-
STAND DER
TECHNIK
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Instrumente für Steuerung bzw. Regelung chemischer
Reaktionen und die Detektion teilnehmender Reagenzien und resultierender
Produkte, im Besonderen integrierte mikrogefertigte Instrumente
zur Ausführung mikroskalarer
chemischer Reaktionen einschließlich einer
präzisen
Regelung der Reaktionsparameter, und im Besonderen betrifft die
vorliegende Erfindung Muffenbausteine auf Siliziumbasis als Reaktionskammern
für chemische
Reaktionen, und wobei diese Bausteine für eine Mikroreaktionseinheit
mit hohem Durchsatz in großen
Anordnungen einzelner Kammern verwendet werden können.
-
Aktuelle
Instrumente zur Ausführung
einer chemischen Synthese durch thermische Regelung und thermische
Wechselbeanspruchung sind allgemein sehr groß (Tischgeräte) und Ineffizient, und häufig werden
sie durch Erhitzen und Abkühlen
einer großen
thermisch wirksamen Masse (z.B. eines Aluminiumblocks) betrieben.
In den letzten Jahren haben sich die Anstrengungen auf eine Miniaturisierung dieser
Instrumente konzentriert, und zwar durch die Entwicklung und Konstruktion
von Reaktionskammern aus Silizium oder Werkstoffen auf Siliziumbasis (z.B.
Silizium, Nitrid, polykristallines Silzium), die integrierte Heiz-
und Kühleinrichtungen
durch Konvektion über
das Silizium aufweisen.
-
Mikrofertigungstechnologien
sind im Fach allgemein bekannt. Dazu zählen unter anderem das Besputtern,
die galvanische Metallabscheidung, die Niederdruckbedampfung, die
Photolithografie und das Ätzen.
Mikrogefertigte Bausteine werden für gewöhnlich auf kristallinen Substraten
ausgebildet, wie etwa Silizium und Galliumarsenid, wobei sie aber auch
aus nichtkristallinen Materialien bzw. Werkstoffen wie etwa Glas
oder bestimmten Polymeren gestaltet werden können. Die Formen kristalliner
Bausteine lassen sich leicht regeln bzw. kontrollieren, da es sich
bei geätzten
Oberflächen
allgemein um kristalline Flächen
bzw. Ebenen handelt, und kristalline Werkstoffe können durch
Verfahren gebondet bzw. verbunden werden, wie etwa durch Schmelzen
auf erhöhten
Temperaturen, durch anodisches Bonding oder durch feldunterstützte Verfahren.
-
Die
monolithische Mikrofertigungstechnologie ermöglicht heute die Produktion
elektrischer, mechanischer, elektrochemischer, optischer, chemischer
und thermischer Bausteine bzw. Vorrichtungen, darunter Pumpen, Ventile,
Heizeinrichtungen, Mischer und Detektoren für Mikroliter- oder Nanolitermengen
von Gasen, Flüssigkeiten
und Feststoffen. Ferner können
heute im Mikromaßstab
Lichtwellenleitersonden und Ultraschall-Biegewellensensoren erzeugt werden.
Die Integration dieser mikrogefertigten Bausteine bzw. Vorrichtungen
in ein einzelnes System ermöglicht
die Chargenfertigung von Analyseinstrumenten auf Reaktorbasis im
Mikromaßstab. Derartige
integrierte Mikroinstrumente können
bei biochemischen, anorganischen oder organischen chemischen Reaktionen
eingesetzt werden, um biomedizinische und Umweltdiagnosen vorzunehmen,
wie etwa eine biotechnologische Verarbeitung und Detektion.
-
Der
Betrieb derartiger integrierter Mikroinstrumente lässt sich
leicht automatisieren, und da die Analysen in Situ ausgeführt werden,
ist die Verunreinigung sehr geringfügig. Aufgrund der inhärent kleinen
Größen dieser
Vorrichtungen können
das Erhitzen und das Abkühlen
außerordentlich
schnell erfolgen. Diese Vorrichtungen weisen eine sehr niedrige Leistungsaufnahme
auf und können über Batterien oder
durch elektromagnetische, kapazitive, induktive oder optische Kopplung
mit Energie versorgt werden.
-
Die
geringen Volumina und die großen
Oberflächen-Volumen-Verhältnisse
mikrogefertigter Reaktionsinstrumente sehen ein hohes Maß der Regelung
bzw. der Steuerung der Parameter einer Reaktion vor. Heizeinrichtungen
können
Temperaturwechsel oder -anstiege erzeugen; während sonochemische und sonophysikalische
Veränderungen
der Konformationsstrukturen durch Ultraschallmesswandler erzeugt
werden können;
und wobei Polymerisationen durch einfallende optische Strahlung
erzeugt werden können.
-
Synthetische
Reaktionen und im Besonderen synthetische Kettenreaktionen wie etwa
die Polymerase-Kettenreaktion (PCR als englische Abkürzung von
Polymerase Chain Reaction) eignen sich besonders gut für Mikrofertigungs-Reaktionsinstrumente.
Die PCR kann selektiv ein einzelnes DNA-Molekül (oder RNA-Molekül) eines Organismus um einen
Faktor von 106 bis 109 verstärken. Dieses allgemein
anerkannte Verfahren erfordert den wiederholten Einsatz von Erhitzungszyklen
(Denaturieren) und Abkühlzyklen
(Ausglühen)
in Gegenwart eines ursprünglichen
DNA-Zielmoleküls,
spezifischer DNA-Primer, von Deoxynukleotid-Triphosphaten und DNA-Polymeraseenzymen
und Cofaktoren. Jeder Zyklus erzeugt eine Verdoppelung der Ziel-DNA-Sequenz,
was zu einer exponentiellen Akkumulation der Zielsequenz führt.
-
Das
PCR-Verfahren umfasst: 1) das Verarbeiten der Probe zur Freisetzung
der Ziel-DNA-Moleküle
in ein Rohextrakt; 2) den Zusatz einer wässerigen Lösung, die Enzyme Puffer-Deoxyribonukleotid-Trihposphate
(dNTPS) und Oligonukleotid-Primer enthält; 3) die
Wärmewechselbeanspruchung
der Reaktionsmischung zwischen zwei oder drei Temperaturen (z.B.
90–96,
72 und 37–55°C); und 4)
das Detektieren von verstärkter
DNA. In das PCR-Verfahren können
Zwischenschritte integriert werden, wie zum Beispiel das Reinigen
der Reaktionsprodukte und das Integrieren von Oberflächen biegenden
Primern.
-
Ein
Problem in Bezug auf Standard-PCR-Labortechniken ist es, dass die
PCR-Reaktionen durch das Einfügen
eines einzelnen verunreinigenden Moleküls von Fremd-DNA verunreinigt
oder inhibiert werden können,
wie etwa durch zurückliegende
Experimente, oder durch andere Verunreinigungen während der Übertragung
der Reagenzien von einem Gefäß in ein
anderes. Ferner liegen PCR-Reaktionsvolumina, die in Standard-Labortechniken zum
Einsatz kommen, für
gewöhnlich
im Bereich von 50 Mikrolitern. Ein thermischer Zyklus bzw. ein Wärmezyklus
besteht für
gewöhnlich
aus vier Phasen: dem Erhitzen einer Probe auf eine erste Temperatur;
das Halten der Probe auf der ersten Temperatur; das Abkühlen der
Probe auf eine zweite Temperatur; und das Aufrechterhalten der Temperatur
auf der niedrigeren Temperatur. Für gewöhnlich wird für jede dieser
vier Phasen eines thermischen Zyklus ungefähr eine Minute benötigt, und
somit sind für
insgesamt vierzig Zyklen etwa drei Stunden erforderlich. Aufgrund
des in Standard-Laborverfahren verwendeten verhältnismäßig großen Volumens, der involvierten Zeit
sowie der Verunreinigungsmöglichkeiten
während
den Übertragungen
von Reagenzien von einem Gefäß in ein
anderes, werden eindeutig Mikroinstrumente benötigt, die das PCR-Verfahren
ausführen können.
-
In
letzter Zeit wurde die Zykluszeit bzw. die Durchlaufzeit zur Ausführung der
PCR-Reaktion durch die Ausführung
der PCR-Reaktion
in Kapillarröhren
und unter Verwendung einer Umluftheizeinrichtung reduziert. Ferner
wurde kürzlich
ein integrierter, mikrogefertigter Reaktor für in Situ chemische Reaktionen
entwickelt, der für
biochemische Reaktionen besonders vorteilhaft ist, die eine thermische
Wärmebeanspruchung
mit sehr hoher Präzision voraussetzen,
im Besonderen DNA-basierte Manipulationen wie etwa PCR, da die kleinen
Abmessungen der Mikroinstrumente kurze Zykluszeiten fördern. Dieser
mikrogefertigte Reaktor ist beschrieben und beansprucht in dem U.S.
Patent US-A-5,639,423 mit dem Titel "Microfabricated Reactor" an den Zessionar
der vorliegenden Erfindung. Ferner entwickelt zum Einsatz in chemischen
Reaktoren wurde eine optisch erhitzte und optisch abgefragte Mikroreaktionskammer,
die zum Beispiel in dem integrierten mikrogefertigten Reaktor aus
dem oben genannten U.S. Patent US-A-5,639,423 verwendet werden kann.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft eine besondere Geometrie von Mikroreaktoren
auf Siliziumbasis, die sich in Bezug auf die Leistungs- und Temperatureinheitlichkeit
als sehr effizient erwiesen haben. Der Mikroreaktor gemäß der vorliegenden
Erfindung, der im weiteren Sinne als Muffenvorrichtung auf Siliziumbasis
für chemische
Reaktionen gilt, kann effektiv in jedem der Reaktorsysteme der vorstehend genannten
gleichzeitig anhängigen
Anmeldungen verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung werden
dotiertes Silizium zum Erhitzen und Bulk-Silizium zum Konvektionskühlen eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht
mehrere bzw. verschiedene Parameter, wie das gleichzeitige Anpassen
der Detektionsfenstergröße, der
Situ-Detektion, der Reaktionsvolumina, der thermischen Einheitlichkeit
und der Erhitzungs- und Abkühlraten.
Darüber
hinaus ermöglicht
sie den Einsatz großer
Anordnungen einzelner Reaktionskammern für eine Mikroreaktionseinheit
mit hohem Durchsatz.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte
chemische Reaktionskammer vorzusehen.
-
Der
vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine
Muffenvorrichtung auf Siliziumbasis für chemische Reaktoren bereitzustellen.
-
Der
vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine
chemische Reaktionskammer bereitzustellen, die den Einsatz von dotiertem Polysilizium
und Bulk-Silizium kombiniert.
-
Der
vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, chemische
Reaktionskammern bereitzustellen, die den Einsatz von dotiertem
Polysilizium und Bulk-Silizium kombinieren, um eine Flexibilität in Bezug
auf die thermischen und optischen Eigenschaften vorzusehen, so dass
eine Implementierung in kleinen und großen Instrumenten ermöglicht wird.
-
Der
vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine
Reaktionsmuffe auf Siliziumbasis bereitzustellen, welche ein kritisches
Verhältnis von
Silizium und Siliziumnitrid zu dem Volumen des zu erhitzenden Materials
(z.B. Flüssigkeit)
kombiniert, um eine einheitliche Erhitzung bei niedriger Leistungsaufnahme
vorzusehen.
-
Der
vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine
Reaktionsmuffe auf Siliziumbasis bereitzustellen, welche das Einführen einer
sekundären
Rohrleitung bzw. Röhre
(z.B. aus Kunststoff) in die Reaktionsmuffe ermöglicht, welche die Reaktionsmischung
enthält,
wodurch etwaige potenzielle Materialunverträglichkeitsaspekte abgeschwächt werden.
-
Der
vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine
Anordnung einzelner Reaktionskammern für eine Mikroreaktionseinheit
mit hohem Durchsatz bereitzustellen.
-
Der
vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, ein handgehaltenes
Instrument bereitzustellen, das muffenartige Reaktionskammern auf
Siliziumbasis mit integrierten Heizeinrichtungen verwendet.
-
Der
vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine
Reaktionskammer mit einer automatisierten Detektion und Regelung
bereitzustellen.
-
Der
vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine
Reaktionsregelung bzw. Reaktionssteuerung in einer Reaktionskammer
durch eine künstliche
Intelligenz vorzusehen.
-
Der
vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, eine
Impulsbreitenmodulation als Regelung für die Reaktionskammer bereitzustellen.
-
Weitere
Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der
folgenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen deutlich.
Im Wesentlichen handelt es sich bei der vorliegenden Erfindung um
eine Muffe auf Siliziumbasis für
chemische Reaktionen. Die Erfindung umfasst eine chemische Reaktionskammer,
die den Einsatz von Polysilizium zum Erhitzen und von Bulk-Silizium
zum Konvektionskühlen
kombiniert. Die Reaktionsmuffe kombiniert ein kritisches Verhältnis von
Silizium und Siliziumnitrid zu dem Volumen des zu erhitzenden Materials,
so dass eine einheitliche Erwärmung
bzw. Erhitzung bei gleichzeitig geringer Leistungsaufnahme vorgesehen
wird. Die Reaktionsmuffe ermöglicht
ferner das Einführen
einer sekundären
Rohrleitung in diese, welche die Reaktionsmischung aufweist, wodurch
etwaige potenzielle Inkompatibilitätsaspekte abgeschwächt werden.
Die Vorliegende Erfindung ist eine Erweiterung des vorstehend bereits
genannten integrierten mikrogefertigten Reaktors aus dem vorstehend
genannten U.S. Patent US-A-5,639,423. Die Muffenreaktionskammer
auf Siliziumbasis kann in chemischen Reaktionssystemen zur Synthese
und Verarbeitung organischer, anorganischer oder biochemischer Reaktionen
verwendet werden, wie etwa der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und/oder
von DNA-Reaktionen (wie etwa der Ligose-Kettenreaktion) oder von
anderen synthetischen Reaktionen auf der Basis von Wärmewechseln.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Es
zeigen:
-
1 eine
Perspektivansicht im teilweisen Aufriss eines mikrogefertigten chemischen
Reaktionsinstruments, das in einer Stromversorgungs-/Regelungsvorrichtung
angebracht ist;
-
2 eine
schematische Ansicht des Reaktionsinstruments aus 1;
-
3 eine
schematische Ansicht einer Heiz- und Detektionsanordnung für eine mikrogefertigte Reaktionskammer;
-
4 ein
Ausführungsbeispiel
einer mikrogefertigten Muffenreaktionskammer auf Siliziumbasis,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt worden ist;
-
5 eine
Anordnung der Muffenreaktionskammern aus 4, die funktionsfähig mit
einer Mikroelektrophoreseanordnung verbunden sind;
-
6 eine
vergrößerte Endansicht
eines weiteren Ausführungsbeispiels
einer Muffenmikroreaktionskammer aus 4;
-
7 ein
Querschnittsausführungsbeispiel eines
vergrößerten Bereichs
aus 6 unter Verwendung eines festen Fensters mit isolierter
Heizeinrichtungsversion;
-
8 eine
Querschnittsansicht eines anderen Ausführungsbeispiels des gleichen
vergrößerten Bereichs
aus 6 unter Verwendung eines variablen Fensters mit
einer nicht-isolierten Heizeinrichtung;
-
9 eine
Ansicht eines handgehaltenen Instruments (PCR Man), das die Reaktionskammern aus 6 als
Einsätze
zur Reaktionsveränderung verwendet;
-
die 10A und 10B das
Wärmezyklusinstrument
unter Verwendung mehrerer hundert einzeln geregelter Mikroreaktionskammern
auf Siliziumbasis;
-
11 eine
schematische Darstellung eines Systems mit hohem Durchsatz zur DNA-Verstärkung, Probenhandhabung
und Elektrophorese;
-
12 ein
Ausführungsbeispiel
eines Einsatzes/einer Auskleidung für eine Reaktionskammer mit
einem optischen Fenster, wobei die Oberseite/die Abdeckung offen
ist;
-
13 das
externe Füllen
eines Einsatzes/einer Auskleidung einer Reaktionskammer;
-
14 immobilisierte
Reagenzien/Proben zur Detektion spezifischer Produkte direkt an
Fenstern oder in einem Reaktionsfluid, die unter Verwendung eines "Teststreifens" optisch in dem handgehaltenen
Instrument (PCR Man) aus 9 detektiert werden;
-
die 15 und 16 eine
schematische Darstellung optischer Detektionssysteme zur Verwendung
in Verbindung mit den Mikroreaktionskammern aus 6;
-
17 eine
schematische Darstellung des Einsatzes der integrierten Detektion
für ein
Regelungssystem mit künstlicher
Intelligenz;
-
18 ein
Diagramm der elektrochemischen Oxidations- und chemischen Reduktionsreaktionen
für Tris(2,2'bipyridyl)Ruthenium(II)(TBR)
und Tripropylamin (TPA);
-
19 ein
Verfahren zur Etikettierung und Separation von DNA zur Detektion
und Quantifizierung durch Elektrochemilumineszenz (ECL);
-
20 eine
Ansicht der Zellenspannung und der ECL-Intensität versus der Zeit, wobei die
Spannung erst ansteigt und danach zurückgeht;
-
21 ein
Ausführungsbeispiel
einer mikrobearbeiteten ECL-Zelle
mit einer Dünnfilmanode
und einem zugeordneten Photodiodendetektor;
-
22 eine
vergrößerte Querschnittsansicht der
ECL-Zelle aus 21 mit elektrischen Zuleitungen;
-
die 23 bis 30 das
Fertigungsverfahren zur Erzeugung einer ECL-Zelle, wie dies in der Abbildung
aus 21 dargestellt ist; und
-
31 ein
Ausführungsbeispiel
unter Verwendung von Al auf ITO auf Glas, wodurch der Widerstand
der ITO-Elektrode reduziert wird.
-
GENAUE BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
-
Bei
der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine mikrogefertigte
Muffenkammer auf Siliziumbasis für
chemische Reaktionen gemäß dem gegenständlichen
Anspruch 1, wobei die Kammer Heizeinrichtungen bzw. Heizelemente
kombiniert, wie etwa dotiertes Polysilizium zum Erhitzen und Bulk-Silizium
zum Kühlen.
Die Mikroreaktionskammern können
in einer Anordnung für
eine Mikroreaktionseinheit mit hohem Durchsatz oder in einer handgehaltenen
Einheit verwendet werden. Diese kombiniert ein kritisches Verhältnis von
Silizium und Siliziumnitrid zu dem Volumen des zu erhitzenden Materials
(z.B. Flüssigkeit),
um eine einheitliche Erwärmung
bei gleichzeitig geringer Leistungsaufnahme bereitzustellen. Ferner
ermöglicht
dies die Einführung
einer sekundären
Rohrleitung (z.B. Kunststoff) in die Reaktionsmuffe, welche die
Reaktionsmischung aufweist, wodurch etwaige potenzielle Materialunverträglichkeitsaspekte
abgeschwächt
werden. Die vorliegende Erfindung verwendet eine spezielle Geometrie
von Mikroreaktoren auf Siliziumbasis, die sich in Bezug auf den
Leistungsverbrauch und die Einheitlichkeit der Temperatur als sehr
effizient erwiesen haben. Das spezielle Ausführungsbeispiel des beschriebenen
mikrogefertigten Reaktors wurde experimentell als Wärmezyklusinstrument
zur Verwendung in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und anderen
chemischen Reaktionen eingesetzt, und dabei hat es sich als gegenüber den
aktuell im Handel erhältlichen Instrumenten
an thermisch gesteuerten chemischen Reaktoren als überlegen
erwiesen. Die erfindungsgemäße Muffenreaktionskammer
auf Siliziumbasis kann an Stelle der Reaktionskammer des mikrogefertigten
Systems aus der oben genannten, gleichzeitig anhängigen Anmeldung mit der Anmeldenummer 07/938,106
und in Verbindung mit der integrierten Heizeinrichtungs- und Detektionsanordnung
der oben genannten, gleichzeitig anhängigen Anmeldung mit dem Aktenzeichen
08/(IL-9121) eingesetzt werden, und sie stellt somit eine Erweiterung
der mikrogefertigten chemischen Reaktionssysteme aus diesen gleichzeitig
anhängigen
Anmeldungen dar.
-
Zur
Vermittlung eines umfassenden Verständnisses eines mikrogefertigten
Instruments für chemische
Reaktionen und der integrierten Heiz-/Detektionsanordnung erfolgt
vor der Beschreibung des Ausführungsbeispiels
der Muffenreaktionskammer gemäß der vorliegenden
Erfindung eine Beschreibung eines mikrogefertigten chemischen Reaktors und
einer integrierten Heiz-/Detektionsanordnung der beiden vorstehend
genannten gleichzeitig anhängigen
Anmeldungen.
-
Die
Abbildung aus 1 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel
eines mikrogefertigten Instruments für chemische Reaktionen, das
allgemein mit der Bezugsziffer 10 bezeichnet ist, wobei
darüber
ein ausgesparter Bereich, allgemein mit der Bezugsziffer 11 bezeichnet,
in einem Stromversorungs-/Regelungssystem des mikrogefertigten Reaktionsinstruments,
allgemein mit der Bezugsziffer 12 bezeichnet, dargestellt
ist. Eine hyperdermische Nadel 13 ist abgebildet, welche
eine Probe durch ein Silikongummifenster 14 in das Reaktionsinstrument 10 einführt. Die
Reaktion wird geregelt und versorgt durch: eine Induktionskopplung
bzw. Induktionskupplung, wie etwa zwischen der Spule LCL in
dem Instrument 10 und einer Magnetspule 15; durch
kapazitive Kopplung, wie etwa zwischen den Platten des Kondensators
C3 und den Platten 16 und 17;
und durch elektromagnetische Kopplung zwischen einer Resonanzschaltung,
siehe 2, in einem Instrument 10 und einer Funkfrequenzantenne 18.
-
Die
Abbildung aus 2 zeigt eine schematische Ansicht
des Instruments 10 aus 1 und umfasst
drei Reagenzienkammern 29, 20 und 21,
die zum Beispiel DNA-Primer, die Polymerase und die Nukleotide und
etwaige Detektions-Etikettierungsmoleküle wie etwa Magnetkügelchen
aufweisen können.
Das Ziel-DNA-Molekül wird in
der Reagenzienkammer 19 platziert, indem eine hypodermische
Nadel 13 (1) oder dergleichen durch ein
Fenster 14 aus Silikongummi oder aus einem andersartigen
Material eingeführt
wird. Die Reagenzienkammern 19, 20 und 21 sind
entsprechend durch Kanäle 22, 23 und 24 mit
schmalen bzw. engen Mittelabschnitten, die nicht abgebildet sind,
mit einer Reaktionskammer 25 verbunden. Für gewöhnlich weisen
die Kammern 19 bis 21 und 25 ein Volumen
auf, das im Bereich von Mikrolitern bis Nanolitern liegt. Die Kanäle 22 bis 24 sind
mit entsprechenden Lambwellenpumpen LW1, LW2 und LW3 ausgerüstet, die
dazu dienen, Reagenzien in den Kammern 19 bis 21 durch
die Kanäle 22 bis 24 in
Richtung der Pfeile in die Reaktionskammer 25 zu pumpen.
Die Lambwellenpumpen können
an jeder Wand oder an mehreren Wänden
der Kanäle 22 bis 24 angeordnet
sein. Die Lambwellenpumpen LW1, LW2 und LW3 sind entsprechend
mit den Kondensatoren C1, C2 und
C3 verbunden. Die Oberflächenspannung an den schmalen
bzw. engen Mittelabschnitten der Kanäle 22 bis 24 verhindert
es, dass Reagenzien in den Kammern 19 bis 21 in
die Reaktionskammer 25 fließen, bevor das Pumpen eingeleitet
wird. Die inneren Oberflächen
der Kanäle 22 bis 24 können so
behandelt werden, dass sie die Oberflächenspannung erhöhen, wodurch
der Fluss der Reagenzien weiter behindert wird, wenn die Lambwellenpumpen
nicht aktiviert sind.
-
Die
Reaktionskammer 25 kann mit einem Lambwellen-Messwandler
LWC und einer Heizeinrichtung bzw. einem
Heizer HC ausgerüstet sein. Der Lambwellen-Messwandler
LWC ist mit einem Induktor LCL (in
der Abbildung aus 1 ebenfalls abgebildet) verbunden
sein. Die Heizeinrichtung HC ist mit einem Resonanzkreis
verbunden, der aus einem Induktor LCH und
einem Kondensator CCH besteht. Der Lambwellen-Messwandler
LWC fungiert als Rührvorrichtung, Mischer oder
sonochemischer Induktor, wie dies durch die verbundenen Pfeile 26 in
der Kammer 25 dargestellt ist.
-
Ein
Kanal 27 verbindet die Reaktionskammer 25 mit
einer Detektionskammer 28. Der Kanal 27 ist mit
einer Lambwellenpumpe LWDP versehen, die mit
einem Resonanzkreis verbunden ist, der aus einem Induktor LDP und einem Kondensator CDP besteht.
Die Detektionskammer 28 ist mit einem Lambwellensensor
LWD ausgestattet, der mit einem Kondensator
CD verbunden ist.
-
Die
Lambwellen-Messwandler weisen hohe mechanische Q-Werte auf und können somit
nur innerhalb eines eng begrenzten Bereichs von Wechselstromspannungsfrequenzen
betrieben werden. Die Lambwellenpumpen (LW1,
LW2, LW3) und der Lambwellensensor
(LWD) werden kapazitiv betrieben, indem
ein elektrisches Feld zwischen den Platten (wie etwa den Platten 16 und 17 aus 1)
auf Resonanzfrequenzen der Lambwellen-Messwandler (LW1,
LW2, LW3) erzeugt
wird. Da die Messwandler jedoch hohe Q-Werte aufweisen, schwingt der Messwandler
nur dann mit einer größeren Magnitude, wenn
die Frequenz des erzeugten Felds nahe der Resonanzfrequenz eines
Messwandlers liegt. In ähnlicher
Weise ist der Lambwellen-Mischkammermesswandler LWC mit
einem Wechselfrequenz-Magnetfeld versehen, das durch die Spule (in 1 mit 15 bezeichnet)
auf der mechanischen Resonanzfrequenz des Messwandlers LWC erzeugt wird. Die Heizeinrichtung HC und die Lambwellenpumpe LWDP werden aktiviert,
indem eine elektromagnetische Welle von der Antenne (in der Abbildung
aus 1 mit 18 bezeichnet) zu dem Resonanzkreis
CCH und LCH und entsprechend
zu dem Resonanzkreis CDP und LDP geführt wird.
Die Frequenz der einfallenden elektromagnetischen Strahlung muss
der mechanischen Resonanzfrequenz des Messwandlers LWDP entsprechen, um
die Pumpe LWDP zu aktivieren. Die Frequenz
der einfallenden elektromagnetischen Strahlung muss der Resonanzfrequenz
der elektrischen Elemente CH, LCH und HC entsprechen, um die Heizeinrichtung HC zu aktivieren.
-
Eine
PCR-Reaktion wird zum Beispiel eingeleitet, indem die Reagenzien
in der Kammer 19, 20 und 21 in die durch
die Pfeile angezeigten Richtungen durch die entsprechenden Kanäle 22, 23 und 24 zu
der Reaktionskammer 25 gepumpt werden, indem die Pumpe
LW1, LW2 und LW3 aktiviert wird. Danach wird eine Reihe
von zum Beispiel etwa zwanzig bis vierzig Wärmezyklen eingeleitet, und
während
jedem Zyklus ändert
sich die Temperatur der Reagenzien in der Reaktionskammer 25 zum
Beispiel von 55°C
auf 96°C
und zurück
auf 55°C.
Die Temperatur der Reaktionskammer wird durch die Leistung des einfallenden
elektromagnetischen Signals auf der Frequenz bestimmt, die der Resonanzfrequenz
der Schaltung entspricht, die sich aus dem Kondensator CCH und dem Induktor LCH in
Verbindung mit der Heizeinrichtung HC zusammensetzt.
Die Lambwellenvorrichung LWC der Reaktionskammer 25 fungiert
als Rührvorrichtung
oder Mischer, wie dies durch die Pfeile 26 dargestellt
ist, um die Reagenzien zu mischen und die Reaktion zu fördern.
-
Wenn
die Temperaturwechselbeanspruchung abgeschlossen ist, wird der Inhalt
der Reaktionskammer 25 durch die Lambwellenpumpe LWDP durch den Kanal 27 in die Richtung
des Pfeils zu der Detektionskammer 28 gepumpt, welche einen
Lambwellensensor LWD verwendet. Alternativ
kann die Detektionskammer 28 mit einem optischen Fenster
bzw. einem Sichtfenster versehen sein, und wobei Tests durch optische
Fluoreszenz- oder Absorptions-Spektroskopie ausgeführt werden
können.
-
Die
Abbildung aus 3 veranschaulicht eine Heiz-/Detektionsanordnung,
die in den mikrogefertigten Reaktor aus den Abbildungen der 1 und 2 integriert
werden kann. Wie dies in der Abbildung aus 3 dargestellt
ist, ist eine chemische Reaktionskammer, wie etwa eine PCR-Kammer
eines miniaturisierten, mikrogefertigten Instruments, das allgemein
mit der Bezugsziffer 30 bezeichnet ist, im Querschnitt
dargestellt, wobei die Kammer 31 in einem Gehäuse 32 ausgebildet
ist, das zum Beispiel aus Pyrex besteht, und wobei darin Siliziumeinsätze 33 und 34 vorgesehen
sind, mit einem Einlass 35 und einem Auslass 36.
Die Energie von zwei unterschiedlichen Energiequellen (Lichtquellen)
wird auf das Gehäuse 32 gerichtet,
wobei es sich bei einer Quelle 37 um eine Infrarotquelle
(IR-Quelle) und bei der zweiten Quelle 38 um eine Ultraviolettquelle
(UV-Quelle) handelt. Die IR-Quelle 17 führt die Hitze einheitlicher durch
die Masse der Lösung
in der Kammer 31 zu. Die UV-Quelle 18 induziert
Fluoreszenz der Reaktionsprodukte in dem sichtbaren (Vis) Spektrum,
die von einem sichtbaren (Vis) Detektor 39 detektiert werden
kann, der sich außerhalb
des Gehäuses 32 befindet,
das die Reaktionskammer begrenzt. Das Gehäuse 32 muss aus einem
für UV-Strahlung und/oder
das sichtbare Spektrum transparentem Material bestehen. Durch die
Integration eines integrierten Erregungs-(Erhitzungs-) und Detektionssystems direkt
in die Reaktionskammer, kann das Vorhandensein einer Problem in
der Reaktionskammer bestätigt
werden, und die dualen Reaktions- und
Detektionskammern 25 und 28 des mikrogefertigten
Reaktors aus 2 können konsolidiert werden, wodurch die
Fertigungskosten durch eine Reduzierung der Komponenten gesenkt
werden können.
-
Die
vorliegende Erfindung, ein Ausführungsbeispiel
welcher allgemein in den Abbildungen der 4 und 5 veranschaulicht
ist, umfasst einen mikrogefertigten Reaktor, der allgemein mit der
Bezugsziffer 40 bezeichnet ist, der eine Muffe auf Siliziumbasis
als eine chemische Reaktionskammer aufweist, die allgemein mit der
Bezugsziffer 41 bezeichnet ist, bestehend aus zwei verbundenen
Siliziumteilen, und wobei dotiertes Polysilizium zur Erhitzung und
Bulk-Silizium zum Konvektionskühlen
verwendet werden, wie dies nachstehend im Text näher beschrieben ist. Die Muffe 41 weist
einen Schlitz oder eine Öffnung 42 auf,
in den bzw. in die Reaktionsfluid, das mit der Bezugsziffer 43 bezeichnet
ist, über
eine hypodermische Nadel 44 in die Reaktionskammer eingeführt wird,
oder in den bzw. die eine sekundäre Rohrleitung 45,
die eine Reaktionsmischung 46 aufweist, eingeführt werden
kann. Die Rohrleitung wird zum Beispiel aus Kunststoff oder einem
anderen Material hergestellt, das in Bezug auf die Reaktionsmischung
inert ist, wodurch etwaige potenzielle Materialunverträglichkeitsprobleme
abgeschwächt
werden. Die Muffe ist ferner mit einer Öffnung 47 versehen, die
sich an einem optischen Fenster 48 befindet, das zum Beispiel
aus Siliziumnitrid, Siliziumdioxid oder Polymeren besteht. Die Siliziummuffenreaktionskammer 41 weist
dotiertes Silizium zum Erhitzen und Bulk-Silizium zum Konvektionskühlen auf
und kombiniert ein kritisches Verhältnis von Silizium und Siliziumnitrid
mit dem Volumen des zu erhitzenden Materials (z.B. Flüssigkeit),
um eine einheitliche Erwärmung
bzw. Erhitzung vorzusehen, bei gleichzeitig niedriger Leistungsaufnahme.
-
Die
Abbildung aus 6 zeigt eine vergrößerte Ansicht
einer Mikroreaktionskammer, ähnlich dem
Ausführungsbeispiel
aus 4, wobei jedoch zwei Fenster verwendet werden.
Die Reaktionskammer aus 6, die allgemein mit der Bezugsziffern 50 bezeichnet
ist, besteht aus zwei Silizium-Halbleiterscheiben
bzw. Wafern oder Substraten 51 und 52, die miteinander
verbunden sind, wie dies unter 53 dargestellt ist, und
mit einer Konfiguration, so dass darin ein Schlitz oder eine Öffnung 54 definiert
wird. Jeder der Wafer 51 und 52 weist eine Schicht
aus Siliziumnitrid 51' und 52' auf, die ein
Fenster definieren, die allgemein unter 55 und 56 entsprechend
abgebildet sind. Das Fenster 55 in dem Wafer 51 aus
Siliziumnitrid ist mit einer Heizeinrichtung 57 versehen, die
elektrische Zuleitungen 58 und Kontakte 59 Aufweist,
die sich entlang der Kanten der Heizeinrichtung 57 erstrecken,
um eine einheitliche Erhitzung vorzusehen. Das Fenster 56 in
dem Wafer 52 weist eine in der Abbildung aus 6 nicht
abgebildete Heizeinrichtung auf, die jedoch durch die Metallkontakte 60 und 61 gesichert
ist, wie dies entsprechend in den Abbildungen der 7 und 8 dargestellt ist.
Die Siliziumnitridschichten 51' und 52' sind sehr dünn (etwa 1 μm) und werden auf die Wafer 51 und 52 aus
Bulk-Silizium aufgedampft. Das Siliziumnitrid wird nur dann zu einem
Fenster gemäß der Darstellung
unter 55 und 56, wenn die Bulk-Siliziumwafer 51 und 52 zur
Gestaltung der Öffnung
oder des Schlitzes 54 weggeätzt werden. Die Heizeinrichtung 57 ist transparent
zum Beispiel in Bezug auf durch das Fenster 55 tretende
Energie.
-
Die
Abbildung aus 7 zeigt eine stark vergrößerte Ansicht
eines Ausführungsbeispiels
eines Abschnitts des Siliziumwafers 52 und des Fensters 56,
wie dies durch den Kreis 62 aus 6 dargestellt ist.
Wie dies aus der Abbildung aus 7 ersichtlich ist,
umfasst der Abschnitt des Siliziumwafers 52, der unter 63 dargestellt
ist, Bulk- oder einkristalliges Silizium und befindet sich in Kontakt
mit einer Niederbelastungs-Siliziumnitridmembran (100 bis 500 MPa) oder
dem Fenster 64 (52' in 6),
das sich wiederum in Kontakt mit einer dotierten Polysilizium-Heizeinrichtung 65 und
dem Metallkontakt 60 und 61 steht. Das Ausführungsbeispiel
aus 7 umfasst ein festes Fenster in der Version mit
isolierter Heizeinrichtung.
-
Die
Abbildung aus 8 zeigt eine stark vergrößerte Ansicht
eines weiteren Ausführungsbeispiels
eines Abschnitts des Siliziumwafers 52 und des Fensters 56,
wie dies durch den Kreis 62 dargestellt ist. Wie dies in
der Abbildung aus 8 ersichtlich ist, bestehen
die Abschnitte des Siliziumsubstrats 52, wie dies unter 66 dargestellt
ist, aus Bulk- oder Einkristall-Silizium. Wie in dem Ausführungsbeispiel
aus 7 befindet sich ein Niederbelastungs-Siliziumnitridelement
(100 bis 500 MPa) oder Fenster 69 (52' in 6)
in Kontakt mit dem Siliziumabschnitt 66, wobei sich eine
dotierte Polysilizium- Heizeinrichtung 70 in
Kontakt mit der Fenstermembran 69 befindet, und wobei Metallkontakte 71 an
der Heizeinrichtung 70 angebracht sind. Das Ausführungsbeispiel
aus 8 umfasst eine nicht-isolierte Heizeinrichtungsausführung. Die
Fenstergröße im Verhältnis zu
der Kammer kann verändert
werden, um eine thermische Einheitlichkeit bzw. Gleichmäßigkeit
und einen optischen Zugang in die Reaktionskammer zu gewährleisten.
-
Zum
Beispiel können
die Siliziumwafer oder Substrate 51 und 52 eine
Länge von
5 bis 50 mm, eine Breite von 2 bis 10 mm, eine Dicke von 0,1 bis 1,0
mm aufweisen, wobei der Schlitz 54 eine Querschnittsfläche von
5 bis 500 mm2 aufweisen kann. Der Schlitz 54,
der mit einer sechsseitigen Konfiguration dargestellt ist, kann
rund, länglich,
quadratisch, rechteckig sein oder eine andere Konfiguration aufweisen.
Die Fenster 55 und 56 können eine Länge von 0,1 bis 1 mm, eine
Breite von 0,1 bis 50 mm, eine Dicke von 0,1 bis 10 μm aufweisen
und zusätzlich
zu dem Siliziumnitrid können
sich aus Siliziumdioxid, Silizium oder Polymeren bestehen. Die dotierte
Polysilizium-Heizeinrichtung 65 aus 7 kann eine
Dicke zwischen 0,05 bis 5 μm
aufweisen, wobei die Heizeinrichtung 70 aus 8 eine
Dicke zwischen 0,05 bis 5 μm
aufweisen kann. Die Metallkontakte 60–61 und 61' aus den Abbildungen
der 6 und 7 können aus Gold oder Aluminium
bestehen, mit einer Dicke von 0,01 bis 5 μm, wobei der Metallkontakt 71 aus
der Abbildung eine Dicke zwischen 0,01 bis 5 μm aufweisen und aus Gold oder
Aluminium bestehen kann. Die Heizeinrichtung 57 in dem
Siliziumwafer oder Substrat 51 besteht aus dotiertem Polysilizium mit
einer Dicke zwischen 0,05 bis 5 μm,
wobei die elektrischen Zuleitungen und die Kontakte 58 und 59 aus
Gold oder Aluminium bestehen.
-
Der
Einsatz von Bulk-Silizium, Polysilizium und Siliziumnitrid ermöglicht eine
Flexibilität
im Design in Bezug auf die thermischen und optischen Eigenschaften
jeder Kammer. Dies ermöglicht
einzeln geregelte, thermisch isolierte Reaktionskammern in einem
kleinen Instrument (9) oder in einem großen Instrument
(10).
-
Die
Abbildung aus 9 zeigt ein Ausführungsbeispiel
eines miniaturisierten, thermischen Zyklen unterliegenden, batteriebetriebenen,
handgehaltenen, geregelten Instruments für PCR mit geringer Leistungsaufnahme,
das mikrogefertigte Reaktionskammern auf Siliziumbasis verwendet,
wie diese etwa in den Abbildungen der 4 und 6 dargestellt
sind, wobei deren Entwicklung die thermische Einheitlichkeit und
Temperaturpräzision
der Reaktionskammern, Temperaturanstiegsraten der Kammern und die
Bioverträglichkeit
der sich mit den Reagenzien in Kontakt befindenden Materialien berücksichtigt.
-
Wie
dies in der Abbildung aus 9 dargestellt
ist, umfasst das handgehaltene, batteriebetriebene Instrument mit
der Bezeichnung "PCR
Man", das allgemein
unter der Bezugsziffer 75 dargestellt ist, eine einschnappende,
den elektrischen Kontakt regelnde Halteeinrichtung bzw. ein entsprechendes Gehäuse 76,
das zum Beispiel die Abmessungen 3 × 5 Zoll aufweisen kann, mit
einer Bedienfeldplatte 77 mit verschiedenen Indikatoren,
einschließlich
einem "Status"-Fenster 78.
Die Halteeinrichtung 76 ist mit einem thermoelektrischen
Regelkreis, einer Heizeinrichungselektronik, einer Computerschnittstelle
und einem Stromversorungssteckverbinder versehen, wie dies nachstehend
im Text näher
beschrieben ist. Die Halteeinrichtung 76 ist mit Batterien
versehen, wie dies unter 79 dargestellt ist, wie etwa mit
vier 9-Volt-Batterien, und das obere Ende ist mit Schlitzen 80 zur
Einführung
der Reaktionskammern in der Halteeinrichtung versehen (abgebildet
sind drei Schlitze), und in welche Reaktionskammern 81, 82, 83 und 84 auf
Siliziumbasis mit integrierten Heizeinrichtungen (gemäß der Abbildung
aus 6) eingefügt
werden, wie dies durch den Pfeil 85 dargestellt ist. Die Reaktionskammern 81 bis 84 können im
konstruierten Zustand verschiedene Reagenzien oder Chemikalien aufweisen,
und sie können
selektiv über
Schlitze 80 in der Halteeinrichtung 80 oder dem
Regler 76 in das handgehaltene Instrument 75 eingeführt werden.
-
Das
Instrument kann dazu verwendet werden, schnell und wiederholt geregelte
Wärmezyklen für die Reaktionsmischung
vorzusehen. Die thermischen Leitfähigkeitseigenschaften des Siliziums
oder eines ähnlichen
Halbleitersubstrats unterstützen
die Beschleunigung der Wärmeanstiegs-
und -abfallszeiten und ermöglichen
einen Betrieb mit geringer Leistungsaufnahme. Während Silizium in Bezug auf
dessen thermische Eigenschaften, d.h. die hohe thermische Leitfähigkeit
einzigartig ist, würde
eine Kombination aus Silizium, Siliziumnitrid, Siliziumdioxid, Polymeren
und anderen Materialien eine Kombination aus thermischer Leitfähigkeit
und Isolierung vorsehen, die eine thermische Einheitlichkeit und
einen Betrieb mit geringer Leistungsaufnahme bereitstellen würde.
-
Das
spezielle beschriebene Ausführungsbeispiel,
wie etwa aus 6, eines mikrogefertigten Reaktors
kann als Wärmezyklusinstrument
zur Verwendung bei der PCR und anderen chemischen Reaktionen, biochemischen
Prozessen, mikrobiologischen Verfahren und Inkubatoren eingesetzt
werden. Wie dies nachstehend dargestellt ist, ist die erfindungsgemäße Reaktionskammer
aktuellen handelsüblichen Instrumenten überlegen,
die in thermisch gesteuerten chemischen Reaktionen eingesetzt werden.
-
Während der
experimentellen Verifizierung des Instruments aus 9 und
der Mikroreaktionskammern zur Verwendung darin, wie diese etwa in den
Abbildungen der 4 und 6 dargstellt
ist, wurden verschiedene Größen von
PCR-Reaktionskammerkonfigurationen
unter Verwendung von Siliziumverarbeitungsschritten des Typs für integrierte Schaltungen
(IS) hergestellt. Das allgemeine Fertigungsverfahren war wie folgt
gegeben: Runde Einkristall-Siliziumwafer
(SCS-Wafer) mit einem Durchmesser von drei zoll und einer Dicke
von 0,5 mm wurden wie folgt verarbeitet: Siliziumnitrid (SixNy) mit geringer
Beanspruchung (200 bis 300 MPa) wurde mit niedrigem Druck chemisch
aufgedampft (LPCVD) auf den gesamten Wafer (mit einer Dicke von
1,0 bis 2,0 μm).
Photolithographische Muster für
die Reaktionskammer und folgende Verfahrensschritte wurden in der
folgenden Reihenfolge ausgeführt:
1) das Siliziumnitrid wurde über
die Fläche
der Reaktionskammer reaktiv Ionen geätzt (RIE); 2) Das SCS wurde
auf die Rückseite
des Siliziumnitrids geätzt,
welche das Kammervolumen definiert; 3) der Wafer wurde mit Muster
versehen und das Siliziumnitrid chemisch an allen Stellen weggeätzt, mit
Ausnahme über
der Nitridmembran oder über
der gesamten Oberfläche
belassen, abhängig
von dem Design der Reaktionskammer; 4) die verbleibende Siliziumnitridmembran (die
der Kammer gegenüberliegende
Seite) wurde LPCVD abgeschieden mit polykristallinem Silizium (Polysilizium)
auf eine Dicke von 3000 Å);
5) das Polysilizium wurde danach bei hoher Temperatur mit Bor auf
ein Widerstandsvermögen
von 50 bis 200 Ohm je Quadrat dotiert; und 6) Dünnfilmmetallkontakte aus Aluminium
oder Gold wurden abgeschieden, wobei die Heizeinrichtungsgeometrie
definiert wurde.
-
Jeder
Wafer weist potenziell viele Reaktionskammern auf, abhängig von
der gewünschten
Geometrie und dem gewünschten
Volumen. Die geätzte Vertiefung
in jedem Wafer bildet eine Hälfte
einer dualen Heizeinrichtungs-Reaktionskammer. Die verarbeiteten
Wafer werden nacheinander miteinander verbunden, so dass eine eingeschlossene
Kammer mit Heizeinrichtungen auf beiden Seien gebildet wird.
-
Die
Reaktionskammern können
miteinander verbunden werden durch das Abscheiden eines dünnen Films
eines bei niedriger Temperatur aushärtenden Polyimids direkt zwischen
den beiden Wafern oder durch andere Verbindungs- bzw. Bonding-Techniken
wie etwa eutektische Metallverbindung. Eine computergesteuerte Siliziumsäge mit hoher
Präzision
wurde für
jedes Design verwendet, um jede duale Heizeinrichtungskammer auszuschneiden.
Die Kammern wurden danach wiederholt mit vollentsalztem Wasser gespült und vor
der Behandlung mit Silan getrocknet.
-
Die
Reaktionskammern wurden in eine einschnappende, den elektrischen
Kontakt regelnde Halteeinrichtung eingeführt, die Bestandteil der Rückwand der
Elektronikkomponenten aus Plexiglas gewesen ist, welche die Steuereinheit
bilden. Die Steuerelektronik kann entweder analog oder digital sein
und Verfahren wie etwa die Impulsbreitenmodulation als Regelungsmechanismus
verwenden. Die Rückwand
maß 3
mal 5 Zoll und bestand aus einem thermoelektrischen Temperaturregelkreis,
einer Heizeinrichtungselektronik, einer Computerschnittstelle und
einem Stromversorgungssteckverbinder. Die Schaltung war für eine Funktionsfähigkeit
zwischen 8 und 32 Volt ausgelegt. Eine thermische Kalibrierung wurde
durch eine Korrelation der Temperatur des Fluids mit der des das
Silizium messenden Thermoelements vom Typ K erreicht. Nach der Kalibrierung eignete
sich das Instrument für
einen automatisierten, geregelten Wärmezyklusbetrieb ohne direkte
Messung des Reaktionsfluids. Die Ausgabe der Wärmezykluseinrichtung geht an
einen Apple Centris 650 Computer, der den Wärmezyklus in Echtzeit anzeigt, in
Verbindung mit einer Speicherung der akkumulierten Profile. Vier
9-Volt-Batterien waren in der Lage, das Instrument über 2,5
Stunden lang zu betreiben.
-
Typische
PCRs wurden als vergrößerte Master-Mischungen
vorbereitet, um eine Einheitlichkeit unter allen Proben mit Wärmewechselbeanspruchung
unter verschiedenen Bedingungen zu gewährleisten. Die Mengen der Reagenzien
basierten auf den idealen Werten für 50 μl Reaktionen. Die Master-Mischungen
enthielten allgemein folgendes: 50 ml KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3,
1,5–3,0
mM MgCl2, 200 μM jedes Deoxynukleotids oder
800 μM dNTP insgesamt,
0,5 μM von
jeweils zwei Oligonukleotid-Primern,
25 Einheiten/ml AmpliTaq® DNA Polymerase und Ziel-Template in einer
spezifizierten Anzahl von Kopien je 50 μl Reaktion. Das Template für einige β-Globin PCRs
wurde einem einzelnen DNA-Strang eines M13-Bakteriophag-Klons eines
Teils des menschlichen β-Globin-Gens
hinzugegeben. Bei dem CF-Template
handelte es sich um Doppelstrang-DNA des menschlichen Genoms, abgeleitet aus
in Kultur angelegten Zellenreihen HL60, GM07460 oder GM08345. Jede
Reaktionsmischung wurde zu gleichen Teilen aus dem Master-Mix aufgeteilt
und in dem Instrument gemäß der vorliegenden Erfindung
und in einem Perkin-Elmer GeneAmp® 9600
Thermal Cycler Temperaturwechseln unterzogen. Die den Temperaturwechseln
unterzogenen Reaktionen aus beiden Temperaturwechselvorrichtungen
wurden unter Verwendung eines Tris-Borat-Puffers mit 3% NuSeive,
1% Seakem-Agarose (FMC Corp.) aufgeteilt. Die Gele wurden mit Ethidiumbromid
kontrastiert und unter Bestrahlung mit 302 nm UV-Licht fotografiert.
-
Obwohl
die Reaktionskammer ursprünglich zur
einmaligen Verwendung und Entsorgung vorgesehen war, ermöglichten
die solide Beschaffenheit und die stabilen Eigenschaften eine wiederholte
Verwendung der Reaktionskammern.
-
Das
Temperaturwechselinstrument (auf MEMS Basis) gemäß der vorliegenden Erfindung wurde
mit einer Vielzahl von PCR-Systemen
getestet, einschließlich
viralen, bakteriellen und Templates des menschlichen Genoms. Ferner
wurden verschiedene Änderungen
sowohl in Bezug auf das Design der Reaktionskammer als auch die
Steuer- bzw. Regelungsinstrumente implementiert und bewertet. Eine
Echtzeitausgabe-Anzeigeeinheit der Steuereinheit eines Temperaturzyklus
der mikrogefertigten Temperaturwechselvorrichtung wurde vorbereitet, und
es hat sich gezeigt, dass bei einer Eingabe von 15 Volt (durchschnittlich
1,2 Watt) Heizraten von über 5°C/Sek. erreicht
werden. Die Abkühlung
erfolgt etwas langsamer (2,5°C/Sek.),
und zwar großteils
aufgrund der Tatsache, dass die Reaktionskammer in einer Instrumententafel
aus Plexiglas gehalten wird. Auf den Zieltemperaturen wird eine
Präzision
der Temperatur von +/– 0,5°C aufrechterhalten.
Es wurden auch höhere
Heiz- und Kühlraten
erreicht.
-
Wir
haben Experimente ausgeführt,
die die quantitative Beschaffenheit des PCR-Verfahrens in der Abbildung
aus 9 sowie in handelsüblichen Instrumenten zeigen.
Diese Experimente umfassten den Entzug von 5 μL Aliquoten aus 105 Ausgangskopien, β-Globin-PCR
aus beiden Instrumenten bei 23, 25, 27, 29 und 31 Zyklen. Diese
Aliquote wurden folglich auf einem Agarose-Elektrophoresegel ausgeführt. Die
Instrumente beider Instrumente sind praktisch identisch. Die gleiche
quantitative Gelelektrophoreseserie ergibt sich aus der Verstärkung des 268-bp-Ziels
von β-Globin
direkt aus der DNA des menschlichen Genoms (HL60), sofern durchgeführt.
-
Multiplex-PCR
gilt als eine der aktuellsten und analytisch leistungsfähigsten
DNA-Amplifikationstechniken. Sie erfordert eine präzise und
einheitliche Temperaturregelung in der Reaktionskammer. Wir haben
dies mit dem Instrument gemäß der vorliegenden
Erfindung erreicht.
-
Die
Post-PCR-Detektion bestimmter Mutationen, die zum Beispiel der Erkrankung
der zystischen Fibrose (CF) zugeordnet sind, kann mit einfachen
Teststreifen auf Nylonbasis unter Verwendung der Reverse Dot Blot-Technologie
identifiziert werden kann. Der Teststreifen weist bestimmte, immobilisierte
DNA-Sonden auf, welche die relevante Mutationssequenz aufweisen.
Die Multiplex-PCR-Amplifikationsprodukte werden gemeinsam mit der
Probe in einen einfachen Reagenztrog gegeben. Wenn eine Bindung
erfolgt und die DNA nach einem Spülungsschritt erhalten wird,
wechselt der DNA-Biotin-Streptavidin-Enzym-Komplex
nach der Behandlung mit dem Substrat seine Farbe. Die kommerziellen
und gemäß der Abbildung
aus 9 instrumental amplifizierten Ergebnisse der PCR
waren gefolgt von einer Reverse Dot Plot-Analyse, vorbereitet für eine CF.
-
Aus
den Ergebnissen der vorstehend aufgeführten Experimente und der vorstehenden
Ergebnisse in Bezug auf die vorsehend genannten gleichzeitig anhängigen Anmeldungen
mit einseitigen Heizeinrichtungen können Reaktionskammern auf Siliziumbasis
verschiedener Größen und
Konfigurationen chemische Reaktionen wie etwa eine PCR mit geringerer
Leistungsaufnahme ausführen.
-
Die
Signifikanz der oben genannten experimentellen Ergebnisse ist es,
dass zum ersten Mal in einem Instrument gemäß der Abbildung aus 9 zum
ersten Mal eine batteriebetriebene, handgehaltene PCR-Amplifikation
und eine einfache, auf Reagenzien basierte Zieldetektion komplexer
Biologika und Erkrankungen ausgeführt werden können.
-
Die
schnellen Temperaturwechsel und die thermische Einheitlichkeit,
die jetzt in einer PCR-kompatiblen Mikroreaktionskammer auf Siliziumbasis
möglich
sind, können
Einblicke in die Hybridisierung und die Enzymkinetik geben. Zum
Beispiel ist die Bedeutung der Temperaturregelung in dem PCP-Verfahren
von höchster
Bedeutung, im Besonderen dann, wenn komplexe Systeme verstärkt werden
sollen (z.B. die DNA des menschlichen Genoms, Multiplex-Amplifikationen).
Die präzise
Temperaturregelung und die thermische Einheitlichkeit müssen ausgeglichen
sein. Für
eine echte Miniaturisierung des Instruments oder die Nutzung mikrogefertigter Reaktionskammern
zur Gestaltung eines Instruments mit hohem Durchsatz gemäß den Abbildungen der 10A, 10B und 11 müssen die
Regelungs- bzw.
Steuerungselemente Einheit für
Einheit integriert werden. Die thermischen Eigenschaften der verschiedenen
verwendeten Materialien müssen
ebenfalls ausgeglichen werden, um eine effiziente Regelung mit thermischer
Zuverlässigkeit
zu kombinieren. Materialien auf Siliziumbasis sehen die erforderlichen
thermischen Eigenschaften vor, die Möglichkeit zur Integration von
Heizeinrichtungen und einer Regelung, und deren Fertigung nutzt
den Vorteil der in hohem Maße
parallelen, automatisierten und in Chargen zusammengefassten Verarbeitung.
-
Die
Abbildungen der 10A–10B und 11 veranschaulichen
einen Systemansatz, der eine Kombination aus einem Wärmezyklusinstrument
mit hohem Durchsatz und hoher Effizienz mit einem Probenhandhabungs-
und Elektrophoresemodul vorsieht. Das Elektrophoresemodul kann auch
in Glas oder Silizium mikrobearbeitet werden. Das Instrument kann
hybrid sein, d.h. eine Reaktionskammer auf Siliziumbasis und ein
Miniglas-Elektrophoresemodul,
das beide Substrate oder Elemente nutzt, wie dies in dem Ausführungsbeispiel
aus 5 der Fall ist. Der Vorteil einer Detektion der
DNA-Produktion in Echtzeit ist es, dass die Bedienungsperson während der
Reaktion Kenntnis über
die PCR-Effizienz hat und nicht darauf warten muss, die Ergebnisse
auf einem Gel zu sehen. Dies unterstützt die DNA-Klassifizierungsproduktivität, indem
keine Zeit verschwendet wird für
den Verlauf von Elektrophoresegels auf nicht verstärkten Proben.
-
Die
Abbildungen der 10A und 10B veranschaulichen
ein Wärmezyklusinstrument,
das allgemein mit der Bezugsziffer 90 bezeichnet ist, mit einem
Gehäuse 91 mit
einer Frontplatte 92 mit verschiedenen darauf vorgesehenen
Indikatoren bzw. Anzeigen, einschließlich eines "Status"-Fensters 93, wobei
die Frontplatte bzw. das Bedienfeld dem Bedienfeld des handgehaltenen
Instruments aus 9 ähnlich ist. Das Gehäuse weist
eine Oberseite 94 mit Scharnier auf, unter der sich eine
Anordnung 95 (siehe 10B)
einzeln geregelter Mikroreaktionskammern 96 auf Siliziumbasis
befindet, die zum Beispiel dem in den Abbildungen der 4 und 6 veranschaulichten
Typ entsprechen. Das Instrument 90 ist für 384 Mikroreaktionskammern 95 ausgelegt,
obwohl die Anordnung 95 gemäß der Abbildung aus 10B zur Vereinfachung der Darstellung nur 100 Kammern
aufweist.
-
Die
Abbildung aus 11 zeigt eine schematische Darstellung
einer DNA-Anwendung mit hohem Durchsatz, der Probenbehandlung und
eines Elektrosystems unter Verwendung des Instruments aus den Abbildungen
der 10A–10B,
wobei die entsprechenden Komponenten mit entsprechenden Bezugszeichen
bezeichnet sind. Eine Anordnung 95' von 384 einzeln geregelten PCR-Reaktionskammern 96' (von denen
nur fünf
abgebildet sind) ist funktionsfähig
mit einer automatisierten Probenein- und Ausgabeeinheit verbunden,
die allgemein mit der Bezugsziffer 97 bezeichnet ist, unter
Verwendung von zwei Mikroinjektoren, die allgemein mit 98 und 99 bezeichnet
sind. Die Probenein- und
Ausgabefunktion zwischen der Mikroinjektoranordnung 98 der
Einheit 97 und der Anordnung 95 ist durch den
Doppelpfeil 100 dargestellt, während die Funktion zwischen den
Anordnungen 98 und 99 der Mikroinjektoren durch
den Doppelpfeil 101 angezeigt wird. Die Mikroinjektoranordnung 99 ist
funktionsfähig
mit einer Anordnung 102 einzelner Mikroelektrophoresekanäle 103 verbunden.
Dieses Injektor-Eingabe-Ausgabe-System lädt Reagenzienproben aus den
Reaktionskammern 96 mit Vakuum oder elektrokinetischer Leistung;
die automatisch oder unter Robotereinsatz zu den Elektrophoresekanälen 103 befördert wird; und
wobei die Reagenzien über
Druck oder elektrokinetische Injektion mit umgekehrtem Feld in die
Kanäle
für eine
elektrophoretische Abscheidung entladen werden. Das Elektrophoresemodul
kann ebenfalls mikrobearbeitet werden. Silizium eignet sich gut
für Reaktionskammern,
Glas ist gut geeignet für
Elektrophorese.
-
Die
in einem Glassubstrat ausgebildeten Elektrophoresekanäle 103 sind
jeweils direkt mit einer Siliziumreaktionskammer der in der Abbildung aus 4 dargestellten
Art verbunden, so dass eine Anordnung 95 von Reaktionskammern 96' erzeugt wird,
die direkt mit der Anordnung 102 der Elektrophoresekanäle 103 verbunden
sind, wie dies in der Abbildung aus 5 dargestellt
ist.
-
Entfernbare/dauerhafte
Auskleidungen/Einsätze
für die
Reaktionskammern aus einem bekannter Maßen mit den entsprechenden
Reaktionen kompatiblem Material, wie dies etwa in der Abbildung
aus 12 dargestellt ist, reduzieren in bestimmen Anwendungen
die Kosten insgesamt, da diese Auskleidungen/Einsätze entsorgt
werden können.
Ebenfalls berücksichtigt
werden Derivatisierungsmittel für
die Oberflächen
der Reaktionskammer auf Siliziumbasis, um die kovalente und/oder
sonstige Bindung mit den Auskleidungen zu verbessern. Beispiele
dafür sind organische/reaktive
Silane, Polyimide, Teflonarten, Polyethylen und sonstige Polymere.
-
Die
Abbildung aus 12 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel
eines Einsatzes/einer Auskleidung, allgemein durch die Bezugsziffer 105 dargestellt,
für eine
Reaktionskammer mit einem darin vorgesehenen optischen Fenster 106.
Der Einsatz/die Auskleidung 105 weist ein sechsseitiges
Gehäuse 107 und
eine Oberseite/Abdeckung 108 auf. Das sechsseitige Gehäuse 107 ist
zum Beispiel so konfiguriert, dass es in die Öffnung 54 der Reaktionskammer 50 des
Ausführungsbeispiels
aus 6 eingeführt
werden kann, so dass das Fenster 106 mit einem der Fenster 55 oder 56 aus 6 ausgerichtet ist.
Das Gehäuse 107 kann
aus Kunststoff oder einem anderen vorstehend ausgeführten kompatiblen Material
gestaltet sein. Das Fenster 106 des Einsatzes/der Auskleidung 105 weist
einen Teststreifen 109 auf, wie dies nachstehend in Bezug
auf die Abbildung aus 14 beschrieben wird.
-
Die
Abbildung aus 13 veranschaulicht die externe
Befüllung
des Einsatzes/der Auskleidung 105 der Reaktionskammer aus 12 über eine
externe interfluide Verbindung, wie dies allgemein unter 110 dargestellt
ist.
-
Beispiele
für fluide
Verbindungen sind: Spritzennadeln, Pipettenspitzen und Quarzglaskapillare oder
Glas- oder Polymerschläuche
bzw. -rohrleitungen.
-
Die
Oberflächenimmobilisierung
der Fenster (oder Teststreifen) mit Sonden für die optische oder sonstige
Detektion (andere mikrobasierte Detektionen) der Produktherstellung
und Spezifikation kann gemäß der Abbildung
aus 14 vorgesehen werden, die eine vergrößerte Ansicht
des Teststreifens 109 aus 12 darstellt.
Ein derartiger Teststreifen kann in den Fenstern der Reaktionskammern
aus den Abbildungen der 4 oder 6 enthalten sein.
Immobilisierte Reagenzien/Sonden bzw. Proben für die Detektion spezifischer
Produkte direkt an dem Fenster wie etwa 106 aus 12 oder
in dem Reaktionsfluid in dem Einsatz/der Auskleidung 105 der
Auskleidung aus 12 können optisch in dem handgehaltenen
Instrument PCR Man aus 9 unter Verwendung des Teststreifens 109 detektiert
werden. Die tatsächliche
innere Oberfläche
des Fensters kann als eine Immobilisierungsoberfläche für spezielle
Ziel- oder Produktdetektionssonden verwendet werden, oder das Fenster
kann zur Ansicht der Immobilisierungs-/Detektionsoberfläche in der
Kammer verwendet werden.
-
Die
Abbildungen der 15 und 16 veranschaulichen
schematisch zwei Einrichtungen für die
optische Detektion. Die Einrichtung aus 15 ist
eine Laser-/CCD-Version, während
die Einrichtung aus 16 einen Niederleistungsbetrieb
zur Implementierung in dem PCR Man (handgehaltenes Instrument) aus 9 ermöglicht.
-
Wie
dies in der Abbildung aus 15 dargestellt
ist, weist diese optische Detektionsanordnung für eine Reaktionskammer 120 mit
einem Fenster 121 und einer Steuerelektronik 122 einen optischen Filter 123 auf,
wie etwa einen Interferenzfilter oder einen Bandpassfilter zum Weiterleiten
der relevanten Detektionswellenlänge,
eine CCD 124, ein digitalisiertes Bild, das allgemein unter
der Bezugsziffer 125 dargestellt ist, eine Fokussierungsoptik 126,
einen Reflektor/Splitter 127 und einen Argon-Ionenlaser 128.
Der Betrieb ist wie folgt gegeben: Der Laser erregt den fluoreszierenden
Indikatorfarbstoff, der der Produktdetektion zugeordnet ist. Das
fluoreszierende Signal wird durch die CCD 124 überwacht.
Die Absorptionsspektroskopie kann ebenso verwendet werden.
-
Die
Abbildung aus 16 zeigt ein miniaturisiertes
optisches Detektorsystem für
die Reaktionskammer 120' mit
einem Fenster 121' und
einer Steuerelektronik 122',
welche aus zwei Filtern 130 und 131 besteht, mit
einem Festkörperdetektor
bzw. einem monolithischen Detektor 132 und eine blauen LED 133.
Die Filter 130 und 131 entsprechen entweder einer
Bandpass- oder Langpassversion für
die Auswahl der Emission (d.h. 600 nm Langpass) und Bandpass für die Auswahl
der relevanten Erregungswellenlänge
wie etwa 488 nm +/– 10
n. Der Erregungsbandpass kann zum Beispiel zur Auswahl aus der kennzeichnenden
breiten Emission einer LED verwendet werden. Der Betrieb des Detektionssystems
aus 16 ist wie folgt gegeben: Die LED wird auf 488
+/– 10
nm gefiltert, als Erregungsquelle (oder Absorption) für den Fluoreszenz
anzeigenden Farbstoff. Der Festkörperdetektor
wird ebenfalls gefiltert, um nur die Wellenlängen der Detektion (> 600 nm) zu empfangen
oder als Absorptionsdetektor.
-
Künstliche
Intelligenz ist eine Möglichkeit
zur Erzeugung von DNA und um zu bestimmen, wie viele Zyklen noch
ausstehen, wenn die Erzeugung abgeschlossen ist, ob sie funktioniert
hat, welche Parameter angepasst werden müssen, um die Produktion zu verbessern,
etc. Unter Verwendung eines Echtzeit-Detektionssystems, wie dies in der Abbildung aus 17 schematisch
dargestellt ist, kann ein Rückkopplungssystem
mit künstlicher
Intelligenz unter Verwendung einer integrierten Detektierung bereitgestellt
werden. Das System aus 17 umfasst eine Reaktionskammer 135 mit
einem Fenster 136, einen Detektor 137 für die in
Situ Detektierung einer DNA-Produktion,
eine Instrumentenregelung 138 für die Reaktionskammer 135 und
ein Datenauslesesystem 139, das Daten von dem Detektor 137 empfängt, wie
dies durch den Pfeil 140 angezeigt ist, und Steuerdaten
an die Steuereinheit 138 vorsieht, wie dies durch den Pfeil 141 dargestellt
ist. Das Datenauslesesystem 139 liefert Information, wie
etwa wie viel DNA hergestellt wird, die Ausgangskopienanzahl, dass
die Reaktion abgeschlossen ist, etc. Durch Quantifizierung der DNA-Produktion über das
optische Überwachungssystem,
das allgemein bekannt ist, kann das System seine Zyklus- bzw. Durchlaufzeit
und die Zyklusanzahl anpassen, um die erforderliche Mindestanzahl
von Zyklen für
die Detektion zu erzeugen, wodurch das Verfahren beschleunigt wird. Durch
das Bestimmen der erforderlichen Anzahl von Zyklen zum Detektieren
eines bestimmten fluoreszierenden Signals oder einer Produktkonzentration wäre das System
ferner in der Lage, alles zu berechnen, die Ausgangskopienanzahl
oder die Konzentration der unbekannten Ausgangsprobe. Dies würde automatisierte
Konzentrationsberechnungen ermöglichen.
Quantitative Echtzeitinformationen können es ermöglichen, dass das System die
Reaktionsparameter anpasst, wie etwa die Zieltemperaturen, die Haltezeiten
und die Anstiegsraten.
-
Eine
mikrogefertigte Elektrochemilumineszenzzelle für die Detektion von amplifizierter
DNA ist nachstehend im Text in Bezug auf die Abbildungen der 18 bis 31 beschrieben, und
wobei darin das Design, die Fertigung und das Testen ausgeführt sind.
Die Mikrozelle ist als Detektionseinheit in einem PCR-Mikroinstrument
gestaltet, wie dies vorstehend beschrieben und in der Abbildung
aus 9 dargestellt ist. Die Zelle ist eine vertikale
Einheit aus mikrobearbeitetem Silizium und Glas und weist Dünnfilmelektroden
auf, wie dies in den Abbildungen der Figuren dargestellt ist.
-
Die
Detektion von DNA durch Elektrochemilumineszenz beginnt mit der
DNA-Amplifikation durch PCR, um die Konzentration auf detektierbare Werte
zu erhöhen.
Danach erfolgt eine Etikettierung mit Tris(2,2'Bipyridyl)Ruthenium(II)(TBR). Oxidiertes TBR
luminesziert bzw. leuchtet (Orange) bei Reduktion. Die Oxidation
erfolgt elektrochemisch an einer Elektrodenoberfläche, wobei
die Lichtemission als Elektrochemilumineszenz (ECL) bezeichnet wird. TBR
erfordert ein verhältnismäßig niedriges
Oxidationspotenzial (wenige Volt) und weist eine hohe ECL-Effizienz
im sichtbaren Bereich auf (620 nm). Dies macht es für Mikrosensoranwendungen
attraktiv, da sichtbare Emissionen leicht mit Siliziumfotodioden
detektierbar sind, die in eine mikrobearbeitete Siliziumzelle integriert
werden können.
Die Reduktion kann elektrochemisch oder chemisch erfolgen; in beiden
Fällen
wird Licht emittiert. Zum Beispiel überträgt oxidiertes Tripropylamin
(TPA) leicht ein Elektron in oxdidiertes TBR, woraufhin das TBR
eine Chemilumineszenz aufweist. Da beide Oxidationen an der gleichen
Elektrode auftreten, können
verhältnismäßig große Konzentrationen
beider Spezies dicht aneinander erzeugt werden, was zu einer höheren Lichtintensität für eine bestimmte
TBR-Konzentration führt,
als wenn nur TBR alleine in der Lösung vorhanden ist. Die Reaktionen
der elektrochemischen Oxidation und der chemischen Reduzierung für TBR, die
an der Anode erfolgen, sind in der Abbildung aus 18 schematisch
dargestellt. Die elektrochemische Reduzierung von TBR erfolgt ebenfalls an
der Kathode. Zur Oxidation nur der mit TBR etikettierten DNA und
nicht des freien TBR ist eine Separierung dieser beiden erforderlich.
Eine Möglichkeit dies
zu erreichen erfolgt unter Verwendung einer hoch spezifischen Bindung
von Immunoproteinen (Antikörper-Antigen).
-
Ein
Beispiel ist in der Abbildung aus 19 dargestellt,
wobei ein Biotin-Primer an dem 5' Ende eines
Strangs von Ziel-DNA
erzeugt wird, und wobei das TBR an dem 5' Ende des komplementären Strangs etikettiert ist.
Während
dem PCR-Verfahren werden
DNA-Doppelstränge
mit Biotin und an einem der Enden etikettiertem TBR erzeugt. Die
mit Biotin markierte bzw. etikettierte DNA kann danach in eine elektrochemische
Zelle mit einer Anode eingeführt werden,
deren Oberfläche
mit Avidin überzogen
ist, dem Antikörper
für Biotin.
Eine selektive Bindung erfolgt, woraufhin die Lösung in der Zelle gespült wird, um
etwaiges "freies" TBR zu entziehen.
Jetzt kann das TBR, das an die DNA gebunden ist, die wiederum über die
Antikörper-Antigen-Bindung
an der Anode angebracht ist, gemeinsam mit zugesetztem PA oxidiert
werden, und die folgende Lumineszenzintensität ist von der Menge der vorhandenen
DNA abhängig.
-
Die
ECL-Mikrozelle, die nachstehend in Bezug auf die Abbildungen der 21 bis 31 näher beschrieben
ist, ist eine mehrlagige Einheit aus mikrobearbeitetem Silizium
und Glas. Zellen mit einer Lösungskapazität zwischen
35 μL und
85 μL wurden in
Silizium gestaltet und hergestellt. Ein durch einen E-Strahl abgeschiedener
Dünnfilm
aus Gold bildet die Zellenkathode. Die Anode ist ebenfalls ein Dünnfilm.
Es wurden Experimente sowohl mit Indiumzinnoxid (ITO) als auch mit Platin
ausgeführt.
ITO ist transparent für
sichtbares Licht, so dass es bei einer Abscheidung auf Glas die
obere Schicht der Einheit bilden kann, durch welche das emittierte
Licht von einem Fotodetektor aufgenommen werden kann (siehe 21).
Die Einheit weist ferner mikrobearbeitete Fluidfüllanschlüsse auf (siehe 22).
Die Schichten wurden unter Verwendung eines bei niedriger Temperatur
härtenden
Polyimids wie etwa Epotek 400 montiert und verbunden (siehe 29–30).
-
ECL-Experimene
wurden in der Mikrozelle mit freiem TBR, d.h. keiner DNA ausgeführt. Die
Zellen wurden mit einer TPA + TBR Lösung gefüllt, und eine Fotoelektronenvervielfacherröhre (PMT)
wurde dicht an der oberen Glasschicht der Zelle platziert, um die
Emission zu detektieren. Die durch die Reaktion von oxidiertem TPA
und TBR erzeugte Chemilumineszenz ist von der Konzentration beider
Chemikalien abhängig.
In diesen Experimenten wurde die Konzentration von TPA konstant
gehalten (50 mM) und TBR wurde verändert. Die Lösungen wurden
wie folgt vorbereitet: 1 Gramm TBR-Hexahydratchlorid wurde in 50
mM TPA aufgelöst,
um 5 mM TBR herzustellen, das danach mit zusätzlichen 50 mM TPA verdünnt wurde,
um eine Reihe von Testlösungen
zu erzeugen, deren TBR-Konzentrationen zwischen 0,1 nM und 5 mM
liegen. Ein Potentiostat von EG&G, Modell
PARC 273, wurde zur Erzeugung von Voltammogrammen der TBR + TPA
Lösung
verwendet, beide in der Mikrozelle mit ITO und Dünnfilm-Goldelektroden und in
einer herkömmlicheren
elektrochemischen Zelle mit Platindrahtelektroden. Aus dem Voltammogramm
wurde das Oxidationspotenzial bestimmt, das dort gegeben ist, wo
ECL auftritt, und wobei dieses dann als eine Gleichstromvorspannung zwischen
der Dünnfilmkathode
und -anode angelegt wurde. Das emittierte Licht wurde mit einem
Hamamatsu MT, Modell R928 mit einer Vorspannung von 600 Volt gemessen.
Die Abbildung aus 20 zeigt das Verhältnis zwischen
der gemessenen Lichtintensität
und der Elektrodenspannung für
eine TBR-Konzentration von/mM, mit einer Darstellung der Zellenspannung
und der ECL-Intensität
im Vergleich zur Zeit. Die Spannung wird erhöht und reduziert, wie dies
durch die strichpunktierte Linie dargestellt ist. In beide Richtungen
verläuft
die Spannung durch das Oxidationspotenzial von TBR, wo die Intensität von ECL
maximal ist. In bislang durchgeführten
Tests betrug die niedrigste gemessene Konzentration von TBR unter
Verwendung der Mikrozelle mit einem ITΟ-Film als Anodenmaterial 1 μM. In Verbindung
mit einer Platinanode betrugen die gemessenen TBP-Konzentrationen
gerade einmal 1 nM. Der verhältnismäßig hohe
Widerstand des ITΟ-Films
beschränkt
scheinbar den Oxidationsstrom für
TPA und reduziert somit die Empfindlichkeit. Es konnte bestimmt
werden, dass die Empfindlichkeit durch das Abscheiden eines Dünnfilms
eines Materials verbessert werden kann, wie etwa von Aluminium auf
den ITO-Film, wie dies nachstehend in Bezug auf die Abbildung aus 31 beschrieben
ist. Ferner werden Versuche unternommen, die Siliziumfotodiode in
die Mikrozelle zu integrieren anstatt sie von dieser getrennt vorzusehen,
wie dies in dem Ausführungsbeispiel
aus 21 dargestellt ist.
-
Die
Abbildung aus 21 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel
einer mikrobearbeiteten ECL-Zelle mit einer Dünnfilmanode, die unter 140 dargestellt
ist, und mit einer Silizium(Si)-Fotodiode 141, die angrenzend
an die ECL-Zelle 140 positioniert
ist. Die ECL-Zelle 140 ist in der Abbildung aus 22 im
vergrößerten Querschnitt
dargestellt. Die Zelle 140 umfasst ein Paar von Siliziumelementen 142 und 143,
zwischen denen eine Elektrode 144 positioniert ist, die
aus Gold (Au), Platin (Pt) oder Silber (Ag) gestaltet sein kann,
eine ITΟ-Schicht 145 und eine
Glasschicht oder ein Dia 146. Das Siliziumelement 142 weist eine
Reaktionskammer 147 auf, und das Element 143 weist
ein Paar von Füllanschlüssen 148 auf
(siehe 22), über welche ein Analyt, wie dies
durch die Legende angezeigt ist, in die Kammer 147 geführt und
aus dieser entzogen wird, und zwar über Rohr- bzw. Schlauchleitungen
oder Leitungen 149 und 150, wie dies durch die
Pfeile 151 und 152 angezeigt wird. Wie dies in
der Abbildung aus 22 dargestellt ist, ist ein
zentraler Abschnitt 153 des Siliziumelements 143 zwischen
den Füllabschnitten 148 angeordnet,
wobei in Verbindung mit der ITO-Schicht 145 und dem Glasdia 146 ein
Fenster definiert wird, über
welches Reaktionen in der Kammer 147 detektiert werden
können,
wie dies durch die Photonen 154 angezeigt wird, die dort
hindurch au die Fotodiode 141 verlaufen. Elektrische Zuleitungen 155 und 156 sind
von einer Stromversorgung entsprechend mit der Elektrode 144 und
der ITO-Schicht 145 verbunden, während die Fotodiode 141 über Zuleitungen 157 und 158 elektrisch
mit einer Stromversorgung verbunden ist.
-
Die
Abbildungen der 23 bis 30 veranschaulichen
die Erzeugung eines Ausführungsbeispiels
einer ECL-Zelle ähnlich
dem Ausführungsbeispiel
aus den Abbildungen der 21 und 22. Das
Fertigungsverfahren wird wie folgt ausgeführt:
- 1.
Ein Block 160 Silizium wird überzogen, so dass eine Schicht 161 Siliziumnitrid
(siehe 23) gebildet wird.
- 2. Eine Schicht 162 Photoresist wird auf die Schicht 161 abgeschieden
(siehe 24).
- 3. Die Schicht 162 wird mit einem Muster versehen und
es wird ein fotolithografisches Verfahren zur Gestaltung einer Öffnung 163 darin
ausgeführt
(siehe 25).
- 4. Der Abschnitt 161' der
Siliziumnitridschicht 161 unterhalb der Öffnung 163 wird
durch RIE-Ätzen entfernt
(siehe 26).
- 5. Ein Abschnitt des Siliziumblocks 160 wird durch KOH-Ätzen entfernt, um eine Reaktionskammer 164 zu
bilden, und das verbleibende Photoresist 162 wird entfernt
(siehe 27).
- 6. Eine Schicht, die zum Beispiel aus Gold besteht, wird durch
Dünnfilmevaporation über die obere
Oberfläche
des Blocks 160 und die Kammer 164 abgeschieden,
so dass eine Elektrode 165 gebildet wird (siehe 28).
- 7. Ein zweiter Block Silizium 166 wird mit einer Schicht 167 Siliziumnitrid überzogen,
und darin werden Öffnungen 168 und 169 durch
RIE-Ätzen entfernt,
und es wird ein Paar von Füllanschlüssen 170 und 171 gebildet,
wie etwa durch Mikrobearbeitung in dem Block 166, und der
mit Siliziumnitrid überzogene
Block 166 wird mit der Elektrode 165 verbunden
(siehe 29).
- 8. Eine ITO-Schicht, die eine Elektrode 172 bildet, wird
auf einer Schicht oder einem Dia 173 aus Glas abgeschieden
und danach mit der Siliziumnitridschicht 167 verbunden
(siehe 29).
- 9. Die elektrischen Zuleitungen 174 und 175 werden
an der Goldelektrode 165 und der ITO-Elektrode 172 angebracht,
wobei ein Detektor 176, wie etwa die Fotodiode aus 21,
welche die Zuleitungen 177 und 178 aufweist, mit
einer Glasschicht 173 verbunden wird, und wobei der mit
Siliziumnitrid überzogene
Siliziumblock 160 an einem Magneten 179 positioniert
ist, der elektrische Zuleitungen 180 und 181 aufweist
(siehe 30).
-
Zur
Reduzierung des Widerstands der ITΟ-Elektrode 172 kann
ein dünner
Film aus Aluminium 182 (siehe 31) auf
die ITO-Schicht
der Elektrode 172 abgeschieden werden, bevor diese mit dem
mit Siliziumnitrid überzogenen
Siliziumblock 166 verbunden wird.
-
Somit
wurde gezeigt, dass die vorliegende Erfindung eine Mikroreaktionskammer
auf Siliziumbasis bereitstellt, die in einem handgehaltenen Instrument
oder in einem großen
Instrument mit hohem Durchsatz eingesetzt werden kann.