DE69633197T2

DE69633197T2 - Osteogene vorrichtungen und methode zur herstellung derselben

Info

Publication number: DE69633197T2
Application number: DE69633197T
Authority: DE
Inventors: Sam T. Lindholm; Aulis Marttinen
Original assignee: BIOACTIVE BONE SUBSTITUTE Oy AB
Current assignee: BIOACTIVE BONE SUBSTITUTE Oy AB
Priority date: 1996-02-29
Filing date: 1996-02-29
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2016-03-01
Also published as: FI981818A0; EP0883410B1; US7186811B2; US20050142164A1; ATE273723T1; ES2225870T3; WO1997031661A1; AU4721696A; EP0883410A1; FI981818A; FI120253B; DE69633197D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine osteogene Vorrichtung, umfassend einen modifizierten Knochen-morphogenetischen Protein (BMP)-Komplex und ein Verfahren zur Herstellung des Komplexes, das verbesserte knocheninduzierende Eigenschaften hat. Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung des Proteinkomplexes zur Herstellung einer osteogenen Vorrichtung mit verbesserten Eigenschaften.
Es ist eine große Herausforderung auf dem Gebiet der chirurgischen Orthopädie und Periodontie, Systeme zur Behandlung von Patienten mit Skeletterkrankungen und -deformationen zu finden, einschließlich der Reparatur der von Traumata, Tumorentfernung und angeborenen Missbildungen stammenden, großen Knochendefekte, der Rekonstruktion des durch eine implantierte Endoprothese verschlissenen Knochenbestandes in Revisionsoperationen und verzögerter Heilung oder nicht zusammengewachsener Frakturen.
Autogene Spongiosatransplantate, die aus menschlichem Knochen erhalten werden, waren bisher die zuverlässigste und effektivste Alternative für den Knochenersatz. Jedoch begrenzen die einschränkte Verfügbarkeit der Quellen, das durch die Explantatoperation verursachte Leiden und das Übertragungsrisiko des menschlichen Immunschwächevirus sowie andere Komplikationsrisiken dessen umfassende klinische Verwendung. Es gab Berichte über das erhöhte Vorkommen von Belastungsfrakturen, nicht zusammengewachsener Frakturen und nicht eingebauter Spongiosatransplantate, wenn sich die Defektgrößen ausdehnen. Die synthetisierten Biomaterialien, die kommerzialisiert wurden, können nur als Füllmaterial oder stützendes Gerüst ohne biologische Aktivität bei der Initiierung der Knochenregeneration verwendet werden. Ein wünschenswerter Knochenersatz, so wie ihn Forscher und Kliniker suchen, könnte eine Rekonstitution von synthetischem Material sein, dass die chemische Zusammensetzung, geometrische Architektur, mechanische Integrität und Biokompatibilität besitzt, die dem Hauptteil des lebenden Knochens ähneln, wobei biologische Wachstumsfakto ren die Knochenregeneration induzieren oder verbessern können. Ein derartiger Ersatz kann hoffentlich Autotransplantate ersetzen und umfassend in allen Situationen verwendet werden, die in der klinischen Medizin im Zusammenhang mit der Transplantation von hartem Gewebe stehen.
Es wurden im Handel erhältliche synthetisierte Biomaterialien entwickelt und sie können als Füllmaterial oder als Einlage sowie als Auflagenstütze verwendet werden. Leider fehlt diesen Materialien die biologische Aktivität bei der Initiierung der Knochenregeneration. Synthetische Träger, die aus derartigen Materialien wie Polymilchsäure und Hyaluronsäure hergestellt werden, werden z. B. im U.S.-Patent 5,366,508 beschrieben. Das Knochen-morphogenetische Protein (BMP) ist ein wichtiger Faktor in osteogenen Vorrichtungen und nimmt aktiv am Implantationsprozess teil.
BMP war das Ziel einer äußerst umfangreichen Forschung, da die Bedeutung von BMP zuerst in der Skelettbiologie erkannt wurde, und die Verfahren für dessen Extraktion und Reinigung wurden von Urist – einem der Pioniere auf dem Gebiet der BMP-Forschung – veröffentlicht. BMP wurde auch gelegentlich zur Behandlung von Patienten mit verzögerter Heilung von Frakturen verwendet, aber es wurde noch nicht im großen Maßstab zur Behandlung von Patienten verwendet.
Wichtige Meilensteine in der Geschichte von BMP sind die Entdeckung der Wirksamkeit von BMP bei der Induktion der neuen Knochenbildung, der Entwicklung von Isolierungsverfahren zur teilweisen Reinigung von natürlich auftretendem BMP aus der Tierknochenmatrix und die Isolierung verschiedener cDNAs, die BMP codieren, was die Herstellung von BMP mit rekombinanten DNA-Techniken ermöglicht.
Die vorläufigen Ergebnisse führten zur Entwicklung einer Vielzahl biologischer Abgabesysteme für BMP in vivo. Auch wenn die Experimente mit hochgereinigtem natürlich vorkommendem BMP oder rekombinantem BMP, die ohne Träger verabreicht wurden, positive Ergebnisse lieferten, löst sich das BMP ohne Träger schnell, diffundiert nach der Implantation in den Körperflüssigkeiten und bald darauf wird die Expression der Osteoinduktivität behindert. Deshalb wird ein geeigneter funktionaler Träger von BMP benötigt, um die Aktivität von BMP zu potenzieren und zu modulieren.
Der Träger oder das Abgabesystem des knocheninduzierenden BMP hat eine große Auswirkung auf die biologische Aktivität von BMP. Der Träger schützt BMP vor schneller Diffusion nach außen und vor endogener Proteinisierung. Er hält einen bestehenden Konzentrationsgradienten von BMP aufrecht, der mit der Differenzierung der BMP-Zielzellen und Osteogenese einhergeht. Ferner stellt er ein Gerüst zur Bindung der auf BMP ansprechenden Zellen bereit.
Die Abgabesysteme für BMP wurden nicht nur in einer Vielzahl von Publikationen diskutiert, sie wurden auch ausführlich in mehreren Patenten und Patentanmeldungen offenbart. Beispielsweise offenbart das Patent US 5,443,531 ein Abgabesystem, bei dem BMP auf einem Hydroxyapaptit-Träger in einer Chromatographie-Säule adsorbiert wird.
Um die Eigenschaften des Abgabesystems für die Verabreichung von BMP in klinischen Anwendungen zu verbessern, wurden Kollagene, insbesondere Typ-IV-Kollagen, verwendet, um Träger zu durchdringen und die biologische Aktivität zu verbessern. In den Patenten US 4,975,527 und US 4,394,370 werden auf Kollagen basierende Träger für BMP offenbart. Das knochen-induzierende Potential und die dosisabhängige Antwort auf Rinder-BMP, kombiniert mit einem Typ IV-Kollagen-Träger, wird bei Gao et al., Ann. Chir. Gynec. 82: 77–84, 1993 diskutiert.
Ein wünschenswerter Knochenersatz wäre ein Material, das nicht die Risiken aufweist, die mit von Menschen stammenden Autotransplantaten im Zusammenhang stehen, die die Eigenschaften eines synthetischen Materials besitzen, d. h. das eine chemische Zusammensetzung und eine geometrische Architektur sowie eine mechanische Integrität und eine Festigkeit aufweist, die dem Hauptteil von Autotransplantaten des lebenden Knochens ähnelt, und gleichzeitig die biologische Aktivität einschließlich Wachstumsfaktoren besitzt, die die Knochenregeneration induzieren oder verbessern können.
Gao et al., (Biomaterials 16, 1175–1179, 1995) haben einen Artikel über die mikroskopische Beurteilung des Knochenimplantatkontaktes zwischen Hydroxyapatit, bioaktivem Glas und Tricalciumphosphat veröffentlicht, die bei Schafen mit einem diaphysären Defekt implantiert wurden.
Mit sogenannten Biokeramiken wie natürlichen Korallen, die vom Skelett von Korallen stammen, wurden vielversprechende Ergebnisse erzielt. Natürliche Korallen wurden häufig als Träger verwendet. Die Verwendung von Calciumcarbonat, das vom Korallenskelett als bioresoptives Knochenmaterial stammte, wurde z. B. im Patent US 5,433,751 und der Patentschrift WO 93/02181 veröffentlicht.
Die Verwendung von natürlichen Korallenträgern in Kombination mit bestimmten Wachstumsfaktoren wie TGF wurde in der Patentveröffentlichung WO 94/26322 und DE 41 30 566 und mit Kollagen in US 4,975,527 offenbart. Die Verwendung des Wachstumsfaktors TGF in Kombination mit BMP wird auch in dem Patent US 5,393,739 offenbart, das ein gereinigtes BMP offenbart, das zwei Peaks bei der Fraktionierung mit RP-HPLC zeigt.
Auch wenn eine Vielzahl verschiedener Abgabesysteme für BMP vorgeschlagen wurde und verschiedene Systeme experimentell getestet wurden (Lindholm & Gao. Ann. Chir. Gynaecol. 82, 3–12, 1993), wurde bisher keine vollkommen zufriedenstellende Kombination von BMP und Träger für die klinische Behandlung menschlicher Patienten entdeckt.
Es wurde auch gezeigt, dass durch die herkömmlichen Verfahren isoliertes BMP zusätzlich zu verringerter Induzierung der Knochenbildung auch immunogene und inflammatorische Reaktionen verursacht. Somit besteht das Problem, das von der vorliegenden Erfindung gelöst werden soll, darin, alternative osteogene Vorrichtungen mit verringerten immunogenen und inflammatorischen Eigenschaften bereitzustellen.
Das Problem wird durch ein Reinigungsverfahren gelöst, das einen modifizierten BMP-Komplex bereitstellt, dem ein 25–55 kD-Protein mit immunogenen und inflammatorischen Eigenschaften fehlt.
Der modifizierten BMP-Komplex (mBMPc) ist durch ein Verfahren erhältlich, umfassend die Schritte:

(a) Pulverisieren oder Mahlen von demineralisiertem Knochenmaterial;
(b) Extraktion des Knochenmaterials aus Schritt (a) mit Guanidiniumhydrochlorid (GuHCl), vorzugsweise eine 1,5–5,0 M Lösung, am meisten bevorzugt eine 4 M Lösung;
(c) Durchführung einer Filtration unter Verwendung eines tangentialen Durchflusssystems;
(d) Reinigung mit Gelfiltration, um drei Fraktionen zu erhalten, die durch verschiedene Molekulargewichte gekennzeichnet sind, wobei Fraktion I ein Protein mit knocheninduzierender BMP-Aktivität mit hohem Molekulargewicht (100 bis 700 kD) ist, Fraktion II ein immunogenes Protein ohne BMP-Aktivität mit mittlerem Molekulargewicht (25 bis 55 kD) ist und Fraktion III ein Protein mit knocheninduzierender BMP-Aktivität mit niedrigem Molekulargewicht (15 bis 25 kD) ist; und
(e) Entfernen einer Proteinfraktion mit immunogenen und inflammatorischen Eigenschaften mit einem Molekulargewicht von 25 bis 55 kD, wie durch Gelfiltration bestimmt.

In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die knocheninduzierende BMP-Fraktion III mit niedrigem Molekulargewicht mit verbesserter Lagerfähigkeit getrocknet und sterilisiert. In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden ein geeignetes mBMPc und die Fraktionen I und III mit hohem und niedrigem Molekulargewicht kombiniert, um ein Gemisch der Fraktionen zu erhalten, und das Gemisch wird für eine längere Lagerung getrocknet und sterilisiert.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des modifizierten BMP-Komplexes zur Herstellung einer osteogenen Vorrichtung mit verbesserten knocheninduzierenden Eigenschaften. Kollagen, vorzugsweise Kollagen I, Kollagen IV oder im Handel erhältliche Kollagengemische, werden mit dem modifizierten BMP-Komplex inkubiert.
Der Träger, vorzugsweise der biokeramische Trägerkörper, am meisten bevorzugt die natürliche Koralle, die von einem Korallenskelett abstammt, wird in die BMP-Kollagen-Lösung getaucht und für einen Zeitraum inkubiert, der ausreicht, damit BMP das Kollagen durchdringt. Der BMP-Kollagen-Biokeramik-Körper wird dialysiert und der Körper und die für die Dialyse verwendete Lösung werden getrennt. Alle Präzipitate, Reste oder BMP-Reste aus der für die Dialyse verwendeten Lösung werden an den formbaren porösen Träger adsorbiert, so dass sich eine biokeramische, osteogene Vorrichtung ergibt. Die Vorrichtung wird getrocknet und mit anerkannten herkömmlichen Verfahren zur verlängerten Lagerung sterilisiert.
1 zeigt ein Sephacryl^®-S-200-Gelfiltrationschromatogramm von teilweise gereinigtem Elch-BMP. Die für die weitere Analyse gesammelten Fraktionen sind dargestellt. Die Fraktio nen I und III zeigten die Osteoinduktivität in einem Maus-Biotest. Spezifikationen: Flussrate 0,9 ml/min. Laufpuffer: 0,06 M K-Phosphat, pH 6,9 + 150 mM NaCl + 6 M Harnstoff + Detergenzien. Injektionsvolumen 1,8 ml. Injektionsmenge 120 mg.
2 zeigt eine HPLC-Chromatographie, die eine teilweise gereinigte Elch-BMP-Zubereitung als Multimer definiert, das aus drei Hauptfraktionen mit einem Molekulargewicht von 11–40, 40–140 bzw. 500–700 kD besteht.
3 zeigt die Variationen des ⁴⁵Calcium-Einbaus in verschiedene Implantatarten in die Muskeltasche von BALB-Mäusen am 10. und 20. Tag nach der Implantation. Die verwendeten osteogenen Vorrichtungen sind wie folgt markiert: natürliche Koralle-Kollagen-BMP (NK/KOL/BMP), Tricalciumphosphat-Kollagen-BMP (TCP/KOL/BMP), Kollagen-BMP (KOL-BMP), Knochen-morphogenetisches Protein (BMP) als solches, natürliche Koralle-Kollagen (NK/KOL), Tricalciumphosphat-Kollagen (TCP-KOL), natürliche Koralle (NK), Tricalciumphosphat (TCP).
In der vorliegenden Erfindung werden mehrere Begriffe verwendet, wie auf dem Gebiet der Knochentransplantate dargelegt, aber einige Begriffe werden häufig in einer leicht veränderten Bedeutung verwendet. Deshalb werden die in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeten Begriffe nachstehend detaillierter definiert.
Mit dem Begriff osteogene Vorrichtung ist ein Abgabesystem für knocheninduzierendes BMP gemeint, das Kollagen einschließt, das zusammengesetztes Material durchdringt, das mindestens aus einem formbaren, porösen Träger, vorzugsweise einem bioaktiven Träger, einschließlich Biokorallen, Hydroxyapatit, bioaktivem Glas oder anderen akzeptablen Materialien besteht, die herkömmlicherweise in der Knochenchirurgie verwendet werden.
Mit dem Begriff knocheninduzierend ist ein Prozess gemeint, bei dem ein Gewebe oder davon stammende Produkte ein zweites undifferenziertes Gewebe dazu veranlassen, sich in Knochengewebe zu differenzieren. Der Prozess ist an der Interaktion zwischen zwei Systemen beteiligt, das induzierende und das reagierende System. Das induzierende System bei der Osteoinduktion schließt hypertrophierten Knorpel, neu gebildete oder demineralisierte Knochenmatrix, Übergangsepithel und BMP ein. Das reagierende Ziel besteht aus Mesenchym-Gewebezellen, die die Fähigkeit besitzen, Osteoblasten zu werden.
Mit dem Begriff Osteokonduktion ist gemeint, dass implantiertes Material als relativ inertes Gitter für einen fortschreitenden Ersatz des Wirtsknochens dient.
Mit dem Begriff Osteogenese ist ein Verfahren der Knochenneubildung in situ durch überlebende prä-Osteoblasten und Osteoblasten in Autotransplantaten oder um verletztes Knochengewebe herum gemeint.
Mit dem Begriff Knochen-morphogenetisches Protein (BMP) ist das teilweise oder vollkommen gereinigte native BMP gemeint, das aus natürlichen Knochenquellen durch zuvor bekannte, häufig verwendete Isolationsverfahren erhalten wird.
Das Knochen-morphogenetische Protein (BMP) ist ein unspezifisches hydrophobes Matrix-Glycoprotein, das zur Familie der β-transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF-β) gehört. Da es ein Differenzierungsfaktor und ein Mitogen ist, spielt BMP sowohl bei der Chrondrogenese als auch der Osteogenese des embryonalen als auch postfötalen Lebens eine wichtige Rolle. Natürliches BMP wurde aus Rindergewebe, menschlichem Gewebe, Schweine-, Kaninchen-, Ratten-, Osteosarkomgewebe sowie aus Elch- und Rentiergewebe extrahiert und charakterisiert. Unterschiede bei der Ertragsmenge in den Extraktionsverfahren und der knocheninduzierenden Wirksamkeit in einem biologischen Test haben gezeigt, dass es bei BMP unter diesen verschiedenen Ursprungsquellen Unterschiede bei den Arten gibt. Für die menschliche Behandlung können jedoch nur spezifische, zugelassene BMP-Typen verwendet werden.
Mit dem Begriff rekombinantes Knochen-morphogenetisches Protein (rBMP), insbesondere dem rBMP menschlichen Ursprungs (rhBMP), ist ein BMP gemeint, das durch herkömmliche rekombinante DNA-Verfahren erhältlich ist.
Mit dem Begriff modifizierter Proteinkomplex (mBMPc) ist das teilweise gereinigte Knochen-morphogenetisches Protein gemeint, das ein Gemisch einer BMP-Fraktion mit hohem MG (100–700 kD) und einer BMP-Fraktion mit niedrigem MG (15–25 kD) umfasst, wobei der Komplex im wesentlichen frei von einer immunogenen und inflammatorischen Protein fraktion mit einem MG von 25–55 kD ist. Dieser mBMPc ist durch ein Verfahren erhältlich, das mindestens die Schritte der Extraktion von gemahlenem, demineralisiertem Knochen mit GuHCl und Fraktionierung umfasst, wie in den Ansprüchen definiert.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff Kollagen hauptsächlich Typ-I-Kollagen, das das Hauptkollagen in der Knochenmatrix ist, oder Typ-IV-Kollagen, das der Hauptbestandteil der Basalmembranen ist, die an der Zelldifferenzierung und Orientierung, Membranpolarisierung, selektiven Permeabilität für Makromoleküle und der Wanderung verschiedener Zelltypen beteiligt sind, aber auch andere Kollagentypen, insbesondere Atelopeptid-Kollagen, und Gemische davon, einschließlich im Handel erhältlicher Kollagengemische, die in dieser Definition eingeschlossen sind.
Mit dem Begriff Keramiken sind vorzugsweise biokeramische Träger gemeint, die aus formbaren Körpern, Blöcken oder Zylindern wie Hydroxyapatit, Tricalciumphosphat, bioaktivem Glas und insbesondere natürlichen Korallen bestehen, die von natürlichen Korallenskeletten stammen.
Koralle ist das Kalkskelett verschiedener Arten mariner Invertebraten. Die poröse Struktur und die Dimensionen in bestimmen Korallentypen ähneln mikroskopisch dem menschlichen Trabekelknochen. Die vorherrschende anorganische Komponente der Koralle in Form von Aragonitkristallen besteht hauptsächlich aus Calciumcarbonat (98% CaCO₃), aber auch aus geringen Mengen an Fluorid, Strontium und Magnesium.
Da sich implantierbares BMP schnell in vivo ausbreitet, ist eine der problematischsten Herausforderungen der BMP-Forschung die Suche nach einem idealen Abgabesystem, dass zulässt, dass BMP in kleinen Mengen über einen längeren Zeitraum wirksam ist, bevor BMP aus der Grundlagenforschung zur klinischen Anwendung eingeführt werden kann.
Nichtkollagen-Protein, Kollagene, Hydroxyapatit, Tricalciumphosphat, Polymilchsäure und Titan wurden als Fördermaterialien von BMP untersucht (Lindholm & Gao, Ann. Chir. Gyn. 82, 3–12, 1993).
Das knocheninduzierende Potential von Kollagen Typ IV als Träger von Rinder-BMP wurde in früheren Studien definiert (Lindholm et al., In Lindholm TS (Herausg.): New Trends in Bone Grafting. Acta Universitatis Tamperiensis, University of Tampere, 1992, Ser. B Bd. 40, S. 45–50 und Gao et al., Ann. Chir. Gyn. 82, 77–84, 1993).
Von Mineralskeletten der Korallen erhaltene natürliche Korallen und Derivate werden auch als resorbierbarer, osteokonduktiver, osteophiler Ersatz der Knochentransplantate in der Periodontologie verwendet. In der vorliegenden Erfindung wurden die Experimente so konzipiert, das Typ IV-Kollagen durchdrungene natürliche Koralle und Tricalciumphosphat-Keramiken als zusammengesetzte Vehikel für BMP verwendet wurden. Da es keine Berichte im Zusammenhang mit einer quantitativ vergleichbaren Studie über die Wirkungen der zusammengesetzten Träger auf die BMP-Bioaktivität in vivo gibt, zielte diese Studie darauf ab, nachzuweisen, ob der zusammengesetzte Träger dem Kollagenträger überlegen ist und welche der Zusammensetzungen, dominiert von natürlichen Korallen oder Tricalciumphosphat, besser zur Osteoinduktion unter dem Gesichtspunkt des Calciumstoffwechsels funktioniert.
Indem gereinigte knocheninduzierende Rinder-Polypeptide wie Rinderknochen-morphogenetische Proteine mit verschiedenen Trägermaterialien kombiniert wurden, wurde eine osteogene Vorrichtung für die klinische Anwendung hergestellt. Indikationen für die Verwendung der osteogenen Vorrichtung waren die chirurgische Behandlung von Pseudoarthrose, nicht zusammengewachsenen Frakturen, Knochendefekten, Knochenzysten oder die Beschleunigung des Reparaturprozesses von Frakturen bei endoprosthetischen chirurgischen Eingriffen. Die minimale erforderliche BMP-Dosis, um die sichtbare Knochenbildung in vivo zu induzieren, wurde in der Praxis verwendet, um die Bioaktivität von BMP von verschiedenen Ursprüngen zu beurteilen. Typischerweise werden mehr als 2 mg eines teilweise gereinigten Rinder-BMP zur intramuskulären Osteoinduktion benötigt.
Die Calciumablagerung an der implantierten Stelle zeigt die metabolische Osteogenese im Frühstadium. Der Peak der Calciumpräzipitation im neu gebildeten Knochen findet bei Nagern gewöhnlich zwischen 10–20 Tagen statt. Signifikant erhöhter ⁴⁵Calciumeinbau an den mit den zusammengesetzten Zubereitungen implantierten Stellen zeigten quantitativ an, dass zusammengesetzte Träger, natürliche Korallen oder Tricalciumphosphat, kombiniert mit Typ IV-Kollagen, viel besser für die Abgabe der BMP-Bioaktivität funktionierten als Einzelkom ponententräger. Natürliches Korallen- und Tricalciumphosphat sind sowohl Calciumdominierte Biokeramiken mit multiporöser Struktur und auch Histokompatibilität. Unter alleiniger Verwendung von Tricalciumphosphat oder Typ IV-Kollagen als BMP-Träger wurde ein günstiges Ergebnis erzielt. Man glaubt, dass die poröse Struktur der Keramiken BMP einfängt, BMP in vivo vor der Diffusion nach außen schützt und das Gebiet des reaktiven Zell-BMP-Kontakts erweitert.
Es wurde gezeigt, dass Typ IV-Kollagen sowohl natürliches als auch denaturiertes BMP bindet und in vitro die Wirkung von BMP auf die Differenzierung und Proliferation der Mesenchymzellen und Knochenvorläufer verstärkt. Typ IV-Kollagen bindet auch stark Wachstum- und Differenzierungsfaktoren, die von BMP freigesetzt werden, und orientieren sie in eine optimale Konformation, um die Knochenneubildung lokal anzuregen. Die multiporöse Struktur der Keramiken kombiniert mit der biologischen Modulation von Typ IV-Kollagen auf die BMP-Bioaktivität in den zusammengesetzten Zubereitungen erhöhte die lokale Wirkung von BMP auf induzierbare Zellen beträchtlich, um die Osteogenese zu verbessern. Das Keramikskelett in einem zusammengesetzten Träger liefert somit ein Gerüst für die induzierbare Zellbindung und -Proliferation und Mineralienablagerung. Die gegebene Geometrie und die mechanische Integrität machen die Zubereitung für die Füllung von Knochendefekten an gewichtstragenden Stellen ideal. Wahrscheinlich spielten Calciumionen, die von der Lösung von Ca-dominanten Keramiken in die zusammengesetzten Zubereitungen freigesetzt wurden, auch eine aktive Rolle bei der Regulation und Expression der BMP-Bioaktivität.
Die zusammengesetzte natürliche Korallen-Kollagen-BMP-Zubereitung verbesserte das knocheninduzierende Potential im Vergleich zum Tricalcium-Kollagen-BMP, wie im experimentellen Teil dieser Beschreibung dargestellt ist. In der radiographischen Analyse war die ⁴⁵Calcium-Aufnahme höher, der neu gebildete Knochen größer und in der histologischen Analyse das neue Einwachsen der Knochen zu den Poren im natürlichen Korallen-Kollagen-BMP höher als in der Tricalciumphosphat-Kollagen-BMP-Zubereitung. Die Unterschiede wurden hauptsächlich als Unterschiede in den Bestandteilen und Ressourcen zwischen den beiden Keramiken betrachtet, die bei den zusammengesetzten Trägern verwendet wurden.
Calciumcarbonat in der Struktur von als Aragonit bezeichneten orthorhombischem Kristallin macht 97% der natürlichen Koralle aus. Nachdem die natürliche Koralle in vivo implantiert wurde, fand eine schnelle Modifizierung der Oberfläche statt, bevor neuer Knochen aufgela gert wurde. Die anfängliche Auflösung der Oberfläche setzte Calcium- und Carbonat-Ionen in die umgebende Flüssigkeit frei und dann erfolgte die Präzipitation oder Ablagerung einer Calciumphosphatschicht und/oder eine Umwandlung der Carbonat-Oberflächenschicht in Carbonatcalciumphosphat. Die Calciumphosphat-reiche Schicht auf der natürlichen Koralle war sowohl für die neue Knochenablagerung als auch für den zellvermittelten Abbau eine wichtige Strukturbasis. Es wurde nachgewiesen, dass das natürliche Korallenskelett perfekt biointegriert ist und etwas knocheninduzierende Eigenschaften besitzt.
Folglich liefert ein höherer ⁴⁵Ca-Einbau in die Kontrollen der natürlichen Koralle mit oder ohne Kollagen im Vergleich mit Tricalciumphosphat mit oder ohne Kollagen den Beweis des osteogenen Effekts im frühen Stadium nach der Implantation. Eine weitere wichtige Tatsache ist, dass die natürliche Koralle vom natürlichen Mineralskelett der Scleractiniakorallen erhalten wird, dessen Struktur sich von dem durch den Menschen hergestellten Tricalciumphosphat unterscheidet. Der natürliche Ursprung und die Architektur ermöglichen der Koralle, mehr BMP zu assimilieren, die BMP-Biofunktion zu regulieren und mehr Knochenvorläuferzellen anzuziehen.
Der Mechanismus im Detail bleibt noch zu erklären. Da die natürliche Koralle eine bessere Bioresorption, mechanische Resistenz und BMP-Abgabewirksamkeit zeigt, ist sie vom klinischen Gesichtspunkt aus gesehen wahrscheinlich eine der idealen Alternativen für BMP-Träger.
Die dosisabhängige Knochenbildung ist ein wichtiger Maßstab der biologischen Eigenschaften von BMP. Die Mengen an induziertem Knochen waren im Verhältnis zu den Dosen des Elch-BMP erhöht, das der zusammengesetzten Zubereitung zugegeben wurde. Die ⁴⁵Ca-Aufnahme war sowohl am 10. als auch am 20. Tag in den zusammengesetzten Zubereitungen mit 4 mg Elch-BMP beispielsweise viel niedriger als mit 8 mg Elch-BMP. Die dosisabhängige Osteoinduktion von mBMP mit Keramiken und Kollagen interferiert nicht mit der biologischen Funktion von Elch-BMP.
Die intensivere Osteoinduktion wurde durch die zusammengesetzten Zubereitungen, Elch-BMP mit oder ohne Typ-IV-Kollagen eher nach 10 Tagen als nach 20 Tagen gezeigt. Der Grund für dieses außergewöhnliche Phänomen bleibt im Dunklen. Da keine Einigung erzielt wurde, wie die Kombination von BMP mit einem Keramikträger die zeitliche Abfolge der Osteoinduktion beschleunigen oder verlangsamen kann, könnte das Kombinationsverfahren, das die Dreifachkomponenten in dieser Studie umfasst, die Expression des BMP-Phänotyps und der Knochenbildung erleichtern.
Die Komplikationen der homo- und heterodimeren Formen, die in dem BMP-Polypeptidkomplex vorhanden sind, könnten die Aktivitäten im Knocheninduktionssystem erhöhen, erniedrigen oder sogar hemmen. Das immunologische Problem, das durch die Implantation des heterogenen BMP initiiert wird, kann sich auch in der Infiltration von inflammatorischen reaktiven Zellen um die Zubereitungen herum manifestieren, die mit Elch-BMP in verschiedenen Gruppen beladen sind. Die bioaktive Einheit von Elch-BMP-Komplexen, die durch multiple Fraktionen verschiedener Molekulargewichte charakterisiert sind, trugen zu seinem knocheninduzierenden Potential sowie der immunogenetischen Initiierung bei, die die Osteoinduktion am 20. Tag nach der Implantation unterbrach oder verringerte. Die Ereignisse, die an der Immunogenität der verschiedenen dissoziierten Fraktionen von Elch-BMP beteiligt sind, werden derzeit erforscht.
Die intensive Forschung von BMP hat neue Grenzen für die Entwicklung von bioaktivem Knochenersatz geöffnet. BMP, das Glycoprotein, das sich besonders in der Matrix des harten Gewebes befindet, spielt sowohl bei der Chondrogenese als auch der Osteogenese von embryonalem als auch postfötalem Leben eine wichtige Rolle. Große nicht ausgeheilte Knochendefekte wurden durch natürlich auftretendes BMP erfolgreich repariert, wenn BMP von einem geeigneten Abgabesystem getragen wurde. Unter Verwendung von teilweise gereinigtem menschlichem BMP, das durch autogene Knochentransplantate oder autolysierte antigenextrahierte allogene Knochen befördert wurde, wurden bei der Behandlung resistenter nicht zusammengewachsener Femurfraktionen, ermutigende vorläufige Ergebnisse erzielt, aber die begrenzten Quellen der autogenen Spongiosatransplantate bei den Patienten war immer noch ein frustrierendes Problem.
Einige Biokeramiken wurden als Träger von BMP in experimentellen Studien verwendet. Die nachgewiesene Porosität, mechanische Integrität und Gewebekompatiblitität qualifizierten einige dieser Biokeramiken als mögliche Träger von BMP. Der Hauptpunkt bei den verbleibenden Problemen ist, wie man BMP, ein biologischer Faktor, mit Keramiken, anorganische Substanzen, effektiv kombiniert und die biologische Funktion von BMP bei der Rekonstitution beibehält oder sogar moduliert.
Unter Verwendung von Tricalciumphosphatzylindern, die mit Schaf-BMP und Typ-IV-Kollagen durchdrungen sind, wurde die verbesserte Wirkung dieses zusammengesetzten Knochenersatzes bei der Reparatur von Knochensegmentdefekten in der Tibia von Schafen nachgewiesen. Die vorliegende subklinische Studie zielte darauf ab, die Möglichkeit und Aussichten der Entwicklung eines bioaktiven Knochenersatzes für die klinische Anwendung zu verfolgen.
Die praktischste Anwendung der BMP-Forschung ist die Behandlung von Patienten mit hartnäckigen, nicht zusammenwachsenden Frakturen und umfassenden Knochendefekten. Die Überbrückung der Lücke zwischen der Grundlagenforschung und der klinischen Anwendung war zwei Jahrzehnte lang das Ziel vieler Forscher und Kliniker. Der kritische Punkt der erfolgreichen Behandlung von umfassenden Knochendefekten, insbesondere bei gewichttragenden Gliedern, besteht darin, eine Knochenkontinuität mit einer etablierten mechanischen Integrität zu rekonstruieren und gleichzeitig die lokale Knochenregeneration zu erleichtern.
Die mechanische Integrität des Implantates verstärkt die Immobilisierung der defekten Stelle zu einem frühen Zeitpunkt und stellt ein Gerüst für das osteogene Gewebe bereit. Die motivierte Osteogenität sichert die Heilung des Defektes. Die bisherige Entwicklung von Biokeramiken lieferte ein breites Spektrum an biokompatiblem knochenfüllenden Materialien zur klinischen Anwendung, jedoch wurde bisher über keine Biokeramik mit definitiver Osteoinduktivität berichtet.
Mit natürlich auftretendem oder menschlichem rekombinantem BMP wurden große Knochendefekte bei Ratten-, Kaninchen-, Hunde-, Schafmodellen und Menschen erfolgreich repariert, wenn die osteogenen Proteine mit Kollagenderivaten, Polymilchsäure bzw. autolysiertem antigenextrahiertem allogenem (AAA) Knochen kombiniert wurden. Jedoch machten der Mangel an wünschenswerter Geometrie und mechanischer Integrität bei diesen BMP-Trägern die zusammengesetzten Implantate für chirurgische Eingriffe unzugänglich.
Unter Verwendung des zusammengesetzten Knochenersatzes, der aus der Dreifachkomponente Tricalciumphosphat, das mit natürlich auftretendem BMP beladen ist, und Typ-IV-Kollagen besteht, zeigen unsere Versuchsergebnisse unseres Wissens bisher zum ersten Mal, dass dieser bioaktive zusammengesetzte Knochenersatz ein Profil mechanischer Festigkeit sowie die Kapazität aufweist, eine Heilung eines diaphysären Segmentdefekts beim Schaf zu induzieren.
Ein geeignetes Abgabesystem erfüllt mehrere wesentliche Funktionen zur Osteoinduktion von BMP, einschließlich der restriktiven Freisetzung von BMP zu der wirksamen Dosis während eines Zeitraums, der mit der Akkumulierung und Proliferation von Zielzellen zusammenfällt und jedem Schritt der Interaktion zwischen den Zellen und der Knochenbildung Rechnung trägt. Das Material muss biokompatibel und biologisch abbaubar sein, und es sollte ein Substrat für die Bindung von rekrutierten Knochenvorläuferzellen bereitstellen.
Von Urist et al., Clin. Orthop. 187, 277–280, 1993, wurde eine Tricalciumphosphat-Scheibe als Träger von Rinder-BMP beschrieben. Nach 21 Implantationstagen wurde die 12-fache Menge an neuem Knochen in einem Implantat mit Tricalciumphosphat-BMP im Vergleich zu einem Implantat mit 1,0 mg BMP allein in Maus-Muskeltaschen produziert. Die potentielle Wirkung von Typ-IV-Kollagen auf die Osteoinduktivität von Rinder-BMP wurde in unserer vorherigen Studie bewiesen.
Die Arbeitshypothese, auf der wir den zusammengesetzten Knochenersatz mit Dreifachkomponenten in diesem Experiment rekonstituierten, war, dass die mechanische Integrität, Biokompatibilität, Porosität und Verfügbarkeit für die Bindung von BMP in einem Tricalciumphosphatzylinder, kombiniert mit der Potenzierung der osteogenen Kapazität von BMP durch Typ IV-Kollagen, den zusammengesetzten Knochenersatz für die klinische Anwendung zugänglicher machen würde.
Versuchsergebnisse haben einen Unterschied im Ausmaß des überbrückenden Kallus zwischen dem zusammengesetzten Knochenersatz mit 100 mg Schaf-BMP und dem zusammengesetzten Knochenersatz mit 13 mg Schaf-BMP oder Tricalciumphosphat mit Typ-IV-Kollagen nach 3 Wochen gezeigt, und 6 Wochen nach der Implantation wurde dies offensichtlich. Es bestätigte sich, dass die Kaskade der von BMP induzierten Knochenbildung gewöhnlich 7 Tage bis 4 Wochen exprimiert wurde, abhängig von verschiedenen Tierarten, Trägern und Implantationsstellen. Da das Periosteum in dieser Studie erhalten wurde, trugen mehr aktivierte mesenchymartige Zellen und induzierbare Zellen von der Cambiumschicht des Peri osteums oder Endosteums zu einer früheren üppigeren Knochenregeneration bei, indem sie die BMP durchdrungenen Implantate bei der Tibia vom Schaf umgaben.
Im Vergleich zur Reparatur eines Segmentdefekts im Femur eines Schafes mit rekombinantem BMP trat die Bildung von überbrückendem Kallus in unserer Studie früher auf. Sowohl nach 3 als auch nach 6 Wochen wurden eine signifikant größere Fläche und höher integriertere Intensität des überbrückenden Kallus im zusammengesetzten Knochenersatz (ZKE) mit 100 mg Schaf-BMP als im zusammengesetzten Knochenersatz mit 13 mg Schaf-BMP oder Tricalciumphosphat-Zylinderimplantate durch computergestützte Bildanalyse definiert.
Die dosisabhängige Osteoinduktion von BMP war eine der bemerkenswerten biologischen Merkmale. Es ist allgemein bekannt, dass je höher die Tierart und je größer der erzeugte Defekt ist, desto mehr BMP wird zur Heilung des Defektes benötigt. Ohne signifikante statistische Unterschiede in der Fläche und integrierten Intensität des Kallus zu verschiedenen Zeiten und bei der mechanischen Stärke zwischen dem zusammengesetztem Knochenersatz mit 13 mg Schaf-BMP und Tricalciumphosphatzylindern wurde in den Experimenten der vorliegenden Erfindung auch gezeigt, dass die Heilung großer Knochendefekte bei höheren Säugern eine große BMP-Dosis erfordert.
Die Verteilungen und Formen des überbrückenden Kallus um die BMP imprägnierten Tricalciumphosphat- und BMP-freien Tricalciumphosphat-Implantate herum, zeigten insbesondere nach 6 Wochen einen klaren Unterschied. Dieses interessante Phänomen kann weitere Beweise lokaler Auswirkungen von BMP auf die Osteoinduktion liefern. Gemäß dem Anstieg der Menge des überbrückenden Kallus beim zusammengesetzten Knochenersatz mit 100 mg Schaf-BMP im frühen Stadium war die akkumulierte Dichte des Kallus in einem Computertomographie (CT)-Scan am Ende des Experimentes beträchtlich erhöht. Diese Zunahme zeigte, dass mehr reifer Kallus und ein höherer Mineralgehalt im zusammengesetzten Knochenersatz mit 100 mg Schaf-BMP als in den Tricalciumphosphatzylindern erzeugt wurde. Die Korrelation des Ausmaßes der Fläche des überbrückenden Kallus im frühen Stadium mit der Zunahme der Dichte des Kallus im späteren Stadium bei BMP durchdrungenen Implantaten könnte implizieren, dass BMP auch den Prozess der Knochenremodellierung fördert.
Die mechanische Festigkeit wurde als Goldstandard für die biologische Heilung von Frakturen in experimentellen Studien etabliert. Man glaubte, dass der Torsionstest ein umfassender und zuverlässiger Parameter der Knochenfestigkeit sei. Bei den zusammengesetzten Knochenersatzgruppen waren alle Parameter des Torsionstests erhöht, da die Schaf-BMP-Dosis im zusammengesetzten Implantat im Vergleich zur Tricalciumphosphatzylinder-Gruppe erhöht war. Trotz des belastungsabschirmenden Effekts der starren Immobilisierung durch zwei überlappende AO-Platten, war die osteotomierte Tibia mit einem Implantat des zusammengesetzten Knochenersatzes mit 100 mg Schaf-BMP sogar fester als die contralaterale Tibia mit sich deckenden Löchern.
Auch in unserer Studie stießen wir auf große Standardabweichungen der Torsionstestparameter, aber es wurde noch nach 16 Wochen ein signifikant erhöhter Prozentsatz der Knochensteifheit gegenüber der contralateralen Tibia in der geheilten osteotomisierten Tibia gezeigt, die mit zusammengesetztem Knochenersatz mit 100 mg Schaf-BMP im Vergleich zu demjenigen mit Tricalciumphosphatzylindern implantiert war. Da der zusammengesetzte Knochenersatz nicht nur die Bildung des überbrückenden Kallus anreicherte, sondern auch neues Einwachsen des Knochens in die Pore von Tricalciumphosphat induzierte, wurde histologisch eine gute Osteointegration zwischen dem neuen Knochen und dem zusammengesetzten Knochenersatz-Implantat beobachtet. Die Tatsache, dass beim mechanischen Test die Frakturlinie, die durch die Implantatknochengrenzfläche hindurch ging, in nur einem der sechs zusammengesetzten Knochenersatzmaterialien mit 100 mg Schaf-BMP auftrat, lieferte ebenfalls den Beweis einer guten Osteointegration.
Die nachgewiesene Osteointegration und Remodellierung, die verankerten Tricalciumphosphatzylinder im Defekt und die erweiterte Beobachtungszeit wurden als Beiträge der erhöhten Knochensteifheit im zusammengesetzten Knochenersatz bei der 100 mg-Schaf-BMP-Gruppe erklärt. Die Nettospiralbruchmuster stimmten ebenfalls mit dem biomechanischen Heilungsstadium überein. Im Torsionstest wurde die contralaterale Tibia, in die sich deckende Löcher gebohrt wurden, als Selbstkontrolle zur Beurteilung der relativen Festigkeit der geheilten Tibia verwendet. Die Idee war, Bedingungen für einen Doppeltest zu schaffen und die Varianzen der Parametermittelwerte zu reduzieren, die auf die Einflüsse der Unterschiede im Körpergewicht und Alter auf die Knochenfestigkeit zurückzuführen waren. Jedoch bleibt noch, den reduzierenden Effekt der Schaf-Tibia mit Löchern auf die mechanische Leistung der intakten Tibia darzustellen.
Abschließend lieferte der zusammengesetzte Knochenersatz mit den Dreifachkomponenten die Vorteile der Osteoinduktion, Osteokonduktion und mechanischen Wiederstandsfähigkeit. Heutzutage werden durch die Fortschritte in der Biomaterialforschung bessere Möglichkeiten bereitgestellt, nach einem geeigneten Biomaterial als Skelett für zusammengesetzten Knochenersatz zu suchen. Die begrenzten Quellen und die Unreinheit des natürlich auftretenden BMP konnten durch die Herstellung von rekombinantem BMP umgangen werden. Mit der Entwicklung von Rekonstitutionsverfahren wird ein wünschenswerter zusammengesetzter Knochenersatz für den Menschen zur Verfügung stehen. Die wesentlichste Relevanz in dieser experimentellen Studie war, die Notwendigkeit und die Vorteile der Entwicklung eines synthetischen bioaktiven Knochenersatzes für die medizinische Praxis herauszustellen.
Es ist nicht nur eine große Herausforderung für die Menschheit, neue und verbesserte Abgabesysteme für BMP zu entwickeln, die bei der Behandlung von Patienten mit Skeletterkrankungen und -deformationen verwendet werden können. Es ist auch wichtig, die Eigenschaften der in der osteogenen Vorrichtung verwendeten Komponenten zu verbessern.
Das Knochen-morphogenetische Protein BMP wird im Allgemeinen mit von Urist et al.; In Lindholm TS (Herausg.): New Trends in Bone Grafting. Acta Universitatis Tamperiensis, University of Tampere, 1992, Ser. B Bd. 40, S. 27–39, Urist et al., PNAS 76, 1828–1932, 1979, etc. entwickelten Verfahren isoliert. BMP, seine Isolierung, Reinigung und Eigenschaften werden auch z. B. in den folgenden Patenten US 5,433,751 , US 4,294,753 , US 4,455,256 , US 4,563,489 , US 4,596,574 , US 4,789,732 und US 4,795,804 beschrieben.
Die von Urist et al. entwickelten Extraktionsverfahren werden heute in den meisten Laboratorien verwendet und durch die Verwendung der Guanidiniumhydrochlorid (GuHCl)-Extraktion charakterisiert und durch folgende Merkmale weiter charakterisiert. Die Knochenmatrix wird zuerst gemahlen und gelatiniert, um Proteine nicht kollagenen Ursprungs freizusetzen. Die Extraktion erfolgt in Gegenwart von Calciumchlorid und Proteaseinhibitoren. Lipide, die den Reinigungsprozess stören, werden vom Rohmaterial entfernt. Somit sind die durch die herkömmlichen Laborverfahren erhältlichen BMP aus nativer Knochenmatrix gelatiniert und im Wesentlichen lipidfrei. Sie könnten Spuren von Proteinaseinhibitoren sowie einen Überschuss an Ca⁺⁺-Ionen enthalten.
Das Knochen-morphogenetische Protein wurde ebenfalls durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Derartige Verfahren werden z. B. in den Patentschriften WO 90/11366 und WO 95/24474 offenbart. rhBMP ist frei von irgendwelchen Überbleibseln oder Resten der nativen Knochenmatrix, die an das native BMP nach der Extraktion mittels der allgemein verwendeten Verfahren gebunden bleiben könnten. rhBMP fehlen beispielsweise Fette oder andere Substanzen, die möglicherweise im natürlichen von Knochen abstammendem BMP vorliegen.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung fanden unerwartet heraus, dass man, falls die herkömmlichen Laborverfahren etwas modifiziert werden, eine neuen BMP-Typ erhält. Der neue BMP-Typ, d. h. der modifizierte BMP-Komplex (mBMPc) der vorliegenden Erfindung, der mit Kollagen und formbaren Trägern wie Biokeramiken einschließlich natürlicher Korallen kombiniert ist, ergab bei der Knochenbildung überraschenderweise gute Ergebnisse.
Native BMPs, die durch Verfahren extrahiert wurden, die sich von denjenigen der vorliegenden Erfindung unterschieden, erwiesen sich nicht als so effektiv wie das mBMPc, das mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung extrahiert wurde in Kombination mit den Trägermaterialien, die in der osteogenen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Es ist jedoch nicht nur das Trägermaterial, das bei der Bioresorption des Knochens wichtig ist. Die Art des verwendeten BMP-Komplexes und seine Eigenschaften sind sehr wichtig, um die gewünschten knocheninduzierenden Eigenschaften zu erhalten.
Die Erfinder haben die besten Ergebnisse mit mBMPc erhalten, was zeigt, dass gelatiniertem BMP oder rhBMP einige wesentlichen Bestandteile fehlen, die essentiell sind, um ein gutes Implantat zu erhalten. Die Erfinder haben folglich herausgefunden, dass überraschend gute knocheninduzierende Eigenschaften mit einer osteogenen Vorrichtung erhalten werden können, die einen modifizierten BMP-Komplex einschließt, der mit einer in den Ansprüchen definierten Modifizierung der Urist-Verfahren in Kombination mit Typ-IV-Kollagen und einem natürlichen Korallenträger isoliert wurde.
Folglich wird das BMP in der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit von Jortikka, L. et al. (Ann. Chir. Gynaecol. 82: 25–30, 1993) und Jortikka et al. (Ann. Chir. Gynaecol. 82: 31–36, 1993) beschriebenen Verfahren extrahiert. Die Verfahren basieren auf dem von Urist et al.; in Lindholm TS (Herausg.): New Trends in Bone Grafting. Acta Universitatis Tamperiensis, University of Tampere, 1992, Ser. B Bd. 40, S. 27–39, beschriebenen Verfahren. Die wesentlichen Unterschiede zwischen den Extraktionsverfahren von Urist und denjenigen, die für die Herstellung des in der osteogenen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendeten, modifizierten BMP-Komplexes verwendet werden, sind nachstehend aufgeführt.
Beim Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die gemahlene Knochenmatrix nicht gelatiniert, da die Erfinder festgestellt haben, dass die Trennung, Abtrennung, Lösung oder Freisetzung von nicht kollagenen Proteinen unter Verwendung von Guanidium-HCl (GuHCl) genauso effektiv ohne Gelatinierung wie mit Gelatinierung ist. Somit erhielt man ein nicht gelatiniertes Produkt. Es ist möglich und manchmal von Vorteil, jedoch nicht notwendig, Kollagenase beim Extraktionsvorgang zu verwenden.
Ein weiteres unterscheidendes Merkmal besteht darin, dass beim Verfahren der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit der GuHCl-Extraktion kein Calciumchlorid verwendet wird und folglich der chelatbildende Effekt von Ca⁺⁺-Ionen bei dem Extraktionsverfahren fehlt. Somit liegt beim durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen Produkt kein Ca⁺⁺-Ionenüberschuss vor.
Ferner haben die Erfinder festgestellt, dass Proteasen in 1,5–5,0 M, vorzugsweise 4 M GuHCl nicht aktiv sind. Somit werden keine Proteaseinhibitoren bei den Extraktionsschritten der vorliegenden Erfindung verwendet und es wird ein modifizierter BMP-Komplex erhalten, der keine Proteinaseinhibitorreste (Spuren) enthält, die für den Patienten schädlich oder von Nachteil sein könnten.
Da ein tangentialer Ultrafiltrationsapparat verwendet wird, ist keine Lipidextraktion erforderlich. Die Funktion des Gerätes wird nicht von Lipiden gestört, und folglich kann die Entfernung der Lipide vor der Konzentration vermieden werden. Da das letzte Stadium bei der Präparation des Rohproduktes die HPLC-Gelfiltration ist, besteht kein Bedarf andere Protein moleküle mit einer verdünnten GuHCl-Lösung in den Zwischenstadien der Extraktionsprozedur zu entfernen. Aus demselben Grund ist keine Triton X-100-Extraktion erforderlich.
Das letzte und wesentliche Stadium bei der Herstellung der Rohzubereitung ist die HPLC-Gelfiltration, bei der drei getrennte Fraktionen erhalten werden. Diese unterscheidbaren Fraktionen werden als Fraktion I, II und III bezeichnet. Fraktion I enthält ein Protein mit hohem Molekulargewicht (100–700 kD). Fraktion II enthält ein Protein mit mittlerem Molekulargewicht (25–55 kD) und Fraktion III enthält ein Protein mit niedrigem Molekulargewicht (15–25 kD). Fraktion II mit mittlerem MG (25–55 kD) verursacht offensichtliche Entzündungsreaktionen und keine Knochenbildung. Da Fraktion II immunogen zu sein scheint, wird sie verworfen und nicht verwendet. Die anderen beiden durch die HPLC-Gelfiltration erhaltenen Fraktionen, Fraktion I, d. h. die BMP-Fraktion mit hohem MG, und Fraktion III, d. h. die BMP-Fraktionen mit niedrigem MG, werden gesammelt.
Die beiden Fraktionen können getrennt verwendet werden. Wegen ihrer guten Lagerfähigkeit wird Fraktion III besonders bevorzugt. Fakultativ werden Fraktion I und III kombiniert (gemischt) und die teilweise gereinigte Zubereitung kann als solche verwendet werden oder durch präparative isoelektrische Fokussierung oder durch präparative SDS-PAGE (BioRad-Gerät) weiter gereinigt werden. Bei der klinischen Behandlung scheint die Verwendung von teilweise gereinigten Zubereitungen die besten knocheninduzierenden Eigenschaften zu besitzen.
Folglich ist der modifizierte BMP-Komplex, der durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhältlich ist, ein nicht gelatinierter, nicht kollagener, nicht chelatbildender, Lipid enthaltender Proteinkomplex, der ein BMP-Gemisch mit mindestens zwei verschiedenen MG (100–700 kD und 15–25 kD) enthält, und dem Komplex fehlt die immunogene 25–55 kD-Fraktion. Die Rohzubereitung kann gefriergetrocknet, sterilisiert werden und besitzt eine verlängerte Lagerfähigkeit.
Die Zubereitung kann direkt verwendet werden, um die erfindungsgemäßen osteogenen Vorrichtungen herzustellen, aber ist auch möglich, die gefriergetrocknete BMP-Zubereitung wieder aufzunehmen und sie nach der Lagerung zur Herstellung einer osteogenen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zu verwenden.
Das durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhältliche, nicht kollagene, wasserlösliche Knochen-morphogenetische Protein (BMP)-Material wird mit löslichen Kollagenen, vorzugsweise Typ IV-Kollagen oder Typ I-Kollagen gemischt und verwendet, um natürliche Koralle zu durchdringen, die fakultativ in Kombination mit Hydroxyapatit, bioaktivem Glas oder anderen geeigneten Trägermaterialien verwendet werden kann.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen und Experimenten detaillierter beschrieben, die Vergleichsergebnisse liefern.
Beispiel 1
Reinigung der knocheninduzierenden Polypeptide BMP aus Rinder-Kortikalknochen
Das Ausgangsmaterial zur Isolierung knocheninduzierender Polypeptide wie Knochen-morphogenetische Proteine (BMP) war kortikaler Rinderknochen, der von örtlichen Tierärzten vor der Verwendung kontrolliert und zugelassen wurde. Unmittelbar nach dem Tod der Tiere wurden die langen Kortikalknochen entfernt, gekühlt und in der Kälte aufbewahrt, bis der Extraktionsvorgang begonnen wurde. Mit der BMP-Reinigung wurde innerhalb von 30 Stunden begonnen.
Das kortikale Rinderknochenmaterial wurde in 1–2 mm³ große Teilchen pulversiert und in 0,6 N HCl demineralisiert. Nicht kollagene Proteine wurden aus den demineralisierten Knochenteilchen in 4 M Guanidiniumhydrochlorid (GuHCl) extrahiert. Das in GuHCl lösliche Proteinmaterial wurde gegen Wasser dialysiert und wasserunlösliches Material wurde gesammelt. Dieses Material wurde wiederum in GuHCl gelöst und unlösliches Material verworfen. Schließlich wurde GuHCl mit dem Proteinmaterial gegen 0,2 M Citratpuffer, pH 3,1, dialysiert.
Citratpuffer-unlösliches Material wurde gelfiltriert und Fraktionen, die knocheninduzierende Polypeptide, BMPs, enthielten, wurden vereinigt und unter Verwendung von präparativer SDS-PAGE fraktioniert. Die knocheninduzierenden Fraktionen wurden wieder vereinigt und unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC weiter fraktioniert. Als Ergebnis konnten drei unterscheidbare Polypeptide gewonnen werden (2).
Der biologische Test der knocheninduzierenden BMP-Eigenschaften der Fraktionen erfolgte in einem Maus-Muskeltaschen-Test, der die Fähigkeit der neuen Knochenbildung zeigte. Für Details über das Biotestverfahrens vgl. Beispiel 4.
Man fand zwei knocheninduzierende Polypeptidfraktionen mit BMP-Aktivität und diese Fraktionen, Fraktion I und III, wurden kombiniert, mit Wasser präzipitiert und zweimal in destilliertem Wasser gewaschen. Alternativ wurde dasselbe Verfahren mit Fraktion III allein durchgeführt. Schließlich wurde das Material mit sterilisiertem Wasser unter aseptischen Bedingungen gewaschen und bei –20°C gelagert.
Beispiel 2
Herstellung teilweise gereinigter knocheninduzierender Polypeptide mit BMP-Aktivität aus noch nicht ausgereiftem Elch (Alces alces)
Insgesamt 102 kg frischer langer Knochen von noch nicht ausgereiften Elch (Alces alces)-Kälbern wurde nicht später als einen Tag nach dem Tod der Tiere eingefroren. Die Epiphysen, das Peristeum und das Knochenmark wurden mechanisch entfernt. Nach dem Einfrieren in flüssigem Stickstoff wurde der gereinigte Kortikalknochen zersägt und in 0,5–1,0 mm³ große Teilchen gemahlen.
Pulverisierte Knochen wurden 72 Stunden in 0,6 Mol/l HCl demineralisiert und 96 Stunden in 4 Mol/l Guanidinium-HCl (GuHCl) ohne Entfettung oder Gelatinierung der demineralisierten Knochenmatrix extrahiert. Die GuHCl extrahierte Lösung wurde mittels eines 0,30 μm-Filters durch ein tangentiales Durchflusssystem filtriert und durch einen Filter mit einem Ausschlusspunkt von 10 kD ultrafiltriert (Minitan, Millipore, Maryland, USA).
Die den BMP-Komplex enthaltende, konzentrierte GuHCl-Lösung wurde 24 Stunden gegen Wasser dialysiert und das wasserunlösliche Material wurde erneut gegen sieben Volumina 0,25 Mol/l Citratpuffer, pH 3,1 dialysiert. Anschließend wurden am Ende des Prozesses insgesamt 5,85 g teilweise gereinigtes Elch-BMP aus dem Citratpuffer-unlöslichen Material nach der Lyophilisierung geerntet.
Der Ertrag der teilweise gereinigten Elch-BMP war 57,35 mg/kg frischer Knochen. Das hier verwendete Herstellungsverfahren war ein modifiziertes Verfahren, das früher von Jortikka, L. et al., Clin. Orthop. 1993; 297: 33–37 und Urist et al.; in Lindholm TS (Herausg.): New Trends in Bone Grafting. Acta Universitatis Tamperiensis, University of Tampere, 1992, Ser. B Bd. 40, S. 27–39, beschrieben wurde.
Beispiel 3
Charakterisierung von teilweise gereinigten knocheninduzierenden Polypeptiden mit BMP-Aktivität aus noch nicht ausgereiftem Elch
Um teilweise gereinigtes Elch-BMP zu charakterisieren, wurden 120 mg der lyophilisierten Zubereitung in 1 ml 6 Mol/l Harnstoff gelöst und unter Verwendung einer Sephacryl^® S-200-HPLC-Gelfiltrationssäule einer Chromatographie unterzogen. Das Chromatogramm ist in 1 dargestellt. Die eluierten Fraktionen wurden gesammelt und mit den Molekulargewichtsmarkern von Thyroglobulin, β-Amylase, Alkoholdehydrogenase, Ovalbumin, Carboanhydrase und Myoglobin verglichen. Die gesammelten Fraktionen wurde für die weitere Charakterisierung und für den Biotest getrennt lyophilisiert.
20 μg lyophilisierte Fraktionen I und III, von denen gezeigt wurde, dass sie eine knochen-induzierende Aktivität im Maus-Oberschenkelmuskel-Biotest besitzen (vgl. Beispiel 4 nachstehend), wurden mit Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt und auf ein 1-mm-Polyacrylamidgel zur isolelektrischen Fokussierung (pH-Bereich 3,5 bis 9,5) zur Bestimmung der isoelektrischen Punkte der Proteine aufgetragen. Ein isolelektrischer Fokussierungskalibrierungskit (Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) wurde als Standard verwendet. Das Gel wurde mit 0,005% Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Die isoelektrischen Punkte für die Fraktionen I und III, die die BMP-Aktivität im Maus-Oberschenkelmuskel-Biotest nachwiesen, lagen bei reduzierten Bedingungen in einem Bereich von 5,3 bis 5,6.
Beispiel 4
BMP-Biotest
Um teilweise gereinigtes BMP durch HPLC-Gelfiltration zu charakterisieren, wurden 0,5 mg BMP in 2,0 ml 4 M GuHCl gelöst und auf eine Sepharyl 200-HPLC-Chromatographiesäule (Pharmacia Diagnostics, Schweden) mit einer Länge von 300 mm aufgetragen. Die eluierten Fraktionen wurden automatisch gesammelt und mit den Standardproteinen bei einer Absorption bei 280 nm verglichen. Nach der Dispersion in N 0,5 Gelatinekapseln wurden 0,5, 1, 2, 5, 10, 15 mg des teilweise gereinigten BMP getrennt in Muskeltaschen in die Hinterläufe von BALB-Mäusen für den Biotest implantiert. 10 und 21 Tage nach der Implantation wurde die ektopische Knochenneubildung mittels Röntgenuntersuchung und Histologie beurteilt.
Biotests des teilweise gereinigten BMP wurden unmittelbar nach dem Extraktionsverfahren und nach weiteren 15 Monaten durchgeführt, als sowohl die Fraktionierung und Biotests für die Fraktionen I–III als auch die isoelektrische Fokussierung durchgeführt wurden.
Beispiel 5
Aufbewahrung von BMP
Das extrahierte und lyophilisierte Material wurde in trockenem Zustand in trockenen sterilen geschlossenen Glasröhrchen in einem Eksikkator bei +1°C aufbewahrt.
Beispiel 6
Die Herstellung der osteogenen Vorrichtung
Durchdringung von BMP mit Kollagen
Wasserlösliches, gereinigtes BMP wurde hergestellt, wie vorstehend beschrieben. Im Handel erhältliches Typ-IV-Kollagen (Sigma Corp. NR. C 5533 aus der Basalmembran der menschlichen Plazenta) oder Atelopeptid Typ-I-Kollagen (Nitta Gelatin Inc. Osaka, Japan) und Lyostypt^R (B. Braun Melsungen AG, Deutschland) sind die Kollagen-Alternativen für den Einsatz beim Menschen.
Wasserlösliches, gereinigtes BMP und Kollagen werden bei Raumtemperatur in NaCl gelöst und das Gemisch wird 12 Stunden bei 4°C inkubiert, so dass BMP vollständig an Kollagen binden kann.
Beispiel 7
Die Herstellung der osteogenen Vorrichtung
Adsorption von BMP durchdrungenem Kollagen an einen Träger
Als poröses Substrat oder Träger sind für den Einsatz beim Menschen zugelassene Biokeramiken erforderlich. Alternativ kann demineralisierter menschlicher Kortikalknochen verwendet werden. Falls menschliches Knochenmaterial verwendet wird, muss es vom Knochenbank-System in der Orthopädie- und Traumatologie-Abteilung, University Hospital of Tampere, Finnland, getestet und zugelassen werden. In derartigen Fällen wird die Demineralisierung von menschlichem Knochenmaterial mit 0,6 N HCl durchgeführt und die Weiterbearbeitung erfolgt nach den herkömmlichen in der Literatur beschriebenen Verfahren.
Unter den für den Einsatz beim Menschen zugelassenen Biokeramiken, wobei die Biokeramiken als Gerüste in den osteogenen Vorrichtungen verwendet werden, können folgende Materialien entweder als solche oder in geeigneten Kombinationen verwendet werden:

(1) Biocoral^® (Inoteb Corp. Saint Gonnery, Frankreich);
(2) Hydroxyapatit (Bioland Corp., Toulouse, Frankreich)
(3) Tricalciumphosphat (Skeleton Repair System, Norian Corp., CA. USA);
(4) Tricalciumphosphat (Howmedica, Warsaw, USA) und
(5) Bioaktives Glas

Bei der Adsorption des BMP durchdrungenen Kollagens an das poröse Substrat oder den Trägerblock verfährt man unter Verwendung folgender Schritte:

(1) Der Trägerblock wurde in ein Lösungsgemisch mit BMP durchdrungenem Kollagen in einen Behälter getaucht und bei 25–30°C in einem Vakuumofen gegeben, bis alle Luftblasen vom Substrat freigesetzt wurden. Der Behälter mit der BMP durchdrungenen Kollagenlösung, die ferner die eingetauchten Trägerböcke enthielt, wurde 6 Stunden bei 4°C aufbewahrt, um mehr BMP in dem porösen Substrat oder Träger einzufangen.
(2) Das Lösungsgemisch mit dem porösen Substratblock wurde in Dialyseschläuche gegossen (Ausschluss 12.000–14.000 Dalton) und sie wurden gegen 10 mM Glycinpuffer, pH 5,9, unter Rühren 24 Stunden bei 4°C dialysiert.
(3) Nachdem die Dialyse abgeschlossen war, wurden die Blöcke aus der Dialyselösung entfernt und in ein Plastikmodell mit der passenden Form gegeben, das in verschiedenen Größen und Formen hergestellt wurde, um den Maßen der Trägerblöcke angepasst zu sein, und schließlich wurde die dialysierte Lösung zentrifugiert (3.200 UpM 20 min)
(4) Der Überstand der zentrifugierten Lösung, der kein BMP durchdrungenes Kollagen enthielt, wurde verworfen und dann wurden die einzelnen Trägerblöcke in dem Modell mit der passenden Form mit Aliquoten des resuspendierten Präzipitats beschichtet, das einige Reste oder Trümmer von BMP enthielt, das in den Zentrifugengefäßen durchdrungen vorlag.
(5) Die osteogenen Vorrichtungen in den Plastikmodellen mit der passenden. Form wurden lyophilisiert.

Die Dosierung von BMP und Kollagen in der hergestellten osteogenen Vorrichtung wurde als Mikrogramm pro Kubikzentimeter Träger berechnet. Sie entsprach 100 μg BMP und 500–1000 μg Kollagen/cm³ Träger.
Beispiel 8
Rekonstitution der zusammengesetzten Implantate
Die Tricalciumphosphatzylinder (B 247, DePuy, Warsaw, IL, USA) und die natürlichen Korallenstöcke (Biocoral^®, Inoteb, Corp., Saint Gonnery, Frankreich) waren im Handel erhältliche Biomaterialien, die eine architektonische Ähnlichkeit mit dem menschlichen Knochen aufweisen. Die Porosität von Tricalciumphosphat und natürlicher Koralle liegt im Bereich von 20 bis 50% und die Porengröße im Bereich von 150 bis 500 Microns mit angereicherten untereinander verbundenen Kanälen. Die Keramiken wurden zu Scheiben mit einem Durchmesser von 4 mm und einer Dicke von 2 mm verarbeitet. Typ IV-Kollagen (Sigma, St. Louis, MO, USA) wurde in 0,25 M HCl, enthaltend 0,5 M NaCl, gelöst, gegen Wasser dialysiert und zentrifugiert, um Unreinheiten zu entfernen.
Das teilweise gereinigte mBMP und das dialysierte Typ IV-Kollagen im Verhältnis 4 zu 1 wurden in 4 M GuHCl-Lösung erneut gelöst und über Nacht bei 20°C inkubiert. Dann wurden das Tricalciumphosphat und die natürlichen Korallenscheiben in die Lösungsgemische getaucht, die eine hohe bzw. niedrige Elch-BMP-Konzentration enthielten. Die Lösungen mit dem Dreifachgemisch wurden unter 24-stündigem Rühren gegen zehn Volumina 10 mM Glycinpuffer, pH 5,9, dialysiert. Die Lösungsgemische wurden bei 3.200 UpM zentrifugiert, nachdem Tricalciumphosphat und die natürlichen Korallenscheiben in einzelne kleine Röhrchen übertragen wurden. Das Aliquot des Präzipitats in den Zentrifugengefäßen wurde in kleine Röhrchen dispergiert, die Tricalciumphosphat oder natürliche Korallenscheiben enthielten. Die Röhrchen wurden einer 48-stündigen Lyophilisierung unterzogen.
Jede zusammengesetzte Zubereitung mit natürlicher Koralle-Kollagen-BMP und Tricalciumphosphat-Kollagen-BMP enthielt 8 mg Elch-BMP in der hochdosierten Gruppe und 4 mg BMP in der Niedrigdosierten.
Unter Verwendung desselben Verfahrens wurden Kombinationen von BMP, Tricalciumphosphat und natürlicher Koralle mit Typ IV-Kollagen (Kollagen-BMP, Tricalciumphosphat-Kollagen und natürliche Koralle-Kollagen) als Trägerkontrollen hergestellt. Elch-BMP, Tricalciumphosphat und natürliche Koralle allein wurden als Komponentenkontrollen verwendet. Vor der Implantation wurden alle Implantate Ethylenoxid zur Sterilisation ausgesetzt.
Beispiel 9
Sterilisation und Lagerung des osteogenen Gerätes
Zur Sterilisation des Gerätes stehen mehrere herkömmliche Verfahren zur Verfügung. Jedoch sind einige davon, z. B. Gamma-Bestrahlung, in einigen Ländern nicht zugelassen und die Sterilisation durch Hitze ist aufgrund der Denaturierung der Proteine nicht akzeptabel.
Folglich wird die osteogene Vorrichtung mit Ethylendioxidgas 2 Stunden in einem versiegelten Sterilisator sterilisiert und wird 2–3 Stunden bei Belüftung evaporisiert.
Beispiel 10
Herstellung von zusammengesetztem Knochenersatz für Schafe
Der Tricalciumphosphatzylinder war eine im Handel erhältliche Biokeramik, die eine Ähnlichkeit in der Architektur und chemische Ähnlichkeit mit dem menschlichen Knochen aufweist. Die geformten Zylinder hatten einen Durchmesser von 15 mm und eine Länge von 16 mm mit einen Pfropfen von 3 mm Länge an jedem Ende. In der Mitte wurde der Länge nach ein Loch mit einem Durchmesser von 4 mm gebohrt, um einen meduallären Kanal zu reproduzieren. Typ IV-Kollagen wurde in 0,25 M HCl-Lösung, enthaltend 0,5 M NaCl, gelöst und dialysiert, um Verunreinigungen zu entfernen. Das Knochen-morphogenetische Protein, das chemisch aus den frischen Tibiae und Femora von Schafen mit 4 M GuHCl in unserem Labor extrahiert wurde, wurde teilweise durch einen 0,65 μm-Filter durch ein tangentiales Durchflusssystem gereinigt, dialysiert und lyophilisiert.
Die minimale Dosierung des teilweise gereinigten Schaf-BMP, das, wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert wurde und die radiologisch nachweisbare ektopische Knochenbildung in Muskeltaschen von BALB-Mäusen induzierte, betrug 3 Wochen nach der Implantation 4,8 mg. Schaf-BMP in niedriger oder hoher Dosierung und gereinigtes Kollagen Typ IV wurden in 4 M GuHCl in einem Verhältnis 5 zu 1 gelöst und über Nacht bei 20°C inkubiert. Der Tricalciumphosphatzylinder wurde in die Gemischlösung getaucht und dann 24 Stunden gegen zehn Volumina 10 mM Glycinpuffer, pH 5,9, dialysiert. Die Zentrifugation des dialysierten Lösungsgemisches wurde durchgeführt, nachdem der Tricalciumphosphatzylinder in eine Plastikform mit der passenden Form übertragen wurde.
Mit dem Präzipitat, das den Rest des Schaf-BMP im Zentrifugenröhrchen enthielt, wurde die Oberfläche des entsprechenden Tricalciumphosphatzylinders in der Form beschichtet. Nach der Lyophilisierung enthielt jeder zusammengesetzter Knochenersatz 13 mg Schaf-BMP in der niedrigdosierten zusammengesetzten Knochenersatz (ZKEN)-Gruppe und 100 mg Schaf-BMP in der hochdosierten zusammengesetzten Knochenersatz (ZKEH)-Gruppe. Die Tricalciumphosphatzylinder, die mit einer entsprechenden Dosis von Typ IV-Kollagen allein durchdrungen vorlagen, wurden durch dasselbe Verfahren als Kontrolle hergestellt. Alle hergestellten Implantate wurden vor der Implantation Ethylenoxid zur Sterilisation ausgesetzt.
Experiment 1
Die knocheninduzierende Aktivität von teilweise gereinigtem Elch-BMP und der Fraktionen I, II und III
Die knocheninduzierende Aktivität von teilweise gereinigtem Elch-BMP und der Fraktionen I, II und III aus der Sephacryl^® S-200-Gelfiltration (2) wurde in einem Biotest bei BALB-Mäusen im Alter von 28 bis 35 Tagen untersucht. Die Kapseln mit unterschiedlichen Dosierungen wurden getrennt in bilaterale Oberschenkelmuskeltaschen in die Mäuse implantiert.
Experiment 2
Die Ergebnisse der Knochenneubildung bei Mäusen unter Verwendung des modifizierten knocheninduzierenden BMP-Komplexes
Kurz nach der Extraktion des in Beispiel 2 erhaltenen Elch-BMP war die ektopische Knochenneubildung in Muskeltaschen radiographisch und histologisch bei einer Dosis von 2 mg BMP 21 Tage nach der Implantation nachweisbar. Da die Dosis des teilweise gereinigten Elch-BMP auf 5–10 mg erhöht wurde, war die Menge des neu gebildeten Knochens in der Radiographie nach 21 Tagen teilweise erhöht. Jedoch gab es keine weitere Zunahme des neu gebildeten Knochens mit 15 mg BMP. Die histologische Analyse zeigte, dass das neu gebildete Gewebe hauptsächlich ein Knöchelchen aus Geflechtknochen mit Knochenmark enthielt.
Als der Biotest nach 15 Monaten mit gereinigtem BMP wiederholt wurde, wurde nur eine kleine Menge an ektopischem verkalktem Gewebe im Vergleich zu den ersten Biotests in der Radiographie nachgewiesen und dann war 21 Tage nach der Implantation die Menge und die Dichte des verkalkten Gewebes im Vergleich zu demjenigen mit entsprechenden Dosen nach 10 Tagen deutlich reduziert. Die histologische Analyse zeigte nach 10 Tagen einen Flecken mit Knorpel und 21 Tage nach der Implantation eine kleine Insel mit Geflechtknochen. Nach 21 Tagen wurden mehr Entzündungszellen um den neu gebildeten Knochen beobachtet als nach 10 Tagen.
Der Ertrag nach der Gelfiltration bestand aus drei Proteinfraktionen mit verschiedenen Molekulargewichten (1). Fraktion I, II und III wurden mit den Molekulargewichten 700–100, 55–25 bzw. 25–15 kD definiert. Die isoelektrischen Punkte von Fraktion I und III, die BMP-Aktivität in dem Mausoberschenkel-Biotest zeigten, lagen in reduziertem Zustand in einem Bereich von 5,3 bis 5,6. Drei verschiedene Proteinbande konnten zwischen diesem pI-Bereich in beiden Fraktionen mit BMP-Aktivität unterschieden werden. Die beiden knocheninduzierenden Fraktionen des Elch-BMP waren saure Proteine nach einer Einschritt-Fraktionierung.
Die radiographisch sichtbare ektopische Knochenbildung wurde in diesem Experiment durch 4,5 mg BMP-Fraktion I und 5,5 mg Fraktion III induziert. Die Menge und Dichte des ektopischen Knochens, der durch dieselbe Dosis von Fraktion I und III induziert wurde, waren nach 21 Tagen in der Radiographie größer als nach 10 Tagen, im Gegensatz zum teilweise gereinigten BMP 15 Monate nach der Extraktion.
Histologisch gesehen induzierten die BMP-Fraktionen I und III vollkommen entwickelte Knorpel in 10 Tagen und man konnte eine anfängliche Transformation des Knorpels in Geflechtknochen sehen. Ein vollständiges Knöchelchen mit normalem Knochenmarkgewebe entwickelte sich in 21 Tagen. Nach der Implantation wurde bei Fraktion I eine stärker fortgeschrittenere Remodellierung von neu gebildetem Knöchelchen als bei Fraktion III in 21 Tagen beobachtet. Bei den Fraktionen I und III gab es sowohl nach 10 als auch nach 21 Tagen im Gegensatz zum teilweise gereinigten Elch-BMP oder der Fraktion II fast keine Infiltration inflammatorischer Zellen.
Fraktion II initiierte einen radiographisch sichtbaren Flecken mit ektopischer Verkalkung in 10 Tagen, aber dieser verringerte sich 21 Tage nach der Implantation. Die Mikroskopie der Proben zeigte, dass die Verkalkungen aus einem Flecken granulärer Kristallstruktursubstanz ohne Knochen- oder Knorpelarchitektur bestanden.
Große Mengen an inflammatorischen Zellen um die Kristalle herum verursachten eine starke Entzündungsreaktion. 21 Tage nach der Implantation wurde mikroskopisch keine Spur neuer Knochenbildung festgestellt. Im Vergleich zum teilweise gereinigten BMP-Komplex in identischen Dosen nach 15-monatiger Lagerung induzierten die Fraktionen I und III ektopisch mehr reifen neuen Knochen zu einem früheren Stadium und zur selben Zeit weniger Entzündungsreaktion.
Jedoch stimmte die knocheninduzierende Aktivität des teilweise gereinigten BMP gleich nach der Extraktion gut mit der Aktivität der Fraktionen I und III aus der Gelfiltration, durchgeführt nach 15 Monaten, überein.
Experiment 3
Das bei Mäusen bestimmte knocheninduzierende Potential von mit Elch-BMP und Typ IV-Kollagen durchdrungener natürlicher Koralle und Tricalciumphosphatkeramik
Unter Verwendung von teilweise gereinigtem Knochen-morphogenetischem Protein aus Elch, das durch das in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren erhalten wurde, und mit Typ IV-Kollagen imprägnierter natürlicher Koralle und Tricalciumphosphatkeramik wurde das knocheninduzierende Potential der Zusammensetzungen durch ⁴⁵Ca-Einbau in BALB-Mäusen bestimmt. Die zusammengesetzten Implantate wurden durch ein Kombinationsverfahren von Dialyse mit Beschichtung hergestellt.
132 BALB-Mäuse wurden in 12 Versuchsgruppen eingeteilt, abhängig von den unterschiedlichen Bestandteilen und der Dosis des Elch-BMP in der Zusammensetzung (vgl. Tabelle 1). Der ⁴⁵Ca-Einbau in die verschiedenen zusammengesetzten Zubereitungen war dem Kollagen-BMP und BMP allein beträchtlich überlegen (p < 0,01). Der höchste Peak des ⁴⁵Ca-Einbaus fand im natürlichen Korallen-Kollagen mit 8 mg mBMP am 10. Tag statt. Er war signifikant höher als im Tricalciumphosphat-Kollagen mit 8 mg Elch-BMP, Kollagen-BMP und BMP allein.
Tabelle 1 Einteilung der Versuchsmäuse und der implantierten Materialien in der Muskeltasche
Die ektopische Knochenneubildung wurde durch Radiographie (100 mA, 20 kV, 0,08 s/Exp;. Mamex de Maq, Soredex Orion Corporation Ltd.) und histologische Schnitte beurteilt, die 10 und 21 Tage mit Hämatoxylin-Eosin und Azur II nach der Implantation gefärbt wurden.
Der Unterschied manifestierte sich auch zwischen den gepaarten zusammengesetzten Implantaten mit identischen Bestandteilen, die sowohl am 10. als auch am 20. Tag mit 8 und 4 mg Elch-BMP beladen wurden (p < 0,01). Die zusammengesetzten Träger, natürliches Korallen-Kollagen und Tricalciumphosphat-Kollagen, regulierten das knocheninduzierende Potential von BMP hoch. Die natürliche Korallen-Kollagen-BMP-Zusammensetzung besitzt noch stärkere Osteoinduktivität als die Tricalciumphosphat-Kollagen-BMP-Zusammensetzung. Die multiporöse Architektur, die gegebene Geometrie und unterschiedliche chemische Eigenschaften der Keramiken in Verbindung mit den biologischen Modulationen von Typ IV-Kollagen gegenüber BMP erhöht wahrscheinlich die lokale Wirkung von BMP auf induzierbare Zellen.
Experiment 4
Implantation und analytische Verfahren
132 BALB-Mäuse im Alter von 28–32 Tagen wurden in 12 Versuchsgruppen eingeteilt. Unabhängige Variablen schlossen das Vorliegen der zusammengesetzten Implantate oder Träger allein, Elch-BMP mit oder ohne Kollagen und natürliche Koralle oder Tricalciumphosphat allein ein. Die Implantation erfolgte bilateral in Muskeltaschen im Hinterlauf der Maus. Die Gruppierung der Tiere und die implantierten Materialien sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Beobachtungszeit betrug 10 und 20 Tage.
Tabelle 2 ⁴⁵Ca-Einbau in Implantate und die ektopische Knochenneubildung auf Röntgenfilmen
24 Stunden bevor sie getötet wurde, wurde jeder Maus eine intraperitoneale Injektion von verdünnter trägerfreier ⁴⁵Calcium-Lösung (Amersham, England) in 4 μCi/kg Körpergewicht verabreicht. Die präparierten Hinterläufe mit Implantaten wurden durch Mammographie (100 mA, 20 KV, 0,06 Sek.) vor der Probennahme geröntgt. Das Gewebe einschließlich Implantat und neu gebildetem Knochen wurde en bloc als Probe genommen.
Ein Stück des Muskels und des Femurs im Hinterlauf wurde als Referenz für den ⁴⁵Ca-Einbau in unterschiedlichen Geweben genommen, die aus demselben Tier stammten. Alle Proben wurden gewogen und in einem Gemisch von 0,2 ml 70%-iger Perchlorsäure und 0,4 ml 33%-igem Peroxid 3 Stunden bei 70°C verdaut (Mahin et al., Anal. Biochem. 16, 500–509, 1966). Dann wurden 0,6 ml der Verdaulösung in ein Diffusionsszintillationsgefäß pipettiert und 5 ml Szintillationscocktail (OptiPhase'Hi-Safe 3', Wallac, England) zugegeben.
Homogene Proben wurden in einem Flüssigkeitsszintillationszähler (Wallac 1410, Pharmacia, Finnland) mit einer internen Spektralbibliothek gezählt. Der ⁴⁵Ca-Einbau in neu gebildeten Knochen, Muskel und Femur wurde jeweils durch OpM/mg Gewebe bestimmt. In jeder Gruppe wurde ein Probenpaar erhalten, mit 70% kühlendem Ethanol fixiert und in Methylmetacrylat (MMA) eingebettet. Ein nicht demineralisierter Schnitt mit einer Dicke von 10 μm wurde unter Verwendung eines Schneide-Mahl-Verfahrens (Exakt-Apparatebau, Hamburg, Deutschland) gemacht und mit Toluidinblau für die lichtmikroskopische Analyse gefärbt. Für die statistische Analyse wurden der GLM-ANOVA und der Scheffe-Test verwendet. Ein signifikanter Unterschied wurde in dem Bereich von p < 0,01 definiert.
Experiment 5
Ergebnisse
Charakterisierung und Bioaktivität des Elch-BMP
Die HPLC-Chromatographie wies nach, dass die teilweise gereinigte mBMP-Zubereitung ein Multimer mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 11–700 kD war. Die dominanten Bestandteile umfassten Polypeptidfraktionen mit niedrigem Molekulargewicht von 11 bis 40 kD im Spektrum (2). Die ektopische knocheninduzierende Kapazität des Elch-BMP wurde radiographisch und histologisch 10 und 21 Tage nach der Implantation bestätigt. Knochenneubildung in der Muskeltasche war radiologisch bei einer so niedrigen Dosis von 2,0 mg von teilweise gereinigtem Elch-BMP nachweisbar. Als die Dosis von 0,5 auf 15 mg an stieg, war die Menge des neu gebildeten Knochens deutlich erhöht. Die histologische Analyse zeigte, dass neu gebildeter Knochen hauptsächlich aus normalem hypertrophem Knorpel und Geflechtknochen mit Markgewebe bestand.
Experiment 6
⁴⁵Ca-Einbau
Der ⁴⁵Ca-Einbau in die verschiedenen Testgruppen mit zusammengesetzten Implantaten war den Kontrollen des Kollagen-BMP, BMP, natürlichen Koralle-Kollagens, Tricalciumphosphat-Kollagens, der natürlichen Koralle und des Tricalciumphosphats allein bemerkenswert überlegen. Der höchste Peak des ⁴⁵Ca-Einbaus trat in der natürlichen Koralle-Kollagen-BMP-Zusammensetzung mit hochdosiertem Elch-BMP (28,06 ± 2,83 OpM/mg/Gewebe) am 10. Tag auf. Er war signifikant höher als bei der Tricalciumphosphat-Kollagen-BMP-Zusammensetzung (19,45 ± 3,05 OpM/mg/Gewebe), beim Kollagen-BMP bzw. beim BMP (6,09 ± 0,43 und 5,6 ± 0,24 OpM/mg/Gewebe) mit einer hohen Dosis BMP am 10. Tag.
Der gleiche Trend wurde in den Gruppen mit dem hochdosierten Elch-BMP am 20. Tag und beim niedrigdosierten Elch-BMP sowohl am 10. als auch am 20. Tag beobachtet. Im Vergleich zu den entsprechenden Gruppen am 10. Tag wurde ein signifikant niedrigerer Einbau von ⁴⁵Ca im zusammengesetzten Implantat, Kollagen-BMP und den BMP-Gruppen am 20. Tag festgestellt. Die Unterscheide wurden auch zwischen den gepaarten zusammengesetzten Implantaten bei identischen Komponenten bei hochdosiertem und niedrigdosiertem BMP zu den gleichen Beobachtungszeiten (p < 0,01) gezeigt. Der ⁴⁵Ca-Einbau in verschiedene Keramikkontrollen lag mehr oder weniger nahe am Spiegel des Muskels.
Jedoch wurde ein höherer ⁴⁵Ca-Einbau in der natürlichen Koralle mit oder ohne Kollagen als in Tricalciumphosphat mit oder ohne Kollagen am 10. Tag im Vergleich zum 20. Tag beobachtet (3).
Es gab keinen signifikanten Unterschied beim ⁴⁵Ca-Einbau in den Muskeln oder die Femora zwischen Elch-BMP implantierten und nicht implantierten Mäusen und zwischen dem 10. und 20. Tag. Die Implantation von Elch-BMP in eine lokale Muskeltasche beeinflusste offensichtlich nicht den systemischen Calcium-Stoffwechsel.
Experiment 7
Radiologische und histologische Bewertung
In Übereinstimmung mit den Ergebnissen des ⁴⁵Ca-Tracers wurde am 10. Tag und 20. Tag nach der Implantation die sichtbare ektopische Osteoinduktion radiologisch in zusammengesetzten Implantaten, Kollagen-BMP und BMP-Gruppen gezeigt, aber nicht in allen keramischen Kontrollen mit oder ohne Kollagen. Neu gebildeter Knochen umgab und begrenzte die Keramikscheiben, die einen starken Kontrast gegen den Schatten des Muskels auf dem Röntgenfilm zeigten. 20 Tage nach der Implantation waren die Menge und Dichte des neu gebildeten Knochens im Vergleich zu demjenigen in den entsprechenden Gruppen nach 10 Tagen deutlich reduziert. Die knocheninduzierende Raten in verschiedenen Gruppen und zu verschiedenen Zeiten sind in Tabelle 2 dargestellt. Die histologische Analyse zeigte, dass der neugebildete Knochen hauptsächlich Flecken mit normalen Geflechtknochen und Knorpel umfasste, die eher in 10 Tagen als in 20 Tagen gebildet wurden. Einige Geflechtknochen und Knorpel waren fragmentiert und 20 Tage nach der Implantation infiltrierten viele Karyocyten in die Bereiche. Es wurde keine Knochenbildung und Proliferation von fibrösem Gewebe ohne offensichtliche Karyocyten-Infiltration in den BMP-freien Kontrollen beobachtet.
Experiment 8
Knocheninduktion und Heilung beim Schaf
Die diaphysären Segmentdefekte der Tibia in 18 Schafen wurden verwendet, um das Potential der Knocheninduktion und Heilung durch einen zusammengesetzten Knochenersatz zu beurteilen, der Tricalciumphosphatzylinder umfasste, die mit natürlich auftretendem Schaf-BMP und Typ IV-Kollagen durchdrungen wurden. Der zusammengesetzte Knochenersatz wurde mit einer niedrigen Dosis von 13 mg bzw. hohen Dosis von 100 mg Schaf-BMP beladen. Die nur mit Typ IV-Kollagen durchdrungenen Tricalciumphosphatzylinder wurden als Kontrolle verwendet. Gemäß der dosisabhängigen Knocheninduktion von Schaf-BMP wurde eine signifikant größere Fläche und eine stärker integrierte Intensität des neu gebildeten externen Kallus zwischen dem hochdosierten zusammengesetzten Knochenersatz und dem niedrigdosierten zusammengesetzten Knochenersatz oder den Tricalciumphosphatzylindern unter Verwendung eines computergestützten Bildanalysegerätes sowohl nach 3 als auch nach 6 Wochen quantifiziert. Der Torsionstest zeigte, dass nach 16 Wochen die maximale Drehmoment kapazität, die maximale Winkeldeformation, die Energieabsorption und Knochensteifheit der geheilten osteotomiserten Tibia mit Implantaten 49–80% in Tricalciumphosphatzylindern, 72–109% im niedrigdosierten zusammengesetzten Knochenersatz und 117–175% im hochdosiertem Knochenersatz im Vergleich zur entsprechenden contralateralen Tibia erreichten. Eine signifikant erhöhte Knochensteifheit lag in einem hochdosierten zusammengesetzten Knochenersatz im Vergleich zum niedrigdosierten zusammengesetzten Knochenersatz vor. Versehen mit der Osteoinduktivität, Osteokonduktivität und mechanischen Festigkeit ist der in dieser Studie definierte zusammengesetzte Knochenersatz besser für die klinische Anwendung zugänglich.
Experiment 9
Chirurgische Verfahren
Es wurde ein Modell mit einem Segmentdefekt der Tiba verwendet, um die Knochenheilung in 18 erwachsenen Schafen, 14 weiblichen und 4 männlichen mit einem Durchschnittskörpergewicht von 44,11 ± 6,35 kg zu beurteilen. Sie wurden 4–7 Tage vor dem chirurgischen Eingriff in Schafhürden gehalten.
Die Anästhesie wurde durch Propolol (2 mg/kg) induziert und durch 2–2,5% Halothan in Sauerstoff in einem halbgeschlossenen Ventilationssystem nach Inkubation aufrechterhalten. Unter sterilen Bedingungen wurde die rechte Tibia durch einen medialen Ansatz exponiert. Die proximalen und distalen Schraublöcher der Platte wurden vorgebohrt und vor der Resektion des Mittelschaftes mit einem Gewinde versehen. Auf 16 mm Länge standardisierte unilaterale Segmentdefekte wurden mit einer Gigli-Säge subperiosteal erzeugt. Nach gründlichem Spülen des Operationsfeldes wurden die Defekte durch 6 niedrigdosierte zusammengesetzte Knochenersatz- bzw. 6 Tricalciumphosphatzylinder-Implantate ersetzt. Das Implantat wurde im Defekt durch Pfropfen an jedem Ende fest gesichert und in den medullären Kanal eingesetzt. Die osteotomisierte Tibia wurde durch zwei überlappende in der Form angepasste Autokompressionsplatten mit einer Dicke von 4 mm sowie 8 bzw. 6 Löchern und kortikalen Schrauben auf der medialen Seite der Tibia befestigt. Die Muskeln und die Haut wurden in Schichten geschlossen. Jedem Schaf wurde eine Stunde vor der Operation intravenös eine Dosis Benzylpenicillin (66.000 I. U.) und pro Tag an 4 aufeinander folgenden postoperativen Tagen intramuskulär Procainpenicillin (36.000 I. U.) verabreicht, um die Schafe vor einer Infektion zu schützen. Man ließ die Tiere unmittelbar nach dem chirurgischen Eingriff ohne Einschränkung laufen.
Experiment 10
Bildquantifizierung
3, 6, 12 und 16 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff wurden aufeinander folgende cranio-caudale und lateromediale Röntgenbilder der osteotomisierten Tibia aufgenommen. Alle von der 3. bis 12. Woche erhaltenen Radiogramme wurde durch einen computergestützten optischen Dichtescanner von Bio Image System (6 XRS, Millipore Corporation, USA) abgetastet, der mit einer Sunspark Station EIPX verbunden war, und mit einer 2D-Systemsoftware analysiert, um die quantitativen Änderungen in der Fläche zu verfolgen, und die integrierte Intensität, die mit den craniocaudalen und lateromedialen Bildern jeder Probe in Verbindung stand, wurde auf ein Viertel der Gesamtfläche bzw. der integrierten Intensität des Kallus standardisiert.
Die Einheit wurde als mm² für die Fläche und optische Dichte für die integrierte Intensität definiert. Nach der Entfernung des weichen Gewebes und der Platten wurde die Schaf-Tibia einer Computertomographie (CT) bei aufeinander folgenden axialen Schnitten mit einem Abstand von 3 mm unterzogen, um die durchschnittliche Querschnittsfläche und Dichte des Kallus zu quantifizieren. Die Dichte wurde in Hunsfield-Einheiten (10) ausgedrückt.
Experiment 11
Mechanischer Test
Alle geernteten Tibiae von beiden Seiten wurden mit physiologischer Kochsalzlösung feucht gehalten, in Plastikbeuteln getrennt versiegelt und bei –20°C bis zum mechanischen Test eingefroren.
Der mechanische Test erfolgte unter Verwendung eines modifizierten Torsionstestgerätes (Lepola et al., Clin. Orthop. 297, 55–61, 1993). Es wurde ein konstante Winkelgeschwindigkeit von 6,5 Grad pro Sekunde nach der Studie von Strömberg et al. (Acta Orthop; Scand. 47, 257–263, 1976) voreingestellt. Das Gerät umfasst elektronische Schaltungen für das Auslösen einer Belastungsmessung und eine Drehmomentmessung. Das nicht rotierende Ende des Ge rätes war mit einem Drehmomentsensor ausgestattet, der auf Belastungsmessung basierte. Die maximale Beladungskapazität des Gerätes betrug 250 Nm. Der Gesamtmessfehler der Maschine lag unter 1%. Die Drehmomentbelastungskurven wurden von einem Plotter registriert.
Nach 4-stündigem Auftauen bei Raumtemperatur wurden beide Enden der Tibia gestutzt und in unsymmetrische runde Aluminiumformen unter Verwendung von Polyesterharz eingebettet. Die Orientierung der Form und die Knochenzentralisierung wurden mit einer speziell konzipierten Formstütze erhalten.
Der Torsionsarm wurde als 135 mm definiert. Die Proben wurden während der Vorbereitung und des Tests mit Salzlösung gesättigt. Der Torsionstest erfolgte durch Beladung bei einer Winkelgeschwindigkeit von 6,5 Grad pro Sekunde, bis die Tibia einen Bruchpunkt erreichte. Die contralaterale Tibia, bei der entsprechende Löcher gemacht wurden, wurde als gepaarte Kontrolle gegen die Ostetomisierte verwendet.
Der Prozentsatz der maximalen Drehmomentkapazität (MTK), des maximalen Deformationswinkels (MW), der Energieabsorption (EA) und Knochensteifheit (KS) in der osteotomisierten Tibia gegen die contralaterale wurde berechnet.
Nach dem Pilottest mit intakter Schafstibia waren die Standardfehler des Verfahrens wie folgt:
MTK 4,7%, MW 8,4%, KS 8,6% und EA 13,1%. Die Stellen der Bruchlinien wurden aufgezeichnet und zwischen der mit zusammengesetztem Knochenersatz implantierten Tibia und der mit Tricalciumphosphatzylindern Implantierten verglichen.
Experiment 12
Histologie
Nach dem mechanischen Test wurde der Probenblock einschließlich der implantierten Materialien diagonal in Stücke mit 0,4–2,0 mm Dicke unter Verwendung einer Diamantenbandsäge (Accutome 5, Struers Tech A/S, Kopenhagen, Dänemark) geschnitten, sofort in 10% neutralem Formalin fixiert und in Methylmetacrylat eingebettet. Ein nicht demineralisierter histologischer Schnitt mit einer Dicke von 12–20 μm wurde unter Verwendung eines Schneide- und Mahlverfahrens hergestellt und mit Van Gieson für die lichtmikroskopische Analyse gefärbt.
Experiment 13
Statistische Analyse und Ergebnisse
Für die statistische Analyse aller quantitativen Daten wurde das GLM-ANOVA-Varianzanalyse-Programm und der multiple Vergleichstest von Duncan verwendet. Die Signifikanz lag bei p < 0,05.
Während des Versuchszeitraums wurde ein Schaf aus der Tricalciumphosphat-Gruppe nach 5 Wochen aufgrund eines Splitterbruchs des distalen Stumpfes der osteotomisierten Tibia und Verlust der Immobilisierung ausgeschlossen. Ein Schaf mit einer niedrigen Dosis Schaf-BMP wurde aufgrund der Freilegung der Platten und Infektion der osteotomisierten Stelle nach 8 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff getötet. 16 Schafe beendeten die Studie nach 16 Wochen.
Experiment 14
Bildanalyse
Die sichtbare Kallus-Bildung um die Implantate herum wurde radiographisch in allen Gruppen 3 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff gezeigt. Das Ausmaß an gewachsenem Kallus erreichte das Maximum nach 6 Wochen und nahm dann von 12 bis 16 Wochen ab. Die Radiodichte des Kallus nahm allmählich im Zeitraum von 3 bis 16 Wochen zu. Auf die umgebenden osteotomisierten Stellen wurde mit Ausnahme der Stelle unter der Platte neuer Knochen aufgelagert. Um den zusammengesetzten Knochenersatz herum wurde neu gebildeter überbrückender Kallus lokal aufgetürmt und nicht wie bei der Tricalciumphosphatzylinder-Gruppe longitudinal unter dem Periosteum verteilt.
Die computergestützte Bildanalyse zeigte, dass im Zeitraum von 3 bis 12 Wochen nach der Implantation die Fläche und die integrierte Intensität des überbrückenden Kallus im mit 100 mg Schaf-BMP überbeladenen, zusammengesetzten Knochenersatz viel höher waren als im zusammengesetztem Knochenersatz mit 13 mg Schaf-BMP oder in den Tricalciumphosphatzylindern. Bei verschiedenen Wochen wurden signifikante Unterschiede in der Fläche und der integrierten Intensität des Kallus zwischen den drei Gruppen festgestellt.
Am Ende des Experiments wurde eine gute Osteointegration zwischen dem neu gebildeten Kallus und den Implantaten in den Querschnitten des Computertomographie (CT)-Scans beobachtet. Es gab keine offensichtliche Abgrenzung zwischen den Implantaten und dem überbrückenden Kallus. In Übereinstimmung mit der computergestützten Bildanalyse war nach 16 Wochen die Diskrepanz bei der Durchschnittsdichte des Kallus in axialen aufeinander folgenden Abschnitten des CT-Scans zwischen verschiedenen Gruppen signifikant. Jedoch wurde kein gleichzeitiger signifikanter Unterschied bei der Kallusfläche zwischen den verschiedenen Gruppen gezeigt (Tabelle 3).
Der Bioabbau der Tricalciumphosphatzylinder wurde radiographisch und tomographisch beim CT-Abtasten beobachtet. Die Tricalciumphosphatzylinder-Resorption trat in der Umgebung und entlang der inneren Wand des zentralen Lochs des Zylinders ab der 6. Woche nach der Implantation auf. Einige der Tricalciumphosphatzylinder fragmentierten und einige blieben bis zum Ende des Experiments intakt. In der zusammengesetzten Knochenersatz-Gruppe schien mehr Abbau der Tricalciumphosphatzylinder als in der Tricalciumphosphat-Kollagen-Gruppe aufzutreten.
Tabelle 3 Die durchschnittliche Durchschnittsfläche und die Dichte des Kallus auf dem CT-Abtast-Film 16 Wochen nach der Implantation
Experiment 15
Mechanischer Test
Die Daten zum Torsionstest sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Die maximale Drehmomentkapazität, die maximale Winkeldeformation bei nicht bestandenem Test, die Energieabsorption und Knochensteifheit der osteotomisierten Tibia mit Implantaten erreichte nach 16 Wochen 49–80% in der Tricalciumphosphat-Kollagen-Gruppe, 72–109% in der niedrigdosierten zusammengesetzten Knochenersatz-Gruppe und 117–175% in der hoch-dosierten Knochenersatz-Gruppe im Vergleich zur entsprechenden contralateralen Tibia. Im Vergleich zur Tricalciumphosphat-Kollagen-Kontrolle sah man bei der niedrigdosierten zusammengesetzten Knochenersatz-Gruppe und in den hochdosierten zusammengesetzten Knochenersatz-Gruppen erhöhte mechanische Parameter.
In der hochdosierten zusammengesetzten Knochenersatz-Gruppe waren alle Parameter der geheilten Tibia sogar über der contralateralen mit sich deckenden Löchern. Die mittleren prozentualen Werte bei der Knochensteifheit zeigten einen signifikanten Unterschied des hochdosierten zusammengesetzten Knochenersatzes zum Tricalciumphosphat-Kollagen oder zum niedrigdosierten zusammengesetzten Knochenersatz, aber keinen signifikanten Unterschied zwischen Tricalciumphosphat-Kollagen und niedrigdosiertem zusammengesetztem Knochen ersatz beim Vergleich unter Verwendung von GLM-ANOVA und des multiplen Vergleichstests von Duncan.
Tabelle 4 Mechanische Testparameter bei Tibiasegmentdefekten beim Schaf, implantiert mit TCPZ, ZKEN und ZKEH nach 16 Wochen
Alle Proben bestanden den Test bei einem mit der eingestellten Torsionskraft übereinstimmenden Spiralfrakturmuster nicht. Die Frakturlinie durch die Implantat-Knochen-Kontakt-Grenzfläche trat in 2 von 5 Tricalciumphosphatzylindern, 2 von 5 niedrigdosierten zusammengesetzten Knochenersatzmitteln und 1 von 6 hochdosierten zusammengesetzten Knochenersatzmitteln auf.
Experiment 16
Histologie
In der inneren Pore, den untereinander verbundenen Kanälen und der Peripherie des Tricalciumphosphatzylinders, der mit Schaf-BMP beladen oder unbeladen war, konnte man eine Knochenneubildung sehen. Der gut remodellierte Lamellenknochen war morphologisch gesehen normal und nach 16 Wochen infiltrierten weder bei der zusammengesetzten Knochenersatz-Gruppe noch bei der Tricalciumphosphat-Kollagen-Gruppe inflammatorische Zellen um die Implantate herum. Noch weiter fortgeschrittener remodellierter neuer Knochen wurde im zusammengesetzten Knochenersatz gezeigt, der mit einem niedrigdosierten oder hochdosierten Schaf-BMP beladen war. Die Bereiche des remodellierten Knochens neben den zentralen Löchern in den Tricalciumphosphatzylindern schienen von normalen Knochenmarkszellen kolonisiert worden zu sein. Es gab kein dazwischen liegendes fibröses Gewebe an der Grenzfläche zwischen neu gebildetem Knochen und dem Tricalciumphosphatzylinder. In der Nähe des endoperiosteralen Kallus und des medullären Kanals im zusammengesetzten Knochenersatz war mehr Absorption und Auflösung der Tricalciumphosphatzylinder zu sehen als in der Tricalciumphosphat-Kollagen-Gruppe.
Abschließend lieferte der zusammengesetzte Knochenersatz mit Dreifachkomponenten die Vorteile der Osteoinduktion, Osteokonduktion und mechanischen Resistenz. Heutzutage bieten die Fortschritte bei der Biomaterialforschung bessere Möglichkeiten nach einem geeigneten Biomaterial als Skelett für zusammengesetzten Knochenersatz zu suchen. Die begrenzten Quellen und die Unreinheit des natürlich auftretenden BMP konnten durch die Herstellung von rekombinantem BMP umgangen werden. Mit der Entwicklung von Rekonstitutionsverfahren wird ein wünschenswerter zusammengesetzter Knochenersatz für den Menschen zur Verfügung stehen, um autogene oder allogene Transplantate zu ersetzen. Die wesentliche Relevanz in dieser experimentellen Studie war die Notwendigkeit und die Vorteile der Entwicklung eines synthetischen bioaktiven Knochenersatzes für die medizinische Praxis herauszustellen.
Experiment 17
Knocheninduktion und Heilung bei Menschen
Im März 1996 wird eine klinische Studie begonnen. In der klinischen Studie wird zusammengesetztes Material, das aus Biocoral^TM-Rinder-BMP und Tricalciumphosphat-Rinder-BMP besteht, zur Behandlung von Patienten mit Knochenfrakturen verwendet, die Heilungsschwierigkeiten zeigen. Die zusammengesetzten Materialien werden, wie vorstehend angegeben, hergestellt, und die durchzuführenden Test sind im Wesentlichen dieselben, wie vorstehend beschrieben.

Claims

Osteogene Vorrichtung, umfassend ein Knochen-morphogenetisches Protein (BMP), eine Kollagenkomponente, einen formbaren porösen Träger und fakulative Wachstumsfaktoren, dadurch gekennzeichnet, dass das BMP ein modifizierter Knochen-morphogenetisches Protein (BMP)-Komplex ist, umfassend ein partiell gereinigtes BMP, welches keine Proteinfraktion mit immunogenen und entzündlichen Eigenschaften besitzt, mit einem durch Gelfiltration bestimmten Molekulargewicht (MW) von 25 bis 55 kD, wobei dieser modifizierte BMP-Komplex im Wesentlichen aus einer Proteinfraktion mit knocheninduzierender BMP-Aktivität mit einem durch Gelfiltration bestimmten Molekulargewicht von 100 bis 700 kD und/oder einer Proteinfraktion mit knocheninduzierender BMP-Aktivität mit einem durch Gelfiltration bestimmten Molekulargewicht von 15 bis 25 kD besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der modifizierte BMP-Komplex im Wesentlichen aus einer Proteinfraktion mit knocheninduzierender BMP-Aktivität mit einem durch Gelfiltration bestimmten Molekulargewicht von 15 bis 25 kD besteht und wobei die Fraktion weiterhin durch eine verlängerte Lagerfähigkeit gekennzeichnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der modifizierte BMP-Komplex im Wesentlichen aus einer Proteinfraktion mit knocheninduzierender BMP-Aktivität mit einem durch Gelfiltration bestimmten Molekulargewicht von 100 bis 700 kD besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Kollagengemischen, Atelopeptidkollagenen, Typ IV-Kollagen und Typ I-Kollagen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kollagenkomponente Typ IV-Kollagen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der formbare poröse Träger ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Hydroxyapatit, Tricalciumphosphat, bioaktives Glas und natürliche Korallen, welche aus einem Korallenskelett stammen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der formbare poröse Träger eine natürliche Koralle ist, ausgewählt von einem Korallenskelett.
Verfahren zur Herstellung des modifizierten BMP-Komplexes für die osteogene Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der modifizierte BMP-Komplex erhältlich ist durch ein Verfahren umfassend die Schritte (a) Pulverisieren von demineralisiertem Knochenmaterial; (b) Extraktion des Knochenmaterials aus Schritt (a) mit Guanidiniumhydrochlorid (GuHCl); (c) Ausführen einer Filtration unter Verwendung eines tangentialen Durchflusssystems; (d) Ausführen einer Gelfiltration, bei der ein partiell gereinigter BMP-Komplex erhältlich ist, welcher drei Peaks aufweist, umfassend drei Proteinfraktionen, welche gekennzeichnet sind durch verschiedene Molekulargewichte, wobei Fraktion I ein Protein mit knocheninduzierender BMP-Aktivität und hohem Molekulargewicht (100 bis 700 kD) ist, Fraktion II ein immunogenes Protein ohne BMP-Aktivität und mit mittlerem Molekulargewicht (25 bis 55 kD) ist, und Fraktion III ein Protein mit knocheninduzierender BMP-Aktivität und niedrigem Molekulargewicht (15 bis 25 kD) ist; und (e) Entfernen einer Proteinfraktion mit immunogenen und entzündlichen Eigenschaften und mit einem durch Gelfiltration bestimmten Molekulargewicht von 25 bis 55 kD aus dem partiell gereinigten BMP.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass für die Reinigung mindestens eine Hochleistungschromotographie (HPLC)-Gelfiltration durchgeführt wird.
Verwendung des modifizierten BMP-Komplexes, wobei dieser modifizierte BMP-Komplex eine Proteinfraktion mit knocheninduzierender BMP-Aktivität und mit einem durch Gelfiltration bestimmten Molekulargewicht von 100 bis 700 kD und/oder eine Proteinfraktion mit knocheninduzieren der BMP-Aktivität mit einem durch Gelfiltration bestimmten Molekulargewicht von 15 bis 25 kD umfasst, zur Herstellung einer osteogenen Vorrichtung mit verbesserten knocheninduzierenden Eigenschaften, wobei die Verbesserung das Fehlen von immunogenen und entzündlichen Eigenschaften und eine verlängerte Lagerfähigkeit ist.