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1. Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf das Gebiet der Kapillarelektrophorese,
bei der chemische Proben in Kapillarrohren zur Analyse ihres spektralen
Inhalts (Frequenzinformationsinhalt) und somit ihrer chemischen
Zusammensetzung angeordnet sind, und insbesondere auf eine photometrische
Vorrichtung zur Absorptionserfassung, die ermöglicht, dass mehrere Separationen
gleichzeitig gemessen werden können.
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2. Hintergrund
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Kapillarelektrophorese
(„CE" = Capillary Electrophoresis)
ist eine bekannte chemische Probentrennungstechnik, die von zunehmenden
Interesse für
diejenigen ist, die sich mit der Analyse der Separation bzw. Trennung
des chemischen Inhalts einer chemischen Probe befassen. Sie ist
eine Modifikation der Elektrophorese und wird typischerweise in
einer dünnen
Glaskapillare anstatt auf einer zweidimensionalen Oberfläche, wie
beispielsweise Papier, oder in einem Gel praktiziert. Diese Technik
bietet die Vorteile eines hohen Wirkungsgrads und hoher Auflösung, schneller
Trennungen, die Fähigkeit
zur Analyse kleiner Probenmengen, und eine wünschenswerte Einfachheit aus
Sicht der erforderlichen Vorrichtung verglichen mit konkurrierenden
analytischen Techniken, wie beispielsweise Gelelektrophorese, Gaschromatographie
und Flüssigkeitschromatographie.
Wie bei allen Trennungssystemen sind hohe Auflösung, hohe Empfindlichkeit
und ein hoher dynamischer Bereich die Endziele.
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Die
Vorteile der Kapillarelektrophorese leiten sich zu einem großen Ausmaß aus der
Verwendung von Kapillarrohren mit engem Durchmesser ab, die eine
effiziente Abfuhr der bei dem Trennungsprozess erzeugten Wärme erlauben.
Diese Wärmeabfuhr
verhindert Konvektionsmischen, das die Trennleistung verschlechtern
würde.
Die Rohre mit engem Durchmesser ermöglichen ebenfalls, dass hohe
Spannungen verwendet werden können,
um das elektrische Feld in der Kapillare zu erzeugen, während der Stromfluss
und somit die Wärmeerzeugung
begrenzt wird.
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Eine
CE-Trennung beginnt mit dem Füllen der
Kapillare mit einem tragenden Elektrolyten. Als nächstes wird
eine kleine Probenmenge in ein Ende der Kapillare injiziert. Typische
Probeninjektionsvolumen reichen von 1 bis 20 Nanoliter. Nach der
Probeninjektion und wenn jedes Ende der Kapillare in eine Pufferlösung eingetaucht
ist, wird eine hohe Spannung an die Kapillare angelegt, und die
Probenkomponenten werden auf Grund unterschiedlicher Ionenmobilität getrennt.
Eine kapillarelektrophoretische Trennung kann ebenfalls mit einer
Bulk-Fluid-Strömung,
genannt elektroosmotische Strömung, verstärkt werden.
Falls vorhanden, fügt
sie eine Komponente konstanter Geschwindigkeit zu allen Spezies
bzw. Bestandteilen in der Kapillare hinzu.
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Bei
einer CE-Trennung, die Absorptionstechniken implementiert, wird
der Inhalt der Kapillarrohre analysiert, indem Licht einer bestimmten
Wellenlänge
durch die Kapillarrohre geleitet und dann die durch das Rohr gelaufene
Lichtmenge mit einem Photodetektor erfasst wird. Die verwendete
Wellenlänge
wird gewählt,
so dass sie mit einem Absorptionsband der interessierenden Probenkomponenten, gewöhnlicherweise
in den ultravioletten oder sichtbaren Regionen des Spektrums, koinzidiert.
Die Photodetektorausgabe wird digital verarbeitet und verwendet,
um die Absorption der Probe zu berechnen. Ein Elektropherogramm,
d.h. die graphische Darstellung von Absorption als Funktion von
Zeit, wird typischerweise in einer Computerdatei gespeichert und
kann beispielsweise auf einem PC-Bildschirm angezeigt werden.
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Mit
herkömmlichen
Systemen müssen,
wenn eine Mehrzahl von Kapillarrohren zu verwenden ist, eine entsprechende
Anzahl von Lichtquellen, Photodetektoren, Verstärkern und A/D-Wandlern ebenfalls verwendet
werden. Die Ausgaben der Mehrzahl von A/D-Wandlern werden in eine
Signalverarbeitungsschaltungsanordnung, wie beispielsweise einen DSP-Chip
(Digital Signal Processing chip), gespeist, um die Daten zeitlich
zu mitteln, sie zu komprimieren und sie an einen Personal-Computer
zur Speicherung und/oder Anzeige zu senden.
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Es
ist sehr praktisch und wünschenswert
geworden, eine Mehrzahl von Kapillarrohren parallel zu verwenden,
da dies ermöglicht,
dass mehrere Proben zur gleichen Zeit ananalysiert werden können. Das
Verwenden der oben beschriebenen herkömmlichen Systeme führt jedoch
zu einer sehr kostenaufwändigen
und großen
Anordnung, da viele Schaltungsanordnungen doppelt vorgesehen werden
müssen.
Für jedes
Kapillarrohr in der parallelen Konfiguration erfordert die Vorrichtung
eine entsprechende Gleichstromlichtquelle, einen Photodetektor,
einen Verstärker
und einen A/D-Wandler. Eine derartige Redundanz von Bauteilen hat
nachteilige Auswirkungen unter anderem auf die Kosten und die Größe derartiger
paralleler analytischer Instrumente.
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Ein
Beispiel eines bekannten Mehrfach-Kapillarelektrophoresetrennungssystems
mit Absorptionserfassung wird in der europäischen Patentanmeldung 0 581
413 A2 offenbart. Bei der offenbarten Vorrichtung wird Licht von
einer Lichtquelle zu der Messregion jeder Kapillare mit einer Mehrzahl
von optischen Fasern gerichtet. Ein zweiter Satz von optischen Fasern
leitet übertragenes
Licht zu einer Mehrzahl von Photodetektoren, von denen jeder seinen
eigenen Verstärker
und seine eigene Signalverarbeitungselektronik aufweist. Die Konfiguration
der optischen Faser führt
zu Komplexität,
Lichtverlust und verringerter analytischer Empfindlichkeit. Außerdem weist,
wie erläutert,
eine derartige Implementierung nachteiligerweise zahlreiche redundante
Bauteile auf.
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Ein
weiteres Beispiel einer Mehrfach-Kapillarelektrophorese
wird in dem US-Patent Nr. 5 324 401 bereitgestellt, das Fluoreszenzerfassung
benutzt. Bei dieser Erfindung wird ein kontinuierlicher Lichtfluss
von einer kohärenten
Lichtquelle, einem Laser, an eine Mehrzahl von optischen Fasern
geliefert, von denen jede Anregungslicht an eine jeweilige Trennungskapillare
liefert. Die Messregionen der Kapillaren sind benachbart zueinander
angeordnet, sodass emittiertes fluoreszierendes Licht mit einer CCD-Kamera
abgebildet werden kann. Es sei bemerkt, dass Laser im Allgemeinen
nicht die erforderliche Stabilität
für Absorptionsmessungen
aufweisen, viel kostenaufwändiger
sind und weniger für
die Verwendung in einer Routineanalysevorrichtung geeignet sind.
Außerdem
existieren keine geeigneten Laser mit Wellenlänge nahe dem Absorptionsmaximum von
vielen Analyten. Außerdem
ist eine CCD-Kamera im Allgemeinen keine geeignete Wahl als ein
Detektor für
eine Absorptionsmessung, weil für
die Absorption Lichtpegel typischerweise hoch sind und zur Sättigung
der CCD-Pixel führen,
bevor sie ausgelesen werden können.
Das Verringern der Lichtquellenausgabe, um dem CCD-Detektor zu entsprechen,
führt zu
einer verringerten analytischem Empfindlichkeit und zu einem verringerten
dynamischen Bereich. Fluoreszenzmessungen sind im Gegensatz dazu Messungen
mit niedrigem Lichtpegel, die gut an die Eigenschaften eines CCD-Detektors
angepasst sind.
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In
dem US Patent Nr. 5 324 401 wird eine weitere Klasse von Mehrfach-Kapillartrennungen aufgezeigt
und deren Einschränkungen
kritisch untersucht. Die aufgezeigten Systeme verwenden Erfassungsimplementierungen,
bei denen die Messregion jeder Kapillare differenziell abgetastet
wird. Typischerweise wird ein konfokales Verfahren verwendet, um
laserangeregte Fluoreszenz von einem Array von Trennungskapillaren
sequenziell zu messen. Die zahlreichen Nachteile derartiger Systeme,
wenn sie auf die hier zuvor erläuterten
Absorptionsmessungen angewendet werden, umfassen die Einschränkungen eines
Laserstrahls als eine Lichtquelle und relativ größere Kosten, die komplexer
Optik zugeordnet sind.
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Die
EP-A-0 476 792 und die US-A-5 324 401 befassen sich mit Fluoreszenzmessung.
Fluoreszenz wird mit sehr niedrigen Lichtpegeln und für eine sehr kurze
Zeit gemessen. Im Gegensatz dazu verwendet die Absorptionserfassung
hohe Lichtpegel, wird über eine
längere
Zeitspanne durchgeführt
und stellt besondere Anforderungen an die Lichtstabilität. Eine Absorptionsmessung
eines Analyten mit niedriger Konzentration wird aus dem kleinen
Unterschied zwischen zwei großen
Signalen hergeleitet. Licht mit einer Wellenlänge im UV-Bereich ist für Absorptionsmessungen
der interessierenden Analyten erforderlich. Laser mit Wellenlängen in
diesem Bereich sind nicht ohne weiteres mit angemessenen Kosten
verfügbar.
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3. Zusammenfassung der
Erfindung
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Erfindungsgemäß wird die
obige Aufgabe durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 erreicht. Die
abhängigen
Ansprüche
sind auf weitere vorteilhafte Aspekte der Erfindung gerichtet.
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Eine
erste bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist eine Vorrichtung, um mehrere gleichzeitige Separationen
bzw. Trennungen zu bewirken, um Absorption zu messen, die ein Photodetektorarray mit
einer Mehrzahl von photoempfindlichen Elementen umfasst, die verbunden
sind, um eine serielle Ausgabe bereitzustellen. Die Elemente sind
typischerweise Pixel eines Photodiodenarrays (PDA). Die Elemente
werden durch eine Lichtquelle beleuchtet, die positioniert ist,
um mindestens einen Abschnitt des Photodetektorarrays zu beleuchten.
Die Lichtquelle kann eine Wechselstromquecksilberlampe oder eine
andere geeignete Lichtquelle für
die Chromatographie sein. Ein Array von Trennungskanälen ist
zwischen der Lichtquelle und dem Photodetektorarray angeordnet,
wobei jeder der Trennungskanäle
ein Lumen, ein Probeneinführungsende
und eine gegenüberliegend
dem Probeneinführungsende angeordnete
Erfassungsregion aufweist. Typischerweise, und wie hier offenbart,
ist das Array ein paralleles Mehrfach-Kapillarelektrophoresesystem. Das letzte
Element ist ein Maskenelement mit mindestens einer Apertur für jeden
zugeordneten Trennungskanal, wobei jede Apertur ihrem zugeordneten
Trennungskanal entspricht, um dadurch Licht von der Lichtquelle
selektiv zu erlauben, durch das Lumen ihres zugeordneten Trennungskanals
zu laufen, wobei mindestens ein Abschnitt des durch das Lumen des zugeordneten
Trennungskanal laufenden Lichts auf ein jeweiliges photoempfindliches
Element des Photodetektorarrays fällt, um die Messung der Lichtabsorption
durch eine in das Probeneinführungsende des
zugeordneten Trennungskanals eingefügte Probe zu bewirken.
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Erfindungsgemäß verwendet
ein Instrument zur Analyse des spektralen Inhalts von chemischen Proben,
die in einer großen
Anzahl von Trennungskanälen
oder Kapillarrohren enthalten sind, eine Lichtquelle und einen einzelnen
selbstabgetasteten Photodiodenarraydetektor („PDA"-Detektor). Dies verringert und vereinfacht
die Anzahl erforderlicher Schaltungselemente sehr, da lediglich
ein Verstärker, ein
A/D-Wandler, eine Lichtquelle und ein Detektor bereitgestellt werden
müssen.
Die resultierende Vorrichtung kann weniger aufwändig aufgebaut werden und weniger
Platz verglichen mit bekannten Mehrfach-Trennungssystemen benötigen.
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In
weiterer Übereinstimmung
mit der Erfindung wird die einzelne Lichtquelle mit Wechselstrom betrieben,
und die Frequenz der Leistungsversorgung der Wechselstromlichtquelle
ist mit dem PDA-Takt verriegelt, sodass jedes Detektorelement oder
Pixel des PDA genau die gleiche Anzahl von Lichtquellenzyklen, einschließlich aller
Teilzyklen an dem Start und Ende der Belichtungszeitspanne, sehen
wird. Dies verbessert dramatisch die Detektorsignalgrundlinienstabilität.
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In
noch weiterer Übereinstimmung
mit der Erfindung ist jeder Trennungskanal eine Kapillare in einem
Array von Trennungskapillaren und umfasst einen maskierten Abschnitt
der auftreffendes Licht auf eine erwünschte Erfassungsregion begrenzt.
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Merkmale
der Erfindung umfassen ein analytisches Instrument, das zu niedrigeren
Kosten hergestellt werden kann und das eine hoch zuverlässige und
stabile Analyse bereitstellt. Bei einer Kapillarelektrophorese-Ausführungsform
(„CE"-Ausführungsform)
wird eine CE mit hohem Durchsatz in einer Vorrichtung bewirkt, die
von angemessener Größe ist. Die
einzelne Lichtquelle und das Detektorarray ermöglichen Flexibilität in der
Anzahl von Kapillaren, die gleichzeitig analysiert werden können. Die CE-Ausführungsform
der Erfindung kombiniert die Vorteile der CE und der hochstabilen
Absorptionserfassung mit dem hohen Durchsatz paralleler Analyse bei
einem System, verglichen mit bekannten parallelen CE-Systemen das
relativ kostengünstig
und relativ kompakt ist.
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4. Kurzbeschreibung der
Zeichnungen
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1 ist
ein Blockdiagramm einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung;
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1A ist
ein Blockdiagramm einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung;
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2 ist
eine diagrammartige Seitenansicht einer Optik, die bei einer veranschaulichenden
Ausführungsform
der Erfindungen implementiert ist;
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3 ist
eine diagrammartige Top-down-Ansicht eines bei einer veranschaulichenden
Ausführungsform
der Erfindungen implementierten Kapillararrays;
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4 ist
eine perspektivische Ansicht einer veranschaulichenden Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen parallelen
Mehrfach-Kapillarelektrophorese;
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5 ist
eine graphische Darstellung von Probendaten, die von einer einzelnen
Abtastung der Ausführungsform
von 4 gesammelt wurden; und
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6 ist
eine veranschaulichende alternative Ausführungsform von in ein planares
Substrat geätzten
Trennungskanälen.
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5. Ausführliche
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Zwei
bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung werden in 1 bis 4 gezeigt,
wobei sie auf eine parallele Kapillarelektrophorese-Vorrichtung („CE"-Vorrichtung) angewendet
werden. 1 stellt eine erste bevorzugte
Ausführungsform
der Erfindung dar, eine Vorrichtung, um mehrere gleichzeitige Trennungen
auszuführen,
um Absorption zu messen, die ein Photodetektorarray 15 mit
einer Mehrzahl von photoempfindlichen Elementen 42 (3)
umfasst, die eine serielle Ausgabe bereitstellen. Die Elemente sind
typischerweise Pixel eines Photodiodenarrays (PDA). Die Elemente
werden durch eine Lichtquelle 12 beleuchtet, die positioniert
ist, um mindestens einen Abschnitt des Photodetektorarrays 15 zu
beleuchten. Die Lichtquelle kann eine Quecksilberlampe oder eine
andere brauchbare Lichtquelle für
Chromatographie sein und wird mit Wechselstrom betrieben. Ein Array
von Trennungskanälen 14 ist
zwischen der Lichtquelle 12 und dem Photodetektorarray 15 angeordnet,
wobei jeder der Trennungskanäle 34 ein
Lumen 36, ein Probeneinführungsende und eine Erfassungsregion,
die dem Probeneinführungsende
gegenüberliegend
angeordnet ist, aufweist. Typischerweise, und wie hier offenbart,
ist das Array ein paralleles Mehrfach-Kapillarelektrophoresesystem mit
Kapillaren 34, wie in 4 gezeigt
ist. Das letzte Element ist eine Maske 38 (2)
mit mindestens einer Apertur 39 für jeden zugeordneten Trennungskanal,
wobei jede Apertur ihrem zugeordneten Trennungskanal entspricht,
um dadurch dem Licht von der Lichtquelle 12 selektiv zu
ermöglichen,
durch das Lumen des zugeordneten Trennungskanals zu laufen, wobei
mindestens ein Teil des durch das Lumen des zugeordneten Trennungskanals
laufenden Lichts auf ein jeweiliges photoempfindliches Element des Photodetektorarrays 15 fällt, um
die Messung der Lichtabsorption durch ein in das Probeneinführungsende
des zugeordneten Trennungskanals eingeführte Probe zu bewirken.
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Die
Erfindung ist auf eine spezifische Anwendung einer phasenverriegelten
Wechselstromquelle für
die Lichtquelle gerichtet und wird in 1A gezeigt.
Eine schaltende Leistungsversorgung 10' liefert Wechselstrom an eine Wechselstrom-Lichtquelle (oder
pulsierende Lichtquelle) 12'.
Bei der vorliegenden veranschaulichten Ausführungsform ist die Lichtquelle
eine einzelne Niederdruck-Quecksilberlampe, die mit Wechselstrom
betrieben sein muss, um ordnungsgemäß zu arbeiten, und die Licht
bei einer Anzahl von diskreten Wellenlängen emittiert. Die Quecksilberlampe
ist eine flächige
oder ausgedehnte Lichtquelle, die imstande ist, ein paralleles Array
von Trennungskanälen
oder Kapillaren gleichzeitig zu beleuchten. Ein schmales Bandpassfilter 13 wird
verwendet, um eine analytische Wellenlänge, wie beispielsweise 254
nm, auszuwählen,
die mit der Probenabsorption koinzidiert. Andere Wellenlängen von Licht,
die nicht in dem ausgewählten
schmalen Band liegen, werden durch das Wellenlängenfilter 13 ausgefiltert.
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Obwohl
die hier beschriebene einzelne Lichtquelle eine mit Wechselstrom
betriebene Quecksilberlampe ist, ist offensichtlich, dass andere
direkte oder indirekte Lichtquellen, die durch Wechselstrom betrieben
werden, wie beispielsweise ein Zink-, Kadmium-, Xenon-, Deuteriumbogen,
oder ein gepulster Laser oder dergleichen, erfindungsgemäß implementiert
werden können.
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Der
Lichtstrahl mit ausgewählter
Wellenlänge
von der einzelnen Lichtquelle läuft
durch das Filter 13 und fällt auf die Trennungskanäle in der
Form eines parallelen Arrays 14 von Kapillarrohren auf,
die jeweils eine chemische Probe enthalten, die analysiert wird.
Die Proben in diesen Rohren absorbieren Licht in unterschiedlichen
Mengen abhängig
von der chemischen Zusammensetzung der Proben. Die bei dieser veranschaulichenden
Ausführungsform
implementierten Trennungskanäle
umfassen ein Kapillarrohrarray 14, das 48 Kapillare 34 umfasst,
die parallel konfiguriert sind, um die gleiche Lichtquelle gemeinsam
zu nutzen. Die Kapillaren sind beschichtet oder anderweitig maskiert,
um Licht zu blockieren. Jede der Kapillaren 34 in dem Array
umfasst eine Apertur 39, die ein Fenster für Licht
bereitstellt, das das Kapillarlumen 36 durchläuft. Bei
dieser veranschaulichenden Ausführungsform
hindert eine dünne
Metallmaske mit chemisch herausgearbeiteten Schlitzen Lichtstrahlen
am Laufen durch die Wände
der Kapillaren oder zwischen den Kapillaren. Andere Maskiermittel
sind möglich
und werden im Allgemeinen eine Funktion der Trennungsanwendung sein.
Die ausgewählte
Lichtwellenlänge
wird in einem Linienbild an der Stelle der Aperturen konzentriert,
um Absorptionserfassung zu erleichtern.
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2 veranschaulicht
das optische System, das erfindungsgemäß implementiert werden kann, um
die ausgewählte(n)
Wellenlänge(n)
von Licht zu lenken. Lichtstrahlen 28 der ausgedehnten,
mit Wechselstrom betriebenen Lichtquelle 12' werden durch eine Fused-Silica-Stablinse 30 gesammelt
und durch ein Wellenlängenfilter 13 in
ein Linienbild auf dem Kapillararray 14 fokussiert, das
in dieser Ansicht von der Seite betrachtet wird. Ein Abschnitt der
Polyimidschicht wird von dem Bereich, der die Apertur bildet, oder
einer Erfassungsregion 32 jedes Kapillarrohrs 34 entfernt.
Die Maske 38 ermöglicht
Lichtstrahlen, die durch jedes Kapillarlumen 36 (ausführlich in 3 gezeigt)
laufen, photoempfindliche Elemente, d.h. Pixel 42 eines
PDA-Detektors 15,
zu erreichen. Pixel auf halbem Weg zwischen den Kapillaren empfangen
im Wesentlichen kein Licht. Die Austrittsenden der Kapillaren 34 enden
in einem Elektrolytpufferbehälter 40,
der typischerweise auf dem Massepotential der elektrophoretischen
Leistungsversorgung (nicht gezeigt) liegt.
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3 zeigt
das Kapillararray 14 und die Montage- und Maskieranordnung
in größerem Detail. Kapillaren 34 sind
in einem Satz von V-Rillen 44 in einer Montageplatte 46 angeordnet,
die maschinell bearbeitet ist, um Aperturen für das Licht bereitzustellen,
um in die Erfassungsregion 32 zu laufen. In Intervallen,
beispielsweise etwa alle 10 Kapillare, wird eine optische Faser
aus Fused-Silica 48 eingefügt, wobei eine Polyimidschicht
entfernt ist. Diese liefern Bezugskanäle, um zu ermöglichen,
dass die Absorptionsmessungen jedes analytischen Kanals auf Lichtquellenrauschen
und Drift korrigiert werden können.
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Licht
der ausgewählten
Wellenlänge,
das nicht durch die analysierte chemische Probe absorbiert wird,
wird durch das Probenarray 14 laufen und auf photoempfindliche
Elemente des PDA-Detektors 15 treffen. Der PDA-Detektor 15 erfasst
die durch das Probenarray 14 laufende Lichtmenge und sammelt eine
entsprechende Ladungsmenge in jedem Element oder Pixel des Detektorarrays 15 an.
Bei dieser veranschaulichenden Ausführungsform wird ein monolithisches
selbstabgetastetes lineares Photodiodenarray von EG&G mit 512 Elementen
implementiert. Das Detektorarray 15 wird vollständiger in
den EG&G RETICON
T Series Solid State Line Scanners Application Notes beschrieben,
die hier durch Bezug aufgenommen sind. Eine an jedem Sensorelement
angesammelte Ladung wird sequentiell auf die Ausgangsvideoleitung 16 verschoben,
wenn ein Verschiebungssteuersignal über eine Leitung 17 von
einem Taktgeber 18 empfangen wird.
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Die
serielle Ladungsausgabe wird an einen Verstärker 19 geliefert,
der die Magnitude des Signals auf einen auswertbaren Pegel erhöht. Die
Ausgabe des Verstärkers 19 wird
dann an einen A/D-Wandler 20 zum Umwandeln des Analogsignals in
ein Digitalsignal geliefert.
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Das
von dem A/D-Wandler 20 ausgegebene Digitalsignal wird an
eine bekannte Signalverarbeitungsschaltungsanordnung 21 (wie
beispielsweise ein DSP-Chip) geliefert, die Verarbeitungsfunktionen an
den Daten, wie beispielsweise Zeitmittelwertbildung und Verringern
der Anzahl von Daten-Samples, durchführt. Der
Taktgeber 18, der den PDA-Detektor 15 steuert,
liefert ebenfalls ein Zeitsteuersignal an die Signalverarbeitungsschaltungsanordnung 21.
Die von der Signalverarbeitungsschaltungsanordnung 21 ausgegebenen
verarbeiteten Ergebnisse werden an einen Personal-Computer (PC) 22 oder
eine andere Berechnungsvorrichtung zur Speicherung oder Anzeige
der spektographischen Ergebnissen zur Analyse durch den Wissenschaftler
gesendet.
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Bei
Systemen, bei denen eine Lichtquelle durch einen Wechselstrom betrieben
wird, sodass der Lichtausgang bei der doppelten Wechselstromfrequenz
moduliert wird, gibt es keine Beziehung zwischen der Lichtquellenfrequenz
und dem Photodetektortaktgeber. Ohne Korrektur kann ein Pixel eine geringfügig unterschiedliche
Anzahl von Lichtzyklen von einer Ladungsansammlungszeitspanne zu
der nächsten
sehen. Dies wird zu einer Änderung
in dem Ausgangssignal führen,
obwohl die durchschnittliche Leistung des auf den Detektor fallenden
Lichts unverändert
ist. Demgemäß wird die
Instrumentengrundlinie verrauscht sein. Im schlimmsten Fall kann,
wenn die Lichtquelle und die PDA-Frequenzen gleichphasig und gegenphasig
zueinander driften, die Grundlinie durch Schwebungen niedrigerer
Frequenz ernsthaft verfälscht
sein.
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Somit
wird in Übereinstimmung
mit der Erfindung die Frequenz der Leistungsversorgung der Wechselstromlichtquelle
auf den PDA-Takt verriegelt, so dass jedes Pixel die gleiche Anzahl
von Lichtquellenzyklen einschließlich irgendwelcher Teilzyklen am
Anfang und Ende der Belichtungszeitspanne sehen wird. Der Taktgeber 18,
der das Verschiebungssteuersignal an das PDA-Detektorarray 15 über eine elektrische
Leitung 17 liefert, liefert ebenfalls ein Steuersignal
an die schaltende Leistungsversorgung 10 über eine
weitere elektrische Leitung 23. Der Taktgeber 18 liefert
diese beiden Steuersignale mit der gleichen Frequenz. Daher werden
sowohl die schaltende Leistungsversorgung 10 als auch das
PDA-Detektorarray 15 mit der gleichen Frequenz betrieben. Dies
verbessert die Detektorsignalgrundlinienstabilität deutlich.
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Es
ist jedoch ersichtlich, dass bei bestimmten Anwendungen und Konfigurationen
die Frequenz der Lichtquellenleistungsversorgung und die Frequenz,
bei der das PDA betrieben wird, genaue Vielfache voneinander sein
können.
Alternativ können die
beiden Frequenzen ausgewählt
werden, sodass die Differenz dazwischen keine Schwingungen niedrigerer
Frequenz gewährleistet.
D.h., die Frequenz der harmonisch induzierten Verzerrung liegt außerhalb
der Bandbreite des Systems.
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Im
Betrieb liefert die veranschaulichte Ausführungsform der Erfindung eine
parallele Mehrfach-CE-Vorrichtung, bei der eine einzelne Wechselstrom-Quecksilberlampe
die Reihe von 48 Kapillarrohren mit einer einzelnen Wellenlänge, beispielsweise
254 nm, beleuchtet. Das Photodiodenarray mit 512 Elementen, das
hinter den Kapillarrohren positioniert ist, misst das durch jedes
Kapillarlumen laufende Licht. Mehrere benachbarte Photodiodenelemente
sammeln Licht von einer jeweiligen Kapillare, und ihre Ausgaben
werden zusammen summiert, um eines der parallelen Elektropherogramme
zu bilden, das der jeweiligen Kapillare zugeordnet ist.
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Die
einzelnen Photodioden in dem PDA 15 sammeln Ladung für eine feste
Zeitspanne an, bevor die Ladung zu einem seriellen Ausgangsport
transferiert wird. Danach wird die Ladung verstärkt und A/D-gewandelt, um die
Messung bereitzustellen. Bei dem veranschaulichten Photodiodenarraydetektor beträgt die Steuertaktfrequenz
50 kHz, und eines der Diodenelemente wird gelesen und zurückgesetzt,
um die Ladungsansammlung erneut alle 20 Mikrosekunden zu beginnen.
Somit wird der 512-Element-Detektor
vollständig
abgetastet und in etwas über
10 Millisekunden zurückgesetzt.
Das Array wird erneut nach einer Verzögerung abgetastet, um zu ermöglichen, dass
Ladungsansammlung auftritt. Optimalerweise wird die Zeitverzögerung für die Pixel
gewählt,
die den meisten Photostrom erzeugen, um eine Ladung nahe bei jedoch
unter der Sättigung
zu erfassen. Es ist bedeutsam anzumerken, dass bei einer verwandten
Reihe von Messungen (z.B. für
die Zeitspanne einer CE-Trennung) die Zeitverzögerung die gleiche ganze Zahl
von Taktzyklen ist, damit sich die Ansammlungszeit nicht von Abtastung
zu Abtastung verändert.
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In
den meisten Fällen,
in denen eine mit Wechselstrom betriebenen Bogenlampe verwendet wird,
wird der Photodetektor das Lichtsignal kontinuierlich mit einer
Zeitkonstante messen, die verglichen mit der Lampenleistungsversorgungsfrequenz
sehr lang ist. Dies wird die Lampenfluktuationszyklen effektiv mitteln,
um eine konstante Ausgabe zu geben.
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Eine
weitere Funktionsdarstellung der Ausführungsform eines erfindungsgemäßen parallelen Mehrfach-Kapillarelektrophoresesystem
wird in 4 gezeigt. Der selbstabgetastete
Photodiodenarraydetektor 15, der ausführlicher in 2 und 3 dargestellt
ist, wird diagrammartig als ein Modul 60 in 4 dargestellt.
Die einzelnen Kapillaren 34 des Kapillararrays 14 werden
an einem Probeneinführungsende 62 mit
einem Halter 64 getrennt. Lediglich ein Abschnitt des Halters 64 wird
in 4 zwecks Klarheit gezeigt. Ein Austrittsende des
Kapillararrays 14 endet in einem Elektrolytpufferbehälter 40,
der auf Massepotential gehalten wird.
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Beim
Start einer Analyse ist der Halter 64 positioniert, sodass
das Probeneinführungsende 62 der Kapillaren 34 in
(eine) Probe(n) in den einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte 68 eingetaucht
ist. Bei der veranschaulichten Ausführungsform sind 48 Trennungskapillaren 34 in
dem Kapillararray 14 enthalten, und diese können gleichzeitig
die Hälfte
der Vertiefungen in einer Standard-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen
abtasten. Eine hydrostatische Probeneinführung wird auf eine herkömmliche
Art und Weise durch Erhöhen
der Höhe
der Mikrotiterplatte 68 und des Halters 64 über die
des Pufferbehälters 40 für einige
Sekunden bewirkt. Nach der Probeneinführung werden die Mikrotiterplatte 68 und
der Kapillarhalter 64 abgesenkt und die Enden 62 der
Kapillaren 34 in einem laufenden Pufferelektrolyten 70 in
einem Elektrolytbehälter 72 angeordnet.
Der Pegel des Elektrolyten in den Behältern 72 und 40 wird
während
der Trennung konstant gehalten. Eine Hochspannung wird an die Elektrode 74 angelegt,
die den Elektrolyten 70 kontaktiert. Eine positive oder
negative hohe Spannung wird abhängig
von den zu trennenden Arten verwendet.
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Wenn
die Elektrophorese fortschreitet, laufen getrennte Arten durch die
Erfassungsregion 32 der Kapillaren 34 (in 3 dargestellt),
und ein Signal, das dem Licht proportional ist, das durch jede Kapillare übertragen
wird, wird auf eine serielle Art und Weise, beispielsweise alle
15 Mikrosekunden, ausgegeben.
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5 veranschaulicht
ein Daten-Sample, das von einer einzelnen Abtastung (oder einem
Mittelwert mehrerer Abtastungen) des Photodiodenarrays 15 gesammelt
wurde. Jedes Pixel an dem PDA sammelt Photoladung zwischen Abtastungen
an. Wenn die Vorrichtung abgetastet wird, werden alle Ladungspakete
sequentiell auf die Videoleitung (16 in 1)
geschaltet. Die Ladungspakete werden verstärkt und in einen digitalen
Wert umgewandelt. Bei der veranschaulichten Ausführungsform umfasst das PDA
512 Pixel, die in 48 analytische Kanäle 80 aufgeteilt sind,
wobei jeder Kanal einer jeweiligen Kapillare der Trennungskapillaren 34 entspricht.
Außerdem
gibt es bei dieser veranschaulichten Ausführungsform drei Bezugskanäle 82,
die optischen Referenz- oder
Bezugswegen 48 entsprechen (3). Ein
optischer Bezugsweg ist in der Mitte und einer nahe jedem Ende des
Arrays angeordnet. 5 veranschaulicht eine graphische
Darstellung des rohen Signals It oder It(ref) (wie hier nachstehend erläutert) für jedes
Pixel in dem Array.
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Eine
Gruppe von 7 oder 8 Pixeln empfängt Licht,
das einem Kanal entspricht, und es gibt zwei oder drei Pixel zwischen
Kanälen,
die sehr wenig Licht empfangen und deren Signale ignoriert werden.
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Um
die Signalverarbeitung leichter zu verstehen, die benötigt wird,
um Absorption in einem analytischen Kanal zu berechnen, sei ein
einzelnes Pixel (Probenpixel), das Licht durch die Erfassungsregion einer
der Trennungskapillaren empfängt,
und ein Pixel, das Licht durch einen der Bezugskanäle empfängt, betrachtet.
Für die
Zwecke dieser Darstellung ist/sind:
- I1
- das Probenpixelsignal
zurzeit t;
- I0
- das Probenpixelsignal
zurzeit Null (dem Start einer Trennung);
- Id
- ist das Dunkelsignal,
das gemessen wird, wenn die Lampe aus oder ihr Licht blockiert ist.
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It(ref), I0(ref),
Id(ref) analoge Signale von dem Bezugspixel.
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Die
Absorption wird berechnet aus: A = log10{[I0 – Id)/(It – Id)][It(ref) – Id(ref)/(I0(ref) – Id(ref)]}
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Der
Zweck der Bezugskanäle
besteht darin, Änderungen
in der Lichtquellenausgabe während
eines Trennungslaufes zu kompensieren. Der zweite Quotient in dem
obigen Ausdruck modifizierte den I0 Wert,
um derartige Fluktuationen zu korrigieren, die ansonsten das Rauschen
und den Drift an der Grundlinie erhöhen würden.
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In
der Praxis werden Signale von Pixeln, die der gleichen Trennung
oder dem Bezugskanal entsprechen, kombiniert, um dem Rauschabstand
der analytischen Messung zu verbessern.
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Der
zeitliche Verlauf der Absorption für jeden Trennungskanal ist
das gewünschte
Elektropherogramm und enthält
die gewünschte
analytische Information.
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Es
ist ersichtlich, dass weitere Trennungskanäle, außer den diskreten Kapillaren,
in einem Array implementiert werden können, um das erfindungsgemäße Trennungssystem
auszuführen. 6 und 6a veranschaulichen,
dass Trennungskanäle
alternativ als geätzte
Kanäle 90 in
einer Planaren Struktur 88 implementiert werden können. Eine
geätzte
Silikaplatte 92 ist an einem Silikasubstrat 94 gebondet,
um eine Struktur 88 zu bilden, die für parallele Trennungen durch
Elektrophorese geeignet ist. Proben werden in Vertiefungen 96 und
Pufferelektroden in Vertiefungen 98 und 100 eingeführt. Eine
Probeninjektion wird durch kurzzeitiges paralleles Anlegen einer
Spannung Vin an alle Probenvertiefungen bewirkt.
Die Trennung wird durch Anlegen der Hochspannung (+/– HV) zwischen
den Elektrolytvertiefungen bewirkt. Eine Lichtquelle und ein Arrayphotodetektor
der Erfindung 60 werden verwendet, um Probenabsorption
zu messen. Licht wird am Laufen zwischen Trennungskanälen gehindert,
indem ein lichtundurchlässiges
Material auf eine der Silikaplatten benachbart zu den Kanälen vor
dem Bonden angeordnet wird. Geeignete Öffnungen in der Maske können verwendet
werden, um Bezugskanäle
zu erzeugen.
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Obwohl
bei der hier zuvor beschriebenen Vorrichtung Licht von einer einzelnen
Quelle durch ein Wellenlängenfilter
läuft,
um auf eine Mehrzahl von Kapillaren zu treffen, ist ersichtlich,
dass die Konfiguration ebenfalls Optik als Teil des Wellenlängenfilters
oder auf andere Weise umfassen kann, um Lichtstrahlen von der einzelnen
Quelle genauer auf das Array von Kapillaren zu fokussieren. Die
Optik kann verwendet werden, um das Array von Kapillaren auf eine
Maske oder auf das PDA abzubilden.
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Obwohl
das bei der veranschaulichten Ausführungsform beschriebene, erfindungsgemäße Kapillararray
mit 48 Kapillaren implementiert ist, ist ersichtlich, dass eine
geringere oder größere Anzahl von
parallelen Trennungen in der biegsamen einzelnen Lichtquelle/Detektorarray-Konfiguration bewirkt werden
können.
Außerdem
ist ersichtlich, dass eine einzelne Lichtquelle in Verbindung mit
gegenüberliegenden
PDAs verwendet werden kann, die jeweils ein Array von parallelen
Kapillaren aufweisen, die zwischen dem Licht und einem jeweiligen
PDA angeordnet sind, um eine Doppelarrayimplementierung zu bewirken.
Bei einer derartigen Implementierung können alle 96 Vertiefungen in
einer Standardmikrotiterplatte gleichzeitig analysiert werden.
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Auf ähnliche
Weise ist ersichtlich, dass das Kapillararray mit einer größeren oder
kleineren Anzahl dazwischen angeordneter Bezugskanäle, wie beispielsweise
in Intervallen angeordnete optische Fasern, implementiert sein kann,
um einen Rückkopplungsmechanismus
zum Überwachen
und Einstellen von Lampenfluktuationen zu bewirken, und dass die Fasern,
obwohl sie hier parallel zu den Kapillaren angeordnet dargestellt
sind, alternativ beispielsweise senkrecht angeordnet, orientiert
sein können,
um Licht zu sammeln.
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Obwohl
die hier zuvor beschriebene veranschaulichte Ausführungsform
ein selbstabgetastetes EG&G-Photodiodenarray
mit 512 Pixeln verwendet, um das durch das Kapillararray des Subjekts
laufende Licht zu erfassen, sollte ersichtlich sein, dass Detektorvorrichtungen
von EG&G oder
von anderen Herstellern mit höherer
oder niedriger Auflösung
implementiert werden können.
Beispielsweise umfasst ein linearer Bildsensor S3904 von Hamamatsu
1024 Pixel, die jeweils 25 Mikrometer breit sind. Auf ähnliche
Weise können
alternative Photoerfassungsmechanismen, wie beispielsweise Ladungskopplungsvorrichtungen
(CCD = Charge Coupled Devices), Ladungsinjektionsvorrichtungen (CID
= Charge Injection Devices) oder dergleichen, implementiert werden.
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Außerdem sollte
ersichtlich sein, obwohl die hier zuvor beschriebene Ausführungsform
sich auf eine Lichtquelle einer einzelnen Wellenlänge und
einen Arraydetektor für
parallele CE-Trennungen mit mehreren Kapillaren bezieht, dass die
einzelne Lichtquelle/Detektor-Kombination auf ähnliche Weise bei anderen Anwendungen,
einschließlich
mehrfachen Trennungskanälen,
die in Glas oder Siliziumsubstrat geätzt sind; elektrokinetische
Chromatographie in einem parallelen Mehrfach-Trennungsformat (z.B. mehrere
elektroosmotisch gepumpte mobile Phasen mit jeweilig gepackten Betten,
oder äquivalent
mikromaschinell angefertigte Spalten); parallele Mehrfach-Kapillarflüssigkeitschromatographiesysteme oder
dergleichen verwendet werden können.
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Äquivalente
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Ein
Fachmann wird ohne weiteres oder lediglich mit Routineversuchen Äquivalente
zu den spezifischen Ausführungsformen
der spezifisch hier beschriebenen Erfindung erkennen. Derartige Äquivalente
sind bestimmt, in dem Schutzumfang der folgenden Ansprüche eingeschlossen
zu sein.