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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft ein Assay-System und insbesondere die Bestimmung
des integrierten glykämischen
Zustands eines Diabetikers durch Messung der Konzentrationsspiegel
von Glucose und proteingebundener Glucose.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Personen,
die unter Diabetes mellitus leiden, haben im allgemeinen einen anormal
hohen Blutzuckerspiegel, weil die Bauchspeicheldrüse keine
ausreichenden Mengen des aktiven Hormons Insulin in den Blutstrom
ausscheidet, um den Kohlenhydratstoffwechsel zu regulieren. Wenn
ein anormal hoher Blutzuckerspiegel, der auch als hyperglykämischer
Zustand bekannt ist, über
längere
Zeiträume
andauern kann, wird das Individuum unter den chronischen Komplikationen
der Diabetes leiden, einschließlich
Retinopathie, Nephropathie, und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Untersuchungen zeigen,
daß bei
diabetischen Patienten, die in der Lage sind, eine normale glykämische Kontrolle
einzuhalten, die Wahrscheinlichkeit für diese schwerwiegenden Komplikationen
stark verringert ist. Daher sind mehrere Tests entwickelt worden,
um den glykämischen
Zustand zu messen und zu kontrollieren.
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Ein üblicher
medizinischer Test zur Kontrolle des glykämischen Zustands durch Diabetiker
ist die direkte Messung des Blut-Glucosespiegels.
Da sich die Blut-Glucosespiegel innerhalb eines Tages verändern, was
durch die Ernährung,
Aktivität
und die Behandlung beeinflußt
wird, und abhängig
von der Natur und dem Schweregrad des individuellen Falls ist, messen
einige Patienten ihren Blut-Glucosespiegel bis zu siebenmal täglich.
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Ausgehend
von dem beobachteten Muster in den gemessenen Glucosespiegeln nehmen
Patient und Arzt gemeinsam Anpassungen in Bezug auf die Ernährung, die
sportliche Betätigung
und die Insulinaufnahme vor, um die Erkrankung besser zu steuern.
Diese Information sollten selbstverständlich für den Patienten sofort verfügbar sein.
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Jedoch
sind wegen der häufigen
Schwankungen der Glucosespiegel an einem Tag auch Tests entwickelt
worden, die unabhängig
von der Ernährung
des Patienten, seiner Aktivität
und/oder der Behandlung sind, und die längerfristige Hinweise auf die
Blut-Glucosespiegel
liefern. Diese Tests messen die Konzentration von glykierten Proteinen
oder "proteingebundener
Glucose" (protein
bound glucose; PBG). Proteine, wie diejenigen, die im Vollblut,
Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind,
reagieren unter nicht-enzymatischen Bedingungen mit Glucose, wobei
glykierte Proteine gebildet werden. Das Ausmaß dieser Reaktion ist direkt
abhängig
von der Glucosekonzentration im Blut.
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Einer
der ersten entwickelten Tests für
glykierte Proteine mißt
glykiertes Hämoglobin,
nämlich
Hämoglobin
A1c (HbA1c), welches
die glykämische
Kontrolle über
einen Zeitraum von ca. 2 bis 3 Monaten widerspiegelt. Andere dieser
Tests messen Serumproteine, wie zum Beispiel das gesamte glykierte
Serumprotein oder ein spezifisches glykiertes Serumprotein, nämlich glykiertes
Albumin. Glykiertes Albumin spiegelt eine mittelfristige glykämische Kontrolle über einen
Zeitraum von etwa 2 bis 3 Wochen wider.
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Eine
weitere Möglichkeit
zur indirekten Abschätzung
der Blutzuckerkonzentration ist die Analyse der Fruktosaminkonzentration.
Glykierte Proteine sind auch als Fruktosamine oder Ketoamine bekannt.
Die Blutproteine werden in vivo durch eine nicht-enzymatische Reaktion
zwischen Glucose und verfügbaren Aminogruppen
von Blutproteinen (hauptsächlich
die ε-Aminogruppe
von Lysinresten und die α-Aminogruppe
der terminalen Aminosäure
des Proteins) glykiert. Die Glucose bindet an eine Aminogruppe des
Proteins, wobei eine Schiff'sche
Base gebildet wird, d.h. ein Glykosylamin oder Aldimin, welches
durch eine molekulare Umlagerung ein stabiles Ketoamin bildet. Diese
Reaktionsabfolge ist in 1a dargestellt.
Im Stand der Technik sind solche Ketoamine generisch als "Fruktosamine" bekannt. Das Ausmaß der Proteinglykierung
und der Fruktosaminbildung ist direkt proportional zur Glucosekonzentration
im Blut. Die Messung der Fruktosaminspiegel in Serum oder Plasma
ist für
die Überwachung
der diabetische Kontrolle nützlich,
weil die Fruktosaminkonzentrationen im Serum oder Plasma den mittleren
Blut-Glucosespiegel über
einen Zeitraum von etwa einem halben Monat widerspiegeln.
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Während diese
individuellen Tests zur direkten und indirekten Messung von Glucose
entwickelt worden sind, gibt es kein praktisches Testsystem, das
es dem Diabetiker oder einem Arzt erlaubt, sowohl den akuten Glucosespiegel
als auch den mittelfristigen oder langfristigen glykämischen
Zustand zu bestimmen. Gegenwärtig
wird der Glucosetest routinemäßig vom
Arzt oder dem Patienten durchgeführt.
Der Test auf glykiertes Protein wird jedoch üblicherweise in einem klinischen
Labor durchgeführt,
wobei komplizierte Verfahren und teure Geräte eingesetzt werden. Die Ergebnisse
dieser klinischen Labortests sind für Arzt und Patient über mehrere
Tage nicht verfügbar.
Diese Verzögerung
bei der Übertragung
von Informationen vermindert den Wert des Testergebnisses. Der Arzt
kann es sogar unterlassen, dem Patienten das Testergebnis mitzuteilen,
und bis zum nächsten
Besuch warten, was mehrere Monate dauern kann. Skandinavische Forscher
konnten kürzlich
zeigen, daß Ärzte und
Patienten, die auf die Testergebnisse der glykierten Proteine aufmerksam
gemacht wurden, eine bessere glykämische Kontrolle hatten, als
diejenige, denen diese Ergebnisse nicht bewußt waren. Man nimmt nunmehr
auch an, daß glykierte
Proteine die auslösenden
Agenzien für
Komplikationen bei der Erkrankung sein können. Daher gibt es einen Bedarf
für die
praktische und schnelle Messung von glykiertem Proteine allein oder
in Kombination mit Glucose, um den integrierten glykämischen
Zustand eines Subjekts zu bestimmen.
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Gegenwärtig gibt
es kein Testsystem, das den integrierten glykämischen Zustand eines Subjekts
bestimmt, um dem Subjekt ein vollständiges Bild von seinem oder
ihrem glykämischen
Status zu liefern, um so die bestmögliche Überwachung und Behandlung zu
erlauben. Besonders nützlich
wäre ein
einziges Instrument zur Bestimmung des integrierten glykämischen
Zustands eines Subjekts, das in der Praxis des Arztes benutzt werden
könnte,
oder sogar noch besser, beim diabetischen Patienten zu Hause. Die
vorliegende Erfindung erfüllt
diese Anforderungen und stellt weitere damit zusammenhängende Vorteile
bereit.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein einziges Testsystem sowie ein
Verfahren zur Bestimmung des integrierten glykämischen Zustands eines Subjekts
durch Messung der Glukosekonzentration und des Spiegels an proteingebundener
Glucose in einer Körperflüssigkeit
eines Subjekts, wie zum Beispiel Vollblut. Die Glucosekonzentration
zeigt den akute glykämischen
Zustand des Subjekts an, während
die Konzentration an proteingebundener Glucose entweder den mittelfristigen
oder den langfristigen glykämischen
Zustand anzeigt. Wahlweise können
auch andere Analyte gemessen werden, die mit dem glykämischen
Zustand zusammenhängen,
wie zum Beispiel Ketonkörper
oder Fettsäurederivate.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Diagnose
von Diabetes.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Analyse der Fruktosaminkonzentration
in weniger als fünf Minuten
oder in fünf
Minuten bereit, sogar in Abwesenheit eines Reaktionsbeschleunigers.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1a zeigt
die Reaktionsabfolge für
die Bildung von Fruktosamin in vivo.
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1b zeigt,
daß unter
alkalischen Bedingungen das Fruktosamin ein Enaminol bildet, ein
reduzierendes Agens, daß beispielsweise
kolorimetrisch gemessen werden kann.
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2 stellt
eine Ausführungsform
für eine
mehrschichtige Testvorrichtung dar, die zur Messung der Fruktosaminkonzentration
in einer Körperflüssigkeitsprobe
verwendet werden kann.
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3a veranschaulicht
eine Ausführungsform
für eine
Testvorrichtung, die ein Reagenzkissen enthält, auf das die zu analysierende
Körperflüssigkeit
aufgebracht wird.
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3b ist
ein schematisches Blockdiagramm eines Geräts, das bei der Ausführung der
vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
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Die 4a und 4b zeigen,
wie eine Körperflüssigkeitsprobe
jeweils auf eine Testvorrichtung für Fruktosamin (F) beziehungsweise
Glucose (G) aufgebracht wird. Die 4a und 4b zeigen ferner eine Ausführungsform
des Geräts,
bei der es möglich
ist, die Konzentrationsspiegel von Fruktosamin und Glucose in der auf
die jeweilige Testvorrichtung aufgebrachten Körperflüssigkeitsprobe zu bestimmen.
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5 zeigt
eine Ausführungsform
einer Testvorrichtung, die zwei Teststreifen aufweist, welche benutzt werden
können,
um glykiertes Hämoglobin
in einer Körperflüssigkeitsprobe
zu messen.
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6 veranschaulicht
ein Beispiel für
eine Testvorrichtung, die zwei Teststreifen aufweist und in der Lage
ist, glykiertes Albumin in einer Körperflüssigkeitsprobe zu messen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Verfahren und das einzelne Testsystem der vorliegenden Erfindung
stellen einen kombinierten Assay bereit, der es einem diabetischen
Patienten oder einem Arzt erlaubt, den akuten Glucosespiegel des
Subjekts sowie auch den mittel- oder langfristigen glykämischen
Zustand des Subjekts zu beurteilen. Ein derartiges System ist für diabetische
Patienten und ihre Ärzte,
die versuchen die glykämische
Kontrolle der Patienten zu normalisieren nützlich, wodurch die Möglichkeit
von schweren Komplikationen der Erkrankung vermindert wird. Vor
der Einführung
dieser Erfindung, konnte der glykämischen Zustand eines Patienten
nur aus getrennten Tests abgeleitet werden, und häufig mußte der
Test auf glykierte Proteine in einem klinischen Labor durchgeführt werden.
Das vorliegende Testsystem erlaubt es dem Arzt, einen kombinierten
Test auf Glucose und proteingebundene Glucose in seiner Praxis durchzuführen; was
sogar noch besser ist: es ermöglicht
die Durchführung
der Untersuchung durch den diabetischen Patienten zu Hause, wodurch
ein schnelles, exaktes und vollständiges Bild vom glykämischen
Zustand des Patienten bereitgestellt wird. Die vorliegende Erfindung
stellt ein einzelnes Testsystem und ein Verfahren zur Bestimmung
des integrierten glykämischen
Zustands eines Subjekts bereit, indem sowohl Glucose als auch proteingebundene Glucose
untersucht werden. Die durch den gemeinsamen Test auf Glucose und
proteingebundene Glucose bereitgestellten Informationen sind besonders nützlich,
weil Glucosekonzentrationen in diabetischen Patienten stark schwanken
können,
und diese Schwankungen würden
in Standardmethoden der Untersuchung von Glucose übersehen
werden.
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Wie
vorliegend verwendet bedeutet der Ausdruck "integrierter glykämischer Zustand" die akute Glucosekonzentration
in Kombination mit der mittleren Glucosekonzentration über einen
Zeitraum. "Akut" (immediate) bedeutet
den gegenwärtigen
Glucosespiegel in der Körperflüssigkeit
eines Subjekts zur Zeit der Messung. Die Glucosekonzentration über einen
Zeitraum zeigt entweder den mittel- oder langfristigen glykämischen
Zustand an, und kann durch Messung der Konzentration an proteingebundener
Glucose bestimmt werden. Der mittelfristige glykämische Zustand bezieht sich
im allgemeinen auf einen Bereich von Tagen bis zu etwa einem Monat,
wie zum Beispiel durch die Messung von Fruktosamin, das eine mittlere
Glucosekonzentration in der Körperflüssigkeit über den
Zeitraum von etwa einem halben Monat widerspiegelt, gezeigt wird. Der
langfristige glykämische
Zustand spiegelt den glykämischen
Zustand weit über
einen Monat hinaus wider, im allgemeinen über einen Zeitraum von 2 bis
3 Monaten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Reihenfolge
bei der Messung von Glucose, proteingebundener Glucose und beliebiger
zusätzlicher
Analyte, die den glykämischen
Zustand anzeigen, irrelevant. Zum Beispiel können Fruktosaminkonzentrationen
zuerst und Glucosespiegel als zweites gemessen werden. Unabhängig von
der Reihenfolge, stellt die Erfindung immer den integrierten glykämischen
Zustand eines Subjekts bereit.
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Zusätzlich zur
Verwendung der vorliegenden Erfindung für die Überwachung des glykämischen
Zustands eines Subjekts, das bekanntermaßen Diabetes hat, kann die
vorliegende Erfindung auch zur Diagnose von Diabetes eingesetzt
werden. Die vorliegende Erfindung kann zur Diagnose oder zum Screening
von Individuen verwendet werden, für die ein Verdacht auf Diabetes
besteht, oder die anfällig
für Diabetes
sein können. Zum
Beispiel könnte
eine schwangere Frau eine Person mit einer Anfälligkeit für Diabetes sein, für die ein Screening
notwendig ist. Andere Personen, für die eine Diagnose besonders
nützlich
sein kann, sind Verwandte von diagnostizierten Diabetikern.
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Das
Verfahren zur Diagnose von Diabetes in einem Subjekt unter Verwendung
des einzelnen Testsystems der vorliegenden Erfindung umfasst zunächst das
Erhalten mindestens einer Körperflüssigkeitsprobe
von einem Subjekt, und anschließend
die Messung der Glucosekonzentration in einer Körperflüssigkeitsprobe des Subjekts
und die Messung der Konzentration an proteingebundener Glucose in
einer Körperflüssigkeitsprobe des
Subjekts. Die Reihenfolge bei der Messung von Glucose und proteingebundener
Glucose ist irrelevant. Schließlich
werden die gemessenen Konzentrationen von Glucose und proteingebundener
Glucose mit den Glucosekonzentrationen und den Konzentrationen von
proteingebundener Glucose eines normalen Subjekts verglichen.
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Die
Verbindung von hohen Glucosespiegeln und einer hohen Konzentration
an proteingebundener Glucose, oder Spiegel von proteingebundener
Glucose, die einen hohen Glucosespiegel über einen Zeitraum anzeigen,
wenn diese mit denen aus einem normalen Subjekt verglichen werden,
sind diagnostisch oder indikativ für Diabetes. Zum Beispiel hat
ein normales Subjekt Nüchternglucosespiegel
im Bereich von 70-120 mg/dl. Glucosewerte oberhalb von 120 mg/dl
können
auf Diabetes hinweisen. Glucosewerte oberhalb von 150 mg/dl sind
ein starker Hinweis auf Diabetes, und oberhalb von 200 mg/dl ein
nahezu unbestreitbares Anzeichen für einen diabetischen Zustand.
Ein normales Subjekt hat PBG-Konzentrationsspiegel im Bereich von
2 bis 3 millimo lar (mM), während
Werte für
PBG oberhalb von 3 mM in Kombination mit hohen Glucosespiegeln diagnostisch
für Diabetes
sein können.
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Der
Vorteil des kombinierten Assays der vorliegenden Erfindung besteht
darin, daß bis
vor kurzem Serumglucose der einzige verfügbare Screening-Test auf eine
mögliche
Diabetes war. Ein anormal hoher Wert für Serumglucose ist nicht eindeutig,
er könnte
durch Diabetes verursacht sein, aber er könnte auch auf einen nicht nüchternen
Zustand, Stress oder auf die Einnahme bestimmter Wirkstoffe hinweisen.
Im Hinblick auf die Beschränkungen
der alleinigen Untersuchung auf Glucose haben Rosen, et al., Hospital
Practice, 27: 59-61 (1992) mehrere Serumproben von Patienten als
Maßnahme
zum Screening nach Diabetes sowohl auf Glucose als auch auf proteingebundene
Glucose getestet. Die vorliegende Erfindung hat jedoch den zusätzlichen Vorteil,
in der Lage zu sein, eine unbehandelte Körperflüssigkeitsprobe zu testen, oder
Proben, die keine Trennung oder dergleichen vor dem Test erfordern.
Zum Beispiel können
Tropfen vom Vollblut eines Patienten mit den Verfahren und dem Testsystem
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ohne Serum oder Plasma vor
der Durchführung
des Tests abzutrennen. Die einfache und praktische Handhabung der
vorliegenden Erfindung erlaubt es somit Ärzten und Patienten, den integrierten
glykämischen
Zustand des Patienten innerhalb von Minuten zu erfahren, entweder
in der Praxis des Arztes oder zu Hause.
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Wie
vorliegend verwendet umfasst der Ausdruck "proteingebundene Glucose" oder "PGB" jedes glykierte
Protein oder eine Kombination derselben. PGB-Konzentrationen korrelieren über die
Zeit mit den Glucosekonzentrationen. Der PGB-Test, oder Non-Glucose-Test auf
den glykämischen
Zustand kann Tests für
die gesamten oder für
einzelne glykierte Proteine umfassen, die in Körperflüssigkeiten gefunden werden.
Zum Beispiel kann man das "gesamte
glykierte Hämoglobin" messen, was alle
Spezies von glykiertem Hämoglobin
einschließt,
oder man kann ein spezifisches Hämoglobin
messen, wie zum Beispiel Hämoglobin
A1c (HbA1c). In ähnlicher
Weise kann man alle glykierten Serumproteine messen, oder das "gesamte glykierte
Serumprotein", oder
ein bestimmtes glykiertes Serumprotein, wie zum Beispiel glykiertes
Albumin. Darüber
hinaus umfasst "proteingebundene
Glucose" auch Fruktosamine.
Mehr als ein PGB-Wert kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung
gemessen werden. Zum Beispiel können
Fruktosamine als ein Anzeichen für
den mittelfristigen, und HbA1c als Anzeichen
für den
langfristigen glykämischen
Zustand gemessen werden.
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Die
hauptsächlichen,
normalen Hämoglobin-Spezies
sind A0(α2β2), A2(α2δ2),
und F(α2γ2). Es gibt noch eine Reihe unbedeutender,
aber normalerweise auftretender Hämoglobine, die im allgemeinen
als HbA1 oder "schnelle" Hämoglobine
bezeichnet werden, da sie in einem elektrophoretischen Gel vor A0 wandern. Die Familie von HbA1 umfasst
A1a1, A1a2, A1b1, A1b2, A1b3, A1c, A1d und 1e, wobei
alle glykierte Hämoglobine
sind. Alle Fraktionen sind typischerweise im diabetischen Zustand
im Vergleich mit den Konzentrationen in der nichtdiabetischen Population
erhöht.
HbA1c ist die dominierende Subfraktion,
aber alle diese Fraktionen schwanken im allgemeinen mit der mittleren
Konzentration an Blutglucose und spiegeln den Status der glykämischen
Kontrolle wider. Die meisten Hämoglobine
werden glykiert, im allgemeinen durch eine Reaktion zwischen Glucose und
der ε-Aminogruppe
von Lysinresten im Hämoglobin.
HbA1c dagegen bindet über seinen aminoterminalen Valinrest
an Glucose. Die Halbwertszeit von Hämoglobin beträgt etwa
60 Tage; daher ist die Messung des gesamten glykierten Hämoglobins
oder HbA1c indikativ für den langfristigen glykämischen
Zustand, wobei im allgemeinen ein Zeitraum von 2 bis 3 Monaten widergespiegelt
wird.
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Die
Glykierung ist nicht auf Hämoglobin
beschränkt,
sondern kann auch bei Serumproteinen auftreten. Da Aminogruppen
mit Glucose reagieren, werden die meisten in Körperflüssigkeiten vorhandenen Proteine glykiert,
einschließlich
von Enzymen, Immunoglobulinen und der meisten anderen Proteinklassen
sowie auch einzelnen Proteinen. Die Gesamtheit aller glykierten
Serumproteine oder das "gesamte
glykierte Serumprotein" kann
analysiert werden, oder es kann ein spezifisches glykiertes Serumprotein,
wie zum Beispiel glykiertes Albumin, gemessen werden. Die Messungen
von glykierten Serumproteinen, entweder als gesamtes glykiertes
Serumprotein oder als einzelnes glykiertes Serumprotein, sind indikativ
für den
mittelfristigen glykämischen Zustand.
Glykiertes Albumin hat eine Halbwertszeit von etwa zwei bis drei
Wochen, während
die von anderen Serumproteine von zweieinhalb Tagen bis dreiundzwanzig
Tagen reichen kann. Die Messung des gesamten glykierten Serumproteins
oder des glykierten Albumins sind somit indikativ für den mittelfristigen
glykämischen Zustand,
was die Glucosekonzentrationen über
einen Zeitraum von einigen Tagen bis zu etwa einem Monat widerspiegelt.
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Fruktosamine
werden durch glykierte Proteine gebildet. Glucose bindet an eine
Aminogruppe des Proteins, wobei eine Schiff'sche Base gebildet wird, d.h. ein Glykosylamin
oder Aldimin, das durch eine molekulare Umlagerung ein stabiles
Ketoamin bildet. Diese Reaktionsabfolge ist in 1a illustriert.
Im Stand der Technik sind solche Ketoamine im allgemeinen als "Fruktosamine" bekannt. Da die
Fruktosaminbildung direkt von der Glucosekonzentration abhängt, haben
diabetische Individuen höhere
Fruktosaminkonzentrationen im Blut als nicht-diabetische Individuen.
Unter alkalischen Bedingungen werden die im Blut gebildeten Fruktosamine
wie in 1b gezeigt, zu Enaminolen umgewandelt.
Die Enaminolform der Fruktosamine ist eine chemisch aktive, reduzierende
Substanz, welche mit einem geeigneten Indikator reagiert, der in
der Lage ist, durch Fruktosamine reduziert zu werden. Zum Beispiel
kann der Farbumschlag eines chromogenen Farbstoffs oder die Fluoreszenz
eines fluoreszenten Reagenz aus dieser Reaktion gemessen werden
und mit einem Standard verglichen werden, um einen Hinweis auf die
mittlere Glucosekonzentration in Blutproben über den Zeitraum des vergangenen
halben Monats zu liefern. Im allgemeinen spiegelt die Fruktosaminkonzentration
in einer Körperflüssigkeit,
wie zum Beispiel im Blutserum, eine mittlere Glucosekonzentration über einen
Zeitraum von etwa einem halben Monat wider.
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Wahlweise
können
andere Analyte, die auf den glykämischen
Zustand hinweisen, wie zum Beispiel Ketonkörper oder Fettsäurederivate,
gemessen werden. Während
einer Insulindefizienz, wie sie zwischen therapeutischen Insulininjektionen
als Folge des Insulinmetabolismus auftreten kann, kann die Energie
zur Aufrechterhaltung der zellulären
Funktionen nicht ausreichend aus Glucose, der Hauptenergiequelle
für Zellen, gewonnen
werden. In dieser Situation werden die Fettsäureoxidationswege herangezogen,
um eine alternative Energiequelle bereitzustellen. Nebenprodukte
dieses metabolischen Prozesses, einschließlich Ketonkörper, wie
zum Beispiel Aceton, β-Hydroxybutyrat
und Acetoacetat, Fettsäuremetabolite
und dergleichen, können
im Blut und anderen Körperflüssigkeiten
nachgewiesen werden, wenn die Fettsäuren-metabolisierenden Stoffwechselwege
aktiviert sind. Da diese Analyte nicht sofort aus dem Blut entfernt
werden, wenn der Blut-Glucosespiegel wieder einen normalen Wert
erreicht hat, liefern sie einen kurzfristigen Hinweis auf den Status
des Glucosemetabolismus im Patienten. Solche Analyte sind in den
Körperflüssigkeiten
als Reaktion auf Veränderungen
im Glucosemetabolismus eines Diabetikers innerhalb von etwa fünf Minuten
(5) bis etwa zwölf
(12) Stunden nach einer derartigen Veränderung vorhanden. Diese optionalen
Messungen von zusätzlichen
Analyten, die auch für
den glykämischen
Zustand indikativ sind, können
in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung mit Verfahren durchgeführt werden,
die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Zum Beispiel können Testreagenzstreifen
zur Messung von Ketonkörpern,
wie sie zum Beispiel im US Patent 4,397,956 von Maggio beschrieben
werden, in Verbindung mit dem Testsystem der vorliegenden Erfindung
verwendet werden.
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Ein
alternativer Analyt, der wahlweise gemessen werden kann und ebenfalls
für den
glykämischen
Zustand indikativ ist, ist Mikroalbumin. Mikroalbumin ist im allgemeinen
nur dann im Urin vorhanden, wenn der glykämischen Zustand eines Patienten
so schwerwiegend ist, daß er
zu Komplikationen in der Nierenfunktion führt.
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Die
Körperflüssigkeitsprobe
des Subjekts, die auf Glucose und PBG, oder auf andere Analyte,
die ebenfalls mit dem glykämischen
Zustand zusammenhängen,
untersucht wird, kann jede unbehandelte biologische Flüssigkeit
sein, die diese Analyte enthält,
einschließlich
z.B. Vollblut, Urin, Speichel, interstitielle Flüssigkeit und Tränen. Die
Körperflüssigkeit
ist "unbehandelt", was bedeutet, daß die Körperflüssigkeit
vor der Testdurchführung
nicht bearbeitet werden muß,
wie zum Beispiel mit Trennungsverfahren und dergleichen. Die Körperflüssigkeit
kann direkt auf die Testvorrichtung aufgebracht werden, ohne zum
Beispiel die Abtrennung von Plasma oder Serum aus dem Vollblut.
Falls erforderlich kann die Körperflüssigkeit
innerhalb der Testvorrichtung selbst aufgetrennt oder anderweitig
behandelt werden, wie zum Beispiel durch eine Schicht zur Abtrennung
von roten Blutzellen.
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Die
zur Messung der Glucosekonzentration verwendete Körperflüssigkeitsprobe
kann (muß aber nicht)
von der gleichen Art Körperflüssigkeitsprobe
sein wie diejenige, die zur Messung der Konzentration von PBG verwendet
wird. Zum Beispiel kann Vollblut sowohl für den Glucoseanteil als auch
für den
PBG-Aspekt der Erfindung
verwendet werden. Alternativ dazu können die Körperflüssigkeitsprobe oder die Körperflüssigkeitsproben
unterschiedliche Arten von Körperflüssigkeitsproben
sein, wie zum Beispiel Urin zur Bestimmung der Glucosekonzentration
und eine Vollblutprobe für
den Test auf Fruktosamin. Weil die vorliegende Erfindung in vorteilhafter
Weise in häuslicher
Umgebung vom Patienten selbst angewendet werden kann, ist Vollblut
die bevorzugte Körperflüssigkeit
sowohl für
die Glucose- als auch für
die PBG-Analyse, vorzugsweise Vollblut aus einer Punktur eines Fingers
oder des Ohrläppchens.
Obwohl Fingerstäbchen
bevorzugt sind, können
auch Pipetten, Tropfer oder dergleichen benutzt werden, abhängig davon,
wo eine Probe entnommen wird.
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Bei
der Körperflüssigkeitsprobe
oder den Körperflüssigkeitsproben,
in denen Glucose und PBG gemessen werden, kann es sich um die gleiche
oder um verschiedene Proben handeln, abhängig davon, wie die Probe vom
Subjekt entnommen wird. Mit "verschiedenen
Proben" sind einzelne
Körperflüssigkeitsproben
gemeint, wie zum Beispiel zwei oder mehr Proben, bei denen es sich
um die selbe Art von Körperflüssigkeit
handeln kann aber nicht muß,
wie es oben beschrieben ist. Wenn zum Beispiel jede der Körperflüssigkeitsproben ein
Blutstropfen ist, wie zum Beispiel von einzelnen Punkturen des Fingers
des Subjekts, sind sie "getrennte" oder verschiedene "Proben". Alternativ dazu
kann die Körperflüssigkeit
vom Subjekt entnommen werden, wie zum Beispiel durch Entnahme einer
Blutprobe, wobei dann die Körperflüssigkeitsprobe
zur Analyse von Glucose und PBG aus der gesammelten Probe entnommen
und als dieselbe Probe betrachtet würde. Zusätzliche Körperflüssigkeitsproben können Verwendet
werden, wie zum Beispiel eine dritte Körperflüssigkeitsprobe oder mehr, wenn
zum Beispiel mehr als eine PBG analysiert wird, oder zur Messung
von optionalen Analyten, wie zum Beispiel Ketonkörper.
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Die
vorliegenden Erfindung ermöglicht
die Messung von Glucose und PBG in einem einzelnen Testsystem. Das
System stellt eine Testvorrichtung bereit, die ein signalerzeugendes
System umfasst, das in der Lage ist, die in einer Körperflüssigkeitsprobe
vorhandene Glucosekonzentration anzuzeigen. Das signalerzeugende
System wird von einem Gerät
ausgelesen, das ein automatisches Mittel zur Bestimmung der Glucosekonzentration
aufweist, welches auf das Signal anspricht, das durch die Glucose-Testvorrichtung
erzeugt wird. Das Testsystem der vorliegenden Erfindung umfasst
auch eine Testvorrichtung, die in der Lage ist, die Konzentration
eines PBG zu messen. Die Nicht-Glucose-Testvorrichtung
enthält
ein signalerzeugendes System, das in der Lage ist, die in einer
Körperflüssigkeitsprobe
vorhandene Konzentration einer PBG anzuzeigen. Das signalerzeugendes
System wird von einem Gerät
ausgelesen, das ein automatisches Mittel zur Bestimmung der Konzentration
der PBG hat, welches auf das Signal anspricht, das durch die PBG-Testvorrichtung erzeugt wird.
Ein geeigneter Apparat, der in dem einzelnen Testsystem verwendet
wird, kann sowohl die Ergebnisse des Glucosetests als auch die Ergebnisse
des PBG-Tests auslesen.
Wenn optionale Analyte, die für
den glykämischen
Zustand ebenfalls indikativ sind, auch gemessen werden, können entsprechende
Testvorrichtungen mit der vorliegenden Erfindung benutzt werden.
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Testvorrichtungen,
die signalerzeugende Systeme enthalten, welche in der Lage sind,
die Konzentration von Glucose anzuzeigen, sind im Stand der Technik
wohlbekannt. Im Stand der Technik umfasst das signalerzeugende System
im Allgemeinen Reagenzien, die eine Glucose-Oxidase-Enzymreaktion
erzeugen. Glucose und das Enzym Glucose-Oxidase reagieren, wobei
Wasserstoffperoxid gebildet wird. Eine Peroxidase, wie zum Beispiel
Meerrettichperoxidase, und ein Redoxindikator, wie zum Beispiel
o-Toluidin, o-Dianisidin, 3,3,5,5-Tetramethylbenzidin (TMB), 4-Aminotipyrin,
und andere im Stand der Technik wohlbekannte Redoxindikatoren sind
in der Lage, in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid oxidiert zu
werden, wobei ein gefärbtes Produkt
gebildet wird. Ein Teststreifen, der diese oder andere Reagenzien
des signalerzeugenden Systems enthält, welches zur Analyse der
Glucosekonzentration benutzt wird, kann mit im Stand der Technik
wohlbekannten Verfahren hergestellt werden, wie sie zum Beispiel
in der veröffentlichten
Europäischen
Patentanmeldung 0 388 782 von Chen und im U.S. Patent 5,304,468
von Phillips et al., beschrieben werden, wobei beide vorliegend
durch Verweis eingeschlossen sind.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform,
wie sie in 3a gezeigt ist, hat die Glucose-Testvorrichtung 15 ein
Reagenzkissen 18, welches das Reagenz bzw. die Reagenzien
des signalerzeugenden Systems enthält. Das Reagenzkissen 18 wird
mittels eines Klebmittels 17 an einem Ende eines Kunststoffträgerelements 16 positioniert,
das eine Kerbe 19 aufweist. Eine ausführlichere Beschreibung der
Materialien für
das Reagenzkissen (oder die Reagenzkissen), das Trägerelement
(oder die Trägerelemente)
und das Klebmittel wird nachfolgend im Rahmen der Erläuterung
der Fruktosamin-Testvorrichtung bereitgestellt und ist in gleicher
Weise auf die Glucose-Testvorrichtung anwendbar. Falls erforderlich,
kann die Glucose-Testvorrichtung zusätzlich eine Bluttrennungsschicht
umfassen, wie zum Beispiel die unten beschriebene, oder andere im
Stand der Technik wohlbekannte. Darüber hinaus können wahlweise
weitere Schichten hinzugefügt
werden, wie zum Beispiel eine Schicht zur Interferenzentfernung,
eine Strahlungsschicht, oder andere Schichten, die im folgenden
beschrieben werden oder im Stand der Technik bekannt sind.
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Wie
oben beschrieben enthält
das Testsystem der vorliegenden Erfindung auch eine Testvorrichtung, die
in der Lage ist, die Konzentration eines PBG zu messen. Die Nicht-Glucose- Testvorrichtung enthält ein signalerzeugendes
System, welches in der Lage ist, die Konzentration des in einer
Körperflüssigkeitsprobe
vorhandenen PBG anzuzeigen. Das signalerzeugende System wird von
einem Gerät
gelesen, das ein automatisches Mittel zur Bestimmung der PBG-Konzentration
aufweist, welches auf das Signal anspricht, das durch die PBG-Testvorrichtung
erzeugt wird. Das signalerzeugende System und die Reagenzien, die
verwendet werden, um das Signal in Reaktion auf PBG zu erzeugen,
werden davon abhängen,
welcher PBG-Analyt gemessen werden soll.
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In
einer Ausführungsform
umfasst die PBG-Testvorrichtung zwei Teststreifen, die in der Lage
sind die Konzentration von glykiertem Hämoglobin in einer Körperflüssigkeitsprobe
zu messen, insbesondere im Blut. Diese Ausführungsform ist in 5 erläutert. Mit
Bezug auf 5 weisen beide Teststreifen, 31 und 32,
eine Schicht auf, die Hämolysereagenzien 33 enthält, die
in der Lage ist, rote Blutkörperchen
zu lysieren, wodurch Hämoglobin
freigesetzt wird. In Teststreifen 31 wandert das Hämolysat
dann in eine Schicht 34, die glykiertes Hämoglobin
bindet. Jedes glykierte Hämoglobin,
oder "Glykohämoglobin", das im Hämolysat
vorhanden ist, wird in der Schicht 34 gebunden, während alle
nicht glykierten Hämoglobine
zur Auslesezone 35 weiterwandern. Im Teststreifen 32 gibt
es keine Schicht zur Bindung von glykiertem Hämoglobin, und das Hämolysat
einschließlich
glykiertem und nicht glykiertem Hämoglobin (im folgenden "Gesamt-Hämoglobin" genannt) wandert direkt
zur Auslesezone.
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In
dieser Ausführungsform
der Testvorrichtung kann die Menge an glykiertem Hämoglobin
mit einem geeigneten Apparat berechnet werden, der in der Lage ist,
die Teststreifen 31 und 32 auszulesen, und den
Unterschied zwischen beiden zu bestimmen. Die Menge an glykiertem
Hämoglobin
kann berechnet werden, indem die Ergebnisse, die mit dem Teststreifen 31 (gesamtes
Hä moglobin
minus glykiertem Hämoglobin)
erhalten wurden, von den Ergebnissen von Teststreifen 32 (gesamtes
Hämoglobin)
subtrahiert werden.
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Bei
dem Hämolysereagenz,
das in der Schicht 33 verwendet wird, kann es sich um Hämolysine
oder chemische Reagenzien handeln, die im Stand der Technik für die Hämolyse wohlbekannt
sind, vorausgesetzt, sie reagieren mit roten Blutzellen, wenn sie
in einer Schicht eines Teststreifens enthalten sind. Beispiele für hämolytische
Reagenzien umfassen zum Beispiel Saponine, oder eine Vielzahl von
Detergenzien, und insbesondere nicht ionische Detergenzien, wie
zum Beispiel Triton-X-100®.
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Die
Schicht zur Bindung von glykiertem Hämoglobin kann zum Beispiel
aus Antikörpern
gegen Glykohämoglobin
bestehen, wie zum Beispiel diejenigen, die in den U.S. Patenten
4,478,744 von Mezei, 4,806,468 von Wagner et al., 5,193,739 von
Cohen und 5,206,144 von Zeuthen et al., beschrieben sind, von denen
jedes vorliegend durch Verweis eingeschlossen. Alternativ kann die
Schicht zur Bindung von glykiertem Hämoglobin Materialien enthalten,
die zur Bindung von Glykohämoglobin
wohlbekannt sind und üblicherweise
in der Affinitätschromatographie
eingesetzt werden, wie zum Beispiel Phenylborsäuren, einschließlich z.B.
m-Aminophenylborsäure
und andere, die zum Beispiel in den U.S. Patenten 4,269,605 von
Dean und 5,284,777 von Rosenthal et al. beschrieben sind, von denen
jedes vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist. Phenylborsäure bindet
an die cis-Diolgruppen
in Glucose-modifiziertem Hämoglobin,
wobei ein reversibler, ringförmiger
Komplex aus fünf
Elementen gebildet wird. Die Phenylborsäure kann mit der Schicht des
Teststreifens durch eine Agarosematrix oder eine Cellulosematrix
gekoppelt werden, oder mittels anderer Verfahren und Materialien, die
im Stand der Technik wohlbekannt sind, wie zum Beispiel diejenigen,
die in den oben aufgeführten
Patenten beschrieben sind.
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Das
Hämoglobin
kann in der Auslesezone durch einfaches Auslesen der Farbe des Hämoglobins
bei 416, 542 oder 576 nm verfolgt werden. Deshalb umfasst das signalerzeugende
System, das in der Lage ist, die Konzentration einer PBG, wie zum
Beispiel von Hämoglobin
anzuzeigen, die direkte Messung der PBG. Diese Verfahren umfassen
eine Reaktion mit Kaliumferricyanid und Thiocyanat, die das Hämoglobin
zu Methämoglobin
oxidieren und es komplexieren, wobei das gefärbte Thiocyan-Methämoglobin
gebildet wird, das bei 531 nm gemessen werden kann. Ein anderes
bekanntes Verfahren ist die Reaktion von Hämoglobin mit Cumolhydroperoxid
und Tetramethylbezidin. Das Hämoglobin
wirkt wie eine Peroxidase und katalysiert die Reaktion, bei der
ein gefärbtes
Produkt erzeugt wird, das entweder bei 660 nm oder im nahen Infrarotbereich
bei 890 nm gemessen werden kann.
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In
einer anderen Ausführungsform
besteht die PBG-Testvorrichtung
aus Teststreifen, welche die Spiegel an glykiertem Albumin messen.
Diese Ausführungsform
kann Techniken benutzen, die denjenigen ähnlich sind, welche zur Messung
des glykierten Hämoglobins
in der obigen Ausführungsform
eingesetzt wurden. Hier wird das gesamte Albumin, das sowohl glykiertes
als auch nicht glykiertes Albumin umfasst, auf einem Teststreifen
gemessen, und auf dem anderen Teststreifen wird das gesamte Albumin
minus dem glykierten Albumin bestimmt. Wiederum ergibt die Differenz
zwischen den beiden Teststreifen die Menge des glykierten Proteins
von Interesse.
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Für eine ausführlichere
Beschreibung der Testvorrichtung zur Messung von glykiertem Albumin
wird nunmehr auf 6 verwiesen. Wie in 6 gezeigt,
ist die erste Schicht in beiden Teststreifen, 36 und 37, eine
Bluttrennungsschicht 38, die Plasma oder Serum abtrennt.
Die Trennungsschicht kann derjenigen Trennungsschicht, die in den
folgenden Beispielen beschrieben ist, oder anderen im Stand der
Technik wohlbekannten Trennungsschichten ähneln. Zum Beispiel wandert
dann das abgetrennte Blutplasma in die nächste Schicht 39,
die in beiden Teststreifen vorhanden ist, und die mobiles, markiertes
Anti-Albumin enthält. Die
markierten Antikörper
aus dieser Schicht binden sowohl an das glykierte als auch an das
nicht-glykierte Albumin, das in der Probe vorhanden ist, und diffundiert
dann als Konjugat in die nächste
Schicht, die immobilisierte Albuminschicht 40. Freier,
mobiler, markierter Antikörper
aus der Schicht 39, der nicht an Albumin gebunden hat, diffundiert
in Schicht 40 und wird durch das dort vorhandene Albumin
immobilisiert. Im Teststreifen 36 wandert das Konjugat
aus Albumin und markiertem Anti-Albumin dann in eine Schicht 41,
die glykiertes Albumin bindet, in der nur solche Konjugate gebunden
werden, die glykiertes Albumin enthalten. Das Konjugat aus markiertem Anti-Albumin
und nicht-glykiertem Albumin im Teststreifen 36 diffundiert
zur Auslesezone 42, wo eine Messung erfolgt, die für Gesamt-Albumin
minus glykiertem Albumin indikativ ist. Teststreifen 37 der
Testvorrichtung enthält
keine Schicht, die glykiertes Albumin bindet, und die Auslesezone 42 auf
Teststreifen 37 ist deshalb für das Gesamt-Albumin indikativ.
Die Menge an glykiertem Albumin kann berechnet werden, indem die
Ergebnisse, die mit dem Teststreifen 36 (gesamtes Albumin
minus glykiertem Albumin) erhalten wurden, von den Ergebnissen des
Teststreifens 37 (gesamtes Albumin) subtrahiert werden.
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Die
oben beschriebene Ausführungsform
zur Messung von glykiertem Albumin, ebenso wie die Ausführungsform
für Glykohämoglobin,
können
von den Methoden und Prinzipien profitieren, die jenen ähnlich sind,
die von Liotta in U.S. Patent 4,446,232 gelehrt wird, welches vorliegend
durch Verweis eingeschlossen ist, insbesondere die Verwendung von
mobilem, markiertem Antikörper
und von immobilisiertem Liganden. Das mobile, markierte Anti-Albumin
der vorliegenden Erfindung kann (wie es zum Beispiel von Liotta
gezeigt wird) mit einem Enzym markiert sein, einschließlich Meerrettichperoxidase,
alkalischer Phosphatase und beta-Galaktosidase, sowie mit anderen
Enzymen, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, und welche zur Erzeugung
einer Farbe oder anderer Signale geeignet sind. Alternativ dazu
können
andere Markierungen, wie beispielsweise kolloidale Partikel, zum
Beispiel kolloidales Gold oder Latex, oder andere Markierungen verwendet
werden, die in der Lage sind, ein Signal zu erzeugen, und die im
Stand der Technik wohlbekannt sind.
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Die
Schicht, die glykiertes Albumin bindet, kann zum Beispiel aus Antikörpern bestehen,
die spezifisch für
die Konjugate aus glykiertem Albumin und daran gebundenem Anti-Albumin
sind. Alternativ dazu kann die Schicht, die glykiertes Albumin bindet,
Materialien umfassen, von denen bekannt ist, das sie glykierte Proteine binden,
wie beispielsweise Phenylborsäuren,
wie sie oben beschrieben und in den U.S. Patenten 4,269,605 von
Dean und 5,284,777 von Rosenthal et al. beschrieben sind, von denen
jede vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist. Wie oben erwähnt bindet
Phenylborsäure
an die cis-Diolgruppen in einem Glucose-modifizierten Protein, wobei
ein reversibler, ringförmiger
Komplex aus fünf
Elementen gebildet wird. Die Borsäure kann mit der Schicht des
Teststreifens über
eine Agarosematrix oder eine Cellulosematrix gekoppelt werden oder mittels
anderer Verfahren und Materialien, die im Stand der Technik wohlbekannt
sind, wie zum Beispiel diejenigen, die in den oben aufgeführten Patenten
beschrieben werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist die PBG-Testvorrichtung eine mehrschichtige Testvorrichtung zur
Analyse der Fruktosamin-Konzentration. Die mehrschichtige Testvorrichtung
enthält
ein signalerzeugendes System, das ein Indikator ist, der in der
Lage ist, durch Fruktosamine reduziert zu werden, wie zum Beispiel bestimmte
Farbstoffe, einschließlich
chromogene Farbstoffe oder fluoreszente Reagenzien. Die mehrschichtige
Test vorrichtung ist im folgenden sowie in der U.S. Patentanmeldung
Seriennummer 08/269,351, die vorliegend durch Verweis eingeschlossen
ist, ausführlicher
beschrieben.
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Mehrschichtige Fruktosamin-Testvorrichtung
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Schichtenanordnung:
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Die
Schichten der mehrschichtigen Testvorrichtung sind benachbart zueinander
angeordnet, so daß sie
für einen
Fluidaustausch sorgen. Der Fluidübergang
zwischen den benachbarten Schichten kann entweder vertikal oder
lateral erfolgen. Dementsprechend können die Schichten der mehrschichtigen
Testvorrichtung übereinander
oder nebeneinander angeordnet sein. Die einzelnen Schichten der
Testvorrichtung enthalten die relevanten Testreagenzien, wie zum
Beispiel einen Puffer oder einen Indikator. Das relevante Reagenz
kann in die Schicht imprägniert
werden, oder in oder auf die Schicht aufgezogen werden, oder kovalent
mit der Schicht verbunden werden.
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Das
Material für
die verschiedenen, hier beschriebenen Schichten, einschließlich der
Pufferschicht, der Indikatorschicht und beliebigen anderen Schichten,
umfasst eine poröse
Matrix, die in der Lage ist, das relevante Testreagenz aufzunehmen,
die aber permeabel für
den Fruktosamin-Analyten und andere wichtigen Testreagenzien und
Flüssigkeiten
ist. Die Permeabilität
entsteht im allgemeinen durch Porosität, Quellfähigkeit oder eine beliebige
andere Eigenschaft. Die Schichten der Testvorrichtung können verschiedene
poröse,
fasrige Materialien enthalten, wie zum Beispiel Cellulose, Papier,
Vlies, Filz, Gewebe und dergleichen (vgl. zum Beispiel U.S. Patente
3,802,842; 3,809,605; und 3,897,214, wobei jedes davon vorliegend
durch Verweis eingeschlossen ist). Alternativ dazu können die
Schichten der Testvorrichtung diverse poröse, nicht- faserartige Materialien umfassen, wie
zum Beispiel mikroporöse
Polymere (vgl. zum Beispiel U.S. Patent 3,552,929, das vorliegend
durch Verweis eingeschlossen ist). Spezifische Beispiele für geeignete
Materialien, die für
die Schichten benutzt werden können,
umfassen Filterpapier, wie zum Beispiel 3mm-Filterpapier (Whatman, Maidenstone,
England), Rayon, Cytosep®-Membran (Ahlstrom Filtration, Inc.,
Mt. Holly Spring, PA), Glasfiber und Biodyne A® Nylonmembran
(Pall Corp., East Hills, NY).
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Die
diversen Schichten, welche die Assayreagenzien (wie Puffer oder
Indikator) enthalten, können gleichzeitig
oder nacheinander zusammengesetzt werden. Das poröse Material
für eine
bestimmte Schicht wird zuerst in eine Lösung aus Assayreagenz gelegt,
wie zum Beispiel eine Pufferlösung
oder eine Indikatorlösung.
Nach dem Trocknen kann die Schicht in einem Exsikkator gelagert
werden, bis sie in der mehrschichtigen Testvorrichtung eingesetzt
wird.
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Die
Schichten liegen im allgemeinen in der Form von Reagenzkissen (reagent
pads) vor, die auf ein Trägerelement
aufgebracht oder zwischen zwei oder mehr Trägerelementen positioniert werden,
wie im folgenden näher
diskutiert ist. Die mehrschichtigen Kissen können eine beliebige geometrische
Dimension haben (wie zum Beispiel kreisförmig oder rechteckig), und
sie haben im allgemeinen einen Umfang von 0,5 bis 20 mm, vorzugsweise
1 bis 10 mm, und sind entweder aufeinander oder nebeneinander angeordnet.
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Unabhängig von
der Anordnung der Schichten umfasst die Testvorrichtung, die erfindungsgemäß zur Analyse
von Fruktosamin verwendet werden kann, die Grundelemente einer Pufferschicht
und einer Indikatorschicht, und sie kann wie im folgenden beschrieben
zusätzliche
Schichten umfassen.
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Pufferschicht:
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Die
Pufferschicht 13 enthält
einen Puffer mit einem pH-Wert von mindestens 9. Verschiedene bekannte
Puffertypen können
in der Pufferschicht enthalten sein, solange der Puffer einen ausreichend
hohen pH gewährleistet,
sodaß die
Fruktosamine in ihre Enaminolform umgewandelt werden. Um dies zu
erreichen, sollte der pH des Puffers bei einem pH-Wert zwischen
etwa 9 und etwa 13 liegen, und für
optimale Ergebnisse ist der pH bei einem pH-Wert zwischen 10 und
12. Beispiele für
solche Puffer umfassen Kaliumhydrogenphosphat, Natriumhydrogenphosphat,
Natriumhydroxid, Guanidiniumsalze, bestimmte Aminosäuren und
andere geeignete Puffer oder Kombinationen derselben sind im Stand
der Technik wohlbekannt. Wenn die Pufferschicht oberhalb der Indikatorschicht
liegt, ist sie im allgemeinen aus einem nicht-opaken flüssigkeitsdurchlässigen Material.
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Indikatorschicht:
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Die
Indikatorschicht 14 enthält einen beliebigen Indikator,
der in der Lage ist, durch Fruktosamine reduziert zu werden, wie
zum Beispiel bestimmte Farbstoffe, einschließlich chromogene Farbstoffe
oder fluoreszente Reagenzien. Beispiele für geeignete chromogene Farbstoffe,
die ihre Farbe abhängig
von der Menge an Fruktosamin verändern,
das in einer flüssigen
Probe vorliegt, umfassen Tetrazoliumfarbstoffe, wie zum Beispiel
Neotetrazoliumchlorid (NT), Tetranitroblautetrazoliumchlorid (TNBT),
Blaues Tetrazoliumchlorid (BT), Jodnitrotetrazoliumchlorid, Nitroblautetrazoliumchlorid
(NBT), Nitroblau-Monotetrazoliumchlorid,
Thiazolylblautetrazoliumchlorid (MTT), Tetrazoliumviolett, 2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazoliumchlorid
Thiocarbamylnitroblautetrazoliumchlorid (TCNBT), Tetrazolium XTT
(XTT), 2,2'-Benzothiazolyl-5-styryl-3-(4'-phthalylhydrazidyl)-tetrazoliumchlorid
(BSPT), Distyrylnitroblautetrazoliumchlorid (DSNBT). Ein Beispiel
für ein
geeigne tes fluoreszentes Reagenz ist 5-Cyano-2,3-ditolyl-Tetrazoliumchlorid
(CTC).
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Andere Schichten:
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Andere
Schichten, zusätzlich
zur Pufferschicht und Indikatorschicht, können in der Fruktosamin-Testvorrichtung
verwendet werden. Zum Beispiel kann die mehrschichtige Testvorrichtung
eine Schicht zur Abtrennung roter Blutzellen (RBC) umfassen, oder
Schichten vor dem Pufferschichtkissen, zum Zweck der Abtrennung
von RBC-Bestandteilen, wie es zum Beispiel in 2 in
den Punkten 8 und 9 gezeigt ist, und wie es in den
Beispielen beschrieben ist. Andere nützliche Schichten umfassen
(sind aber nicht beschränkt
auf) diejenigen, die in den U.S. Patenten 4,050,898 und 4,042,335
beschrieben sind (jedes davon ist vorliegend durch Verweis eingeschlossen),
einschließlich
strahlungsblockierender Schichten, Schichten zur Interferenzentfernung,
die Detergenzien, Chelatoren, Anti-Oxidantien oder andere Substanzen
enthalten können,
die mit exakten Ergebnissen interferieren können, Schichten zur Kontaminationsverhinderung,
Dialyseschichten, Filterschichten, Trägerschichten und dergleichen.
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Träger der mehrschichtigen Anordnung:
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Das
Trägerelement
oder die Trägerelemente,
welche die mehreren Schichten tragen, können opak, reflektierend oder
durchlässig
für Licht
oder eine andere Energie sein. Das Trägerelement oder die Trägerelemente
werden mit den beabsichtigten Analyseverfahren und dem benutzten
Indikator (wie zum Beispiel chromogene oder fluoreszente Indikatoren)
kompatibel sein. Materialien, die als Trägerelemente eingesetzt werden
können,
umfassen eine Vielzahl von Kunstoffmaterialien und Polymeren, wie
zum Beispiel Celluloseacetat, Polyester, Polycarbonat, Polyvinylchlorid,
Polyethylen und Polystyrol. wenn solche Mate rialien benutzt werden,
ist das Trägerelement
im allgemeinen planar. Die Schichten können auch in einem Kunstoffbehälter eingefasst
sein, der die Schichten in ihrer richtigen Orientierung hält, oder
sie können
in anderen Trägern
untergebracht werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind,
wie zum Beispiel die ICON-Testvorrichtung (Hybritech, Inc., San
Diego, CA).
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Die
mehrschichtige Testvorrichtung hat mindestens ein Trägerelement,
das wahlweise eine Detektionsöffnung
aufweist. Wie vorliegend verwendet bedeutet die Formulierung "wahlweise eine Detektionsöffnung aufweisen", daß wenn das
betreffende Trägerelement
transparent ist, es keine Notwendigkeit für eine Detektionsöffnung gibt,
während
bei einem nicht-transparenten Träger
eine Detektionsöffnung
benötigt
wird und anwesend ist. Die Detektionsöffnung ist ein Loch zur Beobachtung
der Farbveränderung
oder der Fluoreszenz auf der Indikatorschicht. Die Größe der Detektionsöffnung ist
im allgemeinen kleiner als die Größe der mehrschichtigen Anordnung,
und die Größe ist abhängig von
der Größe der Schicht
oder der Schichtkissen. Die Größe der Detektionsöffnung wird
im allgemeinen zwischen 0,5 und 20 mm sein, vorzugsweise zwischen
1 und 10 mm. Die Position der Detektionsöffnung auf dem unteren Trägerelement
hängt davon
ab, ob die mehreren Schichten übereinander
oder nebeneinander angeordnet sind. Wenn die mehreren Schichten übereinander
liegen, ist die Detektionsöffnung
unterhalb von allen Schichten angeordnet. Wenn die mehreren Schichten
nebeneinander liegen, ist die Detektionsöffnung direkt unterhalb der
Indikatorschicht oder einer anderen letzten Schicht angeordnet.
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Wenn
nur ein Träger
benutzt wird, kann die flüssige
Probe direkt auf die erste Schicht aufgebracht werden. Die flüssige Probe
kann frei eindringen, diffundiert in die Pufferschicht und fließt durch
diese und jede andere vorhandene Schicht, und sie wandert zur Indikatorschicht,
so daß die
Konzentration an Fruktosamin bestimmt werden kann.
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Obwohl
wie oben beschrieben nur ein Träger
erforderlich sein kann, können
zusätzliche
Träger
benutzt werden. Wenn zwei oder mehr Träger benutzt werden, wird die
mehrschichtige Anordnung zwischen einem ersten Trägerelement
mit einer Probenöffnung
und einem zweiten Trägerelement
mit wahlweise einer Detektionsöffnung
positioniert. Wie bei der Detektionsöffnung ist die Größe der Probenöffnung im
allgemeinen kleiner als die Größe der verschiedenen
Schichten, und ihre Größe ist weitgehend
abhängig
von der Größe der Schicht
oder des Schichtkissens. Die Größe der Öffnung wird
im allgemeinen zwischen 0,5 und 20 mm sein, vorzugsweise zwischen
1 und 10 mm.
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Die
zwei oder mehr Trägerelemente
können
durch eine Haltemittel zusammengehalten werden, wie zum Beispiel
einem Klebmittel. Beispiele für
geeignete Klebmittel umfassen Gelatine, Gummi, Silikon und Klebstoff
auf Acrylat basierender Kleber. Zusätzlich kann der Kunststoffbehälter durch
Ultraschall geschweißt sein,
oder durch Einrasten verbunden sein, wie es im Stand der Technik üblich ist.
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Eine
Ausführungsform
der mehrschichtigen Testvorrichtung, die zur Bestimmung der Konzentration von
Fruktosamin verwendet wird, ist in 2 gezeigt.
Mit Bezug auf 2 hat die Ausführungsform
ein äußeres im
wesentlichen planares Kunststoffträgerelement 1 mit einer
Probenöffnung 6 und
ein zweites äußeres im wesentlichen
planares Kunststoffträgerelement 5,
das eine Detektionsöffnung 11 und
eine Einbuchtung 12 aufweist. Die Ausführungsform umfasst die zusätzlichen
Trägerelemente 2, 3 und 4,
die ein Loch 7 für
den Fluidaustausch aufweisen. In den zusätzlichen Trägerelementen sind Vollblut-Trennungsschichten 8, 9 und 10 untergebracht,
wie in den folgenden Beispielen eingehender beschrieben ist. Unterstützt vom zweiten äußeren Trägerelement 5 ist
ein nicht-opakes, flüssigkeitsdurchlässiges Pufferschichtkissen 13,
das einen Puffer mit einem pH-Wert zwischen etwa 10 und etwa 12
enthält,
und das auf einem Indikatorschichtkissen 14 liegt, das einen
Nitroblautetrazolium-Farbstoff enthält.
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Eine
Körperflüssigkeitsprobe,
die den zu messenden Analyten enthält, wird auf die geeignete
Testvorrichtung aufgebracht, welche ein Reagenz enthält, das
so beschaffen ist, daß es
mit dem Analyten in spezifischer weise interagiert, sodaß wie oben
beschrieben ein messbares Signal erzeugt wird. Nachdem die Körperflüssigkeitsprobe
auf die geeignete Testvorrichtung aufgebracht wurde, kann die Konzentration
von Glucose oder PBG in der Körperflüssigkeitsprobe
mit einem Apparat bestimmt werden, wie er in 4 veranschaulicht
und im folgenden eingehender beschrieben ist. Der Apparat hat automatische
Mittel zur Bestimmung der Konzentrationen von Glucose und PBG, die
auf das Signal ansprechen, das durch die Reaktionen von Glucose und
PBG mit dem signalerzeugenden System der jeweiligen Testvorrichtung
entsteht. Der Apparat hat ferner ein Anzeigemittel, das mit den
automatischen Mitteln zur Bestimmung gekoppelt ist, sowie eine Aufnahmeöffnung,
die mit den automatischen Mitteln zur Bestimmung verbunden ist.
Da die vorliegende Erfindung vorteilhafterweise in der häuslichen
Umgebung eingesetzt wird, sollten Apparat und Test tragbar sein.
Zum Beispiel kann der im Testsystem verwendete Apparat batteriebetrieben
sein.
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Ein
geeigneter, für
das einzelne Testsystem benutzter Apparat kann sowohl die Ergebnisse
des Glucose-Tests als auch die für
PBG auslesen, und er wird deshalb als "glykämischer
Messapparat" bezeichnet. Solche
Apparate werden entsprechend den Spezifikationen konstruiert werden,
die vom signalerzeugenden System des Tests und von den automatischen
Mitteln, die auf das erzeugte Signal ansprechen, abhängen. Wenn
zum Beispiel das automatische Mittel zur Bestimmung der Konzentration
oder das Auslesen eine Farberzeugung ist, kann der Apparat ein Bestimmungsmittel
enthalten, das ein Spektrometer ist. Andere Spektrophotometer, die
im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, messen
zum Beispiel Fluoreszenz, Absorption oder Transmission. Wenn das
Auslesen elektrochemisch erfolgt, kann ein miniaturisiertes Elektrodensystem
eingesetzt werden. Es ist im Stand der Technik zum Beispiel wohlbekannt,
wie man Glucose elektrochemisch messen kann; dies wird zum Beispiel
von Higgins et al. in U.S. Patent No. 4,545,382, Parks et al. in
U.S. Patent No. 4,999,582 und von White in U.S. Patent No. 5,243,516
gelehrt, von denen jedes vorliegend durch Verweis eingeschlossen
ist. Es kann mehr als ein automatisches Mittel zur Bestimmung in dem
Apparat vorhanden sein. Zum Beispiel kann eine Elektrode vorhanden
sein, um die Glucosekonzentration zu messen, und es kann ferner
ein Reflektionsspektrometer im Apparat vorhanden sein, um die Fruktosamin-Konzentration zu
messen. Eine ausführliche
Beschreibung eines Reflektionsspektrometers zur Messung von Glucose
und Fruktosamin ist im folgenden dargestellt. Es können jedoch
auch andere Apparate konstruiert werden, die sowohl Glucose als
auch glykierte Proteine messen können.
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In
dem glykämischen
Messapparat kann ein geeignetes automatisches Mittel zur Bestimmung
der Konzentrationen von Glucose und PGB, wie zum Beispiel ein Reflektionsspektrophotometer
mit geeigneter Software, so eingestellt werden, dass es automatisch
die Reflektion an gewissen Zeitpunkten ausliest, die Rate der Reflektionsänderung
berechnet, und unter Verwendung von Kalbrierungsfaktoren die Menge
des Analyten in der Blutprobe angeben. Ein solches Gerät ist in 3b schematisch
gezeigt, wobei Testvorrichtungen der vorliegenden Erfindung gemessen
werden können.
Die Lichtquelle 21, zum Beispiel eine Leuchtdiode (LED)
mit hoher Intensität,
projiziert einen Lichtstrahl auf die Ausleseregion der Testvorrichtung 15.
Ein Teil dieses Lichts wird von der Ausleseregion diffus reflektiert
und wird durch einen Lichtdetektor 22 detektiert, zum Beispiel
einen Licht-zu-Frequenz-Wandler, der eine Ausgangsfrequenz erzeugt,
die proportional zum empfangenen Licht ist.
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Falls
dies gewünscht
ist, können
Lichtquelle 21 und/oder Detektor 22 angepaßt werden,
um spezifische Wellenlängen
des Lichts zu erzeugen oder auf diese anzusprechen. Die Lichtquelle
kann polychromatisch sein, und der Lichtdetektor kann in der Lage
sein, zwei oder mehr verschiedene Wellenlängen zu messen. Alternativ
dazu oder zusätzlich,
kann der glykämische
Messapparat zwei oder mehr LED-Lichtquellen haben, die in der Lage
sind, zwei oder mehr spezifische Wellenlängen des Lichts zu emittieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
der Apparat zum Beispiel zwei LED-Lichtquellen, beide von Stanley
Electronic Company (Irvine, CA), spezifiziert als MPG3368S und MVR3368S.
Kommerzielle Licht-zu-Frequenz-Wandler umfassen solche, die von
Texas Instruments (Houston, TX) hergestellt werden, und als TSL235
und als die bevorzugte Komponente TSL230 spezifiziert sind.
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Das
Ausgangssignal von Detektor 22 wird von einem Mikroprozessor 24 zur
Datenanalyse verarbeitet. Der Mikroprozessor 24 kann den
folgenden Funktionen dienen: (1) Zeiteinstellung für das gesamte
System; (2) Verarbeitung der Frequenzdaten vom Licht-zu-Frequenz-Wandler;
(3) Berechnung der Analyten-Konzentrationen
aus den gespeicherten Reflektionsdaten; und (4) Ausgabe der Werte
für die
Analyten-Konzentration zur Anzeige 23. Eine Vielzahl von
Mikroprozessoren kann verwendet werden, wie zum Beispiel das DS5000T von
Dallas Semiconductor Company (Dallas, TX). Ein Speicherschaltkreis 25 kann
Daten und das Steuerprogramm für
den Mikroprozessor speichern. Das Anzeigemittel 23 kann
in unterschiedlichen Hardcopy- und Softcopy-Formen vorhanden sein. Üblicherweise
ist es eine visuelle Anzeige, wie zum Beispiel eine Flüssigkristall (LCD)-
oder ei ne LED-Anzeige, aber es kann auch ein Drucker, ein hörbares Signal
oder dergleichen sein. Das Instrument kann ferner einen Ein-Ausschalter
umfassen und, sofern dies gewünscht
ist, kann es eine hörbare oder
sichtbare Zeitausgabe abgeben, um das Auftragen von Proben, das
Ablesen, etc. anzuzeigen.
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Obwohl
andere Verfahren zur Aufnahme von Meßwerten möglich sind, ergab das folgende
Verfahren die gewünschten
Ergebnisse. Nach dem Beginn der Meßzeit werden Meßwerte nach
spezifischen Intervallen verzeichnet. Abhängig von der gemessenen Konzentration
können
die Intervalle variieren. Zum Beispiel können die PBG-Intervalle 15
Sekunden, und die Glucose-Messwerte können alle 5 Sekunden genommen
werden. Die Messungen werden durchgeführt, indem die LED für einen
kurzen Zeitraum eingeschaltet wird. Innerhalb dieses Zeitraums wird
das reflektierte Licht durch den Licht-zu-Frequenz-Wandler in eine
Frequenz umgewandelt. Diese Umwandlung wird vom Mikrocomputer überwacht,
indem die vom Licht-zu-Frequenz-Wandler erzeugte Pulsbreite erfaßt wird.
Diese Rohmesswerte für
die Reflektion werden in Ereignisse für die Ausgangs-Pulsbreite definiert.
Diese Ereignisse werden dann für
die vom Mikroprozessor vorgenommenen Berechnungen verwendet, um
die Konzentration von Glucose oder PBG zu berechnen.
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Der
glykämische
Messapparat kann auch einen Temperatursensor aufweisen, der die
Umgebungstemperatur und Temperaturveränderungen mißt. Der
Sensor ist besonders nützlich,
um temperaturabhängige Veränderungen
in der Testreaktivität
zu berücksichtigen.
Es kann ein digitales Thermometer verwendet werden, das in der Lage
ist, die Umgebungstemperatur und Temperaturveränderungen in zufriedenstellender
Weise zu überwachen.
Der Temperatursensor DS1620 von Dallas Semiconductor hat sich für diese
Anwendung als nützlich
erwiesen.
-
Wie
oben bezüglich
des Temperatursensors erörtert,
kann die Analyse für
Glucose und PBG mit der gegenwärtigen
Erfindung bei Umgebungstemperatur oder Raumtemperatur (etwa 20°C) durchgeführt werden. Überraschenderweise
und unerwarteterweise ist die Erfindung in der Lage, selbst bei
Raumtemperatur und ohne Reaktionsbeschleuniger die Fruktosamin-Konzentrationsspiegel
in weniger als fünf
Minuten oder innerhalb von etwa fünf Minuten analysieren; und
sogar in so kurzer Zeit wie in vier Minuten oder weniger, und bevorzugt
in etwa drei Minuten oder weniger, wie in den folgenden Beispielen
gezeigt wird. Im Stand der Technik wurden entweder Reaktionsbeschleuniger
oder erhöhte
Temperaturen verwendet. Zum Beispiel benötigt der Trockenphase-Fruktosamintest
von Ismail, der in U.S. Patent 4,956,301 beschrieben ist, den Einsatz
eines Reaktionsbeschleunigers, um Fruktosamin-Konzentrationen bei
Umgebungstemperatur zu analysieren. Wie vorliegend verwendet bedeutet "Reaktionsbeschleuniger" jede Substanz, die
nur zum Zweck der Beschleunigung der Reaktion des Fruktosamintests
zugegeben wird. Solche Substanzen sind im allgemeinen nicht-ionische Detergenzien
und organische Lösungsmittel,
welche die Reaktionsrate des Fruktosamintests erhöhen. Die Verfahren
der vorliegenden Erfindung zur Analyse von Fruktosamin in etwa fünf Minuten
oder weniger schließen
die Verwendung derartiger Reaktionsbeschleuniger aus.
-
Wie
oben erwähnt,
werden erhöhte
Temperaturen auch in Verfahren im Stand der Technik zur Beschleunigung
des Fruktosamin-Assays
verwendet. Zum Beispiel erfordert das mehrschichtige analytische
Element von Sakamoto zur Analyse von Fruktosamin (beschrieben in
der veröffentlichten
Europäischen
Patentanmeldung 0 473 109) erhöhte
Temperaturen im Bereich von 37-40°C,
ebenso wie der in U.S. Patent 5,370,990 von Staniford et al. beschriebene
Fruktosamin-Assay. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden erhöhte Temperaturen
nicht benötigt,
um eine vollständige
Fruktosaminanalyse in etwa fünf
Minuten oder weniger zu erreichen.
-
Die
folgenden Beispielen sollen die Erfindung veranschaulichen, jedoch
nicht begrenzen.
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BEISPIEL I
-
Dieses
Beispiel zeigt die Herstellung und das Testen von proteingebundener
Glucose, Fruktosamin mit einer Vollblutprobe.
-
Herstellung
einer Fruktosamin-Testvorrichtung
-
Bluttrennungsteil
der Fruktosamin-Testvorrichtung
-
Ein
Tetko-Netz #7-280/44 (Tetko, Inc. Rueschlikon, Schweiz) wurde für 1 Minute
in eine Detergenzlösung
aus 1% Pluronic (Pragmatics, Inc., Elkhart, IN) gelegt. Überschüssiges Detergenz
wurde entfernt, und das Netz wurde durch Erhitzen bei 60°C für 10 Minuten
getrocknet. Bis zur Benutzung wurde das Netz in getrockneten Plastikbeuteln
aufbewahrt. Dann wurden 3/16''-Kreise in der mehrschichtigen
Testvorrichtung auf Trägerelement 2 platziert
(2).
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Eine
Cytosep®-Membran
#1661 (Ahlstrom Filtration, Inc., Mt. Holly Spring, PA) wurde für 1 Minute
in eine phosphatgepufferte Salzlösung
(PBS) gelegt, die 300 μg/ml
Kartoffellektin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt. Überschüssige Lösung wurde
entfernt, und die Membran wurde durch Erhitzen bei 40°C für 60 Minuten
getrocknet. Bis zur Benutzung wurde die Membran in getrockneten
Plastikbeuteln aufbewahrt. Bei Benutzung wurden fünf (5) 3/16''-Kreise der Membran in der mehr schichtigen
Testvorrichtung zwischen den Trägerelementen 2, 3 und 4 platziert
(2).
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Eine
unbehandelte Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 0,4 μm (Corning
Costar, Cambridge, MA) wurde in ein Quadrat von 1 cm geschnitten
und an den Boden des Kunststoffträgerelements 4 befestigt,
wodurch die 3/16''-Öffnung bedeckt wurde.
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Signalerzeugender
Teil der Fruktosamin-Testvorrichtung
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Pufferschicht-Kissen:
Schleicher und Schuell Papier Typ 589 (Keene, N.H.) wurde für 1 Minute
in eine 1 molare Lösung
Guanidiniumcarbonatpuffer (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) mit
einem pH von 11,5 gelegt, der 1% Pluronic (Pragmatics, Inc., Elkhart,
IN) enthielt. Überschüssige Lösung wurde
entfernt, und das Papier wurde durch Erhitzen bei 60°C für 30 Minuten
getrocknet. Nach dem Trocknen wurde das Papier für die Pufferschicht in einem
Exsikkator aufbewahrt. Bei Benutzung wurde ein 3/16''-Kreis des Pufferpapiers in das Kunstoff-Trägerelement 5 plaziert
(2).
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Indikatorschicht-Kissen:
Ahlstrom A131 Glasfiber (Ahlstrom Filtration, Inc. Mt, Holly Spring,
PA) wurde für
1 Minute in eine wässrige
Lösung
aus 5 mM Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO) gelegt. Überschüssiges NBT
wurde entfernt, und das Glasfiber wurde durch Erhitzen bei 60°C für 30 Minuten
getrocknet. Nach dem Trocknen wurde die Glasfiber im Dunkeln aufbewahrt.
Bei Benutzung wurde ein 3/16''-Kreis der Glasfiber
auf das Kunstoff-Trägerelement 5 plaziert.
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Trägerelemente
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Fünf weiße, im wesentlichen
planare Polystyrolstreifen (LXN Corp., Irvine, CA) wurden benutzt.
Der Bodenstreifen 5 hatte eine Öffnung mit einem Durchmesser
von 3/16'' mit einem 1 mm × 7 mm großen Spalt, der
von einem 0,002 Inch dicken Poylethylenfenster abgedeckt war, welches
am Boden des Streifens befestigt war. Die mittleren drei Streifen 2, 3 und 4 hatten Öffnungen
mit einem Durchmesser von 3/16 Inch und ein Klebmittel auf der Unterseite
jedes Streifens. Der obere Streifen 1 hatte eine Öffnung mit
einem Durchmesser von 1/8 Inch und ein Klebmittel auf der Unterseite
des Streifens.
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Zusammenbau
der mehrschichtigen Fruktosamin-Testvorrichtung
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Der
Bluttrennungsteil der Testvorrichtung und der signalerzeugende Teil
der Vorrichtung wurden zusammengebaut, wie es in 2 gezeigt
ist. Die Netzschicht wurde innerhalb der drei zusammengeklebten Kunststoffträger auf
die fünf
mit Lektin imprägnierten
Cytosep®-Schichten
gelegt. Der Kunststoffträger
mit dem Loch von 1/8 Inch wurde auf die drei zusammengeklebten Kunststoffträger gelegt,
welche die Netzschicht und die Cytosep®-Schichten
enthielten. Ein 1 cm-Quadrat aus Polycarbonat wurde an die Unterseite
der drei zusammengeklebten Kunststoffträger befestigt.
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Ein
Pufferschicht-Kissen wurde in der Öffnung des unteren Kunststoffträgerelements
auf ein NBT-Indikatorschicht-Kissen gelegt, und es wurde gegen das
am Boden dieses Kunststoffträgerelements
befestigten Fensters gedrückt.
Das Kunststoffträgerelement,
das die Pufferschicht und die Indikatorschicht enthielt, wurde an
das Bluttrennungschichtteil befestigt, wobei das Kissen der Pufferschicht
auf der Polycarbonatmembran lag und mit dem Klebmittel an der Unterseite
des Kunststoffträgerelements 4 befestigt
war.
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Analyse von Fruktosamin
in einer Vollblutprobe
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Glykiertes
humanes Serumalbumin (G-HSA) wurde hergestellt, indem 3 g HSA (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO) in 20 ml PBS, das 0,5 molare Glucose
enthielt, bei 45°C
für 14
Tage inkubiert wurde. Das G-HSA wurde durch Elution über eine
Bio-Gel P-10-Säule
in PBS von nicht umgesetzter Glucose getrennt.
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Vollblutproben
von einem einzelnen Patienten wurden mit einem gleichen Volumen
von PBS oder einer G-HSA-Probe mit 6 mM Fruktosamin gemischt. Da
die Vollblutprobe selbst 2 mM Fruktosamin enthielt, wiesen die drei
Proben 1, 2 oder 4 mM Fruktosamin auf. Fünfzehn (15) Mikroliter von
jeder Probe wurden mit der oben beschriebenen mehrschichtigen Fruktosamin-Testvorrichtung
untersucht. Nach dem Auftragen der Probe wurde die Testvorrichtung
in den oben beschriebenen glykämischen
Messapparat eingeführt,
und die Reflexion bei 555 nm wurde für 3 Minuten aufgezeichnet.
Die Änderung
in der Reflexion (ΔK/S)
von 2 auf 3 Minuten ergab die folgenden Ergebnisse:
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Wie
aus den Ergebnissen ersichtlich ist, erhöhte sich die Reaktionsrate
mit zunehmender Fruktosaminkonzentration in der Blutprobe.
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BEISPIEL II
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Dieses
Beispiel zeigt die Herstellung und die Untersuchung eines schnellen
Glucosetests mit einer Vollblutprobe.
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Herstellung von Glucose-Teststreifen
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Ein
Blatt der 0,8 Micron Supor
® Membran (Gelman Science,
Ann Arbor, MI) wurde in eine Lösung
mit folgender Zusammensetzung getaucht:
Gelatine-150
Bloom | 0,5
g |
Glucose-Oxidase | 0,285
g |
Meerrettichperoxidase | 0,133
g |
Zitronensäure | 0,593
g |
Natriumcitrat | 2,61
g |
Destilliertes
Wasser | 32
ml |
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Nach
dem Eintauchen wurde das Blatt in einem Ofen bei 56°C für 20 Minuten
getrocknet. Das Blatt wurde dann in eine Lösung folgender Zusammensetzung
getaucht:
Isopropylalkohol | 39,5
ml |
3,5,3',5'-Tetramethylbenzidin | 0,2
g |
ortho-Tolidin | 0,2
g |
Pluronic
L64 (20%) | 0,5
ml |
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Nach
dem Eintauchen wurde das Blatt bei 56°C für weitere 20 Minuten getrocknet. 3a zeigt
die Konstruktion einer Glucose-Testvorrichtung 19. Die
oben beschriebene Glucose-Testmembran 18 wurde
in 1 cm Quadrate geschnitten und mit Klebmittel 17 an einen
Kunststoffhalter 16 mit einem 5 mm-Loch 20 und
einer dreieckige Einkerbung 19 befestigt. Blutproben wurden
auf das 5 mm Loch 20 aufgebracht. Die Proben befeuchteten
die Membran und reagierten unter Farbbildung, die der Glucose in
der Blutprobe entsprach.
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Analyse von
Glucose in Blutproben
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Unterschiedliche
Konzentration an Glucose wurden zu einer Blutprobe gegeben. Ein
Tropfen jeder Probe wurde auf einen Glucose-Teststreifen aufgebracht,
und die Reflexion (ΔK/S)
wurde wie oben beschrieben in einem glykämischen Meßapparat nach 45 Sekunden gemessen.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
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Die
Daten zeigen, daß die
erzeugte Farbe proportional zur Glucosekonzentration in der Blutprobe
war.
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Obwohl
die Erfindung mit Bezug auf die offenbarten Ausführungsformen beschrieben wurde,
wird der Fachmann problemlos erkennen, daß die Erfindung durch die dargestellten,
spezifischen Beispiele nur veranschaulicht wird.