DE69812158T2 - Mikrosystem mit integrierter biochipschaltung - Google Patents

Mikrosystem mit integrierter biochipschaltung Download PDF

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  • 1.1 GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Biochips, in denen integrierte Schaltkreiselemente, elektrooptische Anregungs- und Detektionssysteme miteinander kombiniert sind, sowie molekulare Rezeptorsonden in einer unabhängigen integrierten Mikrovorrichtung.
  • 1.2 BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK 1.2.1 BIOSENSOREN
  • Biosensoren verwenden Erkennungseigenschaften lebender Systeme, die äußerst selektive Biorezeptoren (z. B. Antikörper, Enzym, Gensonden, usw.) besitzen, mit denen sich komplexe chemische und biologische Spezies spezifisch identifizieren und nachweisen lassen. In den letzten Jahren wurde eine große Vielfalt an chemischen Sensoren, Biosensoren und bioanalytischen Instrumenten mit laserinduzierter Fluoreszenz (Stevenson et al., 1994), Immunfluoreszenz auf Antikörperbasis (Vo-Dinh et al., 1987; Vo-Dinh et al., 1991) und Gensonden (Vo-Dinh et al., 1994; Isda et al., 1996, Isola et al., 1998) entwickelt. Aufgrund der vorzüglichen Spezifität des DNA-Hybridisierungsverfahrens besteht ein wachsendes Interesse an der Entwicklung von Analysesystemen auf DNA-Biorezeptorbasis (Vo-Dinh et al., 1994; Isola et al., 1996; Isola et al., 1998; Schena et al., 1995; Piunno et al., 1995; Kumar et al., 1994; Eggers et al., 1994; Vo-Dinh et al., 1998; Fodor et al., 1991; McGall et al., 1997). Zur Verstärkung sowohl der Selektivität als auch Empfindlichkeit von DNA-Biosensoren wurden kürzlich Gensonden entwickelt, bei denen ein auf Markierungen mit oberflächenverstärkter Raman-Streuung (Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) beruhendes Detektionssystem verwendet wird (Vo-Dinh et al., 1994; Isola et al., 1998). Kürzlich wurden die Entwicklung eines faseroptischen Genosensors für Mycobacterium tuberculosis auf Fluoreszenzbasis (Isola et al., 1996) sowie ein System mit oberflächenverstärkter Raman-Streuung (SERS) zum Nachweis von HIV (Isola et al., 1998) bekannt.
  • 1.2.2 AUF BIOCHIP-DESIGNS BERUHENDE BIOSENSOREN
  • Es bestand ein grundlegendes Interesse an der Entwicklung kostengünstiger Biosensoren für die Umwelt-und biomedizinische Diagnostik. Es wurden bereits Biosensoren untersucht, die meistens auf DNA-Sonden sowie verschiedenen Systemen zur Analyse von Oligonukleotidarrays beruhen, doch scheint die Berücksichtigung und Entwicklung von Biosensoren auf Gensondenbasis mit integriertem Schaltkreis (Integrated Circuit, IC) auf Mikrochips begrenzt zu sein. In bestehenden Systemen werden typischerweise Photomultiplier oder 2-dimensionale Detektoren wie z. B. CCD (Charge-Coupled Device)-Systeme verwendet, die eine sperrige Elektronik sowie Zusatzgeräte zur Datenaufbereitung benötigen (Affymetrix® http, 1997; Schena et al., 1995; Piunno et al., 1995; Kurnar et al., 1994; Eggars et al., 1994; Graham et al., 1992).
  • Trotz deutlicher Fortschritte bei der Entwicklung von DNA-Chips sind die Nachweis- und Analyseverfahren nicht so gut entwickelt, um die Menge an Informationen, die von solchen Chips über einen kurzen Zeitraum gesammelt werden können, auszunutzen. Bei einer gängigen Technik zum Nachweis von DNA-Sonden wird die Sonde mit radioaktiven Tags markiert und die Sonden-Zielmolekül-Hybride durch Autoradiographie nachgewiesen. Phosphor-32 (32P) ist wegen seiner hochenergetischen Emission und folglich kurzer Belichtungszeit die am häufigsten verwendete radioaktive Markierung. Radioaktive Markierungstechniken haben jedoch mehrere Nachteile, wie beispielsweise eine begrenzten Haltbarkeit. Die begrenzte Haltbarkeit von 32P beispielsweise hat ihre Ursache in der nur 14tägigen Halbwertszeit von 32P.
  • Mehrere optische Detektionssysteme, die auf der oberflächenverstärkten Raman-Fluoreszenz von Farbstoffsondenmarkierungen im sichtbaren und nahen Infrarot- (NIR-)Bereich sind auf den nichtradioaktiven Nachweis von mit Tags versehenen Gensonden untersucht worden (Vo-Dinh et al., 1987; Isola et al., 1996). Der Fluoreszenznachweis ist äußerst empfindlich, wenn die Zielverbindungen bzw. die markierten Systeme entsprechend ausgewählt werden. Tatsächlich wurde unter Verwendung eines Fluoreszenznachweises von Farbstoffen mit Laseranregung eine Nachweisgrenze im Zeptomol-Bereich (10-21 mol) erzielt (Stevenson et al., 1994). Dennoch liegen, verglichen mit der Mikrowelt von DNA-Arrays, Detektionssysteme im Makrobereich, da viele Nachweis-/Analyseverfahren lediglich Adaptionen anderer Systeme darstellen. Dies bedeutet, daß im Vergleich zur Datensammlung die Analyse relativ langsam ist.
  • 1.2.3 POLYNUKLEOTIDNACHWEISENDE BIOCHIPS
  • In jüngster Zeit hat sich viel Interesse auf die Entwicklung von DNA-Chips, die auf Oligonukleotidarrays mit hoher Dichte und Fluoreszenzanalyse beruhen, wie beispielsweise in Hacia et al. (1996) beschrieben, konzentriert. Dieses Prinzip wurde in Form des Affymetrix® GeneChip® kommerzialisiert, der zur Verarbeitung großer Mengen genetischer Informationen entwickelt wurde. GeneChip®-Sondenarrays sind auf einzelnen Chips in Form von Zehntausenden von DNA-Sonden, die bei Hybridisierung an ihre Zielmoleküle fluoreszieren sollen, angeordnet. Das Licht wird mit Laserlicht gescannt und die Lichtintensität für die späteren Berechnungen gespeichert (23. Juli 1997, Affymetrix, Inc., http://www.affymetrix.com/).
  • Obwohl die DNA-Chips sehr ähnlich zu den zur Zeit die heutige Technologie beherrschenden Mikropro zessorchips sind, müssen sie unglücklicherweise erst noch zu integrierten Systemen erfolgreich weiterentwickelt werden, die in geeigneter Weise das, was an Informationen von den DNA-Chips gesammelt werden kann, interpretieren. Somit benötigt ein Affymetrix®-Chip, der angeblich HIV-Mutationen nachweisen soll, noch externes Scanning und Interpretation der Signale, die von einer von DNA eingefangenen Nukleinsäure erzeugt werden.
  • 1.2.4 NACHWEIS UND IDENTIFIZIERUNG EINES MIKROORGANISMUS UNTER VERWENDUNG VON BIOCHIPS
  • Der Nachweis biologischer Spezies in komplexen Systemen ist für viele biomedizinische und Umweltanwendungen wichtig. Insbesondere besteht ein starkes Interesse an der Entwicklung von Nachweistechniken und -Sensoren zur Verwendung in Anwendungen wie z. B. der Identifizierung infektiöser Krankheiten, der medizinischen Diagnostik und Therapie ebenso wie der Biotechnologie und der biologischen Wiederherstellung der Umwelt. Eine Zielvorgabe bei der Entwicklung neuer Techniken und Sensoren ist nicht nur die Fähigkeit zur selektiven Identifizierung von Zielverbindungen, sondern auch die Fähigkeit zum Austesten einer großen Anzahl von Proben. Dennoch bestehen weiterhin Probleme hinsichtlich des reproduzierbaren sowie zweckmäßigen, sicheren und schnellen Nachweisens und Messens niedriger Konzentrationen an biologischen Verbindungen.
  • 1.3 NACHTEILE DES STANDES DER TECHNIK
  • Es besteht zur Zeit ein starker Bedarf an einem tatsächlich integrierten Biochipsystem, das Sonden, Probennehmer, einen Detektor ebenso wie einen Verstärker sowie einen "on board" logischen Schaltkreis umfaßt. Ein solches System findet in vielen Umgebungen Verwendung, einschließlich, unter anderem, Arztpraxen, und kann von Personal mit relativ geringen Kenntnissen eingesetzt werden. Bis jetzt beruhen die meisten der bisher bekannten DNA-Biosensoren auf faseroptischen Sonden, Glas- und Kieselgelplatten, die als Träger für die Sonde verwendet werden und extern mit einem Photosensorsystem verbunden sind, das im allgemeinen aus einer herkömmlichen Detektionsvorrichtung, wie beispielsweise einem Photomultiplier oder einem "charge-coupled device" (CCD) besteht. Obwohl die Sonden auf der Probenaufnahmeeinheit (häufig als "DNA-Chip" bzw. "Genchip" bezeichnet) klein sind, so ist die gesamte Vorrichtung mit den Laseranregungsquellen und Detektionssystemen (häufig ein konfokales Mikroskopsystem) relativ groß, z. B. Systeme in Tischgröße. Obwohl diese Systeme ihre Nützlichkeit bei der Genomforschung und -analyse zeigen konnten, sind sie auf das Labor ausgerichtet und beinhalten relativ teures Gerät.
  • Ebenso besteht ein Bedarf an der Entwicklung von Sensoren auf Biochipbasis, die beim Nachweis und bei der Quantifizierung von Nicht-DNA-Makromolekülen geeignet sind. Die Entwicklung von Sensoren, die beim Nachweis von Molekülen wie z. B. RNAs, Peptidnukleinsäuren (PNAs), Ribozymen, Polypeptiden, Antikörpern, Enzymen, Peptidfragmenten geeignet sind, würden einen signifikanten Fortschritt in der Technik bedeuten und neue Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von Molekülen von biologischer Wichtigkeit bereitstellen. Weiterhin würde aufgrund jüngster Fortschritte in den molekularen Wissenschaften die Fähigkeit zur Detektion und Quantifizierung von Biomimetika sowie neuer Klassen biologisch aktiver Moleküle, wie z. B. DNA-Adaptameren (1), Cyclodextrinen (2), Dendrimeren (3), "molecular imprints" (4), u. ä. von der Schaffung eines zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser und weiterer biologisch und medizinisch relevanter Makromoleküle fähigen Geräts auf Biochipbasis profitieren.
    • (1) Erdeniz et al., 1997
    • (2) Topchieva et al., 1998
    • (3) Sakthievel et al., 1998; Bulte et al., 1998
    • (4) Mosbach, 1994
  • Es besteht daher ein deutlicher Bedarf an der Entwicklung von Systemen, Vorrichtungen und Geräten, die eine schnelle, großmaßstäbliche und kostengünstige Analyse dieser Makromoleküle ermöglichen und die Entwicklung von Verfahren zum Nachweis und Quantifizierung biologisch relevanter Moleküle gestatten.
  • Aus WO-A-93/22678 ist ein Mikrochip zum Nachweis von DNA-Hybridisierung bekannt, die auf einem Array von Teststellen beruht, aus denen eine auf (oder in) einem Halbleiter-Wafer gebildete monolithisch integrierte Struktur aufgebaut wird, wobei Verfahren mit integrierten Schaltkreisen in sehr großem Maßstab verwendet werden. Der optische Nachweis der elektromagnetischen (UV, VIS oder IR) Antwort erfolgt mittels eines monolithisch im Wafer integrierten CCD-Sensorarrays.
  • Aus WO-A-97/12225 ist ein integrierter optischer Interferometersensor bekannt, in dem das optische Signal verstärkt und verarbeitet wird, indem (1) ein Teil der planaren Wellenleiterstruktur behandelt und (2) ein Strahlenverarbeitungsbereich zwischen den beiden Bereichen des Wellenleiters integriert wird. Die integrierten Signalverarbeitungsfähigkeiten erhöhen das Signal/Rausch-Verhältnis um mehr als eine Größenordnung gegenüber einer ähnlichen "Multimode"-Vorrichtung.
  • 2. Kurze Darstellung der Erfindung
  • Die Erfindung umfaßt eine Biosensorvorrichtung mit integriertem Mikrochip, wie sie in den Ansprüchen definiert ist.
  • Eine solche Vorrichtung kann mehrere optische Sensorelemente und Mikroelektronikeinheiten auf einem einzigen integrierten Chip in Kombination mit einem oder mehreren Biorezeptoren auf Nukleinsäurebasis, die zum Nachweis sequenzspezifischer genetischer Bestandteile in komplexen Proben vorgesehen sind, verwenden.
  • Die Mikrochips vereinigen integrierte Schaltkreiselemente, elektrooptische Einheiten, Anregungs/Detektionssysteme sowie Rezeptorsonden auf Nukleinsäurebasis in einer unabhängigen und integrierten Mikrovorrichtung. Zu einer Grundversion des Biochips gehören beispielsweise: (1) eine Anregungslichtquelle; (2) eine Biorezeptorsonde; (3) ein Element zur Probennahme; (4) einen Detektor; und (5) ein System zur Signalverstärkung/-behandlung.
  • Die erfindungsgemäßen Biomikrochips mit integriertem Schaltkreis umfassen einen integrierten Schaltkreis, der einen optischen Transducer sowie die dazugehörige Optik und einen Schaltkreis zur Erzeugung eines elektrischen Signals als Antwort auf Licht oder eine andere Strahlung, die die Anwesenheit einer biologischen Zielspezies, insbesondere einer Nukleinsäure, anzeigt, beinhaltet. In dem Chip kann ebenso ein Träger zur Immobilisierung einer Biosonde, bei der es sich vorzugsweise um eine Nukleinsäure handelt, enthalten sein. In besonderen Ausführungsformen kann die Nukleinsäure mit einem Tag versehen oder mit einer Substanz markiert sein, das bzw. die ein nachweisbares Signal emittiert; beispielsweise Lumineszenz.
  • Andererseits kann die an die immobilisierte Biosonde gebundene Biosonde mit einem Tag versehen oder mit einer Substanz markiert sein, die ein nachweisbares oder verändertes Signal emittiert, wenn sie mit der Zielnukleinsäure kombiniert wird. Die mit dem Tag oder der Markierung versehene Spezies kann fluoreszieren, phosphorisieren oder in anderer Weise lumineszieren oder kann Raman-Energie emittieren bzw. Energie absorbieren.
  • Die Vorteile der erfindungsgemäßen hochintegrierten Biosensoren bestehen teilweise darin, daß mehrere optische Sensorelemente sowie mikroelektronische Einheiten auf einem einzelnen integrierten Schaltkreis angebracht werden und daß weiterhin der Chip in bevorzugten Ausführungsformen mit mehreren molekularen Hybridisierungssonden kombiniert wird (Geiger et al., 1990; Aubert et al., 1988). Wenn die Sonden selektiv an eine Zielspezies binden, wird ein Signal erzeugt, das von dem Chip aufgenommen wird. Das Signal kann dann auf verschiedene Weise je nach Beschaffenheit des Signals verarbeitet werden.
  • In einem Aspekt betrifft die folgende Erfindung ein integriertes System, das (1) eine Zielnukleinsäuresequenz kombiniert mit einer biologischen Sonde, die modifiziert ist, um Licht oder andere Strahlung einer ersten Frequenz zu empfangen und dadurch Licht oder andere Strahlung einer von der ersten Frequenz verschiedenen Frequenz zu emittieren und (2) um die emittierte Strahlung mittels eines Phototransducers nachzuweisen, umfaßt. Bei der Zielnukleinsäure handelt es sich typischerweise um eine einzigartig charakteristische Gensequenz eines Krankheitserregers, wie beispielsweise eines Pilzes, Bakteriums oder Virus, oder um eine andere bestimmte Nukleinsäurespezies, wie man sie beispielsweise in Säugerzellenmutanten oder in Personen mit ererbten Stoffwechselfehlern finden kann. Die Zielnukleinsäure wird modifiziert oder markiert, so daß sie ein Tag oder eine Markierung enthält, das bzw. die ein Signal emittiert, wenn es bzw. sie einem einfallenden Licht oder einer anderen Strahlung ausgesetzt wird.
  • Die Zielnukleinsäure kann auf dem integrierten Mikrochip, der ebenfalls einen Phototransducer und damit zusammenhängende Detektionsschaltkreise trägt, immobilisiert sein. Andererseits kann eine Gensonde auf einer Membran oder einem Filter immobilisiert werden, die bzw. der dann an den Mikrochip oder die Detektoroberfläche selbst, wie z. B. den hierin beschriebenen Transducerdetektor, gebunden wird. Die Notwendigkeit einer direkten Bindung des Biorezeptors an den Transducer wird bei diesem Ansatz umgangen, der somit für die Vereinfachung der Produktion im Großmaßstab attraktiv ist.
  • In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform läßt man stark gerichtetes oder fokussiertes Licht auf eine Zielnuklein fallen, die von Natur aus oder aufgrund eines entsprechenden Tag bzw. einer entsprechenden Markierung bei Bestrahlung ein nachweisbares Signal emittiert. Die Bestrahlung kann von einer geeigneten Lichtquelle aus erfolgen, wie z. B. einem Laserstrahl oder einer Licht emittierenden Diode (LED). Bei den Raman-, Fluoreszenz- und Phosphoreszenz-Detektionsmoden wird das einfallende Licht weiterhin getrennt vom emittierten Licht gehalten, wobei unterschiedliche Lichtwege und/oder geeignete optische Filter, um das einfallende Licht vom Detektor fernzuhalten, verwendet werden.
  • Eine Zielnukleinsäuresequenz wird vorzugsweise mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die für diesen Zweck ausgewählt wird (Biosonde). Wie weiter oben erwähnt, wird die ausgewählte Biosonde auf einem geeigneten Substrat, entweder auf dem Biochip selbst oder auf einem membranähnlichen Material, immobilisiert, das dann mit der Chipoberfläche in Kontakt gebracht oder an diese gebunden wird. Die Biosonde kann mit einem Tag markiert werden, das in der Lage ist, Licht oder andere, nichtradioaktive Energie zu emittieren. Nach Hybridisierung mit einer Zielnukleinsäuresequenz läßt sich das Hybridprodukt mit Licht einer geeigneten Wellenlänge bestrahlen und emittiert dann ein Signal entsprechend der Menge an hybridisierter Zielnukleinsäure, siehe 20. Die markierte Biosonde kann einen markierten molekularen Biorezeptor enthalten. Es ist von Vorteil, bekannte Rezeptoren zu verwenden, da diese für ihre Fähigkeit, an die Zielnukleinsäuresequenz selektiv zu binden, bekannt sind. In gewissen besonderen Beispielen kann der Biorezeptor selbst Änderungen in der Lichtemission zeigen, wenn sein entsprechendes Molekül gebunden wird.
  • Bei gewissen Anwendungen kann es wünschenswert sein, die Menge an biologischem Zielmolekül zu erhöhen, wenn in einer Probe nur Spuren davon vorhanden sind. Die folgende Erfindung ist mit der Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR), bei der es sich um eine Technik zur Amplifikation von DNA-Sequenzen handelt, kompatibel.
  • Es gibt mehrere Verfahren zur selektiven Identifizierung biologischer Spezies, einschließlich Antikörpernachweis und -assay, wie den allgemein bekannten "Enzyme-linked immunosuppressant Assay" (ELISA), wobei molekulare Hybridisierungstechniken eingesetzt werden. Im allgemeinen besteht die Möglichkeit, sequenzspezifische Nukleinsäureabschnitte zu identifizieren und zu diesen Abschnitten komplementäre Sequenzen zu konstruieren, wodurch eine für eine Zielzelle, wie z. B. verschiedene Zellen von Krankheitserregern oder selbst Säugerzellen, die gegenüber ihren Normalformen mutiert sind, spezifische Sonde erzeugt wird. In vielen Fällen können einzigartige, für einen Organismus spezifische Sequenzen als Sonden für einen bestimmten Organismus oder Zelltyp verwendet werden. So wurden beispielsweise bei der quantitativen phänotypischen Analyse von Hefedeletionsmutanten einzigartige Nukleinsäuresequenz-Identifizierungsmoleküle verwendet, um Deletionsstämme durch Hybridisierung mit mit Tags versehenen Sonden unter Verwendung eines Parallelarrays mit hoher Dichte zu analysieren (Shoemaker et al., 1996).
  • Bei der Hybridisierung wird ein Nukleinsäure-Einzelstrang mit einer komplementären Sondensequenz verbunden. Die Hybridisierung einer Nukleinsäuresonde an Nukleinsäuresequenzen, wie z. B. Gensequenzen aus Bakterien oder virale DNA, bietet einen sehr hohen Grad an Genauigkeit zur Identifizierung von Nukleinsäuresequenzen, die zur Sequenz der Sonde komplementär sind. Nukleinsäurestränge neigen dazu, mit ihren Komplementen in doppelsträngigen Strukturen zu paaren. So findet ein einzelsträngiges DNA-Molekül sein Komplement in einem komplexen DNA-Gemisch, das eine große Anzahl von anderen Nukleinsäuremolekülen enthält. Daher sind Detektionsverfahren mit Nukleinsäuresonden (z. B. Gensonde) sehr spezifisch für DNA-Sequenzen. Zu den Faktoren, die die Hybridisierung oder Reassoziierung zweier komplementärer DNA-Stränge beeinflussen, gehören Temperatur, Kontaktdauer, Salzkonzentration, das Ausmaß an Fehlpaarungen zwischen den Basenpaaren sowie die Länge und Konzentration der Ziel- und Sondensequenzen. In der möglicherweise einfachsten Verfahrensweise wird die Hybridisierung an einem immobilisierten Ziel- oder einem Sondenmolekül, das an eine feste Oberfläche, wie z. B. eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran oder eine Glasplatte gebunden ist, durchgeführt.
  • 3. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Zum vollständigeren Verständnis der vorliegenden Erfindung sowie der Vorteile davon wird nun auf die folgende Beschreibung zusammen mit den beigefügten Zeichnungen verwiesen, in denen gleiche Bezugsziffern auf gleiche Merkmale hinweisen und wobei:
  • in 1 eine schematische Explosionsansicht eines Beispiels eines erfindungsgemäßen DNA-Biochips gezeigt ist;
  • in 2 ein schematisches Diagramm eines möglichen optischen Detektors und Verstärkerschaltkreises gezeigt ist, der auf einem integrierten Schaltkreis angebracht werden kann, um ein optisches Signal in ein elektrisches Signal umzuwandeln, das zur Digitalisierung und Erfassung der Daten mittels eines Computers geeignet ist;
  • in 3 eine perspektivische, teilvergrößerte und schematische Explosionsansicht eines Biochips mit mehreren Arrays aus Anregungslichtquellen und Detektoren gezeigt ist;
  • in 4 eine schematische Schnittansicht eines Mikrochipsystems mit integriertem Schaltkreis für einen Biochip mit integrierten Anregungsquellen in Form von Licht emittierenden Dioden gezeigt ist;
  • in 5 ein schematisches Schaltkreisdiagramm für eine integrierte Lichtquelle in Form einer Licht emittierenden Diode (LED) und eine Phototransistor-Detektionsvorrichtung dargestellt ist.
  • in 6 ein Schema eines integrierten Schaltkreises, in dem die in 5 dargestellte Lichtquelle und Detektionsvorrichtung realisiert sind, dargestellt ist;
  • in 7 eine physikalische Anordnung eines großflächigen, 4 × 4 Arrays aus n-Well integrierten Verstärker-Photodioden, der in Form eines einzelnen speziellen integrierten Schaltkreises gestaltet ist, dargestellt ist;
  • in 8 ein schematischer Querschnitt einer im Photodiodenarray der 7 verwendeten n-Well-Photodiode dargestellt ist;
  • in 9 ein Detektionsschaltkreis zur Verwendung in Verbindung mit dem Photodiodenarray der 7 dargestellt ist;
  • in 10 ein alternativer Detektionsschaltkreis zur Verwendung in Verbindung mit dem Photodiodenarray der 7 dargestellt ist;
  • in 11 schematisch ein Analogmultiplexer dargestellt ist, mit dem jedes Element im Photodiodenarray der 7 mit einem Verstärker verbunden werden kann;
  • in 12 eine mögliche schematische Ausführung des Multiplexers in 11 zur Verwendung mit 16 Zellen dargestellt ist;
  • in 13 schematisch ein teilweises paralleles System dargestellt ist, das zur Gewinnung von Daten aus dem in 7 gezeigten Photodiodenarray verwendet werden kann. Das teilweise parallele System hat nur jeweils ein read-out-System für jede Zeile von Photodetektoren;
  • in 14 ein vollparalleles System dargestellt ist, das zur Gewinnung von Daten aus dem in 7 gezeigten Photodiodenarray verwendet werden kann. Die vollparallele Vorrichtung hat ein read-out-System (Verstärker, Elektronik) für jeden Photodetektor;
  • in 15 eine Eichkurve für einen mit dem Farbstoff NIR markierten DNA-Einzelstrang (5'-CCTCCTCCTTCCCAGCAGGG-3'; SEQ ID NO: 1) über einen Konzentrationsbereich von 1 pmol/μl bis 3 fmol/μl gezeigt ist;
  • in 16 die Meßergebnisse von Gensonden gezeigt sind, die mit Fluorescein, einer im sichtbaren Bereich emittierenden Farbstoffmarkierung, als Tag versehen sind;
  • in 17 die Leistung eines Phototransistor- und Verstärkerschaltkreises eines Mikrochips mit integriertem Schaltkreis (Integrated Circuit Microchip, ICM) dargestellt ist, wobei der Phototransistor- und Verstärkerschaltkreis aus einem 2 μm, p-Well-CMOS-Prozeß, der eine Fläche von 160000 Quadratmikrometern einnimmt, und 220 Phototransistorzellen in Reihenschaltung besteht, indem die Signalausgangsantwort für verschiedene Konzentrationen des mit einem kleinen Helium-Cadmium-Laser (8 mW, 325 nm) angeregten Farbstoffmarkers Rhodamin-6G gezeigt ist;
  • in 18 schematisch ein experimenteller Aufbau dargestellt ist, der zur Auswertung einer Mikrochipvorrichtung mit integrierten Verstärker/Phototransistorschaltkreisen in einem 4 × 4-Array verwendet werden kann;
  • in 19 die Ergebnisse dargestellt sind, nachdem vier Proben von jeweils 1 μl Fluorescein-markierter DNA punktförmig auf eine Nitrocellulosemembran aufgebracht wurden, die über einen Detektionskanal der in 18 gezeigten Vorrichtung gelegt wurde;
  • in 20 die Eichkurve der Fluorescein-markierten DNA unter Verwendung der in 18 gezeigten Vorrichtung dargestellt ist;
  • in 21 eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dargestellt ist, die für Absorptions- und Reflektionsmessungen verwendet wird;
  • in 22 ein schematischer senkrechter Schnitt durch einen Teil eines erfindungsgemäßen Biochips gezeigt ist, bei dem entweder mit Lumineszenzstrahlung oder Raman-Strahlung gearbeitet werden kann;
  • in 23 ein schematischer senkrechter Schnitt durch einen Teil eines Biochips gezeigt ist, bei dem zur Detektion Lumineszenzenergie oder Raman-Energie eingesetzt werden kann oder der über den Nachweis des Absorptionsgrads eines Lichtstrahls funktioniert;
  • in 24 eine Draufsicht einer erfindungsgemäßen Ausführungsform dargestellt ist, die zum Nachweis von Proben aus einer mikrofluidischen Vorrichtung über mehrere Zellen verwendet wird;
  • in 25 ein schematischer senkrechter Schnitt durch ein mikrofluidisches System zur Injektion einer flüssigen und gasförmigen Probe in den und aus dem in der in 24 dargestellten Ausführungsform verwendeten ICM-Chip dargestellt ist;
  • in 26 eine erfindungsgemäße Ausführungsform dargestellt ist, mit der Proben aus einer mikrofluidischen Vorrichtung nachgewiesen werden, wobei eine Abbildungslinse, binäre Optik oder ein Array von Linsen verwendet wird, um jeden mikrofluidischen Kanal auf einem Detektorelement des ICM abzubilden;
  • in 27 ein mikroelektromechanisches System (MEMS) dargestellt ist, das zur Konstruktion eines ICM mit "Random Access Microsensing" verwendet wird;
  • in 28 ein Überblick über ein ICM-System dargestellt ist, das das in 27 dargestellte MEMS verwendet;
  • in 29 eine erfindungsgemäße Ausführungsform dargestellt ist, in der einzeln ansteuerbare, integrierte VCSEL (Vertical-Cavity Surface-Emitting Laser) sowie axiale und/oder außerachsige Diffraktionslinsen verwendet werden;
  • in 30 eine LED-Treiberschaltung gezeigt ist, wobei es sich bei V1 um eine Gleichstromspannung (z. B. 5 V) und bei V2 um eine Gleichstromspannung (5 V zum Anschalten der LED und 0 V zum Abschalten der LED) oder eine Pulsfolge, wobei bei einem Niveau von 5 V die LED angeschaltet und bei 0 V abgeschaltet wird, handelt;
  • in 31 eine Apparatur zur Herstellung von DNA-Proben-Mikroarrays gezeigt ist. Zu erkennen sind ein Picopumpen-Steuergerät, 601; die Picopumpe, 602; Auftragsspitze, 603; Probe, 604; Substrat, 605; Fritte, 606; Vakuumanschluß, 607; zweiachsige Translationsbühne, 608; und Computer-Steuergerät, 609;
  • in 32 ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Biochips gezeigt ist;
  • in 33 die Ergebnisse der zwischen komplementären DNA-Sequenzen stattfindenden Hybridisierung und des Nachweises von Fluoreszenzsignalen unter Verwendung eines Nukleinsäure-Biochips gezeigt sind. Über dem Hintergrund liegende Fluoreszenzsignale wurden bei denjenigen Biochipkanälen nachgewiesen, in denen eine Hybridisierung markierter DNA-HIV-1-Gensonden mit komplementär gebundenen DNA-Fragmenten stattgefunden hatte. Die Signale im 4 × 4-Array des 3-dimensionalen Graphs zeigten eine positive Hybridisierung mit den verwendeten HIV-1-Sonden an. Ein Referenzsystem aus negativen Leerproben (bestehend aus DNA-Sonden ohne die HIV-1-Gensequenz) zeigte nur schwache Hintergrund-Fluoreszenzsignale.
  • 4.0 BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
  • 4.1 DEFINITIONEN
  • Bei einem integrierten Schaltkreis (Integrated Circuit, IC) handelt es sich um eine Schaltung, die aus Elementen wie z. B. Transistoren, Widerständen und Kondensatoren besteht, die in einem Einzelteil aus einem Halbleitermaterial, normalerweise Silizium- oder Galliumarsenid, hergestellt werden. Der "integrierte Schaltkreis" läßt sich in hochintegrierten Strukturen verwenden, einschließlich z. B.:
    • 1) Multichip-Modulen, wobei mehrere ICs und weitere Schaltungselemente, einschließlich molekularer Zielsonden, miteinander in kompakter Weise auf einem Polymer-, Quarz-, Glas-, Silber-, Keramiksubstrat oder anderen Substraten kombiniert werden können. In manchen Fällen kann ein IC das Substrat für andere Komponenten, wie z. B. darauf angebrachte Photodioden oder LEDs, darstellen;
    • 2) Hybrid-Mikroschaltkreise, wobei einer oder mehrere ICs und weitere Schaltungselemente auf einem oder mehreren Substraten) angebracht sind; und
    • 3) weitere kompakte elektromechanische Anordnungen eines Schaltkreises, der vorwiegend einen, aber möglicherweise mehrere ICs sowie weitere elektronische Komponenten und mikroelektromechanische Systeme (MEMS) enthält.
  • 4.2 EINIGE VORTEILE DER ERFINDUNG
  • Das DNA-Biochipsystem bietet eine einzigartige Kombination aus Leistungsvermögen und analytischen Leistungsmerkmalen, die in keinem anderen zur Zeit erhältlichen DNA-Analysesystem verfügbar sind. Mit ihrem Multikanalpotential ist die DNA-Biochiptechnologie das zur Zeit einzige System, das den gleichzeitigen Nachweis mehrerer DNA-Zielmoleküle zur gleichen Zeit gestattet. Der vorliegende Biochip bietet ebenso mehrere Vorteile hinsichtlich Größe, Leistung, Herstellung, Analyse sowie Herstellungskosten. Die kleinen Größen der Sonden (Mikroliter bis Nanoliter) minimieren den Bedarf an Probe und reduzieren den Bedarf an Reagentien und Abfall. Hochintegrierte Systeme führen zu einer Verringerung des Rauschens sowie einer Signalverstärkung aufgrund der verbesserten Effizienz der Probensammlung und der Reduzierung von Schnittstellen. Die Fähigkeit zur Produktion im Großmaßstab unter Verwendung kostengünstiger IC-Technologie ist ein wichtiger Vorteil. Der Konstruktionsprozeß für verschiedene Komponenten vereinfacht sich durch die Integration mehrerer Elemente auf einem einzigen Chip. Bei medizinischen Anwendungen gestattet dieser Kostenvorteil die Entwicklung äußerst kostengünstiger Einweg-Biochips, die sich zur medizinischen Krankheitsdiagnose zu Hause einsetzen lassen, ohne daß Proben zur Analyse an ein Labor geschickt werden müssen.
  • 4.3 KONSTRUKTION UND ARBEITSPRINZIP DES DNA-BIOCHIPS
  • 4.3.1 INTEGRIERTE BIOCHIPS
  • Zwei grundlegende Arbeitsprinzipien eines Biosensors sind: (1) "Biologische Erkennung"; und (2) "Sensing". Das Grundprinzip eines Biosensors besteht darin, diese molekulare Erkennung nachzuweisen und sie in eine andere Signalform unter Verwendung eines Transducers zu überführen. Es gibt unterschiedliche Arten von Transducern, die entweder ein optisches Signal (d. h. optische Biosensoren) oder ein elektrochemisches Signal (d. h. elektrochemische Biosensoren) oder ein Signal auf Massenbasis (z. B. Mikrowaagen, Vorrichtungen mit akustischen Oberflächenwellen, Mikrocantilever) produzieren können. Es gibt ebenfalls unterschiedliche Arten von Biorezeptoren, die aus einem Enzym, einem Antikörper, einem Nukleinsäurefragment, einem Chemorezeptor, einem Gewebe, einer Organelle oder einem Mikroorganismus bestehen können. In einigen Fällen läßt sich ein synthetisches Molekül, häufig biomimetischer Rezeptor genannt (z. B. synthetischer Antikörper, molekularer Abdruck), zur Nachahmung der Eigenschaften biologischer Rezeptoren verwenden.
  • Es wurde nun ein integrierter DNA-Biochip entwickelt, bei dem Nukleinsäuresonden und ein Detektionssystem in Form einer unabhängigen Mikrovorrichtung verwendet werden. In dem DNA-Biochip werden integrierte Schaltungselemente, Elektrooptik, ein Anregungs-/Detektionssystem sowie Biorezeptorsonden auf DNA-Basis zu einer unabhängigen und integrierten Mikrovorrichtung kombiniert. Ein elementarer DNA-Biochip enthält: (1) eine Anregungslichtquelle mit dazugehöriger Optik; (2) eine Biosonde; (3) eine Probennahmeplattform und ein Zuführsystem; (4) einen optischen Detektor mit damit verbundener Optik und Dispersionsvorrichtung; und (5) ein System zur Signalverstärkung/-bearbeitung.
  • Die Konstruktion eines DNA-Biochips beinhaltet die Integration mehrerer Basiselemente von sehr unterschiedlicher Beschaffenheit. Die grundlegenden Schritte umfassen: (a) die Auswahl oder Entwicklung des Biorezeptors; (b) die Auswahl der Anregungsquelle; (c) die Auswahl oder Entwicklung des Transducers; und (d) die Integration des Anregungsquelle-Biorezeptor-Transducer-Systems.
  • Die Entwicklung des DNA-Biochips umfaßt drei größere Elemente. Zum ersten Element gehört die Entwicklung eines Systems von Biorezeptorsonden: ein Mikroarray von DNA-Sonden auf einer Multiarray-Probennahmeplattform. Das zweite Element konzentriert sich auf die Entwicklung nichtradioaktiver Verfahren zum optischen Nachweis: die Fluoreszenztechnik. Zum dritten Element gehört die Entwicklung eines integrierten elektrooptischen IC-Systems auf einem einzelnen Chip für das Biosensing: Photodiode-Verstärker-Mikrochip mit CMOS-Technologie.
  • 4.3.2 ARBEITSPRINZIP VON POLYNUKLEOTIDSONDEN MOLEKULARE HYBRIDISIERUNG
  • Während die Verwendung immunologischer Sonden auf Antikörper-Antigen-Reaktionen beruht, beruht die Funktion von Gensonden auf dem Verfahren der Hybridisierung, bei dem es sich um eine der leistungsfähigsten und nützlichsten Techniken in der molekularen Genetik handelt. Bei der Hybridisierung wird ein Nukleinsäure-Einzelstrang mit einer komplementären Sondensequenz verbunden. Die Hybridisierung einer Nukleinsäuresonde an biologische DNA-Zielmoleküle (z. B. Gensequenzen, Bakterien, virale DNA, p53-Krebsgenmutation usw.) bietet einen sehr hohen Grad an Genauigkeit zur Identifizierung von DNA-Sequenzen, die zu derjenigen der Sonde komplementär sind. Nukleinsäurestränge neigen zur Paarung mit ihren Sequenzkomplementen (d. h. Adenin-Thymin-, Guanin-Cytosin-Paarung) in der entsprechenden doppelsträngigen Struktur. Ein einzelsträngiges DNA-Molekül findet sein Komplement in einem komplexen DNA-Gemisch, das große Mengen anderer Nukleinsäuremoleküle enthält. Es wurden verschiedene Arten von Gensonden entwickelt, die mit Fluoreszenzmarkierungen (Isola et al., 1996; Vo-Dinh et al., 1998; Vo-Dinh et al., 1998) oder mit Raman-Markierungen (Vo-Dinh et al., 1998; Isola et al., 1998) markiert sind.
  • 4.3.3 PLATTFORM ZUR AUFNAHME VON MIKROPROBEN
  • DNA-Sonden können direkt oder indirekt auf das Biochip-Transducer-Sensorelement immobilisiert werden, so daß ein optimaler Kontakt und maximale Detektion hergestellt werden. Nach Immobilisierung auf einem Substrat lassen sich die Gensonden wiederholt wiederverwenden. In einer Ausführungsform wird die Hybridisierung an einem immobilisierten Ziel- oder einem Sondenmolekül durchgeführt, das an eine feste Oberfläche gebunden ist. DNA läßt sich an unterschiedliche Arten von Trägermaterialien mit mehreren Verfahren binden. Bei dem üblicherweise zur Bindung von DNA an Glas verwendeten Verfahren wird die Glasoberfläche zunächst silanisiert und dann mit Carbodiimid oder Glutaraldehyd aktiviert.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform werden die Gensonden auf einer Membranplattform immobilisiert, die auf die Transducer-Detektionsoberfläche plaziert wird. Auf diese Weise braucht der Biorezeptor nicht an den Biochip-Transducer gebunden zu werden, was eine einfachere Produktion im Großmaßstab erleichtern kann.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform werden 5'-terminale Schutzgruppen durch kontrollierte Belichtung durch eine photolithographische Maske selektiv von wachsenden Polynukleotidketten in vorbestimmten Bereichen eines Trägers (wie z. B. Glas) abgetrennt (Fodor et al., 1991; McGall et al., 1997). Mit diesem Verfahren lassen sich Polynukleotidsonden-Arrays mit Dichten bis zu etwa 106 einmaligen Sondensequenzen pro cm2 herstellen.
  • Zur direkten Absorption von DNA geeignete Plastikplatten (oftmals im Multi-Well-Format verwendet) können zur Entwicklung von Probennahmeplattformen für den Biochip eingesetzt werden. Zur Bindung von DNA über kovalente Verknüpfung geeignete, chemisch aktivierte Platten sind auch kommerziell zum Gebrauch erhältlich (CoStar, Cambridge, MA). Man stellt Multiarrays aus punktförmig aufgetragenen Proben her, und flüssige DNA-Lösungen werden auf die Probennahmeplattform unter Verwendung einer pneumatischen Picopumpe (31) (World Precision Instruments, Sarasota, FL) aufgetragen. Die Picopumpe ist dazu in der Lage, regelmäßige Mikrospots mit einem Durchmesser im Bereich von 500–800 μm zu produzieren, wobei ihre Größe so gewählt werden kann, daß sie mit der Größe der Biochip-Detektorelemente übereinstimmt. Die DNA-Probe wird in eine Glaskapillare mit kleinem Durchmesser aufgezogen, die einige wenige Millimeter über der Probennahmeplattform gehalten wird. Die Membran wird auf einem Vakuumkolben, der mit einer Metalldrahtfritte ausgestattet ist, an Ort und Stelle gehalten. Der Vakuumschritt dient zwei wichtigen Zwecken. Zunächst verbessert das an die Membran angelegte Vakuum die Reproduzierbarkeit des punktförmigen Auftragens, indem die Membran flach gegen die Metalldrahtoberfläche gedrückt wird. Der Vakuumschritt besitzt ebenso einen verkürzenden Effekt auf den Probentrocknungsprozeß, wodurch die Größe des Probenspots verkleinert wird, indem die Verbreitung der Probe über die Probennahmeplattform verhindert wird. Das Biochipformat läßt sich so gestalten, daß es mit der Polymerasekettenreaktion (PCRTM) kompatibel ist, bei der es sich um eine wichtige Technik handelt, die die Replikation definierter DNA-Sequenzen gestattet, wodurch der Nachweis dieser Sequenzen amplifiziert wird.
  • 4.4 BIOSENSORSONDEN
  • Die Entwicklung von Biosensortechnologien zum Nachweis von Spuren an biologischen Spezies in komplexen Systemen ist wichtig für viele biomedizinische und Umweltanwendungen. Es wurden spektroskopische chemische Sensoren und Biosensoren entwickelt, bei denen laserinduzierte Fluoreszenz, Phosphoreszenz bei Raumtemperatur, oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie, Immunfluoreszenz auf Antikörperbasis und Gensonden-Raman-Sensing-Verfahren, einschließlich Gensonden mit oberflächenverstärkten Raman-Streuungsmarkierungen zur Verstärkung der Selektivität und Empfindlichkeit chemischer Sensoren und Biosensoren, verwendet wurden (Vo-Dinh et al., 1994).
  • In der vorliegenden Erfindung werden spektroskopische Techniken wie z. B. Lumineszenz mit Markierungen im sichtbaren und NIR-Bereich ist ein sinnvolles Nachweisschema für Genbiosensoren ohne die Beschränkung von radioaktiven Verfahren.
  • Nichtradioaktive Sonden, insbesondere Gensonden, sind aufgrund ihrer Selektivität zusätzlich zur Vermeidung der mit radioaktiven Materialien verbundenen Gefahren wünschenswert. Die Erkennung und die Detektion biologischer Spezies beruht auf dem Prinzip, daß zellspezifische Nukleinsäuresequenzen spezifisch erkannt werden können und mit einem Rezeptor, der mit dieser Spezies spezifisch eine Bindung eingeht, kombiniert werden können. Zu solchen Rezeptoren gehören beispielsweise Antikörper, Enzyme, Zellen, bakterielle Sonden, komplementäre Nukleinsäuren oder Nukleinsäuren, die selektiv mit einer zellspezifischen Nukleinsäuresequenz hybridisieren. Rezeptoren können in Form von Organellen, Gewebsbestandteilen, Chemorezeptoren oder sogar ganzen Zellen oder Mikroorganismen gefunden und eingesetzt werden. Weitere Rezeptorarten können biomimetische Materialien, wie z. B. Cyclodextrine, Materialien für molekularen Abdruck, usw. einschließen.
  • Gensonden funktionieren auf der Basis eines Hybridisierungsprozesses. Bei der Hybridisierung wird ein Nukleinsäureeinzelstrang mit einer komplementären Sondensequenz verbunden. Die Hybridisierung einer Nukleinsäuresonde an ein biologisches Zielmolekül wie beispielsweise bakterieller oder viraler DNA oder RNA oder ausgewählten Genabschnitten bietet einen hohen Grad an Genauigkeit zur Identifizierung von zu der Sonde komplementären Nukleinsäuresequenzen. Nukleinsäurestränge neigen zur Paarung mit komplementären Strängen, wie sie typischerweise in doppelsträngigen DNA-Strukturen gefunden werden. Daher findet eine einzelsträngige DNA (oder RNA) ihr Komplement in einem komplexen DNA-Gemisch, das große Mengen an anderen Nukleinsäuremolekülen enthält. Nachweisverfahren mit Nukleinsäuresonden oder Gensonden sind spezifisch für DNA-Sequenzen. Zu den Faktoren, die die Hybridisierung oder Reassoziierung zweier komplementärer DNA-Stränge beeinflussen, gehören Temperatur, Kontaktdauer, Salzkonzentration, das Ausmaß der Fehlpaarungen zwischen den Basenpaaren sowie die Länge und Konzentration der Ziel- und Sondensequenzen.
  • 4.5 ZUSAMMENSETZUNGEN AUS PEPTIDNUKLEINSÄUREN
  • In bestimmten Ausführungsformen wird die Verwendung von Peptidnukleinsäuren (PNAs) bei der praktischen Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren in Betracht gezogen. PNA ist ein DNA-Mimetikum, bei dem die Nukleobasen an ein Pseudopeptidrückgrat gebunden sind (Good und Nielsen, 1997). PNAs können in einer Reihe Verfahren, in denen herkömmicherweise RNAs oder DNAs eingesetzt wurden, verwendet werden. Oftmals funktionieren PNA-Sequenzen in technischen Verfahren besser als die entsprechenden RNA- oder DNA-Sequenzen und weisen nützliche Eigenschaften auf, die in RNA oder DNA nicht von Natur aus vorhanden sind. Ein ausgezeichneter Übersichtsartikel über PNA von Corey (1997) enthält Verfahren zur Herstellung, Eigenschaften und Verfahren zur Verwendung davon und wird hiermit unter Bezugnahme aufgenommen.
  • 4.5.1 VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON PNAs
  • Nach Corey besitzen PNAs 2-Aminoethylglycin-Verknüpfungen, die das normale Phosphodiesterrückgrat der DNA ersetzen (Nielsen et al., 1991; Hanvey et al., 1992; Hyrup und Nielsen, 1996; Neilsen, 1996). Diese Chemie hat drei wichtige Konsequenzen: erstens sind PNAs im Gegensatz zu DNA oder Phosporothioat-Oligonukleotiden neutrale Moleküle; zweitens sind PNAs achiral, weswegen keine stereoselektive Synthese entwickelt zu werden braucht; und drittens werden in der PNA-Synthese Boc- (Dueholm et al., 1994) oder Fmoc(Thomson et al., 1995) Standardvorschriften für die Festphasen-Peptidsynthese verwendet, obwohl andere Verfahren, einschließlich eines modifizierten Merrifield-Verfahrens, verwendet worden sind (Christensen et al., 1995).
  • PNA-Monomere oder vorgefertigte Oligomere sind von PerSeptive Biosystems (Framingham, MA, USA) kommerziell erhältlich. PNA-Synthesen sowohl nach den Bocals auch den Fmoc-Vorschriften sind einfach, wobei manuelle oder automatische Vorschriften verwendet werden (Norton et al., 1995). Die manuelle Vorschrift bietet sich für die Herstellung chemisch modifizierter PNAs oder die gleichzeitige Synthese von Familien nahverwandter PNAs an.
  • Wie bei der Peptidsynthese hängt der Erfolg einer bestimmten PNA-Synthese von den Eigenschaften der gewählten Sequenz ab. Während es beispielsweise theoretisch möglich ist, eine beliebige Kombination von Nukleotidbasen in PNAs einzubauen, kann das Vorhandensein von direkt benachbarten Purinen zu Deletionen eines oder mehrerer Reste im Produkt führen. In Erwartung dieser Schwierigkeiten wird vorgeschlagen, daß man bei der Herstellung von PNAs mit benachbarten Purinen die Kopplung von Resten, die wahrscheinlich unzurei chend addiert werden, wiederholen sollte. Daraufhin sollten die PNAs durch Reverse-Phase-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (Norton et al., 1995) gereinigt werden, wodurch sich für das Produkt Ausbeuten und eine Reinheit ergeben, die ähnlich zu den während der Synthese von Peptiden beobachteten Werten sind.
  • Weiterhin werden von Corey für gegebene Anwendungen gewünschte Modifikationen von PNAs erörtert. Modifikationen lassen sich auch erhalten, indem Aminosäuren während der Festphasensynthese gekoppelt werden oder indem Verbindungen gebunden werden, die eine Carbonsäuregruppe an dem exponierten N-terminalen Amin enthalten. Andererseits lassen sich PNAs nach der Synthese durch Kopplung an ein eingeführtes Lysin oder Cystein modifizieren. Die einfache Art und Weise, auf die PNAs modifiziert werden können, erleichtert die Optimierung hinsichtlich besserer Löslichkeit oder hinsichtlich spezifischer funktioneller Anforderungen. Nach der Synthese kann die Identität der PNAs und ihrer Derivate über Massenspektrometrie bestätigt werden. In mehreren Arbeiten wurden PNA-Modifikationen hergestellt und verwendet (Norton et al., 1995; Haaima et al., 1996; Stetsenko et al., 1996; Petersen et al., 1995; Ulmann et al., 1996; Koch et al., 1995; Orum et al., 1995; Footer et al., 1996; Griffith et al., 1995; Kremsky et al., 1996; Pardridge et al., 1995; Boffa et al., 1995; Landsdorp et al., 1996; Gambacorti-Passerini et al., 1996; Armitage et al., 1997; Seeger et al., 1997; Rusckowski et al., 1997). In der US-Patentschrift Nr. 5,700,922 werden chimäre PNA-DNA-PNA-Moleküle und ihre Verwendungen in der Diagnostik, bei der Modulation von Proteinen in Organismen sowie bei der Behandlung von auf Therapeutika ansprechenden Krankheitszuständen erörtert.
  • 4.5.2 PHYSIKALISCHE EIGENSCHAFTEN DER PNAs
  • Im Gegensatz zu DNA und RNA, die negativ geladene Verknüpfungen enthalten, ist das PNA-Rückgrat neutral. Trotz dieser dramatischen Veränderung erkennen PNAs komplementäre DNA und RNA über die Watson-Crick-Paarung (Egholm et al., 1993), wodurch das anfängliche Modell von Nielsen et al. (1991) bestätigt wurde. PNAs fehlt die 3'-5'-Polarität und können daher sowohl in paralleler als auch antiparalleler Weise binden, wobei die antiparallele Weise bevorzugt ist (Egholm et al., 1993).
  • Die Hybridisierung von DNA-Oligonukleotiden an DNA und RNA wird durch elektrostatische Abstoßung zwischen den negativ geladenen Phosphat-Rückgraten der komplementären Stränge destabilisiert. Im Gegensatz dazu erhöht das Fehlen der Ladungsabstoßung in PNA-DNA-bzw. PNA-RNA-Duplexen die Schmelztemperatur (Tm) und verringert die Abhängigkeit von Tm von der Konzentration ein- oder zweiwertiger Kationen (Nielsen et al., 1991). Die erhöhte Geschwindigkeit und Affinität der Hybridisierung sind signifikant, da sie für die überraschende Fähigkeit der PNAs, eine Stranginvasion komplementärer Sequenzen innerhalb relaxierter doppelsträngiger DNA durchzuführen, verantwortlich sind. Darüber hinaus läßt die effiziente Hybridisierung an "inverted repeats" vermuten, daß PNAs Sekundärstrukturen innerhalb doppelsträngiger DNA wirkungsvoll erkennen können. Eine wirkungsvolle Erkennung tritt auch bei an Oberflächen immobilisierten PNAs auf, wobei von Wang et al, gezeigt werden konnte, daß trägergebundene PNAs zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen verwendet werden können (Wang et al., 1996).
  • Man könnte erwarten, daß die feste Bindung von PNAs an komplementäre Sequenzen auch die Bindung an ähnliche (jedoch nicht identische) Sequenzen erhöhen würde, wobei die Sequenzspezifität der PNA-Erkennung reduziert würde. Wie bei der DNA-Hybridisierung läßt sich jedoch eine selektive Erkennung dadurch erzielen, daß ein Gleichgewicht zwischen Oligomerlänge und Inkubationstemperatur gefunden wird. Außerdem wird die selektive Hybridisierung der PNAs dadurch gefördert, daß die PNA-DNA-Hybridisierung weniger tolerant gegenüber Basenfehlpaarungen ist als DNA-DNA-Hybridisierung. So wird beispielsweise die Tm durch eine einzige Fehlpaarung innerhalb eines 16 Bp langen PNA-DNA-Duplex und bis zu 15°C reduziert (Egholm et al., 1993). Dieses hohe Diskriminationsniveau gestattete die Entwicklung mehrerer auf PNA beruhender Strategien für die Analyse von Punktmutationen (Wang et al., 1996; Carlsson et al., 1996; Thiede et al., 1996; Webb und Hurskainen, 1996; Perry-O'Keefe et al., 1996).
  • Eine hochaffine Bindung bietet klare Vorteile für die molekulare Erkennung und die Entwicklung neuer Anwendungen für PNAs. So inhibieren beispielsweise PNAs mit 11–13 Nukleotiden die Aktivität der Telomerase, eines Ribonukleoproteins, das unter Verwendung einer essentiellen RNA-Matrize Telomerenden verlängert, während die analogen DNA-Oligomere nicht inhibieren (Norton et al., 1996).
  • Neutrale PNAs sind hydrophober als analoge DNA-Oligomere, wodurch ihre Lösung bei neutralem pH erschwert werden kann, insbesondere wenn die PNAs einen hohen Puringehalt aufweisen oder das Potential zur Bildung von Sekundärstrukturen besitzen. Ihre Löslichkeit läßt sich durch Anfügen einer oder mehrerer positiver Ladungen an die PNA-Termini verbessern (Nielsen et al., 1991).
  • 4.5.3 ANWENDUNGEN VON PNAs
  • Von Allfrey und Mitarbeitern erhaltene Ergebnisse lassen vermuten, daß die Stranginvasion spontan an Sequenzen innerhalb chromosomaler DNA erfolgt (Boffa et al., 1995; Boffa et al., 1996). In diesen Arbeiten wurden PNAs auf Triplett-Wiederholungen der Nukleotide CAG gerichtet und diese Erkennung zur Reinigung transkriptionsaktiver DNA (Boffa et al., 1995) und zur Hemmung der Transkription (Boffa et al., 1996) verwendet. Dieses Ergebnis läßt vermuten, daß, wenn PNAs in Zellen gezielt zugeführt werden können, sie das Potential als allgemeine sequenzspezifische Regulatoren der Genexpression besitzen. Zu den Arbeiten und Übersichtsartikeln, die sich mit der Verwendung von PNAs als Antisense- und Antigen-Agentien beschäftigen, gehören Nielsen et al., (1993b), Hanvey et al., (1992), und Good und Nielsen (1997). Von Koppelhus et al., (1997) wurden PNAs zur Hemmung der inversen Transkription von HIV-1 eingesetzt, wobei gezeigt wurde, daß PNAs für antivirale Therapien verwendet werden können.
  • Verfahren zur Charakterisierung der Antisense-Bindungseigenschaften von PNAs werden in Rose (1993) und Jensen et al., (1997) erläutert. Rose verwendet Kapillargelelektrophorese, um die Bindung von PNAs an ihre komplementären Oligonukleotide zu bestimmen, wobei die relative Bindungskinetik und Stöchiometrie gemessen wurden. Ähnliche Arten von Messungen wurden von Jensen et al. unter Verwendung der BIAcoreTM-Technologie durchgeführt.
  • Zu weiteren Anwendungen von PNAs gehören die Verwendung bei der DNA-Stranginvasion (Nielsen et al., 1991), der Antisense-Hemmung (Hanvey et al., 1992), der Mutationsanalyse (Orum et al., 1993), in Transkriptionsverstärkern (Mollegaard et al., 1994), bei der Nukleinsäurereinigung (Orum et al., 1995), der Isolierung transkriptionsaktiver Gene (Boffa et al., 1995), der Blockierung der Bindung von Transkriptionsfaktoren (Vickers et al., 1995), der Genomspaltung (Veselkov et al., 1996), in Biosensoren (Wang et al., 1996), bei der in-situ-Hybridisierung (Thisted et al., 1996) sowie bei einer Alternative zum Southern-Blotting (Perry-O'Keefe, 1996).
  • 4.6 ANTIKÖRPERZUSAMMENSETZUNGEN UND HERSTELLUNGSVERFAHREN
  • In bestimmten Ausführungsformen wird die Verwendung von Antikörpern, die sowohl monoklonal als auch polyklonal sein können und die an eines oder mehrere der hierin offenbarten Polypeptide binden, in Betracht gezogen. Die Mittel zur Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Siehe z. B. Harlow und Lane, 1988; die Verfahren zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern (monoclonal antibodies, mAbs) beginnen im allgemeinen in derselben Art und Weise wie diejenigen zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern. Kurz gesagt wird ein polyklonaler Antikörper durch Immunisierung eines Tiers mit einer immunogenen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung und Sammeln der Antisera von diesem immunisierten Tier hergestellt. Für die Herstellung von Antiseren können viele verschiedene Tierspezies eingesetzt werden. Das für die Herstellung von Anti-Antiseren verwendete Tier ist typischerweise ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Meerschweinchen oder eine Ziege. Aufgrund des relativ großen Blutvolumens von Kaninchen ist ein Kaninchen eine bevorzugte Wahl für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern.
  • Wie im Fachgebiet allgemein bekannt, kann eine gegebene Zusammensetzung in ihrer Immunogenität variieren. Es ist daher häufig notwendig, das Wirtsimmunsystem zu stärken, was z. B. durch Kopplung eines Peptid- oder Polypeptid-Immunogens an einen Träger erreicht werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind das "Keyhole Limpet"-Hämocyanin (KLH) und Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin, BSA). Andere Albumine wie z. B. Ovalbumin, Mausserumalbumin oder Kaninchenserumalbumin können ebenfalls als Träger verwendet werden. Mittel zur Konjugation eines Polypeptids an ein Trägerprotein sind im Fachgebiet allgemein bekannt und umfassen Glutaraldehyd, m-Maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und Bis-biazotiertes Benzidin.
  • Wie ebenfalls im Fachgebiet allgemein bekannt ist, läßt sich die Immunogenität einer bestimmten Immunogenzusammensetzung durch die Verwendung nichtspezifischer Stimulantien der Immunantwort, die unter dem Namen Adjuvantien bekannt sind, verstärken.
  • Zu beispielhaften und bevorzugten Adjuvantien gehören das komplette Freund's Adjuvans (ein abgetötete Mycobacterium tuberculosis-Bakterien enthaltendes, nichtspezifisches Stimulans der Immunantwort), nicht komplette Freund's Adjuvantien und Aluminiumhydroxid-Adjuvans.
  • Die Menge an bei der Herstellung von polyklonalen Antikörpern verwendeter Immunogenzusammensetzung variiert je nach Beschaffenheit des Immunogens ebenso wie des für die Immunisierung verwendeten Tiers. Zur Verabreichung des Immunogens können verschiedene Wege verwendet werden (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal). Die Produktion von polyklonalen Antikörpern kann durch die Entnahme von Blut aus dem immunisierten Tier zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung überwacht werden. Ebenso kann man eine zweite, "Booster"-Injektion geben. Der Vorgang des "Boosting" und "Tittering" wird so lange wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht wird. Bei Erreichen eines gewünschten Immunogenitätsniveaus kann das immunisierte Tier ausgeblutet und das Serum isoliert und gelagert werden, und/oder das Tier kann zur Erzeugung von mAbs eingesetzt werden.
  • mAbs lassen sich leicht unter Verwendung allgemein bekannter Techniken, wie z. B. den in US-A-4,196,265 beispielshaft angegebenen, herstellen. Bei dieser Technik wird typischerweise ein geeignetes Tier mit einer ausgewählten Immunogenzusammensetzung, z. B. einem gereinigten oder teilgereinigten Polypeptid oder Peptid, immunisiert. Die immunisierende Zusammensetzung wird in einer Weise verabreicht, die die Stimulation von antikörperproduzierenden Zellen bewirkt. Bevorzugte Tiere sind Nager wie z. B. Mäuse und Ratten, doch können Kaninchen, Schafe oder Froschzellen ebenso verwendet werden. Die Verwendung von Ratten kann gewisse Vorteile bieten (Goding, 1986, S. 60–61), doch sind Mäuse bevorzugt, wobei die BALB/c-Maus am meisten bevorzugt ist, da diese das routinemäßig am meisten verwendete Tier ist und im allgemeinen einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen ergibt.
  • Nach der Immunisierung werden somatische Zellen mit dem Potential zur Herstellung von Antikörpern, insbesondere B-Lymphozyten (B-Zellen) zur Verwendung nach der Vorschrift zur Erzeugung von mAbs ausgewählt. Diese Zellen lassen sich aus durch Biopsien erhaltene Milzen, Mandeln oder Lymphknoten oder aus einer peripheren Blutprobe gewinnen. Milzzellen und periphere Blutzellen sind bevorzugt, die ersteren, da sie eine reiche Quelle an antikörperproduzierenden Zellen, die sich in der Plasmablasten-Teilungsphase befinden, darstellen, und die letzteren, da peripheres Blut leicht zugänglich ist. Häufig wurde eine Gruppe von Tieren immunisiert, und die Milz des Tiers mit dem höchsten Antikörpertiter wird dann entfernt, und man erhält die Milzlymphozyten durch Homogenisieren der Milz mit einer Spritze. Typischerweise enthält eine Milz einer immunisierten Maus ungefähr 5 × 107 bis 2 × 108 Lymphozyten.
  • Die antikörperproduzierenden B-Lymphozyten aus dem immunisierten Tier werden dann mit Zellen von einer unsterblichen Myelomzelle, die im allgemeinen aus derselben Spezies wie das Tier, welches immunisiert wurde, stammt, fusioniert. Zur Verwendung bei Hybridomproduzierenden Fusionsvorgängen geeignete Myelom-Zellinien produzieren vorzugsweise keine Antikörper, besitzen eine hohe Fusionseffizienz und Enzymdefizienzen, durch die sie in gewissen Selektionsmedien, die nur das Wachstum der gewünschten fusionierten Zellen (Hybridomzellen) unterstützen, nicht wachsen können.
  • Es kann eine beliebige Anzahl an Myelomzellen verwendet werden, wie dem Fachmann bekannt ist (Goding, S. 65–66, 1986; Campbell, S. 75–83, 1984). Handelt es sich beispielsweise bei dem immunisierten Tier um eine Maus, so kann man P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPCII-X45-GTG 1.7 und S194/5XX0 Bul verwenden; für Ratten kann man R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210 verwenden; und U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 und UC729-6 sind allesamt nützlich in Verbindung mit menschlichen Zellfusionen.
  • Eine bevorzugte Maus-Myelomzelle ist die NS-1-Myelomzellinie (auch P3-NS-1-Ag4-1 genannt), die von der NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository durch Anfordern der Zellinien-Lagerungsnummer GM3573 leicht erhältlich ist. Eine weitere Maus-Myelomzellinie, die verwendet werden kann, ist die 8-Azaguanin-resistente Maus-"murine myeloma SP2/0 non-producer"-Zellinie.
  • Bei den Verfahren zur Erzeugung von Hybriden aus antikörperproduzierenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen werden üblicherweise somatische Zellen mit Myelomzellen im Verhältnis 2 : 1 gemischt, obwohl das Verhältnis von etwa 20 : 1 bis etwa 1 : 1 in Gegenwart eines (chemischen oder elektrischen) Mittels bzw. Mittel, das bzw. die die Zellmembranfusion fördern, variieren kann. Fusionsverfahren unter Verwendung des Sendai-Virus (Kohler und Milstein, 1975; 1976) und solche mit Polyethylenglykol (PEG), wie z. B. 37% (Vol./Vol.) PEG (Gefter et al., 1977), sind beschrieben. Die Verwendung von elektrisch induzierten Fusionsverfahren ist ebenfalls geeignet (Coding, 1986, S. 71–74).
  • Fusionsverfahrensweisen produzieren üblicherweise lebensfähige Hybride mit niedrigen Frequenzen, etwa 1 × 10–6 bis 1 × 10–8. Dies stellt jedoch kein Problem dar, da sich die lebensfähigen, fusionierten Hybride von den nicht fusionierten Elternzellen (insbesondere den nicht fusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise unendlich weiter teilen würden) durch Kultivierung in einem Selektionsmedium unterscheiden lassen. Bei dem Selektionsmedium handelt es sich im allgemeinen um ein Medium, das ein Mittel zur Blockierung der de-novo-Synthese von Nukleotiden in den Gewebekulturmedien enthält. Beispielhafte und bevorzugte Mittel sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de-novo-Synthese sowohl von Purinen als auch von Pyrimidinen, wohingegen Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Beim Einsatz von Aminopterin oder Methotrexat werden die Medien mit Hypoxanthin und Thymidin als Nukleotidquelle supplementiert (HAT-Medium). Bei der Verwendung von Azaserin werden die Medien mit Hypoxanthin supplementiert.
  • Das bevorzugte Selektionsmedium ist HAT. Nur Zellen, die in der Lage sind, "Salvage Pathways" [Wiederverwertungsstoffwechselwege] von Nukleotiden zu betreiben, können im HAT-Medium überleben. Den Myelomzellen fehlen Schlüsselenzyme des Salvage Pathway, z. B. Hypoxanthin-phosphoribosyltransferase (HPRT), und können daher nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Stoffwechselweg betreiben, doch ist ihre Lebensdauer in Kultur begrenzt und sie sterben im allgemeinen innerhalb von zwei Wochen ab. Die einzigen Zellen, die in den Selektionsmedien überleben können, sind daher die aus Myelom- und B-Zellen gebildeten Hybride.
  • Durch diese Kultivierung wird eine Population von Hybridomzellen bereitgestellt, aus der spezifische Hybridomzellen ausgewählt werden. Typischerweise wird die Selektion der Hybridomzellen durch Kultivierung der Zellen mittels Einzelklonverdünnung in Mikrotiterplatten und anschließendes Austesten der einzelnen klonalen Überstände (nach etwa zwei bis drei Wochen) auf die gewünschte Reaktivität durchgeführt. Der Assay sollte empfindlich, einfach und schnell sein, wie z. B. Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays, Zytotoxizitätsassays, Plaqueassays, Dot-Immunbindungsassays, u. ä.
  • Die ausgewählten Hybridomzellen sollten dann in einer Verdünnungsreihe verdünnt und in individuelle, antikörperproduzierende Zellinien kloniert werden, wobei diese Klone dann zeitlich unbegrenzt vermehrt werden können, um mAbs zu produzieren. Die Zellinien lassen sich für die mAb-Produktion auf zwei grundsätzliche Arten nutzen. Eine Probe der Hybridomzelle kann in ein histokompatibles Tier der Art, die zur Bereitstellung der somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion verwendet wurde, injiziert werden (häufig in die Bauchhöhle). Das injizierte Tier entwickelt Tumore, die den von der fusionierten Hybridzelle produzierten spezifischen monoklonalen Antikörper sezernieren. Die Körperflüssigkeiten des Tiers, wie z. B. Serum oder Ascites-Flüssigkeit, können dann angezapft werden, so daß mAbs in hoher Konzentration erhalten werden. Die einzelnen Zellinien könnten auch in vitro kultiviert werden, wobei die mAbs natürlicherweise in das Kulturmedium sezerniert werden, aus dem sie dann leicht in hohen Konzentrationen gewonnen werden können. Die auf beide Weisen jeweils produzierten mAbs können dann, falls gewünscht, mittels Filtration, Zentrifugation und verschiedenen chromatographischen Verfahren, wie z. B. HPLC oder Affinitätschromatographie, weiter aufgereinigt werden.
  • 4.7 ELISAS
  • Die ELISA-Techniken können in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden, wenn es sich bei dem nachzuweisenden interessierenden Produkt um ein Polypeptid und bei dem Substrat auf dem Chip um einen Antikörper handelt. Alternativ kann man ELISA-Techniken einsetzen, wenn es sich bei dem Substrat auf dem Chip um ein Polypeptid und bei dem nachzuweisenden interessierenden Produkt um einen Antikörper handelt. In beiden Ausführungsformen kann der Antikörper oder das Polypeptid zur Detektion durch den Biochip fluoreszenzmarkiert sein.
  • In einem ELISA-Assay werden antigene Sequenzen enthaltende Proteine oder Peptide auf einer ausgewählten Oberfläche, vorzugsweise einer Oberfläche, die eine Affinität für Proteine zeigt, wie z. B. den Wells einer Polystyrol-Mikrotiterplatte, immobilisiert. Nach dem Waschen zur Entfernung von unvollständig adsorbiertem Material ist es wünschenswert, ein nichtspezifisches Protein, das erwiesenermaßen bezüglich der Test-Antiseren antigenisch neutral ist, wie z. B. Rinderserumalbumin (BSA), Casein oder Milchpulverlösungen, an die Wells der Assay-Platte zu binden oder diese damit zu überziehen. Dadurch können nichtspezifische Adsorptionsstellen auf der Immobilisierungsoberfläche blockiert werden, womit der durch die nichtspezifische Bindung von Antiseren auf der Oberfläche verursachte Hintergrund reduziert wird.
  • Nach Bindung des Antigenmaterials an das Well, Beschichten mit einem nichtreaktiven Material zur Reduzierung des Hintergrunds und Waschen zur Entfernung von nicht gebundenem Material wird die Immobilisierungsoberfläche mit den Antiseren oder einem zu testenden klinischen oder biologischen Extrakt auf eine Weise in Kontakt gebracht, die zur Ausbildung eines Immunkomplexes (Antigen/Antikörper) führt. Zu solchen Bedingungen gehört vorzugsweise das Verdünnen der Antiseren mit Verdünnungsmitteln wie beispielsweise BSA, Gammaglobulin aus Rind (Bovine Gamma Globulin, BGG) und phosphatgepufferte Salzlösung (Phosphate Buffered Saline, PBS)/Tween®. Diese zugesetzten Agentien helfen oft auch bei der Reduzierung des nichtspezifischen Hintergrunds. Man läßt dann die geschichteten Antiseren etwa 2 bis etwa 4 Std. vorzugsweise bei Temperaturen in der Größenordnung von etwa 25°C bis etwa 27°C inkubieren. Nach der Inkubation wird die mit den Antiseren in Kontakt gekommene Oberfläche gewaschen, um so nicht immunkomplexiertes Material zu entfernen. Ein bevorzugter Waschvorgang beinhaltet das Waschen mit einer Lösung wie beispielsweise PBS/Tween® oder Boratpuffer.
  • Nach der Formierung des spezifischen Immunkomplexes zwischen der Testprobe und dem gebundenen Antigen und nachfolgendem Waschen kann das Auftreten und sogar die Menge des gebildeten Immunkomplexes bestimmt werden, indem dieser einem zweiten Antikörper mit Spezifität für den ersten ausgesetzt wird. Als Nachweismittel ist an dem zweiten Antikörper vorzugsweise ein assoziiertes Enzym vorgesehen, das bei Inkubation mit einem geeigneten chromogenen Substrat eine Farbentwicklung erzeugt. So besteht beispielsweise der Wunsch, die Antiseren-gebundene Oberfläche eine Zeit lang und unter Bedingungen, die die Entwicklung der Immunkomplexformierung begünstigen (z. B. Inkubation für 2 Std. bei Raumtemperatur in einer PBS-haltigen Lösung, wie z. B. PBS Tween®) mit einem Urease- oder Peroxidase-konjugierten Anti-Mensch-IgG in Kontakt gebracht und inkubiert wird.
  • Nach Inkubation mit dem zweiten, mit einem Enzym-Tag versehenen Antikörper und anschließendem Waschen zum Entfernen von nicht gebundenem Material wird die Menge an Markierung durch Inkubation mit einem chromogenen Substrat, wie z. B. Harnstoff und Chromkresolviolett oder 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure (ABTS) und H2O2, bei Peroxidase als Enzymmarkierung, quantifiziert. Die Quantifizierung wird dann durch Messen des Ausmaßes der Farberzeugung erzielt. Beispielsweise mit einem Spektrophotometer für den sichtbaren Spektralbereich.
  • 4.8 VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON MUTAGENISIERTEN POLYNUKLEOTIDEN
  • Unter gewissen Umständen kann es wünschenswert sein, ein oder mehrere Nukleotide in einer oder mehreren der hierin offenbarten Polynukleotidsequenzen zum Zwecke der Änderung oder des Wechsels der Insektizidaktivität oder Insektizidspezifität des kodierten Polypeptids zu modifizieren oder zu ändern. Im allgemeinen sind die Mittel und Verfahren zur Mutagenese eines DNA-Abschnitts dem Fachmann allgemein bekannt. Die Modifikationen an solchen Abschnitten lassen sich mittels ungerichteter (random) oder stellenspezifischen Mutageneseverfahren durchführen. Die Polynukleotide können durch die Addition, Deletion oder Substitution eines oder mehrerer Nukleotide aus der das insektizid aktive Polypeptid kodierenden Sequenz modifiziert werden.
  • Die Mutagenese läßt sich gemäß einer der im Fachgebiet bekannten Techniken, wie z. B., ohne darauf beschränkt zu sein, der Synthese eines Oligonukleotids mit einer oder mehreren Mutationen innerhalb der Sequenz eines bestimmten Bereichs, durchführen. Insbesondere handelt es sich bei der stellenspezifischen Mutagenese um eine zur Herstellung von Mutanten nützliche Technik, und zwar durch spezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA. Mit dieser Technik ist es weiterhin leicht möglich, beispielsweise Sequenzvarianten unter Einbeziehung einer oder mehrerer der vorausgegangenen Betrachtungen herzustellen und zu testen, indem eine oder mehrere Nukleotidsequenzveränderungen in die DNA eingeführt werden. Die stellenspezifische Mutagenese gestattet die Herstellung von Mutanten durch Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation sowie eine ausreichende Anzahl an benachbarten Nukleotiden kodieren, so daß eine Primer-Sequenz von ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitgestellt wird, um einen stabilen Duplex auf beiden Seiten der überbrückten Deletionsstelle zu bilden. Typischerweise ist ein etwa 17 bis etwa 75 oder mehr Nukleotide langer Primer bevorzugt, wobei etwa 10 bis etwa 25 oder mehr Reste auf beiden Seiten der Stelle, deren Sequenz verändert wird, liegen.
  • Im allgemeinen ist die Technik der stellenspezifischen Mutagenese im Fachgebiet allgemein bekannt, wie verschiedene Veröffentlichungen beispielhaft zeigen. Wie ersichtlich ist, wird bei dieser Technik typischerweise ein Phagenvektor eingesetzt, der sowohl in einzelsträngiger als auch doppelsträngiger Form existiert. Zu typischen, für die stellengerichtete Mutagenese geeigneten Vektoren gehören Vektoren wie z. B. der M13-Phage. Diese Phagen sind kommerziell leicht erhältlich und ihre Verwendung ist im allgemeinen dem Fachmann allgemein bekannt. Doppelsträngige Plasmide werden ebenfalls routinemäßig bei der stellengerichteten Mutagenese eingesetzt, wodurch der Schritt der Übertragung des interessierenden Gens von einem Plasmid auf einen Phagen entfällt.
  • Im allgemeinen wird die stellengerichtete Mutagenese gemäß dem hier Gesagten durchgeführt, indem zunächst ein einzelsträngiger Vektor gewonnen oder zwei Stränge eines doppelsträngigen Vektors, dessen Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die den gewünschten Promotorbereich oder das gewünschte Peptid kodiert, durch Schmelzen voneinander getrennt werden. Ein Oligonukleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird, im allgemeinen synthetisch, hergestellt. Der Primer wird dann einem Annealing mit dem einzelsträngigen Vektor unterzogen sowie DNA-polymerisierenden Enzymen, wie z. B. dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase I ausgesetzt, um die Synthese des die Mutation tragenden Strangs zu komplettieren. Somit wird ein Heteroduplex gebildet, wobei ein Strang die ursprüngliche, nicht mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplexvektor wird dann zur Transformation oder Transfektion geeigneter Zellen, wie z. B. E. coli-Zellen, verwendet, und es wird auf Klone selektioniert, die die mutierte Sequenzanordnung tragen. Zur Anreicherung von Klonen, die das mutagene Oligonukleotid enthalten, wurde von Kunkel et al., (1987) ein genetisches Selektionsschema entwickelt. Als Alternative dazu läßt sich die Verwendung von PCRTM mit kommerziell erhältlichen thermostabilen Enzymen, wie z. B. Taq-Polymerase, zum Einbau eines mutagenen Oligonukleotidprimers in ein amplifiziertes DNA-Fragment einsetzen, das dann in einen geeigneten Klonierungs- oder Expressionsvektor kloniert werden kann. Die PCRTM-vermittelten Mutageneseverfahren von Tomic et al., (1990) und Upender et al., (1995) stellen zwei Beispiele für solche Verfahrensvorschriften dar. Eine PCRTM, bei der eine thermostabile Ligase zusätzlich zu einer thermostabilen Polymerase eingesetzt wird, kann ebenfalls zum Einbau eines phosphorylierten Mutagenoligonukleotids in ein amplifiziertes DNA-Fragment verwendet werden, das dann in einen geeigneten Klonierungs- oder Expressionsvektor kloniert werden kann. Das von Michael (1994) beschriebene Mutageneseverfahren stellt ein Beispiel für solch eine Verfahrensvorschrift dar.
  • Der Ausdruck "Oligonukleotid-gerichtetes Mutageneseverfahren", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf matrizenabhängige Vorgänge und Vektorvermittelte Vermehrung, wodurch ein Anstieg in der Konzentration eines spezifischen Nukleinsäuremoleküls relativ zu seiner ursprünglichen Konzentration oder ein Anstieg in der Konzentration eines nachweisbaren Signals, wie z. B. eine Amplifikation, erfolgt. Der Ausdruck "Oligonukleotid-gerichtetes Mutageneseverfahren", wie er hier verwendet wird, soll sich ebenfalls auf einen Prozeß beziehen, bei dem die matrizenabhängige Verlängerung eines Primermoleküls beteiligt ist. Der Ausdruck matrizenabhängiger Vorgang bezieht sich auf die Nukleinsäuresynthese eines RNA- oder eines DNA-Moleküls, wobei die Sequenz des neu synthetisierten Strangs der Nukleinsäure durch die allgemein bekannten Regeln der komplementären Basenpaarung (Watson, 1987) diktiert wird. Typischerweise beinhaltet die vektorvermittelte Methodik die Einführung des Nukleinsäurefragments in einen DNA- oder RNA-Vektor, die klonale Amplifikation des Vektors und die Gewinnung des amplifizierten Nukleinsäurefragments. Beispiele für eine solche Methodik sind in US-A-4,237,224 angegeben.
  • Es stehen eine Reihe von matrizenabhängigen Prozessen zur Verfügung, um die interessierenden Zielsequenzen, die in einer Probe vorliegen, zu amplifizieren. Eines der am besten bekannten Amplifikationsverfahren ist die Polymerasekettenreaktion (PCRTM), die ausführlich in US-A-4,683,195, US-A-4,683,202 und US-A-4,800,159 beschrieben ist.
  • Kurz gesagt werden bei der PCRTM zwei Primersequenzen hergestellt, die zu Bereichen auf entgegengesetzten komplementären Strängen der Zielsequenz komplementär sind. Ein Überschuß an Desoxynukleosidtriphosphaten wird zusammen mit einer DNA-Polymerase (z. B. Taq-Polymerase) zu einem Reaktionsansatz gegeben. Ist die Zielsequenz in einer Probe vorhanden, binden die Primer an das Zielmolekül und die Polymerase führt zur Verlängerung der Primer entlang der Zielsequenz durch Hinzufügen von Nukleotiden. Durch Erhöhen und Erniedrigen der Temperatur des Reaktionsansatzes dissoziieren die verlängerten Primer von dem Zielmolekül unter Bildung der Reaktionsprodukte, binden die überschüssigen Primer an das Zielmolekül und an die Reaktionsprodukte, und der Vorgang wiederholt sich. Vorzugsweise wird ein PCRTM-Amplifikationsverfahren mit einer reversen Transkriptase durchgeführt, um die Menge an amplifizierter mRNA zu quantifizieren. Die Methodik der Polymerasekettenreaktion ist im Fachgebiet allgemein bekannt.
  • Ein weiteres Verfahren zur Amplifikation ist die Ligasekettenreaktion (als LCR bezeichnet), offenbart in EP-A-0 320 308. Bei der LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare hergestellt, wobei in Gegenwart der Zielsequenz jedes Paar an jeweils entgegengesetzte komplementäre Stränge des Zielmoleküls bindet, so daß sie aneinander angrenzen. In Gegenwart einer Ligase werden die beiden Sondenpaare unter Ausbildung einer einzigen Einheit verknüpft. Beim Durchlaufen des Temperaturzyklus, wie bei der PCRTM, dissoziieren die gebundenen ligierten Einheiten von dem Zielmolekül und dienen dann als "Zielsequenzen" für die Ligation von überschüssigen Sondenpaaren. In US-A-4,883,750 ist ein alternatives, der LCR ähnliches Amplifikationsverfahren für die Bindung von Sondenpaaren an eine Zielsequenz beschrieben.
  • Als noch ein weiteres Amplifikationsverfahren läßt sich in der vorliegenden Erfindung auch die in WO-A-87/06270 beschriebene Qbeta-Replikase verwenden. Bei diesem Verfahren wird eine replikative RNA-Sequenz, die einen zu dem eines Zielmoleküls komplementären Bereich aufweist, zu einer Probe in Gegenwart einer RNA-Polymerase gegeben. Die Polymerase kopiert die replikative Sequenz, die dann nachgewiesen werden kann.
  • Ein isothermes Amplifikationsverfahren, bei dem Restriktionsendonukleasen und Ligasen verwendet werden, um die Amplifikation von Zielmolekülen, die in einem Strang einer Restriktionsstelle Nukleotid-5'-[α-thio]triphosphate enthalten, (Walker et al., 1992), zu erreichen, können ebenfalls für die Amplifikation von Nukleinsäuren in der folgenden Erfindung geeignet sein.
  • Die Amplifikation durch Strangverdrängung (Strand Displacement Amplification, SDA) ist ein weiteres Verfahren zur Durchführung der isothermen Amplifikation von Nukleinsäuren, das mehrere Runden von Strangverdrängung und Synthese, d. h. Nick-Translation, umfaßt. Ein ähnliches Verfahren, das Kettenreparaturreaktion (Repair Chain Reaction, RCR) genannt wird, ist ein weiteres Verfahren zur Amplifikation, das für die vorliegende Erfindung geeignet sein kann und das das Annealing von mehreren Proben über einen als Ziel für die Amplifikation dienenden Bereich hinweg und eine anschließende Reparaturreaktion umfaßt, bei der nur zwei bis vier Basen vorhanden sind. Die anderen zwei Basen können zwecks einfacherer Detektion als biotinylierte Derivate zugegeben werden. Ein ähnlicher Ansatz wird bei der SDA verwendet.
  • Noch weitere, in GB-A-2 202 328 und in WO-A-89/09284 beschriebene Amplifikationsverfahren können gemäß der folgenden Erfindung verwendet werden. In ersterer Anmeldung werden "modifizierte" Primer in einer PCRTM-ähnlichen, matrizen- und enzymabhängigen Synthese verwendet. Die Primer können durch Markierung mit einem Fängerteil (z. B. Biotin) und/oder einem Detektorteil (z. B. Enzym) modifiziert werden. In letzterer Anmeldung wird ein Überschuß an markierten Sonden zu einer Probe gegeben. In Gegenwart der Zielsequenz bindet die Sonde und wird katalytisch gespalten. Nach der Spaltung wird die Zielsequenz in intakter Form freigesetzt, um dann von überschüssiger Sonde gebunden zu werden. Die Spaltung der markierten Sonde signalisiert die Anwesenheit der Zielsequenz.
  • Zu den weiteren Nukleinsäureamplifikationsverfahren gehören Amplifikationssysteme auf Transkriptionsbasis (TAS) (Kwoh et al., 1989; WO-A-88/10315), einschließlich Amplifikation auf Nukleinsäuresequenzbasis (Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NASBA) und 3SR. Bei der NASBA können die Nukleinsäuren durch Standardextraktion mit Phenol/Chloroform, Hitzedenaturierung einer Probe, Behandlung mit Lysepuffer und Minispin-Säulen zur Isolierung der DNA und RNA oder Guanidiniumchloridextraktion der RNA für die Amplifikation vorbereitet werden. Diese Amplifikationstechniken umfassen das Annealing eines Primers, der zielspezifische Sequenzen aufweist. Nach der Polymerisierung werden DNA/RNA-Hybride mit RNase H verdaut, während doppelsträngige DNA-Moleküle wiederum hitzedenaturiert werden. In beiden Fällen wird durch Zugabe eines zweiten, für das Zielpolypeptid spezifischen Primers und anschließende Polymerisation aus der einzelsträngigen DNA eine komplett doppelsträngige DNA hergestellt. Die doppelsträngigen DNA-Moleküle werden dann mit einer Polymerase, wie z. B. T7 oder SP6, mehrfachtranskribiert. In einer isothermen zyklischen Reaktion werden die RNAs in doppelsträngige DNA revers-transkribiert und mit einer Polymerase, wie z. B. T7 oder SP6, einmal gegentranskribiert. Gleichgültig, ob sie verkürzt oder vollständig vorliegen, zeigen die erhaltenen Produkte zielspezifische Sequenzen an.
  • Aus der EP-A-O 329 822 ist ein Nukleinsäureamplifikationsverfahren bekannt, bei dem einzelsträngige RNA ("ssRNA"), ssDNA und doppelsträngige DNA (dsDNA) in einem Kreisprozeß synthetisiert werden und das im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die ssRNA stellt eine erste Matrize für ein erstes Primer-Oligonukleotid dar, das mit reverser Transkriptase (RNA-abhängiger DNA-Polymerase) verlängert wird. Die RNA wird dann aus dem entstehenden DNA:RNR-Duplex durch Einwirkung der Ribonuklease H (RNase H, eine in einem Duplex mit entweder DNA oder RNA vorliegende RNA-spezifische RNase) entfernt. Die entstandene ssDNA stellt eine zweite Matrize für einen zweiten Primer dar, der ebenfalls die Sequenzen eines Promotors für eine RNA-Polymerase (repräsentatives Beispiel: T7-RNA-Polymerase) 5' zu seiner mit seiner Matrize homologen Sequenz enthält. Dieser Primer wird dann mit DNA-Polymerase (repräsentatives Beispiel: das große "Klenow"-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I) verlängert, wobei daraus ein doppelsträngiges DNA-("dsDNA"-)Molekül entsteht, das eine zu der zwischen den Primern befindlichen Sequenz der ursprünglichen RNA identische Sequenz und zusätzlich an einem Ende eine Promotorsequenz aufweist. Diese Promotorsequenz kann von der entsprechenden RNA-Polymerase zur Herstellung vieler RNA-Kopien der DNA verwendet werden. Diese Kopien können dann wieder in den Kreislauf eintreten, was zu einer sehr schnellen Amplifikation fuhrt. Mit einer geeigneten Enzymwahl kann diese Amplifikation ohne Zugabe von Enzymen bei jedem Zyklus isotherm durchgeführt werden. Aufgrund der zyklischen Natur dieses Vorgangs kann die Ausgangssequenz sowohl in Form von DNA als auch von RNA gewählt werden.
  • Aus WO-A-89/06700 ist ein auf der Hybridisierung einer Promotor-/Primer-Sequenz an ein einzelsträngiges Ziel-DNA-Molekül ("ssDNA") mit nachfolgender Transkription vieler RNA-Kopien dieser Sequenz beruhendes Nukleinsäuresequenz-Amplifikationsschema bekannt. Dieses Schema liegt nicht in Form eines Kreislaufs vor, d. h. es werden aus den entstandenen RNA-Transkripten keine neuen Matrizen hergestellt. Zu den weiteren Amplifikationsverfahren gehören "RACE" (Frohman, 1990) und "one-sided PCRThTM" (Ohara et al. 1989), die dem Fachmann allgemein bekannt sind.
  • Verfahren, die auf der Ligation zweier (oder mehrerer) Oligonukleotide in Gegenwart einer Nukleinsäure mit der Sequenz des entstehenden "Di-oligonukleotids", wodurch das Di-oligonukleotid amplifiziert wird (Wu und Dean, 1996), beruhen, können ebenfalls bei der Amplifikation erfindungsgemäßer Polynukleotidsequenzen eingesetzt werden.
  • 4.9 RIBOZYME
  • Bei den Ribozymen handelt es sich um enzymatische RNA-Moleküle, die bestimmte mRNA-Spezies spalten. Bei bestimmten Ausführungsformen wird von den Erfindern die Auswahl und Nutzung von zur Spaltung von RNA-Abschnitten fähigen Ribozymen sowie der daraus folgende Nachweis solcher mRNAs oder Ribozyme unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Biochips in Betracht gezogen.
  • Zur Zeit sind sechs verschiedene Grundversionen natürlich vorkommender enzymatischer RNAs bekannt. Dabei kann jede von diesen die Hydrolyse von RNA-Phosphodiesterbindungen in trans unter physiologischen Bedingungen katalysieren (und somit andere RNA-Moleküle spalten). Im allgemeinen funktionieren enzymatische Nukleinsäuren dadurch, daß sie zunächst an eine Ziel-RNA binden. Eine solche Bindung erfolgt über den Zielmolekülbindungsanteil einer enzymatischen Nukleinsäure, der in enger Nachbarschaft zu einem enzymatischen Anteil des Moleküls gehalten wird, der die Spaltung der Ziel-RNA bewirkt. Die enzymatische Nukleinsäure erkennt somit zunächst eine Ziel-RNA und bindet dann an diese über komplementäre Basenpaarung und, nach Bindung an die korrekte Stelle, schneidet die Ziel-RNA enzymatisch. Durch die strategische Spaltung einer solchen Ziel-RNA wird deren Fähigkeit zur direkten Synthese eines kodierten Proteins zerstört. Nachdem eine enzymatische Nukleinsäure ihr RNA-Zielmolekül gebunden und gespalten hat, wird sie von dieser RNA freigesetzt, um nach einem weiteren Zielmolekül zu suchen, wobei sie wiederholt neue Ziele binden und spalten kann.
  • Durch die enzymatische Natur eines Ribozyms ergeben sich Vorteile gegenüber vielen Techniken, wie z. B. der Antisense-Technik (bei der ein Nukleinsäuremolekül einfach an ein Nukleinsäurezielmolekül bindet, um dessen Translation zu blockieren), da die zur Beeinflussung einer therapeutischen Behandlung notwendige Ribozymkonzentration niedriger als die eines Antisense-Oligonukleotids ist. Dieser Vorteil spiegelt die enzymatische Funktionsfähigkeit des Ribozyms wider. Somit kann ein einziges Ribozymmolekül viele Moleküle der Ziel-RNA spalten. Darüber hinaus ist das Ribozym ein hochspezifischer Inhibitor, wobei die Spezifität der Hemmung nicht nur vom Basenpaarungsmechanismus der Bindung an die Ziel-RNA, sondern auch von dem Mechanismus der Ziel-RNA-Spaltung abhängt. Einzelne Fehlpaarungen, oder Basensubstitutionen, in der Nähe der Spaltstelle können die katalytische Aktivität eines Ribozyms vollständig aufheben. Bei Antisens-Molekülen wird deren Wirkung durch ähnliche Fehlpaarungen nicht verhindert (Woolf et al., 1992). Somit ist die Wirkspezifität eines Ribozyms größer als die eines an dieselbe RNA-Stelle bindenden Antisense-Oligonukleotids.
  • Das enzymatische Nukleinsäuremolekül kann als "Hammerhead"-, Haarnadel-, Hepatitis-δ-Virus-, Gruppe I-Intron- oder RNaseP-RNA- (in Verbindung mit einer RNA-Leitsequenz) oder als Neurospora-VS-RNA-Motiv ausgebildet sein. Beispiele für Hammerhead-Motive sind in Rossi et al. (1992) beschrieben; Beispiele für Haarnadelmotive sind in Hampel et al. EP-A-0 360 257), Hampel und Tritz (1989), Hampel et al. (1990) und Cech et al. (US-A-5,631,359 beschrieben; ein Beispiel für das Hepatitis-δ-Virus-Motiv ist in Perrotta und Been (1992) beschrieben; ein Beispiel für das RNaseP-Motiv ist in Guerrier-Takada et al. (1983) beschrieben; das Neurospora-VS-RNA-Ribozymmotiv wurde von Collins (Saville und Collins, 1990; Saville und Collins, 1991; Collins und Olive, 1993) beschrieben; und ein Beispiel für das Gruppe I-Intron ist in Cech et al. (US-A-4,987,071) beschrieben. Für ein enzymatisches Nukleinsäuremolekül dieser Erfindung ist lediglich von Bedeutung, daß es eine spezifische Substratbindungsstelle besitzt, die zu einem oder mehreren der Zielgen-RNA-Bereiche komplementär ist, und daß es innerhalb dieser Substratbindungsstelle oder darum herum Nukleotidsequenzen besitzt, die dem Molekül eine RNA- Spaltungsaktivität verleihen. Somit müssen die Ribozymkonstrukte nicht auf die hier erwähnten spezifischen Motive beschränkt sein.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Klasse von enzymatischen Spaltungsagentien bereit, die einen hohen Spezifitätsgrad für die RNA eines gewünschten Zielmoleküls zeigen. Das enzymatische Nukleinsäuremolekül wird vorzugsweise auf einen hochkonservierten Sequenzbereich einer Ziel-mRNA gerichtet, so daß mit entweder einer oder mehreren enzymatischen Nukleinsäuren eine spezifische Behandlung einer Krankheit oder eines Krankheitzustands ermöglicht werden kann. Solche enzymatischen Nukleinsäuremoleküle können an spezifische Zellen nach Bedarf von außen zugeführt werden. Andererseits können die Ribozyme von DNA- oder RNA-Vektoren aus exprimiert werden, die spezifischen Zellen zugeführt werden.
  • Für die Zuführung von außen können kleine enzymatische Nukleinsäuremotive (z. B. mit Hammerhead-oder Haarnadelstruktur) verwendet werden. Die einfache Struktur dieser Moleküle erhöht die Fähigkeit der enzymatischen Nukleinsäure, in die Zielbereiche der mRNA-Struktur einzudringen. Als Alternative können katalytische RNA-Moleküle intrazellulär von eukaryontischen Promotoren aus exprimiert werden (z. B. Scanlon et al., 1991; Kashani-Sabet et al., 1992; Dropulic et al., 1992; Weerasinghe et al., 1991; Ojwang et al., 1992; Chen et al., 1992; Sarver et al., 1990). Dem Fachmann ist bewußt, daß jedes Ribozym in eukaryontischen Zellen von dem entsprechenden DNA-Vektor aus exprimiert werden kann. Die Aktivität solcher Ribozyme kann durch ihre Freisetzung aus dem primären Transkript mittels eines zweiten Ribozyms verstärkt werden (WO-A-93/23569) und (WO-A-94/02595), Ohkawa et al., 1992; Taira et al., 1991; Ventura et al., 1993).
  • Ribozyme können direkt zugegeben oder mit kationischen Lipiden, oder Lipidkomplexen komplexiert, in Liposomen verpackt oder auf andere Weise den Zielzellen zugeführt werden. Die RNA oder RNA-Komplexe lassen sich lokal an die betreffenden Gewebe ex vivo oder in vivo durch Injektion, Aerosolinhalation, mit einer Infusionspumpe oder Stent, mit oder ohne Einbau in Biopolymere verabreichen.
  • Ribozyme können wie in (WO-A-93/23569) oder (WO-A94/02595) beschrieben konstruiert und zum Testen in vitro und in vivo wie beschrieben synthetisiert werden. Solche Ribozyme können ebenfalls hinsichtlich ihrer Zufuhr optimiert werden. Obschon spezifische Beispiele angeführt werden, erkennt der Fachmann, daß, falls notwendig, äquivalente RNA-Zielmoleküle in anderen Spezies Verwendung finden können.
  • Hammerhead- oder Haarnadelribozyme können mittels Faltungsstudien am Computer individuell analysiert werden (Jaeger et al., 1989), um zu beurteilen, ob die Ribozymsequenzen sich in die entsprechende Sekundärstruktur falten. Diejenigen Ribozyme mit ungünstigen intramolekularen Wechselwirkungen zwischen den Bindungsarmen und dem katalytischen Kern werden nicht berücksichtigt. Zur Optimierung der Aktivität können unterschiedliche Bindungsarmlängen gewählt werden. Im allgemeinen sind wenigstens 5 Basen auf jedem Arm in der Lage, die Ziel-RNA zu binden oder in anderer Weise damit zu Wechselwirken.
  • Ribozyme des Hammerhead- oder Haarnadelmotivs können zwecks Annealing an verschiedene Stellen in der mRNA-Message konstruiert werden und lassen sich chemisch synthetisieren. Das verwendete Syntheseverfahren folgt der Vorschrift für die normale RNA-Synthese, wie sie in Usman und Cedergren (1992) und in Scaringe et al. (1990) beschrieben ist, und verwendet bekannte Nukleinsäure-Schutz- und -Kopplungsgruppen, wie z. B. Dimethoxytrityl am 5'-Ende und Phosphoramidite am 3'-Ende. Die durchschnittlichen Kopplungsausbeuten pro Schritt liegen typischerweise bei >98%. Haarnadelribozyme können in zwei Teilen synthetisiert werden und dann einem Annealing unterzogen werden, um ein aktives Ribozym zu rekonstruieren (Chowrira und Burke, 1992). Zur Stabilitätsverbesserung können Ribozyme mittels Modifikation mit Nuklease-resistenten Gruppen, z. B. 2'-Amino, 2'-C-Allyl, 2'-Fluor, 2'-o-Methyl, 2'-H, weitreichend modifiziert werden (für eine Übersicht, siehe Usman und Cedergren, 1992). Man kann Ribozyme mittels Gelelektrophorese unter Verwendung allgemeiner Verfahren oder mittels Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie reinigen und dann in Wasser resuspendieren.
  • Die Ribozymaktivität läßt sich durch Veränderung der Länge der Ribozym-Bindungsarme oder durch chemische Synthese von Ribozymen mit Modifikationen, durch die ihr Abbau durch Serum-Ribonukleasen verhindert wird (siehe z. B., und WO-A-92-07065; Perreault et al 1990; Pieken et al., 1991; Usman und Cedergren, 1992: WO-A-93/15 187 WO-A-91/03102 EP-A-0 519 463; US-A-5,334,711; und WO-A-94/13688, in denen verschiedene chemische Modifikationen, die an den Zuckeranteilen enzymatischer RNA-Moleküle vorgenommen werden können, beschrieben werden), Modifikationen, die ihre Wirksamkeit in Zellen erhöhen, und der Entferung von Stamm-II-Basen zur Verkürzung der RNA-Synthesezeiten und Reduktion der chemischen Anforderungen optimieren.
  • In WO-A-94/02595 werden die allgemeinen Verfahren zur Zuführung von enzymatischen RNA-Molekülen beschrieben. Ribozyme können an Zellen mit verschiedenen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Einschluß in Liposomen, durch Iontophorese oder durch Einbau in andere Vehikel, wie z. B. Hydrogele, Cyclodextrine, biologisch abbaubare Nanokapseln und bioadhäsive Mikrosphären, verabreicht werden. Bei einigen Indikationen können Ribozyme direkt ex vivo an Zellen oder Gewebe mit oder ohne die vorstehend erwähnten Vehikel abgegeben werden. Andererseits kann die RNA/Vehikel-Kombination lokal durch direkte Inhalation, durch direkte Injektion oder durch Verwendung eines Katheters, einer Infusionspumpe oder eines Stents zugeführt werden. Andere Zufuhrwege schließen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die intravaskuläre, intramuskuläre, subkutane bzw. Gelenkinjektion, die Inhalation von Aerosolen, orale (Tabletten- oder Pillenform), topische, systemische, okuläre, intraperitoneale und/oder intrathekale Zufuhr ein. Weitere ausführliche Beschreibungen der Zufuhr und Verabreichung von Ribozymen sind in (WO-A-94/02595) und (WO-A-93/23569) angegeben.
  • Ein weiterer Weg zur Akkumulierung hoher Konzentrationen eines Ribozyms bzw. von Ribozymen in Zellen besteht im Einbau der Ribozym-codierenden Sequenzen in einen DNA-Expressionsvektor. Die Transkription der Ribozymsequenzen wird von einem Promotor für die eukaryontische RNA-Polymerase I (pol I), RNA-Polymerase II (pol II) oder RNA-Polymerase III (pol III) gesteuert. Transkripte von den pol-II- bzw. pol-III-Promotoren werden in allen Zellen auf hohem Niveau exprimiert; das Niveau eines gegebenen pol-II-Promotors in einem gegebenen Zelltyp hängt von der Beschaffenheit der in der Nähe vorhandenen Genregulationssequenzen (Enhancer, Silencer, usw.) ab. Prokaryontische RNA-Polymerasepromotoren können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, daß das prokaryontische RNA-Polymeraseenzym in den entsprechenden Zellen exprimiert wird (Elroy-Stein und Moss, 1990; Gao und Huang, 1993; Lieber et al., 1993; Zhou et al., 1990). Von solchen Promotoren aus exprimierte Ribozyme können in Säugerzellen funktionieren (z. B. Kashani-Saber et al., 1992; Ojwang et al., 1992; Chen et al., 1992; Yu et al., 1993; L'Huillier et al., 1992; Lisziewicz et al., 1993). Solche Transkriptionseinheiten lassen sich in verschiedene Vektoren zur Einführung in Säugerzellen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Plasmid-DNA-Vektoren, viralen DNA-Vektoren (wie z. B. Adenovirus- oder adenoassoziierten Vektoren) oder viralen RNA-Vektoren (wie z. B.. retroviralen, Semliki-Forest-Virus-, Sindbis-Virus-Vektoren), einbauen.
  • Erfindungsgemäße Ribozyme können als Diagnosewerkzeuge zur Untersuchung des genetischen Drifts sowie von Mutationen innerhalb von Zellinien oder Zelltypen verwendet werden. Sie lassen sich ebenfalls zur Beur teilung der Ziel-RNA-Molekülniveaus einsetzen. Die enge Beziehung zwischen Ribozymaktivität und der Struktur der Ziel-RNA gestattet den Nachweis von Mutationen in jedem Bereich des Moleküls, durch den die Basenpaarung und die dreidimensionale Struktur der Ziel-RNA verändert wird. Durch Verwendung mehrerer der in dieser Erfindung beschriebenen Ribozyme kann man Nukleotidänderungen kartieren, die für die RNA-Struktur und – Funktion in vitro ebenso wie in Zellen und Geweben wichtig sind. Die Spaltung der Ziel-RNAs mit Ribozymen kann zur Hemmung der Genexpression und zur Definition der Rolle (im wesentlichen) von spezifischen Genprodukten in bestimmten Zellen oder Zelltypen verwendet werden.
  • Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung von Polynukleotiden besteht in der Verwendung von Oligonukleotidsonden. Bei diesen Sonden handelt es sich um Nukleotidsequenzen mit einer nachweisbaren Markierung. Wie im Fachgebiet allgemein bekannt, kann man durchaus davon ausgehen, daß, falls das Sondenmolekül und die Nukleinsäureprobe unter Ausbildung einer starken Bindung zwischen den beiden Molekülen hybridisieren, die Sonde und die Probe im wesentlichen identisch sind. Mit der nachweisbaren Markierung der Sonde steht ein Mittel zur Verfügung, mit dem in bekannter Weise bestimmt werden kann, ob eine Hybridisierung stattgefunden hat. Eine solche Sondenanalyse stellt ein schnelles Verfahren zur Identifizierung verwandter, homologer oder weitgehend homologer Polynukleotide dar.
  • Die Nukleotidabschnitte, die als erfindungsgemäße Sonden verwendet werden, lassen sich unter Verwendung von Standardvorschriften mit DNA-Syntheseautomaten synthetisieren. Bei Verwendung der Nukleotidabschnitte als Sonden wird die jeweilige Sonde mit einer dem Fachmann bekannten geeigneten Markierung, einschließlich radioaktiver und nichtradioaktiver Markierungen, markiert. Typische radioaktive Markierungen umfassen 32P, 125I 35S, u. ä. Eine mit einem radioaktiven Isotop markierte Sonde läßt sich aus einer zur DNA-Probe komple mentären Nukleotidsequenz mittels einer herkömmlichen Nick-Translationsreaktion unter Verwendung einer DNase und einer DNA-Polymerase konstruieren. Die Sonde und die Probe können dann in einer Hybridisationspufferlösung zusammengegeben und bei einer geeigneten Temperatur gehalten werden, bis das Annealing erfolgt. Danach wird die Membran von überschüssigem Material durch Waschen befreit, wobei die typischerweise mittels Autoradiographie und/oder Auszählen über Flüssigszintillation nachgewiesenen und quantifizierten Proben-und gebundenen Sondenmoleküle zurückbleiben.
  • Zu den nichtradioaktiven Markierungen gehören beispielsweise Liganden, wie z. B. Biotin oder Thyroxin, ebenso wie Enzyme, wie z. B. Hydrolasen oder Peroxidasen, oder die unterschiedlichen Chemilumineszenzmoleküle, wie z. B. Luciferin, oder Fluoreszenzverbindungen wie etwa Fluorescein und seine Derivate. Man kann die Sonde auch an beiden Enden mit unterschiedlichen Markierungsarten markieren, um die Trennung zu erleichtern, wie z. B. durch Verwendung einer Isotopenmarkierung an dem obenerwähnten Ende und einer Biotinmarkierung am anderen Ende.
  • Die Ausbildung und Stabilität des Duplexes hängen von einer weitgehenden Komplementarität zwischen den beiden Strängen eines Hybrids ab, wobei, wie oben angemerkt, ein gewisser Grad an Fehlpaarung toleriert werden kann. Daher zählen zu den erfindungsgemäßen Sonden Mutationen (sowohl Einzel- als auch Mehrfachmutationen), Deletionen, Insertionen der beschriebenen Sequenzen sowie Kombinationen daraus, wobei die Mutationen, Insertionen und Deletionen die Ausbildung stabiler Hybride mit dem interessierenden Zielpolynukleotid gestatten. Mutationen, Insertionen und Deletionen lassen sich in einer gegebenen Polynukleotidsequenz auf vielfache Weise herstellen, und zwar mit Verfahren, die derzeit einer Durchschnittsfachkraft bekannt sind, sowie eventuell mit anderen Verfahren, die in Zukunft bekannt werden könnten.
  • Die möglichen Variationen in den aufgeführten Sonden haben ihre Ursache teilweise in der Redundanz des genetischen Codes. Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes kann also in den meisten der zur Herstellung von Proteinen verwendeten Aminosäuren mehr als ein codierendes Nukleotidtriplett (Kodon) eingesetzt werden. Daher können unterschiedliche Nukleotidsequenzen für eine bestimmte Aminosäure codieren. Somit lassen sich Aminosäuresequenzen durch äquivalente Nukleotidsequenzen, die dieselbe Aminosäuresequenz des Proteins bzw. Peptids codieren, herstellen. Inverse bzw. komplementäre Sequenzen sind ebenfalls ein Aspekt der vorliegenden Erfindung und können leicht von einem Fachmann eingesetzt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß Proteine mit identifizierter Struktur und Funktion konstruiert werden können, indem die Aminosäuresequenz verändert wird, falls solche Veränderungen die Sekundärstruktur des Proteins nicht verändern (Kaiser und Kezdy, 1984). Somit gehören zum Erfindungsgegenstand Mutanten der hier dargestellten Aminosäuresequenz, die die Sekundärstruktur des Proteins nicht verändern, oder wobei, falls die Struktur verändert wird, die biologische Aktivität weitgehend erhalten bleibt.
  • 4.10 IMMOBILISIERUNGSTECHNIKEN
  • Die DNA-Sonden können direkt oder indirekt auf eine Transducer-Detektionsoberfläche immobilisiert werden, um optimalen Kontakt und maximale Detektion sicherzustellen. Bei Immobilisierung auf einem Substrat werden die Sonden stabilisiert und sind daher wiederholt verwendbar. Im allgemeinen wird die Hybridisierung an einem immobilisierten Nukleinsäure-Zielmolekül durchgeführt, oder ein Sondenmolekül wird an eine feste Oberfläche, wie z. B. Nitrocellulose, Nylonmembran oder Glas, gebunden. Zahlreiche andere Matrixmaterialien können verwendet werden, einschließlich verstärkter Nitrocellulosemembran, aktiviertem Quarz, aktiviertem Glas, Polyvinylidendifluorid-(PVDF-)Membran, Polystyrolsubstraten, Substrat auf Polyacrylamidbasis, anderen Polymeren wie z. B. Poly(vinylchlorid), Poly(methacrylsäuremethylester), Poly(dimethylsiloxan), Photopolymeren (welche photoreaktive Spezies wie z. B. Nitrene, Carbene und Ketylradikale, die kovalente Verknüpfungen mit Zielmolekülen ausbilden können (Saiki et al., 1994).
  • Die Bindung der Biosonde an einen ausgewählten Träger kann mit einem von mehreren Mitteln erfolgen. Beispielsweise wird DNA üblicherweise an Glas gebunden, indem zunächst die Glasoberfläche silanisiert und dann mit Carbodiimid oder Glutaraldehyd aktiviert wird. In alternativen Verfahrensweisen können Reagentien wie z. B. 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOP) oder Aminopropyltrimethoxysilan (APTS) verwendet werden, wobei die DNA über Aminolinker, die entweder am 3'- oder 5'- Ende des Moleküls während der DNA-Synthese eingebaut wurden, verknüpft wird. DNA kann unter Verwendung von ultravioletter Strahlung direkt an Membranen gebunden werden. Bei Nitrocellulosemembranen werden die DNA-Sonden auf die Membranen punktförmig aufgetragen. Zur Bestrahlung der DNA-Spots und zur Induzierung der Quervernetzung wird eine UV-Lichtquelle (Stratalinker, von Stratagene, La Jolla, CA.) verwendet. Ein alternatives Verfahren zur Quervernetzung beinhaltet das Backen der mit den Spots versehenen Membranen im Vakuum bei 80°C für zwei Stunden.
  • Spezifische Biosonden können zunächst an eine Membran immobilisiert und dann an eine mit einer Transducer-Detektionsoberfläche in Kontakt stehenden Membran gebunden werden. Bei diesem Verfahren wird die Bindung der Biosonde an den Transducer verhindert, was für die Produktion im Großmaßstab wünschenswert sein kann. Zu den für diese Anwendung besonders geeigneten Membranen gehören Nitrocellulosemembran (z. B. von BioRad, Hercules, CA) oder Polyvinylidendifluorid (PVDF) (BioRad, Hercules, CA) oder Nylonmembran (Zeta- Probe, BioRad) oder Substrate auf Polystyrolbasis (DNA.BINDTM Costar, Cambridge, MA).
  • 4.11 POLYNUKLEOTID-HYBRIDISIERUNGSSONDEN UND -PRIMER
  • Zusätzlich zu ihrer Verwendung bei der Steuerung homologer oder weitgehend homologer Nukleinsäuresequenzen können die hier beschriebenen Polynukleotide auch auf verschiedene andere Weisen verwendet werden. So finden sie beispielsweise Verwendung als Sonden oder Primer in Ausführungsformen der Nukleinsäurehybridisierung. Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis einer ein bestimmtes Polynukleotid codierenden Nukleinsäuresequenz bereit. Bei dem Verfahren werden im allgemeinen Probennukleinsäuren, von denen man annimmt, daß sie ein interessierendes Polypeptid codieren, gewonnen; die Probennukleinsäuren mit einem isolierten Nukleinsäureabschnitt, der weitgehend komplementär zu den Probennukleinsäuren ist, in Kontakt gebracht, und zwar unter Bedingungen, durch die die Hybridisierung weitgehend komplementärer Nukleinsäuren gestattet ist; und die so gebildeten hybridisierten komplementären Nukleinsäuren nachgewiesen.
  • Besondere Berücksichtigung als Hybridisierungssonden zur Verwendung beispielsweise in Southern-Blotting finden Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzbereichen, die aus aufeinanderfolgenden Nukleotidabschnitten von etwa 23 bis etwa 50 oder selbst bis zu und einschließlich Sequenzen von etwa um die 100–200 Nukleotiden, die mit der Ziel-DNA-Sequenz identisch oder dazu komplementär sind. Mittelgroße Fragmente finden ebenfalls allgemeine Anwendung in Hybridisierungsausführungsformen, wobei die Länge des aufeinanderfolgenden komplementären Bereichs variieren kann, wie z. B. zwischen etwa 25–30 oder zwischen etwa 30 und etwa um die 40 Nukleotiden, doch können größere aufeinanderfolgende Komplementaritätsabschnitte verwendet werden, wie z. B. diejenigen mit einer Länge von etwa 200 bis etwa 300 oder von etwa 300 bis etwa um die 400 oder 500 Nukleotiden, gemäß der Länge der komplementären Sequenzen, die man nachweisen möchte. Es ist sogar möglich, daß längere aufeinanderfolgende Sequenzbereiche verwendet werden, einschließlich solcher Sequenzen, die wenigstens etwa 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 oder noch mehr aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen.
  • Natürlich können Fragmente auch mit Hilfe anderer Techniken, wie z. B. durch mechanisches Scheren oder durch Restriktionsenzymverdau, erhalten werden. Kleine Nukleinsäureabschnitte oder -fragmente können leicht, beispielsweise durch direkte Synthese des Fragments auf chemischem Wege, wie es allgemein unter Verwendung eines Oligonukleotid-Syntheseautomaten praktiziert wird, hergestellt werden. Fragmente lassen sich ebenfalls durch Anwendung einer Nukleinsäurereproduktionstechnik, wie z. B. der PCRTM-Technik der US-A-4,683,195 und US-A-4,683,202, durch Einführung ausgewählter Sequenzen in rekombinante Vektoren zur rekombinanten Produktion sowie mit anderen rekombinanten DNA-Techniken, die dem molekularbiologischen Fachmann allgemein bekannt sind, erhalten.
  • Dementsprechend lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen aufgrund ihrer Fähigkeit, selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Abschnitten von DNA-Fragmenten zu bilden, einsetzen. Je nach der ins Auge gefaßten Anwendung möchte man unterschiedliche Hybridisierungsbedingungen verwenden, um unterschiedliche Grade der Selektivität der Probe gegenüber der Zielsequenz zu erzielen. Bei Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, möchte man zur Hybridbildung typischerweise relativ stringente Bedingungen verwenden. Bei "hoch stringenten" Hybridisierungsbedingungen werden typischerweise Bedingungen mit relativ wenig Salz und/oder hoher Temperatur verwendet, wie sie beispielsweise bei etwa 0,02 M bis etwa 0,15 M NaCl und Temperaturen von etwa 50°C bis etwa 70°C vorliegen. Unter solchen selektiven Bedingungen werden nur wenige oder gar keine Fehlpaarungen zwischen der Sonde und der Matrize bzw, dem Zielstrang toleriert, so daß diese zur Isolierung bestimmter DNA-Abschnitte besonders geeignet sein sollten. Der Nachweis von DNA-Abschnitten über Hybridisierung ist dem Fachmann allgemein bekannt, und die Lehren der US-A-4,965,188 und der US-A-5,176,995 sind beispielhaft für die Hybridisierungsanalyseverfahren. Lehren, wie z. B. diejenigen, die den Schriften von Maloy et al., 1990; Maloy 1994; Segal, 1976; Prokop, 1991; und Kuby, 1994 entnommen werden können, sind besonders relevant.
  • Natürlich erfordern manche Anwendungen, beispielsweise solche, bei denen man Mutanten unter Verwendung eines an eine zugrundeliegende Matrize hybridisierten Mutantenprimer-Strangs herstellen möchte, oder solche, bei denen man versucht, bestimmte Ziel-Polynukleotidsequenzen aus verwandten Spezies, funktionellen Äquivalenten, o. ä. zu isolieren, typischerweise weniger stringente Hybridisierungsbedingungen, um die Bildung des Heteroduplexes zu gestatten. Unter diesen Umständen möchte man möglicherweise Hybridisierungsbedingungen mit "niedriger Stringenz" bzw. "reduzierter Stringenz" verwenden, wie z. B. diejenigen, bei denen etwa 0,15 M bis etwa 0,9 M Salz bei Temperaturen im Bereich von etwa 20°C bis etwa 55°C verwendet wird. Kreuzhybridisierende Spezies lassen sich dadurch leicht als positive Hybridisierungssignale in Bezug auf Kontrollhybridisierungen identifizieren. In jedem Fall ist es allgemein ersichtlich, daß Bedingungen durch die Zugabe steigender Mengen an Formamid, was genau wie eine Temperaturerhöhung der Destabilisierung des Hybridduplexes dient, stringenter gemacht werden können. Somit lassen sich Hybridisierungsbedingungen leicht manipulieren und sind damit im allgemeinen ein je nach den gewünschten Ergebnissen ausgewähltes Verfahren. Unabhängig davon, welche jeweilige Kombination aus Salzen (wie z. B. NaCl oder NaCitrat u. ä.), organischen Puffern (einschließlich z. B. Formamid u. ä.) und Inkubations- oder Waschtemperaturen verwendet wird, ist die Fachkraft leicht in der Lage, Hybridisierungsbedingungen mit "hoher", "mittlerer" oder "niedriger" Stringenz einzusetzen und die Ergebnisse aus den Hybridisierungsanalysen mit solchen Bedingungen zu interpretieren, um die relative Homologie einer Zielnukleinsäuresequenz zu derjenigen der jeweiligen eingesetzten Polynukleotidsequenz zu bestimmen.
  • In gewissen Ausführungsformen ist es vorteilhaft, erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen in Kombination mit einem entsprechenden Mittel, wie z. B. einer Markierung, zur Bestimmung der Hybridisierung zu verwenden. Im Fachgebiet sind viele verschiedene geeignete Indikationsmittel bekannt, einschließlich fluoreszierender, radioaktiver, enzymatischer oder anderer Liganden, wie z. B. Avidin/Biotin, die ein nachweisbares Signal abgeben können. In bevorzugten Ausführungsformen ist es besonders wünschenswert, anstelle von radioaktiven oder anderen umweltmäßig nicht wünschenswerten Reagentien eine Fluoreszenzmarkierung oder ein Enzym-Tag, wie z. B. Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, einzusetzen. Im Fall der Enzym-Tags sind kolorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, die sich zur Bereitstellung eines Mittels, das für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, einsetzen lassen, um eine spezifische Hybridisierung mit komplementären nukleinsäurehaltigen Proben zu identifizieren.
  • Im allgemeinen ist es ersichtlich, daß die hier beschriebenen Hybridisierungssonden sowohl als Reagentien bei der Hybridisierung in Lösung als auch bei Ausführungsformen, in denen eine Festphase verwendet wird, geeignet sind. In Ausführungsformen mit einer Festphase wird die Test-DNA (oder -RNA) an eine ausgewählte Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder auf irgendeine andere Art befestigt. Diese fixierte, einzelsträngige Nukleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Sonden unter den gewünschten Bedingungen ausgesetzt. Die ausgewählten Bedingungen hängen von den jeweiligen Umständen, die auf den jeweils benötigten Kriterien beruhen (z. B. je nach G+C-Gehalt, Art der Zielnukleinsäure, Nukleinsäurequelle, Größe der Hybridisierungssonde, usw.), ab. Nach dem Waschen der hybridisierten Oberfläche, um nichtspezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird die spezifische Hybridisierung mittels der Markierung nachgewiesen oder sogar quantifiziert.
  • 4.12 ENTWICKLUNG EINES MIKROCHIPS MIT INTEGRIERTER SCHALTUNG (INTEGRATED CIRCUIT MICROCHIP, ICM)
  • 4.12.1 ICM-SYSTEM UND -DESIGN
  • Einen wichtigen Teil eines ICM bilden das Nachweisverfahren sowie der Spektralbereich des Sensorsystems. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere optische Detektionssysteme, die auf der Fluoreszenz von Farbstoffen im sichtbaren und nahen Infrarot-(NIR-) Bereich hinsichtlich des nichtradioaktiven Nachweises von mit einem Tag versehenen Gensonden untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß an den Chip gebundene, hybridisierte Nukleinsäuren mit Fluoreszenzdetektionsmitteln, in denen die erfindungsgemäßen integrierten Mikrochips verwendet werden, selektiv nachgewiesen werden. Wie bereits gezeigt wurde, ist unter Verwendung der Fluoreszenzdetektion von Farbstoffen mit Laseranregung eine Nachweisgrenze im Zeptomol-Bereich (10–21 mol) möglich (Vo-Dinh et al., 1994). Die Miniaturisierung optischer Biosensoren wird durch die Vielseitigkeit der Wellenleiterkonfigurationen erleichtert. In den Figuren sind verschiedene Konfigurationen und Verwendungen der DNA-Biochips gezeigt.
  • 4.12.2 ICM-SYSTEM MIT INTEGRIERTEN PHOTOTRANSISTOREN
  • Das hierin erörterte instrumentelle System beinhaltet die Konstruktion integrierter elektrooptischer Sensor-Photodetektoren für die Biosensor- Mikrochips. Hochintegrierte Biosensoren werden teilweise dadurch ermöglicht, daß man mehrere optische Sensorelemente und mikroelektronische Eigenheiten auf einem einzigen integrierten Schaltkreis (Integrated Circuit, IC) herstellen kann.
  • In 3 und 4 ist ein Beispiel für eine solche Integration gezeigt. Diese Figur zeigt schematisch ein zweidimensionales Array aus auf einem einzigen IC-Chip integrierten optischen Detektor-Verstärkern. Die in dieser Figur vorhandene Detailzeichnung zeigt, daß es sich bei dem optischen Detektor jeweils um einen an einen Transimpedanzverstärker gekoppelten Phototransistor mit daran anschließendem Verstärker handelt. Dieser Block wiederholt sich mehrere Male auf dem IC-Chip und wird mit anderen elektronischen Elementen, wie z. B. Filtern und Verstärkern, die ebenfalls auf demselben IC integriert sein können, kombiniert.
  • Bei dem mit dem Phototransistor verwendeten Arbeitsverstärker handelt es sich um einen zweistufigen, ungepufferten Verstärker. Der Schaltkreis ist kompakt und nimmt eine Fläche von lediglich 185 μm x 200 μm ein und weist dennoch eine einigermaßen hohe Leistung auf. Er wurde so konstruiert, daß er für eine Breitbandverstärkung sowie für kleine Signalpegel geeignet ist. Das Gewinn-Bandbreite-Produkt beträgt 70 MHz, und der Verstärker ist stabil für Verstärkungen von mehr als 10. Zu den weiteren typischen Eigenschaften gehören: Eingangsoffsetspannung von weniger als 5 mV, Gleichstromverstärkung von 220, positive Flankensteilheit [slew-rate] von 80 V/μs sowie negative Flankensteilheit von 9 V/μs. Der Schaltkreis benötigt 2,5 mW von einer einzigen 5-V-Quelle. In der bevorzugten Ausführungsform wurde von diesem IC-Chip die vollständige Umwandlung eines optischen Signals in ein für die Datendigitalisierung und -erfassung mittels eines Computers geeignetes elektrisches Signal durchgeführt.
  • In 4 ist die physikalische Anordnung des Phototransistor- und Verstärkerschaltkreises gezeigt. Die Schaltung wurde in einem 2 μm-, p-Well-CMOS-Prozeß hergestellt und nahm eine Fläche von 160 000 Quadratmikrometern ein. Der Phototransistor besteht aus 220 in Parallelschaltung verbundenen Phototransistorzellen. Eine einzelne Phototransistorzelle nahm 760 Quadratmikrometer ein. Der Transimpedanzverstärker wies eine Verstärkung von 100 kV/A auf. Da die Phototransistoren mit der 10fachen Verstärkerverstärkung gekoppelt wurden, betrug die erhaltene Verstärkung 106 VIA. Die Phototransistoren wiesen eine Umwandlungsverstärkung in der Größenordnung von 10 μA/μW auf, so daß die gesamte Kette eine ungefähre Umwandlungsverstärkung von 10 μV/μW besaß. Der exakte Verstärkungswert hängt im allgemeinen von dem interessierenden Spektralbereich und in gewissem Ausmaß von dem beobachteten Signalpegel ab.
  • Die obenbeschriebenen Elemente können zur Anpassung der Vorrichtungen an spezifische Anwendungen modifiziert werden. Da der Phototransistor aus einfachen Photozellenelementen besteht, kann man ihn mit so vielen Zellen wie nötig verbinden, um die gewünschte Geometrie oder die zur Anpassung des Detektors an eine spezifische Anwendung erforderliche Anzahl an Kanälen zu erzeugen. In ähnlicher Weise können die Verstärkung und Bandbreite des Verstärkers nach Anwendungsbedarf mittels einfacher Widerstands- oder Kondensatoränderungen angepaßt werden. Weitere Lichtsensorstrukturen können zusätzlich zum Phototransistor unter Verwendung von "Complementary Metal Oxide Semiconductor" (CMOS)-Standardverfahrensschritten hergestellt werden. Durch die Verwendung der p-n-Übergänge, die normalerweise Wells oder Transistoren bilden würden, sind mehrere Photodiodenstrukturen möglich.
  • 4.12.3 ICM-SYSTEM MIT INTEGRIERTEN PHOTOTRANSISTOREN
  • In 3 ist ein Biochip mit mehreren Arrays aus Anregungslichtquellen und Detektoren gezeigt. Die Konstruktion eines ICM-Systems für solch einen Biochip mit integrierten Anregungsquellen aus Licht emittierenden Dioden (LED) ist in 4 dargestellt. Dieses ICM-System enthält sowohl als Lichtquellen verwendete GaAs-Chips als auch den Phototransistor als den Detektor. Die elektrooptische Schaltung und Anordnung dieser Vorrichtung ist in 5 und 6 gezeigt. 5 bzw. 6 zeigen das schematische Diagramm der IC-Schaltung bzw. -Anordnung für die IR-Lichtquelle und den Nachweis des Analogsignals.
  • 4.12.4 ICM-SYSTEM MIT 4 × 4-N-WELL-PHOTODIODENARRAY
  • Ein zweites ICM-System umfaßt ein großflächiges, 4 × 4 n-Well integriertes Verstärker-Photodiodenarray, das als ein einziger, spezieller, für den Biochip hergestellter integrierter Schaltkreis (IC) konstruiert wurde. Diese IC-Vorrichtung ist an den Biosensor gekoppelt und so konstruiert, daß sehr niedrige Lichtmengen beobachtet werden können.
  • Die physikalische Anordnung des IC-Arrays ist in 7 dargestellt und zeigt, daß die einzelnen Photodioden eine Größe von 0,9 mm im Quadrat besitzen und auf einem 1-mm-Raster angeordnet sind. Die Photodioden und die dazugehörige elektronische Schaltung wurden mit einem 1,2-Mikrometer-n-Well-CMOS Standardverfahren von Orbit Semiconductor (Sunnyvale, Calif.) hergestellt. Die Verwendung dieser Art von Standardverfahren gestattet die Herstellung von Photodioden, Phototransistoren ebenso wie von weiteren zahlreichen analogen und digitalen Schaltungstypen auf einem einzigen IC-Chip. Die Photodioden selbst werden unter Verwendung der n-Well-Struktur, die im allgemeinen zur Herstellung von Widerständen oder als Substratmaterial für einen PMOS-Transistor verwendet wird, hergestellt. In 8 ist eine schematische Querschnittszeichnung der n-Well-Photodiode gezeigt. Da es sich bei der Anode der Diode um das p-Typ-Substratmaterial handelt, das allen Schaltungen auf dem IC-Chip gemeinsam ist, seht nur die Kathode zur Beobachtung des Photostroms zur Verfügung, und die Photodiode ist auf den Betrieb mit einer Vorspannung in Sperrichtung beschränkt.
  • In 9 ist eine Eindiodenversion des Schaltkreises gezeigt. Der Operationsverstärker und der Gegenkopplungswiderstand R1 (227) bilden einen Transimpedanzverstärker, der zur Umwandlung des Photostroms in eine Spannung verwendet wird. Die Umwandlungsverstärkung (V/A) wird durch den Wert des Widerstands 227 bestimmt. Der Rückkopplungskondensator führt zwei Funktionen aus: (a) er verhindert das Oszillieren des Verstärkerschaltkreises und (b) er beschränkt die Bandbreite des Schaltkreises. Im allgemeinen sollte die Bandbreite nicht größer als für die gewünschte Messung notwendig sein. Die Reduktion der Bandbreite verringert das am Ausgang des Verstärkers vorliegende Rauschen, so daß man, falls sich diese Reduzierung ohne Abschwächung des Signals bewerkstelligen läßt, einen Nettogewinn beim Signal/Rausch-Verhältnis erzielt. Für diesen Schaltkreis ist die Signalbandbreite durch f = 1/(2πR1C1) definiert, wobei R1 dem Widerstand und C1 dem Kondensator gleichgesetzt ist.
  • Die an den nichtinvertierten Eingang des Operationsverstärkers angelegte Spannung bestimmt die an der Photodiode anliegende Vorspannung in Sperrichtung. Der IC kann mit einer einzigen %-v-Versorgung betrieben werden. Liegt beispielsweise an dem nichtinvertierenden Eingang 2 V an, so beträgt die DC-Spannung am anderen Eingang und am Ausgang ebenso 2 V, so daß die Vorspannung in Sperrichtung an der Diode 2 V beträgt. In die Diode fließende Photoströme fließen ebenfalls durch den Gegenkopplungswiderstand, wodurch der Verstärkerausgang positiver wird. Da die Ausgangsspannung des Operationsverstärkers die positive Versor gungsspannung nicht überschreiten kann, liegt die maximale Ausgangsspannung bei ungefähr 5 V, so daß der maximale Signalausschlag 3 V beträgt, was einem Maximalstrom von 3V/R1 entspricht.
  • Alternative Blockdiagramme des Photodioden- und integrierten Verstärkerschaltkreises sind in 10 gezeigt. Im Wechsel zum Transimpedanzverstärker plus Tiefpaßfilter-Ausleseverfahren kann ein integrierender Verstärker, wie er in 10 gezeigt ist, verwendet werden. In diesem Fall integriert der Verstärker den Strom von der Photodiode, bis das Signal in das Digitalformat umgewandelt ist. Nach der Umwandlung wird der Integrator wieder auf seinen Anfangszustand eingestellt und kann dann eine weitere Messung starten. Dieses Schema hat den Vorteil, daß die Integrationszeit reguliert werden kann, um die Anpassung an verschiedene Licht- (und damit Strom-)Werte zu gestatten. Der Nachteil dieses Schemas besteht darin, daß eine Koordination zwischen dem Analog-Digital-Umwandlungsprozeß und dem Integrator erforderlich ist.
  • Damit die Elemente im Array jeweils mit einem Verstärker verbunden werden können, wird ein analoger Multiplexer konstruiert. In einer spezifischen Ausführungsform könnte jede Photodiode jeweils mit ihrem eigenen Verstärker ausgestattet werden. Bei vielen Anwendungen ist dieses Merkmal nicht notwendig, es sei denn die zusätzliche Datenaufnahmegeschwindigkeit ist aufgrund des Vorhandenseins paralleler Kanäle erforderlich. Der Multiplexer besteht aus 16 Zellen, wie in 11 dargestellt. Jede Zelle besitzt zwei CMOS-Schalter, die über den Ausgang der Adressendecodierzelle gesteuert werden. Jede Zelle besitzt eine einzigartige 4-Bit-Adresse. Ein Schalter wird nur dann geschlossen, wenn es sich bei der jeweiligen Zelle um diejenige handelt, die adressiert wird, während der andere Schalter geschlossen ist, außer wenn es sich bei dieser Zelle um diejenige handelt, die adressiert wird. Dieser Vorgang verbindet die adressierte Diode mit dem einen Verstärker, während alle anderen in Parallel schaltung mit dem anderen Verstärker verbunden sind, wie in 12 gezeigt.
  • Diese Anordnung gestattet die Verbindung eines 4 × 4-Arrays aus Lichtquellen (z. B. unterschiedliche Fluoreszenzsonden) mit dem Photodiodenarray und das Auslesen der Signalpegel nacheinander. Mit einigen Modifikationen läßt sich ein paralleles Auslesesystem konstruieren. Die Verwendung nur eines Photodiodendetektors würde eine mechanische Bewegung erfordern, um den Quellenarray abfahren zu können. Die zusätzlichen Schalter und Verstärker dienen dazu, die durch die anderen Photodioden erzeugte Ladung korrekt vorzuspannen und zu erfassen. Wird dies nicht durchgeführt, würde man aufgrund der Tatsache, daß die adressierte Photodiode irgendwo sonst im IC erzeugten Strom sammelt, falsche Meßergebnisse erhalten. Darüber hinaus gestatten die zusätzlichen Verstärker und Schalter die Verwendung des IC als einen einzigen großflächigen (fast 4 mm2) Photodetektor (32).
  • 4.12.5 ALTERNATIVE PHOTODETEKTOREN
  • Eine Avalanche-Photodiode (APD) bietet ein alternatives Festkörperverfahren zur Detektion geringer Lichtmengen. Zu den Vorteilen der APD-Arrays gegenüber den normalerweise verwendeten Photodiodenarrays gehört die durch den Lawinenprozeß erhaltene Elektronenmultiplikation. Dadurch kann das Signal/Rausch-Verhältnis verbessert werden, so daß geringere Lichtmengen detektiert werden.
  • Das Verfahren zur Herstellung eines APD-Arrays und/oder von APD-Arrays aus Silizium umfaßt die Herstellung von Strukturen, die mit den in der CMOS-Standardverarbeitung verwendeten Schritten nicht kompatibel sind. Ein voll integrierter Mikrochip unter Einschluß von Avalanche-Photodioden benötigt spezielle Halbleiterherstellungsverfahren. Solche Verfahren sind im Fachgebiet bekannt (Geiger et al., 1990; Aubert et al., 1988).
  • 4.12.6 ALTERNATIVE PHOTODIODENARRAY-AUSLESCHEMEN
  • Zusätzlich zu dem eingesetzten Multiplexschema gibt es mehrere alternative Möglichkeiten zum Auslesen eines Arrays aus Photodioden. Bei vielen Anwendungen wird die Tiefpaßfilter-Zeitkonstante auf einen großen Wert eingestellt, um das Signal/Rausch-Verhältnis zu verbessern. Dadurch wird für die Datensammlung für den gesammten Array eine lange Zeit benötigt, falls jede Diode hintereinander abgelesen wird. Stellt man beispielsweise die Zeitkonstante auf 1 Sekunde ein und ist der Array im 4 × 4-Format, so betrüge die minimale Datenaufnahmedauer etwa 4 × 4 × 1 Sekunden × 5 = 80 Sekunden. Durch den letzten Faktor 5 wird berücksichtigt, daß sich der Verstärker und der Tiefpaßfilter auf eine bessere Genauigkeit als 1% einpegeln können, wenn dessen Eingang auf eine andere Photodiode geschaltet wird.
  • Teilparallele Ausleseschemen. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird die Reihe von Dioden in Multiplexform in einen Verstärker/Tiefpaßfilter-Schaltkreis eingeführt. Säulen oder andere Untereinheiten des Arrays können ebenfalls verwendet werden. Die Ausgangssignale der Filter werden jeweils in einen Multikanal Analog/Digital-Transducer (Analog-to-Digital Converter, ADC) eingespeist, der auf demselben IC wie der Photodiodenarray, Verstärker und Filter eingebaut werden kann. Verglichen mit dem sequentiellen bzw. seriellen Auslesen verringert sich die benötigte Zeit für einen n × n-Array um den Faktor n. Das schematische Blockdiagramm dieses teilparallelen Auslesesystems ist in 13 gezeigt.
  • Vollparalleles Ausleseschema. Dieses liefert die schnellste Auslesegeschwindigkeit. Jede Diode ist mit ihrem eigenen Verstärker, Tiefpaßfilter und ADC-Eingangskanal ausgestattet. Verglichen mit dem seriellen Auslesen verkürzt sich die benötigte Zeit für einen n × n-Array um den Faktor n2. Das Blockdiagramm für ein vollparalleles Auslesesystem ist in 14 gezeigt.
  • 4.12.7 PHOTODETEKTORARRAYGRÖSSEN
  • Ein Vorteil eines speziell angefertigten Biosensor-IC besteht darin, daß man die Photodioden physikalisch an die Sonde anpassen kann. Bei dem Prototyp werden 0,9-mm2-Photodioden auf einem 1 mm2 × 1 mm2 großen Raster verwendet, doch lassen sich auch Arrays mit einer größeren Anzahl kleinerer Photodioden anfertigen. Unter Verwendung der leicht erhältlichen 1,2 Mikrometer-Technologie könnte man Photodioden auf einem 20-Mikrometer-Raster für einen 10 × 10-Array herstellen. Dies ergäbe 100 Photodioden auf einer Fläche von nur 0,04 mm2, d. h. 2500 Photodioden pro mm2. Bei Verwendung von 0,5-Mikrometer-Verfahren, die kommerziell erhältlich sind, ist eine noch größere Dichte möglich.
  • Die Verwendung des seriellen Ausleseschemas gestattet die Nutzung des größten Teils der Chipfläche für den Photodiodenarray. Ein Array aus 1000 Elementen paßt wahrscheinlich auf einen 5 mm × 6 min großen IC, was als mittelgroßes Chipformat angesehen würde. Bei großen Arrays mit dem vollparallelen Ausleseschema handelt es sich bei dem die IC-Fläche begrenzenden Faktor höchstwahrscheinlich um die durch das Verdrahten und die Ausleseelektronik beanspruchte Fläche. Durch zukünftige Fortschritte bei der IC-Technologie könnte die Dichte der Elemente auf dem Chip vergrößert werden.
  • Bei dem teilparallelen Ausleseschema handelt es sich um einen Kompromiß zwischen den beiden anderen Fällen. Verglichen mit dem seriellen Fall bei einem großen Array könnte sich die Chipgröße verdoppeln, um ein teilparalleles Auslesen zu gestatten.
  • 4.12.8 ALTERNATIVE DETEKTIONSSCHALTKREISE
  • In den vorhergehenden Beispielen wurde die Verwendung eines Transimpedanzverstärkers für die Umwandlung des Stroms in eine Spannung und von Tiefpaßfiltern zur Verbesserung des Signal/Rausch- Verhältnisses bei Signalen mit sehr niedriger Frequenz oder Gleichstromsignalen gezeigt. Solche Filter können als Digitalfilter oder für unterschiedliche Arten von Signalen, wie z. B. eine Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzabnahme, realisiert werden. Ein an das Signal angepaßter Filter könnte verwendet werden, um eine optimale Identifizierung des Signals zu ermöglichen.
  • In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform können vorhandene niedrige Stromniveaus auch mit anderen Mitteln gemessen werden, beispielsweise durch Integration des Stroms über eine festgelegte Zeitdauer vor Messung der Spannung. Andererseits kann man den Strom integrieren, bis ein vorbestimmtes Spannungsniveau erreicht wird, und dann die für die Integration benötigte Zeit messen. In diesen Verfahren werden die folgenden Beziehungen verwendet, die die Bestimmung des Stroms aus gemessenen Spannungen, Kapazitäten und Zeiten gestatten.
  • Ladung = Strom × Zeit
    Ladung (auf einem Kondensator) = Kapazität × Spannung
  • Der zur Integration des Strom verwendete Schaltkreis hat Ähnlichkeit mit dem in 9 gezeigten Transimpedanzverstärker, außer daß es sich bei dem Rückkopplungselement des Verstärkers um einen Kondensator, gezeigt in 10 unter 241, statt eines Widerstands handelt.
  • Eine andere Möglichkeit für einen integrierenden Verstärker besteht darin, einen Verstärker herzustellen, der die an einen die Ladung aufnehmenden Kondensator entwickelte Spannung verstärkt.
  • In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform besteht ein weiteres Verfahren zur Verwendung eines integrierenden Verstärkers darin, einen Oszillator einzusetzen. Der Integrator integriert den unbekannten Strom zu einer voreingestellten Spannung und wird dann durch Entladung des Kondensators mittels eines Schalters zurückgestellt, und der Integrator kann dann von neuem beginnen. Dieser Kreislauf wird dann wiederholt durchlaufen. Die Schwingungsfrequenz ist proportional zum Eingangsstrom. Diese bekannte Technik der Schaltungskonstruktion kann in den hier offenbarten Systemen verwendet werden.
  • Zur Realisierung des integrierenden Kondensators für die beschriebenen Detektionsschaltkreise können mehrere Verfahren eingesetzt werden. Man kann einen Kondensator, wie z. B. Polysilizium, verwenden, der mit CMOS-Technologie kompatibel ist. Oder man kann die Kapazität der Photodiode selbst ausnutzen, wobei der Verstärker zur Verstärkung der über der Photodiode anfallenden Spannung verwendet wird. Dies hat den Vorteil, daß im Vergleich zur Verwendung getrennter integrierender Kondensatoren weniger Komponenten benötigt werden. Bei einem Array aus Photodioden können alle Photodioden gleichzeitig integriert und ein (schneller) Verstärker zur Multiplexnutzung der Ausgangssignale verwendet werden, ohne daß dem Schaltkreis wesentliche Meßzeit verloren geht.
  • 4.12.9 ANREGUNGSLICHTQUELLEN
  • Lichtquellen, wie z. B. Licht emittierende Dioden (LEDs) und Halbleiterlaser, können in Verbindung mit den hier beschriebenen integrierten Mikrochips verwendet werden. Man kann sich auch dazu entscheiden, alternative Mikrolasersysteme, wie z. B. EEL-Laser ("Edge-Emitting Lasers") und SEL-Laser ("Surface Emitting Lasers"), einzusetzen. VCSELs ("Vertical-Cavity Surface-Emitting Lasers") sind besonders geeignete Lichtquellen für integrierte Mikrochips. Aufgrund ihrer Linearität sind Laserarrays ideal für kompakte 2-dimensionale und 3-dimensionale Konfigurationen in ICM-Systemen. "Quantum Cavity"-(QC-)Laser können aufgrund ihrer geringen Größe ebenfalls verwendet werden. Die QC-Laser bieten leistungsfähige Halbleiterlaser im mittleren Infrarotbereich, die im Absorptions- und Raman-Modus verwendet werden können.
  • Die Fähigkeit, den divergierenden Strahl eines SEL-Lasers oder einer Licht emittierenden Diode zu formen, ist für die mikrooptische Beleuchtung in ICM-Systemen wichtig. Man kann DOE ("Diffractive Optical Elements" optische Diffraktionselemente)-Systeme verwenden, die in die ICBM-Vorrichtungen integriert werden können. So lassen sich beispielsweise viele verschiedene optische Elemente konstruieren und mit den gegenwärtigen Verarbeitungstechniken herstellen. Wie in 29 dargestellt, können kompakte DOEs und VCSELs auf einem einzelnen transparenten Substrat integriert und hergestellt werden. Die DOEs lassen sich direkt in das Substrat ätzen. Solch eine kompakte Quellen-Diffraktionslinse ist ideal für die Konstruktion eines optischen ICM-Arrays im Miniaturformat.
  • 4.13 BEWERTUNG VON FARBSTOFFMARKIERUNGEN IM SICHTBAREN UND NIR-BEREICH FÜR GENSONDEN
  • Viele in IC-Chips eingesetzte Photodetektoren arbeiten im roten und nahen Infrarot-(NIR-)Spektralbereich. Es ist daher wichtig, DNA-Markierungen im roten und NIR-Bereich zu entwickeln und zu bewerten. Von den Erfindern wurden Gensonden-Sensorverfahren untersucht, in denen Fluoreszenzfarbstoffmarkierungen sowohl im sichtbaren (350–700 nm) und NIR- (700–1000 nm) Spektralbereich verwendet wurden. Die Anregung und Detektion im NIR-Bereich bringt gewisse Schwierigkeiten mit sich, doch bietet auch mehrere Vorteile. Die Messungen im NIR-Bereich weisen eine geringere Störung durch Hintergrundfluoreszenz auf, da in Proben wie z. B. Meerwasser, Gewebe, Serum und anderen Körperflüssigkeiten nur sehr wenige Spezies mit einer Emission im NIR-Bereich vorkommen. Da die Streulichtintensität eine Frequenz4 (vierte Potenz)-Abhängigkeit zeigt, können im sichtbaren Bereich lichtundurchlässig erscheinende Proben im NIR-Bereich lichtdurchlässiger sein. Schließlich besteht ein wichtiger Vorteil im Zusammenhang mit NIR-Messungen in der Verfügbarkeit von kostengünstigen miniaturisierten Diodenlasern, die normalerweise Emissionslinien im roten und im NIR-Bereich besitzen.
  • Somit bieten NIR-Farbstoffmarkierungen in Gensonden-Biosensoren die obenerwähnten Vorteile. In einem Modellbeispiel wurde ein Wellenleiter-Multisondensystem mit CCD-Detektor-Konfiguration verwendet. Die Diodenlaserlinie bei 780 nm mit 9,5 mW wurde zur Anregung verwendet. 15 zeigt eine Eichkurve für eine mit einem NIR-Farbstoff markierte einzelsträngige DNA (5'-CCTCCTCCTTCCCAGCAGGG-3'; SEQ ID NO: 1) über einen Konzentrationsbereich von 1 pmol/μl bis 3 fmol/μl. Das Anregungslicht wurde von einer kugelschreibergroßen 9,50-mW-Laserdiode (780 nm) geliefert, und die Meßzeiten lagen im Bereich von 1 bis 3 Min. Diese Eichkurve verlief über den gesamten Bereich der untersuchten Farbstoffkonzentration linear. Die auf einem dem Dreifachen der Standardabweichung des Rauschens entsprechenden Signal beruhende optische Nachweisgrenze wurde als im Bereich der 100 attomol/μl liegend abgeschätzt.
  • 16 zeigt die Meßergebnisse von mit einem Fluoresceintag, einer im sichtbaren Bereich emittierenden Farbstoffmarkierung, versehenen Gensonden. Die Meßzeiten lagen im Bereich von 0,05 bis 2 s. Die Ergebnisse zeigen, daß die Eichkurve selbst bei so niedrigen Konzentrationen wie etwa 2 nmol/μl linear verläuft. Die höhere Nachweisgrenze wird auf einen Anstieg der Hintergrundfluoreszenz des Wellenleiters im sichtbaren Bereich zurückgeführt.
  • 4.14 BEWERTUNG DER ICM-BIOSENSORSYSTEME
  • Die für diese Arbeit konstruierten und hergestellten Mikrochips wurden bewertet, indem das Fluoreszenzsignal eines auf den Detektor punktförmig aufgetragenen Fluoreszenzfarbstoffs gemessen wurde. 17 zeigt die Leistung des speziell konstruierten ICM- Phototransistor- und Verstärkerschaltkreises (Vorrichtung Nr. ICI N551-CD2), der aus einem 2-μm, p-Well-CMOS-Verfahren bestand und eine Fläche von 160 000 Quadratmikrometern einnahm. Wie im experimentellen Teil beschrieben setzte sich der Phototransistor tatsächlich aus 220 in Parallelschaltung verbundenen Phototransistorzellen zusammen. Die Abbildung zeigt die Ausgangssignalantwort für verschiedene Konzentrationen der mit einem kleinen Helium-Cadmium-Laser (8 mW, 325 nm) angeregten Farbstoffmarkierung Rhodamin-6G. Die Ergebnisse verdeutlichen die Linearität des Mikrochipdetektors bezüglich der Markierungskonzentration.
  • Es wurden Messungen unter Verwendung einer Verstärker-Phototransistor-(APT-)ICM-Vorrichtung mit einem 4 × 4-Array aus Phototransistoren (18) durchgeführt. Der Photostrom für jeden Kanal des APT-Mikrochips wurde mit einem digitalen Photometer aufgezeichnet. Die Daten wurden dann vom Photometer über eine RS-232-Verbindung auf einen PC-Rechner ("Personal Computer") übertragen. Die Proben bestanden aus einem Array aus Mikrospots von Fluorescein-markierter DNA auf einer Membran. Die Membran wurde auf einen mit einem Tisch zur linearen Verschiebung verbundenen Glasobjektträger gelegt. Die Messungen wurden durchgeführt, während die Probenarrays mittels des Verschiebetischs über die stationäre Phototransistorvorrichtung geführt wurde. Das Licht eines Argonionenlasers bei 488 um wurde über eine Faseroptik übertragen und auf einen Probenpunkt fokussiert. Ein geeigneter, zwischen dem Probensubstrat und dem Detektorarray plazierter optischer Filter wurde zur Unterdrückung der Laserstrahlung verwendet.
  • Die mit diesem experimentellen Aufbau erhaltenen Daten zeigten beim Überführen der Probenpunkte über einen APT-Mikrochipkanal vier aufgelöste Signale ( 19). Vier Probenspots von jeweils 1 μl Fluoresceinmarkierten DNA-Sonden wurden auf eine Nitrocellulosemembran plaziert, die über einen Detektionskanal eines AP-ICM-Biochips verschoben wurde. Wenn der DNA-Punkt den Photodetektor passiert, wird ein Fluoreszenzsignal detektiert. Die 4 Spitzenwerte in 19 stellen die Detektion der 4 DNA-Punkte auf dem Substrat durch die ICM-Vorrichtung dar. 20 zeigt die Eichkurve der Fluorescein-markierten DNA unter Verwendung der APT-Mikrochipvorrichtung. Damit wird die Möglichkeit zu quantitativen Messungen der Mikrochipvorrichtung demonstriert.
  • Die Photodiodenarray-(PDA-)Mikrochipvorrichtung mit Photodiodenarray wurde ebenfalls bewertet und zeigt eine ausgezeichnete Empfindlichkeit gegenüber der mit dem NIR-Farbstoff markierten DNA. Diese Ergebnisse demonstrieren die Eignung der ICM-Technologie zur Verwendung in DNA-Biosensoranwendungen.
  • 5.0 BEISPIELE
  • Mit den folgenden beigefügten Beispielen sollen bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen veranschaulicht werden. Es sollte dem Fachmann ersichtlich sein, daß es sich bei den in den nachstehenden Beispielen offenbarten Techniken um Techniken handelt, die nach Feststellung der Erfinder bei der praktischen Durchführung der Erfindung gut funktionieren und die damit als bevorzugte Moden für ihre praktische Durchführung angesehen werden können.
  • In den 1–29 der Zeichnungen sind bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dargestellt, wobei gleiche Bezugsziffern als Verweise auf gleiche und entsprechende Teile in den verschiedenen Zeichnungen verwendet werden.
  • 5.1 BEISPIEL 1 – INTEGRIERTE NUKLEINSÄLTREBIOCHIPVORRICHTUNG
  • In 1 ist eine schematische, perspektivische Explosionsansicht eines Beispiels des DNA-Biochips 109 gezeigt, in dem optische und elektrische Komponenten kombiniert sind. Zu den gezeigten Komponenten gehören eine Lichtquelle 101, ein optisches Element 102, ein Filter 103, eine Reflexionsoptik 104, eine Probennahmeplattform 105 zur Aufnahme und Abgabe von Probe 110 auf Spot-Arrays 106 auf einem Substrat 111, ein Filter 107 sowie ein Array aus Photodetektoren 108.
  • Die in 1 gezeigten optischen Elemente können getrennt vom Biochip 109 positioniert werden, sind jedoch vorzugsweise mit dem Biochip integriert. Im letzteren Fall isoliert eine lichtdurchlässige Abschirmung bzw. Abdichtung (z. B. eine Platte aus Glas oder Quarz oder Plastik, die für die für die Deletion interessanten Wellenlängen optisch transparent ist) die optische Komponente von den biochemischen Komponenten. Das Licht von der Lichtquelle 101 passiert das selbstabbildende optische Element 102 (z. B. Systeme mit Diffraktionsoptik, binäre Optik oder Selbstabbildungsoptik, mit denen eine punktförmige Quelle in einen 2-dimensionalen Array aus Lichtstrahlen umgewandelt wird) sowie den Filter 103, so daß die einstrahlende Wellenlänge ausgewählt und spektralisoliert und mit der Reflexionsoptik 104 auf die Probenplattform 105 reflektiert wird. Ein von einem Hybridisierungsereignis stammendes Signal passiert den Filter 107, der das Licht von der Lichtquelle 101 blockiert, und wird von dem Phototransistorarray 108 detektiert.
  • 5.2 BEISPIEL 2 – SCHALTKREIS MIT OPTISCHEM DETEKTOR UND VERSTÄRKER
  • Der in 2 gezeigte Schaltkreis mit optischen Detektor und Verstärker kann auf einem integrierten Schaltkreis eingerichtet werden, um ein optisches Signal in ein für die Datendigitalisierung und -erfassung mittels eines Computers geeignetes elektrisches Signal umzuwandeln. Der optische Detektor und Verstärker umfaßt einen Phototransistor 122, der an einen Transimpedanzverstärker 120 gekoppelt ist, welcher ein Stromsignal in ein Spannungssignal umwandelt und auf den ein Verstärker 121 folgt. Der Operationsverstärker 127 im Transimpedanzverstärker 120 ist ein zweistufiger ungepufferter Verstärker.
  • In einer Ausführungsform weist der Kondensator 125 einen Wert von 2 pF und der Widerstand 126 einen Wert von 100 KΩ auf. Die Verstärkung des Verstärkers 121 ist gleich 1 + (Widerstand 129/Widerstand 130). Somit werden in einer spezifischen Ausführungsform, in der die Verstärkung des Verstärkers 121 bei 10 liegt, die Widerstände 129 und 130 so gewählt, daß ihr Verhältnis 9 beträgt. Der Schaltkreis ist kompakt (185 μm × 200 μm), weist jedoch eine einigermaßen hohe Leistungsfähigkeit auf. Er wird so konstruiert, daß er für eine Breitbandverstärkung sowie für kleine Signalpegel geeignet ist. Das Gewinn-Bandbreite-Produkt beträgt 70 MHz, und der Verstärker ist stabil für Verstärkungen von mehr als 10. Zusätzlich besitzt der Schaltkreis eine Eingangsoffsetspannung von weniger als 5 mV, Gleichstromverstärkung von 220, positive Flankensteilheit [slew-rate] von 80 V/μs sowie negative Flankensteilheit von 9 V/μs. Der Schaltkreis benötigt 2,5 mW von einer einzigen 5-V-Quelle. Der Schaltkreis in 2 kann in einem 2 μm, P-Well-CMOS-Verfahren hergestellt werden.
  • In einer Ausführungsform eines solchen Schaltkreises setzt sich der Phototransistor 122 aus 220 Phototransistorzellen zusammen, die in Parallelschaltung miteinander verbunden sind. Jede Phototransistorzelle nimmt eine Fläche von 760 Quadratmikrometern ein, und der gesamte Schaltkreis nimmt eine Fläche von 160 000 Quadratmikrometern ein. Der Transimpedanzverstärker weist eine Verstärkung von 100 kV/A auf, wobei sich an ihn ein Verstärker mit einer Verstärkung von 10 anschließt. Somit beträgt die Gesamtverstärkung 106 V/A. Die Phototransistoren weisen eine Umwandlungsverstärkung in der Größenordnung von 10 μA/μW auf, so daß der Gesamtschaltkreis eine ungefähre Umwandlungsverstärkung von 10 V/μW besitzt. Die genaue Verstärkung hängt im allgemeinen vom interessierenden Spektralbereich und zu einem gewisse Grad vom Pegel des beobachteten Signals ab.
  • Der in 2 beschriebene Schaltkreis kann entsprechend den Erfordernissen spezifischer Anwendungen modifiziert werden. Da die Phototransistorzelle 122 aus einfachen Photozellelementen zusammengesetzt ist, kann sie mit so vielen Zellen wie nötig verbunden werden, um eine gewünschte Geometrie oder eine erforderliche Anzahl von zur Anpassung des Detektors an eine spezifische Anwendung benötigten Kanälen zu erzeugen. Weitere Lichtsensorstrukturen können zusätzlich zum Phototransistor unter Verwendung von CMOS-Standardverfahrensschritten hergestellt werden. Durch die Verwendung der pn-Übergänge sind mehrere Photodiodenstrukturen möglich.
  • Bei einer Avalanche-Diode handelt es sich um eine alternative Festkörpervorrichtung, mit der man sehr geringe Lichtmengen nachweisen kann. Sie besitzt gegenüber einer herkömmlichen Photodiode den Vorteil, daß die Elektronenvervielfachung mit dem Lawinenprozeß erzielt wird, was zu einer Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses führt, wodurch geringere Lichtmengen nachgewiesen werden können. Ein Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, daß Avalanche-Dioden Schritte und Strukturen benötigen, die mit der CMOS-Standardverarbeitung nicht kompatibel sind. Ein vollintegrierter Mikrochip mit Avalanche-Photodioden würde die Entwicklung eines speziellen Halbleiterherstellungsverfahrens erfordern. Eine APD unterscheidet sich von einer herkömmlichen Photodiode darin, daß die angelegte Vorspannung in Sperrichtung zur Elektronenvervielfachung ausreicht. Der zuverlässigste Weg, um diese Vervielfachung herbeizuführen, besteht darin, einen p-n-Übergang, bei dem sowohl das p- als auch das n-Typ-Material leicht dotiert sind, mittels einer hohen Spannung (70–500 V) zu verarmen. Dies führt zu einem breiten Bereich von verarmtem Material, wo das elektrische Feld groß genug ist, um eine beträchtliche Elektronenvervielfachung, jedoch keinen elektrischen Durchbruch hervorzurufen. Die Verstärkung (Elektronenvervielfachung) wird durch die angelegte Spannung festgelegt. In einem Standardniedrigspannungs-IC-Verfahren liegen die Dotierungsniveaus höher und die Durchbruchsspannungen niedriger. Spannungen, die ausreichen, um eine beträchtliche Elektronenvervielfachung auszulösen, liegen zu nahe bei der Durchbruchsspannung, um praktische APDs zu gestatten. Jedoch könnte es in einem "Hochspannungs"-Verfahren (50–100 V Durchbruch), wie beispielsweise den für gewisse technische Elektronik verwendeten Verfahren, möglich sein, einen p-n-Übergang herzustellen, der als APD verwendet werden könnte, wobei Standardelektronik noch auf demselben IC vorhanden sein darf. Es könnte notwendig sein, daß das Verfahren mit zusätzlichen Diffusionsschritten versehen werden muß, um den p-n-Übergang für die APD zu erzeugen, während die Standardverfahrensschritte zur Erzeugung der Signalverarbeitungselektronik verwendet würden.
  • 5.3 BEISPIEL 3 – BIOCHIP
  • In 3 ist ein Biochip mit mehreren Arrays aus Anregungslichtquellen und Detektoren gezeigt. Der Biochip umfaßt eine Probennahmestufe-Schicht 140, eine Filter- und Linsenstufe-Schicht 141 und eine Siliziumchipstufe-Schicht 142. Das von einer Ansteuerschaltung 149, siehe 30, gesteuerte Licht von der Lichtquelle 144 wird von der Spiegelschicht 150 reflektiert. Die Spiegeloberfläche ist so konstruiert, daß der Lichtstrahl von 144 so fokussiert und geleitet wird, daß er die Fläche der Mikrokammeroberfläche, die die DNA-Sonde bzw. DNA-Probe enthält, abdeckt. Falls es sich bei dem nachzuweisenden Signal um Lumineszenz handelt, passiert das entstehende Licht eine optionale Filter- und Linsenstufe 147 und wird durch den Photodetektor 143 und die dazugehörige Signalverarbeitungselektronik 148, wie z. B. das in 9 gezeigte System, nachgewiesen.
  • 5.4 BEISPIEL 4 – BIOCHIP II
  • In 4 ist eine Konstruktion eines Mikrochipsystems mit integriertem Schaltkreis (ICM-System) für einen wie in 3 gezeigten Biochip mit Substrat 142 und integrierten Licht-emittierenden Diode-Anregungsquellen 144 gezeigt. Dieses ICM-System enthält sowohl einen Gallium-Arsenid-(GaAs-)Chip 151, der als Lichtquelle verwendet wird, und einen Phototransistor 143, der als Detektor verwendet wird. Das Licht 153 von den Quellen 151 trifft auf die lumineszierenden Tags, und das Licht 152 von den Tags trifft auf den Phototransistor 143, wobei die Elektronik 148 aktiviert wird.
  • 5.5 BEISPIEL 5 – INTEGRIERTE DETEKTIONSVORRICHTUNG
  • MIT LED-LICHTQUELLE UND PHOTOTRANSISTOR
  • Eine LED 161 wird von einem LED-Ansteuerelement 160 angesteuert, wie in 5 gezeigt. Das Licht wird von der Basis 173 des Phototransistors 162 gesammelt. In einer Ausführungsform ist der Emitter 163 des Phototransistors 162 mit einer 5-V-Quelle verbunden. Der Strom vom Kollektor 164 wird durch den Transimpedanzverstärker 167 (bestehend aus dem Operationsverstärker 165 mit einem an eine 2,5-V-Quelle angeschlossenen nichtinvertierenden Eingang 175 und einem Gegenkopplungswiderstand 166) in eine Spannung umgewandelt und dann mittels einer Verstärkungsstufe 169 und einem Leistungsverstärker 172 verstärkt. AC-Kopplung mit dem Kondensator 170 und dem geerdeten Widerstand 171 wird zur Blockierung der Gleichstromkomponente des Signals verwendet. Dieser Schaltkreis enthält eine LED für die Anregung. Aufgrund seines AC-Kopplungsschemas läßt sich der Schaltkreis auch zur Detektion von Impuls- oder Modulationslichtsignalen betreiben.
  • 5.6 BEISPIEL 6 – ANORDNUNG EINES INTEGRIERTEN SCHALTKREISES ZUR REALISIERUNG DER LICHTQUELLE UND DER DETEKTIONSVORRICHTUNG
  • In 6 ist ein integrierter Schaltkreis dargestellt, der zur Realisierung der Lichtquelle und der Detektionsvorrichtung in 1 bzw. 5 verwendet werden kann. Der Silikonchip 183 mit Bondinseln 182 enthält eine GaAs-Infrarot-LED 161, die von einer LED-Ansteuerschaltung 160 angesteuert wird. Der LED-Array 180 ist über den Multiplexer 181 im Multiplexbetrieb mit den Verstärkern 167 und 168 verschaltet. Das Signal des Detektors 162 wird verstärkt und vom Komparator 184 mit einem Referenzpegel verglichen. Damit kann man eine einfache Angabe des Gesamtniveaus der vorhandenen Fluoreszenz machen.
  • Eine zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt einen großflächigen 4 × 4 n-Well integrierten Verstärker-Photodiodenarray, der in Form eines einzigen, speziellen, integrierten Schaltkreises konstruiert ist. Dieser integrierte Schaltkreis ist an einen Biosensor gekoppelt und zur Beobachtung sehr geringer Lichtmengen vorgesehen. In 7 ist die physikalische Anordnung eines solchen Arrays gezeigt. Die Größe der sechzehn einzelnen Photodioden beträgt jeweils 0,9 mm mal 0,9 mm und sie sind auf einem 4 mm mal 4 mm-Raster angeordnet. 7 stellt ein Beispiel eines 4 × 4 Detektorarrays dar, der in den in 21, 23, 25 und 29 gezeigten Systemen verwendet werden kann. Die Lichtquellen sind in 7 nicht gezeigt. Die Photodioden und die dazugehörige elektronische Schaltung läßt sich unter Verwendung eines 1,2-Mikrometer-n-Well-CMOS-Standardverfahrens, wie es z. B. von Orbit Semiconductor erhältlich ist, herstellen. Die Verwendung dieser Art von Standardverfahren gestattet die Herstellung von Photodioden und Phototransistoren ebenso wie von vielen anderen Arten Analog- und Digitalschaltung in einem einzigen integrierten Schaltkreis. Die Photodioden werden unter Verwendung der n-Well-Struktur, die im allgemeinen zur Herstellung von Widerständen oder dem Substratmaterial für einen PMOS-Transistor verwendet werden, hergestellt. Einzelheiten sind in 8 gezeigt.
  • BEISPIEL 7 – SCHEMATISCHER QUERSCHNITT DURCH EINE N-WELL-PHOTODIODE
  • In 8 ist ein schematischer Querschnitt einer n-Well-Photodiode dargestellt, die im Photodiodenarray von 7 verwendet werden kann. Das Licht 203 passiert die Oxidschicht 200. Da es sich bei der Anode 202 der Photodiode 190 um das p-Typ-Substratmaterial handelt, das allen Schaltungen auf dem Chip gemeinsam ist, steht nur die Kathode 201 zur Beobachtung des Photostroms zur Verfügung, und die Photodiode ist auf den Betrieb mit einer Vorspannung in Sperrichtung beschränkt.
  • 5.8 BEISPIEL 8 – DETEKTIONSSCHALTKREIS
  • In 9 ist anstelle eines Phototransistors ein Photodiodenschaltkreis gezeigt, in dem die Vorspannung in Sperrichtung der Photodiode etabliert ist und eine einstellbare Verstärkung 222 enthalten ist. (Zu beachten ist, daß in 2 und 5 Phototransistoren anstelle von Photodioden gezeigt sind.) Der Operationsverstärker 225 und der Gegenkopplungswiderstand 227 bilden einen Transimpedanzverstärker 221, der den Strom von der Photodiode 220 (bei der die Anode 230 geerdet und die Kathode 229 an den invertierenden Eingang des Operationsverstärkers 225 angeschlossen ist) in eine Spannung umwandelt. Die Umwandlungsverstärkung (in Volt pro Ampere) wird durch den Wert des Gegenkopplungswiderstands 227 bestimmt. Der Rückkopplungskondensator 226 verhindert ein Oszillieren des Verstärkers 221 und begrenzt die Bandbreite des Schaltkreises, die im allgemeinen nicht größer als zur Erhaltung der gewünschten Messung notwendig sein sollte. Die Reduzierung der Bandbreite verringert das am Ausgang des Verstärkers vorhandene Rauschen und führt somit, falls das Signal nicht durch die verringerte Bandbreite abgeschwächt wird, zu einem Nettogewinn an Signal/Rausch-Verhältnis. Die Signalbandbreite für die Schaltung in 9 beträgt 1/(2πR1C1)
  • In einer Ausführungsform besitzt der Gegenkopplungswiderstand 227 einen Wert von I MΩ, und der Rückkopplungskondensator 226 besitzt einen Wert von 100 pF. Man kann eine Vorspannung an den nichtinvertierenden Eingang 228 des Operationsverstärkers 225 anlegen, um die Ansprechzeit der Photodiode 220 zu verkürzen. Ein Tiefpaßfilter 224 sowie eine einstellbare Verstärkung 222 sind dem Analog/Digital-Transducer 223 vorgeschaltet und hier enthalten, um das Signal/Rausch-Verhältnis bei Signalen mit sehr niedriger Frequenz oder Gleichstromsignalen zu verbessern. Die an den nichtinvertierten Eingang des Operationsverstärkers angelegte Spannung bestimmt die an der Photodiode angelegte Vorspannung in Sperrichtung. Der integrierte Schaltkreis kann mit einer einzigen 5-V-Stromversorgung betrieben werden. Legt man 2 V an den nichtinvertierenden Eingang an, so beträgt die Gleichspannung am anderen Eingang und am Ausgang ebenfalls 2 V, so daß die Umkehrspannung in Sperrichtung an der Photodiode 2V beträgt. In die Photodiode fließender Strom fließt ebenfalls durch den Gegenkopplungswiderstand, wodurch der Verstärkerausgang positiver wird. Da das Ausgangssignal des Operationsverstärkers den Wert der positiven Spannungsversorgung nicht überschreiten kann, liegt das Ausgangsmaximum bei ungefähr 5 V. Somit beträgt der maximale Signalausschlag 3 V, was einem Maximalstrom von 3 V/R1 entspricht.
  • Zwar wurde in dieser Ausführungsform nur ein Verfahren zur Messung von geringen Strommengen dargestellt, doch sind viele andere Verfahren möglich.
  • So bestünde beispielsweise ein Verfahren zur Bestimmung des Stroms darin, den Strom unter Verwendung eines integrierenden Verstärkers über eine festgelegte Zeitdauer zu integrieren und dann die Spannung zu messen, oder den Strom zu integrieren, bis eine festgelegte Spannung erreicht ist, und dann die Zeit zu messen. Ein zweites Verfahren zur Bestimmung des Stroms wäre die Verwendung eines Oszillators. Insbesondere könnte ein Integrator den unbekannten Strom kontinuierlich integrieren, bis eine voreingestellte Spannung erreicht wäre, und dann sich selbst zurückstellen. Die erhaltene Schwingungsfrequenz wäre proportional zum Strom. Zusätzlich zur Verwendung von Standard-CMOS-Kondensatoren könnte man dieses zweite Verfahren auch unter Verwendung der Kapazität der Photodiode selbst realisieren. Zu Anfang ist der Schalter geschlossen und die Kapazität der Photodiode wird entladen, und die Spannung über der Photodiode ist null. Wird der Schalter geöffnet, erzeugt das auf die Photodiode treffende Licht eine Ladung, die an der Photodiodenkapazität eine Spannung erzeugt. Zusätzliches Licht erhöht die Spannung, die von einem Verstärker verstärkt wird. Überschreitet die Ausgangsspannung des Verstärkers die Referenzspannung, ändert sich der Zustand des Komparatorausgangs, wobei dieser das Einzelsignal abfeuert, welches wiederum den Schalter schließt und die Photodiodenkapazität entlädt. Dadurch wird der Verstärkereingang auf seinen Anfangszustand rückgestellt, und der Komparator stellt sich ebenfalls wieder auf seinen Anfangszustand ein. Nach Ablauf des Einzelsignals öffnet sich der Schalter, und der Ladungsvorgang kann von neuem beginnen. Eine größere Lichtmenge führt zu schnellerer Ladung und damit zu einer höheren Ausgangsfrequenz des Oszillators. Dies führt zu einem Array aus Integratoren, der, ohne daß wesentliche Meßzeit verlorengeht, im Multiplexbetrieb mit einem einzigen schnellen Verstärker geschaltet werden könnte.
  • 5.9 BEISPIEL 9 – ALTERNATIVER DETEKTIONSSCHALTKREIS
  • In 10 ist ein alternativer Detektionsschaltkreis gezeigt, der in Verbindung mit dem Photodiodenarray von 7 verwendet werden kann. Der Schaltkreis in 10 verwendet anstelle des Transimpedanzverstärkers 221 in 9 einen integrierenden Verstärker 240. Der Tiefpaßfilter 224 in 9 wird nicht benötigt, da es sich bei dem Integrator 240 in 10 um einen Tiefpaßfilter handelt, der während jeder Abtastzeit automatisch mitläuft. In 10 integriert der Integrator 240 den Strom von der Photodiode 220, bis das Signal abgefragt ist, wobei dann der Integrator 240 durch Schließen des Rückstellungsschalters 242 auf null gesetzt wird. Ein Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, daß die Integrationszeit an verschiedene Lichtmengen (und damit Strommengen) angepaßt werden kann. Dieser Ansatz erfordert die Koordination zwischen dem Analog/Digital-Umwandlungsprozeß und dem Integrator. Der Analog/Digital-Transducer muß den Ausgang des Verstärkers mit programmierbarer Verstärkung abfragen, wenn die Integrationszeit abgelaufen ist und bevor der Integrator zurückgestellt wird.
  • 5.10 BEISPIEL 10 – ANALOGER MULTIPLEX
  • 11 zeigt einen analogen Multiplexer 265, den man dazu verwenden kann, die Verbindung eines beliebigen einzelnen Elements 266 in dem Photodiodenarray von 7 durch den Ausgang 267 mit einem Verstärker 260 zu gestatten. Eine mögliche Realisierung dieses Multiplexers für die Verwendung mit 16 Elementen ist in 12 gezeigt. Jedes Element 266 weist eine einzigartige Vier-Bit-Adresse sowie zwei CMOS-Schalter 286 und 287 auf, die über den Ausgang des Adressendecoders 280 der Zelle gesteuert werden. Der Schalter 286 ist nur geschlossen, wenn die jeweilige Zelle adressiert wird, und der Schalter 287 ist geschlossen, außer wenn diese jeweilige Zelle adressiert wird. Auf diese Weise ist die adressierte Photodiode mit einem Verstärker 260 durch den Ausgang 267 verbunden, und die nicht adressierten Photodioden sind in Parallelschaltung mit einem anderen Verstärker 261 durch den Ausgang 268 verbunden. Der Schalter 286 besteht aus parallelen CMOS-Schaltern 282 und 283, und der Schalter 287 besteht aus den parallelen CMOS-Schaltern 284 und 285. Bei jedem Paar wird ein Gate über den Ausgang des Adressendecoders gesteuert und das andere Gate über die Inversion 281 des Adressendecoderausgangs gesteuert. Diese Konfiguration gestattet das Schalten von Signalen, die vom Massepotential bis zur Versorgungsspannung reichen (die einzelnen CMOS-Gates werden beim maximalen Signalhub nicht in Durchlaßrichtung vorgespannt).
  • 5.11 Beispiel 11 – LICHTQUELLENARRAY
  • Unter Verwendung des Multiplexers in 11 wird in 12 der Einsatz eines 4 × 4-Arrays aus Lichtquellen (wie z. B. Lumineszenzsonden) gezeigt, die mit einem Photodiodenarray verbunden werden, von dem die Signalpegel nacheinander abgelesen werden. Würde man statt dessen einen einzigen Photodiodendetektor verwenden, so würde das Abrastern des Quellenarrays eine mechanische Bewegung erfordern. Der Verstärker für die nicht adressierten Photodioden gestattet die korrekte Vorspannung und Erfassung der Ladungen von diesen Photodioden. Wird dieser Verstärker nicht verwendet, so kann dies zu einer fehlerhaften Messung von der adressierten Photodiode führen, da diese die Ströme von nicht adressierten Photodioden sammelt. Weiterhin gestattet dieser Zwei-Verstärker-Ansatz im Multiplexbetrieb, daß der Chip wie ein einziger großflächiger (fast 4 mm2) Photodetektor funktioniert.
  • Bei vielen Anwendungen besitzt der Tiefpaßfilter eine große Zeitkonstante, um das Signal/Rausch-Verhältnis zu verbessern. Werden die Daten nacheinander gelesen, so kann eine große Zeitkonstante die zum Ablesen des gesamten Arrays benötigte Zeit stark erhöhen. Wird beispielsweise die Zeitkonstante auf 1 Sekunde eingestellt und liegt ein 4 × 4-Array vor, so betrüge die Minimalzeit zum Sammeln der Daten 80 Sekunden, wobei darin ein Faktor 5 enthalten ist, um den Verstärker und den Tiefpaßfilter das Einpegeln nach Schaltung ihres Eingangs auf eine andere Photodiode zu gestatten.
  • 5.12 BEISPIEL 12 – TEILPARALLELES VERFAHREN
  • Als Alternative zum in 11 und 12 gezeigten Verfahren im Multiplexbetrieb kann ein teilparalleles Verfahren verwendet werden, um Daten von dem in 7 gezeigten Photodiodenarray zu erhalten. Ein solches teilparalleles Verfahren ist in 13 dargestellt. In diesem Fall wird eine Reihe 310 von Photodioden 300 über den Multiplexer 301 mit einem Verstärker 302 und einem Tiefpaßfilter 303 im Multiplexbetrieb verschaltet. Anstelle der Zeilen können Spalten oder andere Untereinheiten des Arrays verwendet werden. Das Ausgangssignal von jedem Tiefpaßfilter wird jeweils in einen Multikanal-Analog/Digital-Transducer 304 eingespeist, der auf demselben integrierten Schaltkreis wie der Photodiodenarray, der Verstärker und der Tiefpaßfilter realisiert sein kann. Der A/D-Transducer 304 produziert das Ausgangssignal 305. Bei einem nxn-Array verkürzt ein solches teilparalleles Verfahren die für ein sequentielles Verfahren benötigte Zeit um einen Faktor n.
  • 5.13 BEISPIEL 13 – VOLLPARALLELES AUSLESEN
  • Noch ein weiteres Verfahren, das zur Gewinnung von Daten von dem in 7 gezeigten Photodiodenarray gewonnen werden kann, ist das in 14 gezeigte vollparallele Ausleseschema. In diesem Fall wird jede Photodiode 320 mit ihrem eigenen Verstärker 321, Tiefpaßfilter 322 und Analog/Digital-Transducereingang 328 ausgestattet. Bei einem nxn-Array verkürzt ein solches vollparalleles Verfahren die für ein sequentielles Verfahren benötigte Zeit um einen Faktor n2.
  • Ein Vorteil eines speziell angefertigten integrierten Biosensor-Schaltkreises besteht darin, daß man die Photodioden physikalisch an die Sonde anpassen kann. In der Ausführungsform in 7 werden 0,9-mm2-Photodioden auf einem 1 mm2 mal 1 mm2-Raster verwendet, doch sind Arrays mit einer größeren Anzahl kleinerer Photodioden ebenfalls möglich. Unter Verwendung der leicht erhältlichen 1,2-Mikrometer-Technologie läßt sich ein 10 × 10-Array mit Photodioden auf einem 20-Mikrometer-Raster herstellen, wodurch 100 Photodioden auf einer Fläche von nur 0,04 mm2 bereitgestellt werden, was einer Dichte von 2500 Photodioden pro mm2 entspricht. Mit 0,5-Mikrometer-Verfahren bzw. 0,25 (oder weniger)-Mikrometer-Verfahren, die ebenfalls kommerziell erhältlich sind, ist sogar noch eine größere Dichte möglich. Bei diesen Verfahren werden lithographische Verfahren zur Herstellung dieser Submikrometerstrukturen verwendet, um eine größere Dichte der Photodetektor- und Lichtquellenarrays zu ermöglichen.
  • 5.14 BEISPIEL 14 – NIR-FARBSTOFFMARKIERTE NUKLEINSÄUREN
  • In 15 ist eine Eichkurve für eine mit einem NIR-Farbstoff markierte, einzelsträngige DNA (Sequenz: 5'-CCTCCTCCTTCCCAGCAGGG-3'; SEQ ID NO: 1) über einen Konzentrationsbereich von 1 pmol/μl bis 3 fmol/μl gezeigt. Das Anregungslicht wurde von einer kugelschreibergroßen 9,5 mW-Laserdiode (780 nm) geliefert, und die Meßzeiten lagen im Bereich von 1 bis 3 Minuten. Die Daten wurden unter Verwendung eines Wellenleiter-Multisondensystems mit einem CCD("Charge-Coupled Device")-Detektor gesammelt. Diese Eichkurve verlief über den gesamten Bereich der untersuchten Farbstoff konzentration linear. Die auf einem dem Dreifachen der Standardabweichung des Rauschens entsprechenden Signal beruhende optische Nachweisgrenze wurde als in den 100 attomol/μl liegend abgeschätzt.
  • 5.15 BEISPIEL 15 – FLUORESZENZMESSUNGEN AN MIT EINEM TAG VERSEHENEN GENSONDEN
  • 16 zeigt die Meßergebnisse von mit einem Fluoresceintag, einer im sichtbaren Bereich emittierenden Farbstoffmarkierung, versehenen Gensonden. Die Meßzeiten lagen im Bereich von 0,05 bis 2 s. Die Ergebnisse zeigen, daß die Eichkurve bis hinunter zu einer Konzentration von etwa 2 nmol/μl linear verlief. Die höhere Nachweisgrenze wird auf einen Anstieg der Hintergrundfluoreszenz des Wellenleiters im sichtbaren Bereich zurückgeführt. Die Messungen wurden mit dem CCD-Detektionssystem durchgeführt. Die Ergebnisse demonstrieren die Möglichkeit für eine quantitative Analyse von Fluorescein-markierten DNA-Sonden.
  • 5.16 BEISPIEL 16 – AUSGANGSSIGNALANTWORT FÜR FLUORESZENZFARBSTOFF
  • Die vorliegende Erfindung wurde bewertet, indem das Fluoreszenzsignal eines auf den Detektor punktförmig aufgetragenen Fluoreszenzfarbstoffs gemessen wurde. 17 zeigt die Leistung eines ICM-Phototransistor-und Verstärkerschaltkreises, der aus einem 2-μm, p-Well-CMOS-Verfahren, das eine Fläche von 160 000 Quadratmikrometern einnimmt, sowie 220 in Parallelschaltung verbundenen Phototransistorzellen besteht. In 17 ist die Ausgangssignalantwort für verschiedene Konzentrationen des mit einem kleinen Helium-Cadmium-Laser (8 mW, 325 nm) angeregten Farbstoffmarkers Rhodamin-6G gezeigt, wobei die Linearität des Mikrochipdetektors bezüglich der Markerkonzentration veranschaulicht wird.
  • 5.17 BEISPIEL 17 – BEWERTUNG EINES INTEGRIERTEN CHIPS MIT 4 × 4-ARRAY
  • In 18 ist ein Aufbau für die Bewertung einer Mikrochipvorrichtung mit integriertem Verstärker/Phototransistor-Schaltkreis ("Amplifier/Phototransistor Integrated Circuit Microchip" [AP-ICM]) mit 4 × 4-Array dargestellt. Der Strom in jedem Kanal wurde jeweils mit einem digitalen Photometer aufgezeichnet. Die Daten vom Photometer wurden über eine serielle RS-232-Verbindung auf einen Rechner (PC) übertragen. Die Proben bestanden aus einem Array aus Mikrospots 343 von Fluorescein-markierter DNA auf einer Membran. Die Membran wurde auf einen Glasobjektträger 341, der mit einem Tisch zur linearen Verschiebung 340 verbunden war, plaziert. Die Messungen wurden durchgeführt, während die Probenarrays mit dem Verschiebetisch über die stationäre Phototransistorvorrichtung 342 geführt wurden. Das Licht von einem Argonionenlaser 348 bei 488 nm wurde über eine Faseroptik 346 durch die Fokussierungsoptik 345 und 347 übertragen und auf einen Probenspot fokussiert. Zwischen das Probensubstrat 343 und den Detektorarray 342 wurde ein geeigneter optischer Filter 344 plaziert, um die Laserstrahlung zu unterdrücken. Der hier beschriebene Aufbau war zur Bewertung der Antwort eines jeden einzelnen Photodetektors auf dem Chip vorgesehen. Es werden Anwendungen bzw. Systeme in Betracht gezogen, bei denen mehrere Proben über einzelne Detektoren abgerastert werden.
  • 5.18 BEISPIEL 18 – NACHWEIS VON DNAS MIT DEM AP-ICM
  • In 19 sind die Ergebnisse für vier Probenspots gezeigt, die als l-μl-Spot von Fluoresceinmarkierter DNA auf eine Nitrocellulosemembran plaziert wurden, die über einen Detektionskanal der in 18 gezeigten AP-ICM-Vorrichtung verschoben wurde. Wenn der DNA-Punkt den Photodetektor passierte, wurde ein Fluoreszenzsignal detektiert. Die vier Spitzenwerte in 19 stellen die Detektion der vier DNA-Punkte auf dem Substrat durch die AP-ICM-Vorrichtung dar.
  • 20 zeigt die Eichkurve der Fluoresceinmarkierten DNA unter Verwendung der in 18 gezeigten AP-ICM-Vorrichtung. Die Ergebnisse demonstrieren die Fähigkeit der AP-ICM-Chips, quantitative Messungen von Fluoreszein-markierter DNA durchzuführen.
  • 5.19 BEISPIEL 19 – ABSORPTIONS- UND REFLEXIONSMESSUNGEN
  • 21 zeigt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die für Absorptions- und Reflexionsmessungen verwendet wird. Licht von dem LED- oder Diodenlaser 366 passiert eine optionale optische Filter- oder Linsenstufe 365 sowie die Probe 363, die über einen optionalen Probeneinlaß 364 zugänglich ist. Licht von der Probe 363 passiert eine optische Filter-oder Linsenstufe 362 und fällt auf den Photodetektor 361. Der Signalprozessor 360 empfängt das Ausgangssignal vom Photodetektor 361.
  • 5.20 BEISPIEL 20 – GLEICHZEITIGER NACHWEIS VON FLUORESZENZ UND RAMAN
  • 22 zeigt eine erfindungsgemäße Ausführungsform, in der zwei Photodetektoren für gleichzeitige Fluoreszenz- und Ramanmessungen verwendet werden. Licht von einer Anregungsquelle 385 fällt auf die Probe 384. Licht von der Probe 384 passiert die Linsenstufe und den optischen Filter 380 für die Fluoreszenzmessung und die Linsenstufe und den optischen Filter 383 für die Ramanmessung. Das die Linsenstufe und den optischen Filter 380 passierende Licht wird vom Photodetektor 381 gemessen und vom Signalprozessor 386 verarbeitet. Das die Linsenstufe und den optischen Filter 383 passierende Licht wird vom Photodetektor 382 gemessen und vom Signalprozessor 387 verarbeitet.
  • 5.21 BEISPIEL 21 – MULTIDETEKTIONSAPPARATUR
  • 23 zeigt eine erfindungsgemäße Ausführungsform, in der drei Photodetektoren für gleichzeitige Absorptions-, Fluoreszenz- und Ramanmessungen verwendet werden. Eine Probe tritt in die Probenkammer 414 durch den Probeneinlaß 401 ein und verläßt dieselbe durch den Probenauslaß 400. Eine LED oder Diodenlaser 412 wird von einer Stromversorgung 413 mit Strom versorgt und leitet Licht durch einen Anregungsfilter 411 in die Probenkammer 414. Fluoreszenzmessungen werden mit optischem Filter und Linse 402, Photodetektor 403 sowie Signalprozessor 404 durchgeführt. Absorptionsmessungen werden mit optischem Filter und Linse 405, Photodetektor 406 sowie Signalprozessor 407 durchgeführt. Ramanmessungen werden mit optischem Filter und Linse 410, Photodetektor 409 sowie Signalprozessor 408 durchgeführt.
  • 5.22 BEISPIEL 22 – APPARATUR FÜR MIKROFLUIDISCHE VORRICHTUNGEN
  • 24 zeigt eine erfindungsgemäße Ausführungsform, die zum Nachweis von Proben von einer mikrofluidischen Vorrichtung, wie z. B. einem Kapillarelektrophorese-Array, einem Flüssigkeitschromatographie-Array, einem Gaschromatographie-Array oder einem "Lab-on-chip"-System, verwendet wird. Ein mikrofluidischer Array 420 der mikrofluidischen Vorrichtungen 422 leitet Proben durch mikrofluidische Kanäle 423 zum ICM-Chip 421.
  • 25 zeigt eine Detailzeichnung des in der in 24 dargestellten Ausführungsform verwendeten ICM-Chips 421. Die Probe von der mikrofluidischen Vorrichtung 422 tritt in die Probenkammer 445 durch den Einlaß 441 ein und verläßt dieselbe durch den Auslaß 440. Licht von der LED 444 tritt in die Probenkammer 445 ein, und die Ergebnisse werden vom Photodetektor 443 sowie dem Signalprozessor 442 detektiert.
  • 26 zeigt eine erfindungsgemäße Ausführungsform, die zum Nachweis von Proben von einer mikrofluidischen Vorrichtung unter Verwendung einer Abbildungslinse, binärer Optik oder einem Linsenarray zur Abbildung jedes mikrofluidischen Kanals auf jeweils ein Detektorelement des ICM verwendet wird. Proben werden von dem mikrofluidischen System 460 in die Probenkammern 461 geleitet. Licht von den Probenkammern 461 wird durch Abbildungslinse, binäre Optik oder Linsenarray 465 sowie durch einen optischen Filter 462 auf Photodetektoren 463 auf einen ICM-Chip 464 gelenkt.
  • 5.23 BEISPIEL 23 – MIKROELEKTROMECHANISCHE SYSTEME
  • 27 zeigt ein mikroelektromechanisches System (MEMS), das zur Konstruktion eines ICM mit "Random Access Microsensing" verwendet wird. Licht 483 vom Laser 485 wird in Richtung eines elektrisch positionierbaren MEMS-Spiegels 482 geführt, der dann das Licht selektiv auf das mit DNA beschichtete Substrat 484 in eine Mikroprobenkammer 480 lenkt. Die Ergebnisse werden von einer Photodiode 481 detektiert.
  • 28 zeigt einen Überblick eines ICM-Systems, das das in 27 dargestellte MEMS verwendet. Licht 503 vom Laser 504 wird über Spaltenselektionsspiegel 500 selektiv auf einen Selektionsspiegel 501 einer bestimmten Zelle umgelenkt, der dann das Licht in die entsprechende Biosensorzelle 502 lenkt. Die Spiegel sind ebenso wie die Dioden aus Silizium geätzt und geformt. Die allgemeinen Herstellungsschritte für MEMs sind ähnlich den Verfahrensschritten zur IC-Herstellung, wobei lithographische Techniken eingesetzt werden. Bei MEMs werden zusätzliche Ätzschritte durchgeführt, um die Vorrichtungen (z. B. Spiegel) vom Substrat frei beweglich zu machen. Über die Spiegel kann das Licht vom Laser 504 in die Richtung einer beliebigen individuellen Biosensorzelle gelenkt werden.
  • 5.24 BEISPIEL 24 – VCSEL-("VERTICAL-CAVITY SURFACEEMITTING LASER"-)APPARATUR
  • 29 zeigt eine erfindungsgemäße Ausführungsform, in der einzeln adressierbare, integrierte VCSELs (Vertical-Cavity Surface-Emitting Lasers) sowie achsige und/oder außerachsige Diffraktionslinsen verwendet werden. Aufgrund ihrer Linearität sind VCSEL-Arrays ideal für eine kompakte zweidimensionale und dreidimensionale Konfiguration in ICM-Systemen. Die Fähigkeit, einen divergierenden Strahl von einem "surface-emitting"-Laser oder einer LED zu formen, ist wichtig für die mikrooptische Beleuchtung in ICM-Systemen. Das in 29 gezeigte DOE("Diffractive Optical Element")-System berücksichtigt diese Fähigkeit und kann, wie gezeigt, mit einem VCSEL auf ein einzelnes lichtdurchlässiges Substrat integriert und hergestellt werden. Eine solche Quellendiffraktionslinse ist ideal für einen optischen ICM-Array im Miniaturformat und es ist zu beachten, wie in 29 gezeigt, daß ein DOE-System so konstruiert werden kann, daß entweder achsige oder außerachsige Strahlen erzeugt werden. Eine achsige Konfiguration ist für Absorptionsmessungen geeignet, wohingegen eine außerachsige Konfiguration für Emissionsmessungen geeignet ist. Der außerachsige Strahl läßt sich so konstruieren, daß er nicht auf den Detektor fällt, so daß Streulicht minimiert wird.
  • Das Licht vom VCSEL-Array 520 wird durch die auf dem GaAs-Substrat 523 konstruierten Strahltaillen 522 und danach durch entweder eine achsige Diffraktionslinse 521 oder eine außerachsige Diffraktionslinse 524 geführt. Die Ergebnisse von der Probenkammer 525 werden dann mit dem Photodetektor 526 detektiert.
  • 5.25 BEISPIEL 25 – ENTWICKLUNG EINES DNA-BIOCHIPS ZUR GENDIAGNOSE
  • Schnelle, einfache, kostengünstige medizinische Geräte zum Screenen mehrerer medizinischer Erkrankungen und infektiöser Krankheitserreger sind für die frühe Diagnose und verbesserte Behandlungen vieler Krankheiten essentiell. Ein wichtiger Faktor in der medizinischen Diagnostik ist der schnelle, selektive und empfindliche Nachweis biochemischer Substanzen (Proteine, Metabolite, Nukleinsäuren), biologischer Spezies oder lebender Systeme (Bakterien, Viren oder verwandte Komponenten) in biologischen Proben (z. B. Geweben, Blut und anderen Körperflüssigkeiten) im "ultratrace"-Bereich. Um das erforderliche Empfindlichkeits- und Spezifitätsniveau des Nachweises zu erzielen, ist es häufig notwendig, einen Biosensor zu verwenden, der in der Lage ist, eine große Anzahl biochemischer Bestandteile in komplexen Proben zu identifizieren und zu unterscheiden. Lebende Systeme besitzen ausgezeichnete Erkennungselemente (z. B. Antikörper-, Enzym-, Gensonden, usw.), die oftmals als Biorezeptoren bezeichnet werden und die spezifische Identifizierung und Detektion komplexer chemischer und biologischer Spezies gestatten. Biosensoren nutzen dieses leistungsfähige molekulare Erkennungsvermögen der Biorezeptoren aus. Aufgrund der ausgezeichneten Spezifität des DNA-Hybridisierungsprozesses besteht ein wachsendes Interesse an der Entwicklung von Analysesystemen auf DNA-Biorezeptorbasis (Vo-Dinh et al., 1994; Isola et al., 1996; Alarie et al., 1992; Vo-Dinh et al., 1987; Vo-Dinh et al., 1991; Stevenson et al., 1994). Im Labor der Erfinder wurden kürzlich Gensonden entwickelt, bei denen ein neuartiges, auf SERS-("Surface-Enhanced Raman Scattering")-Markierungen beruhendes Detektionsschema zum Einsatz kommt, um sowohl die Selektivität als auch die Empfindlichkeit von DNA-Biosensoren zu verbessern (Vo-Dinh et al., 1994). Ein faseroptischer Genosensor auf Fluoreszenzbasis für Mycobacterium tuberculosis wurde veröffentlicht (Isola et al., 1996).
  • Diese Arbeit beinhaltet die Entwicklung einer neuen Generation von Biosensoren auf Basis von Mikrochips mit integriertem Schaltkreis (IC) unter Verwendung von DNA-Biorezeptoren, die für den Nachweis sequenzspezifischer genetischer Bestandteile in komplexen Proben vorgesehen sind. Die Konstruktion des integrierten elektrooptischen Systems auf IC-Mikrochips, Photodetektorelemente mit Verstärkerschaltung sowie ihre Integration und Verwendung in DNA-Biosensoranwendungen werden erörtert. Die Verwendung der IC-Technologie könnte zur Entwicklung äußerst kostengünstiger diagnostischer Biochips für medizinische Anwendungen führen. Messungen unter Verwendung der HIV-1-sequenzspezifischen Sonden auf der Biochipvorrichtung veranschaulichen die Anwendung des DNA-Biochips beim Nachweis eines Genabschnitts des AIDS-Virus.
  • 5.25.1 ENTWICKLUNG DES INTEGRIERTEN SCHALTKREISES DES PHOTODIODENARRAY-MIKROCHIPS
  • Der in diesem Beispiel untersuchte Biochip enthält einen großflächigen, 4 × 4 n-Well integrierten Verstärker-Photodiodenarray, der als ein einziger, speziell für den Biochip angefertigter integrierter Schaltkreis (IC) konstruiert wurde. Diese IC-Vorrichtung ist an die Multiarray-Probennahmeplattform gekoppelt und für die Beobachtung sehr geringer Lichtmengen vorgesehen. Die einzelnen Photodioden besitzen eine Größe von 900 μm2 und sind als Array auf einem Raster im 1-mm-Abstand angeordnet. Die Photodioden und die dazugehörige elektronische Schaltung wurden mit einem 1,2-Mikrometer-n-Well-CMOS-Standardverfahren hergestellt. Die Verwendung dieser Art von Standardverfahren gestattet die Produktion von Photodioden und Phototransistoren ebenso wie zahlreicher anderer Arten analoger und digitaler Schaltungen in einem einzigen IC-Chip. Die Photodioden selbst werden unter Verwendung der n-Well-Struktur hergestellt, die im allgemeinen zur Herstellung von Widerständen oder als Substratmaterial für Transistoren verwendet wird. Da es sich bei der Anode der Diode um das p-Typ-Substratmaterial handelt, das allen Schaltungen auf dem IC-Chip gemeinsam ist, steht lediglich die Kathode zur Beobachtung des Photostroms zur Verfügung, und die Photodiode ist auf den Betrieb mit einer Vorspannung in Sperrichtung beschränkt.
  • Es wird ein analoger Multiplexer konstruiert, damit jedes der Elemente in dem Array mit einem Verstärker verbunden werden kann. In der endgültigen Vorrichtung könnte jede Photodiode jeweils mit ihrem eigenen Verstärker versorgt werden. Der Multiplexer besteht aus 16 Zellen. Jede Zelle besitzt zwei CMOS-Schalter, die über das Ausgangssignal der Adressendecodierzelle gesteuert werden. Jede Zelle besitzt eine einzigartige 4-Bit-Adresse. Ein Schalter ist lediglich offen, wenn er adressiert wird, während die anderen Schalter geschlossen sind. Durch diesen Vorgang wird die adressierte Diode mit einem Verstärker verbunden, während alle anderen in Parallelschaltung mit dem anderen Verstärker verbunden sind.
  • Diese Anordnung gestattet den Anschluß eines 4 × 4-Arrays aus Lichtquellen (z. B. unterschiedlicher Fluoreszenzsonden) an den Photodiodenarray sowie das sequentielle Auslesen der Signalpegel. Mit einigen Modifikationen läßt sich ein paralleles Auslesesystem konstruieren. Die Verwendung eines einzigen Photodiodendetektors würde eine mechanische Bewegung zum Abrastern des Quellenarrays erfordern. Die zusätzlichen Schalter und Verstärker dienen der korrekten Vorspannung und Erfassung der von den anderen Photodioden erzeugten Ladung. Der zusätzliche Verstärker sowie die zusätzlichen Schalter gestatten die Verwendung des IC in Form eines einzigen großflächigen (fast 4 mm2 großen) Photodetektors.
  • 5.25.2 ANWENDUNG DES BIOCHIPS AUF DEN NACHWEIS EINES HIV-GENFRAGMENTS
  • Von den Erfindern wurden Messungen durchgeführt, bei denen die Biochipvorrichtung mit 4 × 4-Photodiodenarray zum Nachweis des HIV-1-Gens verwendet wurde. Die Signale vom Photodioden-Mikrochip wurden direkt aufgezeichnet, ohne daß irgendein elektronisches Interface-System oder eine Signalverstärkungsvorrichtung benötigt wurde. Der Photostrom von jedem "Sensing"-Vorgang des Mikrochips wurde direkt über ein Digitalphotometer oder einen Streifenschreiber übertragen. Die Daten vom Photometer wurden über eine RS-232-Verbindung auf einen PC (Personal Computer) geschaltet. Die Probennahmeplattform auf dem Biochip enthielt einen 4 × 4-Array aus Mikrospots von NIR-markierter DNA auf einer Nitrocellulosemembran.
  • Bei der HIV-1-Gensonde handelt es sich um die 18-Basen lange, zu dem Gag-Genbereich komplementäre Oligonukleotidsequenz. Für diese Untersuchung wurde von den Erfindern cDNA mit spezifischen Sequenzen des HIV-1-Virus auf der Nitrocellulosemembran gebunden und mit zu diesen Sequenzen komplementäre Sequenzen aufweisenden Cy5-Farbstoff-markierten DNA-Strängen hybridisiert. Die HIV-1-Messungen auf der Nitrocellulose wurden durchgeführt, indem die HIV-1-Sonden-DNA in einem 4 × 4-Array auf der Nitrocellulose-Probennahmeplattform punktförmig aufgetragen wurde. Die DNA wurde dann entweder über ein UV-Crosslinker-Molekül oder durch zweistündiges Backen im Vakuum bei 80 Grad Celsius mit der Nitrocellulose quervernetzt. Bei Nitrocellulosemembranen wurden die DNA-Lösungen direkt auf die Membranen punktförmig aufgetragen. Die Spots wurden anschließend entweder einer UV-Quervernetzungsreaktion mit einem Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA) unterzogen oder im Vakuum bei 80°C 2 h gebacken. Im ersten Schritt der Membranhybridisierung wurden die einzelsträngigen Zielnukleinsäuren auf der ausgewählten Oberfläche der Sonde immobilisiert. Die Sonden wurden dann zur Blockierung nichtspezifischer Nukleinsäurebindungsstellen mit Hybridisierungspuffer behandelt. Die Sonde wurde dann mit Proben zusammengegeben, die die markierte Sonden-DNA enthielten, und unter Wiederherstellung eines doppelsträngigen Moleküls mit den komplementären Zielsequenzen hybridisieren gelassen. Nach der Hybridisierung wurde der Überschuß an ungebundener, markierter Sonde weggewaschen und die hybriden Zielsequenzen nachgewiesen. In dieser Arbeit wurden die Nitrocellulosemembranen eine h bei 37°C in 5 ml 6x SSC (1x SSC = 15 mM Natriumcitrat, 150 mM Natriumchlorid pH 7,0) mit 1% BSA, 0,2% SDS (Natriumdodecylsulfat) vorhybridisiert. Nach der Vorhybridisierung wurde die Hybridisierungssonde in einer Endkonzentration von 100 ng/ml zugegeben und die Hybridisierungen durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen in 5x SSC mit 0,1% SDS bei Raumtemperatur 10–15 min gewaschen, um die Hintergrundfluoreszenzniveaus zu reduzieren.
  • Hybridisierungsereignisse zwischen komplementären DNA-Sequenzen wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale mittels des Biochips demonstriert. Fluoreszenzsignale wurden auf den Biochipkanälen nur dort detektiert, wo eine Hybridisierung der markierten DNA-HIV1-Gensonden mit komplementär gebundenen DNA-Fragmenten stattgefunden hatte. Die 4 × 4-Arraysignale des 3-dimensionalen Diagramms demonstrierten die positive Hybridisierung mit den in dieser Untersuchung verwendeten HIV1-Sonden. Ein Referenzsystem aus negativen Leerproben (bestehend aus DNA-Sonden, die keine HIV1-Gensequenz aufwiesen) zeigte keine Fluoreszenzsignale. Dieses Ergebnis verdeutlicht die Eignung des DNA-Biochips zum Nachweis der HIV-Gensonde.
  • 5.26 BEISPIEL 26 – ENTWICKLUNG EINES DNA-BIOCHIPS 5.26.1 OLIGONUKLEOTIDHERSTELLUNG
  • Die gewünschten Oligonukleotidstränge wurden von den Erfindern synthetisiert und mit Fluoreszenzmarkierungen (z. B. Fluorescein und Cy5-Farbstoffe) markiert, wobei bereits beschriebene Verfahrensweisen verwendet wurden (Vo-Dinh et al., 1994; Isola et al., 1998). Alle Oligonukleotide wurden mit einem Expedite 8909-DNA-Synthesegerät (Millipore, Bedford, MA) synthetisiert. Fluorescein-markierte Oligonukleotide wurden mit Fluorescein-CPG-Säulen (für 3'-Markierung) oder Fluorescein-Phosphoramidit (für 5'-Markierung) unter Verwendung modifizierter Synthesevorschriften, wie sie von den Herstellern empfohlen wurden, hergestellt. Oligonukleotide mit Amino-Linkern wurden entweder mit C3-Aminolink-CPG für 3'-Markierung oder dem 5'-Amino-Modifikationsmolekül C6 (Glenn Research, Sterling, VA) für die Y-Markierung synthetisiert. Alle Oligonukleotide wurden unter Verwendung der "Expedite"-Reagentien (Millipore) synthetisiert und unter Verwendung von Ammoniumhydroxid entschützt und von den Glasträgern abgespalten. Die entschützten Oligonukleotide wurden durch Verdampfen des Ammoniumhydroxids in einem Speedvac-Verdampfer (Savant Instruments, Farmingdale, NY) verdampft und in 100 μl destilliertem H2O aufgenommen. Die weitere Reinigung wurde mittels Isopropanolpräzipitation der DNA wie folgt durchgeführt: 10 μl 3 M Natriumacetat pH 7,0 und 110 μl Isopropanol wurden zu 100 μl der DNA-Lösung gegeben. Die Lösung wurde dann bei -70°C gefroren. Es wurde Natriumacetat anstelle von Ammoniumacetat verwendet, da Reste von Ammoniumionen die Cy5-Verknüpfung ebenso wie die Bindung der DNA an feste Träger über die Amino-Linker stören. Das Präzipitat wurde durch 15minütige Zentrifugation bei Raumtemperatur gesammelt und dreimal mit 50% Isopropanol gewaschen. Isopropanolreste wurden durch Vakuumtrocknung im Speedvac entfernt, und die DNA wurde in sterilem destilliertem Wasser mit einer Endkonzentration von 10 μg μl–1 resuspendiert. Diese Stammlösungen wurden in einer 1 : 10 Verdünnung in dem entsprechenden Puffer unter Erhalt einer DNA-Konzentration von 1 μg μl–1 verdünnt.
  • Zur Markierung der DNA mit Cy5-Farbstoff (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) wurden Alkylaminogruppen enthaltende modifizierte Oligonukleotide wie folgt derivatisiert (Vo-Dinh et al., 1994). 30 pmol der DNA wurden in 250 μl 0,5 M Natriumchlorid gelöst und durch eine mit 5 mM Boratpuffer (pH 8,0) äquilibrierte Sephadex-G10-Säule (Durchmesser 1 cm, Länge 10 cm) (Pharmacia, Piscataway, NJ) geleitet. Das das Oligonukleotid enthaltende Totvolumen wurde gesammelt und durch Verdampfen konzentriert. Dieses wurde in 100 μl 0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,0) gelöst. Cy5 (1 mg in Carbonatpuffer) wurde zu dem Oligonukleotid gegeben und die Konjugationsreaktion über 60 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen durchgeführt. Das konjugierte Oligonukleotid wurde von dem freien Farbstoff unter Verwendung einer Sephadex-G10-Säule wie oben beschrieben getrennt. Die die markierte DNA enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und mit einem Speedvac-Verdampfer konzentriert.
  • 5.26.2 ERGEBNISSE
  • 5.26.2.1 ENTWICKLUNG VON INTEGRIERTEN BIOCHIPSCHALTKREISEN
  • Ein wichtiges Element bei der Entwicklung des Biochips beinhaltet die Konstruktion und Entwicklung eines IC-elektrooptischen Systems für die Mikrochip-Detektionselemente unter Verwendung der CMOS-Technologie. Diese Technologie ermöglicht hochintegrierte Biosensoren teilweise dadurch, daß mehrere optische Sensorelemente und Mikroelektronikelemente auf einem einzigen IC hergestellt werden können. Ein zweidimensionaler Array aus optischen Detektorverstärkern wurde auf einem einzigen IC-Chip integriert. Ein solches integriertes Mikrochipsystem ist zur Zeit kommerziell nicht erhältlich.
  • Es wurden zwei beispielhafte, auf Photodiodenschaltungen beruhende IC-Systeme konstruiert, wobei ein System 16 Kanäle (4 × 4-Array) und das andere 100 Kanäle (10× 10-Array) aufweist. Die Biochips enthalten einen großflächigen, n-Well integrierten Verstärker-Diodenarray, der in Form eines einzigen, speziell für den Biochip angefertigten integrierten Schaltkreises (IC) konstruiert wurde. Diese IC-Vorrichtung ist an die Multiarray-Probennahmeplattform gekoppelt und für die Beobachtung sehr geringer Lichtmengen vorgesehen. Die einzelnen Photodioden besitzen eine Größe von 900 μm2 und sind auf einem Raster im 1-mm-Abstand in Form eines Arrays angeordnet. Die Photodioden und die dazugehörigen elektronischen Schaltungen wurden unter Verwendung eines 1,2-μ-n-Well-CMOS-Standardverfahrens hergestellt. Die Verwendung dieser Art von Standardverfahren gestattet die Produktion von Photodioden und Phototransistoren ebenso wie von anderen zahlreichen Arten analoger und digitaler Schaltungen in einem einzigen IC-Chip. Dieses Merkmal ist der Hauptvorteil der CMOS-Technologie im Vergleich mit anderen Detektortechnologien, wie z. B. ladungsgekoppelten Bauelementen oder Ladungsinjektionsbauelementen. Die Photodioden selbst werden unter Verwendung der n-Well-Struktur hergestellt, die im allgemeinen zur Herstellung von Widerständen oder als das Substratmaterial für Transistoren verwendet wird. Da es sich bei der Anode der Diode um das p-Typ-Substratmaterial handelt, das allen Schaltungen auf dem IC-Chip gemeinsam ist, steht lediglich die Kathode zur Beobachtung des Photostroms zur Verfügung, und die Photodiode ist auf den Betrieb mit einer Vorspannung in Sperrichtung beschränkt.
  • Damit die Elemente im Array jeweils mit einem Verstärker verbunden werden können, wurde ein analoger Multiplexer konstruiert. In der endgültigen Vorrichtung könnte jede Photodiode jeweils mit ihrem eigenen Verstärker versorgt werden. Der Multiplexer besteht aus 16 Zellen für die 4 × 4-Arrayvorrichtung. Jede Zelle besitzt zwei CMOS-Schalter, die über das Ausgangssignal der Adressendecodierzelle gesteuert werden. Jede Zelle besitzt eine einzigartige 4-Bit-Adresse. Ein Schalter ist lediglich offen, wenn er adressiert wird, während die anderen Schalter geschlossen sind. Durch diesen Vorgang wird die adressierte Diode mit einem Verstärker verbunden, während alle anderen in Parallelschaltung mit dem anderen Verstärker verbunden sind.
  • Diese Anordnung gestattet den Anschluß eines 4 × 4- (bzw. 10 × 10-)Arrays aus Lichtquellen (z. B. unterschiedliche Fluoreszenzsonden) an den Photodiodenarray sowie das sequentielle Auslesen der Signalpegel. Mit einigen Modifikationen läßt sich ein paralleles Auslesesystem konstruieren. Die Verwendung eines einzigen Photodiodendetektors würde eine mechanische Bewegung zum Abrastern des Quellenarrays erfordern. Die zusätzlichen Schalter und Verstärker dienen der korrekten Vorspannung und Erfassung der von den anderen Photodioden erzeugten Ladung. Der zusätzliche Verstärker sowie die zusätzlichen Schalter gestatten die Verwendung des IC in Form eines einzigen großflächigen (fast 4 mm2 großen) Photodetektors.
  • 5.26.3 ANWENDUNGSBEISPIELE MIT BIOCHIPVORRICHTUNGEN
  • Als Modellmatrize zur Bewertung des Biochip-Sensorsystems wurde die Gag-Gensequenz des menschlichen Immunschwächevirus (Human Immunodeficiency Virus, HIV) ausgewählt. Eine Infektion mit dem menschlichen Immunschwächevirus Typ I (HIV 1) führt zu einer allgemein zum Tode führenden Erkrankung. Leider sind die serologischen HIV-Standardtests, einschließlich ELISA ("enzyme-linked immunosorbent assay") und Western-Blot-Assay, für die Diagnose einer HIV-Infektion während der frühen Kindheit aufgrund der störenden Anwesenheit des transplazentar erhaltenen mütterlichen Antikörpers im Blut des Säuglings nicht geeignet. Es besteht daher ein Bedarf für einen direkten Test auf Nukleinsäurebasis, mit dem die Anwesenheit von viralen HIV-Sequenzen nachgewiesen werden kann. Von den Erfindern wurden synthetische DNA-Matrizen (Isola et al., 1998) aus dem Gag-Genbereich von HIV 1 als Modellsystem verwendet, um die Anwendung des Biochipsystems beim HIV-Gennachweis zu veranschaulichen.
  • Die Biochipvorrichtung mit 4 × 4-Photodiodenarray wurde hinsichtlich des Nachweises von HIV-1-Genfragmenten beurteilt. Die Signale vom Photodioden-Mikrochip wurden direkt aufgezeichnet, ohne daß irgendein elektronisches Interface-System oder eine Signalverstärkungsvorrichtung benötigt wurde. Der Photostrom von jedem "Sensing"-Vorgang des Mikrochips wurde direkt über ein Digitalphotometer oder einen Streifenschreiber übertragen. Die Daten vom Photometer wurden über eine RS-232-Verbindung auf einen PC (Personal Computer) geschaltet. Die Probennahmeplattform auf dem Biochip enthielt einen 4 × 4-Array aus Mikrospots von NIR-markierter DNA auf einer Nitrocellulosemembran.
  • Zur Veranschaulichung der Eignung des Biochips bei Hybridisierungsanwendungen wurde eine 18-Basen lange, zum Gag-Gen komplementäre Oligonukleotidsequenz verwendet Bereich des HIV-1-Gens (Isola et al., 1998). Von den Erfindern wurden verschiedene Sondensequenzen in diesem Bereich ausgewählt, um DNA-Sonden für die Hybridisierung und die Detektion mit einer neuen Technik auf Basis einer oberflächenverstärkten Raman-Streuung (Isola et al., 1998) zu konstruieren. Für diese Untersuchung wurde von den Erfindern cDNA mit spezifischen Sequenzen des HIV-I-Virus auf der als Probennahmeplattform verwendeten Nitrocellulosemembran gebunden und mit zu diesen Sequenzen komplementäre Sequenzen aufweisenden Cy5-Farbstoff-markierten DNA-Strängen hybridisiert. Die HIV-1-Messungen auf der Nitrocellulose wurden durchgeführt, indem die HIV-1-Sonden-DNA in einem 4 × 4-Array auf der Nitrocellulose-Probennahmeplattform gebunden wurde. Die DNA wurde dann entweder über ein UV-Crosslinker-Molekül oder durch zweistündiges Backen im Vakuum bei 80°C mit der Nitrocellulose quervernetzt. Die Spots wurden anschließend entweder einer UV-Quervernetzungsreaktion mit einem Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA) unterzogen oder im Vakuum bei 80°C 2 h gebacken. Im ersten Schritt der Membranhybridisierung wurden die einzelsträngigen Zielnukleinsäuren auf der ausgewählten Oberfläche der Sonde immobilisiert. Die Sonden wurden dann zur Blockierung nichtspezifischer Nukleinsäurebindungsstellen mit Hybridisierungspuffer behandelt. Die Sonde wurde dann mit Proben zusammengegeben, die die markierte Sonden-DNA enthielten, und unter Wiederherstellung eines doppelsträngigen Moleküls mit den komplementären Zielsequenzen hybridisieren gelassen. Nach der Hybridisierung wurde der Überschuß an ungebundener, markierter Sonde weggewaschen und die hybriden Zielsequenzen nachgewiesen. In dieser Arbeit wurden die Nitrocellulosemembranen eine h bei 37°C in 5 ml 6x SSC (1x SSC = 15 mM Natriumcitrat, 150 mM Natriumchlorid pH 7,0) mit 1% BSA, 0,2% SDS (Natriumdodecylsulfat) vorhybridisiert. Nach der Vorhybridisierung wurde die Hybridisierungssonde in einer Endkonzentration von 100 ng/ml–1 zugegeben und die Hybridisierung durchgeführt. Nach der Hybridisierung unter geeigneten Bedingungen wurden die Membranen in 5x SSC mit 0,1% SDS bei Raumtemperatur 10– 15 min gewaschen, um die Hintergrundfluoreszenzniveaus zu reduzieren.
  • Hybridisierungsereignisse zwischen komplementären DNA-Sequenzen wurden durch Detektion der Fluoreszenzsignale mittels des Biochips demonstriert. Die Daten zeigten, daß über dem Hintergrund liegende Fluoreszenzsignale auf der. Biochipkanälen detektiert wurden, in denen die Hybridisierung der markierten DNA-HIV-1-Gensonden mit komplementär gebundenen DNA-Fragmenten stattgefunden hatte (33). Die 4 × 4-Array-Signale des 3-dimensionalen Diagramms demonstrierten die positive Hybridisierung mit den in dieser Untersuchung verwendeten HIV-1-Sonden. Ein Referenzsystem aus negativen Leerproben (bestehend aus DNA-Sonden ohne die HIV-1-Gensequenz) zeigte nur schwache Hintergrundfluoreszenzsignale. Dieses Ergebnis ist ein Beispiel für die Eignung des DNA-Biochips zum Nachweis einer spezifischen HIV-Gensequenz. Für den Nachweis des HIV-Virus selbst kann auch der gleichzeitige Nachweis mehrerer Gensequenzbereiche des Virus erforderlich sein. Es wurde beobachtet, daß sich im Verlauf der AIDS-Erkrankung die Genotypdiversität in HIV-Viren erhöht. Es wurde berichtet, daß die HIV-Viren das Immunsystem zu besiegen scheinen, indem sie diese Genmutationen während des Krankheitsverlaufs produzieren und anhäufen (Wolinsdy und Korber, 1996). Neben den in diesem Beispiel verwendeten beispielhaften Sequenzen könnten andere Sequenzfragmente der HIV-Viren verwendet werden, um bestimmte Gene oder Bereiche des HIV-Genoms nachzuweisen.
  • Gleichfalls muß es sich bei den für die Hybridisierungsanwendungen der Biochipapparatur verwendeten Polynukleotidsonden weder unbedingt um DNA-Sonden handeln, noch müssen die nachzuweisenden jeweiligen Polynukleotidziele notwendigerweise DNA-Moleküle sein. Da unter den entsprechenden Hybridisierungsbedingungen und je nach Homologiegrad der beiden Stränge DNA:DNA-, DNA:RNA-, DNA:PNA-, RNA:RNA-, RNA:RNA- und PNA:PNA-Duplexe gebildet werden können, wird von den Erfindern in Betracht gezogen, daß verschiedene Hybridisierungsbiochips konstruiert werden können, die beim Nachweis anderer homologer Polynukleotidmoleküle entweder RNAs, DNAs oder PNAs verwenden. Die Herstellung, Synthese und Verwendung von Ribozymen, RNAs und PNAs als Polynukleotidsonden ist hier in Abschnitt 4 beschrieben.
  • Wie bereits erörtert, ist es nicht notwendig, daß nur auf Nukleinsäuren beschränkte Biosonden eingesetzt werden können. Selbstverständlich gibt es zahlreiche Sonden, die für die Immobilisierung auf dem offenbarten Biochip in Betracht kommen könnten. So berichten beispielsweise Erdeniz et al. (1997) über klonierungsfreie Allelaustauschverfahren auf PCRTM-Basis. Es wird ein Alleltransfer zwischen Hefestämmen beschrieben, bei dem das gewünschte Allel durch PCRTM mit einem Paar von Adaptameren amplifiziert wird. Adaptamere sind chimäre Oligonukleotide, die zur Ampli fikation des gewünschten Allels verwendet werden und dessen 5'- und 3'-Enden mit unterschiedlichen Tags versehen. Solche Adaptameren könnten je nach der gewünschten Amplifikation an den Biochip gebunden und zur Verfolgung der Amplifikationsreaktion eingesetzt werden.
  • Beim molekularen Abdruck handelt es sich um eine Technik, die zur Erzeugung selektiver Erkennungsstellen in synthetischen Polymeren verwendet wird. Ein Matrizenmolekül in Polymerisationsreaktionen von ausgewählten Monomeren verwendet. Viele durch dieses Verfahren erhaltene Polymere zeigen stereo- und regiospezifische Selektivität und ermöglichen somit die chirale Trennung bioaktiver Moleküle, Mosbach (1994). Es wird darüber nachgedacht, daß man ausgewählte Polymere mit Abdruck konstruieren könnte, die eine oder mehrere nachweisbare Markierungen enthalten, welche gegebenenfalls ihr Emissionssignal bei Bindung eines verwandten Moleküls verändern können.
  • Cyclodextrine sind allgemein für ihre Nützlichkeit bei der Zuführung bestimmter Medikamente, insbesondere Peptid- und Proteinmedikamente, bekannt. Die Cyclodextrine sind auch dafür bekannt, daß sie zahlreiche Arten von Verbindungen als Gastmolekül einbauen können. Modifizierte Cyclodextrine, wie z. B. solche, die durch Polymerisation von Ethylenoxid um einen Cyclodextrinkern herum erhalten wurden, wurden als Medikamentenzuführungssysteme eingesetzt. Polyethylenoxid-modifizierte Cyclodextrine wurden von Topchieva et al. (1998) als neue Familie bouquetähnlicher Moleküle mit ähnlichen Eigenschaften wie die "Course"-Cyclodextrine beschrieben. Mit geeigneten Tags versehene Cyclodextrine oder modifizierte Cyclodextrine werden auch dahingehend in Betracht gezogen, daß sie als in Verbindung mit dem offenbarten Biochip geeignete Biosonden von Nutzen sind.
  • Lipophile Polyamiddendrimere bilden eine weitere Klasse symmetrischer Makromoleküle, die als potentielle Medikamententräger angesehen werden, Sakthivel et al.
  • Aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften wurden sie als Mittel zur Genübertragung untersucht. Von Qin et al. (1998) wurde die Verwendung von Starburst-Dendrimeren zur Erhöhung der Plasmid-vermittelten Genübertragung und Effizienz berichtet. Zu Starburst-Dendrimeren zusammengesetzte Polyamidoaminuntereinheiten wurden dazu verwendet, den Plasmid-vermittelten Gentransfer zu erhöhen. Starburst-Dendrimere können daher für die Überwachung der Effizienz des Gentransfers, die in-vivo-Überwachung der Lebensverlängerung von Allograften oder andere Ereignisse in vivo, bei denen der Nachweis markierter Tracer in biologischen Flüssigkeiten wünschenswert sein könnte, geeignet sein. Neben den Starburst-Dendrimeren wurden radioaktiv markierte Dendrimere beschrieben, bei denen es sich um makromolekulare T2-Kontrastmittel handelt. Mit Tags versehene Dendrimere könnten nachgewiesen werden, indem die entsprechende Biosonde auf dem Chip gewählt wird, um diese Mittel aufzunehmen, und das Vorhandensein könnte durch Messung der Radioaktivität nachgewiesen werden. Von Bulte et al. (1998) wurden Dysprosium-DOTA-PAMAM-Dendrimere beschrieben, die ein besonderes Beispiel eines AT2-Kontrastmittels darstellen. Zusätzliche Sonden umfassen biotentilierte Starburst-Dendrimere könnten beim Antikörper-"Pretargeting" verwendet werden, wie bei Wilbur et al. (1998) beschrieben.
  • Darüber hinaus wird zusätzlich zu den hier beschriebenen Ausführungsbeispielen von den Erfindern die Verwendung der Biochipvorrichtung bei der Detektion, Quantifizierung oder Identifizierung verschiedener Organismen und Makromoleküle von biologischem oder medizinischem Interesse in Betracht gezogen. So können die Chips beispielsweise zum Nachweis oder zur Quantifizierung oder Identifizierung von Krankheitserregern von medizinischem Interesse verwendet werden. Bei solchen Krankheitserregern kann es sich um Viren (wie z. B. EBV, HIV, FIV, Parvoviren, Retroviren, u. ä.), Rickettsien, Pilze (einschließlich Organismen wie z. B. Candida und anderer Hefegattungen, dermatomykotische Pilze (einschließlich Epidermophyton spp., Microsporum spp. und Trichophyton spp., u. ä.), systemische Pilze (einschließlich Blastomyces, Histoplasma, Coccidioides, Cryptococcus, Geotrichum, Histoplasma, Sporotrichum, u. ä.), Bakterien (wie z. B. Mycobacteria einschließlich Mycobacterium tuberculosis, Vibrio einschließlich V. cholerae; Salmonella, einschließlich S. choleraesius, S. paratyphi, S. schottmulleri und S. typhimurium; Treponema, einschließlilch T. pallidum; Shigella, einschließlich S. dysenteriae und S. flexneri, Serratia, einschließlich S. marcescens; Yersinia, einschließlich Y. pestis und Y. pseudotuberculosis; Proteus, einschließlich P. mirabilis, Morganella, einschließlich M. morganii; Streptococcus, einschließlilch S. faecalis, S. pneumoniae, S. salivarius, S. pyogenes, und S. sanguis; Staphylococcus, einschließlich S. aureus; Bacillus, einschließlich B. anthracis, B. coagulans, B. pasteurii, B. cereus und B. subtilis, oder andere krankheitsverursachende Bakterien, einschließlich solchen der Gattungen Leptospira, Clostridium, Neisseria, Brucella, Francisella, Hemophilus, Corynebacterium, u. ä.); oder eukaryontische Mikroorganismen, wie z. B. Giardia, einschließlich G. lamblia und G. intestinalis; Chlamydia, einschließlich C. psittaci und C. trachomatis, u. ä. handeln.
  • Andererseits könnte der Nachweis bestimmter Gene, wie z. B. des p53-Krebsgens (Vo-Dinh et al., 1998) auch unter Verwendung eines einzigen Biochips oder von mehreren Einzelbiochips durchgeführt werden.
  • Ein weiteres Gebiet für die Anwendung der Biochiptechnologie ist die funktionale Genomanalyse. Vorausgesetzt, daß ein vernünftiger Grad an Basenkomplementarität besteht, findet unter den richtigen Bedingungen eine molekulare Hybridisierung zweier Nukleinsäurestränge aus unterschiedlichen Quellen (DNA und RNA) statt. Dieses Merkmal gestattet die Verwendung der Biochiptechnologie auch bei der Analyse von Genexpression und -funktion. Weiterhin läßt sich der Biochip auch zur Beobachtung des Ausmaßes der geneti schen Variation zwischen Individuen und ihrer Anfälligkeit für Krankheiten einsetzen.
  • Das DNA-Biochipsystem bietet eine einzigartige Kombination aus Leistungsvermögen und analytischen Leistungsmerkmalen, die in keinem anderen zur Zeit erhältlichen DNA-Analysesystem verfügbar sind. Mit seiner Multikanalkapazität stellt die hier beschriebene DNA-Biochiptechnologie das bislang erste beschriebene System, das auf einem optischen Sensor-Mikrochipsystem mit einem integrierten Signalverstärker und on-board Datenbearbeitung beruht. Die DNA-Biochipvorrichtung gestattet den gleichzeitigen Nachweis mehrerer DNA-Ziele zur gleichen Zeit. Der vorliegende DNA-Biochip bietet mehrere Vorteile hinsichtlich Größe, Leistung, Herstellung, Analyse sowie Herstellungskosten aufgrund seines integrierten optischen Sensor-Mikrochips. Die kleinen Größen der Sonden (Mikroliter bis Nanoliter) minimieren den Bedarf an Probe und reduzieren den Bedarf an Reagentien und Abfall. Hochintegrierte Systeme führen zu einer Verringerung des Rauschens sowie einer Signalverstärkung aufgrund der verbesserten Effizienz der Probensammlung und der Reduzierung von Schnittstellen. Die Fähigkeit zur Produktion im Großmaßstab unter Verwendung kostengünstiger IC-Technologie ist ein wichtiger Vorteil. Der Konstruktionsprozeß für verschiedene Komponenten vereinfacht sich durch die Integration mehrerer Elemente auf einem einzigen Chip. Bei medizinischen Anwendungen gestattet dieser Kostenvorteil die Entwicklung äußerst kostengünstiger Einweg-Biochips, die sich zur medizinischen Krankheitsdiagnose zu Hause einsetzen lassen, ohne daß Proben zur Analyse an ein Labor geschickt werden müssen.
  • 5.27 BEISPIEL 27 – DNA-BIOCHIPS MIT PHOTOTRANSISTOR-ZC
  • Seit kurzem besteht ein wachsendes Interesse an der Entwicklung von Analysesystemen auf DNA-Biorezeptorbasis (Vo-Dinh et al., 1994; Isola et al., 1996; Schena et al., 1995; Piunno et al., 1995; Kumar et al., 1994; Eggers et al., 1994). Ein wichtiges Gebiet der biologischen Beobachtung ist die empfindliche Diagnose von Krankheiten, biologischen Spezies oder lebenden Systemen (Bakterien, Viren oder verwandten Bestandteilen) auf dem "Ultratracer"-Niveau in biologischen Proben (z. B. Geweben, Blut und anderen Körperflüssigkeiten) sowie Umweltproben (z. B. Luft-, Boden- und Wasserproben). Um eine Verbindung in einer "real life"-Probe nachzuweisen, muß ein Biosensor verschiedene biochemische Mitglieder dieser Systeme erkennen und unterscheiden können, um eindeutige Identifizierung und genaue Quantifizierung zu liefern. Lebende Systeme besitzen ausgezeichnete Erkennungselemente (z. B. Antikörper-, Enzym-, Gensonden, usw.), häufig als Biorezeptoren bezeichnet, die die spezifische Identifizierung und Detektion komplexer chemischer und biologischer Spezies gestatten.
  • Dieses Beispiel beschreibt einen auf Mikrochips mit integriertem Schaltkreis (IC) beruhenden Biosensor, wobei DNA-Biorezeptoren verwendet werden, die zur Detektion genetischer Bestandteile in komplexen Proben von biomedizinischem und Umweltinteresse vorgesehen sind. In diesem System wurden Phototransistoren verwendet, bei denen es sich um Vorrichtungen handelt, die miniaturisiert und auf einem integrierten Schaltkreis hergestellt werden können. Es wurde ein Phototransistor entwickelt, der aus 220 in Parallelschaltung verbundenen Phototransistorzellen bestand. Diese Miniaturisierungstechnologie ist nicht nur für die hier beschriebenen DNA-Sondensubstrate geeignet, sondern auch für das integrierte Detektorsystem, das zur Herstellung von Mikrochip-Biosensorvorrichtungen, d. h. den "biosensor-on-a-Chip", eingesetzt werden könnte. Diese Vorrichtung weist Sensoren, Verstärker, Diskriminatoren und Logikschaltungen auf der Platine auf. Diese hochintegrierten Biosensoren wurden unter Nutzung der Kapazität für die Herstellung mehrerer optischer Sensorelemente und Mikroelektronikelemente auf einem einzigen IC hergestellt.
  • Biosensoren vereinen in sich zwei wichtige Konzepte, die die "biologische Erkennung" und das "Sensing" integrieren. Das Grundprinzip eines optischen Biosensors besteht darin, diese molekulare Erkennung zu detektieren und mittels eines Transducers in ein optisches Signal zu transformieren. Wie schematisch in 1 dargestellt, werden in dem DNA-Biochip integrierte Schaltkreiselemente, elektrooptisches Anregungs/Detektionssystem und Biorezeptorsonden auf DNA-Basis zu einer selbständigen und integrierten Mikrovorrichtung kombiniert. Ein einfacher DNA-Biochip enthält: 1) Anregungslichtquelle mit dazugehöriger Optik, 2) eine Biosonde, 3) ein Probennahmeelement mit Probenplattform und Zuführsystem, 4) einen optischen Detektor mit zugehöriger Optik und Dispersionsvorrichtung und 5) ein Signalverstärkungs-/Bearbeitungssystem.
  • Die Konstruktion eines DNA-Biochips beinhaltet die Integration mehrerer Basiselemente von sehr unterschiedlicher Beschaffenheit. Die grundlegenden Schritte umfassen: (a) die Auswahl oder Entwicklung des Biorezeptors; (b) die Auswahl der Anregungsquelle; (c) die Auswahl oder Entwicklung des Transducers; und (d) die Integration des Anregungsquelle-Biorezeptor-Transducer-Systems.
  • Die Entwicklung des DNA-Biochips in diesem Beispiel umfaßt drei Hauptelemente. Das erste Element beinhaltet die Entwicklung eines Biorezeptorsondensystems: ein Mikroarray aus DNA-Sonden auf einer Nitrocellulose-Probennahmeplattform. Das zweite Element konzentriert sich auf die Entwicklung nichtradioaktiver Verfahren für den optischen Nachweis: die Fluoreszenztechnik. Das dritte Element beinhaltet die Entwicklung eines integrierten elektrooptischen IC-Systems auf einem einzigen Chip für das Biosensing: Phototransistor-Verstärker-Mikrochiptechnologie.
  • Das Design der Techniken zur Immobilisierung der Gensonde auf den Biosensorsubstraten wurde ebenso wie die Entwicklung integrierter elektrooptischer Systeme auf IC-Biochips unter Verwendung eines Phototransistor-Multiarraysystems demonstriert. Die Messungen fluoreszenzmarkierter DNA-Sonden und Hybridisierungsuntersuchungen mit einer HIV1-sequenzspezifischen Sonde auf dem Nitrocellulose-Probennahmeplattformsystem veranschaulichen die analytischen Leistungswerte dieser beispielhaften Biochipvorrichtung.
  • 5.27.1 EXPERIMENTELLES UND MATERIALIEN
  • 5.27.1.1 ENTWICKLUNG DER OLIGONUKLEOTIDE
  • Oligonukleotidstränge wurden synthetisiert und mit Fluoreszenzmarkierungen markiert (z. B. Fluorescein und Cy5-Farbstoffe). Oligonukleotide wurden mit einem Expedite 8909-DNA-Synthesegerät (Millipore, Bedford, MA) synthetisiert. Fluorescein-markierte Oligonukleotide wurden mit Fluorescein-CPG-Säulen (für 3'-Markierung) oder Fluorescein-Phosphoramidit (für 5'-Markierung) unter Verwendung modifizierter Synthesevorschriften, wie sie von den Herstellern empfohlen wurden, hergestellt. Oligonukleotide mit Amino-Linkern wurden entweder mit C3-Aminolink-CPG für 3'-Markierung oder dem 5'-Amino-Modifikationsmolekül C6 (Glenn Research, Sterling, VA) für die 5'-Markierung synthetisiert. Alle Oligonukleotide wurden unter Verwendung der "Expedite"-Reagentien (Millipore) synthetisiert und unter Verwendung von Ammoniumhydroxid entschützt und von den Glasträgern abgespalten. Die entschützten Oligonukleotide wurden durch Verdampfen des Ammoniumhydroxids in einem Speedvac-Verdampfer (Savant Instruments, Farmington, NY) verdampft und in 100 μl destilliertem H2O aufgenommen. Die weitere Reinigung wurde mittels Isopropanolpräzipitation der DNA wie folgt durchgeführt: 10 μl 3 M Natriumacetat pH 7,0 und 110 μl Isopropanol wurden zu 100 μl der DNA-Lösung gegeben. Die Lösung wurde dann bei -70°C gefroren. Es wurde Natriumacetat anstelle von Ammoniumacetat verwen det, da Reste von Ammoniumionen die Cy3-und-Cy5-Verknüpfung ebenso wie die Bindung der DNA an feste Träger über die Amino-Linker stören. Das Präzipitat wurde durch 15minütige Zentrifugation bei Raumtemperatur gesammelt und dreimal mit 50% Isopropanol gewaschen. Isopropanolreste wurden durch Vakuumtrocknung im Speedvac entfernt, und die DNA wurde in sterilem destilliertem Wasser mit einer Endkonzentration von 10 μg/μl resuspendiert. Diese Stammlösungen wurden in einer 1 : 10 Verdünnung in dem entsprechenden Puffer unter Erhalt einer DNA-Konzentration von 1 μg/μl verdünnt.
  • Zur Markierung der DNA mit Cy5-Farbstoff (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) wurden Alkylaminogruppen enthaltende modifizierte Oligonukleotide wie folgt derivatisiert: 30 pmol der DNA wurden in 250 μl 0,5 M Natriumchlorid gelöst und durch eine mit 5 mM Boratpuffer (pH 8,0) äquilibrierte Sephadex-G10-Säule (Durchmesser 1 cm, Länge 10 cm) (Pharmacia, Piscataway, NJ) geleitet. Das das Oligonukleotid enthaltende Totvolumen wurde gesammelt und durch Verdampfen konzentriert. Dieses wurde in 100 μl 0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,0) gelöst. Cy5 (1 mg in Carbonatpuffer) wurde zu dem Oligonukleotid gegeben und die Konjugationsreaktion über 60 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen durchgeführt. Das konjugierte Oligonukleotid wurde von dem freien Farbstoff unter Verwendung einer Sephadex-G10-Säule wie oben beschrieben getrennt. Die die markierte DNA enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und mit einem Speedvac-Verdampfer konzentriert.
  • 5.27.1.2 IMMOBILISIERUNG VON DNA-SONDEN UND DER PROBENNAHMESUBSTRATE
  • Biologisch aktive DNA-Sonden können direkt oder indirekt auf einer Transducer-Detektionsoberfläche immobilisiert werden, so daß ein optimaler Kontakt und maximale Detektion gewährleistet sind. Bei Immobilisie rung auf einem Substrat werden die Gensonden stabilisiert und können daher wiederholt wiederverwendet werden. Bei einer Verfahrensweise wird die Hybridisierung an einem immobilisierten Ziel oder einem auf einer festen Oberfläche, wie z. B. Nitrocellulose, oder einer Nylonmembran oder einer Glasplatte, verbundenen Sondenmolekül durchgeführt. Zur Bindung der DNA an unterschiedliche Träger können mehrere Verfahren eingesetzt werden. Ein zur Bindung von DNA an Glas häufig verwendetes Verfahren beinhaltet die Silanisierung der Glasoberfläche mit nachfolgender Aktivierung mit Carbodiimid oder Glutaraldehyd.
  • Ein weiterer Ansatz besteht aus der Immobilisierung der Gensonde auf einer Membran und nachfolgender Bindung der Membran an die Transducer-Detektionsoberfläche. Dieser Ansatz hat den Vorteil, daß der Biorezeptor nicht auf den Transducer gebunden werden muß. Für die DNA-Bindung stehen mehrere Arten von Membranen zur Verfügung: Nitrocellulose, ladungsmodifiziertes Nylon, usw. Die Gensonde wurde an die Membran unter Verwendung von Ultraviolettaktivierung gebunden. Bei Nitrocellulosemembranen wurden die DNA-Lösungen direkt auf die Membranen punktförmig aufgetragen. Die Spots wurden anschließend entweder einer UV-Quervernetzungsreaktion mit einem Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA) oder zwei Stunden im Vakuum bei 80°C gebacken.
  • 5.27.1.3 HYBRIDISIERUNG AUF EINER PROBENNAHMEPLATTFORM AUF NITROCELLULOSEBASIS
  • Im ersten Schritt der Membranhybridisierung wurde einzelsträngige DNA (ss-DNA) auf der ausgewählten Oberfläche der Sensorsonde (z. B. Membran oder Oberfläche) immobilisiert. Die Sonden wurden dann mit Hybridisierungspuffer zur Blockierung nichtspezifischer Nukleinsäurebindungsstellen behandelt. Fluoreszenzmarkierte DNA enthaltende Proben wurden dann der Sensorsonde zugeführt und unter Wiederherstellung eines doppelsträngigen Moleküls mit den komplementären Zielsequenzen hybridisieren gelassen. Nach der Hybridisierung wurde der Überschuß an ungebundener, markierter DNA weggewaschen und die hybriden Zielsequenzen nachgewiesen. In dieser Arbeit wurden die Nitrocellulosemembranen eine Stunde bei 37°C in 5 ml 6x SSC (1x SSC = 15 mM Natriumcitrat, 150 mM Natriumchlorid pH 7,0) mit 1% BSA und 0,2% SDS (Natriumdodecylsulfat) vorhybridisiert. Nach der Vorhybridisierung wurde die Hybridisierungssonde mit einer Endkonzentration von 100 ng/ml zugegeben und die Hybridisierungen 16 h lang durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen in 5x SSC mit 0,1% SDS bei Raumtemperatur 10– 15 min und, falls notwendig, bei höheren Temperaturen gewaschen, um die Hintergrundfluoreszenzniveaus zu reduzieren.
  • 5.27.1.4 MESSGERÄTESYSTEM FÜR DIE MIKROARRAYSONDEN
  • Zusätzlich zu der in diesem Beispiel beschriebenen integrierten Phototransistor-IC-Vorrichtung wurde zur Bewertung der Leistung der Gensonden ein Meßgerätesystem entwickelt. Im ersten System wurde ein zweidimensionales Multiarray-Detektionssystem mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtung (Charge-Coupled Device, CCD) verwendet. Der experimentelle Aufbau für die CCD bestand aus einer Laserquelle, optischen Filtern, Linsen, dem Multisonden-Wellenleiter und dem CCD-Detektor. Bei dieser Bewertung wurden mehrere Laser eingesetzt: ein Kryptonionenlaser (647,1 nm) wurde für die mit dem Cy5-Farbstoff markierte DNA-Sonde und ein Argonionenlaser mit der 514-nm-Linie für eine sichtbare, mit Fluorescein markierte DNA-Sonde verwendet. Der Laserstrahl wurde in eine Faser mit einem Durchmesser von 600 μm fokussiert und auf das Probensubstrat übertragen. Die Laserstrahlung wurde durch einen Laser-Bandpaßfilter geführt, um unerwünschte Laserlinien bzw. Hintergrundfluoreszenzemission von der Faseroptik zu entfernen. Die Fluoreszenz wurde durch einen holographischen Raman-Filter geführt, um das verbliebene Laserlicht restlos zu entfernen, und mit einer 1 : 2 50 mm-Linse und einem 2x Makrofokussierungstelekonverter auf die Oberfläche eines CCD-Detektors fokussiert. Ein 514,5-nm-holographischer Raman-Filter (Kaiser) wurde eingesetzt, um die Fluoreszenz passieren zu lassen und das Laserlicht abzublocken für Fluoreszenzmessungen. Ein 670-nm-Langpaßfilter wurde verwendet, um die Laseranregung abzublocken und die Cy5-Fluoreszenz passieren zu lassen. Mehrere CCD-Systeme wurden bewertet, einschließlich derjenigen von: Photometrics, Ltd. (z. B. Modell PM-512) (Tucson, AZ), Princeton Instrument, (z. B. Modell RE-ICCD) (Princeton, NJ) und Santa Barbara Instruments Group (z. B. Modell ST-6) (Santa Barbara, CA).
  • 5.27.2 ERGEBNISSE
  • 5.27.2.1 ENTWICKLUNG UND BEWERTUNG DER DNA-MIKROARRAYS
  • Zur Bewertung des Verfahrens der Entwicklung von Mikroarrays von DNA-Sonden wurden umfangreiche Messungen durchgeführt. Eine Nitrocellulosemembran wurde aufgrund ihrer einfachen Handhabung und ihrer effizienten DNA-Bindung als Substrat verwendet. Multiarrays aus Probenspots wurden mit der in 31 dargestellten Vorrichtung produziert. Flüssige Lösungen von ss-DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung einer pneumatischen pV 830 PicopumpTM (World Precision Instruments, Sarasota, FL) auf die Nitrocellulose (Zeta Probe®, Bio Rad, Hercules, CA) aufgetragen. Die PicopumpTM war in der Lage, gleichmäßige Mikrospots mit Durchmessern im Bereich von 500–800 μm zu produzieren, wobei die Durchmesser so gewählt werden können, daß sie mit der Größe der Detektorelemente übereinstimmen. Die DNA-Probe wurde in eine Glaskapillare mit kleinem Durchmesser, die einige wenige mm oberhalb der Cellulosemembran gehalten wurde, eingeführt. Die Membran wurde auf einem Vakuumkolben, der mit einer Metalldrahtfritte ausgestattet ist, an Ort und Stelle gehalten. Der Vakuumschritt diente zwei wichtigen Zwecken. Zunächst verbessert das an die Membran angelegte Vakuum die Reproduzierbarkeit des punktförmigen Auftragens, indem die Membran flach gegen die Metalldrahtoberfläche gedrückt wird. Der Vakuumschritt besaß ebenso einen verkürzenden Effekt auf den Probentrocknungsprozeß, wodurch die Größe des Probenspots verkleinert wurde, indem die Verbreitung der Probe über die Membran verhindert wird.
  • Das Photometrics-CCD (Modell CH 210)-Detektionssystem wurde zur Bewertung des DNA-Probenarrays herangezogen, da dieses System eine 2-dimensionale Abbildung des Sondenarrays liefert (Picard und Vo-Dinh, 1991). Die Ergebnisse zeigten die mit dem CCD-System erhaltene Abbildung von Fluorescein-markierten DNA-Proben, die als 4 × 4-Array auf der Nitrocellulosemembran angeordnet waren. Die Probe wurde mit der 514,5-nm-Linie des Argonlasers beleuchtet. Zur Abblockung der Laseranregung von der CCD wurde ein 514,5-nm-holographischer Filter von Kaiser verwendet. Die Ergebnisse veranschaulichten die Effizienz des zur Herstellung von DNA-Arrays auf der Nitrocellulose-Probennahmeplattform entwickelten PicopumpTM-Spot-Auftragungssystems. Der Durchmesser des Probenspots läßt sich durch Variation der Probennahmevolumen regulieren und kann mit 5–10% relativer Standardabweichung reproduziert werden. Die Probenmenge läßt sich über die Spotintensität abschätzen. So zeigte beispielsweise ein Spot auf dem Array (Position 1 : 3) eine größere Menge an Fluoreszenzmaterial als alle anderen Proben-Spot-Arrays an.
  • Das Verfahren des Sensing von Gensonden mit Fluoreszenzfarbstoffmarkierungen sowohl im sichtbaren als auch im NIR- (700–1000 nm)Spektralbereich wurde ebenfalls bewertet. Die Anregung und Detektion im NIR-Bereich bereitet gewisse Schwierigkeiten, doch bietet auch mehrere Vorteile. Messungen im NIR-Bereich werden durch die Hintergrundfluoreszenz des Nitrocellulosesub strats weniger gestört, da nur sehr wenige Spezies mit NIR-Emission vorkommen. Ein wichtiger Vorteil im Zusammenhang mit NIR-Messungen besteht in der Verfügbarkeit von kostengünstigen Diodenlasern im Miniaturformat, die normalerweise Emissionslinien im roten und im NIR-Bereich aufweisen. Die DNA-Sonden wurden mit dem Cy5-NIR-Farbstoff nach der oben beschriebenen Verfahrensweise markiert. Für die Anregung wurde die Diodenlaserlinie von 780 nm bei 9,5 mW verwendet. Die Eichkurve für die mit dem NIR-Farbstoff markierte einzelsträngige DNA über einen Konzentrationsbereich von 1 pmol/μl bis 3 fmol/μl. Das Anregungslicht wurde von einer kugelschreibergroßen 9,5-mW-Laserdiode (780 nm) geliefert, und die Meßzeiten lagen im Bereich von 1 bis 3 min. Diese Eichkurve verlief über dem gesamten Bereich der untersuchten Farbstoffkonzentration linear. Die optische Nachweisgrenze, auf der Basis eines dem Dreifachen der Standardabweichung vom Rauschen entsprechenden Signals, wurde als im Bereich der 100 attomol/μl liegend abgeschätzt.
  • Hybridisierungsuntersuchungen wurden ausgeführt, um die Nützlichkeit der DNA-Arraysonden auf der Nitrocellulose-Probennahmeplattform zu demonstrieren. Die Aufgabe der DNA-Sonde besteht darin, die Zielverbindungen über molekulare Erkennung zu identifizieren. Die Gensonden funktionieren auf der Grundlage des Hybridisierungsvorgangs. Bei der Hybridisierung wird ein Nukleinsäureeinzelstrang mit einer homologen komplementären Sondensequenz verbunden. Die Hybridisierung einer Nukleinsäuresonde an biologische DNA-Zielmoleküle (z. B. Gensequenzen, Bakterien, virale DNA) bietet einen hohen Grad an Genauigkeit zur Identifizierung von zu der Sondensequenz komplementären DNA-Sequenzen. Nukleinsäurestränge neigen zur Paarung mit ihren Komplementen in der entsprechenden doppelsträngigen Struktur. Daher findet ein einzelsträngiges DNA-Molekül sein Komplement in einem komplexen DNA-Gemisch, das große Mengen an anderen Nukleinsäuremolekülen enthält. Daher sind Nukleinsäuresonden- (d. h.
  • Gensonden-)Nachweisverfahren sehr spezifisch für DNA-Sequenzen. CDNAs mit spezifischen Sequenzen des HIV1-Virus wurden auf der Nitrocellulosemembran gebunden und mit komplementäre Sequenzen dazu aufweisenden Cy5-markierten DNA-Strängen hybridisiert. Die HIV1-Messungen auf der Nitrocellulose wurden durchgeführt, indem die HIV1-Sonden-DNA auf die Nitrocellulose punktförmig aufgetragen wurde. Bei der HIV1-Gensonde handelt es sich um die 18 Basen lange, zum Gag-Genbereich (Clewley, 1989) komplementäre Oligonukleotidsequenz. Hybridisierungsereignisse zwischen komplementären DNA-Sequenzen wurden durch einen positiven Nachweis der Fluoreszenzsignale demonstriert. Für das Abbildungssystem wurde die Photometrics-CCD verwendet. Die Daten zeigten das mit dem CCD-Detektor erhaltene Fluoreszenzsignal, das aus der Hybridisierung der HIV1-markierten Gensonde mit komplementärer, an die Nitrocellulosemembran gebundener DNA. Das 3 × 3-Array-Signal des 3-dimensionalen Diagramms demonstrierte die positive Hybridisierung mit der HIVI-Sonde. Ein Referenzsystem bestehend aus einem Array aus Kontroll-DNA-Sonden, die keine HIVI-Gensequenz aufweisen, zeigte keine Fluoreszenzsignale. Dieses Ergebnis veranschaulicht die Kapazität der Nitrocellulosemembran als Probennahmeplattform für in-situ-Hybridisierungsuntersuchungen auf dem DNA-Biochip.
  • 5.27.2.2 ENTWICKLUNG UND BEWERTUNG DES PHOTOTRANSISTORS INTEGRIERTES SCHALTKREIS-SYSTEM
  • Ein wichtiges Element bei der Entwicklung des Biochips beinhaltet die Konstruktion und Entwicklung eines IC-elektrooptischen Systems für die Mikrochip-Detektionselemente unter Verwendung der Phototransistor-Verstärker-Technologie. Diese Technologie ermöglicht hochintegrierte Biosensoren teilweise aufgrund der Kapazität zur Herstellung mehrerer optischer Sensorelemente und Mikroelektronikelemente auf einem einzigen IC. Ein zweidimensionaler Array aus optischen Detektor-Verstärkern wurde auf einem einzigen IC-Chip integriert. Jeder optische Detektor bestand jeweils aus einem an einen Transimpedanzverstärker gekoppelten Phototransistor mit daran anschließendem Verstärker. Dieser Block wurde mehrere Male auf dem IC-Chip wiederholt und mit anderen elektronischen Elementen, wie z. B. Filtern und Verstärkern, die ebenfalls auf demselben IC integriert wurden, kombiniert. Der mit dem Phototransistor verwendete Operationsverstärker ist ein zweistufiger ungepufferter Verstärker. Der Schaltkreis ist sehr kompakt und nimmt eine Fläche von lediglich 185 μm × 200 μm ein. Er wurde so konstruiert, daß er für die Breitbandverstärkung und Niedrigpegelsignale geeignet ist. Das Gewinn-Bandbreiten-Produkt beträgt 70 MHz, und der Verstärker ist bei Verstärkungen von mehr als 10 stabil. Zu weiteren typischen Eigenschaften zählen: Eingangsoffsetspannung von weniger als 5 mV, Gleichstromverstärkung von 220, positive Flankensteilheit [slew-rate] von 80 V/μs sowie negative Flankensteilheit von 9 V/μs. Der Schaltkreis benötigt 2,5 mW von einer einzigen 5-V-Quelle. Von diesem IC-Chip wurde die vollständige Umwandlung eines optischen Signals in ein für die Datendigitalisierung und -erfassung mittels eines Computers geeignetes elektrisches Signal durchgeführt.
  • Der Schaltkreis wurde in einem 2-μm-, p-Well-CMOS("Complementary Metal Oxide Semiconductor")-Verfahren hergestellt und nahm eine Fläche von 160 000 Quadratmikrometern ein. Detektorelemente mit einzelnen Phototransistoren sind für die Detektion von Spuren nicht ausreichend empfindlich. Daher bestand der Phototransistor tatsächlich aus 220 in Parallelschaltung miteinander verbundenen Phototransistorzellen. Eine individuelle Phototransistorzelle beanspruchte 760 Quadratmikrometer. Der Transimpedanzverstärker besaß eine Verstärkung von 100 kV/A. Da die Phototransistoren mit der 10fachen Verstärkerverstärkung gekoppelt waren, betrug die erhaltene Verstärkung 106 V/A. Die Phototransistoren wiesen eine Umwandlungsverstärkung in der Größenordnung von 10 μA/μW auf, so daß die gesamte Kette eine ungefähre Umwandlungsverstärkung von 10 V/μW besaß. Die genaue Verstärkung hängt im allgemeinen von dem interessierenden Spektralbereich und in gewisser Weise von dem beobachteten Signalpegel ab.
  • Die oben beschriebenen Elemente können zur Anpassung der Vorrichtungen an spezifische Anwendungen modifiziert werden. Da der Phototransistor aus einfachen Photozellenelementen besteht, kann er mit so vielen Zellen wie zur Erzeugung der gewünschten Geometrie oder der erforderlichen Anzahl von Kanälen zur Anpassung des Detektors an eine spezifische Anwendung notwendig sind, verbunden werden. In ähnlicher Weise lassen sich die Verstärkung und Bandbreite der Verstärker mit einfachen Widerstands- oder Kondensatoränderungen je nach Bedarf der Anwendung anpassen.
  • Die konstruierten und hergestellten Mikrochips wurden durch Messung des Fluoreszenzsignals einer mit Fluorescein markierten und auf die Membransonde punktförmig aufgetragenen DNA-Probe bewertet. 20 zeigt die Leistung des integrierten Phototransistor-und Verstärkerschaltkreises (Geräte-Nr. ICI N551-CD2). Die Abbildung zeigt die Ausgangssignalantwort für verschiedene Konzentrationen der mit Fluorescein markierten und mit dem Argonionenlaser angeregten DNA. Die Ergebnisse veranschaulichen die Linearität des Mikrochipdetektors in bezug auf die Konzentrationen der mit Fluorescein markierten DNA und demonstrieren die Möglichkeit für eine quantitative Analyse.
  • 5.27.2.3 BEWERTUNG DES BIOCHIPS MIT FLUORESZENZMARKIERTEN DNA-SONDEN
  • In diesem Beispiel wurden von den Erfindern Messungen unter Verwendung einer Verstärker-Phototransistor-(APT-)Vorrichtung mit einem 4x4-Array aus Phototransistoren entwickelt und durchgeführt. Während das CCD-Meßgerät verwendet wurde, um eine Abbildung der Mikroarray-Probenspots zu erhalten und ein Intensitätsdiagramm aufzuzeichnen, wurden die Signale von dem APT-Mikrochip direkt aufgezeichnet, ohne daß irgendein elektronisches Schnittstellensystem oder eine Signalverstärkungsvorrichtung benötigt wurde. Der Photostrom von jedem Sensorelement des APT-Mikrochips wurde jeweils direkt in ein Digitalphotometer übertragen. Die Daten von dem Photometer wurden über eine RS-232-Verbindung auf einen PC (Personal Computer) geschaltet. Die Proben bestanden aus einem Array aus Mikrospots von mit Fluorescein markierter DNA auf einer Nitrocellulosemembran. In der in den vorhergehenden Abschnitten beschriebenen Untersuchung der Sondenarrays auf Nitrocellulosemembranen wurde von den Erfindern das CCD-System verwendet, um eine zweidimensionale Abbildung des Fluoreszenzsignals zu erhalten.
  • Da die Sensorelemente des Phototransistorchips nur eine Signalintensität und keinen Signalverlauf liefern, wurde von den Erfindern eine Vorrichtung zur Aufzeichnung der Antwort der Phototransistor-Detektionselemente während der Passage der Probenspots über die Sensorelemente entwickelt. In dieser Untersuchung wurde eine Nitrocellulosemembran mit einer Reihe von Probenspots von mit Fluoreszein markierter DNA auf einen mit einem Tisch zur linearen Verschiebung vebundenen Glasobjektträger gelegt. Die Messungen wurden durchgeführt, während die Probenarrays mit dem Verschiebetisch über die stationäre Phototransistorvorrichtung geführt wurden. Das Meßsystem ist schematisch in 18 dargestellt. Licht von einem Argonionenlaser mit 488 nm wurde über eine Faseroptik übertragen und auf einen Probenspot fokussiert. Ein zwischen dem Probensubstrat und dem Detektorarray angebrachter optischer Filter wurde zur Unterdrückung der Laserstrahlung verwendet. Die Daten zeigten vier aufgelöste Signale, als die Probenspots über einen ATP-Mikrochipkanal geführt wurden (19).
  • Vier Proben von jeweils 1 μl mit Fluoreszein markierter DNA wurden auf eine Nitrocellulosemembran punktförmig aufgetragen, die über einen Detektionskanal eines APT-Biochips geführt wurde. Während der Passage des DNA-Spots über den Photodetektor wurde ein Fluoreszenzsignal nachgewiesen. Die vier Maxima in 19 veranschaulichen den Nachweis der vier aufgelösten DNA-Probenspots auf dem Substrat durch die APT-Biochipvorrichtung.
  • 6.0 LITERATURHINWEISE
  • Affymetrix http://www.affymetrix.com; 23. Juli 1997.
  • Alarie, Stokes, Sutherland, Edwards, Vo-Dinh, „Intensified charge coupled device-based fiber-optic monitor for rapid remote surface-enhanced Raman scattering sensing, Appl. Spectrose., 46: 1608–1612, 1992.
  • Anderson, McGall, Lipshutz, „Polynucleotide arrays for genetic sequence analysis," in: Microsystem Technology in Chemistry and Life Science, A. Manz, H. Becket (Hrsg.), Springer-Verlag, Berlin, S. 117–129, 1998.
  • Armitage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23): 12320–12325, 1997.
  • Aubert, Oguey, Vuillcumier, „Monolithic Optical Position Encoder with On-Chip Photodiodes," IEEE J. Solid State Circuits, 23(2): 465–73, 1988.
  • Boffa, Carpaneto, Allfrey, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 92: 1901–1905, 1995.
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    <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: SYNTHETISCH
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    cctcctcctt cccagcaggg 20

Claims (16)

  1. Integrierter Schaltkreis, umfassend: a) einen Detektor, mit dem ein elektromagnetisches Signal nachgewiesen werden kann, wobei der Detektor mit dem integrierten Schaltkreis integriert ist; b) eine elektromagnetische Anregungsstrahlungsquelle, wobei die elektromagnetische Strahlungsquelle mit dem integrierten Schaltkreis integriert ist; c) wenigstens ein mit dem integrierten Schaltkreis operativ assoziiertes Sensorelement, wobei sich das Sensorelement selektiv mit einem Zielmolekül verbindet; und d) Mittel zur Erzeugung eines Signals.
  2. Integrierter Schaltkreis nach Anspruch 1, wobei das erzeugte Signal im sichtbaren, ultravioletten oder infraroten Bereich oder im nahen Infrarotbereich nachweisbar ist.
  3. Integrierter Schaltkreis nach Anspruch 1, weiterhin ein Probennahmeelement umfassend.
  4. Integrierter Schaltkreis nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Sensorelement um eine molekulare Sonde, wie z. B. einen chemischen Rezeptor, einen Biorezeptor, ein Polymer, ein Biopolymer, einen biomimetischen Rezeptor wie etwa einen molekularen Abdruck, eine Nukleinsäure, einen Antikörper, ein Enzym, einen Zellrezeptor oder eine oder mehrere Zellen handelt.
  5. Integrierter Schaltkreis nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei der elektromagnetischen Anregungsstrahlungsquelle um eine Lichtquelle, die aus der Gruppe bestehend aus einer Licht emittierenden Diode bzw. einem Laser ausgewählt ist, handelt.
  6. Integrierter Schaltkreis nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin ein Signalverstärkungs- und -verarbeitungssystem, das mit dem integrierten Schaltkreis integriert ist, umfassend.
  7. Integrierter Schaltkreis nach Anspruch 6, wobei das Signalverstärkungs- und -verarbeitungssystem einen Mikroprozessor und einen Verstärker umfaßt.
  8. Integrierter Schaltkreis nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Detektor, mit dem ein elektromagnetisches Signal nachgewiesen werden kann, Photodetektoren umfaßt.
  9. Integrierter Schaltkreis nach Anspruch 8, wobei die Photodetektoren Photodioden oder Phototransistoren umfassen.
  10. Integrierter Schaltkreis nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Detektor weiterhin einen oder mehrere Transimpedanzverstärker und Tiefpaßfilter umfaßt.
  11. Integrierter Schaltkreis nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend: a) mehrere elektromagnetische Anregungsstrahlungsquellen; b) mehrere Sonden, die gegebenenfalls mit einer Markierung, die auf die elektromagnetische Strahlung aus diesen Quellen reagiert, indem sie elektromagnetische Anworten mit einer unterschiedlichen Frequenz emittiert oder absorbiert, versehen sind; und c) mehrere Detektoren, mit denen die elektromagnetischen Antworten nachgewiesen werden.
  12. Integrierter Schaltkreis nach Anspruch 11, wobei es sich bei den Sonden um Polynukleotid- oder Polypeptid/Nukleinsäure-Sonden handelt.
  13. Integrierter Schaltkreis nach Anspruch 11 oder 12, wobei die elektromagnetischen Antworten aus der Gruppe bestehend aus Lumineszenzstreuung, Infrarotabsorption und Ultraviolettabsorption ausgewählt sind.
  14. Integrierter Schaltkreis nach Anspruch 4, wobei die Sonden auf die elektromagnetische Strahlung mit der Emission von Lumineszenzantworten reagieren.
  15. Integrierter Schaltkreis nach Anspruch 14, wobei die Lumineszenzantworten im sichtbaren Spektralbereich oder nahen Infrarotspektralbereich liegen.
  16. Vorrichtung zum Nachweis eines Polynukleotids, umfassend: a) einen integrierten Schaltkreis gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei es sich bei der elektromagnetischen Anregungsstrahlungsquelle um eine Lichtquelle handelt und wobei der Detektor, mit dem ein elektromagnetisches Signal nachgewiesen werden kann, einen Phototransducer umfaßt, b) eine zum Halten einer Probe eines Materials, das die bestimmte Nukleinsäure enthalten kann, angepasste Oberfläche, wobei das Material eine Sonde mit einem Tag, das das Licht als Antwort auf von der Lichtquelle empfangenes Licht emittiert, enthält, wobei die Oberfläche auf dem integrierten Schaltkreis positioniert wird, so daß das Material Licht von der Quelle und der Transducer von dem Tag emittiertes Licht empfangen kann.
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