.
Wenn DNA in winzigen Mengen in dem Urin vorliegt, können größere Urinproben gesammelt und danach durch irgendein Mittel, das den Nachweis von in der Probe vorliegender DNA nicht beeinträchtigt, konzentriert werden. Einige Beispiele umfassen, ohne die Breite der Erfindung zu beschränken, das Verringern von in der Probe vorliegender Flüssigkeit durch Butanol-Konzentration oder durch Konzentration unter Verwendung von Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway NJ).
Nested PCR kann verwendet werden, um die Empfindlichkeit um mehrere Größenordnungen zu verbessern. Wegen der Anfälligkeit von nested PCR für ungenaue Ergebnisse aufgrund von DNA-Verunreinigung werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Vorkehrungen getroffen, um eine DNA-Verunreinigung der Probe zu vermeiden. Beispielsweise kann man, ohne die vorliegende Erfindung zu beschränken, PCR-Reagenzien mit Restriktionsendonuclease(n), die in der Zielsequenz spalten, behandeln, bevor man sie der Test-DNA-Probe zugibt.
C. Im Wesentlichen Reinigen der Nucleinsäuren vor dem Nachweis.
In einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung, dass die Nucleinsäuren vor dem Nachweis im Wesentlichen gereinigt oder von einer Probe isoliert werden. Nucleinsäuremoleküle können unter Verwendung einer Anzahl von Verfahren, die in der Technik wohl bekannt sind, aus Urin isoliert werden. Jedes Verfahren zur Isolierung, das den Nachweis von Ziel-Nucleinsäure erleichtert, ist annehmbar. Beispielsweise kann DNA durch Ausfällung isoliert werden, wie beschrieben von Ishizawa et al., Nucleic Acids Res. 19, 5972 (1991). Wenn eine Probe mit großem Volumen eine geringe Konzentration an DNA enthält, wie bei Urin, ist ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung von DNA beinhaltet. In diesem Verfahren wird eine Probe mit einem Adsorptionsmittel behandelt, das dahingehend wirkt, die DNA zu konzentrieren. Beispielsweise kann eine Probe mit einem festen Material behandelt werden, das DNA adsorbiert, wie DEAE Sephadex A-25 (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway NJ), ein DNA-Filter und/oder Glasmilch, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Proben-DNA wird von dem Adsorptionsmittel eluiert, nachdem andere Zusammensetzungen weggewaschen wurden.
In Erwägung der Empfindlichkeit verschiedener Techniken zur Analyse von Nucleinsäuren, wie PCR, umfasst die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Verringerung der Anwesenheit verunreinigender Nucleinsäuren in der Urinprobe. Eine Verunreinigung von Urinproben durch Nucleinsäure-Sequenzen, die die Nierenschranke nicht durchquert haben, kann durch Zellen, die von der Harntrakt-Auskleidung abgestoßen werden, durch Geschlechtsverkehr oder während der Behandlung der Urinprobe vor dem Nachweis der DNA-Sequenz von Interesse eingeführt werden. Ohne die vorliegende Erfindung auf irgendeinen Mechanismus beschränken zu wollen, geht man davon aus, dass DNA, die die Nierenschranke durchquert und im Urin auftaucht, wegen der Fragmentierung, die in apoptotischen Zellen und nekrotischen Zellen im Körper auftritt, in Kombination mit der Wirkung von DNase im Blut und im Urin, im Mittel wahrscheinlich eine kürzere Länge hat als DNA, die von verunreinigenden Quellen eingeführt wird.
Filtration kann verwendet werden, um den Anteil an verunreinigender DNA in einer Urinprobe vor dem Nachweis zu verringern, indem man eine Selektion im Hinblick auf kürzere DNA-Sequenzen durchführt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäuren, die mehr als 1000 Basenpaare, oder bei Denaturierung 1000 Nucleotide, enthalten, vor dem Nachweis aus der Probe entfernt. In einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Urinproben vor der Amplifikation durch PCR filtriert, um im Wesentlichen alle DNA, die mehr als 300 Basenpaare, oder bei Denaturierung 300 Nucleotide enthält, zu entfernen. Ohne die Erfindung auf einen spezifischen Mechanismus einzuschränken, wird vorgeschlagen, dass eine solche Filtration verunreinigende DNA von Zellen, die von der Harnröhren/Blasenwand abgestoßen oder während des Geschlechtsverkehrs in die Harnröhre eingeführt wurden, entfernt. Der Hauptteil der DNA aus solchen verunreinigenden Quellen weist wahrscheinlich mehr als 300 Nucleotide auf, da die DNA nicht größtenteils ein Fragmentierungsprodukt von Nucleinsäuren als Ergebnis des apoptotischen Zelltods ist.
Nucleinsäure-Moleküle können auch durch Gel-Elektrophorese isoliert werden, wodurch Fragmente von Nucleinsäuren entsprechend dem Molekulargewicht getrennt werden. Die Technik des Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) wendet die Verfahren der Elektrophorese-Trennung, gefolgt von Nucleinsäure-Nachweis an, was einen Molekulargewicht-Vergleich von Fragmenten von zwei oder mehr Allelen einer spezifischen Gensequenz ermöglicht.
Die oben angegebenen Reinigungsverfahren sind dazu gedacht, die zur Verwendung bei der Erfindung brauchbaren Verfahren zu beschreiben, aber nicht zu beschränken. Die Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren liegen innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns und werden hier nicht im Detail beschrieben.
D. Analyse und Nachweis spezifischer Nucleinsäure-Sequenzen.
Der Ausdruck "Prüfen auf das Vorliegen eine Nucleinsäure-Sequenz" betrifft die Verwendung irgendeines Verfahrens zur Bestimmung, ob eine Nucleinsäure-Sequenz in einer Probe vorliegt oder nicht. Zu Verfahren gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Techniken zur Hybridisierung, Amplifizierung und zum Nachweis von Nucleinsäuren. Ein Fachmann hat Zugang zu einer Vielzahl dieser Verfahren, wozu diejenigen gehören, die dargelegt sind in Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York (1987) und regelmäßige Aktualisierungen, aber ohne darauf beschränkt zu sein. Es ist beabsichtigt, dass zwei oder mehr Verfahren in Kombination verwendet werden können, um die Ergebnisse zu bestätigen oder die Empfindlichkeit des Tests zu verbessern. Ein Beispiel für das Analysieren mittels der Kombination von Verfahren zur Bestimmung, ob eine Nucleinsäure-Sequenz vorliegt oder nicht, ist die Technik der PCR auf der Basis von Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus ("PCR-RFLP"), bei der Nucleinsäure-Sequenzen amplifiziert, mit Restriktionsenzymen behandelt und durch Elektrophorese getrennt werden, was den Nachweis von Nucleinsäuren, die kleine Veränderungen wie Punkt-Mutationen enthalten, erlaubt.
Der Begriff "Nachweisen", in Beziehung zu einer Nucleinsäure-Sequenz, betrifft die Verwendung irgendeines Verfahrens zur Beobachtung oder Ermittlung von Signalen, die das Vorliegen der Ziel-Nucleinsäure-Sequenz in einer Probe anzeigen. Nachweisverfahren können mit Nucleinsäure-Markierungsverfahren kombiniert werden, um ein Signal durch, beispielsweise, Fluoreszenz, Radioaktivität, Colorimetrie, Gravimetrie, Röntgen-Diffraktion oder -Adsorption, Magnetismus, enzymatische Aktivität und dergleichen, zu liefern. Das Signal kann dann durch Verfahren, die für den Typ von Signal geeignet sind, nachgewiesen werden, um das Vorliegen oder Fehlen der spezifischen DNA-Sequenz von Interesse zu bestimmen.
Spezifische DNA-Sequenzen können auf eine Anzahl von Weisen "amplifiziert" werden, wozu Cycling-Probe-Reaktion (Bekkaoui, F. et al, Bio Techniques 20,240-258 (1996), Poylymerase-Kettenreaktion (PCR), nested PCR, PCR-SS-CP (Einzelstrang-Konformationspolymorphismus, single strand conformation polymorphism), Ligasekettenreaktion (LCR, ligase chain reaction) (F. Barany Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189-93 (1991)), Clonen, Strand Displacement Amplifikation (SDA) (G.K. Terrance Walker et al., Nucleic Acids Res., 22:2670-77 (1994)), und Abwandlungen wie Allel-spezifische Amplifikation (ASA) gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein.
Eine Alternative zur Amplifikation einer spezifischen DNA-Sequenz, die bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Anzeigen des Vorliegens der Sequenz verwendet werden kann, basiert auf der Hybridisierung einer Nucleinsäure-Spaltstruktur mit der spezifischen Sequenz, gefolgt von Spaltung der Spaltstruktur in einer ortsspezifischen Weise. Dieses Verfahren wird hierin als "Spaltprodukt-Nachweis" bezeichnet. Dieses Verfahren ist in den US-Patenten Nr. 5 541 331 und Nr. 5 614 402 und in den PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 94/29482 und Nr. WO 97/23714 genau beschrieben. Es erlaubt den Nachweis kleiner Mengen spezifischer Nucleinsäure-Sequenzen, ohne die DNA-Sequenz von Interesse zu amplifizieren.
Es folgt eine lediglich beispielhafte Beschreibung unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen.
In den Zeichnungen:
1A ist eine Fotografie eines Agarosegels, gefärbt mit Ethidiumbromid, die den Nachweis polymerer DNA in Urinproben, die von Mäusen genommen wurden, denen λ-Phagen-DNA injiziert worden war, darstellt. Die Ergebnisse von zwei Experimenten (Bahnen 1 und 2) sind wiedergegeben.
1B ist ein Autoradiogramm eines Agarosegels, das den Nachweis von 32P-markierter λ-Phagen-DNA im Urin von Mäusen, denen Phagen-DNA injiziert wurde, darstellt. Die Ergebnisse von zwei Experimenten (Bahnen 1 und 2) sind wiedergegeben.
2 ist eine Fotografie eines Agarosegels, die den Nachweis von DNA-Sequenzen menschlicher Raji-Lymphomzellen aus dem Urin von Mäusen, die vorher mit bestrahlten menschlichen Zellen geimpft wurden, durch Gel-Elektrophorese darstellt. Bahnen: 1 – Urin-DNA einer Kontrollmaus; 2 – menschliche Kontroll-DNA; 3 – Urin-DNA einer Maus, der menschliche Zellen injiziert worden waren.
3 ist eine Fotografie einer Agarosegels, die den Nachweis von Y-Chromosom-spezifischen DNA-Sequenzen aus dem Urin einer Frau, der 10 Tage vorher Blut von einem Mann übertragen worden war, darstellt. Bahnen: 1 – Marker (pBR322 DNA-Msp1-Verdau); 2 – positive Kontrolle (0,1 μg Gesamt-DNA aus Lymphozyten eines männlichen Spenders); 3 – Blindprobe (Salzlösung, die alle Verfahren der DNA-Isolierung und Analyse durchlaufen hat); 4 – negative Kontrolle (keine zugegebene DNA); 5 – Urin-DNA nach Blutübertragung.
4A ist eine Fotografie eines Agarosegels, die den Nachweis eines Fragments von 154 Basenpaaren der Y-Chromosom-spezifischen repetitiven DNA-Sequenz im Urin schwangerer Frauen, die männliche Feten tragen, darstellt. Bahnen: M – Molekulargewicht-Standard; 1 – negative Kontrolle (keine DNA zugegeben); 2-5 – positive Kontrollen (0,1, 1,0, 10 bzw. 100 pg männliche Gesamt-DNA); 6 und 8 – männliche Feten; 7 – weiblicher Fetus; 9 – Blindprobe; 10 – Urin-DNA einer nicht-schwangeren Frau.
4B ist eine Fotografie eines Agarosegels, die den Nachweis eines Fragments von 97 Basenpaaren der Y-Chromosom-spezifischen repetitiven DNA-Sequenz im Urin schwangerer Frauen, die männliche Feten tragen, darstellt. Bahnen M – Molekulargewicht-Standard; 1-3 – positive Kontrollen (0,1, 1,0 bzw. 10 pg männliche Gesamt-DNA); 4 und 5 – weibliche Feten; 6 und 7 – männliche Feten; 8 – Blindprobe; 9 – Urin-DNA einer nicht-schwangeren Frau.
5 ist eine Fotografie eines Agarosegels, die den Nachweis einer Y-Chromosom-spezifischen Einzelkopie (single copy)-DNA-Sequenz (198 Basenpaare) im Urin schwangerer Frauen, die männliche Feten tragen, darstellt. Bahnen: M – Molekulargewicht-Standard; 1 – negative Kontrolle (keine DNA zugegeben); 2-5 – positive Kontrollen (1, 10, 100 bzw. 1000 pg männliche Gesamt-DNA); 6 und 7 – männliche Feten; 8 – weiblicher Fetus; 9 – Blindprobe; 10 – Urin-DNA einer nicht-schwangeren Frau.
6 ist eine Fotografie eines Agarosegels, die die Kinetik des DNA-Abbaus im Verlauf der Zeit als ein Ergebnis der Aktivität endogener DNase in Urin darstellt, wobei die Bahnen Folgendes enthalten: Bahn 1 – positive Kontrolle (200 pg λ-Phagen-DNA zu PCR-Röhrchen zugegeben); Bahnen 2-5-0, 30 min, 60 min bzw. 120 min lang inkubierte Proben.
7 ist ein Autoradiogramm einer Zeta-Sonden-Membran, das den Nachweis spezifischer Y-Chromosomen-DNA-Sequenzen in Urinproben schwangerer Frauen durch Hybridisierung darstellt. Bahnen: 1 – negative Kontrolle (nicht-schwangere Frau); 2 – positive Kontrolle (männliche Gesamtgenom-DNA, 5 ng); 3, 4 – männliche Feten; 5, 6 – weibliche Feten.
8A, 8B und 8C sind Fotografien von Agarosegelen, die fetale DNA mit mütterlicher Urin-DNA bei Schwangerschafts-Stadien von näherungsweise 7 bis 8 Wochen vergleichen. 8A repräsentiert fetale DNA, 8B repräsentiert mütterliche Urin-DNA, vorbereitet durch einfache 10-fache Urinverdünnung, und 8C repräsentiert mütterliche Urin-DNA, vorbereitet durch GEAE Sephadex A-25-Adsorption. M – männliche; f – weiblich.
9 ist eine Fotografie eines Agarosegels, die die Wirkung der Adsorption von Urin-DNA an Hybond N-Filtern unter verschiedenen Bedingungen auf die PCR zeigt. Bahnen 1-4 – 20 fg, 1 pg, 2 pg oder 10 pg männliche DNA wurden pro 1 μl weiblichem Urin zugegeben. Kontrolle – 10 μl-Teilmengen von 10-fach verdünntem Urin wurden, direkt in PCR-Röhrchen gefüllt. Andere Urinproben wurden in Salz (10 × SSC) oder Alkali (mit NaOH auf pH 12 eingestellt) hoch konzentriert gemacht und mit dem "Filtertransfer"-Verfahren gehandhabt. nc-negative Kontrolle; m-Molekulargewicht-Standard.
10A, 10B und 10C sind Fotografien eines Agarosegels, die die Wirkung der Adsorption von Urin-DNA unter Verwendung von Hybond N-Filtern auf den DNA-Abbau zeigen. A – Kontrolle (Bahnen: 1 – eine 10 μl-Teilmenge von 10-fach verdünntem Urin wurde unmittelbar nach Zugabe männlicher DNA direkt in PCR-Röhrchen gefüllt; 2 – eine 10 μl-Teilmenge von 10-fach verdünntem Urin wurde nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur direkt in PCR-Röhrchen gefüllt; 3 – ein Hybond N-Filter wurde über Nacht in Urin inkubiert und zum DNA- Filtertransfer verwendet (für die Analyse wurde eine 10 μl-Teilmenge des Eluats von dem Filter verwendet). B – alle Verfahren wie in A, außer dass die Urinproben 10 mM in EDTA gemacht wurden. C – alle Verfahren wie in A, außer dass die Urinproben 10 mM in EDTA gemacht und auf pH 12 eingestellt wurden.
BEISPIEL 1
Nachweis polymerer DNA im Urin von Mäusen, die vorher mit λ Phagen-DNA geimpft wurden
Dieses Beispiel analysiert die Fähigkeit von DNA, bei Nagetieren die Nierenschranke zu durchqueren und in nachweisbarer Form im Urin aufzutreten.
λ-Phagen-DNA (New England Biolabs, MA) wurde durch Nick-Translation mit [α-32P] dNTP-DNA (New England Biolabs, MA) unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase von E. coli mit einer spezifischen Radioaktivität von 108 cmp/μg wie vorher beschrieben, markiert. (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2^nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989). Zwei Monate alten männlichen Wistar-Ratten wurden subkutan 0,4 μg der [32P]-markierten DNA injiziert. Dann wurden 3 Tage lang Urinproben gesammelt, und die gesamte und die Säure-unlösliche Radioaktivität wurde in einem Flüssig-Scintillationszähler gemessen. Die Kinetik der Ausscheidung Säure-unlöslicher Radioaktivität in Urin geht aus Tabelle 1 unten hervor. Es wurde festgestellt, dass 3,2% der Gesamt-DNA, die den Ratten eingeimpft wurde, die Nierenschranke durchquerten und im Urin nachgewiesen wurden, und 0,06% der Gesamt-DNA im Urin in einer Säure-unlöslichen Form, die polymere Nucleotide repräsentiert, auftraten. TABELLE 1 KINETIK DER URIN-AUSSCHEIDUNG VON INJIZIERTER [32P]-DNA.

NN = nicht nachgewiesen

DNA aus den Urinproben wurde durch Phenol-Deproteinierung isoliert (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und der Elektrophorese in einem 1,5%igen Agarosegel unterzogen. Die Gele wurden zur Sichtbarmachung von DNA mit Ethidiumbromid (0,5 μg/ml) gefärbt. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
1A und 1B stellen die Ergebnisse von Doppelexperimenten (repräsentiert durch die Bahnen 1 und 2) dar. 1A ist das Gel mit Ethidiumbromid-Färbung betrachtet, und 1B repräsentiert dasselbe Gel, mit Autoradiographie betrachtet. In der Autoradiographie traten markierte Fragmente von DNA auf, die Sequenzen mit einem Mittel von näherungsweise 150 Basenpaaren repräsentierten.
Die Ergebnisse dieses Experiments stützen, dass DNA sowohl die Nierenschranke in polymerer Form durchqueren kann, als auch trotz der Anwesenheit von DNasen für eine ausreichende Zeitdauer in polymerer Form im Urin bleiben kann, um zu erlauben, dass eine Urinprobe genommen wird und DNA aus der Urinprobe isoliert wird. Die Kinetik der Ausscheidung der injizierten DNA legt nahe, dass viel von der injizierten DNA im Körper wiederverwendet wird, bevor sie im Urin auftritt. Es ist möglich, dass recycelte radioaktiv markierte Nucleotide später in Zellen des Harntrakts eingebaut worden sein könnten und dann im Urin auftre ten, ohne die Nierenschranke zu durchqueren. Wegen der kurzen Zeitdauer zwischen der Injektion von markierter DNA und dem Sammeln von Urin ist es jedoch unwahrscheinlich, dass die in diesem Experiment nachgewiesene DNA von Zellen des Harntrakts in den Urin eingeführt worden sein könnte. Während die injizierte DNA schließlich in Zellen der Blase auftreten kann, ist es unwahrscheinlich, dass sie dieselbe Nucleinsäure-Sequenz repräsentiert, weil erwartet wird, dass die Wirkung von Nucleasen im Körper die DNA, nachdem sie eine ausreichende Zeitdauer zellfrei im Körper ist, schließlich zu Nucleotiden abbauen wird.
BEISPIEL 2
NACHWEIS MENSCHLICHER DNA-SEQUENZEN IM URIN EINER MAUS, DIE VORHER MIT MENSCHLICHEN ZELLEN GEIMPFT WURDE.
Beispiel 1 zeigte, dass DNA-Sequenzen in polymerer Form im Blutstrom bleiben, die Nierenschranke durchqueren und für einen nachfolgenden Nachweis geeignet bleiben konnten. Der nächste Satz von Experimenten wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob DNA aus Zellen, die im Organismus, aber nicht im Harntrakt sterben, im Urin nachgewiesen werden kann.
In RPMI, ergänzt mit 5%igem fetalem Kälberserum, wachsende menschliche Raji-Lymphomzellen wurden mit 1000 Rad 137 Cs γ-Strahlen bestrahlt. Mäuse wurden dann jeweils mit 10⁸ Zellen subkutan geimpft. Urinproben wurden 3 Tage lang gesammelt, und DNA wurde wie oben beschrieben isoliert. Menschen-spezifische DNA-Sequenzen wurden durch Multilocus-Screening unter Verwendung von Alu-Oligonucleotid-gerichteter PCR, wie vorher beschrieben, (Zietkiewics, E., Labude M., Sinnett D., Glorieux F.H., Labuda D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8448-8451, 1992), gefolgt von Elektrophorese in einem 1,5%igen Agarosegel, nachgewiesen.
Die Ergebnisse gehen aus 2 hervor. PCR-Amplifikation von Urin-DNA von dem Kontrolltier (Bahn 1) erzeugte keinerlei DNA-Fragmente; und die durch PCR-Amplifikation der Urin-DNA, die von der Testmaus, der menschliche Zellen injiziert worden waren, genommen wurde, erhaltenen Fragmente (Bahn 3) enthielten nachweisbare menschliche DNA-Sequenzen, wie bewiesen wurde durch einen Vergleich mit den identischen Banden, die bei der Referenzprobe mit menschlicher DNA auftreten (Bahn 2).
Die Ergebnisse stützen, dass ein Teil der DNA von Zellen, die in einen Säugetier sterben, die Nierenschranke durchquert und trotz der Anwesenheit von DNasen für eine ausreichende Zeitdauer in polymerer Form im Urin bleibt, um zu erlauben, dass eine Urinprobe genommen und DNA aus der Urinprobe isoliert wird. Außerdem kann man unter Verwendung von Verfahren wie PCR-Amplifikation spezifischer gewünschter Sequenzen, die in der Urinprobe nicht vorhanden wären, außer nach Durchquerung der Nierenschranke in amplifizierbarer Form, auf das Vorliegen spezifischer DNA-Sequenzen in Urinproben testen.
BEISPIEL 3
NACHWEIS VON DNA, DIE DIE NIERENSCHRANKE DURCHQUERT HAT UND IN MENSCHLICHEM URIN AUFTRITT.
Zusammengenommen beweisen die Beispiele 1 und 2, dass, im Mäusemodell, sowohl freie DNA als auch DNA von sterbenden Zellen die Nierenschranke durchquert und durch PCR-Analyse im Urin nachgewiesen werden kann. Zwei Systeme wurden als Modelle ausgewählt, um zu zeigen, dass DNA die Nierenschranke durchqueren und in polymerer Form in menschlichen Urinproben bleiben kann. Die Systeme sind dazu ausgelegt, sich auf DNA zu konzentrieren, die von außerhalb des Harntrakts sterbenden Zellen stammt, statt auf DNA, die wegen des Tods von Zellen im Harntrakt im Urin auftritt.
Frauen, die entweder schwanger waren oder denen männliches Blut übertragen worden war, wurden studiert, weil diese beiden Modelle Menschen repräsentieren, die DNA in ihrem Körper haben, die in ihrem normalen Genom nicht vorliegt. Jede studierte Frau wurde hinsichtlich des Vorliegens Y-Chromosom-spezifischer Sequenzen in ihrem Urin analysiert.
Nachweis von repetitiven und Einzelkopie-Y-Chromosom-spezifischen Sequenzen im Urin von Frauen, die mit männlichen Feten schwanger sind.
Wie oben diskutiert, spielt der apoptotische Zelltod eine signifikante Rolle bei der Embryogenese. Wenn fetale DNA die Plazentaschranke durchquert, tritt sie im Blut der Mutter und danach in ihrem Urin auf. Fetale Reticulozyten und weiße Blutzellen sind andere mögliche Quellen für fetale DNA und werden auch in den ersten 4 bis 5 Wochen der Schwangerschaft im Blut der Mutter nachgewiesen. Lo, Y-M.D., et al., Lancet 335:1463-1464, (1990). Bianchi, D.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3279-3283, (1990). Bianchi, D.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:705-708, (1996).
Urinproben wurden von schwangeren Frauen bei Schwangerschafts-Stadien von zwischen 16 und 36 Wochen erhalten. Das Fetus-Geschlecht wurde durch Ultraschall-Durchmusterung bestätigt. In früheren Studien, in Beispiel 4 unten beschrieben, wurde gefunden, dass menschlicher Urin Bestandteile enthält, die DNA abbauen können (DNase). Diese DNase-Aktivität variiert von Probe zu Probe. Zur Verringerung des DNA-Abbaus wurden die folgenden Schritte unternommen, um die Urinproben zu sammeln und zu konservieren. Urinproben (jeweils 20 ml) wurden in 50 ml Corning-Röhrchen, die mit 5 ml einer 250 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung als ein Prophylaktikum gegen DNase-Aktivität gefüllt waren, gesammelt. Die die Urinproben enthaltenden Röhrchen wurden dann bis zur Verwendung bei -80°C gehalten.
Zur DNA-Isolierung aus den Urinproben wurden zwei Verfahren verwendet, die beide im Wesentlichen dieselben Ergebnisse ergaben. Bei dem ersten Verfahren, das früher beschrieben wurde von Ishizawa et al. (Ishizawa M., et al., Nucleic Acids Res. 19, 5972, 1991), wurden Urinproben (150 μl) bei 60°C aufgetaut und zu 3 Volumina einer Lösung, die 6 M Guanidin-isothiocyanat (GITC), 13 mM EDTA, 0,5% Natrium-N-lauroylsarcosin, 10 μg Glycogen und 26 mM Tris-HCl, pH 8, enthielt, zugegeben. Das Gemisch wurde bei 60°C 15 min lang in einem Heizblock inkubiert, und DNA wurde durch Zugabe einer gleichen Volumens an Isopropanol ausgefällt. Nach kräftigem Schütteln wurden dicht verschlossene Röhrchen 15 min lang bei Raumtemperatur gehalten, und DNA wurde durch 5 min langes Zentrifugieren bei 10.000 g gesammelt. Das sich ergebende Pellet wurde mit 80% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet, in 50 μl deionisiertem Wasser gelöst und mit DNA-Extraktionsreagens auf der Basis von Chelex 100 (Perkin El mer) wie beschrieben behandelt (Walsh P.S., Metzger D.A., Higuchi R. Bio Techniques 10,506-513, 1991).
Die vorliegende Erfindung umfasst ein alternatives Verfahren zur DNA-Isolierung, das zur Isolierung von DNA aus größeren Proben geeignet ist. Bei diesem Verfahren, das auf der Adsorption von DNA auf Glaspulver basiert, wurden 2,5 ml Urinproben zu einem gleichen Volumen an 10 M Guanidin-HCl zugegeben, und das Gemisch wurde auf eine Säule mit 0,1 ml an 5%igem Wizard-Harz (Wizard Minipreps DNA purification system, Promega) aufgebracht. Die Säulen wurden mit einer Lösung, die 100 mM NaCl in einer 50%igen Ethanol-Lösung enthielten, gewaschen, und die DNA wurde mit 100 μl deionisiertem Wasser eluiert.
Aus Urin gereinigte DNA-Proben wurden 5 min bei 95°C hitzedenaturiert, gefolgt von Filtration durch einen Microcon 100-Filter (Amicon, MA), wie vom Lieferanten empfohlen, um von der Probe im Wesentlichen die gesamte DNA mit einer Länge von mehr als 300 Nucleotiden abzutrennen.
Als Nächstes wurden die Proben der PCR unterzogen. Jedes Experiment hatte interne positive und negative Kontrollen sowie eine Blindprobe (Kochsalzlösung, die auf dieselbe Weise wie die Urinproben behandelt wurde), die dazu ausgelegt waren, eine PCR-Verunreinigung nachzuweisen.
Zur Verringerung der Gefahr einer DNA-Verunreinigung durch Übertragung aus dem PCR-Reaktionsgemisch wurden die Reagenzien vor der Zugabe einer DNA-Probe durch Inkubation mit einer Restriktionsendonuclease, die für die Zielsequenz spezifisch ist, dekontaminiert: HinfI – für die Y-Chromosom-spezifische Sequenz mit 97 Basenpaaren und HaeIII für die Sequenz mit 154 Basenpaaren. Die Reagenzien wurden 1 h lang bei 37°C mit einer Einheit pro 25 μl Reaktionsgemisch behandelt. Die PCR-Proben wurden dann in eine Temperaturwechslerzelle gebracht, bei 94°C 3 min lang erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren, und die DNA-Proben wurden zugegeben.
Es wurden zwei verschiedene Marker verwendet, um Y-Chromosom-spezifische Sequenzen nachzuweisen. DYZ1 ist eine repetitive (2000-5000 Mal pro Genom) Sequenz, die von Nakahori Y., et al., Nucl. Acids Res.14, 7569-7580, 1986, beschrieben wurde. Der Einzelkopie-Genmarker DYS14 wurde ebenfalls verwendet, um die Fähigkeit der Verfahren der vorliegenden Erfindung, Veränderungen in Einzelkopie-Genen, wie sie bei bestimmten genetischen Krankheiten und Krebs auftreten (Arnemann J., et al., Nucl. Acids Res. 15, 8713-8724, 1987) nachzuweisen, zu untersuchen. Die Einzelkopie-Sequenz wurde unter Verwendung von nested PCE, einer empfindlicheren und spezifischen PCR-Technik (Lo Y-M.D., et al., Lancet 335, 1463-1464, 1990) analysiert.
Die folgenden Primer wurden verwendet, um DYZ1-Fragmente zu amplifizieren:
(Y1) 5'-TCCACTTTATTCCAGGCCTGTCC (SEQ ID NO: 1)
(Y2) 5'-TTGAATGGAATGGGAACGAATGG (SEQ ID NO: 2)
(YZ1) 5'-CCATTCCTTTGCATTCCGTTTCC (SEQ ID NO: 3)
(YZ2) 5'-ATCGACTGGCAGGGAACCAAAAG (SEQ ID NO: 4)
Zum Nachweisen von DYS14 führten wir nested PCR unter Verwendung der folgenden Primer durch:
(Y1,5) 5'-CTAGACCGCAGAGGCGCCAT (SEQ ID NO: 5)
(Y1,6) 5'-TAGTACCCACGCCTGCTCCGG (SEQ ID NO: 6)
(Y1,7) 5'-CATCCAGAGCGTCCCTGGCTT (SEQ ID NO: 7)
(Y1,8) 5'-CTTTCCACAGCCACATTTGTC (SEQ ID NO: 8)
Y1 und Y2 führen zu einem Produkt mit 154 Basenpaaren. Ivinson A.J., Taylor G.R. In PCR. A practical approach. (McPherson M.J., Quirke P., and Taylor G.R., eds.). IRL Press. Oxford, New York, Tokyo, Seiten 15-27, 1993.
Man glaubt, dass kürzere DNA-Abschnitte wegen der Filtration durch die Nierenschranke und die Wirkung von DNase in den Urinproben häufiger vorkommen als längere Abschnitte. Die vorliegende Erfindung umfasst die neuen Primer YZ1 und YZ2, die ein kürzeres (97 Basenpaare) Fragment erzeugen, um die Leistungsfähigkeit des Nachweisverfahrens zu maximieren.
Zum Nachweisen von DYS14 verwendeten wir nested PCR mit den folgenden Primern: Y1.5 und Y1.6, die ein externes Fragment mit 239 Basenpaaren erzeugen; und Y1.7 und Y1.8, die ein internes Fragment mit 198 Basenpaaren erzeugen. (Lo Y-M.D., et al., Lancet 335, 1463-1464, 1990).
Es wurden 35 oder 40 PCR-Reaktionszyklen durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren wie folgt: 30 s lang Denaturierung bei 94°C; 60 s lang Annealing bei 58°C bis 63°C (abhängig von den Primern, wie unten beschrieben); 30 s lang Kettenverlängerung bei 72°C. Zu Beginn des ersten Zyklus wurde der Denaturierungsschritt auf 2 min ausgedehnt, und der letzte Kettenverlängerungsschritt wurde auf 7 min ausgedehnt. Das Annealing fand bei den Primern YZ1/YZ2 bei 63°C und bei den Primern Y1/Y2 bei 58°C statt. Für nested PCR folgten 40 Zyklen mit den Primern Y1.5/Y1.6 25 Zyklen mit den Primern Y1.7/Y1.8, beide bei 58°C.
Die PCR-Produkte wurden in einem 10%igen Polyacrylamid-Gel (29:1), 1 × TBE-Elektrophoresepuffer, 10 V/cm für 2,5 h bei Raumtemperatur analysiert und durch Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse gehen aus den 4A, 4B und 5 hervor. In 4A wurde ein PCR-Produkt von DYZ1 mit 154 Basenpaaren, eine repetitive Sequenz des Y-Chromosoms, mit den Primern Y1 und Y2 nachgewiesen. Bahn M ist ein msp1-Verdau von pBR322 als ein Molekulargewicht-Standard; die negative Kontrolle (Bahn 1, keine DNA zugegeben) zeigte keine nachweisbaren Banden; die positiven Kontrollen (Bahnen 2 bis 5, die 0,1, 1,0, 10 bzw. 100 pg männliche Gesamt-DNA repräsentieren) zeigen Banden von steigender Intensität; die erste Gruppe von Testproben, von Frauen, die männliche Feten tragen (Bahnen 6 und 8), zeigt deutliche Banden derselben Größe wie jene bei den positiven Kontrollen; die zweite Testprobe, von einer Frau, die einen weiblichen Fetus trägt (Bahn 7), zeigt keine Bande; zwei weitere Kontrollbahnen, (9), die eine Blindprobe repräsentiert, und 10, die DNA aus dem Urin einer nicht-schwangeren Frau repräsentiert) zeigen kein Anzeichen von Banden.
In 4B wurde ein PCR-Produkt von DYZ1 mit 97 Basenpaaren mit den Primern YZ-1 und YZ-2 nachgewiesen. Bahn M ist ein msp1-Verdau von pBR322 als ein Molekulargewicht-Standard; die positiven Kontrollen (Bahnen 1 bis 3, die 0,1, 1,0 bzw. 10 pg männlicher Gesamt-DNA repräsentieren), zeigten Banden steigender Intensität; die ersten Testproben, von Frauen, die weibliche Feten tragen (Bahnen 4 und 5), zeigten keine Banden; die zweite Gruppe von Testproben, von Frauen, die männliche Feten tragen (Bahnen 6 und 7), zeigt Banden derselben Größe wie diejenigen in den positiven Kontrollen; zwei weitere Kontrollbahnen (8, die eine Blindprobe repräsentiert, und 9, die DNA aus dem Urin einer nichtschwangeren Frau repräsentiert) zeigen kein Anzeichen von Banden.
In 5 wurde eine Y-Chromosomen-spezifische Einzelkopie-DNA-Sequenz (198 Basenpaare) im Urin schwangerer Frauen, die männliche Feten trugen, nachgewiesen. Bahn M ist ein msp1-Verdau von pBR322 als ein Molekulargewicht-Standard; die negative Kontrolle (Bahn 1, keine DNA zugegeben) zeigte keine nachweisbaren Banden. Die positiven Kontrollen (Bahnen 2 bis 5, die 0,1, 1,0, 10 bzw. 100 pg männliche Gesamt-DNA repräsentieren) zeigen Banden steigender Intensität; die erste Gruppe von Testproben, von Frauen, die männliche Feten tragen (Bahnen 6 und 7), zeigt deutliche Banden derselben Größe wie diejenigen in den positiven Kontrollen; die zweite Testprobe, von einer Frau, die einen weiblichen Fetus trägt (Bahn 8), zeigt keine Banden; zwei weitere Kontrollbahnen (9, die eine Blindprobe repräsentiert, und 10, die DNA aus dem Urin einer nicht-schwangeren Frau repräsentiert) zeigen kein Anzeichen von Banden.
Die Ergebnisse dieser Experimente stützen die folgenden Schlussfolgerungen bezüglich der vorliegenden Erfindung: Ein Bruchteil der DNA aus Zellen, die in dem tierischen oder menschlichen Körper sterben, durchquert die Nierenschranke und kann im Urin in polymerer Form nachgewiesen werden, trotz der Anwesenheit von DNasen; ein Bruchteil der DNA aus Zellen, die in dem sich entwickelnden Embryo sterben, durchquert sowohl die Plazentaschranke als auch die Nierenschranke und kann im Urin der Mutter nachgewiesen werden; die Größe der zellfreien Urin-DNA ist ausreichend, um in der PCR amplifiziert zu werden; und die Konzentration an fetaler DNA im Urin der Mutter ist, selbst in den allerersten Schwangerschaftsmonaten, hoch genug, um Gene nachzuweisen, die in dem fetalen Genom nur in Einzelkopie-Form vorliegen.
Die Ergebnisse stützen außerdem, dass mütterlicher Urin als ein Indikator des fetalen Geschlechts insbesondere, und der Zusammensetzung des fetalen Genoms im Allgemeinen, soweit es sich von dem mütterlichen Genom unterscheidet, verwendet werden kann, was zur Diagnose bestehender oder möglicher Krankheiten verwendet werden kann. Die Analyse fetaler DNA im Urin einer schwangeren Mutter kann zum Nachweis von Sequenzen von DNA, die von dem männlichen Elternteil ererbt wurde, einschließlich jener Sequenzen, die ein Anzeichen für eine Krankheit sind oder eine Krankheit verursachen, verwendet werden. Daher stützen die Ergebnisse, dass Verfahren der vorliegenden Erfindung die Bestimmung des fetalen Geschlechts sowie die Diagnose bestimmter fetaler Zustände, die durch das Vorliegen spezifischer DNA-Sequenzen in dem fetalen Genom gekennzeichnet sind, umfassen.
Nachweis von Y-Chromosom-spezifischen Sequenzen im Urin einer Frau, der männliches Blut übertragen wurde.
Im Falle einer Frau, der das Blut eines männlichen Spenders übertragen wurde, wurde erwartet, dass die toten oder sterbenden weißen Blutzellen des Spenders die Quelle von Sequenzen von DNA, die für das männliche Genom spezifisch ist, in der zellfreien DNA des Bluts und des Urins des Empfängers sein würde.
Eine Urinprobe wurde von einer Frau 10 Tage nach einer Übertragung von 250 ml Vollblut von einem männlichen Spender erhalten. DNA aus dem Urin wurde Isoliert und unter Verwendung der Primer Y1 und Y2 durch Verwendung der oben beschriebenen Verfahren auf das Vorliegen einer Männer-spezifischen Sequenz von 154 Basenpaaren des Y-Chromosoms getestet.
Die Ergebnisse gehen aus 3 hervor. Bahn 1 ist ein msp1-Verdau von pBR322 als ein Molekulargewicht-Standard; Bahn 2 ist eine positive Kontrolle (0,1 μg Gesamt-DNA von Lymphozyten eines männlichen Spenders), die eine 154 Basenpaar-Bande von DNA zeigt; Bahn 3 ist eine Blindprobe (Kochsalzlösung, die alle Verfahren der DNA-Isolierung und -Analyse durchlaufen hat); Bahn 4 ist eine negative Kontrolle (enthält keine zugegebene DNA); und Bahn 5, die eine 154 Basenpaar-Sequenz, die für das Y-Chromosom spezifisch ist, zeigt, ist DNA aus der Urinprobe der Frau nach der Blutübertragung. In einer nachfolgenden Studie wurde bei 9 Frauen, denen männliches Spenderblut übertragen worden war, eine Männer-spezifische Bande in 5 Proben nachgewiesen. (Daten nicht gezeigt). So können in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verschiedene hierin diskutierte Verfahren sowie alle in der Technik bekannten Verfahren verwendet werden, um die Empfindlichkeit des Verfahrens zu verbessern.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass bei einem Menschen polymere DNA, die aus sterbenden Blutzellen freigesetzt wurde, in polymerer Form im zirkulierenden Blut bleiben kann, die Nierenschranke durchqueren und durch PCR im Urin nachgewiesen werden kann. Die Ergebnisse zeigen ferner, dass DNA-Sequenzen, die aus Zellen mit Genotypen, die von dem normalen Genotyp des Patienten verschieden sind, freigesetzt werden, im Urin des Patienten selektiv nachgewiesen werden können. Diese Ergebnisse stützen klar die Anwendung der vorliegenden Erfindung zur Diagnose pathologischer Zustände, die mit genetischen Veränderungen im Zusammenhang stehen.
BEISPIEL 4
DNASE-AKTIVITÄT IM URIN
Dieses Beispiel prüft die Aktivität von im Urin vorliegender DNase durch Untersuchung der Kinetik des Abbaus von λ-Phagen-DNA in einer Urinprobe.
Exogene λ-Phagen-DNA (200 pg) wurde zu 2,5 ml-Teilmengen einer Urinprobe von einer schwangeren Frau zugegeben. Die Teilmengen wurden bei 37°C für verschiedene Zeitspannen (von 0 bis 2 h) inkubiert, DNA wurde isoliert und durch PCR (mit Annealing bei 58°C) amplifiziert, wie in Beispiel 3 beschrieben, um das Vorliegen einer λ-Phagen-DNA-Sequenz von 200 Basenpaaren nachzuweisen. Die folgenden Primer wurden verwendet, um ein Phagen-λ- DNA-Fragment von den Nucleotiden 20722 bis 20921 zu amplifizieren:
5'CAACGAGAAAGGGGATAGTGC (SEQ ID NO: 9)
5'AAGCGGTGTTCGCAATCTGG (SEQ ID NO: 10).
Die Ergebnisse gehen aus 6 hervor. Bahn 1, die positive Kontrolle (200 pg λ-Phagen-DNA zu dem PCR-Röhrchen zugegeben) zeigt eine deutliche Bande bei näherungsweise 200 Basenpaaren; Bahnen 2 bis 5, die Proben repräsentieren, die 0, 30 min, 60 min bzw. 120 min lang inkubiert wurden, zeigen in Folge abnehmende Signale. Die Abbau-Aktivität von in dem Urin vorliegender DNase ist aus dieser Figur offensichtlich. In einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung verschiedener Verfahren, die einem Fachmann bekannt sind, um den Abbau von DNA durch DNase oder andere Bestandteile von Urin zu verhindern.
BEISPIEL 5
Konzentration und Reinigung von Urin
Es wurden verschiedene Verfahren zum Konzentrieren und Reinigen von Urinproben, um die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Nachweises von Urin-DNA zu verbessern, getestet.
Butanol-Konzentration. [32P] markierte DNA nach Nick-Translation, intakt oder denaturiert, wurde zu 20 ml-Proben von Urin zugegeben und mehreren Schritten der Butanol-Konzentration unterzogen. Nach jedem Konzentrationsschritt wurden das Probenvolumen und die Radioaktivität von 50 μl-Teilmengen gemessen. Die Ergebnisse zeigten über 5 Extraktionen eine Verringerung des Probenvolumens von mehr als 90%, mit einer Erhöhung der Strahlung von näherungsweise 100% in der 50 μl-Teilmenge.
Sephadex-Reinigung. Abgemessene Mengen von trockenem Sephadex G-25 Coarse (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway NJ), (zwischen 2 und 4 g, einschließlich) wurden zu 10 ml-Urinproben, die mit Dextran Blue (A630 – 0,1) von 200.000 Dalton ergänzt waren, zugegeben. Nach näherungsweise 30 min Quellung wurde das Hohlraumvolumen durch Filtration unter Druck aus dem Gemisch entfernt und gemessen. Der Konzentrationswert wurde durch Messung der Dextran Blue-Extinktion bei 630 nm bestimmt. Mit steigender Menge an Se phadex fiel das Hohlraumvolumen auf weniger als 2 ml, und der Konzentrationswert stieg um das näherungsweise 4,5-fache seines Ausgangswerts.
Isolierung von unveränderter und denaturierter DNA durch Glasmilch-Adsorption.
Glasmilch-Adsorption wurde ebenfalls getestet. Unveränderte oder denaturierte [32P] markierte DNA nach Nick-Translation wurde zu 2 ml-Urinproben zugegeben und der Isolierung durch Adsorption an Glaspulver in Anwesenheit von 6 M Guanidin-Isothiocyanat (GITC) unterzogen. Das Adsorptionsmittel wurde danach mit GITC gewaschen, gefolgt von einer Wäsche mit Isopropanol. Dann wurde die DNA in TE zurückgewonnen. Nach diesem Verfahren wurden zwischen 80 und 90% der DNA, sowohl unverändert als auch denaturiert, zurückgewonnen. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung ionischer Detergentien wie EDTA, die verwendet werden können, um DNA vor DNase-Aktivität zu schützen, auch eine ungünstige Wirkung auf den Adsorptionsprozess einiger Materialien, einschließlich Glasperlen, haben kann. Daher wurden die Proben vor der Glasmilch-Adsorption nicht mit EDTA behandelt.
BEISPIEL 6
Nachweis von DNA im Urin durch Hybridisierung.
Dieses Beispiel untersucht die Hybridisierung als eine Technik zum DNA-Nachweis zur Verwendung bei Verfahren der vorliegenden Erfindung. Urinproben wurden von schwangeren Frauen gesammelt. Aus 1 ml Urin isolierte DNA-Proben wurden in 0,4 M NaOH, 10 mM EDTA unter Verwendung eines Bio-Dot SF Mikrofiltrationsgeräts (Bio-Rad) auf eine Zeta-Probe-Membran (Bio-Rad, CA) getupft. Vorhybridisierungs- und Hybridisierungs-Verfahren wurden 16 h lang bei 42°C durch Inkubation in einer Hybridisierungslösung auf Formamid-Basis durchgeführt, wie früher beschrieben (Sambrook et al., 1989). Ein DNA-Fragment von 979 Basenpaaren (DYZ1-p), von einer Y-Chromosomen-spezifischen repetitiven DYZ1-Sequenz durch PCR amplifiziert, wurde als eine Sonde zur Hybridisierung verwendet. Zum Amplifizieren dieses Fragments konstruierte, neue PCR-Primer sind wie folgt:
L1: 5'-CCAATCCCATCCAATCCAATCTAC (SEQ ID NO: 11)
L2: 5'-GCAACGCAATAAAATGGCATGG (SEQ ID NO: 12)
DNA-Sonden wurden durch zufallsgesteuertes Priming mit [α-32P] dCTP für eine spezifische Radioaktivität von über 5 × 10⁸ Zählereignissen (counts) pro min (cpm)/μg markiert. Die Hybridisierungsmembranen wurden 2 Mal bei Raumtemperatur mit 2 × SSC, 01 % SDS gewaschen, gefolgt von zwei hochstringenten Wäschen mit 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei 65°C. Ein Kodak X-Omat AR-Film mit Fisher Biotech L-Plus-Verstärkungsschirm wurde bei Raumtemperatur 2 bis 16 h lang den Filtern ausgesetzt.
Die Ergebnisse gehen aus 7 hervor. Die negative Kontrolle (Bahn 1, nicht-schwangere Frau) zeigt kein Signal; die positive Kontrolle (Bahn 2, männliche Gesamtgenom-DNA, 5 ng) zeigt Hybridisierung; die Urinproben von Frauen, die männliche Feten tragen (Bahnen 3, 4), haben ausgeprägte Signale; und die Urinproben von Frauen, die weibliche Feten tragen (Bahnen 5, 6), zeigen ein beträchtlich kleineres Signal, das von der positiven Testprobe und der Kontrollprobe leicht unterschieden werden kann. Die schwache Bande in den Bahnen 6 und 7 kann ein Ergebnis verunreinigender DNA aus der Umgebung sein. In der Figur treten deutliche Banden nur bei der positiven Kontrolle und im Urin von schwangeren Frauen, die männliche Feten tragen, auf. Daher ist die Hybridisierung eine wirkungsvolle Technik zum Nachweis von DNA in Urin für Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie den Nachweis spezifischer Nucleinsäure-Sequenzen, die die Nierenschranke durchquert haben, und spezieller für die Bestimmung des Geschlechts des Fetus. Die Hybridisierungstechnik gibt zwar einen deutlichen Unterschied zwischen Proben, die für das Vorliegen der DNA-Zielsequenz positiv und negativ sind, an, aber die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen auch die Anwendung von Techniken zur Kontrolle der Einführung von verunreinigender DNA in die Proben vor der Hybridisierung oder Amplifizierung.
BEISPIEL 7
Frühe vorgeburtliche Geschlechtsbestimmung
Dieses Beispiel untersucht die Machbarkeit des Nachweises fetaler DNA im mütterlichen Urin in frühen Schwangerschafts-Stadien. Es ist bekannt, dass fetale Zellen im mütterlichen Blut in frühen Schwangerschafts-Stadien von nur 5 bis 9 Wochen auftreten (Eggling et al., "Determination of the origin of single nucleated cells in maternal circulation by means of random PCR and a set of length polymorphisms", (1997) Hum. Genet. 99, 266-270; Thomas et al., "The time of appearance, and quantitation, of fetal DNA in the maternal circulation", (1994) Annals NY Ac. Sci. 731, 217-225). Man kann unterstellen, dass die Apoptose in frühen Stadien der embryonischen Entwicklung besonders aktiv ist, und daher kann zu dieser Zeit ein erhöhter Eintrag an abgebauter DNA in den mütterlichen Kreislauf erwartet werden, was einen solchen frühen Nachweis möglich macht.
Zu diesem Zweck wurden schwangere Frauen, die eine Schwangeren-Sprechstunde aufsuchten, um einen geplanten Abbruch vornehmen zu lassen (Schwangerschaftsstadien von 5 bis 12 Wochen), mit ihrer Einwilligung nach Information untersucht. Frische Urinproben, die unmittelbar vor der Operation genommen wurden, sowie Proben von embryonischen Geweben, die während des Eingriffs entfernt wurden, wurden gesammelt.
Urin-DNA wurde durch zwei Verfahren für die PCR-Amplifikation vorbereitet – einfache Urin-Verdünnung oder Adsorption auf Anionenaustauscher DEAE-Sephadex A-25 (Pharmacia Biotech, Inc. Piscataway, NJ). Die Proben mit einfacher Urin-Verdünnung wurden mit destilliertem Wasser 10-fach verdünnt, in einem siedenden Bad erhitzt und zur PCR verwendet (5-10 μl pro Röhrchen, d.h. 0,5-1 μl Ausgangsurin). Die DEAE-Sephadex A-25-Reinigung wurde wie folgt durchgeführt. Ein kleines Urin-Volumen (1-1,5 ml) wurde durch eine DEAE-Sephadex A-Säule (10 ml Volumen) laufen lassen, um Verunreinigungen und Salze zu entfernen. Die erhaltenen Eluat-Proben wurden direkt zur PCR gebracht. Die Konzentration an Urin-DNA, die durch Adsorption an Anionenaustauscher-DEAE-Sephadex A-25 erhalten wurde, schien beträchtlich höher zu sein (näherungsweise 500-700 ng/ml) als die vorher abgeschätzte (2-20 ng/ml). Die DNA-Konzentration wurde durch Spektralfluorometrie mit Hoechst 33258 bestimmt.
Die PCR wurde, wie in Beispiel 3 oben dargelegt, mit den folgenden Primern durchgeführt. Das Geschlecht des Fetus wurde durch PCR-Analyse von DNA aus fetalem Gewebe mit den Primern Y1 (SEQ. ID. NO.1) und Y2 (SEQ. ID. NO.2) zur Amplifizierung einer Y-spezifischen DYZ1-Sequenz von 154 Basenpaaren bestimmt. Weil die Menge an fetaler DNA ausreichend war, war es nicht notwendig, eine nested PCR durchzuführen. Nested PCR wurde mit mütterlichen Urin-DNA-Proben ausgeführt, wobei zusätzlich die Primer nY1 und nY2 zur Zielfindung einer Sequenz von 77 Basenpaaren, die sich innerhalb der Sequenz von 154 Basenpaaren fand, verwendet wurden:
nY1: 5'-GTCCATTACACTACATTCCC-3' (SEQ ID NO: 13)
nY2: 5'-AATGCAAGCGAAAGGAAAGG-3' (SEQ ID NO: 14)
Die Ergebnisse gehen aus 8 hervor. Bei 2 von 5 männlichen Feten wurden Y-spezifische Sequenzen in mütterlicher Urin-DNA bei Schwangerschaftsstadien von 7 bis 8 Wochen nachgewiesen.
BEISPIEL 8
Vorgeburtliches Testen auf kongenitale Krankheiten
Die prinzipielle Entdeckung der Durchlässigkeit der Nierenschranke für DNA-Moleküle wesentlicher Größe ebnet den Weg zur Verwendung von mütterlichem Urin zur Durchführung einer vollständig nicht-invasiven vorgeburtlichen Diagnose kongenitaler Krankheiten. Man kann eine derartige nicht-invasive Durchmusterung wie folgt durchführen.
Zuerst wird eine Urinprobe von einer schwangeren Frau gesammelt. Wenn gewünscht, kann polymere DNA in der Urinprobe dann isoliert, gereinigt und/oder behandelt werden, um einen Abbau zu verhindern, wobei in der Technik bekannte Verfahren verwendet werden, einschließlich der hierin beschriebenen Verfahren, aber nicht auf sie beschränkt. Polymere DNA, die die Nierenschranke durchquert hat, wird dann unter Verwendung von Primern, die für bekannte, mit einer Krankheit verbundene genetische Anomalien spezifisch sind, amplifiziert oder in sonstiger Weise behandelt, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen, wenn die spezifische Anomalie vorliegt. Schließlich wird das Produkt der DNA-Amplifizierung oder das erzeugte Signal analysiert, um zu bestimmen, ob in der Urin-DNA eine mit einer Krankheit verbundene Anomalie vorliegt oder nicht. Wenn eine solche Anomalie nachgewiesen wird und die Mutter die Anomalie nicht in ihrem Genom trägt, kann hergeleitet werden, dass der Fetus die Anomalie trägt.
BEISPIEL 9
Filtertransfer von DNA
Wie in den obigen Beispielen gezeigt, erlaubt eine nested PCR den Nachweis kleiner DNA-Mengen im Urin. Daher war es erwünscht, festzustellen, ob DNA unmittelbar aus dem Urin analysiert werden konnte, anstatt vor der Amplifizierung oder anderen Nachweisverfahren einen DNA-Isolierungsschritt durchführen zu müssen.
Weibliche Urinproben wurden gesammelt (jeweils näherungsweise 20 ml) und mit mehreren Konzentrationen an männlicher DNA behandelt. 3,5 cm Hybond N-Filter (Amersham) wurden 1,5 h lang mit 0,25 N HCl vorbehandelt, um jegliche verunreinigende DNA zu entfernen, gefolgt von Spülen mit destilliertem Wasser. Zwei Filter wurden in jede Urinprobe eingetaucht und über Nacht bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln inkubieren lassen. Die Filter wurden dann entfernt und mit destilliertem Wasser gespült. Die DNA wurde desorbiert durch Inkubation der Filter mit 450 μl 0,25 × PCR-Puffer in einem siedenden Bad für 10 min. Von jeder Probe wurde eine Teilmenge (5-10 μl, d.h. 0,5-1,0 μl der Ausgangs-Urinprobe) für die nested PCR genommen.
Die Ergebnisse gehen aus den 9 und 10 hervor. In 9 repräsentieren die Bahnen 1 bis 4 20 fg, 1 pg, 2 pg bzw. 10 pg männliche DNA pro 1 μl weiblichem Urin. Die Kontrolle enthielt 10 μl-Teilmengen von 10-fach verdünntem Urin, die direkt in PCR-Röhrchen gebracht wurden. Andere Urinproben wurden in Salz (10 × SSC) oder Alkali (mit NaOH auf pH 12 eingestellt) hochgradig konzentriert gemacht und mit dem hierin beschriebenen "Filtertransfer" Verfahren gehand habt. nc-negative Kontrolle; m-Molekulargewicht-Standard. Aus der Figur ist klar, dass das einfache Filtertransfer-Verfahren ein stärkeres Signal liefert, als bei einer Übertragung einer äquivalenten Menge an Urin nachgewiesen werden kann.
Außerdem scheint, wie 10 zeigt, die Adsorption von Urin-DNA an Hybond N-Filtern die DNA vor dem Nuclease-Verdau geschützt zu haben. Dieser Schutz wurde durch eine Erhöhung des pH der Probe vervollkommnet. Abschnitt A repräsentiert die Kontrollen (Bahnen: 1 – eine 10 μl-Teilmenge von 10-fach verdünntem Urin wurde unmittelbar nach Zugabe von männlicher DNA direkt in PCR-Röhrchen gebracht; 2 – eine 10 μl-Teilmenge von 10-fach verdünntem Urin wurde nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur direkt in PCR-Röhrchen gebracht; 3 – ein Hybond N-Filter wurde über Nacht in Urin inkubiert und zum DNA-Austausch (crossover) verwendet (zur Analyse wurde eine 10 μl-Teilmenge des Eluats verwendet). Abschnitt B – alle Verfahren wie in A, außer dass die Urinproben in EDTA 10 mM gemacht wurden. Abschnitt C – alle Verfahren wie in A, außer dass die Urinproben in EDTA 10 mM gemacht und auf pH 12 eingestellt wurden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweisen eines Fragments einer fetalen Nucleinsäure, das die Plazentaschranke und die Nierenschranke durchquert hat, wobei das Verfahren ein Prüfen auf das Vorliegen der fetalen Nucleinsäure in einer Urinprobe, die von einem schwangeren weiblichen Wesen erhalten wurde, aufweist.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, bei dem die fetale Nucleinsäure eine Nucleinsäure-Sequenz aufweist, die nur auf dem Y-Chromosom vorliegt.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, bei dem der Schritt des Prüfens auf das Vorliegen der fetalen Nucleinsäure ausgewählt wird aus Hybridisierung, Cycling Probe-Reaktion, Polymerasekettenreaktion, nested Polymerasekettenreaktion, Polymerasekettenreaktion-Einzelstrang-Konformationspolymorphismus, Ligasekettenreaktion, Strand Displacement Amplifikation und Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus.
Verfahren wie in Anspruch 3 beansprucht, bei dem das Durchführen der Polymerasekettenreaktion die Verwendung von Primern, die im Wesentlichen komplementär zu einem Teil der fetalen Nucleinsäure sind, aufweist.
Verfahren wie in Anspruch 4 beansprucht, bei dem der Teil der fetalen Nucleinsäure in dem väterlichen Genom vorliegt und in dem mütterlichen Genom nicht vorliegt.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, außerdem aufweisend ein Verringern des Nucleinsäure-Abbaus in der Urinprobe.
Verfahren wie in Anspruch 6 beansprucht, bei dem das Verringern des Nucleinsäure-Abbaus ein Hemmen der Nuclease-Aktivität durch erhöhten pH, erhöhte Salzkonzentration, Hitze-Inaktivierung oder durch Behandeln der Nucleinsäure mit einer Verbindung, die ausgewählt wird aus Ethylendiamintetraessigsäure, Guanidin-HCl, Guanidin-isothiocyanat, N-Lauroylsarkosin und Natrium-dodecylsulfat, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Urinprobe weniger als 12 Stunden lang in der Blase gehalten wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Prüfen auf das Vorliegen der fetalen Nucleinsäure-Sequenz aufweist, dass die Nucleinsäure in der Urinprobe im Wesentlichen isoliert wird.
Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, bei dem die fetale Nucleinsäure in der Urinprobe durch Ausfällen im Wesentlichen isoliert wird.
Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, bei dem die Nucleinsäure in der Urinprobe durch Behandlung mit einem festen adsorbierenden Material im Wesentlichen isoliert wird.
Verfahren wie in Anspruch 9 beansprucht, bei dem die Nucleinsäure in der Urinprobe durch Adsorption an einem Harz im Wesentlichen isoliert wird.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, bei dem die Sequenz der fetalen Nucleinsäure für eine Krankheit charakteristisch ist.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, außerdem aufweisend ein Filtrieren der Urinprobe, um verunreinigende Nucleinsäuren zu entfernen.
Verfahren wie in Anspruch 14 beansprucht, bei dem das Filtrieren Nucleinsäuren, die mehr als etwa 1000 Nucleotide aufweisen, entfernt.
Verfahren wie in Anspruch 13 beansprucht, bei dem die fetale Nucleinsäure ein Ziel-DNA-Fragment, das eine genetische Anomalie aufweist, enthält.
Verfahren wie in Anspruch 16 beansprucht, bei dem die genetische Anomalie eine mit Krebs in Zusammenhang stehende Veränderung aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung des Geschlechts eines Fetus, aufweisend: (a) Amplifizieren eines Teils einer männlichen fetalen Nucleinsäure, die in einer von einem schwangeren weiblichen Wesen erhaltenen Urinprobe vorliegt, unter Verwendung eines Oligonucleotid-Primers, mit Sequenzen, die für einen Teil des Y-Chromosoms spezifisch sind, um amplifizierte Nucleinsäure zu erzeugen; und (b) Nachweisen des Vorliegens der amplifizierten Nucleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweisen von Nucleinsäure des Y-Chromosoms, aufweisend: (a) Durchführen einer Polymerasekettenreaktion an einer Urinprobe, die von einer schwangeren Frau erhalten wurde, unter Verwendung eines Paars von Oligonucleotid-Primern, die ausgewählt werden aus SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO:4 und aus SEQ ID. NO:11 und SEQ ID. NO:12; und (b) Nachweisen von amplifizierter Nucleinsäure des Y-Chromosoms.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 5, 9 bis 13 oder 18 oder 19 beansprucht, bei dem die Nucleinsäure DNA ist.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 1 bis 5, 9 bis 13 oder 18 oder 19 beansprucht, bei dem die Nucleinsäure RNA ist.