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1. EINFÜHRUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung,
die eine biokompatible Matrix umfasst, die DNA-Moleküle zur Herstellung
eines Arzneimittels für
die Verwendung zur Regulation der Angiogenese, besonders zur Förderung
der Blutgefäßbildung
oder zur Hemmung der Blutgefäßbildung
enthält.
Es basiert auf der Präsentation
und der direkten Übertragung
von DNA, die für ein
entsprechendes therapeutisches Agens kodiert, in Säugetierreparaturzellen.
Reparaturzellen, die normalerweise lebendem Gewebe, das eine Wunde umgibt,
entstammen, proliferieren und migrieren in die genaktivierte Matrix,
wo sie zusammentreffen, DNA aufnehmen und exprimieren. Transfizierte
Reparaturzellen agieren daher als in situ-Bioreaktoren (lokalisiert
innerhalb der Wundstelle), die Agenzien herstellen (DNA, die für RNA's, Proteine, etc.
kodiert), die die gewünschte
therapeutische Wirkung haben.
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2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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2.1 WUNDHEILUNG
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Derzeit
verfügbare
Wundheilungstherapien schließen
das Verabreichen von therapeutischen Proteinen ein. Solche therapeutischen
Proteine können
regulatorische Faktoren, die beim normalen Heilungsprozess eingeschlossen
sind, wie zum Beispiel systemische Hormone, Cytokine, Wachstumsfaktoren
und andere Proteine, welche die Proliferation und Differenzierung
der Zellen regulieren, einschließen. Wachstumsfaktoren, Cytokine
und Hormone von denen berichtet wurde, dass sie solche Kapazitäten zur Wundheilung
aufweisen, schließen
zum Beispiel die transformierende Wachstumsfaktor-β-Superfamilie (TGF-β) von Proteinen
(Cox, D. A., 1995, Cell Biology International, 19: 357–371), den
sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) (Slavin, J., 1995, Cell
Biology International, 19: 431–444),
den Makrophagen koloniestimulierender Faktor (Macrophage-Colony
Stimulating Factor, M-CSF) und calciumregulierende Agenzien, wie
zum Beispiel das Parathyroidhormon (PTH), ein.
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Eine
Vielzahl von Problemen ist mit der Verwendung von therapeutischen
Proteinen, d.h. Cytokinen, bei Therapien zur Wundheilung verbunden.
Als erstes ist die Reinigung und/oder rekombinante Herstellung von
therapeutischen Proteinen häufig
ein teures und zeitraubendes Verfahren. Trotz der größten Mühen sind
gereinigte Proteinzubereitungen jedoch häufig instabil, was die Lagerung
und Verwendung mühsam
macht, und die Proteininstabilität
kann zu unerwarteten Entzündungsreaktionen
(Blutproteinabbauprodukten) führen,
die für
den Wirt toxisch sind.
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Als
Zweites kann die systemische Abgabe von therapeutischen Proteinen,
d.h. Cytokinen, mit ernsten, unerwünschten Nebenwirkungen im nicht verwundeten
Gewebe verbunden sein. Infolge der ineffizienten Abgabe an spezifische
Zellen und Gewebe im Körper
ist die Verabreichung von hohen Dosen an Protein erforderlich, um
sicherzustellen, dass ausreichende Mengen des Proteins das dazugehörige Zielgewebe
erreichen. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit im Körper infolge
des proteolytischen Abbaus, müssen
die Proteine auch wiederholt verabreicht werden, was zu einer Immunreaktion
gegen die therapeutischen Proteine führen kann. Die Zirkulation
hoher Dosen an therapeutischen Proteinen ist infolge von pleiotropen
Wirkungen des verabreichten Proteins häufig toxisch und kann zu ernsten
Nebenwirkungen führen.
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Als
Drittes ist die exogene Abgabe von rekombinanten Proteinen ineffizient.
Es sind Versuche angestellt worden, durch Immobilisation von therapeutischem
Protein an der Zielstelle, das Verabreichen von großen Proteinmengen
zu begrenzen. Dieser therapeutische Versuch kompliziert jedoch die Widerverabreichung
des Proteins für
ein wiederholtes Zumessen.
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Als
Viertes hängt
für verschiedene
Proteine, wie zum Beispiel Membranrezeptoren, Transkriptionsfaktoren
und intrazelluläre
Bindungsproteine, die biologische Aktivität von der richtigen Expression
und Lokalisation in der Zelle ab. Bei vielen Proteinen findet die
richtige zelluläre
Lokalisation statt, wenn das Protein innerhalb der Zelle posttranslational
modifiziert wird. Daher können
solche Proteine exogen nicht auf solche Weise verabreicht werden,
wie sie innerhalb der Zelle aufgenommen und ordnungsgemäß lokalisiert
werden.
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Wie
diese Probleme bestätigen,
leiden die gegenwärtigen
Therapien mit rekombinanten Proteinen zur Wundheilung an Mängeln, da
sie kein rationales Verfahren zur Abgabe von exogenen Proteinen darstellen.
Diese Proteine, d.h. Cytokine, werden normalerweise an ihrer Wirkstelle
in physiologischen Mengen hergestellt und wirksam an Signalrezeptoren
an der Zelloberfläche
abgegeben.
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2.2. GENTHERAPIE
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Die
Gentherapie wurde ursprünglich
als eine spezifische Genaustauschtherapie zur Korrektur von erblichen
Defekten erdacht, um funktionelle, aktive, therapeutische Gene in
Zielzellen abzugeben. Anfängliche
Bestrebungen in Richtung somatischer Gentherapie waren auf indirekte
Mittel zum Einführen von
Genen in Gewebe angewiesen, ex vivo Gentherapie genannt, z.B. werden
Zielzellen aus dem Körper entfernt,
mit Vektoren, die rekombinante Gene tragen, transfiziert oder infiziert
und in den Körper
reimplantiert („autologe
Zellübertragung"). Verschiedene Transfektionstechniken
sind gegenwärtig
verfügbar
und werden zur Übertragung
von DNA in vitro in Zellen verwendet; einschließlich der Calciumphosphat-DNA-Präzipitation,
der DEAE-Dextrantransfektion, der Elektroporation, der Liposomen
vermittelten DNA-Übertragung
oder der Transduktion mit rekombinanten viralen Vektoren. Solche
ex vivo Behandlungsprotokolle sind vorgeschlagen worden, um DNA in
verschiedene unterschiedliche Zelltypen, die Epithelzellen (US-Patent
4,868,116; Morgan und Mulligan WO87/00201; Morgan et al., 1987,
Science 237: 1476–1479;
Morgan und Mulligan; US-Patent
Nr. 4,980,286), Endothelzellen (WO89/05345), Hepatocyten (WO89/07136;
Wolff et al., 1987; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3344–3348; Ledley
et al., 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 5335–5339; Wilson und Mulligan,
WO89/07136; Wilson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 8437–8441),
Fibroblasten (Palmer et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1055–1059; Anson
et al., 1987, Mol. Biol. Med. 4: 11–20; Rosenberg et al., 1988,
Science 242: 1575–1578;
Naughton & Naughton,
U.S. Patent 4,963,489), Lymphozyten (Anderson et al., U.S. Patent
Nr. 5,399,346; Blaese, R. M. et al., 1995, Science 270: 475–480) und
hämopoetische
Stammzellen (Lim, B. et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8892–8896; Anderson
et al., U.S. Patent Nr. 5,399,346) einschließen, zu übertragen.
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Die
direkte in vivo Genübertragung
ist vor kurzem mit Formulierungen von DNA, die in Liposomen (Ledley
et al., 1987, J. Pediatrics 110: 1) oder in Proteoliposomen, die
virale Hüllrezeptorproteine
enthalten (Nicolau et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:
1068), eingeschlossen sind, und DNA, die mit einem Polylysin-Glycoprotein-Trägerkomplex verbunden
ist, versucht worden. Zusätzlich
hat man „Genkanonen" für die Genabgabe
in Zellen verwendet (Australisches Patent Nr. 9068389). Es wurde
sogar spekuliert, dass nackte DNA oder DNA, die mit Liposomen verbunden
ist, in flüssigen
Trägerlösungen für die Injektion
in den interstitiellen Raum zur Übertragung
von DNA in Zellen (Felgner, WO90/11092) formuliert werden kann.
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Vielleicht
eines der größten Probleme,
das mit den gegenwärtig
ersonnenen Gentherapien ob ex vivo oder in vivo verbunden ist, ist
die Unfähigkeit, DNA
wirksam in eine Zielzellpopulation zu übertragen und ein hohes Expressionsniveau
des Genproduktes in vivo zu erreichen. Virale Vektoren werden als
das wirksamste System erachtet, und rekombinante, replikationsgestörte virale
Vektoren sind verwendet worden, um Zellen sowohl ex vivo als auch
in vivo zu transduzieren (d.h., infizieren). Solche Vektoren beinhalteten
retrovirale-, adenovirale-, und adenoassoziierte- und Herpesvirus
Vektoren. Während sie
bei der Genübertragung
sehr wirksam sind, schließen
die Hauptnachteile, die mit der Verwendung von viralen Vektoren
verbunden sind, die Unfähigkeit
vieler viraler Vektoren, nicht teilende Zellen zu infizieren, Probleme,
die mit der Insertionsmutagenese zusammenhängen, Entzündungsreaktionen gegenüber Viren
und die Herstellung von möglichen Helferviren
und/oder die Produktion und Übertragung von
gesundheitsgefährdenden
Viren auf andere menschliche Patienten, ein.
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Zusätzlich zur
geringen Wirksamkeit der meisten Zelltypen, fremde DNA aufzunehmen
und zu exprimieren, sind viele Zielzellpopulationen in solch geringer
Anzahl im Körper
zu finden, dass die Wirksamkeit der Präsentation der DNA gegenüber den spezifischen
Zielzelltypen sogar noch weiter abnimmt. Zurzeit existiert kein
Protokoll oder Verfahren, um die Wirksamkeit zu erhöhen, mit
der DNA zur Zielzellpopulation gesteuert wird.
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3. ZUSAMMENFASSUNG DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung,
die eine biokompatible Matrix umfasst, die DNA-Moleküle zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Regulation der Angiogenese, besonders zur
Förderung
der Blutgefäßbildung
oder zur Hemmung der Blutgefäßbildung
in Übereinstimmung
mit den Ansprüchen
1, 2 und 3 enthält.
Bevorzugte Ausführungsformen
sind in den abhängigen
Ansprüchen
4 bis 9 offenbart und beansprucht.
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Die
Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, dass Reparaturzellen,
die im Wundheilungsprozess aktiv sind, aus dem umliegenden Gewebe
in den Bereich der Wunde proliferieren und migrieren und die genaktivierte
Matrix infiltrieren. Die Matrix fungiert als ein Gerüst, die
das Zelleinwachsen und dies wiederum den Gentransfer durch die lokale
Ansammlung von Reparaturzellen nahe der DNA fördert. Während sie in der Matrix sind,
sind Reparaturzellen überraschend
wirksam bei der Aufnahme der DNA und bei deren Expression als Translationsprodukte,
d.h. Proteine, oder Transkriptionsprodukte, d.h. Antisense und Ribozyme.
Die transfizierten Reparaturzellen dienen dann als lokale Bioreaktoren, welche
die Produktion des Genprodukts in vivo vervielfachen.
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Während irgendeine
Anzahl von DNA-Sequenzen im Verfahren verwendet werden kann, sind bevorzugte
DNA-Sequenzen solche,
die für
Translationsprodukte (d.h. Proteine) oder Transkriptionsprodukte
(d.h. Antisense oder Ribozyme) kodieren, die (a) die Gewebereparatur
fördern;
oder (b) einen Erkrankungsprozess stören können (wodurch die normale Gewebsheilung
stattfinden kann).
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Die
Erfindung überwindet
die Mängel
der Verfahren, die derzeit zur Wundheilung verwendet werden, einschließlich der
Verabreichung der therapeutischen Proteine. Als erstes kann DNA,
die sowohl stabil als auch nicht toxisch ist, sicher in hohen Dosen
in vivo verabreicht werden. Als zweites ist die wiederholte Verabreichung,
obwohl möglich,
nicht erforderlich. Die Zellen, welche die DNA aufnehmen und exprimieren,
ermöglichen
eine Versorgung mit dem Genprodukt an der Wundstelle. Als drittes
kann die Erfindung auf eine Weise praktiziert werden, die die zeitlichen
Anforderungen der Dosierung berücksichtigt.
Zum Beispiel kann die DNA in Vektoren präsentiert werden, die in das
Genom der Zielzelle integrieren. In diesem Fall werden alle Tochterzellen
die übertragene
DNA enthalten und exprimieren, wodurch sie als fortwährende Quelle
für das
therapeutische Agens fungieren. Im Gegensatz dazu können nicht
integrierende Systeme verwendet werden, wobei die DNA sich nicht
in das Genom integriert und das Gen nicht an die Tochterzellen weitergegeben wird.
In einem solchen Beispiel wird, wenn der Wundheilungsprozess beendet
ist und das Genprodukt nicht länger
benötigt
wird, das Genprodukt nicht länger
exprimiert.
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Die
Erfindung wird anhand von Beispielen dargestellt, die zeigen, das
Gene in verschiedenen verwundeten Weich- und Hartgeweben in vivo
reproduzierbar übertragen
und exprimiert werden können. Es
wird besonders gezeigt, dass das Verfahren der Erfindung die Probleme,
die mit derzeit verfügbaren Gentherapieprotokollen
verbunden werden, überwindet.
Das Verfahren der Erfindung ermöglicht
eine Genübertragung
auf eine geeignete Anzahl von Reparaturzellen, um funktionelle Wirkungen
zu erzielen, d.h. in Abwesenheit irgendeiner weiteren Steuerung oder
zellulären
Identifikation durch den Fachmann. Die in vivo Verfahren zur Gentherapie
erfordern irgendeine Form der Steuerung, die sehr häufig nicht funktioniert.
Im Verfahren der Erfindung ist die Steuerung kein Problem. Als Analogie
betrachtet, fungiert die DNA ähnlich
einem „Köder" in einer „Falle": die DNA trifft
unwissentlich auf Reparaturzellen, die sich proliferiert haben und
dann in die genaktivierte Matrix migriert sind. Diese Zellen sind
wiederum überraschenderweise
dazu in der Lage, DNA aufzunehmen und sie als ein therapeutisches
Agens zu exprimieren.
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Das
Verfahren kann als ein Arzneimittelabgabesystem bis einschließlich der Übertragung
von DNA in Säugetierreparaturzellen
zum Zwecke der Stimulierung der Weich- und Hartgewebereparatur und
Geweberegeneration verwendet werden. Die Reparaturzellen werden
solche Zellen sein, die sich normalerweise im zu behandelnden Wundbereich einfinden.
Demgemäß gibt es
keine Schwierigkeit, die mit dem Erhalt von geeigneten Zielzellen,
an die die vorliegenden therapeutischen Zusammensetzungen verabreicht
werden sollen, in Verbindung steht. Alles, was erforderlich ist,
ist die Implantation einer genaktivierten Matrix an der Wundstelle.
Die Natur dieser biologischen Umgebung ist dergestalt, dass die
geeigneten Reparaturzellen die „Köder"-DNA in Abwesenheit irgendeiner weiteren
Steuerung oder zellulären
Identifikation durch den Fachmann aktiv aufnehmen und exprimieren
werden.
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Die
Erfindung, die sowohl biologische als auch synthetische Matrizes
verwendet, kann verwendet werden, um DNA in Säugetierreparaturzellen zu übertragen,
um die Blutgefäßreparatur
zu stimulieren.
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Die
im Verfahren der Erfindung zu verwendende DNA kann jede DNA einschließen, die
für Translationsprodukte
(d.h. Proteine) oder Transkriptionsprodukte (d.h. Antisense oder
Ribozyme) kodiert, welche die Gewebereparatur fördert oder einen Entzündungsprozess
stören
kann. Zum Beispiel kann die DNA Gene umfassen, die für therapeutisch
verwendbare Proteine, wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren, Cytokine,
Hormone, etc. kodieren. Zusätzlich kann
die DNA für
Antisense- oder Ribozym-Moleküle kodieren,
die die Translation von mRNA's
hemmen, die für
Proteine kodieren, welche die Wundheilung hemmen oder eine Entzündung induzieren.
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Die
DNA, die für
das entsprechende therapeutische Produkt kodiert, ist mit einer
Matrix verbunden oder innerhalb einer Matrix imprägniert,
um eine genaktivierte Matrix zu bilden. Sobald sie einmal hergestellt
ist, wird die genaktivierte Matrix innerhalb des Säugetiers
an der Wundstelle eingebracht.
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Die
Erfindung wird anhand von Beispielen dargestellt, wobei die wirksame
in vivo Übertragung und
Expression der Gene in/im Gewebe, das eine Reparatur und Regeneration
durchläuft,
dargestellt wird.
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3.1 DEFINITIONEN
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Wie
hierin verwendet, werden die folgenden Begriffe die weiter unten
angegebenen Bedeutungen haben.
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Eine
genaktivierte Matrix (GAM) wird hierin als irgendein Matrixmaterial
definiert, das DNA enthält,
die für
ein entsprechendes therapeutisches Agens kodiert. Zum Beispiel werden
genaktivierte Matrizes innerhalb von Wundstellen im Körper eines Säugetierwirtes
eingebracht, um die Wundheilung zu verstärken.
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Eine
Reparaturzelle wird hierin als irgendeine Zelle definiert, die stimuliert
wird, um als Reaktion auf eine Gewebsverletzung zu migrieren und
zu proliferieren. Reparaturzellen sind eine Komponente der Wundheilungsreaktion.
Solche Zellen schließen
Fibroblasten, Kapillarendothelzellen, Kapillarperizyten, mononukleäre Entzündungszellen,
segmentierte Entzündungszellen
und Granulationsgewebezellen ein.
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Eine
Wundstelle ist als irgendein Ort im Wirt definiert, der sich aus
einer traumatischen Gewebsverletzung ergibt oder alternativ dazu
aus einem Gewebeschaden, der eine Folge von chirurgischen Verfahren
ist oder durch sie induziert wurde.
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4. BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die
Figuren zeigen schematische Beispiele von DNA-Konstrukten, wie sie in Zusammensetzungen
für die
Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung zur Regulation
von Angiogenese verwendet werden können.
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1.
Schematisches Diagramm des pGAM1-Konstruktes,
das für
Mäuse BMP-4
kodiert. Die Position des CMV-Promotors, der BMP-4 kodierenden Sequenz,
des HA-Epitops und des Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignals
werden gezeigt.
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2 Schematisches
Diagramm des pGAM2-Konstruktes,
das für
humanes PTH1-34 kodiert. Die Position einer stromaufwärts liegenden
langen terminalen Wiederholung, die die PTH1-34-Expression (Pfeil)
steuert, die PTH1-34 kodierende Sequenz, der SV40-Promotor, der
die Neo-Expression (Pfeil) steuert, die Neo kodierende Sequenz,
die pBR-Sequenzen,
und die stromabwärts
liegende lange terminale Wiederholung werden gezeigt.
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5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung,
die eine biokompatible Matrix umfasst, die ein oder mehrere DNA-Moleküle enthält, die
für therapeutische
Proteine, Antisense- oder Ribozym-Moleküle kodieren, wobei die Matrix
als ein Gerüst
fungiert, das die Infiltration von Zellen für die Herstellung von Arzneimitteln für die Verwendung
zur Regulation der Angiogenese, zur Förderung der Blutgefäßbildung
oder Hemmung der Blutgefäßbildung,
fördert.
Angiogenese, Blutgefäßbildung
oder Hemmung der Blutgefäßbildung
sind physiologische Ereignisse, die eine Rolle, inter alia, bei
der Wundheilung spielen.
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Die
Wundheilung ist für
gewöhnlich
eine koordinierte, stereotypisierte Sequenz von Ereignissen, die
(a) den Gewebeabbau und den Verlust der normalen Gewebearchitektur;
(b) die Zellnekrose und Hämorrhagie;
die Hämostase
(Gerinselbildung); (c) die Infiltration von segmentierten und mononukleären Entzündungszellen
mit Gefäßkongestion
und Gewebeödem;
(d) das Auflösen
des Gerinsels als auch beschädigter
Zellen und Geweben durch mononukleäre Zellen (Makrophagen); (e)
die Bildung von Granulationsgewebe (Fibroplasie und Angiogenese)
einschließt.
Diese Sequenz zellulärer
Ereignisse ist in Wunden aller Gewebe und Organe, die in einer großen Anzahl
von Säugetierspezies
erzeugt werden, beobachtet worden (Gailet et al., 1994, Curr. Opin. Cell.
Biol. 6: 717–725).
Daher ist die oben beschriebene zelluläre Sequenz ein universeller
Aspekt der Reparatur aller Säugetiergewebe.
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Die
Erfindung basiert auf der Entdeckung, das Reparaturzellen, die am
Wundheilungsprozess beteiligt sind, natürlicherweise an die Stelle
der Gewebsverletzung proliferieren und migrieren werden und die
genaktivierte Matrix infiltrieren werden. Überraschenderweise sind diese
Reparaturzellen, die sich für
gewöhnlich
schwierig wirksam transfizieren lassen, entweder in vitro oder in
vivo, extrem wirksam bei der Aufnahme und Expression von DNA, wenn sie
durch den Wundheilungsprozess zur Proliferation aktiviert werden.
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Den
Vorteil dieses Merkmals ausnutzend, ist die vorliegende Erfindung
so ausgestaltet, dass sie ein oder mehrere DNA-Moleküle, die
für therapeutische
Agenzien kodieren, wirksam auf die proliferierenden Reparaturzellen übertragen.
Die aktivierte Matrix, die DNA enthält, die für Translationsprodukte (d.h.
therapeutische Proteine) oder Transkriptionsprodukte (d.h. Antisense
oder Ribozyme) kodiert, wird innerhalb eines Säugetierwirtes an der Wundstelle
eingebracht. Die Wunde kann durch eine traumatische Gewebsverletzung,
oder alternativ dazu durch einen Gewebeschaden, der entweder eine
Folge von chirurgischen Verfahren ist oder durch sie induziert wird,
entstehen.
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Während die
proliferierenden Reparaturzellen in eine genaktivierte Matrix migrieren
und diese kontaktieren, nehmen sie die entsprechende DNA auf und
exprimieren sie, wodurch die Menge des therapeutischen Agens, Proteins
oder RNA, vervielfältigt wird.
Die transfizierten Reparaturzellen dienen dabei als örtliche
Bioreaktoren, die therapeutische Agenzien herstellen, die die örtliche
Reparaturumwelt beeinflussen. Zum Beispiel werden Wachstumsfaktoren oder
Cytokine, die durch die transfizierten Reparaturzellen hergestellt
werden, die angesteuerten Effektorzellen, die verwandte Zelloberflächenrezeptoren exprimieren,
binden und stimulieren, wodurch die Kaskade von physiologischen
Ereignissen, die normalerweise mit dem Wundheilungsprozess verbunden
sind, stimuliert und vervielfacht werden.
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Alternativ
dazu können
Reparaturzellen DNA, die für
Proteine kodiert, die die Aktivität von Antagonisten des Wundheilungsprozesses
hemmen, aufnehmen und exprimieren. Die DNA kann auch für Antisense-
oder Ribozym-RNA-Moleküle
kodieren, die für
die Hemmung der Translation von mRNA's, die für Entzündungsproteine oder andere
Faktoren kodieren, die die Wundheilung hemmen oder eine exzessive
Fibrose verursachen, verwendet werden.
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Die
genaktivierte Matrix, die in Übereinstimmung
mit der Erfindung verwendet wird, kann mittels verschiedener Techniken
auf den Patienten übertragen
werden. Zum Beispiel werden, wenn die Wundheilung und Regeneration
stimuliert wird, die Matrizes direkt an die Wundstelle, d.h. des
frakturierten Knochens, des beschädigten Bindegewebes, etc., übertragen.
Für die
Verwendung bei der Hautreparatur werden die Matrizes topisch verabreicht.
Für die Verwendung
bei der Organregeneration werden die Matrizes chirurgisch in eine
in einem Organ erzeugte Wunde eingebracht.
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Da
die Erfindung auf der natürlichen
Migration und Proliferation von Reparaturzellen in einer Wundstelle
und der Infiltration in die genaktivierte Matrix, die an der Wundstelle
lokalisiert ist, gefolgt von der Aufnahme der DNA basiert, wird
verständlich,
dass die Matrizes an eine Stelle im Körper übertragen werden müssen, an
der der Wundheilungsprozess induziert worden ist.
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Ein
besonders wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, dass
der Reparaturprozess manipuliert werden kann, um entweder zur Bildung von
Narbengewebe und/oder zur Geweberegeneration zu führen. Zum
Beispiel kann die Überexpression der
therapeutischen Proteine an der Wundstelle zur Regeneration des
verletzten Gewebes führen,
ohne die Bildung von Narbengewebe. In vielen Fällen, zum Beispiel bei der
Knochenreparatur, ist eine solche Regeneration wünschenswert, da Narbengewebe nicht
optimal strukturiert ist, um normale mechanische Funktionen zu unterstützen. Alternativ
dazu kann es um eine Narbe herum wünschenswert sein, Narbengewebe
zu bilden, um inhärent
schwaches Gewebe zusammenzuhalten. Daher können die Verfahren der Erfindung
verwendet werden, um die Wundheilung entweder mit oder ohne die
Bildung von Narbengewebe abhängig
vom Typ und dem Niveau des exprimierten therapeutischen Proteins
zu stimulieren.
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Die
direkte Plasmid-DNA-Übertragung
aus einer Matrix in eine Säugetierreparaturzelle
durch Stimulation des Wundheilungsprozesses bietet eine Vielzahl
von Vorteilen. Als erstes lässt
sich die Einfachheit der Herstellung und Reinigung von DNA-Konstrukten
positiv mit den traditionellen Proteinherstellungsverfahrenskosten
vergleichen. Als zweites können
Matrizes als strukturelle Gerüste
fungieren, die in und auf sich selbst den Zelleinwuchs und die Proliferation
fördern.
Daher erleichtern sie das Steuern von Reparaturzellen für die Genübertragung.
Als drittens kann die direkte Genübertragung ein vorteilhaftes
Verfahren zur Arzneimittelabgabe für Moleküle sein, die normalerweise
eine komplexe biosynthetische Prozessierung durchlaufen, oder für Rezeptoren,
die in der zellulären
Membran genau platziert werden müssen.
Diese Molekültypen
würden
nicht funktionieren, wenn sie exogen an die Zellen abgegeben werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von pharmazeutischen
Zusammensetzungen, die Matrizes umfassen, die DNA zur Regulation der
Angiogenese enthalten. Die Zusammensetzungen bestehen im Allgemeinen
aus einem biokompatiblen Matrimaterial, das DNA enthält, die
für ein
entsprechendes therapeutisches Protein kodiert.
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Die
Erfindung überwindet
Mängel,
die mit derzeitigen rekombinanten-Protein-Therapien für Wundheilungsanwendungen
spezifisch zusammenhängen.
Als erstes ist die direkte Genübertragung eine
rationelle Strategie, die es transfizierten Zellen ermöglicht,
(a) physiologische Mengen eines therapeutischen Proteins herzustellen,
das in einer Gewebe- und Kontext-spezifischen Art und Weise modifiziert
wurde und (b) dieses Proteins an den geeigneten Zelloberflächensignalrezeptor
unter den geeigneten Umständen abzugeben.
Aus den oben genannten Gründen
erwartet man, dass die exogene Abgabe solcher Moleküle mit signifikanten
Dosierungs- und Abgabeproblemen verbunden ist. Als zweites ist die
wiederholte Verabreichung, obwohl möglich, mit der genaktivierten
Matrix-Technologie nicht erforderlich: Die Zellaufnahme von DNA
kann mit gut etablierten Langzeitabgabetechnologien präzise kontrolliert werden
oder, alternativ dazu, kann die Integration von transfizierter DNA
mit langfristiger rekombinanter Proteinexpression verbunden werden.
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Die
Erfindung kann universell auf Wunden, die viele verschiedene Zellen,
Gewebe und Organe einschließen,
angewendet werden; die Reparaturzellen des Granulationsgewebes (Gailet
et al., 1994, Curr. Opin. Cell. Biol. 6: 717–725) werden „gesteuert", wenn das Verfahren
der Erfindung verwendet wird. Die Erfindung wird hierin in einem
Tiermodell (Hase) unter Verwendung von alkaliner Phosphatase als
Markergen veranschaulicht.
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5.1 DIE GENAKTIVIERTE
MATRIX
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Jedes
biokompatible Matrixmaterial, das DNA enthält, die für ein entsprechendes therapeutisches
Agens kodiert, wie zum Beispiel ein Translationsprodukt, d.h. therapeutische
Proteine, oder Transkriptionsprodukte, d.h. Antisense oder Ribozyme, kann
in Übereinstimmung
mit der Erfindung formuliert und verwendet werden.
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Die
genaktivierten Matrizes der Erfindung können von jedem biokompatiblen
Material abstammen. Solche Materialien können beinhalten, sind jedoch
nicht begrenzt auf biologisch abbaubare oder nicht biologisch abbaubare
Materialien, die in Gerüste,
die die Zellanbindung und das Wachstum unterstützen, Pulver oder Gele formuliert
werden. Matrizes können
von synthetischen Polymeren oder natürlich auftretenden Proteinen,
wie zum Beispiel Kollagen, anderen extrazellulären Matrixproteinen oder anderen
strukturellen Makromolekülen
abstammen.
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Die
in die Matrix eingebaute DNA kann für alle einer Vielzahl von therapeutischen
Proteinen abhängig
von der gewünschten
therapeutischen Verwendung kodieren. Solche Proteine können Wachstumsfaktoren,
Cytokine, Hormone oder alle anderen Proteine, die das Wachstum,
die Differenzierung oder physiologische Funktion der Zellen regulieren können, einschließen. Die
DNA kann auch für
Antisense- oder Ribozym-Moleküle kodieren,
die die Translation von Proteinen hemmen, die die Wundreparatur
hemmen und/oder eine Entzündung
induzieren.
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Die übertragene
DNA braucht nicht in das Genom der Zielzelle integriert zu werden;
in der Tat ist die Verwendung von nicht integrierender DNA in der
genaktivierten Matrix die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung. Auf diese Weise wird, wenn der Wundheilungsprozess beendet ist
und das Genprodukt nicht länger
benötigt
wird, das Genprodukt nicht exprimiert.
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Therapeutische
Kits, die eine biokompatible Matrix und DNA enthalten, bilden einen
anderen Aspekt der Erfindung. In einigen Fällen werden die Kits vorgefertigte
genaktivierte Matrizes enthalten, die es dem Arzt ermöglichen,
die Matrix innerhalb des Körpers
direkt zu verabreichen. Alternativ dazu können die Kits die Komponenten,
die zur Bildung einer genaktivierten Matrix erforderlich sind, enthalten.
In solchen Fällen
kann der Arzt die Komponenten kombinieren, um die genaktivierten
Matrizes zu bilden, die dann durch Einsetzen innerhalb des Körpers therapeutisch
verwendet werden kann. In einer Ausführungsform der Erfindung können die
Matrizes verwendet werden, um chirurgische Vorrichtungen, wie zum
Beispiel Nahtmaterialien oder Implantate, zu beschichten. In noch
einer anderen Ausführungsform der
Erfindung können
genaktivierte Matrizes Fertigtupfer, Röhrchen, Verbandshilfen, lyophilisierte
Komponenten, Gele, Pflaster, oder Pulver und Telfa-Schutzabdeckungen
einschließen.
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5.1.1 DIE MATRIXMATERIALIEN
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In
einem Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen hergestellt,
in der die DNA, die für das
entsprechende therapeutische Agens kodiert, mit einer Matrix verbunden
ist oder innerhalb einer Matrix imprägniert ist, um eine genaktivierte
Matrix zu bilden. Die Matrixzusammensetzungen fungieren, (i) um
das Einwachsen von Reparaturzellen (Steuerung) zu erleichtern; und
(ii) um DNA aufzunehmen (Abgabe). Sobald die genaktivierte Matrix
einmal hergestellt worden ist, wird sie für die weitere Verwendung gelagert
oder sofort an der Wundstelle eingebracht.
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Der
Matrixtyp, der in den Zusammensetzungen, Vorrichtungen und Verfahren
der Erfindung verwendet werden kann, ist praktisch unbegrenzt und kann
sowohl biologische als auch synthetische Matrizes einschließen. Die
Matrix wird alle Eigenschaften aufweisen, die für gewöhnlich mit „biokompatibel" sein in Verbindung
gebracht werden, insofern sie in einer Form vorliegt, die keine
nachteilige, allergische oder andere ungewollte Reaktion erzeugt,
wenn sie an ein Säugetierwirt
verabreicht wird. Solche Matrizes können sowohl aus natürlichen
als auch aus synthetischen Materialen gebildet werden. Die Matrizes können nicht
biologisch abbaubar sein, in Fällen,
in denen es wünschenswert
ist, dauerhafte Strukturen im Körper
zu hinterlassen; oder biologisch abbaubar, wenn die Expression des
therapeutischen Proteins nur für
einen kurzen Zeitraum erforderlich ist. Die Matrizes können die
Form von Tupfern, Implantaten, Röhrchen, Telfa-Schutzabdeckungen,
Verbandshilfen, Bandagen, Schutzabdeckungen, lyophilisierten Komponenten,
Gelen, Pflastern, Pulvern oder Nanopartikeln annehmen. Zusätzlich können Matrizes
entworfen werden, die eine fortwährende
Abgabe der DNA über
längere
Zeiträume
ermöglicht.
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Die
Wahl des Matrixmaterials wird sich gemäß den besonderen Umständen und
der zu behandelnden Wundstelle ändern.
Matrizes, wie sie im U.S. Patent 5,270,300, das hiermit hierin aufgenommen wird,
beschriebenen werden, können
verwendet werden. Physikalische und chemische Charakteristika, wie
z.B. Biokompatibilität,
biologische Abbaubarkeit, Stärke,
Steifheit, Schnittstelleneigenschaften und sogar kosmetisches Erscheinen,
könnten
bei der Auswahl einer Matrix berücksichtigt
werden, wie dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt ist. Geeignete
Matrizes werden sowohl das DNA-Molekül abgeben, als auch als ein
in situ-Gerüst fungieren, durch
das Säugetierreparaturzellen
migrieren können.
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Wenn
die Matrizes für
ausgedehnte Zeiträume
erhalten bleiben müssen,
können
nichtbiologisch abbaubare Matrizes, wie zum Beispiel gesintertes Hydroxylapatit,
Bioglas, Aluminate, andere biokeramische Materialien und metallische
Materialien, besonders Titan, verwendet werden. Ein geeignetes keramisches
Abgabesystem ist das im U.S. Patent 4,596,574 beschriebene, das
hiermit hierin aufgenommen wird. Die Biokeramiken können in
der Zusammensetzung verändert
werden, wie zum Beispiel in Calcium-Aluminat-Phosphat; und sie können bearbeitet werden, um
bestimmte physikalische und chemische Eigenschaften zu modifizieren,
wie zum Beispiel die Porengröße, die
Partikelgröße, die
Partikelform und die biologische Abbaubarkeit. Polymermatrizen können ebenfalls
verwendet werden, einschließlich
Acrylesterpolymere und Milchsäurepolymere,
wie in den U.S. Patenten 4,521,909 beziehungsweise 4,563,489 offenbart,
die beide hiermit hierin aufgenommen werden. Besondere Beispiele für verwendbare
Polymere sind die von Orthoestern; Anhydriden, Propylen-Cofumaraten
oder ein Polymer eines oder mehrerer γ-Hydroxylcarboxylsäuremonomeren,
z.B. γ-Hydroxylessigsäure (Glycolsäure) und/oder γ-Hydroxylpropionsäure (Milchsäure).
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Ein
besonders wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ihre Verwendung
in Verbindung mit orthopädischen
Implantaten, und Schnittstellen und künstlichen Gelenken, einschließlich eigenen Implantaten
und funktionellen Teilen eines Implantates, wie z.B. chirurgischen
Schrauben, Stiften und ähnlichem.
In bevorzugten Ausführungsformen
wird in Erwägung
gezogen, dass die Metalloberflächen, oder
Oberflächen
eines Implantates oder eines Teiles davon, wie zum Beispiel einer
Titanoberfläche,
mit einem Material beschichtet werden, das eine Affinität für Nukleinsäuren aufweist,
am meisten bevorzugt mit Hydroxylapatit, und dann wird das beschichtete Metall
weiter mit dem Gen oder der Nukleinsäure, das man zu übertragen
wünscht,
beschichtet. Die verfügbaren
chemischen Gruppen des absorbierenden Materials, wie zum Beispiel
Hydroxylapatit, können
bereits manipuliert sein, um seine Affinität für Nukleinsäuren zu kontrollieren, wie
es dem Fachmann auf diesem Gebiet bereits bekannt ist.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
wird in Erwägung
gezogen, dass eine biologisch abbaubare Matrix wahrscheinlich am
nützlichsten
sein wird. Eine biologische abbaubare Matrix wird im Allgemeinen als
eine Matrix definiert, die vom Körper
resorbiert werden kann: Mögliche
biologische abbaubare Matrizes für
die Verwendung in Verbindung mit den Zusammensetzungen, Vorrichtungen
und Verfahren dieser Erfindung schließen zum Beispiel biologisch abbaubare
und chemisch definiertes Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxylapatit,
Polymilchsäure, Polyanhydride,
Matrizes von gereinigten Proteinen und halbgereinigte extrazelluläre Matrixzusammensetzungen
ein.
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Andere
biokompatible, biologisch abbaubare Polymere, die verwendet werden
können,
sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen beispielhaft und nicht
begrenzend Polyester, wie zum Beispiel Polyglykolide, Polylaktide
und Polylaktid-Polyglykolsäure-Copolymere
(„PLGA") (Langer und Volkmann,
1976, Nature 263: 797–800);
Polyether, wie zum Beispiel Polycaprolakton („PCL"); Polyanhydride; Polyalkylcyanoacrylate,
wie zum Beispiel n-Butylcyanoacrylat
und Isopropylcyanoacrylat; Polyacrylamide; Poly(orthoester); Polyphosphazene;
Polypeptide; Polyurethane und Mischungen solcher Polymere ein.
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Es
soll deutlich werden, dass praktisch jedes Polymer, das bekannt
ist oder das später
entwickelt werden wird und für
die anhaltende oder kontrollierte Freigabe von Nukleinsäuren geeignet
ist, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
ist das biokompatible biologisch abbaubare Polymer ein Copolymer
der Glykolsäure
und der Milchsäure
(„PLGA") mit einem Verhältnis zwischen
den Milchsäure/Glykolsäureeinheiten,
das von etwa 100/0 bis etwa 25/75 variiert. Das durchschnittliche
Molekulargewicht („MW") des Polymers wird üblicherweise
von etwa 6.000 bis 700.000 und bevorzugt von etwa 30.000 bis 120.000
variieren, wie es die Gelpermeationschromatographie unter Verwendung
von kommerziell erhältlichem
Polystyren mit Standardmolekulargewicht bestimmt, und eine intrinsische
Viskosität
aufweisen, die von 0,5 bis 10,5 variiert.
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Die
Länge des
Zeitraums der ständig
andauernden oder kontrollierten Freigabe von Nukleinsäuren aus
der Matrix gemäß der Erfindung
wird zum großen
Teil vom MW des Polymers und des Zusammensetzungsverhältnisses
von Milchsäure/Glykolsäure abhängen. Im
Allgemeinen wird ein höheres Verhältnis von
Milchsäure/Glykolsäure, wie
zum Beispiel 75/25, für
einen längeren
Zeitraum eine kontrollierte, fortdauernde Freisetzung der Nukleinsäuren ermöglichen,
wohingegen ein niedrigeres Verhältnis von
Milchsäure/Glykolsäure eine
schnellere Freisetzung der Nukleinsäuren ermöglichen wird. Das Milchsäure/Glykolsäure-Verhältnis liegt
bevorzugt bei 50/50.
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Die
Länge des
Zeitraums der fortdauernden oder kontrollierten Freigabe hängt auch
vom MW des Polymers ab. Im Allgemeinen wird ein höheres MW-Polymer
einen längeren
Zeitraum zur kontrollierten oder fortdauernden Freisetzung ermöglichen.
Im Falle der Herstellung, zum Beispiel von Matrizes, die eine kontrollierte
oder fortdauernde Freisetzung für über drei
Monate ermöglichen,
wenn das Zusammensetzungsverhältnis
der Milchsäure/Glykolsäure bei
100/0 liegt, variiert das bevorzugte durchschnittliche MW des Polymers
von etwa 7.000 bis 25.000; wenn 90/10 von etwa 6.000 bis 30.000;
und wenn 80/20 von etwa 12.000 bis 30.000.
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Ein
anderer Biomaterialtyp, der verwendet werden kann, ist die Dünndarmsubmucosa
(SIS). Das SIS-Transplantatmaterial
kann aus einem Segment des Jejunum eines ausgewachsenen Schweines
hergestellt werden. Die Isolation von Gewebeproben kann unter Verwendung
von Routinegewebskulturtechniken, wie den von Badybak et al., 1989,
J. Surg. Res. 47: 74–80
beschriebenen, durchgeführt werden.
Das SIS-Material wird durch das Entfernen von Mesenterialgewebe,
Inversion des Segmentes gefolgt vom Entfernen der Mucosa und der
oberflächlichen
Submucosa mittels einer mechanischen Abschürftechnik hergestellt. Nach
dem Wiedereinsetzen des Segments in seine ursprüngliche Orientierung werden
die Serosa- und Muskelschichten gewaschen und für die weitere Verwendung gelagert.
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Ein
anderes besonderes Beispiel eines geeigneten Materials ist das fibröse Kollagen,
das nach der Extraktion und partiellen Reinigung vom Gewebe und
anschließender
Sterilisierung lyophilisiert werden kann. Matrizes können auch
aus Sehnen oder dermalem Kollagen hergestellt werden, wie man sie von
verschiedenen kommerziellen Quellen, z.B. Sigma und der Collagen
Corporation erhalten kann. Kollagenmatrizes können, wie in den U.S. Patenten 4,394,370
und 4,975,527 beschrieben, wobei beide hiermit hierin aufgenommen
werden, ebenfalls hergestellt werden.
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Zusätzlich können Gitter,
die aus Kollagen und Glycosaminoglycan (GAG) gemacht sind, wie zum
Beispiel dem, das von Yannas & Burke
im U.S. Patent 4,505,266 beschrieben wird, bei der Anwendung der
Erfindung verwendet werden. Die Kollagen/GAG-Matrix könnte wirksam
als Unterstützung oder "Gerüst"-Struktur, in die
Reparaturzellen migrieren könnten,
dienen. Eine Kollagenmatrix, wie zum Beispiel denen, die von Bell
im U.S. Patent Nr. 4,485,097 offenbart werden, könnte ebenfalls als Matrixmaterial
verwendet werden.
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Die
verschiedenen Kollagenmaterialien können auch in Form von mineralisiertem
Kollagen vorliegen. Zum Beispiel kann das fibröse Kollagenimplantatmaterial,
das UltraFiberTM genannt wird, wie es bei
Norian Corp. erhalten werden kann (1025 Terra Bella Ave., Mountain
View, CA, 94043), für
die Bildung der Matrizes verwendet werden. Das U.S. Patent 5,231,169,
das hiermit hierin aufgenommen wird, beschreibt die Herstellung
von mineralisiertem Kollagen durch die Bildung eines Calciumphosphatminerals
unter mildem Rühren
in situ, in Gegenwart von dispersierten Kollagenfibrillen. Solch
eine Formulierung kann im Kontext der Abgabe eines Nukleinsäuresegments
an eine Knochengewebsstelle verwendet werden. Mineralisiertes Kollagen
kann verwendet werden, zum Beispiel als Teil eines therapeutischen Kits
mit genaktivierter Matrix für
die Reparatur von Frakturen.
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Mindestens
20 unterschiedliche Formen von Kollagen sind identifiziert worden
und jedes dieser Kollagene kann bei der Anwendung der Erfindung verwendet
werden. Zum Beispiel kann Kollagen aus hyalinem Knorpel, wie es
aus Diarthrosen oder Wachstumsplatten isoliert wird, aufgereinigt
werden. Typ II-Kollagen, das aus hyalinem Knorpel aufgereinigt wurde,
ist kommerziell verfügbar
und kann, z.B. bei Sigma Chemical Company, St. Louis, bezogen werden.
Typ I-Kollagen aus der Rattenschwanzsehne kann, z.B. bei der Collagen
Corporation, bezogen werden. Jede Form des rekombinanten Kollagens kann
genauso verwendet werden, wie man es auch aus einer Kollagen-exprimierenden rekombinanten Wirtszelle,
einschließlich
bakterieller Hefe-, Säugetier-
und Insektenzellen, erhalten kann. Wenn Kollagen als Matrixmaterial
verwendet wird, kann es von Vorteil sein, das zu entfernen, was
als „Telopeptid" bezeichnet wird,
und das am Ende des Kollagenmoleküls lokalisiert ist und dafür bekannt
ist, dass es eine Entzündungsreaktion
induziert.
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Das
in der Erfindung verwendete Kollagen kann, wenn es gewünscht wird,
mit zusätzlichen
Mineralien, wie zum Beispiel Calcium, z.B. in Form von Calciumphosphat,
zugesetzt werden. Sowohl natives- als auch Kollagen vom rekombinanten
Typ kann durch Zumischen, Absorbieren oder anderweitig, mit zusätzlichen
Mineralien auf diese Weise in Verbindung bringen, zugesetzt werden.
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5.1.2 DIE DNA
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Die
vorliegenden Verfahren und Zusammensetzungen können eine Vielzahl von unterschiedlichen
DNA-Molekültypen
verwenden. Die DNA-Moleküle
können
genomische, cDNA's, einzelsträngige DNA,
doppelsträngige
DNA, dreisträngige
DNA, Oligonukleotide und Z-DNA einschließen.
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Die
DNA-Moleküle
können
für eine
Vielzahl von Faktoren kodieren, die die Wundheilung fördern, einschließlich extrazellulärer-, Zelloberflächen-, und intrazellulärer RNA's und Proteine. Beispiele
für extrazelluläre Proteine
schließen
Wachstumsfaktoren, Cytokine, therapeutische Proteine, Hormone und Peptidfragmente
von Hormonen, Cytokinhemmer, Peptidwachstums- und Differenzierungsfaktoren, Interleukine,
Chemokine, Interferone, Koloniestimulierende Faktoren und angiogenetische
Faktoren ein. Beispiele für
solche Proteine schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die Superfamilie von TGF-β-Molekülen, einschließlich der
fünf TGF-β-Isoformen
und der knochenbildenden Proteine (Bone Morphogenetic Proteins,
BMP), den latenten TGF-β-bindende
Proteinen, LTBP; den Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF); den Hepatozytenwachstumsfaktor
(HGF); den Plättchenwachstumsfaktor (Platelet
Derived Growth Factor, PDGF); die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren
(insuline like growth factor, IGF); die Basisfibroblasten-Wachstumsfaktoren
(Basic Fibroblast Growth Factors, FGF-1, FGF-2 etc.), den Gefäßendothelwachstumsfaktor
(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF); den Faktor VIII und
den Faktor IX; das Erythropoiethin (EPO), den Gewebeplasminogenaktivator
(tissue plasminogen activator, TPA); die Aktivine und die Inhibine.
Hormone, die bei der Anwendung der Erfindung verwendet werden können, schließen das
Wachstumshormon (GH) und das Parathyroidhormon (PTH) ein. Beispiele
für extrazelluläre Proteine
schließen
auch die extrazellulären
Matrixproteine, wie zum Beispiel Kollagen, Laminin und Fibronektin
ein. Beispiele für
Zelloberflächenproteine
schließen
die Familie der Zelladhäsionsmoleküle (z.B.
die Integrine, Selektine, Ig- Familienmitglieder,
wie zum Beispiel N-CAM und L1 und Cadherine); Cytokinsignalrezeptoren,
wie zum Beispiel die Typ I und Typ II TGF-β-Rezeptoren und der FGF-Rezeptor;
und nicht signalisierende Corezeptoren, wie zum Beispiel Betaglycan
und Syndecan, ein. Beispiele für
intrazelluläre
RNA's und Proteine
schließen
die Familie der signaltransduzierenden Kinasen, Cytoskelettproteine,
wie zum Beispiel Talin und Vinculin, cytokinbindende Proteine, wie
zum Beispiel die Familie der latenten TGF-β-Proteine und nukleäre trans-agierende
Proteine, wie zum Beispiel Transkriptionsfaktoren und verstärkende Faktoren,
ein.
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Die
DNA-Moleküle
können
auch für
Proteine kodieren, die pathologische Prozesse blockieren, wodurch
das Eintreten des ungehinderten Wundheilungsprozesses ermöglicht wird.
Beispiele für
blockierende Faktoren schließen
Ribozyme ein, die die RNA-Funktion und DNA's, die zum Beispiel für Gewebehemmer
von Enzymen kodieren, welche die Gewebeintegrität zerstören, z.B. Hemmer der mit Arthritis
in Verbindung stehenden Metalloproteinasen, zerstören.
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Man
kann das DNA-Segment, das für
das entsprechende Protein kodiert, unter Verwendung von verschiedenen
molekularbiologischen Techniken, die dem Fachmann im Allgemeinen
bekannt sind, erhalten. Zum Beispiel können cDNA- oder genomische Bibliotheken unter
Verwendung von Primern oder Sonden mit Sequenzen, die auf den bekannten
Nukleotidsequenzen basieren, durchsucht werden. Die Polymerasekettenreaktion
(PCR) kann ebenfalls verwendet werden, um das DNA-Fragment, das
für das
entsprechende Protein kodiert, zu erzeugen. Alternativ dazu kann
das DNA-Fragment
aus einer kommerziellen Quelle erhalten werden.
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Gene
mit Sequenzen, die sich von denen unterscheiden, die in der Literatur
beschrieben werden, werden ebenfalls von der Erfindung umfasst,
solange das veränderte
oder modifizierte Gen immer noch für ein Protein kodiert, das
bei der Stimulation der Wundheilung auf irgendeine direkte oder
indirekte Weise wirkt. Diese Sequenzen schließen die ein, die durch Punktmutationen
erzeugt wurden, solche infolge der Degeneriertheit des genetischen
Codes, oder natürlich
auftretende allele Varianten und weitere Modifikationen, die durch
genetische Manipulation, d.h. durch die Hand eines Menschen, eingeführt wurden.
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Techniken
zum Einführen
von Veränderungen
in Nukleotidsequenzen, die entworfen wurden, um die funktionellen
Eigenschaften der kodierten Proteine oder Polypeptide zu verändern, sind
im Stand der Technik gut bekannt. Solche Modifikationen schließen die
Deletion, Insertion oder Substitution von Basen ein, was zu Veränderungen
in der Aminosäuresequenz
führt.
Die Veränderungen
können durchgeführt werden,
um die Aktivität
eines kodierten Proteins zu erhöhen,
um seine biologische Stabilität oder
Halbwertszeit zu erhöhen,
um sein Glykosilierungsmuster zu verändern, um die Temperaturempfindlichkeit
zu konferieren oder um das Expressionsmuster des Proteins verändern und ähnliches.
Alle diese Modifikationen an den Nukleotidsequenzen sind durch diese
Erfindung umfasst.
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Die
DNA, die für
die entsprechenden Translations- oder
Transkriptionsprodukte kodieren, können in verschiedene Vektorsysteme
eingearbeitet werden, die die Replikation der DNA für die Herstellung
von genaktivierten Matrizes im großen Maßstab ermöglichen. Diese Vektoren können so
entworfen werden, dass sie die notwendigen Elemente zum Steuern
der Transkription und/oder Translation der DNA-Sequenz, die durch
die Reparaturzellen an der Wunde in vivo aufgenommen wird, enthalten.
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Vektoren,
die verwendet werden können, schließen ein,
sind jedoch nicht begrenzt auf solche, die von rekombinanter Bakteriophagen-DNA,
Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA abstammen. Zum Beispiel können Plasmidvektoren,
wie zum Beispiel pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 und die M13 mp-Serie
von Vektoren verwendet werden. Bakteriophagenvektoren können γgt10, γgt11,-γgt18-23, γZAP/R und
die EMBL-Serie von Bakteriophagenvektoren einschließen. Cosmidvektoren,
die verwendet werden können,
schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV
108, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 und
die Charomid-9-Serie
von Vektoren. Vektoren, die die in vitro-Transkription von RNA ermöglichen,
wie zum Beispiel die SP6-Vektoren,
können
ebenfalls verwendet werden, um große Mengen an RNA, die in Matrizes
eingebaut werden kann, herzustellen. Alternativ dazu können rekombinante
Virusvektoren, die einschließen,
jedoch nicht begrenzt sind auf solche, die von Viren abstammen, wie
zum Beispiel dem Herpesvirus, den Retroviren, den Vakziniaviren,
den Adenoviren, den Adeno-verbundenen
Viren oder den Rinder-Papillomaviren, manipuliert werden. Während integrierende
Vektoren verwendet werden können,
werden nicht integrierende Systeme, die das Genprodukt nicht für viele
Generationen auf Tochterzellen übertragen,
für die
Wundheilung bevorzugt. Auf diese Weise wird das Genprodukt während des
Wundheilungsprozesses exprimiert und, da das Gen in nachkommenden
Generationen ausgedünnt
wird, wird die Menge des exprimierten Genproduktes abnehmen.
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Verfahren,
die dem Fachmann gut bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren
zu konstruieren, welche die proteinkodierende Sequenz in operativer
Verbindung mit geeigneten Transkriptions/Translations-Kontrollsignalen enthalten.
Diese Verfahren schließen
in vitro rekombinante DNA-Techniken und synthetische Techniken ein.
Siehe zum Beispiel die Techniken, die bei Sambrook, et al., 1992,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
N.Y. und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology,
Greene Publishing Associates & Wiley
Interscience, N. Y. beschrieben werden.
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Die
Gene, welche für
die entsprechenden Proteine kodieren, können mit einer Vielzahl von
verschiedenen Promotor/Enhancer-Elementen operativ verbunden sein.
Die Expressionselemente dieser Vektoren können in ihrer Stärke und
Spezifitäten
variieren. Abhängig
vom verwendeten Wirt/Vektor-System kann jeder beliebige von etlichen
geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden.
Der Promotor kann in der Form des Promoters vorliegen, der natürlicherweise
mit dem entsprechenden Gen verbunden ist. Alternativ dazu kann die
DNA unter der Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promotors,
d.h. ein Promotor, der normalerweise nicht mit dem Gen verbunden
ist, positioniert werden. Zum Beispiel können gewebespezifische Promotor/Enhancer-Elemente
verwendet werden, um die Expression der übertragenen DNA in spezifischen
Zelltypen zu regulieren. Beispiele für Transkriptionskontrollregionen,
die eine Gewebespezifität
aufweisen, die beschrieben worden ist und verwendet werden kann,
schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf: Elastase-I-Genkontrollbereich,
der in pankreatischen Acinuszellen aktiv ist (Swift et al., 1984,
Cell 38: 639–646;
Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399–409; MacDonald,
1987, Hepatology 7: 425–515);
Insulin-Genkontrollbereich,
der in pankreatischen Betazellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315:
115–122);
Immunoglobulin-Genkontrollbereich, der
in Lymphoidzellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647–658; Adams
et al., 1985, Nature 318: 533–538;
Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436–1444); Albumin-Genkontrollbereich,
der in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel.
1: 268–276);
alpha-Fetoprotein-Genkontrollbereich, der in der Leber aktiv ist
(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639–1648; Hammer et al., 1987,
Science 235: 53–58);
alpha-1-Antrypsin-Genkontrollbereich, der in der Leber aktiv ist
(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161–171; beta-Globin-Genkontrollbereich, der in Myeloidzellen
aktiv ist (Magram et al., 1985, Nature 315: 338–340; Kollias et al., 1986,
Cell 46: 89–94);
Myelinbasisprotein-Genkontrollbereich, der in Oligodendrozytenzellen
im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703–712); Myosin
leichte Kette-2-Genkontrollbereich,
der in Skelettmuskeln aktiv ist (Shani, 1985, Nature 314: 283–286) und
gonadotropisches Freisetzungshormon-Genkontrollbereich, der im Hypothalamus
aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234: 1372–1378). Promotoren, die aus
dem Genom von Viren isoliert wurden, die in Säugetierzellen wachsen, (z.B.
RSV, Vakziniavirus 7,5K, SV40, HSV, die Adenoviren MLP, MMTV, LTR
und CMV-Promotoren), können
verwendet werden, als auch Promotoren, die durch rekombinante DNA-
oder synthetische Techniken erzeugt wurden.
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In
einigen Fällen
können
die Promotorelemente konstitutive oder induzierbare Promotoren sein
und können
unter den geeigneten Bedingungen verwendet werden, um zu großen Mengen
zu führen oder
zur regulierten Expression des entsprechenden Gens. Die Expression
von Genen unter der Kontrolle von konstitutiven Promotoren erfordert
nicht die Anwesenheit eines spezifischen Substrates, um die Genexpression
zu induzieren und wird unter allen Bedingungen des Zellwachstums
stattfinden. Im Gegensatz dazu ist die Expression von Genen, die durch
induzierbare Promotoren kontrolliert werden, reaktiv gegenüber der
Anwesenheit oder Abwesenheit eines induzierbaren Agens.
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Spezifische
Initiationssignale sind ebenfalls für die ausreichende Translation
von inserierten Protein-kodierenden
Sequenzen erforderlich. Diese Signale schließen das ATG-Initiations-Codon
und benachbarte Sequenzen ein. In Fällen, in denen die gesamte
kodierende Sequenz einschließlich
des Initiationscodons und benachbarter Sequenzen in die geeignete
Expressionsvektoren inseriert werden, sind keine zusätzlichen
Translationskontrollsignale erforderlich. In Fällen jedoch in denen nur ein
Teil der kodierenden Sequenz inseriert wird, müssen exogene Translationskontrollsignale
einschließlich
des ATG Initiationscodons bereitgestellt werden. Darüber hinaus
muss das Initiationscodon mit dem Leserahmen der Protein kodierenden
Sequenzen in Phase sein, um die Translation des gesamten Inserts
sicherzustellen. Diese exogenen Translationskontrollsignale und
Initiationscodons können
verschiedenen Ursprungs sein, sowohl natürlichem als auch synthetischen.
Die Wirksamkeit und Kontrolle der Expression kann durch den Einschluss
der Transkriptionsattenutionssequenzen, Enhancerelementen etc. verstärkt werden.
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Zusätzlich zu
den DNA-Sequenzen, die für entsprechende
therapeutische Proteine kodieren, schließt der Schutzumfang der vorliegenden
Erfindung die Verwendung von Ribozymen oder Antisense-DNA-Molekülen ein,
die in die Säugetierreparaturzellen übertragen
werden können.
Solche Ribozyme und Antisense-Moleküle können verwendet werden, um die
Translation von RNA-kodierenden Proteinen von Genen, die einen Krankheitsprozess
oder den Wundheilungsprozess hemmen, wodurch ermöglicht wird, das die Gewebereparatur
stattfindet, zu hemmen.
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Die
Expression der Antisense-RNA-Moleküle wird so wirken, dass die
Translation von mRNA durch Binden an Ziel-mRNA und Unterbinden der Proteintranslation
direkt blockiert wird. Die Expression von Ribozymen, die enzymatische
RNA-Moleküle darstellen,
die die spezifische Spaltung von RNA katalysieren können, können ebenfalls
verwendet werden, um die Proteintranslation zu blockieren. Der Mechanismus
der Ribozymwirkung schließt
die sequenzspezifische Hybridisation des Ribozymmoleküls an die
komplementäre
Ziel-RNA, gefolgt von einer endonukleolytischen Spaltung, ein. Innerhalb
des Schutzumfangs der Erfindung liegen bearbeitete Hammerkopfmotiv-Ribozymmoleküle, die
die endonukleolytische Spaltung von RNA-Sequenzen spezifisch und
wirksam katalysieren. Die RNA-Moleküle können durch Transkription von
DNA-Sequenzen, die für
das RNA-Molekül
kodieren, hergestellt werden.
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Es
liegt auch innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung, das mehrere
Gene, die auf einem einzelnen genetischen Konstrukt unter Kontrolle
eines oder mehrerer Promotoren kombiniert werden oder als separate
Konstrukte des gleichen oder unterschiedlicher Typen hergestellt
werden, verwendet werden können.
Dadurch kann eine fast endlose Kombination von unterschiedlichen
Genen und genetischen Konstrukten verwendet werden. Bestimmte Genkombinationen
können
entworfen werden, oder ihre Verwendung auf andere Weise dazu führen, dass
synergistische Wirkungen bei der Zellstimulation und der Regeneration
erzielt werden, wobei jede und alle dieser Kombinationen in den
Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen sollen. In der Tat sind
viele synergistische Wirkungen in der wissenschaftlichen Literatur
beschrieben worden, so dass der Fachmann bereits dazu in der Lage
wäre, ähnliche
synergistische Genkombinationen oder sogar Gen-Proteinkombinationen
zu identifizieren.
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5.1.3 HERSTELLUNG DER
GENAKTIVIERTEN MATRIZES
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In
bevorzugten Ausführungsformen
wird Matrix- oder Implantatmaterial mit der DNA, die für ein entsprechendes
therapeutisches Produkt kodiert, durch Aufsaugen des Matrixmaterials
in einer rekombinanten DNA-Vorratslösung in Kontakt gebracht. Die
Menge an DNA und der Umfang der Kontaktzeit, die für das Einbauen
der DNA in die Matrix erforderlich sind, werden vom Typ der verwendeten
Matrix abhängen
und können
von einem Fachmann ohne übermäßiges experimentieren
einfach bestimmt werden. Alternativ dazu kann die DNA innerhalb
einer Matrix aus synthetischen Polymeren, wie zum Beispiel Blockcopolymeren
der Polymilch-Polyglykolsäure (siehe
Langer und Folkmann, 1976 Nature, 263: 797–800, das hiermit hierin aufgenommen
wird) eingekapselt werden. Diese Parameter können wiederum durch einen Fachmann
ohne übermäßiges Experimentieren
einfach bestimmt werden. Zum Beispiel wird die Menge des DNA-Konstruktes,
das auf der Matrix aufgebracht wird, unter Berücksichtigung verschiedener
biologischer und medizinischer Faktoren bestimmt werden. Man würde das
bestimmte Gen, die Matrix, die Wundstelle, das Alter des Säugetierwirtes,
das Geschlecht und die Ernährung
und jeden weiteren klinischen Faktor, der die Wundheilung beeinflussen
könnte,
wie zum Beispiel die Serummengen verschiedener Faktoren und Hormone,
berücksichtigen.
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In
zusätzlichen
Ausführungsformen
der Erfindung können
Zusammensetzungen sowohl von biologischen als auch synthetischen
Matrizes und DNA zusammen lyophilisiert werden, um ein trockenes pharmazeutisches
Pulver zu bilden. Die genaktivierte Matrix kann vor der Implantation
in den Körper
rehydriert werden oder, alternativ dazu, kann die genaktivierte
Matrix auf natürliche
Weise rehydriert werden, wenn sie in den Körper eingebracht wird.
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In
einigen Beispielen können
medizinische Vorrichtungen, wie zum Beispiel Implantate, Nahtmaterialien,
Wundabdeckungen, etc. mit den Nukleinsäurezusammensetzungen der Erfindung
unter Verwendung von konventionellen Beschichtungstechniken, die
im Stand der Technik gut bekannt sind, beschichtet werden. Solche
Verfahren schließen
beispielhaft und nicht begrenzend das Eintauchen der Vorrichtung
in die Nukleinsäurezusammensetzung, Bestreichen
der Vorrichtung mit der Nukleinsäurezusammensetzung
und/oder Besprühen
der Vorrichtung mit der Aerosol-Nukleinsäurezusammensetzung
der Erfindung. Die Vorrichtung wird dann entweder bei Raumtemperatur
oder mit der Hilfe eines Trockenofens, gegebenenfalls bei verringertem
Druck, getrocknet. Ein bevorzugtes Verfahren zum Beschichten von
Nahtmaterialien wird in den Beispielen bereitgestellt.
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Für Nahtmaterial,
das mit einer polymerischen Matrix, die Plasmid-DNA enthält, beschichtet ist,
haben. die Anmelder herausgefunden, dass das Anwenden einer Beschichtungszusammensetzung, die
insgesamt etwa 0,01 bis 10 mg Plasmid-DNA und bevorzugt etwa 1 bis
5 mg Plasmid-DNA enthält,
auf Nahtmaterial von 70 cm Länge
unter Verwendung von etwa 5 bis 100, bevorzugt etwa 5 bis 50 und
noch bevorzugter etwa 15 bis 30 Beschichtungsanwendungen, eine therapeutisch
wirksame und gleichmäßige Beschichtung
erbringt.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
stellt die Erfindung beschichtete Nahtmaterialien bereit, besonders
Nahtmaterialien, die mit einer Polymermatrix, die Nukleinsäuren enthält, die für therapeutische
Proteine kodieren, die die Wundheilung in vivo stimulieren, beschichtet.
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Nahtmaterialien,
die in Übereinstimmung
mit den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
beschichtet werden, schließen
alle Nahtmaterialien natürlichen
oder synthetischen Ursprungs ein. Typische Nahtmaterialien schließen beispielhaft
und nicht begrenzend Seide, Baumwolle, Leinen, Polyolefine, wie
zum Beispiel Polyethylen und Polypropylen; Polyester, wie zum Beispiel
Polyethylenterephtalat; homopolimere und copolimere der Hydroxylcarbonsäureester;
Kollagen (einfach oder chromiert); Katgut (einfach oder chromiert)
und Ersatznahtmaterialien, wie zum Beispiel Cyanoacrylate, ein.
Die Nahtmaterialien können
jede geeignete Form annehmen, wie zum Beispiel Zöpfe oder Spiralen, und können einen
breiten Größenbereich
aufweisen, wie er im Stand der Technik für gewöhnlich verwendet wird.
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Die
Vorteile von beschichteten Nahtmaterialien, besonders Nahtmaterialien,
die mit einer Polymermatrix beschichtet sind, die Nukleinsäuren enthalten,
die für
therapeutische Proteine kodieren, die die Wundheilung stimulieren,
decken praktisch jedes Gebiet der chirurgischen Anwendung bei Menschen und
Tieren ab.
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5.2 ANWENDUNGEN DER GENAKTIVIERTEN
MATRIX
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Die
Erfindung ist bei einer großen
Vielzahl von Zuständen
der Wundheilung in der Humanmedizin anwendbar. Dies schließt die Blutgefäßreparatur ein.
Zum Beispiel werden unter Verwendung der genaktivierten Matrixtechnologie
Cytokinwachstumsfaktoren, die durch transfizierte Reparaturzellen
hergestellt werden, andere Zellen in der Wunde durch das Binden
von Zelloberflächensignalrezeptoren
beeinflussen, wodurch die Kaskaden von physiologischen Ereignissen,
die normalerweise mit dem Prozess der Wundheilung verbunden sind,
stimuliert und vervielfältigt wird.
Das Endergebnis ist die Zunahme der Gewebereparatur und der Regeneration.
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Das
Verfahren der Erfindung ist auch verwendbar, wenn es klinisches
Ziel ist, einen Krankheitsprozess zu blockieren, wodurch man das
Ablaufen der natürlichen
Gewebeheilung ermöglicht,
oder wenn es das Ziel ist, eine genetisch defekte Proteinfunktion
zu ersetzen.
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Wunden
können
sich aus traumatischen Verletzungen ergeben oder alternativ dazu;
aus Gewebeschäden,
die entweder durch ein chirurgisches Verfahren induziert wurden
oder sich aus diesem ergeben. Die genaktivierte Matrix der Erfindung
kann unter Verwendung verschiedener Techniken auf den Patienten übertragen
werden. Zum Beispiel können Matrizes
durch die Hand des Arztes direkt an die Wundstelle übertragen
werden, entweder als ein therapeutisches Implantat oder als eine
beschichtete Vorrichtung (z.B. Nahtmaterial, Stent, beschichtetes Implantat,
etc.). An einer normalen Gewebestelle können Matrizes entweder topisch
verabreicht oder chirurgisch eingebracht werden, um erkanntes Gewebe
in einiger Entfernung zu behandeln.
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Der
Prozess der Wundheilung ist eine koordinierte Sequenz von Ereignissen,
welche die Hämorrhagie,
Gerinnselbildung, Auflösung
des Gerinnsels bei gleichzeitiger Entfernung von beschädigtem Gewebe
und das Absetzen von Granulationsgewebe als anfängliches Reparaturmaterial,
einschließt.
Das Granulationsgewebe ist eine Mischung aus Fibroblasten und kapillaren
Blutgefäßen. Der
Wundheilungsprozess schließt
diverse Zellpopulationen ein, einschließlich Endothelzellen, Stammzellen,
Makrophagen und Fibroblasten. Die regulatorischen Faktoren, die
bei der Wundreparatur beteiligt sind, sind bekannt dafür, dass
sie systemische Hormone, Cytokine, Wachstumsfaktoren, extrazelluläre Matrixproteine
und andere Proteine, die das Wachstum und die Differenzierung regulieren,
einschließen.
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Die
DNA-Übertragungsverfahren
und Matrixzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden einen
breiten Anwendungsbereich haben, wie zum Beispiel ein Arzneimittelabgabeverfahren zur
Stimulation der Gewebereparatur und der Regeneration in einer Vielzahl
von verschiedenen Gewebetypen. Diese schließen ein, sind jedoch nicht
begrenzt auf die Knochenreparatur, Hautreparatur, Bindegewebsreparatur,
Organregeneration oder die Regulation der Vaskulogenese und/oder
Angiogenese. Die Verwendung von genaktivierten Matrizes kann auch
verwendet werden, um Patienten mit beeinträchtigter Heilungskapazität, die sich
zum Beispiel aus den Wirkungen des Alterns oder Diabetes ergeben,
zu behandeln. Die Matrizes können
auch zur Behandlung von Wunden, die aufgrund natürlicher Gründe, z.B. bei den Älteren und
jenen, die auf existierende Therapien nicht reagieren, wie zum Beispiel in
jenen Individuen mit chronischen Hautwunden, langsamer heilen, verwendet
werden.
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Ein
wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, dass die Bildung
von Narbengewebe an der Wundstelle durch die selektive Verwendung
der genaktivierten Matrizes reguliert werden kann. Die Bildung von
Narbengewebe kann durch Kontrollieren der Mengen des exprimierten
therapeutischen Proteins reguliert werden. In Fällen, wie zum Beispiel der Behandlung
von Verbrennungen oder Bindegewebsschäden, ist es besonders wünschenswert,
die Bildung von Narbengewebe zu hemmen.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen das Grafting oder Transplantieren
der Matrizes, die die entsprechende DNA enthalten, in den Wirt ein.
Verfahren zum Transplantieren der Matrizes können das chirurgische Einbringen
oder die Injektion der Matrizes in den Wirt einschließen. In
Fällen,
in denen die Matrizes injiziert werden sollen, werden die Matrizes
in eine Spritze aufgezogen und an der Wundstelle in einen Patienten
injiziert. Mehrfache Injektionen können im Bereich der Wunde durchgeführt werden.
Alternativ dazu können
die Matrizes chirurgisch an der Wundstelle eingebracht werden. Die Menge
der Matrizes, die für
das Erreichen des Ziels der vorliegenden Erfindung, d.h. die Stimulation
der Wundreparatur und der Regeneration erforderlich ist, ist variabel,
abhängig
von der Größe, dem
Alter und dem Gewicht des Wirtes.
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Es
ist ein wesentliches Merkmal der Erfindung, dass, wann immer eine
genaktivierte Matrix in den Wirt übertragen wird, durch Injektion
oder Chirurgie, der lokale Gewebeschaden ausreichend ist, um den
Wundheilungsprozess zu induzieren. Dies ist ein notwendiges Erfordernis
für die
Induktion der Migration und Proliferation der Säugetierzielreparaturzellen
an die Stelle der genaktivierten Matrix.
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Spezifische
Ausführungsformen
werden in den Abschnitten die folgen beschrieben.
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5.3 REGULATION DER ANGIOGENESE
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Die
vorliegende Erfindung wird zur Regulation der Bildung und der Ausbreitung
der Blutgefäße, oder
Vasculogenese beziehungsweise Angiogenese verwendet. Diese beiden
physiologischen Prozesse spielen eine wichtige Rolle bei der Wundheilung
und der Organregeneration.
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Zunächst wird
an der Wundstelle Granulationsgewebe, das eine Mischung aus Kollagen,
Matrix und Blutgefäßen darstellt,
abgelagert und stellt die Wundverstärkung während der Gewebereparatur bereit.
Die Bildung neuer Blutgefäße schließt die Proliferation,
Migration und Infiltration von Gefäßendothelzellen ein, und es
ist bekannt, dass sie durch eine Vielzahl von Polypeptidwachstumsfaktoren
reguliert wird. Zahlreiche Polypeptide mit wachstumsfördernder
Aktivität
für Endothelzellen
sind identifiziert worden, wobei dies die Säure- und Basisfibroblasten-Wachstumsfaktoren
(Basic Fibroblast Growth Factors, FGF), den Gefäßendothelwachstumsfaktor (Vascular
Endothelial Growth Factor, VEGF) und den Plazentawachstumsfaktor
(Placental Derived Growth Factor, PIGF) einschließt.
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Um
die Bildung und Ausbreitung von Blutgefäßen zu stimulieren, kann DNA,
die für
solche Wachstumsfaktoren kodiert, in Matrizes eingebaut werden,
und diese Matrizes können
in den Wirt implantiert werden. In einigen Fällen kann es erforderlich sein,
den Wundheilungsprozess durch Gewebsverletzung zu induzieren.
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Es
kann wünschenswert
sein, die Proliferation der Blutgefäßbildung, wie bei der Angiogenese, die
mit dem Wachstum von festen Tumoren, die für das Wachstum von der Vaskularisierung
abhängen, in
Verbindung stehen, zu hemmen. Die Tumorangiogenese kann durch die Übertragung
von DNA's, die für negative
Hemmer der Angiogenese, wie zum Beispiel Thrombospondin oder Angiostatin,
kodieren, gehemmt werden. In spezifischen Ausführungsformen der Erfindung
kann DNA, die für,
zum Beispiel, Thrombospondin oder Angiostatin kodiert, in eine Matrix
eingebaut werden und anschließend
kann die Matrix in einen Patienten an der Tumorstelle implantiert
werden.
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6. BEISPIEL: IN VIVO-PROTEINDETEKTION
NACH DER TRANSGENEXPRESSION
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6.1 β-GALACTOSIDASETRANSGEN
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Die
bakterielle β-Galactosidase
kann immunohistochemisch detektiert werden. Gewebeproben von einer Osteotomie
wurden in Bouins-Fixiermittel fixiert, demineralisiert und dann
entlang der Längsebene
hälftig
geteilt. Eine Hälfte
jeder Probe wurde für die
nachfolgende immunohistochemische Identifikation des bakteriellen β-Galactosidaseproteins
in Paraffin eingebettet.
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Für die Immunohistochemie
wurden Querschnitte (2–3
mm dick) auf Poly-L-Lysin beschichtete Mikroskop-Objektträger übertragen
und in Aceton bei 0°C
für mindestens
20 Minuten fixiert. Die Schnitte wurden in PBS rehydriert. Die endogene
Peroxydaseaktivität
wurde durch Immersion von Gewebeschnitten in 0,1% Wasserstoffperoxyd
(in 95% Methanol) bei Raumtemperatur für 10 Minuten gequenscht und
gequenschte Schnitte wurde 3 × mit PBS
gewaschen. In einigen Fällen
wurde geschnittenes Calvaria durch Immersion in 4% EDTA, 5% Polyvinylpyrrolidon
und 7% Saccharose bei pH 7,4 für
24 h bei 4°C
demineralisiert. Demineralisierte Schnitte wurden vor der Anwendung
mit Antikörpern
3 × gewaschen.
Primäre
Antikörper
wurden ohne Verdünnung
in Form des Hybridomüberstandes
verwendet. Gereinigte Antikörper
wurden auf Gewebsschnitte in einer Konzentration von 5 mg/ml angewendet.
Primäre
Antikörper
wurden mit biotinyliertem Hasen-Antimaus-IgG und Peroxydase konjugiertem
Streptavidin (Zymed Histostain-SPkit) detektiert. Nach der Peroxydasefärbung wurden
die Schnitte mit Hämotoxylin gegengefärbt.
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Bakterielles β-gal wurde
ebenfalls durch Substrat verwendende Assays unter Verwendung von
kommerziell erhältlichen
Kits (z.B. Promega) gemäß den Anweisungen
des Herstellers detektiert.
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6.2 LUCIFERASETRANSGEN
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Luciferase
wurde durch Substrat verwendende Assays unter Verwendung von kommerziell
verfügbaren
Kits (z.B. Promega) gemäß den Anweisungen
des Herstellers detektiert.
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6.3 PTH-TRANSGENE
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Rekombinantes
PTH, wie zum Beispiel das hPTH1-34-Peptid, wurde in Homogenaten des Osteotomielückengewebes,
zum Beispiel unter Verwendung von zwei kommerziell verfügbaren Radioimmunoassay-Kits,
gemäß den Protokollen
des Herstellers (Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA)
untersucht.
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Ein
Kit ist das Intact-PTH-Parathyroidhormon-100T-Kit. Dieses Radioimmunoassay verwendet
einen Antikörper
gegen das Carboxylende des intakten Hormons, und dieses wird zum
Messen von endogenen Mengen des Hormons in Osteotomielückengewebe
verwendet. Dieses Assay kann verwendet werden, um einen Basiswert
der PTH-Expression in der Ratte des Osteotomie-Modells zu etablieren.
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Das
zweite Kit ist ein zweiseitiges immunoradiometrisches Kit zur Messung
des Ratten-PTH. Dieses Kit verwendet affinitätsgereinigte Antikörper, die für das Aminoende
des intakten Rattenhormons (PTH1-34) spezifisch sind und daher die
endogene PTH-Produktion als auch das rekombinante Protein messen
werden. vorherige Studien haben gezeigt, dass dieser Antikörper mit
humanem PTH kreuzreagiert und diese in der Lage sind, rekombinante
Moleküle
in vivo zu erkennen.
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Werte,
die mit Kit #1 erhalten wurden (Antikörper gegen das Carboxylende)
wurden von den Werten abgezogen, die mit Kit #2 erhalten wurden (Antikörper gegen
das Aminoende), um genaue und empfindliche Messwerte zu erhalten.
Die Menge an rekombinantem Peptid wurde dadurch mit dem Grad der
Knochenneubildung korreliert.
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6.4 BMP-TRANSGEN
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BMP-Proteine,
wie zum Beispiel das murine BMP-4 transgene Peptidprodukt wurden
immunohistochemisch unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers detektiert,
der das HA-Epitop erkennt (Majmudar et al., 1991, J. Bone and Min.
Res. 6: 869–881),
wie zum Beispiel der monoklonale Antikörper, der bei Boehringer-Mannheim
erhältlich
ist. Antikörper
gegen BMP-Proteine selber können
ebenfalls verwendet werden. Solche Antikörper zusammen mit verschiedenen
Immunoassayverfahren werden im U.S. Patent 4,857,456, das hierin
aufgenommen wird, beschrieben.
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Gewebeproben
von einer Osteotomie wurden in Bouins-Fixiermittel fixiert, demineralisiert
und dann entlang der Längsebene
hälftig
geteilt. Eine Hälfte
jeder Probe wurde für
die nachfolgende immunohistochemische Identifikation des rekombinanten murinen
BMP-4-Moleküls
in Paraffin eingebettet.
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7. METHODIK
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7.1 IMMUNOHISTOCHEMIE
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Die
Gewebe wurden für
die Lichtmikroskopie vorbereitet, und die Immunohistochemie wurde
wie beschrieben durchgeführt
(Wong et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5592–5598). Histologische Schnitte
wurden mit einem kommerziell verfügbaren anti-β-gal-Antikörper (1:200
Verdünnung,
5 Prime 3 Prime) und mit einem kommerziell verfügbaren anti-HA.11 polyklonalen
Antikörper
(1:500 Verdünnung, BAbCO)
inkubiert.
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7.2 LUCIFERASE UND β-GAL-ENZYMASSAYS
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Die
Luciferase- und β-gal-Aktivität wurde
unter Verwendung des Luciferaseassaysystems (Promega) und β-Galactosidaseenzymassaysystems (Promega)
entsprechend den durch die Hersteller gelieferten Protokollen bestimmt.
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7.3 pGAM1-EXPRESSIONSPLASMID
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Um
pGAM1 zusammenzubauen, wurde mRNA aus Tag 13,5 p.c. CD-1-Mausembryos
unter Verwendung von Kitreagenzien und Protokollen vorbereitet (Poly-AT-Tract-mRNA-Isolationssystem
I, Promega). Ein Aliquot der mRNA wurde verwendet, um cDNA unter
Verwendung kommerzieller Reagenzien zu erzeugen (Reverse Transcriptase
System, Promega). Eine volllängen
Mäuse-BMP-4
cDNA kodierende Sequenz wurde mittels der Polymerasekettenreaktion
(PCR) unter folgenden Bedingungen erzeugt: 94°C, 4 Min., 1 Zyklus; 94°C, 1 Min.,
65°C, 1 Min.
72°C, 1
Min., 30 Zyklen; 72°C,
8 Min., 1 Zyklus. Die Sequenz der PCR-Primer basierte auf der bekannten
Mäuse-BMP-4-Sequenz
(Genbank): Stromaufwärtsprimer-5' CCATGATTCCTGGTAACCGAATGCTG
3'; Stromabwärtsprimer-5' CTCAGCGGCATCCGCACCCCTC
3'. Ein einzelnes
PCR-Produkt der erwarteten Größe (1,3
kb) wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in den TA-Klonierungsvektor
(Invitrogen) kloniert. Das 5'-Ende
des BMP-4-Inserts wurde weiterhin durch Anfügen einer 27-Nukleotidsequenz,
die für
das HA-Epitop kodiert, modifiziert (PCR), und das BMP-4-Insert wurde
in den pcDNA3-Expressionsvektor
(InVitrogen) kloniert. Die Plasmid-DNA wurde zubereitet und sequenziert (beide
Stränge),
um die Orientierung und Integrität des
BMP-4-Inserts sicherzustellen.
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Das
pGAM1-Plasmid wurde unter Verwendung eines in vitro Transkriptions-
und Translationskits (TNT T7 gekoppeltes Retikulozyten-Lysatsystem,
Promega) gemäß den durch
die Hersteller beigefügten
Protokollen exprimiert. Proteinradiomarkierung, Immunopräzipitation,
Probenvorbereitung und SDS-Page, Autoradiographie, Transiententransfektion
und Westernanalysen wurden wie beschrieben durchgeführt (Yin
et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 10147–10160).
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7.4 pGAM2-EXPRESSIONSPLASMID
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Die
humanen Parathyroidhormon-cDNA-Fragmente, die für die Aminosäuren Prepol-34 kodieren,
wurden durch PCR erzeugt. Die Sequenz der PCR-Primer basierte auf
der bekannten humanen PTH-Sequenz (Genbank): Stromaufwärtsprimer-5' GCGGATCCGCGATGATACCTGCAAAAGACATG 3'; Stromabwärtsprimer-5' GCGGATCCGCGTCAAAAATTGTGCACATCC
3'. Dieses Primerpaar
erzeugte BamHI-Stellen an beiden Enden des PCR-Fragmentes. Das Fragment
wurde mit BamHI verdaut und in die BamHI Klonierungsstelle im PLJ-Retrovirusvektor
kloniert (Wilson et al., 1992, Endocrinol. 130: 2947–2954).
Ein Klon mit dem Insert in der kodierenden Orientierung (pGAM2)
wurde letztendlich isoliert und durch DNA-Sequenzanalysen charakterisiert.
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Um
retrovirale Vorräte
zu erzeugen, wurde die φ CRIP-Verpackungszelllinie
(Wilson, J. M., et al., 1992, Endocrinology 130: 2947–2954) mit
10 μg rekombinanter
Vektor-DNA unter
Verwendung des Calciumphosphat-Verfahrens transfiziert. Nach einer
Inkubation über
Nacht wurde das Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 10% fötales Rinderserum, Penicillin
(100 Units/ml) und Streptomycin (100 mg/ml) (alle Reagenzien von
Gibco-BRL Life Technologies, Inc.) wurden zugesetzt), das Retrovirionpartikel
enthält,
wurde geerntet und zu kultivierten Rat-1-Zellen gegeben. Unabhängige Klone
und erfolgreich transduzierte Rat-1-Zellen wurden durch Standardinfektions-
und Selektionsverfahren erhalten. In aller Kürze, kultivierte Rat-1-Zellen
wuchsen bis zur Konfluenz, wurden 1:10 geteilt und in G418 selektiert
(1 mg/ml Gibco-BRL Life Technologies, Inc.). In einigen Fällen wurden
antibiotikaresistente Kolonien in einer einzelnen Kultur zusammengefasst. In
anderen Fällen
wurden einzelne Kolonien von resistenten Zellen behalten. Ähnliche Verfahren
wurden verwendet, um Klone von Rat-1-Zellen zu erzeugen, die mit
dem BAGT-Retrovirus, der für
das bakterielle b-gal-Enzym kodiert, transduziert wurden.
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Die
hPTH1-34-Konzentration im Zellkulturmedium wurde unter Verwendung
eines kommerziellen Radioimmunoassaykits (INS-PTH, Nichols) und gemäß dem Protokoll
des Herstellers abgeschätzt. Die
biologische Aktivität
des Peptids, das durch pGAM2 kodiert wird, wurde wie beschrieben
evaluiert (McCauley, et al., 1994, Mol. Cell. Endocrinol. 101: 331–336).
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7.5 HERSTELLUNG VON GENAKTIVIERTEN
KOLLAGENTUPFERN
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Für jede Osteotomielücke, wurde
lyophilisiertes Rindertrachealkollagen (10 mg, Sigma) in einer sterilen
Lösung
aus 0,5–1,0
mg Plasmid-DNA gründlich
befeuchtet und zur Inkubation bei 4°C für 1–16 Stunden vor der Implantation
stehen gelassen.
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7.6 RADIOGRAPHIE
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Wöchentlich
wurden einfache Röntgenbilder (posterior-anterior
Ansicht) gemacht, während
die Säugetierwirte
bei Verwendung eines transportablen Röntgengerätes (GE, Model 100) wach waren.
Sie wurden 1/10 Sek. bei 57 kV und 15 ma bestrahlt.
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7.7 HERSTELLUNG DER DNA-PLGA
BESCHICHTUNGSZUSAMMENSETZUNG
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Zu
1,5 ml einer PLGA/Chloroformlösung
(3% (w/v) 50/50 Polymilch-Polyglycolsäure PLGA Copolymer, durchschnittliches
MW 90.000, inhärente
Viskosität
1,07) wurden 0,2 ml einer Lösung,
die Marker-DNA enthält,
die für
die humane Plazenta-Alkaline-Phosphatase kodiert (1 mg DNA, 0,5
mM Tris-EDTA, 0,5 mM EDTA, pH 7,3), zugegeben. Die Lösung wurde
durch zweiminütiges
Vortexen emulsifiert, gefolgt durch eine 30 Sek. Beschallung bei
etwa 0°C unter
Verwendung eines Mikrochip-Sondentyp-Beschallers bei 55 Watt Output.
Dieser Prozess ergab eine Emulsion, die sehr milchig aussah.
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9. BEISPIEL: ÜBERTRAGUNG
VON GENEN AUF BLUTGEFÄßE
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Es
gibt einen klinischen Bedarf für
die Vorbeugung gegen eine exzessive Fibrose (Restenose), wie sie
zum Beispiel während
der Blutgefäßreparatur im
Anschluss an eine Angioplastie auftreten kann. Dies kann zum Beispiel
durch Abgabe von Genen, die für
Lysyloxidasehemmer kodieren, oder durch Übertragung von Genen, die für bestimmte
TGF-β kodieren,
erreicht werden. Es gibt zusätzlich
einen klinischen Bedarf für
die Regulation der Angiogenese, wie zum Beispiel bei Gefäßmangelerkrankungen, bei
denen es das Ziel wäre,
die Gefäßneubildung
zu stimulieren, um einer Gewebehypoxie und dem Zelltod vorzubeugen.
Ein Modelsystem ist entwickelt worden, in dem Reparaturzellen in
großen
Blutgefäßen im Hasen
mit einem Präparat
aus langfristig freisetzbaren PLGA-Partikeln und Plasmid-DNA transfiziert
werden. Reparaturzellen sind vorhanden, da diese Hasenblutgefäße eine
Xanthomzellläsion
aufweisen, die klinische Arteriosklerose in Menschen mimt. Das vorliegende
Beispiel stellt die Fähigkeit dar,
Markergenkonstrukte in große
Blutgefäßreparaturzellen
abzugeben und zu exprimieren.
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9.1 MATERIALIEN UND METHODEN
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New
Zealand White rabbits beiden Geschlechts, die 3,1 bis 3,5 kg wiegen,
wurden für
diese Studie verwendet. Die Hasen wurden mittels Ketamin (35 mg/kg)
und Xylazin (5 mg/kg), das intramuskulär verabreicht wurde, anästhesiert,
und die andauernde Anästhesie
wurde mit intravenösem
Ketamin (8 mg/kg), das über
eine Vena Marginalis verabreicht wurde, erreicht. Etwa 2 cm Segmente
sowohl der Iliac-Arterien zwischen der absteigenden Aortengabelung
als auch im Leistenband wurden isoliert, proximal abgebunden und
alle kleinen Äste
dieses arteriellen Segments wurden abgebunden. Lokalen Blutgerinseln
wurde durch die Verabreichung von Heparin (100 mg) durch die Vena
Marginalis des Ohrs vorgebeugt. Über
eine Iliac-Arteriotomie wurde ein Ballonangioplastiekatheter (2,0
mm Ballon) in die Iliac Arteriensegmente eingeführt und der Ballon wurde für eine Minute
mit einem Druck von 8 atm aufgeblasen.
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Nach
der Ballondilatation wurde der Angioplastiekatheter entfernt, 20
mg Heparin wurden intraarterial injiziert, um einem distalen Blutgerinsel
vorzubeugen. Beide Enden der Iliacarterie wurden mit 10,0 Seide
abgedichtet, die 5 mg/ml DNA-Nanopartikelsuspension wurde in jede
Iliacarterie über
3 Minuten bei 0,5 atm infundiert. Die Wunde wurde genäht. Die Hasen
wurden zwei Wochen nach der Ballonangioplastie und Nanopartikelabgabe
getötet.
Durch einen vertikalen niedrigeren Abdominaleinschnitt wurden beide
Iliacarterien isoliert. Ein 2 cm Segment der Iliacarterie wurde
bilateral ausgeschnitten. Die Halsschlagadern vom Hasen wurden als
Kontrollprobe herausgenommen. Das Gewebe wurde im flüssigen Stickstoff
für das
alkaline Phosphataseassay konserviert.
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9.2 ERGEBNISSE
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Die
Ergebnisse des Phosphatase-Expressionsassays zeigten, dass eine
Nanopartikel plus DNA-Formulierung in der Lage war, Nukleinsäuren an
Reparaturzellen in den Iliacarterien von erwachsenen Hasen, die
mit einem Ballonkatheter verletzt wurden, abzugeben. Sowohl die
rechten als auch die linken Iliacarterien zeigten eine positive
Phosphataseaktivität
nach dem Aussetzen gegenüber
Nanopartikel plus DNA-Formulierungen. In der Kontrollaorta wurde
keine Phosphataseaktivität
detektiert. Diese positiven Ergebnisse zeigen nach dem Aussetzen gegenüber einer
genaktivierten Matrix Reparaturzellen in großen Blutgefäßen Nukleinsäuremoleküle aufnehmen
und exprimieren können.
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Die
vorliegende Erfindung soll in ihrem Schutzumfang durch die exemplarischen
Ausführungsformen,
die als Illustration einzelner Aspekte der Erfindung dienen sollen,
nicht begrenzt werden, und alle Klone, DNA- oder Aminosäuresequenzen, die
funktionelle Äquivalente
darstellen, liegen innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung. In
der Tat werden dem Durchschnittsfachmann verschiedene Modifikationen
der Erfindung zusätzlich
zur vorhergehenden Beschreibung und den beiliegenden Zeichnungen
deutlich werden. Solche Modifikationen sollen innerhalb des Schutzumfangs
der beigefügten Ansprüche fallen.
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Es
sollte auch deutlich werden, dass alle Basenpaargrößen, die
für Nukleotide
gegeben werden, Annäherungen
sind und zum Zwecke der Beschreibung verwendet wurden.