DE69730030T2

DE69730030T2 - Konfokales Spektroskopiesystem und -verfahren

Info

Publication number: DE69730030T2
Application number: DE69730030T
Authority: DE
Inventors: Thomas M. Dr. Jovin; Quentin Dr. Hanley; Peter Verveer
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1997-11-17
Filing date: 1997-11-17
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2017-11-18
Also published as: JP4712923B2; ATE272224T1; EP0916981B1; DE69730030D1; JPH11249023A; EP0916981A1; US6128077A

Description

Die Erfindung betrifft allgemein ein konfokal-spektroskopisches Abbildungssystem (CSIS), das ein konfokal-spektroskopisches System (CSS) und optional eine Wellenlängenprogrammierbare Lichtquelle (PLS) verwendet. Die Komponenten CSS und PLS können gemeinsam verwendet werden, um das CSIS zu bilden. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf eine bevorzugte Implementierung des CSIS mit einem Mikroskop mit programmierbarem Array (PAM), in dem die Muster der Beleuchtung und Detektion frei programmierbar sind.
Konfokalmikroskopie, die auf Punktscannsystemen mit konjugierten Paaren von Beleuchtungs- und Detektionsaperturen basiert, ist ein wirksames Werkzeug zum Abbilden eines zu untersuchenden mikroskopischen Objekts mit direkter optischer Schnittbildung. In der Objektebene des Mikroskops werden die diskreten Aperturspots beleuchtet, von denen Reflektions- oder Fluoreszenzlicht durch konjugierten Detektionsaperturen in einer Bildebene beobachtet werden. Herkömmlich verwendete Konfokalmikroskope, die auf Scannsystemen mit mechanisch bewegten Aperturscheiben (sogenannte Nipkow-Scheiben mit einer Vielzahl von Aperturen) oder mit rotierenden Spiegeln basieren, sind dazu eingerichtet, einen Gegenstand mit einem Laserstrahl zu scannen (konfokale Laserscannmikroskopie, CSLM). Scheiben-basierte Scannsysteme weisen Beschränkungen in Bezug auf eine Begrenzung des Beleuchtungsfeldes, einen verminderten Kontrast und hohe Intensitätsverluste auf. Typischerweise sind weniger als 3% der Aperturscheibe transmittierend, da die Abstände zwischen den Pinholes groß sein müssen, um den Konfokaleffekt zu erhalten. Andererseits besitzt die CSLM den Nachteil eines niedrigen Betriebszyklus, der durch den se quenziellen Einzelpunktmodus der Datenakquisition gebildet wird.
Ein modifiziertes, räumlich licht-moduliertes Mikroskop wurde von M. Liang et al. in „Optics Letters" (Bd. 22, 1997, S. 751–753) und in dem entsprechenden US-Patent Nr. 5 587 832 beschrieben. Ein zweidimensionaler, räumlicher Lichtmodulator wird durch eine digitale Mikrospiegeleinrichtung (im folgenden: „DMD") gebildet, die Beleuchtungslicht von einer Quelle (Laser oder Weisslichtquelle) zu einer Probe und Detektionslicht von der Probe zu einem zweidimensionalen Detektor reflektiert. Jeder Mikrospiegel des DMD wird individuell gesteuert, um so einen Beleuchtungs- und Detektionspunkt zu bilden oder nicht.
Ein allgemeiner Nachteil der herkömmlichen Konfokalmikroskope betrifft die Detektion von spektral aufgelösten Bildern. Die Betriebszyklen und die Beleuchtungs- und Detektionsintensitäten sind begrenzt, so dass eine spektrale Abbildung nicht innerhalb praktisch interessierender Messzeiten möglich ist. Des weiteren sind Anregungsquellen mit einer schnellen Auswahl von einer großen Anzahl (> 50) von im Multiplex betriebenen spektralen Elementen bei kHz-Frequenzen nicht verfügbar.
Es sind Hadamard-Transformations-Spektrometer (im folgenden: „HTS") bekannt, die eine örtliche und spektrale Selektivität auf der Basis einer Detektion durch eine sogenannte Hadamard-Kodierungsmaske bereitstellen. Derartige Spektrometer werden z. B. durch R. M. Hammaker et al. in „Journal of Molecular Structure" (Bd. 348, 1995, S. 135–138) oder von P. J. Treado et al. in „Applied Spectroscopy" (Bd. 44, 1990, S. 1–5, Bd. 44, 1990, S. 1270–1275) beschrieben.
Ein Hadamard-Transformations-Ramanmikroskop gemäß P. J. Treado et al. ist als HTS 70 in den 7A, B gezeigt. 7A zeigt die Anordnung einer Hadamard-Maske 72 in dem Detektionsweg eines Mikroskops 71. Die Hadamard-Maske 72 ist eine lineare Kodierungsmaske, und ein räumliches Multiplexing von spektralen Messungen wird durch ein Antreiben der Maske mit einer Translationsstufe 73 erzielt. Das Bild, das mit dem Spektrographen 74 erhalten wird, wird mit einem Steuercomputer 75 decodiert. Einzelheiten des herkömmlichen Mikroskops 71, das in dem HTS 70 verwendet wird, sind in 7B gezeigt.
Das HTS gemäß P. J. Treado et al. weist die folgenden Nachteile auf. Die Beleuchtung ist auf eine bestimmte Anregungswellenlänge ohne jegliche Steuerbarkeit beschränkt. Die Anordnung erlaubt nur Raman-Messungen. Wegen des Gebrauchs eines herkömmlichen Mikroskops ist die Erzeugung von optischen Schnitten eines untersuchten Objekts ohne eine Bildverarbeitung unmöglich. Die Maske stellt nur einen nicht-programmierbaren Lichtmodulator dar.
Dementsprechend ist die Anwendung bekannter HTS allgemein auf optische Detektionswege oder auf akusto-optische Messungen, Raman-Mikroskopie und herkömmliche Mikroskopie beschränkt.
Ein konfokales Raman-Mikrospektroskopie-System wird durch G. J. Pupples et al. in „Nature" (Bd. 347, 1990, S. 301–303) beschrieben. Licht, das durch ein untersuchtes Objekt gestreut wird, wird durch ein Objektiv gesammelt und zur konfokalen Detektion durch ein Pinhole in ein Spektrometer eingekoppelt. Die Detektion durch ein Pinhole stellt eine wesentliche Beschränkung der gemessenen Lichtintensität dar, so dass die Anwendbarkeit des herkömmlichen Mikrospektroskopie-Systems begrenzt ist.
Konfokale Linien-Scannsysteme sind allgemein bekannt. Die Arbeit von P. A. Benedetti et al. in „Journal of Microscopy" (Bd. 165, 1992, S. 119–129) offenbart den Gebrauch eines spektroskopischen Systems mit dem Konfokallinien-(CL)-Verfahren. Die CL-Technik besitzt die folgenden Nachteile. Erstens erfordert die Bildung der linienförmigen Beleuchtung aufwendige optische Komponenten (Spalten, Linsen, Spiegel) mit strengen Justierungsanforderungen. Zweitens sind die optischen Komponenten fest positioniert, so dass das Scannen senkrecht zu der Linienrichtung durch einen mechanischen Objekt-Scanntisch durchgeführt werden muss. Entsprechend ist die Scanngeschwindigkeit stark eingeschränkt, und insbesondere die spektrale Abbildung ist zeitaufwendig. Drittens ist die Beleuchtung in diesem CL-System auf den Gebrauch von nur einem Spalt beschränkt. Ein Betrieb mit einem Multiplexing in der Ortsdomäne ist unmöglich.
Eine Echtzeit-Konfokalmikroskopie oder -abbildung, insbesondere im Gebiet des Abbildens von biologischen Objekten, wie Zellen oder deren Teile, erfordert weitere Verbesserungen in Bezug auf einen hohen Kontrast, die Empfindlichkeit, die Detektionsgeschwindigkeit und eine erweiterte Anwendbarkeit des spektralen Abbildens.
Ein konfokales spektrales Abbildungssystem, das eine Kombination aus einem Konfokalmikroskop und einem Spektrographen umfasst, ist in EP 508 257 beschrieben. Spektrale Bilder werden durch Synchronisieren eines drehenden Spiegels, der in dem Spektrographen enthalten ist, mit dem Scannbetrieb des Konfokalmikroskops aufgenommen. Der Gebrauch von räumlichen Lichtmodulatormitteln in konfokalen Abbildungssystemen ist in GB-A-2299235 und im IBM Technical Disclosure Bulletin (36, 1993, Juni No. 6B, S. 261–262) beschrieben.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Einrichtung und Verfahren zur konfokalen spektralen Abbildung bereitzustellen, die eine schnelle Datenakquisition, insbesondere mit einer effektiven optischen Schnittbildung, einer hohen Ortsauflösung, einer hohen optischen Effektivität und spektralen Auflösung ermöglichen. Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung, eine schnelle optische Abbildung von biologischen oder chemischen Materialien (z. B. lebende Zellen, Reaktionsbestandteile usw.), während die Fähigkeit zu spektroskopischen Messungen ausgenutzt wird, und somit Informationen über die molekulare Struktur und Funktion bereitzustellen. Wegen ihrer inhärenten Empfindlichkeit und Selektivität ist die molekulare Fluoreszenz ein bevorzugtes spektroskopisches Phänomen, das mit der neuen Abbildungseinrichtung und dem Verfahren implementiert werden soll.
Die obige Aufgabe wird durch eine konfokale Abbildungseinrichtung oder ein Verfahren oder durch eine Lichtquelle gelöst, die jeweils entsprechen die Merkmale der Ansprüche 1 oder 13 umfassen. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Die Grundidee der Erfinder ist der Betrieb eines konfokalen optischen Abbildungssystems, das spektroskopische Analysatormittel aufweist, mit räumlichen Lichtmodulatormitteln (im folgenden: SLM). Die SLM-Mittel weisen ein Array von Lichtmodulatorelementen auf. Ein Array kann eine Maske sein, die aus Modulatorelementen besteht, von denen jedes individuell steuerbar ist. Die Steuerbarkeit bezieht sich auf optische Merkmale der Elemente, wie Transmission, Reflektion oder Brechung. Eine sich ändernde Gruppe oder alle der Modulatorelemente bilden ein kodierendes Beleuchtungsmuster als eine Beleuchtungs- und/oder Detektionsapertur. Die Muster zur Be leuchtung und Detektion, die aneinander angepasst sind, werden getrennt oder durch einen gemeinsamen Modulator erzeugt. Die Modulatorelemente, die die aktuelle Apertur repräsentieren, sind entsprechend einer vorbestimmten Mustersequenz auswählbar, so dass eine Beleuchtungsmustersequenz in der konjugierten Objektebene gebildet wird und sich ändernde Orte beleuchtet werden. Die Beleuchtungsmustersequenz ermöglicht eine zeitkodierte Beleuchtung. Dementsprechend bilden die SLM-Mittel ein Beleuchtungs- und/oder Detektionskodierungsmittel. Bei einer modifizierten Version kann das Array eine bewegliche Maske sein und die Sequenz von einer Maskenbewegung erhalten werden. In diesem Fall wird ein Abbildungsspektrograph in der konjugierten Bildebene des Mikroskops angeordnet und viele Aperturen der Maske werden zur Sammlung des Lichts verwendet. Das System kann ein weiteres Array von Lichtmodulatorelementen erhalten, die die Maske einer spektral programmierbaren Beleuchtungsquelle sind, die unten beschrieben wird.
Die Beleuchtungsmustersequenz umfasst eine sich systematisch verschiebende Zeile oder Zeilen, die entweder gleichmäßig, gemäß einer Pseudo-Zufalls-Sequenz endlicher Länge, gemäß einer S-Matrix-Typ-Hadamard-Sequenz oder zufällig beabstandet sind; gleichmäßige Punktgitter wie z. B. Dreiecke, Quadrate, Rechtecke, Hexagone; Zufallsmuster oder Pseudo-Zufallsmuster endlicher Länge auf der Grundlage sogenannter Walsch-, Sylvester-, Hadamard- oder Golay-Sequenzen; quadratische oder rechteckige Gitter, die aus sich schneidenden Zeilenmustern gebildet sind; flächenfüllende Muster, die dazu eingerichtet sind, die SLM-Elemente eine ganzzahlige Anzahl einzuschalten, wenn sie sequenziell auf dem SLM erzeugt werden; oder eine Kombination der oben genannten Mustersequenzen auf der Basis von logischen Bool'schen AND-, OR-, NAND-, NOR- oder XOR-Operationen.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen ist vorgesehen, dass die Detektionsapertur mit der Beleuchtungsapertur zusammenfällt und/oder den Eingang von spektral dispersiven Elementen des Analysatormittels bildet. Wenn der Eingang der spektral dispersiven Elemente und eine zweidimensionale Detektorkamera in konjugierten optischen Ebenen angeordnet sind, kann die Bereitstellung eines Eingangsspalts unterlassen werden.
Vorzugsweise wird das konfokale Spektroskopiesystem der Erfindung mit einem PAM implementiert, wie es in der europäischen Patentanmeldung Nr. 97118354.6 beschrieben ist, die am 22. Oktober 1997 angemeldet wurde und deren gesamter Inhalt in die vorliegende Beschreibung durch Bezugnahme eingefügt wird.
Lichtquellenmittel des Systems enthalten eine Weißlichtlampe mit einem festen oder abstimmbaren Wellenlängenfilter oder einen Laser. Eine Weißlichtlampe mit einem abstimmbaren Wellenlängenfilter ist insbesondere mit einer spektral programmierbaren Beleuchtungsquelle erhältlich. In diesem Fall umfasst der Wellenlängenfilter ein spektral dispersives Element und ein zweidimensionales Array von Lichtmodulatorelementen, die dazu eingerichtet sind, mindestens eine der vorbestimmten Wellenlängen auszuwählen, die durch das dispersive Element hindurchgelassen werden.
Gemäß bevorzugten Anwendungen der Erfindung ist das Detektionslicht Fluoreszenz-, Phosphoreszenz-, Reflektions- oder Ramanstreuungs-Licht, das vom Objekt emittiert wird.
Das konfokale spektrale Abbildungsverfahren gemäß der Erfindung umfasst die Schritte des Fokussierens von Beleuchtungslicht von Lichtquellenmitteln über ein Lichtmodulatormittel mit einem Array von Lichtmodulatorelementen, die ein Beleuchtungsmuster in konjugierten Positionen in einem untersuchten Objekt bilden, und des Sammelns von Licht, das von dem Objekt emittiert wurde, mit Analysatormitteln mit einer Detektinsapertur, spektral dispersiven Elementen und einer zweidimensionalen Detektorkamera, wobei die Beleuchtungsapertur und die Detektionsapertur in konjugierten optischen Ebenen angeordnet sind und wobei die Lichtmodulatormittel in einer zeitabhängigen Form derart gesteuert werden, dass eine Gruppe von Modulatorelementen, die gemäß einer/einem vorbestimmten Apertur oder Muster geformt sind, eine Beleuchtungsmustersequenz bildet. Zur Sammlung eines zweidimensionalen optischen Schnittbildes wird die Mustersequenz wie oben charakterisiert verwendet. Die zeitabhängige Steuerung ist dazu eingerichtet, ein Scannen der Objektebene zur Sammlung des zweidimensionalen Bildes als ein optisches Schnittbild bereitzustellen.
Vorzugsweise wird das spektrale Abbilden unter Verwendung eines programmierbaren Array-Mikroskops implementiert, wie es in der europäischen Patentanmeldung Nr. 97118354.6 beschrieben ist, die am 22. Oktober 1997 angemeldet wurde, um eine konfokale Anordnung von Beleuchtungs- und Detektionsaperturen zu erzeugen. Bei dieser bevorzugten Anordnung werden zwei komplette spektrale Bilder entsprechend zu den konjugierten I_c- und nicht-konjugierten I_nc-Bildern aufgezeichnet, die in der oben genannten Anmeldung beschrieben sind. Ein Entfaltungsschritt kann dann an den aufgenommenen Bildern angewendet werden, um eine Unschärfe in einem oder mehreren optischen Schnittbildern zu verringern. Die Einführung der Unschärfematrix wird mit einer weiteren spektralen oder zeitlichen Dimension gegeben.
Vorteilhafte Anwendungen der Erfindung umfassen Verfahren der gleichzeitigen ortsselektiven Auslösung und Beobachtung foto chemischer Reaktionen auf einem Substrat, wobei die Auslösung, die Beleuchtung von vorbestimmten Substanzen mit einer geeigneten Wellenlänge (z. B. mit einer programmierbaren Lichtquelle, wie unten beschrieben) umfasst und die Beobachtung Fluoreszenzmessungen an den Substanzen oder den Reaktionsprodukten umfasst; Untersuchungen in der Zell- und Gewebebiologie; analytische/biotechnologische Verfahren, in-situ-Hybridisierung in der Genanalyse; die Bildung einer optischen Maske für ortsselektive photochemische Reaktionen; ortsselektive Fluoreszenzmessungen einschließlich von Anregungs- und Emissionsspektren von einem oder mehreren intrinsischen oder externen Fluorophoren, Lebensdauermessungen und/oder Polarisationsmessungen; Auslesen von biochemischen Arrays auf Chips; großskalige Oberflächeninspektionen in der Halbleiterindustrie und/oder optisches Aufzeichnen oder Auslesen.
Die Erfindung weist die folgenden Vorteile auf. Erstens liefert die Schnittbildung von Proben in Kombination mit Spektrospkopie eine bessere Indikation der Spektren, die an einem bestimmten Ort in einer Probe gegeben sind. In der Biologie wird dies eine bessere Unterscheidung von colokalisierten Strukturen ergeben. Zweitens erlaubt die Erfindung eine selektive Photochemie mit einer Detektion der Produkte in einem konfokalen Modus. Drittens ermöglicht die Erfindung die Fähigkeit, spektral aufgelöste Lebensdauermessungen durchzuführen, wenn sie mit einer Phasenrelation oder Zeitkorrelationstechniken kombiniert wird. Die Abbildung ermöglicht eine spektrale Diskriminierung gegen Autofluoreszenz und andere störende Signalquellen. Die Erfindung ermöglicht eine Kombination mit einer Zwei- oder Mehrphotonen-Anregung bei Fluoreszenzmessungen und mit einer stereoskopischen Abbildung.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, die zeigen:
1: eine schematische Ansicht einer ersten Ausführungsform eines spektral abbildenden CSIS gemäß der Erfindung, das nur aus einem CSS besteht;
2a–2f: Illustrationen von spektral-aufgelösten Messungen, die mit der Anordnung gemäß 1 erhalten wurden;
3: eine schematische Ansicht einer zweiten Ausführungsform eines spektral abbildenden CSIS gemäß der Erfindung;
4: eine schematische Ansicht einer dritten Ausführungsform eines spektral abbildenden CSIS gemäß der Erfindung;
5: eine schematische Ansicht einer programmierbaren Lichtquelle, die bei einer Ausführungsform der Erfindung verwendet wird;
6: eine schematische Ansicht eines CSIS gemäß der Erfindung, das sowohl eine konfokales spektroskopisches System (CSS) als auch eine programmierbare Lichtquelle (PLS) enthält; und
7: eine schematische Ansicht eines Hadamard-Transformations-Raman-Mikroskops, das lediglich eine nicht-programmierbare Lichtmodula tormaske im Detektionsweg verwendet (Stand der Technik).
Im folgenden werden zwei getrennte Gesichtspunkte der Erfindung betreffend die spektrale Abbildung und die programmierbare Lichtquelle beschrieben. In Bezug auf die Anwendung eines Systems gemäß der Erfindung werden die Schritte der Objekthandhabung, der Bildverarbeitung und der Anzeige im einzelnen nicht beschrieben, soweit sie von herkömmlichen konfokalen Scanneinrichtungen bekannt sind.
Spektrales Abbilden
Das konfokale spektroskopische System (CSS) mit einem spektralen Abbilden gemäß der Erfindung kann auf der Basis von SLM's implementiert werden, die in Transmission (z. B. programmierbare Aperturmasken auf der Basis von Flüssigkristallen oder mikromechanischen Schaltern), in Reflektion (z. B. DMD), mit Brechung oder mit lithographisch geätzten Modulatoren betrieben werden. Das CSS enthält einen räumlichen Lichtmodulator, der in der Bildebene des Mikroskops angeordnet ist. Eine Gruppe oder alle der Elemente des räumlichen Lichtmodulators, von denen jedes konjugiert zu einem bestimmten Punkt in der Fokalebene des Mikroskopobjektivs ist, repräsentieren eine Beleuchtungsapertur und definieren eine programmierbares Array, dass zur Beleuchtung und/oder Detektion verwendet werden kann. Die Position des programmierbaren Arrays in Bezug auf die optische Achse des Beleuchtungsweges wird entsprechend einer individuellen Steuerung von jedem der Modulatorelemente oder entsprechend einer physikalischen Bewegung eines Modulators mit einem festen Muster geändert. Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung enthält das CSS einen weiteren räumlichen Lichtmodulator, der eine wellenlängenselektive Einrichtung, die dazu vorgesehen ist, den obigen ersten Lichtmodulator zu beleuchten, als ein Teil einer Lichtquelle darstellt, wie unten beschrieben wird.
Das CSIS 100 gemäß 1 repräsentiert eine Implementierung der Erfindung in einem Mikroskop, das einen räumlichen Lichtmodulator 120 verwendet. Es enthält ein optionales zweidimensionales Kamerasystem 160 zu dessen Integration in ein PRM. Dieses CSIS ist ein Doppelweg-Einzelreflektions-Design. Der Begriff „Doppelweg" bezieht sich auf die Tatsache, dass die Beleuchtung und die Detektion zwei getrennten optischen Wegen folgen. Des weiteren wird nur eine einzelne Reflektionsrichtung des reflektierenden SLM verwendet. Eine alternative Anordnung ist ein Gemeinsamer-Weg-Doppelreflektions-Design, das in 4 gezeigt ist. Das CSIS 100 enthält im wesentlichen ein Lichtquellenmittel 110, das wie gezeigt eine weiße Lampe (mit einem Anregungswellenlängenauswahlmittel) oder eine Quelle mit festen oder abstimmbaren Wellenlängen, wie eine Laserquelle oder eine unten beschriebene, programmierbare Beleuchtungsquelle ist, eine DMD 120, der als ein SLM betrieben wird, der in einer Bildebene des Mikroskops angeordnet ist, Abbildungsoptiken 130, einen Probenbereich 140, Analysatormittel 150 und ein Gesamtfeld-Detektionsmittel 160.
Die DMD 120 besteht aus einem Array von flächigen Spiegeln, von denen jeder einzeln über einen vorbestimmten Neigungswinkel ±α relativ zur Normalen in zwei stabile Ruhezustände geneigt werden kann. Der Wert des Neigungswinkels α hängt von der praktisch verwendeten DMD ab. Jedes Spiegelelement weist eine vorbestimmte Fläche auf, die wiederum von der DMD abhängig ist. Bevorzugte Parameter sind z. B. α = ±10° mit flächigen Spiegeln der Größe < 20 μm. Jedes Spiegelelement kann mit charakteristischen Frequenzen im kHz-Bereich entsprechend einem vorbestimmten Modulationsmuster zwischen den Ruhezuständen geschaltet werden. Die Ruhezustände werden „Ein"- und „Aus"-Positionen gemäß den entsprechenden Muster- (z. B. Zeilen-)-Formverteilungen („Ein"), die auf konjugierte Positionen des Objekts fokussiert werden, und dem übrigen Beleuchtungslicht („Aus") bezeichnet.
Die DMD 120 wird mit dem Lichtquellenmittel 110 über eine Linse 111 beleuchtet. Der Anregungsfilter 131 kann ein Bandpass für einen vorbestimmten, interessierenden Wellenlängenbereich sein. Für die Detektion von Anregungsspektren kann der Bandpass durch ein variables dispersives Element implementiert werden. Die Reflektionen von den „Ein"-Elementen werden über den ersten Strahlteiler 132 (teildurchlässiger Spiegel) und das Objektiv 141 in die Objektebene des Objekts 142 fokussiert. Der Strahlteiler 132 kann einen dichroitischen Spiegel enthalten. Fluoreszenz- oder Streulicht, das in der Objektebene stimuliert wurde, kehrt durch das Objektiv 141 zu dem ersten Strahlteiler 132 zurück, wo es entlang der optischen Achse über einen Filter 153, eine Tubuslinse 152 und einen zweiten Strahlteiler 151 zu dem Analysatormittel 150 hindurchtritt. Die konfokale Anordnung ermöglicht es, Licht von nicht-konjugierten Positionen des Objekts zu unterdrücken. Der Filter 153 ist vorzugsweise ein Langpassfilter, der für die Fluoreszenz-, Phosphoreszenz- oder Raman-Streuungs-Messung (λ_em > λ₀) eingerichtet ist. In dem Analysatormittel 150 wird das Detektionslicht gesammelt und die erhaltenen Bildsignale werden zur Bild- oder optischen Schnittbild-Rekonstruktion verarbeitet.
Das CSIS 100 kann mit einem „Digital Light Processing"-Kit (z. B. von Texas Instruments, Dallas, USA) als eine Lichtquelle in Kombination mit einem Mikroskop mit Seitenbeleuchtungseingängen (z. B. Zeiss Axioplan) und einem Kameramodul mit einer CCD-Kamera (z. B. CH220-Kamera von Photometrics, Tucson, USA, mit Kodak KAF1400-CCD-Sensoren) aufgebaut sein. Der Spektrograph 154 des Analysatormittels 150 ist irgendein herkömmlicher Spektrograph, wie z. B. ein SpectraPro-150-Abbildungsspektrograph mit einem Gitter mit 300 Zeilen/mm, Acton Research Corp., Acton, USA, und eine SBIG ST-6-Kamera, Santa Barbara Instruments Group, Santa Barbara, USA. Der Eingangsspalt ist an die Zeilenbreite angepasst, die mit der DMD 120 erzeugt wird, z. B. ist gemäß dem oben genannten Beispiel der Spalt auf 25 μm gesetzt. Der Probenbereich 140 enthält eine Antriebseinrichtung 143 für z-Bewegungen (senkrecht zu der Fokusebene), wie z. B. eine Computer-basierte Fokussteuerung z. B. von Ludl Electronics Products, Hawthorne, USA. Das Objektiv ist z. B. ein 40 × 1.3 NA-Ölimmersions-Objektiv. Jedes erfindungsgemäße System (z. B. das CSIS 100) enthält zusätzlich eine Antriebseinheit zur Steuerung der Modulatorelemente oder einer beweglichen Maske, eine Steuereinheit, Rechner-, Dekodierungs- und/oder Entfaltungs-Schaltungen und Anzeigeeinheiten (nicht gezeigt). Der Beleuchtungsweg ist mit einer schraffierten Fläche gezeigt. Die Steuereinheit ist insbesondere dazu eingerichtet, Kamerasignale synchron mit der Steuerung der Modulatorelemente aufzunehmen.
Zur konfokalen spektralen Abbildung wird in die DMD 120 eine sich bewegende Mustersequenz eingeschrieben, wodurch veranlasst wird, dass Licht von den entsprechenden Spiegeln mit der Beleuchtungs-Tubuslinse 133 gesammelt und durch den Filter 131 gerichtet wird. Um ein komplettes zweidimensionales Bild des Objekts zu erhalten, muss das Muster gescannt werden, z. B. muss jedes der Modulatorelemente separat derart gesteuert werden, dass die Position des Musters sich entsprechend einer vorbestimmten Mustersequenz ändert. Die DMD 120 wird wie oben beschrieben z. B. so gesteuert dass das zu untersuchende Objekt z. B. mit einem Zeilenmuster von SLM-Elementen beleuchtet wird. Diese Situation wird konfokaler Zeilenbetrieb genannt, bei dem die Zeile von Pixeln in dem SLM, die zu dem Eingangsspalt des Spektrographen konjugiert sind, auf „Ein" geschaltet werden. Mit einer DMD-Spiegelelementbreite von ungefähr 16 μm und einem 40×-Objektiv besitzt die Beleuchtungszeile, die auf das Objekt abgebildet wird, eine Breite von ungefähr 400 nm. Diese Zeile ist konjugiert zu dem Eingangsspalt des Analysatormittels angeordnet.
Die Abbildungsmustersequenz kann allgemein umfassen eine feste oder eine sich systematisch verschiebende Zeile oder Zeilen, die entweder gleichmäßig oder gemäß einer Pseudo-Zufallssequenz endlicher Länge, gemäß einer S-Matrix-Typ-Hadamard-Sequenz oder zufällig beabstandet sind, gleichmäßige Punktgitter, wie z. B. Dreiecke, Quadrate, Rechtecke, Hexagone, Zufallsmuster oder Pseudozufallsmuster endlicher Länge auf der Grundlage so genannter Walsch-, Sylvester-, Hadamard- oder Golay-Sequenzen. Sylvester-Matrizen sind wegen der Fähigkeit, eine Raumdomäne zu multiplexen, was einem zweidimensionalen Detektor ermöglicht, drei Datendimensionen aufzuzeichnen, bevorzugte Kodierungssequenzen. Dies verbessert das SNR der Messungen in vielen Fällen. Die Zeilenabbildung (konfokale Spaltbeleuchtung) ist wegen der Anpassung an die Gestalt der Eingangsapertur üblicherweise verwendeter Spektrographen bevorzugt.
Bei dem Beispiel wird ein verkleinertes Bild der Zeile durch das Objektiv 141 in der Objektebene gebildet, wo die Fluoreszenz stimuliert oder das Licht gestreut wird. Das emittierte Licht bildet ein Zeilenbild am Eingangsspalt 155 des Abbildungsspektrographen 154. Konfokales (Fokus-)Licht tritt durch den Spalt 155 hindurch und wird mit der ein- oder zweidimensionalen Kamera 156 aufgezeichnet. Die weitere Verarbeitung des gesammelten Bildes entspricht den bekannten Dekodierungs- und Rekonstruktionsprozeduren.
Zur Gesamtfeldabbildung wird die gesamte DMD 120 in die „Ein"-Position geschwenkt. Zur spektralen Abbildung ist der optische Weg ähnlich, außer dass das Licht, das durch den Eingangsspalt 155 hindurchtritt, eine größere Menge von Licht außerhalb des Fokus von Strukturen oberhalb und unterhalb der Objektebene enthält. Für eine nicht-spektrale Abbildung wird das Gesamtfeld zusätzlich mit dem Detektormittel 160, das eine zweidimensionale Kamera 161 enthält, aufgezeichnet. Die zweite Kamera 161 nimmt das Gesamtfeldbild über den zweiten Strahlteiler 151 auf. Dies ermöglicht den direkten Vergleich zwischen konfokalen und herkömmlichen Betriebsmoden bei identischen Probenpositionen. Die Kamera 161 kann insbesondere in einem sogenannten Einzelkameramodus verwendet werden, wie es in der parallel anhängigen europäischen Patentanmeldung Nr. 97118354.6 beschrieben ist, die am 22. Oktober 1997 angemeldet wurde, so dass ein konventionelles und ein konfokales Bild alternierend erhalten werden.
Des weiteren können Anregungsspektren durch Anordnen eines Wellenlängenselektors in dem optischen Weg zwischen der Lichtquelle und dem SLM erhalten werden. Gemäß einer alternativen Anwendung können Absorptionsspektren in einem Reflektionsmodus aufgenommen werden. Der SLM wird vorzugsweise mit einer Kodierungssequenz entsprechend den oben genannten Hadamard-Sequenzen gesteuert. Dementsprechend werden die Hadamard-Sequenzen erstmalig sowohl für die Beleuchtung als auch die Detektion gleichzeitig verwendet.
Die 2a–f zeigen Beispiele von spektralen Bildern, die mit einer Anordnung gemäß 1 erhalten wurden. Aus drucktechnischen Gründen können farbige Fotographien nur schematisch gezeigt werden.
2a zeigt ein Beispiel einer fluoreszierend markierten biologischen Probe. Ein 15 μm-Schnitt eines Convallaria Rhizoms, das eine Struktur mit einer hohen Ortsfrequenz aufweist, wurde mit Acridinorange gefärbt. Bei Anregung bei 450 bis 490 nm wird die Fluoreszenz in zwei spektralen Bereichen gelb und rot emittiert, die in der Figur verschiedene Grauwerte aufweisen. Der Pfeil in 2a zeigt die Position des Eingangsspaltes an. Die horizontalen Linien beziehen sich auf die entsprechenden Spektren in den 2b, 2c. 2b zeigt ein (herkömmliches) Gesamtfeld-Spekrallinienbild von der Spaltposition in 2a. Die schematische Zeichnung zeigt das Fluoreszenzmaximum in dem roten Bereich, das gemäß der entsprechenden Struktur in der Probe im unteren Teil der Figur dominant ist. In den mittleren und oberen Teilen der Figur überlappt die rote Fluoreszenz mit geometrischen Bereichen, wo auf der Basis der 2a geänderte spektrale Eigenschaften erwartet werden. Diese Überlappung repräsentiert eine verringerte Auflösung der herkömmlichen Abbildung.
2c zeigt ein konfokales Spektralbild von der selben Spaltposition wie in 2b. In dem oberen Teil der Figur sind die Bereiche mit roter Fluoreszenz gemäß den rot emittierenden Strukturen, die von den horizontalen Linien in 2a gekreuzt werden, klar von den gering emittierenden „Schatten" in 2a getrennt. Die Überlappung, wie sie in 2b gegeben ist, wird komplett vermieden. Dies repräsentiert in Bezug auf den verbesserten Kontrast und die spektrale Reinheit der Bilder einen wesentlichen Vorteil der Erfindung.
2d zeigt den Vergleich der Intensitätsverteilung entlang der Spaltachse bei 540 nm (normiert in Bezug auf das gesammelte Gesamtlicht) für eine (oben) Konfokal- und (unten) Gesamtfeld-Abbildung. Gemäß der Struktur in 2a ergeben die stärker fluoreszierenden Elemente Maxima in den Intensitäts kurven. Das konfokale Bild in 2d zeigt eine verbesserte Hintergrundunterdrückung im Vergleich mit dem Gesamtfeldbild.
Die Fluoreszenzspektren der 2e und 2f wurden an den entsprechenden Positionen e, f aufgenommen, die in 2a angezeigt sind. Die Spektren sind in Bezug auf die Quantenausbeute des Detektors unkorrigiert. 2e (normiert wie in 2d) entspricht der „dunklen" Struktur e in 2a. Das herkömmliche Spektrum zeigt eine relativ starke Fluoreszenz, die durch die Emissionen um die Struktur e herum verursacht wird. Andererseits wird das Konfokalspektrum unterdrückt, da die störenden Emissionen vermieden werden. Dieses Ergebnis liefert ein Hintergrundunterdrückung von einem Faktor von ungefähr 3. 2f (normiert auf die Intensität von 546 nm) zeigt ein Spektrum gemäß der Struktur f in 2a. Das Spektrum ist in dem konfokalen Fall wegen der geringeren Störung von der angrenzenden gelben Struktur zu rot hin verschoben.
3 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Mikroskops, das eine integrierte konfokale Beleuchtung und einen Spektrographen aufweist. Das CSIS 300 repräsentiert integriert eine konfokale Beleuchtung und einen Spektrographen.
Auf der optischen Achse des CSIS 300 sind ein Probenbereich 340, Abbildungsoptiken 330a und 330b und Analysatormittel 350 mit einem Abbildungsspektrographen 354 angeordnet. Die Optiken 330b sind ein anamorphes System zum Einkoppeln des Lichtes in den Eingang des Spektrographen. Das anamorphe System enthält eine Komponente, z. B. eine zylindrische Linse, um selektiv eine einzelne optische Achse zu verkleinern (komprimieren). Im Gegensatz zu der Ausführungsform gemäß 1 ist auch der SLM 320 gleichzeitig das Beleuchtungsmuster (Beleuchtungsapertur) und den Eingangsspalt (Detektionsapertur) der Analysatormittel 350 axial definierend angeordnet. Die herkömmliche Spalte des Abbildungsspektrographen 354 ist entfernt oder alternativ genügend geöffnet, um zu ermöglichen, dass ein virtuelles Bild des SLM 320 an der Eingangsebene 355 reproduziert wird, die in der Fig. mit VSLM („virtuelles Bild vom SLM") gekennzeichnet ist.
Das Beleuchtungslicht von dem Lichtquellenmittel 310 wird über einen Anregungsfilter 311 und eine Beleuchtungslinse 331 durch einen Seitenanschluss des Mikroskops und einen Strahlteiler 332 (z. B. einen halbversilberten Spiegel) auf den SLM 320 gerichtet. Der SLM 320 ist eine transmittierende Einrichtung, wobei jedes Element steuerbar ist, um die Transmission zum Hindurchlassen des Beleuchtungslichts und nach der Anregung der Probe des Detektionslichts zu ändern, das durch die Abbildungsoptiken 330 (einschließlich einer Tubuslinse und eines Emissionsfilters) zu der Eingangsebene 355 des Spektrographen 354 mit der Detektorkamera 356 hindurchtritt. Der Spektorgraph 354 ist mit der Fastie-Ebert-Gestaltung illustriert, die fokussierende Spiegel F1, F2 und ein Gitter G1 aufweist, wobei jedoch ein weiter Bereich von anderen dispersiven Anordnungen einschließlich Prismen, holographischen Gittern oder akusto-optischen, verstimmbaren Filtern (AOTF's) verwendet werden können. Die gestrichelte Linie definiert die Grenze des Spektrographen.
Die Abbildungsprozedur wird ausführt, wie es oben für die erste Ausführungsform beschrieben wurde. Insbesondere wird der SLM 320 z. B. derart gesteuert, dass das zu untersuchende Objekt mit einem Zeilenmuster von SLM-Elementen oder jedwedem anderem geeigneten Beleuchtungsmuster beleuchtet wird.
Die Anordnung von 3 kann durch die Bereitstellung einer zweiten Kamera zur Bildung eines Gesamtfeld-Abbildungszweiges wie in 1 modifiziert sein. Des weiteren können die Filter durch AOTF's ersetzt werden. Das SLM-Muster kann in jedweder Form gewählt werden, wie es oben beschrieben wurde. Der Strahlteiler 332 kann einen dichroitischen Spiegel enthalten.
Der SLM 320 kann eine Maske mit einem festen Muster sein, das durch lithographisches Ätzen oder mit einem photographischen Film hergestellt ist. Die sowohl für die Beleuchtung als auch die Detektion verwendete Kodierungsmaske wird mit einem Halter kombiniert, der dazu eingerichtet ist, die Maske physikalisch zu bewegen oder zu verschieben, um eine Folge von Mustern zu erzeugen, die für die spektrale Abbildung erforderlich sind. Im einfachsten Fall könnte das Muster ein Zeilenmuster sein, wie es in der oberen Einfügung „Feld 1" gezeigt ist, das sequenziell verschoben wird. Alternativ wird ein kodierender Satz von Mustern (z. B. Zeilen oder Aperturen oder kompliziertere Muster) auf der Maske geformt, wie es in der unteren Einfügung „Feld 2" gezeigt ist. „Feld 2" zeigt ein „stilisiertes" Muster, das annähernd einem Hadamard-Muster entspricht. In diesem Fall kann, nachdem die Daten gesammelt wurden, eine Hadamard-Transformation auf die Daten angewendet und das Bild rückgewonnen werden.
Ein Mikroskop 400, das ähnliche Komponenten wie die obigen Ausführungsformen aufweist, jedoch ein Gemeinsamer-Weg-Doppelreflektions-Design aufweist, ist in 4 gezeigt. Beleuchtungslicht von dem Lichtquellenmittel 410 wird über den Strahlteiler 432 und einen Spiegel 421 zu der DMD 420 gerichtet, die wie oben beschrieben gesteuert wird. Die DMD 420 beleuchtet das Objekt und reflektiert emittiertes Detektionslicht zurück zu dem Analysatormittel 450. Zusätzlich zu dem Spektroskopiezweig des CSIS 400 kann ein sogenannter Abbildungszweig 460 angeordnet sein, der Komponenten für eine konventionelle und/oder konfokale Abbildung des untersuchten Ob jekts umfasst. Die Abbildung kann durchgeführt werden wie es in der parallel anhängigen europäischen Patentanmeldung Nr. 97118354.6 beschrieben ist, die am 22. Oktober 1990 angemeldet wurde und deren Inhalt durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung eingefügt wird.
Spektral-programmierbare Lichtquelle (PLS)
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung mit einer spektral-programmierbaren Lichtquelle (PLS) ausgestattet, die zur schnellen spektralen Formung eines einfallenden Lichtes eingerichtet ist. Diese PLS erlaubt eine vorteilhafte Kombination mit der obigen konfokalen spektralen Abbildungstechnik sowie allgemeine Anwendungen in allen Gebieten der Beleuchtung für Messungs- oder Anzeigezwecke. Eine bevorzugte Anwendung ist die Messung von Hochdurchsatz-Anregungsspektren durch Modulation des Spektrums, das die PLS verlässt, gemäß einer Hadamard-Sequenz. Eine weitere bevorzugte Anwendung ist die Verwendung einer PLS als eine Komponente (Lichtquellenmittel) in einem konfokalen Spektroskopiesystem, das oben beschrieben wurde (siehe 6).
Die PLS umfasst eine Weiß- oder Breitbandlichtquelle, fokussierende Optiken, ein Dispersionselement, einen räumlichen Lichtmodulator und eine Einrichtung zum Rekombinieren der aufgetrennten Wellenlängen. Eine schematische Illustration eines derartigen Systems ist in 5 gezeigt. Die Lichtquelle 510 wird mit dem Dispersionselement 515 (Prisma oder Gitteranordnung oder ähnliche Spektrographenanordnungen) über der Oberfläche eines räumlichen Lichtmodulators wie oben beschrieben zerlegt. Prismenoptiken weisen den Vorteil einer vergrößerten optischen Effektivität auf.
Der räumliche Lichtmodulator (strukturiert wie oben beschrieben) ist ein Transmissionsmodulator 520 mit einzelnen steuerbaren Modulatorelementen. Eine entsprechende Reflektions- oder Brechungs-Anordnung ist jedoch auch möglich. Gemäß der ortsselektiven Transmissivität des Transmissionsmodulators 520 (Bildung von „Fenstern" mit einer bestimmten äußeren Form), treten bestimmte Wellenlängen durch den Modulator z. B. zu einer Einrichtung zur Rekombination der durchgelassenen Strahlen oder direkt zu einer Probe. Die äußere Form der selektiven Transmittivität des Modulators (z. B. eine Spaltform) kann an die Gestalt des Lichtausgangs von dem Dispersionselement (z. B. einem Spalt) angepasst sein. Die Modulatorelemente sind derart gesteuert, dass Gruppen von Modulatorelementen gleichzeitig transmittierend oder reflektierend und/oder absorbierend sind, die eine äußere Gestalt gemäß der Gestalt des Lichtausgangs bilden. Falls diese Gestalt z. B. eine Spalt- oder Zeilen-Gestalt ist, werden die Modulatorelemente entsprechend als eine Zeile gemustert. Der Modulator kann in einer dynamischen Art gesteuert werden, so dass der wellenlängenspezifische Modulatorausgang seine Wellenlängencharakteristik gemäß einem vorbestimmten Zeitmuster mit hohen Geschwindigkeiten ändert.
Im illustrierten Fall ist die Einrichtung 530 zur Rekombination eine integrierende Sphäre. Andere Alternativen sind Anordnungen, die das Licht mit einem Linsensystem sammeln und dieses für die Beleuchtung in einem Parallelmodus verwenden (Beleuchtung vom Kohler-Typ), wobei ein passender Satz von Dispersionsoptiken verwendet wird, wie es durch Tilotta et al. in „Applied Spectroscopy", Band 41, 1987, Seite 727–734, beschrieben wird, die Faseroptiken oder flüssige Lichtleiter oder strahlende Oberflächen (Mattscheibe) verwenden.
Die Einrichtung zur Rekombination kann weggelassen werden, so dass das Licht, das durch den Modulator hindurchtritt, eine Probe mit einem komplexen, sich verschiebenden Muster mit verschiedenen Wellenlängen beleuchtet. Vorzugsweise sind die Modulatorelemente derart gesteuert, dass die Transmissions- oder Reflektionsmuster den Reihen oder Spalten von einer S-Typ-Hadamard-Kodierungsmatrix entsprechen. Alternativ werden die Modulatorelemente so gesteuert, dass die Ausgangswellenlängen einem vorbestimmten Zeitdurchlauf, z. B. einem Zeitdurchlauf gemäß einer linearen oder einer anderen Funktion folgen.
Der untere Teil von 5 zeigt den Effekt des Modulators. Während das Eingangsspektrum (unten links) eine im wesentlichen „weiße" Verteilung zeigt, weist das Ausgangsspektrum eine vorbestimmte Gestalt auf. Die Gestalt ist durch die Anzahl von Auflösungselementen in dem dispersiven Element und den Grad der Dispersion begrenzt.
6 zeigt ein CSIS 600, das sowohl ein konfokales spetroskopisches System (CSS), wie es unter Bezug auf die 1, 3 oder 4 beschrieben wurde, und eine wellenlängenprogrammierbare Lichtquelle (PLS) kombiniert, wie sie unter Bezug auf 5 beschrieben wurde. Das Objekt wird durch eine Vielzahl von kodierenden Maskenmodulatoren 611, 620 beleuchtet. Das CSIS enthält als eine Lichtquelle 610 das PLS mit einem ersten räumlichen Lichtmodulator 611, der dazu eingerichtet ist, eine feste Anregungswellenlänge auszuwählen oder die Anregungswellenlänge zu modulieren. Im letzteren Fall wird die Anregungswellenlänge, um örtlich und spektral aufgelöste Anregungsspektren zu erhalten, entsprechend einer geeigneten Kodiersequenz, z. B. entsprechend einer Hadamard-Sequenz moduliert. Das CSS enthält einen zweiten räumlichen Lichtmodulator 620, der wie oben beschrieben das Beleuch tungsmuster formt. Weitere Einzelheiten und die Funktion des CSIS 600 entsprechen den obigen Ausführungsformen.

Claims

Konfokales spektrales Abbildungssystem (100, 300, 400, 600) das umfasst: – Lichtquellenmittel (110, 310, 410, 510, 610); – Lichtmodulatormittel, die eine Beleuchtungsapertur bilden und dazu eingerichtet sind, ein vorbestimmtes Beleuchtungsmuster auf konjugierte Positionen eines untersuchten Objektes zu richten; und – Analysatormittel (150, 350, 450, 650) mit einer Detektionsapertur, spektral dispersiven Elementen und einer Detektorkamera, wobei die Analysatormittel (150, 350, 450, 650) zur Aufnahme spektral aufgelöster Bilder eingerichtet sind, – wobei die Beleuchtungs- und Detektionsaperturen in konjugierten optischen Ebenen angeordnet sind, dadurch gekennzeichnet, dass – die Lichtmodulatormittel (120, 320, 420, 620) aus einem zweidimensionalen Array von Lichtmodulatorelementen bestehen, von denen eine Gruppe entsprechend dem Beleuchtungsmuster angeordnet ist und die Beleuchtungsapertur bildet, wobei die Lichtmodulatormittel derart steuerbar sind, dass das Beleuchtungsmuster zu zeitabhängig sich ändernden konjugierten Positionen des Objektes gerichtet wird, und – die Analysatormittel (150, 350, 450, 650) eine Steuereinheit enthalten, die zur Aufnahme von Kamerasignalen synchron zur Steuerung der Modulatorelemente eingerichtet ist.
System nach Anspruch 1, bei dem die Lichtmodulatorelemente einzeln derart steuerbar sind, dass deren reflektiven, transmissiven oder diffraktiven Eigenschaften geändert werden.
System nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Lichtmodulatormittel dazu eingerichtet sind, mindestens einen Teil des Objekts entsprechend einer vorbestimmten Beleuchtungsmustersequenz abzutasten.
System nach Anspruch 3, bei dem die Mustersequenz gewählt ist als eine sich systematisch verschiebende Zeile oder Zeilen, die entweder gleichmäßig, gemäß einer Pseudo-Zufalls-Sequenz endlicher Länge, gemäß einer S-Matrix-Typ-Hadamard-Sequenz oder zufällig beabstandet sind; gleichmäßige Punktgitter wie z. B. Dreiecke, Quadrate, Rechtecke, Hexagone; Zufallsmuster oder Pseudo-Zufallsmuster endlicher Länge auf der Grundlage sogenannter Walsch-, Sylvester-, Hadamard- oder Golay-Sequenzen; quadratische oder rechteckige Gitter, die aus sich schneidenden Zeilenmustern gebildet sind; flächenfüllende Muster, die dazu eingerichtet sind, die SLM-Elemente eine ganzzahlige Anzahl einzuschalten, wenn sie sequenziell auf dem SLM erzeugt werden; oder eine Kombination der oben genannten Mustersequenzen.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Detektionsapertur durch die Muster-geformte Gruppe von Modulatorelementen gebildet ist, so dass die konjugierten optischen Ebenen zur Beleuchtung und Detektion zusammenfallen.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Eingang der spektral dispersiven Elemente und die zweidimensionale Detektorkamera in konjugierten optischen Ebenen angeordnet sind.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Eintrittsebene der spektral dispersiven Elemente durch das zweidimensionale Array von Lichtmodulatorelementen definiert wird.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das Teil eines Konfokalmikroskop mit programmierbarem Array ist und ferner Gesamtfeld-Detektionsmittel (160) mit einer zweidimensionalen Kamera zur Aufnahme eines konjugierten und/oder eines nicht konjugierten mikroskopischen Bildes des Objekts aufweist.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Lichtquellenmittel eine Weiß- oder Breitband-Lichtquelle (510), Dispersionsmittel (515) zur Wellenlängenselektion von Licht von der Lichtquelle (510), und weitere räumliche Lichtmodulatorenmittel (520) mit einem zweidimensionalen Array von einzeln zeitabhängig steuerbaren Lichtmodulatorelementen umfasst, die mit dem zerlegten Licht beleuchtet werden und eine ortsselektive Transmittivität oder Reflektivität bereitstellen, so dass ein Lichtausgangssignal mit einer vorbestimmten Wellenlängenverteilung die räumlichen Lichtmodulatormittel (520) passiert.
System nach Anspruch 9, das ferner eine Einrichtung zur Rekombination der zerlegten Wellenlängen (530) umfasst, die eine integrierende Kugel, ein Linsensystem, das zur Beleuchtung im Parallelmodus (Beleuchtung vom Köhler-Typ) eingerichtet ist, ein Anpassungssatz von Dispersionsoptiken, eine Faseroptik, flüssige Lichtleiter oder streuende Oberflächen oder Materialien umfasst.
System nach Anspruch 9 oder 10, bei dem die Modulatorelemente mit einem zeitabhängigen Transmissions- oder Reflekti onsmuster entsprechend den Reihen oder Spalten einer S-Typ-Hadamard-Kodierungsmatrix oder mit einem vorbestimmten Zeitverlauf steuerbar sind.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Detektionslicht Fluoreszenzlicht, Phosphoreszenzlicht, Reflektionslicht oder Raman-gestreutes Licht ist, das von dem Projekt emittiert wird.
Konfokales spektrales Abbildungsverfahren, umfassend die Schritte: – Fokussieren von Beleuchtungslicht von Lichtquellenmitteln (110, 310, 410, 610) über Lichtmodulatormittel, die eine Beleuchtungsapertur bilden und ein vorbestimmtes Beleuchtungsmuster formen, zu konjugierten Positionen eines untersuchten Objektes, und – Aufnahme von spektral aufgelösten Bildern, die von dem Objekt emittiert wurden, mit Analysatormitteln (150, 350, 450, 650) mit einer Detektionapertur, spektral dispersiven Elementen und einer Detektorkamera, wobei die Beleuchtungsapertur und die Detektionsapertur in konjugierten optischen Ebenen angeordnet sind, dadurch gekennzeichnet, dass – die Lichtmodulatormittel (120, 320, 420, 620) aus einem zweidimensionalen Array von Lichtmodulatorelementen bestehen, die zeitabhängig derart gesteuert werden, dass Modulatorelemente, die entsprechend der Beleuchtungsapertur geformt sind, eine Beleuchtungsmustersequenz bilden, und – die spektral aufgelösten Bilder mit einer Steuereinheit erhalten werden, die Kamerasignale synchron zur Steuerung der Modulatorelemente aufnimmt.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Lichtmodulatorelemente derart gesteuert werden, dass mindestens ein Teil des Objektes entsprechend einer vorbestimmten Mustersequenz mit Beleuchtungsmustern abgetastet wird, die gewählt sind aus: eine systematisch sich verschiebende Zeile oder Zeilen, die entweder gleichförmig beabstandet, gemäß einer Pseudo-Zufalls-Sequenz endlicher Länge, gemäß einer S-Matrix-Typ-Hadamard-Sequenz oder zufällig gebildet sind; regelmäßige Punktgitter, wie z. B. Dreiecke, Quadrate, Rechtecke, Hexagone; Zufallsmuster oder Pseudo-Zufalls-Muster endlicher Länge, die auf sogenannten Walsch-, Sylvester-, Hadamard- oder Golay-Sequenzen basieren; quadratische oder rechteckige Gitter, die aus sich schneidenden Zeilenmustern gebildet sind; flächenfüllende Muster, die dazu eingerichtet sind, die SLM-Elemente eine ganzzeilige Anzahl anzuschalten, wenn sie auf den SLM sequenziell erzeugt werden; oder eine Kombination der obigen Mustersequenzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 14, bei dem gleichzeitig spektral aufgelöste konjugierte (I_c) und/oder nicht konjugierte (I_nc) Bilder des Objekts mit Gesamtfeld-Detektionsmitteln aufgenommen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, bei dem der Schritt des Fokussierens des Lichts eine Wellenlängenauswahl enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, der des weiteren einen Entfaltungsschritt umfasst, wobei das Objekt mit einem Entfaltungsalgorithmus rekonstruiert wird, der die spektral aufgelösten konjugierten (I_c) und nicht-konjugierten (I_nc) Bilder kombiniert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, der ferner die Schritte eines ortsselektiven Auslösens und Beobachtens fotochemischer Reaktionen auf einem Substrat umfasst, wobei das Auslösen die Beleuchtung von vorbestimmtem Substanzen mit einer geeigneten Wellenlänge und die Beobachtung von Fluoreszenzmessungen an den Substanzen oder den Reaktionsprodukten umfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 13 bis 18, dass verwendet wird bei: – Untersuchungen in der Zell- und Gewebebiologie, – analytischen/biotechnologischen Prozeduren, – in-situ Hybridisierungen bei der Genanalyse, – der Bildung einer optischen Maske für ortsselektive, chemische Reaktionen, – ortsselektive spektroskopische Messungen, die Anregungs- und Emissionsspektren von einem oder mehreren intrinsischen oder externen Fluorophoren, Lebensdauermessungen, Polarisationsmessungen und/oder Absorptionsmessungen in einem Reflektionsmodus enthalten, – Auslesen von biochemischen Arrays auf Chips, – großformatige Oberflächenuntersuchungen der Halbleiterindustrie, und/oder – optischem Aufzeichnen und Auslesen.