DE69814639T3

DE69814639T3 - Nicht-invasive pränatale diagnose

Info

Publication number: DE69814639T3
Application number: DE69814639T
Authority: DE
Inventors: Yuk-Ming Lo; James Wainscoat
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 1997-03-04
Filing date: 1998-03-04
Publication date: 2012-09-13
Anticipated expiration: 2018-03-05
Also published as: ATE240409T1; DE69814639T2; GB9704444D0; HK1026720A1; ES2198700T3; JP4245666B2; WO1998039474A1; DK0994963T3; EP0994963B2; AU727919B2; JP2001513648A; PT994963E; CA2282793C; AU6507498A; US6258540B1; ES2198700T5; DK0994963T4; DE69814639D1; CA2282793A1; EP0994963B1

Description

Diese Erfindung betrifft pränatale Detektionsverfahren unter Anwendung nicht-invasiver Techniken. Insbesondere betrifft sie die Pränataldiagnostik durch Detektieren fötaler Nukleinsäuren im Serum oder Plasma einer maternalen Blutprobe.
Die herkömmlichen pränatalen Screening-Methoden zum Nachweis fötaler Abnormalitäten und zur Geschlechtsbestimmung verwenden üblicherweise fötale Proben, die mittels invasiver Techniken wie der Fruchtblasenpunktion und Chorionzotten-Probenentnahme erhalten werden. Diese Techniken erfordern Behutsamkeit in der Handhabung und bergen einen gewissen Grad an Risiko für die Mutter und die Schwangerschaft.
Vor kürzerem wurden Techniken zur Vorhersage von Abnormalitäten beim Fötus und möglichen Komplikationen während der Schwangerschaft entwickelt, bei denen maternale Blut- oder Serumproben verwendet werden. Zu drei häufig verwendeten Markern zählen Alpha-Fötoprotein (AFP – von fötalem Ursprung), humanes Choriongonadotropin (hCG) und Östriol, zum Screening auf Down-Syndrom und Neuralrohrdefekte. Maternales Serum wird derzeit außerdem zum biochemischen Screening auf chromosomale Aneuploidie und Neuralrohrdefekte eingesetzt. Der Übertritt kernhaltiger Zellen zwischen der Mutter und dem Fötus ist heutzutage ein wohl erkanntes Phänomen (Lo et al. 1989; Lo et al. 1996). Mit der Ausnutzung der Fötuszellen im maternalen Blut für die nicht-invasive Pränataldiagnostik (Simpson und Elias 1993) wird das mit herkömmlichen invasiven Techniken verbundene Risiko vermieden. In WO 91/08304 ist die pränatale genetische Bestimmung unter Ausnutzung der aus Fötuszellen im mütterlichen Blut erhaltenen fötalen DNA beschrieben. Bei der Anreicherung und Isolierung von Fötuszellen für die Analyse wurden beträchtliche Fortschritte gemacht (Simpson und Elias 1993; Cheung et al. 1996). Diese Techniken sind allerdings zeitaufwendig und erfordern teure Apparaturen.
In letzter Zeit bestand ein Interesse an der Verwendung von aus Plasma oder Serum stammender DNA für die Molekulardiagnostik (Mulcahy et al. 1996). Insbesondere wurde gezeigt, dass die Tumor-DNA durch Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction – PCR) im Plasma oder Serum einiger Patienten nachgewiesen werden kann (Chen et al. 1996; Nawroz et al. 1996).
In GB 2 299 166 ist eine nicht-invasive Krebsdiagnostik durch Nachweis von K-Ras- und N-Ras-Genmutationen unter Anwendung von auf PCR basierenden Techniken beschrieben.
Es wurde nun entdeckt, dass fötale DNA in maternalen Serum- oder Plasmaproben nachweisbar ist. Dies stellt einen überraschenden und unerwarteten Befund dar; bei dem maternalen Plasma handelt es sich um eben jenes Material, das von den Forschern, die die nicht-invasive Pränataldiagnostik unter Verwendung der Fötuszellen im maternalen Blut untersuchen, routinemäßig weggeschüttet wird. Die Nachweisrate liegt bei Verwendung von Serum oder Plasma viel höher als bei kernhaltiger Blutzell-DNA, die aus einem vergleichbaren Voluminen an Vollblut extrahiert wurde, was nahelegt, dass eine Anreicherung der fötalen DNA im maternalen Plasma und Serum vorliegt. Tatsächlich wurde die Konzentration der fötalen DNA im maternalen Plasma, ausgedrückt in Prozent der Gesamt-DNA, mit von 0,39% (der im Frühstadium der Schwangerschaft gemessenen niedrigsten Konzentration) bis sogar 11,4% (in der späten Schwangerschaft) gemessen, im Vergleich zu Verhältnissen von generell um 0,001% bis zu lediglich 0,025% für zelluläre Fraktionen (Hamada et al. 1993). Es ist wichtig, dass die fötale DNA kein Artefakt des Gerinnungsprozesses ist.
Mit der Erfindung wird ein Detektionsverfahren bereitgestellt, welches an einer maternalen Serum- oder Plasmaprobe von einer schwangeren Frau vorgenommen wird und welches Verfahren das Nachweisen des Vorhandenseins einer Nukleinsäure von fötalem Ursprung in der Probe umfasst, wobei die Nukleinsäure eine väterlicherseits vererbte Sequenz ist, welche die schwangere Frau nicht besitzt. Der Nachweis kann die Quantifizierung der Nukleinsäure oder Bestimmung der Sequenz der Nukleinsäure umfassen. Mit der Erfindung wird daher ein Verfahren für die Pränataldiagnostik bereitgestellt.
Der Begriff ”Pränataldiagnostik”, wie hierin verwendet, deckt die Bestimmung jeglichen maternalen oder fötalen Zustands oder Charakteristikums ab, welcher entweder zur fötalen DNA selbst oder zur Menge oder Qualität der fötalen DNA im maternalen Serum oder Plasma in Bezug steht. Dies umfasst die Geschlechtsbestimmung und den Nachweis fötaler Abnormalitäten, welche z. B. chromosomale Aneuploidien oder einfache Mutationen sein können. Ebenfalls umfasst sind die Detektion und Überwachung Schwangerschafts-bezogener Zustände, wie etwa einer Präeklampsie, welche zu über- oder unterdurchschnittlichen Mengen an fötaler DNA im maternalen Serum oder Plasma führen. Die beim Verfahren gemäß der Erfindung nachgewiesene Nukleinsäure kann von anderer Art als DNA, z. B. mRNA, sein.
Mit der Erfindung wird ein Verfahren zum Durchführen einer Pränataldiagnostik an einer maternalen Blutprobe bereitgestellt, welches Verfahren das Gewinnen einer nicht-zellulären Fraktion der Blutprobe und das Durchführen einer Nukleinsäure-Analyse an der Fraktion umfasst, um das Vorhandensein einer Nukleinsäure von fötalem Ursprung in der Probe nachzuweisen, wobei die Sequenz eine väterlicherseits vererbte Sequenz ist, welche die schwangere Frau nicht besitzt. Ein Verfahren zum Durchführen einer Pränatal-diagnose an einer maternalen Blutprobe gemäß der Erfindung kann das Entfernen aller oder im wesentlichen aller kernhaltigen und nicht-kernhaltigen Zellpopulationen aus der Blutprobe und das Unterziehen der verbliebenen Flüssigkeit einem Test auf die fötale Nukleinsäure, die einen maternalen oder fötalen Zustand oder ein Charakteristikum anzeigt, umfassen.
Ein Verfahren zur Durchführung einer Pränataldiagnose umfasst typischerweise:

(i) Gewinnen einer maternalen Blutprobe;
(ii) Auftrennen der Probe in eine zelluläre und eine nicht-zelluläre Fraktion;
(iii) Nachweisen des Vorhandenseins einer Nukleinsäure von fötalem Ursprung in der nicht-zellulären Fraktion unter Anwendung eines Detektionsverfahrens der Erfindung;
(iv) Stellen einer Diagnose auf der Basis des Vorhandenseins und/oder der Menge und/oder der Sequenz der fötalen Nukleinsäure.

Die nicht-zelluläre Fraktion, wie in Schritt (iii) verwendet, kann eine Plasmafraktion sein. Die Methode kann außerdem das Durchführen eines weiteren Schritts beinhalten, bei dem eine Gerinnung in der maternalen Probe zugelassen und das resultierende Serum in Schritt (iii) verwendet wird.
Die maternale Serum- oder Plasmaprobe stammt aus dem mütterlichen Blut. Es brauchen lediglich 10 μl des Serums oder Plasmas verwendet werden. Es mag allerdings zum Zwecke einer erhöhten Genauigkeit bevorzugt sein, größere Probenmengen zu verwenden. Das erforderliche Volumen an Probe hängt von dem nachzuweisenden Zustand oder Charakteristikum ab. In jedem Fall ist das zu entnehmende Volumen an maternalem Blut gering.
Die Präparierung des Serums oder Plasmas aus der maternalen Blutprobe wird mittels standardmäßiger Techniken vorgenommen. Das Serum oder Plasma wird dann normalerweise einem Nukleinsäure-Extraktionsverfahren unterzogen. Zu geeigneten Methoden zählen die hierin in den Beispielen beschriebenen Methoden, ebenso wie Abwandlungen dieser Methoden. Zu möglichen Alternativen zählen die von Frickhofen und Young (1991) beschriebene kontrollierte Erhitzungsmethode. Eine andere geeignete Serum- und Plasma-Extraktionsmethode ist die Proteinase-K-Behandlung, gefolgt von einer Phenol/Chloroform-Extraktion. Die Nukleinsäure-Extraktionsmethoden aus Serum- und Plasma, die das Ausreinigen von DNA oder RNA aus größeren Volumina der maternalen Probe erlauben, erhöhen die Menge an fötalem Nukleinsäure-Material für die Analyse und folglich die Genauigkeit. Auch eine Sequenz-bezogene Anreicherungsmethode könnte am maternalen Serum oder Plasma vorgenommen werden, um die fötalen Nukleinsäure-Sequenzen spezifisch anzureichern.
Üblicherweise lässt sich ein Verfahren gemäß der Erfindung vornehmen, bei dem die Probe des maternalen Serums oder Plasmas fötale DNA bei einer fraktionellen Konzentration der Gesamt-DNA von mindestens etwa 0,14%, zum Beispiel mindestens 0,39%, enthält, ohne diese einem fötalen DNA-Anreicherungsschritt zu unterziehen.
Normalerweise wird eine Amplifikation der fötalen DNA-Sequenzen in der Probe vorgenommen. Dazu können standardmäßige Nukleinsäure-Amplifikationssysteme einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), der Ligase-Kettenreaktion, der Nukleinsäuresequenz-bezogenen Amplifikation (NASBA), verzweigter DNA-Methoden usw. eingesetzt werden. Bevorzugte Amplifikationsmethoden beziehen die PCR ein. Typischerweise wird für die Amplifikation mindestens ein fötaler Sequenzspezifischer Oligonukleotid-Primer verwendet. Generell kann die Nukleinsäure mittels einer Sequenz-spezifischen Sonde nachgewiesen werden.
Die Methode gemäß der Erfindung kann besonders zur Geschlechtsbestimmung nützlich sein, die durch Nachweisen des Vorhandenseins eines Y-Chromosoms erfolgt. Das Y-Chromosom lässt sich durch Nachweisen des Vorhandenseins einer fötalen Nukeinsäure-Sequenz vom Y-Chromosom detektieren. Die Y-Chromosom-Sequenz kann vom DYS14-Locus oder vom SRY-Gen stammen. Hierin wird gezeigt, dass unter Verwendung von lediglich 10 μl an Plasma oder Serum eine Nachweisrate von 80% für Plasma und 70% für Serum erreicht werden kann. Es wurde gezeigt, dass die Verwendung von weniger als 1 ml des maternalen Plasmas oder Serums eine zu 100% genaue Nachweisrate erbringt.
Das Verfahren der Erfindung kann auch zum Nachweisen des Vorhandenseins einer fötalen Nukleinsäure von einem väterlicherseits vererbten Nicht-Y-Chromosom verwendet werden, für den Nachweis jeglicher väterlicherseits vererbter Sequenzen, die die Mutter nicht besitzt und die z. B. Gene sein können, die dem Fötus einen Krankheits-Phänotyp verleihen oder die ein Blutantigen-Gen sein können, z. B. das Rhesus-D-Gen. Zu Beispielen zählen:

a) Bestimmung des fötalen Rhesus-D-Status bei Rhesus-negativen Müttern (Lo et al. 1993). Dies ist möglich, da Rhesus-D-positive Individuen das Rhesus-D-Gen besitzen, welches in Rhesus-D-Gensequenzen im Plasma und Serum eines Rhesus-D-negativen Individuums abwesend ist. Daher ist der Nachweis von Rhesus-D-Gensequenzen im Plasma und Serum einer Rhesus-D-negativen Mutter indikativ für das Vorhandensein eines Rhesus-D-positiven Fötus. Dieser Ansatz kann auch für den Nachweis fötaler Rhesus-D-mRNA in maternalem Plasma und Serum angewendet werden.
b) Hämoglobinopathien (Camaschella et al. 1990). Über 450 verschiedene Mutationen im Betaglobin-Gen sind dafür bekannt, dass sie Beta-Thalassämie verursachen. Vorausgesetzt, dass der Vater und die Mutter unterschiedliche Mutationen tragen, kann die paternale Mutation als ein Amplifikationsziel im maternalen Plasma und Serum genützt werden, um das Risiko zu beurteilen, dass der Fötus betroffen sein kann.
c) Paternal vererbte DNA-Polymorphismen oder Mutationen. Auf entweder einem Y- oder einem Nicht-Y-Chromosom vorhandene paternal vererbte DNA-Polymorphismen und Mutationen können im mütterlichen Plasma oder Serum nachgewiesen werden, um das Risiko mittels Kopplungsanalyse zu bewerten, dass der Fötus von einer bestimmten Krankheit betroffen ist. Weiterhin kann diese Art von Analyse zur Bestimmung des Vorhandenseins fötaler Nukleinsäure in einer bestimmten maternalen Plasma- oder Serumprobe vor einer diagnostischen Analyse wie der Geschlechtsbestimmung angewendet werden. Diese Anwendung erfordert die vorherige Genotypisierung des Vaters und der Mutter unter Verwendung eines Panels polymorpher Marker, woraufhin ein Allel zum Nachweis ausgewählt wird, welches im Vater vorhanden, in der Mutter jedoch abwesend ist.

Die auf Plasma oder Serum basierende nicht-invasive Pränataldiagnose-Methode gemäß der Erfindung kann zum Screening auf Down-Syndrom und andere chromosomale Aneuploidien angewendet werden. Zwei mögliche Wege, auf denen dies erfolgen kann, sind die folgenden:

a) Es wurde festgestellt, dass bei Schwangerschaften mit Föten mit chromosomalen Aneuploidien, z. B. Down-Syndrom, die Menge an im mütterlichen Blut zirkulierenden fötalen Zellen höher ist als bei Schwangerschaften mit normalen Föten (Bianchi et al. 1996). Auf die hierin beschriebene überraschende Entdeckung hin, dass fötale DNA im maternalen Plasma und Serum vorhanden ist, wurde außerdem gezeigt, dass die Menge an fötaler DNA im maternalen Plasma und Serum bei Schwangerschaften, bei denen der Fötus eine chromosomale Aneuploidie zeigt, höher ist als bei normalen Schwangerschaften. Ein quantitativer Nachweis der fötalen Nukleinsäure im maternalen Plasma oder Serum, z. B. ein quantitativer PCR-Assay, kann zum Screening von schwangeren Frauen auf chromosomale Aneuploidien eingesetzt werden.
b) Eine zweite Methode bezieht die Quantifizierung fötaler DNA-Marker auf unterschiedlichen Chromosomen ein. Zum Beispiel ist bei einem vom Down-Syndrom betroffenen Fötus die absolute Menge an fötaler DNA, die von Chromosom 21 stammt, in jedem Fall größer als die von den anderen Chromosomen. Die jüngste Entwicklung der sehr exakten quantitativen PCR-Techniken, wie zum Beispiel die quantitative Real-Time-PCR (Heid et al. 1996), erleichtert diese Art von Analyse.

Eine andere Anwendung der exakten Quantifizierung der fötalen Nukleinsäuremengen im maternalen Serum oder Plasma besteht in der molekularen Überwachung bestimmter Plazenta-Pathologien, wie etwa der Präeklampsie. Die Konzentration der fötalen DNA im maternalen Serum und Plasma ist bei Präeklampsie erhöht. Dies liegt vermutlich an der aufgetretenen Plazentabeschädigung.
Demgemäß kann ein Verfahren gemäß der Erfindung die Bestimmung der Konzentration einer fötalen Nukleinsäure-Sequenz im maternalen Serum oder Plasma umfassen, wobei die Nukleinsäure eine väterlicherseits vererbte Sequenz ist, welche die schwangere Frau nicht besitzt. Die Konzentration der Nukleinsäure kann mittels quantitativer PCR bestimmt werden. Diese Verfahren der Erfindung können zum Nachweis eines maternalen oder fötalen Zustandes eingesetzt werden, bei dem die Menge an fötaler DNA im maternalen Serum oder Plasma höher oder niedriger als normal ist, oder bei dem das Muster der Abweichung der fötalen DNA-Konzentration im maternalen Serum oder Plasma zu verschiedenen Gestationsstadien von normal verschieden ist. Zum Beispiel können Präeklampsie und fötale chromosomale Aneuploidie mittels dieser Verfahren nachgewiesen werden.
Es wird erwartet, dass die Einbeziehung der hierin beschriebenen, auf Nukleinsäure basierenden Diagnoseverfahren in existierende pränatale Screening-Programme möglich sein wird. Die Geschlechtsbestimmung wurde bei Schwangerschaften von 7 bis 40-wöchiger Gestation erfolgreich vorgenommen.
Bei den Figuren im Anhang zeigt:
1 eine erhöhte fötale DNA-Menge bei aneuploiden Schwangerschaften im Vergleich zu Kontroll-Schwangerschaften;
2 eine erhöhte fötale DNA-Menge bei Präeklampsie im Vergleich zu Kontroll-Schwangerschaften;
3 eine Amplifikationskurve und Schwellenzyklus für die quantitative Real-Time-PCR;
4 fötale DNA-Konzentrationen in maternalen Proben für eine Reihe von Individuen mit unterschiedlichen Gestationsstadien.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Analyse der fötalen DNA zur Geschlechtsbestimmung Patienten
Schwangere Frauen, die das Nuffield Department of Obstetrics & Gynaecology, John Radcliffe Hospital, Oxford, aufsuchten, wurden vor der Fruchtblasenpunktion oder Geburt rekrutiert. Die Genehmigung der Ethikkommission für das Projekt wurde vom Central Oxfordshire Research Ethics Commitee erhalten. Die Patientenerklärung wurde in jedem Falle eingeholt. 5 bis 10 ml maternales peripheres Blut wurden in ein EDTA enthaltendes und ein leeres Röhrchen eingebracht. Von Frauen, die einer Fruchtwasserpunktion unterzogen wurden, wurde maternales Blut immer vor der Prozedur und daraufhin 10 ml Fruchtwasser für die fötale Geschlechtsbestimmung entnommen. Bei Frauen, die direkt vor der Geburt rekrutiert wurden, wurde das Geschlecht des Kindes zum Zeitpunkt der Geburt festgehalten. Außerdem wurden Kontroll-Blutproben von 10 nicht-schwangeren weiblichen Personen erhalten, wobei die weitere Probenbehandlung dieselbe war wie bei den von den schwangeren Personen erhaltenen Proben.
Präparierung der Proben
Die maternalen Blutproben wurden 1 bis 3 Stunden nach Venenpunktion verarbeitet. Die Blutproben wurden bei 3000 × g zentrifugiert und das Plasma und Serum vorsichtig aus den EDTA-haltigen bzw. leeren Röhrchen entfernt und in leere Polypropylenröhrchen übertragen. Es wurde sehr darauf geachtet, dass die Leukozytenmanschette oder der Blutkuchen unbeeinträchtigt blieben, wenn die Plasma- bzw. Serumproben entnommen wurden. Im Anschluss an die Entnahme der Plasmaproben wurden die roten Blutkörperchen und die Leukozytenmanschette für die DNA-Extraktion unter Verwendung eines Neukleon DNA-Extraktions-Kit (Scotlabs, Strathclyde, Schottland, UK) sichergestellt. Die Plasma- und Serum-proben wurden einer zweiten Zentrifugation bei 3000 × g unterzogen und die nochmals zentrifugierten Plasma- und Serumproben in frische Polypropylenröhrchen eingebracht. Die Proben wurden bei –20°C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.
DNA-Extraktion aus den Plasma- und Serumproben
Die Plasma- und Serumproben wurden für die PCR unter Anwendung einer Modifikation der Methode von Emanuel und Pestka (1993) verarbeitet. Kurz gesagt wurden 200 μl Plasma oder Serum in ein 0,5 ml-Eppendorf-Röhrchen eingebracht. Die Probe wurde bei 99°C für 5 Minuten auf einem Heizblock erhitzt. Die erhitzte Probe wurde dann bei Maximalgeschwindigkeit unter Verwendung einer Mikrozentri-fuge zentrifugiert. Der klare Überstand wurde daraufhin entnommen und 10 μl davon für die PCR verwendet.
DNA-Extraktion aus dem Fruchtwasser
Die Fruchtwasserproben wurden für die PCR unter Anwendung der Methode von Rebello et al. (1991) verarbeitet. Einhundert μl Fruchtwasser wurden in ein 0,5 ml-Eppendorf-Röhrchen eingebracht und mit einem gleichen Volumen von 10% Chelex-100 (Bio-Rad) gemischt. Nach Zugabe von 20 μl Mineralöl zur Verhinderung einer Verdampfung wurde das Röhrchen bei 56°C für 30 Minuten auf einem Heizblock inkubiert. Dann wurde das Röhrchen kurz verwirbelt und bei 99°C für 20 Minuten inkubiert. Das behandelte Fruchtwasser wurde bei 4°C bis zur PCR gelagert, wobei dann 10 μl für eine 100 μl-Reaktion verwendet wurden.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde im wesentlichen wie beschrieben (Saiki et al. 1988) unter Verwendung der aus einem GeneAMP DNA Amplifikation Kit (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA) erhaltenen Reagenzien durchgeführt. Der Nachweis der Y-spezifischen Fötussequenz aus dem maternalen Plasma, Serum und zellulären DNA wurde wie beschrieben unter Verwendung der Primer Y1.7 und Y1.8 ausgeführt, die zur Amplifikation einer einzigen Kopie der Y-Sequenz (DYS14) ausgelegt waren (Lo et al. 1990). Die Sequenz von Y1.7 ist 5' CAT CCA GAG CGT CCC TGG CTT 3' [SEQ ID NR: 1], und die von Y1.8 ist 5' CTT TCC ACA GCC ACA TTT GTC 3' [SEQ ID NR. 2]. Das Y-spezifische Produkt betrug 198 bp. Sechzig Zyklen einer Hot Start-PCR unter Anwendung der Ampliwax-Technologie wurden an 10 μl maternalem Plasma oder Serum oder 10 ng maternaler kernhaltiger Blutzell-DNA angewendet (Denaturierungsschritt bei 94°C für 1 Minute und ein kombinierter Wiedervereinigungs/Extensionsschritt bei 57°C für 1 Minute). Vierzig Zyklen wurden zur Amplifikation des Fruchtwassers angewendet. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese und Ethidiumbromid-Anfärbung analysiert. Die PCR-Ergebnisse wurden punktbewertet, bevor der untersuchenden Person das Geschlecht des Fötus offenbart wurde.
Ergebnisse
Empfindlichkeit des PCR-Assay
Es wurden Reihenverdünnungen männlicher genomischer DNA in 1 μg weiblicher genomischer DNA vorgenommen und mittels des Y-PCR-Systems unter Anwendung von 60 Amplifikationszyklen amplifiziert. Positive Signale wurden bis zur 100.000-fachen Verdünnung, d. h. etwa dem Äquivalent einer einzigen männlichen Zelle, detektiert.
Amplifikation der fötalen DNA-Sequenz aus maternalem Plasma und Serum Maternale Plasma- und Serumproben wurden von 43 schwangeren Frauen mit Gestationsdauern von 12 bis 40 Wochen genommen. Es handelte sich um 30 männliche Föten und 13 weibliche Föten. Von den 30, mit männlichen Föten schwangeren Frauen wurden V-positive Signale bei 24 Plasmaproben und 21 Serumproben detektiert, wenn 10 μl der jeweiligen Proben für die PCR verwendet wurden. Wurde kernhaltige Blutzell-DNA für die Y-PCR verwendet, so wurden positive Signale lediglich bei 5 der 30 Fälle detektiert. Keine der 13, mit weiblichen Föten schwangeren Frauen und keine der 10 nicht-schwangeren weiblichen Kontrollpersonen ergab ein positives V-Signal, wenn entweder Plasma, Serum oder zelluläre DNA amplifiziert wurde. Folglich ist die Genauigkeit dieser Methode, selbst mit Serum/Plasmaproben von lediglich 10 μl, sehr hoch, und vor allem hoch genug, um nützlich zu sein. Es ist offensichtlich, dass die Genauigkeit auf 100% oder nahe 100% verbessert werden kann, wenn zum Beispiel größere Volumina an Serum oder Plasma eingesetzt werden.
Beispiel 2
Quantitative Analyse der fötalen DNA in maternalem Serum bei aneuploiden Schwangerschaften
Das pränatale Screening und die Diagnose fötaler chromosomaler Aneuploidien stellt einen wichtigen Teil der modernen obstetrischen Vorsorge dar. Aufgrund der mit den invasiven Verfahren wie der Fruchtblasenpunktion verbundenen Risiken und der Impraktikabilität der Durchführung von Screenings mit invasiven Methoden wurden der Entwicklung nicht-invasiver Screening-Methoden auf fötale chromosomale Aneuploidien große Anstrengungen gewidmet. Die beiden nicht-invasiven Hauptmethoden, die entwickelt wurden, sind das biochemische Screening von maternalem Serum und die Ultraschalluntersuchung der Nacken-Lichtdurchlässigkeit. Diese Methoden sind sowohl mit signifikant falsch-positiven als auch falsch-negativen Raten verbunden.
Der Nachweis fötaler kernhaltiger Zellen im mütterlichen Kreislauf bietet eine neue Quelle an fötalem Material für die nicht-invasive Diagnose fötaler chromosomaler Aneuploidien (Simpson et al. 1993). Unter Anwendung fötaler kernhaltiger Zell-Anreicherungsprotokolle haben verschiedene Gruppen den Nachweis aus maternalem Blut isolierter aneuploider kernhaltiger Fötuszellen berichtet (Elias et al. 1992; Bianchi et al. 1992). Vor kurzem wurde gezeigt, dass eine erhöhte Zahl kernhaltiger Fötuszellen im mütterlichen Blutkreislauf vorliegt, wenn der Fötus an einer chromosomalen Aneuploidie leidet (Bianchi et al. 1997).
Patientenproben
Blutproben von schwangeren Frauen, die sich dem Pränataltest unterzogen, wurden vor jeglichem invasiven Verfahren entnommen. Der fötale Karyotyp wurde durch zytogenetische Analyse des Fruchtwassers oder Chorionzotten-Proben bestätigt. Die Genehmigung wurde vom Research Ethics Committee of The Chinese University of Hong Kong eingeholt. Die Blutproben wurden in leeren Röhrchen gesammelt. Auf die Blutgerinnung hin wurden die Proben bei 3000 × g zentrifugiert und das Serum vorsichtig entfernt und in leere Polypropylen-Röhrchen übertragen. Die Proben wurden bei –70°C oder –20°C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.
DNA-Extraktion aus Plasma- und Serumproben
Die DNA aus Serumproben wurde unter Verwendung eines QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) unter Zugrundelegung des ”Blut- und Körperflüssig-keits-Protokolls”, wie vom Hersteller empfohlen, extrahiert (Chen et al. 1996). Vierhundert bis 800 μl der Plasma/Serumprobe wurden für die DNA-Extraktion pro Säule verwendet. Die exakt verwendete Menge wurde dokumentiert, um die Berechnung der Ziel-DNA-Konzentration zu ermöglichen.
Quantitative Real-Time-PCR
Die theoretischen und praktischen Aspekte der quantitativen Real-Time-PCR wurden zuvor beschrieben von Heid et al. (1996). Die quantitative Real-Time-PCR-Analyse wurde unter Verwendung eines PE Applied Biosystems 7700 Sequenzdetektors (Foster City, CA, USA) vorgenommen, bei welchem es sich im wesentlichen um einen kombinierten Wärmzyklierer/Fluoreszenzdetektor mit einer optischen Überwachungsmöglichkeit des Ablaufs einzelner PCR-Reaktionen handelt. Das verwendete Amplifikations- und Produkt-Berichtsystem basiert auf dem 5'-Nuklease-Assay (Holland et al. 1991) (der von Perkin-Elmer vermarktete TaqMan-Assay). In diesem System ist, abgesehen von den beiden Amplifikations-Primern wie bei der herkömmlichen PCR, eine zweifach markierte fluorogene Hybridisations-Sonde enthalten (Lee et al. 1993; Livak et al. 1995). Ein Fluoreszenzfarbstoff dient als ein Reporter (FAM, d. h. 6-Carboxyfluoreszein), dessen Emissionsspektrum durch einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff (TAMRA, d. h. 6-Carboxytetramethylrhodamin) gelöscht wird. Während der Extensionsphase der PCR spaltet die 5' nach 3'-Exonuklease-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase den Reporter von der Sonde und setzt ihn so vom Löscher frei, was zu einem Anstieg der Fluoreszenzemission bei 518 nm führt. Der PE Applied Biosystems 7700 Sequenzdetektor ist in der Lage, die Fluoreszenz-spektren der 96-Amplifikationswells während der DNA-Amplifikation kontinuierlich zu messen, wobei die Daten auf einem Macintosh-Computer (Apple Computer, Cupertino, CA, USA) verarbeitet werden.
Das SRY-TaqMan-System bestand aus den Amplifikations-Primern SRY-109F, 5'-TGG CGA TTA AGT CAA ATT CGC-3' [SEQ ID NR. 3]; SRY-245R, 5'-CCC CCT AGT ACC CTG ACA ATG TAT T-3' [SEQ ID NR. 4]; und einer zweifach markierten fluoreszenten TaqMan-Sonde SRY-142T, 5'-(FAM)AGC AGT AGA GCA GTC AGG GAG GCA GA(TAMRA)-3' [SEQ ID NR. 5]. Primer/Sonden-Kombinationen wurden unter Anwendung der Primer-Express-Software (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) entworfen. Die Sequenzdaten für das SRY-Gen wurden von der GenBank Sequence Database (Zugriffsnummer L08063) erhalten.
Die TaqMan-Amplifiktionsreaktionen wurden in einem Reaktionsvolumen von 50 μl unter Verwendung der in einem TaqMan PCR Core Reagent Kit (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) bereitgestellten Komponenten (außer TaqMan-Sonde und Amplifikations-Primern) vorbereitet. Die SRY-TaqMan-Sonde wurde durch PE Applied Biosystems kundenspezifisch synthetisiert. Die PCR-Primer wurden durch Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) synthetisiert. Jede Reaktion enthielt 5 μl an 10X Puffer A, 300 nM jedes Amplifikations-Primers, 100 nM der SRY-TaqMan-Sonde, 4 mM MgCl₂, 200 μM sowohl von dATP, dCTP und dGTP, 400 μM dUTP, 1,25 Einheiten AmpliTaq Gold und 0,5 Einheiten AmpErase-Uracil-N-Glykosylase. Fünf bis zehn μl der extrahierten Serum-DNA wurden zur Amplifikation verwendet. Die exakt verwendete Menge wurde zur anschließenden Berechnung der Konzentration aufgezeichnet. Die DNA-Amplifikationen wurden in 96-Well-Reaktionsplatten durchgeführt, die durch den Hersteller zur Vermeidung von Lichtreflexion mattiert und unter Verwendung von zur Vermeidung von Lichtstreuung gestalteten Deckeln verschlossen worden waren (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA). Jede Probe wurde im Duplikat analysiert. Eine Kalibrierungskurve wurde parallel und im Duplikat mit jeder Analyse aufgezeichnet. Der Umwandlungsfaktor von 6,6 pg DNA pro Zelle wurde zum Ausdrücken der Ergebnisse in Kopienzahlen verwendet.
Die Wärmezyklierung wurde mit einer 2-minütigen Inkubation bei 50°C eingeleitet, um die Uracil-N-Glykosylase zu aktivieren, gefolgt von einem ersten Denaturierungsschritt von 10 Minuten bei 95°C. Dann erfolgten 40 Zyklen von 95°C für 15 Sek. und 60°C für 1 Minute.
Die durch den 7700 Sequenzdetektor gesammelten und im Macintosh-Computer gespeicherten Amplifikationsdaten wurden dann unter Verwendung der Sequence Detection System-(SDS)-Software, entwickelt von PE Applied Biosystems, analysiert. Die mittlere Menge jedes Duplikats wurde der weiteren Berechnung der Konzentration zugrundegelegt. Die in Kopien/ml ausgedrückte Konzentration wurde unter Zugrundelegung der folgenden Gleichung errechnet:
worin C = Zielkonzentration im Plasma oder Serum (Kopien/ml);
Q = Zielmenge (Kopien), wie mittels Sequenzdetektor in einer PCR bestimmt;
V_DNA = Gesamtvolumen der im Anschluss an die Extraktion erhaltenen DNA, typischerweise 50 μl pro Qiagen-Extraktion;
V_PCR = Volumen der für die PCR verwendeten DNA-Lösung, typischerweise 5–10 μl
V_ext = Volumen des extrahierten Plasma/Serum, typischerweise 400–800 μl
Kontaminationsverhütende Maßnahmen
Strikte Vorsichtsmaßnahmen zur Verhütung einer PCR-Kontamination wurden getroffen (Kwok et al. 1989). Für alle Flüssigkeitsbehandlungen wurden Aerosolresistente Pipettenspitzen verwendet. Separate Flächen wurden für die Anordnung der Amplifikationsreaktionen, die Zugabe der DNA-Template und die Ausführung der Amplifikationsreaktionen verwendet. Der 7700 Sequenzdetektor bot dadurch ein besonders hohes Maß an Schutz, dass sich durch sein optisches Detektionssystem das Erfordernis erübrigte, die Reaktionsröhrchen nach Abschluss der Amplifikationsreaktionen wieder zu öffnen, was die Wahrscheinlichkeit einer Übertragungskontamination minimierte. Außerdem umfasste der TaqMan-Assay auch eine weitere kontaminationsverhütende Maßnahme in Form einer Präamplifikations-Behandlung unter Verwendung Uracil-N-Glykosylase, welche Uracil-haltige PCR-Produkte zerstörte (Longo et al. 1990). Multiple negative Wasser-Blindproben wurden in jede Analyse einbezogen.
Ergebnisse
Entwicklung der quantitativen Real-Time-PCR
Um den dynamischen Bereich der quantitativen Real-Time-PCR zu bestimmen, wurden Reihenverdünnungen männlicher DNA in Wasser vorgenommen, bestehend im DNA-Äquivalent von 1000 Zellen bis 1 Zelle, und einer Analyse mittels des SRY-TaqMan-Systems unterzogen. Je geringer die Zahl der Zielmoleküle, um so mehr Amplifikationszyklen waren erforderlich, um eine bestimmte Menge an Reporter-Molekülen zu erzeugen. Das System war empfindlich genug, um das DNA-Äquivalent von einer einzigen Zielzelle zu detektieren.
Ein Parameter, bezeichnet als Schwellenzyklus (C_T), konnte definiert werden, der auf 10 Standardabweichungen über die mittlere Ausgangslinien-Fluoreszenz, wie aus Zyklen 1 bis 15 errechnet, festgelegt wurde und proportional zur für die Amplifikation verwendeten Ausgangsziel-Kopienzahl war (Heid et al. 1996). Ein Diagramm des Schwellenzyklus (C_T) gegenüber der zugeführten Zielmenge, aufgetragen auf eine übliche Log-Skala, wies den großen dynamischen Bereich und die Genauigkeit der quantitativen Real-Time-PCR nach.
Das quantitative Real-Time-SRY-System war unempfindlich gegenüber dem Vorhandensein eines Hintergrunds an weiblicher DNA von 0 bis 12.800 weiblichen Genom-Äquivalenten. Dies vereinfachte die Anwendung dieses Systems in starkem Maße, da keine getrennten Kalibrationskurven für die verschiedenen Fälle aufgrund des Vorhandenseins unterschiedlicher Konzentrationen an fötaler und maternaler DNA erstellt werden mussten.
Quantitative Analyse des fötalen SRY-Gens aus maternalem Serum von aneuploiden und Kontroll-Schwangerschaften
Die quantitative Real-Time-SRY-PCR wurde für von Frauen extrahierte Serum-DNA durchgeführt, die aneuploide und normale Föten austrugen. Die Daten für die einzelnen Fälle sind in 1 diagrammatisch gezeigt. Die fötale DNA-Konzentration war bei aneuploiden Schwangerschaften höher als bei den Kontroll-Schwangerschaften (Mann-Whitney-U-Test, p = 0,006).
Erörterung
In dieser Studie weisen wir nach, dass die Konzentration der fötalen DNA im maternalen Serum bei aneuploiden Schwangerschaften erhöht ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die fötale DNA-Quantifizierung das Potential zur Verwendung als ein neuer Screening-Marker für fötale chromosomale Aneuploidien aufweist. Eine Populations-bezogene Studie in großem Maßstab konnte zur Entwicklung von Grenzwerten für Screening-Zwecke vorgenommen werden. Die Untersuchung der Korrelation der fötalen DNA-Konzentration mit den anderen biochemischen Markern wäre ebenfalls für ein biochemisches maternales Serum-Screening nützlich.
Der oder die Mechanismen, durch die erhöhte Mengen an fötaler DNA bei aneuploiden Schwangerschaften in den mütterlichen Kreislauf freigesetzt werden, erfordern weitere Untersuchungen. Eine Möglichkeit betrifft die erhöhte Anzahl an fötalen kernhaltigen Zellen, die bei aneuploiden Schwangerschaften in das mütterliche Blut freigesetzt werden (Bianchi et al. 1997). Ein anderer möglicher Mechanismus kann ein erhöhter Zelltod oder Umsatz sein, was mit chromosomalen Aneuploidien in Verbindung stehen kann.
Beispiel 3
Nicht-invasive pränatale Bestimmung des fötalen RhD-Status aus dem Plasma RhD-negativer schwangerer Frauen
Einführung
Das Rhesus-Blutgruppensystem ist bei Transfusionen und in der klinischen Medizin von Bedeutung, zumal es bei hämolytischen Erkrankungen von Neugeborenen, Transfusionsreaktionen und autoimmunhämolytischer Anämie eine Rolle spielt. Trotz der weit verbreiteten Anwendung einer Rhesus-Immunglobulin-Prophylaxe bei Rhesus-D-(RhD)-negativen Müttern treten noch immer Rhesus-Isoimmunisierungen auf. In jenen Fällen, bei denen der Vater für das RhD-Gen heterozygot ist, besteht eine 50/50%-ige Chance, dass der Fötus RhD-positiv oder aber RhD-negativ ist. Die pränatale Bestimmung des fötalen RhD-Status ist in diesen Fällen von klinischem Nutzen, da keine weiteren pränatalen invasiven Tests oder therapeutischen Maßnahmen erforderlich sind, wenn der Fötus als RhD-negativ nachgewiesen ist.
Fortschritte in Richtung auf dieses Ziel wurden in letzter Zeit durch das Klonieren des humanen RhD-Gens (Le Van Kim et al. 1992) und den Nachweis möglich, dass RhD-negativen Individuen das RhD-Gen fehlt (Colin et al. 1991). Die pränatale Bestimmung des fötalen RhD-Status wird unter Anwendung von auf PCR basierenden Techniken an Fruchtwasserproben vorgenommen (Bennett et al. 1993).
Eine Reihe von Forschungsgruppen hat außerdem die Verwendbarkeit fötaler Zellen im maternalen Blut zur Bestimmung des fötalen RhD-Status untersucht (Lo et al. 1993). Das Hauptproblem bei diesem Ansatz besteht darin, dass das System ohne Anreicherung von Fötuszellen oder Isolationsverfahren nicht zuverlässig genug ist, wie durch die hohen falsch-positiven und falsch-negativen Raten bei nicht-angereicherten Proben nachgewiesen. Die Anreicherungs- oder Isolationsverfahren der Fötuszellen sind aber ermüdend und kostspielig in der Durchführung (Geifman-Holtzman et al. 1996; Sekizawa et al. 1996).
Unsere Entdeckung des Vorhandenseins von fötaler DNA in maternalem Plasma und Serum bietet einen neuen Ansatz für die nicht-invasive Pränataldiagnostik.
Materialien und Methoden
Patienten
Schwangere Frauen, die im Nuffield Department of Obstetrics & Gynaecology in Behandlung waren, wurden mit einer Einverständniserklärung rekrutiert. Die Genehmigung des Projekts wurde vom Central Oxfordshire Research Ethics Committee eingeholt. Frauen im zweiten Drittel der Schwangerschaft wurden direkt vor der Fruchtblasenpunktion rekrutiert. Die Blutproben wurden vor jeglichem invasiven Verfahren entnommen. Es wurden auch zehn ml Fruchtwasser für die fötale RhD-Genotypisierung entnommen. Frauen im dritten Drittel der Schwanger-schaft wurden direkt vor der Entbindung rekrutiert. Eine Probe des Nabelschnurbluts wurde nach der Entbindung zur Bestimmung des fötalen RhD-Status mittels serologischer Methoden genommen.
Präparierung der Proben
Die Blutproben wurden in EDTA enthaltende Röhrchen eingebracht. Die Proben wurden bei 3000 × g zentrifugiert und das Plasma vorsichtig entfernt und in leere Polypropylen-Röhrchen übertragen. Es wurde große Vorsicht walten gelassen, um sicherzugehen, dass der Leukozytenmantel nicht beschädigt wurde. Die Proben des Leuzkozytenmantels wurden bei –20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Die Plasmaproben wurden dann nochmals bei 3000 × g zentrifugiert, und das Plasma wurde wiederum vorsichtig entfernt und in einen frischen Satz leerer Polypropylenröhrchen übertragen. Die Proben wurden bei –20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.
DNA-Extraktion aus Plasma- und Serumproben
Die DNA aus Plasma- und Leukozytenmantel-Proben wurde unter Verwendung eines QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) unter Anwendung des ”Blut- und Körperflüssigkeits-Protokolls”, wie vom Hersteller empfohlen, extrahiert (Cher et al. 1996). Achthundert μl der Plasmaprobe und 200 μl der Leukozytenmantel-Probe pro Säule wurden für die DNA-Extraktion verwendet.
Quantitative Real-Time-PCR
Die quantitative Real-Time-PCR-Analyse wurde wie in Beispiel 2 beschrieben mit den folgenden Modifikationen vorgenommen.
Das RhD-TaqMan-System bestand aus den Amplifikations-Primern RD-A: 5'-CCT CTC ACT GTT GCC TGC ATT-3' [SEQ ID NR: 6]; RD-B: 5'-AGT GCC TGC GCG AAC ATT-3' [SEQ ID NR: 7]; und einer zweifach markierten fluoreszenten TaqMan-Sonde RD-T: 5'-(FAM)TAC GTG AGA AAC GCT CAT GAC AGC AAA GTC T(TAMRA)-3' [SEQ ID NR: 8]. Primer/Sonden-Kombinationen wurden unter Verwendung der Primer-Express-Software (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) konstruiert. Die Sequenzdaten für das RhD-Gen waren wie zuvor beschrieben (Le Van Kim et al. 1992).
Das Betaglobin-TaqMan-System bestand aus den Amplifikations-Primern Betaglobin-354F: 5'-GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG A-3' [SEQ ID NR: 9]; Betaglobin-455R: 5'-CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG-3'; und einer zweifach markierten fluoreszenten TaqMan-Sonde Betaglobin-402T: 5'-(FAM)AAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GG(TAMRA)-3' [SEQ ID NR: 10]. Die Primer/Sonden-Kombinationen wurden unter Verwendung der Primer-Express-Software (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) konstruiert. Die Sequenzdaten wurden von der GenBank Sequence Datebase: Zugriffsnummer U01317, erhalten.
Ergebnisse
Entwicklung der Real-Time-TaqMan-PCR
Der Real-Time-Sequenzdetektor ist zur Messung der Fluoreszenzintensität der freigesetzten Reporter-Moleküle Zyklus für Zyklus in der Lage. Ein Parameter, bezeichnet als Schwellenzyklus (C_T), konnte definiert werden, der bei 10 Standardabweichungen über der mittleren Ausgangslinien-Fluoreszenz, wie aus Zyklen 1 bis 15 errechnet, festgesetzt wurde (Heid et al. 1996). Eine Amplifikations-reaktion, bei der die Fluoreszenzintensität während des Ablaufs der Wärmezyklierung über die Schwelle hinaus ansteigt, ist als eine positive Reaktion definiert.
Zur Bestimmung der Empfindlichkeit der TaqMan-PCR wurden Reihenverdünnungen der aus einem RhD-positiven Individuum isolierten genomischen DNA in Wasser vorgenommen, bestehend aus dem DNA-Äquivalent von 1000 Zellen bis 1 Zelle, und einer Analyse durch das SRY-TaqMan-System unterzogen. Je geringer die Zahl der Zielmoleküle, um so mehr Amplifikationszyklen waren erforderlich, um eine bestimmte Menge an Reporter-Molekülen zu erhalten. Das System war empfindlich genug, um das DNA-Äquivalent von einer einzigen Zielzelle zu detektieren.
Korrelation von Serologie und Genotypisierung der RhD-negativen Frauen
Die 21 in diese Studie aufgenommenen schwangeren Frauen waren alle serologisch RhD-negativ. Die aus dem Leukozytenmantel jeder Frau isolierte genomische DNA (10 ng) wurde dem RhD-TaqMan-Assay unterzogen, wobei in jedem Fall ein negatives Ergebnis festgestellt wurde; dies wies die völlige Korrelierung zwischen der Serologie und der Genotypisierung nach.
RhD-Genotypisierung von aus maternalem Plasma isolierter DNA
Die aus dem Plasma der 21 RhD-negativen schwangeren Frauen extrahierte DNA wurde dem RhD-TaqMan-Assay unterzogen. Es lag eine völlige Korrelation zwischen dem aus der maternalen Plasma-Analyse vorhergesagten fötalen RhD-Genotypus und dem aus der Genotypisierung des Fruchtwassers und dem serologischen Test des Nabelschnurbluts erhaltenen Ergebnis vor (Tabelle 1).
Als eine Kontrolle für die Amplifizierbarkeit der aus maternalem Plasma extrahierten DNA wurden diese Proben außerdem dem Betaglobin-TaqMan-Assay unterzogen. In jedem Fall wurde ein positives TaqMan-Signal erzeugt.
Erörterung
In dieser Untersuchung haben wir die Durchführbarkeit einer nicht-invasiven fötalen RhD-Genotypisierung aus maternalem Plasma nachgewiesen. Dies stellt die erste Beschreibung der Einzelgen-Diagnose aus maternalem Plasma dar. Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Form der Genotypisierung hochgradig genau und potentiell für die klinische Diagnose einsetzbar ist. Diese hohe Genauigkeit ist möglicherweise das Ergebnis der hohen Konzentration an fötaler DNA im maternalen Plasma.
Die Rhesus-Familie der Polypeptide ist durch zwei verwandte Gene kodiert: das CcEe-Gen und das RhD-Gen (Le Van Kim et al. 1992; Chérif-Zahar et al. 1990). Aufgrund der Komplexität des genetischen Rh-Systems wurde eine Anzahl von Primer-Sätzen für die RhD-Genotypisierung beschrieben (Bennett et al. 1993; Lo et al. 1993; Aubin et al. 1997). Um die Genauigkeit unseres Genotypisierungs-Systems bei den Studienproben zu gewährleisten, führten wir eine Kontroll-Genotypisierung an Leukozytenmantel-DNA von unserer Patientenpopulation durch. In allen Fällen lag eine völlige Korrelation zwischen der Serologie und der Genotypisierung vor. Es ist möglich, dass für eine robuste klinische Diagnose multiple Primer-Sätze bevorzugt sind. Die TaqMan-Chemie erlaubt ohne weiteres die Einbeziehung multipler Primer/Sonden-Sätze.
Die Korrelation zwischen dem Schweregrad einer fötalen hämolytischen Erkrankung und maternaler DNA-Menge stellt ein Gebiet dar, das weiterer Untersuchung bedarf.

Es ist möglich, dass erhöhte Mengen an fötaler DNA in den mütterlichen Kreislauf bei Vorliegen einer erhöhten fötalen Hämolyse freigesetzt werden. TABELLE 1 RhDd-Genotypisierung aus Plasma von RhD-negativen schwangeren Frauen

Fall	Fötaler RhD-Genotyp	Maternales Plasma-RhD-TaqMan-Signal
1	–	–
2	–	–
3	–	–
4	+	+
5	+	+
6	–	–
7	–	–
8	+	+
9	+	+
10	–	–
11	+	+
12	+	+
13	+	+
14	+	+
15	–	–
16	+	+
17	+	+
18	+	+
19	+	+
20	+	+
21	+	+

Beispiel 4
Anstieg der fötalen DNA-Konzentration in maternalem Serum bei präeklamptischen Schwangerschaften
Einführung
Präeklampsie stellt eine wichtige Ursache für Mortalität und Morbidität bei Mutter und Fötus dar. Trotz umfangreichen Forschungsaufwands ist die Pathogenese dieser Erkrankung nach wie vor unklar. Die Störung ist in erster Linie durch das gleichzeitige Auftreten Schwangerschaft-induzierter Veränderungen zu erkennen, die sich nach der Entbindung rückbilden, von denen Bluthochdruck und Proteinurie die am häufigsten angelegten klinischen Kriterien sind. Einige Forscher haben vorgeschlagen, dass Präeklampsie die Folge einer abnormalen Trophoblasten-Einnistung ist, wie möglicherweise durch immunologische Mechanismen vermittelt. Andere Forscher haben pathologische Veränderungen der Rankenarterien im Schwangerschaftsendometrium und -myometrium festgestellt, wofür ein Teilverschluss durch fibrinoides Material ein Merkmal ist.
Bei diesem Beispiel verwenden wir einen quantitativen Real-Time-PCR-Assay, um die Konzentration an fötaler DNA im Serum von an Präeklampsie leidenden Frauen zu zeigen. Als ein fötaler Marker wurden Y-chromosomale Sequenzen männlicher Föten verwendet.
Materialien und Methoden
Patienten
Schwangere Frauen, die das Department of Obstetrics & Gynaecology am Prince of Wales Hospital, Shatin, Hong Kong und das Nuffield Department of Obstetrics & Gynaecology, Oxford, U. K., aufsuchten, wurden mit einer Einverständniserklärung rekrutiert. Die Genehmigung wurde vom Research Ethics Committee of The Chinese University of Hong Kong und dem Central Oxfordshire Research Ethics Committee eingeholt. Präeklampsie wurde als ein Langzeit-Anstieg des diastolischen Blutdrucks auf 90 mmHg oder höher von zuvor niedrigeren Werten bei gleichzeitiger neu aufgetretener oder aufrechterhaltener Proteinurie in Abwesenheit einer Harntrakt-infektion definiert. Die schwangeren Frauen der Kontrollgruppe waren nicht auf Medikation und wiesen keinen Bluthochdruck oder Proteinurie auf (definiert als mehr als eine Spur bei der Tauchstäbchen-Harnuntersuchung). Die präeklamptischen und Kontrollpersonen wurden nach Gestationsalter gruppiert.
Präparierung der Proben
Die Blutproben wurden in leere Röhrchen eingebracht. Nach der Blutgerinnung wurden die Proben wurden bei 3000 × g zentrifugiert, und das Serum wurde vorsichtig entfernt und in leere Polypropylenröhrchen eingebracht. Die Proben wurden bei –70°C oder –20°C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.
DNA-Extraktion aus Plasma- und Serumproben
Die DNA aus den Serumproben wurde unter Verwendung eines QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) unter Anwendung des ”Blut- und Körperflüssigkeits-Protokolls”, wie vom Hersteller empfohlen, extrahiert (Chen et al. 1996). Vierhundert bis 800 μl der Plasma/Serumprobe wurden für die DNA-Extraktion pro Säule verwendet. Die exakt verwendete Menge wurde dokumentiert, um die Berechnung der Ziel-DNA-Konzentration zu ermöglichen.
Quantitative Real-Time-PCR
Die quantitative Real-Time-PCR-Analyse wurde wie in Beispiel 2 beschrieben vorgenommen.
Ergebnisse
Quantitative Analyse des fötalen SRY-Gens aus maternalem Serum
Die quantitative Real-Time-SRY-PCR wurde für aus präeklamptischen und Kontroll-Patienten extrahierte Serum-DNA durchgeführt. Die Daten einzelner Fälle sind in 2 aufgetragen. Die mittleren fötalen DNA-Konzentrationen bei präeklamptischen und Kontroll-Schwangerschaften betrugen 381 Kopien/ml bzw. 76 Kopien/ml. Die fötale DNA-Kozentration war bei präeklamptischen Schwangerschaften höher als bei den Kontroll-Schwangerschaften (Mann-Whitney U-Test, p < 0,0001).
Erörterung
Unsere Daten zeigen, dass die Konzentration der fötalen DNA bei präeklamptischen Schwangerschaften im Vergleich zu nicht-präeklamptischen Schwangerschaften höher ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Messung der fötalen DNA-Konzen-tration im maternalen Plasma als ein neuer Marker für Präeklampsie eingesetzt werden kann. Verglichen zu anderen Markern für Präeklampsie ist die fötale DNA-Messung darin einzigartig, dass sie einen genetischen Marker darstellt, wohingegen andere Marker wie Aktivin A und Inhibin A generell hormonelle Marker sind. Naturgegebenerweise weist ein Test auf der Basis eines genetischen Markers den Vorteil auf, völlig Fötus-spezifisch zu sein.
Weitere Forschungsarbeit wird vonnöten sein, um zu untersuchen, ob die Menge an fötaler DNA in Bezug zum Schweregrad der Präeklampsie steht. Unsere Entdeckung erschließt auch eine Untersuchung über die potentielle Anwendbarkeit einer fötalen DNA-Quantifizierung zur Vorhersage des Auftretens von Präeklampsie, bevor sich klinische Anzeichen wie Bluthochdruck und Proteinurie zeigen.
Der Mechanismus, durch den erhöhte Mengen an fötaler DNA in den Kreislauf präeklamptischer Frauen freigesetzt werden, ist derzeit unklar. Zu möglichen Mechanismen zählen eine Schädigung der Plazenta-Umgrenzungsfläche, was zu fötalem Zelltod und der anschließenden Freisetzung der fötalen DNA in den mütterlichen Kreislauf führt. Ein zweiter Mechanismus ist auf ein verstärktes Wandern der Fötuszellen im mütterlichen Kreislauf bei Präeklampsie zurückzu-führen. Die fötale DNA wird dann im Anschluss an ihre Zerstörung im mütterlichen Kreislauf freigesetzt. Weitere Studien bezüglich der Mengen an Fötuszellen und fötaler DNA wären erforderlich, um diese Fragen zu klären.
Beispiel 5
Quantitative Analyse der fötalen DNA in maternalem Plasma und Serum
Einführung
Wir haben gezeigt, dass fötale DNA in maternalem Plasma und Serum vorhanden ist. Der Nachweis fötaler DNA-Sequenzen war in 80% bzw. 70% der Fälle unter Verwendung von lediglich 10 μl gekochten Plasmas und Serums möglich (10 et al. 1997).
Diese Beobachtungen zeigen, dass maternale Plasma/Serum-DNA als eine nützliche Materialquelle für die nicht-invasive Pränataldiagnostik bestimmter genetischer Störungen nützlich sein kann. Um zu zeigen, dass klinische Anwendungen möglich sind, gilt es, eine ganze Reihe wichtiger Fragen zu beantworten. Erstens muss gezeigt werden, dass fötale DNA im maternalen Plasma und Serum in ausreichenden Mengen vorhanden ist, um eine zuverlässige Molekulardiagnose durchzuführen. Zweitens sind Daten über die Abweichung der fötalen DNA-Menge im maternalen Plasma und Serum bezüglich des Gestationsalters erforderlich, um die Anwendbarkeit dieser Technologie auf die pränatale Frühdiagnose bestimmen zu können.
In diesem Beispiel haben wir uns diesen beiden Fragen zugewandt, indem wir einen quantitativen Real-Time-TaqMan-Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Assay (Heid et al. 1996) zur Messung der Kopienzahl der fötalen DNA-Moleküle im mütterlichen Plasma und Serum entwickelten. Diese Technik erlaubt eine kontinuierliche optische Überwachung des Verlaufs einer Amplifikationsreaktion, wobei sie eine exakte Zielquantifizierung über breite Konzentrationsbereiche erbringt. Unsere Daten zeigen, dass fötale DNA im maternalen Plasma und Serum bei Konzentrationen vorhanden ist, die jenen ähneln, die durch zahlreiche fötale Zellanreicherungs-Protokolle erreicht werden. Wir haben auch die veränderlichen fötalen DNA-Konzentrationen im maternalen Serum bei unterschiedlichem Gestationsalter untersucht. Unter Anlegung dieses Plasma- oder Serum-bezogenen Ansatzes zeigen wir, dass ein zuverlässiger Nachweis von fötaler DNA erreichbar und folglich für die nicht-invasive Pränataldiagnostik bestimmter genetischer Störungen nützlich ist.
Versuchspersonen und Methoden
Patienten
Schwangere Frauen, die das Department of Obstetrics & Gynaecology am Prince of Wales Hospital, Shatin, Hong Kong, besuchten, wurden mit einer Einverständniserklärung rekrutiert. Die Genehmigung wurde vom Research Ethics Committee of The Chinese University of Hong Kong eingeholt. Bei Frauen, die zu einem einzigen Zeitpunkt untersucht wurden, wurden Proben der Frühschwangerschaft vor der Fruchtblasenpunktion oder Chorionzotten-Probenentnahme genommen, während Proben einer Spätschwangerschaft direkt vor der Entbindung entnommen wurden. Fünf bis zehn ml maternales peripheres Blut wurden jeweils in ein EDTA enthaltendes Röhrchen und ein leeres Röhrchen eingebracht. Versuchspersonen, die zu mehreren Zeitpunkten untersucht wurden, wurden aus dem in vitro-Fertilisationsprogramm vor der Konzeption rekrutiert. Fünf bis zehn ml maternales Blut von diesen Versuchspersonen wurden in ein leeres Röhrchen zu jedem untersuchten Zeitpunkt eingebracht. Bei Frauen, die einer Pränataldiagnose unterzogen wurden, wurde das Geschlecht des Babys aus den zytogenetischen Ergebnissen der Fruchtblasenpunktion oder den Chorionzotten-Proben bestimmt. Bei Frauen, die direkt vor der Entbindung oder aus dem in vitro-Fertilisationsprogramm rekrutiert wurden, wurde das Geschlecht des Fötus zum Zeitpunkt der Entbindung festgehalten.
Präparierung der Proben
Die Blutproben wurden bei 3000 × g zentrifugiert, und das Plasma und Serum wurde vorsichtig aus dem EDTA enthaltenden bzw. leeren Röhrchen entfernt und in leere Polypropylenröhrchen übertragen. Umfangreiche Vorsichtsmaßnahmen wurden getroffen, um sicherzugehen, dass der Leukozytenmantel oder Butkuchen bei Entfernung der Plasma- bzw. Serumproben unzerstört blieben. Die Plasma- und Serumproben wurden bei 3000 × g nochmals zentrifugiert und die Überstände in frische Polypropylenröhrchen abgesammelt. Die Proben wurden bei –20°C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.
DNA-Extraktion aus Plasma- und Serumproben
Die DNA aus Plasma- und Serumproben wurde unter Verwendung eines QIAamp Blond Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) unter Zugrundelegung des ”Blut- und Körperflüssigkeits-Protokolls”, wie vom Hersteller empfohlen, extrahiert (Chen et al. 1996). Vierhundert bis 800 μl der Plasma/Serumprobe wurden zur DNA-Extraktion pro Säule verwendet. Die exakt verwendete Menge wurde dokumentiert, um die Berechnung der Ziel-DNA-Konzentration zu ermöglichen.
Quantitative Real-Time-PCR
Die quantitative Real-Time-PCR-Analyse wurde wie in Beispiel 2 beschrieben unter Verwendung des im vorangegangenen Beispiel 2 beschriebenen SRY-TaqMan-Systems und des Betaglobin-TaqMan-Systems durchgeführt.
Ein identisches Wärmeprofil wurde sowohl für das SRY- als auch das Betaglobin-TaqMan-System angelegt. Die Wärmezyklierung wurde mit einer 2-minütigen Inkubation bei 50°C zur Aktivierung der Uracil-N-Glykosylase eingeleitet, gefolgt von einem ersten Denaturierungsschritt für 10 Minuten bei 95°C. Daraufhin erfolgten 40 Zyklen bei 95°C für 15 Sek. und 60°C für 1 Minute.
Ergebnisse
Entwicklung des quantitativen Real-Time-PCR
Zur Bestimmung des dynamischen Bereichs der quantitativen Real-Time-PCR wurden Reihenverdünnungen männlicher DNA in Wasser vorgenommen, bestehend aus dem DNA-Äquivalent von 1000 Zellen bis 1 Zelle, und einer Analyse durch das SRY-TaqMan-System unterzogen. 3A zeigt, dass sich die Amplifikationskurve nach rechts verschob, als die Eingabe-Zielmenge reduziert wurde. Dies war zu erwarten, da Reaktionen mit weniger Zielmolekülen mehr Amplifikationszyklen erfordern, um eine bestimmte Menge an Reporter-Molekülen zu erzeugen, als Reaktionen mit mehr Zielmolekülen. Dieses System war empfindlich genug, um das DNA-Äquivalent einer einzigen Zielzelle zu detektieren.
In 3B ist ein Diagramm des Schwellenzyklus (C_T) gegenüber der Eingabe-Zielmenge, aufgetragen auf eine übliche Log-Skala, gezeigt. Der C_T wurde auf 10 Standardabweichungen über der mittleren Ausgangslinien-Fluoreszenz, wie aus Zyklen 1 bis 15 berechnet, festgesetzt und war proportional zur für die Amplifikation verwendeten Ausgangsziel-Kopienzahl (Heid et al. 1996). Die Linearität des Graphen gibt den großen dynamischen Bereich und die Genauigkeit der quantitativen Real-Time-PCR wieder. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung des Betaglobin-TaqMan-Systems erhalten (Ergebnisse nicht gezeigt).
Das quantitative Real-Time-SRY-System war unempfindlich gegenüber dem Vorhandensein eines Hintergrunds an weiblicher DNA von 0 bis 12.800 weiblichen Genom-Äquivalenten. Dies vereinfachte die Anwendung dieses Systems stark, da innerhalb dieses Bereichs keine separaten Kalibrationskurven für die verschiedenen Fälle aufgrund des Vorliegens unterschiedlicher Konzentrationen an fötaler und maternaler DNA konstruiert werden mussten.
Die Reproduzierbarkeit der DNA-Extraktion aus Plasma und Serum unter Anlegung des Qiagen-Protokolls wurde durch Vornehmen von Replikat-Extraktionen (10 für jeden Fall) aus Plasma- und Serumproben normaler Individuen getestet. Diese Replikat-Extraktionen wurden dann einer quantitativen Real-Time-PCR unter Verwendung des Betaglobin-Systems unterzogen. Der Koeffizient der Abweichung (CV) der C_T-Werte dieser Replikat-Extraktionen betrug 1,1%.
Quantitative Analyse unter Anwendung des Real-Time-Betaglobin-TaqMan-Systems
Die Konzentration der Betaglobin-Sequenzen in maternalen Plasma- und Serumproben wurde als ein Maß der Gesamtmenge an extrahierter DNA vewendet, d. h. aus Plasma- und Serumproben von 50 schwangeren Frauen extrahierte maternale und fötale DNA wurde unter Anwendung des Betaglobin-TaqMan-Systems analysiert. Fünfundzwanzig Versuchspersonen wurden während des ersten und zweiten Drittels rekrutiert (Gestationsalter: 11 bis 17 Wochen) und wurden als Frühschwangerschafts-Proben in Tabelle 2 bezeichnet. Die anderen fünfundzwanzig Versuchspersonen wurden direkt vor der Entbindung rekrutiert (Gestationsalter: 37 bis 43 Wochen) und wurden als Spätschwangerschafts-Proben in Tabelle 1 bezeichnet. Die Konzentrationen der Betaglobin-Sequenzen im maternalen Plasma und Serum sind in Tabelle 2 aufgelistet. Diese Ergebnisse zeigen, dass Serum mehr DNA enthält als Plasma (Wilcoxon-Rangsummentest, p < 0,0005), bei einer mittleren Konzentration der Serum-DNA vom 14,6-fachen dessen der Plasma-DNA in unserer Studienpopulation. Die Konzentration der Betaglobin-Sequenzen im maternalen Plasma von Früh- und Spätschwangerschafts-Proben sind in Tabelle 2 verglichen. Diese Daten zeigen, dass die Gesamtmenge an Plasma-DNA mit dem Fortschreiten der Schwangerschaft steigt (Mann-Whitney-Rangsummentest, p < 0,0005).
Quantitative Analyse des fötalen SRY-Gens aus maternalem Plasma und Serum
Die quantitative Real-Time-Analyse unter Anwendung des SRY-Taqman-Systems wurde an aus maternalem Plasma und Serum extrahierter DNA zur Bestimmung der Menge an fötaler DNA vorgenommen. Von den 25 Frühschwangerschafts-Proben (Gestationsalter: 11 bis 17 Wochen) stammten 13 von Frauen, die männliche Föten austrugen, und 12 von Frauen, die weibliche Föten austrugen. Von den 25 Spätschwangerschafts-Proben (Gestationsalter: 37 bis 43 Wochen) stammten 14 von Frauen, die männliche Föten austrugen, und 11 von Frauen, die weibliche Föten austrugen. Ein positives Signal wurde bei jeder der 27 Frauen erhalten, die männliche Föten austrugen, wohingegen kein Signal bei jeder der 23 Frauen detektiert wurde, die weibliche Föten austrugen. Vierzehn Frauen hatten früher bereits ein männliches Baby geboren, wobei 5 von diesen bei der derzeit untersuchten Schwangerschaft ein weibliches Baby austrugen.
Die quantitativen SRY-Daten der 27 Frauen, die männliche Föten austrugen, sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Diese Daten zeigen, dass die Konzentrationen an fötaler DNA im Plasma und Serum in der späten Gestation höher sind als in der frühen Gestation (Mann-Whitney-Rangsummentest, p < 0,0005). Die mittleren Konzentrationen der fötalen DNA im maternalen Plasma und Serum sind 11,5-mal bzw. 11,9-mal höher in der späten Gestation als bei der frühen Gestation. Die Absolutkonzentrationen an fötaler DNA im maternalen Plasma und Serum waren in einzelnen Fällen ähnlich. Die fraktionelle Konzentration der fötalen DNA in der Frühschwangerschaft liegt im Bereich von 0,39% bis 11,9% (Mittel: 3,4%) im Plasma und 0,014% bis 0,54% (Mittel: 0,13%) im Serum. In der Spätschwanger-schaft liegt die Fraktion der fötalen DNA im Bereich von 2,33% bis 11,4% (Mittel: 6,2%) im Plasma und 0,032% bis 3,97% (Mittel: 1,0%) im Serum.
Sequentielle Untersuchung von Frauen, die durch in vitro-Fertilisation empfingen
Zwanzig Frauen, die durch in vitro-Fertilisation (IVF) empfingen, wurden vor der Konzeption und zu mehreren Zeitpunkten während der Schwangerschaft untersucht. Alle zwanzig Patientinnen wiesen Einzelton-Schwangerschaften auf, wie mittels Ultraschallabtastung bestimmt. Zwölf Frauen gebaren männliche Babys und die verbliebenen 8 weibliche Babys. Keine der Frauen, die männliche Föten austrugen, hatten in ihrer Geschichte Schwangerschafts-bezogene Komplikationen erlebt. Patientin S-51 (4) wurde eine Chorionzotten-Probe bei Woche 12 entnommen. Patientinnen S-1 und S-56 (4) wurden einer Fruchtblasenpunktion bei Woche 16 bzw. 17 unterzogen. Insgesamt 163 Serumproben dieser 20 Frauen wurden unter Anwendung des quantitativen Real-Time-SRY-TaqMan-Systems analysiert. Keine der 65 Serumproben von den 8 Frauen, die weibliche Föten austrugen, ergab ein positives SRY-Signal. Die Konzentrationen der fötalen DNA in den 98 Serumproben von Frauen, die männliche Föten austrugen, sind in 4 aufgetragen.
Erörterung
Von uns wurde ein exaktes quantitatives Real-Time-PCR-System zur Bestimmung der Konzentration an fötaler DNA im maternalen Plasma und Serum entwickelt. Dieses System weist eine Reihe von Vorteilen auf: (1) einen großen dynamischen Bereich von über 5 Größenordnungen (Heid et al. 1996); (2) einen hohen Durchsatz und eine schnelle Durchlaufzeit – 96 Proben konnten gleichzeitig in etwa 2 Stunden amplifiziert und quantifiziert werden; und (3) die Verwendung eines homogenen Amplifikations-/Detektionssystems, das keine PCR-Nachbearbeitung erfordert und daher das Risiko einer Übertragungskontamination minimiert.
Die wichtigste Beobachtung bei dieser Studie ist die sehr hohe Konzentration an fötaler DNA im maternalen Plasma und Serum. Bianchi et al. berichten, dass die durchschnittliche Zahl der Fötuszellen im maternalen Blut bei normalen Schwangerschaften in 16 ml maternalem Blut 19 betrug, d. h. 1,2 Zellen/ml während des zweiten Drittels (Bianchi et al. 1997). Daher ist die mittlere Konzentration an fötaler DNA in maternalem Plasma und Serum um das 21,2-(25,4/1,2)- bzw. 23,9-(28,7/1,2)-fache höher als die in der zellulären Fraktion des maternalen Bluts beim gleichen Gestationsstadium. Die relative Konzentration von fötaler zu Gesamt-plasma-DNA ist sogar noch höher. Daher macht in der Frühschwangerschaft die fötale DNA im maternalen Plasma im Mittel 3,4% der Gesamtplasma-DNA aus. Die entsprechende Zahl in der Spätschwangerschaft beträgt 6,2%. Hamada et al. berichten, dass die Häufigkeit der fötalen Zellen im zweiten Drittel 0,0035% betrug, die im dritten Drittel dagegen 0,008% (Hamada et al. 1993). Das fetomaternale Verhältnis ist daher im maternalen Plasma 971-mal bzw. 775-mal höher als in der zellulären Fraktion des entsprechenden Gestationsalters. In der Tat ist das fetomaternale Verhältnis bei Plasma-DNA dem vergleichbar, das auf zahlreiche fötale Zellanreicherungs-Protokolle hin erhalten wird. Zum Beispiel berichteten Bianchi et al., dass im Anschluss auf eine Anreicherung fötaler kernhaltiger roter Blutkörperchen unter Anwendung einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung die resultierenden fötalen Zellen 0,001%–5% der sortierten Zellpopulationen ausmachten, wie mittels quantitativer PCR-Analyse bestimmt (Bianchi et al. 1994). In einer ähnlichen Studie unter Anwendung der Zellsortierung und fötalen Zelldetektion mittels fluoreszenter in situ-Hybridisierung haben Sohda et al. festgestellt, dass durchschnittlich 4,6% der sortierten Zellen von fötalem Ursprung waren (Sohda et al. 1997). Maternales Plasma bietet daher eine leicht zugängliche fötale DNA-Quelle für die pränatale Genanalyse.
Wir haben gezeigt, das die absolute Konzentration der fötalen DNA in maternalem Plasma ähnlich der in maternalem Serum ist. Der Hauptunterschied besteht im Vorliegen einer größeren Menge an maternaler Hintergrund-DNA im Serum gegenüber dem Plasma, was möglicherweise an der Freisetzung von DNA während des Gerinnungsprozesses liegt. Zwar zeigt dies keine merkliche Wirkung auf die Leistungsfähigkeit der fötalen DNA-Detektion unter Anwendung des Real-Time-TaqMan-Systems, doch ist es möglich, dass bei Verwendung weniger empfindlicher Methoden, z. B. der herkömmlichen PCR, gefolgt von Ethidium-angefärbter Agarosegel-Elektrophorese, maternales Plasma dem maternalen Serum für eine robuste fötale DNA-Detektion vorzuziehen wäre.
Die hohe Konzentration an fötaler DNA im maternalen Plasma und Serum hat uns den zuverlässigen Nachweis des Vorhandenseins fötalen genetischen Materials ermöglicht. Von den in dieser Studie analysierten 263 Serum- oder Plasmaproben waren wir zum Detektieren des fötalen SRY-Gens im maternalen Plasma oder Serum von jeder Versuchsperson in der Lage, die zum Zeitpunkt der Venenpunktion einen männlichen Fötus austrug. Diese robuste Detektionsrate wurde unter Verwendung von aus lediglich 40 bis 80 μl maternalem Plasma und Serum extrahierter DNA erhalten. Dieses Volumen bedeutet das 4- bis 8-fache gegenüber den 10 μl an gekochtem maternalem Plasma oder Serum, wie in unserer früheren Studie berichtet (Lo et al. 1997) und führt zu einer signifikanten Verbesserung der Empfindlichkeit. Die Spezifität blieb erhalten, da wir keine Amplifikationssignale von Proben beobachteten, die vor der Konzeption oder von einen weiblichen Fötus austragenden Versuchspersonen erhalten wurden. Aus den bisher erhaltenen Daten schien die Plasma/Serum-Analyse durch das Fortbestehen von fötalen Zellen aus vorangegangenen Schwangerschaften nicht signifikant beeinträchtigt zu werden (Bianchi et al. 1996). So erhielten wir keine falsch-positiven Ergebnisse von Frauen, die früher einen männlichen Fötus ausgetragen hatten, aber nun zum Zeitpunkt der Blutentnahme für diese Studie einen weiblichen Fötus austrugen.
Die sequentielle Untersuchung von Patienten, die sich einer IVF unterzogen, ergab eine Anzahl wichtiger Ergebnisse. Erstens wurde von allen 12 Patienten, die männliche Föten austrugen, gezeigt, dass sie für SRY-Sequenzen in ihren Seren vor der Konzeption negativ waren. Dies lieferte den überzeugenden Nachweis dafür, dass die durch den TaqMan-Assay nachgewiesene SRY-Sequenz tatsächlich vom männlichen Fötus der vorliegenden Schwangerschaft stammte. Zweitens waren wir dazu in der Lage, fötale SRY-Sequenzen sogar schon in der 7. Woche der Gestation nachzuweisen; was aufzeigt, dass die fötale Genanalyse in maternalem Plasma/Serum im ersten Drittel eingesetzt werden könnte. Drittens haben wir gezeigt, dass die fötale DNA-Konzentration im Verlauf der Schwangerschaft steigt (4). Dieser letzte Punkt wurde auch durch Daten bestätigt, die von zu einem einzigen Zeitpunkt untersuchten Frauen erhalten wurden. Zu einem späten Zeitpunkt der Schwangerschaft rekrutierte Frauen weisen höhere fötale DNA-Konzentrationen in ihrem Plasma und Serum auf (Tabelle 3).
Über den Anstieg der fötalen DNA-Konzentration im Verlauf der Schwangerschaft hinaus zeigen unsere Daten außerdem, dass auch die maternale Plasma-DNA mit dem Gestationsalter zunimmt (Tabelle 2). Die biologische Grundlage für dieses Phänomen ist derzeit unklar. Zu möglichen Erklärungen zählen die Größenzunahme der fetomaternalen Grenzfläche im Verlauf der Gestation und eine mögliche Abnahme der DNA-Clearance in Verbindung mit anderen physiologischen Veränderungen während der Schwangerschaft.
Für bestimmte Störungen könnte die fötale genetische Information in wirtschaftlicherer und schnellerer Weise aus dem maternalen Plasma oder Serum erhalten werden als unter Verwendung von aus maternalem Blut isolierten Fötuszellen. Wir stellen uns vor, dass die fötale DNA-Analyse im mütterlichen Plasma und Serum in Situationen am nützlichsten wäre, in denen die Bestimmung im Fötus vorliegender väterlicherseits vererbter Polymorphismen/Mutationen von Genen in der klinischen Pränataldiagnostik hilfreich wäre (Lo et la. 1994). Zu Beispielen zählen die fötale Geschlechtsbestimmung für die Pränataldiagnostik geschlechtsgebundener Störungen, die Bestimmung des fötalen Rhesus-D-Status bei sensibilisierten Rhesusnegativen schwangeren Frauen (Lo et al. 1993), autosomal dominanter Störungen, bei denen der Vater die Mutation trägt, und autosomal rezessiver genetischer Störungen, bei denen der Vater und die Mutter unterschiedliche Mutationen tragen (Lo et al. 1994), z. B. bestimmte Hämoglobinopathien (Camaschella et al. 1990) und zystische Fibrose. Aufgrund des stark reduzierten maternalen Hintergrunds und der hohen fötalen DNA-Konzentration im maternalen Plasma und Serum sagen wir voraus, dass diese Art von Analyse viel robuster wäre, verglichen zu ihrer Anwendung zum Nachweis unsortierter Fötuszellen im maternalen Blut. Die Allelunterscheidbarkeit (Lee et al. 1993; Livak et al. 1995) erlaubt die Anwendung des homogenen TaqMan-Assay zu diesem Zweck. Der hohe Durchsatz und die kontaminationsverhindernde Kapazität dieses Systems macht es zu einem attraktiven Kandidaten für eine klinische Anwendung im großen Maßstab.
Bianchi et al. berichteten kürzlich, dass die Fötuszellen im maternalen Blut bei aneuploiden Schwangerschaften erhöht waren (Bianchi et al. 1997), und es wurde gezeigt (Beispiel 2), dass die fötale DNA-Konzentration im maternalen Plasma und Serum bei diesen Schwangerschaften ebenfalls erhöht ist. Dies macht einen neuen Screening-Test für fötale Chromosomenstörungen möglich. Für diese Anwendung lassen sich fötale DNA-Quantifizierungssysteme für polymorphe Marker außerhalb des Y-Chromosoms entwickeln, so dass die Quantifizierung für weibliche Föten angewendet werden kann. Autosomale polymorphe Systeme, die zu diesem Zweck verwendet werden können, wurden bereits beschrieben (Lo et al. 1996). Allerdings wären noch Fötuszell-Isolationstechniken für eine definitive zytogenetische Diagnose erforderlich. Entsprechend wäre auch die Fötuszell-Isolierung für eine direkte Mutationsanalyse von durch eine einzige Mutation erzeugten autosomalen rezessiven Störungen erforderlich. Es ist wahrscheinlich, dass die Fötuszellisolation und Analyse der fötalen DNA in maternalem Plasma/Serum als komplementäre Techniken für die nicht-invasive Pränataldiagnostik verwendet werden würden.

Die biologische Grundlage, mittels derer fötale DNA in maternales Plasma freigesetzt wird, bleibt noch zu beleuchten. Es ist möglich, dass fötale DNA durch eine Zelllyse, die aus einem physikalischen und immunologischen Schaden resultiert, oder durch entwicklungsgebundene Apoptose der fötalen Gewebe freigesetzt wird. Es ist auch wahrscheinlich, dass erhöhte Mengen an fötaler DNA bei Zuständen vorliegen, die aus einer Plazentabeschädigung entstehen, wie etwa die Präeklampsie. Das hierin beschriebene quantitative Real-Time-PCR-System bietet ein wirkungsvolles Werkzeug zur Untersuchung dieser unerforschten pathophysio-logischen Aspekte der fötalen DNA in maternalem Plasma und kann zu einem verbesserten Verständnis der fetomaternalen Beziehung führen. TABELLE 2 Quantitative Analyse von maternalem Plasma und Serum unter Anwendung des Betaglobin-TaqMan-Assay

	Mittelwert	Median	Bereich
	(Kopien/ml)	(Kopien/ml)	(Kopien/ml)
Plasma (Früh- + Spätschwangerschaft)	3466	1594	356–31875
Serum (Früh- + Spätschwangerschaft)	50651	34688	5813–243750
Plasma (Frühschwangerschaft)	986	975	356–1856
Plasma (Spätschwangerschaft)	5945	4313	1125–31875

TABELLE 3 Quantifizierung der fötalen DNA in maternalem Plasma und Serum: Beziehung mit Gestationsalter

	SRY-Konzentration (Kopien/ml)
	Frühschwangerschaft		Spätschwangerschaft
	Plasma	Serum	Plasma	Serum
Bereich	3,3–69,4	4,0–58,1	76,9–769	33,8–900
Mittelwert	25,4	28,7	292,2	342,1
Median	20,6	19,5	244,0	286,0

Beschreibung der Figuren
1. Fötale DNA in maternalem Serum von Frauen, die aneuploide und normale Föten austrugen. Die Kontroll- und aneuploiden Gruppen sind auf der x-Achse angegeben. Die fötalen SRY-DNA-Konzentrationen, ausgedrückt in Kopien/ml, sind auf der y-Achse aufgetragen.
2. Fötale DNA in maternalem Serum bei präeklamptischen und nicht-präeklamptischen Schwangerschaften. Die präeklamptischen und Kontroll-Gruppen sind auf der x-Achse angegeben. Die fötalen SRY-DNA-Konzentrationen, ausgedrückt in Kopien/ml, sind auf der y-Achse aufgetragen.
3. Quantitative Real-Time-PCR.
A, Amplifikations-Diagramme, wie unter Verwendung des quantitativen Real-Time-PCR für das SRY-Gen erhalten. Jedes Diagramm entspricht einer bestimmten Eingabe-Zielmenge, wie durch ein entsprechendes Symbol angegeben. Die x-Achse zeigt die Zykluszahl einer quantitativen PCR-Reaktion. Die y-Achse zeigt die ΔRn, die die Fluoreszenzintensität gegenüber dem Hintergrund angibt (Heid et al. 1996).
B, Diagramm des Schwellenzyklus (C_T) gegenüber der Eingabe-Zielmenge (herkömmliche Log-Skala). Der Korrelationskoeffizient beträgt 0,986.
4. Sequentielle Studie an 12 Frauen, die männliche Föten austrugen und durch in vitro-Fertilisation empfangen hatten. Jeder Fall ist durch eine einzelne Rekrutierungsfall-Nummer gekennzeichnet. Die x-Achse zeigt das Gestationsalter, bei dem die Serumprobe erhalten wurde. Ein Gestationsalter von Null steht für eine Probe vor der Konzeption. Die y-Achse zeigt die Konzentration an fötalem SRY im maternalen Serum, ausgedrückt in Kopien/ml. Die Skala wurde für den Konzentrationsbereich für jeden Fall optimiert.
Literaturnachweise

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Claims

Detektionsverfahren, vorgenommen an einer maternalen Serum- oder Plasmaprobe von einer schwangeren Frau, welches Verfahren das Nachweisen des Vorhandenseins einer Nukleinsäure von fötalem Ursprung in der Probe umfasst, wobei die Nukleinsäure eine väterlicherseits vererbte Sequenz ist, welche die schwangere Frau nicht besitzt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei diese Detektion das Bestimmen der Menge der Nukleinsäure umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei diese Detektion das Nachweisen des Vorhandenseins einer Nukleinsäuresequenz umfasst.
Verfahren nach jedem der Ansprüche 1 bis 3, wobei diese Detektion das Amplifizieren der Nukleinsäure umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei diese Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei bei dieser Amplifikation mindestens ein für die fötale Sequenz spezifischer Oligonukleotid-Primer verwendet wird.
Verfahren nach jedem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Vorhandensein einer fötalen Nukleinsäuresequenz vom Y-Chromosom detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 7, zur Bestimmung des Geschlechts des Fötus.
Verfahren nach jedem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nukleinsäure von einem väterlicherseits vererbten Nicht-Y-Chromosom ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Nukleinsäure das Rhesus-D-Gen ist.
Verfahren nach Anspruch 10, zur Rhesus-D-Genotypisierung eines Fötus bei einer Rhesus-D-negativen Mutter.
Verfahren nach Anspruch 2, welches das Bestimmen der Konzentration der fötalen Nukleinsäuresequenz im maternalen Serum oder Plasma umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei diese Bestimmung mittels quantitativer PCR erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, zur Detektion eines maternalen oder fötalen Zustands, bei dem die Menge an fötaler DNA im maternalen Serum oder Plasma höher oder niedriger als normal ist.
Verfahren nach Anspruch 14, zur Detektion von Präeklampsie.
Verfahren nach Anspruch 14, zur Detektion einer fötalen chromosomalen Aneuploidie.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei diese fötale chromosomale Aneuploidie Down-Syndrom ist.
Verfahren zum Durchführen einer pränatalen Diagnose, welches Verfahren umfasst: (i) Bereitstellen einer maternalen Blutprobe; (ii) Auftrennen der Probe in eine zelluläre und eine nicht-zelluläre Fraktion; (iii) Detektieren des Vorhandenseins einer Nukleinsäure von fötalem Ursprung in der nicht-zellulären Fraktion unter Anwendung des Verfahrens nach jedem der Ansprüche 1 bis 17; und (iv) Stellen einer Diagnose auf der Basis des Vorhandenseins und/oder der Menge und/oder der Sequenz der fötalen Nukleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die nicht-zelluläre Fraktion, wie in Schritt (iii) verwendet, eine Plasma-Fraktion ist.