DE69823657T2

DE69823657T2 - Reagens, das zur Herstellung von geschwefelten Oligonukleotidanaloga geeignet ist

Info

Publication number: DE69823657T2
Application number: DE69823657T
Authority: DE
Inventors: S. Zacharia CHERUVALLATH; C. Daniel CAPALDI; T. Vasulinga RAVIKUMAR; L. Douglas COLE
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-03-03
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2018-03-04
Also published as: US6040438A; US5902881A; AU6680498A; DE69823657D1; ATE266001T1; EP0983233B1; EP0983233A1; EP0983233A4; WO1998039290A1; JP2000510872A; US6399831B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Synthetisieren geschwefelter Oligonukleotidanaloga durch Umsetzen eines Oligonukleotidanalogons, das eine trivalente Phosphorverknüpfung enthält, mit einem Dithiokohlensäurediester-Polysulfid.
Diskussion des Hintergrunds
Es ist wohlbekannt, daß die meisten körperlichen Zustände in Säugetieren, einschließlich der meisten Krankheitszustände, durch Proteine bewirkt werden. Durch direktes Wirken oder durch ihre enzymatischen Funktionen tragen Proteine zu einem großen Teil zu vielen Krankheiten in Tieren und im Menschen bei.
Klassische Therapeutika haben sich im allgemeinen auf die Wechselwirkungen mit solchen Proteinen in einem Bemühen, ihre krankheitsverursachenden oder krankheitspotenzierenden Funktionen zu moderieren, fokussiert. Kürzlich sind jedoch Versuche unternommen worden, die Produktion von Proteinen, die bei Krankheiten beteiligt sind, durch Wechselwirken mit den Boten-RNA(mRNA-)Molekülen, die ihre Synthese steuern, direkt zu hemmen. Diese Wechselwirkungen haben die Hybridisierung von komplementären oder Antisense-Oligonukleotiden oder Oligonukleotidanaloga mit mRNA eingeschlossen. Hybridisierung ist die sequenzspezifische Wasserstoffbindung eines Oligonukleotids oder Oligonukleotidanalogons mit einer mRNA-Sequenz über Watson-Crick-Wasserstoffbindungsbildung. Interferieren mit der Produktion von Proteinen, die bei Krankheiten beteiligt sind, würde maximale therapeutische Ergebnisse mit minimalen Nebenwirkungen ergeben.
Die pharmakologische Aktivität von Antisense-Oligonukleotiden und Oligonukleotidanaloga hängt von einer Zahl von Faktoren ab, die die wirksame Konzentration dieser Mittel an spezifischen intrazellulären Targets beeinflussen. Ein wichtiger Faktor für Oligonukleotide und Analoga davon ist ihre Stabilität gegenüber Nukleasen. Es ist unwahrscheinlich, daß unmodifizierte Oligonukleotide, die Phosphodiesterverknüpfungen enthalten, nützliche therapeutische Mittel sein werden, weil sie durch Nukleasen rasch abgebaut werden. Modifizierte Oligonukleotide, welche nukleaseresistent sind, sind daher sehr erwünscht.
Phosphorthioat- und Phosphordithioat-Oligonukleotidanaloga, in welchen ein beziehungsweise beide Nichtbrückensauerstoffe der natürlichen Phosphodiesterverknüpfung durch Schwefel ersetzt sind, sind besonders vielversprechende Antisense-Therapeutika. Diese Oligonukleotidanaloga sind hochresistent gegenüber Nukleasen, weisen die gleiche Ladung wie natürliche Phosphodiesterverknüpfungen enthaltende Oligonukleotide auf und werden durch Zellen in therapeutisch wirksamen Mengen aufgenommen. Siehe zum Beispiel Baracchini et al., U.S. 5,510,239, Ecker, U.S. 5,512,438, Bennett et al., U.S. 5,514,788 und Ecker et al., U.S. 5,523,389.
Phosphorthioat- und Phosphordithioat-Oligonukleotidanaloga werden bequem mit automatischen DNA-Synthesizern unter Anwendung von Hydrogenphosphonatchemie synthetisiert, welche erlaubt, das Phosphonatrückgrat in einem einzigen Schritt nach der automatischen Synthese zu schwefeln. Ein Nachteil dieses Ansatzes ist, daß Kupplungsausbeuten während der Kettensynthese typischerweise niedriger sind als solche, die unter Anwendung von Phosphoramiditchemie erhalten werden. Die Endausbeute des gewünschten Oligonukleotidanalogons ist daher zu niedrig aufgrund niedriger individueller Kupplungsausbeuten.
Die automatische Synthese unter Anwendung von Phosphoramiditchemie ist ein sehr erwünschter Ansatz für die Synthese dieser geschwefelten Oligonukleotidanaloga mit Kupplungsausbeuten, die typischerweise größer als 99% sind. Allerdings sind die Phosphor(III)-enthaltenden Phosphitzwischenstufen instabil unter den Bedingungen des Detritylierungsschritts des Synthesezyklus. Daher müssen diese Phosphor(III)verknüpfungen nach jedem Kupplungsschritt geschwefelt werden.
Ein neueres Verfahren für die Synthese von Oligonukleotidanaloga ist der "Blockmer"-Ansatz. Bei der Blockmersynthese wird ein Oligonukleotidanalogon durch sequentielles Kuppeln von kurzen, geschützten Oligomeren oder Blöcken, z. B. einem Dinukleotid, auf einem festen Träger hergestellt. Diese Strategie eröffnet einige Vorteile gegenüber dem herkömmlichen synthetischen Ansatz, welcher das sequentielle Kuppeln von monomeren Nukleosidphosphoramiditen einschließt. Die Zahl der Synthesezyklen, die erforderlich sind, ein Oligonukleotidanalogon herzustellen, wird vermindert, wodurch Zeit gespart und der Reagenzienverbrauch minimiert wird. Die Blöcke können in einem großen Maßstab unter Anwendung preiswerter Lösungsphasensynthesetechniken hergestellt werden. Um geschwefelte Oligonukleotidanaloga mit dem Blockmerverfahren herzustellen, ist ein Reagenz zum Schwefeln der Phosphor(III)verknüpfungen der Blöcke in einem großen Maßstab erforderlich. Der Blockmer-Ansatz wird in den folgenden Literaturstellen beschrieben: Ravikumar et al., WO 95/32980, WO 94/15947, Journal of Organic Chemistry 1984, 49, 4905–4912, Helvetica Chimica Acta 1985, 68, 1907–1913, Chem. Pharm. Bull. 1987, 35, 833–836.
Es sind einige Reagenzien zum Schwefeln der Phosphitzwischenstufen während der automatischen Oligonukleotidsynthese erhältlich. Alle diese Reagenzien haben Nachteile, welche ihre Verwendung für die Synthese geschwefelter Oligonukleotidanaloga beschränken.
Elementarer Schwefel zum Beispiel ist verwendet worden, um Phosphor(III)verknüpfungen in der Festphasenoligonukleotidsynthese zu schwefeln. Allerdings ist elementarer Schwefel wegen seiner schlechten Löslichkeit in Standardlösungsmitteln und der langsamen Schwefelungsgeschwindigkeit nicht geeignet für die Verwendung mit automatischen Synthesizern. Außerdem ist Kohlenstoffdisulfid, das bevorzugte Lösungsmittel für elementaren Schwefel, hochflüchtig und hat einen niedrigen Flammpunkt. Siehe U.S. 5,232,723 und U.S. 5,449,769.
Das Beaucage-Reagenz 3H-1,2-benzodithiol-3-on ist ein beträchtlich wirksameres Schwefelungsmittel. Allerdings fällt dieses Reagenz aus der Lösung aus und verstopft die Lösungsmittel- und Reagenzübertragungsleitungen eines automatischen DNA-Synthesiziers. Auch ist das während der Schwefelungsreaktion gebildete Beiprodukt ein wirksames Oxidationsmittel. Dieses Beiprodukt kann zu Nebenprodukten führen, z. B. Phosphodiestern, welche schwer von den gewünschten geschwefelten Oligonukleotiden abzutrennen sind. Außerdem schließt die Herstellung dieses Reagenzes teure und toxische Materialien ein und ist daher nicht für Synthesen geschwefelter Oligonukleotidanaloga in großem Maßstab zugänglich. Siehe U.S. 5,003,097.
Tetraethylthiuramdisulfid ist ein preiswertes und chemisch stabiles Schwefelungsmittel. Allerdings ist die Schwefelungsgeschwindigkeit langsam, und daher ist ein signifikanter molarer Überschuß dieses Reagenzes erforderlich. Auch mit einem Überschuß dieses Reagenzes sind die Schwefelungsausbeuten inakzeptabel niedrig. Siehe U.S. 5,166,387.
Phenylacetyldisulfid kann verwendet werden, um Phosphitzwischenstufen während der automatischen Oligonukleotidsynthese zu schwefeln. Allerdings ist von diesem Reagenz nicht berichtet worden, daß es für die Synthese von geschwefelten Oligonukleotidanaloga in großem Maßstab nützlich sei. Siehe Recherches Travaux Chimiques des Pays-Bas 1991, 110, 325–331, Tetrahedron Letters 1989, 30, 6757–6760, Synthesis 1981, 637–638.
Entsprechend besteht in der Wissenschaft weiter ein Bedarf für Verfahren und Reagenzien für die Synthese geschwefelter Oligonukleotidanaloga, welche diese Probleme überwinden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Synthetisieren eines geschwefelten Oligonukleotids unter Verwendung eines Reagenzes, das eine Phosphor(III)verknüpfung in einem Oligonukleotidanalogon wirksam schwefelt.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Synthetisieren eines geschwefelten Oligonukleotids unter Verwendung eines Reagenzes, das die Verwendung von Lösungsmitteln mit hoher Flüchtigkeit und Flammpunkt nicht erfordert.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Synthetisieren eines geschwefelten Oligonukleotids unter Verwendung eines Reagenzes, das hochlöslich in organischen Lösungsmitteln ist und nicht aus der Lösung ausfällt.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Synthetisieren eines geschwefelten Oligonukleotids unter Verwendung eines Reagenzes, das in der automatischen Festphasensynthese von Oligonukleotidanaloga nützlich ist.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Synthetisieren eines geschwefelten Oligonukleotids unter Verwendung eines Reagenzes, das mit Synthesen in großem Maßstab und in kleinem Maßstab unter Anwendung von Lösungsphasenverfahren kompatibel ist.
Diese Aufgaben und andere können gelöst werden mit einem Verfahren zum Synthetisieren eines geschwefelten Oligonukleotidanalogons durch Umsetzen eines Oligonukleotidanalogons, das eine Phosphor(III)verknüpfung enthält, die in der Lage ist, geschwefelt zu werden mit einem Thiodikohlensäurediester-Polysulfid mit der Formel:
wobei jede Gruppe R eine inerte Seitenkette ist und n 2, 3 oder 4 ist.
Die obigen Aufgaben können auch gelöst werden mit einem Verfahren zum Synthetisieren eines geschwefelten Oligonukleotidanalogons durch

(a) das Bereitstellen eines Nukleosidanalogons mit einer blockierten Hydroxylgruppe,
(b) das Entblockieren der blockierten Hydroxylgruppe, um eine freie Hydroxylgruppe herzustellen,
(c) das Umsetzen der freien Hydroxylgruppe mit einem geschützten Nukleosidanalogon-Phosphoramidit oder einem geschützten Nukleosidanalogon-Phosphorthioamidit mit einer blockierten Hydroxylgruppe, um ein Oligonukleotidanalogon herzustellen, das eine Phosphor(III)verknüpfung und eine blockierte Hydroxylgruppe enthält,
(d) das Umsetzen der Phosphor(III)verknüpfung mit einem Reagenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Oxidationsmittel und einem Dithiocarbonsäurediester-Polysulfid, um eine oxidierte oder geschwefelte Phosphor(V)verknüpfung herzustellen,
(e) das Wiederholen der Schritte (b) bis (d) mindestens einmal, um ein geschwefeltes Oligonukleotidanalogon herzustellen,

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine vollständigere Würdigung der Erfindung und viele der damit verbundenen Vorteile werden leicht erhalten werden, sobald sie durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung verstanden wird.
Wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, schließt der Ausdruck "Oligonukleotidanalogon" lineare Oligomere natürlicher oder modifizierter Nukleoside verknüpft durch Phosphodiesterbindungen oder Analoga davon in einem Größenbereich von zwei monomeren Einheiten bis zu einigen hundert monomeren Einheiten ein. Oligonukleotidanaloga schließen Modifikationen des heterocyclischen Basenrestes und/oder des Zuckerteils einer Nukleotidkomponente ein. Insbesondere schließt der Ausdruck nicht-natürliche Oligomere ein, enthaltend Phosphor(III)verknüpfungen, welche der Schwefelung zugänglich sind. Bevorzugt hemmen die Modifikationen nicht die Fähigkeit eines Oligonukleotidanalogons, an eine Target-Nukleinsäure zu binden. Der Ausdruck "geschwefeltes Oligonukleotidanalogon" ist ein Oligonukleotidanalogon, enthaltend mindestens ein Analogon einer Phosphodiesterverknüpfung, in welcher eine oder beide Nichtbrückensauerstoffatome durch Schwefel ersetzt sind. Der Ausdruck "Nukleosidanalogon" bezieht sich auf natürliche oder modifizierte Nukleoside. Insbesondere schließt dieser Ausdruck Nukleoside ein, die an der heterocyclischen Base und/oder dem Zucker modifiziert sind, um die Hybridisierung mit den Target-Nukleinsäuren zu verstärken. Es sollte verstanden werden, daß die stereochemische Beziehung zwischen den Zuckersubstituenten in den hier offenbarten Nukleosid- und Oligonukleotidanaloga bevorzugt die gleiche ist wie die natürlich vorkommender DNA und RNA, siehe G. M. Blackburn und M. J. Gait (Hrsg.), Nucleic Acids in Chemistry and Biology (ILR Press, 1990), Kapitel 2, S. 19–70.
Das Thiodikohlensäurediester-Polysulfid der vorliegenden Erfindung hat bevorzugt die Formel:
wobei jede Gruppe R bevorzugt eine inerte Gruppe ist. Diese Gruppen enthalten bevorzugt keine reaktiven Reste, welche zu Nebenreaktionen oder schlechten Ausbeuten bei der Schwefelungsreaktion führen könnten. Bevorzugt ist jede Gruppe R unabhängig voneinander C₁-C₈-Alkyl, substituiertes C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertes C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertes C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder substituiertes C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome. Der Ausdruck "C₁-C₈-Alkyl" schließt lineare, verzweigte und cyclische Alkylgruppen ein. Der Ausdruck "substituiert" bedeutet, daß bis zu drei Wasserstoffatome in der Gruppe durch bis zu drei Halogen-, Nitro-, Cyano-, C₁-C₈-Alkyl-, O-C₁-C₈-Alkyl-, N-C₁-C₈-Alkyl, S-C₁-C₈-Alkyl-Gruppen oder Kombinationen davon substituiert sein können. Besonders bevorzugt ist jede Gruppe R unabhängig voneinander C₂-C₈-Alkyl, C₆-C₁₄-Aryl oder substituiertes C₆-C₁₄-Aryl. Insbesondere ist jede Gruppe R unabhängig voneinander Ethyl oder p-Chlorphenyl. Das Dithiocarbonsäurediester-Polysulfid kann ein Disulfid, Trisulfid oder Tetrasulfid sein, d. h. n ist 2, 3 beziehungsweise 4. Bevorzugt ist n 2 oder 3, besonders bevorzugt ist n 2.
Das Thiodikohlensäurediester-Polysulfid kann durch Oxidation der entsprechenden Thiodikohlensäure oder des entsprechenden Säuresalzes mit Oxidationsmitteln wie Iod oder Brom hergestellt werden. Verfahren zur Synthese von und Eigenschaften von diesen Polysulfiden sind in den folgenden Literaturstellen beschrieben: Barany et al., Journal of Organic Chemistry, 1983, 48, 4750–4761, W. F. Zeise, J. Prakt. Chem. 1845, 36, 352–362, Losse et al., J. Prakt. Chem. 1961, 13, 260, S. R. Rao, Xanthates and Related Compounds, (M. Decker, New York, 1971), Bulmer et al., J. Chem. Soc. 1945, 674–677.
Das Thiodikohlensäurediester-Polysulfid der vorliegenden Erfindung ist ein effizientes Reagenz zum Schwefeln von Phosphor(III)verknüpfungen in Oligonukleotidanaloga. Das Reagenz fällt nicht aus der Lösung aus, selbst bei längerer Lagerung. Das Reagenz kann in der Lösungsphasensynthese verwendet werden und ist besonders nützlich in der Festphasensynthese von Oligonukleotidanaloga mit automatischen DNA-Synthesizern. Das Reagenz ist insbesondere nützlich in der Synthese in großem Maßstab unter Verwendung entweder von Lösungsphasen- oder Festphasentechniken.
Wenn es verwendet wird, um Phosphor(III)verknüpfungen in Oligonukleotidanaloga zu schwefeln, wird das Thiodikohlensäurediester-Polysulfid dem Oligonukleotidanalogon bevorzugt in einem organischen Lösungsmittel wie Acetonitril, Pyridin, Tetrahydrofuran, Dichlormethan, Dichlorethan und Collidin zugeführt. Diese Lösungsmittel können einzeln oder als Mischungen in jedem Verhältnis verwendet werden. Bevorzugte Lösungsmittel sind Pyridin, Dichlormethan und Mischungen davon. Pyridin ist am meisten bevorzugt. Das Reagenz kann in jeder wirksamen Konzentration zum Schwefeln einer Phosphor(III)verknüpfung verwendet, bevorzugt zwischen 0,01 M bis 1,5 M, besonders bevorzugt von 0,2 bis 1,2 M und insbesondere von 0,5 bis 1,0 M.
Die Schwefelungsreaktion kann bei jeder passenden Temperatur ausgeführt werden, bevorzugt von 0 bis 70 EC, besonders bevorzugt von 10 bis 40 EC und insbesondere bei Raumtemperatur, d. h. 18 bis 25 EC. Die Schwefelungsreaktion wird bevorzugt für 30 Sekunden bis 15 Minuten, besonders bevorzugt 1 bis 15 Minuten und insbesondere 3 bis 10 Minuten ausgeführt. Bevorzugt wird die Schwefelung unter wasserfreien Bedingungen und Ausschluß von Luft durchgeführt.
Das vorliegende Verfahren zum Synthetisieren eines geschwefelten Oligonukleotidanalogons kann auf jedes Oligonukleotidanalogon angewendet werden, das mindestens eine Phosphor(III)verknüpfung enthält, welche der Schwefelung zugänglich ist. Insbesondere ist das vorliegende Verfahren nützlich zum Schwefeln von Phosphittriestern, Thiophosphittriestern und Hydrogenphosphonaten. Besonders bevorzugt ist die Phosphor(III)verknüpfung ein Phosphittriester oder ein Thiophosphittriester. Insbesondere ist die Phosphor(III)verknüpfung ein Phosphittriester.
Detaillierte Vorschriften zum Synthetisieren von Oligonukleotidanaloga, die mindestens eine Phosphor(III)verknüpfung enthalten, sind im Stand der Technik wohlbekannt und werden in den folgenden Literaturstellen beschrieben: M. J. Gait (Hrsg.), Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach (ILR Press, 1984); J. S. Cohen (Hrsg.), Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1989).
Bevorzugt wird das Dithiocarbonsäurediester-Polysulfid der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit den Phosphoramidit- oder Phosphorthioamidit-Syntheseansätzen verwendet. Die Synthese kann in Lösungsphase oder unter Anwendung von Festphasentechniken durchgeführt werden. Besonders bevorzugt wird die Synthese unter Verwendung eines festen Trägers durchgeführt. Insbesondere wird die Synthese auf einem Festphasenträger unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers, z. B. eines APPLIED BIOSYSTEMS Modell 380B oder einer ähnlichen Maschine, durchgeführt.
Bevorzugt umfaßt dieser Syntheseansatz die folgenden Schritte: (1) das Entschützen einer blockierten reaktiven Funktionalität an der wachsenden Oligonukleotidanalogon-Kette oder an dem ersten Nukleosidanalogonmonomer, um eine entblockierte reaktive Funktionalität herzustellen, (2) das Umsetzen eines geeignet blockierten und geschützten Nukleosidanalogon-Phosphoramidit- oder -Phosphorthioamiditmonomers mit der entblockierten reaktiven Funktionalität der wachsenden Nukleotidanalogon-Kette, bevorzugt in Gegenwart eines Aktivators, um ein Oligonukleotidanalogon enthaltend eine Phosphor(III)verknüpfung zu bilden, (3) die Cap-Bildung jedweder nicht ungesetzter Funktionalitäten und (4) das Schwefeln der neu gebildeten Phosphor(III)verknüpfung mit dem Thiodikohlensäurediester-Polysulfid, um das Phosphoratom in einem geschwefelten pentakoordinierten Zustand zu erhalten.
Der Ausdruck "blockiert" bedeutet, daß eine reaktive Funktionalität, üblicherweise ein Nukleophil, z. B. ein 5'-Hydroxyl, mit einer Gruppe geschützt wird, die selektiv entfernt werden kann. Bevorzugt sind diese Blockierungsgruppen labil gegenüber verdünnter Säure, z. B. Dichloressigsäure in Dichlormethan, und stabil gegenüber Base. Bevorzugte Blockierungsgruppen schließen 4,4'-Dimethoxytrityl (DmTr), Monomethoxytrityl, Diphenylmethyl, Phenylxanthen-9-yl (Pixyl) oder 9-(p-Methoxyphenyl)xanthen-9-yl (Mox) ein. Die 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ist am meisten bevorzugt. In der vorliegenden Offenbarung wird die labile 5'-Blockierungsgruppe als "R⁶" dargestellt.
Jede natürliche oder nicht-natürliche heterocyclische Base kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 2-Aminopurin, Inosin, substituierte Pyrimidine, z. B. 5-Methylcytosin, und 5-Nitropyrrol. Andere geeignete heterocyclische Basen werden von Merigan et al., U.S. 3,687,808, beschrieben. Bevorzugt ist die heterocyclische Base mit C-1 des Zuckerrestes des Nukleosidanalogon-Phosphoramidits (1) über einen Stickstoff der Base verbunden. In der vorliegenden Offenbarung wird die heterocyclische Base als "B" dargestellt.
Während der Synthese werden diese heterocyclischen Gruppen bevorzugt geschützt, um zu verhindern, daß irgendeine reaktive Gruppe, z. B. eine exocyclische Aminogruppe, unerwünschte Nebenreaktionen eingeht. Der Ausdruck "geschützt" bedeutet, daß die reaktiven Reste wie exocyclische Aminogruppen, 2'-Hydroxylgruppen, Sauerstoff oder Schwefel gebunden an Phosphoratome und dergleichen Schutzgruppen aufweisen, welche im allgemeinen entfernt werden, nachdem die Synthese des Oligonukleotidanalogons vollendet ist. Bevorzugt sind diese Schutzgruppen labil gegenüber einer Base und/oder einem Nukleophil. Dieser Ausdruck schließt auch Oligonukleotid- und Nukleosidanaloga ein, welche Gruppen aufweisen, die keinen solchen Schutz erfordern, z. B. heterocyclische Basen wie Thymin oder abasische Nukleoside.
Bevorzugte Schutzgruppen für diese heterocyclischen Basen schließen basenlabile Gruppen ein. Die exocyclischen Aminogruppen der heterocyclischen Gruppen werden bevorzugt geschützt mit Acylgruppen, die durch Basenbehandlung nach der Synthese des geschwefelten Oligonukleotidanalogons entfernt werden. Bevorzugt sind diese Schutzgruppen C₂-C₁₀-Acylgruppen. N-Benzoyl- und N-Isobutyryl-Schutzgruppen sind besonders bevorzugt. Adenin wird bevorzugt als ein N²-Isobutyrylderivat geschützt. Guanin wird bevorzugt als ein N⁶-Isobutyrylderivat geschützt. Cytidin wird bevorzugt als ein N⁴-Benzoylderivat geschützt.
Die geschwefelten Nukleotidanaloga der vorliegenden Erfindung können an der 2'-Position substituiert sein. Bevorzugte 2'-Substituenten sind Gruppen, die die Hybridisierung eines Oligonukleotidanalogons mit seiner Target-Nukleinsäure verstärken, eine Gruppe, die die in vivo-Stabilität eines Oligonukleotidanalogons verbessert oder die pharmakokinetischen und/oder pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonukleotidanalogons erhöht. Beispiele von 2'-Substituenten schließen Wasserstoff, Hydroxyl, F, Cl, Br, C₁-C₈-Alkyl, substituiertes C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertes C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertes C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₁-C₈-Alkyl, substituiertes O-C₁-C₈-Alkyl (wie CF₃), O-C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes O-C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₆-C₁₄-Aryl (wie Phenyl), substituiertes O-C₆-C₁₄-Aryl-, O- C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes O-C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₇-C₁₈-Aralkyl (wie Benzyl), substituiertes O-C₇-C₁₈-Aralkyl, O-C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes O-C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₁-C₈-Alkyl-O-C₁-C₈-alkyl, O-C₁-C₈-Alkenyl, O-C₁-C₈-Alkoxyamino, O-Tri-C₁-C₈-alkylsilyl (wie tert.-Butyldimethylsilyl), substituiertes O-Tri-C₁-C₈-alkylsilyl, NH-C₁-C₈-Alkyl, N-(C₁-C₈)₂, NH-C₁-C₈-Alkenyl, N-(C₁-C₈)₂-Alkenyl, S-C₁-C₈-Alkyl, S-C₁-C₈-Alkenyl, NH₂, N₃, NH-C₁-C₈-Alkyl-NH₂, Polyalkylamino und eine RNA-spaltende Gruppe ein. Bevorzugte RNA-spaltende Gruppen schließen die O-{3-Propoxy-[2-naphthyl-7-(1-(dimethylaminosulfonyl)-imidazol-4-yl)]}-Gruppe und die O-{3-Propoxy-[2-naphthyl-7-(1-(dimethylaminosulfonyl-2-methoxy-5-acetylaminomethyl)-imidazol-4-yl)]}-Gruppe ein: Diese Gruppen werden von Cook et al., U.S. 5,359,051, diskutiert.
Bevorzugt sind die 2'-Substituenten Wasserstoff, Hydroxyl, O-C₁-C₈-Alkyl, F, O-C₁-C₈-Alkoxyamino und O-C₁-C₈-Alkyl-O-C₁-C₈-alkyl. Besonders bevorzugt sind die 2'-Substituenten Wasserstoff, O-C₁-C₈-Alkyl, F und O-C₁-C₈-Alkyl-O-C₁-C₈-alkyl. Insbesondere ist der 2'-Substituent Wasserstoff oder eine Methoxyethoxygruppe. In der vorliegenden Offenbarung wird der 2'-Substituent als "X" dargestellt.
Eine Reihe von Schutzgruppen für die Sauerstoff- und Schwefelatome, die an das Phosphoratom in dem Nukleosidanalogon-Phosphoramidit beziehungsweise -Phosphorthioamidit gebunden sind, können verwendet werden. Diese Schutzgruppen werden bevorzugt entfernt, nachdem die Synthese vollendet ist. Bevorzugt sind diese Schutzgruppen labil gegenüber einer Base und/oder einem Nukleophil. Insbesondere werden diese Schutzgruppen durch wäßriges Ammoniumhydroxid entfernt. Bevorzugte Schutzgruppen sind 2-Cyanoethyl, 4-Cyano-2-butenyl, 2-Diphenylmethylsilylethyl (DPSE) oder eine 2-N-Amidoethylgruppe mit der Formel R¹CONR²CHR³CHR⁴-. Diese Schutzgruppen werden bevorzugt nach der Synthese entfernt, bevorzugt mit einer wäßrigen Lösung von Ammoniak bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 75°C. In der vorliegenden Erfindung beschreiben die Ausdrücke "Phosphodiesterverknüpfung", "Phosphorthioatverknüpfung" und "Phosphordithioatverknüpfung" diese Internukleosidverknüpfungen in geschützter oder ungeschützter Form. In der vorliegenden Offenbarung werden diese Phosphorschutzgruppen als "Pg" dargestellt werden. Ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom, das an das Phosphoratom in einem Nukleosidanalogon-Phosphoramidit oder -Thiophosphoramidit oder einem Oligonukleotidanalogon gebunden ist, wird als ein "Y" dargestellt. Bevorzugt ist Y ein Sauerstoffatom.
Die 4-Cyano-2-butenyl-Schutzgruppe wird durch ä-Eliminierung entfernt, bevorzugt unter Verwendung der üblichen, im Stand der Technik bekannten NH₃/H₂O-Entschützungsbedingungen. 4-Cyano-2-butenyl-geschützte Nukleosidanalogon-Phosphoramidite können mit 4-Cyano-2-buten-1-ol und entsprechend geschützten Nukleosidanaloga unter Anwendung bekannter synthetischer Methoden hergestellt werden. Die Synthese von 4-Cyano-2-buten-1-ol wird von Ravikumar et al., Synthetic Communications 1996, 26(9), 1815–1819, offenbart.
Die 2-Diphenylmethylsilylethyl-(DPSE-)Schutzgruppe wird in Ravikumar et al., WO 95/04065, beschrieben. Diese Schutzgruppe kann durch Behandlung mit einer Base, bevorzugt wäßriges Ammoniumhydroxid, entfernt werden. Die DPSE-Gruppe kann auch mit Fluoridion entfernt werden. Bevorzugt wird das Fluoridion durch ein Salz wie Tetraalkylammoniumfluorid, z. B. Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF), oder ein anorganisches Fluoridsalz, z. B. Kaliumfluorid oder Cäsiumfluorid, in einem Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran, Acetonitril, Dimethoxyethan oder Wasser bereitgestellt.
Die 2-N-Amidoethylgruppe wird in der gemeinsam übertragenen Anmeldung US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/811,232 beschrieben. Die 2-N-Amidoethylgruppe weist die Formel R¹CONR²CHR³CHR⁴- auf, wobei R¹ C₁-C₈-Alkyl, substituiertes C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertes C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertes C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder substituiertes C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome ist. Besonders bevorzugt ist R¹ C₁-C₈-Alkyl, substituiertes C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertes C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder substituiertes C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome. Ganz besonders bevorzugt ist R¹ Methyl, Fluormethyl, Difluormethyl oder Trifluormethyl. Insbesondere ist R¹ Methyl, Trifluormethyl oder Phenyl.
Das Stickstoffatom der 2-N-Amidoethylgruppe kann unsubstituiert, d. h. R² kann Wasserstoff sein, oder substituiert sein. Bevorzugt ist R² Wasserstoff, C₁-C₈-Alkyl, substituiertes C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertes C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertes C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder substituiertes C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome. Besonders bevorzugt ist R² Wasserstoff oder C₁-C₈-Alkyl. Insbesondere ist R² Wasserstoff oder Methyl.
Der Ethylrest der 2-N-Amidoethylgruppe kann unsubstituiert sein, z. B. können R³ und R⁴ beide Wasserstoff sein. Alternativ kann der Ethylrest mit Gruppen substituiert sein, die bevorzugt die Stabilität der 2-N-Amidoethylgruppe während der Oligonukleotidanalogon-Synthese nicht beeinträchtigen und erlauben, die Schutzgruppe durch Behandlung mit einer Base und/oder einem Nukleophil nach dem stufenartigen Aufbau eines Oligonukleotidanalogons zu entfernen. Bevorzugte Gruppen R³ und R⁴ sind Wasserstoff, C₁-C₈-Alkyl, substituiertes C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆- C₁₄-Aryl, substituiertes C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertes C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder substituiertes C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome. Besonders bevorzugt ist R³ Wasserstoff oder lineares C₁-C₈-Alkyl. Insbesondere ist R³ Wasserstoff oder Methyl. Besonders bevorzugt ist R⁴ Wasserstoff, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertes C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder substituiertes C₃-C₁₁-Heteroaryl enthaltend bis zu drei Heteroatome. Insbesondere ist R⁴ Wasserstoff oder Phenyl. Die Gruppen R³ und R⁴ sind unabhängig voneinander ausgewählt, d. h. sie können gleich oder verschieden sein.
Alternativ können R³ und R⁴ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, eine C₃-C₈-Cycloalkylgruppe, eine substituierte C₃-C₈-Cycloalkylgruppe, eine C₂-C₈-Heterocycloalkylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder eine substituierte C₂-C₈-Heterocycloalkylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome, bilden. In dieser Ausführungsform bilden R³ und R⁴ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, bevorzugt eine C₃-C₈-Cycloalkylgruppe oder eine substituierte C₃-C₈-Cycloalkylgruppe. Besonders bevorzugte Cycloalkylgruppen sind C₄-C₇- oder substituierte C₄-C₇-Cycloalkylgruppen, wobei C₅-C₆- oder substituierte C₅-C₆-Gruppen insbesondere bevorzugt sind. Eine unsubstituierte Cycloalkylgruppe ist besonders bevorzugt. Eine unsubstituierte C₆-Cycloalkylgruppe ist insbesondere bevorzugt. Die stereochemische Beziehung zwischen der N-Amidogruppe und Y kann cis oder trans sein. Eine trans-Beziehung ist bevorzugt.
Eine Allylgruppe ist ebenfalls eine bevorzugte Schutzgruppe für das Sauerstoff- oder Schwefelatom, das an das Phosphoratom in einem Oligonukleotidanalogon gebunden ist. Die Allylschutzgruppe wird in U.S. 5,026,838 beschrieben. Der Ausdruck "Allylgruppe" schließt Allyl-, Methallyl-, Crotyl-, Phenyl-, Geranyl-, Cinnamyl- und p-Chlorcinnamylgruppen ein. Die Zahl der Kohlenstoffatome in diesen Gruppen ist bevorzugt 3 bis 10. Bevorzugt ist die Allylgruppe eine unsubstituierte Allylgruppe. Die Allylgruppe kann mit einer Palladium(0)-Verbindung und einem nukleophilen Mittel wie einem Amin oder einem Ameisensäuresalz unter neutralen Bedingungen bei Raumtemperatur entfernt werden. Ein bevorzugtes Reagenz ist Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) und n-Butylamin in Tetrahydrofuran.
Ein Aktivator wird im allgemeinen beim Kuppeln einer entblockierten reaktiven Funktionalität an dem Oligonukleotid- oder Nukleosidanalogon und des Phosphoramidit- oder Phosphorthioamiditmonomers. Bevorzugte Aktivatoren sind im Stand der Technik wohlbekannt, wie 1H-Tetrazol, 5(4-Nitrophenyl)-1H-tetrazol und Diisopropylaminotetrazolid. 1H-Tetrazol ist insbesondere bevorzugt.
Ein Cap-Bildungsschritt wird bevorzugt angewendet nach dieser Kupplungsreaktion, um alle nicht gekuppelten reaktiven Funktionalitäten permanent zu blockieren. Geeignete Cap-Bildungsreagenzien sind im Stand der Technik wohlbekannt. Ein bevorzugtes Cap-Bildungsreagenz ist Acetanhydrid/Lutidin/THF (1 : 1 : 8) mit N-Methylimidazol/THF.
Wenn die Synthese mit Lösungsphasenverfahren ausgeführt wird, wird die 3'-terminale Hydroxylgruppe eines Oligonukleotidanalogons bevorzugt geschützt, um die 3'-Hydroxylgruppe daran zu hindern, an irgendwelchen unerwünschten Nebenreaktionen teilzunehmen. Bevorzugt wird die terminale 3'-Hydroxylgruppe mit einer Gruppe geschützt, welche selektiv entfernt werden kann, ohne irgendwelche andere Schutzgruppen zu entfernen. Eine C₂-C₁₀-Acylgruppe ist bevorzugt. Die Acetyl- oder Levulinylgruppe ist besonders bevorzugt. Die Levulinylgruppe ist insbesondere bevorzugt. In der vorliegenden Offenbarung wird diese 3'-Schutzgruppe als "R⁷" dargestellt.
Die sequentielle Addition von Nukleosidanalogon-Phosphoramiditen oder -Phosphorthioamiditen kann wiederholt werden, bis ein Oligonukleotidanalogon mit der gewünschten Sequenzlänge erhalten worden ist. Die Länge des geschwefelten Oligonukleotidanalogons ist bevorzugt 2 bis 200 Monomereinheiten, besonders bevorzugt 2 bis 100 Monomereinheiten, ganz besonders bevorzugt 2 bis 50 Monomereinheiten und insbesondere 2 bis 25 Monomereinheiten. Diese Bereiche schließen alle Unterbereiche dazwischen ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein geschwefeltes Oligonukleotidanalogon an einem festen Träger synthetisiert. Geeignete feste Träger schließen Controlled-Pore-Glass (CPG), Oxalyl-Controlled-Pore-Glass, siehe zum Beispiel Alul et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527; TENTAGEL-Träger, siehe Wright et al., Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373; POROS, ein Polystyrolharz erhältlich von PERCEPTIVE BIOSYSTEMS, und ein Polystyrol/Divinylbenzol-Copolymer ein. Controlled-Pore-Glass ist der am meisten bevorzugte feste Träger. In der vorliegenden Offenbarung wird der feste Träger als "S^p" dargestellt.
Das Oligonukleotidanalogon wird bevorzugt an den festen Träger mit einer Gruppe gebunden, welche leicht gespalten werden kann, um das Oligonukleotidanalogon von dem Träger freizusetzen, sobald die Synthese vollendet ist. Bevorzugt kann diese Gruppe durch Exposition gegenüber einer Base und/oder einem Nukleophil gespalten. Besonders bevorzugt ist die Gruppe ein Acyl. Insbesondere ist die Gruppe eine Carboxylgruppe, die mit der terminalen 3'-Hydroxylgruppe des Oligonukleotidanalogons verestert ist. Die Gruppe, die ein Oligonukleotidanalogon mit einem festen Träger verknüpft, wird als "L" in der vorliegenden Offenbarung dargestellt.
Die vorliegende Erfindung schließt geschwefelte Oligonukleotidanaloga, enthaltend Phosphorthioat-, Phosphordithioat- und Phosphodiesterverknüpfungen in jedweder Kombination ein. Die geschwefelten Oligonukleotidanaloga der vorliegenden Erfindung können ausschließlich geschwefelte Verknüpfungen enthalten, z. B. Phosphorthioat und/oder Phosphordithioat. Die Oligonukleotidanaloga können auch eine oder mehrere Phosphodiesterverknüpfungen zusätzlich zu den geschwefelten Verknüpfungen enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das geschwefelte Oligonukleotidanalogon sowohl Phosphorthioat- als auch Phosphodiesterverknüpfungen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält das Oligonukleotid sowohl Phosphordithioat- als auch Phosphodiesterverknüpfungen. Phosphodiesterverknüpfungen werden durch Oxidieren einer Phosphor(III)verknüpfung mit irgendeinem im Stand der Technik bekannten geeigneten Oxidationsmittel, z. B. I₂/THF/H₂O, H₂O₂/H₂O, tert.-Butylhydroperoxid oder eine Persäure wie m-Perchlorbenzoesäure gebildet. I₂/THF/H₂O ist ein bevorzugtes Oxidationsmittel.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Oligonukleotidanalogon enthaltend mindestens eine Phosphor(III)verknüpfung, die Formel:
wobei
jede Gruppe Pg unabhängig voneinander eine Gruppe, die gegenüber einer Base und/oder einem Nukleophil labil ist, oder eine Allylgruppe ist;
R⁶ eine labile Blockierungsgruppe ist;
jede Gruppe B unabhängig voneinander eine ungeschützte oder geschützte heterocyclische Base ist,
jede Gruppe X unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, F, Cl, Br, C₁-C₈-Alkyl, substituiertes C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertes C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertes C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₁-C₈-Alkyl, substituiertes O-C₁-C₈-Alkyl, O-C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes O-C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₆-C₁₄-Aryl, substituiertes O-C₆-C₁₄-Aryl, O-C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes O-C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertes O-C₇-C₁₈-Aralkyl, O-C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes O-C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₁-C₈-Alkyl-O-C₁-C₈-alkyl, O-C₁-C₈-Alkenyl, O-C₁-C₈-Alkoxyamino, O-Tri-C₁-C₈-alkylsilyl, substituiertes O-Tri-C₁-C₈-alkylsilyl, NH-C₁-C₈-Alkyl, N-(C₁-C₈)₂, NH-C₁-C₈-Alkenyl, N-(C₁-C₈)₂Alkenyl, S-C₁-C₈-Alkyl, S-C₁-C₈-Alkenyl, NH₂, N₃, NH-C₁-C₈-Alkyl-NH₂, Polyalkylamino und einer RNA-spaltenden Gruppe, ausgewählt ist,
jede Gruppe Y unabhängig voneinander O oder S ist,
jede Gruppe Z unabhängig voneinander O oder S ist,
L eine Gruppe ist, die gegenüber einem Nukleophil und/oder einer Base labil ist,
S^p ein fester Träger ist und
m 0 oder eine positive ganze Zahl ist.
Bevorzugte Schutzgruppen Pg schließen 2-Cyanoethyl, 4-Cyano-2-butenyl, 2-Diphenylmethylsilylethyl (DPSE) und eine 2-N-Amidoethylgruppe ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Oligonukleotidanalogon, das eine Phosphor(III)verknüpfung enthält, 2 bis 100 Monomereinheiten, d. h. –+m ist 0 bis 98, besonders bevorzugt von 2 bis 50 Monomereinheiten, d. h. m ist 0 bis 48, insbesondere von 2 bis 25 Monomereinheiten, d. h. m ist 0 bis 23.
Behandeln des obigen Oligonukleotidanalogons mit einem Dithiokohlensäurediester-Polysulfid ergibt das entsprechende geschwefelte Oligonukleotidanalogon mit der Formel:
wobei Pg, R⁶, B, X, Y, Z, L, S und m oben definiert sind. Z ist ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom. Angemessene Wahl von Z erlaubt der Internukleosidverknüpfung, die Z enthält, in Abhängigkeit von der Auswahl von Y eine Phosphodiester-, Phosphorthioat- oder Phosphordithioatverknüpfung zu sein. Beispielsweise ist, wenn sowohl Y als auch Z Sauerstoff sind, die Verknüpfung ein Phosphodiester. Wenn Y Sauerstoff ist und Z Schwefel ist oder umgekehrt, ist die Verknüpfung ein Phosphorthioat. Wenn sowohl Y als auch Z Schwefel sind, ist die Verknüpfung ein Phosphordithioat. Bevorzugt ist Y ein Sauerstoffatom und ist Z ein Schwefelatom, welches unter Verwendung des oben beschriebenen Dithiodikohlensäurediester-Polysulfids eingeführt worden ist. Es muß verstanden werden, daß die Ausdrücke Phosphodiester, Phosphorthioat oder Phosphordithioat sich auf die Internukleotidverknüpfung nach dem Entfernen der Pg-Gruppen beziehen.
Nach der Schwefelung kann die Sequenz des geschwefelten Oligonukleotidanalogons weiter ausgedehnt werden. Alternativ kann das geschwefelte Oligonukleotidanalogon entschützt und von dem festen Träger entfernt werden, um das entsprechende entschützte geschwefelte Analogon zu liefern. Das entschützte geschwefelte Analogon kann Phosphorthioat-, Phosphordithioat- oder Phosphodiesterverknüpfungen in jeder Kombination enthalten.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Oligonukleotidanalogon, das mindestens eine Phosphor(III)verknüpfung enthält, ein Dinukleotid mit der Formel:
wobei R⁷ eine Gruppe ist, die labil gegenüber einer Base und/oder einem Nukleophil ist. Schwefeln des Dinukleotidanalogons mit dem Dithiodikohlensäurediester-Polysulfid liefert das entsprechende geschwefelte Dinukleotidanalogon mit der Formel:
Die vorliegende Erfindung stellt auch bereit ein Verfahren zum Synthetisieren eines geschwefelten Oligonukleotidanalogons durch:

(a) das Bereitstellen eines Oligonukleotidanalogons mit einer blockierten Hydroxylgruppe,
(b) das Entblockieren der blockierten Hydroxylgruppe, um eine freie Hydroxylgruppe zu erhalten,
(c) das Umsetzen der freien Hydroxylgruppe mit einem geschützten Nukleosidanalogon-Phosphoramidit mit einer blockierten Hydroxylgruppe, um ein Oligonukleotidanalogon, enthaltend eine Phosphor(III)verknüpfung und eine blockierte Hydroxylgruppe, herzustellen,
(d) Umsetzen der Phosphor(III)verknüpfung mit einem Reagenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Oxidationsmittel und einem Dithiodikohlensäurediester-Polysulfid mit der der Formel:
um eine oxidierte oder geschwefelte Phosphor(V)verknüpfung herzustellen,
(e) das Wiederholen der Schritte (b) bis (d) mindestens einmal, um ein geschwefeltes Oligonukleotidanalogon herzustellen, wobei das Oligonukleotidanalogon mindestens eine geschwefelte Phosphor(V)verknüpfung enthält. Bevorzugt ist jede Phosphor(V)verknüpfung geschwefelt.

Ein bevorzugtes Nukleosidanalogon-Phosphoramidit mit einer blockierten Hydroxylgruppe, das in Schritt (c) verwendet wird, hat die Formel:
Die R⁵-Gruppen werden so gewählt, daß das Nukleosidanalogon-Phosphoramidit bevorzugt effizient mit einer reaktiven Gruppe an der wachsenden Oligonukleotidanalogon-Kette kuppelt, z. B. einer 5'-Hydroxylgruppe, um eine Phosphor(III)internukleotidverknüpfung zu bilden. Die R⁵-Gruppen sind unabhängig voneinander ausgewählt, d. h. sie können gleich oder verschieden sein. Bevorzugte R⁵-Gruppen sind C₁-C₈-Alkyl, substituiertes C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertes C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertes C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertes C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder substituiertes C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder beide R⁵-Gruppen bilden zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, eine C₂-C₈-Heterocycloalkylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome, eine substituierte C₂-C₈-Heterocycloalkylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome, eine C₃-C₁₁-Heteroarylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder eine substituierte C₃-C₁₁-Heteroarylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome. Besonders bevorzugt sind die R⁵-Gruppen jeweils eine C₁-C₈-Alkylgruppe oder bilden zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, eine C₂-C₈-Heterocycloalkylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome. Es ist noch mehr bevorzugt, daß jede R⁵-Gruppe eine verzweigte C₁-C₈-Alkylgruppe ist. Insbesondere sind beide R⁵-Gruppen Isopropyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleosidanalogon in Schritt (a) an einen festen Träger gebunden. Ein bevorzugtes Nukleosidanalogon, das an einen festen Träger gebunden ist, hat die Formel:
In einer anderen Ausführungsform ist das Oligonukleotidanalogon, enthaltend eine Phosphor(III)verknüpfung und eine blockierte Hydroxylgruppe, an einen festen Träger gebunden und hat die Formel:
und hat das entstehende geschwefelte Oligonukleotidanalogon die Formel:
Das an einem festen Träger synthetisierte geschwefelte Oligonukleotidanalogon kann von dem Träger entfernt werden, bevorzugt durch Basenbehandlung. Bevorzugt werden alle Schutzgruppen während der Abspaltung von dem festen Träger entfernt. Bevorzugte Reagenzien zum Abspalten des geschwefelten Oligonukleotidanalogons von dem festen Träger sind wäßriges Ammoniumhydroxid und Ammoniak/Methanol-Lösungen. Die gleichzeitige Entschützung und Entfernung des geschwefelten Oligonukleotidanalogons wird bevorzugt in wäßrigem Ammoniumhydroxid bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur, d. h. 18 bis 25°C, und 75°C, besonders bevorzugt zwischen Raumtemperatur und 65°C und insbesondere zwischen Raumtemperatur und 60°C erreicht. Eine Temperatur von 55°C ist insbesondere bevorzugt. Die Entschützungsreaktionszeit ist bevorzugt 1 bis 30 Stunden, besonders bevorzugt 1 bis 24 Stunden und insbesondere 12–24 Stunden. Die Konzentration an Ammoniumhydroxid in der Lösung, die zum Entschützen verwendet wird, ist bevorzugt 20 bis 30 Gewichts-%, besonders bevorzugt 25 bis 30 Gewichts-% und insbesondere 28 bis 30 Gewichts-%.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat das von dem festen Träger freigesetzte Oligonukleotidanalogon die Formel:
wobei jede Gruppe B bevorzugt eine ungeschützte heterocyclische Base ist.
Jede Internukleotidverknüpfung des von dem festen Träger freigesetzten geschwefelten Oligonukleotidanalogons kann in Abhängigkeit von den pH-, Temperatur- und Salzbedingungen ionisiert sein. Jede Internukleotidverknüpfung wird in wäßriger Lösung bei physiologischen pH-, Temperatur- und Salzbedingungen ionisiert sein, d. h. bei pH 7,2, 37°C und etwa 150 mM monovalenten Salzen.
Nachdem diese Erfindung allgemein beschrieben worden ist, kann ein weiteres Verständnis durch Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele erhalten werden, welche hier nur für die Zwecke der Veranschaulichung angegeben werden und die nicht beschränkend sein sollen, soweit nichts anderes angegeben.
BEISPIELE
Beispiel 1
Diethyldithiocarbonat-Disulfid
Kaliumethylxanthat (120 g) wurde in einer minimalen Menge Wasser gelöst. Iod wurde zu dieser Lösung portionsweise bei 10°C hinzugegeben, bis eine dunkelbraune Farbe fortbestand. Eine kleine Menge an wäßrigem gesättigtem Na₂S₂O₃ wurde hinzugegeben, um die Reaktion zu quenchen und die dunkelbraune Farbe aus der Lösung zu entfernen. Die entstehende Lösung wurde mit Ether extrahiert. Die vereinigten Etherschichten wurden dreimal mit Wasser gewaschen, getrocknet und konzentriert, um Diethyldithiocarbonat-Disulfid als schwachgelben Feststoff zu ergeben.
Beispiel 2
Synthese eines T-T-Phosphorthioatdimeren
100 Milligramm (4 mmol) 5'-O-Dimethoxytritylthymidin, gebunden an einen Controlled-Pore-Glass-(CPG-)Träger durch eine Esterverknüpfung, wurde zu einem Glasreaktor hinzugegeben, und eine Lösung von 2% Dichloressigsäure in Dichlormethan (Volumen/Volumen) wurde hinzugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Das Produkt wurde zuerst gewaschen mit Dichlormethan und dann mit Acetonitril.
Eine 0,2 M Lösung von 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)thymidin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit) in Acetonitril und eine 0,4 M Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril wurden hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren. Das Produkt wurde zuerst mit Acetonitril gewaschen, und dann wurde eine 1 M Lösung von Diethyldithiocarbonat-Disulfid in Pyridin hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 100 Sekunden reagieren.
Dieser Schwefelungsschritt wurde für 100 Sekunden wiederholt. Das CPG wurde mit Acetonitril gewaschen, und dann wurden eine Lösung von Acetanhydrid/Lutidin/THF (1 : 1 : 8) und N-Methylimidazol/THF hinzugegeben, um die nicht umgesetzten 5'-Hydroxylgruppen mit Caps zu versehen. Das CPG wurde dann mit Acetonitril gewaschen. Das CPG wurde mit 30% wäßriger Ammoniumhydroxidlösung für 90 Minuten behandelt. Die wäßrige Lösung wurde filtriert, unter vermindertem Druck konzentriert, um das gewünschte T-T-Phosphorthioatdimer zu ergeben.
Beispiel 3
Synthese eines C-T-Phosphorthioatdimeren
100 Milligramm (4 mmol) 5'-O-Dimethoxytritylthymidin, gebunden an einen CPG-Träger durch eine Esterverknüpfung, wurde zu einem Glasreaktor hinzugegeben, und eine Lösung von 2% Dichloressigsäure in Dichlormethan (Volumen/Volumen) wurde hinzugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Das CPG wurde dann mit Acetonitril gewaschen. Eine 0,2 M Lösung von N⁴-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit) in Acetonitril und eine 0,4 M Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril wurden hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehen. Das CPG wurde dann mit Acetonitril gewaschen, gefolgt von der Zugabe einer 1 M Lösung von Diethyldithiocarbonat-Disulfid in Pyridin. Diese Schwefelungsreaktion ließ man bei Raumtemperatur für 100 Sekunden ablaufen. Dieser Schwefelungsschritt wurde für weitere 100 Sekunden wiederholt. Der Träger wurde dann mit Acetonitril gewaschen, gefolgt von der Zugabe einer Lösung von Acetanhydrid/Lutidin/THF (1 : 1 : 8) und von N-Methylimidazol/THF, um die nicht umgesetzten 5'-Hydroxylgruppen mit Caps zu versehen. Nach der Cap-Bildung wurde das CPG mit Acetonitril gewaschen. Das CPG wurde mit 30% wäßriger Ammoniumhydroxidlösung für 90 Minuten behandelt und dann bei 55 EC für 12 Stunden inkubiert. Die wäßrige Lösung wurde filtriert, unter vermindertem Druck konzentriert, um das gewünschte C-T-Phosphorthioatdimer zu ergeben.
Beispiel 4
Synthese von G-T-Phosphorthioatdimer
100 Milligramm (4 mmol) 5'-O-Dimethoxytritylthymidin, gebunden an einen CPG-Träger durch eine Esterverknüpfung, wurde zu einem Glasreaktor hinzugegeben, und eine 2%ige Lösung von Dichloressigsäure in Dichlormethan (Volumen/Volumen) wurde hinzugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Das CPG wurde mit Dichlormethan gewaschen und dann mit Acetonitril gewaschen. Eine 0,2 M Lösung von N²-Isobutyryl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyguanosin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit) in Acetonitril und eine 0,4 M Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril wurden hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren. Das Produkt wurde mit Acetonitril gewaschen, und dann wurde eine 1 M Lösung von Diethyldithiocarbonat-Disulfid in Pyridin hinzugegeben. Die Schwefelungsreaktion ließ man bei Raumtemperatur für 100 Sekunden ablaufen. Der Schwefelungsschritt wurde für weitere 100 Sekunden wiederholt. Der Träger wurde mit Acetonitril gewaschen, und dann wurden eine Lösung von Acetanhydrid/Lutidin/THF (1 : 1 : 8) und N-Methylimidazol/THF hinzugegeben, um die nicht umgesetzten 5'-Hydroxylgruppen mit Caps zu versehen. Das CPG wurde dann mit Acetonitril behandelt. Das CPG wurde mit 30% wäßriger Ammoniumhydroxidlösung für 90 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen und dann bei 55 EC für 1 Stunde inkubiert. Die wäßrige Lösung wurde filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, um das gewünschte T-T-Phosphorthioatdimer zu ergeben.
Beispiel 5
Synthese eines 5'-TTTTTTT-3'-Phosphorthioatheptameren
50 Milligramm (2 mmol) 5'-O-Dimethoxytritylthymidin, gebunden an einen CPG-Träger durch eine Esterverknüpfung, wurde zu einem Glasreaktor hinzugegeben, und eine 2%ige Lösung von Dichloressigsäure in Dichlormethan (Volumen/Volumen) wurde hinzugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Das CPG wurde dann mit Acetonitril gewaschen. Eine 0,2 M Lösung von 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)thymidin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit) in Acetonitril und eine 0,4 M Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril wurden hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren. Das CPG wurde mit Acetonitril gewaschen, und dann wurde eine 1 M Lösung von Diethyldithiocarbonat-Disulfid in Pyridin hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 100 Sekunden reagieren. Dieser Schwefelungsschritt wurde für 100 Sekunden wiederholt. Der Träger wurde mit Acetonitril gewaschen, und dann wurden eine Lösung von Acetanhydrid/Lutidin/THF (1 : 1 : 8) und N-Methylimidazol/THF hinzugegeben, um die nicht umgesetzten 5'-Hydroxylgruppen mit Caps zu versehen. Nach der Cap-Bildung wurde der feste Träger mit Acetonitril gewaschen. Dieser vollständige Zyklus wurde fünfmal wiederholt, um das geschützte Thymidinheptamer zu ergeben. Der die Verbindung enthaltende Träger wurde mit 30% wäßriger Ammoniumhydroxidlösung für 90 Minuten bei Raumtemperatur behandelt. Die wäßrige Lösung wird filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert, um das gewünschte Phosphorthioatheptamer 5'-TTTTTTT-3' zu ergeben.
Beispiel 6
Synthese von 5'-d(GACTT)-3'-Phosphorthioatpentamer
50 Milligramm (2 mmol) 5'-O-Dimethoxytritylthymidin, gebunden an einen CPG-Träger durch eine Esterverknüpfung, wurde zu einem Glasreaktor hinzugegeben, und eine 2%ige Lösung von Dichloressigsäure in Dichlormethan (Volumen/Volumen) wurde hinzugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Das CPG wurde dann mit Acetonitril gewaschen. Eine 0,2 M Lösung von 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)thymidin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit) in Acetonitril und eine 0,4 M Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril wurden hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren. Das CPG wurde mit Acetonitril gewaschen, und dann wurde eine 1 M Lösung von Diethyldithiocarbonat-Disulfid in Pyridin hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 100 Sekunden reagieren. Dieser Schwefelungsschritt wurde für 100 Sekunden wiederholt. Der Träger wurde mit Acetonitril gewaschen, und dann wurden eine Lösung von Acetanhydrid/Lutidin/THF (1 : 1 : 8) und N-Methylimidazol/THF hinzugegeben, um die nicht umgesetzten 5'-Hydroxylgruppen mit Caps zu versehen. Nach der Cap-Bildung wurde der Träger mit Acetonitril gewaschen.
Eine Lösung von 2% Dichloressigsäure in Dichlormethan (Volumen/Volumen) wurde hinzugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen, gefolgt von Waschen mit Acetonitril. Eine 0,2 M Lösung von N⁴-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit) in Acetonitril und eine 0,4 M Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril wurden hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren. Nach Waschen des festen Trägers mit Acetonitril wurde eine 1 M Lösung von Diethyldithiocarbonat-Disulfid in Pyridin hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 100 Sekunden reagieren. Dieser Schwefelungsschritt wurde für weitere 100 Sekunden wiederholt. Der Träger wurde mit Acetonitril gewaschen, und dann wurden eine Lösung von Acetanhydrid/Lutidin/THF (1 : 1 : 8) und N-Methylimidazol/THF hinzugegeben, um die nicht umgesetzten 5'-Hydroxylgruppen mit Caps zu versehen. Der Träger wurde mit Acetonitril gewaschen.
Eine Lösung von 2% Dichloressigsäure in Dichlormethan (Volumen/Volumen) wurde hinzugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Das CPG wurde mit Acetonitril gewaschen. Eine 0,2 M Lösung von N⁶-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyadenosin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit) in wasserfreiem Acetonitril und eine 0,4 M Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril wurden hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren. Das Produkt wurde mit Acetonitril gewaschen, und dann wurde eine 1 M Lösung von Diethyldithiocarbonat-Disulfid in Pyridin hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren. Dieser Schwefelungsschritt wurde für 5 Minuten wiederholt. Der Träger wurde mit Acetonitril gewaschen, und dann wurden eine Lösung von Acetanhydrid/Lutidin/THF (1 : 1 : 8) und N-Methylimidazol/THF hinzugegeben, um die nicht umgesetzten 5'-Hydroxylgruppen mit Caps zu versehen. Der Träger wird mit Acetonitril gewaschen.
Eine Lösung von 2% Dichloressigsäure in Dichlormethan (Volumen/Volumen) wurde hinzugegeben, um die 5'-Hydroxylgruppe zu entschützen. Das Produkt wurde mit Acetonitril gewaschen. Dann wurden eine 0,2 M Lösung von N²-Isobutyryl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyguanosin-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit) in Acetonitril und eine 0,4 M Lösung von 1H-Tetrazol in Acetonitril hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 5 Minuten reagieren. Das Produkt wurde mit Acetonitril gewaschen, und dann wurde eine 1 M Lösung von Diethyldithiocarbonat-Disulfid in Pyridin hinzugegeben, und man ließ bei Raumtemperatur für 100 Sekunden reagieren. Dieser Schwefelungsschritt wurde für 100 Sekunden wiederholt. Der Träger wurde mit Acetonitril gewaschen, und dann wurde eine Lösung von Acetanhydrid/Lutidin/THF (1 : 1 : 8) und von N-Methylimidazol/THF hinzugegeben, um die nicht umgesetzten 5'-Hydroxylgruppen mit Caps zu versehen. Das Produkt wurde mit Acetonitril gewaschen.
Das CPG wurde mit 30% wäßriger Ammoniumhydroxidlösung für 90 Minuten bei Raumtemperatur behandelt und dann bei 55°C für 24 Stunden inkubiert. Die wäßrige Lösung wurde filtriert, unter vermindertem Druck konzentriert, um das gewünschte 5'-d(GACTT)-3'-Phosphorthioattetramer zu ergeben.
Beispiel 7
Synthese von Homo-Thymidinphosphorthioat-19-mer
Ein 19-Basen Homo-Thymidinphosphorthioat-Oligonukleotid wurde mit dem Phosphoramiditverfahren auf einem automatischen Synthesizer (ABI Modell 39OZ, Foster City, California) synthetisiert. Der Standard-Synthesevorschrift wurde gefolgt mit der Ausnahme, daß anstelle des Oxidationsschritts ein Schwefelungsschritt substituiert wurde, und dieser Schritt ging dem Cap-Bildungsschritt voraus. Mit anderen Worten bestand die Synthese aus wiederholten Zyklen von Detritylierung, Kuppeln, Schwefeln und Cap-Bildung.
Trennung des Endprodukts von der Synthesesäule und Reinigung wurden unter Anwendung wohlbekannter Verfahren erreicht. Der Schwefelungsschritt schloß das Exponieren der wachsenden Kette gegenüber einer 1 M Lösung von Diethyldithiocarbonat-Disulfid in Pyridin für 100 Sekunden bei Raumtemperatur ein.
Die Ausbeute des während des Detritylierungsschritts freigesetzten Tritylkations betrug im Durchschnitt 99%. Die Tritylausbeute ist sowohl ein Maß für die Kupplungseffizienz als auch ein Maß für das Ausmaß der Schwefelung, weil nicht geschwefelte trivalente Phosphorverknüpfungen in dem Oligonukleotid labil gegenüber der Spaltung während der Detritylierung sind. Das 19-mer wurde von dem Träger abgespalten und mit konzentriertem Ammoniumhydroxid unter Standardbedingungen entschützt und unter Anwendung von im Stand der Technik wohlbekannten Techniken isoliert.
Beispiel 8
Synthese eines 20-mer Phosphorthioat-Oligonukleotidanalogons in großem Maßstab
Ein 20-Basen-Phosphorthioat-Oligonukleotidanalogon der Sequenz 5'-TCCCGCCTGTGACATGCATT-3' wurde mit dem Phosphoramiditverfahren auf einem automatischen OligoPlot-DNA-Synthesizer (erhältlich von Pharmacia, Schweden) synthetisiert. Die Standardsynthesevorschrift wurde verwendet, wobei der Oxidationsschritt durch einen Schwefelungsschritt mit Diethyldithiocarbonat-Disulfid ersetzt wurde. Schwefeln jeder Phosphor(III)verknüpfung wurde durch Exponieren des Oligonukleotidanalogons gegenüber einer 0,2 M Lösung von Diethyldithiocarbonat-Disulfid in Pyridin/Dichlormethan (1 : 1, Vol./Vol.) für 100 Sekunden bei Raumtemperatur erreicht. Das entstehende 20-mer-Phosphorthioat-Oligonukleotidanalogon wurde entschützt und von dem festen Träger mit wäßrigem Ammoniumhydroxid abgespalten und mit wohlbekannten Verfahren gereinigt.
Alle in der vorliegenden Anmeldung zitierten Literaturstellen werden hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingefügt.
Offensichtlich sind zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Licht der obigen Lehren möglich. Es muß daher verstanden werden, daß innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche die Erfindung anders als hier spezifisch beschrieben ausgeführt werden kann.

Claims

Verfahren, umfassend: das Umsetzen eines Oligonukleotidanalogons, das mindestens eine Phosphor(III)verknüpfung umfaßt, mit einem Thiodikohlensäurediester-Polysulfid mit der Formel:
um ein geschwefeltes Oligonukleotidanalogon herzustellen, wobei jede Gruppe R unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₈-Alkyl, substituiertem C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, und substituiertem C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, ausgewählt ist, und n 2, 3 oder 4 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Phosphor(III)verknüpfung ein Phos phor(III)säuretriester oder ein Thiophosphor(III)säuretriester ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei jede Gruppe R unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus einer C₂-C₈-Alkylgruppe, einer substituierten C₂-C₈-Alkylgruppe, einer C₆-C₁₄-Arylgruppe und einer substituierten C₆-C₁₄-Arylgruppe, ausgewählt ist, und n 2 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotidanalogon, das mindestens eine Phosphor(III)verknüpfung umfaßt, die Formel:
aufweist, wobei jede Gruppe Pg unabhängig voneinander eine Gruppe, die gegenüber einer Base und/oder einem Nukleophil labil ist, oder eine Allylgruppe ist, R⁶ eine labile Blockierungsgruppe ist, jede Gruppe B unabhängig voneinander eine ungeschützte oder geschützte heterocyclische Base ist, jede Gruppe X unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, F, Cl, Br, C₁-C₈-Alkyl, substituiertem C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, subsitutiertem C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₁-C₈-Alkyl, substituiertem O-C₁-C₈-Alkyl, O-C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem O-C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem O-C₆-C₁₄-Aryl, O-C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem O-C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem O-C₇-C₁₈-Aralkyl, O-C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem O-C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₁-C₈-Alkyl-O-C₁-C₈-Alkyl, O-C₁-C₈-Alkenyl, O-C₁-C₈-Alkoxyamino, O-tri-C₁-C₈-Alkyl-silyl, substituiertem O-tri-C₁-C₈-Alkyl-silyl, NH-C₁-C₈-Alkyl, N-(C₁-C₈)₂, NH-C₁-C₈-Alkenyl, N-(C₁-C₈)₂ Alkenyl, S-C₁-C₈-Alkyl, S-C₁-C₈-Alkenyl, NH₂, N₃, NN-C₁-C₈-Alkyl-NH₂, Polyalkylamino und eine RNA-spaltende Gruppe, ausgewählt ist, jede Gruppe Y unabhängig voneinander O oder S ist, jede Gruppe Z unabhängig voneinander O oder S ist, L eine Gruppe ist, die gegenüber einem Nukleophil und/oder einer Base labil ist, S^p ein fester Träger ist und m 0 oder eine positive ganze Zahl ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei jede Gruppe R unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus einer C₂-C₈-Alkylgruppe, einer substituierten C₂-C₈-Alkylgruppe, einer C₆-C₁₄-Arylgruppe und einer substituierten C₆-C₁₄-Arylgruppe, ausgewählt ist, wobei n 2 ist und m eine ganze Zahl zwischen 0 und 198 ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei jede Gruppe Pg unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus 2-Cyanoethyl, 4-Cyano-2-butenyl, 2-Diphenylmethylsilyl und einer 2-N-Amidoethylgruppe mit der Formel R¹CONR²CHR³CHR⁴-, ausgewählt ist, wobei jede Gruppe R¹ unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₈-Alkyl, substituiertem C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, und unsubstituiertem C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, ausgewählt ist, jede Gruppe R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C₁-C₈-Alkyl, substituiertem C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substitu iertem C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, und substituiertem C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, ausgewählt ist, oder R³ und R⁴ zusammen mit den Kohlenstoffatomen verbunden sind, um eine C₃-C₈-Cycloalkylgruppe, eine substituierte C₃-C₈-Cycloalkylgruppe, eine C₂-C₈-Heterocycloalkylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder eine substituierte C₂-C₈-Heterocycloalkylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome, zu bilden, R⁶ aus der Gruppe, bestehend aus 4,4'-Dimethoxytrityl, Monomethoxytrityl, Diphenylmethyl, Phenylxanthen-9-yl und 9-(p-Methoxyphenyl)xanthen-9-yl, ausgewählt ist, und wobei jede Gruppe B unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 2-Aminopurin, Inosin und 5-Methylcytosin, ausgewählt ist, wobei die exocyclische Aminogruppe jeder Base mit einer Acylgruppe geschützt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Oligonukleotidanalogon, das mindestens eine Phosphor(III)verknüpfung umfaßt, ein Dinukleotidanalogon mit der Formel:
ist, wobei Pg eine Gruppe ist, die gegenüber einer Base und/oder einem Nukleophil labil ist, R⁷ eine Gruppe ist, die gegenüber einer Base und/oder einem Nukleophil labil ist, R⁶ eine labile Blockierungsgruppe ist, jede Gruppe B unabhängig voneinander eine ungeschützte oder geschützte heterocyclische Base ist, jede Gruppe X unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, F, Cl, Br, C₁-C₈-Alkyl, substituiertem C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₁-C₈-Alkyl, substituiertem O-C₁-C₈-Alkyl, O-C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem O-C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem O-C₆-C₁₄-Aryl, O-C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem O-C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem O-C₇-C₁₈-Aralkyl, O-C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem O-C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₁-C₈-Alkyl-O-C₁-C₈-Alkyl, O-C₁-C₈-Alkenyl, O-C₁-C₈-Alkoxyamino, O-tri-C₁-C₈-Alkyl-silyl, substituiertem O-tri-C₁-C₈-Alkyl-silyl, NH-C₁-C₈-Alkyl, N-(C₁-C₈)₂, NH-C₁-C₈-Alkenyl, N-(C₁-C₈)₂ Alkenyl, S-C₁-C₈-Alkyl, S-C₁-C₈-Alkenyl, NH₂, N₃, NH-C₁-C₈-Alkyl-NH₂, Polyalkylamino und eine RNA-spaltende Gruppe, ausgewählt ist, und Y O und S ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei jede Gruppe R unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus einer C₂-C₈-Alkylgruppe, einer substituierten C₂-C₈-Alkylgruppe, einer C₆-C₁₄-Arylgruppe und einer substituierten C₆-C₁₄-Arylgruppe, ausgewählt ist, und n 2 ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei Pg aus der Gruppe, bestehend aus 2-Cyanoethyl, 4-Cyano-2-butenyl, 2-Diphenylmethylsilyl und einer 2-N-Amidoethylgruppe mit der Formel R¹CONR²CHR³CHR⁴-, ausgewählt ist, wobei R¹ aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₈-Alkyl, substituiertem C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, und substituiertem C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, ausgewählt ist, R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C₁-C₈-Alkyl, substituiertem C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, und substituiertem C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, ausgewählt ist, oder R³ und R⁴ zusammen mit den Kohlenstoffatomen verbunden sind, um eine C₃-C₈-Cycloalkylgruppe, eine substituierte C₃-C₈-Cycloalkylgruppe, eine C₂-C₈-Heterocycloalkylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder eine substituierte C₂-C₈-Heterocycloalkylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome, zu bilden, R⁶ aus der Gruppe, bestehend aus 4,4'-Dimethoxytrityl, Monomethoxytrityl, Diphenylmethyl, Phenylxanthen-9-yl und 9-(p-Methoxyphenyl)xanthen-9-yl, ausgewählt ist, und jede Gruppe B unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 2-Aminopurin, Inosin und 5-Methylcytosin, ausgewählt ist, wobei die exocyclische Aminogruppe jeder Base mit einer Acylgruppe geschützt ist, und R⁷ eine C₂-C₁₀-Acylgruppe ist.
Verfahren, umfassend: (a) das Bereitstellen eines Nukleosidanalogons mit einer blockierten Hydroxylgruppe, (b) das Entblockieren der blockierten Hydroxylgruppe, um eine freie Hydroxylgruppe herzustellen, (c) das Umsetzen der freien Hydroxylgruppe mit einem geschützten Nukleosidanalogon-Phosphoramidit mit einer blockierten Hydroxylgruppe, um ein Oligonukleotidanalogon, umfassend eine Phosphor(III)verknüpfung und eine blockierte Hydroxylgruppe, herzustellen, (d) das Umsetzen der Phosphor(III)verknüpfung mit einem Reagens, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Oxidationsmittel und einem Dithiokohlensäurediester-Polysulfid mit der Formel:
um eine oxidierte oder geschwefelte Phorphor(V)verknüpfung zu bilden, wobei mindestens eine Verknüpfung eine geschwefelte Phosphor(V)verknüpfung ist, und (e) das Wiederholen der Schritte (b) bis (d) mindestens einmal, um ein geschwefeltes Oligonukleotidanalogon herzustellen, wobei jede Gruppe R unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₈-Alkyl, substituiertem C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, und substituiertem C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, ausgewählt ist, und n 2, 3 oder 4 ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei jede Gruppe R unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus einer C₂-C₈-Alkylgruppe, einer substituierten C₂-C₈-Alkylgruppe, einer C₆-C₁₄-Arylgruppe und einer substituierten C₆-C₁₄-Arylgruppe, ausgewählt ist, und n 2 ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Nukleosidanalogon an einen festen Träger gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Oligonukleotidanalogon, das eine Phosphor(III)verknüpfung und eine blockierte Hydroxylgruppe umfaßt, die Formel:
aufweist, wobei jede Gruppe Pg unabhängig voneinander eine Gruppe, die gegenüber einer Base und/oder einem Nukleophil labil ist, oder eine Allylgruppe ist, R⁶ eine labile Blockierungsgruppe ist, jede Gruppe B unabhängig voneinander eine ungeschützte oder geschützte heterocyclische Base ist, jede Gruppe X aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, F, Cl, Br, C₁-C₈-Alkyl, substituiertem C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₃-C₁₁- Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₁-C₈-Alkyl, substituiertem O-C₁-C₈-Alkyl, O-C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem O-C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem O-C₆-C₁₄-Aryl, O-C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem O-C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem O-C₇-C₁₈-Aralkyl, O-C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem O-C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, O-C₁-C₈-Alkyl-O-C₁-C₈-alkyl, O-C₁-C₈-Alkenyl, O-C₁-C₈-Alkoxyamino, O-tri-C₁-C₈-Alkyl-silyl, substituiertem O-tri-C₁-C₈-Alkyl-silyl, NH-C₁-C₈-Alkyl, N-(C₁-C₈)₂, NH-C₁-C₈-Alkenyl, N-(C₁-C₈)₂ Alkenyl, S-C₁-C₈-Alkyl, S-C₁-C₈-Alkenyl, NH₂, N₃, NH-C₁-C₈-Alkyl-NH₂, Polyalkylamino und eine RNA-spaltende Gruppe, ausgewählt ist, jede Gruppe Y unabhängig voneinander O oder S ist, jede Gruppe Z unabhängig voneinander O oder S ist, L eine Gruppe ist, die gegenüber einem Nukleophil und/oder einer Base labil ist, S^p ein fester Träger ist, und m 0 oder eine positive ganze Zahl ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei jeder Schritt (d) dem Umsetzen der Phosphor(III)verknüpfung mit dem Dithiokohlensäurediester-Polysulfid entspricht, wobei jede Gruppe R unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus einer C₂-C₈-Alkylgruppe, einer substituiertem C₂-C₈- Alkylgruppe, einer C₂-C₁₄-Arylgruppe und einer substituierten C₆-C₁₄-Arylgruppe, ausgewählt ist, n 2 ist und m eine ganze Zahl zwischen 0 und 198 ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei jede Gruppe Pg unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus 2-Cyanoethyl, 4-Cyano-2-butenyl, 2-Diphenylmethylsilyl und einer 2-N-Amidoethylgruppe mit der Formel R¹CONR²CHR³CHR⁴-, ausgewählt ist, wobei jede Gruppe R¹ unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₈-Alkyl, substituiertem C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, und substituiertem C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, ausgewählt ist, jede Gruppe R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, C₁-C₈-Alkyl, substituiertem C₁-C₈-Alkyl, C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₂-C₈-Heterocycloalkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₆-C₁₄-Aryl, substituiertem C₆-C₁₄-Aryl, C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, substituiertem C₃-C₁₁-Heteroaryl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, C₇-C₁₈-Aralkyl, substituiertem C₇-C₁₈-Aralkyl, C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, und substituiertem C₄-C₁₅-Heterocycloaralkyl, enthaltend bis zu drei Heteroatome, ausgewählt ist, oder R³ und R⁴ zusammen mit den Kohlenstoffatomen verbunden sind, um eine C₃-C₈-Cycloalkylgruppe, eine substituierte C₃-C₈-Cycloalkylgruppe, eine C₂-C₈-Heterocycloalkylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome, oder eine substituierte C₂-C₈-Heterocycloalkylgruppe, enthaltend bis zu drei Heteroatome, zu bilden, R⁶ aus der Gruppe, bestehend aus 4,4'-Dimethoxytrityl, Monomethoxytrityl, Diphenylmethyl, Phenylxanthen-9-yl und 9-(p-Methoxyphenyl)xanthen-9-yl, ausgewählt ist, und jede Gruppe B unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, 2-Aminopurin, Inosin und 5-Methylcytosin, ausgewählt ist, wobei die exocyclische Aminogruppe jeder Base mit einer Acylgruppe geschützt ist.
Verfahren nach Anspruch 12, ferner umfassend: (f) das Entfernen des geschwefelten Oligonukleotidanalogons von dem festen Träger.
Verfahren nach Anspruch 13, ferner umfassend: (f) das Entfernen des geschwefelten Oligonukleotidanalogons von dem festen Träger, wobei das geschwefelte Oligonukleotidanalogon, das von dem festen Träger entfernt ist, die Formel:
aufweist.
Verfahren nach Anspruch 14, ferner umfassend: (f) das Entfernen des geschwefelten Oligonukleotidanalogons von dem festen Träger, wobei das geschwefelte Oligonukleotidanalogon, das von dem festen Träger entfernt ist, die Formel:
aufweist.