DE69816051T2

DE69816051T2 - Zusammensetzungen und verfahren zur hemmung der licht-induzierten inaktivierung von biologischen reagenzien

Info

Publication number: DE69816051T2
Application number: DE69816051T
Authority: DE
Inventors: F. Kenneth BEUCHLER; H. Paul MCPHERSON; R. Alfred SUNDQUIST
Original assignee: Biosite Inc
Current assignee: Alere San Diego Inc
Priority date: 1997-04-09
Filing date: 1998-04-06
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2018-04-07
Also published as: EP0972194B1; CA2286183A1; CA2286183C; AU6796598A; US6544797B1; DE69816051D1; US20030129642A1; WO1998045705A2; WO1998045705A3; US7588908B2; EP0972194A2; JP2001519908A; ATE244404T1

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Stabilisierung fluoreszierender Konjugate, insbesondere die Stabilisierung biologischer Reagenzien, wie zum Beispiel Proteine, Peptide, Ligandanaloga und Nukleinsäuren, die an ein fluoreszierendes Molekül oder an einen fluoreszierenden Partikel konjugiert sind.
Stand der Technik
Um die Gegenwart oder die Konzentration der Zielliganden oder der Analyte in einer Flüssigkeit zu bestimmen, verwenden immunologische Versuche Bindeproteine, wie zum Beispiel Antikörper, zum spezifischen Binden an Zielliganden oder an Analyte. Gewöhnlich wird ein Signal vom immunologischen Versuch zum Bereitzustellen eines detektierbaren und wahrnehmbaren Ergebnisses erzeugt. Eine Klasse nützlicher Signalerzeuger sind wegen ihrer hohen spezifischen Aktivität fluoreszierende Moleküle.
Fluoreszierende Moleküle wurden in unterschiedlicher Weise in immunologischen Versuche als Signalerzeuger verwendet. Beispielsweise können Enzyme die Bildung fluoreszierender Farbstoffe aus einem Substrat in der Weise katalysieren, dass die Menge des erzeugten fluoreszierenden Farbstoffs sich auf die Gegenwart oder die Menge des Analyten oder des Zielliganden in einer Probe bezieht; derartige Enzyme können an Antikörper oder an Ligandanaloga konjugiert sein. Die fluoreszierenden Farbstoffe können ebenfalls an Antikörper oder an Ligandanaloga konjugiert sein und die Menge des fluoreszierenden Signals wird als ein Ergebnis des Testverfahrens zum Bestimmen der Gegenwart oder der Menge des Analyten gemessen.
Ein Ziel von immunologischen Versuchen ist es, diese empfindlicher zu machen, so dass eine niedrigere Konzentration des Analyten gemessen werden kann. Zum Steigern der Empfindlichkeit kann man ein biologisches Reagenz an einen fluoreszierenden Partikel konjugieren. "Fluoreszierende Partikel", wie hier verwendet, können aus einem synthetischen Material, wie zum Beispiel Latex, ausgebildet sein, können ein natürliches Material, wie zum Beispiel Liposomen oder Kombinationen natürlicher und synthetischer Materialien umfassen. Bei der Präparation der fluoreszierenden Partikel werden die fluoreszierenden Farbstoffe oder Enzyme im Allgemeinen unter Verwendung gemischter organischer und wässriger Lösungen in die Partikel aufgesogen und/oder auf den Partikeln adsorbiert sein. Die in die Partikel aufgenommenen fluoreszierenden Farbstoffe oder Enzyme sind gewöhnlich wasserunlöslich, wohingegen die unmittelbar an die biologischen Reagenzien konjugierten Farbstoffe oder Enzyme im Allgemeinen wasserlöslich sind.
Man kann beispielsweise ein biologisches Reagenz an einen fluoreszierenden Partikel konjugieren, der viele fluoreszierende Moleküle oder Enzyme enthält, die in der Lage sind, ein Substrat in ein fluoreszierendes Produkt umzuwandeln. Im Falle der Konjugation eines Antikörpers an einen fluoreszierenden Partikel wird der Analyt, welcher durch den Antikörper gebunden wird, der an den fluoreszierenden Partikel konjugiert ist, welcher viele fluoreszierende Moleküle enthält, somit einem größeren Signal zugeordnet, als mit dem Anbinden eines Antikörpers verglichen, der mit einem einzelnen fluoreszierenden Molekül oder Enzym konjugiert ist.
Beispiele von immunologischen Versuchen, die fluoreszierende Farbstoffe oder Enzyme einbeziehen, sind zahlreich und einige werden in den U.S. Patenten 4,283,382; 4,351,760; 4,420,568; 4,868,132; 4,876,190; 5,075,215 und in der EPA Anmeldung Nr. PCT/US87/03226 beschrieben.
Immunologische Versuche werden entweder als konkurrierende oder nicht konkurrierende charakterisiert. Konkurrierende immunologische Versuche arbeiten im Allgemeinen aufgrund der Konkurrenz zwischen einem Ligandanalogon Signalerzeugerkomplex und einem Liganden (das heißt, dem Analyten) um die Bindung an eine begrenzte Menge des Antikörpers. Konkurrierende immunologische Versuche können zudem durch die Konkurrenz zwischen einem Protein oder einem Antikörper Signalerzeugerkonjugat und einem Analyten, welcher jeweils ein Protein oder ein Antikörper ist, um die Bindung an eine begrenzte Menge des Liganden funktionieren. Nicht konkurrierende immunologische Versuche funktionieren im Allgemeinen indem zwei unterschiedliche Antikörper den Analyten an unterschiedlichen Epitopen binden, ein Antikörperkonjugat an den Signalerzeuger konjugiert ist und der andere Antikörper in Lösung oder an eine Festphase gebunden ist, um die Abtrennung des ungebundenen Signalerzeugers von dem gebundenen Signalerzeuger zu erleichtern.
Die Antikörperkonzentration in einem immunologischen Versuch bestimmt im Allgemeinen die Kinetiken des Immuntotests als auch den an den Antikörper gebundenen Anteil des Analyten. Im Allgemeinen wird, um das Binden eines Analyten an einen Antikörper zu beschleunigen, so dass die Reaktion eine gewünschte Reaktionsgeschwindigkeit oder ein Gleichgewicht in einer gewünschten Zeit erreicht, die höchste Antikörperkonzentration, die realisierbar ist, in dem Test verwendet; das trifft insbesondere auf die nicht konkurrierenden immunologischen Versuche zu. Somit wird häufig eine hohe Antikörperkonzentration in den Fluoreszenztests eingesetzt. Im Allgemeinen wird zudem eine hohe Antikörperkonzentration mit einer hohen Fluoreszenzfarbstoffkonzentration in Verbindung gebracht, da beide zum Antikörper : Partikelkonjugat oder zum Antikörper : Farbstoffkonjugat beitragen.
Für immunologische Versuche werden somit häufig fluoreszierende Partikel verwendet, um ein empfindlicheres Maß der Konzentration des Analyten zu erhalten. Die Anzahl eines Fluoreszenzmoleküls, die zur Assoziation mit einem Komplex eines Analyten und eines fluoreszierenden Konjugates benötigt wird, wird im Allgemeinen auf Basis der Empfindlichkeitsanforderungen des Testes bestimmt. Für empfindliche Tests wird somit die Menge des fluoreszierenden Farbstoffs oder Enzyms, die mit dem Analyten in dem Testverfahren verbunden ist, maximiert. In einem derartigen Fall ist die lokale Konzentration der fluoreszierenden Moleküle in unmittelbarer Nähe zum biologischen Reagenz sehr hoch, da sie sich in enger Nachbarschaft zueinander befinden.
Nukleinsäuretests verwenden ebenfalls Fluoreszenzsignalerzeuger. Mit Nukleinsäuren verbundene Signalerzeuger werden in Tests zum Messen der Nukleinsäuren verwendet, die zur Nukleinsäure komplementär sind, die mit einem Signalerzeuger verbunden ist. Um die Kinetiken der Hybridisierung mit der Zielnukleinsäure zu optimieren und um zudem den empfindlichsten Test zu ermöglichen, sind diese Nukleinsäuren ebenfalls in einer hohen lokalen Konzentration in der Nähe der fluoreszierenden Moleküle. Zum Erstellen eines Nukleinsäurekonjugates wird ein Signalentwicklungselement an eine Nukleinsäuresequenz konjugiert. Das Signalentwicklungselement kann ein fluoreszierender Partikel oder ein fluoreszierendes Molekül sein.
Bislang ergab sich jedoch ein Problem mit den fluoreszierenden Konjugaten für die Verwendung in den Tests. Oftmals waren die fluoreszierenden Konjugate nicht stabil. Es wurde gefunden, dass die Reaktivität solcher Konjugate über die Zeit abfällt, so dass die Funktion oder die Eigenschaften eines biologischen Reagenzes in einem fluoreszierenden Konjugat sich mit der Zeit verändern würden. Beispielsweise würde häufig die Bindungsaffinität eines an ein fluoreszierendes Signal geknüpften Antikörpers mit der Zeit absinken. Der Mechanismus (Mechanismen) für diesen Abbau der Eigenschaften der biologischen Reagenzien in fluoreszierenden Konjugaten war nicht bekannt. Es wurde jedoch angenommen, dass der Abbau als Konsequenz zu der Freisetzung oder dem Entkoppeln des biologischen Reagenzes aus dem fluoreszierenden Molekül auftrat.
Offenbarung der Erfindung
Zum ersten Mal wurden in der Technik die Mechanismen identifiziert, die zum Abbau der biologischen Reagenzien in fluoreszierenden Konjugaten führen. Demgemäß werden Zusammensetzungen und Verfahren zum Modulieren dieses Abbaus, sowohl in fluoreszierenden Konjugaten als auch in den Reagenzien, die zum Synthetisieren der fluoreszierenden Konjugate verwendet werden, bereitgestellt. Die Leistungsfähigkeit von fluoreszierenden Konjugaten für die Verwendung in Tests wird gemäß der vorliegenden Erfindung erhöht.
Das Konjugat kann umfassen, dass das fluoreszierende Molekül unmittelbar mit dem biologischen Reagenz verknüpft ist. Das Konjugat kann weiterhin ein Partikel umfassen, welches ein fluoreszierendes Molekül umfasst; das Partikel kann ein natürliches Material oder ein synthetisches Material umfassen. Beispielsweise kann das Partikel ein natürliches Material umfassen, welches Tonerde, Siliziumdioxid oder ein Liposom ist.
Offenbart ist eine Lösung, die ein fluoreszierendes Konjugat und ein Sauerstoff abreicherndes System umfasst. Bei einer Ausführungsform des in eine Lösung zu gebenden fluoreszierenden Konjugats kann die Lösung Mittel zum Verhindern des phototoxischen Abbaus umfassen. Die Mittel der Lösung zum Verhindern können ein Antioxidationsmittel, ein Protein, ein Sauerstoff abreicherndes System oder eine Kombination davon umfassen.
Ebenfalls offenbart ist ein fluoreszierendes Konjugat, das durch ein Verfahren hergestellt wird, das die Schritte umfasst: Bereitstellen eines biologischen Reagenzes; Bereitstellen eines fluoreszierenden Moleküls; Bereitstellen eines heterofunktionellen verknüpfenden Reagenzes; chemisches Umsetzen des biologischen Reagenzes, des fluoreszierenden Moleküls und des heterofunktionellen verknüpfenden Reagenzes, wodurch das biologische Reagenz mit dem fluoreszierenden Molekül verknüpft wird.
Offenbart ist ein Verfahren zur Verwendung eines Antioxidationsmittel, eines Proteins, eines Sauerstoff abreichernden Systems oder einer quervernetzenden Substanz zum Vermindern des phototoxischen Abbaus eines biologischen Reagenzes in einem fluoreszierenden Konjugat, welches das biologische Reagenz und ein fluoreszierendes Molekül umfasst oder zum Vermindern des phototoxischen Abbaus des Materials, das zum Präparieren einer Zusammensetzung verwendet wird, die ein fluoreszierendes Molekül umfasst, das sich durch Kombinieren eines Antioxidationsmittels, eines Proteins, eines Sauerstoff abreichernden Systems oder einer quervernetzenden Substanz mit dem fluoreszierenden Konjugat oder mit dem Material, das zum Präparieren einer ein fluoreszierendes Molekül umfassenden Zusammensetzung verwendet wird, ergebende Verfahren.
Ebenso offenbart ist ein Verfahren zum Erleichtern der Präparation einer stabilen fluoreszierenden Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung ein fluoreszierendes Molekül umfasst, welches Licht absorbiert und ein Fluoreszenzresultat nach der Einwirkung von Licht eines definierten Spektrums bereitstellt. Das Verfahren umfasst: Bereitstellen eines Umfeldes, das relativ gegenüber einem Umfeld von weißem Licht verminderte Mengen des Lichtes des definierten Spektrums umfasst; Bereitstellen des fluoreszierenden Moleküls oder eines Materials zum Präparieren der Zusammensetzung; Anordnen des fluoreszierenden Moleküls oder des Materials zum Präparieren der Zusammensetzung in das bereitgestellte Umfeld. Eine Ausführungsform des Verfahrens wird offenbart, welche umfasst: Bereitstellen des fluoreszierenden Moleküls; Bereitstellen des Materials zum Präparieren der Zusammensetzung; Anordnen des fluoreszierenden Moleküls in das bereitgestellte Umfeld; Anordnen des Materials zum Präparieren der Zusammensetzung in das bereitgestellte Umfeld; und Kombinieren des fluoreszierenden Moleküls und des Materials zum Präparieren der Zusammensetzung, wodurch der phototoxische Abbau des Materials zum Präparieren der Zusammensetzung nach Vollendung des Verfahrens verringert wird. Wenn diese Ausführungsform des Verfahrens ausgeführt wird, kann der Kombinierungsschritt vor dem Schritt des Anordnens des fluoreszierenden Moleküls in das bereitgestellte Umfeld und vor dem Schritt des Anordnens des Materials zum Präparieren der Zusammensetzung in das bereitgestellte Umfeld erfolgen.
Definitionen
Fluoreszierendes Molekül – Ein fluoreszierendes Molekül, wie hier verwendet, ist eines, das entweder während des Übergangs von einem angeregten elektronischen Zustand in einen Zustand niedrigerer Energie Licht emittiert oder es ist ein Enzym oder Katalysator, der in der Lage ist, auf ein Substrat einzuwirken, um ein Molekül zu erzeugen, das während des Übergangs von einem angeregten elektronischen Zustand in einen Zustand niedrigerer Energie Licht emittiert.
Fluoreszierende Farbstoffe – Fluoreszierende Farbstoffe sind jene, die während des Übergangs von einem angeregten elektronischen Zustand in einen Zustand niedrigerer Energie Licht emittieren. Der Zustand niedrigerer Energie wird gewöhnlich als der Grundzustand bezeichnet. Der angeregte Zustand wird durch Absorption von Licht einer geeigneten Wellenlänge erreicht. Ein Weg zur Entspannung des angeregten Zustands ist die Emission von Lieht. Fluoreszierende Farbstoffe zeigen die Singulett-Singulett Emission von Licht.
Fluoreszierende Partikel – Ein Partikel, welches ein oder mehrere fluoreszierende Moleküle umfasst. Ein fluoreszierendes Partikel kann aus einem synthetischen Material, wie zum Beispiel Latex, ausgebildet sein, kann ein natürliches Material, wie zum Beispiel Liposomen, umfassen oder kann eine Kombination von natürlichen und synthetischen Materialien umfassen.
Ligand – Ein Bindungspartner an einem Ligandrezeptor oder an einer komplementären Nukleinsäuresequenz.
Ligandanalogon – Ein chemisches Derivat eines Liganden. Ein Ligandanalogon kann entweder kovalent oder nicht kovalent an andere Spezies, zum Beispiel an ein Signalentwicklungselement, angefügt sein. Das Ligandanalogon und der Ligand können das Gleiche sein und beide können in der Lage sein, an den Ligandrezeptor zu binden.
Ligandrezeptor – Ein Rezeptor ist in der Lage ist, den Liganden zu binden. Typischerweise ist ein Ligandrezeptor ein Antikörper oder eine komplementäre Nukleinsäuresequenz, er kann jedoch auch ein Ligand sein.
Signalentwicklungselement – Das Element des biologischen Reagenzkonjugates, welches ein detektierbares Signal produziert. Das Signal kann unmittelbar durch das Signalentwicklungselement oder nach der Einwirkung der Signalentwicklung auf ein Substrat produziert werden.
Radikal – Ein Radikal ist ein Atom oder eine Gruppe von Atomen, das ein ungepaartes Elektron besitzt. Radikale werden auch als freie Radikale, Di-Radikale und Radikalpaare bezeichnet.
Biologisches Reagenz – Eine Gruppe, zum Beispiel ein Protein, Peptid, Ligandanalogon oder Nukleinsäure, die in der Lage ist, mit einem Signalentwicklungselement in einem Konjugat verbunden zu sein.
Fluoreszierende Konjugate – Ein fluoreszierendes Konjugat umfasst ein biologisches Reagenz, zum Beispiel ein Protein, Peptid, Ligandanalogon oder Nukleinsäuresequenz im Verbund mit einem fluoreszierenden Molekül, einem fluoreszierenden Partikel, einem Enzym oder einem Erzeuger der fluoreszierenden Farbstoffe. Der Verbund kann kovalent oder nicht kovalent sein.
Die fluoreszierenden Moleküle können mit natürlichen oder synthetischen Partikeln konjugiert werden, um fluoreszierende Partikel auszubilden. Zum Beispiel kann ein fluoreszierendes Molekül an Tonerde oder Siliziumdioxidpartikel adsorbiert werden oder in Latexpartikel oder Liposomen aufgesogen werden; die Proteine, Peptide, Ligandanaloga oder Nukleinsäuren können an die Partikel adsorbiert oder kovalent gekoppelt werden, um die fluoreszierenden Konjugate herzustellen. Alternativ können die fluoreszierenden Moleküle unmittelbar an die Proteine, Peptide, Ligandanaloga oder Nukleinsäuren gekoppelt werden, um fluoreszierende Konjugate auszubilden. Die unmittelbare Kopplung kann eine kovalente Bindung sein. Die für diese letzteren Konjugate benutzten fluoreszierenden Moleküle sind im Allgemeinen wasserlöslich, besitzen eine Carbonsäure-, Thiol-, Amin-, Maleinimid-, Alkylhalid- oder N-Hydroxybernsteinsäurestergruppe, um das Koppeln an die Proteine, Peptide, Ligandanaloga oder Nukleinsäuren zu erleichtern.
Antioxidanz – Eine Substanz, wie zum Beispiel ein Quencher, welcher, wenn dieser in einem System vorliegt, die Oxidation des Substrates signifikant verzögert oder inhibiert.
Reaktive Spezies – Beispiele von reaktiven Spezies sind Singulett-Sauerstoff, freie Radikale und angeregte Triplett-Zustände.
Quencher – ein Substrat, welches entweder durch physikalische Mittel, wie zum Beispiel Energietransfer oder durch chemische Mittel die Zersetzung einer anderen Substanz verzögert oder inhibiert.
Arten der Ausführung der Erfindung
Zum ersten Mal wurden in der Technik die Mechanismen identifiziert, die zum Abbau der biologischen Reagenzien in fluoreszierenden Konjugaten führen. Es wurde herausgefunden, dass umgebendes weißes Licht zur Bildung von Singulett-Sauerstoff oder Radikalen führt, welche auf biologische Reagenzien einwirken. Die Untersuchungen, die zu diesem Ergebnis führten, als auch die Zusammensetzungen und Verfahren zum Modulieren dieses Abbaus werden offenbart. Nach der vorliegenden Erfindung wird die Wirksamkeit der fluoreszierenden Konjugate für die Verwendung in Versuchen erhöht.
Obwohl der Abbau biologischer Reagenzien in fluoreszierenden Systemen bemerkt wurde, war der auslösende Mechanismus unbekannt. Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass biologische Reagenzien, wie Antikörper, Peptide und Ligandanaloga, wie auch Reagenzien, die zum Synthetisieren der fluoreszierenden Konjugate verwendet werden, durch einen Mechanismus abgebaut werden, welcher nach dem Aussetzen dieser Materialien gegenüber routinemäßigen Umgebungsbedingungen induziert wird. Die Umgebungsbedingungen können die einfache Exposition gegenüber weißem Licht und Sauerstoff darstellen.
Demgemäss betrifft diese Erfindung die Stabilisierung von Proteinen, Peptiden, Ligandanaloga und Nukleinsäuren, welche in fluoreszierenden Konjugaten enthalten sind als auch die Stabilisierung dieser Materialien für die Herstellung fluoreszierender Konjugate.
Mechanismus (Mechanismen) des Abbaus biologischer Reagenzien Die Inaktivierung der Bindungsaktivität der Antikörper in immunologischen Versuchen oder die Inaktivierung von Nukleinsäure-Hybridisierungsversuchen durch Singulett-Sauerstoff oder durch Radikale wurde zuvor nicht beschrieben. Zuvor wurde lediglich die Inaktivierung von Lysozym und die Oxidation von Aminosäuren beschrieben (Singulet Oxygen, 1985, Bd. IV, S. 91–143, Ed. A. A. Frimer, CRC Press, Boca Raton, FL; Int. J. Radiat. Biol. (1986) 50: 41–45); jedoch beziehen sich diese Beschreibungen auf fluoreszierende Farbstoffe, welche nicht an Proteine, Peptide, Ligandanaloga und Nukleinsäuren konjugiert sind; im Unterschied zur vorliegenden Erfindung waren diese Farbstoffe und biologischen Reagenzien in wässrigen Lösungen frei löslich.
Weiterhin wurde festgestellt, dass Phthalocyanine ebenfalls Phototoxizität auslösen können durch einen Elektronentransfermechanismus (Typ 1), in welchem der fluoreszierende Farbstoff in einem angeregten Triplett-Zustand Reaktionen mit benachbarten Molekülen durch einen Elektronenoder Wasserstoff-Transferprozess unterliegen kann. Die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff (Typ II) durch die Anregung von fluoreszierenden Farbstoffen wurde für die photodynamische Therapie (Polym. Adv. Technol. (1995) 6: 118–130; Int. J. Radiat. Biol. (1995) 67: 85–91; Ciba Foundation Symposium (1989) 146: 17–26) und in immunologischen Versuchen eingesetzt, wobei die Bildung von Singulett-Sauerstoff durch Partikel, die Silizium-Phthalocyanin umfassen, zum Erzeugen einer verzögerten Lumineszenz verwendet wurde. Die verzögerte Lumineszenz ist proportional zur Konzentration des Analyten (Clin. Chem. 42: 1518–1526).
Die Lehren hierin zeigen, dass Licht (umgebendes oder fokussiertes) die Wirksamkeit von Bindungsreaktionen von Antikörpern, Peptid- und Ligandanalog-fluoreszierenden Konjugaten herabsetzt. Es wird angenommen, dass der Mechanismus für das Herabsetzen der Wirksamkeit, in Beziehung zur Erzeugung reaktiver Spezies, wie zum Beispiel Singulett-Sauerstoff oder von Radikalen durch die fluoreszierenden Moleküle, steht. Die Inaktivierung von biologischen Reagenzien in fluoreszierenden Konjugaten macht diese für die Verwendung in Versuchen unzuverlässig. Die Inaktivierung der Bindung der Antikörper in immunologischen Versuchen oder der Nukleinsäurehybridisierung in Versuchen mit Nukleinsäuren wird im Allgemeinen durch ein Absinken der Steigung einer Dosis-Antwort-Kurve des Versuches offenkundig.
Wie hier offenbart, ist die Licht-vermittelte Inaktivierung biologischer Reagenzien in fluoreszierenden Konjugaten sehr einschneidend. Es wurde herausgefunden, dass der Abbau der biologischen Reagenzien in fluoreszierenden Konjugaten unabhängig vom fluoreszierenden Molekül ist, welches bei der Herstellung des fluoreszierenden Konjugates verwendet wurde. Es wird angenommen, dass sich die Effizienz der Inaktivierung im Ergebnis von zwei Faktoren ergibt: Erstens, die hohen lokalen Konzentrationen von sowohl dem Farbstoff als auch dem biologischen Reagenz; und zweitens, die relative Nähe des biologischen Reagenzes und des fluoreszierenden Farbstoffes in dem fluoreszierenden Konjugat.
Die vermutete Art des Abbaus sind die Typ I und/oder die Typ II Mechanismen der Phototoxizität. Im Fall der Typ I Mechanismen reagiert der Triplett-Sensibilisator, welcher der Triplettzustand eines fluoreszierenden Farbstoffes ist, mit den nahegelegenen Molekülen durch einen Elektronen- oder Wasserstoff-Transferprozess. Freie Radikale werden somit erzeugt; nämlich die halb-reduzierten Sensibilisatoren und das halb-oxidierte Substrat. Der halb-reduzierte Sensibilisator kann mit Sauerstoff unter Bildung eines Superoxid-Radikalanions reagieren, welches mit anderen Molekülen weiter reagieren kann. Der halb-oxidierte Sensibilisator kann durch ein anderes Molekül reduziert werden, um ein halb-oxidiertes Substrat zu bilden, welches weiter reagieren kann.
In dem Fall der Typ II Mechanismen kann der Triplett-Sensibilisator mit Sauerstoff im Grundzustand reagieren, um Singulett-Sauerstoff zu erzeugen, welcher mit anderen Molekülen weiter reagieren kann, wie zum Beispiel Biomolekülen und Reagenzien, um oxidierte Produkte zu ergeben. (Siehe z. B., Int. J. Radiat. Biol. (1995) 67: 85–91).
Biologische Reagenzien, die mit fluoreszierenden Farbstoffen verbunden sind, werden, wie hier offenbart, durch den Triplettzustand des Farbstoffes inaktiviert oder unwirksam.
Die Bildung von Triplettzuständen der fluoreszierenden Farbstoffe kann zur Bildung einer Reihe von radikalischen Spezies führen, die Singulett-Sauerstoff, Superoxid-Radikale, Hydroxylradikale und organische Radikale einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind. Diese radikalischen Spezies sind dafür bekannt, Schaden an biologischen Zellen und Proteinen zu verursachen. Demgemäß reagieren diese reaktiven Spezies im Triplettzustand mit der Oberfläche des biologischen Reagenzes. Daraus ergibt sich in der Folge eine verminderte Wirksamkeit der Bindung eines Antikörpers an den Analyten oder der Bindung eines Peptides oder eines Ligandanalogon an den Antikörper. Die erfinderischen Lehren legen Zusammensetzungen vor, die die Licht-induzierte Zerstörung biologischer Reagenzien verlangsamen oder verhindern.
Stabilisierung biologischer Reagenzien
Die Erfindung betrifft die Stabilisierung biologischer Reagenzien, die an fluoreszierende Partikel konjugiert oder an ein fluoreszierendes Molekül konjugiert sind, als auch die Herstellung solche Konjugate. Das biologische Reagenz kann ein Protein, Peptid, Ligandanalogon oder eine Nukleinsäurekomponente umfassen. Wenn ein biologisches Reagenz gemäß der Erfindung stabilisiert wird, wird der phototoxische Abbau des biologischen Reagenzes in einem fluoreszierenden Konjugat verhindert.
Demgemäss wurde jetzt herausgefunden, dass die Inaktivierung biologischer Reagenzien, die an fluoreszierende Moleküle oder fluoreszierende Partikel konjugiert sind, verringert oder verhindert werden kann durch die Verwendung von Radikalfängern, die als Quencher bezeichnet werden, von Sauerstoff abreichernder Systeme in Lösungen, welche die fluoreszierenden biologischen Reagenzkonjugate enthalten, von chemischen Verknüpfungen in den Konjugaten um die Wirkungen der Radikale zu minimieren, oder von Kombinationen dieser.
Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung umfasst ein System, welches gelösten Sauerstoff verbraucht. Beispielsweise umfasst ein System dieser Ausführungsform Katalysieren, Glukoseoxidase und Glukose, wie hierin ausführlicher diskutiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten Lösungen, die chemisch oxidierbare Verbindungen enthalten, ebenfalls Singulett-Sauerstoff und/oder freie Radikalquencher, um die Oxidation der chemischen Spezies zu minimieren oder zu verhindern. Oxidierbare Verbindungen schließen diejenigen ein, die in der Lage sind, von einem Oxidationszustand in einen Höheren umgewandelt zu werden. Im Allgemeinen schließen die meisten Oxidationen eine Zunahme an Sauerstoff und/oder einen Verlust an Wasserstoff ein.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthalten die Lösungen, die biologische Reagenzien enthalten, die mit fluoreszierenden Molekülen assoziiert sind oder an fluoreszierende Moleküle konjugiert sind, ebenfalls Singulett-Sauerstoff und/oder freie Radikalquencher zum Minimieren oder Verhindern der Inaktivierung des biologischen Reagenzes. Die biologischen Reagenzien schließen Peptide und Proteine ein, die oxidierbare Aminosäuren oder angefügte Moleküle und Nukleinsäuren enthalten.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthalten die Lösungen, die Antikörper enthalten, die mit fluoreszierenden Molekülen assoziiert sind oder an fluoreszierende Moleküle konjugiert sind, ebenfalls Singulett-Sauerstoff und/oder freie Radikalquencher zum Minimieren oder Verhindern der Fähigkeit des Antikörpers an dessen Antigen zu binden. Antikörper schließen polyklonale und monoklonale Antikörper und bindende Fragmente ein, die durch rekombinante Proteinsynthese oder andere Techniken erzeugt wurden.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthalten die Lösungen, die Nukleinsäuren enthalten, die mit fluoreszierenden Molekülen assoziiert sind oder an fluoreszierende Moleküle konjugiert sind, ebenfalls Singulett-Sauerstoff und/oder freie Radikalquencher zum Minimieren oder Verhindern der Inaktivierung oder Verzögerung der Geschwindigkeit der Hybridisierung der Nukleinsäure an einen komplementären Nukleinsäurestrang.
Verbindungen, die als Quencher des Singulett-Sauerstoffs verwendet werden können, schließen die in Tabelle 1 aufgeführten ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die Verbindungen, die als Quencher der freien Radikale verwendet werden können, schließen die in der Tabelle 2 aufgeführten ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Tabelle 1
Singulett-Sauerstoff Quencher

Carotenoide: natürlich vorkommende und synthetische Tocopherole und Tocopheramine: Homologe, Isomere, Derivate und verwandte Verbindungen
Thiole: zum Beispiel Glutathion, Ergothionin, Cystein, N-Acetyl-Cystein, Dihydrolipoinsäure, Thiol-enthaltende Proteine und Peptide
Aminosäuren: Tryptophan, Tyrosin, Histidin, Methionin, Cystein und Peptide und Proteine, die diese Aminosäuren enthalten
Probucol
2,2,6,6-Tetra-Methyl-piperidin (TEMP)
Plamitoyl-Ascorbinsäure
Koffein
Squalen
Ester ungesättigter Fettsäuren
Flavonoide
Lidocain
Imidazol und Derivate
Phthalocyanine und Naphthalocyanine
p-Aminobenzoesäure (PABA)
Curcumin
Spermin
Spermidin
Merocyanin 540
Cholesterin
Azid

Tabelle 2
Freie Radikalquencher
Metallkomplexe

Mangan(II)stearat
Mangan(II)acetat
Bis-(Acetylacetonat)-mangan(II)
N,N'-Ethylen-bis-(salicylideniminato)-mangan(II)
Bis-(Dimethylglioximato)-bis-pyridin-eisen
Eisenstearat
Tris-(Acetylacetonato)-eisen
Bis-(Dimethylglioximato)-ammin-iodid-cobalt (II)
Bis-(Dimethylglioximato)-ammin-chlorid-cobalt (II)
Tris-(Dimethylglioximato)-cobalt(II)
Bis-(Dimethylglioximato)-ammin-iodid-cobalt(II)
Bis-(Dimethylglioximato)-pyridin-iodid-cobalt(II)
Bis-(Dimethylglioximato)pyridinechloridecobalt (II)
Bis-(Dimethylglioximate)-bis-pyridinecobalt (II)
Cobalt(II)stearat
Cobalt(II)chlorid
Cobalt(II)acetat
Cobalt(II)cyclohexyl-carboxylat
Bis-(Acetylacetonato)-cobalt(II)
N,N'-Ethylen-bis-(salicylideniminato)-cobalt(II)
Porfirin-cobalt(II)
Bis-(Salicylat)-nickel
N,N'-Ethylen-bis-(salicylidenimidinato)-nickel
N,N'-Ethylen-bis-(N-p-toluidinyl)salicylideniminato)-nickel
Kupferstearat
Bis-(Dimethylglioximato)-kupfer
Bis-(Salicylat)-kupfer
Bis-(Dimethylglioximato)-kupfer
Bis-(Diphenylglioximato)-kupfer
Bis-(Dimethylglioximato)-ammin-iodide-kupfer
Kupfersulfat
Kupferacetat
Bis-(Acetylacetonato)-kupfer
Porfirin-kupfer

Phenole

Hydroxybenzene
Benzochinone
Catechol und Derivate
Cresol-Isomere (o-, m-, p-)
Chromane
Dihydrobenzofurane
1,2-Ethan-2,2'-bis-(4,6-di-tert-butylphenol)
Hydroxyfluorene
Hydrochinon
4,4'-Methan-bis-(2,6-di-tert-butylphenol)
Dihydroxynaphthalen
Naphtol-Isomere
Pentaerithritol-Ester der 3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl-propionsäure
Hydroxyphenantren-Isomere
Phenol und Derivate
Pentaerithrityl-tetrakis-[3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)-propionat]
Ethylenglycol-bis-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl) propionat
Resorcinol
Silan, Tetra(ethyloxy-3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)
4,4'-Sulfid-bis-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzyl)
2,2'-Sulfid-bis-[4-methyl-5-hydroxy-6-(1'-phenyl)ethyl]
2,2'-Di-Sulfid-bis-[4-methyl-6-hydroxy-5-(1'-phenyl)ethyl]
Indophenol
Tetrahydrochinolin, 5,7,8-Trimethyl-6-hydroxy-N-acetamido
Tetrahydrochinolin, 5,7,8-Trimethyl-6-hydroxy-N-ethyl
Tocol, 5,7-Dimethyl
Tocopherol-Isomere (α, β, γ, δ)

Aromatische Amine

Carbasol
Mono- und Di-Naphthylamine
Diphenylamin und Derivate
p-Phenylendiamin-Derivate
Phenylamin
Phenylnaphthylamin-Isomere
4-Phenyloxyphenyl-2-naphtylamin
4-(Spirotetrahydrofuran-2')spirocyclohexyl-1,2,3,4-tetrahydrochinolin
4-Tert-butylphenyl-l-(4-tert-butyl)-naphthylamin
1,2,3,4-Tetrahydrochinolin, 2,2,4-Trimethyl

Hydroxylamine und Nitroxyl-Radikale

9-Azabicyclo[3.3.1]nonanhydroxylamin
8-Azabicyclo[3.2.1]octanhydroxylamin
1,4-Di-Azacycloheptan, 2,2,6,6-Tetramethyl-5-oxo
2,5-Dihydroimidazol-Derivate
2,5-Dihydropyrrol-Derivate
3,4-Dihydropyrrol-Derivate
1,2-Dihydrochinolin-Derivate
Hydroxylamin-Derivate
Piperidin-Derivate
Pyrrolidin-Derivate
Tetrahydroimidazol-Derivate
Tetrahydropyridin-Derivate
Tetrahydropyrrol-Derivate
Tetrahydrochinolin-Derivate

Thiophenole

Thionaphthol-Isomere
Thiophenol und Derivate
Phenolsulfide

Phosphor und Schwefel enthaltende Antioxidantien

Phosphine
Phosphite
Sulfide
Di-Sulfide
Sulfoxide
Metall-Thiocarbamate
Metall-Thiophosphate

Biologische Antioxidantien
niederes Molekulargewicht, wasserlöslich

Ascorbat;
Thiole;
Urat;
Bilirubin und Biliverdin;
Flavine (z. B. Vitamin B2);
Quercetin

niederes Molekulargewicht, fettlöslich

Carotenoide (natürliche und synthetische) und verwandte Polyene;
Vitamin A (d. h., Retinol, Retinal, Retininsäure) und verwandte Verbindungen;
Tocopherol-Homologe, -Isomere, -Derivate und verwandte Verbindungen;
Ubichinol und Ubichinon;
Flavonoide

Proteine

Thiol enthaltend: Albumin; Thioredoxin; Glutaredoxin
redox-aktive: Cytochrom c; Myoglobin
Enzyme: Superoxid-Dismutase (SOD), Katalase, verschiedene Peroxidasen

Arzneimittel
Salicylat; Ebselen; synthetische Thiole und Thiol-Derivate; Probucol und dessen Derivate; Phenylbutylnitron; Spin-Fallen; Nitecapon und dessen Analoga; Penicillamin; Lazaroide; Aminosalicylate; Stobadin; Nitroxide; Tamoxifen und Östrogene; Plasmalogene; Calciumkanal-blockierende Arzneimittel; Nitroxide; Melatonin
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfasst die Verwendung von heterofunktionalen Reagenzien, wie zum Beispiel heterobifunktionale Reagenzien, welche große molekulare Abstände aufweisen. Die dadurch erzeugten Verknüpfungen wurden in fluoreszierenden Konjugaten zum Anknüpfen eines fluoreszierenden Moleküls an ein biologisches Reagenz verwendet. Demgemäss befand sich das biologische Reagenz in einer maximierten Entfernung zur Quelle der Radikalerzeugung.
Die Maximierung der Entfernung des biologischen Reagenzes zur Quelle des Radikalerzeugers erhöhte die Zeit, welche das Radikal zurücklegen musste und steigerte deshalb den Verfall des Radikals, bevor es das biologische Reagenz erreichen und anschließend schädigen konnte. Solche querverbindenden Reagenzien schließen ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein,: heterofunktionale PEGs, die umfassen N-Hydroxysuccinidyl- (NHS) Ester der Poly(Oxyethylen)-Derivate, die eine Maleimid- oder Vinylsulfongruppe oder ähnliche elektrophile Gruppen enthalten, langkettige Formen von Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-l-carboxylat (SMCC), wie zum Beispiel Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxy-(6-amido-caproat) oder Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP), wie zum Beispiel Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido]-hexanoat; und heterofunktionale Peptidderivate.
Eine alternative Ausführungsform dieser Erfindung verwendet ein Proteinsubstrat, welches zwischen einem fluoreszierenden Molekül und einem biologischen Reagenz eingereiht wurde. Das Proteinsubstrat ist funktionalisiert, um mit den reaktiven Spezies in Wechselwirkung zu treten, so dass die reaktiven Spezies abgefangen werden, bevor sie in den Bereich des biologischen Reagenzes gelangen, dass in diesem Versuch einbezogen ist. Das führt zu einer über die Zeit gesteigerten Stabilität der Versuchsreagenzien. Ein Beispiel dieser Ausführungsform ist als Beispiel 7 dargelegt.
Solche Quencher schließen, ohne jedoch auf Quencher des Singulett-Sauerstoffs beschränkt zu sein, freie Radikale und angeregte Triplettzustände ein; Beispiele von diesen sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben. Ein bevorzugter Quencher ist das Carotenoid β-Caroten, welches Singulett-Sauerstoff, freie Radikale und angeregte Triplettzustände abfangen kann; die meisten anderen Quencher, die in den Tabellen 1 und 2 aufgelistet sind, zeigen die ermittelten Quencher-Aktivitäten. Die wasserunlöslichen Quencher im physischen Kontakt mit den Farbstoffmolekülen traten effizient in Wechselwirkung mit den reaktiven Spezies, da sie sich näher zur Quelle der Erzeugung der reaktiven Spezies befanden als das biologische Reagenz, das in den Versuch einbezogen war. Ein Beispiel dieser Ausführungsform wird als Beispiel 8 dargelegt.
Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung umfasst eine Kombination wasserlöslicher Quencher und Emulsionen von wasserunlöslichen Quenchern, die einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, Detergens-Micellen und Liposomen, mit einer Lösung, die das fluoreszierende Konjugat oder das fluoreszierende Partikelkonjugat enthielten. Beispiele dieser Ausführungsform werden als Beispiele 5 und 6 dargelegt.
Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung umfasst eine Kombination von wasserunlöslichen Quenchern, die in ein fluoreszierendes Partikel eingebaut sind, das an ein biologisches Reagenz konjugiert ist, in Kombination mit einem System, das gelösten Sauerstoff verbraucht, der in der Lösung vorliegt, welche das Konjugat enthält.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Kombination wasserlöslicher Quencher oder Emulsionen von wasserunlöslichen Quenchern in Kombination mit einem System, das gelösten Sauerstoff in einer Lösung verbraucht, die ein fluoreszierendes Konjugat enthält.
Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung umfasst eine Kombination von sowohl wasserunlöslichen Quenchern, die in das fluoreszierende Konjugatpartikel eingebaut sind, wasserlösliche Quencher oder Emulsionen oder wasserunlösliche Quencher in der Lösung, die das Konjugat enthält, zusammen mit einem System, welches gelösten Sauerstoff in der Lösung verbraucht, die das fluoreszierende Konjugat enthält.
Beispiele
Beispiel 1
Wirkung der Lichtexposition auf die Aktivität der an die fluoreszierenden Partikel gekoppelten Antikörper
Mit Anti-Troponin Antikörpern gekoppelte Partikel (Diese und alle anderen in diesem und in den folgenden Beispielen verwendeten Antikörperkonjugate, wie auch die einbezogenen besonderen fluoreszierenden Moleküle, wurden offenbart und hergestellt, wie in den U.S. Patentanmeldungen der Nummern: 08/409,298 und 08/409,825, jeweils am 23. März 1995 eingereicht; und in der U.S. Patentanmeldung der Nummer: 08/620,597, eingereicht am 22. März 1996, offenbart. Die U.S. Patentanmeldungen der Nummern: 08/409,298; 08/409,825; und 08/620,597, einschließlich aller entsprechender Stammanmeldungen, sind vollständig unter Bezugnahme hier eingeschlossen.) wurden zu 0,14 Feststoff in mit Luft gesättigten Lagerpuffern verdünnt (nachfolgend Lagerpuffer genannt, welcher die folgende Zusammensetzung aufwies: STABILCOAT (BSI, Eden Prairie, MN), 13% (Vol/Vol); Saccharose, 23 mg/ml; Rinderserum-Albumin (30%ige Lösung, Herstellergüte, Bayer Corp. Kankakee, IL), 13 mg/ml; Kaliumphosphat, 30 mM Kaliumborat, 6 mM; Natriumchlorid, 90 mM, pH 7.5), um ein Inkubationsgemisch zu ergeben und das anschließend in zwei farblose 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt wurde, eines davon wurde bei Raumlicht (Licht, das durch gewöhnliche weiße Leuchtstoffröhren bereitgestellt wurde) und das andere wurde vor Licht geschützt und beide bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Antikörperaktivität wurde durch einen immunologischen Versuch bestimmt durch Kombinieren eines Aliquots des Inkubationsgemisches, das die Antikörperkonjugate mit einem gleichen Volumen des Troponin I Versuchsreagenz enthielt (Dieses Reagenz bestand aus 6 ng/ml humanen Herz-Troponin I (Biotech International, Inc., Seattle, WA) und 2 μg/ml biotinylierten Ziegen Anti-Troponin I Peptid 3 spezifischen Antikörper (BioPacific, Emeryville, CA), welches ein komplementäres Paar mit den Anti-Troponin Antikörpern ausbildete, die an die fluoreszierenden Partikel gekoppelt waren (das heißt, ein fluoreszierendes Konjugat), in einem Versuchsreagenz-Puffer, der aus 140 mM Natriumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat, 40 g/l Rinderserum-Albumin (30%ige Lösung, Herstellergüte, Bayer Corp., Kankakee, IL), pH 7.4) besteht; die resultierende Probe wurde für 15 Minuten inkubiert und anschließend in einem immunologischen Versuchsgerät getestet, gemäß der Offenbarung in der U.S. Patentanmeldung 08/423,582 (eingereicht am 18. April 1995).
Kurz, die Probe wurde am oberen Abschnitt der diagnostischen Spur des Gerätes aufgeladen und es wurde ihr erlaubt, über die Kapillarwirkung durch die diagnostische Spur zu fließen, welche Amidin-HS aufwies, das an einer Oberfläche in einer Fangzone gebunden war. Nachdem die Probe in das Gerät geflossen war, wurde der Versuchsreagenz-Puffer im oberen Abschnitt der diagnostischen Spur aufgeladen, um ungebundene Reagenzien aus der Fangzone wegzuspülen. Die Menge an Antikörper-Konjugat, die an die Fangzone gebunden hatte, wurde quantifiziert durch Abtasten der diagnostischen Spur mit einem Fluorometer, der besteht aus einer Laserdioden-Anregungsquelle (670 nm) und einem Siliziumphotodioden-Detektor, der die Fluoreszenz bei dem Wellenlängenmaximum von 760 nm mit geeigneten optischen Filtern und geeigneter Elektronik misst, um das Fluoreszenzsignal zu erhalten. Eine Antikörperaktivitätseinheit wurde auf der Grundlage des Anstiegs der Dosis-Antwort-Kurve des Versuchs definiert. Die Versuchsaktivitäten in Tabelle 3 sind relativ zur Aktivität der Probe angegeben, welche nicht dem Licht ausgesetzt wurde (das heißt, die Dunkelkontrolle), welche als 100 angenommen wurde.
Tabelle 3
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Exposition der Antikörper-Konjugate gegenüber Licht, zu einem zeitabhängigen Verlust des Versuchssignals führt, sofern mit einer Dunkelkontrolle verglichen wird.
Beispiel 2
Wirkung des Farbstoffgehalts der Partikel auf die Lichtinduzierte Inaktivierung der an die fluoreszierenden Partikel gekoppelten Antikörper
Antikörper-Konjugate mit sowohl Anti-Troponin als auch mit Anti-CKMB Antikörpern wurden mit Latexpartikeln hergestellt, die Fluoreszenzfarbstoff in drei unterschiedlichen Konzentrationsniveaus enthalten. Die drei Partikelpräparationen wurden auf 0,14% Feststoff in mit Argon gespültem Lagerpuffer verdünnt, der 5 mM Natriumascorbat und das Glukoseoxidase-System enthielt (10 mg/ml Glukose, 10 μg/ml Glukoseoxidase (Calbiochem, San Diego) und 10 μg/ml Katalase (Calbiochem, San Diego)) und anschließend auf zwei farblose 1.5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt, eines davon wurde bei Raumlicht inkubiert und das andere wurde vor Licht geschützt.
Nach 24 Stunden wurden die Inkubationsgemische auf Aktivität durch einen immunologischen Versuch durch Kombinieren von Aliquots von jedem mit einem gleichen Volumen an Troponin/CKMB Versuchsreagenz getestet (Dieses Reagenz bestand aus jeweils 20 μg/ml humanen Herz-Troponin I (Biotech International, Inc., Seattle, WA) und CKMB (Genzyme, San Carlos, CA), 2 μg/ml biotinylierter Ziegen Anti-Troponin I Peptid 3 spezifischer Antikörper (BioPacific, Emeryville, CA) und 2 μg/ml Fluorescein-markierter Anti-CKMB Antikörper (IIL-3, IIL Inc.), welche ein komplementäres Paar mit den Anti-CKMB Antikörpern ausbildeten, die an die fluoreszierenden Partikel gekoppelt waren, in Puffer, der 140 mM Natriumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat, 40 g/l Rinderserum-Albumin (30%ige Lösung, Herstellergüte, Bayer Corp., Kankakee, IL), pH 7.4) enthielt, für zwei Minuten wurde inkubiert und das Inkubationsgemisch, wie im Beispiel 1 beschrieben, getestet. Die in diesem Beispiel verwendeten Geräte besaßen Fangzonen, die aus immobilisierten Anti-Fluorescein Antikörpern und Avidin-HS bestanden. In Tabelle 4 werden die Versuchsaktivitäten relativ zur Aktivität der Proben ausgedrückt, welche nicht dem Licht ausgesetzt wurden (das heißt, die Dunkelkontrolle), welche als 100 angenommen wurde.
Tabelle 4
Diese Ergebnisse zeigten eine direkte, positive Korrelation zwischen dem Farbstoffgehalt der Antikörper-Konjugate und dem Ausmaß der Licht-abhängigen Inaktivierung der Antikörper, die an die Partikel gekoppelt waren. Dies war sowohl in dem Troponin- als auch in dem CKMB-Antikörperversuchen zu erkennen.
Beispiel 3
Wirkung von grünem Licht auf die Aktivität der an fluoreszierende Partikel gekoppelten Antikörper
Ein Inkubationsgemisch von Anti-Troponin-Konjugaten wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben und wurde auf drei farblose 1,5 ml Zentrifugenröhrchen aufgeteilt, welche jeweils bei grünem fluoreszierendem Licht (Modell F40G, General Electrics), gewöhnlichem weißem fluoreszierendem Licht oder bei Dunkelheit inkubiert wurden. Nach 24 Stunden wurde von jedem Inkubationsgemisch eine Probe genommen und getestet, wie in Beispiel 1 beschrieben; die Ergebnisse werden in Tabelle 5 dargelegt.
Tabelle 5
Diese Ergebnisse zeigten, dass das durch das grün fluoreszierende Röhrchen emittierte Licht nicht die gleiche schädigende Wirkung auf die Antikörperaktivität ausübt, wie das beim gesamten Spektrum des weißen Lichtes beobachtet wurde. Das Maximum der Anregungswellenlänge des fluoreszierenden Farbstoffes in dem Antikörper-Konjugat ist 670 nm, welches dem roten Bereich des sichtbaren Spektrums entspricht. Das Emissionsspektrum des grünen fluoreszierenden Lichtes enthält viel weniger rotes Licht, als das des weißen fluoreszierenden Lichtes; folglich wurde die Erzeugung der Fluoreszenz während der Präparation der fluoreszierenden Konjugate verhindert.
Beispiel 4
Wirkung der Abreichung des gelösten Sauerstoffs auf die Lichtinduzierte Inaktivierung der an fluoreszierende Partikel gekoppelten Antikörper
Partikel, die mit Anti-Troponin I Antikörper gekoppelt wurden, wurden auf 0,14 Feststoff in einem mit Luft gesättigten Lagerpuffer, in einem mit Argon gespülten Lagerpuffer und in einem mit Argon gespülten Lagerpuffer, der mit 100 mM Natriumascorbat hergestellt wurde, verdünnt und in farblosen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumlicht inkubiert. Proben wurden aus den Inkubationsgemischen entnommen und, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. Die Antikörperaktivität der Konjugate in dem mit Luft gesättigten Lagerpuffer betrug 74, 19 und 12 Einheiten nach jeweils 0, 14 und 24 Stunden der Exposition gegenüber Licht. In Tabelle 6 wird für jeden Zeitpunkt die Antikörperaktivität relativ zur Aktivität der Konjugate, die in mit Luft gesättigtem Lagerpuffer aufbewahrt wurden, ausgedrückt.
Tabelle 6
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Verringerung des Spiegels an gelöstem Sauerstoff in den Inkubationsgemischen, entweder durch Spülen des Gemisches mit einem Inertgas oder durch Einbeziehen einer autooxidierbaren Verbindung in das Gemisch, das Antikörper-Konjugat vor der Licht-induzierten Inaktivierung schützten. Ein Vorteil des Einbeziehens eines Antioxidans, wie zum Beispiel Ascorbat, wird insbesondere beim längeren Zeitpunkt deutlich, wo das Ascorbat einen größeres Maß an Schutz ergab, als das einfache Spülen des Gemisches mit Argon.
Beispiel 5
Wirkung der Antioxidantien auf die Licht-induzierte Inaktivierung der an fluoreszierende Partikel gekoppelten Antikörper
Partikel, die mit Anti-Troponin I Antikörper gekoppelt wurden, wurden auf 0,14% Feststoff in mit Luft gesättigtem Lagerpuffer und in mit Argon gespültem Lagerpuffer, der mit 20 mM Ascorbat und dem Glukoseoxidase-System, der, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt wurde, verdünnt. Jedes Inkubationsgemisch wurde auf 2 farblose 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt, eines davon wurde bei Raumlicht und das andere vor Licht geschützt inkubiert. Nach 17 Stunden wurden die Gemische auf Aktivität durch einen immunologischen Versuch durch Kombinieren der Aliquots von jedem mit dem gleichen Volumen des Troponin-Versuchsreagenzes getestet, für zwei Minuten inkubiert und, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 dargelegt.
Tabelle 7
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Zugabe eines Antioxidans und eines Sauerstoff-verbrauchenden Systems zu dem Lagerpuffer, die Stabilität des Antikörper-Konjugates gegenüber der Exposition gegenüber Licht verstärkt; hier kann beobachtet werden, dass die Aktivität der Konjugate, die in Abwesenheit der Antioxidantien inkubiert wurden, sich um 85% verringerte, wohingegen die Konjugate, die in der Gegenwart eines Antioxidans und des Sauerstoff-verbrauchenden Systems inkubiert wurden, deren Aktivität behielten.
Beispiel 6
Bedingungen für das Stabilisieren der Antikörper-Konjugate
Partikel, die mit Anti-Troponin I Antikörper gekoppelt wurden, wurden auf 0,14 Feststoff in mit Argon gespültem Lagerpuffer verdünnt, der mit den Endkonzentrationen von 50 mM Natriumascorbat, 20 mM Trolox (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), 10 mM Natriumazid und 10 mg/ml Glukose hergestellt wurde. Das Inkubationsgemisch lag in zwei durchsichtigen, farblosen Glasgefäßen vor. Glukoseoxidase wurde zu den Gemischen hinzugefügt und die Gefäße wurden mit Argon gespült. Die Gefäße wurden anschließend mit einem mit einer Quetschkappe überzogenen Septum abgedichtet. Eines der Gefäße wurde in Folie gehüllt, um Licht auszuschließen, während das andere dem Licht ausgesetzt wurde. Beide Gefäße wurden in einen Drei-Hals-Rundkolben gegeben, an welchem eine Stickstoffgasleitung, eine zu einer Blasenkammer führende Abgasleitung und ein Stöpsel angeschlossen wurden. Der Kolben wurde bei Raumlicht aufbewahrt und unter einem kontinuierlichen Stickstofffluss für 3,8 Tage gehalten. Die Antikörperaktivität wurde bestimmt, wie im Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 dargelegt.
Tabelle 8
Diese Ergebnisse zeigten, dass das Herabsetzen und das Eliminieren des Sauerstoffs aus den Antikörper-Konjugaten die Licht-induzierte Inaktivierung verhindern kann. In einem zusätzlichen Experiment wurde herausgefunden, dass die Proben, die mit dem Glukoseoxidase-System, jedoch ohne die Antioxidantien Ascorbat, Trolox und Azid hergestellt wurden und unter einer Stickstoffatmosphäre aufbewahrt wurden, die gesamte Aktivität während der Exposition gegenüber Licht für 7,8 Tage aufrecht erhielten.
Beispiel 7
Wirkung einer intervenierenden Proteinhülle auf die Licht-induzierte Inaktivierung von Antikörper-Konjugaten
Partikel, die mit Anti-Troponin I Antikörper gekoppelt wurden, wurde aus Latexpartikeln hergestellt, die vor dem Koppeln der Antikörper Rinderserum-Albumin adorbiert hatten, und aus Latexkügelchen, die kein Rinderserum-Albumin erhalten hatten. Das Rinderserum-Albumin wurde von den fluoreszierenden Partikeln zu 5 mg/ml Protein und 0,5% Feststoff adsorbiert. Ungebundenes Protein wurde unter Verwendung der Gelfiltrationschromatografie abgetrennt. Der Antikörper wurde an die Proteinhülle mit SMCC und -SPDP (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) unter Verwendung gängiger Proteinkopplungsverfahren gekoppelt.
Gemische von 0,14 Feststoff dieser beiden Partikel wurden durch Verdünnen derselben in mit Luft gesättigtem Lagerpuffer hergestellt und anschließend auf zwei farblose 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt. Ein Röhrchen jeder Gruppe wurde bei Raumlicht und in der Dunkelheit inkubiert. Nach 17 Stunden wurden Proben aus jedem Röhrchen entnommen und, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 9 dargelegt.
Tabelle 9
Diese Ergebnisse zeigten, dass die mit einer intervenierenden Proteinschicht hergestellten Partikel gegenüber der Licht-induzierten Inaktivierung der Antikörper stärker widerstanden, als Partikel, denen eine Proteinschicht fehlte. Andere Proteinhüllen, welche aus Fibrinogen, Cytochrome C und Thyroglobulin bestanden, verringerten ebenfalls die Licht-induzierte Inaktivierung der Antikörper-Konjugate (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 8
Wirkung von Antioxidantien auf die Licht-induzierte Inaktivierung von Antikörpern, die an unterschiedliche fluoreszierende Partikel gekoppelt wurden
Partikel, die mit Anti-CKMB Antikörpern gekoppelt wurden, wurden aus fluoreszierenden Latizes hergestellt, die kommerziell erhalten wurden (Molecular Probes, Inc., Katalognummern L7189, L7201 und L7204) und aus einem verschiedenen, gängigen fluoreszierenden Latex, das für dieses Experiment und die anderen Experimente hierin hergestellt wurde. Gemische zu 0,14 Feststoff dieser Partikel wurden durch Verdünnen derselben entweder in mit Luft gesättigtem Lagerpuffer oder in mit Argon gespültem Lagerpuffer, der 5 mM Natriumascorbat, 10 mM Trolox, 10 mM Natriumazid, 10 mg/ml Glukose und jeweils 10 mg/ml Katalase und Glukoseoxidase enthält, hergestellt. Jedes Gemisch wurde auf zwei durchsichtige, farblose Glasgefäße aufgeteilt und die Gefäße wurden mit einem mit einer Quetschkappe überzogenem Septum abgedichtet. Die die Gemische der Antioxidantien enthaltenden Gefäße wurden mit Argon vor der Zugabe der Glukoseoxidase und dem Verschließen evakuiert. Alle Gefäße wurden in einen 3-Hals-Rundkolben gesetzt, welcher mit einer Stickstoffgasleitung, einer Abgasleitung, die zu einer Blasenkammer führt, und einem Stöpsel versehen wurde. Der Kolben wurde mit Stickstoff evakuiert, abgedichtet und Raumlicht ausgesetzt. Nach einer viertägigen Inkubation wurden Proben aus den Gefäßen entnommen und in einem immunologischen Versuch auf Antikörperaktivität getestet.
Die immunologischen Versuche wurden ausgeführt durch Kombinieren der Proben mit dem gleichen Volumen des CKMB Versuchsreagenz (Dieses Reagenz bestand aus 50 ng/ml CKMB (Genzyme, San Carlos, CA) und 2 μg/ml eines biotinylierten Anti-CKMB Antikörpers, der ein komplementäres Paar mit den Antikörpern ausbildete, die an die fluoreszierenden Partikel gekoppelt wurden, in einem Puffer, der 140 mM Natriumchlorid, 10 mM Kaliumphosphat, 40 g/l Rinderserum (30%ige Lösung, Herstellergüte, Bayer Corp., Kankakee, IL, pH 7.4) enthielt, das Reaktionsgemisch wurde für 15 Minuten inkubiert und anschließend wurde es mittels des Gerätetests, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, analysiert.
Die Versuchssignale wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrometers (Modell LS 50B, Perkin Elmer, Norwalk, CT) ermittelt und werden als relative Fluoreszenz ausgedrückt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 11 dargelegt.
Tabelle 11
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Antikörper-Konjugate, die mit einer Reihe von Fluoreszenzfarbstoffen hergestellt wurden, alle gegenüber der Licht-induzierten Inaktivierung der Antikörper empfänglich waren. Es zeigte sich außerdem, dass in jedem Fall die Inaktivierung durch Einbeziehen von Antioxidantien in den Lagerpuffer und dem Minimieren der Exposition gegenüber gelöstem Sauerstoff verringert werden konnte.
Beispiel 9
Wirkung von Licht und Antioxidantien auf die Versuchsantwort eines Antikörper-Konjugates und eines Morphin-Konjugates
Fluoreszierende Partikel, die mit Anti-Dansyl Antikörpern (Antikörper-Konjugat) oder Morphin (Morphin-Konjugat; das heißt, ein Ligandanalogon-Konjugat) gekoppelt wurden, wurden mit Antioxidantien in einem immunologischen Versuch getestet.
Die Versuchsreagenzien wurden entweder an einem im Wesentlichen dunklen Ort (bei abgeschwächtem grünen Licht) oder bei weißem Raumlicht inkubiert. Die Reagenzien schließen ein das Antikörper-Konjugat, einen Anti-Morphin Antikörper, der mit einem Peptid-Anhänger gekoppelt wurde, das Morphin-Konjugat und entweder keine Antioxidantien oder die Antioxidantien Ascorbat (200 mM nach der Rekonstitution) und Trolox (10 mM nach der Rekonstitution). Der immunologische Versuch wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, ausgeführt. Die Fangzonen an dem Gerät enthielten einen Anti-Peptid Antikörper zum Binden des Ligandanalogon-Konjugates und ein Dansyl-Derivat zum Binden des Antikörper-Konjugates.
Die Fluoreszenzsignale aus den Versuchen, die bei weißem Licht ausgeführt wurden, wurden durch die Fluoreszenzsignale aus den Versuchen, die in der Dunkelheit ausgeführt wurden, zum Erhalt der in Tabelle 12 dargelegten Versuchsantwort, geteilt. Die Ergebnisse zeigten, dass die maximale Versuchsantwort für die Geräte, die bei weißem Licht gelaufen sind, nur mit den Antioxidantien Ascorbat und Trolox erhalten wurde.
In getrennten Experimenten schützten Trolox allein und Ascorbat allein ebenso vor der Licht-induzierte Inaktivierung (Daten nicht gezeigt).
Tabelle 12
Beispiel 10
Verwendung von heterobifunktionalen Reagenzien zur Erhöhung der Entfernung für die Diffusion für reaktive Spezies in Konjugaten
Heterobifunktionale Reagenzien, die große molekulare Entfernungen aufweisen, wurden zum Herstellen fluoreszierender Konjugate verwendet.
Die dadurch erzeugten Verknüpfungen wurden zum Verbinden eines fluoreszierenden Moleküls mit einem biologischen Reagenz verwendet. Solche quervernetzenden Reagenzien schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt: heterofunktionale PEGs, die N-Hydroxysuccinidyl (NHS) Ester von Poly(oxyethylen) Derivaten umfassen, die eine Maleimid- oder eine Vinylsulfongruppe oder eine ähnliche elektrophile Gruppe enthalten; ein heterofunktionales quervernetzendes Reagenz, wie zum Beispiel ein Sulfhydryl- und Amino-reaktives heterobifunktionales quervernetzendes Reagenz; und heterofunktionale Peptidderivate. In bevorzugten Ausführungsformen können das Sulfhydryl- und das Aminoreaktive heterobifunktionale quervernetzende Reagenz langkettige Formen von SMCC oder SPDP umfassen; zum Beispiel Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxy-(6-amino-caproat) bzw. Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)-propionamido]-hexanoat. Es wird verstanden werden, dass andere, im Stand der Technik bekannte, verknüpfende Agenzien, in Übereinstimmung mit der offenbarten und hier beanspruchten Erfindung verwendet werden können.
Demgemäß befand sich das biologische Reagenz in einem Konjugat in einer maximierten Entfernung zur Quelle der Radikalerzeugung bei der Signalgruppe. Das Maximieren der Entfernung des biologischen Reagenzes zur Quelle der Radikalerzeugung erhöhte die Zeit, die das Radikal zurücklegen musste und steigerte deshalb den Verfall des Radikals, bevor es das biologische Reagenz erreichte und anschließend das biologische Reagenz abbaute oder beschädigte. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen Konjugate, die große molekulare Entfernungen zwischen -dem biologischen Reagenz und den fluoreszierenden Signalgruppen aufweisen, in Kombination mit anderen erfinderischen Ausführungsformen zum Stabilisieren der fluoreszierenden Konjugate, wie zum Beispiel ein Sauerstoff-abreicherndes System, ein Protein, ein Antioxidans oder eine Kombination davon.
Fazit
Es muss festgehalten werden, dass, wie hier und in den angefügten Ansprüchen verwendet, die singulären Formen "ein" "und" und "das" die Mehrfachformen einschließen, es sei denn, aus dem Zusammenhang ergibt es sich etwas anderes. Die Bezugnahme auf "eine Formulierung" schließt somit zum Beispiel Gemische der unterschiedlichen Formulierungen ein und die Bezugnahme auf "das Verfahren zum Behandeln" schließt die Bezugnahme auf äquivalente Schritte und Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, und so weiter ein.
Wenn nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise durch einen Fachmann, an den sich diese Erfindung richtet, verstanden werden. Obwohl jegliche Verfahren und Materialien, die gegenüber den hierin beschriebenen ähnlich bis äquivalent sind, in der Praxis oder beim Ausprobieren der Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien jetzt beschrieben.

Claims

Verfahren zum Schutz eines biologischen Reagenz in einem fluoreszierenden Partikel, welches das biologische Reagenz und ein fluoreszierendes Molekül umfasst, vor der Inaktivierung durch reaktive Spezies, die durch das fluoreszierende Molekül bei Exposition gegenüber Licht und Sauerstoff erzeugt werden, wobei das Verfahren umfasst: Suspendieren des fluoreszierenden Partikels in einer Lösung, die ein oder mehrere Agenz(ien) umfasst, welche die Inaktivierung des biologischen Reagenz durch die reaktiven Spezies verhindern, die durch das fluoreszierende Molekül erzeugt werden, wobei das (die) ein oder mehreren Agenzien) aus der Gruppe ausgewählt wird (werden), die aus einem Singulet-Sauerstoff Quencher, einem freien Radikal Quencher, einem biologischen Antioxidans und einem Sauerstofferschöpfenden System besteht, wobei das biologische Reagenz vor Inaktivierung durch die reaktiven Spezies geschützt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, das ferner die Aufnahme von einem oder mehreren Proteinen oder wasserunlöslichen Quenchern hinein in das oder auf das fluoreszierenden Partikel umfasst, welche die Inaktivierung des biologischen Reagenz durch die reaktiven Spezies verhindern, die durch das fluoreszierende Molekül erzeugt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das eine oder die mehreren Proteine eine Zwischenschicht zwischen dem fluoreszierenden Molekül und dem biologischen Reagenz bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der eine oder die mehreren wasserunlöslichen Quencher ein Antioxidans umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das Antioxidans ein Quencher eines freien Radikals oder ein Quencher von Singulet-Sauerstoff ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, wobei das fluoreszierende Molekül kovalent mit dem biologischen Reagenz verbunden ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, wobei das fluoreszierende Partikel ein natürliches Material oder ein synthetisches Material umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das natürliche Material aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Aluminiumoxid, Siliziumoxid oder einem Liposom besteht.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–8, wobei das biologische Reagenz aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Antikörper, einem Ligandenrezeptor, einem Liganden-Analogon, einer Nukleinsäure, einem Protein und einem Peptid besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Lösung eine wässrige Lösung ist, und das Agens, das die Inaktivierung des biologischen Reagenz durch die reaktiven Spezies verhindert, die durch das fluoreszierende Molekül erzeugt werden, ein wasserlösliches Antioxidans ist.
Zusammensetzung, die umfasst: ein fluoreszierendes Partikel, das ein biologisches Reagenz und ein fluoreszierendes Molekül umfasst; und ein wässriges Lösungsmittel, das ein oder mehrere Agen z ien) umfasst, welche die Inaktivierung des biologischen Reagenz durch die reaktiven Spezies verhindern, die durch das fluoreszierende Molekül erzeugt werden, wobei das eine oder die mehreren Agen z ien) aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einem Singulet-Sauerstoff Quencher, einem freien Radikal Quencher, einem biologischen Antioxidans und einem Sauerstofferschöpfenden System besteht.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, wobei das fluoreszierende Partikel ferner ein oder mehrere Proteine oder wasserunlösliche Quencher umfasst, welche die Inaktivierung des biologischen Reagenz durch die reaktiven Spezies verhindern, die durch das fluoreszierende Molekül erzeugt werden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei das eine oder mehreren Proteine eine Zwischenschicht zwischen dem fluoreszierenden Molekül und dem biologischen Reagenz bilden.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der eine oder die mehreren wasserunlöslichen Quencher ein Antioxidans umfassen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, wobei das Antioxidans ein Quencher eines freien Radikals oder ein Quencher von Singulet-Sauerstoff ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 11–15, wobei das fluoreszierende Molekül kovalent mit dem biologischen Reagenz verbunden ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 11–16, wobei das fluoreszierende Partikel ein natürliches Material oder ein synthetisches Material umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei das natürliche Material aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Aluminiumoxid, Siliziumoxid oder einem Liposom besteht.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 11–18, wobei das biologische Reagenz aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Antikörper, einem Ligandenrezeptor, einem Liganden-Analogon, einer Nukleinsäure, einem Protein und einem Peptid besteht.