DE69820111T2

DE69820111T2 - Massenspektroskopische verfahren zur sequenzierung von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69820111T2
Application number: DE69820111T
Authority: DE
Inventors: Maryanne J. O'donnell; Changwon Yusong-gu KANG; Young-Soo Puk-gu KWON; Young Tae Songpa-gu KIM; Hubert KÖSTER; P. Daniel LITTLE; Guobing Xiang; David M. Eyemouth LOUGH; Charles Cantor
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Sequenom Inc
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Sequenom Inc
Priority date: 1997-12-15
Filing date: 1998-12-15
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2018-12-16
Also published as: DE69820111D1; EP1038031B1; JP3331210B2; JP2002508192A; NO20003058L; NO20003058D0; KR100463459B1; CA2314906A1; EP1038031A1; ATE255168T1; US6268131B1; WO1999031278A1; AU1918799A; KR20010033130A; AU745149B2

Description

Es wird die Priorität der U.S.-Anmeldung Nr. 08/990,851, eingereicht am 15. Dezember 1997 von Changwon Kang, Young-Soo Kwon, Young Tae Kim, Hubert Köster, Daniel Little, Maryanne O'Donnell, Guobing Xiang, Charles Cantor und David Lough mit dem Titel "MASSENSPEKTROMISCHE VERFAHREN ZUM SEQUENZIEREN VON NUKLEINSÄUREN" in Anspruch genommen.
Der Gegenstand dieser Anmeldung betrifft die folgenden mitanhängigen Anmeldungen, internationalen Anmeldungen und Patente: U.S. Patente Nr. 5,605,798, 5,622,824 und 5,547,835, 5,691,141, Internationale PCT-Anmeldungen Nr. WO 98/20019, WO 98/20166 und WO 97/42348.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Nukleinsäuresequenzierungsverfahren sind wichtige und wirkungsvolle Werkzeuge in dem Repertoire des Molekularbiologen an Techniken zum Bewerten und Verstehen von Genexpression und -regulierung. Verfahren zum Sequenzieren von DNA-Molekülen umfassen das Sequenzieren durch chemischen Abbau (Maxam et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560, siehe auch Ambrose et al. (1987) Methods Enz. 152: 522) und Kettenterminierungssequenzieren (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463). Das Maxam-Gilbert-Sequenzierungsverfahren ist ein Abbauverfahren, das auf der spezifischen Spaltung von DNA-Fragmenten beruht. Ein DNA-Fragment, das an einem Ende radioaktiv markiert ist, wird partiell in fünf separaten chemischen Reaktionen gespalten. Jede Reaktion ist spezifisch für einen Basentyp oder eine Base, so daß fünf Populationen markierter Fragmente verschiedener Längen erzeugt werden. Die Populationen von Fragmenten werden durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) aufgelöst.
Das Kettenterminierungs- oder Sanger-Verfahren beruht auf DNA-Synthese. Einzelsträngige DNA wird als Templat verwendet, und markierte Primer werden verwendet, um die Bildung von Komplementärsträngen zu initiieren. Die Synthesereaktion wird in Gegenwart der vier Deoxynukleotide (dNTPs), dATP, dTTP, dCTP und dGTP und einem der vier Dideoxynukleotide (ddNTPs), ddATP, ddTTP, ddCTP und ddGTP durchgeführt. Die Komplementärstränge werden vorzeitig entlang der Kette durch Zugabe von Dideoxynukleotiden zu den wachsenden Ketten terminiert. Indem mit vier Reaktionsgemischen begonnen wird, von denen jedes eins der vier ddNTPs enthält, werden Sätze von Strängen, die in A, C, G und T enden, erzeugt. Jedes Reaktionsgemisch wird in einer Bahn eines Polyacrylamidgels einer Elektrophorese unterzogen, welches die Fragmente auftrennt, die sich durch eine einzige Base in ihrer Länge unterscheiden.
Diese Verfahren sind primär geeignet zum Sequenzieren einzelsträngiger DNA, die durch Denaturieren der DNA und Auftrennen der Einzelstränge oder durch andere Verfahren, wie etwa Klonieren in einzelsträngige Phagenvektoren hergestellt wird. Diese Sequenzierungsverfahren beruhen auf Reaktionen, die eine Reihe von Fragmenten erzeugen, die sich um eine einzige Base in ihrer Länge unterscheiden und an einer identifizierbaren Base enden. Die Fragmente werden unter Verwendung von PAGE nach Größe aufgetrennt und unter Verwendung eines Markers wie etwa eines Radioisotops nachgewiesen. Da die Auflösung der Banden auf einem Elektrophorese-Gel exponentiell mit der ansteigenden Länge der DNA-Fragmente abnimmt, erlauben diese Verfahren eine Sequenzierung von DNA-Fragmenten von nur bis zu 300 bis 400 Nukleotiden.
Die Ziel-DNA kann auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) (siehe z. B. Mullis et al. (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263; U.S. Patent Nr. 4,683,202 von Mullis et al.) amplifiziert werden, was zu einer amplifizierten Konzentration der Duplex-Ziel-DNA führt. Eine Reihe von Verfahren sind verwendet worden, um einzelsträngige Template direkt aus der PCR zu erzeugen, um sie anschließend zu sequenzieren. Beispielsweise kann ein radioaktiv markierter Primer, der nur für einen Strang spezifisch ist, verwendet werden. Alternativ kann eine PCR unter solchen Bedingungen durchgeführt werden, daß ein Primer in einer limitierenden Konzentration vorhanden ist. Nachdem der Primer, der in einer limitierenden Konzentration vorhanden ist, verbraucht ist, wird der zweite Strang mit linearer Geschwindigkeit durch aufeinanderfolgende Zyklen amplifiziert (Gyllenstein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 7652; Mihilovic et al. (1989) BioTechnigues 7: 14).
Es sind mehrere Sequenzierungsstrategien in Anwendung. Die ausgewählte Strategie hängt von dem Zweck ab, für den die DNA sequenziert wird und von der Menge an Information, die vor dem Sequenzieren über die DNA erhältlich ist. Wenn beispielsweise die Ziel-DNA sequenziert wird, um zu bestätigen, daß eine bestimmte Mutation in die DNA eingeführt wurde, kann es lediglich notwendig sein, eine kleine Region der DNA zu sequenzieren. Wenn das DNA-Fragment ein unbekanntes Gen oder ein Teil eines Gens ist, für den eine Sequenz genau bestimmt werden muß, dann kann es notwendig sein, das gesamte Fragment zu sequenzieren. Da die Größen der Fragmente, die sequenziert werden können, auf etwa 400 Basen beschränkt sind, müssen DNA-Fragmente, die länger sind, gespalten werden. Die Spaltung kann per Zufall erfolgen, und wird gefolgt von Subklonieren der Segmente der Ziel-DNA. Die subklonierten Fragmente, die überlappende Fragmente umfassen, werden dann sequenziert und unter Verwendung eines Computerprogramms sortiert (siehe z. B. Staden (1986) Nucl. Acids Res. 14: 217). Die DNA kann auch systematisch subkloniert werden, indem überlappende oder genestete Mutanten erzeugt und sequenziert werden oder mit Hilfe von anderen geordneten Ansätzen.
Die Sanger-Kettenterminierungsmethode und andere Sequenzierungsverfahren beruhen auf der Verwendung eines einzelsträngigen Templats durch Klonieren der Ziel-DNA in einzelsträngige Phagenvektoren. Die Verwendung von Plasmiden als Vektoren für die Ziel-DNA ist jedoch gegenüber der Verwendung von Phagen-DNA aus Gründen, die die Vielfältigkeit der erhältlichen Plasmide, die Einfachheit, mit der Plasmide manipuliert werden und die größere Stabilität der insertierten DNA in Plasmide im Vergleich mit Phagenvektoren umfassen, bevorzugt. Daher wurden eher Verfahren zum Sequenzieren entwickelt, in denen die Ziel-DNA in Plasmid-DNA kloniert wird, anstatt in eine einzelsträngige Phagen-DNA (siehe z. B. Wallace et al. (1981) Gene 16: 21–26; Guo et al. (1982), Nucl. Acids. Res. 10: 2065–2084; Vieira et al. (1982) Gene 19: 259–268).
Diese Verfahren sind dazu geeignet, nur einen einzigen Strang der Ziel-DNA gleichzeitig zu sequenzieren (siehe z. B. Chen et al. (1985) DNA 4: 165–170; Hattori et al. (1986) Anal. Biochem. 152: 232–238; Mierendorf et al. (1987) Methods Enzymol. 152: 556; Mehra et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7013–7017). Die Verwendung doppelsträngiger DNA vermeidet das Subklonieren oder Isolieren einzelsträngiger DNA-Fragmente, die für die Dideoxy-Kettenterminierungssequenzierungsreaktionen verwendet werden. Die Verwendung von doppelsträngiger DNA war jedoch beschränkt aufgrund der schlechten Templatqualität von denaturierter Duplex-DNA. Aus diesem Grund hatten diese Verfahren nicht den Grad der Genauigkeit der gelieferten Sequenzdaten ergeben, die in Verfahren erhalten werden, in denen die DNA in einen einzelsträngigen Vektor kloniert wird.
Vor kurzem wurden die mit der Templatqualität zusammenhängenden Probleme durch die Entwicklung von Verfahren gelöst, welche Plasmide verwenden, die neben den Komplementärsträngen der insertierten DNA Stellen umfassen, an die strangspezifische Primer effizient hybridisiert werden können. Durch diese Verfahren kann jeder der Einzelstränge doppelsträngiger DNA direkt aus Plasmid-DNA und ohne vorheriges Subklonieren in Phagenvektoren sequenziert werden (siehe z. B. Chen et al. (1985) DNA 4: 165–170 und Chi et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 10382). Ein strangspezifischer synthetischer Primer wird an kovalent geschlossene zirkuläre DNA geheftet, die durch Wärme oder alkalische Bedingungen denaturiert wurde, bevor mit den Dideoxysequenzierungsreaktionen fortgefahren wird. Alternativ kann der Primer an eine offene zirkuläre doppelsträngige Plasmid-DNA als Templat geheftet werden, die mit Alkali denaturiert wurde (siehe Hattori et al. (1986) Anal. Biochem. 152: 232– 238). Die doppelsträngige DNA wird mit Alkali oder Wärme vor dem Sequenzieren nach der Sanger-Methode, die bei 37°C oder höher durchgeführt wird, denaturiert. Die Verwendung von verschiedenen "Vorwärts"- und "Rückwärts"-Primern, die jeweils zu den neben der EcoRI-Stelle in λgt11 liegenden lacZ-Sequenzen komplementär sind, um jeden Strang einer DNA, die in λgt11 kloniert wurde, separat zu sequenzieren, wurde ebenfalls bereits beschrieben (siehe Mehra et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7013–7017).
Plasmide mit gegensätzlich orientierten Promotor-Regionen, die in Verfahren verwendet werden, die eine Transkription beinhalten, werden ebenfalls als Vehikel für zu sequenzierenden Ziel-DNA verwendet. Jede Promotor-Region dient als bestimmte spezifische Primerstartstelle zum Sequenzieren der insertierten DNA. Solche Plasmide sind gewerblich erhältlich. Beispielsweise enthält das Zwillings-Promotorplasmid pGEM^TM die Promotoren für die SP6 und T2-RNA-Polymerasen von Bakteriophagen in gegensätzlichen Orientierungen (Mierendorf et al. (1987) Meth. Enzymol. 152: 556– 562), welche Transkripte zum Sequenzieren generieren können.
Die meisten Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren erfordern die Verwendung einer Polyacrylamidgelelektrophorese (d. h. PAGE), die zu Sequenzierungsartefakten führen kann oder nachweisbare Marker, wie etwa Radioisotope, Enzyme oder Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Gruppen erfordert. Verfahren zum Sequenzieren von DNA unter Verwendung eines massenspektrometrischen Nachweises werden ebenfalls angewandt (siehe U.S. Patent Nr. 5,547,835). Diese Verfahren beruhen hauptsächlich auf dem Sequenzieren von DNA.
Bei der Anwendung von Sequenzierungsverfahrenstechniken wird irgendwann die gesamte Sequenz des menschlichen Genoms bestimmt werden. Die Kenntnis der gesamten Sequenz der menschlichen Genom-DNA wird dazu beitragen, menschliche Krankheiten zu verstehen, zu diagnostizieren, zu verhindern und zu behandeln. Um in der Lage zu sein, die Sequenzbestimmung der etwa 3 Milliarden Basenpaaren des menschlichen Genoms in einem angemessenen Zeitraum und auf wirtschaftliche Art und Weise in Angriff nehmen zu können, sind schnelle, verläßliche, sensitive und kostengünstige Verfahren erforderlich.
WO 97/37041 offenbart ein Verfahren zum Bestimmen der Sequenz einer Nukleinsäure, umfassend die Schritte: a) Erzeugen von mindestens zwei basenspezifisch terminierten Nukleinsäurefragmenten, die modifizierte Purinnukleotide enthalten, die relativ resistent gegen Fragmentierung während einer Massenspektrometrie sind; b) Bestimmen des Molekulargewichtswerts jedes basenspezifisch terminierten Fragments durch Massenspektrometrie, wobei die Molekulargewichtswerte von mindestens zwei basenspezifisch terminierten Fragmenten gleichzeitig bestimmt werden; und c) Bestimmen der Sequenz der Nukleinsäure durch Alignment der basenspezifisch terminierten Nukleinsäurefragmente gemäß dem Molekulargewicht.
WO 96/05325 beschreibt Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen. Insbesondere betrifft dieses Dokument die Amplifizierung von mindestens einer Nukleinsäuresequenz durch Hybridisieren in Lösung mindestens einer Zielsequenz mit einem Polynukleotidkonstrukt, umfassend mindestens eine einzelsträngige Domäne (A), die mit einer komplementären Nukleotidsequenz der Zielsequenz korrespondiert, und eine doppelsträngige Domäne (B, B') die einen Promotor bildet, (2) Trennen der Nukleinsäuren; (3) Verdauen unter Verwendung einer Nuklease, die für einzelsträngige Nukleinsäuren von Polynukleotidkonstrukten spezifisch ist, nämlich für diejenigen, die keine Hybride mit der Zielsequenz gebildet haben, und (4) Transkribieren der in Schritt (1) hybridisierten Zielsequenz in einer Lösung und in Gegenwart einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase, um mehrere RNA-Kopien der Zielsequenz zu bilden. Die amplifizierte Sequenz kann nachgewiesen oder quantifiziert werden.
Es ist daher hierin eine Aufgabe, zusätzliche Verfahren für die Sequenzierung bereitzustellen. Insbesondere ist es hierbei eine Aufgabe, massenspektrometrische Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren unter Verwendung von RNA-Polymerase bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe hierin, Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren in einem Array-Format unter Verwendung von RNA-Polymerase bereitzustellen, wobei Nukleinsäuresonden auf Trägern mit hohen Dichten immobilisiert werden, um den massenspektrometrischen Nachweis zu vereinfachen. Es ist auch eine Aufgabe hierin, Verfahren zum Identifizieren von Transkriptions-Terminator-Sequenzen unter Verwendung von massenspektrometrischen Verfahren bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es werden Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren, insbesondere DNA, unter Verwendung von RNA-Transkripten bereitgestellt. Insbesondere werden Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren unter Verwendung von RNA-Polymerasen, einschließlich DNA-abhängigen und RNA-abhängigen RNA-Polymerasen bereitgestellt. Die RNA-Transkripte werden durch Massenspektrometrie analysiert.
Bei der Durchführung dieser Verfahren wird ein DNA-Molekül, das einen Promotor und eine Zielnukleinsäuresequenz enthält, die operativ mit dem Promotor verknüpft ist, mit einer RNA-Polymerase transkribiert, welche den Promotor erkennt, unter Bedingungen, die einen genesteten Satz von RNA-Transkripten erzeugen, der das Ziel umfaßt. Das Molekulargewicht der Transkripte wird durch Massenspektrometrie bestimmt, um dadurch die Nukleinsäuresequenz der Zielsequenz zu bestimmen. Das DNA-Molekül, welches den Promotor und das Ziel enthält, wird vorzugsweise immobilisiert.
Die Verfahren verwenden ein doppelsträngiges Promotor-enthaltendes Fragment mit einer einzelsträngigen Region an einem Ende, welches ein Molekül einfängt, das die Ziel-DNA enthält, wobei die Ziel-DNA vorzugsweise einzelsträngig ist.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Promotor-enthaltende Nukleinsäure kovalent über das 3'-Ende des nicht codierenden (Antisense) Stranges oder das 5'-Ende des codierenden Stranges an einen festen Träger gekoppelt. Die Kopplung kann durch jedwedes dem Fachmann bekannte Verfahren durchgeführt werden wie etwa über eine Thiol-Bindung. Beispielsweise wird eine 5'- oder 3'-thiolierte DNA hergestellt und an einen mit Aminosilan behandelten festen Träger gebunden. Die Bindung kann direkt oder über eine Linkergruppe erfolgen. Die resultierenden immobilisierten Moleküle werden vorzugsweise in einem Array-Format angeordnet.
Ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das für eine Promotorsequenz codiert, kann aus jeder Quelle, wie etwa Bakterien, Viren, Bakteriophagen, Pflanzen und eukaryontischen Organismen erhalten werden, oder mit synthetischen Verfahren zusammengesetzt werden. Es wird so manipuliert, daß das resultierende Fragment eine einzelsträngige Region mit mindestens 5 Nukleotiden am 3'-Ende des codierenden (sense) Stranges enthält. Diese einzelsträngige Region ist so gestaltet, daß sie zu einer Region der zu sequenzierenden Nukleinsäure oder einer gemeinsamen überlappenden Sequenz, wie etwa einer Restriktionsendonukleasenstelle komplementär ist.
Die Zielnukleinsäure, welche die Region der zu sequenzierenden Nukleinsäure umfaßt, ist einzelsträngig oder doppelsträngig, enthält aber ein einzelsträngiges 3'-Ende, und wird mit den komplementären Sequenzen der Promotor-enthaltenden DNA hybridisiert. Die Hybridisierung wird entweder vor oder nach der Immobilisierung durchgeführt. Die Hybridisierung der zwei Nukleinsäuremoleküle führt einen oder mehrere Brüche ("nicks") in das Hybrid ein, an den Stellen der angrenzenden Nukleinsäuremoleküle. In bestimmten Ausführungsformen werden die Brüche im codierenden oder nicht-codierenden Strang, vorzugsweise im codierenden Strang, durch die Zugabe einer geeigneten Nukleinsäureligase vor dem Beginn der Transkription ligiert.
Die Verfahren verwenden vorzugsweise eine geeignete Strategie zur Erzeugung von genesteten RNA-Transkripten. Die bevorzugten Verfahren beruhen auf einer modifizierten Sanger-Sequenzierungsstrategie, in der eine RNA-Polymerase verwendet wird, um einen Satz genesteter RNA-Transkripte zu erzeugen, die durch basenspezifische Kettenterminierung erhalten werden. Diese werden durch Massenspektrometrie analysiert. Eine modifizierte Gilbert-Maxam-Strategie kommt ebenfalls in Frage. In diesem Verfahren werden die Transkripte mit basenspezifischen RNasen geschnitten, um basenspezifisch terminierte Fragmente zu erzeugen, und die Molekulargewichte werden anschließend durch Massenspektrometrie bestimmt.
Die Transkription wird von dem Promotor aus durch Zugabe einer geeigneten RNA-Polymerase in Gegenwart von Ribonukleosid-Triphosphaten und einem ausgewählten basenspezifischen Ketten-terminierenden 3'-Deoxyribonukleosid-Triphosphat initiiert. In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Transkriptionsgemisch auch modifizierte Ribonukleosid-Triphosphate und Ribonukleotidanaloga, welche die Sekundärstruktur der resultierenden RNA-Transkripte reduzieren und/oder die Verläßlichkeit der Terminierung und den Turnover des RNA-Polymeraseenzyms erhöhen, wobei die Menge an RNA-Transkripten, die für die Analyse zur Verfügung stehen, erhöht wird. Diese Analoga umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Inosin-5'-triphosphat (ITP), welches die Sekundärstruktur reduziert, 4-Thio-uridin-5'-triphosphat (UTP) und 5-Brom-UTP oder 5'-Jod-CTP, welche die Verläßlichkeit der Terminierung und den Turnover des RNA-Polymeraseenzyms erhöhen, wobei die Menge an RNA-Transkripten, die für die Analyse zur Verfügung stehen, erhöht wird. Die resultierenden RNA-Transkripte werden durch Massenspektrometrie analysiert.
In anderen Ausführungsformen enthält die Probe weiterhin ein Matrixmaterial für die Massenspektrometrie für die Analyse durch Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisierungs-Massenspektrometrie (MALDI), und verwendet vorzugsweise weiterhin Time-of-Flight (TOF)-Analyse. Die Sequenz der Nukleinsäure wird durch Alignment der beobachteten Massen der Ketten-terminierten RNA-Transkripte erhalten, die aus den Sequenzierungsreaktionen, die jeweils die vier Ketten terminierenden Basen enthalten, erhalten wurden.
Die hierin bereitgestellten Sequenzierungsverfahren können für diagnostische Anwendungen verwendet werden. Diagnostische Anwendung umfassen Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von genetischen Veränderungen in einer bekannten Zielnukleinsäure. Beispielsweise wird eine Region der Zielnukleinsäure amplifiziert, und der dem nicht codierenden Strang entsprechende Nukleinsäurestrang wird isoliert. Die den Promotor enthaltende Nukleinsäuresonde kann aus einer natürlichen Quelle isoliert werden oder synthetisch durch Hybridisieren von zwei komplementären Oligonukleotiden zusammengesetzt werden, um eine Promotorsequenz zu bilden. Am 3'-Ende des codierenden Stranges wird durch rekombinante Verfahren eine einzelsträngige Region von mindestens 5 Nukleotiden eingeführt, die komplementär ist zu einer Region der zu sequenzierenden Nukleinsäure oder zu einer gemeinsamen Sequenz. In bevorzugten Ausführungsformen wird die einen Promotor enthaltende Nukleinsäure kovalent über das 3'-Ende des nicht codierenden Stranges oder das 5'-Ende des codierenden Stranges kovalent an einen festen Träger gekoppelt, und stärker bevorzugt wird die 5'- oder 3'-thiolierte DNA in hoher Dichte an einen mit Aminosilan behandelten festen Träger gebunden. Die Bindung kann in Gegenwart oder Abwesenheit einer Linkergruppe durchgeführt werden und wird vorzugsweise in einem Array-Format angeordnet.
Ein einzelsträngiger 3'-Überhang der zu sequenzierenden Nukleinsäure in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form wird mit den komplementären Sequenzen des nicht codierenden Stranges hybridisiert, und in einigen Ausführungsformen wird der Bruch oder die Brüche zwischen einem oder mehreren Nukleinsäuresträngen vor der Transkription ligiert. Die Transkription wird unter Verwendung der geeigneten RNA-Polymerase in Gegenwart von Ribonukleosid-Triphosphaten und einem ausgewählten basenspezifischen Ketten-terminierenden 3'-Deoxyribonukleosid-Triphosphat durchgeführt. In bevorzugten Ausführungsformen kann das Transkriptionsgemisch auch Inosin-5'-triphosphat und/oder ein oder mehrere modifizierte Ribonukleosid-Triphosphate enthalten, um die Analyse der RNA-Transkripte zu vereinfachen. Die RNA-Transkripte werden mit Hilfe von Massenspektrometrie, vorzugsweise unter Verwendung von MALDI-TOF analysiert.
Wenn sie in Array-Formaten verwendet werden, kann eine Reihe von Promotorenthaltenden Nukleinsäuresonden konstruiert werden und in einem Array so gebunden werden, daß die Zielnukleinsäure entlang der gesamten Sequenz permutiert wird, beispielsweise die codierende Sequenz eines Gens, was die Bestimmung der Nukleinsäuresequenz des gesamten Gens während einer einzigen Reaktionssequenz erlaubt.
Verfahren zum Identifizieren von Transkriptions-Terminator- und Attenuator-Sequenzen sind ebenfalls bereitgestellt. Durch die Modifizierung der Transkriptionsbedingungen, um Transkripte mit voller Länge zu erzeugen, können Transkriptions-Terminator-Sequenzen, wie etwa rho-abhängige und rho-unabhängige Terminator-Sequenzen unter Verwendung von massenspektrometrischen Verfahren identifiziert werden. Bei der Durchführung dieser Verfahren wird eine einzelsträngige Region des 3'-Endes der zu sequenzierenden Zielnukleinsäure mit einer komplementären Sequenz am 3'-Ende des codierenden Stranges einer Promotor enthaltenden Nukleinsäuresonde hybridisiert. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Promotor enthaltende Nukleinsäure über das 5'-Ende des nicht codierenden Stranges oder das 3'-Ende des codierenden Stranges an einen festen Träger kovalent gebunden, und, stärker bevorzugt, wird eine 5'- oder 3'-thiolierte DNA in hoher Dichte an einen mit Aminosilan behandelten festen Träger gebunden. Die Bindung kann in Gegenwart oder Abwesenheit einer Linkergruppe durchgeführt werden und wird vorzugsweise in einem Array-Format angeordnet.
Die Transkription wird in Gegenwart oder Abwesenheit eines modifizierten RNA-Triphosphat-Analogons initiiert, das die Effizienz der RNA-Polymerase-Terminierung bei einer derartigen Terminatorsequenz erhöht, wie etwa 4-Thio-UTP, 5-Brom-UTP oder 5'-Jod-CTP. In bestimmten Ausführungsformen können die Brüche in einem oder mehreren Strängen durch Zugabe einer geeigneten Nukleinsäureligase vor dem Initiieren der Transkription ligiert werden (d. h. durch Zugabe einer DNA- oder RNA-Ligase). Die Masse der terminierten RNA-Transkripte wird durch Massenspektrometrie bestimmt. Die beobachtete Masse ist indikativ für den Ort des Terminator-abhängigen Anhaltens der Transkription, und durch Vergleich des Alignments der Sequenz, die der Stelle der Transkriptions-Terminierung direkt vorangeht von bestimmten genomischen Stellen, können Terminator- und Attenuator-Sequenzen für verschiedene RNA-Polymerasen identifiziert werden.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein System für die Herstellung von Arrays von Probenmaterial für die Analyse.
2 zeigt eine Nadelanordnung, die für die Verwendung mit dem in 1 dargestellten System zur Implementierung eines parallelen Verfahrens zum Verteilen von Material auf einer Oberfläche eines Substrats geeignet ist.
3 zeigt den unteren Teil der in 2 gezeigten Anordnung.
4 zeigt eine alternative Ansicht des unteren Teils der in 2 dargestellten Nadelanordnung.
5A bis 5D zeigen ein Verfahren zur Herstellung eines Arrays mit Probenmaterial.
6A bis 6B zeigen eine alternative Anordnung zum Ausgeben von Material auf die Oberfläche eines Substrats.
7 ist eine schematische Darstellung der kovalenten Bindung eines Oligodeoxynukleotids auf einer Siliciumdioxidoberfläche wie hierin beschrieben. Insbesondere wurde das Siliciumdioxid mit 3-Aminopropyltriethoxysilan reagiert, um eine gleichmäßige Schicht primärer Aminogruppen auf der Oberfläche zu erzeugen. Ein heterobifunktionelles quervernetzendes Mittel wurde anschließend mit dem primären Amin reagiert, um eine Jodacetamidgruppe einzubringen. Ein 3'- oder 5'-Disulfid enthaltendes Oligodeoxynukleotid (als 5' gezeigt) wurde mit Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) behandelt, um das Disulfid zu einem freien Thiol zu reduzieren, welches anschließend an die Jodacetamidoberfläche gekoppelt wurde.
8 ist ein Schaubild, welches die Konjugierung von Oligodeoxynukleotidsonden auf einer Siliciumoberfläche als Funktion der in der Disulfidreduktion verwendeten TCEP-Konzentration darstellt.
9 ist ein Matrix-assistiertes Laser-Desorptions/Ionisations-time-of-flight-Massenspektrum (MALDI-TOF) eines Siliciumwafers mit der Oligodeoxynukleotidsequenz, die als "TCUC" bezeichnet wird (5'-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG-3'; SEQ ID NO: 1), die im Wesentlichen wie in 7 beschrieben kovalent gebunden ist, und der als "MJM6" bezeichneten Oligodeoxynukleotidsequenz (5'-CCGGGTACCGAGCTCGAATTC-3'; SEQ ID NO: 2) die damit hybridisiert ist.
10 zeigt eine Ausführungsform eines Substrats mit darin eingeätzten Vertiefungen, die zum Aufnehmen von Analysematerial geeignet sind.
11 zeigt ein Beispiel von aus einem linearen Time-of-Flight-Massenspektrometer-Instrument erhaltenen Spektren, die für die Materialzusammensetzung des Probenmaterials auf der Oberfläche des in 10 dargestellten Substrats repräsentativ sind.
12 zeigt die für das Probenmaterial mit den in 11 identifizierten Spektren bestimmten Molekulargewichte.
13 ist ein schematischer 4 × 4 (16-Stellen) DNA-Arrays auf der Oberfläche eines Siliciumwafers mit den Thiol-enthaltenden Oligonukleotidenmolekülen, die als "Oligomer 1" (5'-CTGGATGCGTCGGATCATCTTTTTT-(S)-3'; SEQ ID NO: 5), "Oligomer 2" (5'-(S)-CCTCTTGGGAACTGTGTAGTATT-3'; SEQ ID NO: 6) und "Oligomer 3" (SEQ ID NO: 1; ein freies Thiolderivat "TCUC" Oligonukleotid von BEISPIEL 1) bezeichnet werden, die kovalent an die 16-Stellen der Oberfläche des Siliciumwafers im Wesentlichen wie in BEISPIEL 2 beschrieben, gekoppelt sind.
14 ist eine schematische Darstellung der Hybridisierung von spezifischen Oligonukleotiden an jeweils die 16 Stellen des DNA-Hybridisierungsarrays von 13 mit dem Oligomer 1 komplementären Oligonukleotid (5'-GATGATCCGACGCATCAGAATGT-3'; SEQ ID NO: 7), das an Oligomer 1 gebunden ist, dem Oligomer 2 komplementären Oligonukleotid (5'-AATACTACACAG-3'; SEQ ID NO: 8) das an Oligomer 2 gebunden ist, und dem Oligomer 3 komplementären Oligonukleotid (5'-CCGGGTACCGAGCTCGAATTC-3'; SEQ ID NO: 2), das an Oligomer 3 gebunden ist.
15 ist ein repräsentatives MALDI-TOF-Massenspektrum eines 4 × 4 (16-Stellen) DNA-Arrays auf einem Siliciumwafer, das schematisch in 15 dargestellt ist. Das Spektrum zeigt ein einziges hervortretendes Signal eines experimentellen Masse-zu-Ladung-Verhältnisses in jeder Stelle, die den spezifisch hybridisierten Oligonukleotiden entspricht. Die 2+ zeigt die Position eines doppelt geladenen Moleküls, das als Standard während der MALDI-TOF-MS-Analyse verwendet wird. Das * bezeichnet Restmengen von kontaminierendem Oligonukleotid, die auf der Oberfläche des Chips nach dem Waschverfahren verblieben waren. Die relative Position des *-Signals zeigt die ungefähre Größe des kontaminierenden Oligonukleotids.
16 ist ein repräsentatives MALDI-TOF-Massenspektrum eines 8 × 8 (64-Stellen) DNA-Arrays. Das Spektrum zeigt ein einziges hervortretendes Signal eines experimentellen Masse-zu-Ladung-Verhältnisses, entsprechend den vorhergesagten spezifisch hybridisierten Oligonukleotiden. Das * kennzeichnet Restmengen an kontaminierendem Oligonukleotid, die auf der Oberfläche des Wafers nach den Waschverfahren verblieben waren. Die relative Position des *-Signals zeigt die ungefähre Größe des kontaminierenden Oligonukleotids.
17 zeigt die Nukleotidsequenz eines DNA-Moleküls (SEQ ID NO: 10), das durch Hybridisieren eines 55-mer Oligonukleotids mit einem komplementären 25-mer Oligonukleotid (SEQ ID NO: 11) und einem komplementären 30-mer Oligonukleotid (SEQ ID NO: 12) zusammengesetzt wurde. Die resultierende doppelsträngige DNA codiert für einen SP6-Promotor (nt 1–18 von SEQ ID NO: 10) und hat einen einzigen Bruch im codierenden Strang des Moleküls bei nt + 7 relativ zum Transkriptionsstart ausgehend vom SP6-Promotor. Die Position des Bruchs und die Startstelle der Transkriptionsinitiation vom SP6-Promotor aus sind dargestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen
Soweit nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Termini, die hierin verwendet werden dieselbe Bedeutung wie sie im Allgemeinen von einem Fachmann in dem Bereich verstanden werden, zu dem diese Erfindung gehört.
Der Ausdruck "Nukleinsäure" wir hierin verwendet, bezieht sich auf Oligonukleotide oder Polynukleotide, wie etwa Deoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA) sowie Analoga von entweder RNA oder DNA, die beispielsweise aus Nukleotidanaloga hergestellt sind, von denen alle entweder in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form vorliegen können, sowie auf Proteinnukleinsäure (PNA). Nukleinsäuremoleküle können synthetisch sein oder sie können aus einer bestimmten biologischen Probe unter Verwendung einer Anzahl von Verfahren, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, isoliert werden, wobei das gewählte Verfahren so ausgewählt ist, daß es für die bestimmte biologische Probe geeignet ist.
Nukleotide, wie hierin verwendet, umfassen Nukleosidmono-, -di- und -triphosphate. Nukleotide umfassen auch modifizierte Nukleotide, wie etwa Phosphorthioatnukleotide und Deazapurinnukleotide. Ein kompletter Satz von Ketten-verlängernden Nukleotiden bezieht sich auf vier verschiedene Nukleotide, die mit jeder der vier verschiedenen Basen, die im DNA-Templat umfaßt sind, hybridisieren können.
Eine Promotor enthaltende Nukleinsäuresonde, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Nukleinsäurefragment, das eine doppelsträngige Region umfaßt, die für einen Promotor codiert, und eine einzelsträngige Region umfaßt, die mindestens fünf Nukleotide am 3'-Ende des codierenden (sense) Stranges relativ zum Promotor enthält. Die mindestens fünf Nukleotide werden so ausgewählt, daß sie zu einer einzelsträngigen Region am 3'-Ende der Nukleinsäure, welche die interessierende Zielnukleinsäure enthält, komplementär sind. Verweise auf das 3'-Ende beziehen sich auf den Antisense-Strang, wenn das Ziel in einem doppelsträngigen Molekül enthalten ist. Wenn das Ziel doppelsträngig ist, hat das resultierende Molekül in den codierenden und nicht-codierenden Strängen Brüche.
Alternativ umfaßt die einzelsträngige Region der einen Promotor enthaltenden Nukleinsäuresonde mindestens fünf Nukleotide am 5'-Ende des nicht-codierenden (Antisense) Stranges (relativ zum Promotor), die komplementär sind zu mindestens etwa fünf Nukleotiden am 5'-Ende des codierenden Stranges der Zielnukleinsäure. In dieser Ausführungsform muß das Ziel doppelsträngig sein. Im Anschluß an die Hybridisierung hat das resultierende Molekül in den codierenden und nicht-codierenden Strängen Brüche.
In allen Ausführungsformen können die Brüche vor der Transkription ligiert werden. Wie hierin gezeigt, ist es jedoch nicht nötig, die Brüche zu ligieren, wenn sie sich in einem ausreichenden Abstand befinden, vorzugsweise mindestens etwa +7 Nukleotide.
Die Zielnukleinsäure, wie hierin verwendet ist das zu sequenzierende Nukleinsäuremolekül. Es kann Teil eines größeren Moleküls sein. Das Molekül, welches die Zielnukleinsäure enthält, kann mindestens etwa fünf Nukleotide enthalten, oder so modifiziert sein, daß es sie enthält, deren Sequenz so geartet ist, daß sie zu mindestens fünf angrenzenden Nukleotiden am 3'-Ende des Überhangs der Promotor enthaltenden Fängersonde komplementär ist (oder zu dem 5'-Ende, je nach der ausgewählten Konfiguration). Die Zielnukleinsäure kann doppelsträngig sein, mit einem 3'- oder 5'-einzelsträngigen Überhang, oder sie kann einzelsträngig sein. RNA-Polymerasen sind in der Lage, einzelsträngige Moleküle zu transkribieren und tun dies auch, insbesondere wenn der ternäre Komplex gebildet wird. Das Ziel kann auch RNA oder PNA sein (Proteinnukleinsäure, die durch Konjugieren von Basen an ein Aminosäurenrückgrat gebildet wird; siehe z. B. Nielsen et al. (1991) Sience 254: 1497).
Die Nukleinsäuresynthese, wie hierin verwendet, bezieht sich auf jedwedes Verfahren, in dem Oligonukleotide oder Polynukleotide erzeugt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Verfahren, die chemische oder enzymatische Reaktionen beinhalten.
Ein basenspezifisch terminiertes Ribonukleotid, wie hierin verwendet, ist eines, welches nach dem Einfügen während der Transkription ein Nukleotid erzeugt, das zu einer Terminierung der Transkription führt. basenspezifisch terminierende Ribonukleosid-Triphosphate, welche basenspezifisch terminierte Ribonukleotide erzeugen, sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Beispiele von basenspezifisch terminierenden Ribonukleosid-Triphosphaten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: 3'-Deoxyribonukleosid-Triphosphate, wie etwa 3'-dGTP und weitere hierin beschriebene und dem Fachmann auf dem Gebiet bekannte.
Der Begriff komplementär, wie hierin verwendet, wenn er sich auf zwei Nukleotidsequenzen bezieht, bedeutet, daß die beiden Nukleotidsequenzen in der Lage sind, miteinander zu hybridisieren, insbesondere mit weniger als 25%, stärker bevorzugt mit weniger als 15%, stärker bevorzugt mit weniger als 5%, und am meisten bevorzugt mit keinen Fehlübereinstimmungen zwischen gegenüberliegenden Nukleotiden. Vorzugsweise hybridisieren die beiden Moleküle unter Bedingungen mit hoher Stringenz.
Die Stringenz der Hybridisierung bei der Bestimmung des Prozentsatzes der Fehlübereinstimmung, wie hierin verwendet, ist wie folgt:

1) hohe Stringenz: 0,1 × SSPE, 0,1% SDS, 65°C
2) mittlere Stringenz: 0,2 × SSPE, 0,1% SDS, 50°C
3) niedrige Stringenz: 1,0 × SSPE, 0,1% SDS, 50°C

Es ist so zu verstehen, daß äquivalente Stringenzen erreicht werden können unter Verwendung von alternativen Puffern, Salzen und Temperaturen.
Der Ausdruck 'Array" wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine geordnete Anordnung von Substanzen oder Positionen. Ein Array kann jede Anzahl von Substanzen oder Positionen enthalten und kann in einer Vielzahl von Formen vorliegen. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Array zweidimensional und enthält n × m Substanzen, wobei m und n gerade Zahlen sind, die gleich oder verschieden sein können. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind n und m jeweils 4 oder ein Mehrfaches davon.
Der Ausdruck "quervernetzendes Mittel" ist im Stand der Technik bekannt und bezieht sich, wie hierin verwendet, auf Reagenzien, welche eine Nukleinsäure an einem unlöslichen Träger immobilisieren, vorzugsweise durch kovalente Bindungen. Somit umfassen geeignete "quervernetzende Mittel" für die Verwendung hierin eine Vielzahl von Mitteln, die in der Lage sind, mit einer funktionellen Gruppe, die auf einer Oberfläche des unlöslichen Trägers vorhanden ist, und mit einer funktionellen Gruppe, die in dem Nukleinsäuremolekül vorhanden ist, zu reagieren. Reagenzien, die zu einer solchen Reaktivität fähig sind, umfassen homo- und heterobifunktionelle Reagenzien, von denen viele im Stand der Technik bekannt sind. Heterobifunktionelle Reagenzien sind bevorzugt.
Der Ausdruck "Thiol-reaktive Funktionalität", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Funktionalität, die schnell oder vorzugsweise mit einer nukleophilen Thiolgruppe reagiert, um eine kovalente Bindung zu bilden, wie etwa eine Disulfid- oder Thioetherbindung. Im Allgemeinen sind Thiolgruppen gute Nukleophile und bevorzugte Thiol-reaktive Funktionalitäten sind reaktive Elektrophile. Eine Vielzahl von thiolreaktiven Funktionalitäten sind im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise Halogenacetyle (vorzugsweise Jodacetyl), Diazoketone, Epoxyketone, α, β-ungesättigte Carbonyle (wie etwa α, β-Enone) und weitere reaktive Michael-Akzeptoren (einschließlich Maleimid), Säurehalogenide, Benzylhalogenide und dgl. In bestimmten Ausführungsformen kann eine freie Thiolgruppe eines Disulfids mit einer freien Thiolgruppe reagieren wie etwa durch die Bildung einer Disulfidbindung, einschließlich durch Disulfidaustausch. Ein "Thiol-reaktives" quervernetzendes Mittel, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein quervernetzendes Reagenz (oder eine solche Oberfläche), welche mindestens eine Thiol-reaktive Funktionalität umfaßt oder so modifiziert ist, daß sie sie umfaßt. Die Reaktion einer Thiolgruppe kann zeitweilig durch Blockierung mit einer geeigneten Schutzgruppe verhindert werden, wie es im Stand der Technik herkömmlich ist (siehe z. B. T. W. Greene und P. G. M. Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", zweite Auflage, John Wiley & Sons (1991)).
Ein selektiv spaltbarer Linker, wie hierin verwendet ist ein Linker, der unter ausgewählten Bedingungen gespalten wird, wie etwa ein fotospaltbarer Linker, ein chemisch spaltbarer Linker und ein enzymatisch spaltbarer Linker (d. h. eine Restriktionsendonukleasenstelle oder ein Verdau durch Ribonukleotid/RNase). Der Linker wird zwischen den Träger und der immobilisierten DNA eingefügt.
Die Ausdrücke "Protein", "Polypeptid" und "Peptid", wie hierin verwendet, werden untereinander austauschbar verwendet, wenn eine translatierte Nukleinsäure, wie etwa als Genprodukt, gemeint ist.
Der Ausdruck "Probe", wie hierin verwende, bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die ein zu detektierendes Material enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe eine "biologische Probe", die sich auf jedes Material bezieht, das aus einer lebenden Quelle erhalten wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Tiere, insbesondere Säugetiere, einschließlich Menschen, Pflanzen, Bakterien, Pilze, Protisten und Viren. Die biologische Probe kann in jeder Form vorliegen, einschließlich fester Materialien, wie etwa Gewebe, Zellen und Biopsiematerial, und als biologische Flüssigkeiten, einschließlich Urin, Blut, Speichel, amniotische Flüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit und Mundspülung (die buccale Zellen enthält). Vorzugsweise werden feste Materialien mit einer Flüssigkeit gemischt.
"Substrat" oder "fester Träger", wie hierin verwendet, sollen einen festen Träger bezeichnen, auf dem eine Probe gemäß den hierin beschriebenen Materialien abgelagert wird. Beispiele von geeigneten Substraten umfassen Kügelchen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Silicagel, kontrolliertes Porenglas, magnetische Partikel, Dextran, Agarose und Cellulose, Kapillaren, flache Träger, wie etwa Glasfaserfilter, Glasoberflächen, Metalloberflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Kupfer und Silicium), Kunststoffmaterialien, einschließlich Platten mit mehreren Vertiefungen oder Membranen (z. B. aus Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid), Nadeln, wie etwa Arrays aus Nadeln, die für die kombinatorische Synthese oder Analyse geeignet sind, oder Kügelchen in Vertiefungen oder auf flachen Oberflächen, wie etwa als Wafer, insbesondere Siliciumwafer, mit oder ohne Platten.
RNA-Polymerase, wie hierin verwendet, bezieht sich auf DNA-abhängige RNA-Polymerasen und RNA-abhängige RNA-Polymerasen. Jede RNA-Polymerase, die eine bestimmte Promotorsequenz erkennt und in der Lage ist, eine Transkription zu initiieren und ein RNA-Transkript zu elongieren, wird vom Umfang dieses Ausdrucks umfaßt. Beispielhafte RNA-Polymerasen, die in den hierin bereitgestellten Verfahren verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die aus den Folgenden erhaltenen: 1) Archebakterien, wie etwa Halobakterium; Methanobakterium, Methanococcus, Sulfolobales und Thermoplasma; 2) Eubakterien, wie etwa gramnegative Bakterien, z. B. Escherichia coli und Stämme von Salmonella und Shigella, gram-positive Bakterien, z. B. Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus; 3) Bakteriophagen, wie etwa T7, T3, SP6, SP6 mit Brüchen („nicks") und N4; 4) DNA-Viren; 5) RNA-Viren, wie etwa Influenzavirus; 6) Pflanzen, wie etwa Weizen; und 7) eukaryontische RNA-Polymerase II, die aus Pilzen isoliert wurde, z. B. Saccharomyces cerevisae und höheren eurkaryontischen Organismen, z. B. Säugern. Ebenfalls vom Umfang des Ausdrucks RNA-Polymerase wie hierin verwendet umfaßt ist die RNA-Replikase aus dem Phagen Qβ (siehe z. B. internationale PCT-Anmeldung Nr. PCT/US87/00880 und 5,270,184). Eukaryontische RNA-Polymerasen, wie etwa die aus eukaryontischen Geweben isolierten, einschließlich aus Pflanzen und Tieren, die eukaryontische Promotoren erkennen einschließlich virale Promotoren aus Viren, die eukaryontische Zellen infizieren, werden hierin auch berücksichtigt. Die T7, T3 und SP6 RNA-Polymerasen sind kloniert worden, und deren Sequenzen sowie Verfahren für Ihre Aufreinigung, sowie für die Aufreinigung der bakteriellen RNA-Polymerasen und bestimmter eukaryontischer DNA-abhängiger RNA-Polymerasen sind bekannt. Zusätzlich sind mehrere RNA-Polymerasen in großen Mengen gewerblich erhältlich und können auch aus gewerblich erhältlichen Vektoren leicht hergestellt werden. Die Sequenzen der Promotoren für jede der oben erwähnten Polymerasen und andere RNA-Polymerasen sind dem Fachmann auf dem Gebiet ebenfalls bekannt.
Eine Promotorregion wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Teil der DNA eines Gens, das die Expression der DNA, mit der er operativ verknüpft ist, kontrolliert. Die Promotorregion umfaßt spezifische Sequenzen von DNA, die für eine Erkennung durch RNA-Polymerase, die Bindung und die Initiierung der Transkription ausreichend sind. Dieser Teil der Promotorregion wird als Promotor bezeichnet. Zusätzlich umfaßt die Promotorregion Sequenzen, die diese Erkennung, das Binden und die Initiierung der Transkriptionsaktivität der RNA-Polymerase modulieren. Diese Sequenzen können in cis agieren oder sie können auf trans-agierende Faktoren antworten. Je nach der Art der Regulierung können Promotoren konstitutiv oder reguliert sein. Ein konstitutiver Promotor ist immer an. Ein regulierbarer Promotor erfordert spezifische Signale, um an- oder abgestellt zu werden. Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist einer, der als Funktion der Entwicklung an oder abgestellt ist. Der Promotor kann eine Konsenssequenz oder eine Variante aufweisen. Wenn ein Nicht-Wildtyp-Promotor verwendet wird, erfolgt die Transkription bei einer Geschwindigkeit, die ausreichend ist, um ein nachweisbares Transkript zu erzeugen, und beträgt typischerweise mindestens etwa 5 bis 10% der Geschwindigkeit, bei der die Transkription erfolgt wäre, wenn ein Wildtyp oder nativer Promotor von der RNA-Polymerase verwendet worden wäre, um die Nukleinsäure in vitro zu transkribieren. Jede Spezies von RNA-Polymerase ist spezifisch für eine bestimmte Promotorsequenz. Jede der drei Bakteriophasen-RNA-Polymerasen (T7, T3 und SP6) hat ihre eigene spezifische DNA-Promotorsequenz. Nachdem sich die RNA-Polymerase an die Promotorsequenz des Templats angelagert hat und die Transkription initiiert worden ist, setzt die Promotorsequenz die RNA-Polymerase frei. Die RNA-Polymerase fährt mit der Transkription entlang dem Templat fort, bis (1) sie keine RNA-Startmaterialien mehr hat, (2) die Transkriptionsreaktion durch ein bestimmtes Nukleotid, Nukleosid oder Analoga terminiert wird, (3) die Transkription spontan gestoppt wird, wenn die RNA-Polymerase oder das Templat sich vorzeitig voneinander lösen oder (4) das Ende des DNA-Templats erreicht ist.
Eine "Promotor enthaltende Nukleinsäure" wie hierin verwendet ist eine Nukleinsäure, die eine Sequenz von Nukleotiden enthält, welche die das stellenspezifische Binden eines RNA-Polymerasemoleküls bestimmen, die an die doppelsträngige DNA bindet und diese schmilzt, um einen offenen Transkriptionsinitiationskomplex zu bilden, der in der Lage ist, die RNA-Synthese in Gegenwart von Ribonukleotid-Triphosphaten zu initiieren. Somit ist eine funktionelle Promotorsequenz eine Sequenz von Nukleotiden, an die eine DNA-abhängige RNA-Polymerase bindet, diese schmilzt und einen Initiationskomplex bildet und die Transkription initiiert. Die Promotor-enthaltende Nukleinsäure-Einfangsonde bezieht sich auf das doppelsträngige Molekül, das die Promotorregion und einen 3'-Überhang von mindestens 5 Nukleotiden umfaßt, mit dem die Zielnukleinsäure hybridisiert, insbesondere unter Bedingungen mit hoher Stringenz. Typischerweise erfordert eine solche Hybridisierung etwa 5 angrenzende Basenpaare mit Identität zwischen dem Ziel und der Promotor enthaltenden Einfangsonde. Nach dem Initiieren der Transkription ist die RNA-Polymerase (oder Untereinheiten davon) Teil eines ternären Komplexes, enthaltend die Polymerase, die DNA und das entstehende RNA-Transkript.
Ein "codierender Strang", wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Nukleinsäurestrang einer Promotor enthaltenden Nukleinsäure, welche dieselbe Polarität wie ein entsprechendes mRNA-Molekül aufweist, das von dem Promotor initiiert wurde. Somit bezieht er sich auf den Sense-Strang. Der nicht codierende Strang ist der Anti-Sense-Strang, der durch die RNA-Polymerase transkribiert wird.
Ein "natives Nukleosid- (oder Ribonukleosid-) Triphosphat" oder "natives Nukleotid" oder Ribonukleotid-Triphosphat, wie hierin verwendet, bedeutet jedes der natürlich vorkommenden normalen Vorläufer von RNA, d. h. ATP, GTP, CTP oder UTP. Ein "Nukleosid-Triphosphat-Analogon" oder "Nukleotidanalogon" bedeutet ein Nukleosid-Triphosphat, das zu einem nativen Nukleotid analog ist, das jedoch eine oder mehrere chemische Modifikationen im Vergleich mit dem nativen Nukleosid oder Nukleotid enthält.
Ein "Matrixmaterial", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein in der Massenspektrometrie verwendetes Material, das ein Proton abgebendes, UV-absorbierendes Material ist, im Allgemeinen eine organische Säure, die kristalline Matrix-Nukleinsäurestrukturen bildet, die während des MALDI leicht ionisierbar sind. Ein beispielhaftes Matrixmaterial ist eine Lösung aus 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA, 0,7 M in 50% Acetonitril, 10% Ammoniumcitrat).
"Konditionieren", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem vor der massenspektrometrischen Analyse die zu analysierende Nukleinsäure modifiziert wird, beispielsweise durch Verringern der für die Volatisation erforderliche Laserenergie und/oder zum Minimieren der Fragmentierung. Die Konditionierung kann auf einer Nukleinsäure, vorzugsweise nach der Immobilisierung, durchgeführt werden. Ein Beispiel für die Konditionierung ist die Modifizierung des Phosphodiesterrückgrats des Nukleinsäuremoleküls durch, beispielsweise, Kationenaustausch, welcher eine Verbreiterung des Peaks aufgrund einer Heterogenität in den pro Nukleotideinheiten gebundenen Kationen eliminiert. Das Inkontaktbringen eines Nukleinsäuremoleküls mit einem alkylierenden Mittel, wie etwa einem Alkyljodid, Jodacetamid, Jodethanol oder 2,3-Epoxy-1-propanol, können die Monothiophosphodiesterbindungen eines Nukleinsäuremoleküls in ein Phosphotriesterbindung umgewandelt werden. Gleichermaßen können Phosphodiesterbindungen zu ungeladenen Derivaten unter Verwendung von Trialkylsilylchloriden umgewandelt werden. Die Konditionierung kann auch durchgeführt werden, indem modifizierte Nukleotide während der Synthese in eine Nukleinsäure eingefügt werden. Solche modifizierten Nukleotide können verwendet werden, um die Empfindlichkeit für Depurinierung (Fragmentierung während MS) zu verringern, wie etwa mit einem Purinanalogon, wie etwa N5-, N7- oder N9-Deazapurinnukleotiden oder -Ribonukleotiden. Modifizierte Nukleotide können auch RNA-Aufbaublöcke, Oligonukleotidtriester, Phosphorthioatfunktionen, die alkyliert sind, oder Oligonukleotidmimetika, wie etwa PNA umfassen. Bei der Herstellung von konditionierten RNA-Transkripten mit modifizierten Nukleotiden muß die ausgewählte RNA-Polymerase in der Lage sein, das modifizierte Nukleotid in das RNA-Transkript einzubauen.
Verfahren zum Sequenzieren
Es werden massenspektrometrische Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren bereitgestellt. Insbesondere verwenden die Sequenzierungsverfahren Promotoren enthaltende Nukleinsäuresonden, die eine doppelsträngige Region enthalten, die für einen Promotor codiert, und eine einzelsträngige Region enthalten zur Hybridisierung mit einer komplementären Region auf Zielnukleinsäuren. Die einen Promotor enthaltende Nukleinsäureeinfangsonde wird vorzugsweise auf einem festen Träger immobilisiert. Die einzelsträngige Region wird mit einer komplementären Region auf der Zielnukleinsäure hybridisiert, welche die zu sequenzierende Nukleinsäure und mindestens 5 Nukleotide einer einzelsträngigen Region, die mit 5 aneinandergrenzenden einzelsträngigen Nukleotiden auf der Sonde identisch ist, enthält.
Im Anschluß an die Hybridisierung des Ziels an die Promotor enthaltende Nukleinsäuresonden wird die Nukleinsäuresequenz durch Erzeugen eines Satzes von genesteten basenspezifisch kettenterminierten RNA-Transkripten bestimmt, die vom Promotor aus initiiert wurden und entlang der Zielnukleinsäure transkribiert wurden. Die resultierenden genesteten RNA-Transkripte werden unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert.
Obwohl DNA oft als Vehikel für die Sequenzierung bevorzugt wird, sequenzieren die Verfahren hierin RNA-Transkripte. RNA-Fragmente sind während der Matrixassistierten Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI) stabiler als DNA-Fragmente. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, kann es sein, daß die erhöhte Stabilität aus dem Vorhandensein der 2'-Hydroxylgruppe auf der Zuckergruppe der RNA resultiert, die dazu beiträgt, die Depurinierung während des MALDI-Verfahrens zu reduzieren.
RNA-Polymerasen und Promotoren
Jede RNA-Polymerase, die in der Lage ist, die in vitro-Transkription eines RNA-Moleküls zu dirigieren, kommt für die Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren in Frage. Bevorzugte RNA-Polymerasen sind DNA-abhängige RNA-Polymerasen. Verfahren zum Isolieren und Aufreinigen von RNA-Polymerasemolekülen sind dem Fachmann im Stand der Technik wohlbekannt: Qβ-Replikase (siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5,696,249, Re: 35,443 und Eoyang et al. (1971) in Procedures in Nucleic Acid Research, Cantoni und Davies, Hrsg., Band 2, Seiten 829–839, Harper und Rowe, NY); Bakterien (z. B. E. coli, siehe Burgess und Jendrisak (1975) Biochemistry 14: 4634–4638 und Hager et al. (1990) Biochemistry 29: 7890– 7894; Leishmania, z. B. siehe Sadhukhan et al. (1997) Mol. Cell. Biochem. 171: 105– 114; Bacillus subtilis, Giacomoni (1980) Eur. J. Biochem. 106: 579–591); Phagen T7, McDonnell et al. (1977) J. Mol. Biol. 89: 719–736 und Studier et al. (1969) Virology 39: 562–574; siehe auch He et al. (1997) Protein Expr. Purif. 9: 142–151); Viren (z. B. Rhabdovirus, siehe Das et al. (1996) Methods Enzymol. 275: 99–122; Rübemosaikvirus, siehe Deidman et al. (1997) J. Viral Meth. 64: 184–195; Vaccinia, Gershon et al. (1996) Methods Enzymol. 275: 35–57; und Säuger z. B. Hefe pol II, Koleske et al. (1996) Methods Enzymol. 273: 176–184; humane pol II, Maldonado et al (1996) Methods Enzymol. 274: 72–100. Zusätzlich sind eine Reihe von prokaryotischen, eukaryotischen, bakteriophagen- und viralen RNA-Polymerasen, wie etwa T3, T7 und SP6 gewerblich erhältlich (z. B. von Stratagene, La Jolla, CA; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; Pharmacia, Uppsala, Schweden; und Sigma Chemical Corp. St. Louis, Mo) und/oder sind wohlbekannt. Die Promotoren sind ebenfalls wohlbekannt und leicht erhältlich z. B. die pGEM-Serie von Plasmiden ist von Promega, Madison WI erhältlich; siehe auch U.S. Patent Nr. 4,766,072, welches die Konstruktion der pGEM-Plasmide beschreibt).
Bei der Durchführung der Verfahren können DNA-abhängige RNA-Polymerasen und RNA-abhängige RNA-Polymerasen verwendet werden. Beispielsweise umfassen RNA- Polymerasen, die in den hierin bereitgestellten Verfahren verwendet werden können, die aus den folgenden erhaltenen, sind jedoch nicht beschränkt auf diese: 1) Archebakterien, wie etwa Halobakterium Methanobakterium, Methanococcus, Sulfolobales und Thermoplasma; 2) Eubakterien, wie etwa gram-negative Bakterien, z. B. Escherichia coli und Stämme von Salmonella und Shigella, gram-positive Bakterien, z. B. Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus; 4) Bakteriophagen, wie etwa T7, T2, SP6 und N4; 4) DNA-Viren; 5) RNA-Viren, wie etwa Influenzavirus; 6) Pflanzen und Pflanzenviren, wie etwa Weizen und Rübemosaikvirus; und 7) eukaryontische RNA-Polymerase II, die aus Pilzen isoliert wurde, z. B. Saccharomyces cerevisae und höhere eukaryontische Organismen, z. B. Säuger (z. B. siehe für ein Review RNA Polymerase and the Regulation of Transcription, Reznikoff et al., Herausgeber, Elsevier, NY). Ebenfalls umfaßt für die Verwendung hierin ist die Qβ-Replikase aus dem Qβ-RNA-Phagen (z. B. siehe U.S. Patente Nr. 5,670,353, 5,696,249 und Re: 35,443).
Die Auswahl der geeigneten RNA-Polymerase für ein zu sequenzierendes Nukleinsäuretemplat liegt im allgemeinen Fachwissen des Fachmanns und variiert je nach dem zu sequenzierenden Nukleinsäuremolekül und der ausgewählten Promotorregion. Die Auswahl kann empirisch bestimmt werden gemäß Lehren, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich der hierin beschriebenen. Bevorzugte zu sequenzierende Nukleinsäuremoleküle sind DNA-Moleküle. RNA und insbesondere PNA (Proteinnukleinsäuren) sind ebenfalls geeignet für die Sequenzierung, nachdem eine geeignete RNA-Polymerase ausgewählt wurde.
Jede einen Promotor enthaltende Nukleinsäuresonde, die in den hierin beschriebenen Sequenzierungsverfahren verwendet wird, enthält einen Promotor. Die in den hierin beschriebenen Verfahren verwendeten Promotoren können aus jeder Quelle erhalten werden oder können synthetisch hergestellt werden auf der Grundlage von Sequenzen, die von der ausgewählten RNA-Polymerase erkannt werden. Beispielsweise kann die einen Promotor enthaltende Nukleinsäure direkt aus einer Vielzahl von verschiedenen Organismen, wie etwa Bakterien, Viren, Phagen und Eukaryonten durch Klonieren erhalten werden, oder aus gewerblich erhältlichen Expressionsvektoren (z. B. T7, T3, SP6 und λ_PL und λ_PR-Promotoren von Boehringer Mannheim und Pharmacia; bla oder lac-Promotoren, RSV-LTR-Promotor und F9-1-Promotor von Stratagene). Die Auswahl des geeigneten Promotors hängt von der zu sequenzierenden Nukleinsäure, den Sequenzierungsbedingungen und, was am wichtigsten ist, von der für die Transkription ausgewählten RNA-Polymerase ab.
Die Promotoren können durch Hybridisieren von Oligonukleotiden, welche die codierenden und nicht codierenden DNA-Stränge eines Promotors codieren, hergestellt werden (siehe Beispiel 4). Die separaten Stränge der Nukleinsäure werden vorzugsweise durch Nukleinsäuresynthesetechniken erhalten. Oligonukleotide, die zur Herstellung eines Promotors verwendet werden, sind so geartet, daß im Anschluß an die Hybridisierung eine einzelsträngige Region am 3'-Ende des codierenden Stranges existiert, mit der die Zielnukleinsäure hybridisieren kann.
Immobilisierung von Promotor enthaltenden Nukleinsäuresonden
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Promotor-enthaltende Nukleinsäuresonde immobilisiert, entweder direkt oder mit Hilfe eines quervernetzenden Mittels, an einen hierin bereitgestellten festen Träger. Die Sonde kann vor der Hybridisierung oder im Anschluß an die Hybridisierung mit dem Ziel immobilisiert werden. Vorzugsweise wird aus Bequemlichkeitsgründen die Hybridisierung im Anschluß an die Immobilisierung auf den festen Träger durchgeführt. Die Sonde wird vorzugsweise über das 5'-Ende des codierenden Stranges oder das 3'-Ende des nicht codierenden Stranges immobilisiert.
In anderen Ausführungsformen kann ein Promotor und eine downstream befindliche Zielnukleinsäure als Transkriptionseinheit aus genomischer DNA durch Amplifikation mit Primern oder durch Hybridisierungsklonierungstechnologie isoliert werden. Die für den Promotor und das Ziel codierende DNA kann dann auf einem festen Träger über die Endnukleotide des 5'-Endes des codierenden Stranges (Sense-Strang) oder des 3'-Endes des nicht codierenden Stranges immobilisiert werden. Wie unten erläutert, kann eine Linkergruppe in die PCR-Primer eingebracht werden, die verwendet werden, um das Promotor enthaltende Nukleinsäuretemplat zu isolieren, um eine direkte Immobilisierung auf einem Träger zu erreichen. Die Verwendung einer geeigneten RNA-Polymerase, welche den Promotor in Gegenwart von Ketten-terminierenden Nukleotiden erkennt, führt zu einem Satz von genesteten Fragmenten, aus dem die Sequenz bestimmt werden kann.
Bevorzugte feste Träger sind solche, die eine Bindung von Nukleinsäuren daran mit hoher Dichte unterstützen, vorzugsweise so daß die kovalent gebundenen Nukleinsäuren auf dem Substrat mit einer Dichte von mindestens etwa 20 fmol/mm², stärker bevorzugt mindestens 75 fmol/mm², noch stärker bevorzugt mindestens etwa 100 fmol/mm² und am meisten bevorzugt mindestens 150 fmol/mm² vorhanden sind. Unter den am meisten bevorzugten Substraten zur Verwendung in den bestimmten Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren auf die hierin bereitgestellten Substrate ist Silicium, während weniger bevorzugte Substrate Polymermaterialien wie etwa Polyacrylamid umfassen. Substrate zur Verwendung in Verfahren zum Erzeugen von hierin bereitgestellten Arrays umfassen eine große Vielzahl von unlöslichen Trägermaterialien, einschließlich aber nicht beschränkt auf Silicagel, kontrolliertes Porenglas, Cellulose, Glasfaserfilter, Glasoberflächen, Metalloberflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Silicium und Kupfer), Kunststoffmaterialien z. B. aus Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid) und Silicium.
In Ausführungsformen der Verfahren, in denen kein quervernetzendes Reagenz verwendet wird, wird eine modifizierte Nukleinsäure direkt mit einer geeignet funktionalisierten Oberfläche reagiert, um eine immobilisierte Nukleinsäure zu ergeben. Somit kann eine Jodacetyl-modifizierte Oberfläche (oder eine andere Thiolreaktive Oberflächenfunktionalität) mit einer Thiol-modifizierten Nukleinsäure reagieren, um immobilisierte Nukleinsäuren zu ergeben.
In Ausführungsformen, die ein quervernetzendes Mittel verwenden, wird das quervernetzende Mittel so ausgewählt, daß es eine hohe Dichte von auf dem unlöslichen Träger immobilisierten Nukleinsäuren ergibt. Das quervernetzende Mittel (und andere zur Funktionalisierung der Trägeroberfläche oder des Nukleinsäuremoleküls verwendete Reagenzien) können so ausgewählt werden, daß ein gewünschter Abstand der immobilisierten Nukleinsäuremoleküle von der Trägeroberfläche erreicht wird, und daß ein gewünschter Abstand der immobilisierten Nukleinsäuren voneinander erreicht wird. Somit kann die sterische Hinderung der Nukleinsäuremoleküle reduziert oder eliminiert werden durch die Auswahl eines geeigneten quervernetzenden Mittels. In bestimmten Ausführungsformen kann das quervernetzende Mittel so ausgewählt werden, daß mehrfache reaktive Funktionalitäten, wie sie in der Dendrimersynthese für die Verknüpfung von mehreren Nukleinsäuren an eine einzige quervernetzende Gruppe verwenden werden, erreicht werden. Vorzugsweise wird das quervernetzende Mittel so ausgewählt, daß es mit dem Nukleinsäuremolekül hochreaktiv ist, um eine schnelle, vollständige und/oder selektive Reaktion zu erzielen. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Reaktionsvolumen der Reagenzien (z. B. des Thiolgruppenreagenzes und der Thiolreaktiven Funktionalität) klein.
Modifizierte Promotor enthaltende Nukleinsäuresonden und Linker
Bevorzugte Promotor enthaltende Nukleinsäuresonden zur Verwendung hierin sind "Thiol-modifizierte Nukleinsäuren", d. h. Nukleinsäuren, die so derivatisiert sind, daß sie mindestens eine reaktive Thiolgruppe enthalten. Wie detailliert in Beispiel 1 unten beschrieben, werden Nukleinsäuren, die mindestens eine reaktive Thiolgruppe enthalten, vorzugsweise durch Behandeln einer Nukleinsäure, die ein 3'- oder 5'-Disulfid enthält, mit einem reduzierenden Mittel behandelt wird, welches vorzugsweise nicht an den nachfolgenden Reaktionen beteiligt ist (d. h. es reagiert nicht mit einer Jodacetimidofunktionalität). Disulfid-derivatisierte Nukleinsäuren können nach mehreren Verfahren synthetisiert werden. Beispielsweise kann eine Nukleinsäure am 3'- oder 5'-Terminus durch Reaktion mit einem Disulfid enthaltenden modifizierenden Reagenz modifiziert werden. Alternativ kann ein thiolierter Primer enzymatisch oder nicht enzymatisch mit der Nukleinsäure verknüpft werden. Eine 5'-Phosphoramidatfunktionalität kann auch eine Verknüpfungsstelle für ein Thiol oder Disulfid enthaltendes Cytosin oder Deoxycytosin darstellen. Beispiele von reduzierenden Mitteln, die für die Reduktion einer Disulfid modifizierten Nukleinsäure geeignet sind, umfassen: tris-(-2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP) (vorzugsweise in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 100 mM (am stärksten bevorzugt etwa 10 mM)) wird bei einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 6 (am stärksten bevorzugt etwa 4,5), einer Temperatur im Bereich von 20 bis 45°C (am stärksten bevorzugt etwa 37°C) für eine Zeitdauer im Bereich von etwa 1 bis 10 Stunden (am stärksten bevorzugt für etwa 5 Stunden) reagiert; Dithiothreitol (vorzugsweise in einer Konzentration im Bereich von 25 bis 100 mM (je nach dem ob der Reaktant isoliert wird), wird bei einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 10 (am meisten bevorzugt etwa 8) und einer Temperatur im Bereich von 25 bis 45°C (am meisten bevorzugt etwa 37°C)) für eine Zeit im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 Stunden (am meisten bevorzugt etwa 5 Stunden) reagiert. TCEP hat einen Vorteil im niedrigen pH-Bereich bei dem es reaktiv ist. Dieser niedrige pH protoniert Thiole sehr effektiv, wobei nukleophile Reaktionen von Thiolen unterdrückt werden und es zu weniger Nebenreaktionen kommt als mit anderen Disulfid-reduzierenden Mitteln, die bei einem höheren pH-Wert eingesetzt werden.
Wie weiter in Beispiel 1 unten beschrieben, ist ein bevorzugtes bifunktionelles quervernetzendes Mittel N-Succinimidyl(4-jodacetyl)aminobenzoat (STAB). Weitere quervernetzende Mittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Dimaleimid, Dithio-bis-nitrobenzoesäure (DTNB), N-Succinimidyl-S-acetyl-thioacetat (SATA), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) und 6-Hydrazinonicotimid (HYNIC) können auch in dem neuen Verfahren verwendet werden. Für weitere Beispiele für quervernetzende Reagenzien, siehe z. B. Wong "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking", CRC Press (1991) und Hermanson "Bioconjugate Technigues" Academic Press (1995).
In anderen Ausführungsformen wird die Nukleinsäure unter Verwendung einer photospaltbaren oder photolabilen Linkergruppe immobilisiert, die während der Massenspektrometrie gespalten wird. Beispielhafte photolabile Quervernetzer umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf 3-Amino-(2-nitrophenyl)propionsäure (Brown et al. (1995) Molecular Diversity, Seiten 4–12 und Rothschild et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 361–66). Siehe auch internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 98/20019).
Die Promotor-enthaltende Nukleinsäuresonde kann direkt über eine reversible oder irreversible Bindung zwischen einer geeigneten Funktionalität (L') auf dem Zielnukleinsäuremolekül (T) und einer geeigneten Funktionalität (L) auf dem Einfangmolekül direkt an einen festen Träger gebunden werden. Das Format ist ähnlich zu dem im U.S. Patent Nr. 5,503,980 dargestellten. Eine reversible Bindung umfaßt Bindungen, die unter den Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten werden. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf photospaltbare Bindungen, wie etwa einen Ladungstransferkomplex, sowie labile Bindungen, die zwischen relativ stabilen organischen Radikalen gebildet werden.
Des Weiteren kann die Bindung mit L', die eine quaternäre Ammoniumgruppe ist, gebildet werden. In diesem Fall trägt die Oberfläche des festen Trägers vorzugsweise negative Ladungen, um das negativ geladene Nukleinsäurerückgrat abzustoßen, wo die Desorption, die für eine Analyse durch den Massenspektrometer erforderlich ist, erleichtert wird. Die Desorption kann entweder durch den Laserimpuls und/oder, je nach L', durch spezifische Absorption der Laserenergie, die sich in Resonanz mit dem L'-Chromophor befindet, entsteht, auftreten.
Somit kann die L-L'-Chemie eine Art von Disulfidbindung sein (chemisch spaltbar, z. B. durch Mercaptoethanol oder Dithioerythrol; ein Biotin/Streptavidin-System; ein heterobifunktionelles Derivat einer Tritylethergruppe; siehe z. B. Köster et al. (1990) "A versatile Acid-Labile Linker for Modfication of Synthetic Biomolecules", Tetrahedron Letters 31: 7095), das unter mild-sauren Bedingungen sowie unter Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten werden kann, eine Levulinylgruppe, die unter fast neutralen Bedingungen mit einem Hydrazinium/Acetatpuffer spaltbar ist, eine Arginin-Arginin oder Lysin-Lysin-Bindung, durch ein Endopeptidaseenzym wie etwa Trypsin spaltbar ist, oder eine Pyrophosphatbindung, die durch eine Pyrophosphatase spaltbar ist, oder eine Ribonukleotidbindung zwischen den Oligodeoxynukleotidsequenzen, die z. B. durch eine Ribonuklease oder Alkali gespalten werden kann.
Die Funktionalitäten L und L' können auch einen Ladungstransferkomplex bilden und dabei eine temporäre L-L'-Bindung bilden. Da in vielen Fällen die "Ladungstransferbindung" durch UV/vis-Spektrometrie bestimmt werden kann (siehe z. B. Organic Charge Transfer Complexes von R. Foster, Academic Press, 1969), kann die Laserenergie auf die entsprechende Energie der Ladungstransferwellenlänge abgestimmt werden, und es kann somit eine spezielle Desorption von dem festen Träger aus initiiert werden. Die Fachleute in diesem Gebiet werden erkennen, das verschiedene Kombinationen diesen Zweck erfüllen und daß die Donorfunktionalität entweder auf dem festen Träger oder gebunden an das Nukleinsäuremolekül daß das zu detektierende Nukleinsäuremolekül oder umgekehrt vorhanden sein kann.
In einem anderen Ansatz kann eine reversible L-L'-Bindung dadurch erzeugt werden, daß relativ stabile Radikale homolytisch gebildet werden. Unter dem Einfluß eines Laserimpulses, finden eine Desorption (wie oben erläutert) sowie eine Ionisierung an den Radikalstellen statt. Der Fachmann wird erkennen, daß weitere organische Radikale ausgewählt werden können und daß im Verhältnis zu den Dissoziationsenergien, die zur homolytischen Spaltung der Bindung eine entsprechende Laserwellenlänge ausgewählt werden kann (siehe z. B. Reactive Molecules von C. Wentrup, John Wiley & Sons, 1984).
Wie erwähnt, kommen mehrere Ausführungsformen des Verfahrens, das eine Immobilisierung beinhaltet, hierin in Frage. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Ausführungsformen, in denen: 1) die Primernukleinsäure auf dem festen Träger immobilisiert wird und die Zielnukleinsäure damit hybridisiert wird, um eine Promotorsequenz zu bilden; 2) eine doppelsträngige Nukleinsäure, die für einen Promotor codiert (amplifiziert oder isoliert) wird über eine Bindung an einen vorbestimmten Strang immobilisiert und eine in vitro Transkription wird in Gegenwart eines vorbestimmten Deoxyribonukleotids initiiert, und 3) die Zielnukleinsäure, die amplifiziert werden kann, wenn es Sequenzinformation gibt, wird an eine doppelsträngige Nukleinsäureeinfangsonde mit einem 3'-Überhang hybridisiert, und die resultierenden Hybride werden immobilisiert.
In den Ausführungsformen, in denen die Primernukleinsäure auf dem festen Träger immobilisiert wird und die Zielnukleinsäure damit hybridisiert wird, erlaubt das Einbringen eines spaltbaren Linkers, das die Primery-DNA am 5'-Ende immobilisiert wird, so daß ein freies 3'-OH für die "Hybridisierung" der Ziel-DNA an den freien DNA-Strang zur Verfügung steht, und die Transkription initiiert werden kann.
Jeder dem Fachmann bekannte Linker zum Immobilisieren von Nukleinsäuren an feste Träger kann hierin verwendet werden, um die Nukleinsäure an einen festen Träger zu koppeln. Die bevorzugten Linker sind selektiv spaltbare Linker, insbesondere die hierin beispielhaft dargestellten. Weitere Linker umfassen Säure-spaltbare Linker, wie etwa Bismaleimidoethoxypropan und säurelabile Trityllinker. Säure-spaltbare Linker, photospaltbare und wärmeempfindliche Linker können ebenfalls verwendet werden, insbesondere wenn es notwendig ist, das Zielmittel zu spalten, damit es für die Reaktion besser zugänglich ist.
Säurespaltbare Linker
Säurespaltbare Linker umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Bismaleimidoethoxypropan und Adipinsäuredihydrazidlinker (siehe z. B. Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60.584–589) und säurelabile Transferrinkonjugate, die einen ausreichenden Anteil Transferrin enthalten, um den Eintritt in die intrazelluläre Transferrinkreislaufroute zu erlauben (siehe z. B. Welhöner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 4309–4314).
Photospaltbare Linker
Photospaltbare Linker sind Linker, die nach der Behandlung mit Licht gespalten werden (siehe z. B. Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem.3: 104–107), wobei das Zielagenz nach dem Behandeln mit Licht freigesetzt wird. Photospaltbare Linker, die nach der Behandlung mit Licht gespalten werden sind bekannt (siehe z. B. Hazum et al. (1981) in Pept. Proc. Eur. Pept. Symp., 16., Brunfeldt, K (Herausgeber) Seiten 105–110, welche die Verwendung einer Nitrobenzylgruppe als photospaltbare Schutzgruppe für Cystein beschreiben; Yen et al. (1989) Makromol. Chem. 190: 69–82, welches wasserlösliche photospaltbare Copolymere beschreibt, einschließlich Hydroxypropylmethacrylamidcopolymer, Glycincopolymer, Fluoresceincopolymer und Methylrhodamincopolymer; Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104–107, welches eine Quervernetzer und ein Reagenz beschreibt, welches einem photolytischen Abbau unterliegt nach der Behandlung von annähernd UV-Licht (350 nm) und Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol. 42: 231–237, welches Nitrobenzyloxycarbonylchlorid quervernetzende Reagenzien beschreibt, die photospaltbare Bindungen erzeugen) wobei das Zielmittel nach dem Behandeln mit Licht freigesetzt wird. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Nukleinsäure unter Verwendung der photospaltbaren Linkergruppe immobilisiert, die während der Massenspektrometrie gespalten wird.
Chemisch spaltbare Linker
Eine Vielfalt von chemisch spaltbaren Linkern kann verwendet wurden, um zwischen der immobilisierten Nukleinsäure und dem festen Träger eine spaltbare Bindung einzufügen. Säurelabile Linker sind derzeit bevorzugte chemisch spaltbare Linker für die Massenspektrometrie, insbesondere MALDI-TOF MS, da die säurelabile Bindung während der Konditionierung der Nukleinsäure nach der Zugabe der 3-HPA-Matrixlösung gespalten wird. Die säurelabile Bindung kann als separate Linkergruppe eingefügt werden, z. B. die säurelabilen Tritylgruppen oder sie kann in einen synthetischen Nukleinsäurelinker eingefügt werden durch Einfügen einer oder mehrerer Silylinternukleosidbrücken unter Verwendung von Diisopropylsilyl-derivierten Nukleosiden, wobei Diisopropylsilyl gebundene Oligonukleotidanaloga entstehen. Die Diisopropylsilylbrücke ersetzt im DNA-Rückgrat die Phosphodiesterbindung und unter mild sauren Bedingungen, wie etwa 1,5%-iger Trifluoressigsäure (TFA) oder 3-HPA/1 TFA MALDI-TOF-Matrixlösung, führt dies zur Einfügung von einem oder mehreren Intrastrangbrüchen in dem DNA-Molekül. Verfahren zur Herstellung von Diisopropylsilyl-gebundenen Oligonukleotidvorläufern und -analoga sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt (siehe z. B. Saha et al. (1993) J. Org. Chem. 58: 7827–7831). Diese Oligonukleotidanaloga können leicht unter Verwendung von Festzustand-Oligonukleotidsyntheseverfahren hergestellt werden unter Verwendung von Diisopropylsilyl-derivatisierten Deoxyribonukleosiden.
Modifizierung von Nukleinsäuren
A. Massenmodifikation
In bestimmten Ausführungsformen können Nukleinsäuren verwendet werden, die an anderen Positionen modifiziert sind als am 3'- oder am 5'-Terminus. Die Modifikation der Zuckergruppe eines Nukleotids an anderen Positionen als der 3'- und 5'-Position ist durch herkömmliche Verfahren möglich. Auch die Nukleinsäurebasen können modifiziert werden, z. B. wie beschrieben in F. Eckstein, Herausgeber, "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach", IRL Press (1991). Solch ein Linkerarm kann so modifiziert werden, daß er eine Thiolgruppe umfaßt. Alternativ können Rückgrat-modifizierte Nukleinsäuren verwendet werden, so daß die Thiolgruppe am Stickstoffzentrum, das durch das modifizierte Phosphatrückgrat bereitgestellt wird, gebunden wird.
In bevorzugten Ausführungsformen beeinträchtigt die Modifikation einer Nukleinsäure, wie oben beschrieben, die Fähigkeit des Nukleinsäuremoleküls, mit seinem Komplementärmolekül zu hybridisieren, nicht wesentlich. Somit sollte es jede Modifikation vorzugsweise vermeiden, die Funktionalitäten der Nukleinsäure, die für die Watson-Crick-Basenpaarung verantwortlich sind, wesentlich zu modifizieren. Die Nukleinsäure kann so modifiziert werden, daß eine nicht-terminale Thiolgruppe vorhanden ist, und die Nukleinsäure ist, wenn sie auf dem Träger immobilisiert ist, in der Lage, eine selbst-komplementäre Basenpaarung durchzuführen, um eine "Haarnadel"-Struktur mit einer Duplexregion zu bilden.
B. Weitere modifizierende RNA-Analoga
Bei der Durchführung der hierin beschriebenen Verfahren wird ein Satz (oder Sätze) von genesteten Basen spezifisch Ketten-terminierten RNA-Transkripten während der Transkription durch den Einbau eines modifizierten basenspezifisch Kettenterminierenden Ribonukleotidanalogons gebildet (oder spezifische Spaltung durch RNAsen in einer modifizierten Maxam-Gilbert-Strategie). Jedes Ribonukleosid-Triphosphat-Analogon, das zu einem Sequenz-spezifischen Anhalten der Transkriptionselongierung durch Einbau in ein RNA-Molekül durch eine RNA-Polymerase führt, kann in den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden.
Derzeit bevorzugte Ribonukleotidanaloga sind 3'-Deoxyribonukleotide, deren Verwendung zu einer basenspezifischen Terminierung der Transkription führt (siehe z. B. Axelrod et al. (1985) Biochemistry 24: 5716–5723; Tyagarajan et al. (1985) Biochemistry 30: 10920–10924).
In bestimmten Ausführungsformen können zusätzlich zu einem basenspezifisch Ketten-terminierenden Ribonukleosid-Triphosphat-Analogon zusätzliche Ribonukleotidanaloga hinzugefügt werden, um die Sekundärstruktur des resultierenden RNA-Transkripts zu reduzieren und/oder die vorzeitige Transkriptionsterminierung oder das Pausieren oder eine RNA-Spaltung zu verhindern. Beispielsweise ist der Einbau von Riboinosin unter Verwendung von Inosin-5'-Triphosphat dafür bekannt, daß er die Sekundärstruktur von RNA-Produkten reduziert. In Gegenwart eines Dinukleotidguanininitiators kann Inosin-5'-Triphosphat GTP in in vitro Transkriptionsreaktionen wirksam ersetzen (z. B. Axelrod et al. (1985) Biochemistry 24: 5716–5723).
Zusätzlich können modifizierte Ribonukleotidanaloga zu dem Transkriptionsgemisch hinzugefügt werden, um die Effizienz der Transkriptions-Terminierung und/oder der Freisetzung des Transkripts zu erhöhen, um die Geschwindigkeit des Enzym-Turnovers zu verbessern und zu vereinfachen. Beispielsweise verändert die Zugabe von 4-Thio UTP, 5-Brom UTP, 5-Jod CTP die Wasserstoffbindung der Nukleinsäure, was, zumindest bei einigen RNA-Polymerasen, die Transkriptions-Terminierung und die Freisetzung des Transkripts erleichtert.
Feste Träger und Substrate
Beispiele von unlöslichen Trägern und Substraten zur Verwendung hierin umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Kügelchen, wie etwa Silicagel, kontrolliertes Porenglas, magnetische Kügelchen, Dextran und Agarose (Sephadex und Sepharose), Kügelchen, Cellulosekügelchen und andere, Kapillaren, flache Träger wie etwa Glasfaserfilter, Glasoberflächen, Metalloberflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Silicium und Kupfer), Kunststoffmaterialien, umfassend Platten mit mehreren Vertiefungen oder Membranen (z. B. aus Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid), Wafer, Kämme, Nadeln (z. B. Arrays aus Nadeln, die für eine kombinatorische Synthese oder Analyse geeignet sind) oder Kügelchen oder Partikel in Vertiefungen in flachen Oberflächen, wie etwa Wafer (z. B. Siliciumwafer), mit oder ohne Filterplatten.
Massenspektrometrie
Nachdem die Transkription beendet ist, können die RNA-Transkripte durch eines von vielen Mitteln analysiert werden einschließlich, z. B. spektrometrischen Techniken, wie etwa UV/VIS, IR, Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie, Gelelektrophorese und andere im Stand der Technik bekannte Verfahren oder Kombinationen davon. Massenspektrometrie ist hierin bevorzugt. Massenspektrometerformate umfassen die Ionisierungstechniken (I), wie etwa Matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI), kontinuierliche oder gepulste Elektrospray (ESI) und verwandte Verfahren (z. B. Ionenspray oder Thermospray) und Massiv- Cluster Impact (MCI); diese Ionenquellen können auf Detektionsformate abgestimmt werden, einschließlich lineare oder reflektronische Laufzeitanalyse (time of flight TOF), einzelne oder multiple Quadrupel, einzelne oder multiple magnetische Sektor, Fourier-Transformationsionencyclotronresonanz (FTICR), Ionenfalle, und Kombinationen davon, um einen Hybriddetektor zu ergeben (z. B. Ionenfalle/Laufzeit (time of flight)). Für die Ionisierung können verschiedene Matrix/Wellenlängenkombination (MALDI) oder Lösungsmittelkombination (ESI) verwendet werden.
Herstellung von DNA-Arrays
In bevorzugten Ausführungsformen werden Promotor enthaltende Nukleinsäuresonden vor oder im Anschluß an die Hybridisierung mit Zielnukleinsäure auf der Oberfläche eines festen Trägers in einem Arrayformat immobilisiert. Besonders geeignete Verfahren zur Herstellung dieser DNA-Arrays sind die hierin beschriebenen und die U.S.-Anmeldungen Nr. 08/746,053, 08/787,639 und 08/786,988.
1 zeigt ein System zur Herstellung von Arrays aus Probenmaterial für die Analyse durch ein diagnostisches Werkzeug. 1 zeigt ein System 10, das einen Datenverarbeiter 12, einen Bewegungsregler 14, eine Roboterarmanordnung 16, ein Monitorelement 18A, eine zentrale Verarbeitungseinheit 18B, eine Mikroliterplatte mit Ausgangsmaterial 20, ein Aufbaugehäuse 22, ein Roboterarm 24, einen Aufbau 26, einen Druckregler 28, eine Leitung 30, eine Befestigungsanordnung 32, eine Nadelanordnung 38 und Substratelemente 34 umfaßt. In der in 1 dargestellten Ansicht ist auch dargestellt, daß die Roboteranordnung 16 ein bewegliches Befestigungselement 40 und eine horizontale Gleitnut 42 umfassen kann. Der Roboterarm 24 kann gegebenenfalls um einen Stift 36 drehbar sein, um die Reichweite des Arms 24 zu erhöhen, so daß der Arm 24 die Nadelanordnung 38 oberhalb der Ursprungsplatte 20 anordnen kann.
Der Datenverarbeiter 12, der in 1 dargestellt ist, kann ein herkömmliches digitales Datenverarbeitungssystem, wie etwa ein IBM PC kompatibles Computersystem sein, das geeignet ist zur Verarbeitung von Daten und zum Ausführen von Programminstruktionen, die Informationen zum Regeln der Bewegung und des Betriebs der Roboteranordnung 16 bereitstellt. Die Datenverarbeitungseinheit 12 kann jeder Art von System sein, die geeignet ist zum Verarbeiten eines Programms von Instruktionssignalen, welche die Roboteranordnung betreiben, die in dem Robotergehäuse 16 integriert ist. Gegebenenfalls kann der Datenverarbeiter 12 eine Microcontroller-geregelte Anordnung sein, die in das Robotergehäuse 16 integriert ist. In weiteren alternativen Ausführungsformen braucht das System 10 nicht programmierbar zu sein und kann ein Einplatinen-Computer sein mit einem Firmware-Speicher zum Aufbewahren von Instruktionen zum Betreiben der Roboteranordnung 16.
In der in 1 dargestellten Ausführungsform gibt es einen Regler 14, der den Datenverarbeiter 12 mit der Roboteranordnung 16 elektronisch verknüpft. Der dargestellte Regler 14 ist ein Bewegungsregler, der die Motorelemente der Roboteranordnung 16 zum Positionieren des Roboterarms 24 an einer ausgewählten Stelle betreibt. Zusätzlich kann der Regler 14 Instruktionen an die Roboteranordnung 16 geben, um den Druckregler 28 zu dirigieren, um das Volumen der aus den einzelnen Nadelelementen der dargestellten Nadelanordnung 38 ausgestoßenen Flüssigkeit zu kontrollieren. Das Design und die Konstruktion des dargestellten Bewegungsreglers 14 folgt den Prinzipien der im Stand der Technik bekannten Elektrotechnik, und es kann jedes Regelelement, das für das Betreiben der Roboteranordnung 16 geeignet ist, verwendet werden, ohne vom Schutzbereich abzuweichen.
Die in 1 dargestellte Roboteranordnung 16 ist elektronisch an den Regler 14 gekoppelt. Die dargestellte Roboteranordnung 16 ist ein Gerüstsystem, das einen XY-Tisch zum Bewegen des Roboterarms auf einer XY-Ebene umfaßt, und weiterhin einen Z-Achsenaktuator umfaßt, um den Roboterarm orthogonal zu der XY-Ebene zu bewegen. Die in 1 dargestellte Roboteranordnung 16 umfaßt einen Arm 24, welcher auf dem XY-Aufbau gelagert ist, welche den Arm innerhalb einer Ebene definiert durch den XY-Zugriff bewegt. In der dargestellten Ausführungsform ist der XY-Tisch auf dem Z-Aktuator gelagert, um den gesamten Tisch entlang der Z-Achse orthogonal zu der XY-Ebene zu bewegen. Auf diese Weise ermöglicht die Roboteranordnung drei Freiheitsgrade, was ermöglicht, daß die Nadelanordnung 38 an jede Stelle oberhalb der Substrate 34 und der Ursprungsplatte 20 angeordnet werden kann, die in 1 so dargestellt sind, daß sie auf dem Aufbau 26, die auf der Roboteranordnung 16 gelagert ist, sitzen.
Die dargestellte Roboteranordnung 16 folgt aus im Stand der Technik wohlbekannten Prinzipien der Elektrotechnik und ist nur ein Beispiel einer geeigneten Roboteranordnung zur Bewegung einer Nadelanordnung an Stellen oberhalb eines Substrats und einer Ursprungsplatte, so wie das dargestellte Substrat 34 und Ursprungsplatte 20. Alternative Robotersysteme können gemäß den Beschreibungen hierin durchgeführt werden, ohne vom Schutzumfang abzuweichen.
1 zeigt eine Ausführungsform einer Roboteranordnung 16, die einen Druckregler 28 umfaßt, welcher über eine Leitung 30 mit der Befestigung 32 verknüpft ist, welche mit der Nadelanordnung 38 verknüpft ist. In dieser Ausführungsform hat die Befestigung 32 einen inneren Kanal zur Flüssigkeitsverbindung der Leitung 30 und der Nadelanordnung 38. Demgemäß ist der Druckregler 28 flüssigkeitsverbunden mit der Leitung 30 und der Befestigung 32 an die Nadelanordnung 38. Auf diese Weise kann der Regler 14 Signale an den Druckregler 28 senden, um selektiv einen Flüssigkeitsdruck, der an die Nadelanordnung 38 gegeben wird, zu regeln.
2 zeigt eine Ausführungsform einer Nadelanordnung 50, die für das in 1 dargestellte System geeignet ist, welche den Druckregler 28 umfaßt. In der dargestellten Ausführungsform umfaßt die Nadelanordnung 50 ein Gehäuse, das aus einem oberen Teil 52 und einem unteren Teil 54 besteht, die durch die Schrauben 56A und 56B verbunden sind, um ein inneres Kammervolumen 58 zu definieren. 2 zeigt weiterhin, daß, um das innere Kammervolumen 58 flüssigkeitsabzudichten, das Gehäuse ein Dichtungselement umfassen kann, daß in 2 als eine O- Ringdichtung 60 dargestellt ist, der zwischen dem oberen Block 52 und dem unteren Block 54 sitzt und den Umfang des inneren Kammervolumens 58 vollständig umgibt. 2 zeigt weiterhin, daß die Nadelanordnung 50 mehrere Vesikel 62A–62D umfaßt, von denen jedes eine axiale Bohrung, die sich dadurch zieht, umfaßt, um die dargestellten Aufnahmekammern 64A–64D zu bilden. Jedes der dargestellten Vesikel setzt sich durch eine jeweilige Öffnung 68A–68D fort, die innerhalb des unteren Blocks 54 des Gehäuses angeordnet ist.
Wie weiterhin in der dargestellten Ausführungsform gezeigt ist, hat jedes der Vesikel 62A–62D einen oberen Flanschteil, der gegen ein Dichtungselement 70A–70D angeordnet ist, um eine flüssigkeitsdichte Dichtung zwischen dem Vesikel und dem unteren Block 54 zu bilden, um zu verhindern, daß eine Flüssigkeit durch die Öffnungen 68A–68D austritt. Um die Dichtung dicht zu halten, umfaßt die dargestellte Nadelanordnung 50 weiterhin einen Satz Vorspannelemente 74A–74D, die in 2 als Federn dargestellt sind, welche in den dargestellten Ausführungsformen sich im zusammengedrückten Zustand befinden, um das Flanschelement der Vesikel 62A–62D gegen ihre jeweiligen Dichtungselemente 70A–70D bis zu drücken. Wie in 2 dargestellt, setzen sich die Vorspannelemente 74A–74D zwischen den Vesikeln und dem oberen Block 52 fort. Jede der Federn 74A–74D kann fest auf einer Befestigungsplatte 76A–76D gelagert sein, wo die Federelemente am oberen Block 52 befestigt sein können. Der obere Block 52 umfaßt weiterhin eine Öffnung 78, die in 2 als mittig angeordnete Öffnung dargestellt ist, die eine Fadenbohrung aufweist, um einen Verschluß 80 aufzunehmen, der innerhalb der Öffnung 78 drehbar gelagert sein kann.
Wie weiterhin in 2 dargestellt, ist der Verschluß 80 durch eine Leitung mit einem Ventil 82 verbunden, das den Verschluß 80 mit einer Leitung 84 verbinden kann, die an eine Druckquelle gekoppelt sein kann, oder alternativ hierzu den Verschluß 80 an eine Leitung 86 koppeln kann, die für eine Belüftung der inneren Kammer 58 sorgt. Eine zentrale Bohrung 88 führt durch den Verschluß 80 und verbindet diesen mit dem Rohrelement, welches weiterhin mit dem Ventil 82 verbunden ist, um somit das innere Kammervolumen 58 entweder mit einer Druckquelle oder einem Belüftungsauslaß flüssigkeitsmäßig oder selektiv zu verbinden.
Die Nadelanordnung 50, die oben beschrieben und in 2 dargestellt ist, ist über einem Substratelement 90 angeordnet, das mehrere Vertiefungen 92 umfaßt, die in die obere Oberfläche des Substrats 90 eingeätzt sind. Wie in 2 dargestellt, ist der Abstand der Vesikel 62A–62D so, daß jedes Vesikel von den angrenzenden Vesikeln durch einen Abstand getrennt ist, der ein ganzzahliges Vielfaches des Abstands zwischen den Vertiefungen 92 ist, die in die obere Oberfläche des Substrats 90 eingeätzt sind. Wie aus der folgenden Beschreibung erkennbar ist, erlaubt diese Beabstandung das parallele Ausgaben von Flüssigkeit, so daß die Flüssigkeit in einem einzigen Betriebsvorgang in mehrere Vertiefungen ausgegeben werden kann. Jedes der Vesikel ist aus rostfreiem Edelstahl, Silicamaterial, polymerem Material oder einem anderen Material gefertigt, das zur Aufnahme einer flüssigen Probe geeignet ist. In einem Beispiel werden in der Anordnung 16 Vesikel verwendet, die aus gehärtetem Berylliumkupfer gefertigt sind, vergoldet über Nickelblech. Sie sind 43,2 mm lang und der Schaft des Vesikels ist auf 0,46 mm Außendurchmesser mit einer konkaven Spitze abgestuft. Eine solche Nadel wurde gewählt, da die Zielgenauigkeit etwa 501 Mikrometer sein kann. Jede geeignete Nadelform kann für die Vorrichtung verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf flache, sternförmige, konkave, feste Spitze, Spitze halb-hohl, auf einer oder auf beiden Seiten abgewinkelte oder andersförmige Nadeln.
3 zeigt eine Seitenansicht des unteren Blocks 54 der Nadelanordnung 50, die in 2 dargestellt ist. 3 zeigt ungefähre Ausmaße für einen Nadelanordnung. Wie dargestellt, hat der untere Block 54 eine Bodenplatte 98 und einen umgebenden Rand 100. Die Bodenplatte 98 hat eine Dicke von etwa 3 mm, und der Rand 100 hat eine Dicke von etwa 5 mm.
4 zeigt eine Draufsicht der allgemeinen Struktur und Ausmaße für einen unteren Block 54, der zur Verwendung der in 2 dargestellten Nadelanordnung 50 geeignet ist. Wie in 4 dargestellt, umfaßt der untere Block 54 eine vier-mal-vier-Matrix mit Öffnungen 68, um 16 Öffnungen bereitzustellen, die jede ein Vesikel aufnehmen können. Wie oben unter Verweis auf 2 beschrieben, ist der Abstand zwischen der Öffnung 68 typischerweise ein ganzzahliges Vielfaches des Abstandes zwischen den Vertiefungen auf einer Substratoberfläche, sowie den Vertiefungen auf der Ursprungsplatte. Somit kann eine Nadelanordnung mit dem unteren Block 54 wie in 4 dargestellt Flüssigkeit in bis zu 16 Vertiefungen gleichzeitig ausgeben. 4 zeigt auch die allgemeinen Ausmaße eines unteren Blocks 54, so daß jede Seite des Blocks 54 im Allgemeinen 22 mm lang ist und der Abstand zwischen den Öffnungen 68 etwa 4,5 mm beträgt. Solch ein Abstand ist geeignet für die Verwendung mit einem Substrat, bei dem Flüssigkeit an Stellen ausgegeben werden soll, die etwa 500 μm voneinander entfernt sind, wie durch das Substrat 90 von 2 beispielhaft dargestellt. 4 zeigt auch, daß der untere Block 54 eine optionale O-Ring-Nut 94 umfassen kann, die so angepaßt ist, daß sie ein O-Ring-Dichtungselement aufnehmen kann, wie etwa das Dichtungselement 60, das in 2 dargestellt ist.
Der Nadelblock kann aus rostfreiem Edelstahl hergestellt sein, da dieses Material mit einer Genauigkeit von etwa +25 μm gebohrt werden kann, aber es kann auch eine Vielzahl von Sondenmaterialien verwendet werden, wie etwa G10-Laminat, PMMA oder anderes geeignetes Material. Der Nadelblock kann eine Anzahl von Öffnungen enthalten und ist mit 16 Behältern dargestellt, welche die 16 Nadeln an ihrem Platz halten. Um die Zielgenauigkeit jeder Nadel zu erhöhen, kann eine optionale Ausrichtungsstelle unterhalb des Blocks angeordnet werden, so daß etwa 6 mm der Nadelspitze noch hervorsteht, um in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte eingetaucht werden zu können. Die Anordnung der Sonden in dem dargestellten Werkzeug ist so geartet, daß sie mit einer 384-Vertiefungen-Mikrotiterplatte koordiniert, somit ist die Mitte-zu-Mitte-Beabstandung der Sonden 4,5 mm. Ein Array von 4 × 4 Sonden wurde gewählt, da dies ein Array erzeugt, der in weniger als einen Quadratzoll hineinpaßt, welches der Bewegungsbereich einer xy-Plattform eines MALDI-TOF MS ist, der durch die Anmelderin verwendet wird.
Die Nadelwerkzeuganordnung wird vervollständigt durch eine Abdeckung aus rostfreiem Edelstahl auf der Oberseite der Vorrichtung, die anschließend an den Z-Arm des Roboters angebracht wird.
Unter Verweis auf die 1 und 2 verwendet die Roboteranordnung 16 eine Nadelwerkzeuganordnung 38, die ähnlich zu der in 2 dargestellten Nadelwerkzeuganordnung konfiguriert ist. Der Druckregler 28 reguliert selektiv den Druck innerhalb der Kammer 58. In dieser Ausführungsform betreibt ein Reglerprogramm den Datenverarbeiter 12, um die Roboteranordnung 16 so zu steuern, daß die Anordnung 16 einen Array von Elementen auf die Substrate 34 druckt. In einem ersten Schritt (siehe auch 2 und 5) dirigiert das Programm die Roboteranordnung 16 so, daß die Nadelanordnung 38 oberhalb der Ursprungsplatte 20 angeordnet ist. Die Roboteranordnung 16 taucht dann die Nadelanordnung in die Ursprungsplatte 20 ein, die eine DNA-Ursprungsplatte mit 384 Vertiefungen sein kann. Wie in 4 dargestellt, kann die Nadelanordnung 16 verschiedene Nadeln umfassen, so daß die Nadelanordnung 50 16 Nadeln in 16 verschiedene Vertiefungen der DNA-Ursprungsplatte 20 mit 384 Vertiefungen eintaucht. Anschließend dirigiert der Datenverarbeiter 12 den Bewegungsregler 14, um die Roboteranordnung 16 so zu betreiben, daß die Nadelanordnung auf eine Position oberhalb der Oberfläche des Substrats 34 bewegt wird. Das Substrat 34 kann jedes Substrat sein, das geeignet ist, um ein Probenmaterial aufzunehmen und kann aus Silicium, Kunststoff, Metall oder jedem anderen geeigneten Material gefertigt sein. Gegebenenfalls hat das Substrat eine flache Oberfläche, kann aber alternativ auch eine körnige Oberfläche, eine Oberfläche, die mit Vertiefungen oder einer anderen geeigneten Oberflächenbeschaffenheit eingeätzt ist umfassen, und kann weiterhin Partikel auf der Oberfläche jeder Vertiefung enthalten. Das Programm, das den Datenverarbeiter 12 betreibt, kann dann die Roboteranordnung über den Bewegungsregler 14 steuern, um den Druckregler 28 zu steuern, um einen positiven Druck im inneren des Kammervolumens 58 zu erzeugen. Bei dieser Ausführung treibt der positive innere Druck Flüssigkeit aus den Kammern der Vesikel 62, um Flüssigkeit aus den Vesikeln und in die jeweilige Vertiefung 92 des Substrats 90 auszustoßen.
Das Programm, daß den Datenverarbeiter 12 betreibt, kann auch den Regler 14 steuern, um den Druckregler 28 zu steuern, um das Befüllen der Aufnahmekammern mit Ursprungsmaterial aus der Ursprungsplatte 20 zu kontrollieren. Der Druckregler 28 kann innerhalb des inneren Kammervolumens 58 der Nadelanordnung einen negativen Druck erzeugen. Dies führt dazu, daß Flüssigkeit in die Aufnahmekammern der Vesikeln 62A–62D aufgezogen wird. Der Druckregler 28 kann den Druck entweder durch offenen oder geschlossenen Regelkreis regulieren, um zu vermeiden, daß Flüssigkeit durch die Aufnahmekammern zuviel aufgenommen wird und im inneren Kammervolumen 58 verschüttet wird. Regelkreisregelsysteme zum Regeln des Drucks sind im Stand der Technik wohlbekannt und es kann jeder geeignete Regler verwendet werden. Ein solches Verschütten könnte Kreuzverunreinigungen verursachen, insbesondere wenn das Ursprungsmaterial, das aus der Ursprungsplatte 20 aufgezogen wird, von Vertiefung zu Vertiefung verschieden ist.
In einer alternativen Ausführungsform ist jede der Aufnahmekammern 64A–64D ausreichend klein, um die Kammern durch Kapillarkraft zu füllen. In einer solchen Ausführung kann die Nadelanordnung einen Array von schmalen Bohrungsnadeln umfassen, wie etwa Nadeln aus rostfreiem Edelstahl, die durch die Öffnungen in den unteren Block 54 reichen. Die Nadeln, die in die Ursprungslösungen eingetaucht werden, befüllen sich durch Kapillarkraft. In einer Durchführung wird die Länge der Kapillare, die durch atmosphärischen Druck befüllt werden soll, etwa durch die folgende Gleichung bestimmt:
wobei H die Höhe ist, Gamma die Oberflächenspannung ist, P die Lösungsdichte ist, G die Gravitationskraft ist und R der Nadelradius ist. Somit kann das Flüssigkeitsvolumen, das von jedem Vesikel aufgenommen wird, kontrolliert werden, in dem die Ausmaße der inneren Bohrung gewählt werden. Es versteht sich, daß bei Raumtemperatur Wasser eine 15 cm lange Kapillare mit einem Radius von 100 μm füllt. Somit füllt sich eine kurze Nadel mit Nanoliterbohrungsvolumen bis zur vollen Kapazität, sollte jedoch nicht überfließen, denn die Kapillarkraft ist zu klein, um einen Meniskus oben an der Nadelöffnung zu bilden. Dies verhindert die Kreuzverunreinigung aufgrund von Verschütten. In einer Ausführungsform können die Vesikel der Nadelanordnung mit unterschiedlich großen inneren Kammern zum Aufnehmen und Ausgeben von unterschiedlichen Volumina an Flüssigkeit versehen werden.
In einer alternativen Ausführung kann ein kleiner positiver Druck innerhalb des inneren Kammervolumens 58 durch den Druckregler 28 bereitgestellt werden, um das Volumen an Flüssigkeit, das in die Aufnahmekammern der Vesikel aufgezogen wird, zu verringern. Die durch den positiven Druck erzeugte nach unten gerichtete Kraft, kann verwendet werden, um der nach oben gerichteten Kapillarkraft entgegenzuwirken. Auf diese Weise kann das Volumen an Flüssigkeit, das durch Kapillarkraft in die Aufnahmekammern der Vesikel aufgezogen wird, kontrolliert werden.
5B zeigt, daß Flüssigkeit innerhalb der Aufnahmekammern der Nadel durch einen kleinen positiven Druck ausgegeben werden kann, welcher durch die zentrale Bohrung 88, die sich durch einen Swagelok 80 erstreckt. Durch Regulieren des Druckimpulses, der in das innere Kammervolumen 58 eingebracht wird, kann Flüssigkeit entweder als Spray oder als tropfenförmige Formation an der Spitze der Nadel ausgestoßen werden. Es versteht sich, daß die die Ausgabegeschwindigkeit, Tropfen gegenüber Spray, teilweise von dem durch den Druckregler 28 angelegten Druck abhängt. In einer Ausführung wird ein Druck im Bereich von 10 und 1000 Torr Luftdruck angelegt.
Um dies zu erreichen, kann der Datenverarbeiter 12 ein Computerprogramm laufen lassen, welches das ausgegebene Flüssigkeitsvolumen kontrolliert und reguliert. Das Programm kann den Regler 28 steuern, um ein definiertes Flüssigkeitsvolumen auszustoßen, entweder durch Erzeugen eines Sprays oder durch Erzeugen eines Tropfens, der am Ende des Vesikels sitzt, und der mit der Substratoberfläche zum Ausgeben von Flüssigkeit darauf kontaktiert werden kann.
5C und 5D zeigen, daß die früheren Schritte, die in 5A–5B dargestellt sind, wieder durchgeführt werden können, dieses Mal an einer Position auf der Substratoberfläche, die von der früheren Position beabstandet ist. Im dargestellten Verfahren wird das Nadelwerkzeug mit einem Abstand, der dem Abstand zwischen zwei Vertiefungen 92 entspricht, beabstandet. Andere Offset-Druckertechniken können angewandt werden.
Es werden mehrere Vorteile der Nadelanordnung, die in 2 dargestellt ist, erreicht. Beispielsweise ist das Spülen zwischen den Ausgabeereignissen einfach und erfordert lediglich eine einfache oder mehrere Nadelbefüllungen und Entleerungen mit einer Spüllösung. Darüber hinaus variiert die Genauigkeit der ausgegebenen Volumina nur in Abhängigkeit der inneren Nadelausmaße, die während der Nadelherstellung genau kontrolliert werden kann, da alle Aufnahmekammern sich bis zur vollen Kapazität befüllen. Des Weiteren ist die Vorrichtung kosteneffektiv, wobei die höchsten Ausgaben für die Nadeln gebraucht werden, da jedoch kein Kontakt mit einer Oberfläche erforderlich ist, werden die Nadeln wenig physikalischer Beanspruchung ausgesetzt, was dazu führt, daß sie selten ausgewechselt werden müssen und eine lange Lebensdauer haben.
Alternativ hierzu kann die Ablagerung von Probenmaterial auf der festen Trägeroberfläche Techniken umfassen, die Nadelwerkzeuganordnungen verwenden, die feste Nadelelemente aufweisen, die von einem Block ausgehen, wobei die Roboteranordnung die festen Nadelelemente der Nadelanordnung in eine Quelle von Probenmaterial eintaucht, um die entfernten Enden der Nadeln mit den Probenmaterialien zu benetzen. Anschließend kann die Roboteranordnung die Nadelanordnung an eine Position oder oberhalb des Substrats bewegen und anschließend die Nadelanordnung gegen die Oberfläche des Substrats bewegen, um die einzelnen benetzten Nadeln mit der Oberfläche zu kontaktieren, um das Material auf die Substratoberfläche zu spotten.
Nadelwerkzeuganordnungen, die feste Nadeln mit einer Promotor-enthaltenden Nukleinsäure aufweisen, die darauf immobilisiert ist, können in Vertiefungen eingetaucht werden, die ein Reaktionsgemisch für die Hybridisierung und/oder die Erzeugung eines RNA-Transkripts enthalten. Die Flüssigkeit mit den Transkripten kann anschließend in einem Array wie oben erörtert abgelagert werden, beispielsweise unter Verwendung von festen Nadeln einer Nadelwerkzeuganordnung, um die Probe auf die Substratoberfläche zu spotten.
6A und 6B zeigen ein weiteres alternatives System zum Ausgeben von Material auf oder an die Oberfläche des Substrats. Insbesondere zeigt 6A eine Strahldruckvorrichtung 110, die ein Kapillarelement 112, ein Umwandlerelement 114 und eine Öffnung (nicht gezeigt) 118, eine Flüssigkeitsleitung 122 und einen Aufbau 124 umfaßt, welcher mit einer Roboterarmanordnung, wie dem in 1 dargestellt Roboterarm 24 verbunden ist. Wie weiterhin in 6A dargestellt ist, ist die Strahlanordnung 110 geeignet zum Ausstoßen einer Serie von Tropfen 120 aus der Öffnung 118 an Probenmaterial zum Ausgeben von Probenmaterial auf die Oberfläche 128.
Die Kapillare 112 der Nadelanordnung 110 kann eine Glaskapillare, eine Kunststoffkapillare oder jedes andere geeignete Gehäuse sein, welches eine Flüssigkeitsprobe aufnehmen kann und welche das Ausstoßen durch die Wirkung eines Umwandlerelements, wie etwa des Umwandlerelements 114 ermöglicht. Das in 6A dargestellte Umwandlerelement 114 ist ein piezo-elektrisches Umwandlerelement, welches sich um den Parameter der Kapillare 112 bildet und einen vom Impulsgenerator innerhalb der Roboteranordnung 16 erhaltenen elektrischen Impuls transformieren kann, um zu ermöglichen, daß Flüssigkeit aus der Öffnung 118 der Kapillare 112 ausgestoßen wird. Eine derartige Strahlanordnung mit einem piezo-elektrischen Umwandlerelement wird von MicroFab Technology, Inc., Deutschland hergestellt. Es kann jedoch jede Strahlanordnung, die für das Ausgeben von definierten und kontrollierten Volumina an Flüssigkeit geeignet ist, hierin verwendet werden, einschließlich derjenigen, die piezo-elektrische Umwandler, elektrische Umwandler, elektrorestriktive Umwandler, magnetorestriktive Umwandler, elektromechanische Umwandler oder jedes andere geeignete Umwandlerelement verwenden. In der dargestellten Ausführungsform hat die Kapillare 112 eine Flüssigkeitsleitung 122 zum Aufnehmen von Flüssigkeitsmaterial. In einer optionalen Ausführungsform kann Flüssigkeit in die Kapillare durch die Wirkung eines Vakuumdrucks aufgenommen werden, welcher Flüssigkeit durch die Öffnung 118 anzieht, wenn die Öffnung 118 in eine Quelle von Probenmaterial eingetaucht wird. Weitere Ausführungsformen der Strahlanordnung 110 können im Rahmen der Erfindung ausgeführt werden, ohne vom Schutzumfang abzuweichen.
6B zeigt eine weitere alternative Anordnung, die dazu geeignet ist, am Roboterarm der Roboteranordnung durchgeführt zu werden, wie etwa die in 1 dargestellte Anordnung 16. 6B zeigt vier Strahlanordnungen, die miteinander verbunden sind, 130A–130D. Ähnlich der Nadelanordnung in 2, kann die in 6B dargestellte Strahlanordnung für das parallele Ausgeben von Flüssigkeitsmaterial verwendet werden. Jede der Strahlanordnungen 130A–130D können unabhängig von den anderen betrieben werden, wodurch die selektive Ausgabe von Flüssigkeit aus ausgewählten Strahlanordnungen ermöglicht wird. Darüber hinaus kann jede der Strahlanordnungen 130A–130D unabhängig gesteuert werden, um das aus jeder der jeweiligen Anordnungen 130A–130D auszugebenden Volumina an Flüssigkeit auszuwählen. Weitere Modifikationen und Abänderungen können an der in 6B dargestellten Anordnung durchgeführt werden, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Auf der Substratoberfläche können gemäß einem der oben erörterten Techniken Arrays gebildet werden. Die Probenarrays werden anschließend durch Massenspektrometrie analysiert, um Spektrendaten zu sammeln, die für die Zusammensetzung der Proben auf dem Array repräsentativ sind. Es versteht sich, daß die obigen Methoden Verfahren bereitzustellen, die das schnelle Ausgeben von definierten und kontrollierten Volumina von Analytenmaterial erlauben. Insbesondere erlauben diese Verfahren das Ausgeben von Flüssigkeitsvolumina im Bereich von unterhalb einem Nanoliter bis zum niedrigen Nanoliterbereich. Diese Ablagerungstechniken für niedrige Volumina erzeugen Probenarrays, die für die Analyse durch Massenspektrometrie gut geeignet sind. Beispielsweise ergeben die geringen Volumina eine Reproduzierbarkeit der Spot-Eigenschaften, wie etwa die Verdunstungsraten, sowie eine verringerte Abhängigkeit von atmosphärischen Bedingungen, wie etwa Umgebungstemperatur und Licht.
Fortfahrend mit dem in 5 dargestellten Beispiel, können die Arrays durch das Laden von Oligonukleotiden (0,1–50 ng/μl) verschiedene Sequenzen oder Konzentrationen in die Vertiefungen einer Mikrotiterursprungsplatte mit 96 Vertiefungen 20 hergestellt werden; die erste Vertiefung kann für das Aufnehmen einer Matrixlösung reserviert werden. Ein Substrat 34, wie etwa das körnige Silicium-Chip-Substrat kann auf den Aufbau 26 der Roboteranordnung 16 angeordnet werden und manuell so ausgerichtet werden, daß die Matrix der Vertiefungen an einem Satz Referenzachsen ausgerichtet ist. Das Steuerungsprogramm, welches den Datenverarbeiter 12 betreibt, kann die Koordinaten der ersten Vertiefung der Ursprungsplatte 20 aufnehmen. Der Roboterarm 24 kann die Nadelanordnung 38 in die Ursprungsplatte 20 eintauchen, so daß jede der 16 Nadeln in eine der Vertiefung eingetaucht wird. Jedes Vesikel kann sich durch Kapillarkraft befüllen, so daß das volle Volumen der Aufnahmekammer Flüssigkeit enthält. Optional kann das den Datenverarbeiter 12 betreibende Programm den Druckregler so steuern, daß die innere Kammer 58 der Nadelanordnung 38 mit einem positiven Vordruck versehen wird, der teilweise der Wirkung der Kapillarkraft entgegenwirkt, um das Flüssigkeitsvolumen, das in die Aufnahmekammer aufgezogen wird, zu beschränken oder zu reduzieren.
Gegebenenfalls kann die Nadelanordnung 38 in dieselben 16 Vertiefungen der Ursprungsplatte 20 eingetaucht werden und auf ein zweites Targetsubstrat gespottet werden. Dieser Zyklus kann für die Anzahl der gewünschten Targetsubstrate wiederholt werden. Anschließend kann der Roboterarm die Nadelanordnung 38 in eine Waschlösung eintauchen und anschließend die Nadelanordnung in 16 verschiedene Vertiefungen der Ursprungsplatte 20 eintauchen und auf ein Substrat-Target aufspotten, das mit einem Abstand vom Ursprungssatz an 16 Spots beabstandet ist. Dies kann wiederum für so viele Targetsubstrate wiederholt werden wie gewünscht. Der gesamte Zyklus kann wiederholt werden, um einen 2 × 2 Array von jedem Vesikel herzustellen, um einen 8 × 8-Array mit Spots (2 × 2 Elemente/Vesikel × 16 Vesikel = 64 gespottete Elemente insgesamt) herzustellen. Jedes Verfahren, das zum Herstellen von Arrays geeignet ist, kann angewandt werden.
Oligonukleotide verschiedener Sequenzen oder Konzentrationen können in die Vertiefungen der bis zu drei verschiedenen Mikrotiterursprungsplatten mit 384 Vertiefungen geladen werden. Ein Satz von 16 Vertiefungen kann für eine Matrixlösung reserviert werden. Die Vertiefungen auf zwei Platten werden mit Waschlösung gefüllt. Fünf Mikrotiterplatten können auf den Aufbau der Roboteranordnung geladen werden. Es können mehrere Targetsubstrate so angeordnet werden, daß sie an den optionalen Satz von Quernadeln oder Registrierungsnadeln angrenzen, die auf dem Aufbau 26 angeordnet sind und zum Ausrichten der Targetsubstrate entlang einem Satz von Referenzachsen dienen. Falls die Matrix und Oligonukleotide nicht vorgemischt werden, kann die Nadelanordnung dazu verwendet werden, um zuerst eine Matrixlösung auf alle gewünschten Targetsubstrate auszuspotten. In einem folgenden Schritt kann die Oligonukleotidlösung im gleichen Muster wie das Matrixmaterial gespottet werden, um die Matrix wieder aufzulösen. Alternativ hierzu kann ein Probenarray hergestellt werden, indem die Oligonukleotidlösung zuerst auf dem Wafer plaziert wird, gefolgt von der Matrixlösung, oder auch durch Vormischen der Matrix- und Oligonukleotidlösungen.
Nach dem Aufbringen der Probenarrays auf der Oberfläche des Substrats können die Arrays unter Verwendung einer Vielzahl von Mitteln untersucht werden spektrometrische Techniken, wie etwa UV/VIS, IR, Fluoreszenz, Chemilumineszenz, NMR-Spektrometrie oder Massenspektrometrie). Beispielsweise können im Anschluß an das jeweilige Ausgabeverfahren die mit Proben beladenen Substrate auf eine MALDI-TOF-Ursprungsplatte plaziert werden und dort mit einem Satz abgeschrägter Schrauben fixierter Polycarbonatträger gehalten werden. In einer Ausführung kann die Platte an einem Ende der Sonde transferiert werden, um dort auf einem 1'' Bewegungs-xy-Aufbau (Newport) mit 1 μm Auflösung in der Ursprungsregion eines Time-of-Flight-Massenspektrometers gehalten zu werden. Jedes geeignete massenspektrometrische Werkzeug kann verwendet werden.
Bevorzugte Massenspektrometerformate zur Verwendung mit den hierin beschriebenen Arrays umfassen Ionisierungstechniken (I) einschließlich aber nicht beschränkt auf matrix assisted laser desorption (MALDI), kontinuierliche oder gepulste Elektrosprayverfahren (ESI) und verwandte Verfahren (z. B. Ionenspray oder Thermospray) oder Massiv-Cluster Impact (MCI); jene Ionenquellen können auf die Detektionsformate abgestimmt werden, einschließlich linearem oder nicht-linearem Reflektron Time-of-Flight (TOF), einfachem oder mehrfachem Quadrupel, einfachem oder mehrfachem magnetischen Sektor, Fourier-Transformations-Ionen-Cyclotronresonanz (FTICR), Ionenfalle und Kombinationen davon (z. B. Ionenfalle/Time-of-Flight). Für die Ionisierung können verschiedene Matrix/Wellenlängenkombinationen (MALDI) oder Lösungsmittelkombinationen (ESI) verwendet werden. Subattomolare Proteinmengen sind z. B. unter Verwendung von ESI (Valaskovic, G. A. et al., (1996) Science 273: 1199–1202) oder MALDI (Li, L. et al., (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 1662–1663) Massenspektrometrie nachgewiesen worden.
Somit versteht es sich, daß in den hierin beschriebenen Verfahren eine Betriebsart des vollständig ohne Kontakt verlaufenden, Hochdrucksprays oder mit partiellem Kontakt, Niedrigdrucktropfenformationsart verwendet werden kann. Im Letzteren ist der einzige Kontakt, der Auftritt, zwischen dem Tropfen und den Wänden der Vertiefung oder einer hydrophilen flachen Oberfläche des Substrats 34. In keiner Ausführungsform muß ein Kontakt zwischen der Nadelspitze und der Oberfläche bestehen.
Beispielhafte Ausführungsform
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine doppelsträngige Nukleinsäuresequenz, die für eine Promotorsequenz codiert, aus einer natürlichen Quelle isoliert (z. B. Bakterien, Viren, Bakteriophagen, Pflanzen oder eukaryontische Organismen) oder aus synthetischen Sequenzen zusammengesetzt. Eine einzelsträngige Region von mindestens fünf Nukleotiden am 3'-Ende des codierenden Stranges unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind siehe Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Diese einzelsträngige Region ist so geartet, daß sie zu einer Region der zu sequenzierenden Nukleinsäure oder einer Sequenz, die von zwei Nukleinsäuremolekülen geteilt wird (z. B. einer Restriktionsendonukleasenstelle) komplementär ist.
Die zu sequenzierende Nukleinsäure, die mindestens ein teilweise einzelsträngiges 3'-Ende enthält, wird gemäß den hierin beschriebenen Bedingungen hybridisiert, vorzugsweise mit hoher Stringenz, was dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, so daß fünf aufeinanderfolgende zusammenpassende Basenpaare sich innerhalb der komplementären Sequenzen der Promotor-enthaltenden DNA bilden. Die zu sequenzierende Nukleinsäure kann doppelsträngig oder vorzugsweise einzelsträngig sein. Die Hybridisierung der zwei Nukleinsäuremoleküle bringt einen oder mehrere Brüche in das Hybrid an der Anschlußstelle(n) der benachbarten Nukleinsäuremoleküle ein. Brüche im codierenden oder nicht codierenden Strang, vorzugsweise dem codierenden Strang, können durch Zugabe einer geeigneten Nukleinsäureligase vor dem Transkriptionsstart ligiert werden. Verfahren zum Ligieren von Nukleinsäuren sind dem Fachmann wohlbekannt (siehe Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) und DNA- und RNA-Ligasen sind gewerblich erhältlich (z. B. Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN).
Die Transkription wird von dem Promotor aus initiiert durch Zugabe der geeigneten RNA-Polymerase in Gegenwart von Ribonukleosid-Triphosphaten unter hierin beschriebenen Bedingungen, die auch anderswo bekannt sind (z. B. in RNA Polymerase and the Regulation of Transcription, Reznikoff et al., Hrsg., Elsevier, NY). In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Transkriptionsgemisch ein ausgewähltes Basen-spezifisch Ketten-terminierendes 3'-Deoxyribonukleosid-Triphosphat und auch ein Inosin-5'-triphosphat, um die Sekundärstruktur des RNA-Produkts zu reduzieren, oder modifizierte Ribonukleosid-Triphosphate, wie etwa 4-thio UTP, 5-Brom UTP oder 5'-Jod CTP, um den Turnover des RNA-Polymeraseenzyms zu erleichtern und somit die Menge an RNA-Transkript, das für die Analyse zur Verfügung steht, zu erhöhen.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Promotor enthaltende Nukleinsäuresonde kovalent auf einen Silicaträger durch Funktionalisieren des Trägers mit einer Aminofunktionalität immobilisiert (z. B. durch Derivatisieren des Trägers mit einem Reagenz, wie etwa 3-Aminopropyl-triethoxysilan (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI; siehe 7). Andere funktionalisierte Oxysilane oder Orthosilicate können verwendet werden und sind gewerblich erhältlich (z. B. von Gelest, Inc., Tullytown, PA). Beispielsweise kann 3-Mercaptopropyltriethoxysilan verwendet werden, um eine Siliciumoberfläche mit Thiolgruppen zu funktionalisieren. Das Amino-funktionalisierte Silicamaterial kann dann mit heterobifunktionellen Reagenz reagiert werden, wie etwa N-Succinimidyl (4-Jodacetyl)-aminobenzoat (STAB) (Pierce, Rockford, IL). Andere homo- und heterobifunktionelle Reagenzien, die verwendet werden können, sind gewerblich erhältlich, beispielsweise von Pierce. Schließlich kann eine mit einer Thiolgruppe (z. B. am 5'-Terminus) funktionalisierte Nukleinsäure kovalent an den derivatisierten Silicamaterialträger gebunden werden durch Reaktion der Thiolfunktionalität des Nukleinsäuremoleküls mit der Jodacetylfunktionalität des Trägers.
In einigen Ausführungsformen kann die Nukleinsäure mit dem quervernetzenden Reagenz reagiert wird, um ein Quervernetzer/Nukleinsäurekonjugat zu bilden, welches anschließend mit einem funktionalisierten Träger reagiert wird, um eine immobilisierte Nukleinsäure zu ergeben. Alternativ hierzu kann der Quervernetzer mit der Nukleinsäure und einem funktionalisierten festen Träger in einem Gefäß gemischt werden, um eine im Wesentlichen simultane Reaktion des quervernetzenden Reagenzes mit der Nukleinsäure und dem festen Träger herbeizuführen. In dieser Ausführungsform ist es im Allgemeinen notwendig, einen heterobifunktionellen Quervernetzer zu verwenden, d. h. einen Quervernetzer mit zwei unterschiedlichen reaktiven Funktionalitäten, die in der Lage sind, eine selektive Reaktion mit jeweils der Nukleinsäure und dem funktionalisierten Träger durchzuführen.
Gemäß den hierin beschriebenen Verfahren können räumlich erreichbare Arrays von auf unlöslichen Trägern immobilisierten Nukleinsäuren, die zum Sequenzieren von Nukleinsäuren unter Verwendung von RNA-Polymerase geeignet sind, hergestellt werden. Beispielsweise können die Verfahren verwendet werden, um Arrays mit verschiedenen Nukleinsäuren herzustellen, die in einem Array auf Nadeln angeordnet sind. In einer anderen Ausführungsform kann eine fotospaltbare Schutzgruppe auf dem unlöslichen Träger selektiv gespalten werden (z. B. durch Fotolithographie) um Teile einer Oberfläche zur ergeben, die aktiviert sind, für die Immobilisierung einer Nukleinsäure. Beispielsweise kann eine Siliciumoberfläche, die durch Behandlung mit 3-Mercaptopropyltriethoxysilan modifiziert wurde, um Thiolgruppen zu ergeben, mit einer fotospaltbaren Schutzgruppe blockiert werden (z. B. sind fotospaltbare Schutzgruppen offenbart in PCT-Veröffentlichung WO 92/10092 oder McCray et al. (1989) Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18: 239–270) und können durch Bestrahlung ausgewählter Bereiche der Oberfläche, z. B. unter Verwendung einer fotolithographischen Maske selektiv entblockiert werden. Eine Promotor enthaltende Nukleinsäuresonde, die so modifiziert wurde, daß sie eine Thiol-reaktive Gruppe enthält, kann dann direkt an den Träger gebunden werden, oder gebunden werden oder alternativ hierzu kann ein Thiol-reaktives quervernetzendes Reagenz mit dem Thiol-modifizierten Träger reagiert werden, gefolgt von (oder im Wesentlichen gleichzeitig mit) der Reaktion mit einer Nukleinsäure, um immobilisierte Nukleinsäuren zu ergeben. Eine Nukleinsäurebase oder Sequenz kann, nachdem sie gemäß den hierin beschriebenen Verfahren auf einem Träger immobilisiert wurde, gemäß bekannten Verfahren weiter modifiziert werden. Beispielsweise kann das Nukleinsäuremolekül durch Durchführung einer Festphasennukleinsäuresynthese gemäß herkömmlichen Techniken, einschließlich kombinatorischen Techniken verlängert werden.
Vorzugsweise sind die Nukleinsäuren kovalent an eine Oberfläche des unlöslichen Trägers über mindestens ein Schwefelatom gebunden, d. h. die Nukleinsäuren sind kovalent an die Oberfläche über eine Linkergruppe gebunden, die mindestens ein Schwefelatom umfaßt. Solche kovalent gebundenen Nukleinsäuren werden durch die hierin beschriebenen Verfahren leicht hergestellt. In bevorzugten Ausführungsformen sind die kovalent gebundenen Nukleinsäuren auf der Oberfläche des unlöslichen Trägers in einer Dichte von mindestens etwa 20 fmol/mm², stärker bevorzugt mindestens etwa 75 fmol/mm², noch stärker bevorzugt mindestens etwa fmol/mm², noch stärker bevorzugt mindestens etwa 100 fmol/mm² und am meisten bevorzugt mindestens etwa 150 fmol/mm² gebunden vorhanden.
Anwendungen
Die Verfahren zum Sequenzieren von Nukleinsäuren, die hierin beschrieben sind, können für eine Vielzahl von Endverwendungsanwendungen verwendet werden. Beispielsweise können die Verfahren für diagnostische Anwendungen verwendet werden zur Identifizierung von Mutationen, wie etwa Transitionen, Transversionen, Deletionen, Insertionen und dgl. Die Verfahren können auch verwendet werden, um die Diagnose einer Anzahl von genetischen Erkrankungen zu unterstützen, sie können verwendet werden zur genetischen Musterung oder der Bestimmung von Erblichkeit oder Organkompatibilität.
Das Sequenzierungsverfahren kann für diagnostische Anwendungen verwendet werden, um das Vorhandensein von genetischen Änderungen in einer bekannten Zielnukleinsäure zu bestimmen. Beispielsweise kann eine Region der Zielnukleinsäure unter Verwendung von Standardverfahren amplifiziert werden, wie etwa PCR oder andere Amplifikationsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind (siehe z. B. Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Die amplifizierte Nukleinsäure kann denaturiert werden, und der zu sequenzierende Strang (der nicht codierende Strang wird isoliert oder kann als doppelsträngiges Molekül verwendet werden.
Das Vorhandensein von genetischen Änderungen in einer bekannten Zielnukleinsäure wird in einer diagnostischen Anwendung durch das Isolieren (oder Amplifizieren) einer Zielnukleinsäure aus einer biologischen Probe und Hybridisieren des Ziels an eine Promotor enthaltende Fangsonde zum Erzeugen eines Promotor-enthaltenden Templats bestimmt. Ein genesteter Satz von RNA-Transkripten wird erzeugt, und die Sequenz der Zielnukleinsäure bestimmt und verglichen mit einer Wildtypsequenz, um zu bestimmen, um in der Zielnukleinsäure eine genetische aufgetreten ist. Das Vorhandensein einer genetischen Änderung kann aus den RNA-Transkripten durch andere Arten, die im Stand der Technik bekannt sind, bestimmt werden (siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5,605,798 und internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 98/20019).
Verfahren zum Identifizieren Transkriptions-Terminator-Sequenzen
Verfahren zum Identifizieren von bisher unbekannten Transkriptions-Terminator- und Attenuatorsequenzen sind ebenfalls bereitgestellt. Transkriptions-Terminator-Sequenzen sind verantwortlich für den Sequenz-spezifischen Stillstand der RNA-Elongation, und es sind derartige Terminator-Sequenzen von einer Vielzahl von Organismen berichtet worden. Beispielsweise besitzen bakterielle rho-unabhängige Terminator-Sequenzen zwei invertierte Wiederholungen, die durch mehrere Basenpaare getrennt sind, gefolgt von einer 5–10 nt langen polyT-Strecke. Bei der Transkription dieser Sequenzen bildet das resultierende mRNA-Transkript eine RNA-Sekundärstruktur mit einer Haarnadel-Schleife hinter dem RNA-Polymerasemolekül, was das Pausieren der RNA-Polymerase erhöht und/oder die Wechselwirkung zwischen der RNA-Polymerase und dem DNA-Templat destabilisiert, bis zu einer Beendigung des Transkripts innerhalb der DNA-polyT-Strecke führt (z. B. siehe Wilson und von Hippel (19; Reynolds et al. (1992a), J. Mol. Biol, 224: 53–63; Reynolds et al. (1992b) J. Mol. Biol. 224: 31–51; Telesnitsky et al. (1989) Biochemistry 28: 5210–5218; d'Aubenton Carafa et al. (1990) J. Mol. Biol. 216: 835–858).
Bakterielle rho-abhängige Terminatoren weisen nicht die traditionellen invertierten Wiederholungen der Schleifen-Struktur auf und erfordern zusätzliche Faktoren, wie etwa das rho-Protein, um die Transkription anzuhalten (z. B. siehe Schmidt et al. (1984) J. Mol. Biol. 259: 15000–15002). Man glaubt, daß die rho-abhängige Terminierung zu einer vorzeitigen Terminierung in bakteriellen Spezies führt nach dem Entkoppeln der Transkription und der Translation.
Durch Modifizieren der Standard-Transkriptionsbedingungen, die hierin beschrieben sind, können Transkriptions-Terminator-Sequenzen, z. B. rho-abhängige und rhounabhängige Terminatoren unter Verwendung von massenspektrometrischen Verfahren identifiziert werden. Bei der Durchführung dieser Verfahren wird eine einzelsträngige Region des 3'-Endes der zu sequenzierenden Nukleinsäure mit einer komplementären Sequenz am 3'-Ende des codierenden Stranges einer Promotor enthaltenden Nukleinsäuresonde hybridisiert. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Promotor enthaltende Nukleinsäure kovalent über das 5'-Ende des nicht codierenden Stranges oder das 3'-Ende des codierenden Stranges an einen festen Träger gebunden und stärker bevorzugt, ist eine 5'- oder 3'-thiolierte DNA, die mit hoher Dichte an einen mit Aminosilan behandelten festen Träger gebunden ist. Die Bindung kann in Gegenwart oder Abwesenheit einer Linkergruppe stattfinden und ist vorzugsweise in einem Arrayformat angeordnet.
Die Transkription wird in Abwesenheit oder Gegenwart eines modifizierten RNA- Triphosphat-Analogons initiiert, welches die Effizienz der RNA-Polymerasetermination bei solchen Terminator-Sequenzen erhöht, wie er etwa 4-Thio UTP, 5-Brom UTP oder 5'-Jod CTP. Die Massen der spezifisch terminierten RNA-Transkripte können durch Massenspektrometrie detektiert werden, wobei die beobachtete Masse der RNA für den Ort des Terminator-abhängigen Stillstands der Transkription Indikativ ist. Durch Vergleichen des Alignments der Sequenzen, die unmittelbar vor der Stelle der Transkriptions-Terminierung sich befinden aus verschiedenen unterschiedlichen genomischen Stellen, können bis dato unbekannte Terminator-Sequenzen für verschiedene RNA-Polymerasen identifiziert werden.
In einigen Ausführungsformen können Brüche in einem oder mehreren Strängen, die aus der Hybridisierung der zu sequenzierenden Nukleinsäure resultieren, durch die Zugabe einer geeigneten Nukleinsäureligase vor dem Initiieren der Transkription ligiert werden (z. B. durch Hinzufügen einer DNA- oder RNA-Ligase).
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter verdeutlicht.
BEISPIEL 1
Hochdichte Bindung von Nukleinsäuren an Siliciumwafer
Materialien und Verfahren
Alle Reagenzien wurden, wenn nicht anders angegeben, von Aldrich Chemical, Milwaukee, WI erhalten.
Herstellung von Siliciumoberflächen
Siliciumwafer wurden mit Ethanol gewaschen, über einem Bunsenbrenner geflammt und in eine wasserfreie Lösung aus 25% (nach Volumen) 3-Aminopropyltriethoxysilan in Toluol für 3 Stunden eingetaucht. Die Silanlösung wurde entfernt, und die Wafer wurden dreimal mit Toluol gewaschen und dreimal mit Dimethylsulfoxid (DMSO). Die Wafer wurden dann in einer 10 mM wasserfreien Lösung aus N-Succinimidyl-(4-jodacetyl)-aminobenzoat (SIAB) Lösung inkubiert (Pierce Chemical, Rockford, IL) in wasserfreiem DMSO. Nach dieser Reaktion wurde die SIAB-Lösung entfernt, und die Wafer wurden dreimal mit DMSO gewaschen.
Da es unmöglich war, die Kondensation von SIAB und der Aminogruppe zu überwachen, während sie sich auf dem festen Träger des Wafers befand, wurde die Reaktion in Lösung durchgeführt, um die optimale Reaktionszeit zu bestimmen. Dünnschichtchromatographie (TLC) (glasverstärkte Silicaplatten mit einem 254 nm Fluoreszenzindikator) (Baker, Phillipsburg, NF) wurden verwendet unter Verwendung von 95 : 5 Chloroform : Methanol (Baker, Phillipsburg, NJ), was die Trennung der beiden Ausgangsmaterialien erlaubte. Es war möglich, das SIAB-Ausgangsmaterial unter langwelligem ultraviolettem Licht sichtbar zu machen (302 nm); 3-Aminopropyltriethoxysilan war unter ultraviolettem Licht nicht aktiv, daher wurde die Platte mit einer Lösung aus Ninhydrin besprüht, welche mit den primären Aminen reagiert, um bei Erwärmen einen lila-farbenen Fleck sichtbar zu machen. Es wurde eine Reaktion im Mikromaßstab in Chloroform/DMSO unter Verwendung eines geringfügigen molaren Überschusses von SIAB im Vergleich mit 3-Aminopropyltriethoxysilan durchgeführt und unter den oben erwähnten TLC-Bedingungen überwacht.
Oligonukleotidmodifikationen
Die Reduktion des Disulfids aus den 3'- oder 5'-Disulfid enthaltenden Oligodeoxynukleotiden (Operon Technologies, Alameda, CA oder Oligo Etc., Wilsonville, OR) wurde überwacht unter Verwendung von Umkehrphasen-FPLC (Pharmacia, Piscataway, NJ); man beobachtet eine Verschiebung in der Retentionszeit des Oligodeoxynukleotids nach Spaltung des Disulfids. Verschiedene Reduktionsverfahren wurden untersucht, um die optimalen Bedingungen zu bestimmen. In einem Fall wurde das Disulfid-enthaltende Oligodeoxynukleotid (31,5 nmol, 0,5 mM) mit Dithiothreitol (DTT) (Pierce Chemical, Rockford, IL)(6,2 mmol, 100 mM) bei pH 8,0 und 37°C inkubiert. Wenn die Spaltungsreaktion im Wesentlichen vollständig war, wurde das freie Thiol enthaltende Oligodeoxynukleotid unter Verwendung einer Chromaspin-10-Säule (Clontech, Palo Alto, CA) isoliert, da das DTT in der nachfolgenden Reaktion mitwirken kann. Alternativ hierzu wurde tris-(2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP) (Pierce Chemical, Rockford, IL) verwendet, um das Disulfid zu spalten. Das Disulfid enthaltende Oligodeoxynukleotid (7,2 nmol, 0,36 mM) wurde mit TCEP in pH 4,5 Puffer bei 37°C inkubiert. Es ist nicht notwendig, das Produkt im Anschluß an die Reaktion zu isolieren, da das TCEP nicht mit der Jodacetamidofunktionalität kompetitiv reagiert. Verschiedene Konzentrationen von TCEP wurden verwendet für die Spaltungsreaktion, um die optimalen Bedingungen für die Konjugierungsreaktion zu bestimmen.
Sondenkopplung
Zu jedem Wafer, der so derivatisiert wurde, daß er die Jodacetamidofunktionalität wie oben beschrieben enthielt, wurde eine 10 mM wäßrige Lösung des freie Thiolgruppen enthaltenden Oligodeoxynukleotids in 100 mM Phosphatpuffer, pH 8 hinzugegeben; man ließ die Reaktion für ein Minimum von 5 Stunden bei Raumtemperatur in 100% relativer Feuchtigkeit ablaufen. Im Anschluß an die Reaktion wurde die Oligodeoxynukleotidlösung entfernt, und die Wafer wurden zweimal in 5 × SSC-Puffer (75 mM Natriumcitrat, 750 mM Natriumchlorid, pH 7) mit 50% Formamid (USB, Cleveland, OH) bei 65°C für jeweils 1 Stunde gewaschen.
Radiochemische Bestimmung der Sondendichte
Um die Menge an kovalent an eine Oberfläche gebundene DNA oder die Menge einer kovalent hybridisierten Sequenz zu bestimmen, wurden radiomarkierte Sonden verwendet. In Fällen, in denen ein 5'-Disulfid enthaltendes Oligodeoxynukleotid immobilisiert werden sollte, wurde das 3'-Ende unter Verwendung eines terminalen Transferaseenzyms und eines radiomarkierten Dideoxynukleosid-Triphosphats radiomarkiert; in einer Standardreaktion wurden 15 pmol (0,6 μM) des 5'-Disulfid enthaltenden Oligodeoxynukleotids mit 50 μCi (16,5 pmol, 0,66 μM) eines (α-³²P) Dideoxyadenosin-5'-triphosphats (ddATP) (Amersham, Arlington Height, IL) in Gegenwart von 0,2 mM 2-Mercaptoethanol inkubiert. Nach der Zugabe von 40 Einheiten des terminalen Deoxynukleotidyltransferaseenzyms (USB, Cleveland, OH), ließ man die Reaktion für 1 Stunde bei 37°C ablaufen. Nach dieser Zeit wurde die Reaktion durch Eintauchen in ein Gefäß in einem 75°C Wasserbad für 10 Minuten gestoppt, und das Produkt wurde unter Verwendung einer Chromaspin-10-Säule (Clontech, Palo Alto, CA) isoliert. In ähnlicher Weise wurde ein 5'-Disulfid-enthaltendes Oligodeoxynukleotid mit ³⁵S radiomarkiert.
In Fällen, in denen ein 3'-Disulfid-enthaltendes Oligodeoxynukleotid immobilisiert werden sollte, wurde der 5'-Terminus unter Verwendung einer T4 Polynukleotidkinase und einem radiomarkierten Nukleosid-Triphosphat radiomarkiert. Beispielsweise wurden 15 pmol (0,6 μM) eines 3'-Disulfid-enthaltenden Oligodeoxynukleotids mit 50 μCi (16,5 pmol, 0,66 μM) eines (γ³²P) Adenosin-5'-triphosphat (ATP) (Amersham, Arlington Height, IL) in Gegenwart von 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol inkubiert. Im Anschluß an die Zugabe von 40 Einheiten T4 Polynukleotidkinase ließ man die Reaktion für 1 Stunde bei 37°C weiterlaufen. Die Reaktion wurde durch Eintauchen des Gefäßes in ein 75°C Wasserbad für 10 Minuten gestoppt. Das Produkt wurde anschließend isoliert unter Verwendung einer Chromaspin-10 Säule (Clontech, Palo Alto, CA).
Um die Dichte der kovalent immobilisierten Sonde zu bestimmen, wurde das gewählte Disulfid-enthaltende Oligodeoxynukleotid zu einer Spur derselben Spezies hinzugefügt, die wie oben beschrieben radiomarkiert wurde. Das Disulfid wurde gespalten, die Sonde wurde auf Jodacetamido-funktionalisierten Wafern immobilisiert, die Wafer wurden gewaschen und dann einem Phosphorimagermonitorverfahren ausgesetzt (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Für jedes unterschiedliche verwendete Oligodeoxynukleotid wurden auf Polystyrol Referenzspots hergestellt, in denen die molare Menge des Oligodeoxynukleotids bekannt war. Diese Referenzspots wurden ebenfalls dem Phosphorimagermonitorverfahren ausgesetzt. Nach dem Scannen des Schirms wurde die Menge (in Mol) an Oligodeoxynukleotid, das an den jeweiligen Chip gebunden war, durch Vergleichen der Zählungen mit den spezifischen Aktivitäten der Referenzen bestimmt.
Hybridisierung und Effizienz
Zu einem Wafer, der mit einer immobilisierten Sonde funktionalisiert worden war, wurde eine Lösung einer komplementären Sequenz (10 μM) in 1 M NaCl und TE-Puffer hinzugefügt. Der Wafer und die Lösung wurden auf 75°C erwärmt und auf Raumtemperatur über 3 Stunden abgekühlt. Nach dieser Zeit wurde die Lösung entfernt, und der Wafer wurde zweimal mit TE-Puffer gewaschen.
Um die Menge an hybridisiertem Oligonukleotid zu bestimmen wurde die Immobilisierung der Sonde zunächst wie oben beschrieben durchgeführt, außer daß die Sonde mit ³⁵S markiert wurde und nicht mit ³²P. Die Dichte der immobilisierten Sonde wurde mit dem Phosphorimager bestimmt. Anschließend wurde derselbe Wafer in TE-Puffer, 1 M NaCl, und sein komplementärer Strang (10 μM), der mit ³²P markiert worden war, inkubiert. Die Hybridisierung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Nach dem Waschschritt, um nicht-spezifische Bindung zu entfernen, wurden der Wafer und die Referenz einem Phosphorimagerschirm mit einem Stück Kupferfolie zwischen dem Schirm und dem Wafer ausgesetzt. Die Kupferfolie dient dazu, das Signal von ³⁵S zu blockieren, während es dem ³²P-Signal erlaubt, hindurchzugehen. Die molare Menge an hybridisiertem Oligonukleotid wird anschließend bestimmt, wobei der Prozentsatz an kovalent immobilisierter Sonde, die für die Hybridisierung zur Verfügung steht, sichtbar gemacht wird.
MALDI-TOF-massenspektrometrische Analyse
Wie oben beschrieben, wurden Wafer synthetisiert, welche nicht-radiomarkierte immobilisierte Oligonukleotide enthielten (Name: TCUC; Sequenz: GAATTCGAGCTCGGTACCCGG; Molekulargewicht 6455 Da; SEQ ID NO. 1) sowie eine Komplementärsequenz (Name: MJM6; Sequenz: CCGGGTACCGAGCTCGAATTC; Molekulargewicht: 6415 Da, SEQ ID NO. 2) wurde hybridisiert. Die Wafer wurden in 50 mM Ammoniumcitratpuffer für einen Kationenaustausch gewaschen, um Natrium und Kaliumionen auf dem DNA-Rückgrat zu entfernen (Pieles, U. Et al., (1993) Nucl. Acids. Res. 21: 3191–3196). Eine Matrixlösung aus 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA, 0,7 M in 50% Acetonitril, 10% Ammoniumcitrat; Wu, K. J. et al. (1993) Rapid Commun. Mass. Spectrom. 7: 142–146) wurde auf den Wafer gespottet und bei Raumtemperatur getrocknet. Die Wafer wurden direkt an die Probensonde eines Finnigan MAT (Bremen, Deutschland) Vision 2000 Reflektron-TOF-Massenspektrometer unter Verwendung von Leitungsfolie angebracht. Der Reflektron besitzt eine 5 keV-Ionenquelle und 20 keV-Nachbeschleunigung; ein Stickstofflaser wurde verwendet, und alle Spektren wurden im positiven Ionenmodus erstellt.
Oberflächenchemie
Unter Verwendung von Standardsiliciumdioxidmodifikationschemie wurde ein Siliciumwafer mit 3-Aminopropyltriethoxysilan reagiert, um eine gleichmäßige Schicht primärer Aminogruppen auf der Oberfläche zu bilden. Wie in 7 dargestellt, wurde die Oberfläche anschließend einem heterobifunktionellen Quervernetzer ausgesetzt, was zu Jodacetamidogruppen auf der Oberfläche führte. Es war möglich, die optimale Reaktionszeit dieser Reaktion in Lösung unter Verwendung von TLC zu bestimmen. Der SIAB-Quervernetzer wurde unter langwelligem ultraviolettem Licht (302 nm) visualisiert, um einen Spot mit einem R_f-Wert von 0,58 zu zeigen. 3-Aminopropyltriethoxysilan war unter ultraviolettem Licht nicht aktiv. Daher wurde Ninhydrin verwendet, um einen lila-farbenen Spot sichtbar zu machen, was die Gegenwart eines primären Amins auf der Grundlinie anzeigte. Eine Reaktion im Mikrobereich wurde durchgeführt unter Verwendung eines geringfügigen molaren Überschusses von STAB im Vergleich mit 3-Aminopropyltriethoxysilan. Eine TLC-Analyse nach etwa einer Minute zeigte einen neuen Spot, der unter langwelligem ultraviolettem Licht sichtbar war, mit einem R_f-Wert von 0,28. Es gab keine Hinweise auf einen lila-farbenen Spot nach dem Besprühen mit Ninhydrin. Somit war das gesamte 3-Aminopropyltriethoxysilan-Ausgangsmaterial in der Reaktion verbraucht worden. Das UV-Licht zeigte auch den Überschuß an SIAB, der nach der Reaktion verblieb. Aus diesen Ergebnissen wurde bestimmt, daß die Reaktion nach etwa einer Minute vollständig abgelaufen war. In allen Fällen wurden die Jodacetamido funktionalisierten Wafer unmittelbar verwendet, um die Hydrolyse der labilen Jodacetamidofunktionalität zu minimieren. Zusätzlich wurden alle weiteren Wafer-Manipulationen im Dunkeln durchgeführt, da die Jodacetamidofunktionalität lichtempfindlich ist.
Die Disulfid-Reduktion des modifizierten Oligonukleotids wurde überwacht, indem eine Verschiebung in der Retentionszeit auf Umkehrphasen-FPLC beobachtet wurde. Es wurde bestimmt, daß nach fünf Stunden in Gegenwart von DTT (100 mM) oder TCEP (10 mM) das Disulfid vollständig zu einem freien Thiol reduziert worden war. Wenn die DTT-Reaktion nicht für eine längere Zeit weiterlaufen konnte, bildete sich ein Oligonukleotiddimer, in dem Paare von freien Thiolen reagiert hatten. Solch eine Dimerisierung wurde auch beobachtet, wenn DTT nach dem Abschluß der Spaltungsreaktion entfernt wurde. Diese Dimerisierung wurde nicht beobachtet, wenn TCEP als Spaltungsreagenz verwendet wurde, da diese Reaktion bei pH 4,5 stattfindet. Somit waren die freien Thiole vollständig protoniert, was die Dimerisierung hemmt.
Unmittelbar nach der Disulfidspaltung wurde das modifizierte Oligonukleotid mit den Jodacetamido-funktionalisierten Wafern inkubiert. Um eine vollständige Thiol-Deprotonierung sicherzustellen, wurde die Kopplungsreaktion bei pH 8,0 durchgeführt. Die Sondenoberflächendichte, die mit der Chemie von Siliciumwafern erreicht wurde, wurde analysiert unter Verwendung von radiomarkierten Sonden und einem Phosphorimager. Die Sondenoberflächendichte wurde ebenfalls als Funktion der TCEP-Konzentration, die bei der Disulfidspaltungsreaktion verwendet wurde, überwacht (8). Unter Verwendung von 10 mM TCEP, um das Disulfid zu spalten, und der weiteren oben beschriebenen Reaktionsbedingungen war es möglich, reproduzierbar eine Oberflächendichte von 250 fmol pro Quadrat-mm Oberfläche zu erhalten. Identische Experimente wie oben beschrieben wurden durchgeführt, außer daß die Oligonukleotidsonde keine Thiolmodifizierung aufwies. Die Oberflächendichten von weniger als 5 fmol pro Quadrat-mm Oberfläche bewiesen, daß nicht-spezifische Bindung minimal war und daß die Sondenkopplung sehr wahrscheinlich wie in 7 vorgeschlagen auftrat.
Hybridisierung
Nach der Bindung von ³⁵S-markierten Sonden an die Oberfläche von Wafern unter Bestimmung der Konjugierungsdichte wie oben beschrieben, wurde eine Hybridisierung von ³²P-markierten Oligonukleotiden durchgeführt. Die Hybridisierungseffizienz und Dichte wurden bestimmt unter Verwendung des Phosphorimagers und Kupferfolie. Es wurde experimentell bestimmt, daß die Kupferfolie 98,4% eines ³⁵S-Signals blockiert, während ein ³²P-Signal vollkommen nachgewiesen werden kann. Die Komplementärsequenz hybridisierte reproduzierbar, um 105 fmol pro Quadrat-mm Oberfläche zu ergeben. Dies entspricht etwa 40% der konjugierten Sonden, die für die Hybridisierung zur Verfügung standen. In ähnlicher Weise wurde eine nicht-komplementäre Sequenz in diesem Schema verwendet, was weniger als 5 fmol pro Quadrat-mm Oberfläche an nicht-spezifischer Bindung ergab.
Es wird spekuliert, daß die sterische Interferenz zwischen den eng gepackten Oligonukleotiden auf der flachen Oberfläche die Hybridisierungseffizienzen von höher als 40% inhibiert. Vor diesem Hintergrund wurde ein Spacermolekül zwischen den Terminus der hybridisierenden Region des Oligonukleotids und dem Träger eingefügt. Die ausgewählten Spacer waren eine Serie von poly dT-Sequenzen im Längenbereich von 3 bis 25. Nach der Untersuchung dieser Proben mit Radiomarkierungen und dem Phosphorimager wurde bestimmt, daß 40% immer noch die maximale Hybridisierung darstellte, die erreicht werden konnte.
MALDI-TOF-MS-Analyse
Wafer wurden mit Sonden funktionalisiert, komplementäre Sequenzen wurden hybridisiert, und die Proben wurden unter Standard-MALDI-Bedingungen wie oben beschrieben analysiert. Die Analyse zeigte, daß nur der angeheftete Strang (MJM6) im Massenspektrum mit einem experimentellen Masse-zu-Ladung-Verhältnis von 6415,4 beobachtet wurde. Das theoretische Masse-zu-Ladungs-Verhältnis beträgt 6415 (9). Da kein Signal bei einem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 6455 erhalten wurde, wurde bestimmt, daß der Wafer-konjugierte Strang (TCUC) nicht desorbiert wurde, und daß somit die Jodacetamidobindung stabil genug war, um dem Laser zu widerstehen und intakt zu bleiben. Es gab ein zusätzliches Signal bei einem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 6262,0. Dieses Signal resultiert aus einer Depurinierung von Guanosinen, da es bekannt ist, daß DNA zum Verlust von Purinbasen während des MALDI-Prozesses neigt (Nordhoff, E., et al., (1992), Rapid Commun. Mass Spectrom. 6: 771–776). Die Probenkristalle auf dem Wafer waren nicht homogen verteilt, und es war somit notwendig, nach einem guten Spot zu suchen. Aufgrund dieser Nicht-Homogenität variierte die Massenauflösung, aber es befand sich im Allgemeinen im Bereich von 200 bis 300 im Massenspektrum für das desorbierte Oligonukleotid. In einem Satz Experimente wurden nicht-komplementäre Sequenzen mit dem Wafer hybridisiert. Im Anschluß an eine wie oben beschriebene Waschung zeigte eine Analyse durch MALDI-TOF-MS, daß minimales nicht-spezifisches Anheften stattgefunden hatte, da kein Signal detektiert wurde.
BEISPIEL 2
Herstellung von DNA-Arrays unter Verwendung von seriellen und parallelen Ausgabewerkzeugen
Roboter-betriebene serielle und parallele pL-nL Ausgabewerkzeuge wurden verwendet, um DNA-Arrays mit 10–10³ Elementen auf < 1'' zum Quadrat Chips mit flachen oder geometrisch veränderten (z. B. mit Vertiefungen) Oberflächen für Matrix unterstützte Laser-Desorptions-Ionisierungs-Massenspektrometrische Analyse herzustellen. Im ersteren gibt eine „piezoelektrische Pipette" (70 μm id Kapillare) einzelne oder mehrere etwa 0,2 nL Tröpfchen auf die Matrix, anschließend in den Analyten, auf den Chip; Spektren von so geringen Mengen wie 0,2 fmol einer 36-mer DNA wurden unter Verwendung dieses Verfahrens erhalten. Trotz der schnellen Verdunstung (< 5 sec) wurden Mikrokristalle einer 3-Hydroxypicolinsäurematrix, die den Analyten enthielt, routinemäßig hergestellt, was zu einer größeren Reproduzierbarkeit führte als normalerweise mit Präparationen mit größeren Volumina erhalten wird. Alle 100 fünf fmol-Spots eines 23-mers in 800 μm Vertiefungen ergaben leicht interpretierbare Massenspektren, wobei 99/100 Ausgangsionensignale ein Signal-Rausch-Verhältnis von > 5 hatten. In einem zweiten Ansatz wurden Sonden aus einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen in Chipvertiefungen ausgegeben, jeweils 16 gleichzeitig, oder auf flache Oberflächen unter Verwendung eines Arrays von federbelasteten Nadeln, die etwa 20 nL auf den Chip durch Oberflächenkontakt übertragen. MS-Analysen von Arrayelementen, die mit der parallelen Methode aufgebracht worden waren, sind bezüglich der Empfindlichkeit und Auflösung vergleichbar mit denen, die mit der seriellen Methode hergestellt wurden.
Beschreibung des piezoelektrischen seriellen Dispensers
Das experimentelle System entwickelte sich aus einem von Microdrop GmbH, Norderstedt, Deutschland, erhaltenem System und kann einen Treiber für piezoelektrische Elemente enthalten, der ein gepulstes Signal an ein piezoelektrisches Element sendet, das an eine Glaskapillare gebunden ist und diese umgibt, welche die auszugebende Lösung beinhaltet; einen Druckwandler, um (durch negativen Druck) die Kapillare zu beladen oder (durch positiven Druck) die Kapillare zu entleeren; einen Roboter-xyz-Aufbau und Robotertreiber, um die Kapillare zum Laden, Entladen, Ausgeben und Säubern zu manövrieren, ein Stroboskop und einen Treiber, die mit der Frequenz des Piezoelements gepulst werden, um eine Ansicht der Eigenschaften der „schwebenden" Tröpfchen zu ermöglichen; separate Aufbauten für die Ursprungsplatten und Targetplatten oder Proben-Targets (d. h. Si-Chip); eine Kamera, die am Roboterarm befestigt ist, um das Laden auf die Targetplatte mitzuverfolgen; und eine Datenstation, welche die Druckeinheit, den xyz-Roboter und den piezoelektrischen Treiber steuert.
Beschreibung des parallelen Dispensers
Das Roboter-Nadelwerkzeug umfaßt 16 Sonden, die in einem Sondenblock untergebracht und auf einem X Y, Z-Roboter-Aufbau befestigt sind. Der Roboter-Aufbau war ein Gerüstsystem, welches das Anordnen von Probenwannen unterhalb der Arme des Roboters ermöglicht. Die Gerüsteinheit selbst besteht aus X- und Y-Armen, die sich 250 bzw. 400 mm bewegen, und von bürstenlosen linearen Servomotoren mit positionellem Feedback geführt werden, welches durch lineare optische Codeumsetzer gewährleistet wird. Eine Gewindespindel betriebene Z-Achse (50 mm vertikale Bewegung) wird an der xy-Achsengleitfläche der Gerüsteinheit befestigt und wird durch einen Inline kreisenden Servomotor mit positionellem Feedback gesteuert, und zwar mittels eines Motor-befestigten kreisenden optischen Codeumsetzers. Die Arbeitsfläche des Systems ist mit einer ausziehbaren Werkzeugplatte ausgestattet, die fünf Mikrotiterplatten (meistens 2 Platten mit Waschlösung und 3 Platten mit Proben für ein Maximum von 1152 verschiedenen Oligonukleotidlösungen) und bis zu zehn 20 × 20 mm Wafern aufnimmt. Die Wafer werden genau gegen zwei Begrenzungsstifte in der Platte positioniert und durch Vakuum festgehalten. Das gesamte System ist aus Sicherheitsgründen in einem Plexiglasgehäuse eingeschlossen und zur Wärmedämmung und Vibrationsdämmung auf einem Stahlträgerrahmen befestigt. Die Bewegungssteuerung wird durch die Anwendung eines kommerziell erhältlichen Bewegungsreglers durchgeführt, der ein 3- Achsenservoregler war und in einem Computer integriert war. Der Programmierungscode für die speziellen Anwendungen wird je nach Erfordernis geschrieben.
Die Proben wurden mit einem seriellen System auf mehrere Oberflächen ausgegeben, die als Targets in der MALDI-TOF-Analyse dienten einschließlich (1) ein flaches Proben-Target aus rostfreiem Edelstahl wie zur Routineverwendung in einem Thermo Bioanalysis Vision 2000 bereitgestellt; (2) dasselbe Target aus rostfreiem Edelstahl mit dem gleichen Design mit mikromaschinell erzeugten Nanovertiefungen; (3) flache Silicium-(Si)-Wafer; (4) polierte flache Si-Wafer; (5) Si-Wafer mit rauhen Vertiefungen (3–6 pLm Eigenschaften); (6)(a) 12 × 12 (oder (b) 18 × 18) mm Si-Chips mit (a) 10 × 10 (oder (b) 16 × 16) Arrays aus chemisch geätzten Vertiefungen, jeweils 800 × 800 μm auf einer Seite mit Tiefen im Bereich von 99 bis 400 (oder (b) 120) Mikrometer, Abstand (a) 1,0 (oder (b) 1,125) mm; (7) 15 × 15 mm Si-Chips mit 28 × 28 Arrays aus chemisch geätzten Vertiefungen, jeweils 450 × 450 Mikrometer auf einer Seite mit Tiefen im Bereich von 48 bis 300 Mikrometer, Abstand 0,5 mm; (8) flaches Polycarbonat oder andere Kunststoffe; (9) Gold oder andere Metalle; (10) Membranen; (11) Kunststoffoberflächen, die mit Gold oder anderen leitenden Materialien bestäubt sind. Das ausgegebene Volumen wird von 10^–10 bis 10^–6 L gesteuert durch das Regeln der Anzahl von ausgegebenen Tröpfchen.
Probenherstellung und -ausgabe
1. Seriell
Oligonukleotide (0,1–50 ng/Mikroliter) verschiedener Sequenz oder Konzentrationen wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen geladen; die erste Vertiefung war für Matrixlösung reserviert. Ein gekörnter Chip (Target 6a in MALDI Targetbereich) wurde auf dem Aufbau plaziert und manuell ausgerichtet. In die Robotersteuersoftware (auf Windows-Basis) wurden die Koordinaten der ersten Vertiefung eingegeben, sowie die Arraygröße (d. h. die Anzahl von Spots in x und y) und der Abstand zwischen den Elementen, sowie die Anzahl der 0,2 nL Tropfen pro Arrayelement. Die Kapillare war mit etwa 10 μL Spül-H₂O gefüllt, wurde automatisch in den Bereich einer Stroboskoplicht beleuchteten Kamera bewegt, um die Nadelintaktheit und Sauberkeit zu überprüfen, während sie sich im kontinuierlichen Pulsmodus befand, und geleert. Die Kapillare wurde anschließend mit Matrixlösung gefüllt, wiederum mit dem Stroboskop überprüft und anschließend verwendet, um einen Array auf flache oder gekörnte Oberflächen zu spotten. Für Reproduzierbarkeitsstudien in verschiedenen MS-Modi wurde typischerweise ein 10 × 10 Array von 0,2–20 nL Tröpfchen ausgegeben. Die Kapillare wurde durch Anlegen eines positiven Drucks geleert, gegebenenfalls mit H₂O gespült und auf die Ursprungsoligoplatte geführt, wo etwa 5 μL 0,05–2,0 μM synthetische Oligos aufgezogen wurden. Die Kapillare wurde dann in Serien über jeden der Matrixspots gerastert, zu denen jeweils 0,2–20 nL wäßrige Lösung hinzugefügt wurden.
2. Parallel
Parallele Programme wurden geschrieben, um die Herstellung des Arrays durch Offset-Drucken zu kontrollieren; beispielsweise um einen Array aus 64 Elementen auf 10 Wafern herzustellen wurde das Werkzeug in 16 Vertiefungen einer DNA-Ursprungsplatte mit 384 Vertiefungen eingetaucht, auf das Target bewegt (z. B. Si, Kunststoff, Metall) und die Probe durch Oberflächenkontakt aufgespottet. Das Werkzeug wurde dann in die gleichen 16 Vertiefungen eingetaucht und auf ein zweites Target gespottet. Dieser Zyklus wurde auf allen 10 Wafern wiederholt. Anschließend wurde das Werkzeug in eine Waschlösung eingetaucht, dann in 16 verschiedene Vertiefungen auf der Ursprungsplatte eingetaucht und auf das Target aufgespottet mit 2,25 mm Abstand vom ursprünglichen Satz von 16 Spots; dies wurde wieder auf allen 10 Wafern wiederholt; der gesamte Zyklus wurde wiederholt, um einen 2 × 2 Array von jeder Nadel herzustellen, um einen 8 × 8 Array von Spots zu erzeugen (2 × 2 Elemente/Nadel × 16 Nadeln = insgesamt 64 gespottete Elemente).
Um Arrays für die MS-Analyse herzustellen, wurden Oligonukleotide mit verschiedenen Sequenzen oder Konzentrationen in die Vertiefungen von bis zu drei verschiedenen Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen geladen, ein Satz von 16 Vertiefungen war für Matrixlösung reserviert. Die Vertiefungen von zwei Platten wurden mit Waschlösung gefüllt. Die fünf Mikrotiterplatten wurden auf die ausziehbare Werkzeugplatte geladen. Zehn Wafer wurden auf der Werkzeugplatte angrenzend an die Begrenzungsstifte plaziert, und das Vakuum angelegt. In Fällen, in denen Matrix und Oligonukleotid nicht vorgemischt wurden, wurde das Nadelwerkzeug verwendet, um zunächst Matrixlösung auf alle gewünschten Arrayelemente auf den zehn Wafern zu spotten. Für dieses Beispiel wurde ein 16 × 16 Array hergestellt, somit muß das Werkzeug auf jeden der zehn Wafer 16-mal spotten, mit einem Abstand von 1,125 mm. Anschließend wurde die Oligonukleotidlösung im selben Muster aufgespottet, um die Matrix wieder aufzulösen. In ähnlicher Weise könnte ein Array hergestellt werden, indem zunächst die Oligonukleotidlösung auf dem Wafer plaziert wird, gefolgt von der Matrixlösung, oder dadurch, daß die Matrix- und Oligonukleotidlösungen vorher gemischt werden.
Massenspektrometrie
Im Anschluß an beide Ausgabeverfahren wurden die geladenen Chips auf einer MALDI-TOF-Ursprungsplatte mit einem Satz mit abgeschrägten Schrauben befestigter Polycarbonat-Träger gehalten. Die Platte wurde an das Ende einer Sonde bewegt, um dort auf einen 1 μm Auflösung, 1" Bewegungs-xy-Aufbau (Newport) in die Ursprungsregion eines Time-of-Flight-Massenspektrometers gehalten zu werden. Das Instrument wurde im Allgemeinen mit 18–26 kV-Extraktion betrieben, konnte im linearen oder gekrümmten Feldreflektronmodus, sowie im kontinuierlichen oder verzögerten Extraktionsmodus betrieben werden.
Serielles Ausgeben mit der piezoelektrischen Pipette
Während die Abgabe einer gesättigten 3HPA-Lösung zur Verstopfung der Nadel führen kann, wenn das Lösungsmittel in der Grenzfläche der Kapillare zur Luft verdunstet, verdünnt das Vormischen von DNA und Matrix die Matrix ausreichend, sodaß sie in Lösung bleibt, während stabile Sprays erhalten werden konnten, die beibehalten werden konnten bis die Kapillare leer war; mit 1 : 1 verdünnter (in H₂O) Matrixlösung, war kontinuierliches Sprühen für > > 10 Minuten möglich. Das Abstellen des Piezoelements, sodaß die Kapillare für > 5 Minuten inaktiv wurde, und das Reaktivieren des Piezoelements führte ebenfalls nicht zu einer verstopften Kapillare.
Anfängliche Experimente unter Verwendung von Proben-Targets aus rostfreiem Edelstahl, wie bereitgestellt durch Finnigan Vision 2000 MALDI-TOF-System, das im Reflektormodus betrieben wurde, wendeten eine vorgemischte Lösung der Matrix und DNA vor der Ausgabe auf ein Proben-Target an. In einer einzigen Mikrotitervertiefung wurden 50 μL gesättigte Matrixlösung, 25 μL einer 51 μL Lösung des 12-mers (ATCG)3 (SEQ ID NO. 3) und 25 μL einer 51 μL Lösung des 28-mers (ATCG)7 (SEQ ID NO. 4) gemischt. Ein Satz 10 × 10 Arrays von 0,6 μL Tröpfchen wurde direkt auf eine Finnigan Vision 2000 Proben-Target-Scheibe ausgegeben; ein MALDI-TOF-Massenspektrum wurde aus einem einzigen Arrayelement, das 750 Attomol jedes der beiden Oligonukleotide enthielt, erhalten. Interpretierbare Massenspektren wurden erhalten für DNA-Moleküle bis zu einer Größe von einem 53-mer (350 amol geladen, nicht dargestellt) unter Verwendung dieses Verfahrens.
Massenspektren wurden ebenfalls von DNA-Molekülen erhalten, die in die Vertiefungen eines Siliciumchips mikroausgegeben wurden. 10 zeigt einen 12 × 12 mm Siliciumchip mit 100 chemisch geätzten Vertiefungen; die Maskenausmaße und Ätzzeit wurden so gewählt, daß Vertiefungen mit einer Pyramidenstumpfgeometrie (d. h. umgekehrte abgeflachte Pyramidengeometrie) mit 800 × 800 μm (obere Oberfläche) und 100 μm Tiefe erhalten wurden. Optional können die Vertiefungen aufgerauht oder gekörnt sein. Wie oben beschrieben wurde die Chipkante gegen eine erhöhte Oberfläche auf dem Aufbau ausgerichtet, um die x- und y-Koordinatensysteme hinsichtlich der Kapillare zu definieren. (Alternativen umfassen eine optische Ausrichtung, künstliche Intelligenzmustererkennungsroutinen und Paßstift-basierende manuelle Ausrichtung). In jede Vertiefung wurden 20 Tröpfchen (etwa 5 nL) einer 3-HPA-Matrixlösung ohne Analyt ausgegeben; für die verwendete 50%-ige CH₃CN-Lösung betrugen die Verdunstungszeiten für jedes Tröpfchen in etwa 5 bis 10 Sekunden. Nach der Verdunstung des Lösungsmittels erschienen die mikroausgegeben Matrixtröpfchen bei Betrachtung unter einem 120X Stereomikroskop im Allgemeinen als eine amorphe und „milchige" flache Scheibe; solches Aussehen ist im Einklang mit dem von Tröpfchen, von denen das Spektrum gemäß 3b erhalten wurde. Nach dem Entleeren der Spitze, Spülen und Wiederauffüllen mit einer 1,4 μM wäßrigen Lösung einer 23-mer DNA (M_r(berechnet) = 6967 Da) wurde die Kapillare über jeden der 100 Spots der Matrix bewegt, wo 5 nL der wäßrigen DNA-Lösung direkt auf die Matrixtröpfchen ausgegeben wurden. Unter Verwendung der Sichtbarmachung über eine CCD-Kamera erschien es, daß die wäßrige Analytenlösung mit der Matrix gemischt war und diese wieder auflöste (die vollständige Verdunstung braucht etwa 10 Sekunden bei Umgebungstemperatur und Umgebungsfeuchtigkeit). Die amorphen Matrixoberflächen wurden in echte mikrokristalline Oberflächen umgewandelt, wobei die kristallinen Eigenschaften im Bereich von < 1 μm waren.
Im Einklang mit der durch das Verfahren des Wiederauflösens der Matrix verbesserten Kristallisierung erschien das Erhalten von Massenspektren besser reproduzierbar als mit Lösungen, in denen die Matrix- plus Analytlösung vorgemischt wurden; jeder der 100 fünf-fmol-Spots des 23-mers ergab interpretierte Massenspektren (11) mit 99/100 Ursprungsionensignalen mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von > 5; eine solche Reproduzierbarkeit wurde auch erhalten mit den flachen Silicium- und metallischen Oberflächen, die verwendet wurden (nicht gezeigt). Die Spektren aus 11 wurden auf einem linearen TOF-Instrument, das bei 26 kV betrieben wurde, erhalten. Nach der internen Kalibrierung des oberen linken Spektrums (Vertiefung „k1") unter Verwendung von einzeln und doppelt geladenen molekularen Ionen und Anwendung dieser Kalibrierung auf alle anderen 99 Spektren als externe Kalibrierung (12) wurde eine Standardabweichung von < 9 Da vom mittleren Molekulargewicht erhalten, entsprechend einer relativen Standardabweichung von etwa 0,1%.
Parallele Ausgabe mit dem Roboter-Nadelwerkzeug
Arrays wurden mit Hilfe von Offset-Drucken, wie oben beschrieben erhalten. Die Geschwindigkeit der X- und Y-Aufbau betrugen 35 Zoll/Sekunde und die Geschwindigkeit des Z-Aufbaus beträgt 5,5 Zoll/Sekunde. Es ist möglich, die X- und Y-Aufbau bei einer maximalen Geschwindigkeit zu bewegen, um die Zykluszeiten zu verringern, jedoch ist die Geschwindigkeit des Z-Aufbaus vor dem Oberflächenkontakt mit dem Wafer zu verringern, um dessen Beschädigung zu vermeiden. Bei solchen Achsengeschwindigkeiten beträgt die ungefähre Zykluszeit zum Spotten von 16 Elementen (ein Abdruck des Werkzeugs auf dieselben Lösungen) auf alle zehn Wafer 20 Sekunden, sodaß die Herstellung eines Arrays mit 256 Elementen etwa 5,3 Minuten dauern würde. Wenn verschiedene Oligonukleotidlösungen auf den Array aufgebracht werden, muß ein zusätzlicher Waschschritt durchgeführt werden, um die Nadelspitze vor dem Eintauchen in eine andere Lösung zu säubern, somit würde die Zykluszeit um etwa 25 Sekunden oder 6,7 Minuten zur Herstellung von zehn Wafern erhöht werden.
Zur Probenausgabe durch das Werkzeug wurde unter Verwendung von radiomarkierten Lösungen und dem Phosphorimager wie oben beschrieben untersucht; es wurde bestimmt, daß jede Nadel etwa 1 nL Flüssigkeit abgibt. Die Reproduzierbarkeit von Spot-zu-Spot ist hoch. Ein Array von 256 Oligonukleotidelementen mit variierender Sequenz und Konzentration wurde unter Verwendung des Nadelwerkzeugs auf flachen Siliciumwafern hergestellt, und der Wafer wurde mit MALDI-TOF MS analysiert.
BEISPIEL 3
Verwendung von hochdichter Nukleinsäureimmobilisierung zum Erzeugen von Nukleinsäurearrays
Unter Verwendung der hochdichten Anheftungsmethode, die in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde ein Array von DNA-Oligomeren, der für die MALDI-TOF-Massenspektrometrienanalyse geeignet war, auf einem Siliciumwafer hergestellt, der eine Vielzahl von Plätzen aufwies, z. B. Vertiefungen oder Bereiche auf seiner Oberfläche aufwies. Um den Array herzustellen wurde ein freie Thiole enthaltender Oligonukleotid-Primer nur an den ausgewählten Plätzen des Wafers immobilisiert (z. B. siehe 13). Jeder Platz auf dem Array enthielt einen von drei verschiedenen Oligomeren. Um zu zeigen, daß die verschiedenen immobilisierten Oligomere separat nachgewiesen und unterschieden werden konnten, wurden drei unterschiedliche Oligonukleotide mit verschiedenen Längen, die komplementär waren zu einem der drei Oligomere, auf dem Array auf dem Wafer hybridisiert und mit Hilfe von MALDI-TOF-Massenspektrometrieanalyse analysiert.
Oligodeoxynukleotide
Drei Sätze komplementärer Oligodeoxynukleotidpaare wurden synthetisiert, in denen ein Partner der komplementären Oligonukleotidpartner eine 3'- oder 5'-Disulfidbindung enthält (erhalten von Operon Technologies oder Oligos, Etc.). Beispielsweise enthält Oligomer 1 (d(CTGATGCGTCGGATCATCTTTTTT-SS); SEQ ID NO: 5), ein 3'-Disulfidbindung, während Oligomer 2 (d(SS-CCTCTTGGGAACTGTGTAGTATT); eine 5'-Disulfidderivat von SEQ ID NO: 6) und Oligomer 3 (d(SS-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG); ein 5'-Disulfidderivat von SEQ ID NO: 1) jeweils eine 5'-Disulfidbindung enthalten.
Die zu den Oligomeren 1–3 komplementären Oligonukleotide wurden so gestaltet, daß sie verschiedene Längen aufweisen und während der MALDI-TOF-MS-Analyse leicht voneinander zu unterscheiden sind. Beispielsweise wurde ein 23-mer Oligonukleotid (SEQ ID NO: 7) komplementär zu einem Teil von Oligomer 1 hergestellt, es wurde ein 12-mer Oligonukleotid (SEQ ID NO: 8) komplementär zu einem Teil von Oligomer 2 hergestellt, und es wurden 21-mer (SEQ ID NO: 2, Sequenz bezeichnet als „MJM6" in Beispiel 1) komplementär zu einem Teil von Oligomer 3 hergestellt. Zusätzlich wurde ein viertes 29-mer Oligonukleotid (SEQ ID NO: 9) synthetisiert, welches keine Komplementarität zu den drei Oligomeren aufweist. Dieses vierte Oligonukleotid wurde als negative Kontrolle verwendet.
Siliciumoberflächenchemie und DNA-Immobilisierung
(a) 4 × 4 (16-Plätze) Arrayelement
Ein 2 × 2 cm² Siliciumwafer mit 256 einzelnen Abdrücken oder Vertiefungen in Form eines Arrays mit 16 × 16 Vertiefungen wurde von einem gewerblichen Hersteller erhalten (Accelerator Technology Corp., College Station, Texas). Die Vertiefungen waren 800 × 800 μm², 120 μm tief, mit einem Abstand von 1,125. Der Siliciumwafer wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan reagiert, um eine gleichmäßige Schicht primärer Amine auf der Oberfläche zu erzeugen, und anschließend mit einem heterobifunktionellen Quervernetzer STAB behandelt, was zu Jodacetamidofunktionalitäten auf der Oberfläche führte (z. B. siehe 7).
Um die Oligomere zum Ankoppeln an die verschiedenen Plätze auf dem Siliciumarray herzustellen, wurde die Disulfidbindung jedes Oligomers unter Verwendung von 10 mM TCEP wie in Beispiel 1 dargestellt, vollkommen reduziert, und die DNA bei einer endgültigen Konzentration von 10 μM in einer Lösung von 100 mM Phosphatpuffer, pH 8,0 resuspendiert. Unmittelbar nach der Reduktion der Disulfidbindung wurde die freie Thiolgruppe des Oligomers mit der Jodacetamidofunktionalität an 16 Plätze auf dem Wafer gekoppelt unter Verwendung der Sondenkopplungsbedingungen wie im Wesentlichen in 7 beschrieben. Um die separate Kopplung an 16 verschiedene Plätze auf dem Wafer zu erreichen, wurde nicht die gesamte Oberfläche des Wafers mit einer Oligonukleotidlösung benetzt, sondern es wurde parallel an jeden der 16 Plätze (d. h. Abdrücke) der 256 Vertiefungen auf dem Wafer ein Aliquot von etwa 30 nL eines vorbestimmten modifizierten Oligomers zugefügt, um einen 4 × 4 Array immobilisierter DNA unter Verwendung des hierin beschriebenen Nadelwerkzeugs zu erzeugen (siehe z. B. detaillierte Beschreibung und Beispiel 4, die hierin bereitgestellt werden).
Wie in 13 dargestellt, wurde somit einer der modifizierten Oligomere 1 bis 3 kovalent an jede der 16 separaten Vertiefungen der 256 Vertiefungen auf dem Siliciumwafer immobilisiert, wodurch ein 4 × 4 Array mit immobilisierter DNA erzeugt wurde. Beispielsweise wurde Oligomer 1 an einer Vertiefungsposition in der oberen linken Ecke des 4 × 4 Arrays konjugiert, und Oligomer 2 wurde an dem benachbarten Platz konjugiert, usw. Eine Darstellung des vollständigen Arrays ist in 13 dargestellt.
Bei der Durchführung der Hybridisierungsreaktion wurden die drei komplementären Oligonukleotide und das negative Kontroll-Oligonukleotid bei einer endgültigen Konzentration von 10 μM für jedes Oligonukleotid in 1 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) versehen mit 1 M NaCl gemischt, und die Lösung wurde für 10 Minuten auf 65°C erhitzt. Unmittelbar im Anschluß wurde die gesamte Oberfläche des Siliciumwafers mit 800 μl der erwärmten Oligonukleotidlösung benetzt. Die komplementären Oligonukleotide wurden an die immobilisierten Oligomere durch Inkubieren des Siliciumarrays bei Umgebungstemperatur für 1 Stunde, gefolgt von Inkubation für mindestens 10 Minuten bei 4°C angeheftet. Alternativ hierzu kann die Oligonukleotidlösung zu dem Wafer hinzugegeben werden, welcher anschließend erwärmt und für die Hybridisierung abgekühlt wird. Eine Darstellung der an die spezifischen Oligomere, die kovalent an jedem Platz immobilisiert sind, angeheften komplementären Oligonukleotide ist in 14 dargestellt.
Der hybridisierte Array wurde anschließend mit einer Lösung von 50 mM Ammoniumcitratpuffer zum Kationenaustausch gewaschen, um Natrium und Kaliumionen auf dem DNA-Rückgrat zu entfernen (Pieles, U. et al., (1993) Nucl. Acids Res. 21: 3191–3196). Ein 6 nl Aliquot einer Matrixlösung aus 3-Hydroxypicolinsäure (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure-10% Ammoniumcitrat in 50% Acetonitril; siehe Wu et al., Rapid Commun. Mass. Spectrom. 7: 142–146 (1993)) wurde zu jedem Platz auf dem Array hinzugegeben unter Verwendung einer hierin beschriebenen piezoelektrischen Pipette.
Die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur getrocknet und anschließend wurde ein 6 nl Aliquot Wasser zu jedem Platz hingefügt unter Verwendung einer piezoelektrischen Pipette, um den getrockneten Matrix-DNA-Komplex zu resuspendieren, sodaß bei Trocknen bei Umgebungstemperatur der Matrix-DNA-Komplex eine gleichmäßige kristalline Oberfläche auf der Bodenoberfläche jedes Platzes bildet.
MALDI-TOF-MS-Analyse
Die MALDI-TOF-MS-Analyse wurde in Serie an jedem der 16 Plätze auf dem Hybridisierungsarray, der in 14 dargestellt ist, durchgeführt, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben. Das resultierende Massenspektrum der Oligonukleotide, die spezifisch mit jedem der 16 Plätze auf dem DNA-Hybridisierungsarray hybridisieren, ist in 15 dargestellt. Das Massenspektrum zeigte ein spezifisches Signal an jedem Platz, das für das beobachtete experimentelle Masse-zu-Ladungs-Verhältnis repräsentativ war, das den spezifischen komplementären Nukleotidsequenzen entsprach.
Beispielsweise zeigte das Massenspektrum für die Plätze, die Oligomer 1 konjugiert hatten, ein Hauptsignal mit einem beobachteten experimentellen Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 7072,4, das etwa dem des 23-mers entsprach; das theoretische Massezu-Ladungs-Verhältnis des 23-mers ist 7072,6 Da. Ähnlich führte die spezifische Hybridisierung des 12-mer Oligonukleotids an den Array ein beobachtetes experimentelles Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 3618,33 Da (theoretisch 3622,4 Da), was nur an den Plätzen nachgewiesen wurde, die mit Oligomer 2 konjugiert waren, während die spezifische Hybridisierung von MJM6 (beobachtetes experimentelles Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 6415,4) nur an jenen Plätzen auf dem Array nachgewiesen wurde, die mit Oligomer 3 konjugiert waren (theoretisch 6407,2 Da).
Keiner der Plätze auf dem Array zeigte ein Signal, das dem negativen Kontroll-29-mer Oligonukleotid entsprach (theoretisches Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 8974,8) was darauf hindeutete, daß die spezifischen Target-DNA-Moleküle mit dem kovalent an die spezifischen Plätze auf der Oberfläche des Siliciumarrays immobilisierten Oligomeren hybridisiert werden können, und daß eine Vielzahl von Hybridisierungsassays individuell unter Verwendung von MALDI-TOF-MS-Analyse überwacht werden können.
(b) 8 × (64-Plätze) Arrayelement
Ein 2 × 2 cm² Siliciumwafer mit 256 einzelnen Abdrücken oder Vertiefungen, die einen Array mit 16 × 16 Vertiefungen bildeten, wurde von einem gewerblichen Hersteller erhalten (Accelerator Technology Corp., College Station, Texas). Die Vertiefungen waren 800 × 800 μm², 120 μm tief mit einem Abstand von 1,125. Der Siliciumwafer wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan reagiert, um eine gleichmäßige Schicht primärer Amine auf der Oberfläche zu bilden, und anschließend mit einem heterobifunktionellen Quervernetzer SIAB behandelt, was zu Jodacetamidofunktionalitäten auf der Oberfläche führte (z. B. siehe 7).
Gemäß den oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung des 16-Plätze-DNA-Arrays wurden Oligomere 1 bis 3 auf 64 Plätze immobilisiert, um einen 8 × 8 Array auf dem Siliciumwafer mit 256 Vertiefungen zu bilden, mit komplementären Oligonukleotiden hybridisiert und durch MALDI-TOF-MS-Analyse analysiert. 16 zeigt das Massenspektrum des DNA-Arrays mit 64 Plätzen, das in Serie mit MALDI-TOF-Analyse analysiert wurde. Wie für den 16-Plätze-Array gezeigt, wurde die spezifische Hybridisierung für die komplementären Oligonukleotide für jedes der immobilisierten Thiol enthaltenden Oligomere in jedem der Plätze auf dem DNA-Array beobachtet.
BEISPIEL 4
RNA-Transkription eines einsträngigen mit Brüchen versehenen DNA-Templats
Dieses Beispiel bewertet die Wirkungen von Brüchen im codierenden Strang auf die Effizienz aus, mit der RNA-Transkripte erzeugt werden, und stellt auch die optimalen Bedingungen für die Herstellung von RNA-Transkripten für die Sequenzierung bereit.
1. Design von Templat- und Primer-Sequenzen
Alle Primer wurden auf einem gewerblich erhältlichen DNA-Synthesizer synthetisiert unter Verwendung von herkömmlicher Phosphoramiditchemie (Sinha et al., (1984) Nucleic Acid Res. 12: 4539). Die in vitro RNA-Transkription wurde auf einem synthetischen 55 Nukleotid-doppelsträngigen DNA-Templat durchgeführt. Das Templat wurde unter Verwendung von drei Primersequenzen zusammengesetzt, einem 55 Nukleotid nicht codierenden Strang (SEQ ID NO: 10) und zwei zusätzlichen Primern, die den codierenden Strang bilde (SEQ ID NO: 11 und 12). Wie in 17 dargestellt, wird die spezifische Position des Bruchs im codierenden Strang durch die Länge jedes der Primer für den codierenden Strang bestimmt. Die Verwendung dieses Konstrukts für die Transkription zeigte, daß ein Bruch an dieser Position die Transkription nicht wesentlich verlangsamt.
2. Primer-Hybidisierung und RNA-Transkription
Einsträngig mit Brüchen versehene Template wurden hergestellt durch die Hybridisierung von drei einzelsträngigen Oligonukleotiden bei einer Gesamt-DNA-Konzentration von 10 μM (2-facher Überschuß von Primer gegenüber Templat) in 10 mM MgCl₂ durch Erwärmen des Reaktionsgemisches auf 70°C für 10 Minuten und Abkühlen auf Raumtemperatur für mindestens 4 Stunden. Die Position des Bruchs wird bestimmt durch die entsprechenden Längen der beiden DNA-Oligonukleotide des codierenden Stranges (5'-3').
SP6 RNA-Polymerasetranskription
In vitro Transkription der mit Brüchen versehenen DNA-Template wurde durchgeführt in 20 μl Reaktionen von 40 mM Tris-HCl (pH 7,0), 6 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin, 10 mM NaCl, 10 mM Dithiothreitol, 1 Einheit/μl RNasin (Promega), 5 mM rNTP, 5 μCi [α-32P]rCTP, 1 Einheit/μl SP6 RNA-Polymerase (Amersham, Arlington Heights, IL) bei 37°C für 30 Minuten. Unvollkommene und Volllängen-RNA-Transkripte wurden durch Gelelektrophorese getrennt und durch Messen der Radioaktivität der einzelnen RNA-Fragmente durch Trocknen des Polyacrylamidgels und Messen der Radioaktivität als Vergleich mit einem bekannten Standard unter Verwendung eines Phosphorimagers (Molecular Dynamics, Inc.) quantifiziert. Die Effizienz der Volllängen-RNA-Transkription eines mit Brüchen versehenen DNA-Templats wurde als Prozentsatz der Mol an Volllängen-RNA, die von einem DNA-Templat, das keine Brüche enthielt, transkribiert wurde, berechnet. Die Bruch-Überspringungseffizienz eines mit Brüchen versehenen DNA-Templats wurde berechnet als Prozentsatz von Mol-Volllängen-RNA-Transkript und Mol RNA-Transkript, das durch den Bruch zum Stillstand gebracht wurde.
Wie in Tabelle 1 dargestellt, fährt die Transkription einer Volllängen-RNA mit 88 bis 94 % Effizienz fort, wenn ein Bruch in den codierenden Strang nach den Nukleotiden +7, +8, +9 oder +19 relativ zum Transkriptionsstart eingefügt wurde.
TABELLE 1
BEISPIEL 5
DNA-Sequenzierung unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase
1. Design von Templat und Primer-Sequenzen
Alle Primer wurden auf einem gewerblich erhältlichen DNA-Synthetisierert synthetisiert unter Verwendung der herkömmlichen Phosphoramiditchemie (Sinha et al. (1984) Nucleic Acid Res. 12: 4539). In vitro RNA-Transkription wurde auf einem synthetischen 276 Nukleotid doppelsträngigen DNA-Templat durchgeführt (SEQ ID NO: 13, welches einen T7-Promotor umfaßt).
2. DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenzierung eines Target-DNA-Templats wurde in 10 μl Reaktionen von 40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl₂, 2 mM neutralisiertem Spermidin, 5 mM Dithiothreitol, 300 nM rCTP, 300 nM rATP, 300 nM rUTP, 300 nM rITP, 600 nM rGMP, 10 μCi (α-³²P) rCTP oder UTP, 10–300, im Allgemeinen 10 bis 50 μM 3'-Deoxynukleotid, 0,5 bis 1,0 pmol linearisiertem oder supercoiled DNA-Templat, 4 Einheiten RNasin (Promega), 10 Einheiten/μl T7-RNA-Polymerase (USB) bei 37°C für 30 Minuten durchgeführt. Kettenterminierungsfragmente der RNA-Transkripte wurden durch Gelelektrophorese unter Verwendung eines 8%-igen oder 13%-igen Polyacrylamidgels aufgetrennt.
Die DNA-Sequenzierungsleitern von RNA-terminierten Fragmenten von bis zu 180 bis 200 Basen wurden erzeugt. Dieses Beispiel zeigt, daß T7 RNA Polymerase spezifisch modifizierte 3'-Deoxyribonukleosid-Triphosphate als basenspezifische Kettenterminatoren einbaut, um genestete RNA-Transkripte für die Sequenzierung von Nukleinsäuren zu erzeugen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Bestimmen der Sequenz eines Zielnukleinsäuremoleküls, umfassend: a) Immobilisieren einer einen Promotor enthaltenden Nukleinsäuresonde auf einem festen Träger, wobei: die einen Promotor enthaltende Nukleinsäuresonde mindestens 5 Nukleotide am 3'-Ende des codierenden Strangs, die zu einer einzelsträngigen Region am 3'-Ende der Zielnukleinsäure komplementär sind, sowie einen doppelsträngigen Abschnitt umfasst, der einen Promotor umfasst, welcher orientiert ist, um die Transkription eines hybridisierten Zielnukleinsäuremoleküls zu erlauben; b) Hybridisieren der Zielnukleinsäure mit dem einzelsträngigen Abschnitt der immobilisierten Nukleinsäuresonde; c) Transkribieren der Zielnukleinsäure mit einer RNA-Polymerase, um mehrere basenspezifisch terminierte RNA-Transkripte herzustellen, wobei die RNA-Polymerase den Promotor erkennt; d) Bestimmen des Molekulargewichtswerts jedes basenspezifisch terminierten RNA-Transkripts durch Massenspektrometrie; und e) Bestimmen der Sequenz der Nukleinsäure durch Alignment der basenspezifisch terminierten RNA-Transkripte gemäß dem Molekulargewicht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die einen Promotor enthaltende Nukleinsäuresonde durch Hybridisieren von Oligonukleotiden, welche für die codierenden und nicht-codierenden DNA-Stränge eines Promotors codieren, hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend zwischen den Schritten b) und c): Hinzufügen einer Ligase, um eine Phosphodiesterbindung zwischen der 3'-Hydroxylgruppe und der 5'-Phosphatgruppe von angrenzenden Strängen der Nukleinsäuresonde und der Zielnukleinsäure zu bilden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Promotor ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Archaebakterien, Eubakterien, Bacteriophagen, DNA-Viren, RNA-Viren, Pflanzen, Pflanzenviren und eukaryontischen Promotoren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA-Polymerase eine DNA-abhängige RNA-Polymerase ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA-Polymerase eine RNA-abhängige RNA-Polymerase ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Archaebakterien, Eubakterien, Bacteriophagen, DNA-Viren, RNA-Viren, Pflanzen und eukaryontischen RNA-Polymerasen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA-Polymerase ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli RNA-Polymerase, T7 RNA-Polymerase, SP6 RNA-Polymerase, T3 RNA-Polymerase und Qβ Replikase.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei vor dem Immobilisieren der Nukleinsäure die Oberfläche des Trägers durch Reagieren der Oberfläche mit einem Aminosilan derivatisiert wird, um auf der Oberfläche des Trägers primäre Amine zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Aminosilan 3-Aminopropyltriethoxysilan ist.
Verfahren nach Anspruch 9, weiterhin umfassend: Reagieren der primären Amine auf der Oberfläche des Trägers mit einem Thiolreaktiven quervernetzenden Reagenz, um einen Thiol-reaktiven festen Träger zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Thiol-reaktive quervernetzende Reagenz N-Succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoat (SIAB) ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Immobilisieren der Nukleinsäuresonde auf einem festen Träger durch Reagieren des Thiolreaktiven festen Trägers mit einer Nukleinsäuresonde bewirkt wird, welche eine freie 5'- oder 3'-Thiolgruppe aufweist, wodurch eine kovalente Bindung zwischen der Thiolgruppe und dem Thiol-reaktiven festen Träger gebildet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäuresonde bei einer Dichte von mindestens 20 fmol/mm² kovalent auf eine Oberfläche des festen Trägers gebunden wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäuren auf der Oberfläche des festen Trägers in Form eines Arrays immobilisiert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der feste Träger Silizium ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Oberfläche mehrere Vertiefungen aufweist, welche das immobilisierte Nukleinsäuremolekül umfassen.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Vertiefungen eine raue innere Oberfläche aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der feste Träger eine raue Oberfläche aufweist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Oberfläche der Vertiefungen geätzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Massenspektrometrie-Analyse ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation, Time-of-Flight (MALD1-TOF) Analyse, kontinuierliches oder gepulstes Elektrospray und Fourier-Transformations-Ionencyclotronenresonanz.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Transkription in Gegenwart eines oder mehrerer 3'-Deoxyribonukleotide durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend: Hinzufügen eines Matrixmaterials zu der Oberfläche des Trägers, und Bestimmen des Molekulargewichts der synthetisierten einzelsträngigen Ribonukleinsäure unter Verwendung von Massenspektrometrie-Analyse.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hybridisierung der zu sequenzierenden Nukleinsäure auf dem festen Träger zur Bildung eines Bruchs im codierenden Strang führt, welcher den Positionen entspricht, welche relativ zum Beginn der Transkription vom Promotor aus hinter der Position +6 liegen.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Bruch sich an Position +7, +8, +9 oder +19 befindet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Transkription in Gegenwart mindestens eines modifizierten Ribonukleosid-Triphosphat-Analogs durchgeführt wird, wodurch das resultierende RNA-Molekül eine verringerte Sekundärstruktur im Vergleich mit einem RNA-Molekül aufweist, welches aus unmodifizierten Ribonukleotid-Triphosphaten gebildet wurde.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt c) die Transkription in Gegenwart eines modifizierten Ribonukleotids durchgeführt wird, wodurch der Turnover der RNA-Polymerase erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das modifizierte Ribonukleotid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus 4-Thio-UTP, 5-Brom-UTP und 5-Jod-CTP.
Verfahren zum Identifizieren von transkriptionsterminierenden Sequenzen oder attenuierenden Sequenzen in einem Zielnukleinsäuremolekül, umfassend: a) Immobilisieren einer einen Promotor enthaltenden Nukleinsäuresonde auf einem festen Träger, wobei die einen Promotor enthaltende Nukleinsäuresonde mindestens 5 Nukleotide am 3'-Ende des codierenden Strangs, die zu einer einzelsträngigen Region am 3'-Ende der Zielnukleinsäure komplementär sind, und einen doppelsträngigen Abschnitt umfasst, welcher den Promotor umfasst, welcher orientiert ist, um die Transkription des hybridisierten Zielnukleinsäuremoleküls zu erlauben; b) Hybridisieren des Zielnukleinsäuremoleküls mit der immobilisierten Nukleinsäuresonde; c) Transkribieren der Zielnukleinsäure mit einer RNA-Polymerase, um ein Sequenz-terminiertes RNA-Transkript herzustellen, wobei die RNA-Polymerase den Promotor erkennt; und d) Bestimmen des Molekulargewichtswerts des RNA-Transkripts durch Massenspektrometrie, wobei die beobachtete Masse der RNA die Gegenwart einer Terminatorsequenz oder eines Attenuators im Zielnukleinsäuremolekül anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 29, welches ein Verfahren zum Identifizieren eines Attenuators ist, wobei die Terminierung vor einer codierenden Sequenz auftritt.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei in Schritt c) die Transkription in Gegenwart eines modifizierten Ribonukleotids durchgeführt wird, wodurch der Turnover der RNA-Polymerase erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das modifizierte Ribonukleotid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus 4-Thio-UTP, 5-Brom-UTP und 5-Jod-CTP.