DE69827913T2

DE69827913T2 - Systeme und Verfahren zur Ausrichtung eines abgetasteten Bildes

Info

Publication number: DE69827913T2
Application number: DE69827913T
Authority: DE
Inventors: Peter Los Altos Fiekowsky; Dan M. Bartell
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1998-12-10
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2018-12-11
Also published as: EP0923050A3; US20060258002A1; CA2255384A1; US6090555A; JP2000069998A; US6611767B1; ATE284066T1; EP0923050B1; US20050037367A9; US20040096883A1; US20060165313A1; DE69827913D1; EP0923050A2

Description

ANMERKUNG ZUM URHEBERRECHT
Ein Teil der Offenbarung dieses Patents enthält Material, das dem Urheberrechtsschutz unterliegt. Der Inhaber des Urheberrechtsschutzes hat keine Einwände gegen die Vervielfältigung der Patentdruckschrift oder der Offenbarung des Patents in genau derselben Form, in dem sie in den Akten des Patent- und Markenamtes oder dessen Aufzeichnungen erscheinen, behält sich jedoch alle übrigen das Urheberrecht betreffenden Rechte vor.
SOFTWAREANHANG
Ein Softwareanhang eines Quellcodes für eine Ausführungsform der Erfindung, der zwei (2) Seiten umfasst, ist beigefügt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Bildbearbeitung. Insbesondere betrifft die Erfindung Computersysteme zum Ausrichten von Rastern auf einem gescannten Bild eines Chips, der hybridisierte Nukleinsäurefrequenzen enthält.
Vorrichtungen und Computersysteme zum Ausbilden und Verwenden von Arrays von Materialien auf einem Chip oder einem Substrat sind bekannt. Bspw. beschreiben die PCT-Anmeldungen WO092/10588 und 95/11995, die beide zu jedem Zweck hierin durch Bezugnahme aufgenommen sein sollen, Techniken zur Sequenzierung oder Sequenzüberprüfung von Nukleinsäuren und anderen Materialien. Arrays zum Ausführen dieser Tätigkeiten können bspw. gemäß den Verfahren der Pioniertechniken, die in der US 5,445,934 , der US 5,384,261 sowie der US 5,571,639 , offenbart sind, welche hierin durch Bezugnahme für alle Zwecke eingeschlossen sein sollen, in Arrays ausgebildet werden.
Gemäß einem Aspekt der dort beschriebenen Techniken wird ein Array aus Nukleinsäureproben an bekannten Stellen auf einem Chip hergestellt. Eine markierte Nukleinsäure wird dann in Kontakt mit dem Chip gebracht, und ein Scanner erzeugt eine Bilddatei (auch "Zelldatei" genannt), welche die Stellen angibt, an denen die markierten Nukleinsäuren mit dem Chip verbunden sind. Basierend auf der Bilddatei und den Identitäten der Proben an den spezifischen Stellen wird es möglich, Information, wie bspw. die Nucleotidsequenz oder Monomersequenz einer DNA oder RNA, zu extrahieren. Solche Systeme wurden bspw. dazu eingesetzt, Arrays aus DNA auszubilden, die dazu verwendet werden können, Mutationen zu studieren und zu detektieren, welche in Bezug auf genetische Krankheiten, Krebsarten, infektiöse Krankheiten, HIV oder andere genetische Eigenschaften relevant sind.
Die VLSIPS^TM-Technologie gibt Verfahren zum Herstellen sehr großer Arrays aus Oligonucleotidproben auf sehr kleinen Chips an. Hierzu seien auch die US 5,143,854 sowie die PCT-Anmeldungen WO90/15070 und 92/10092 angeführt, die jeweils für alle Zwecke hierin durch Bezugnahme aufgenommen sein sollen. Die Oligonucleotidproben auf dem DNA-Probenarray werden dazu verwendet, komplementäre Nukleinsäuresequenzen in einer interessierenden Musternukleinsäure (die "Zielnukleinsäure") zu detektieren.
Für die Anwendungen der Sequenzüberprüfung kann der Chip für eine spezifische Ziel-Nukleinsäuresequenz ein Fliesenmuster aufweisen. Bspw. kann der Chip Proben enthalten, die vollständig komplementär zur Zielsequenz sind, und Proben, die sich von der Zielsequenz durch eine einzelne nicht übereinstimmende Base unterscheiden. Für Neusequenzierungsanwendungen kann der Chip alle möglichen Proben einer spezifischen Länge enthalten. Die Proben werden kachelartig auf einem Chip in Reihen und Spalten aus Zellen verteilt, wobei jede Zelle mehrere Kopien einer speziellen Probe umfasst. Zusätzlich können "Leerzellen" auf dem Chip vorhanden sein, die keine Proben enthalten. Da die Leerzellen keine Proben enthalten, sollten markierte Ziele sich nicht spezifisch in diesem Bereich mit dem Chip verbinden. Somit stellt eine Leerzelle eine Maßeinheit der Hintergrundintensität dar.
Bei der gescannten Bilddatei ist eine Zelle typischerweise durch mehrere Pixel dargestellt. Obwohl eine visuelle Überprüfung der gescannten Bilddatei durchgeführt werden kann, um die individuellen Zellen in der gescannten Bilddatei zu überprüfen, wäre es wünschenswert, computerimplementierte Bildverarbeitungstechniken zu verwenden, um die gescannte Bilddatei auszurichten.
Die EP A-0254644 offenbart ein Verfahren zum Bestimmen der Ausrichtung integrierter Schaltungsstrukturen, welche das Definieren eines ersten Musters an einer Stelle auf einer Vorrichtung während eines Verarbeitungsschritts umfasst, das Definieren eines zweiten Musters an jener Stelle während eines anderen Verarbeitungsschritts, das Erfassen eines Bildes der Kombination des ersten und des zweiten Musters, das Filtern jenes Bildes und das Vergleichen des gefilterten Ergebnisses mit dem Ergebnis eines gespeicherten Bildes, um Ausrichtungsfehler zu bestimmen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung ist durch die beigefügten Ansprüche definiert. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geben neuartige Techniken zum Ausrichten gescannter Bilder an. In das gescannte Bild wird ein Muster aufgenommen, so dass, wenn das Bild mit einem Filter gefaltet wird, ein erkennbares Muster im gefalteten Bild erzeugt wird. Das gescannte Bild kann dann gemäß der Position des erkennbaren Musters des gefalteten Bildes ausgerichtet werden. Der Filter kann auch darauf ausgerichtet sein, die Anteile des gescannten Bildes, die dem Muster des gescannten Bildes nicht entsprechen, "auszufiltern" oder zu entfernen. Mehrere Ausführungsformen der Erfindung sind nachstehend beschrieben.
Gemäß einer Ausführungsform gibt die Erfindung ein computerimplementieres Verfahren zum Ausrichten gescannter Bilder an. Das gescannte Bild wird mit einem Filter gefaltet. Das gescannte Bild umfasst ein erstes Muster, welches der Filter zu einem zweiten Muster im gefalteten Bild faltet. Das gescannte Bild wird dann gemäß der Position des zweiten Musters im gefalteten Bild ausgerichtet. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das erste Muster ein Damebrettmuster sein, das im gefalteten Bild in ein Gittermuster umgewandelt ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform gibt die Erfindung ein Verfahren zum Ausrichten gescannter Bilder von Chips mit hybridisierten Nukleinsäuresequenzen an. Es wird ein Chip synthetisiert, der angebracht Nukleinsäuresequenzen (Proben) aufweist, wobei der Chip ein erstes Muster von Nukleinsäuresequenzen umfasst. Markierte Nukleinsäuresequenzen werden zu Nukleinsäuresequenzen auf dem Chip hybridisiert, und der hybridisierte Chip wird gescannt, um ein gescanntes Bild zu erzeugen. Das gescannte Bild wird mit einem Filter gefaltet, der das erste Muster in ein zweites Muster im gefalteten Bild faltet. Das gescannte Bild wird dann gemäß der Position des zweiten Musters im gefalteten Bild ausgerichtet. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das erste Muster ein Damebrettmuster sein, das von Kontrollnukleinsäuresequenzen erzeugt wird, welche zu wechselnden Quadraten im Damebrettmuster hybridisieren.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung zusammen mit den beigefügten Zeichnungen offensichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht ein Beispiel eines Computersystems, das eingesetzt werden kann, um die Software einer Ausführungsform der Erfindung auszuführen.
2 veranschaulicht ein Blockdiagramm des Computersystems von 1.
3 veranschaulicht ein Gesamtsystem zum Ausbilden und Analysieren von Arrays biologischer Materialien, bspw. DNA oder RNA.
4 ist ein Flussdiagramm eines Verfahrens zum Synthetisieren eines Chips auf hoher Ebene.
5 veranschaulicht das Konzept des Bindens von Proben auf Chips.
6 veranschaulicht ein Flussdiagramm, welches zeigt, wie ein Chip hybridisiert und analysiert wird, um experimentelle Ergebnisse zu erzeugen.
7A zeigt ein Damebrettmuster im gescannten Bild, und 7B zeigt ein Gitter, das über dem gescannten Bild angeordnet wurde, um die individuellen Zellen auf dem Chip zu zeigen.
8 veranschaulicht ein Flussdiagramm eines Verfahrens zur Bildausrichtung.
9A zeigt ein Damebrettmuster in einem gescannten Bild, und 9B zeigt das gefaltete Bild von 9A mit einem Gittermuster, das durch das Damebrettmuster erzeugt wurde.
10 veranschaulicht ein Flussdiagramm eines Verfahrens zum Falten des gescannten Bildes.
11 zeigt Nachbarpixels, die analysiert werden können, um einen gefalteten Pixel im gefalteten Bild zu erzeugen.
Die 12A bis 12D zeigen, wie der Filter über das gescannte Bild bewegt werden kann, um das gefaltete Bild zu erzeugen.
13 veranschaulicht ein Flussdiagramm eines Verfahrens des Verfeinerns der Gitterausrichtung über dem gescannten Bild.
14 zeigt die Gitterlinien im gescannten Bild, die analysiert werden können, um die Gitterausrichtung zu verfeinern.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Übersicht
In der folgenden Beschreibung wird die Erfindung mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen unter Einsatz der VLSIPS^TM-Technologie zum Erzeugen sehr großer Arrays von Oligonocleotidproben auf Chips beschrieben. Jedoch ist die Erfindung nicht auf in dieser Art erzeugte Bilder beschränkt und kann vorteilhaft bei anderen Hybridisierungstechnologien oder Bildern auf anderen Technologiegebieten eingesetzt werden. Deshalb dient die folgende Beschreibung von Ausführungsformen der Veranschaulichung und nicht der Beschränkung.
1 veranschaulicht ein Beispiel eines Computersystems, das verwendet werden kann, die Software einer Ausführungsform der Erfindung auszuführen. 1 zeigt ein Computersystem 1, welche ein Display 3, einen Bildschirm 5, ein Gehäuse 7, eine Tastatur 9 und eine Maus 11 umfasst. Die Maus 11 kann eine oder mehrere Tasten für die Wechselwirkung mit einer graphischen Benutzerschnittstelle aufweisen. Das Gehäuse 7 beinhaltet ein CD-ROM-Laufwerk 13, den Systemspeicher und ein Festplattenlaufwerk (siehe 2), das dazu verwendet werden kann, Softwareprogramme, die einen Computercode beinhalten, welcher die Erfindung implementiert, Daten zur Verwendung mit der Erfindung und dergleichen zu speichern und abzufragen. Obwohl eine CD-ROM 15 als exemplarisches computerlesbares Speichermedium gezeigt ist, können andere computerlesbare Speichermedien, einschließlich Floppy-Disk, Magnetband, Flash-Speicher, Systemspeicher und Festplattenspeicher verwendet werden. Zusätzlich kann ein Datensignal, das in einer Trägerwelle verkörpert ist (bspw. in einem Netzwerk, einschließlich des Internets), das computerlesbare Speichermedium sein.
2 zeigt ein Systemblockdiagramm des Computersystems 1, das dazu verwendet wird, die Software einer Ausführungsform der Erfindung auszuführen. Ebenso wie in 1 umfasst das Computersystem 1 einen Monitor 3 und eine Tastatur 9 und eine Maus 11. Das Computersystem 1 umfasst ferner Subsysteme, bspw. einen zentralen Prozessor 51, ein Systemspeicher 53, einen festen Speicher 55 (bspw. einen Festplattenspeicher), einen entfernbaren Speicher 57 (bspw. ein CD-Rom-Laufwerk), einen Displayadapter 59, eine Soundkarte 61, Lautsprecher 63 und eine Netzwerkschnittstelle 65. Andere Comutersysteme, die zur Verwendung mit der Erfindung geeignet sind, können zusätzliche oder weniger Subsysteme umfassen. Bspw. kann ein anderes Computersystem mehr als einen Prozessor 51 umfassen (d. h. ein Multiprozessorsystem) oder einen Pufferspeicher.
Die Busarchitektur des Computersstems 1 ist durch die Pfeile 67 dargestellt. Jedoch sind diese Pfeile beispielhaft für ein beliebiges Verbindungsschema, das dazu dient, die Subsysteme zu verbinden. Bspw. könnte ein lokaler Bus dazu verwendet werden, den zentralen Prozessor mit dem Systemspeicher und dem Displayadapter zu verbinden. Das Computersystem 1, das in 2 gezeigt ist, ist nur ein Beispiel eines Computersystems, das für die Verwendung mit der Erfindung geeignet ist. Andere Computerarchitekturen mit unterschiedlichen Konfigurationen von Subsystemen können ebenfalls verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung gibt Verfahren zum Ausrichten gescannter Bilder oder Bilddateien hybridisierter Chips an, die Nukleinsäureproben enthalten. In einer repräsentativen Ausführungsform umfassen die gescannten Bilddateien Fluoreszenzdaten eines biologischen Arrays, wobei die Dateien jedoch auch andere Daten darstellen können, bspw. Daten in Bezug auf radioaktive Intensität, Lichtstreuung, Brechungsindex, Leitfähigkeit, Elektrolumineszenz oder Detektion großer Moleküle. Deshalb ist die vorliegende Erfindung nicht auf das Analysieren von Fluoreszenzmessungen von Hybridisierungen beschränkt, sondern kann gut eingesetzt werden, um andere Messungen von Hybridisierungen zu analysieren.
Zum Zweck der Veranschaulichung wird die vorliegende Erfindung als Teil eines Computersystems beschreiben, welches eine Chipmaske entwirft, die Proben auf dem Chip synthetisiert, die Nukleinsäuren markiert und die hybridisierten Nukleinsäureproben scannt. Ein solches System ist vollständig in der US 5,571,639 beschrieben, welche zu jedem Zweck durch Bezugnahme hier aufgenommen sein soll. Jedoch kann die vorliegende Erfindung getrennt von dem Gesamtsystem zum Analysieren von Daten, die von solchen Systemen erzeugt werden, eingesetzt werden.
3 veranschaulicht ein computerisiertes System zum Formieren und Analysieren von Arrays biologischer Materialien, bspw. RAN oder DNA. Der Computer 100 wird dazu verwendet, Arrays aus biologischen Polymeren, bspw. RNA und DNA, zu entwerfen. Der Computer 100 kann bspw. eine geeignet programmierte Sun-Workstation oder ein Personal Computer oder eine Workstation sein, bspw. ein IBM-PC-Äquivalent, einschließlich eines geeigneten Speichers und einer CPU, wie in den 1 und 2 gezeigt. Das Computersystem 100 erhält Eingaben von einem Benutzer bezüglich Eigenschaften eines interessierenden Gens und andere Eingaben bezüglich der gewünschten Merkmale des Arrays. Optional kann das Computersystem Information bezüglich einer interessierenden spezifischen genetischen Sequenz von einer externen oder internen Datenbank 102, bspw. einer Genbank, erhalten. Der Ausgang des Computersystems 100 ist ein Satz Chipdesign-Computerfiles 104, bspw. in Form einer Schaltmatrix, wie in der PCT-Anmeldung WO 92/10092 beschrieben, oder anderer entsprechender Computerfiles.
Die Chipdesignfiles werden einem System 106 zur Verfügung gestellt, welches die lithographischen Masken entwirft, die bei der Herstellung von Arrays von Molekülen, bspw. von DNA, eingesetzt werden. Das System oder Verfahren 106 kann die Hardware umfassen, die zur Herstellung von Masken 110 notwendig ist, und auch die notwendige Computerhardware und Software 108, die notwendig ist, um die Maskenmuster auf der Maske effizient abzulegen. Ebenso wie die anderen Merkmale von 3 können sich solche Ausrüstungen entweder am selben physikalischen Ort oder anderswo befinden, sie sind jedoch aus Gründen der Einfachheit der Darstellung in 3 zusammen gezeigt. Das System 106 erzeugt Masken 110 oder andere Synthesemuster, bspw. Chrom-auf-Glas-Masken zur Verwendung bei der Herstellung von Polymerarrays.
Die Masen 110 sowie ausgewählte Information in Bezug auf den Entwurf des Chips von System 100 werden in einem Synthesesystem 112 verwendet. Das Synthesesystem 112 umfasst die nötige Hardware und Software zur Verwendung zur Herstellung von Polymerarrays auf einem Substrat oder Chip 114. Bspw. umfasst der Synthetisierer 112 eine Lichtquelle 116 und eine chemische Flusszelle 118, auf welcher das Substrat oder der Chip 114 angeordnet ist. Die Maske 110 wird zwischen der Lichtquelle und dem Substrat/Chip angeordnet, und die beiden werden relativ zueinander zu geeigneten Zeiten versetzt, um ausgewählte Bereiche des Chips freizulegen. Ausgewählte chemische Reagenzien werden durch die Strömungszelle 118 geleitet, um an freigelegten Regionen anzukoppeln, sowie zum Waschen und für andere Tätigkeiten. Alle Tätigkeiten werden vorzugsweise von einem geeignet programmierten Computer 119 gesteuert, bei dem es sich um den Computer/die Computer handeln kann, der/die für die Maskengestaltung und die Maskenherstellung eingesetzt wird/werden.
Die vom Synthesesystem 112 erzeugten Substrate werden optional in kleinere Chips geschnitten und gegen markierte Targets freigelegt. Die Targets können komplementär zu einem oder mehreren der Moleküle auf dem Substrat sein. Die Targets sind mit einer Markierung gekennzeichnet, bspw. einer Fluoreszenzmarkierung (in 3 durch ein Asterisk angedeutet) und sind im Scannsystem 120 angeordnet. Das Scannsystem 120 arbeitet wiederum unter der Leitung eines geeignet programmierten digitalen Computers 122, bei dem es sich ebenfalls um denselben Computer handeln kann, der für die Synthese, Maskenherstellung und Maskengestaltung eingesetzt wird. Der Scanner 120 umfasst eine Detektionsvorrichtung 124, bspw. ein konfokales Mikroskop oder eine CCD (ladungsgekoppeltes Bauelement), die dazu verwendet wird, die Stelle zu detektieren, an der das markierte Target (*) an das Substrat gebunden ist. Der Ausgang des Scanners 120 ist eine oder mehrere Bilddatei(en) 124, die im Fall eines fluoreszenzmarkierten Targets die Fluoreszenzintensität (gezählte Photonen oder andere entsprechende Messungen, bspw. Spannung) als Funktion der Position auf dem Substrat angeben. Da höhere Photonenzahlen dann beobachtet werden, wenn das markierte Target stärker an das Array aus Polymeren (bspw. DNA-Proben auf dem Substrat) gebunden ist, und da die Monomersequenz der Polymere auf dem Substrat als Funktion der Position bekannt ist, wird es ermöglicht, die Sequenz(en) von Polymer(en) auf dem Substrat zu bestimmen, die komplementär zu dem Target sind.
Die Bilddatei 124 wird als ein Eingang für ein Analysesystem 126 bereitgestellt, welches die Ausrichtungstechniken für das gescannte Bild gemäß der Erfindung beinhaltet. Wiederum kann das Analysesystem eines aus einer großen Anzahl an Computersytemen sein, wobei jedoch in einer bevorzugten Ausführungsform das Analysesystem auf einer Windows-NT-Workstation oder einem Äquivalent basiert. Das Analysesystem kann die Bildatei(en) analysieren, um einen geeigneten Ausgang 128 zu erzeugen, bspw. die Identität spezifischer Mutationen in einem Target, bspw. DNA oder RNA.
4 ist ein Flussdiagramm einer höheren Ebene eines Prozesses zum Synthetisieren eines Chips. Bei Schritt 201 werden die gewünschten Chipeigenschaften in das Chipsynthesesystem eingegeben. Die Chipeigenschaften können (bspw. die Sequenzüberprüfungssysteme) die genetische(n) Sequenz(en) oder Targets umfassen, die von Interesse sind. Die interessierenden Sequenzen können bspw. ein Virus, Mikroorganismen oder Individuen umfassen. Zusätzlich kann die interessierende Frequenz Informationen über genetische Krankheiten, Krebsarten oder infektiöse Krankheiten liefern. Die Sequenzauswahl kann über manuelle Eingabe von Textdateien oder über externe Quellen, bspw. eine Genbank, erfolgen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, welche eine neue Sequenzierung von TargetNukleinsäuren ausführt, ist dieser Schritt nicht notwendig, da der Chip alle möglichen n-mer Proben umfasst (wobei n die Länge der Nukleinsäureprobe repräsentiert).
Für eine neue Sequenzierung kann ein Chip so synthetisiert werden, dass er Zellen umfasst, die alle möglichen Proben einer spezifischen Länge enthalten. Bspw. kann ein Chip synthetisiert werden, der alle möglichen 8-meren DNA-Proben enthält. Ein solcher Chip hätte 65536 Zellen (4*4*4*4*4*4*4*4), wobei jede Zelle einer speziellen Probe entspricht. Ein Chip kann auch andere Proben enthalten, einschließlich aller Proben anderer Längen.
Bei einem Schritt 203 bestimmt das System, welche Proben auf dem Chip wünschenswert wären und erzeugt ein geeignetes "Layout" auf dem Chip für die Proben. Das Layout implementiert gewünschte Eigenschaften, bspw. eine Anordnung auf dem Chip, welche des "Auslesen" der genetischen Sequenz und/oder die Minimierung von Kanteneffekten, die Einfachheit der Synthese und dergleichen ermöglicht.
Die Masken für die Chipsynthese werden bei Schritt 205 entworfen. Die Masken werden gemäß den gewünschten Chipeigenschaften und dem Chiplayout entworfen. Bei Schritt 207 synthetisiert das System die DNA oder andere Polymerchips. Die Software steuert unter anderem die relative Übersetzung des Substrats und der Maske, die Strömung der gewünschten Reagenzien durch eine Strömungszelle, die Synthesetemperatur der Strömungszelle und andere Parameter.
5 veranschaulicht das Binden einer bestimmten Target-DNA an ein Array von DNA-Proben 114. Wie in diesem einfachen Beispiel gezeigt, werden die folgenden Proben im Array ausgebildet:
Wie gezeigt ist, wird, wenn das floureszenzmarkierte (oder anders gekennzeichnete) Target 5'-TCTTGCA gegen das Array freilegt, es nur zur Probe 3'-AGAACGT komplementär, und Fluoreszenz wird hauptsächlich auf der Oberfläche des Chips gefunden, wo sich 3'-AGAACGT befindet. Der Chip enthält Zellen, welche mehrere Kopien einer speziellen Probe enthalten. Somit enthält die Bilddatei Fluoreszenzintensitäten, und zwar eine für jede Probe (oder Zelle). Durch Analysieren der Fluoreszenzintensitäten, die zu einer spezifischen Probe gehören, wird es ermöglicht, Sequenzinformation aus solchen Arrays unter Verwendung der hier offenbarten erfindungsgemäßen Verfahren zu extrahieren.
Zur Erleichterung der Bezugnahme können Basen bezeichnet werden, indem ihnen die folgenden Codes zugeordnet werden:
Die meisten der Codes entsprechen dem IUPAC-Standard. Jedoch wurde Code N neu definiert und Code X wurde hinzugefügt.
Ausrichtung des gescannten Bildes
Bevor das erfindungsgemäße Ausrichten des gescannten Bildes erörtert wird, kann es nützlich sein, eine Übersicht über den gesamten Prozess in eine Ausführungsform zu geben. 6 veranschaulicht ein Flussdiagramm eines Verfahrens, das zeigt, wie ein Chip hybridisiert und analysiert wird, um experimentelle Ergebnisse zu erzeugen. Ein Chip 251 mit angehängten Nukleinsäuresequenzen (oder Proben) wird mit einer Musternukleinsäuresequenz (bspw. markierten Fragmenten des Musters) und Reagenzien in einem Hybridisierungsschritt 255 kombiniert. Der Hybridisierungsschritt erzeugt einen hybridisierten Chip 257.
Der hybridisierte Chip wird bei Schritt 259 gescannt. Beispielsweise kann der hybridisierte Chip durch einen Laser abgetastet werden, um zu detektieren, wo fluoreszenzmarkierte Musterfragmente am Chip hybridisiert sind. Zahlreiche Techniken können dazu verwendet werden, die Musterfragmente zu markieren, und der Scanprozess wird typischerweise gemäß der Art der verwendeten Markierung ausgeführt. Der Scanschritt erzeugt ein digitales Bild des Chips.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das gescannte Bild des Chips variierende Fluoreszenzintensitäten, welche der Hybridisierungsintensität oder Affinität des Musters zu den Proben in einer Zelle entsprechen. Um genaue Resultate zu erzielen, ist es günstig, die Pixel zu identifizieren, welche zu jeder Zelle auf dem Chip gehören. In einem Bildausrichtungsschritt 263 wird das gescannte Bild so ausgerichtet, dass die Pixel, die jeder Zelle entsprechen, identifiziert werden können. Optional umfasst der Bildausrichtungsschritt die Ausrichtung eines Gitters über dem gescannten Bild (siehe 7B).
In einem Schritt 267 analysiert das Analysesystem das gescannte Bild, um die relativen Hybridisierungsintensitäten für jede interessierende Zelle auf dem Chip zu errechnen. Beispielsweise können die Hybridisierungsintensität für eine Zelle, und deshalb die relative Hybridisierungsaffinität zwischen der Probe der Zelle und der Mustersequenz, als der Durchschnitt der Pixelwerte innerhalb der Zelle berechnet werden. Die Pixelwerte können Photonenzahlen aus den markierten hybridisierten Musterfragmenten entsprechen.
Die Zellenintensitäten können als Zellenintensitätsdatei 269 gespeichert werden. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Zellintensitätsdatei eine Liste von Zellenintensitäten für die Zellen. In einem Analyseschritt 271 kann das Analysesystem die Zellintensitätsdatei sowie Chipeigenschaften analysieren, um Ergebnisse 273 zu erzeugen. Die Chipeigenschaften können dazu verwendet werden, die Proben zu identifizieren, die bei jeder Zelle auf dem Chip synthetisiert wurden. Durch Analysieren sowohl der Sequenz der Proben als auch ihrer Hybridisierungsintensitäten aus der Zellintensitätsdatei kann das System Sequenzinformation, bspw. die Lage von Mutationen, Auslassungen oder Einschüben, oder die Sequenz der Musternukleidsäure, extrahieren. Dementsprechend können die Ergebnisse Sequenzinformation, Graphen der Hybridisierungsintensitäten einer oder mehrer Proben, Graphen der Differenzen zwischen Sequenzen und dergleichen enthalten. Hierzu wird auch auf die US 08/327,525 verwiesen, deren Inhalt hierdurch zu jedem Zweck eingeschlossen wird.
Um das gescannte Bild auszurichten, schafft die Erfindung ein Muster im gescannten Bild, welches in ein erkennbares Muster gefaltet wird. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Muster im gescannten Bild ein Damebrettmuster, das durch Synthetisieren alternierender Zellen erzeugt wird, welche Proben umfassen, die komplementär zu einer Kontrollnukleinsäuresequenz sind. Die Kontrollnukleinsäuresequenz kann eine bekannte Sequenz sein, welche markiert und an den Chip hybridisiert ist, zum Zweck des Ausrichtens des gescannten Bildes. Zusätzlich kann die Helligkeit der Zellen komplementär zur Nukleinsäuresequenz als Basis oder zum Vergleich mit anderen Intensitäten eingesetzt werden.
Als Beispiel zeigt 7A ein Damebrettmuster in einem hybridisierten Chip. Ein gescanntes Bild 301 eines hybridisierten Chips umfasst einen aktiven Bereich 303, bei dem die Proben synthetisiert wurden. An der Ecke des aktiven Bereiches ist ein Muster 305, welches ein Damebrettmuster ist. Typischerweise erscheint das Muster an jeder Ecke des aktiven Bereiches des gescannten Bildes. Obwohl das Muster als Damebrettmuster gezeigt ist, ist es in anderen Ausführungsformen ein Kreis, ein Rechteck, ein Pluszeichen oder ein beliebiges anderes Muster.
In Bezug auf 6 wurde angemerkt, dass ein Gitter optional über dem gescannten Bild angeordnet werden kann, um die individuellen Zellen des Chips zu zeigen oder abzugrenzen. 7B zeigt ein Gitter, das über dem gescannten Bild von 7A ausgerichtet wurde, um die individuellen Zellen des Chips zu zeigen. Wie gezeigt ist, wurde ein Gitter 307 über einem aktiven Bereich 303 eines hybridisierten Chips 301 plaziert.
8 veranschaulicht ein Flussdiagramm eines Prozesses der Bildausrichtung. Das Flussdiagramm zeigt ein Detail für Schritt 263 von 6. Bei Schritt 351 wird das gescannte Bild mit einem Filter gefaltet. Der Filter ist typischerweise ein Softwarefilter, der das gescannte Bild in ein gefaltetes Bild faltet. Wenn das gescannte Bild gefaltet wird, wird ein Muster im gescannten Bild in ein erkennbares Muster gefaltet. Die Position des erkennbaren Musters im gefalteten Bild kann dazu verwendet werden, das gescannte Bild auszurichten, bspw. durch Anordnen eines Gitters über dem Bild.
Bei Schritt 353 wird das gefaltete Bild nach hellen Bereichen abgesucht. Wenn das gescannte Bild gefaltet wird, wird/werden das/die Muster im gescannten Bild in ein erkennbares Muster oder erkannbare Muster aus hellen Bereichen gefaltet. Dementsprechend bestätigt das System, sobald helle Bereiche im gefalteten Bild identifiziert werden, dass die hellen Bereiche im erwarteten erkennbaren Muster (bspw. ein Gittermuster) bei Schritt 355 sind.
Zum besseren Verständnis, was mit den verschiedenen Mustern gemeint ist, zeigt 9A ein Damebrettmuster 401 in einem gescannten Bild 403. 9B zeigt ein erkennbares Muster 451 im gefalteten Bild 453. Das gefaltete Bild wurde aus dem gescannten Bild von 9A erzeugt. Wie dies gezeigt ist, ist das erkennbare Muster 41 in dieser Ausführungsform ein Gittermuster, das durch das Damebrettmuster erzeugt wurde, als es durch einen Filter gefaltet wurde. Zusätzlich ist anzumerken, dass der Filter daraufhinwirkte, die anderen Pixelintensitäten zu entfernen, so dass das gefaltete Bild nur das erkennbare Muster umfasst. Durch Entfernen von Pixelintensitäten, welche nicht Teil des Musters im gescannten Bild sind, ist es leichter, das gescannte Bild auszurichten.
10 zeigt ein Flussdiagramm eines Verfahrens des Faltens des gescannten Bildes. Das Flussdiagramm veranschaulicht einen Prozess, der bei Schritt 351 von 8 ausgeführt werden kann. Bei Schritt 501 wird ein Pixel ausgewählt. Aus Gründen der Einfachheit wird angenommen, dass der Prozess Pixel des gescannten Bildes von links nach rechts und von oben nach unten auswählt. Natürlich kann die Reihenfolge, in der die Pixel analysiert werden, variiert werden.
Sobald ein Pixel ausgewählt ist, können Nachbarpixel in Schritt 503 ausgewählt werden. Unter "Nachbarpixel" werden Pixel verstanden, die den Pixeln nahe sind, jedoch nicht zwingend an ein Pixel angrenzen. Bspw. zeigt 11 Nachbarpixel, welche analysiert werden können, um einen gefalteten Pixel in einem gefalteten Bild zu erzeugen. Wie in 11 gezeigt, gibt es neun Pixel, die mit 1 bis 9 gekennzeichnet sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Pixel 1 der Pixel, der bei Schritt 501 gewonnen wird, und die Nachbarpixel, die bei Schritt 503 gewonnen werden, sind die Pixel 2 bis 9. Natürlich kann eine beliebige Anzahl oder Lage verschiedener Nachbarpixel verwendet werden.
Bei Schritt 505 wird der Durchschnitt der ungeraden Pixel und der Durchschnitt der geraden Pixel bestimmt. Mit erneutem Bezug auf 11 können die Intensitäten der Pixel 1, 3, 5, 7 und 9 gemittelt werden, um den Durchschnitt der ungeraden Pixel (AVG_O) zu erzeugen. Auf ähnliche Weise können die Intensitäten der Pixel 2, 4, 6 und 8 gemittelt werden, um den Durchschnitt der geraden Pixel (AVG_E) zu bilden. Somit können die ungeraden Pixel Pixel sein, die eine ungerade Bestimmungszahl haben, und die geraden Pixel können Pixel sein, die eine gerade Nummernbezeichnung aufweisen.
Pixel 1 wird zu einem gefalteten Pixel in einem gefalteten Bild gefaltet, indem bestimmt wird, dass der Durchschnitt der ungeraden Pixel größer ist als der Durchschnitt der geraden Pixel bei Schritt 507. Wenn der Durchschnitt der ungeraden Pixel größer ist, wird der gefaltete Pixel gleich der Intensität des Minimums der ungeraden Pixel minus der Intensität des Maximums der geraden Pixel in Schritt 509 gesetzt. Im anderen Fall wird der gefaltete Pixel gleich der Intensität des Minimums der geraden Pixel minus der Intensität des Maximums der ungeraden Pixel bei Schritt 511 gesetzt.
Konzeptionell können die Nachbarpixel als gefiltert angesehen werden, bspw. von einem Softwarefilter in bevorzugten Ausführungsformen. Mit dem Filter sucht das System nach einem Damebrettmuster, bei dem alle ungeraden Pixel entweder dunkler oder heller als die geraden Pixel sind. Dementsprechend werden bei Schritt 505 die Durchschnitte der ungeraden und geraden Pixel berechnet. Schritt 507 wirkt darauf hin, zu bestimmen, ob die Pixel wahrscheinlich ein Damebrettmuster wiedergeben, bei dem die ungeraden Pixel und somit die Quadrate hell (bspw. hohe Intensität) oder dunkel (bspw. niedrige Intensität) sind. Wenn die ungeraden Pixel wahrscheinlich ein Damebrettmuster wiedergeben, bei dem die ungeraden Pixel hell sind, wird in Schritt 509 der gefaltete Pixel gleich der Differenz zwischen den ausgewählten ungeraden und geraden Pixeln gesetzt, wobei der ausgewählte ungerade Pixel das Minimum der ungeraden Pixel ist und der ausgewählte gerade Pixel das Maximum der geraden Pixel ist. Schritt 511 ist ähnlich, aber umgekehrt.
Deshalb ist bei Schritt 509, wenn alle ungeraden Pixel viel heller sind als alle geraden Pixel, die Differenz ein größerer Wert. Folglich wird der gefaltete Pixel relativ hell sein (d. h. von hoher Intensität). Der gefaltete Pixel wird auch relativ hell sein, wenn alle geraden Pixel viel heller sind als die ungeraden Pixel bei Schritt 511. Wenn jedoch die Differenz bei Schritt 509 oder 511 sehr gering ist (oder negativ), wird der gefaltete Pixel auf eine relativ dunkle Intensität gesetzt. Gefaltete Pixel mit negativen Pixelwerten können in bevorzugten Ausführungsformen auf Null gesetzt werden. Zusammengefasst, wenn der Filter ein Damebrettmuster findet, wird der gefaltete Pixel hell, und wenn der Filter ein relativ zufälliges Muster findet, wird der gefaltete Pixel dunkel (wodurch "Rauschen" ausgefiltert wird, das nicht Teil des gewünschten Musters ist).
Das erkennbare Muster in 9B, das ein Gittermuster ist, wurde durch den Softwarefilter von 10 erzeugt. Um besser zu sehen, wie das erkennbare Muster erzeugt wurde, zeigen die 12A–D, wie der Filter über das Damebrett bewegt werden kann um ein Gittermuster im gefalteten Bild zu erzeugen. Wenn der Filter über das Muster im gescannten Bild, das in 12A in einem Rechteck 530 gezeigt ist, gefaltet wird, wird ein helles Quadrat im gefalteten Bild erzeugt, da ein Damebrettmuster gefunden wird. Auf ähnliche Weise wird ein helles Quadrat im gefalteten Bild erzeugt, wenn der Filter über dem Muster im Quadrat 530 von 12B ist. Natürlich werden die Damebrettmuster im Quadrat 530 der 12A und B umgekehrt, aber beide erzeugen ein helles Quadrat im gefalteten Bild, wie vorstehend in Bezug auf 10 beschrieben. Die 12C und 12D erzeugen ebenfalls zwei helle Quadrate. Deshalb wird, wie in 9B gezeigt, ein 2 × 2 Gittermuster aus hellen Quadraten erzeugt.
Zusätzlich ist das erkennbare Muster (bspw. ein Gittermuster) leichter zu identifizieren, wenn der Softwarefilter von 10 darauf hinwirkt, Signale auszufiltern, welche nicht Bestandteil des Musters sind. Die erkennbaren Muster im gefalteten Bild werden dazu verwendet, das gescannte Bild auszurichten. Mit erneuten Bezug auf 10 wird, nachdem ein ausgewählter Pixel in einen gefalteten Pixel durch den Filter gefaltet wird, bestimmt, ob ein anderer Pixel vorhanden ist, um im gescannten Bild bei Schritt 513 verarbeitet zu werden.
Das Folgende zeigt, wie gut eine Ausführungsform der Erfindung gescannte Bilder hybridisierter Chips ausrichtet:
Das frühere Verfahren bestand dahin, das gescannte Bild (ungefiltert) zu analysieren, um helle Bereiche oder Flächen in einem Damebrettmuster zu Vokalisieren. Wie gezeigt wurde, konnte eine Ausführungsform der Erfindung die Genauigkeit der Ausrichtung des gescannten Bildes dramatisch erhöhen.
Verfeinerte Gitterausrichtung
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen kann eine verfeinerte Bildausrichtung ausgeführt werden, um die Genauigkeit der Ausrichtung des gescannten Bildes weiter zu erhöhen. 13 veranschaulicht ein Flussdiagramm eines Prozesses des Verfeinerns der Gitterausrichtung über einem gescannten Bild. So kann bspw., sobald das vorstehend beschriebene Verfahren ausgeführt wurde, um das gescannte Bild auszurichten, der Prozess von 13 eingesetzt werden, um die Ausrichtung zu verfeinern.
Bei Schritt 551 werden die Pixelintensitäten auf Gitterlinien im Gitter summiert. Bspw. können die Intensitäten des Gitters in Vertikalrichtung im Damebrettmuster im gescannten Bild summiert werden. 14 zeigt die Gitterlinien im gescannten Bild, die analysiert werden können, um die Gitterausrichtung zu verfeinern. Wie dies gezeigt ist, können die Pixelintensitäten vertikaler Linien 601 eines Damebrettmusters 603 summiert und gespeichert werden.
Dann, bei Schritt 553, kann das System bestimmen, ob es mehr Positionen des Gitters zu analysieren gibt. Wenn dies der Fall ist, kann die Position des Gitters bei Schritt 555 angepasst werden. Deshalb kann das Gitter nach links und rechts durch einen oder mehrere Pixel bewegt werden, bevor die Intensitäten entlang den Gitterlinien bei Schritt 551 summiert werden. Sobald alle Positionen des Gitters analysiert wurden, wählt das System eine Gitterposition, bei der Pixelintensitäten (bspw. die Summe, die in Schritt 551 berechnet wurde) bei einem Minimum liegen. Deshalb wird, wenn die Pixelintensitäten für Gitterlinien bei einer anderen Position niedriger sind, das Gitter entsprechend angepasst. Diese Verfeinerung funktioniert gut, wenn die Zellen typischerweise durch einen dunkleren Bereich oder durch eine dunklere Linie getrennt sind.
Obwohl das Verfahren von 13 für Gitterlinien in Vertikalrichtung beschrieben wurde, wird gemäß bevorzugten Ausführungsformen die gleiche Gitterausrichtung für die horizontale Richtung ausgeführt. Die Distanz, um die das Gitter für die Verfeinerung bewegt werden kann, kann begrenzt werden. Bspw. kann die Bewegung des Gitters auf ein Drittel einer Zellengröße begrenzt werden.
Das Folgende zeigt, wie gut eine Ausführungsform der Erfindung gescannte Bilder hybridisierter Chips unter Einsatz der verfeinerten Gitterausrichtung ausrichtete:
Wiederum bestand die frühere Methode darin, das gescannte Bild (ungefiltert) zu analysieren, um helle Bereiche oder Flächen in einem Damebrettmuster zu lokalisieren. Wie gezeigt wurde, konnte gemäß einer Ausführungsform der Erfindung die Genauigkeit der Ausrichtung des gescannten Bildes dramatisch erhöht werden. Darüber hinaus erhöhte die verfeinerte Gitterausrichtung den Prozentsatz der gescannten Bilder, welche perfekt ausgerichtet waren, durch die Erfindung von 4% auf 64%. Somit kann das Ausführen einer Verfeinerung der Gitterausrichtung die Genauigkeit der Gitterausrichtung signifikant erhöhen.
Softwareanhang Software-Listing des Algorithmus

Claims

Computerimplementiertes Verfahren zur Ausrichtung gescannter Bilder, aufweisend: Falten eines gescannten Bildes mit einem Filter (351), wobei das gescannte Bild ein erstes Muster beinhaltet, das der Filter in ein erkennbares zweites Muster in einem gefalteten Bild zusammenrollt; und Ausrichten des gescannten Bildes (263) gemäß einer Position des zweiten Musters im gefalteten Bild, dadurch gekennzeichnet, dass der Filter auch dazu dient, Pixelintensitäten, die nicht Teil des ersten Musters im gescannten Bild sind, zu entfernen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zusammenrollen eines gescannten Bildes mit einem Filter das Einstellen eines gefalteten Pixels auf die Differenz zwischen einem ausgewählten ungeraden Pixel und einem ausgewählten geraden Pixel des ersten Musters (509, 511) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der ausgewählte ungerade Pixel die niedrigste Intensität der ungeraden Pixel aufweist und der ausgewählte gerade Pixel die höchste Intensität der geraden Pixel (509) aufweist, wenn die Durchschnittsintensität der ungeraden Pixel größer ist als die Durchschnittsintensität der geraden Pixel (507).
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der ausgewählte ungerade Pixel die höchste Intensität der ungeraden Pixel aufweist und der ausgewählte gerade Pixel die niedrigste Intensität der geraden Pixel (511) aufweist, wenn die Durchschnittsintensität der ungeraden Pixel nicht größer als die Durchschnittsintensität der geraden Pixel (507) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Muster ein Damebrettmuster ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zweite Muster ein Gittermuster ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ausrichten des gescannten Bildes das Ausrichten eines Gitters über dem gescannten Bild (265) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, weiter aufweisend das Einstellen der Position des Gitters, um die Summe der Intensitäten der Pixel entlang einer Richtung im Gitter (557) zu minimieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das gescannte Bild mehrere Kopien des ersten Musters enthält.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das gescannte Bild ein Rechteck mit einer Kopie des ersten Musters in der Nähe jeder Ecke ist.
Verfahren nach Anspruch 1, aufweisend das Erhalten des gescannten Bildes durch: Synthetisieren eines Chips mit angehängten Nucleinsäuresequenzen, wobei der Chip ein erstes Muster von Nucleinsäuresequenzen aufweist; Hybridisieren markierter Nucleinsäuresequenzen zu Nucleinsäuresequenzen auf dem Chip; und Scannen des hybridisierten Chips zum Produzieren des gescannten Bildes.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das erste Muster ein Damebrettmuster ist und die markierten Nucleinsäuresequenzen Kontrollnucleinsäuresequenzen umfassen, welche zu wechselnden Quadraten im Damebrettmuster hybridisieren.
Computerprogrammprodukt, aufweisend ein computerlesbares Medium, einen Computerspeichercode, der es einem Computer ermöglicht, beim Abarbeiten des Codes das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 auszuführen.
Computerprogrammprodukt nach Anspruch 13, weiter aufweisend: einen Computercode, der bei seiner Abarbeitung als Eingabe ein gescanntes Bild eines Chips mit angehängten Nucleinsäuresequenzen empfängt, an dem die markierten Nucleinsäuresequenzen hybridisiert werden, wobei der Chip ein erstes Muster von Nucleinsäuresequenzen umfasst.
Computersystem, aufweisend einen Computer, der dafür programmiert ist, das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 auszuführen.
System nach Anspruch 15, wobei der Computer dafür programmiert ist, als Eingabe ein gescanntes Bild eines Chips mit angehängten Nucleinsäuresequenzen zu empfangen, an dem markierte Nucleinsäuresequenzen hybridisiert werden, wobei der Chip ein erstes Muster von Nucleinsäuresequenzen umfasst.
System nach Anspruch 16, weiter aufweisend einen Chip, wobei eine Anzahl an Nucleinsäuresequenzen am Chip in dem ersten Muster angehängt sind, so dass das erste Muster in das zweite Muster gefaltet werden kann, um den Chip für das Scannen auszurichten.