DE69729101T2

DE69729101T2 - Magnetische trennung mit hilfe von externen und internen gradienten

Info

Publication number: DE69729101T2
Application number: DE69729101T
Authority: DE
Inventors: J. Gerald DOLAN; W. Leon TERSTAPPEN; A. Paul LIBERTI
Original assignee: Immunivest Corp
Current assignee: Immunivest Corp
Priority date: 1996-06-07
Filing date: 1997-06-02
Publication date: 2005-05-12
Anticipated expiration: 2017-06-03
Also published as: EP0920627B1; US6013188A; EP0920627A1; DE69729101D1; JP2000513437A; US5985153A; JP3996644B2; WO1997046882A1; AU3374597A; US5993665A; EP0920627A4

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gerät und Verfahren zum Trennen, Immobilisieren und Quantifizieren von biologischen Substanzen aus einem flüssigen Medium. Insbesondere betrifft die Erfindung die Durchführung von Beobachtungen biologischer Substanzen durch Verwendung einer magnetischen Fangkonstruktion mit hohem internen Gefälle, die in einem Gefäß geformt ist, in Verbindung mit einer extern aufgebrachten Kraft zum Transportieren von magnetisch reagierendem Material zu der Fangkonstruktion. Die vorliegende Erfindung eignet sich auch zur Durchführung von quantitativen Analysen und zur Vorbereitung von Proben in Verbindung mit automatischen Zellzähltechniken.
Hintergrund der Erfindung
Ein magnetisches Material oder ein magnetischer Dipol bewegt sich in einem magnetischen Feldgefälle in Richtung der zunehmenden maximalen magnetischen Feldstärke. Magnetische Gefälle, die zur Trennung von Flüssigkeiten verwendet werden, lassen sich grob in zwei Kategorien unterteilen. Innere magnetische Gefälle entstehen durch Induktion einer Magnetisierung in einem empfänglichen Material, das sich im Inneren eines Trenngefäßes befindet. Äußere Gefälle entstehen durch einen extern angeordneten Magnetkreislauf.
Im Fall einer einfachen rechteckigen Magnetstange bewegen sich Feldlinien, die Magnetkreisläufe bilden, üblicherweise von Nord nach Süd und können mit Eisenspänen leicht sichtbar gemacht werden. Aus diesem bekannten Experiment aus der elementaren Physik erinnert man sich, dass die Feldlinien in der Nähe der Pole eine höhere Intensität aufweisen. An den Polen zeigen die Ränder mit den Seiten und Flächen der Stange eine noch höhere Dichte bzw. ein noch höheres Gefälle. Ein Stahlball, der in die Nähe einer Magnetstange gelegt wird, wird also zunächst zu dem nächsten Pol gezogen und bewegt sich dann zu der Region mit der höchsten Feldstärke, in der Regel dem am nächsten gelegenen Rand. Bei Magnetkreisläufen erzeugt jede Konfiguration, die eine erhöhte oder verminderte Dichte der Feldlinien fördert, ein Gefälle. Entgegengesetzte Magnetdesigns, z. B. N-S-N-S-Vierpolanordnungen mit entgegengesetzten Nordpolen und entgegengesetzten Südpolen erzeugen radiale magnetische Gefälle.
Magnetische Separatoren mit hohem internem Gefälle werden seit fast 50 Jahren zur Entfernung von schwach magnetischen Materialien aus Schlämmen verwendet, wie beispielsweise in der Kaolinindustrie, oder zur Entfernung von magnetischen Materialien im Nanobereich aus einer Lösung. In einem magnetischen Separator mit hohem internem Gefälle ist ein Trenngefäß in einem gleichmäßigen magnetischen Gefäß angeordnet. Eine ferromagnetische Konstruktion befindet sich im Gefäß, um das magnetische Feld zu verzerren und ein „internes" Gefälle im Feld zu erzeugen. In der Regel wird magnetische Edelstahlwolle in eine Säule gepackt, die dann in ein gleichförmiges Magnetfeld gelegt wird, das Gefälle auf der Stahlwolle erzeugt, siehe z. B. US-Patent Nr. 3.676.337 von Kolm. Dabei lassen sich leicht Gefälle bis zu 200 kGauss/cm erreichen. Die Größe des Feldgefälles in der Umgebung eines Drahtes steht in umgekehrtem Zusammenhang zum Durchmesser des Drahtes. Die räumliche Ausdehnung der Region mit dem hohen Gefälle ist proportional zum Durchmesser des Drahtes. Wie unten ausführlicher beschrieben wird, wird magnetisches Material an den Seiten des Drahtes gesammelt, die lotrecht zu den angelegten Magnetfeldlinien verlaufen, aber nicht an den Seiten, die tangential zum angelegten Feld verlaufen. Bei der Verwendung eines solchen Systems wird das zu trennende Material durch den resultierenden magnetischen „Filter" geleitet. Danach wird das gesammelte Material gewaschen und das Gefäß wird in eine Position außerhalb des angelegten Felds gebracht, so dass das magnetische Material entfernt werden kann und die Sammelvorrichtung erneut eingesetzt werden kann.
Tabelle I unten zeigt die Größe eines magnetischen Gefälles in Abhängigkeit von der Entfernung R von der Mitte eines ferromagnetischen Drahtes für runde Drähte mit unterschiedlichen Durchmessern. Die Gefälle werden durch die Maxwell-Gleichungen bestimmt, die Gleichungen I und II für die Stärke des Magnetfelds um die Drähte und das Gefälle des Felds ergeben. Die Gleichungen ergeben die Größe dieser Mengen bei einer inneren Magnetisierung M pro Volumeneinheit. Wenn die Drähte aus „weichen" ferromagnetischen Materialien bestehen, hängt die Magnetisierung vom Wert B_ext eines extern angelegten Felds ab. Für einen beliebigen Wert von M ist die Abhängigkeit von der Entfernung und dem Drahtdurchmesser selbst für ein hartes ferromagnetisches Material mit konstanter gleichmäßiger Magnetisierung wie gezeigt. Die in Tabelle 1 aufgeführten Werte für das Gefälle nehmen eine solche typische Drahtmagnetisierung an, dass 4 π M = 10 KiloGauss (kG), ein Wert, der dem Wert einer magnetischen Seltenerdlegierung sehr nahe kommt. Tabelle 1 zeigt, dass das Feldgefälle für einen schmäleren Draht an der Oberfläche des Drahts größer ist als für dickere Drähte, obwohl die Größe des Gefälles mit zunehmender Entfernung vom Draht viel schneller abnimmt.
Drahtdurchmesser
Tabelle I

Bint = [Bext(μ – 1)D2]/[4(μ + 1)R2] = 2πMD2/4R2 (I)
Gefälle Bint = [Bext(μ – 1)D2)/[4(μ + 1)R3] = 2πMD2/4R3 (II)wobei D = Durchmesser eines kreisförmigen Drahts R = die Entfernung von der Mitte des Drahts M = die Drahtmagnetisierung μ = die magnetische Permeabilität des Drahts B_ext = die Größe des externen Felds lotrecht zum Draht B_int = die Größe des resultierenden internen Feldbeitrags Gefälle B_int = die Größe des resultierenden internen Feldgefälles.

Ein Verfahren und ein Gerät zum Abtrennen von Zellen und anderen fragilen Teilchen werden von Graham et al. in US-Patent Nr. 4.664.796 beschrieben. Das Gerät enthält eine rechteckige Kammer in einem Zylinder. Ein Paar gegenüberliegender Seiten der Kammer bestehen aus einem nichtmagnetischen Material, während die anderen Seiten aus einem magnetischen Material bestehen. Die Fließkammer ist mit einer magnetisch reagierenden Zwischenraumtrennmatrix aus Stahlwolle gepackt. Das abzutrennende Material wird durch die Kammer geführt, die sich in einem gleichmäßigen Magnetfeld befindet. Während der Abtrennung ist die Kammer im Magnetfeld ausgerichtet, so dass die magnetischen Seiten der Kammer parallel zu den angelegten Feldlinien liegen und so hohe Gefälle um die Zwischenraummatrix in der Kammer erzeugen. Wenn die Kammer sich in dieser Position befindet, werden magnetisch markierte Zellen zur Matrix hingezogen und daran festgehalten, während die nichtmagnetischen Bestandteile herausgelöst werden. Die Kammer wird dann gedreht, so dass die magnetischen Seiten zu Magneten weisen, wodurch das Magnetfeld „umgangen" wird, die Gefälle in der Fließkammer geneigt werden und die interessierenden Teilchen durch die Scherkraft der Flüssigkeitsströmung entfernt werden.
Andere interne magnetische Trennvorrichtungen sind ebenfalls bekannt. Das eigene US-Patent Nr. 5.200.084 lehrt die Verwendung dünner ferromagnetischer Drähte zum Sammeln magnetisch markierter Zellen aus einer Lösung. US-Patent Nr. 5.411.863 von Miltenyi lehrt die Verwendung beschichteter Stahlwolle oder eines anderen magnetisch empfänglichen Materials zur Abtrennung von Zellen. Die US-Patentanmeldung 08/424.271 von Liberti und Wang lehrt eine interne HGMS-Vorrichtung zur Immobilisierung, Beobachtung und Durchführung sequenzieller Reaktionen auf Zellen.
Ahn C. H. et al. (Proceeding of the workshop on micro electro mechanical systems (MEM, OISO, 25.–28. Jan., 1994, S. 91–96)) beschreibt ein Gerät, in dem mikroskopisch kleine Elektromagneten in sehr kleinen Durchflusssystemen angeordnet sind, die Teilchen in einer Flüssigkeitsströmung, die durch das System fließt, abtrennen zu können. Die Teilchen werden an den Polpositionen der Elektromagneten an den Wänden der in einem Substrat geformten Kanäle zusammengeballt.
WO 94/11078 offenbart eine magnetische Immobilisierungsvorrichtung, in der magnetisch reagierende Teilchen an einer ferromagnetischen Fangkonstruktion, die sich im Inneren eines Gefäßes befindet, beispielsweise ein hängender Draht zwischen den Stirnwänden einer Kammer oder ein Draht oder Metallkeil an einer Seitenwand einer Kammer gesammelt werden. In diesem System werden magnetische Teilchen am Rand des Sammeldrahts oder Sammelkeils im Inneren der Kammer eingesammelt. Damit die gesammelten Teilchen angesehen werden können, muss die Flüssigkeit einsehbar sein, weil sich die gesammelten Spezies tief in der Kammer an einer von der Oberseite der Kammer entfernten Stelle befinden.
Zum Einsammeln magnetisch reagierender Teilchen sind auch magnetische Separatoren mit externem Gefälle bekannt. Externe Vorrichtungen werden als „extern" bezeichnet, weil in diesen Vorrichtungen ein Magnetfeld mit hohem Gefälle durch geeignete Konfiguration der Magneten, die an der Außenseite des Trenngefäßes angeordnet sind, erzeugt wird und nicht durch eine innere Magnetkonstruktion. Eine Standardmagnetstange erzeugt beispielsweise ein Gefälle, weil die magnetischen Feldlinien nichtlinearen Pfaden folgen und sich über jeweilige Pfade von Nord nach Süd „ausfächern" oder wölben. Typische Gefälle von ca. 0,1 bis 1,5 kGauss/cm werden von hochwertigen Labormagneten erzeugt. Diese relativ kleinen Gefälle können erhöht werden, wenn ein Magnetkreislauf so konfiguriert wird, dass er die Feldliniendichte komprimiert oder expandiert. Eine zweite Magnetstange, die gegenüber einem ersten Magneten positioniert wird, verursacht beispielsweise Abstoßung zwischen den beiden Magneten. Die Anzahl Feldlinien bleibt gleich, aber sie werden komprimiert, wenn die beiden Magneten näher aneinander rücken. Somit ergibt sich ein erhöhtes Gefälle. Durch Hinzufügen von Magneten mit entgegengesetztem Magnetfeld zu. dieser zweipoligen Konfiguration zur Bildung einer vierpoligen Konfiguration, wird die Ausdehnung der Region mit dem hohen Gefälle weiter vergrößert. Um Gefälle zu erzeugen, die größer sind als die durch eine Magnetstange vergleichbarer Stärke verursachten, können auch andere Konfigurationen, wie z. B. benachbarte Magneten mit entgegengesetztem Feld, verwendet werden. Ein weiteres Verfahren zur Erhöhung der Gefälle in externen Feldvorrichtungen ist die Abwandlung der Form der Polflächen oder Polstücke. Ein Magnet mit einer spitz zulaufenden Fläche erzeugt beispielsweise ein höheres Gefälle als ein Magnet mit einer flachen Polfläche.
US-Patent Nr. 3.326.374 von Jones und US-Patent Nr. 3.608.718 von Aubrey beschreiben typische Trennvorrichtungen mit externem Gefälle. Separatoren mit einer zweipoligen Konfiguration zur Verhinderung von Kesselstein- und Kalkablagerungen in Wassersystemen werden in US-Patent Nr. 3.228.878 von Moody und US-Patent Nr. 4.946.590 von Herzog beschrieben. Benachbarte Magneten mit entgegengesetzter Polarität wurden in Trommel- oder Rotorseparatoren zur Abtrennung von Eisen- und Nichteisenabfall verwendet, wie in US-Patent Nr. 4.869.811 von Wolanski et al. und US-Patent Nr. 4.069.145 von Sommer et al. beschrieben.
Vorrichtungen mit externem Gefälle wurden auch zur Zellabtrennung und für Immunoassays verwendet. US-Patente Nr. 3.970.518 und 4.018.886 von Giaever beschreiben die Verwendung kleiner magnetischer Teilchen zur Abtrennung von Zellen mit einer Betätigungsspule. Dynal Corp. (Oslo, Norwegen) stellt Separatoren her, die zur Abtrennung von Trägerperlen für verschiedene Arten von Zelltrennungen einfache externe Magnetfelder verwenden. Die US-Patente Nr. 5.466.574 und 5.541.072 offenbaren die Verwendung externer Felder zur Abtrennung von Zellen aus einer Lösung zur Bildung einer Monoschicht aus Zellen oder anderer biologischer Komponenten an der Wand eines Trenngefäßes.
Die Resuspension und Wiedergewinnung des gesammelten Materials erfordert in der Regel die Entfernung des Sammelgefäßes vom Gradientenfeld sowie ein gewisses Maß an physikalischer Agitation. Im Hinblick auf die magnetischen Teilchen, die in solchen Auffangvorrichtungen verwendet werden, sind superparamagnetische Materialien in den letzten 20 Jahren zur Stütze der magnetischen Trenntechnik in diversen Anwendungsbereichen in der Gesundheitsfürsorge und bei Bioverfahren geworden. Diese Materialien, deren Größe im Bereich von 25 nm bis 100 μm liegt, sind nur dann magnetisch, wenn sie in ein Magnetfeld gelegt werden. Sobald das Feld entfernt wird, sind sie nicht mehr magnetisch und können wieder in Suspension redispergiert werden. Die Grundlage für das superparamagnetische Verhalten ist die, dass solche Materialien Magnetkerne enthalten, deren Durchmesser kleiner als 20–25 nm ist, was schätzungsweise kleiner ist als die Größe einer magnetischen Domäne. Eine magnetische Domäne ist das kleinste Volumen, mit dem ein permanenter magnetischer Dipol existieren kann. Magnetisch reagierende Teilchen können um einen oder mehrere solcher Kerne geformt werden. Das magnetische Material der ersten Wahl ist Magnetit, aber es können auch andere Oxide der Übergangselemente und Gemische davon verwendet werden.
Magnetische Teilchen der oben beschriebenen Art wurden schon für verschiedene Anwendungen eingesetzt, insbesondere in der Gesundheitsfürsorge, z. B. für Immunoassays, Zellabtrennung und in der Molekularbiologie. Teilchen im Bereich von 2 μm bis 5 μm sind von Dynal erhältlich. Diese Teilchen bestehen aus kugelförmigen Polymermaterialien, in die magnetische Kristallite abgelagert wurden. Diese Teilchen werden aufgrund ihres Magnetitgehalts und ihrer Größe problemlos in relativ kleinen externen Gefällen abgetrennt (0,5 bis 2 kGauss/cm). Eine andere ähnliche Materialklasse umfasst Teilchen, die von Rhone Poulenc hergestellt werden und typischerweise im 0,75 μm-Bereich gefertigt werden. Aufgrund ihrer Größe werden sie langsamer abgetrennt als die Perlen von Dynal mit äquivalenten Gefällen. Eine weitere Materialklasse ist von Advanced Magnetics erhältlich. Diese Teilchen sind im Grunde Anhäufungen von Magnetitkristallen mit einer Größe von ca. 1 μm, die mit Aminopolymersilan, an das Biorezeptoren gekoppelt werden können, beschichtet sind. Diese hoch magnetischen Materialien werden in Gefällen bis zu 0,5 kGauss/cm problemlos abgetrennt. Aufgrund ihrer Größe bleiben sowohl die Materialien von Advanced Magnetics als auch die Materialien von Rhone Poulenc jeweils stundenlang in Lösung suspendiert.
Es gibt eine Klasse magnetischer Materialien, die für Biotrennungen verwendet wurde, mit Eigenschaften, die sie in eine völlig andere Kategorie als die oben beschriebenen einstufen. Dabei handelt es sich um Kolloide mit einer Größe im Nanobereich (siehe US-Patente Nr. 4.452.773 von Molday; 4.795.698 von Owen et al.; 4.965.007 von Yudelson; 5.512.332 von Liberti & Piccoli; 5.597.531 von Liberti et al. und US- Patentanmeldung 08/482.448 von Liberti et al.). Sie bestehen in der Regel aus Einzel- oder Multikristall-Agglomeraten aus Magnetit, die mit einem Polymermaterial beschichtet sind, wodurch sie mit Wasser kompatibel sind. Einzelne Kristalle weisen eine Größe im Bereich von 8 bis 15 nm auf. Die Beschichtungen dieser Materialien interagieren ausreichend mit dem als Lösungsmittel verwendeten Wasser, um sie permanent in einer kolloidalen Suspension zu halten. In der Regel zeigen gut beschichtete Materialien unter 150 nm bis zu 6 Monate keine Hinweise auf Absetzen. Diese Materialien weisen im Wesentlichen alle Eigenschaften von Ferroflüssigkeiten auf.
Aufgrund der geringen Teilchengröße und der starken Interaktion mit dem als Lösungsmittel verwendeten Wasser werden zur Trennung von Ferroflüssigkeiten erhebliche magnetische Gefälle benötigt. In der Literatur war es gebräuchlich, Stahlwoll-Säulenanordnungen wie oben beschrieben zu verwenden, die Gefälle von 100–200 kGauss/cm erzeugen. Anschließend wurde aber beobachtet, dass diese Materialien in magnetischen Feldern „Ketten" (wie Perlen auf einer Kette) bilden, so dass eine Trennung in Gradientenfeldern bis zu 5 oder 10 kGauss/cm möglich wird. Diese Beobachtung führte zur Entwicklung von Trennvorrichtungen mit Drähten mit großem Durchmesser, die relativ kleine Gefälle erzeugen. Drähte mit großem Durchmesser können verwendet werden, um Ferroflüssigkeiten dazu zu bringen, bei der Sammlung gleichförmige Schichten zu bilden. Durch die Kontrolle der Mengen von Ferroflüssigkeit in einem System kann eine Monoschicht erzeugt werden. Magnetisch markierte Zellen können so dazu gebracht werden, Monoschichten wie in den eigenen US-Patenten Nr. 5.186.827 und 5.466.574 beschrieben zu bilden.
Die Analyse der zellulären Zusammensetzung von Körperflüssigkeiten wird in der Diagnose der verschiedensten Erkrankungen eingesetzt. Die mikroskopische Untersuchung von Zellabstrichen oder -ablagerungen, die nach der Methode von Romanowsky oder zytochemisch angefärbt sind, auf Objektträgern war bisher die traditionelle Methode für die Zellanalyse. Die Einführung von Zellzählern auf Impedanzbasis Ende der 1950er Jahre brachte einen großen Fortschritt in der Genauigkeit der Zellzählung und Zelldifferenzierung. Seit damals wurden zahlreiche andere Technologien für die Zählung und Differenzierung von Zellen eingeführt, z. B. Fluoreszenz-Aktivierte Flusszytometrie, Quantitative Buffy Coat Analyse, Volumetrische Kapillarzytometrie und Laser-Scanning-Zytometrie. Die Flusszytometrie auf Fluoreszenzbasis hat die Fähigkeit zur Unterscheidung unterschiedlicher Zelltypen in heterogenen Zellgemischen verbessert. Die gleichzeitige Beurteilung multipler Parameter einzelner Zellen, die eine Messöffnung mit einer Geschwindigkeit von bis zu 1000 bis 10.000 Zellen/sec passieren, ist eine aussagekräftige Technologie. Sie ist allerdings mit Einschränkungen behaftet, beispielsweise können keine hohen Zellkonzentrationen, bei denen eine Verdünnung mit Blut notwendig ist, durchgeführt werden, weniger häufig vorkommende oder seltene Zellen können nicht nachgewiesen werden und interessierende Zellen können nicht wiederholt untersucht werden. Zur Überwindung dieser Einschränkungen werden klinische Proben in der Regel verschiedenen Anreicherungstechniken unterworfen, z. B. Erythrozytenlyse, Dichtetrennung, immunspezifische Auswahl oder Abreicherung von Zellpopulationen vor der flusszytometrischen Analyse.
Zahlreiche bioanalytische Techniken beinhalten die Identifizierung und Trennung von Zielteilchen wie z. B. Zellen oder Mikroben in einem flüssigen Medium, z. B.
Körperflüssigkeiten, Kulturflüssigkeiten oder Proben aus der Umwelt. Häufig ist es auch wünschenswert, das Zielteilchen bei der Trennung intakt und/oder lebensfähig zu halten, um es analysieren, identifizieren oder charakterisieren zu können. Zur Messung der absoluten und relativen Anzahl Zellen in einer bestimmten Untergruppe von Leukozyten in Blut wird beispielsweise eine Blutprobe entnommen und mit einer Sonde, wie z. B. einem fluoreszierend markierten Antikörper, der für diese Untergruppe spezifisch ist, inkubiert. Die Probe wird dann mit einem lysierenden Puffer, der optional eine Fixierlösung enthält, verdünnt und die verdünnte Probe wird durch Flusszytometrie analysiert. Dieses Analyseverfahren kann für viele verschiedene Antigene angewandt werden. Die Nachteile dieses Verfahrens werden aber ersichtlich, wenn für relativ seltene Analysen große Proben benötigt werden. In diesen Situationen benötigt der Flusszytometer für die Analyse dieser Proben extrem viel zeit, so dass die Analyse aufgrund wirtschaftlicher Überlegungen nicht mehr machbar ist.
Ein System, bei dem versucht wurde, einige dieser Probleme mit Flusszytometern zu beheben, war das sogenannte „Cytodisk", das 1985 von DeGrooth, Geerken & Greve beschrieben wurde (Cytometry 6: 226–233 (1985)). Die Autoren beschreiben eine Methode zur Ausrichtung von Zellen in den Rillen einer Grammophonplatte. Die Platte mit den getrockneten Zellen wurde auf einen Plattenspieler gelegt und der Arm des Plattenspielers wurde unmittelbar hinter der Nadel mit einer Faseroptik versehen. Die Nadel hielt die Faseroptik mit den Rillen in der Platte ausgerichtet. Die unizellulären Algenzellen (Durchmesser 3 Mikron), die in diesem Experiment verwendet wurden, blieben im Boden der Rille, um vom optischen System analysiert zu werden. Zu den Vorteilen des Cytodisk zählte, dass multiple Parameter der Zellen ohne optischen Crosstalk gemessen werden konnten, dass einzelne Zellen diesen Messungen zugeordnet werden konnten und dass Zellen mit verschiedener analytischer Auflösung wiederholt gemessen werden konnten. Bei diesem System war es aber erforderlich, dass die Zellen auf der Grammophonplatte getrocknet wurden, und bei diesem nicht homogenen Verfahren wurden viele Zellen beschädigt. Selbst wenn Zellen auf der Platte effektiv getrocknet werden könnten, um analysiert zu werden, wären sie dennoch tote Zellen. Die vorliegende Erfindung versucht, einige der Vorteile des Cytodisk, einschließlich Messung multipler Parameter, Indexierung und wiederholte Messung mit neuen Merkmalen zu kombinieren, die die Analyse intakter Zellen gestatten, die zur Züchtung oder einer anderen erneuten Verwendung freigesetzt werden können, einschließlich zur Infusion zurück in einen lebenden Organismus.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Immobilisierung mikroskopischer Teilchen, einschließlich biologischer Teilchen, wie z. B. Zellen, die die Abtrennung dieser Teilchen aus einem flüssigen Medium, einschließlich Vollblut, in eine definierte Region in einer Auffangkammer ermöglicht, so dass eine Analyse mit automatischen Mitteln möglich wird. Diese Erfindung gestattet auch die quantitative Sammlung magnetisch markierter Zielteilchen, so dass eine Probe in Mikroliter-Mengen zum Nachweis der Zielteilchen, einschließlich Teilchen, die mit geringer Häufigkeit vorkommen, verwendet werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein Auffanggefäß vorgesehen, in dem ferromagnetische Linien durch Adhäsion entlang einer transparenten Wand unterstützt werden. Die Linien besitzen wirksame Durchmesser im Bereich von 0,1 μm bis 30 μm und führen zur Immobilisierung und Ausrichtung magnetisch markierter biologischer Materialien in einer geordneten Anordnung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden menschliche Blutzellen für die automatische Analyse ausgerichtet.
Die erfindungsgemäßen Verfahren verwenden doppelte Kräfte zum Sammeln der Teilchen. In einer Ausführungsform wird das Zielmaterial durch Schwerkraft in einen Bereich mit hohem internem Gefälle gebracht. In einer weiteren Ausführungsform hat ein einzelnes angelegtes Magnetfeld zweierlei Zwecke. Das angelegte Feld umfasst ein erstes externes magnetisches Gefälle, das magnetisch reagierende Teilchen in eine Region eines Auffanggefäßes bewegt. Gleichzeitig induziert das angelegte Feld Magnetisierung in einer ferromagnetischen Fangkonstruktion, wodurch ein zweites internes Gefälle hinzugefügt wird, das weiter auf die magnetisch reagierenden Teilchen wirkt und sie zur Analyse in die definierte Region des Auffanggefäßes schiebt. Das Gefäß kann so orientiert sein, dass das externe Gefälle entgegengesetzt zu oder in Verbindung mit dem Einfluss der Schwerkraft auf das Zielmaterial wirkt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich zur Abtrennung biologischer Teilchen, einschließlich einer großen Vielzahl von Substanzen biologischen Ursprungs, einschließlich Zellen – sowohl eukaryotische (z. B. Leukozyten, Erythrozyten, Thrombozyten, Epithelzellen, Mesenchymzellen oder Pilze) als auch prokaryotische (z. B. Bakterien, Protozoa oder Mykoplasmen), Viren, Zellkomponenten wie z. B. Organellen, Vesikel, Endosome, Lysosomalpakete oder Kerne, sowie Moleküle (z. B. Proteine) und Makromoleküle (z. B. Nukleinsäuren – RNA und DNA). Die interessierenden biologischen Teilchen können zumindest in Proben verschiedenen Ursprungs vorliegen, einschließlich biologische Flüssigkeiten, wie z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Knochenmark, Sputum, Urin, Liquor, Fruchtwasser oder Lavageflüssigkeiten, sowie Gewebehomogenaten, disaggregierten Geweben oder Zellkulturmedium. Sie können auch in Materialien vorliegen, die nicht aus einer klinischen Quelle stammen, wie z. B. Schlamm, Klärschlämme, Wasser (z. B. Grundwasser oder Ströme), Nahrungsprodukte oder andere Quellen. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Abtrennung von verschiedenen Bakterien und Parasiten aus Fäkalmaterial, Urin oder anderen Quellen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In den Zeichnungen sind:
1 eine aufgebrochene perspektivische Ansicht eines Trenngefäßes nach einer Ausführungsform der Erfindung;
2 eine vergrößerte perspektivische Ansicht eines ferromagnetischen Gitters, das in dem Trenngefäß aus 1 angeordnet ist;
3 eine Draufsicht, von der Seite, auf eine Anordnung zum Ansehen der gesammelten Zellen im Trenngefäß aus 1;
4A und 4B Fotos von Zellen, die mit alternativen Beleuchtungsmethoden in der Anordnung aus 3 gesammelt wurden;
5A eine perspektivische Ansicht einer alternativen Ausführungsform eines Trenngefäßes mit einer erfindungsgemäßen ferromagnetischen Fangkonstruktion;
5B eine Schnittansicht des Trenngefäß entlang Linie 5B-5B in 5A;
6 ein schematisches Diagramm des Trenngefäßes aus 5A, das in einem relativ homogenen horizontalen externen Magnetfeld angeordnet ist;
7 ein computergeneriertes Diagramm der Wirkung des angelegten Magnetfelds aus 6 auf die Bewegung der einzelnen magnetisch reagierenden Teilchen, die im gesamten Trenngefäß angeordnet sind;
8 ein schematisches Diagramm des Trenngefäßes, das in einem angelegten Feld mit externem Gefälle angeordnet ist;
9 ein computergeneriertes Diagramm der Pfadkomponente zahlreicher magnetisch reagierender Teilchen im Separator aus 8, die alleine auf das externe Gefälle zurückzuführen ist;
10 ein computergeneriertes Diagramm der Pfade der magnetisch reagierenden Teilchen im Trenngefäß aus 8, unter Berücksichtigung des externen Gefälles, des internen Gefälles und der Schwerkraft;
11 ein schematisches Diagramm einer Anordnung zur automatischen Analyse gesammelter Zielteilchen in einem Trenngefäß der in 5A gezeigten Art; und
12 ein schematisches Diagramm eines Trenngefäßes zur Verwendung bei der Durchführung sequenzieller Reaktionen und zur Analyse von darin gefangenem Zielmaterial.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
I. Allgemeine Definitionen
Sofern nicht anders angegeben sind allgemein verwendete Begriffe in der gesamten vorliegenden Spezifikation wie folgt definiert.
Der Begriff „Sonde" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper oder eine andere spezifische Bindungssubstanz, die eine nachweisbare Markierung enthält oder enthalten kann. Nachweisbare Markierungen sind u. a. fluoreszierende, chemilumineszente und radioaktive Verbindungen sowie Verbindungen mit speziellen oder erkennbaren Licht streuenden oder anderen optischen Eigenschaften. Nachweisbare Markierungen umfassen auch Verbindungen, die nur nach Bindung an der charakteristischen Determinante nachweisbar sind.
Der Begriff „ferromagnetische Fangkonstruktion" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Konstruktion aus ferromagnetischem Material, das in Anwesenheit eines Magnetfelds magnetisiert wird, um magnetisch reagierende Materialien anzuziehen. Die Fangkonstruktion kann in Form von Drähten, dünnen Streifen, lithografisch geformten Streifen oder eines galvanisierten ferromagnetischen Materials, das an oder von einer Wand eines Trenngefäßes getragen wird, vorliegen. Das ferromagnetische Material kann Eisen, Nickel, Kobalt, Legierungen davon, Legierungen von magnetischen Seltenerdelementen oder andere paramagnetische Materialien enthalten. Der Begriff „internes Gefälle" wie hierin verwendet bezieht sich auf ein magnetisches Gefälle, das von der Fangkonstruktion ausgelöst wird, wenn diese in ein Magnetfeld gelegt wird. Der Begriff „externes Gefälle" bezieht sich auf ein magnetisches Gefälle, das ausschließlich durch eine Konfiguration aus Magneten oder Polstücken auf der Außenseite des Trenngefäßes angelegt wird. Zur Bildung von Magnetfeldern, die für die Erfindung nützlich sind, können auch Elektromagneten verwendet werden.
Der Begriff „Determinante" wird hier in einem weiteren Sinn verwendet und bezeichnet den Teil des biologischen Teilchens, der an der selektiven Bindung an eine spezielle Bindungssubstanz, deren Anwesenheit für die selektive Bindung notwendig ist, beteiligt oder dafür verantwortlich ist. Der Ausdruck „charakteristische Determinante" wird hierin mit Bezug auf Zellen verwendet, beispielsweise um ein Epitop (oder eine Gruppe von Epitopen) zu bezeichnen, die dazu dienen, einen bestimmten Zelltyp zu identifizieren und ihn von anderen Zelltypen zu unterscheiden. Zell-assoziierte Determinanten beinhalten beispielsweise auch Bestandteile der Zellmembran, wie z. B. membrangebundene Proteine oder Glykoproteine, einschließlich Oberflächenantigene von Zellen mit Wirts- oder Virusursprung, Histokompatibilitätsantigene oder Membranrezeptoren.
Der Ausdruck „spezifische Bindungssubstanz" wie hierin verwendet bezieht sich auf jede Substanz, die die charakteristische Determinante auf einem interessierenden biologischen Teilchen selektiv erkennt und mit ihr interagiert, um Determinanten, die auf nicht interessierenden biologischen Teilchen vorliegen, im Wesentlichen auszuschließen. Zu den spezifischen Bindungssubstanzen, die für Affinitäts-Bindungs-Trennungen eingesetzt werden können, zählen Antikörper, Antihaptene, Lektine, Peptide, Peptid-Nukleinsäuren-Konjugate, Nukleinsäuren, Protein A, Protein G, Concanavalin A, Soja-Agglutinin, Hormone und Wachstumsfaktoren. Der Begriff „Antikörper" wie hierin verwendet umfasst Immunoglobuline, monoklonale oder polyklonale Antikörper, immunreaktive Immunoglobulinfragmente, Einzelketten-Antikörper und Peptide, Oligonucleotide oder eine beliebige Kombination davon, die Determinanten mit einer ähnlichen Spezifität wie traditionell erzeugte Antikörper spezifisch erkennen können.
Der Begriff „magnetisch reagierende Teilchen" wie hierin verwendet bezieht sich auf magnetische Teilchen mit einer metallischen oder metallorganischen Zusammensetzung, die optional mit einem Polymer überzogen sind, vorzugsweise mit einem Polymer biologischen Ursprungs, wie z. B. BSA. Die Teilchen können mit einem Antikörper oder einer anderen spezifischen Bindungssubstanz verknüpft sein, damit sie an interessierende biologische Teilchen binden können. Geeignetes magnetisches Material wird von Dynal, Rhone Poulenc, Miltenyi Biotec, Cardinal Associates, Bangs Labs, Ferrofluidics und Immunicon Corp. hergestellt. Der Begriff „magnetisch reagierende Teilchen" umfasst auch einen Komplex aus biologischen Teilchen/magnetischen Teilchen, der optional an eine fluoreszierende Markierung oder eine andere nachweisbare Markierung gebunden ist.
Die für die Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugten magnetischen Teilchen sind Teilchen, die sich wie echte Kolloide verhalten. Solche Teilchen sind durch ihre Teilchengröße im Submikronbereich, die im Allgemeinen unter ca. 200 Nanometer (nm) liegt, und ihre Langzeit-Stabilität gegen Abtrennung unter Schwerkraft aus einer Lösung charakterisiert. Solch kleine Teilchen erleichtern die Beobachtung der Zielteilchen mit einem optischen Mikroskop, da die Teilchen bedeutend kleiner sind als der Wellenlängenbereich des Lichts. Geeignete Materialien setzen sich zusammen aus einem kristallinen Kern aus superparamagnetischem Material, der von Molekülen umgeben ist, die physikalisch absorbiert oder kovalent am Magnetkern befestigt sein können und die stabilisierende kolloidale Eigenschaften verleihen. Die Größe der kolloidalen Teilchen ist so gering; dass sie keine vollständige magnetische Domäne enthalten, und ihre Brownsche Energie übersteigt ihr magnetisches Moment. Dadurch erscheint die Nordpol/Südpol- Ausrichtung und die darauffolgende gegenseitige Anziehung/Abstoßung dieser kolloidalen magnetischen Teilchen selbst in mittelmäßig starken Magnetfeldern auszubleiben, was zu ihrer Stabilität in Lösung beiträgt. Demnach lassen sich kolloidale magnetische Teilchen nicht problemlos als solche aus einer Lösung trennen, selbst wenn kraftvolle Elektromagneten verwendet werden, sondern stattdessen wird dazu ein magnetisches Gefälle benötigt, das in dem Testmedium, in dem die Teilchen suspendiert sind, erzeugt werden muss, um die einzelnen Teilchen abtrennen zu können. Magnetische Teilchen mit den oben beschriebenen Eigenschaften können wie in US-Patenten Nr. 4.795.698, 5.512.332 und 5.597.531 beschrieben hergestellt werden.
II. Durch Schwerkraft unterstützte Immobilisierung mit internem Gefälle
1 zeigt eine aufgebrochene Ansicht eines Trenngefäßes 10 nach einer ersten Ausführungsform der Erfindung. Das Gefäß 10 umfasst ein Paar gegenüberliegende parallele Wandelemente 12 und 14, die durch lotrechte Wände 16 voneinander getrennt sind, wodurch eine Innenkammer definiert wird. Eine ferromagnetische Fangkonstruktion aus einer Vielzahl von längsgerichteten Elementen wird auf einer Innenfläche der Kammer unterstützt und wird von dieser getragen. Beispielsweise ist ein Maschengeflecht 18 aus Nickel auf der Innenfläche der Wand 14 positioniert und wird darauf mit einem Klebstoff festgehalten.
Ein Teil des Maschengeflechts 18 ist in 2 gezeigt. Das Maschengeflecht wird durch Galvanisierungstechniken geformt, so dass es keine verwebten oder überlappenden Zwischenabschnitte gibt, die nicht interessierende Substanzen durch Kapillaranziehung auf unerwünschte Weise einfangen würden. Zu geeigneten Maschengeflechten zählen Nickel-Gitter, wie sie in der Elektronenmikroskopie verwendet werden und von Polysciences, Inc., aus Warrington, Pennsylvania, erhältlich sind (beispielsweise Katalog-Nr. 8424N). Das Maschengeflecht umfasst eine Vielzahl von Längselementen 18a, die mit Querelementen 18b verbunden sind und ein Gitter zur mechanischen Unterstützung bilden. Der Abstand zwischen den Längselementen 18a sollte mindestens doppelt so groß sein wie der Durchmesser der zu sammelnden Teilchen. Wenn das Gefäß 10 in einem quer zu den Längselementen 18a liegenden Magnetfeld positioniert wird, wird an beiden Seiten jedes Längselements 18a magnetisch markiertes Zielmaterial gesammelt. Zur Bildung einer einschichtigen linearen Anordnung der Zielteilchen auf der Innenfläche der Wand 14, die das Maschengeflecht 18 trägt, sollte die Höhe der Längselemente 18a nicht größer sein als der durchschnittliche Durchmesser der Zielteilchen. Die Anzahl Zielteilchen, die im Gefäß 10 gefangen werden kann, entspricht dem Doppelten der Gesamtlänge der Längselemente 18a, dividiert durch den durchschnittlichen Durchmesser der Zielteilchen. Die ferromagnetische Fangkonstruktion und somit auch die Kammer können somit eine Größe aufweisen, die ausreicht, um die Sammlung praktisch aller Zielteilchen, die in einer Probe aus Testflüssigkeit vorliegen, zu ermöglichen.
BEISPIEL 1
Leukozytendifferenzierung in Vollblut
Es wurde ein Gefäß 10 mit Längselementen 18a konstruiert, die sich über 150 μm an einer 5 mm × 3 mm großen Region der Wand 14 entlang erstreckten. Die Längselemente 18a waren 5 μm hoch, 20 μm breit und durch Zwischenräume von 63 μm voneinander getrennt. Die Stützelemente 18b waren 48 μm breit. Die Höhe der Kammer betrug 0,13 mm und das Volumen der Kammer betrug 2 μl. Zur Sammlung von Leukozyten, die einen durchschnittlichen Durchmesser von 10 μm aufweisen, betrug demnach die Teilchen-Sammelkapazität 30.000. Eine solche Sammelkapazität reicht aus, um im Wesentlichen alle Leukozyten im Kammervolumen zu sammeln.
Eine Testflüssigkeit wurde hergestellt, indem 0,4 μg einer 130 nm CD45-markierten Ferroflüssigkeit, 3 ng Acridinorange und 10 ng Ethidiumbromid zu 1 μl Blut hinzugefügt wurden. Die Testflüssigkeit wurde 10 Minuten inkubiert und im Gefäß 10 abgelegt. Das Gefäß wurde dann zwischen ein Paar Magneten 20a und 20b platziert, wie in 3 gezeigt, wobei das Maschengeflecht 18 auf dem Boden der Kammer positioniert wurde, damit sich die markierten Zellen unter dem Einfluss von Schwerkraft in Richtung des Maschengeflechts absetzen konnten und dann an den Längselementen des Maschengeflechts in den innen erzeugten Regionen mit hohem Gefälle an den Längselementen ausgerichtet werden konnten. Zur Verbesserung der Sicht auf das gefangene Material kann die in 3 gezeigte Anordnung dann umgedreht werden, damit sich das nicht interessierende Material an einer vom Maschengeflecht 18 entfernt liegenden Stelle absetzen kann.
Acridinorange wird von den nukleierten Zellen absorbiert, die bei Anregung in blauem Licht (460–500 nm) dann grünes Licht ausstrahlen. Mit derselben Beleuchtung senden intrazytoplasmische Körnchen von Granulozyten rotes Licht aus. Ethidiumbromid wird nur von Zellen mit nicht intakten Membranen (d. h. toten Zellen) absorbiert und sendet unter blauem Licht tiefrotes Licht aus. Die optische Reaktion des Materials in der Kammer auf blaues Licht wurde durch ein umgedrehtes Mikroskop 22 beobachtet. Das resultierende Foto von 4A wurde unter einer Kombination aus blauem Licht (das die von den eingefangenen Zellen ausgesendete Fluoreszenz sichtbar macht) und weißem Umgebungslicht (das das ferromagnetische Maschengeflecht sichtbar macht) aufgenommen. Die eingefangenen fluoreszierenden Zellen lassen sich problemlos von anderen Blutbestandteilen unterscheiden.
Eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Zelltypen lässt sich durch Nachweis ausgewählter Emissionsspektren und Lichtstreuungseigenschaften der gesammelten Zelle erreichen. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass Sonden mit verschiedenen Spezifitäten und unterschiedlicher Fluoreszenzanregung und Emission zur Differenzierung zwischen eingefangenen ausgerichteten Zellen verwendet werden können. Ferner können ein oder mehrere Anregungswellenlängen zur Diskriminierung zwischen Zielen oder zwischen den Zielen und der Fangkonstruktion verwendet werden. 4B zeigt beispielsweise dieselben gesammelten Zellen unter monochromatischem blauem fluoreszierenden Licht. Die Fangkonstruktion ist nicht mehr problemlos sichtbar und die gesammelten Leukozyten sind einfach zu unterscheiden. Zur Beobachtung der Zellen könnte dann ein Standardmikroskop herangezogen werden.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Unterscheidung zweier Zelltypen. In diesem Fall wurden Leukozyten von anderen Zelltypen abgetrennt und unter den ausgerichteten Leukozyten wurden lebende Zellen von toten Zellen mithilfe eines Farbstoffs unterschieden. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass beliebige zwei (oder mehr) Zelltypen mit unterschiedlichen Sonden voneinander unterschieden werden können. Beispiele: fötale nukleierte Erythrozyten aus dem Blut der Mutter, zirkulierende Tumorzellen (Epcam⁺ CD45^–) von normalen nukleierten Blutzellen, Thrombozyten (CD41⁺, PAC-1^–) von aktivierten Thrombozyten (CD41⁺, PAC-1^–) und verschiedene Untergruppen von Leukozyten. Wichtige Leukozyten-Untergruppen, die in menschlichem Blut vorkommen, sind u. a. CD4⁺ oder CD8⁺ Zellen (T-Lymphozytenzellen); CD56⁺ Zellen (NK-Zellen); CD19⁺ Zellen (B-Lymphozyten); CD14⁺ Zellen (Monozyten); CD83⁺ Zellen (dendritische Zellen); CD33⁺, CD66a⁺ oder CD64⁺ Zellen (Granulozyten); CD66a⁺CD66b⁺ Zellen (aktivierte Granulozyten); CD34⁺ Zellen (Vorläuferzellen); und CD90w⁺ Zellen (hämatopoetische Stammzellen).
BEISPIEL 2
Immunphänotypische Differenzierung in Vollblut
Eine Blutprobe wird mit einem fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff und Ferroflüssigkeit, die mit einem Antikörper gegen ein Zelloberflächenepitop, wie z. B. CD4 exprimiert auf T-Helfer-Lymphozyten und Monozyten oder CD34 auf Vorläuferzellen, markiert ist, inkubiert. Die Inkubation kann in einem Trenngefäß oder außerhalb eines Trenngefäßes erfolgen. Das Gefäß wird dann in ein Magnetfeld gebracht und die Zellen mit dem Zelloberflächenantigen, das von der bioaktiven Ferroflüssigkeit erkannt wird, richten sich auf beiden Seiten der ferromagnetischen Linien aus. Obwohl alle nukleierten Zellen fluoreszierend markiert sind, sind nur die Zellen, die neben den ferromagnetischen Linien liegen, Zielzellen und werden von einem optischen Nachweissystem, das so angeordnet ist, dass es wie hiernach weiter beschrieben Zellen entlang der Linien scannt, als solche identifiziert.
Wenn die Zielzellen nicht häufig vorkommen, wie dies bei Vorläuferzellen in peripherem Blut, identifiziert durch CD34 bei normalen Spendern (1–10 CD34⁺ Zellen/μl) der Fall ist, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass nicht interessierende Zellen, die zufallsbedingt an den ferromagnetischen Linien vorliegen, die Genauigkeit der Zählung beeinflussen. Die Wahrscheinlichkeit für zufallsbedingtes Vorliegen von nicht interessierenden Zellen an einer ferromagnetischen Linie und somit einer falschen Zählung dieser Zelle als Zielzelle, kann durch Verringerung der Gesamtlänge der ferromagnetischen Linien reduziert werden. Dies lässt sich durch Verringerung der Anzahl ferromagnetischer Linien in der Kammer erreichen.
Ein anderer Weg ist der Verzicht auf die Verwendung eines fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoffs und statt dessen Verwendung eines fluoreszierend markierten monoklonalen Antikörpers oder anderer Sonden, die gegen denselben Zelltyp gerichtet sind wie die bioaktive Ferroflüssigkeit. Vorzugsweise ist diese Sonde gegen ein anderes Epitop gerichtet als die bioaktive Ferroflüssigkeit. Bei dieser Vorgehensweise werden nur die Zielzellen fluoreszierend markiert und als solche identifiziert. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, dass es eine höhere Sensitivität des Nachweissystems erfordert. Weitere Markierungsstrategien sind diejenigen, die allgemein in der Flusszytometrie zum Einsatz kommen und als Multifarb- und/oder multidimensionale Analyse bekannt sind. In diesem Fall wird eine bioaktive Ferroflüssigkeit zur Ausrichtung der interessierenden Teilchen an den ferromagnetischen Linien und eine Vielzahl von monoklonalen Antikörpern oder andere antigenspezifische Sonden, die mit verschiedenen Fluorochromen markiert sind, zur Identifizierung verschiedener Eigenschaften oder Populationen innerhalb der immunmagnetisch immobilisierten Teilchen verwendet.
III. Durch externes Feld unterstützte Immobilisierung mit internem Gefälle
Bei Trennverfahren nach einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden sowohl intern erzeugte als auch extern angelegte magnetische Gefälle zum Sammeln und Immobilisieren magnetisch reagierender Zielsubstanzen verwendet. Ein ungleichförmiges Magnetfeld wird an ein Trenngefäß angelegt. Das externe magnetische Gefälle bewegt die magnetisch reagierenden Teilchen zu einem ferromagnetischen Fangmittel. Das angelegte Magnetfeld induziert auch Magnetisierung einer ferromagnetischen Fangkonstruktion, die in dem Gefäß unterstützt wird. Während sich die magnetisch reagierenden Teilchen zu der ferromagnetischen Fangkonstruktion bewegen, geraten sie unter den zusätzlichen Einfluss des intern erzeugten Gefälles und werden zur Fangkonstruktion gezogen. Wenn die Fangkonstruktion eine entsprechende Konfiguration aufweist, werden die magnetisch reagierenden Teilchen immobilisiert und richten sich an der Fangkonstruktion entlang aus, so dass sie durch eine transparente Wand einer vom Trenngefäß definierten Kammer analysiert werden können. Wenn das Zielmaterial entsprechend markiert ist, lässt sich die Fluoreszenz oder Lichtstreuung durch die Wand messen, um die Menge des Zielmaterials in der Testprobe zu quantifizieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erzwingt das angelegte Magnetfeld eine Bewegung der magnetisch reagierenden Teilchen gegen die Schwerkraft, was zusätzlich zur Trennung der markierten Teilchen von den unmarkierten Teilchen beiträgt und so die nichtspezifische Sammlung von Teilchen verringert.
Zielsubstanzen, die mit den oben beschriebenen magnetisch reagierenden kolloidalen Teilchen markiert sind, können in einem Auffanggefäß 10 wie in 5A und 5B gezeigt gesammelt werden. Das Gefäß 10 umfasst ein wannenförmiges Trägerelement 12 mit einer darin geformten Vertiefung und ein oberes Wandelement 14. Das Wandelement 14 ist so konfiguriert, dass es zur Definition einer Kammer 11, die von der Innenfläche des Wandelements 14 und den Innenflächen des Trägerelements 12 begrenzt wird, in das Trägerelement 12 passt. Das Wandelement 14 besteht aus einem nichtmagnetischen transparenten Material, wie z. B. Glas, Quarz oder durchsichtiger Kunststoff. Das Trägerelement 12 besteht ebenfalls aus einem nichtmagnetischen Material und ist vorzugsweise ebenfalls durchsichtig.
Das Wandelement 14 bedeckt einen Teil der in dem Trägerelement 12 geformten Vertiefung, um an gegenüberliegenden Längsenden der Kammer 11 die Öffnungen 16a und 16b zu schaffen. Die freiliegenden vertieften Teile 18a und 18b des Trägerelements 12 bieten Aufnahmen, in die ein Tropfen der Testflüssigkeit für Analysezwecke gegeben werden kann. Diese Flüssigkeit kann dann in die Kammer 11 fliegen. Der Eintritt der Flüssigkeit in die Kammer 11 kann durch Kapillarwirkung verstärkt werden, wenn die Kammer ausreichend schmal ist. Bezugszeichen (nicht gezeigt) können auf dem Wandelement 14 geformt oder aufgedruckt sein, um Mittel zum Messen des in der Kammer 11 enthaltenen Flüssigkeitsvolumens zu erhalten.
Eine ferromagnetische Fangkonstruktion wird durch Adhäsion gestützt oder ist auf der Innenfläche des Wandelements 14 geformt. In der in 5A und 5B gezeigten Ausführungsform umfasst die ferromagnetische Fangkonstruktion eine Vielzahl von lithografisch definierten ferromagnetischen Linien 20, die auf der Innenfläche des Wandelements 14 geformt sind. Die Wände der Kammer 11 sind optional mit einem Material wie z. B. BSA, Silikon oder einem negativ geladenen Oberflächenüberzug beschichtet, um chemisch oder biologisch inerte freiliegende Innenflächen bereitzustellen. Es ist wichtig, ein Aufbauen elektrostatischer Ladung auf den Wandflächen zu eliminieren, um die nichtspezifische Bindung von Zielteilchen oder freiem magnetischem Material an den Wänden der Kammer zu begrenzen.
Wenn das Gefäß 10 in ein Magnetfeld gestellt wird, werden die ferromagnetischen Linien 20 magnetisiert. Die magnetischen Gefälle, die von diesen Linien 20 erzeugt werden, sind mit den Gefällen vergleichbar, die für einen kreisförmigen Draht mit demselben Querschnittsbereich berechnet wurden. Die Breite der ferromagnetischen Linien hat keinen Einfluss auf die einschichtige Anordnung der Teilchen entlang der magnetischen Linien, aber die Breite beeinflusst die Stärke des magnetischen Gefälles. Die Lücken zwischen den Linien 20 sind vorzugsweise mindestens doppelt so groß wie der Durchmesser des Zielteilchen. Optional kann eine einzelne Linie für die Sammlung verwendet werden.
Die Dicke der magnetischen Linien wird so gewählt, dass sie der Größenordnung der magnetisch reagierenden, zu sammelnden Zielteilchen entspricht, so dass die Zielteilchen sich an gegenüberliegenden Seiten 7 der Linien in einer Monoschicht ausrichten. Deshalb können die Linien 20 eine Dicke in der Größenordnung der Dicke der zu sammelnden Teilchen aufweisen. Vorzugsweise sind die Linien 20 dünner als der Durchmesser der zu sammelnden Teilchen. Wenn die zu sammelnden Teilchen menschliche Lymphozyten in der Größenordnung von 10 μm Durchmesser und die ferromagnetischen Linien 20 ca. 5 μm dick sind, richten sich die Zellen in einer einzelnen Schicht mit einer Dicke von ca. 10 μm aus. Es ist besonders bevorzugt, wenn die magnetischen Linien signifikant dünner sind als der Durchmesser der zu sammelnden Teilchen. Magnetische Linien in der Größenordnung von 0,25 μm können beispielsweise zum Sammeln von Teilchen mit einem Durchmesser von 10 μm verwendet werden.
Solch dünne ferromagnetische Linien können mit den Methoden hergestellt werden, die zurzeit bei der Herstellung von Computerchips zur Anwendung kommen. Bei solchen Verfahren wird die Oberfläche des Wandelements mit einer Dampfabscheidungstechnik, wie z. B. Vakuumevaporation oder Sputtering, zunächst mit einem ferromagnetischen Material beschichtet. Eine solche Technik liefert eine Metallschicht auf der eventuellen Innenfläche des Gefäßes. Die Kombination aus ferromagnetischem Material und dem zur Bildung des Wandelements verwendeten Material sollte so ausgewählt werden, dass das ferromagnetische Material ausreichend am Wandelement anhaftet. Eine Schicht aus lichtempfindlichem Polymer oder Photoresist wird dann auf die beschichtete Oberfläche des Wandelements aufgebracht und einem Muster ultravioletten Lichts ausgesetzt, das dem gewünschten Muster der ferromagnetischen Fangkonstruktion (oder eines Negativbilds davon, je nach eingesetztem Photoresist) entspricht. Der Photoresist wird dann entwickelt, um unerwünschte Teile der Metallschicht freizulegen, die durch Ätzen, wie z. B. nasschemisches Ätzen oder reaktives Ionenätzen, entfernt werden können. Alternativ können die Linien mit einem Abhebeverfahren gebildet werden, bei dem zunächst ein Photoresist-Muster auf das Wandelement aufgebracht und nach der Abscheidung der ferromagnetischen Beschichtung wieder entfernt wird.
Solche lithografischen Verfahren können zur Herstellung eines gewählten Musters ferromagnetischer Metallisierung auf einem einzelnen Wandelement oder auf einem großflächigen Substrat, das später in eine Vielzahl von Wandelementen unterteilt wird, verwendet werden. Diese lithografischen Techniken können erheblich preiswerter sein als die Verwendung von Galvanisierung oder Elektroformung, die für dickere Linien verwendet werden würde. Dünne Linien neigen von Natur aus dazu, glatter zu sein als ihre dickeren Gegenstücke. Diese Konsistenz ist ein Nebenprodukt der Herstellungstechnik. Glättere Linien sind wichtig, weil die induzierten Magnetfelder ebenfalls konsistenter sind. Da so kleine Linien verwendet werden, schwankt die Stärke des Magnetfelds entlang einer relativ „holperigen" Linie stark, was zum Verklumpen des gesammelten magnetischen Materials führt. Somit führen eine glättere ferromagnetische Fangkonstruktion und konsistentere Magnetfelder zu gleichmäßiger beabstandetem magnetischem Material, was die automatische Untersuchung des gesammelten Materials erleichtert.
Die Trennung einer magnetisch reagierenden Zielsubstanz mit dem Gefäß 10 wird nun in Verbindung mit verschiedenen magnetischen Anordnungen beschrieben, bei denen als beispielhafte Zielsubstanz menschliche Lymphozyten verwendet werden, die mit wie in US-Patenten Nr. 4.795.698, 5.512.332 und 5.597.531 und in US-Patentanmeldung Nr. 08/482.448 beschrieben hergestellten magnetischen Teilchen markiert sind.
6 zeigt das Gefäß 10, das in einem im Wesentlichen gleichmäßigen, durch Feldlinien 30 gezeigten in einer Lücke zwischen den beiden Magneten 21 entgegengesetzter Polarität erzeugten Magnetfeld positioniert ist. Für die richtige Magnetisierung ist die Längsachse der ferromagnetischen Fangkonstruktion lotrecht zu den Feldlinien 30 orientiert.
7 ist ein computergeneriertes Diagramm, das die Pfade 40 zeigt, denen zahlreiche magnetisch reagierende Teilchen 41 folgen, nachdem das Gefäß in einem homogenen Magnetfeld positioniert wurde. Magnetisierte ferromagnetische Linien 20 mit einer Dicke von 5 μm sind vom Ende gezeigt. Die meisten der Teilchen in der Kammer bleiben von den internen magnetischen Gefällen unbeeinflusst und fallen schließlich unter dem Einfluss der Schwerkraft zum Boden der Kammer.
In der zur Erzeugung von 7 verwendeten Computersimulation wurde davon ausgegangen, dass alle Teilchen in der Kammer magnetisch reagieren. Bei einer tatsächlichen Trennung sind die meisten Zellen nicht magnetisch reagierend und setzen sich deshalb unter dem Einfluss der Schwerkraft auf dem Kammerboden ab. Die verhältnismäßig wenigen Zielzellen sammeln sich in linearen Monoschichten entlang der ferromagnetischen Linien.
Um quantitative Informationen über die Zielteilchen zu erhalten, würde wünschenswerterweise ein reproduzierbarer und hoher Anteil der Teilchen von der Vorrichtung gesammelt werden. Um Informationen über verhältnismäßig seltene Ereignisse zu erhalten, beispielsweise über zirkulierende Tumorzellen, fötale Zellen im Blut der Mutter oder hämatopoetische Stammzellen, müssen praktisch alle Zielteilchen gesammelt werden. Zur Verwendung verhältnismäßig dünner ferromagnetischer Konstruktionen zur Ausrichtung der Teilchen wird ein Verfahren benötigt, das die Zellen in der Kammer „aufwischt", damit die Teilchen in die räumlich begrenzten Regionen mit hohem internen Gefälle bewegt werden. Ein Weg zum „Aufwischen" der Teilchen wäre die Verwendung einer engen Kammer. Wie in 7 gezeigt reicht eine Kammerdicke von knapp unter 100 μm für ferromagnetische Linien von 5 μm aus, aber dies würde ein kleines Kammervolumen erfordern, was die Möglichkeit zur Beobachtung seltener Spezies einschränken würde. Bei Verwendung einer langen Kammer zur Erhöhung des Volumens wäre eine längere ferromagnetische Fangkonstruktion notwendig und die Zeit, die benötigt wird, um die Fangkonstruktion nach dem gesammelten Zielmaterial abzusuchen, wäre zu lang. Alternativ könnte man die Kammer umdrehen, so dass die Schwerkraft dazu beitragen würde, dass sich alle Teilchen auf den Drähten wie oben in Zusammenhang mit der ersten Ausführungsform beschrieben absetzen. Bei Flüssigkeiten mit einer heterogenen Population, die von nicht interessierenden Spezies dominiert wird, kann es aber sein, dass magnetisch markiertes Material nicht durch eine dicke Schicht von abgesetztem nicht interessierendem Material dringen kann, um die ferromagnetische Fangkonstruktion zu erreichen, was zum Verlust der Selektivität und zur Überfüllung des Nachweisbereichs führt. Ein weiterer Weg wäre die Erhöhung der Feldstärke der Magnete, aber wie in Formel II gezeigt müsste die externe Feldstärke zur Verdopplung des Bereichs des Gefälles um das Achtfache erhöht werden.
Eine Methode der vorliegenden Erfindung verwendet ein ungleichmäßiges angelegtes Magnetfeld zur Magnetisierung der ferromagnetischen Fangkonstruktion und zur Bereitstellung eines externen Gefälles lotrecht zur Fangkonstruktion, um die magnetisch reagierenden Teilchen, die anfänglich nicht im Einflussbereich der internen magnetischen Gefälle sind, „aufzuwischen". Das angelegte Magnetfeld liefert vorzugsweise ein externes Gefälle ausreichender Größe, damit die Zellen zu der ferromagnetischen Fangkonstruktion bewegt werden, wo sie dann durch das interne magnetische Gefälle an der Wand neben der Fangkonstruktion immobilisiert werden. Attribute eines solchen Feldes sind beispielsweise die, dass es in einer Ebene parallel zur ferromagnetischen Fangkonstruktion im Wesentlichen homogen ist und dass das Feld lotrecht zur horizontalen Längsachse der Konstruktion orientiert ist. Darüber hinaus enthält das Feld ein vertikales externes Gefälle, das in Richtung zur Fangkonstruktion zunimmt, und das externe Gefälle ist so groß, dass magnetisch reagierendes Material zur Fangkonstruktion transportiert wird. Ein Magnetfeld, das einen solchen doppelten Zweck erfüllen könnte, kann mit unterschiedlichen Magnetkonfigurationen erreicht werden. Eine vorteilhafte Anordnung von externen Magnetquellen ist in 8 gezeigt.
8 zeigt das Trenngefäß 10 an einer bevorzugten Stelle relativ zu einem Paar entgegengesetzter Magnetpole 23 und 24 mit einer Lücke dazwischen. Die unteren Flächen der Pole 23 und 24 sind zur Lücke hin verjüngt, so dass das an die Kammer angelegte Magnetfeld ungleichmäßig ist und ein im Wesentlichen vertikales Gefälle aufweist, das wirksam ist, um magnetisch reagierende Teilchen in der Kammer gegen die Schwerkraft zu der ferromagnetischen Fangkonstruktion an der oberen Wand zu treiben.
9 zeigt die Pfade, denen solche Teilchen in der Kammer in Abwesenheit der ferromagnetischen Fangkonstruktion folgen würden. Wie zu sehen ist, reicht der Einfluss des extern angelegten Gefälles aus, um die Teilchen im Wesentlichen vertikal zur oberen Kammerwand zu bewegen.
10 zeigt die Pfade, denen die Teilchen in der Kammer folgen, sowie die Wirkung auf sie, die durch die Anwesenheit einer ferromagnetischen Fangkonstruktion mit lithografisch definierten Linien mit einer Dicke von 5,0 μm und einer Breite von 20 μm verursacht wird. Wie zu sehen ist, neigt das extern angelegte Gefälle dazu, Teilchen, die sich zunächst im unteren Teil der Kammer befunden hatten, in die Regionen mit hohem Gefälle, das durch Magnetisierung der ferromagnetischen Linien erzeugt wurde, zu bewegen.
Die genauen Konstruktionsparameter für die in 8 (und in Verbindung mit einem automatischen Beobachtungssystem in 11) gezeigten Magneten 23 und 24, die zur Auslösung eines erwünschten starken inneren Gefälles und zum Anlegen eines erwünschten starken vertikalen externen Gefälles benötigt werden, hängen von anwendungsspezifischen Bedingungen ab, wie z. B. der Magnetisierung der verwendeten magnetischen Teilchen, der Masse und Größe der Zielteilchen und der Viskosität und Temperatur des flüssigen Mediums. Ein Fachmann kann aus diesen Überlegungen heraus entsprechende Konstruktionsparameter auswählen. Unter Versuchsbedingungen wie hierin beschrieben könnte ein Paar Seltenerd-Magnete (Crucible Magnets; Elizabethtown, Kentucky) mit einer inneren Magnetisierung von 1200 Gauss und einem spitzen Verjüngungswinkel von 20° verwendet werden, die zur Bildung einer Lücke, durch die die gefangenen Teilchen beobachtet werden können, in einem Abstand von 5,0 mm angeordnet sind. Die Oberfläche des Trenngefäßes war 2,0 bis 3,0 mm unterhalb der Lücke angeordnet. Obwohl 10 eine Kammerhöhe von 200 μm zeigt, wurden auch schon Kammerhöhen von 1 mm in Modellen hergestellt und tatsächlich zur Sammlung und Quantifizierung von magnetisch markierten Zellen verwendet.
Natürlich kann die Kapazität der magnetischen Linien überschritten werden, indem versucht wird, so viel Zielmaterial einzusammeln, dass eine Monoschicht aus Zielteilchen nicht mehr möglich ist. In diesem Fall muss die Testprobe verdünnt oder eine größere Kammer mit einer größeren linearen Kapazität der magnetischen Linien verwendet werden.
So wird eine Analyse des magnetisch markierten Zielmaterials möglich. Die Ausrichtung des Zielmaterials in einer Monoschicht gestattet ferner die Durchführung der Analyse mit automatischen Mitteln, beispielsweise mit mechanisch-automatischer Zellzähltechnik. Das Zielmaterial kann durch das transparente Wandelement beleuchtet werden und die optischen Eigenschaften des Zielmaterials können nachgewiesen werden. Optische Eigenschaften umfassen die direkte Beobachtung des Zielmaterials und die Messung von adsorbiertem, gestreutem oder fluoreszierendem Licht. Optional kann die Zielmaterialanalyse durch Hinzufügen eines Substrats oder einer anderen Verbindung unterstützt werden. Andere Verbindungen sind z. B. die Verwendung von Sonden, die eine charakteristische Determinante des Zielmaterials erkennen, und nukleare, zytoplasmische oder Membranfarbstoffe. Diese Sonden können entweder intrinsisch fluoreszierend oder fluoreszierend markiert sein oder sie können nur bei Bindung an die charakteristische Determinante fluoreszieren. So wird die Differenzierung des Zielmaterials, d. h. der Leukozyten, mit einer spezifischen Bindungssubstanz möglich, die Untergruppen des Zielmaterials erkennt.
Obwohl die oben aufgeführten Beschreibungen anhand der Sammlung von Leukozyten beispielhaft gezeigt sind, können auch andere Arten von Zellen in dem erfindungsgemäßen Gerät immobilisiert werden. Beispielsweise können durch Verwendung von CD41 oder CD61 Thrombozyten gewählt werden. Die Differenzierung in Untergruppen umfasst eine Analyse ihres Aktivierungszustands (Erkennung durch CD62p oder PAC-1) oder die Anwesenheit von Körnchen (Erkennung durch CD63 oder LDS-751). Die Immobilisierung von Erythrozyten wird an einer anderen Stelle in dieser Spezifikation besprochen.
Ein bemerkenswerter Vorteil des erfindungsgemäßen Geräts und des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Tatsache, dass die Fähigkeit linear einschichtige Teilchen zu präsentieren, die Möglichkeit bietet, sequenzielle Reaktionen auf schnelle und hoch effiziente Weise durchzuführen. Somit kann das erfindungsgemäße Gerät und das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur zur Erleichterung der Zellanalyse zur Bestimmung von Zelloberflächenmerkmalen, z. B. T-Zell-, B-Zell-Vorläuferzellen und Untergruppen-Marker davon, verwendet werden, sondern sie können im Prinzip auch für die Analyse von intrazellulären Bestandteilen oder Genen herangezogen werden. Bei einer solchen Analyse würden zunächst die interessierenden Zellen eingefangen und ausgerichtet werden. An diesen Schritt würde sich eine Reihe von sequenziellen Reaktionen anschließen, die zur Permeation der Zelle, Markierung der interessierenden Teilchen und Amplifikation des Signals auf den markierten Teilchen führen würde. Diese Möglichkeit bietet einen klaren Vorteil gegenüber den existierenden zytometrischen Techniken.
Die folgenden Beispiele beschreiben die erfindungsgemäßen Aspekte ausführlicher.
BEISPIEL 3
Eine direkt beschichtete Ferroflüssigkeit wurde gemäß US-Patentanmeldung 08/482.448 hergestellt. Die Teilchen der Ferroflüssigkeit wurden mit CD45-Antikörper beschichtet, der an Leukozyten bindet. Die Ferroflüssigkeit wurde in einem HEPES-Puffer von pH 7,5 bei 100 μg/ml aufbewahrt.
Die Zielzellen waren CEM-Zellen mit einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen/ml. 100 μl der Zellen wurden zehn Minuten bei Raumtemperatur mit 10–30 μl Ferroflüssigkeit inkubiert, bevor die Auffangkammer beladen wurde.
Ein Trenngefäß wurde mit einer Kammer ausgestattet, die Abmessungen von 0,1 mm × 5 mm × 20 mm und ein Kammervolumen von 10 μl aufwies. Die ferromagnetische Fangkonstruktion umfasste lithografisch geformte Linien aus Nickel mit einer Dicke von ca. 5 μm und einer Breite von ca. 25 μm. Die Linien waren mit Zwischenräumen von 100 μm voneinander beabstandet.
Nach der Inkubation wurden ca. 10 μl der magnetisch markierten CEM-Zellen in die Auffangkammer geladen. Der Innenraum der Kammer wurde zunächst in Abwesenheit eines Magnetfelds beobachtet. Dabei zeigte sich, dass fast alle Zellen sich auf dem Boden der Kammer abgesetzt hatten. Die Kammer wurde dann zur Resuspension der Zellen agitiert. Anschließend wurde die Auffangkammer in ein Magnetfeld gestellt, das von zwei quadratischen Magneten (wie die in 2 gezeigten Magneten) geformt wurde. Das Gefäß befand sich in einer ungleichmäßigen Region des Felds außerhalb des im Wesentlichen gleichförmigen Felds direkt zwischen den Magneten (d. h. an Stelle 33 in 6). Dann wurde ein externes Gefälle in vertikaler Richtung an die Kammer angelegt, um die magnetisch reagierenden Teilchen zu dem ferromagnetischen Fangmittel zu drücken.
Während sich die Auffangkammer im Magnetfeld befand, stand sie auf einem Mikroskopständer und die Zellen wurden durch eine transparente Wand der Kammer beobachtet. Fast alle Zielzellen waren an den ferromagnetischen Fanglinien in einer einzelnen Schicht ausgerichtet. Die meisten Zeller waren ca. zehn Sekunden nach Platzierung der Kammer in das Magnetfeld ausgerichtet. Nach einer Minute stoppte jede wahrnehmbare Zellbewegung.
In einem anderen Versuch wurde die beladene Kammer in ein im Wesentlichen homogenes Magnetfeld gestellt, wie durch die Kammer 10 in 6 gezeigt. Obwohl die magnetisierten Drähte ca. 50% der magnetisch markierten CEM-Zellen sammelten, setzte sich eine große Anzahl Zellen auf dem Boden der Auffangkammer ab.
BEISPIEL 4
Der Versuch aus Beispiel 3 wurde mit menschlichem Vollblut wiederholt. 100 μl Vollblut wurde mit 10–30 μl der in Beispiel 1 beschriebenen CD45 direkt markierten Ferroflüssigkeit inkubiert. Nach zehnminütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Auffangkammer mit 10 μl der Testprobe beladen und in die oben beschriebene Magnetanordnung gestellt. Innerhalb einer kurzen Absetzperiode von einer Minute konnten sich die nicht zu den Zielzellen zählenden roten Zellen auf dem Boden der Kammer und entfernt von dem ferromagnetischen Fangmittel absetzen, damit die angestrebten Leukozytenzellen beobachtet werden konnten. Bei mikroskopischer Untersuchung waren die Zielzellen entlang der ferromagnetischen Fanglinien ausgerichtet. In anderen Versuchen mit fluoreszierend markierten nukleierten Zellen war keine Absetzperiode notwendig, um die gesammelten Zielzellen (d. h. die Leukozyten) eindeutig identifizieren zu können.
Obwohl dieses Beispiel die Ausrichtung von Leukozyten in Vollblut veranschaulichte, können die Leukozyten durch Hinzufügen von Sonden zu den gewünschten Leukozyten-Untergruppen noch weiter unterschieden oder differenziert werden. Wie in Beispiel 1 erwähnt ist es für den Fachmann offensichtlich, dass das in diesem Beispiel beschriebene Verfahren für zahlreiche Arten der Zelltrennung und/oder Zelldifferenzierung verwendet werden könnte.
BEISPIEL 5
Die vorliegende Erfindung eignet sich auch zur Durchführung kompetitiver Immunoassays. Proteine, Hormone oder andere Blutbestandteile können mit einer Vorrichtung, der der in Verbindung mit 1A und 1B beschriebenen ähnelt, in Vollblut gemessen werden. Magnetische Teilchen, die direkt oder indirekt an zu analysierende Blutbestandteile binden, könnten zusammen mit einer fluoreszierenden, chemilumineszenten oder anderen nachweisbaren Sonde, die direkt oder indirekt an den zu analysierenden Bestandteil bindet, in eine Blutprobe eingeführt werden. Nach Einführung der Blut, magnetisch reagierende Teilchen und die nachweisbare Sonde enthaltenden Lösung in die Vorrichtung, wird die Vorrichtung in ein ungleichmäßiges Magnetfeld gestellt und so orientiert, dass Schwerkraft und das extern angelegte Gefälle zusammenwirken und einander verstärken anstatt in entgegengesetzter Richtung zu wirken. Das magnetisch markierte Protein, Hormon oder ein anderer magnetisch markierter Blutbestandteil wird zur magnetischen Fangkonstruktion herunter gezogen. Die überschüssige nachweisbare Sonde würde in Lösung bleiben. Die Zellbestandteile im Blut würden durch die Schwerkraft ebenfalls zur magnetischen Fangkonstruktion herunter gezogen werden. Der Nachweis der nicht gebundenen nachweisbaren Sonde durch Fluoreszenzemission, Chemilumineszenz oder andere Mittel wäre durch eine transparente Wand der Auffangvorrichtung möglich. Das Signal der Sonde, beispielsweise Lichtemission, von der nicht gebundenen nachweisbaren Sonde würde zunächst von Zellen, wie z. B. Erythrozyten, blockiert werden. Diese Zellen würden sich schließlich absetzen und eine Schicht über der (den) magnetischen Fangkonstruktion(en) bilden, damit Emissionsfluoreszenz oder ein lichtstreuendes Sondensignal ungehindert nachgewiesen werden kann.
III. Automatische optische Analyse immobilisierter Zielteilchen
Wie oben in Verbindung mit 6 angemerkt, kann das Grenzgebiet unter einem Paar entgegengesetzter Magneten mit rechteckigem Querschnitt das gewünschte vertikale externe Gefälle liefern und innere Magnetisierung der ferromagnetischen Fangkonstruktion auslösen. Für die mikroskopische Beobachtung des gesammelten Materials, bei der das optische Beobachtungssystem durch eine endliche Brennlänge von z. B. unter 5 mm begrenzt ist, ist es wünschenswert, den vertikalen Abstand zwischen der oberen Wand des Auffanggefäßes und der Oberseite der das Feld liefernden magnetischen Elemente zu verringern. Im Allgemeinen kann dieses Ziel in einer magnetischen Anordnung mit zwei entgegengesetzten Polflächen, die durch eine Lücke voneinander getrennt sind, erreicht werden, wobei die Polflächen so geformt sind, dass sie zur Lücke hin sich verjüngende Flächen besitzen, wie in 8 gezeigt.
Die Bereitstellung eines wünschenswert kurzen Abstands zwischen der Oberseite der magnetischen Anordnung und der Oberseite des Gefäßes ermöglicht die Verwendung verschiedener automatischer Beobachtungsmittel. Da Zielteilchen in einem geordneten Muster auf der Innenfläche einer transparenten Kammer gesammelt werden, kann ein automatisches Beobachtungssystem ferner so konfiguriert werden, dass es eine Relativbewegung zwischen dem Gefäß und den Licht fangenden Elementen des Beobachtungssystems zulässt, um die gesammelten Zielteilchen für die automatische Zählung zu „verfolgen". Dazu kann beispielsweise die Spektralanalyse Licht, das von den gesammelten Zielteilchen emittiert oder absorbiert wird, analysieren.
Ein solches automatisches Analysesystem 100 ist in 11 gezeigt. Das Analysesystem 100 umfasst optische Verfolgungs- und Strahlenanalysekomponenten ähnlich denen, die in der Ton- und Datenspeicherungstechnik zum Lesen von CDs verwendet werden. Kurz gesagt ist ein Paar Laserdioden 110 und 112 mit einer Stromzufuhr 114 verbunden, um parallele Lichtstrahlen zu erzeugen. Ein Strahl wird vom Analysesystem zur Lokalisierung und Verfolgung von Linien der ferromagnetischen Fangkonstruktion verwendet. Der andere Strahl dient dem Nachweis der Anwesenheit gesammelter Zielteilchen neben einer lokalisierten Linie. Eine Relativbewegung zwischen den optischen Elementen des Analysesystems 100 wird durch die mechanische Verfolgungseinheit 116 ermöglicht. Die Koordination der Funktionen des Analysesystems 100 erfolgt über einen Mikroprozessor 118.
Der Laser 112 erzeugt den Verfolgungsstrahl, der durch dichroitische Spiegel 120 und 122 übertragen und auf der Innenfläche des Trenngefäßes 10 durch die Objektivlinse 124 fokussiert wird. Der Verfolgungsstrahl wird von der Innenfläche des Trenngefäßes reflektiert und durch dichroitische Spiegel 122 und 120 zurück zu einem Photodetektor 126 übertragen. Der Photodetektor 126 erzeugt als Reaktion auf den Empfang des reflektierten Lichts ein elektrisches Signal, das dem Mikroprozessor 118 zur Verfügung gestellt wird. Die mechanische Verfolgungseinheit 116 wird zur Bewegung des Objektivs in die angenommene Richtung der Linien der ferromagnetischen Fangkonstruktion vom Mikroprozessor 118 betätigt. Der Mikroprozessor 118 ist so programmiert, dass er Abweichungen im elektrischen Signal vom Photodetektor 126 nachweisen kann, um der mechanischen Verfolgungseinheit 116 ein Feedback-Signal zur Verstellung der Position des Objektivs 124 in einer zu den Linien der ferromagnetischen Fangkonstruktion lotrechten Richtung zuzuführen.
Wenn das Objektiv zur Verfolgung der Linien der ferromagnetischen Fangkonstruktion bewegt wird, wird der Laser 110 betätigt, um einen Lichtstrahl zum Nachweis der Anwesenheit gesammelter Zielteilchen zu erzeugen. Das Licht vom Laser 110 wird durch dichroitische Spiegel 128 und 122 übertragen und zur Bildung eines Punkts neben dem Brennpunkt des Verfolgungsstrahls auf der Innenfläche des Auffanggefäßes fokussiert. Das von den Zielteilchen reflektierte Licht wird durch die dichroitischen Spiegel 122 und 128 zum Photodetektor 130 übertragen. Der Photodetektor 130 erzeugt ein für das von den Zielteilchen reflektierte Licht repräsentatives elektrisches Signal, das zum Mikroprozessor 118 übertragen wird. Der Mikroprozessor 118 ist so programmiert, dass er Schwankungen im elektrischen Signal vom Photodetektor 130 überwacht, um ein Analyseausgangssignal zu liefern, wie z. B. ein Zählsignal an einer Ausgangsklemme 132. Es versteht sich, dass ein solches Ausgangssignal zur Bereitstellung von Informationen zur Menge und den jeweiligen Positionen der gesammelten Zielteilchen weiter bearbeitet werden kann.
In alternativen Ausführungsformen könnte zur Beleuchtung der Kammer ein Laser anstelle von zwei Lasern wie im Analysesystem 100 gezeigt verwendet werden. Optional könnte der Laser auch ganz entfallen und die Kammer könnte mit einer Leuchtdiode oder einer anderen Lichtquelle, einschließlich Lichtquellen, die die Kammer von den Seiten her oder von unten beleuchten, beleuchtet werden. In anderen Ausführungsformen können Spektralanalysenkomponenten, wie z. B. optische Filter und Gitter, sowie Beleuchtungskomponenten mit verschiedenen Spektraleigenschaften in einem automatischen Analysesystem zur Durchführung einer Spektralanalyse des von den gesammelten Teilchen emittierten Lichts verwendet werden, während die Objektivlinse des Analysesystems zur Verfolgung der ferromagnetischen Fangkonstruktion bewegt wird.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, ein Mittel zur Vibration der Kammer aufzunehmen, um zu verhindern, dass magnetische Teilchen durch Reibung an den Wänden der Kammer festgehalten werden. Es hat sich gezeigt, dass die Vibration der Kammer die magnetische Trenneffizienz unter gewissen Umständen erhöht. Zur Erleichterung der Vibration kann das Trenngefäß auf einem piezoelektrischen Kristall 123 befestigt werden, der zur Vibration der Kammer mit einer erwünschten Frequenz mit einer elektrischen Stromquelle verbunden ist.
IV. Quantitative Bestimmungen von biologischen Flüssigkeitsbestandteilen
A. Anreicherung seltener Spezies und Probenvorbereitung
Mit abnehmender Häufigkeit einer Zielpopulation wird der zuverlässige Nachweis, die Zählung und Untersuchung der Zielpopulation immer schwieriger. Die Spezifität der identifizierenden Komponenten, d. h. Sonden oder einer Kombination von Sonden, muss erhöhte Anforderungen erfüllen und es ist notwendig, größere Volumen der Körperflüssigkeit zu verarbeiten und eine spezielle Anreicherungstechnik der Zielspezies zu verwenden. Die Tabelle II unten verdeutlicht dies, indem sie die Häufigkeit verschiedener Zellpopulationen unter den nukleierten Zellen im peripheren Blut gesunder Probanden zeigt.
TABELLE II
Für Analysen seltener vorkommender Zellen, wie z. B. CD34+-Zellen oder eine Untergruppe dieser Zellen, oder im Fall von zirkulierenden Tumorzellen mit Krankheitspotenzial muss die Blutmenge, die benötigt wird, um die Zielpopulation zuverlässig nachweisen, zählen und untersuchen zu können, erheblich größer als 1 μl sein. Eine praktische Auswirkung für die Analyse größerer Blutvolumen ist eine erheblich verlängerte Bearbeitungszeit. Für die Analyse einer Blutprobe von 1 ml mit Flusszytometrie werden beispielsweise die Erythrozyten in der Probe in der Regel aufgelöst, was mit einer 10fachen Verdünnung der Probe einhergeht. Für eine typische Probenflussrate von 1 μl/Sek benötigt das 10 ml-Volumen der gelösten Probe somit 2,78 Stunden für die Analyse. Somit wird deutlich, dass es wünschenswert ist, die Zielpopulation anzureichern und ihre Konzentration zu erhöhen. Zur Erhöhung der Konzentration des gewünschten Ziels in der zu analysierenden Probe können unterschiedliche Anreicherungsmethoden verwendet werden, so dass eine ausreichende Anzahl Zielteilchen im Trenngefäß vorhanden ist, damit ein Nachweis möglich ist. Der Erfolg dieser Verfahren hängt vom Übertrag von nicht zu den Zielzellen zählenden Teilchen, der Wiedergewinnung der Zielzellen, der Fähigkeit ihrer Konzentration und der Fähigkeit ihrer genauen Analyse nach dem Verfahren ab. Die Einführung einer Körperflüssigkeitsprobe, deren Zielzellen konzentriert sind und bei der die nicht zu den Zielzellen zählenden Teilchen verringert sind, in ein Trenngefäß gestattet die Zählung und Untersuchung der Zielpopulation.
Bei einem Verfahren zur Probenvorbereitung kann ein Separator mit externem Gefälle wie in US-Patent Nr. 5.186.827 beschrieben verwendet werden. Eine bioaktive Ferroflüssigkeit, die Zellen mit epithelialem Ursprung identifiziert, wird beispielsweise in ein Gefäß gegeben, das 10 ml Blut enthält. Nach angemessener Inkubation wird die Probe in den Separator mit externem Gefälle überführt. Nach der Trennung werden die Blutbestandteile, die nicht magnetisch an der Gefäßwand anhaften, entfernt, während die gewünschte Zielsubstanz an der Wand des Separators haften bleibt. Die getrennten Zellen können jetzt in einem kleineren Volumen resuspendiert werden, wenn das Trenngefäß aus dem Magnetfeld genommen wird.
Der resuspendierten Probe können fluoreszierend markierte Sonden hinzugefügt werden. Nach der Inkubation wird die Probe erneut in einen magnetischen Separator mit externem Gefälle gelegt. Nach der Trennung wird der Überstand (einschließlich überschüssiger Reagenzien) entfernt und die getrennten Zellen werden in einem Volumen resuspendiert, das der Kammer des erfindungsgemäßen Trenngefäßes entspricht. Unter der Annahme, dass die 10 ml Blut 10⁸ Zellen enthielten, würde ein Übertrag von 0,01 zu 10⁴ Zellen führen, was innerhalb des Bereichs der Zellfangkapazität des erfindungsgemäßen Geräts liegt. Bei einer Zielzellhäufigkeit von 1 pro 10⁷ und einer Fangeffizienz von 70% würden 7 Zielzellen gefangen werden, was zur Identifizierung und weiteren Charakterisierung ausreicht. Die das Antigen exprimierenden Zellen, auf die die Ferroflüssigkeit abzielte, richten sich zusammen mit anderen Zellen, die unspezifisch an die Ferroflüssigkeit binden, an den ferromagnetischen Linien aus. Zellen, die aus anderen Gründen gefangen wurden, beispielsweise durch Einschluss, richten sich nicht aus, was zur weiteren Reinigung der weniger häufig vorkommenden Zelltypen führt.
Die Identifikation und weitere Charakterisierung der Zielzellen kann anhand der Unterschiede in der Streuung und dem Spektrum des fluoreszierenden Lichts erfolgen.
Eine weitere Verbesserung lässt sich durch Verwendung einer fluoreszierenden Form der bioaktiven Ferroflüssigkeit erreichen, bei der die Zielzellen dann anhand der Fluoreszenzmenge, die von den Zellen emittiert wird, von den unspezifisch gebundenen Zellen unterschieden werden können, d. h. die Dichte des Antigens auf der Oberfläche der Zielzelle unterscheidet sich höchstwahrscheinlich von der Dichte der unspezifisch gebundenen Ferroflüssigkeit an nicht zur Zielgruppe gehörenden Zellen. Im Gegensatz zur Flusszytometrie können die einzelnen Zielzellen, die mit der vorliegenden Erfindung isoliert wurden, erneut untersucht werden, weil ein optisches Nachweissystem so konfiguriert werden kann, dass es den Ort der interessierenden Zielteilchen identifiziert und dokumentiert. Wenn der Ort der Zielzellen nachgewiesen und dokumentiert wurde, kann das Immobilisierungsgefäß dann mit einem anspruchsvolleren optischen Nachweissystem, wie z. B. mit einem konfokalen Mikroskop, untersucht werden.
B. Quantitative Analyse
Bei der Durchführung einer quantitativen Analyse bestimmter Zellarten ergibt sich die Schwierigkeit, dass vor dem magnetischen Einfangen der interessierenden Zellart mehrere Verdünnungen der ursprünglichen Blutprobe durchgeführt werden müssen. Nach Durchführung mehrerer Verdünnungen erfordert die Bestimmung der Konzentration der eingefangenen Spezies im Verhältnis zum ursprünglichen Blutvolumen die Kenntnis des genauen Verdünnungsverhältnisses und der magnetischen Fangeffizienz. Diese Mengen können durch Hinzufügen von Markern zur ursprünglichen Blutprobe bestimmt werden. Ein erster Marker zur Bestimmung der Verdünnung umfasst eine bekannte Konzentration genau identifizierbarer Teilchen, die mit genügend magnetisch reagierendem Material beladen werden, um mit praktisch vollständiger Effizienz gefangen werden zu können. Der zweite Marker zur Bestimmung der magnetischen Fangeffizienz der Zielzellen umfasst eine bekannte Konzentration genau identifizierbarer Teilchen, die mit ungefähr derselben Menge magnetisch reagierendem Material beladen werden wie die Zielzelle. Der zweite Marker kann magnetisch reagierende Perlen umfassen, die mit ausreichend magnetischem Material geformt wurden, um ein Magnetmoment zu erhalten, das dem Magnetmoment der mit der Ferroflüssigkeit markierten Zielteilchen im Wesentlichen entspricht und ein ähnliches Flüssigkeitstransportverhalten aufweist. Alternativ kann der zweite Marker magnetisch inerte Körper umfassen, die mit einer Bindungssubstanz beschichtet sind, die im Wesentlichen dieselbe Anzahl Bindungsstellen und dieselbe Bindungsaffinität aufweist wie die Zielzellen. Der zweite Marker kann auch mit anderen Techniken mit einem analogen Sammelverhalten gegenüber den Zielteilchen versehen werden. Diese Verfahren werden in den folgenden Beispielen besprochen.
BEISPIEL 6
Probenaufbereitung mit kalibrierter Konzentration unter Verwendung magnetisch beladener Marker
5 ml Reagenz, das eine für Epithelzellen spezifische Ferroflüssigkeit enthält, 10.000 grüne fluoreszierende 10 μm-Perlen mit ca. 500 Ferroflüssigkeitsteilchen pro Perle und 10.000 rote fluoreszierende 10 μm-Perlen mit ca. 5000 Ferroflüssigkeitsteilchen pro Perle werden zu 10 ml Blut gegeben. Nach 15minütiger Inkubation wird die Probe 10 Minuten in einen magnetischen Separator der in US-Patent Nr. 5.186.827 beschriebenen Art gelegt. Der Teil der Probe, der nicht an der Gefäßwand anhaftet, wird verworfen, das Gefäß wird aus dem Magnetfeld entfernt und die Zellen, die sich an der Wand gesammelt haben, werden in 2 ml Lösung, wie z. B. isotonischer Puffer oder eine Lösung, die die Zellmembran permeabilisiert, resuspendiert. Die resuspendierten Zellen werden 5 Minuten in das Magnetfeld gebracht und die Probe, die nicht an der Gefäßwand anhaftet, wird verworfen. Die Zellen, die sich an der Wand gesammelt haben, werden in 0,2 ml Lösung, die fluoreszierend markierte Antikörper enthält, wie z. B. CD45 PerCP zur Identifikation von Leukozyten, anti-EPCAM-PE und/oder Anticytokeratin PE zur Identifikation von Epithelzellen, resuspendiert. Optional kann die Probe erneut getrennt werden, überschüssige Antikörper werden verworfen und die gesammelten Zellen werden in einer Lösung resuspendiert, die einen Nukleinsäurefarbstoff mit fluoreszierenden Eigenschaften enthält, die spektral von der Fluoreszenz unterschieden werden können, die von den fluoreszierenden konjugierten monoklonalen Antikörpern erzeugt wird.
Leukozyten, Epithelzellen, grüne und rote Perlen können dann mit den hierin beschriebenen Verfahren oder mit traditionellen Zählverfahren gezählt werden. Eine Messung von beispielsweise 10 Epithelzellen, 5000 grünen Perlen und 7000 roten Perlen würde darauf hinweisen, dass bei einer Dichte der Epithelzellen von 500 Ferroflüssigkeitsteilchen/Zelle ihre Konzentration bei (10 × 10.000/5000)/10 = 2 Epithelzellen pro ml Blut liegen würde; und bei einer Dichte der Epithelzellen von 5.000 Ferroflüssigkeitsteilchen/Zelle wäre ihre Konzentration bei (10 × 10.000/7.000)/10 = 1,4 Epithelzellen pro ml Blut.
Obwohl dieses Beispiel die Verwendung von zwei Markern zur genauen Bestimmung der Epithelzellkonzentration beschreibt, ist offensichtlich, dass jede Zellkonzentration bestimmt werden kann.
BEISPIEL 7
Probenaufbereitung unter Verwendung von Ferroflüssigkeit bindenden Markern
Die Zellanalyse aus Beispiel 6 wurde wiederholt, aber hier wurden 10.000 rote und 10.000 grüne Perlen mit 500 bzw. 5.000 Antigenen pro Perle dem Blut hinzugefügt. (Viele Antigene sind geklont und rekombinante Proteine können erhalten werden, die von den Antikörpern erkannt werden). Anschließend wird Ferroflüssigkeit zugefügt, die sowohl die Perlen als auch Epithelzellen identifiziert. In diesem Beispiel wird eine genaue Schätzung der absoluten Zahl der Zielzellen erhalten und es wird darüber hinaus bestimmt, ob die für die Zielzellen spezifische Ferroflüssigkeit funktioniert.
Beispiele 6 und 7 oben beschreiben ein Probenaufbereitungsverfahren zur Kontrolle der Durchführung eines Zellanalysesystems. Ferner geben sie die Konzentration der gemessenen Zielzellen pro Volumeneinheit an. Eine gemäß dem oben beschriebenen Verfahren aufbereitete Probe kann dann mittels Flusszytometrie oder mit dem hierin beschriebenen Gerät quantitativ analysiert werden. Das Volumen in dem hierin beschriebenen Gerät ist bekannt, während das Volumen, das durch einen Flusszytometer läuft, durch die Perlen bestimmt werden muss oder durch tatsächliches Messen des Volumens, in dem der Flusszytometer die Zielzellen gemessen hat. Unter Verwendung von präzisen Probenabgabetechniken (Pipette) werden das Volumen der Probe, des Reagenz und des Verdünnungsmittels genau gemessen. In dem vergleichbaren Verfahren mit dem erfindungsgemäßen Gerät reicht andererseits die genaue Abgabe der Probe und der Reagenzien aus, um die Zellkonzentration zu bestimmen (ohne für die Volumenbestimmung gleichzeitig die Perlen zählen zu müssen). In ihrer einfachsten Ausgestaltung ist es aber wünschenswert, die präzise Abgabe der Probe überflüssig zu machen. Dazu kann der oben beschriebene Weg mit den Perlen zur Bestimmung der genauen Verdünnung der Probe anstelle der Bestimmung des genauen Volumens, aus dem die Zielzellen analysiert werden, verwendet werden, wie oben beschrieben.
Beispiel 8
Bestimmung der Zellkonzentration unter Verwendung einer kalibrierten Markerlösung
Ca. 50 μl einer Lösung mit für die Zielzellen spezifischer Ferroflüssigkeit, Reagenzien, wie z. B. fluoreszierende Nukleinsäurefarbstoffe zur Erleichterung der Identifikation der Zielzellen und eine bekannte Konzentration von 10 μm-Perlen, beispielsweise 1.000 pro μl, mit physikalischen Eigenschaften, die sie von den Zielzellen unterscheiden, und die mit einer Ferroflüssigkeitsmenge im selben Bereich wie die Zielzellen markiert sind, werden in ein erfindungsgemäßes Trenngefäß eingeführt. Beispielsweise durch Kapillarwirkung wird zusätzlich ein Tropfen Blut in das Gefäß eingeführt. Blut und Flüssigkeit werden gemischt und inkubiert. Das Gefäß wird dann in ein Magnetfeld gestellt und die Zielzellen und die Perlen werden an den ferromagnetischen Linien ausgerichtet. Aus der Anzahl gezählter Perlen kann das tatsächliche Blutvolumen, das mit der Flüssigkeit gemischt wurde, nun bestimmt werden. Wenn beispielsweise 6.000 Perlen gemessen werden und das Kammervolumen 10 μl beträgt, ist das Volumen der Markerflüssigkeit in der Kammer 6.000/1000 = 6 μl. Das Blutvolumen in der Kammer beträgt somit 10 μl – 6 μl = 4 μl. Wenn 32.000 Zielzellen gemessen werden, liegt die Konzentration der Zielzellen bei 32.000/4 = 8.000 Zellen/μl. Aus der obigen Beschreibung sollte hervorgehen, dass weder das exakte Blutvolumen noch das exakte Volumen der Markerflüssigkeit bekannt sein muss, solange die Konzentration der Perlen in der Markerflüssigkeit bekannt ist und das Blut und die Perlenlösung vollständig miteinander gemischt sind.
Wie in Beispiel 7 können Perlen hinzugefügt werden, deren Antigenmenge der Antigenmenge auf den Zielzellen entspricht. Zusätzlich zu den in Beispielen 5, 6 und 7 beschriebenen Merkmalen liefert dieses Vorgehen ferner ein Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit der Technik und der zur Auswahl und zum Nachweis des Zielmaterials verwendeten Reagenzien.
C. Beurteilung von Parametern von Erythrozyten
Wichtige Parameter in der Hämatologie sind Hämoglobin und Hämatokrit, das mittlere Zellvolumen (MCV), die mittlere Hämoglobinkonzentration (MCH), die mittlere zelluläre Hämoglobinkonzentration (MCHC) und die Erythrozytenzahl (RBC). Zur Messung der Erythrozyten wird eine stärkere Verdünnung des Blutes benötigt als bei der Messung von Leukozyten oder Untergruppen davon (in der Größenordnung von einer um das 1000fache höheren Konzentration). Um eine stärkere Verdünnung zu erhalten, kann in der Kammer ein höheres Flüssigkeitsvolumen verwendet werden. Es könnte auch vorteilhaft sein, die Kammerhöhe zur Reduzierung der Anzahl ausgerichteter Erythrozyten zu verringern.
Erythrozyten können durch Verwendung einer für Erythrozyten sgezifischen Ferroflüssigkeit, wie z. B. mit Glycophorin-A markierte Ferroflüssigkeit oder mit Transferrin markierte Flüssigkeit, wobei letztere nur unreife Retikulozyten, d. h. RNA-enthaltende Erythrozyten, erkennt, identifiziert und ausgerichtet werden. Erythrozyten, die an solche Ferroflüssigkeiten gebunden sind, lassen sich von nukleierten Zellen, die den Transferrin-Rezeptor tragen, durch das Fehlen von nuklearer Fluoreszenz unterscheiden. Alternativ könnte die Anwesenheit von Hämoglobin in den Erythrozyten genutzt werden, um die Erythrozyten magnetisch reaktionsfähig zu machen. Das im Hämoglobin anwesende Eisen kann reduziert oder mit einem bekannten Verfahren magnetisiert werden, so dass die roten Blutzellen von den internen Gefällen, die in der Nähe der ferromagnetischen Linien erzeugt werden, immobilisiert werden. Bei einem solchen Verfahren wird keine Ferroflüssigkeit benötigt, um die Erythrozyten zu den ferromagnetischen Linien zu ziehen und die Rate, mit der sie zu den ferromagnetischen Linien gezogen werden würden, wäre proportional zur Hämoglobinmenge in den Zellen.
Wenn die Erythrozyten an den ferromagnetischen Linien ausgerichtet sind, können Lichtstreuungs- und Absorptionsmessungen an den einzelnen Zellen vorgenommen werden, die die Beurteilung von Größe, Volumen und Hämoglobingehalt nach den Verfahren zur Durchführung von Messungen in bekannten Hämatologie-Analysatoren, angepasst an das erfindungsgemäße Gerät, gestatten.
Die Möglichkeit zur Beurteilung der Form der einzelnen Erythrozyten liefert klinisch wertvolle Informationen. Elliptozyten, Leptozyten, tränenförmige RBC, Sphärozyten, Sichelzellen, Schistozyten, Acanthozyten, Echinozyten, Stomatozyten, Xerozyten sind alles Formen von roten Blutzellen, die mit Krankheitszuständen verbunden sind, die durch Beurteilung der Erythrozyten in Hämatologie-Analysatoren nicht genau definiert werden können. Optional können die Erythrozyten durch Hinzufügen von Sonden, die Erythrozyten-Untergruppen erkennen, wie z. B. CD71 oder Transferrin, weiter differenziert werden. Die Fluoreszenz oder ein anderes nachweisbares Signal der Sonde könnte so durch das transparente Wandelement analysiert werden. Die Beurteilbarkeit von Formen von roten Blutzellen könnte durch Messung der Oberfläche der Zellmembran signifikant verbessert werden, was durch Hinzufügen eines fluoreszierenden Membranfarbstoffs zur Verdünnungsflüssigkeit erzielt werden kann. Die Messung der Gesamtmenge Fluoreszenz pro Zelle ist dann zur Gesamtmenge der Membran proportional. Aus der Oberfläche der Zellmembran und der Analyse der Lichtstreuung und der Fluoreszenzsignale lässt sich dann die Form der Erythrozyten ableiten. Die Verdünnung der Blutprobe kann durch Hinzufügen von Perlen zur Verdünnungsflüssigkeit bestimmt werden und anschließend können Anzahl und Volumen der Erythrozyten bestimmt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch der Hämatokrit (Zellvolumen/(Gesamtblutvolumen)) bestimmt werden.
BEISPIEL 9
Messung des Immunstatus und der Funktion in Vollblut
Ein kritisches Erfordernis für die Immunfunktion ist die Fähigkeit der Lymphozyten, durch die unterschiedlichen Körpergewebe zu zirkulieren. Diese Zirkulation verwendet Blut und Lymphe für den Transport und die auf der Lymphozytenoberfläche anwesenden Antigenrezeptoren ermöglichen die Überwachung einer Stelle, an der Antigen in den Blutstrom eintreten könnte. Gedächtnis-T-Zellen, die für Antigene spezifisch sind, die mit bestimmten Infektionskrankheiten assoziiert sind, wie z. B. Masern, Mumps, Tetanus, HIV oder Lyme-Borreliose, kommen seltener vor. Ihre Anzahl steigt aber dramatisch, wenn Antigen wieder in den Körper eindringt. Für krankheitsspezifische T-Zellen spezifische monoklonale Antikörper können hergestellt werden, und nach der Markierung mit Ferroflüssigkeit können die antigen(krankheits-) spezifischen Gedächtnis-T-Zellen ausgerichtet und gezählt werden. Alternativ können alle spezifischen oder Untergruppen von T-Zellen ausgerichtet werden. Das erfindungsgemäße Gerät könnte dann zur Bestimmung der spezifischen Reaktionen von Untergruppen von Zellen auf immunologische Reize verwendet werden.
Sequenzielle Nebenreaktionen generischer oder krankheitsspezifischer Antigene oder anderer Marker könnten ebenfalls zur Bestimmung des Funktionsstatus und der Kapazität neben anderen Merkmalen der ausgerichteten Zellen verwendet werden. Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, dass die Reaktion der einzelnen Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation gemessen werden kann. Diese Art von Analyse ist ein offensichtlicher Vorteil gegenüber der Messung der Immunfunktion durch Flusszytometrie, die lediglich die Messung einzelner Zellantworten gestattet.
Eine Anordnung zur Durchführung von „Neben-" oder sequenziellen Reaktionen an immobilisiertem Zielmaterial ist in 12 zu sehen. Zur Aufnahme der Testprobe und der jeweiligen Reagenzien für die Reaktion mit dem Zielmaterial sind Flüssigkeitszufuhrmittel wie z. B. Pumpen, Schwerkraft-Reservoirs oder Spritzen 220, 222 vorgesehen. Flüssigkeitsleitungen 224, 226 sind zum Durchleiten von Strömen der jeweiligen Flüssigkeiten zu einem Mischventil 228 vorgesehen. Das Mischventil 228 ist so ausgelegt, dass es einen oder mehrere Flüssigkeitsbestandteile auswählt, um sie zu mischen und einer Einlassöffnung 230 des Trenngefäßes 210 zuzuführen. Das Trenngefäß 210 enthält ferner eine Auslassöffnung 232 zum Leiten einer Flüssigkeitsströmung aus dem Trenngefäß 210 heraus. Das Trenngefäß 210 kann mit magnetischen Anordnungen und manuellen oder automatischen optischen Beobachtungsmitteln wie oben beschrieben verwendet werden, so dass Zielmaterial darin mit einer ferromagnetischen Fangkonstruktion 218 immobilisiert und anschließend mit den von dem Flüssigkeitszufuhrmittel zugeführten und vom Multiport-Ventil 228 in Reihe und/oder Kombination ausgewählten Flüssigkeiten sequenziellen Reaktionen unterworfen werden kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann das Gerät aus 12 zur Durchführung einer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Differenzierung zwischen Merkmalen von Zell-Untergruppen verwendet werden. Bei einem solchen Verfahren werden die gewünschten Zellarten im Gerät immobilisiert. Die Zellmembranen werden vor oder nach der Immobilisierung durch ein entsprechendes Reagenz permeabilisiert. Anschließend wird an den immobilisierten, permeabilisierten Zellen eine in-situ-Hybridisierung durchgeführt, indem sequenzielle Flüsse von Reagenzien durch das Gefäß geleitet werden. Für die Fluoreszenz-Hybridisierung umfassen die jeweiligen Reagenzien fluoreszierende Sonden.
Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders gut für die Durchführung von sequenziellen Reaktionen aufgrund der im Vergleich mit anderen Separatoren mit internem Gefälle geringen Größe der ferromagnetischen Linien. Die Linien können relativ dünn sein, da die Gefäßwand für mechanische Unterstützung sorgt. Daher werden Zellen oder andere Teilchen durch die relativ großen internen Gefälle, die in der Nähe der Linien erzeugt werden, stark immobilisiert. Diese starke Immobilisierungskraft führt zu einem größeren Widerstand gegenüber hydraulischen Kräften bei der Durchführung von Nebenreaktionen an immobilisierten Substanzen. Bisher wiesen magnetische Fangkonstruktionen signifikant größere Abmessungen auf, um ein internes Gefälle mit ausreichender räumlicher Ausdehnung zu erhalten, das magnetische Teilchen immobilisiert. Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass Schwerkraft und/oder ein angelegtes externes Gefälle verwendet werden kann, um magnetisierbare Teilchen zu einer Region mit starkem internem Gefälle in der Nähe einer Fangkonstruktion mit relativ kleinen Abmessungen zu ziehen, die auf einer Seite der Kammer des Trenngefäßes gestützt ist.

Claims

Gerät zur Beobachtung magnetisch reagierender mikroskopischer Teilchen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, umfassend: ein Gefäß mit einer durchsichtigen Wand und einer darin geformten Kammer zur Aufnahme des flüssigen Mediums; eine ferromagnetische Fangkonstruktion, die in einem lithografischen Verfahren auf der durchsichtigen Wand geformt wird; und ein magnetisches Mittel zur Induzierung eines internen magnetischen Gefälles in der Nähe der ferromagnetischen Fangkonstruktion, wodurch die magnetisch reagierenden Teilchen über die Wand neben der Fangkonstruktion immobilisiert werden.
Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefäß einen Flüssigkeitseinlass und einen Flüssigkeitsauslass zur Durchleitung einer Flüssigkeitsströmung durch das Gefäß umfasst.
Gerät nach Anspruch 2, umfassend ein mit dem Flüssigkeitseinlass zur sequentiellen Zufuhr mehrerer Reagenzien zum Flüssigkeitseinlass verbundenes Flüssigkeitszufuhrmittel.
Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die ferromagnetische Fangkonstruktion mehrere ferromagnetische Linien mit einem wirksamen Durchmesser unter 30 μm umfasst.
Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Mittel so ausgestaltet ist, dass es zum Transport von Teilchen im Gefäß in Richtung der Fangkonstruktion ein externes Gefälle an das Gefäß anlegt.
Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend ein automatisches optisches Beobachtungssystem zum Nachweis und Zählen der immobilisierten Teilchen.
Gerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das automatische Beobachtungssystem Folgendes umfasst: einen optischen Detektor zum Nachweis der immobilisierten Teilchen; und Verfolgungsmittel zum Scannen des optischen Detektors parallel zu den ferromagnetischen Linien.
Gerät zum Beobachten magnetisch reagierender mikroskopischer Teilchen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, umfassend: ein Gefäß mit einer durchsichtigen Wand und einer darin geformten Kammer zur Aufnahme des flüssigen Mediums; eine ferromagnetische Fangkonstruktion, die auf der durchsichtigen Wand festgehalten wird; ein magnetisches Mittel zur Induzierung eines internen magnetischen Gefälles in der Nähe der ferromagnetischen Fangkonstruktion, wodurch die magnetisch reagierenden Teilchen über die Wand neben der Fangkonstruktions immobilisiert werden; und ein automatisches optisches Beobachtungssystem zum Nachweis und Zählen der immobilisierten Teilchen.
Gerät nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das automatische Beobachtungssystem folgendes umfasst: einen optischen Detektor zum Nachweis der immobilisierten Teilchen; und optische Verfolgungsmittel zum Scannen des optischen Detektors entlang der Fangkonstruktion.
Gerät nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das automatische Beobachtungssystem einen vibrationsfähigen Träger zum Unterstützen und selektiven Vibrieren des Gefäßes umfasst.
Gerät nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der vibrationsfähige Träger einen piezoelektrischen Vibrator umfasst.
Gerät zum Beobachten magnetisch reagierender mikroskopischer Teilchen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, umfassend: ein Gefäß mit einer durchsichtigen Wand und einer darin geformten Kammer zur Aufnahme des flüssigen Mediums; eine ferromagnetische Fangkonstruktion, die auf der durchsichtigen Wand festgehalten wird; ein magnetisches Mittel zur Induzierung eines internen magnetischen Gefälles in der Nähe der ferromagnetischen Fangkonstruktion und zum Anlegen eines externen Gefälles lotrecht zur ferromagnetischen Fangkonstruktion, wodurch die magnetisch reagierenden Teilchen zur Wand neben der Fangkonstruktion transportiert und darauf immobilisiert werden.
Gerät nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Mittel ein Magnetpaar mit spitz zulaufenden Polflächen umfasst, die so angeordnet sind, dass dazwischen zur Aufnahme des Gefäßes eine Lücke entsteht.
Gerät nach Anspruch 12–13, dadurch gekennzeichnet, dass die ferromagnetische Fangkonstruktion mehrere ferromagnetische Linien mit einem wirksamen Durchmesser unter 30 μm umfasst.
Gerät nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die ferromagnetischen Linien durch Adhäsion an der Wand gehalten werden.
Gerät nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die ferromagnetischen Linien durch ein lithografisches Verfahren auf der Wand geformt werden.
Verfahren zur Immobilisierung mikroskopischer, magnetisch reagierender Teilchen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, für Beobachtungszwecke, umfassend folgende Schritte: Bereitstellen eines Gefäßes mit einer Kammer mit einer durchsichtigen Wand und einer ferromagnetischen Fangkonstruktion, die auf der Wand festgehalten wird; Einführen des flüssigen Mediums in die Kammer; Anlegen eines Magnetfelds an die Kammer, um ein internes magnetisches Gefälle in der Nähe der ferromagnetischen Fangkonstruktion zu induzieren; und Beobachten der magnetisch reagierenden Teilchen, die neben der ferromagnetischen Fangkonstruktion gegen die Wand gehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die ferromagnetische Fangkonstruktion mehrere lineare ferromagnetische Elemente umfasst und der Beobachtungsschritt den Schritt des Scannens entlang den linearen ferromagnetischen Elementen mit einem automatischen optischen Nachweissystem umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Beobachtungsschritt den Schritt des Zählens der magnetisch reagierenden Teilchen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Anlegeschritt den Schritt der Orientierung des Gefäßes umfasst, um die ferromagnetische Fangkonstruktion so unter der Kammer anzuordnen, dass die magnetisch reagierenden Teilchen unter dem Einfluss der Schwerkraft zu der Fangkonstruktion transportiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Anlegeschritt das Anlegen eines externen magnetischen Gefälles an das Gefäß zum Transport der magnetisch reagierenden Teilchen zur Fangkonstruktion umfasst.
Verfahren zur Immobilisierung mikroskopischer, magnetisch reagierender Teilchen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, für Beobachtungszwecke, umfassend folgende Schritte: Bereitstellen eines Gefäßes mit einer Kammer mit einer durchsichtigen Wand und einer ferromagnetischen Fangkonstruktion, die auf der Wand festgehalten wird; Einführen des flüssigen Mediums in die Kammer; Anlegen eines Magnetfelds mit einem externen Gefälle an die Kammer, um ein internes magnetisches Gefälle in der Nähe der ferromagnetischen Fangkonstruktion zu induzieren und magnetisch reagierende Teilchen zur Fangkonstruktion zu transportieren; Auffangen der magnetisch reagierenden Teilchen in einer linearen Monoschicht gegen die Wand und neben der ferromagnetischen Fangkonstruktion; und Beobachten der magnetisch reagierenden Teilchen, die neben der ferromagnetischen Fangkonstruktion gegen die Wand gehalten werden.
Verfahren zur Differenzierung biologischer Substanzen zumindest einer ersten und zweiten Art in einer Flüssigkeitsprobe, umfassend folgende Schritte: Markieren der ersten und zweiten Art von biologischen Substanzen mit entsprechenden Markern zur Erzeugung deutlich unterscheidbarer optischer Eigenschaften; Hinzufügen einer Ferroflüssigkeit mit Bindungsaffinität für biologische Substanzen der ersten und zweiten Art zu der Flüssigkeitsprobe; Überführen der Flüssigkeitsprobe in ein Trenngefäß mit einer durchsichtigen Wand, die eine Seite einer Kammer definiert und einer ferromagnetischen Fangkonstruktion, die an der Wand festgehalten wird; Positionieren des Gefäßes in einem Magnetfeld zur Induzierung eines internen Gefälles in der Nähe der Fangkonstruktion, das ausreicht, um die biologischen Substanzen der ersten und zweiten Art entlang der Wand neben der Fangkonstruktion zu immobilisieren; und Beobachten der deutlich unterscheidbaren optischen Eigenschaften der ersten bzw. zweiten Art von biologischer Substanz.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Markierungsschritt folgendes umfasst: Hinzufügen erster und zweiter optischer Marker zu der Flüssigkeitsprobe zur Erzeugung deutlich unterscheidbarer optischer Reaktionen von biologischen Substanzen einer ersten Art bzw. einer zweiten Art; und dass der Beobachtungsschritt den Schritt des Beleuchtens des Gefäßes mit optischer Strahlung zur Erzeugung der deutlich unterscheidbaren optischen Reaktionen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten und zweiten biologischen Substanzen Zelltypen von Leukozyten-Unterpopulationen sind.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Leukozyten-Unterpopulationen lebende und tote Leukozyten enthalten.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten und zweiten biologischen Substanzen erste bzw. zweite Erythrozyten-Unterpopulationen sind.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten und zweiten biologischen Substanzen Zelltypen von Thrombozyten-Unterpopulationen sind.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Beobachtungsschritt die Beobachtung deutlich unterscheidbarer Formen der ersten bzw. zweiten Art von biologischen Substanzen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Substanzen Zelltypen sind und der Beobachtungsschritt das Zählen der immobilisierten Zellen der ersten und zweiten Art und das Bestimmen eines Verhältnisses von immobilisierten Substanzen zur Nettooberfläche der immobilisierten Zellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, umfassend folgende Schritte: Verdünnen der Flüssigkeitsprobe mit einem Verdünnungsmittel, das einen fluoreszierenden Membranfarbstoff enthält; und dadurch gekennzeichnet, dass der Beobachtungsschritt das Messen der Fluoreszenz von den immobilisierten Zellen zur Bestimmung der proportionalen Oberfläche der immobilisierten Zellen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 31, umfassend den Schritt der Durchleitung sequenzieller Ströme von Reagenzien durch das Gefäß zur Erzeugung der deutlich unterscheidbaren optischen Reaktionen.
Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Substanzen jeweils Zellen bestimmter Zellunterpopulationen sind, wobei das Verfahren den Schritt der Permeabilisierung der Zellmembranen vor der Durchleitung der sequenziellen Ströme von Reagenzien durch das Gefäß umfasst.
Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenziellen Ströme von Reagenzien sequenzielle Ströme von Reagenzien zur Erzeugung deutlich unterscheidbarer fluoreszierender optischer Reaktionen umfassen und dass der Beobachtungsschritt die Beleuchtung der immobilisierten Zellen mit einer Beleuchtung, die ausgewählt ist, um die deutlich unterscheidbaren fluoreszierenden Reaktionen zu erzeugen, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Substanz Zellen umfasst und der Beobachtungsschritt das Durchführen einer Hybridisierung in situ der immobilisierten Zellen umfasst.
Verfahren zur Identifizierung immunophenotypischer Unterpopulationen von biologischen Substanzen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, umfassend folgende Schritte: Hinzufügen einer Menge magnetisch reagierender Teilchen mit Bindungsaffinität für die biologischen Substanzen zu dem flüssigen Medium; Hinzufügen mehrerer Sonden mit voneinander unterscheidbaren Fluorochromen zu dem flüssigen Medium; Überführen des flüssigen Mediums in ein Trenngefäß mit einer durchsichtigen Wand, die eine Seite einer Kammer definiert und mit einer ferromagnetischen Fangkonstruktion, die an der Wand festgehalten wird; Positionieren des Gefäßes in einem Magnetfeld zur Induzierung eines internen Gefälles in der Nähe der Fangkonstruktion, das ausreicht, um die biologischen Substanzen entlang der Wand neben der Fangkonstruktion zu immobilisieren; Beleuchten des Gefäßes mit optischer Strahlung, die zumindest ein ausgewähltes Fluorochrom anregen kann; und Beobachten der optischen Reaktion des ausgewählten Fluorochroms.
Verfahren zur Differenzierung von Erythrozyten-Unterpopulationen in einer Flüssigkeitsprobe, umfassend die folgenden Schritte: Behandlung von Erythrozyten in der Flüssigkeitsprobe, so dass sie magnetisch reagieren; Überführen des flüssigen Mediums in ein Trenngefäß mit einer durchsichtigen Wand, die eine Seite einer Kammer definiert und mit einer ferromagnetischen Fangkonstruktion, die an der Wand festgehalten wird; Positionieren des Gefäßes in einem Magnetfeld zur Magnetisierung der magnetisch reagierenden Erythrozyten und zur Induzierung eines internen Gefälles in der Nähe der Fangkonstruktion, das ausreicht, um die Zellen entlang der Wand neben der Fangkonstruktion anzuziehen und zu immobilisieren; und Beobachten der neben der Fangkonstruktion immobilisierten Erythrozyten.
Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass der Behandlungsschritt den Schritt. der Markierung der Erythrozyten mit magnetisierbaren Teilchen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetisierbaren Teilchen mit einer charakteristischen Determinante zumindest einer Unterpopulation von Erythrozyten binden können.
Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetisierbaren Teilchen zumindest eine Bindungssubstanz aus der Gruppe CD71, Glycophorin A und Transferrin umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass der Beobachtungsschritt das Zählen von Erythrozyten-Unterpopulationen mit entsprechenden voneinander unterscheidbaren Formen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 41, umfassend folgende Schritte: Verdünnen der Flüssigkeitsprobe mit einem Verdünnungsmittel, das einen fluoreszierenden Membranfarbstoff enthält; und dadurch gekennzeichnet, dass der Beobachtungsschritt das Messen der Fluoreszenz von den immobilisierten Zellen zur Bestimmung der proportionalen Oberfläche der immobilisierten Zellen umfasst.
Verfahren zur Durchführung einer quantitativen Analyse der Zellen in einem ersten flüssigen Medium, umfassend folgende Schritte: Hinzufügen eines ersten Markers mit einer bekannten Menge erster magnetisch reagierender Teilchen zu dem ersten flüssigen Medium; Hinzufügen einer Menge zweiter magnetisch reagierender Teilchen mit Bindungsaffinität für die Zellen zu dem ersten flüssigen Medium; Überführen des ersten flüssigen Mediums in einem magnetischen Separator zum Trennen der magnetisch reagierenden Teilchen von anderen Bestandteilen des ersten flüssigen Mediums; Resuspendieren der getrennten magnetisch reagierenden Teilchen in einem zweiten flüssigen Medium; Zählen der Menge des ersten Markers und der Zellen in dem zweiten flüssigen Medium zum Bestimmen der Konzentration der Zellen in dem ersten flüssigen Medium, wobei der Zählschritt folgende Schritte umfasst: Überführen des zweiten flüssigen Mediums in eine Kammer eines Trenngefäßes mit einer durchsichtigen Wand und einer ferromagnetischen Fangkonstruktion, die an der Wand festgehalten wird; Positionieren dieses Trenngefäßes in einem Magnetfeld zur Erzeugung eines internen magnetischen Gefälles in der Nähe der ferromagnetischen Fangkonstruktion; und Zählen der gegen die durchsichtige Wand neben der ferromagnetischen Fangkonstruktion immobilisierten Zellen.
Verfahren nach Anspruch 43, umfassend folgende Schritte: Hinzufügen eines zweiten Markers mit einer bekannten Menge dritter magnetisch reagierender Teilchen, deren Magnetmoment ungefähr dem der gebundenen Zellen entspricht, zu dem ersten flüssigen Medium; und dadurch gekennzeichnet, dass der Zählschritt den Schritt des Zählens der Menge des zweiten Markers in dem zweiten flüssigen Medium als Maß für die magnetische Trenneffizienz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 43 oder 44, umfassend den Schritt des Vorbereitens des zweiten Markers durch Bereitstellung einer Menge nicht magnetisch reagierender Teilchen mit einem Bindungsmittel für die zweiten magnetisch reagierenden Teilchen.
Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass der Zählschritt des Schritt des Bereitstellens des zweiten flüssigen Mediums zu einem Flusszytometer umfasst.
Verfahren zur Messung eines hämatologischen Parameters einer Erythrozyten enthaltenden Flüssigkeitsprobe, umfassend: Verdünnen einer ersten Blut enthaltenden Flüssigkeitsprobe mit einem Verdünnungsmittel mit einer bekannten Menge erster magnetischer Teilchen zum Erhalt einer zweiten Flüssigkeitsprobe; Behandlung der Erythrozyten einer der ersten und zweiten Flüssigkeitsproben, so dass sie magnetisch reagieren; Überführen der zweiten Flüssigkeitsprobe in eine Kammer eines Trenngefäßes mit einer durchsichtigen Wand und einer ferromagnetischen Fangkonstruktion, die an der Wand festgehalten wird; Positionieren dieses Trenngefäßes in einem Magnetfeld zur Magnetisierung der Erythrozyten und zum Erzeugen eines internen magnetischen Gefälles in der Nähe der ferromagnetischen Fangkonstruktion; und Zählen der gegen die durchsichtige Wand neben der ferromagnetischen Fangkonstruktion immobilisierten Erythrozyten und ersten magnetischen Teilchen.
Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass der Behandlungsschritt den Schritt der Verbesserung der Magnetisierbarkeit der Erythrozyten durch Hinzufügen eines zweiten magnetischen Teilchens mit Bindungsaffinität für Erythrozyten zu einer der ersten und zweiten Flüssigkeitsproben umfasst.
Verfahren nach Anspruch 47 oder 48, umfassend den Schritt des Hinzufügens einer bekannten Menge eines dritten magnetischen Teilchens mit einer magnetischen Eigenschaft, die der der durch Behandlung magnetisch reagierenden Erythrozyten entspricht, zu einer der ersten und zweiten Flüssigkeitsproben, und dadurch gekennzeichnet, dass der Zählschritt das Zählen der gegen die Fangkonstruktion immobilisierten dritten magnetischen Teilchen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 47 bis 49, umfassend den Schritt des Bestimmens auf Basis der Zählung zumindest eines der Parameter Hämoglobingehalt, Hämatokrit, mittleres Zellvolumen, mittlere Hämoglobinkonzentration und Erythrozytenzahl.