DE69633015T2

DE69633015T2 - Vorrichtung für Kapillarelektrophorese

Info

Publication number: DE69633015T2
Application number: DE69633015T
Authority: DE
Inventors: S. Edward YEUNG; Huan-Tsang Chang; N. Eliza FUNG; Qingbo Li; Xiandan Lu
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; Iowa State University Research Foundation ISURF
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; Iowa State University Research Foundation ISURF
Priority date: 1995-05-19
Filing date: 1996-05-16
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2016-05-17
Also published as: DE69638214D1; EP1835281A1; EP0830593B1; DE69638110D1; EP1760462A1; DE69638019D1; US5582705A; EP1109014B1; EP1837647A3; WO1996036872A1; EP1109014A2; EP1760462B1; EP1109014A3; EP2199784A3; EP2199784A2; EP2199784B1; EP1669752A1; DE69633015D1; EP1837647A2; US5695626A

Description

Der Einsatz der Kapillarelektrophorese (CE) hat die DNA-Sequenzierungsraten im Vergleich zur herkömmlichen Plattengelelektrophorese erheblich verbessert. Ein Teil dieser höheren Geschwindigkeit ist jedoch durch den Verlust der (für Plattengele typischen) Fähigkeit aufgezehrt worden, mehrere Spuren in einem Lauf verarbeiten zu können. Die Hochmultiplex-Kapillarelektrophorese, die Hunderte oder gar Tausende von parallelen Sequenzierungsläufen ermöglicht, stellt einen attraktiven Ansatz zur Überwindung der derzeitigen Durchsatzbeschränkungen vorhandener DNA-Sequenzierungssysteme dar.
Anregungs- und Detektionsgeometrie. Für die Arbeit mit parallelen Anordnungen in der Kapillarelektrophorese sind verschiedene Anregungs- und Detektionssysteme entwickelt worden. Die laserinduzierte Fluoreszenzdetektion (LIF) ist als Hauptverfahren bei der Automatisierung der DNA-Sequenzierung benutzt worden. Der auftreffende Laserstrahl und das gesammelte Fluoreszenzlicht sind im Allgemeinen senkrecht zueinander, um das Grundrauschen aufgrund von Lichtstreuung zu verringern. Die Säulenanregung und Detektion erfolgen im Allgemeinen von oberhalb der parallelen Anordnung durch transparente Fenster in den Kapillaren. Bei einem System werden zum Beispiel ein Strahlexpander und eine zylindrische Linse benutzt, um das Laserlicht auf eine dünne Linie zu verteilen, die die Achsen der Kapillaren schneidet, die in einem geriffelten Block befestigt sind, um das Übersprechen zu verringern (K. Ueno et al., Anal. Chem., 66, 1424 (1994)). Auch wenn mit diesem System eine niedrige Detektionsgrenze und eine gleichmäßige Verteilung der Anregungsintensitäten erreicht werden kann, muss wegen der Gaußschen Intensitätsverteilung eine im Verhältnis zur Breite der Anordnung lange Laserlinie verwendet werden. Dadurch wird die Hälfte des Laserlichts im Bereich der Anordnung aufgrund der längeren Laserlinie und des Vorhandenseins von Abstandsrillen verschwendet. Das Übersprechen ist zwar handhabbar, liegt aber immer noch im Bereich von 10% des beobachteten Signals.
Die Säulendetektion ist auch mittels laserinduzierter Axialstrahl-Fluoreszenzdetektion durchgeführt worden, indem Glasfasern in ein Ende jeder Trennkapillare eingesteckt wurden (J. A. Taylor et al., Anal. Chem., 65, 956 (1993)). Das Einbringen der Glasfasern in die Trennkapillaren beeinträchtigt jedoch den elektroosmotischen Fluss und erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Verunreinigung und Verstopfung. Außerdem ist die Detektionsgrenze höher.
Eine Art von Anregung an einem seitlichen Einlass bei einem System mit einer Kapillare ist ebenfalls beschrieben worden (R. N. Zare et al., US-Patent Nr. 4.675.300 (1987)). Bei diesem System wird eine Glasfaser benutzt, um kohärentes Licht zu einem lichtdurchlässigen Bereich einer Kapillare zu führen, und Fluoreszenz wird durch den lichtdurchlässigen Bereich mit einer zweiten Glasfaser detektiert, die senkrecht zu der ersten Glasfaser angeordnet ist. Nachteile dieses Verfahrens sind eine starke Verunreinigung durch Streulicht und eine geringere Kollimationseffizienz.
Eine höhere Laserleistung ist im Allgemeinen vorteilhaft zur Erzielung eines stärkeren Analytsignals. Fluorophore bleichen jedoch leicht aus, d. h. ihre fluoreszierenden Eigenschaften werden durch den Laserstrahl zerstört, selbst im Milliwatt-Bereich, was eine Erhöhung der Anregungsintensität sinnlos erscheinen lässt. Daher würde eine LIF-Geometrie, die trotz Verwendung eines Lasers mit niedriger Leistung (zum Beispiel unter 50 mW) hoch aufgelöste Analytsignale liefert, eine nötige Verbesserung des Stands der Technik darstellen.
Detektionsverfahren und -systeme. Die Hochmultiplex-Kapillarelektrophorese stellt hohe Anforderungen an das Detektionssystem. Bei einem Lösungsansatz wird zum Beispiel ein Zweifarben-Konfokalfluoreszenzscanner für 25 Kapillaren eingesetzt (X. C. Huang et al., Anal. Chem., 64, 967 (1992)). Ein Kreuztisch wird benutzt, um die Kapillarenanordnung über den optischen Bereich zu verfahren. Weil die Datenerfassung sequenziell und nicht wirklich parallel erfolgt, ist der Nutzen dieses Systems für Hunderte von Kapillaren begrenzt. Um mit der hohen Geschwindigkeit der Kapillarelektrophorese und der hohen Durchsatzleistung einer großen Kapillarenanordnung kompatibel zu sein, ist ein schneller, empfindlicher Bildfelddetektor erforderlich.
Seit einiger Zeit werden ladungsgekoppelte Bauelemente (CCD – charge-coupled devices) als zweidimensionale Bildfelddetektoren (n × m) eingesetzt, um eine schnelle DNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz zu ermöglichen. S. Takahashi et al. (Anal. Chem., 66, 1021 (1994)) benutzen zum Beispiel eine Mehrmantelströmungsvorrichtung und ein Vierfarbdetektionssystem. Zwei Laserstrahlen werden zu einem zusammengefasst, der die Strömungen in einer Anordnung von 20 Kapillaren in einer Linie zur Anregung kreuzt, und ein CCD-Element wird zur gleichzeitigen Detektion senkrecht zum Anregungsstrahl benutzt. Mit diesem System kann eine hervorragende Streulichtunterdrückung erzielt werden. Bei der Skalierung von 20 Kapillaren auf Hunderte oder Tausende von Kapillaren sind jedoch noch zahlreiche Schwierigkeiten zu lösen. Eine Fehlausrichtung der einzelnen Mantelströme, Turbulenzen in den Strömungswegen, fehlerhafte Anpassung der Laserstrahltaille über eine lange Strecke an die Kerndurchmesser, in denen die eluierten Fragmente enthalten sind, und die mögliche Notwendigkeit, zusätzlichen Platz zwischen den Kapillaren für den Mantelstrom vorzusehen, sind nur einige der Probleme in Zusammenhang mit einer Vergrößerung des technischen Maßstabs. Darüber hinaus stellen CCD-Detektoren hohe Anforderungen an ein System in Bezug auf Datenanalyse und -speicherung. CCD-Elemente lesen jeweils nur eine Reihe der Anordnung, und die Zeit für das Lesen einer bestimmten Reihe kann nicht beliebig als Reaktion auf die Menge an Informationen in dieser Reihe verlängert oder verkürzt werden. Ein zweidimensionales Bildfelddetektionssystem, das eine Adressierung für den direkten Zugriff und variable Belichtungszeiten erlaubt, würde die Anforderungen für Datenspeicherung und -analyse wesentlich verringern und gleichzeitig erhebliche Zeiteinsparungen ermöglichen.
Nucleotidbestimmung in DNA-Sequenzierungsexperimenten – „Base Calling ". Es ist unwahrscheinlich, dass die Kapillarelektrophorese jemals Migrations- oder Wanderungszeiten bieten wird, die über eine Gruppe von Kapillaren genügend reproduzierbar sind, um die Verarbeitung von vier Gruppen von Fragmenten (eine Gruppe von Fragmenten für jede Nucleotidbase A, T, C und G) aus einer einzigen DNA-Probe in einer DNA-Sequenzierungsanalyse in getrennten Kapillaren zu ermöglichen. Daher sind Verfahren entwickelt worden, um die vier Basen in einer einzigen Kapillare unterscheiden zu können. Das Einfarben-Vierintensitäten-Verfahren ist wegen der Schwierigkeiten bei der Steuerung der Polymerase und der Maximierung des Signal-Rausch-Verhältnisses am wenigsten wünschenswert (H. Swerdlow et al., Anal. Chem., 63, 2835–2841 (1991)). Das Zweifarben-Zweiintensitäten-Verfahren bietet die Vorteile eines einfacheren optischen Aufbaus, einer guten Lichtsammlung und eines unkomplizierten Algorithmus (R. A. Mathies et al., Anal. Chem., 64, 2149–2154 (1992); D. Chen et al., Nucl. Acids Res., 20, 4873–4880 (1992)). Wie das Einfarben-Vierintensitäten-Verfahren geht aber auch dieses Verfahren von einem gleichmäßigen Einbau der Markierung durch die Polymerase aus, was häufig eine falsche Annahme ist.
Die meistgebrauchte Technologie ist daher nach wie vor das ursprünglich von F. Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463–5467 (1977)) entwickelte Vierfarbverfahren. Für das „Base Calling" (Herauslesen der Basen) mit vier Farbstoffmarkierungen sind viele optische Anordnungen entwickelt worden (S. Carson et al., Anal. Chem., 65, 3219–3226 (1993); R. Tomisaki et al., Anal. Sci., 10, 817–820 (1994); A. E. Karger et al., Nucl. Acids Res., 19, 4955–4962 (1991)). Die vier Standardfarbstoffe (die Fluoresceinderivate FAM und JOE und die Rhodaminderivative ROX und TAMRA, erhältlich als die PRISM-Farbstoffe von der ABD Division von Perkin Elmer, Foster City, Kalifornien) unterscheiden sich in spektraler Hinsicht nicht, weder bei Anregung noch bei Emission. Die derzeit auf dem Markt erhältlichen Instrumente benutzen daher relativ schmale Interferenzfilter für die Emission und zwei Laserwellenlängen für die Anregung. Dennoch muss für das „Base Calling" eine komplizierte Reihe von Emissionsverhältnissen angewandt werden. Die Spektralbestimmung der Markierungen mit einem Monochromator bietet im Prinzip die beste Selektivität. Um jedoch ein Spektrum zu erhalten, muss man die gesamte Fluoreszenz über viele Pixel verteilen. Dies erhöht die Menge an erfassten Rohdaten und gleichzeitig die Erfassungszeit und den Aufwand für die Datenaufbereitung. Außerdem weisen Monochromatoren nicht die vorteilhaften Blendenzahlen im Vergleich zur Lichtstärke einfacher Filter auf.
Das von DuPont entwickelte so genannte Zweifarben-Sequenzierungsverfahren ist eigentlich ein Verfahren mit vier Markierungen (J. M. Prober et al., Science, 238, 336–341 (1987)). Das optische System ist unkompliziert, und der verhältnisbasierte „Base Calling"-Algorithmus ist relativ einfach. Die Emissionsbanden der vier Markierungen liegen jedoch sehr nahe beieinander. Auch wenn die Intensitätsverhältnisse (benutzt für das „Base Calling") relativ unabhängig von der Einbaugeschwindigkeit der Polymerasereaktion sind, können Spektralinterferenzen und ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis (geringe Durchlässigkeit der Bandpassfilter) zu mehrdeutigen Ergebnissen führen. Obwohl es bereits verschiedene bewährte „Base Calling"-Verfahren gibt, bleibt noch viel Raum für Verbesserungen im Hinblick auf Genauigkeit, Geschwindigkeit und Einfachheit.
Siebmedium. Eine weitere Steigerung der Sequenzierungsraten sollte durch Optimierung des Siebmediums möglich sein, dass auch als Trennmedium, Siebmatrix oder Trennmatrix bezeichnet wird. Vernetzte Polymere wie zum Beispiel Polyacrylamid sind wegen ihrer bekannten Eignung in Plattengelen für die Trennung von Proteinen und DNA als Matrizen für die Kapillargelelektrophorese (CGE) benutzt worden. Aufgrund der Instabilität im Zeitverlauf, der Nichtreproduzierbarkeit in den Polymerisationsverfahren und des empfindlichen Charakters des Mediums hält vernetztes Polyacrylamid bei der Kapillarelektrophorese Berichten zufolge nur einige Läufe und ist daher zur DNA-Sequenzierung im großen Stil nicht geeignet, vor allem nicht im Multiplexbetrieb (H. Swerdlow et al., Electrophoresis, 13, 475–483 (1992)). Daher sind alternative Siebmatrizen nötig.
Verschlungene Polymere mit niedriger bis mittlerer Viskosität sind benutzt worden, um einige der oben genannten Probleme zu überwinden. Im Gegensatz zu vernetzten Gelen sind sie leichter austauschbar und stabiler für den Einsatz bei höheren Temperaturen und höheren elektrischen Feldstärken. Lineares Polyacrylamid (0% C, das heißt der Anteil des Vernetzers bzw. Crosslinkers beträgt 0 Prozent) ist für die Größenklassierung von DNA oder Proteinen benutzt worden (D. N. Heiger et al., J. Chromatogr., 516, 33–48 (1990); M. C. Ruiz-Martinez et al., Anal. Chem., 65, 2851–2858 (1993). Darüber hinaus sind auch Methylcellulose (W. A. M. Crehan et al., J. Liq. Chromatogr., 15, 1063–1080 (1992)), Hydroxyalkylcellulose (S. Nathakarnkitkool et al., Electrophoresis, 13, 18–31 (1992)), Polyhydroxy- und Polyethylenglycol-Methacrylat (T. Zewert et al., Electrophoresis, 13, 817–824 (1993)) und Polyvinylalkohol (M. H. Kleemiss et al., Electrophoresis, 14, 515–522 (1993)) für DNA-Separationen eingesetzt worden.
Mehrere wichtige Probleme sind jedoch noch zu lösen, ehe verschlungene Polymere routinemäßig für die DNA-Sequenzierung im großen Maßstab benutzt werden können. Der Austausch der Siebmatrix nach jedem Lauf war nicht so einfach wie erwartet. Die hohen Drücke, die nach M. C. Ruiz-Martinez et al., Anal. Chem., 65, 2851–2858 (1993) für einen vollständigen Austausch der Matrix nötig sind (zum Beispiel 1,25 × 10³ Pounds per square inch (psi) bzw. 6,46 × 10⁵ Torr), können die Anwendung von ansonsten einfachen, automatisierten Verfahren zum Ausspülen einer großen Anzahl von Kapillaren in einer Anordnung ausschließen. Darüber hinaus ist das Herstellen der linearen Polyacrylamidpolymerlösungen schwierig zu steuern und zu reproduzieren. Der Polymerisationsprozess ist in hohem Maße abhängig von Sauerstoffgehalt, Temperatur, Zeit zum Abschluss der Gesamtreaktion, Reinheit der Reagenzien und Verunreinigungen. Während das Humangenomprojekt die industriellen Hersteller eines Tages vielleicht veranlassen wird, „Standard"-Polymermischungen herzustellen, werden derzeit nur eine 10%ige Lösung (M_n 700.000 bis 1.000.000) und ein festes Polyacrylamidprodukt (M_n 8.000.000) angeboten.
Ein getrenntes, aber zugehöriges Problem ist die Innenbeschichtung der Kapillarröhren. In der Regel werden die „Fused Silica"- oder Quarzkapillaren, die bei der DNA-Sequenzierung mittels Kapillarelektrophorese zum Einsatz kommen, mit einer anhaftenden Polyacrylamidschicht vorbehandelt. Der Grund für diese Beschichtung ist die Verringerung oder Beseitigung des elektroosmotischen Flusses (EOF), der in unbehandelten Fused-Silica-Kapillaren herrscht. Der elektroosmotische Fluss kann sogar zu einem Austreiben der Siebmatrix aus der Kapillare führen. Obwohl der elektroosmotische Fluss gering ist, bedeutet die Tatsache, dass er entgegen der Wanderungsrichtung der DNA-Fragmente wirkt, lange Separationszeiten. Weil die Nettobewegung durch (μ_DNA – μ_EOF) bestimmt wird, was den entsprechenden Mobilitätsunterschied (Δμ) darstellt, sind die großen Fragmente weit aus stärker betroffen als die kurzen Fragmente. Liegt ein elektroosmotischer Fluss vor, erschwert die Variabilität der Wanderungszeiten die Analyse von Proben mit größeren DNA-Fragmenten. Leider wird die zur Verringerung des elektroosmotischen Flusses vorgesehene Beschichtung im Gebrauch zunehmend abgebaut. Dies überrascht nicht, denn auch Polyacrylamid, wenn es als Siebmedium verwendet wird, wird im Laufe der Zeit durch Wechselwirkung mit den typischen Puffern für die DNA-Sequenzierung abgebaut. Es besteht ein klarer Bedarf an besseren Oberflächenbehandlungsverfahren, damit die Kapillarsäulen über viele Analyseläufe unversehrt bleiben.
Das Kapillarelektrophoresesystem nach der vorliegenden Erfindung ist von der Art, wie sie S. Takahashi et al. in einer Arbeit mit dem Titel „Multiple Sheath-Flow Gel Capillary-Array Electrophoresis for Multicolour Fluorescent DNA Detection" in Analytical Chemistry, Vol. 66, Nr. 7 (1. April 1994), Seiten 1021–1026, beschrieben hat, umfassend:
eine Kapillarenanordnung von koplanaren parallelen Kapillaren, wobei jede Kapillare eine einen Innenbereich definierende ringförmige Wand, ein Einlassende und ein Ausflussende aufweist;
eine Quelle kohärenten Lichts, dazu ausgelegt, einen Strahl kohärenten Lichts über die Kapillarenanordnung zu leiten; und
einen Bildfelddetektor mit einem mit der Kapillarenanordnung optisch verbundenen Pixelfeld.
Bei dem dort beschriebenen System ist ein Stück jeder Kapillare entfernt, und der Strahl kohärenten Lichts wird durch die Pufferlösung geschickt, die in dem durch das Entfernen dieser Stücke definierten offenen Teil der Kapillarenanordnung fließt.
Das Kapillarelektrophoresesystem nach der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass:
jede Kapillare einen ersten transparenten Bereich ihrer ringförmigen Wand aufweist, wodurch ein senkrecht zu den Kapillaren durch die Kapillarenanordnung verlaufender transparenter Weg definiert wird;
die Quelle kohärenten Lichts dazu ausgelegt ist, den Strahl kohärenten Lichts durch die ringförmigen Wände der Kapillaren entlang des transparenten Wegs durch die ersten transparenten Bereiche zu schicken;
jede Kapillare einen zweiten transparenten Bereich aufweist; und
der Bildfelddetektor mit dem inneren Bereich mindestens einer Kapillare über den zweiten transparenten Bereich ihrer ringförmigen Wand optisch verbunden ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Detektieren von fluoreszierenden Zielspezien in einer Probe mittels Kapillarelektrophorese bereit, das in Übereinstimmung mit dem von S. Takahashi et al. in der oben genannten Arbeit beschriebenen Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Aufstellen einer Kapillarenanordnung von koplanaren parallelen Kapillaren, die jeweils eine einen Innenbereich definierende ringförmige Wand, ein Einlassende und ein Ausflussende aufweisen;
(b) optisches Verbinden der Kapillarenanordnung mit dem ein Pixelfeld umfassenden Bildfelddetektor;
(c) Einführen einer eine fluoreszierende Zielspezie enthaltenden Probe in das Einlassende mindestens einer Kapillare, so dass die Probe durch die Kapillare dem Ausflussende entgegenwandert;
(d) Induzieren von Fluoreszenzemission von der Zielspezie mit einem Strahl kohärenten Lichts; und
(e) Detektieren der Fluoreszenzemission von der Zielspezie mittels des Bildfelddetektors.

Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass:
der Strahl kohärenten Lichts entlang eines durch die Kapillarenanordnung senkrecht zu den Kapillaren verlaufenden transparenten Wegs geschickt wird, der durch je weilige erste transparente Bereiche der ringförmigen Wände der Kapillaren definiert ist; und
die Fluoreszenzemission, die in der durch die mindestens eine Kapillare wandernden Zielspezie induziert wird, den Bildfelddetektor über einen zweiten transparenten Bereich der ringförmigen Wand der mindestens einen Kapillare erreicht.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Schemadiagramm einer Seiteneinlassanregungsgeometrie für ein Multiplex-Kapillarelektrophoresesystem.
2 zeigt einen um die gesamte Kapillare verlaufenden transparenten Bereich der ringförmigen Wand einer Kapillare.
3 zeigt das optische Verbinden eines transparenten Wegs mit einem Bereich außerhalb der Kapillarenanordnung.
4 zeigt das optische Verbinden der Pixel in einem Bildfelddetektor mit dem Innenbereich und den Seitenwände einer Kapillare in einer Anordnung von im Wesentlichen nebeneinander liegenden koplanaren parallelen Kapillaren mit einem Verhältnis von Pixeln zu Kapillaren von 2 : 1.
5 zeigt eine Draufsicht der in 4 gezeigten optischen Verbindungsanordnung mit einem Verhältnis von 2 : 1.
6 zeigt eine Draufsicht einer alternativen optischen Verbindungsanordnung, bei der das Verhältnis von Pixeln zu Kapillaren in der Anordnung von im Wesentlichen nebeneinander liegenden koplanaren parallelen Kapillaren 3 : 1 beträgt.
7 zeigt einen Querschnitt einer optischen Verbindungsanordnung mit einem Verhältnis von 2 : 1 mit einer zwischen den Pixeln und den Kapillaren, die optisch mit den Pixeln verbunden sind, angeordneten Bildgebungslinse.
8 zeigt eine Draufsicht einer alternativen optischen Verbindungsanordnung, bei der das Verhältnis von Pixeln zu Kapillaren in einer Anordnung von im Wesentlichen nebeneinander liegenden koplanaren Kapillaren kein ganzzahliges Verhältnis ist.
9 zeigt ein Schemadiagramm einer optischen Anordnung zum Aufteilen einer induzierten Fluoreszenzlinie in einer Gruppe von Kapillaren in zwei Emissionskanäle.
10 zeigt die Basenpaarauflösung von aufeinander folgenden DNA-Fragment-Peaks in verschiedenen Polymermatrizen.
11 zeigt eine grafische Darstellung eines Vergleichs der theoretischen Plattenanzahl aus der elektrophoretischen Trennung eines mit Ethidiumbromid eingefärbten pBR 322 DNA-Hae III-Verdaus.
12 zeigt die elektrophoretische Trennung der Mischung aus pBR 322 DNA-Hae III-, pBR 328 DNA-Bg1 I- und pBR 328 DNA-Hinf I-Verdauen.
13 zeigt die elektrophoretische Trennung von PGEM/U DNA-Fragmenten aus der DNA-Sequenzierungsreaktion nach Sanger ab Base 28 bis Base 108.
14 zeigt die elektrophoretische Trennung von PGEM/U DNA-Fragmenten aus der DNA-Sequenzierungsreaktion nach Sanger ab Base 420.
15 zeigt ein Schemadiagramm einer Druckinjektions-/Spülzelle für eine Kapillare.
16A zeigt die CID-Detektion von DNA-Fragmenten nach einer DNA-Sequenzierungsreaktion nach Sanger ohne Anwendung eines Belichtungszeitgradienten.
16B zeigt die CID-Detektion von DNA-Fragmenten nach einer DNA-Sequenzierungsreaktion nach Sanger mit einem Belichtungszeitgradienten.
17 ist ein Histogramm, das die Häufung der Peakhöhenverhältnisse für die vier Farbstoffmarkierungen bei einem DNA-Sequenzierungsexperiment nach Sanger zeigt.
18 zeigt eine Verhältniskurve (oben, dicke Linie), die für das „Base Calling" (das heißt die Bestimmung der Nucleotidsequenzen) bei einer DNA-Sequenzierungsanalyse benutzt wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung benutzt einen integrierten Ansatz zur Erzielung einer automatischen, schnellen, präzisen und preiswerten DNA-Sequenzierung mittels Kapillarelektrophorese und insbesondere Multiplex-Kapillarelektrophorese. Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff Multiplex-Kapillarelektrophorese auf Kapillarelektrophoresesysteme mit mindestens etwa 10 Kapillaren. Die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung sind besonders geeignet für die Verwendung in Kapillarelektrophoresesystemen mit mindestens etwa 100 Kapillaren, bis zu einigen Tausend und mehr Kapillaren. Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich auf die Verbesserung der Trennmatrizen, Weiterentwicklungen der Anregungs- und Detek tionsgeometrie, einen verbesserten zweidimensionalen Bildfelddetektor und neuartige Strategien für das „Base Calling" bzw. Herauslesen der Basen.
Bei der Kapillarelektrophorese wird eine mit Puffer gefüllte Kapillare zwischen zwei mit Puffer gefüllten Reservoiren angeordnet. An die beiden Enden der Kapillare wird ein elektrisches Feld angelegt. Das elektrische Potenzial, das das elektrische Feld erzeugt, liegt im Kilovolt-Bereich. Proben, die einen oder mehrere Komponenten oder Spezien enthalten, werden in der Regel an dem Ende mit hohem Potenzial und unter dem Einfluss des elektrischen Felds eingeführt. Alternativ kann die Probe mittels Druck oder Vakuum injiziert werden. Dieselbe Probe kann in viele Kapillaren eingeführt werden, oder es kann in jede Kapillare eine andere Probe eingeführt werden. In der Regel wird die Kapillarenanordnung in einer Führung gehalten, und die Einlassenden der Kapillaren werden in Phiolen eingetaucht, in denen die Proben enthalten sind. Nachdem die Proben mit den Kapillaren aufgenommen worden sind, werden die Enden der Kapillaren aus den Probenphiolen genommen und in einen Puffer eingetaucht, der in einem gemeinsamen Behälter oder in getrennten Phiolen enthalten sein kann. Die Proben wandern zu dem Ende mit niedrigem Potenzial. Während der Wanderung werden die Komponenten der Probe elektrophoretisch getrennt. Nach der Trennung werden die Komponenten mit einem Detektor erfasst. Das Detektieren kann erfolgen, wenn sich die Proben noch in den Kapillaren befinden oder nachdem sie diese verlassen haben.
Die Kanallänge für die Kapillarelektrophorese wird so gewählt, dass sie geeignet ist, um eine einwandfreie Trennung der Spezien zu erzielen. Im Allgemeinen gilt, je länger der Kanal ist, desto länger ist die Zeit, die eine Probe zur Wanderung durch die Kapillare benötigt. Daher können die Spezien mit größeren Abständen voneinander getrennt werden. Längere Kanäle tragen jedoch zu einer Verbreiterung der Banden bei und führen zu übermäßig langen Trennzeiten. Im Allgemeinen haben die Kapillaren für die Kapillarelektrophorese eine Länge von ca. 10 cm bis ca. 5 m und vorzugsweise von ca. 20 cm bis ca. 200 cm. Bei der Kapillargelelektrophorese, bei der meist eine Polymertrennmatrix benutzt wird, beträgt die bevorzugtere Kanallänge ca. 10 cm bis ca. 100 cm.
Der Innendurchmesser (das heißt die Kapillarweite) der Kapillaren ist nicht kritisch, obwohl Kapillaren mit geringerer Weite für Hochmultiplex-Anwendungen besser geeignet sind. Die Erfindung bezieht sich auf einen großen Bereich von Kapillarweiten. Im Allgemeinen können Kapillaren einen Innendurchmesser von ca. 5 bis 300 Mikrometer und vorzugsweise von ca. 20 bis 100 Mikrometer aufweisen. Die Länge der Ka pillaren kann im Allgemeinen zwischen ca. 100 bis 3.000 mm und vorzugsweise zwischen ca. 300 und 1.000 mm betragen.
Die Verwendung von durch maschinelle Bearbeitung hergestellten Kanälen anstelle von Kapillaren ist kürzlich beschrieben worden (R. A. Mathies et al., Abstract 133, DOE Human Genome Workshop IV, Santa Fe, New Mexico, 13. bis 17. November 1994; J. Balch et al., Abstract 134, DOE Human Genome Workshop IV, Santa Fe, New Mexico, 13. bis 17. November 1994). Bei konventioneller Technologie sind jedoch mehrere Kapillaren immer noch das besser entwickelte Format für Multiplex-Kapillarelektrophoreseanalysen. Die für Kapillaren entwickelten Technologien, beispielsweise die hier beschriebenen, lassen sich ohne weiteres auf durch maschinelle Bearbeitung hergestellte Kanäle übertragen, sobald diese Technologie sich weiter entwickelt.
Eine geeignete Kapillare besteht aus einem Werkstoff, der stabil und beständig ist, so dass er seine physikalische Integrität bei wiederholtem Gebrauch unter normalen Bedingungen für die Kapillarelektrophorese behält. Sie besteht in der Regel aus einem nicht leitenden Material, so dass hohe Spannungen an die Kapillare angelegt werden können, ohne zu einer übermäßigen Wärmeerzeugung zu führen. Anorganische Werkstoffe wie zum Beispiel Quarz, Glas, „Fused Silica" (Quarzglas) und organische Werkstoffe wie zum Beispiel Polytetrafluorethylen, fluorierte Ethylen-/Propylenpolymere, Polyfluorethylen, Aramid, Nylon (das heißt Polyamid), Polyvinylchlorid, Polyvinylfluorid, Polystyrol, Polyethylen und dergleichen können vorteilhaft zur Herstellung von Kapillaren benutzt werden.
Wenn das Anregen und/oder Detektieren durch die Kapillarwand erfolgen, besteht eine besonders vorteilhafte Kapillare aus einem transparenten Werkstoff, wie nachstehend ausführlich beschrieben. Eine transparente Kapillare, die im Wesentlichen keine Fluoreszenz aufweist, das heißt eine Fluoreszenz, die geringer als der Hintergrundpegel ist, wenn sie der Einwirkung von Licht zum Bestrahlen einer Zielspezie ausgesetzt ist, ist besonders in Situationen geeignet, in denen die Anregung durch die Kapillarwand erfolgt. Eine solche Kapillare ist von Polymicro Technologies (Phoenix, Arizona) erhältlich. Alternativ kann in der Wand einer ansonsten nicht transparenten oder fluoreszierenden Kapillare ein transparenter, nicht fluoreszierender Bereich ausgebildet werden, um das Anregen und/oder Detektieren durch die Kapillarwand zu ermöglichen. Fused-Silica-Kapillaren werden zum Beispiel im Allgemeinen mit einer Polyimidbeschichtung auf der Außenfläche der Kapillare geliefert, um deren Bruchfestigkeit zu verbessern. Diese Beschichtung emittiert bekanntlich eine breite Fluoreszenz, wenn sie Licht mit Wellenlängen unter 600 nm ausgesetzt ist. Wenn ein Anregungssystem durch die Wand benutzt wird, ohne zuerst diese Beschichtung zu entfernen, kann die Hintergrundfluoreszenz ein schwaches Analytsignal überdecken. Daher kann ein Teil der fluoreszierenden Polymerbeschichtung mit einem geeigneten Verfahren entfernt werden, zum Beispiel durch Kochen in Schwefelsäure, durch Oxidieren mit einer beheizten Sonde wie zum Beispiel einem unter Strom stehenden Draht oder durch Abkratzen mit einem Messer. Bei einer Kapillare mit einem Innendurchmesser von ca. 0,1 mm oder weniger hat ein geeigneter transparenter Bereich eine Breite von ca. 0,01 mm bis 1,0 mm.
Bei der Elektrophorese wird der Trennpuffer in der Regel so gewählt, dass er zum Lösen oder Suspendieren der in der Probe enthaltenen Spezien beiträgt. Im Allgemeinen ist die Flüssigkeit ein Elektrolyt, der sowohl anionische als auch kationische Spezien enthält. Vorzugsweise enthält der Elektrolyt ca. 0,005 bis 10 Mol pro Liter ionische Spezien, besser jedoch ca. 0,01 bis 0,5 Mol pro Liter. Beispiele für einen Elektrolyt für ein typisches Elektrophoresesystem sind unter anderem Mischungen von Wasser mit organischen Lösungsmitteln und Salzen. Repräsentative Materialien, die mit Wasser gemischt werden können, um geeignete Elektrolyte zu erhalten, sind unter anderem anorganische Salze wie zum Beispiel Phosphate, Bicarbonate und Borate, organische Säuren wie zum Beispiel Essigsäuren, Propionsäuren, Citronensäuren, Chloressigsäuren und deren entsprechende Salze und dergleichen, Alkylamine wie zum Beispiel Methylamine, Alkohole wie zum Beispiel Ethanol, Methanol und Propanol, Polyole wie zum Beispiel Alkandiole, stickstoffhaltige Lösungsmittel wie zum Beispiel Acetonitril, Pyridin und dergleichen, Ketone wie zum Beispiel Aceton und Methylethylketon und Alkylamide wie zum Beispiel Dimethylformamid, N-methyl- und N-ethylformamid und dergleichen. Die vorstehend genannten ionischen und Elektrolytspezien sind nur zur Illustration angegeben. Ein Fachmann kann aus den oben genannten Spezien und optionalen Spezien wie zum Beispiel Aminosäuren, Salzen, Alkalien usw. Elektrolyte formulieren, um geeignete Trägerelektrolyte für Kapillarelektrophoresesysteme herzustellen.
Die für die elektrophoretische Trennung benutzte Spannung ist für die Erfindung nicht kritisch und kann sehr stark variieren. Typische Spannungen betragen zwischen ca. 500 und 30.000 Volt, vorzugsweise ca. 1.000 bis 20.000 Volt.
Die elektrophoretische Trennung kann mit oder ohne eine Molekülmatrix (hier auch als Siebmatrix oder Siebmedium sowie als Trennmatrix oder Trennmedium bezeichnet) erfolgen, um die Trennung zu bewirken. Wird keine Matrix verwendet, wird das Verfahren allgemein als Kapillarzonenelektrophorese (CZE) bezeichnet. Wird eine Matrix eingesetzt, bezeichnet man das Verfahren meist als Kapillargelelektrophorese (CGE). Eine bevorzugte Trennmatrix nach der Erfindung für die Kapillargelelektrophorese ist eine lineare Polymerlösung wie zum Beispiel eine Poly(ethylenoxid)-Lösung. Andere Trennmatrizen, wie sie üblicherweise bei der Kapillarelektrophorese benutzt werden, zum Beispiel vernetztes Polyacrylamid, können ebenfalls in verschiedenen Aspekten der Erfindung benutzt werden. Geeignete Matrizen können die Form von Flüssigkeiten, Gelen oder Granulaten haben.
Die vorliegende Erfindung kann für die Trennung, Detektion und Messung der in Proben von biologischem, ökologischem oder chemischem Interesse enthaltenen Spezies eingesetzt werden. Von besonderem Interesse sind Makromoleküle wie zum Beispiel Proteine, Polypeptide, Saccharide und Polysaccharide, genetische Materialien wie zum Beispiel Nucleinsäuren, Polynucleotide, Kohlenhydrate, Zellmaterialien wie zum Beispiel Bakterien, Viren, Organellen, Zellfragmente, Metaboliten (Stoffwechselprodukte), Arzneimittel, Drogen und dergleichen sowie Kombination hiervon. Zu den Proteinen, die von Interesse sind, gehören die im Blutplasma vorhandenen Proteine wie unter anderem Albumin, Globulin, Fibrinogen, Blutgerinnungsfaktoren, Hormone und dergleichen. Andere interessierende Proteine, die mit Kapillarelektrophoresesystemen getrennt und detektiert werden können, sind Interferone, Enzyme, Wachstumsfaktoren und dergleichen. Zu den sonstigen Chemikalien, die mittels der vorliegenden Erfindung getrennt und detektiert werden können, gehören unter anderem Pharmazeutika wie zum Beispiel Antibiotika, aber auch Agrochemikalien wie zum Beispiel Insektizide und Herbizide.
Von besonderem Interesse ist die Gruppe der Makromoleküle, die mit dem genetischen Material von lebenden Organismen in Zusammenhang stehen. Hierzu gehören Nucleinsäuren und Oligonucleotide wie zum Beispiel RNA, DNA, deren Fragmente und Kombinationen, Chromosomen, Gene sowie deren Fragmente und Kombinationen. Die Erfindung eignet sich insbesondere für Anwendungen in der DNA-Diagnostik wie zum Beispiel DNA-Sequenzierung, DNA-Fragmentanalyse und DNA-Fingerprinting. Se quenzvariationen von der Größe nur einer Base oder Basenpaarunterschiede zwischen einer Probe und einer Kontrolle können detektiert werden.
Anregungs- und Detektionsgeometrie. Es ist wichtig, zu verstehen, dass das, was mit einzelnen Kapillaren gut funktioniert, sich eventuell nicht auf eine Multiplex-Kapillarenanordnung im großen Maßstab übertragen lässt. Ein Aspekt hierbei ist die normale Anregungs-/Emissionsgeometrie für die Kapillarelektrophorese auf der Grundlage der engen Bündelung des Laserstrahls und der effizienten Kollimation durch Verwendung von Mikroskopobjektiven mit großen numerischen Aperturen. Der Raleigh-Bereich des eng gebündelten Laserstrahls und das eingeschränkte Gesichtsfeld eines Mikroskopobjektivs können einfach nicht erweitert werden, um mehr als ein paar Kapillaren gleichzeitig zu beobachten.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Kapillarelektrophoresesystem „S" mit einer Seiteneinlassanregungsgeometrie bereit. Das System eignet sich besonders gut für die Fluoreszenzdetektion von fluoreszierenden Zielspezien in einer Probe, was im Folgenden beschrieben wird. 1 und 2 zeigen eine Ausführungsform der Erfindung. Kapillaren 1 sind in einer koplanaren parallelen Kapillarenanordnung 2 angeordnet. Vorzugsweise weist die Kapillarenanordnung 2 mindestens etwa 100 koplanare parallele Kapillaren 1 auf. Die ringförmige Wand 3 jeder Kapillare 1 weist einen ersten transparenten Bereich 4 auf. Der transparente Bereich 4 ist transparent für Licht mit einer Wellenlänge, die in etwa der Wellenlänge eines Strahls kohärenten Lichts entspricht, der zum Bestrahlen einer Zielspezie in einer Kapillare benutzt wird, wie nachstehend ausführlich beschrieben. Ein transparentes Medium ist eines, das Licht im Wesentlichen ohne zugehörige Lichtstreuung durchlässt. Vorzugsweise ist der transparente Bereich 4 transparent für Licht mit einer Wellenlänge von ca. 200 bis 1.500 nm, besser jedoch ca. 250 bis 800 nm. Bei einer bevorzugten Ausführungsform verläuft der transparente Bereich 4 vollständig um die Kapillare herum, wie in 1 gezeigt.
Zusammen definieren die transparenten Bereiche 4 der ringförmigen Wände 3 einen transparenten Weg 5, der senkrecht zu den Kapillaren 1 durch die Kapillarenanordnung 2 verläuft, wie in 2 gezeigt. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der transparente Weg eine durch die Kapillaren verlaufende Ebene auf, wie dies der Fall ist, wenn die Kapillaren vollständig aus einem transparenten Werkstoff hergestellt sind.
Vollständige Transparenz ist nicht entscheidend, denn es reicht aus, wenn jede ringförmige Wand 3 einen lichtdurchlässigen Bereich aufweist, der einen senkrecht zu den Kapillaren 1 durch die Anordnung 2 verlaufenden optischen Weg definiert. Ein lichtdurchlässiges Medium verursacht jedoch eine gewisse Lichtstreuung, wenn Licht hindurchgeleitet wird. Vollständige Transparenz ist der Durchlässigkeit wegen der höheren Lichtleistung und des geringeren Signal-Rausch-Verhältnisses beim Detektieren vorzusehen. Der Begriff „transparent", so wie er hier verwendet wird, ist daher breit auszulegen und nicht restriktiv zu verstehen.
Es ist viel einfacher, eine koplanare parallele Konfiguration aufrechtzuerhalten, wenn die Kapillaren 1 im Wesentlichen unmittelbar nebeneinander liegen und auf einer glatten Fläche befestigt sind, wie in 1 gezeigt, als wenn sie physikalisch voneinander getrennt sind. Der Ausdruck „im Wesentlichen unmittelbar nebeneinander liegen", so wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass die koplanaren parallelen Kapillaren in der Anordnung dicht gepackt sind, so dass sie entlang ihrer parallelen Längen im Wesentlichen dicht beieinander liegen und im Wesentlichen keinen Platz zwischen benachbarten Kapillaren lassen. Im Wesentlichen unmittelbar nebeneinander liegende Kapillaren können sich tatsächlich über ihre gesamte parallele Länge oder einen Teil davon berühren, obwohl geringfügige Abweichungen im Kapillarwanddurchmesser oder andere Eigenschaften der Anordnung verhindern können, dass sie über ihre gesamten koplanaren parallelen Längen miteinander in Kontakt stehen. Die Kapillarenanordnung kann eine oder mehrere Untergruppen oder Teilanordnungen von koplanaren parallelen Kapillaren mit Platz zwischen den Untergruppen oder Teilanordnungen aufweisen. Vorzugsweise liegen die Kapillaren in den Untergruppen oder Teilanordnungen im Wesentlichen unmittelbar nebeneinander.
Die bewusste physikalische Trennung der Kapillaren durch Platzlassen oder Abstandshalter ist bei anderen nach dem Stand der Technik bekannten Kapillargeometrien im Allgemeinen nötig gewesen, weil durch zu dichtes Zusammenbringen der Kapillaren übermäßige Störungen der Fluoreszenzdetektion aufgrund von erhöhtem Übersprechen und Streulicht verursacht werden können. Das durch die Seiteneinlassanregungsgeometrie nach der vorliegenden Erfindung verursachte Übersprechen und die Lichtstreuung sind jedoch ausreichend niedrig, um das Platzlassen oder Abstandshalter zwischen den Kapillaren 1 überflüssig zu machen, wie nachstehend beschrieben wird. Selbstverständlich können die Kapillaren 1 bei Bedarf voneinander getrennt werden, indem sie auf einen Block mit eingearbeiteten Rillen gelegt oder durch Abstandshalter voneinander getrennt werden, sofern sie dabei parallel und in derselben Ebene bleiben.
Die Lichtstreuung und Lichtbrechung durch die ringförmigen Wände 3 kann weiter verringert oder beseitigt werden, indem man mindestens den transparenten Bereich 4 der Kapillarenanordnung 2 mit einem Medium umgibt, das einen ähnlichen Brechungsindex wie die Kapillaren 1 aufweist. Der transparente Bereich 4 ist vorzugsweise mit einem flüssigen Medium umgeben, das einen Brechungsindex von etwa 1,3 bis 1,5 aufweist, zum Beispiel Wasser. Besonders vorteilhaft ist es, die gesamten Kapillarenanordnung 2 in Wasser einzutauchen.
Die Seiteneinlassanregung der Zielspezien in einer Kapillare 1 erfolgt durch den transparenten Bereich 4 der ringförmigen Wand 3 jeder Kapillare 1 in der Anordnung 2, wie in 1 gezeigt. Licht gelangt nacheinander durch den transparenten Bereich 4 jeder Kapillare 1 in der Anordnung 2. Eine Quelle 7 kohärenten Lichts ist so angeordnet, dass sie einen Strahl 8 kohärenten Lichts entlang des transparenten Wegs 5 schickt. Eine Quelle kohärenten Lichts erzeugt Lichtwellen, die sich in Phase miteinander ausbreiten. Das Licht hat vorzugsweise eine Wellenlänge von ca. 200 bis 1.500 nm. Vorzugsweise ist die verwendete Quelle 7 kohärenten Lichts ein Laser. Ein Argon-Ionen-Laser, der gleichzeitig eine oder mehrere sichtbare Linien liefert, wird im Allgemeinen zum Anregen verwendet, obwohl auch andere Lichtquellen und Wellenlängen benutzt werden können. Besonders bevorzugte Anregungswellenlängen sind 488 nm und 514 nm. Ein spektral reiner Laser, das heißt ein Laser, der Licht einer einzigen Wellenlänge emittiert, ist eine besonders bevorzugte Lichtquelle. Alternativ kann die Wellenlänge des Lasers mit einem Interferenzfilter oder einem Glasprisma gewählt werden.
Der Strahl 8 kohärenten Lichts kann mit einer zwischen der Quelle 7 kohärenten Lichts und der Kapillarenanordnung 2 angeordneten Kollimationsfokussierlinse 9 gebündelt und kollimiert werden. Vorzugsweise hat der kollimierte Anregungsstrahl 8 einen Durchmesser von weniger als ca. 300 μm, besser jedoch weniger als ca. 75 μm, wenn er die Kapillaren 1 in der Anordnung 2 passiert. Bei einer Anordnung mit etwa 100 Kapillaren beträgt die Breite der Anordnung ca. 1,5 cm, und eine Linse mit einer Brennweite von ca. 5 bis 30 cm, vorzugsweise ca. 10 cm, wird zum Fokussieren und Kollimieren des Strahls 8 verwendet, so dass der Strahldurchmesser kleiner als ca. 75 μm bleibt, so lange er die Kapillaren 1 durchläuft.
Die fokussierte Laserlinie kann mit einer Strahlenaufweitungseinrichtung oder einem Strahlexpander 10 verändert werden, um eine größere Anzahl von Kapillaren effektiver zu bestrahlen. Der Laserstrahl 8 wird senkrecht zu der Kapillarenanordnung 2 aufgeweitet, wie in 1 gezeigt. Dieses Verlängern oder Auffächern der Laserlinie macht es leichter, den Strahl so zu positionieren, dass alle Kapillaren ausreichend bestrahlt werden. Der Strahl 8 kann wahlweise verändert oder umgelenkt werden, zum Beispiel mit einem Spiegel 11, einem Filter 12 oder einer Linse 13, ehe er auf die Anordnung 2 trifft. In 1 werden zwei Spiegel 11 benutzt, um eine praktische Einrichtung zum Einstellen der Richtung des Laserstrahls 8 vorzusehen, damit er koplanar mit der Kapillarenanordnung 2 senkrecht zu den Kapillaren 1 wird. Ebenfalls in 1 gezeigt sind ein Filter und eine Linse, obwohl die Benutzung von Spiegeln, Filtern, Linsen oder beliebigen Kombinationen hiervon eine wahlweise Möglichkeit ist.
Praktischerweise erlaubt die offen gelegte Anregungs- und Detektionsgeometrie die Verwendung von Lasern mit relativ geringer Leistung (zum Beispiel mehrere Milliwatt, typischerweise 0,5 bis 50 mW). Weil der Laserstrahl 8 nacheinander alle Kapillaren durchläuft und wegen der geringen Konzentration von DNA-Proben (in der Regel 10^–10 M) geht nur wenig von dem Laserstrahl verloren. Außerdem ist die Geometrie einfach und problemlos skalierbar bis zu mindestens Tausend Kapillaren. Handelsüblich sind zum Beispiel Detektionssysteme zum Abbilden von 2.048 Kapillaren erhältlich. Die Breite der Anordnung beträgt in diesem Fall 30 cm, was immer noch vereinbar ist mit großformatigen Weitwinkelobjektiven. Es kann eventuell nicht mehr möglich sein, einen Strahl von 75 μm oder schmaler über diese Breite aufrechtzuerhalten; es können jedoch ohne weiteres höhere Laserleistungen mit einem nicht gebündelten Strahl verwendet werden, um die Fehlanpassung in der Größe zwischen dem Laser und den Kapillarkernen auszugleichen.
3 zeigt eine alternative Ausführungsform des Systems „S", wobei die ringförmigen Wände 3 der Kapillaren 1' einen zweiten transparenten Bereich 14 zum optischen Verbinden des transparenten Wegs 5 mit einem Bereich 15 außerhalb der Kapillarenanordnung aufweisen, so dass zwischen den beiden Punkten elektromagnetische Strahlung fließen kann. Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft für die Fluoreszenzdetektion von Zielspezien. Der zweite transparente Bereich 14 ist transparent für Licht mit einer Wellenlänge, die in etwa der Wellenlänge des von einer in 3 mit „E" bezeichneten fluoreszierenden Zielspezie emittierten Lichts entspricht. Vorzugs weise ist der zweite transparente Bereich 14 transparent für Licht mit einer Wellenlänge von ca. 200 bis 1.500 nm, besser jedoch ca. 250 bis 800 nm. Der zweite transparente Bereich 14 jeder ringförmigen Wand 3 kann praktischerweise an den ersten transparenten Bereich 4 jeder ringförmigen Wand 3 angrenzen oder diesen überlappen.
Wie in 1 gezeigt, kann mindestens eine Kapillare 1 in Fluidverbindung mit einer Probe 6 stehen, so dass die Probe 6 in die Kapillare 1 gezogen wird. Die Probe enthält vorzugsweise eine fluoreszierende Zielspezie. Der erste transparente Bereich 4 der ringförmigen Wand 3 weist vorzugsweise im Wesentlichen keine Fluoreszenz auf, wenn er dem Strahl 8 kohärenten Lichts ausgesetzt ist, um die Hintergrundfluoreszenz von der detektierten Fluoreszenz auszuschließen. Besser jedoch weist der erste transparente Bereich 4 im Wesentlichen keine Fluoreszenz auf, wenn er Licht mit einer Wellenlänge von 200 bis 1.500 nm, am besten jedoch 250 bis 800 nm, ausgesetzt ist. „Im Wesentlichen keine Fluoreszenz" bedeutet, dass die Intensität der von dem transparenten Bereich emittierten Fluoreszenz, wenn überhaupt, kleiner als die beobachtete Hintergrundfluoreszenz ist. Das Detektieren einer Zielspezie erfolgt durch den zweiten transparenten Bereich 14. Dementsprechend weist der zweite transparente Bereich vorzugsweise im Wesentlichen keine Fluoreszenz auf, wenn er Licht mit einer Wellenlänge ausgesetzt wird, die in etwa der Wellenlänge des von einer fluoreszierenden Zielspezie „E" emittierten Lichts entspricht. Am besten ist es, wenn die gesamte Kapillare 1 aus einem transparenten, nicht fluoreszierenden Werkstoff wie zum Beispiel Fused Silica besteht. Alternativ können in handelsüblichen Kapillaren mit einer äußeren Polyimidbeschichtung transparente Fenster ausgebildet werden, indem ein Teil der Beschichtung wie oben beschrieben entfernt wird.
Der Bereich 15 außerhalb der Kapillarenanordnung, mit dem der transparente Weg 5 optisch verbunden sein kann, ist allgemein als ein Punkt, eine Linie oder eine ebene Fläche außerhalb der Anordnung zu verstehen, einschließlich eines einzelnen Pixels, eines linearen Pixelfelds oder eines planaren Pixelfelds. Vorzugsweise umfasst der Bereich 15 außerhalb der Kapillarenanordnung eine planare Oberfläche parallel zu der Kapillarenanordnung. Der Bereich 15 außerhalb der Kapillarenanordnung weist einen optischen Detektor 16 auf. Ein geeigneter optischer Detektor kann die Fluoreszenzemission von einer Zielspezie in einer Probe in einer Kapillare detektieren. Vorzugsweise ist der optische Detektor ein zweidimensionaler Bildfelddetektor. Besser jedoch handelt es sich bei dem optischen Detektor um ein ladungsgekoppeltes Bauelement (CCD) oder ein Ladungsinjektions-Bauelement (CID), und am besten wird ein CID-Element als optischer Detektor benutzt.
Ebenfalls mit der Erfindung bereitgestellt wird ein Verfahren zum Detektieren von fluoreszierenden Zielspezien in einer Probe mit einem Multiplex-Kapillarelektrophoresesystem „S", das die vorstehend beschriebene Seiteneinlassanregungsgeometrie aufweist. Eine Kapillarenanordnung 2 von koplanaren parallelen Kapillaren 1 wie in 1 wird aufgestellt. Wie in 1 weist jede Kapillare ein Einlassende 17, ein Ausflussende 18 und eine ringförmige Wand 3 mit einem ersten transparenten Bereich 4 auf, der einen senkrecht zu den Kapillaren 1 durch die Kapillarenanordnung 2 verlaufenden transparenten Weg 5 definiert. Eine eine fluoreszierende Zielspezie enthaltende Probe wird in das Einlassende 17 mindestens einer Kapillare 1 eingeführt, so dass die Probe durch die Kapillare 1 zum Ausflussende 18 wandert. Vorzugsweise erfolgt das Einführen der Probe mittels Druckinjektion wie nachstehend ausführlich beschrieben. Die Fluoreszenzemission von den Zielspezien wird durch Bestrahlen mit einem Strahl 8 kohärenten Lichts entlang des transparenten Wegs 5 induziert (siehe 2). Das kohärente Licht weist vorzugsweise eine Wellenlänge von ca. 200 bis 1.500 nm auf. Die Fluoreszenzemission von den Zielspezien wird detektiert. Die ringförmige Wand 3 jeder Kapillare 1' in der Anordnung 2 weist einen zweiten transparenten Bereich 14 auf, um den transparenten Weg 5, wie in 3 gezeigt, optisch mit einem Bereich 15 außerhalb der Kapillarenanordnung zu verbinden, durch die die Fluoreszenzemission detektiert wird. Die Fluoreszenz kann zum Beispiel mit einem CCD- oder CID-Element detektiert werden, das in dem optisch verbundenen Bereich außerhalb der Kapillarenanordnung angeordnet ist. Vorzugsweise weist der erste transparente Bereich 4 im Wesentlichen keine Fluoreszenz auf, wenn er dem kohärenten Licht zum Bestrahlen der Zielspezien ausgesetzt ist. Besser jedoch weist der erste transparente Bereich 4 im Wesentlichen keine Fluoreszenz auf, wenn er Licht mit einer Wellenlänge von 200 bis 1.500 nm, am besten jedoch 250 bis 800 nm, ausgesetzt ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfassen die Zielspezien auch DNA-Fragmente.
Detektionsverfahren und -systeme. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Kapillarelektrophoresesystem mit einem Bildfelddetektor bereit, der mit mindestens einer der mehreren koplanaren parallelen Kapillaren in der Kapillarenanordnung optisch verbunden ist. Die Kapillaren in der Anordnung weisen alle eine ringförmige Wand mit einem transparenten Bereich auf, um den Innenbereich der Kapillare optisch mit dem Bildfelddetektor zu verbinden. Vorzugsweise liegen die Kapillaren entlang ihrer parallelen Längen im Wesentlichen unmittelbar nebeneinander. Die Kapillaren können in Untergruppen oder Teilanordnungen zusammengefasst sein, wie vorstehend beschrieben. Ein Bildfelddetektor erfasst Bilder vom Inneren einer Kapillare mit Hilfe von Pixeln zum Erfassen von elektromagnetischer Strahlung in Form von Photonen. Ein Pixel ist ein Bilderfassungselement des Bildfelddetektors, das dazu ausgelegt ist, die interessierenden Bildelemente während der Zeit, über die das Pixel elektromagnetischer Strahlung (zum Beispiel Licht) ausgesetzt ist, elektronisch zu erfassen. Ein Pixel hat in der Regel einen Durchmesser von ca. 26 μm (Mikrometer), und die benachbarten Pixel sind im Allgemeinen in einem Abstand von ca. 2 bis 3 μm auf einer ebenen Oberfläche des Detektors angeordnet. Ein Pixel, das elektromagnetischer Strahlung ausgesetzt ist, erzeugt ein elektrisches Signal, das direkt proportional zur Stärke der elektromagnetischen Strahlung während der Zeit ist, über die es belichtet wird. Dieses Signal wird dann für die Datenanalyse verwendet.
Das Kapillarelektrophoresesystem nach der Erfindung weist vorzugsweise einen Bildfelddetektor mit linear ausgerichteten Pixeln in einer Ebene parallel zu der Kapillarenanordnung auf, so dass mindestens eine Kapillare in der Kapillarenanordnung mit weniger als etwa sechs Pixeln optisch verbunden ist. Die Pixel in dem linearen Bildfelddetektor können mit dem Innenbereich der Kapillare oder einer der Seitenwände der Kapillare optisch verbunden sein. Vorzugsweise ist mindestens ein Pixel mit einer Seitenwand einer Kapillare in der Nähe des Innenbereichs optisch verbunden. Optisch mit einer Seitenwand verbundene Pixel weisen ein ungünstiges Signal-Rausch-Verhältnis auf, weil sie Störungen durch Übersprechen und Streulicht aufgrund der Kapillarwände unterliegen. Diese Pixel können praktischerweise bei der Datenerfassung und Analyse außer Acht gelassen werden, wenn ein Ladungsinjektions-Detektor als Bildfelddetektor benutzt wird, wie nachstehend beschrieben. Im Gegensatz dazu weisen optisch mit dem Innenbereich verbundene Pixel im Allgemeinen ein günstiges Signal-Rausch-Verhältnis auf. Besonders vorteilhaft ist eine Pixelanordnung, bei der nur ein Pixel mit einem Innenbereich verbunden ist und die beiden Pixel zu beiden Seiten des mit dem Innenbereich verbundenen Pixels jeweils mit einer Seitenwand verbunden sind. Bei dieser Anordnung sind Störungen durch Übersprechen und Streulicht aufgrund der Kapillarwände im Wesentlichen auf die mit den Seitenwänden verbundenen Pixel beschränkt und wirken sich nicht auf das Signal aus, das von dem mit dem Innenbereich verbundenen Pixel erzeugt wird. Diese Anordnung ist einer Anordnung vorzuziehen, bei der zwei oder mehr Pixel optisch mit dem Innenbereich verbunden sind, weil sie den Dunkelstrom minimiert, der abhängig ist von der Anzahl der mit dem Innenbereich einer Kapillare verbundenen Pixel, obwohl solche weniger bevorzugten Anordnungen für bestimmte Ausführungsformen ebenfalls unter die Erfindung fallen.
Ein besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist in 4 gezeigt. Das Kapillarelektrophoresesystem weist eine Kapillarenanordnung 2 mit mehreren koplanaren parallelen Kapillaren 1 auf. Bei dieser Ausführungsform verläuft der transparente Bereich 20 der ringförmigen Wand 3 um die Kapillaren 1 herum, und die Kapillaren 1 in der Anordnung 2 liegen im Wesentlichen unmittelbar nebeneinander. Ein Bildfelddetektor 21 mit einem linearen Pixelfeld 22 in einer Ebene parallel zu der Kapillarenanordnung 2 ist mit den Innenbereichen 23 der Kapillaren 1 optisch verbunden. Das Verhältnis von Pixeln 22 zu Kapillaren 1 beträgt bei dieser Ausführungsform 2 : 1, und die Pixel 22 sind so angeordnet, dass jedes zweite Pixel in dem linearen Bildfelddetektor optisch mit einer Seitenwand 24 einer Kapillare 1 verbunden ist und jedes dazwischen liegende Pixel mit einem Innenbereich 23 einer Kapillare 1 verbunden ist. 5 ist eine alternative Ansicht der Kapillarenanordnung 2 in 4, die eine Projektion der optisch verbundenen Pixel 22 auf die innersten Bereiche 23 und die Seitenwände 24, 25 der im Wesentlichen unmittelbar nebeneinander liegenden Kapillaren 1 zeigt.
Bei einer anderen, in 6 gezeigten Ausführungsform der Erfindung hat eine Gruppe von Pixeln 26 ein Anfangspixel 27, eine mittlere Gruppe 28 von Pixel und ein Endpixel 22, die optisch mit einer Kapillare 1 verbunden sind. Im Einzelnen ist das Anfangspixel 27 optisch mit der ersten Seitenwand 24 einer Kapillare 1 verbunden, die mittlere Gruppe 28 von Pixeln ist optisch mit einem Innenbereich 23 einer Kapillare 1 verbunden und das Endpixel 29 ist optisch mit einer zweiten Seitenwand 25 einer Kapillare 1 verbunden. Vorzugsweise besteht die mittlere Gruppe von Pixeln aus zwei Pixeln, wie in 6 gezeigt, und am besten besteht sie aus nur einem Pixel, wie implizit in 4 und 5 gezeigt. In 6 sind die optisch verbundenen Pixel 26 zwecks einfacherer Darstellung grafisch auf die Kapillaren 1 in der Anordnung 2 projiziert. Die zwei Pixel 28 sind optisch mit dem Innenbereich 23 jeder Kapillare verbunden. Benachbarte Kapillaren 1 teilen sich die optisch mit einer Seitenwand 24, 25 verbundenen Pixel 27, 29.
Das Verhältnis von optisch verbundenen Pixeln zu Kapillaren beträgt weniger als etwa 6 : 1, vorzugsweise etwa 3 : 1 und am besten etwa 2 : 1 für eine Kapillarenanordnung von im Wesentlichen unmittelbar nebeneinander liegenden koplanaren Kapillaren. Ein Verhältnis von 2 : 1 ist in 4 und 5 gezeigt, während in 6 ein Verhältnis von 3 : 1 gezeigt ist. Die koplanaren parallelen Kapillaren können in einer Anordnung mit einer oder mehreren Untergruppen von im Wesentlichen unmittelbar nebeneinander liegenden koplanaren Kapillaren angeordnet sein. In diesem Fall kann das Gesamtverhältnis von optisch verbundenen Pixeln zu Kapillaren für die gesamte Anordnung größer als 6 : 1 sein, obwohl für jede Untergruppe von im Wesentlichen unmittelbar nebeneinander liegenden koplanaren Kapillaren das Verhältnis kleiner als etwa 6 : 1 ist. Das Verhältnis von optisch verbundenen Pixeln zu Kapillaren muss kein ganzzahliges Verhältnis sein. In diesem Fall kann die Anzahl der optisch mit jeder Kapillare in der Anordnung verbundenen Pixel variieren (siehe 8 und die Beschreibung weiter unten). Wenn die Kapillaren in der Anordnung variable Durchmesser aufweisen, kann in gleicher Weise die Anzahl der optisch mit jeder Kapillare in der Anordnung verbundenen Pixel variieren.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung (7) ist eine Bildgebungslinse 26 zwischen der Kapillarenanordnung 2 und dem Bildfelddetektor 21 angeordnet, um die Pixel 22 optisch mit den Kapillaren 1 zu verbinden. Die Anordnung in 7 zeigt ein Verhältnis von 2 : 1 von Pixeln 22 zu Kapillaren 1, wobei jedes zweite Pixel optisch mit einer Seitenwand 24 verbunden ist und jedes Pixel dazwischen durch den transparenten Bereich 20 mit einem Innenbereich 23 einer Kapillare 1 verbunden ist. Die Bildgebungslinse 26 kann jede Linse sein, die ein Bild auf die Pixel des Bildfelddetektors abbilden kann, etwa ein Kameraobjektiv wie zum Beispiel ein 24 mm-Weitwinkelobjektiv (Canon, Tokio, Japan, Modell FD 24 mm, F1.4L, 50 mm Durchmesser) oder eine Kondensorlinse.
Der Bildfelddetektor kann ein linearer Bildfelddetektor oder ein zweidimensionaler Bildfelddetektor sein. Vorzugsweise handelt es sich um einen zweidimensionalen Bildfelddetektor, besser jedoch um ein Ladungsverschiebe-Bauelement wie zum Beispiel ein ladungsgekoppeltes Bauelement (CCD) oder ein Ladungsinjektions-Bauelement (CID), wobei am besten ein CID-Element als Bildfelddetektor benutzt wird.
Ebenfalls mit der Erfindung bereitgestellt wird ein Verfahren zum Detektieren von fluoreszierenden Zielspezien in einer Probe mittels des in den vorstehenden Absätzen beschriebenen Kapillarelektrophoresesystems. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Kapillarenanordnung mit mehreren koplanaren parallelen Kapillaren aufge stellt. Die ringförmige Wand jeder Kapillare weist einen transparenten Bereich auf, um den Innenbereich der Kapillare optisch mit einem Bildfelddetektor zu verbunden. Der Bildfelddetektor kann ein linearer Bildfelddetektor oder ein zweidimensionaler Bildfelddetektor sein. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Bildfelddetektor um einen zweidimensionalen Bildfelddetektor, besser jedoch um ein CCD- oder CID-Element und am besten um ein CID-Element. Der Bildfelddetektor weist linear angeordnete Pixel in einer Ebene parallel zu der Kapillarenanordnung auf. Der Detektor ist optisch so mit der Kapillarenanordnung verbunden, dass mindestens eine Kapillare in der Anordnung optisch mit weniger als etwa sechs der linear ausgerichteten Pixel verbunden ist. Eine Probe, die eine fluoreszierende Zielspezie, vorzugsweise ein DNA-Fragment, enthält, wird in das Einlassende der optisch verbundenen Kapillare eingeführt, so dass sie durch die Kapillare zum Ausflussende wandert. Die Fluoreszenzemission von der Zielspezie wird dann durch Bestrahlen mit einem Strahl kohärenten Lichts induziert. Vorzugsweise hat das zur Bestrahlung benutzte Licht eine Wellenlänge von ca. 200 bis 1.500 nm, besser jedoch ca. 250 bis 800 nm. Die Fluoreszenzemission wird mit dem Bildfelddetektor durch den transparenten Bereich der optisch verbundenen Kapillare mit Hilfe der optisch verbundenen Pixel detektiert. Das Detektieren erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von ca. 20 bis 30°C.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens bilden die optisch mit einer Kapillare verbundenen Pixel eine Gruppe von weniger als etwa sechs Pixeln mit einem Anfangspixel, einer mittleren Gruppe von Pixeln und einem Endpixel (siehe 6). Vor dem Einführen einer Probe wird das Anfangspixel optisch mit einer ersten Seitenwand einer Kapillare verbunden, die mittlere Gruppe von Pixeln wird optisch mit dem Innenbereich einer Kapillare verbunden und das Endpixel wird optisch mit einer zweiten Seitenwand der Kapillare verbunden. Die mittlere Gruppe besteht vorzugsweise aus zwei Pixeln, und am besten besteht sie aus nur einem Pixel.
Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens umfasst den zusätzlichen Schritt des Auswählens eines Pixels aus der mittleren Gruppe von Pixeln und des Benutzens dieses Pixels zum Detektieren der Fluoreszenzemission von den Zielspezien. Sind mehr als ein Pixel optisch mit dem Innenbereich einer Kapillare verbunden, ist es wünschenswert, nur eines für die Analyse auszuwählen und die anderen zu ignorieren, weil der Dunkelstrom mit der Anzahl der pro Kapillare ausgewerteten Pixel und damit auch das Grundrauschen zunimmt. Bei einer Anordnung oder Teilanordnung von im Wesent lichen unmittelbar nebeneinander liegenden Kapillaren ist im Idealfall nur ein Pixel optisch mit jeder Kapillare verbunden (was einem Verhältnis von Pixeln zu Kapillaren von 2 : 1 entspricht), wodurch die Notwendigkeit einer Pixelauswahl entfällt. Bei großen Anordnungen mit vielen Kapillaren kann es jedoch sehr praktisch sein, ein höheres Verhältnis von Pixeln zu Kapillaren zu benutzen, um Ungenauigkeiten und Schwankungen in der Packung der Kapillaren, der Breite der ringförmigen Wand usw. zu berücksichtigen. Bei Verwendung von höheren Verhältnissen von Pixeln zu Kapillaren kann mehr als ein Pixel optisch mit dem Innenbereich einer Kapillare verbunden sein. Jedes dieser Pixel erzeugt ein Signal mit einer Intensität, die direkt proportional zur Intensität des detektierten Lichts ist. Das Pixel, das das Signal mit der größten Intensität produziert, wenn es der Einwirkung von elektromagnetischer Strahlung aus der Kapillare ausgesetzt ist, das heißt das „hellste" Pixel, wird vorteilhafterweise ausgewählt. Beispiele für die ausgewählten Pixel 27 sind in 8 schraffiert gezeigt. In 8 sind die optisch verbundenen Pixel 23 zwecks einfacherer Darstellung grafisch auf die Kapillaren in der Anordnung projiziert. Ein schraffiertes Pixel steht für das Pixel, das optisch mit einer bestimmten Kapillare verbunden ist, das die größte Signalintensität produziert, wenn die Kapillare ein fluoreszierendes Material enthält, wie nachstehend beschrieben. Die Daten von den schraffierten Pixeln werden für die Probenanalyse benutzt.
Das Auswählen des geeigneten Pixels aus den optisch mit dem Innenbereich einer Kapillare verbundenen Pixeln kann praktischerweise mit Hilfe eines Kalibrierungsschritts erfolgen. Daher kann das erfindungsgemäße Verfahren weiter einen vor dem Einführen der Probe durchgeführten Kalibrierungsschritt umfassen. Ein fluoreszierendes Medium, zum Beispiel eine Fluoresceinlösung, vorzugsweise eine Lösung mit ca. 10^–8 bis 10^–5 M Fluorescein, oder eine Rhodaminlösung oder jeder geeignete fluoreszierende Puffer wird in eine Kapillare eingeführt. Die Fluoreszenzemission von dem fluoreszierenden Medium wird durch Bestrahlen des Mediums mit einem Strahl kohärenten Lichts mit einer Wellenlänge von ca. 200 bis 1.500 nm induziert und mit dem Bildfelddetektor durch den transparenten Bereich der ringförmigen Wand detektiert. Die Fluoreszenzemission wird mit jedem Mitglied der mittleren Gruppe von Pixeln detektiert, die optisch mit dem Innenbereich der Kapillare verbunden sind. Die Intensität des von jedem Pixel in der mittleren Gruppe erzeugten Signals wird verglichen, und das Pixel, das das Signal mit der größten Intensität produziert, wird ausgewählt. Die mit dem ausgewähl ten Pixel detektierte Fluoreszenz, die von einer Zielspezie emittiert wird, wird dann zur Durchführung der Datenanalyse benutzt.
Der am meisten bevorzugte Bildfelddetektor zur Verwendung in dem System und Verfahren nach der Erfindung ist ein Ladungsinjektions-Bauelement (CID). Anwendungen von CID-Elementen sind aus den Gebieten der Astronomie und der Atomspektroskopie bekannt (P. Epperson et al., Anal. Chem., 60, 327A (1988)). Ein CID-Element ist ein Ladungsverschiebungs-Halbleiterbauelement (CTD) ähnlich einem CCD-Element, verfügt jedoch über andere Eigenschaften als CCD-Elemente, die bei der Multiplex-Kapillarelektrophorese sehr vorteilhaft genutzt werden können. Wenn es sich nur um eine einzelne Kapillare oder eine kleine Anzahl von Kapillaren handelt, bietet die Benutzung eines CID-Elements keinen erkennbaren Vorteil, weil verschiedene Fotovervielfacher, Avalanche-Fotodioden oder CCD-Kameras erhältlich sind. Muss jedoch eine große Anzahl von Kapillaren in einem Anordnungsformat gleichzeitig überwacht werden, können die besonderen Merkmale einer CID-Kamera einen erheblichen Unterschied ausmachen. Zu diesen Merkmalen gehören die Adressierung für den direkten Pixelzugriff die Flexibilität einer vom Anwender programmierbaren Architektur (insbesondere zum Programmieren der Belichtungszeit), großer Dynamikumfang, niedriger Dunkelstrom, Anti-Bloom-Abbildung, hohe Bestrahlungstoleranz, hohe Quantenausbeute über einen großen Wellenlängenbereich und eine zerstörungsfreie Messung.
Die für CID-Elemente typische „Direktzugriffs"- oder elektronische Fensterfunktion ist besonders nützlich. Der Begriff „Direktzugriff" bzw. „Random Access" bezieht sich auf die besonderen Merkmale eines CID-Elements, die ein Kalibrieren oder Programmieren ermöglichen, um nur die Pixel auszulesen, die in einem bestimmten Untersuchungsbereich fokussiert sind, was im Vergleich zu einem CCD-Element, das nur sehr wenig Flexibilität beim Auslesen der Pixel bietet, enorm viel Zeit für die Datenanalyse und Speicherplatz spart. Ein CID-Element kann zum Beispiel so kalibriert werden, dass nur eines oder mehrere Pixel gelesen werden, die auf einem transparenten Bereich einer Kapillare fokussiert sind, durch den Fluoreszenzemissionen von einer Zielspezie passieren. Daher kann das erfindungsgemäße Verfahren weiter eine Random-Access-Programmierung zum Auswählen eines Pixels mit der größten Signalintensität aus einer Gruppe von Pixeln umfassen, die optisch mit dem Innenbereich einer Kapillare verbunden sind. Die Probenwanderungszeit für die Zielspezien wird dann durch Verarbeiten des von dem ausgewählten Pixel erzeugten Signals bestimmt.
Obwohl die CID-Kamera mit einer niedrigeren Pixelleserate als ein herkömmliches CCD-Element arbeitet, kann sie sehr hohe Abtastraten mit hoher Belichtungsleistung und somit hoher Empfindlichkeit erreichen. Die Vorteile sind sogar noch größer, wenn mehrere räumlich voneinander getrennte Teilanordnungen erfasst werden müssen, weil der Freiraum oder Abstand zwischen den Teilanordnungen bei einem CID-Element nicht gelesen werden muss.
Das CID-Element kann weiter vorteilhaft betrieben werden, indem es zur Benutzung unterschiedlicher Belichtungszeiten programmiert wird, um Emissionen mit variablen Intensitäten zu detektieren. Kürzere Belichtungszeiten können für Emissionen mit hoher Intensität geeignet sein, während längere Belichtungszeiten für Emissionen mit geringerer Intensität benutzt werden können. Bei einem DNA-Sequenzierungsexperiment kann zum Beispiel ein Kalibrierungslauf durchgeführt werden, um die ungefähren Wanderungszeiten von DNA-Fragmenten verschiedener Länge zu bestimmen. Ein Belichtungszeitgradient kann dann programmiert werden, um größere, länger laufende Fragmente mit höheren Emissionsintensitäten für eine kürzere Zeit zu belichten, als für die schnelleren, kürzeren Fragmente nötig ist, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis für die größeren DNA-Fragmente verbessert und gleichzeitig die Menge der generierten Daten verringert wird. Daher umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiter eine Belichtungszeitprogrammierung, um die Belichtungszeit für ein ausgewähltes Pixel während der Probenwanderung im Wesentlichen invers zu der Intensität der Fluoreszenzemission von den Zielspezien zu variieren. Die Belichtungszeitprogrammierung erfolgt vorzugsweise durch Programmieren eines Belichtungszeitgradienten, der zunächst in einem Kalibrierungslauf mit DNA-Fragmenten bekannter Größe und Fluoreszenzintensität bestimmt werden kann, oder durch Programmieren einer Rückkopplungsschleife, um die Belichtungszeit automatisch mit der von dem ausgewählten Pixel detektierten Fluoreszenzemissionsintensität zu variieren. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens kommen sowohl die Random-Access-Programmierung als auch die Belichtungszeitprogrammierung zur Anwendung.
Um etwaige Einschränkungen der Abtastrate eines CID-Elements aufgrund der Tatsache zu überwinden, dass die Abtastrate durch die Ladungsinjektionsgeschwindigkeit und die Pixelleserate bestimmt wird, kann das CID-Element in einem asynchronen Scanmodus betrieben werden. Im asynchronen Scanmodus bleibt der Kameraverschluss offen, und die Teilanordnung wird kontinuierlich abgetastet, ohne zwischen dem Ausle sen der Bilder oder Frames auf den Transport zum nächsten Element in der Anordnung zu warten. Die Ladung in jedem Pixel wird einzeln während jedes „Frame" gelöscht, ohne die übrigen Pixel zu beeinträchtigen. Die Einschaltdauer, die Bildrate oder „Frame Rate" und die Ladungslöschzeit variieren je nach Größe der Teilanordnung.
Das CID-Element wird vorzugsweise bei Umgebungstemperatur (20 bis 30°C) betrieben. Dadurch wird es einfacher und kompakter, um es in ein automatisches DNA-Sequenzierungsinstrument einzubauen. Weil kein Dewar-Gefäß für flüssigen Stickstoff (N₂) nötig ist, beansprucht das Brennebenenfeld des CID-Elements nur sehr wenig Platz.
Nucleotidbestimmung in DNA-Sequenzierungsexperimenten – „Base Calling". Bei der DNA-Sequenzierung mittels Fluoreszenzdetektion von DNA-Fragmenten in einer einzelnen Kapillare werden im Allgemeinen mehrere Farbstoffe mit unterschiedlichen Emissionsspektren verwendet, um die Fragmente entsprechend den vier verschiedenen Basen zu bestimmen. Viele Detektionsverfahren für die DNA-Sequenzierung beruhen auf der Verwendung von mindestens zwei Anregungswellenlängen, zum Beispiel 488 nm und 543 nm (z. B. S. Carson et al., Anal. Chem., 65, 3219–3226 (1993)). Werden jedoch mehrere Strahlen zum Anregen von fluoreszierenden Spezien in einer einzelnen Kapillare benutzt, ist eine Anpassung der Wanderungszeiten durch Normalisieren bezogen auf die zurückgelegte relative Strecke nötig, um eine Sequenz erfolgreich auslesen zu können. Darüber hinaus können mehrere Strahlen Streulicht erzeugen, das Störungen bzw. Interferenzen verursacht. Detektionsverfahren mit nur einer Anregungswellenlänge und Mehrkanalemissionen, die mit zwei oder mehr Fotovervielfachern detektiert werden, die mit schmalen Bandpassfiltern verbunden sind, sind beschrieben worden (M. C. Ruiz-Martinez et al., Anal. Chem., 65, 2851–2858 (1993); X. C. Huang et al., Anal. Chem., 64, 2149–2154 (1992); J. M. Prober et al., Science, 238, 336–341 (1987); R. Tomisaki et al., Anal. Sci., 10, 817–820 (1994)), aber die Benutzung von schmalen Bandpassfiltern, die Licht einer bestimmten Wellenlänge ± 10 bis 30 nm durchlassen, führt zu einer niedrigen Lichtleistung und damit einem Verlust an Empfindlichkeit. Darüber hinaus muss auch eine gleichmäßige Aufnahme durch die Polymerase angenommen werden. Ein DNA-Sequenzierungsexperiment mit vier Farbstoffmarkierungen mit einer Anregungswellenlänge und CCD-Detektion mehrerer Wellenlängen mit einem Spektrometer ist ebenfalls beschrieben worden (A. E. Karger et al., Nucl. Acids Res., 19, 4955–4962 (1991)), aber eine niedrige Lichtleistung ist ein wesentlicher Nachteil auch dieses Verfahrens.
Das Kapillarelektrophoresesystem nach der vorliegenden Erfindung kann zum Detektieren der Fluoreszenzemission von einer fluoreszierenden Zielspezie benutzt werden, wobei nur eine Anregungswellenlänge und zwei Tiefpassfilter, wie nachstehend beschrieben, benutzt werden, um die Fluoreszenzemission in einen ersten und einen zweiten Emissionskanal aufzuteilen. Als Ergebnis dieser Aufteilung enthalten der erste und der zweite Emissionskanal Licht mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen. Ein Detektor detektiert gleichzeitig die Fluoreszenzemission in dem ersten und dem zweiten Emissionskanal. Die Erfindung eignet sich besonders zum Einsatz bei DNA-Sequenzierungs- und DNA-Diagnoseexperimenten, bei denen die Zielspezien DNA-Fragmente sind und alle vier Nucleotidbasen in einer einzelnen Kapillare detektiert werden. Wie in 9 gezeigt und nachstehend ausführlich beschrieben, ist eine Quelle 7 kohärenten Lichts so angeordnet, dass sie einen einzelnen Strahl 8 kohärenten Lichts so ausschickt, dass der Innenbereich 23 mindestens einer Kapillare 1 berührt wird, der durch ihre ringförmige Wand 3 definiert ist. Ein Detektor 34 ist vorgesehen, um die Fluoreszenzemission „E" von einer fluoreszierenden Zielspezie im Innenbereich der Kapillare zu detektieren, wobei die Emission mit dem ersten Tiefpassfilter 33 und mit dem zweiten Tiefpassfilter 32 in den ersten Emissionskanal 30 bzw. den zweiten Emissionskanal 31 aufgeteilt wird.
Die Kapillare steht in Fluidverbindung mit einer Probe, die eine fluoreszierende Zielspezie enthält, so dass die Probe in die Kapillare gezogen wird, wo sie mit dem Strahl kohärenten Lichts in Kontakt gebracht wird. Das Anregen der Zielspezie in einer Kapillare erfolgt durch die Wand der Kapillare, wie nachstehend beschrieben. Wenn eine fluoreszierende Zielspezie in der Kapillare vorhanden ist, induziert der Strahl die Fluoreszenzemission von der Zielspezie.
Die ringförmige Wand der Kapillare weist einen transparenten Bereich auf, durch den die Fluoreszenzdetektion erfolgt. Das System besteht aus einer Kapillarenanordnung von koplanaren parallelen Kapillaren, wobei jede Kapillare einen ersten transparenten Bereich aufweist, der einen senkrecht zu den Kapillaren durch die Kapillarenanordnung verlaufenden transparenten Weg definiert. Der Strahl kohärenten Lichts wird entlang des transparenten Wegs geschickt. Jede ringförmige Wand weist einen zweiten transparenten Bereich auf, um den transparenten Weg optisch mit einem Detektor zu verbinden, wie nachstehend beschrieben ist.
Die zwischen den Zielspezien und dem Detektor angeordneten Tiefpassfilter sind Filter, die Licht durchlassen, dessen Wellenlänge über einem bestimmten Wert liegt. Ein standardmäßiger Tiefpassfilter mit einem angegebenen Wellenlängenwert lässt etwa 50% des Lichts mit dem angegebenen Wellenlängenwert und geringer werdende Anteile Licht mit kürzeren Wellenlängen durch, so dass praktisch kein Licht mit einer kürzeren Wellenlänge als etwa 50 nm unter dem angegebenen Wert durchgelassen wird. Im Gegensatz dazu weist ein Raman-Tiefpassfilter eine abrupte Abschneidewellenlänge auf. Praktisch kein Licht mit einer kürzeren als der angegebenen Wellenlänge eines Raman-Tiefpassfilters wird durchgelassen. Durch die Benutzung von Tiefpassfiltern kann wesentlich mehr Licht den Detektor erreichen als bei Verwendung von Schmalbandfiltern.
Die optimalen Anregungswellenlängen und Kombinationen von Tiefpassfiltern hängen von den jeweils zum Markieren der DNA-Fragmente bei der Sequenzierungsreaktion verwendeten Farbstoffen ab. Im Allgemeinen filtern beide Filter Licht mit einer Wellenlänge an oder unter der zum Anregen der DNA-Zielspezien verwendeten Wellenlänge aus. In der Regel wird der erste Filter so gewählt, dass er Laserstreulicht ausfiltert, das heißt Licht mit einer Wellenlänge, die niedriger als oder etwa gleich der Anregungswellenlänge ist, und der zweite Filter wird so gewählt, dass Licht mit einer geringeren als einer etwas höheren Wellenlänge ausgefiltert wird, wobei der Abschneidewert von den zum Derivatisieren der DNA-Fragmente verwendeten Markierungen abhängig ist.
Dementsprechend hat der erste Tiefpassfilter vorzugsweise einen solchen Wellenlängenabschneidewert, dass er weniger als etwa 0,1%, vorzugsweise 0,01% des Lichts mit einer Wellenlänge durchlässt, die in etwa der Wellenlänge des einzelnen Strahls kohärenten Lichts zum Induzieren der Fluoreszenz von den Zielspezien entspricht, und der zweite Tiefpassfilter hat vorzugsweise einen höheren Wellenlängenabschneidewert. Wie viel höher hängt von den Farbstoffmarkierungen ab und ist für den Fachmann ohne weiteres erkennbar. Vorzugsweise handelt es sich bei dem ersten Tiefpassfilter um einen Raman-Tiefpassfilter mit einem Wellenlängenabschneidewert, der in etwa der Wellenlänge des einzelnen Strahls kohärenten Lichts entspricht.
Das Anordnen der beiden Filter in dem Weg der Fluoreszenz kann in jeder Reihenfolge erfolgen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der erste Filter unmittelbar neben dem Detektor angeordnet, und der zweite Filter ist zwischen den DNA-Zielspezien und dem ersten Filter so angeordnet, dass er einen Teil der Emis sion abfängt, die ansonsten direkt den ersten Filter passiert hätte, und mit einem Winkeln von ungefähr 1 bis 89 Grad, vorzugsweise ungefähr 20 bis 40 Grad relativ zu dem ersten Filter geneigt ist. Das durch den ersten Filter hindurchtretende Licht passiert anschließend den ersten Filter, bevor es auf den Bildfelddetektor auftrifft, und bildet das, was man als den „roten Kanal" bezeichnen kann. Licht, das nur den ersten Filter passiert, kann dementsprechend als der „blaue Kanal" bezeichnet werden, weil es Licht mit kürzeren Wellenlängen als das enthält, welches den roten Kanal bildet. Der Umfang der von dem zweiten Filter abgefangenen Emission kann eingestellt werden, um die Gesamtempfindlichkeit der beiden Kanäle zu optimieren. Insbesondere die Verhältnisse der mit den beiden Kanälen detektierten Emissionen, die zur Bestimmung der DNA-Sequenz benutzt werden, werden durch den Teil der Gesamtemission beeinflusst, der jedem Kanal mit Hilfe der relativen Positionierung der Filter zugeordnet wird. Der zweite Filter muss geneigt sein, um mittels Brechung das Bild des durch beide Filter passierenden Lichts relativ zu dem Licht, das nur den ersten Filter durchquert, zu verschieben, um die Datenanalyse zu erleichtern. Besonders vorteilhaft ist es, als ersten Filter einen Raman-Tiefpassfilter zu verwenden, der Wellenlängen herausfiltert, die kleiner als oder etwa gleich der Anregungswellenlänge sind, und die höheren Wellenlängen vollständig durchlässt.
Ein bevorzugter Detektor ist ein zweidimensionaler Bildfelddetektor, insbesondere bei Multiplexsystemen, obwohl auch ein erster linearer Detektor und ein zweiter linearer Detektor benutzt werden können, einer für jeden Kanal. Besser jedoch wird ein ladungsgekoppeltes Bauelement (CCD) oder ein Ladungsinjektions-Bauelement (CID) verwendet. In Multiplexsystemen, bei denen das Detektieren mit einem CID- oder CCD-Element erfolgt, können praktischerweise Rechteckfilter mit Abmessungen, die größer als die Abmessungen der Anordnung sind, zum Aufteilen der gleichzeitig in mehreren Kapillaren in einer Anordnung von koplanaren parallelen Kapillaren induzierten Fluoreszenzemissionen von Zielspezien benutzt werden.
Wie in 9 gezeigt, wird eine Kapillare 1, die eine fluoreszierende Zielspezie enthält, auf einer Halterung 35 mit einer Rille 36 angeordnet. Die Rille verringert Streulichtinterferenzen, indem sie die Reflektion des Anregungsstrahls durch die Halterung verhindert, die anderenfalls auftreten würde, wenn die Rille nicht vorhanden wäre. Eine Quelle 7 kohärenten Lichts ist so angeordnet, dass sie einen einzelnen Strahl 8' kohärenten Lichts zum Induzieren von Fluoreszenz von der Zielspezie durch den transparenten Bereich 14' der ringförmigen Wand 3 der Kapillare 1 schickt. Die Fluoreszenzemission wird in einen ersten Kanal 31 und einen zweiten Kanal 30 aufgeteilt. Der erste Kanal 31 enthält die Fluoreszenzemission, die sowohl den Raman-Tiefpassfilter 33 als auch einen standardmäßigen Tiefpassfilter 32 durchquert. Der standardmäßige Tiefpassfilter 32 ist in einem Winkel von etwa 30 Grad zu der ebenen Oberfläche des Detektors 34 geneigt, um das Bild zu verschieben. Der standardmäßige Tiefpassfilter 32 ist so angeordnet, dass etwa die Hälfte der Fluoreszenzemission von den Zielspezien auf ihn auftrifft. Der zweite Kanal 30 enthält den Teil der Fluoreszenzemission, der nur den Raman-Filter 33 passiert. Beide Kanäle werden mit einem CCD-Detektor 34 detektiert.
Eine 488 nm-Laserlinie wird benutzt, um Fluoreszenz in der mit den PRISM^TM-Farbstoffen von der ABD Division von Perkin Elmer (Foster City, Kalifornien) markierten DNA-Zielspezies anzuregen. Diese vier Farbstoffe weisen unterschiedliche Emissionswellenlängen, jedoch ähnliche Anregungswellenlängen auf. Ein 488 nm-Raman-Tiefpassfilter wird benutzt, um Laserstreulicht zu eliminieren. Ein standardmäßiger 610 nm-Tiefpassfilter ist etwa 30 Grad geneigt und deckt ungefähr die Hälfte des Kameraobjektivs eines CCD-Elements ab, wie in 9 gezeigt. Das Bild wird auf diese Weise in zwei Emissionskanäle mit hoher Lichtleistung aufgeteilt, weil Tiefpassfilter anstelle von Schmalbandfiltern benutzt werden. Durch die Verwendung des geneigten zweiten Filters haben das verschobene Bild und das direkte Bild automatisch die gewünschte Wellenlänge, und ist gibt keine Zeitdifferenz zwischen den Elektropherogrammen von den beiden Emissionskanälen.
Die Erfindung sieht außerdem ein Verfahren zum Detektieren eines fluoreszierenden DNA-Fragments in einer Probe mit dem oben beschriebenen Detektionsverfahren mit einer Anregungswellenlänge und zwei Emissionskanälen vor. Die Erfindung eignet sich besonders zum Einsatz in DNA-Sequenzierungs- und DNA-Diagnoseexperimenten, bei denen die Zielspezien DNA-Fragmente sind und alle vier Nucleotidbasen in einer einzelnen Kapillare detektiert werden. Eine Kapillarenanordnung von koplanaren parallelen Kapillaren ist vorgesehen. Jede Kapillare weist eine ringförmige Wand mit einem transparenten Bereich auf, der optisch mit einem Detektor verbunden ist. Eine Probe mit einem DNA-Fragment wird in das Einlassende mindestens einer Kapillare eingeführt, so dass die Probe durch die Kapillare zum Ausflussende wandert. Vorzugsweise erfolgt das Einführen der Probe mittels Druckinjektion, wie nachstehend ausführlich beschrieben ist. Die Fluoreszenzemission von dem DNA-Fragment wird durch Bestrahlen der Probe mit einem einzelnen Strahl kohärenten Lichts induziert. Die Fluoreszenzemission wird mit einem ersten und einem zweiten Tiefpassfilter in einen ersten und einen zweiten Emissionskanal aufgeteilt. Bevorzugte optische Anordnungen und Merkmale der ersten und zweiten Tiefpassfilter zur Benutzung in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind vorstehend in der Beschreibung des Kapillarelektrophoresesystems beschrieben. Die Fluoreszenzemission von beiden Kanälen wird durch den transparenten Bereich der Kapillarwand detektiert.
Der in dem Verfahren nach der Erfindung benutzte Detektor ist vorzugsweise ein Bildfelddetektor, besser jedoch ein ladungsgekoppeltes Bauelement (CCD) oder ein Ladungsinjektions-Bauelement (CID). Ein CID-Element mit linear ausgerichteten Pixeln in einer Ebene parallel zu der Kapillare ist besonders bevorzugt. Weniger als etwa sechs der linear ausgerichteten Pixel sind optisch mit mindestens einer Kapillare verbunden. Diese Pixel können ein Anfangspixel, eine mittlere Gruppe von Pixeln und ein Endpixel aufweisen. Das Verfahren umfasst weiterhin das optische Verbinden eines Anfangspixels mit einer Seitenwand der Kapillare, einer mittleren Gruppe von Pixeln mit dem Innenbereich der Kapillare und eines Endpixels mit der gegenüber liegenden Seitenwand der Kapillare. Vor dem Detektieren der Fluoreszenzemission kann vorteilhafterweise ein Pixel aus jeder mittleren Gruppe ausgewählt werden. Dies ist vorzugsweise das „hellste" mit dem Innenbereich einer Kapillare verbundene Pixel, wie oben beschrieben. Danach kann eine Random-Access-Programmierung benutzt werden, um die Fluoreszenzemission mit dem ausgewählten Pixel zu detektieren. Eine Belichtungszeitprogrammierung kann benutzt werden, um die Belichtungszeit für ein ausgewähltes Pixel invers zu der Fluoreszenzintensität während der Probenwanderung zu variieren, um die Auflösung weiter zu verbessern. Vorzugsweise wird das DNA-Fragment mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, zum Beispiel mit den PRISM^TM-Farbstoffen (die Fluoresceinderivate FAM und JOE und die Rhodaminderivative ROX und TAMRA), erhältlich von der ABD Division von Perkin Elmer (Foster City, Kalifornien).
Das Verfahren umfasst weiterhin das Bestimmen der Sequenz des DNA-Fragments durch Auftragen des Verhältnisses der Emissionsintensitäten in dem ersten Emissionskanal gegenüber dem zweiten Emissionskanal als Funktion einer Probenwanderungszeit zur Bestimmung der Nucleotide in der Sequenz, das heißt zum „Herauslesen der Basen". Das Verfahren sieht die Verwendung einer Verhältniskurve vor, die das Verhältnis der Signale aus den beiden Emissionskanälen angibt, berechnet Punkt für Punkt an jedem Datenintervall. Das Verhältnis der Intensitäten in diesen beiden unabhängigen Kanälen ist unabhängig von der Konzentration, die um den Peak variieren kann, und kann daher vorteilhaft zum Aussortieren nicht aufgelöster Komponenten in ansonsten gemischten Peaks verwendet werden.
Ebenfalls vorgesehen ist ein Verfahren der Druckinjektion zum Einführen von Proben in das Einlassende einer Kapillare bei DNA-Sequenzierungsexperimenten mit einem Multiplex-Kapillarelektrophoresesystem. Insbesondere ist eine Kapillarenanordnung von koplanaren parallelen Kapillaren vorgesehen, wobei jede Kapillare ein Einlassende und ein Ausflussende aufweist. Druck wird benutzt, um eine Probe mit einem DNA-Fragment in das Einlassende mindestens einer Kapillare zu injizieren, so dass die Probe durch die Kapillare zum Ausflussende wandert. Typische Probevolumen sind 0,1 bis 50 nl. Die Fluoreszenzemission von dem DNA-Fragment wird durch Bestrahlen mit einem Strahl kohärenten Lichts induziert. Das kohärente Licht hat vorzugsweise eine Wellenlänge von ca. 200 bis 1.500 nm, besser jedoch 250 bis 800 nm. Die Fluoreszenzemission von dem DNA-Fragment wird anschließend mit einer geeigneten Einrichtung detektiert.
Die Druckinjektion der die DNA-Fragmente enthaltenden Probe ist ein im Vergleich zu der elektromagnetischen Injektion, die üblicherweise bei DNA-Sequenzierungsexperimenten benutzt wird, überlegenes Verfahren, vor allem in einer Multiplex-Umgebung. Hierbei entfallen die Probleme aufgrund von Kreuzkontamination, weil keine Elektrode mit der Probe in Kontakt gebracht werden muss. Die Druckinjektion erfolgt meist mit einer Druckzelle zur Isolierung der Hochdruckumgebung. Der Probenbehälter wird in die Druckzelle gestellt, und die Zelle wird druckdicht verschlossen. Der Druck kann durch Gas, z. B. mit einem Stickstoffgastank, oder mit einer Pumpe oder einer druckbeaufschlagten Flüssigkeit erzeugt werden. Vorzugsweise beträgt der Druck zum Injizieren der Probe etwa 3,3 × 10⁵ bis 1,0 × 10⁶ Pa (50 bis 150 psi) (2.500 bis 7.500 Torr), besser jedoch etwa 6,7 × 10⁵ Pa (100 psi) (5.000 Torr). Die Kapillaren können praktischerweise am Einlassende aufgefächert sein, um den Kontakt mit einzelnen Druckzellen oder Probenrohren in einer Druckzelle zu ermöglichen. 15 zeigt eine geeignete Zelle für die Druckinjektion. Die Druckkammer 56 wird in einen Plexiglas-Block 51 eingesetzt, der auf einer Oberfläche 52 aus rostfreiem Stahl angeordnet ist. Die O-Ringe 53 dienen als Dichtung zwischen dem Deckel 54 und dem Block 51. Der Deckel 54 ist mit einer Mutter 55 und einem Bolzen 56 befestigt. Der Deckel 54 weist ei nen Einlass 57 zum Einleiten von Druckgas und einen Auslass 58 zum Injizieren der Probe in die Trennkapillare auf, die beide mit den Fittings 59 befestigt sind. Nach dem Einsetzen der Probe in den Probenbehälter 60 wird die Zelle abgedichtet und mit Druck beaufschlagt. Stickstoffgas wird benutzt, um die Probe in die Kapillare zu injizieren. Ein Vakuum ist nicht zur Druckinjektion geeignet, weil es keine Drücke von mehr als einer Atmosphäre, etwa 1,0 × 10⁵ Pa (14 psi) (760 Torr), unterstützt.
Die Druckinjektion einer Probe kann mit der Verwendung einer Poly(ethylenoxid)-Matrix zur Durchführung der elektrophoretischen Trennung kombiniert werden, wie nachstehend beschrieben. Die Matrix wird in der Regel mit einem Druck von 100 bis 400 psi (5.000 bis 20.000 Torr) in die Kapillare injiziert. Danach kann eine Probe mittels Druck, vorzugsweise ca. 6,7 × 10⁵ Pa (100 psi) (5.000 Torr), in die Kapillare injiziert werden. Bei diesem Druck bewirkt die Probe ein Verdrängen der Polymermatrix entsprechend dem Volumen der Probe. Es wurde jedoch festgestellt, dass diese kleine Verdrängung keine nachteilige Auswirkung auf die Trennleistung hat.
Siebmedium. Um bei der Kapillargelelektrophorese die beste Trenneffizienz für große Moleküle zu erreichen, ist es wichtig, Matrizen mit der richtigen Maschenweite zu haben, um eine geeignete Siebwirkung für die gelösten Stoffe zu erhalten. Außerdem müssen Wechselwirkungen zwischen der Kapillarwand und den gelösten Stoffen unterbunden werden, um eine gute Trenneffizienz zu erzielen. Die Verlängerung der Haltbarkeit bzw. Lebensdauer der Kapillare ist eine weitere wichtige Überlegung.
Eine Poly(ethylenoxid) (PEO) enthaltende Polymermatrix kann bei der hier betrachteten Kapillarelektrophorese benutzt werden. Insgesamt bieten PEO-Matrizen verschiedene Vorteile, zu denen unter anderem einfache Herstellung, bessere Reproduzierbarkeit und längere Haltbarkeit als bei Cellulosematrizen gehören. Im Vergleich zu linearem Polyacrylamid ist PEO stabiler, da keine weitere Polymerisierung dieser handelsüblichen Zubereitungen zu beobachten ist. Lineare Polyacrylamidzubereitungen sind handelsüblich erhältlich, jedoch noch nicht mit großen Bereich von Zahlenmitteln des Molekulargewichts (M_n), was für DNA-Separationen wichtig ist, wie nachstehend beschrieben wird. Die hier beschriebenen Matrizen sind besonders für die DNA-Sequenzierung geeignet.
Die hier ausgewählte Polymermatrix weist im Allgemeinen eine ausreichend niedrige Viskosität auf, um mittels Druck in 50 μm-Kapillaren injiziert zu werden. Die Polymermatrix weist vorzugsweise eine Viskosität von weniger als ca. 5.000 Centipoise, besser jedoch weniger als ca. 2.000 Centipoise auf, gemessen in einer Kapillare bei 1 atm und 25°C nach der Poiseuille-Gleichung. Bei einem Anwendungsbeispiel ist die Matrix eine Einzelpolymermatrix aus PEO mit einem M_n zwischen 2.000.000 und 5.000.000 bei einer Konzentration von etwa 2 bis 3%. Dies wird hier als eine „Einzelpolymermatrix" bezeichnet, weil sie aus einem einzigen handelsüblich erhältlichen Polymerprodukt mit einem bestimmten Zahlenmittel des Molekulargewichts (M_n) hergestellt ist. Es ist zu erkennen, dass auch ein handelsüblich erhältliches Polymerprodukt mit einem bestimmten M_n polydispers ist; diese Produkte (z. B. von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) weisen jedoch ein allgemein geringes Maß an Polydispersität um ihren angegebenen M_n-Wert auf. Vorzugsweise wird die Einzelpolymermatrix aus PEO mit einem M_n von 5.000.000 bei einer Konzentration zwischen etwa 2 und 2,5% hergestellt. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Polymermatrix eine Mischpolymermatrix, hergestellt aus PEO mit zwei oder mehr verschiedenen Polymerprodukten mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts zwischen etwa M_n 300.000 und M_n 8.000.000 bei Konzentrationen von 0,5 bis 2,0%, wie für die jeweilige Anwendung gewünscht. Die Auswahl der Molekulargewichte und Konzentrationen wird durch die Länge der zu trennenden DNA-Fragmente bestimmt. Vorzugsweise wird die Mischpolymermatrix aus entweder (a) je 0,6% PEO mit einem M_n von 300.000, 600.000, 1.000.000, 2.000.000, 5.000.000 und 8.000.000 oder (b) je 0,7% PEO mit einem M_n von 300.000, 600.000, 1.000.000, 2.000.000, 5.000.000 und 8.000.000 hergestellt. Vorzugsweise wird die Mischpolymermatrix aus einer binären Mischung von zwei verschiedenen Polymerprodukten hergestellt, zum Beispiel ca. 1,4% PEO mit einem M_n von 600.000 und 1,5% PEO mit einem M_n von 8.000.000. Noch vorteilhafter kann die binäre Matrix in einem Puffer mit ca. 2 bis 7 M Harnstoff, besser noch 3 bis 4 M Harnstoff und am besten 3,5 M Harnstoff hergestellt werden.
Es gehört in der Technik zur Routine, vor der Verwendung bei der Kapillarelektrophorese eine innere Polymerbeschichtung wie zum Beispiel γ-Methacryloxypropyltrimethoxysilan und Polyacrylamid (S. Hjerten, J. Chromatogr., 347, 191 (1985)) auf Kapillaren aufzubringen, um die Innenwände gegen eine Beschädigung durch eine Pufferumgebung mit hohem pH-Wert zu schützen, die bei Experimenten wie etwa der DNA-Sequenzierung benutzt wird. Nach mehreren Läufen wird die Schutzschicht jedoch allmählich abgebaut, wodurch es zu unerwünschten Schwankungen im elektroosmotischen Fluss kommt, die die Auswertung der Ergebnisse beeinträchtigen. Es wur de jedoch festgestellt, dass die Verwendung einer inneren Schutzschicht nicht die einzige Möglichkeit ist, Probleme in Zusammenhang mit dem elektroosmotischen Fluss anzugehen. Insbesondere wurde eine gute Leistung und Auflösung beobachtet, wenn die Silanolgruppen auf den inneren Kapillarwänden einer Kapillare vor einer elektrophoretischen Trennung in einem protonierten Zustand waren.
Als Beispiel wird ein Verfahren zum Detektieren einer Zielspezie in einer Probe durch Kapillarelektrophorese mit einer unbehandelten Kapillare beschrieben, die mit Säure behandelt worden ist, um die Silanolgruppen auf ihren Innenwänden zu protonieren. Insbesondere wird eine unbehandelte Kapillare mit einer unbeschichteten Innenwand aus Fused Silica mit der Säure, vorzugsweise 0,01 bis 0,5 N Salzsäure, besser jedoch etwa 0,1 N HCl, über einen ausreichenden Zeitraum in Kontakt gebracht, um die Silanolgruppen auf der Innenwand der Kapillare zu protonieren, in der Regel durch Spülen für etwa 2 Stunden. Eine Probe mit einer Zielspezie, vorzugsweise eine fluoreszierende Zielspezie, besser noch ein fluoreszierendes DNA-Fragment, wird in das Einlassende der Kapillare eingeführt, so dass sie durch die Kapillare zum Ausflussende wandert. Die Probe wird vorzugsweise durch Druckinjektion eingeführt. Danach wird die Probe mittels Fluoreszenz detektiert.
Eine Polymermatrix, vorzugsweise Poly(ethylenoxid), kann unmittelbar vor dem Einführen der Probe in die unbehandelte Kapillare gegeben werden, vorzugsweise durch Druckinjektion mit einem Druck von ca. 6,7 × 10⁵ bis 2,7 × 10⁶ Pa (100 bis 400 psi) (5.000 bis 20.000 Torr). Die Polymermatrixlösung enthält vorzugsweise ein Polymer mit einer Viskosität von weniger als 5.000 Centipoise, besser noch weniger als etwa 2.000 Centipoise, gemessen wie vorstehend beschrieben. Um ein hohes Leistungsniveau aufrechtzuerhalten, sollten die unbehandelten Kapillaren häufig regeneriert (neu protoniert) werden, vorzugsweise nach jedem Lauf, unabhängig davon, ob eine Polymermatrix benutzt wird oder nicht. Daher umfasst das Verfahren weiter das Regenerieren der Kapillare, um deren Gebrauchsdauer zu verlängern, und das Austauschen der gebrauchten Polymermatrix gegen frische Matrix. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die gebrauchte Poly(ethylenoxid)-Matrix aus der unbehandelten Kapillare entfernt, und die Kapillare wird mit Säure gespült, um die Silanolgruppen erneut zu protonieren, wie vorstehend beschrieben. Eine frische Lösung der Poly(ethylenoxid)-Matrix wird dann in die unbehandelte Kapillare injiziert und ein weiteres Kapillarelektrophoreseexperiment durchgeführt. Diese Schritte können unendlich wiederholt werden, und mehrere Expe rimente können mit derselben Kapillare durchgeführt werden, weil die Kapillare zwischen den Läufen immer mit Säure regeneriert wird. Dieses Verfahren ist besonders für DNA-Sequenzierungsexperimente geeignet.
Die Kapillarenanordnung des Kapillarelektrophoresesystems kann mindestens eine unbehandelte Kapillare mit einer unbeschichteten unbehandelten Wand aus Fused Silica mit protonierten Silanolgruppen aufweisen. Die protonierte Kapillare kann sowohl für die Kapillargelelektrophorese als auch für die Kapillarzonenelektrophorese benutzt werden. Bei der Kapillarzonenelektrophorese empfiehlt sich die Verwendung einer verdünnten Polymerlösung, vorzugsweise PEO, zum dynamischen Beschichten und Isolieren der Kapillarwände gegen die Umgebung mit hohem pH-Wert (etwa pH 8 bis 9) der Pufferlösung, um die Silanolgruppen möglichst lange protoniert zu halten.
Integriertes System. Jede Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt eine nützliche Verbesserung der Kapillarelektrophoresetechnik dar, insbesondere soweit sie sich auf die DNA-Sequenzierung bezieht. Es ist jedoch zu erkennen, dass die verschiedenen Ausführungsformen einen zusätzlichen Nutzen haben, wenn sie in Kombination mit einem integrierten System benutzt werden. Es kann zum Beispiel nötig sein, die Leistung einer oder mehrerer der kritischen Technologien zu opfern, um einen funktionsfähigen Kompromiss für großtechnische Anwendungen zu erzielen. Dies ist zum Beispiel der Fall bei Verwendung eines CID-Elements als Detektionsvorrichtung, das in einem Hochmultiplex-System vorteilhafter als ein CCD-Element ist, jedoch eventuell nicht so effizient wie ein CCD-Element in einem kleineren System ist. Daher stellt die vorliegende Erfindung weiter ein integriertes Kapillarelektrophoresesystem mit Seiteneinlassanregungsgeometrie und einem CID-Detektor bereit sowie ein Verfahren zu seiner Benutzung bei der DNA-Sequenzierung mit einer binären PEO-Polymermatrix und dem Auslesen der Basen mit einer Ein-Laser/Zwei-Emissions-Verhältniskurve.
Auch wenn sich die Erfindung allgemein auf den Einsatz in einem Multiplex-Kapillarelektrophoresesystem bezieht, wird der Fachmann erkennen, dass Aspekte der Erfindung vorteilhaft in Kapillarelektrophoresesystemen mit nur einigen wenigen Kapillaren angewendet werden können. Das Verfahren zum Auslesen der Basen, die Polymermatrix und die Verwendung unbehandelter Kapillaren sowie das Kapillarregenerierungsverfahren für die DNA-Sequenzierung können von einem Fachmann nach Bedarf ohne weiteres für Kapillarenanordnungssysteme mit nur einigen wenigen Kapillaren angepasst werden.
Die Vorteile der Erfindung werden anhand der nachstehenden Beispiele aufgezeigt. Die jeweiligen in diesen Beispielen angegebenen Materialien und Mengen derselben sowie andere Bedingungen und Details sind so zu interpretieren, dass sie allgemein für den Bereich der Kapillarelektrophorese gelten, und sollten nicht als unzulässige Einschränkung der Erfindung angesehen werden.
BEISPIELE
Beispiel I. Poly(ethylenoxid) für die hochauflösende und schnelle DNA-Separation mittels Kapillarelektrophorese
Absorptionsdetektion. Ein handelsübliches Messinstrument (Modell 3850 ISCO; Lincoln, Nebraska) wurde für alle Absorptionsuntersuchungen benutzt. Die Detektionswellenlänge war auf 260 nm eingestellt. Eine mit DB-1 beschichtete GC-Kapillare (J. & W. Scientific, Folsom, Kalifornien) mit 50 μm Innendurchmesser, 360 μm Außendurchmesser und einer Beschichtungsdicke von 0,2 μm ohne jede weitere Änderung wurde benutzt. Die Kapillarlänge betrug insgesamt 50 cm mit einer Wirklänge von 32 cm (Länge bis zum Detektor). Eine Elektromigrationsinjektion erfolgte für 2 Sekunden bei Betriebsspannung (–10 bis –30 kV).
Laserinduzierte Fluoreszenzdetektion (LIF). Der Versuchsaufbau ähnelte dem, der in P. Wang et al., J. Chromatogr., 608, 73 (1992) beschrieben ist. Ein Hochspannungsnetzteil (Glassman High Voltage, Whitehorse Station, New Jersey) wurde benutzt, um die Elektrophorese durchzuführen. Das gesamte Elektrophorese- und Detektionssystem war in einem Blechkasten mit einer Hochspannungsverriegelung untergebracht. Ein Argon-Ionen-Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm von Uniphase (San Jose, Kalifornien) und ein 1 mW Helium-Neon-Laser mit einer Wellenlänge von 543,6 nm von Melles Griot (Irvine, Kalifornien) wurden zur Anregung benutzt. Soweit die mit Thiazolorange-Dimer (TOTO) markierten DNA-Fragmente, nachstehend als DNA-TOTO-Proben bezeichnet, mit dem Argon-Ionen-Laser bestrahlt wurden, wurde ein 535 nm-Interferenzfilter (Oriel Corp., Stratford, Connecticut) verwendet, um Streulicht zu blockieren und es zu ermöglichen, dass das emittierte Licht den Fotovervielfacher (PMT) erreicht. Wenn der Helium-Neon-Laser zum Bestrahlen der DNA-TOTO-Proben benutzt wurde, wurden ein Sperrfilter RG610 und ein 630 nm-Interferenzfilter (Oriel Corp., Stratford, Connecticut) benutzt. Für mit Ethidiumbromid markierte DNA, nachstehend als DNA-EthB-Proben bezeichnet, wurden bei der Bestrahlung mit beiden La sern ein Sperrfilter RG610 und ein 630 nm-Interferenzfilter benutzt. Das Fluoreszenzsignal wurde direkt durch einen 10 kΩ-Widerstand an eine 24-Bit-A/D-Schnittstelle mit 4 Hz (Justice Innovation, Palo Alto, Kalifornien, Modell DT 2802) weitergeleitet und in einem Computer gespeichert (IBM, Boca Raton, Florida, Modell PC/AT 286).
Kapillaren und Reagenzien. Kapillaren (Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona) mit 75 μm Innendurchmesser und 365 μm Außendurchmesser wurden für Fluoreszenzuntersuchungen benutzt, nachdem sie nach dem Hjertens-Verfahren (S. Hjerten, J. Chromatogr., 347, 191 (1985)) mit γ-Methacryloxypropyltrimethoxysilan und Polyacrylamid beschichtet worden waren. Alle Chemikalien zum Herstellen von Pufferlösungen und zum Beschichten der Kapillaren wurden bei ICN Biochemicals (Irvine, Kalifornien) gekauft, mit Ausnahme von Acrylamid und Formamid, die von Sigma Chemical (St. Louis, Missouri) stammten, und Poly(ethylenoxid) (PEO), das von Aldrich Chemical (Milwaukee, Wisconsin) stammte. Ethidiumbromid (EthB) wurde bei Sigma gekauft. TOTO (Thiazolorange-Dimer) wurde bei Molecular Probes (Eugene, Oregon) beschafft. Die Konzentrationen der Farbstoffe im Laufpuffer betrugen 1 μg/ml. Der ϕX 174 DNA-Hae III Restriktionsfragment-Verdau wurde bei United States Biochemical (Cleveland, Ohio) gekauft, und die pBR 322 DNA-Hae III, pBR 328 DNA-Bg1 I + pBR 328 DNA-Hinf I Restriktionsfragment-Verdaue wurden bei Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, Indiana) gekauft.
Methoden. Die Pufferlösung zum Herstellen der PEO-Matrizen (Tris-Borat-EDTA oder „TBE") enthielt äquimolare Mengen Tris(hydroxymethyl)aminomethan (THAM) und Borsäure mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als chelatbildendes Reagens für zweiwertige Kationen. Die erhaltene Konzentration von 1 × TBE-Puffer betrug 89 mM THAM, 89 mM Borsäure und 2 mM EDTA. Der pH-Wert des 1 × TBE-Puffers betrug 8,2 ohne weitere Einstellung. Die Matrix wurde mit Poly(ethylenoxid) (PEO) und TBE-Pufferlösung in der gewünschten Konzentration hergestellt. Dazu wurde PEO nach und nach zu der TBE-Pufferlösung in einem Becherglas in einem Wasserbad bei 85 bis 90°C zugegeben. Während der Zugabe von PEO wurde ein magnetischer Rührstab mit hoher Drehzahl benutzt, um eine gut homogenisierte Lösung zu erhalten. Nach erfolgter Zugabe wurde die Lösung mindestens weitere 15 Minuten lang gerührt.
Zunächst wurde die Kapillare mit Wasser, Methanol und Wasser für mindestens zwei Zyklen druckgespült. Danach wurde die Kapillare mit sehr niedrig viskoser Polymerlösung (z. B. 0,5% PEO) gefüllt und für 10 Minuten bei –10 kV betrieben. Zum Schluss wurde die Kapillare erneut mit der Trennmatrix gefüllt und vor dem Injizieren der Probe bei der Betriebsspannung für 15 Minuten äquilibriert. Die Kapillare wurde mittels Luftdruck mit der Polymerlösung gefüllt, und die gesamte Betriebszeit betrug nicht mehr als 5 Minuten. Die Kapillare wurde ohne Qualitätsminderung über zwei Wochen für mehr als 50 Läufe benutzt.
Die injizierte DNA-Konzentration für die Mischpolymerseparationen betrug 0,83 μg/ml, und die Elektroinjektion erfolgte bei –6 kV für 3 Sekunden. Zwischen jedem Lauf wurde die gebrauchte Polymermatrix aus der Kapillare ausgespült und die Kapillare anschließend mit neuer Polymermatrix gefüllt. Vor dem Injizieren der Analyte wurde die Kapillare bei –10 kV für 10 Minuten äquilibriert.
Trennleistung. Um ein Siebmedium zu erhalten, muss die Konzentration der Polymere über einem bestimmten Wert, der sog. Überlappungsschwelle, liegen. Die Polymerketten reagieren dann miteinander zu einer verschlungenen Lösung. Die durchschnittliche Maschenweite (f) der gebildeten Poren lässt sich wie folgt ausdrücken: ξ(Φ) ≈ A Φ–0,75 (1)wobei Φ die Polymervolumenfraktion und A eine Proportionalitätskonstante ist. Weil Φ gleich S^–0,8 ist, wobei S die Größe der Polymerkette ist, lässt sich Gleichung (1) wie folgt umschreiben: ξ(Φ) ≈ AS0,6 (2)
Um also kleine Maschen zu erzeugen, muss ein Polymer mit kurzen Ketten verwendet werden und umgekehrt. Um die Kapillare bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der optimalen Maschenweite für eine gute Trennung problemlos mit der Matrix füllen zu können, ist es weiter erwünscht, Gelmatrizen mit möglichst niedriger Viskosität zu haben.
Die elektrophoretische Trennung eines ϕX 174 DNA-Hae III-Verdaus (250 μg/ml) erfolgte in aus PEO mit M_n 300.000 bis 5.000.000 bei verschiedenen Konzentrationen hergestellten Matrizen. Insbesondere wurden die Separationen mit den folgenden Matrizen durchgeführt, die mit den einzelnen bei Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wisconsin) gekauften Polymerprodukten mit den angegebenen Zahlenmitteln des Molekulargewichts (M_n) und einem geringen Maß an Polydispersität hergestellt wurden: (a) 3% M_n 300.000, (b) 3,3% M_n 300.000, (c) 2,75% M_n 1.000.000, (d) 2% M_n 2.000.000, (e) 3% M_n 2.000.000 und (f) 2% M_n 5.000.000. Das bei der elektrophoretischen Trennung angelegte Potenzial betrug –26 kV. Diese Matrizen werden hier als „Einzelpolymermatrizen" bezeichnet, um sie von „Mischpolymermatrizen", die aus zwei oder mehr Poly merprodukten mit unterschiedlichen Zahlenmitteln des Molekulargewichts hergestellt sind, und von „binären Polymermatrizen" zu unterscheiden, die aus zwei Polymerprodukten mit unterschiedlichen Zahlenmitteln des Molekulargewichts hergestellt sind. Es ist zu erkennen, dass alle Polymerprodukte notwendigerweise ein gewisses Maß an Polydispersität (Abweichung bestimmter Polymerketten von dem angegebenen Zahlenmittel des Molekulargewichts) aufweisen.
Für eine vergleichbare Trennleistung müssen die Konzentrationen von kurzkettigen Polymeren in Lösung (niedriges M_n) höher als die von langkettigen Polymeren sein. Das Erhöhen der Polymerkonzentration (festes M_n) führt im Allgemeinen zu einer höheren Auflösung, jedoch auf Kosten einer längeren Analysezeit und einer schwierigeren Handhabung der höhenviskosen Matrix. Bei diesem Experiment zeigten die 271-, 281-, 310- und 872-Basenpaarfragmente eine anomale Wanderung. Weil der molare Absorptionskoeffizient jedoch proportional zur Anzahl der Basenpaare ist, konnten die Fragment-Peaks auf der Grundlage der Peakfläche zugeordnet werden (H. M. Wenz, Nucleic Acids Res., 22, 4002 (1994)).
Im Vergleich zu celluloseartigen Gelmatrizen war die Auflösung zwischen den Paaren 271 und 281 der Fragmente bei Verwendung von PEO-Matrizen deutlich besser. Auch lieferte die mit PEO-Matrizen durchgeführte Trennung über mindestens 10 Läufe ohne Wechsel sehr gut reproduzierbare Ergebnisse. Die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Kapillaren und verschiedenen Chargen der Polymere war ebenfalls ausgezeichnet.
Auflösung. Die Auflösung (R) wird wie folgt berechnet:
wobei Δt_R die Differenz in der Wanderungszeit zwischen den beiden benachbarten Peaks und HW die volle Breite bei halbem Maximum ist. 10 zeigt die Veränderung der Auflösung pro Basenpaar für aufeinander folgende Paare von Fragmenten als Funktion der Polymermatrizen. Die verwendeten Symbole sind: 3% M_n 300.000, +, 3,3% M_n 300.000; 0, 2,75% M_n 1.000.000, Δ, 2% M_n 2.000.000, x, 3% M_n 2.000.000 und ∇, 2% M_n 5.000.000. Die Ordinatenachse gibt die numerische Reihenfolge der aufeinander folgenden Peakpaare an. Es ist zu erkennen, dass aus PEO mit M_n 2.000.000 bei 3 hergestellte Matrizen die beste Auflösung für DNA-Fragmente boten. Diese Lösung war jedoch zu viskos, um ohne weiteres mittels Druck in 50 μm-Kapillaren eingebracht zu werden. Insgesamt sollte die beste Leistung mit PEO mit M_n 5.000.000 bei einer Konzentration von etwas höher als 2% erzielt werden. Die beste Auflösung pro Basenpaar wurde für DNA-Fragmente im Bereich von 250 bis 350 Basenpaaren beobachtet. Bei DNA-Fragmenten mit einer Länge von mehr als 600 Basenpaaren verschlechterte sich die Auflösung.
Die Stärke des angelegten elektrischen Felds beeinflusst auch die Trennleistung bei der Kapillarelektrophorese. Die Form der DNA-Fragmente und der Grad der Aufspaltung des Netzwerks der Polymere können mit Änderungen der elektrischen Feldstärke variieren. Die bei einer elektrophoretischen Trennung erzeugte Wärme nimmt ebenfalls mit der elektrischen Feldstärke zu. Es ist wünschenswert, die Kapillarelektrophorese mit einer möglichst hohen elektrischen Feldstärke durchzuführen, um die Trennzeit zu verkürzen. Bei kurzen bis mittellangen DNA-Fragmenten nahm die Auflösung zu, wenn die elektrische Feldstärke von 220 V/cm auf 520 V/cm erhöht wurde, weil die Längsdiffusion minimiert wurde. Bei der höheren elektrischen Feldstärke von 600 V/cm nahm die Auflösung jedoch deutlich ab. Bei längeren Fragmenten verringert sich die Auflösung sogar mit steigender elektrischer Feldstärke. Mögliche Erklärungen sind unter anderem lokale Erwärmungsstörungen und große Veränderungen sowohl in der Form der DNA als auch der Maschenweite der Polymermatrix bei höheren elektrischen Feldstärken.
Wirkungen interkalierender Farbstoffe. Ein Vorteil der laserinduzierten Fluoreszenzdetektion (LIF) zur Beobachtung von DNA-Separationen besteht darin, dass sehr kleine Mengen DNA nachgewiesen werden können. Die elektrophoretische Trennung von 0,9 μg/ml ϕX 174 DNA-Hae-Verdau (elf Fragmente mit einer Länge von 72 bis 1.353 Basenpaaren), interkaliert mit (a) 9,5 μg/ml TOTO (ein dimerer Interkalator oder „Bi-Interkalator") für mindestens 20 Sekunden vor der Trennung, (b) 1 μg/ml EthB (ein monomerer Interkalator oder „Mono-Interkalator") im Laufpuffer und (c) 1 μg/ml TOTO im Laufpuffer wurde mit einer Kapillare mit einer Gesamtlänge von 60 cm und einer Wirklänge von 52 cm und einem anliegenden Potenzial von –12 kV durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass PEO-Matrizen mit diesen beiden interkalierenden Farbstoffen für die Trennung und Detektion von DNA-Fragmenten verträglich waren, dass aber EthB die schärfsten Peaks lieferte und das anomale Wanderungsverhalten verringerte. Alle elf Fragmente wurden aufgelöst, wenn ein Farbstoff in den Laufpuffer eingearbeitet war, aber wenn der Verdau vor der Trennung mit TOTO interkaliert wurde, wurden nur neun Peaks aufgelöst. Die Trennleistung und Empfindlichkeit verringerten sich bei nachfolgenden Läufen, wenn die Farbstoffe in den Laufpuffer eingearbeitet waren. Daher war es wichtig, dass die Kapillaren nach jedem Lauf mit neuen Polymerlösungen aufgefüllt wurden. Die Verschlechterung fiel am stärksten aus, wenn TOTO im Laufpuffer enthalten war. Möglicherweise kommt es zu starken Wechselwirkungen zwischen TOTO und der Polymermatrix oder zwischen TOTO und der Kapillarwand.
Separationen in Einzel- und Mischpolymermatrizen. Polymermatrizen wurden aus Einzel-M_n-Materialien wie folgt hergestellt: (a) 9% M_n 300.000, (b) 6% M_n 600.000, (c) 3,5% M_n 2.000.000, (d) 2,5% M_n 5.000.000, (e) 2% M_n 8.000.000 und (f) 2,5% M_n 8.000.000. Die elektrophoretische Trennung der in einem mit EthB eingefärbten pBR 322 DNA-Hae III-Verdau enthaltenen 20 Fragmente erfolgte mit einer Kapillare mit einer Gesamtlänge von 50 cm und einer Wirklänge von 32 cm und einem anliegenden Potenzial von –10 kV. Die 20 Fragmente hatten eine Größe zwischen 18 und 587 Basenpaaren. Die Peakzuordnung basierte auf den relativen Intensitäten. Aus Polymeren mit niedrigem Molekulargewicht hergestellte Matrizen erforderten eine höhere Konzentration der Polymere. Es wurde festgestellt, dass es nicht möglich war, DNA-Fragmente mit weniger als 400 Basenpaaren in Matrizen aus Polymeren mit niedrigem Molekulargewicht (M_n 300.000) zu trennen, auch wenn eine hohe Konzentration, bis zu 15%, verwendet wurde. Die Porengröße der Matrizen war zu gering, um selbst bei diesen kurzen DNA-Fragmenten eine Siebwirkung zu erzielen. Für DNA-Fragmente von 80 bis 400 Basenpaaren wurde in Matrizen aus Einzelpolymeren mit höherem M_n (z. B. M_n von 600.000 bis 2.000.000) eine bessere Auflösung erzielt. Keine verwendete Einzelpolymergröße lieferte jedoch allein eine ausreichende Effizienz über den gesamten Größenbereich.
Ausgehend von dem Konzept der Gradientenelution in der Chromatographie wurden aus Mischungen von Polymergrößen hergestellte Matrizen untersucht. PEO-Mischmatrizen wurden wie folgt hergestellt: (a) 1,5% M_n 300.000, 1,8% M_n 2.000.000, 0,7% M_n 5.000.000 und 0,7% M_n 8.000.000, (b) 3,0% M_n 1.000.000 und 1,3% M_n 8.000.000, (c) 1,5% M_n 600.000, 1,0% M_n 1.000.000 und 1,5% M_n 5.000.000, (d) je 0,6% M_n 300.000, 600.000, 1.000.000, 2.000.000, 5.000.000 und 8.000.000 und (e) je 0,7% M_n 300.000, 600.000, 1.000.000, 2.000.000, 5.000.000 und 8.000.000. Die elektrophoretische Trennung der in einem mit EthB eingefärbten pBR 322 DNA-Hae III- Verdau enthaltenen 20 Fragmente erfolgte gemäß der Beschreibung für die Einzelpolymermatrizen. In den Mischpolymermatrizen entsteht ein Polymernetzwerk mit zufälligen Porengrößen. Die Trennleistung unterscheidet sich von der bei Verwendung von Matrizen aus Einzel-M_n-Polymeren. Dies liegt daran, dass die Mischmatrizen gleichzeitig eine optimale Porengröße für einen großen Bereich von DNA-Fragmenten bieten. Anhand eines Vergleichs der Ergebnisse für die DNA-Mobilität in Matrizen aus Einzelpolymeren wurde geschätzt, dass die durchschnittliche Porengröße der Mischpolymermatrizen zwischen der von Matrizen aus 2,5% (M_n 8.000.000) und 3,5% (M_n 2.000.000) PEO liegt. Während die Auflösung für die längeren Fragmente in der Matrix aus 3,5% PEO (M_n 2.000.000) im Vergleich zu Mischpolymermatrizen schlechter war, war die Auflösung für die kurzen Fragmente besser. Andererseits lieferte die aus 2,5% PEO (M_n 8.000.000) hergestellte Matrix eine etwas höhere Auflösung für DNA-Fragmente mit einer Länge von 80 bis 400 Basenpaaren als die Mischpolymermatrizen, aber die Auflösung für kürzere Fragmente war schlechter. Für DNA-Fragmente mit einer Länge von mehr als 400 Basenpaaren kann in Mischpolymermatrizen eine relativ höhere Auflösung erzielt werden.
Ein repräsentativer Vergleich der verschiedenen PEO-Matrizen ist in 11 gezeigt. Die Poly(ethylenoxid)-Matrizen waren 6% M_n 600.000 (weißer Balken), 2,5% M_n 8.000.000 (gestrichelter Balken) und je 0,7% M_n 300.000, 600.000, 1.000.000, 2.000.000, 5.000.000 und 8.000.000 (schwarzer Balken). Die Peakzuordnungen (Peaknummer = Länge der DNA-Fragmente in Basenpaaren) waren: 1 = 18 Basenpaare (bp), 2 = 28 bp, 3 = 51 bp, 4 = 57 bp, 5 = 64 bp, 6 = 80 bp, 7 = 89 bp, 8 = 104 bp, 9 = 123 bp, 10 = 124 bp, 11 = 184 bp, 12 = 192 bp, 13 = 213 bp, 14 = 234 bp, 15 = 267 bp, 16 = 434 bp, 17 = 458 bp, 18 = 504 bp, 19 = 540 bp und 20 = 587 bp. Das Material mit niedrigem M_n (6% M_n 600.000) lieferte eine effizientere Trennung für die kürzeren DNA-Fragmente, während das Material mit hohem M_n (2,5% M_n 8.000.000) die längeren DNA-Fragmente effizienter trennte. Im Gegensatz dazu zeigte die Mischpolymerlösung eine gute Trennung für einen breiten Bereich von DNA-Fragmenten. Die höhere Viskosität der 0,7%igen Lösung kann ihren Nutzen bei der Kapillarelektrophorese jedoch einschränken, weil die Matrix im Inneren der Kapillaren leicht austauschbar sein muss. Eine 0,6%ige Mischpolymermatrix, die nachstehend beschrieben ist, lieferte eine mit den Einzelpolymermatrizen vergleichbare Auflösung unter Beibehaltung einer deutlich niedrigeren Viskosität.
12 zeigt das Ergebnisse der Trennung von DNA-Fragmenten in einer Mischung von Molekulargewichtsmarkierungen enthaltenden DNA-Fragmenten mit Größen im Längenbereich von 8 bis 2.176 Basenpaaren. Eine PEO-Mischmatrix (je 0,6% M_n 300.000, 600.000, 1.000.000, 2.000.000, 5.000.000 und 8.000.000) wurde verwendet. Die elektrophoretische Trennung erfolgte gemäß der Beschreibung für Einzelpolymermatrizen. Die Peakzuordnungen (Peaknummer = Länge der DNA-Fragmente in Basenpaaren) waren: 1 bis 20 wie in 11, 21 = 154 bp, 22 = 220 bp, 23 = 234 bp (von pBR 328), 24 = 298 bp, 25 = 394 bp, 26 = 453 bp, 27 = 517 bp, 28 = 653 bp, 29 = 1.033 bp, 30 = 1.230 bp, 31 = 1.766 bp und 32 = 2.176 bp. Alle Fragmente wurden in weniger als 30 Minuten separiert. Eine ausgezeichnete Trennleistung wurde bei den Fragmenten mit 434, 453 und 458 Basenpaaren beobachtet. Die Ergebnisse zeigen auch, dass diese Matrix verwendet werden kann, um bestimmte normale DNA-Proben von mutierten Proben zu trennen, weil Fragmente mit identischen Längen von 234 Basenpaaren, jedoch unterschiedlichen Nucleotidsequenzen (Peaks 14 und 23) sehr gut separiert wurden.
Es ist zu beachten, dass DNA-Fragmente aus normalen Sanger-Reaktionen sich insoweit von den DNA-Fragmenten unterscheiden, die in diesen Experimenten benutzt werden, als dass die Sanger-Fragmente denaturiert einzelsträngig und kovalent markiert sind statt doppelsträngig und mit einem Fluorophor interkaliert. Es wird angenommen, dass Separationen von Produkten aus Sequenzierungsreaktionen nach Sanger noch effizienter sind, weil es keine Verteilung von Konformationen oder Fluorophorzahlen pro DNA-Fragment gibt. Die hier entwickelten sehr gut reproduzierbaren Polymermatrizen für die hochauflösende Trennung von Restriktionsfragment-Verdauen oder PCR-Produkten dürften auch für die DNA-Typisierung sowie die DNA-Sequenzierung von Nutzen sein.
Beispiel II. Schnelle DNA-Sequenzierung mit gemischten
Poly(ethylenoxid)-Lösungen in unbeschichteten Kapillarsäulen
Laserinduzierte Fluoreszenzdetektion (LIFT Der Versuchsaufbau ähnelte dem in Beispiel I, außer dass ein 1 mW-Helium-Neon-Laser mit einer Wellenlänge von 543,6 nm von Melles Griot (Irvine, Kalifornien) zur Anregung benutzt wurde. Zum Blockieren von Streulicht wurden zwei Filter RG610 (Oriel Corp., Stratford, Connecticut) benutzt.
Kapillaren und Reagenzien. Kapillaren wurden beschafft und zum Teil beschichtet, wie in Beispiel I beschrieben. Alle Chemikalien zum Herstellen von Pufferlösungen und zum Beschichten der Kapillaren wurden bei ICN Biochemicals (Irvine, Kalifornien) gekauft, mit Ausnahme von Acrylamid und Formamid, die von Sigma Chemical (St. Louis, Missouri) stammten, und Poly(ethylenoxid) (PEO), das von Aldrich Chemical (Milwaukee, Wisconsin) stammte. Rauchende Salzsäure wurde bei Fisher (Fairlawn, New Jersey) gekauft. Polyacrylamidlösung (10% in Wasser, M_n 700.000 bis 1.000.000) wurde bei Polysciences (Warrington, Pennsylvania) beschafft. Ein Kalibrierungsstandard für PGEM/U DNA, hergestellt durch zyklische Sequenzierung mit handelsüblichen Vierfarb-Terminatoren und Taq-Polymerase wurden bei Nucleic Acid Facilities (Iowa State University, Ames, Iowa) beschafft.
Gel- und Pufferzubereitungen. Die 1 × -Pufferlösung wurde durch Lösen von Tris(hydroxymethyl)aminomethan (THAM), Borsäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Harnstoff in deionisiertem Wasser hergestellt, um eine Lösung mit 89 mM THAM, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA und 3,5 M Harnstoff zu erhalten, deren pH-Wert auf 8,2 eingestellt wurde.
Die Siebmatrix wurde durch allmähliche Zugabe von 1,5 g Poly(ethylenoxid) (PEO) mit M_n 8.000.000 und 1,4 g PEO mit M_n 600.000 in 100 ml Pufferlösung bei 50 bis 60°C hergestellt. Während der Zugabe von PEO wurde ein magnetischer Rührstab mit hoher Drehzahl benutzt, um das Auflösen des Polymerpulvers zu verbessern. Nach erfolgter Zugabe wurde die Lösung weitere 30 Minuten lang gerührt. Anschließend wurde die Lösung in einem Ultraschallbad für 30 Minuten entgast.
Behandlung der Kapillarwand. Eine unbehandelte Fused-Silica-Kapillare (das heißt eine Kapillare ohne zusätzliche Innenbeschichtung) mit einer typischen Gesamtlänge von 45 cm (Wirklänge 35 cm) wurde für 10 Minuten mit Methanol und danach für 2 Stunden mit 0,1 N HCl gespült und anschließend mit einer sehr niedrig viskosen Polymerlösung (z. B. 0,5% PEO) gefüllt, ehe die Polymermatrix mit einer Kanüle eingefüllt wurde. Die gefüllte Kapillare wurde vor dem Injizieren der Probe 10 Minuten lang bei der Betriebsspannung (12 kV) äquilibriert. Die DNA-Probe wurde durch Erwärmen in einer Denaturierungslösung (5 : 1-Lösung von Formamid und 50 mM wässrigem EDTA) bei 95°C für 2,5 Minuten denaturiert; danach erfolgte das Injizieren bei 6 kV für 12 Sekunden. Zwischen den Läufen wurde die gebrauchte Polymermatrix mit Hoch druck (400 psi, 20 × 10³ Torr, 3 Minuten) aus der Kapillare ausgespült und 15 bis 30 Minuten lang mit 0,1 N HCl gespült, ehe neue Polymermatrix eingefüllt wurde.
„Base Calling". Die Nucleotidbestimmung in DNA-Sequenzierungsexperimenten, das heißt das „Base Calling" bzw. Herauslesen der Basen, wurde anhand des Verhältnisses der durch zwei unterschiedliche optische Filter erfassten Emissionsintensitäten durchgeführt, wie in Beispiel V beschrieben. Eine unabhängige Bestätigung erfolgte durch Vergleich mit den mit einem handelsüblichen DNA-Sequencer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien) erhaltenen Daten.
Neuartiges Siebmedium. Ein direkter Vergleich zwischen PEO und 6% T unvernetztes Polyacrylamid wurde angestellt. (In der in der Technik üblichen Nomenklatur gibt T den prozentualen Anteil des Gesamt-Acrylamids an, während C für den prozentualen Anteil des Vernetzers steht.) Die Testprobe war eine von der Iowa State University Nucleic Acid Facility unter Verwendung der normalen mit Farbstoff markierten Terminatoren (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien) und Taq-Polymerase hergestellte DNA (PGEM/U)-Fragmentleiter. Das Verfahren zum Herstellen der Probe unterschied sich in keiner Weise von dem Verfahren, das zum Herstellen der Proben für den handelsüblichen DNA-Sequencer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien) benutzt wurde. Die injizierte Probe war in Konzentration und Zusammensetzung identisch mit den Empfehlungen für das Beschicken des handelsüblichen Geräts. Die für die DNA-Sequenzierung benutzte Matrix bestand aus 1,4% PEO M_n 600.000, 1,5% PEO M_n 8.000.000, 1 × TBE (pH 8,2) und 3,5 M Harnstoff. Polymere mit dazwischen liegendem M_n (siehe Beispiel I) waren nicht erforderlich; anscheinend können die Polymere an den beiden Enden des Größenbereichs sich so verschlängeln, dass auch die zwischenliegenden Porengrößen gebildet werden. Diese binäre Matrix lieferte eine sehr ähnliche Leistung wie die 0,7% Mischpolymermatrix (siehe Beispiel I), wies jedoch eine noch niedrigere Viskosität (1.200 Centipoise bei Raumtemperatur, gemessen in einer Kapillare bei 1 atm und 25°C nach der Poiseuille-Gleichung) als die 0,7%ige Mischung auf. Alle Experimente in diesem Beispiel wurden mit dieser speziellen binären Matrix durchgeführt.
Handelsübliches unvernetztes Polyacrylamid (10% T-Lösung, M_n 700.000 bis 1.000.000) wurde verdünnt, um eine Matrix aus 6% T, 1 × TBE und 3,5 M Harnstoff zu erhalten. Diese Lösung hatte eine gemessene Viskosität von 4.900 Centipoise bei Raumtemperatur (gemessen wie oben beschrieben). Ansonsten wurden durchweg identische Bedingungen verwendet. Die Anregung mit einem Helium-Neon-Laser bei 543 nm und zwei Tiefpassfilter RG610 selektierten vorwiegend die Cytosin- (C) und Thymidinfragmente (T) aus der DNA-Sequenzierungsreaktion nach Sanger. Lyophilisierte DNA-Proben wurden durch Erwärmen in einer 5 : 1-Lösung von Formamid und 50 mM wässrigem EDTA bei 95°C für 2 Minuten denaturiert. Die elektrokinetische Injektion erfolgte bei 6 kV für 12 Sekunden, und die Separation wurde bei 13 kV durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 13 und 14 für die Bereiche von DNA-Fragmenten mit 24 bis 108 Basenpaaren bzw. über 420 Basenpaaren gezeigt. Die Zeitspanne auf der Abszisse ist bei allen Kurven unterschiedlich. In 13 (für DNA-Fragmente mit einer Länge zwischen 24 und 108 Basenpaaren) zeigt Kurve A eine PEO-Matrix in einer beschichteten Kapillare (14 bis 19 Minuten), Kurve B eine Polyacrylamidmatrix in einer beschichteten Kapillare (37 bis 55 Minuten), Kurve C eine PEO-Matrix in einer frischen, unbehandelten Kapillare (15 bis 20,3 Minuten), Kurve D eine PEO-Matrix in einer mit HCl neu konditionierten unbehandelten Kapillare (6. Lauf, 9,5 bis 13 Minuten) und Kurve E eine Polyacrylamidmatrix in einer unbehandelten Kapillare (2. Lauf, 14,5 bis 26,5 Minuten). In 14 (für DNA-Fragmente mit einer Länge von mehr als 420 Basenpaaren) zeigt Kurve A eine PEO-Matrix in einer beschichteten Kapillare (39 bis 52 Minuten), Kurve B eine Polyacrylamidmatrix in einer beschichteten Kapillare (111 bis 129 Minuten), Kurve C eine PEO-Matrix in einer frischen, unbehandelten Kapillare (40 bis 52 Minuten), Kurve D eine PEO-Matrix in einer mit HCl neu konditionierten unbehandelten Kapillare (6. Lauf, 26 bis 33 Minuten) und Kurve E eine Polyacrylamidmatrix in einer unbehandelten Kapillare (2. Lauf, 60 bis 69,5 Minuten). Die Ordinate der einzelnen Elektropherogramme wurde jeweils angepasst, um eine ungefähre Übereinstimmung mit den anderen zu erzielen und die kleinen Peaks hervorzuheben, weil diese beim „Base Calling" aufgrund von Überlappung und einem unzureichenden Signal-Rausch-Verhältnis die meisten Probleme verursachen. Alle Peaks waren maßstabsgerecht; sie sind in den Abbildungen lediglich abgeschnitten, um die Kurven übereinander darstellen zu können. Die Abszisse jedes Elektropherogramms ist ebenfalls angepasst worden, um in jedem Fall denselben Basenpaarbereich aufzuträge Vergleich der Kurven A und B in 13 zeigt, dass für die kurzen Fragmente PEO ein Auflösungsvermögen lieferte, das dem von Polyacrylamid sehr nahe kommt. Der Hauptunterschied lag in der Separationsgeschwindigkeit. Die PEO-Kurve (Kurve A) reichte von 14 bis 19 Minuten, während die Polyacrylamidkurve (Kurve B) von 37 bis 55 Minuten reichte. Dies ist auf die höhere Viskosität der Polyacrylamidmatrix zurückzuführen. Sehr auffällig war der Unterschied in der Trennung für die großen Fragmente in 14, Kurven A und B. Die PEO-Matrix (Kurve A) lieferte klar die bessere Auflösung und könnte sogar die Konvergenzgrenze zu größeren Fragmenten hin verschieben. Im mittleren Bereich (108 bis 420 Basenpaare, Daten nicht gezeigt) gab es eine direkte Entsprechung zwischen der Auflösung für DNA-Fragmente in PEO im Vergleich zu der in Polyacrylamid, obwohl in den Polyacrylamid-Läufen für DNA-Fragmente mit einer Länge von mehr als 320 Basenpaaren bereits eine gewisse Verschlechterung zu erkennen war.
Eine vernünftige Erklärung für die Leistungsunterschiede ist die, dass die maximale Länge des Polyacrylamidpolymers nicht ausreicht, um dynamische Porengrößen zu bilden, die groß genug für die großen DNA-Fragmente sind. In der Tat müsste ein PEO-Molekül mit derselben M_n wegen der spezifischen Anordnung der Atome entlang der Hauptkette länger als Polyacrylamid sein. Das Gleiche gilt auch, wenn PEO mit anderen Polymeren verglichen wird, die bei der Kapillarelektrophorese als Siebmedium benutzt werden. Ein mit PEO verwandtes polymeres Material ist Poly(ethylengycol) (PEG). Von der Struktur her ist PEG beinahe identisch mit PEO, aber das Ausgangsmonomer und der Polymerisationsprozess sind unterschiedlich. Letzteres ist vermutlich der Hauptgrund, weshalb handelsübliche PEG-Zubereitungen nicht in den Millionen von Dalton erhältlich sind, in denen PEO zu kaufen ist, und weshalb PEG keine geeignete unvernetzte Matrix für die Kapillarelektrophorese ist.
Säulenbehandlungsverfahren. Auch wenn das Siebmedium nach jedem Lauf ausgetauscht wird, um die wiederholte Benutzung der Kapillaren zu ermöglichen, wird die Schutzschicht (S. Hjerten, J. Chromatogr., 347, 191–198 (1985)) auf der Innenwand der Kapillare allmählich abgebaut. Es ist versucht worden, die Beschichtung nach mehreren Läufen durch Repolymerisation von Polyacrylamid in situ zu regenerieren (S. Hjerten, J. Chromatogr., 347, 191–198 (1985)). Die ursprüngliche Leistung konnte auf diese Weise jedoch nicht reproduzierbar wiederhergestellt werden. Bei anderen Versuchen hat man die Polyacrylamidbeschichtung von vornherein weggelassen (H. Swerdlow et al., Electrophoresis, 13, 475–483 (1992), M. Starita-Geribaldi et al., Electrophoresis, 14, 773–781 (1993)). Die Silanolgruppen auf der Wand aus Fused Silica können zum Beispiel irreversibel kovalent modifiziert werden, indem man die Kapillare mit 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan behandelt (Silanisierung), und die Kapillaren können ohne weite re Polymerisation mit Polyacrylamid benutzt werden. Der elektroosmotische Fluss war anfangs bei Verwendung solcher Kapillaren in der Tat deutlich reduziert, wie an den Wanderungszeiten des Primer-Peak und dem hohen MW-Konvergenz-Peak zu erkennen ist. Die Trennleistung war jedoch so stark beeinträchtigt, dass eine Sequenzierung von DNA-Fragmenten mit einer Länge von mehr als 200 Basenpaaren nicht möglich war.
Weil der Hauptzweck der Beschichtung der Kapillarsäule darin besteht, den elektroosmotischen Fluss auszuschalten, wurden alternative Ansätze zur Beseitigung des elektroomotischen Flusses untersucht. Um festzustellen, ob eine DNA-Sequenzierung auf einer unbehandelten Säule aus Fused Silica durchgeführt werden kann, das heißt ob das Siebpolymer allein in der Lage ist, die Kapillarwände wirksam zu beschichten und zu isolieren, wurden handelsübliche unbehandelte Fused-Silica-Kapillarsäulen mit Methanol ausgewaschen, und direkt danach wurde die Polymermatrix in die unbehandelten Kapillaren eingeführt und ein DNA-Sequenzierungslauf gestartet.
DNA-Separationen in unbehandelten Kapillarsäulen sind in 13, Kurve C (DNA-Fragmente mit einer Länge von 24 bis 108 Basenpaaren), und in 14, Kurve C (Länge über 420 Basenpaare), für die PEO-Mischpolymermatrix gezeigt. Der Vergleich von Kurve A (beschichtete Kapillaren) und Kurve C (unbeschichtete Kapillaren) in 13 bzw. 14 zeigt, dass es praktisch keinen Unterschied in den Elektropherogrammen mit oder ohne Beschichtung der Kapillarwand gibt. Selbst die tatsächlichen Wanderungszeiten sind nahezu identisch. Dies ist der erste Nachweis einer DNA-Sequenzierung mittels Kapillarelektrophorese ohne eine aufgebrachte Beschichtung auf der Säulenwand. Obwohl diese Ergebnisse für eine neue Kapillarsäule reproduziert werden können, setzt leider schon nach ein oder zwei Läufen eine unvermeidliche Abnahme der Auflösung ein. Die Wanderungszeiten wurden zunehmend länger, und die mit den längsten Fragmenten verbundenen Peaks waren nicht mehr zu erkennen. Ein Auswechseln der Kapillarenanordnung nach jedem Lauf ist natürlich keine sinnvolle Möglichkeit für die DNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz.
Daher wurde die Säule mit deionisiertem Wasser, Methanol, Pufferlösung oder 1 M NaOH plus Kombinationen davon gespült, um zu versuchen, die Oberflächeneigenschaften der Säule zu regenerieren. Die ursprüngliche Leistung konnte jedoch in keinem Fall wiederhergestellt werden. Es wurde jedoch festgestellt, dass sich die ursprünglichen Eigenschaften der Säulenoberfläche durch Spülen der Säule mit Säure (0,1 N HCl) zwischen den Läufen wiederherstellen ließen.
Die Leistung einer unbehandelten Fused-Silica-Säule für die Kapillarelektrophorese bei der Separation von DNA-Fragmenten nach sechs Zyklen aus Füllen mit PEO, DNA-Elektrophorese, PEO-Druckentlastung und Konditionieren mit 0,1 N HCl ist in den Kurven D in 13 und 14 (Separation von DNA-Fragmenten mit einer Länge von 24 bis 108 Basenpaaren bzw. mehr als 420 Basenpaaren) gezeigt. Es gibt keinen erkennbaren Unterschied in der Auflösung zwischen diesem Elektropherogramm und denen für eine beschichtete Säule/PEO (Kurven A in 13 und 14) oder für eine frische unbehandelte Säule/PEO (Kurven C in 13 und 14). Es gibt geringfügige zufällige Schwankungen der Wanderungszeiten, aber keine systematische Veränderung über den Zeitverlauf. Weil keine aufgebrachte Beschichtung benutzt wurde, gab es nichts, was hätte abgebaut werden können. Daher sollte die Säule im Prinzip unendlich lange halten. Dies ist der erste Nachweis für die erweiterte, längere Nutzung einer Kapillarelektrophorese-Kapillare für die DNA-Sequenzierung.
Ein überraschendes Ergebnis ist, dass die in den mit HCl behandelten Kapillaren beobachteten Wanderungszeiten erheblich kürzer sind als für alle Polymermatrix/Oberflächenbehandlungen, unabhängig davon, ob hier oder in der Literatur beschrieben. Der unerwartete Vorteil aus der Verwendung von mit HCl behandelten, unbeschichteten Säulen ist der, dass DNA-Fragmente mit Längen von 28 bis 420 Basenpaaren in einer Zeitspanne von nur 16 Minuten mit einer durchschnittlichen Rate von 25 Basenpaaren pro Minute (bp/Minute) eluiert werden. Dies ist um den Faktor 3 bis 5 schneller als die bekannten Ergebnisse mit unvernetztem Polyacrylamid in beschichteten Kapillaren.
Als Letztes wurde die Leistung einer unvernetzten Polyacrylamidmatrix in einer unbehandelten Fused-Silica-Kapillare untersucht (Kurven E in 13 und 14). Die Auflösung für die kurzen Fragmente (Kurve E, 13) ist die beste aller hier untersuchten Systeme, aber die Auflösung für Fragmente mit einer Länge von mehr als 420 Basenpaaren (Kurve E, 14) ist die schlechteste. Dieses Elektropherogramm ist tatsächlich der zweite Lauf in der unbehandelten Säule, was zeigt, dass der Abbau langsamer als im Falle der PEO-Matrix in einer unbehandelten Säule verläuft. Dennoch war aufgrund eines Anstiegs des elektroosmotischen Flusses eine allmähliche Verschlechterung zu erkennen, denn der erste Lauf begann 0,5 Minuten früher und endete 10 Minuten früher. Dies stimmt mit der Tatsache überein, dass Polyacrylamid eine höher viskose Matrix ist, so dass die Ionen im Hauptmedium länger brauchen, um die Oberflächen silanolgruppen im gleichen Umfang zu titrieren. Das Rekonditionierungsverfahren mit HCl war unwirksam, nachdem eine Säule mit Polyacrylamid gefüllt worden war.
Systemintegration. In Erwartung der Notwendigkeit einer Spülung, Neukonditionierung und Wiederbefüllung der Kapillarsäulen nach jedem von vielen Läufen und der Notwendigkeit, mehrere Proben getrennt in die Anordnung zu injizieren, wurde eine für diesen Vorgang geeignete Druckzelle entwickelt. Der nötige Druck zum Füllen einer Kapillare mit dieser relativ niedrigviskosen Siebmatrix beträgt nur etwa 100 bis 400 psi (5 × 10² bis 20 × 10³ Torr), je nach der für jeden Vorgang zulässigen Zeit. Die in 15 gezeigte Zelle ist für den Ein-Kapillaren-Betrieb in den meisten vorstehend beschriebenen Experimenten benutzt worden. Bei 100 Kapillaren in einem Bündel kann das Auslassende zusammengefasst werden, um eine dicht gepackte Gruppe mit einem Durchmesser von nur 2 mm zu erhalten. Diese passt durch denselben Fitting wie in 15, um denselben Recyclingprozess zu realisieren. Die Druckinjektion trägt zur Vermeidung einer Kreuzkontamination der Probe durch die Elektroden bei und macht elektrische Kontakte an jeder Probenphiole in einer großen Anordnung vollkommen überflüssig.
Beispiel III. Optimierung der Anregungs- und Detektionsgeometrie für die Multiplex-Kapillarelektrophorese von DNA-Fragmenten
Seiteneinlassanregung. Das Schemadiagramm des Versuchsaufbaus ist in 1 gezeigt. Ein luftgekühlter Argon-Ionen-Laser (Uniphase, San Jose, Kalifornien, Modell 2213-150ML), der gleichzeitig mehrere sichtbare Linien liefert, wurde zur Anregung benutzt. Die Wellenlänge des Lasers wurde mit einem Interferenzfilter oder einem Glasprisma gewählt. Bei Verwendung eines Glasprismas ermöglicht der Aufbau eine Anregung mit mehreren Farben. Der Laserstrahl wurde mit einer Linse mit einer Brennweite von 10 cm (Edmund Scientific Co., Barrington, New Jersey) gebündelt. Der Bereich, über den der Strahldurchmesser kleiner als 75 μm blieb, betrug 1,5 cm. Dies wurde durch Verschieben einer Fotodiode (Hamamatsu Corp., Middlesex, New Jersey) über den Strahl in Verbindung mit einer Lochblende von 5 μm bestätigt. Der Ausgang der Fotodiode wurde mit einem Digital-Multimeter (Keithley Instruments, Cleveland, Ohio) überwacht. Zwei Spiegel (Melles Griot, Irvine, Kalifornien) wurden benutzt, um die Richtung des Laserstrahls parallel zu der Ebene der Kapillarenanordnung und durch die Mitten der Kapillaren hindurch einzustellen.
Fused-Silica-Kapillaren (Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona, Modell TSP075150, 75 μm Innendurchmesser, 150 μm Außendurchmesser, Gesamtlänge 50 cm, Wirklänge 35 cm) wurden mit Klebeband (wasserfestes Klebeband der Marke 3M SCOTCH, St. Paul, Minnesota) dicht gepackt auf einer polierten Aluminiumoberfläche befestigt. Die Detektionsfenster von 1 cm wurden durch Entfernen der äußeren Polyimidbeschichtung mit kochender Schwefelsäure erhalten. Die Kapillaren waren in der Flüssigkeitszelle in Wasser eingetaucht. Zum Feineinstellen der Position der Zelle wurde ein Translationstisch benutzt, um den Brennpunkt des Lasers auf den Mittelpunkt der Anordnung einzustellen.
CCD-Detektionssystem. Der Kamerakopf (CH-220 mit thermoelektrischer Kühlung/Wärmeableitung durch Flüssigkeitszirkulation, Photometrics TH7883-PM) wurde auf –40°C gekühlt. Er war oben auf der Anordnung mit Blickrichtung nach unten befestigt. Die 384 × 576 Pixel waren jeweils quadratisch mit einer Kantenlänge von 23 μm. Die Kameraelektronik (CE-200) enthielt einen Analog-Digital-Wandler (ADC) mit einer Genauigkeit von 14 Bit und einer mittels Software einstellbaren Umwandlungsverstärkung.
Die Kamerasteuerung (CC-200) bestand aus einem Prozessor 68000, einem Bildrahmen-RAM-Speicher (12 MB), einem Firmware-ROM, einer IEEE-488-Schnittstelle zu einem Host-Personalcomputer, einem Maus-Anschluss und Schnittstellenschaltung für einen Videomonitor (RS-170). Das RS-170-Teilsystem und die Maus lieferten dem Experimentator Feedback sowohl beim Abgleich der Geräte als auch bei der Datenerfassung. Die Kapillarenanordnung im Detektionsbereich wurde mit einem 24 mm-Weitwinkelobjektiv (Canon, Tokio, Japan, Modell FD 24 mm, F1.4L, 50 mm Durchmesser) auf den CCD-Sensor abgebildet. Vor dem Objektiv wurden in verschiedenen Experimenten unterschiedliche Filter angeordnet.
Die Software für die CCD-Bilddatenerfassung stammte von Photometrics (Tucson, Arizona). Die Datenanalyse erfolgte offline mit in Turbo Basic (Borland) geschriebener Software. Während der Datenerfassung wurden alle Bilder im Cache-Speicher gespeichert, dessen Inhalt später auf die Festplatte übertragen wurde. Die maximale Anzahl der Aufnahmen richtete sich nach der Größe des RAM-Speichers und der Größe jedes Bildes. Durch das Erfassen von drei aufeinander folgenden Pixeln entlang jeder Kapillare betrug die Pixelanzahl bei 100-Kapillaren für jeden Rahmen bzw. jedes Bild nur 200.
Fokuseinstellung. Um eine möglichst effiziente Abbildung zu erreichen, wurde jede Kapillare auf eine Breite von 2 CCD-Pixeln abgebildet. Bei seitlich dicht nebeneinander in einer Anordnung gepackten Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 75 μm und einem Außendurchmesser von 150 μm markierten abwechselnde Pixel die flüssigen Kerne der Kapillaren. Die benachbarten Kapillarwände, die nutzlose Daten darstellten, wurden auf die zwischenliegenden Pixel abgebildet.
Die Erzielung der besten Fokussierung bzw. Scharfeinstellung wurde durch die Benutzung des Videomonitors RS-170 erleichtert. Eine Reihe von Bildern wurden aufgenommen und auf dem Videomonitor angezeigt, um jeweils geringfügige Einstellungen der Schärfe zu ermöglichen. Für die Endeinstellung wurden zwei unbehandelte, mit 10^–10 M Fluorescein gefüllte Säulen auf beiden Seiten der Anordnung benutzt. Die bestmögliche Fokussierung resultiert in der kleinsten Anzahl von Pixeln und dem stärksten Signal für jede Kapillare.
Empfindlichkeitstest. Die 488 nm-Laserlinie (ca. 25 mW) wurde mit einem Glasprisma zur Anregung ausgewählt. Fünf Kapillaren wurden seitlich nebeneinander in die Flüssigkeitszelle mit seitlichem Einlass gepackt. Der Laufpuffer war 10 mM Phosphat mit einem pH-Wert von 9,5. Die elektrophoretische Trennung wurde bei –20 kV mit einem Hochspannungsnetzteil (Spellman, Plainview, New York, Modell UHRSOPN50) durchgeführt. Proben mit 9,0 × 10^–11 M Fluorescein wurden durch elektrokinetische Injektion für 3 Sekunden eingeführt. Zwei Sperrfilter (Melles Griot, Modell OG550) wurden vor der CCD-Kamera angeordnet, um Streulicht zu unterdrücken. Die Datenerfassung wurde 1 Minute nach Beginn der Elektrophorese gestartet.
Fluoreszenzdetektion von DNA-Größenmarkierungen. Die Laserlinie bei 514 nm (3 mW) wurde gewählt, um die Analyte zu bestrahlen. Ein Sperrfilter RG610 und ein 630 nm-Interferenzfilter (Oriel Corp., Stratford, Connecticut) wurden benutzt, um Streulicht zu reduzieren. Die Signale wurden mit der CCD-Kamera bei einer Rate von 1 Hz mit 0,8 Sekunden Belichtungszeit erfasst. Neun Kapillaren, aufgeteilt in drei Gruppen zu je drei Kapillaren, waren entlang des Laserstrahl angeordnet. Die mittleren drei Kapillaren lagen an der Strahltaille des Lasers (dem Brennpunkt, d. h. dem Punkt auf dem Strahl mit dem kleinsten Durchmesser). Die beiden anderen Gruppen befanden sich an den Kanten, jeweils 0,75 cm von Strahltaille entfernt. Die Kapillaren waren beschichtet wie in Beispiel I beschrieben. Die Gesamtlängen der Kapillaren betrugen 50 cm und die Wirklängen 35 cm oder 40 cm. In jeder Gruppe war die Kapillare in der Mitte länger als die beiden anderen, um eine unterschiedliche Reihe von Wanderungszeiten zu erzeugen. Das Hochspannungsnetzteil wurde bei –10 kV betrieben.
Der Laufpuffer war 1 × TBE (89 mM Tris., 89 mM Borsäure und 2 mM EDTA) mit 1 μg/ml Ethidiumbromid (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Die Polymermatrix war eine Lösung von je 0,6% Poly(ethylenoxid) (PEO) mit M_n 300.000, 600.000, 1.000.000, 2.000.000, 5.000.000 bzw. 8.000.000 (die einzelnen Polymerprodukte stammten von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin). Ein pBR 322 Hae III DNA Restriktions-Verdau (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) wurde mit deionisiertem Wasser verdünnt und bei 10 kV von der negativen Hochspannungsseite für 3 Sekunden injiziert. Vor dem Injizieren wurden die Kapillaren bei 10 kV für 10 Minuten äquilibriert. Nach jedem Lauf wurden die gebrauchten Polymermatrizen aus den Kapillaren ausgespült. Danach wurden die Kapillaren mit einer frischen Polymerlösung gefüllt.
Trennen der DNA-Sequenzleiter. Die 488 nm-Laserlinie bei 10 mW wurde zur Anregung gewählt. Ein 488 nm-Interferenzfilter wurde benutzt, um die Plasmalinien zu beseitigen. Zwei Sperrfilter OG515m (Oriel Corp., Stratford, Connecticut) wurden zur Unterdrückung der Laserlinie benutzt. Eine Kapillare aus der mittleren Gruppe in der vorstehenden Anordnung wurde für die Separation (bei –10 kV) ausgewählt.
Die Puffer und Polymermatrizen waren dieselben, außer dass 5 M Harnstoff zugegeben wurden. Die Proben für die DNA-Sequenzierungstests (PGEM/U) wurden aus der Sanger-Reaktion nach Standardverfahren (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien, DyeDeoxy-Terminatoren und zyklische Sequenzierung mit Taq-Polymerase) in der DNA Facility der Iowa State University (Ames, Iowa) hergestellt. Eine 1,7 μl-Denaturierungslösung (Verhältnis von EDTA zu Formamid = 1 : 5) wurde der Probenphiole zugegeben. Diese wurde für 3 Minuten in ein Wasserbad (90 bis 100°C) getaucht, um die DNA zu denaturieren. Die Probe wurde bei –3 kV für 12 Sekunden injiziert.
Ergebnisse. Bei einem Empfindlichkeitstest des Systems waren die Fluoreszenzsignale von einer Injektion von 9,0 × 10^–11 M Fluorescein in jede Kapillare leicht zu detektieren. Die Detektionsgrenze wurde durch Extrapolation bestimmt und sollte im niedrigem Picomol-Bereich (pM) liegen. Es wurde unabhängig bestätigt, dass die Systemreaktion in diesem Bereich linear abhängig von der Konzentration war. Im Vergleich zu den mit einem früheren Aufbau erhaltenen Ergebnissen (K. Ueno et al., Anal. Chem., 66, 1424 (1994)) war eine mindestens hundertfache Verbesserung festzustellen. Bei dem früheren Aufbau war der Laser in eine dünne Linie aufgeteilt, um 100 Kapillaren abzudecken. Unter Berücksichtigung der Teile des Laserstrahls, die auf die Abstandsrillen verschwendet wurden und die außerhalb der Anordnung lagen, wurde bei diesem Aufbau jede Kapillare tatsächlich mit weniger als 0,5% der Laserleistung bestrahlt. Bei dem in diesem Beispiel verwendeten Aufbau passierte der Laser nacheinander alle Kapillaren. Wegen der niedrigen Konzentration der DNA-Proben (10^–10 M) war die Laserleistung trotz der Verwendung von Farbstoffen mit sehr hohen Absorptionskoeffizienten (10⁵) als Markierungen nach dem Durchqueren einer Kapillare um weniger als 0,0001% verringert. Daher verringert sich die für jede nachfolgende Kapillare verfügbare Laserleistung nicht wesentlich aufgrund der Absorption der DNA-Proben in den vorangegangenen Kapillaren. Dies ermöglicht die Verwendung niederenergetischer Laser, was die Gefahr des Ausbleichens der Zielspezien verringert.
Eine wichtige Überlegung ist hierbei die Lichtstreuung und Brechung durch die zylindrischen Kapillarwände. Das Eintauchen der Kapillaren in Wasser, das in etwa denselben Brechungsindex wie die Kapillaren (1,45) aufweist, hat sich als die Lösung für das Problem der Lichtstreuung und Brechung erwiesen. Die elektrophoretische Trennung von pBR 322 Hae III-Fragmenten (0,125 μg/ml) erfolgte mit einem Argon-Ionen-Laser (514 nm, 3 mW) und elektrokinetischer Injektion (3 Sekunden bei –10 kV). Der Verdau enthielt Fragmente der folgenden Größen (in Basenpaaren): 51, 57, 64, 80, 89, 104, 123, 124, 184, 192, 213, 234, 267, 434, 458, 504, 540 und 587. Brechung und Lichtstreuung waren im Vergleich zum Betrieb in Luft deutlich verringert. Von allen Kapillaren wurden relativ gleichmäßige Signale erhalten. Die Variation der von den drei im Abstand von 0,7 cm angeordneten Gruppen (siehe 7) erhaltenen Detektionsgrenze lag um den Faktor 2, was aufgrund der unterschiedlichen Spotgröße des Lasers an jeder Stelle nicht überraschend ist. Bedingt durch die Abmessungen der Kapillare im Mikrometerbereich ist die Aufrechterhaltung der Ebenheit der Anordnung, damit der Laser die Mitten der Kapillaren durchqueren kann, wichtig, um gleichmäßige Signalpegel für die Anordnung zu erhalten. Eine noch bessere Anpassung des Brechungsindex ist durch Auswahl des geeigneten Eintauchfluids möglich, erwies sich jedoch als unnötig.
Das Übersprechen zwischen den Trennkanälen ist ein weiterer wichtiger Aspekt, vor allem bei einem Multiplex-Detektionssystem. Das von den Wänden der nebeneinander liegenden Kapillaren gebrochene Fluoreszenzlicht verursacht Übersprechen. Nach wiederholten Versuchen wurde festgestellt, dass das Übersprechen mit diesem optischen Aufbau und bei guter Ausrichtung der Kapillaren weiter verringert werden kann. Wird zum Beispiel eine Kapillare (150 μm Außendurchmesser) auf die Größe nur eines Pixels des CCD-Elements fokussiert, kann ein Übersprechen nicht vermieden werden. Bedeckt die Bildgröße einer Kapillare jedoch zwei Pixel, so dass der Flüssigkeitskern genau einem Pixel entspricht, und werden die benachbarten Pixel auf die Kapillarwände abgestimmt, wird kein Übersprechen beobachtet.
Die elektrophoretische Trennung von pBR 322 Hae III DNA-Fragmenten (0,05 μg/ml) erfolgte mit einem Argon-Ionen-Laser (514 nm, 3 mW) und elektrokinetischer Injektion (3 Sekunden bei –10 kV). Die Fluoreszenz wurde von sieben aufeinander folgenden Pixeln detektiert, die sich über drei aufeinander folgende Kapillaren erstreckten. Die Flüssigkeitskerne der Kapillaren entsprachen dem zweiten, vierten und sechsten Pixel. Das dritte Pixel teilten sich die erste und zweite Kapillare, und das fünfte Pixel teilten sich die zweite und dritte Kapillare. Obwohl in diesen beiden Pixeln Übersprechen festgestellt wurde, waren die zweiten, vierten und sechsten Pixel, die den Mitten der drei Kapillaren ansprachen, vollkommen frei von Übersprechen. Die höheren Intensitäten der Peaks in diesen drei Pixeln bestätigten außerdem, dass sie die Mitten der Kapillaren repräsentierten. Diese Ergebnisse wurden durch Anpassen des Brechungsindex durch Eintauchen der Kapillaren in Wasser erreicht, zusammen mit einer guten Fokussierung und Ausrichtung aller Kapillaren in der Anordnung.
Die elektrophoretische Trennung von PGEM/U DNA-Fragmenten aus der Sequenzierungsreaktion nach Sanger erfolgte mit einem Argon-Ionen-Laser (488 nm, 10 mW) und elektrokinetischer Injektion (12 Sekunden bei –3 kV). Eine Kapillare in der mittleren Gruppe wurde überwacht. Die Probe wurde nach dem üblichen Verfahren mit Taq-Polymerase und mit Farbstoff markierten Terminatoren hergestellt. Das Verfahren zum Herstellen der Probe unterschied sich in keiner Weise von dem Verfahren, das zum Herstellen der Proben für den handelsüblichen DNA-Sequencer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien) benutzt wurde. Die injizierte Probe war in Konzentration und Zusammensetzung identisch mit den Empfehlungen für das Beschicken des handelsüblichen Geräts. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen erzeugten Fluoreszenzsignale vorwiegend von den Sanger-Sequenzierungsfragmenten Adenosin (A) und Guanin (G). Von den längeren Fragmenten wurde wegen des „elektrokinetischen Injektions-Bias" und der Ineffizienz der Polymerasereaktion weniger injiziert. Die Bildrate für die Datenerfassung betrug 1 Hz (Belichtungszeit 0,8 Sekunden). Die Datenrate war durch die nicht lineare Reaktion des CCD-Verschlusses begrenzt, wenn sich die Gesamtzeit auf 0,1 Sekunden verringerte. Die zeitliche Auflösung war ausreichend für diese spezielle DNA-Separation, wie an den Formen und Abständen der frühen Elutionspeaks zu erkennen ist. Für noch schnellere Separationen muss die Datenrate jedoch erhöht werden. Bei einer Belichtungszeit von 0,8 Sekunden reichte die Empfindlichkeit des Systems für tatsächliche DNA-Sequenzierungsläufe aus. Die Empfindlichkeit war in der Tat durch Hintergrundfluoreszenz von der Polymermatrix und nicht durch zu geringe Fluoreszenzintensität von den DNA-Fragmenten eingeschränkt. Es wurde nachgewiesen, dass Fragmente mit einer Länge bis zu 450 Basenpaaren mit Belichtungszeiten von 0,5 Sekunden separiert und detektiert werden können.
Die Datenrate für die neue Generation von CCD-Elementen, selbst im Modus mit hoher Empfindlichkeit und niedriger Scangeschwindigkeit, kann im Bereich von Millisekunden pro Bild liegen. Daher ist die Verwendung eines CCD-Detektors sinnvoll, auch wenn die Separationsgeschwindigkeit weiter erhöht wird. Es wurde bestätigt, dass der CCD-Verschluss während der gesamten Separation offen gehalten werden kann, während die Bildrahmen in konstanten Intervallen ausgelesen werden. Selbst bei der relativ niedrigen Datenleserate (50 kHz) war kein Verwischen der Daten zu beobachten, wenn die Ladungen in den CCD-Spalten nach unten verschoben werden. Für 100 Kapillaren (200 Pixel) betrug die Gesamtzeit zum Verschieben einer ganzen CCD-Spalte nur 4 Millisekunden, was im Vergleich zu der Belichtungszeit kurz ist. Die Bildrate der Kamera kann für Belichtungszeiten von 0,5 Sekunden auf 0,6 Sekunden verringert werden. Ein Nachteil ist der, dass bei diesen älteren Versionen von CCD-Elementen ganze Teilanordnungen ausgelesen werden müssen. Wird der Aufbau modifiziert, um eine Anregung mit zwei oder mehr Laserlinien zu ermöglichen (K. Ueno et al., Anal. Chem., 66, 1424 (1994)), ist es vorteilhafter, einen CID-Detektor wie in Beispiel IV zu benutzen, der den direkten Zugriff auf die Daten ermöglicht, oder aber neuere Versionen von CCD-Kameras einzusetzen, die das Auslesen einzelner Teilanordnungen erlauben.
Beispiel IV. Untersuchung des Potenzials von Ladungsiniektions-Bauelementen für die DNA-Sepuenzierung mittels Multiplex-Kapillarelektrophorese
Material und Methoden. Als Bildfelddetektor wurde das wissenschaftliche CID-Kamerasystem SCM5000E (CID Technologies Inc., Liverpool, New York) benutzt. Das System bestand aus einer Steuerung und einen Kamerakopf. Der Kamerakopf umfasste einen Bildfelddetektor mit je 512 Pixeln in horizontaler und vertikaler Richtung, der in einer Dewar-Kammer installiert war, um die Kamera mit flüssigem Stickstoff zu kühlen. Das System kann auch bei Umgebungstemperatur betrieben werden. Das System war an einen Host-Computer 486 DX/33 MHz (Electra, Ames, Iowa) angeschlossen. Alle Befehle und Konfigurationsparameter für den Betrieb des Kamerasystems konnten mit dem Host-Computer programmiert werden. Das CID-Betriebsprotokoll wurde unter Benutzung der CIDTEC-Standardfunktionsbibliotheken entwickelt. Hierbei handelt es sich um mit dem CID-System gelieferte Bibliotheken von Subroutinen. Zur Entwicklung des Betriebsprotokolls wurden die entsprechenden Subroutinen ausgewählt und mit einer in C geschriebenen Subroutine mit Hilfe von Microsoft Quick C 2.5 als Compiler zusammengestellt.
Ein Nikon-Objektiv F/1.4 (Nikor 28 mm Brennweite, Weitwinkel) war an dem CID-Kamerakopf angebracht. Für unterschiedliche Vergrößerungsfaktoren war zwischen der CID-Objektivfassung und dem Objektiv ein Nikon-Zwischenring vorgesehen.
Um die Kamera in vertikaler Richtung zu betreiben, wurde die Kopfeinheit mit Blickrichtung nach unten auf eine Aluminiumplatte von 9'' × 9'' × 1'' (22,9 cm × 22,9 cm × 2,5 cm) gelegt. Die Objektivfassung und das Objektiv standen an der Unterseite der Platte durch eine Öffnung hervor. Die Aluminiumplatte ruhte auf vier mit Maßeinteilungen versehenen Bronzestangen mit einem Durchmesser von 1'' (2,5 cm). Jede Stange konnte durch eine Öffnung von 1'' (2,5 cm) Durchmesser an der Ecke der Platte gesteckt und mit einer Schraube befestigt werden, so dass die Kamera auf die gewünschte Höhe eingestellt werden konnte. Um die Stabilität der Kamera zu erhöhen, wurde das Oberteil der Dewar-Kammer zwischen zwei halbkreisförmigen Aluminiumplatten eingespannt. Eine der halbkreisförmigen Platten war an zwei Bronzestangen angebracht, die auf der Aluminiumhauptplatte befestigt waren.
Ein U-förmiger Kapillarenhalter war auf einem Translationstisch befestigt, der an einer magnetischen Bühne befestigt war. Eine Kapillare wurde horizontal über den U-förmigen Halter gelegt, und eine oder mehrere Kapillaren können parallel zueinander auf den Halter aufgelegt werden. Zum Trennen der DNA-Proben wurde eine Kapillarsäule mit Polyacrylamid beschichtet und mit einer Matrix aus einer Mischung von Poly (ethylenoxid) (PEO)-Polymeren, Tris-Borat-EDTA (TBE)-Pufferlösung und 5 M Harnstoff gefüllt. Die ausführlichen Verfahren zur Herstellung der polyacrylamid beschichteten Kapillaren, Puffer und Trennmatrix sind in den Beispielen I und II beschrieben. In diesem Beispiel wurde eine Kapillare von 45 cm Länge, 360 μm Außendurchmesser und 75 μm Innendurchmesser benutzt. In 30 cm Entfernung vom Injektionsende wurde ein 1 cm großer Abschnitt der Polyimidbeschichtung mit Schwefelsäure weggeätzt, um ein Detektionsfenster zu bilden. Die Kapillare wurde mit Wasser und dann mit der Polymermatrix gefüllt, und zwar unter einem Druck von 2,7 × 10⁶ Pa (400 psi) aus einem Stickstoffgastank. Zwei 10 ml-Phiolen mit TBE-Puffer wurden an beiden Enden der Kapillare angesetzt. Die Proben wurden bei –9 kV für 6 Sekunden injiziert. Für die Elektrophorese wurde ein Potenzial von –9 kV am Injektionsende der Kapillare angelegt, während das andere Ende geerdet war. Nach dem Füllen der Kapillare mit der Polymermatrix, jedoch vor dem Injizieren einer Probe wurde die Kapillare 10 Minuten lang vorlaufen gelassen, um die Grundlinie zu stabilisieren. Nach jeder Separation wurde die Matrix mit Stickstoffdruckgas aus der Kapillare herausgedrückt. Danach wurde die Kapillare mit Wasser gespült und für die nächste Separation wieder mit frischer Matrix gefüllt. Der Austausch dauerte im Allgemeinen ca. 20 Minuten. Um die Kapillare zu konservieren, wenn sie über Nacht oder für mehrere Tage nicht gebraucht wurde, wurde die Kapillare mit Wasser ausgespült und trocken geblasen.
Die Anregung erfolgte mit der 488 nm-Linie eines luftgekühlten Argon-Ionen-Lasers (Ar⁺) (Uniphase, San Jose, Kalifornien). Ein 488 nm-Filter war vor dem Laserkopf angeordnet, um die Plasmaemission zu unterdrücken. Die Laserlinie wurde mit einer 10 cm-Linse (Melles Griot) aus der horizontalen Richtung auf die Kapillare fokussiert. Die Position der Kamera wurde auf die richtige Höhe eingestellt, damit das Bild des Inneren der Kapillare vollständig auf ein Pixel des CID-Bildfelddetektors fokussiert war; das Bild der Seitenwände der Kapillare war auf die benachbarten Pixel in der Reihe fokussiert. Ein 515 nm-Tiefpass-Glasfilter mit oder ohne Kurzpass-Interferenzfilter bei 540 nm diente zur Unterdrückung von Laserstreulicht.
Ergebnisse. Zweck dieses Experiments war die Untersuchung des Betriebs einer CID-Kamera für den Einsatz in der Hochmultiplex-Kapillarelektrophorese für die DNA-Sequenzierung. Daher wurde in diesem Beispiel nur eine Kapillare benutzt; eine 100-Kapillarenanordnung kann jedoch ohne weitere Änderung ebenfalls benutzt werden.
1. Hardware. Bei der Multiplex-Kapillarelektrophorese wurde, um die höchste Abtastrate zu erzielen und irrelevante Pixel zu überspringen, nur eine Reihe von Pixeln gescannt, die Bilder der beleuchteten Fenster der Kapillarenanordnung enthielten. Bei diesem Beispiel war die Kapillare zwischen zwei Hälften eines U-förmigen Halters eingespannt, um ihr mechanische Festigkeit zu geben. Weil der Aufbau keine beweglichen Teile hat, wurde das Bild jeder Kapillare nach dem Fokussieren über viele Arbeitszyklen wie zum Beispiel Einfüllen der Matrix, Auswechseln der Matrix und Injizieren der Probe auf demselben Pixel gehalten. Durch das Fokussieren jeder Kapillare auf insgesamt zwei Pixel kann die CID-Kamera bis zu 250 Kapillaren erfassen. Die Pixel repräsentieren abwechselnd die Kapillaröffnung bzw. die Kapillarwände. Wegen der einfachen Handhabung wurden für dieses Experiment Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 75 μm und einem Außendurchmesser von 360 μm Kapillaren benutzt. Dies hat keinen Einfluss auf die Untersuchung der CID-Kamera.
Wird eine Kapillarenanordnung mit einem Laserstrahl bestrahlt, kann der Lichtweg entlang einer Reihe oder Spalte des Bildfelddetektors fokussiert werden. Die beiden Ausrichtungen können zu unterschiedlichen Ausleseraten für die Teilanordnungen führen. Bei CCD-Elementen war die Ausleserate unterschiedlich, wenn man eine n × 1-Teil-anordnung entlang der parallelen Register leitet, im Vergleich zu derselben Teilanordnung entlang der seriellen Register. Um diesen Unterschied bei einer CID-Kamera zu erkennen, muss man die Teilanordnungs-Scanreihenfolge des CID-Bildfelddetektors kennen. Wenn die Kamera mit dem Lesen einer Teilanordnung beginnt, setzt sie zuerst die horizontalen (H) und vertikalen (V) Scanner zurück. Der V-Scanner schwenkt auf die erste Reihe in der Teilanordnung. Der H-Scanner geht dann auf die ersten Spalte in der Teilanordnung. Danach wurde die ganze Reihe (Zeile) ausgelesen. Der V-Scanner wurde dann eine Zeile weiter geschaltet, um die zweite Reihe in der Teilanordnung zu erfassen. Der H-Scanner wurde zurückgesetzt und tastet erneut die erste Spalte der Teilanordnung ab. Diese Schleife wurde wiederholt, bis alle Pixel in der Teilanordnung gelesen waren. Bei Ausrichtung der Teilanordnung entlang einer Spalte muss der Bildfelddetektor die horizontale Abtastung n-mal, das Rücksetzen des H-Scanners n-mal und das Weiterschatten um eine Zeile n-1-mal durchlaufen, um alle Pixel auszulesen. Obwohl die Abtastrate der CID-Kamera bis zu 5 MHz beträgt, ist die Zeit für das wiederholte Nachführen bzw. Abtasten nicht zu vernachlässigen, wenn n groß ist und die n × 1-Teilanordnung nicht am Rand des Bildfelddetektors liegt. Wenn zum Beispiel die Kamera mit einer Pixelrate von 9 kHz betrieben wird und eine 400 × 1-Teilanordnung an der 250. Spalte zwischen der 51. Reihe und der 450. Reihe angeordnet ist, beträgt die experimentell gemessene Teilanordnungs-Auslesezeit 47 Millisekunden bei Reihenausrichtung und 86 Millisekunden bei Spaltenausrichtung.
Auch wenn sie langsamer als die Reihenausrichtung ist, ist die Spaltenausrichtung in Situationen zu bevorzugen, bei denen das räumliche Übersprechen in einem CID-Bildfelddetektor signifikant ist. Dies konnte zum Beispiel auftreten, wenn die Hintergrundfluoreszenz gegenüber den in diesen Experimenten gemessenen Werten deutlich reduziert ist, etwa wenn die Polymermatrix von fluoreszierenden Verunreinigungen gereinigt worden ist. Das Übersprechen zwischen Reihen und Spalten nimmt linear mit dem Signalpegel zu, während das Übersprechen zwischen den Spalten unbedeutend bleibt, bis der Signalpegel nahezu Sättigung erreicht. Das Übersprechen zwischen Reihen und Spalten bei einem nicht beleuchteten Pixel entsprach nur 0,11% des Signals in dem beleuchteten Bereich, selbst bei dem älteren CID-Modell. Bei dem aktuellen Modell des CID-Systems beeinträchtigt das räumliche Übersprechen, falls überhaupt vorhanden, die Messung der laserinduzierten Fluoreszenz mit dem Kapillarelektrophoresesystem nicht.
Dieser Unterschied in der Teilanordnungs-Ausleserate entsteht dadurch, dass das CID-System SCM5000E mit einem Pseudo-Zufallsverfahren arbeitet, um einen direkten Zugriff zu erreichen. In künftigen Modellen soll ein echter Direktzugriffs- bzw. Random Access-Mechanismus implementiert werden. Der Unterschied zwischen den beiden Ausrichtungen wird damit beseitigt.
2. Rauschen. Bei CID-Kameras wird die Detektionsgrenze durch Faktoren wie Hintergrundschwankungen, Integrationszeit, Einschaltdauer, Leserauschen, Dunkelstrom und Quantenausbeute in einem bestimmten Wellenlängenbereich bestimmt. Je nach den vorliegenden Bedingungen ist auch die vorherrschende Rauschquelle unterschiedlich. Die CID ist im Vergleich zur CCD ein rauschbehafteter Detektor. Bei einem einzelnen Lesevorgang beträgt das Leserauschen 250 Elektronen (e), während das Leserauschen einer typischen CCD 5 bis 10e beträgt. Weil das Leserauschen mit der Quadratwurzel der Anzahl der Lesevorgänge abnimmt, ist das Rauschen bei 100 zerstörungsfreien Lesevorgängen auf 25 e reduziert, was immer noch höher als bei der CCD ist. Dies bedeutet jedoch nicht, dass mit der CCD-Kamera in einer bestimmten Situation eine bessere Detektionsgrenze erreicht werden kann. In der Praxis spielen andere Faktoren eine wichtigere Rolle bei der Bestimmung der Detektionsgrenze für die laserinduzierte Fluoreszenzdetektion bei der Multiplex-Kapillarelektrophorese.
Das Grundrauschen wurde als Funktion der Anzahl der zerstörungsfreien Lesevorgänge aufgetragen. Zunächst wurde die Kamera bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff ohne Belichtung betrieben, jedoch mit einer Integrationszeit von 1.000 Millisekunden (Dunkelzählung, Integration 1 Sekunde). Weil durch Kühlung mit flüssigem Stickstoff der Dunkelstrom grundsätzlich ausgeschaltet wird, handelte es sich bei dem gemessenen Grundrauschen nur um Leserauschen, das linear mit der Quadratwurzel der Anzahl der zerstörungsfreien Lesevorgänge abnahm. Danach wurden dieselben Messungen bei Umgebungstemperatur vorgenommen. Die gesamte Kurve war um zwei Einheiten erhöht. Wenn die Anzahl der zerstörungsfreien Lesevorgänge zunahm, erhöhte sich wegen der längeren Pixel-Verweilzeit auch der Beitrag des Dunkelrauschens. Die Kurve erreichte ein Minimum nach 36 zerstörungsfreien Lesevorgängen und stieg nach 64 zerstörungsfreien Lesevorgängen wieder an. Aus diesem Grund sind mehrere zerstörungsfreie Lesevorgänge bei Umgebungstemperatur nur in begrenztem Umfang von Nutzen. Danach wurde die Säulen-LIF-Detektion für eine Kapillarelektrophorese bei Raumtemperatur mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer gemessen (Integration 1 Sekunde). Die Belichtungszeit betrug 1.000 Millisekunden, und die Kamera wurde im Schnappschuss-/Einzelbildmodus betrieben. Bei weniger als 25 zerstörungsfreien Lesevorgängen wurde das Grundrauschen durch das Leserauschen dominiert. Danach wurde das Grundrauschen durch die Hintergrundfluoreszenz und das Dunkelrauschen bestimmt. Bei dem letzten Experiment erfolgte eine Säulen-LIF-Detektion bei Umgebungstemperatur in einer mit Polymermatrix gefüllten Kapillare (Integration 0,45 Sekunden). Die Kamera wurde mit einer Belichtungszeit von 450 Millisekunden betrieben. Bei allen Werten über vier zerstörungsfreien Lesevorgängen war keine weitere Verringerung des Grundrauschens zu beobachten, wenn die Anzahl der zerstörungsfreien Lesevorgänge zunimmt. Dies bedeutet, dass das Grundrauschen (Matrixfluoreszenz) mit dem Leserauschen vergleichbar war. Daher stellt für die Säulen-LIF-Detektion bei der DNA-Sequenzierung mit Polymermatrizen beim Vergleich von CID und CCD das höhere Leserauschen der CID kein größeres Problem mehr.
3. Empfindlichkeit. CID-Kameras besitzen eine hohe Quantenausbeute über einen großen Spektralbereich. Die typische Quantenausbeute ist höher als die der besten Fotovervielfacher (PMT) und höher als oder vergleichbar mit der einer typischen CCD. Daher ist zu erwarten, dass CIDs mindestens so empfindlich wie Fotovervielfacher und herkömmliche CCD-Elemente sind, wenn die Kamera auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff gekühlt wird, um den Dunkelstrom zu unterdrücken, und wenn mehrere zerstörungsfreie Lesevorgänge angewendet werden, um das Leserauschen zu verringern.
Es wurde festgestellt, dass die Detektionsgrenze der Kamera bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff für Kapillarelektrophoresemessungen bei 10^–12 M Fluorescein bei Anregung mit 20 mW lag. Dies wurde durch elektrokinetische Injektion von Fluorescein-Standardlösungen (in Puffer gelöst, um den „elektrokinetischen Injektions-Bias" zu vermeiden) bei +12 kV für 4 Sekunden und Durchführung der Elektrophorese in einem 2 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 9,5 bei +12 kV gemessen. Die Detektionsgrenze war definiert als die (extrapolierte) Konzentration, die nach Verifizierung dessen, dass das Signal linear abhängig von der Konzentration in diesem Bereich war, ein Signal-Rausch-Verhältnis = 2 (Peak-to-Peak) lieferte. Die Kamera lief im Schnappschuss-Modus mit einer Integrationszeit von 1.000 Millisekunden und 100 zerstörungsfreien Lesevorgängen. Das Pixel mit dem Bild des bestrahlten Punkts der Kapillare wurde vor und nach einer Belichtung ausgelesen. Danach wurde die Ladung gelöscht. Das Nettosignal war der Unterschied zwischen zwei Auslesungen. Die Detektionsgrenze wurde auch mit unterschiedlichen Laser-Anregungsleistungen bis zu 20 mW gemessen, wobei festgestellt wurde, dass sie umgekehrt proportional zur Laserleistung in diesem Bereich war.
Die Empfindlichkeit der CID-Kamera wurde auch im Betrieb bei Umgebungstemperatur getestet. Die Kamera lief im Schnappschussmodus mit einer Integrationszeit von 1.000 Millisekunden und Einzelauslesung. Die Detektionsgrenze betrug 10^–11 M Fluorescein, geschätzt anhand der Peakhöhen und der Standardabweichung der Grundlinie wie vorstehend beschrieben. Das Grundrauschen unter diesen Bedingungen betrug 9,9 Counts (Verstärkung = 250) und war damit zehnmal höher als das bei Kühlung mit flüssigem Stickstoff und 100 zerstörungsfreien Lesevorgängen. Dementsprechend verringerte sich die Detektionsgrenze um den Faktor 10 aufgrund des höheren Dunkelstroms.
4. Betriebsarten. Für die schnelle DNA-Separation muss die Abtastrate mindestens 2 Hz betragen. Im Gegensatz zur CCD, bei der die Pixel durch zerstörendes Auslesen gescannt werden, ist bei der CID ein getrennter Ladungsinjektionsschritt nötig, um die Pixel zu löschen. Daher wird die Abtastrate der CID nicht nur durch ihre Pixelleserate, sondern auch durch die Ladungsinjektionsgeschwindigkeit bestimmt.
Um das System zu testen, wurde die Kamera bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff im Schnappschussmodus mit einer Integrationszeit von 1.000 Millisekunden betrieben. Das Injizieren der Ladung erfolgte durch Anwendung von 100 globalen Injektionszyklen. Leider waren jedoch aufgrund mangelnder Effizienz der Ladungsinjektion die Kapillarelektrophorese-Peaks und die Grundlinie verzerrt, und es gingen quantitative Daten verloren. Auch nach 100 Zyklen globaler Ladungsinjektion mit 20 Zyklen Teilanordnungs-Injektion war die integrierte Ladung immer noch unvollständig gelöscht. Der Hersteller hat vorgeschlagen, eine globale Dauerinjektion über 800 Millisekunden anzuwenden, um eine vollständige Ladungsinjektion zu erreichen. Eine solche Verzögerung ist ungeeignet für den Betrieb der Kamera bei einer vernünftigen Abtastrate für die Kapillarelektrophorese.
Alternativ kann man das Signal weiter integrieren, ohne die Ladung zu löschen. Das kontinuierlich integrierte Signal wird mit der gewünschten Abtastrate ausgelesen. Das tatsächliche integrierte Signal während jeder Rahmenperiodendauer wird durch Differenzierung erhalten. Wenn das Gesamtsignal sich entweder der Digitalisierung oder der Pixelsenken-Sättigung annähert, wird die Ladung gelöscht und der Zyklus wiederholt. In dieser Betriebsart braucht die Ladungsinjektion nicht vollständig zu sein, weil das Signal für jedes Bild auf einer Differenz basiert. Der Betrieb der CID-Kamera in dieser Art und Weise hat jedoch Nachteile. Erstens ist der Rauschpegel in verschiedenen Teilen des rekonstruierten Elektropherogramms unterschiedlich, weil die absolute Standardabweichung der wiederholten Messung desselben Signals proportional zum Signalpegel ist. Zweitens nimmt das Leserauschen um den Faktor der Quadratwurzel von 2 zu, weil das Signal für jedes Bild die berechnete Differenz von zwei Lesevorgängen ist. Drittens gibt es bei Anwendungen wie der DNA-Sequenzierung Hunderte von Peaks in jedem Lauf, und der zeitliche Abstand zwischen benachbarten Peaks ist sehr kurz. Außerdem gibt es ein starkes Hintergrundsignal von der Polymermatrix. Daher muss die kumulierte Ladung nach nur wenigen Peaks gelöscht werden. Weil jeder Ladungsinjektionszyklus ein zusätzliches Auslesen erfordert, verkürzt eine solche Betriebsart die Einschaltdauer.
Ein asynchroner Scanmodus kann benutzt werden, um die vorstehende Einschränkung zu überwinden. Um zum Beispiel eine 400 × 1-Teilanordnung mit einer Pixelleserate von 9 kHz auszulesen, wenn jedes Pixel pro Bild/Rahmen neunmal gelesen werden muss, beträgt die Gesamtauslesezeit 400 Millisekunden. Bei einer Bildrate von 2 Hz im Schnappschussmodus beträgt die Belichtungseinschaltdauer nur 20%. Hält man den Verschluss die ganze Zeit offen und scannt die Teilanordnung kontinuierlich, ohne zwischen zwei Bildlesevorgängen zu warten, ergibt sich eine tatsächliche Belichtungszeit von 399 Millisekunden oder eine Belichtungseinschaltdauer von 99,75%. Die 400 Pixel werden zu unterschiedlichen Zeiten, das heißt asynchron, belichtet und ausgelesen. Obwohl das gleiche Prinzip auch auf die CCD angewandt werden kann, kann es, wenn die Teilanordnung nxm (n > 1, m > 1) beträgt, zu Unschärfe in der CCD kommen, weil die Ladung in einem Pixel verschoben und nicht wie bei einer CID auf eine feste Position begrenzt ist.
Um die Ladung jedes Bildrahmens zu löschen, muss man eine Teilanordnungs-Ladungsinjektion anwenden. Die Ladung in jedem Pixel wird einzeln während jedes Rahmens gelöscht, ohne die übrigen Pixel zu beeinträchtigen. Es dauerte mehr als 3,5 Millisekunden, um die Ladung in einem Pixel mittels Teilanordnungs-Ladungsinjektion vollständig zu löschen. Obwohl die Belichtungseinschaltdauer bei einer 400 × 1-Teilanordnung immer noch über 99% liegen kann, kann die Bildrate nicht höher als 0,65 Hz sein, was für die schnelle DNA-Sequenzierung im Grenzbereich liegt.
Glücklicherweise war die Ladungsinjektion bei Umgebungstemperatur effizienter als bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff. Bei Umgebungstemperatur können mit 100 Zyklen globaler Injektion, die nur 2,8 Millisekunden dauern, alle Pegel der integrierten Ladung vollständig gelöscht werden.
Das Dunkelrauschen der CID ist wegen der unterschiedlichen Pixelstruktur der beiden Arten von Bildfelddetektoren allgemein niedriger als bei der CCD. Das Dunkelrauschen der CID ist auch bei Umgebungstemperatur nicht von Bedeutung. Bei einer Integration von 1.000 Millisekunden pro Rahmen betrug das Dunkelrauschen 2,0 bis 2,6 Counts (Verstärkung = 250). Bei 10 Sekunden Integration pro Rahmen betrug das Dunkelrauschen 8,1 bis 8,3 Counts (Verstärkung = 250), was immer noch niedriger als das Einzelleserauschen ist. Es dauerte etwa 40 Sekunden, bis der Dunkelstrom die Digitalisierungsskala (Verstärkung = 250) gesättigt hatte. Wenn die CID bei Umgebungstemperatur betrieben wird, ist der Dunkelstrom nicht die Hauptursache für das Rauschen im Fall von matrixgefüllten Kapillaren mit signifikanter Hintergrundfluoreszenz.
Nach Optimierung wurde der in Tabelle 1 gezeigte Betriebsablauf für eine Verstärkungseinstellung von 250 festgelegt. Die Zeit für jeden Schritt wurde ebenfalls gemessen. Die Teilanordnungskonfiguration wurde durch Annahme eines Zweikanalsys tems wie bei K. Ueno et al., Anal. Chem., 66, 1424 (1994) gewählt. Das Schema für zwei 200 × 1-Teilanordnungen galt für eine 100-Kapillarenanordnung, das Schema für zwei 500 × 1-Teilanordnungen für eine 250-Kapillarenanordnung. Weil die CID 512 × 512 Pixel aufweist, können durch Fokussieren jeder Kapillare auf zwei Pixel insgesamt 256 Kapillaren eingestellt werden.
Tabelle 1. CID-Betriebsablauf für die laserinduzierte Fluoreszenzdetektion in einer Multiplex-Kapillarenanordnung
Wenn die Fluoreszenzbilder jeweils mehr als ein Pixel abdecken, besteht in der Axialrichtung der Kapillaren keine Notwendigkeit, alle diese Pixel zu lesen und die Intensitäten zu kombinieren, da die Messung durch das Hintergrundrauschen begrenzt ist. Aus demselben Grund müssen bei Verwendung einer CCD für die Detektion nicht mehrere Pixel zusammengefasst werden. Das Zusammenfassen unbeleuchteter Pixel oder Pixel mit geringerer Intensität mit den intensivsten Pixel verringert faktisch das Signal-Rausch-Verhältnis, weil der Gesamtdunkelstrom zunimmt.
Bei Standard-CCDs, wenn zwei getrennte Linien (n × 1-Teilanordnungen) gelesen werden müssen, müssen auch die Pixel zwischen diesen zwei Linien gelesen werden. Dies erhöht die Anzahl der zu lesenden Pixel und damit auch das Volumen der zu verarbeitenden Daten ganz enorm. Je weiter die beiden Linien voneinander entfernt sind, desto mehr Pixel müssen gelesen werden. Im Gegensatz dazu werden bei der CID nur die Teilanordnungen oder Pixel mit Nutzdaten selektiv gelesen. Müssen die beiden Laserlinien für eine optimale optische Verbindung weit voneinander entfernt angeordnet werden, wird die Abtastrate hierdurch nicht beeinträchtigt, weil sich die Anzahl der zu lesenden Pixel nicht ändert.
5. Zeitlicher Ablauf des CID-Betriebs. Das CID-System SCM5000E kann mit einer Pixelleserate von 8,8 kHz bis 100 kHz betrieben werden, was einer Verstärkung von 255 bis 0 entspricht. Die Verstärkung definiert die Digitalisierungsempfindlichkeit der Kamera. Bei unterschiedlichen Leseraten benötigen die Pixel dieselbe Menge Licht zur Sättigung. Mit anderen Worten, dieselbe Menge Licht erzeugt unabhängig von der Digitalisierungsverstärkung dieselbe Anzahl von Ladungsträgern in einem Pixel. Die Digitalisierungsempfindlichkeit für diese Menge an Ladungsträgern ist bei verschiedenen Leseraten jedoch unterschiedlich. Je schneller die Kamera liest, desto weniger empfindlich ist das Digitalisierungsverfahren. Darüber hinaus nimmt das Leserauschen rasch zu, wenn die Kamera schneller als mit 33 kHz liest. Unter 33 kHz ist das Leserauschen relativ konstant. Wie in Tabelle 1 gezeigt, war die Auslesezeit kurz im Vergleich zur Belichtungszeit, auch wenn die Kamera mit der niedrigsten Leserate arbeitete. Daher wurde die Kamera mit 9 kHz betrieben, was durch Einstellen der Verstärkung auf 250 gewählt wird, so dass die Digitalisierungsempfindlichkeit auf dem höchstmöglichen Wert gehalten wird.
Bei dem in Tabelle 1 gezeigten Betriebsablauf war die Belichtungseinschaltdauer für jedes Pixel unterschiedlich, weil die tatsächlichen Belichtungszeiten sich geringfügig unterschieden. Für das erste Pixel in der ersten Teilanordnung betrug die Einschaltdauer 90%, weil die Belichtungszeit für dieses Pixel nur 448 Millisekunden betrug. Für das nte zu lesende Pixel wurde die Belichtungszeit um zusätzliche (n – 1)* 110 Mikrosekunden verlängert, während die Kamera die ersten (n – 1) Pixel liest. Für das letzte Pixel betrug die tatsächliche Belichtungszeit 494 Millisekunden und die Einschaltdauer 99%.
Das Ergebnis zeigt, dass es vorteilhaft ist, den Verschluss offen zu lassen. Arbeitet die Kamera mit einer Bildrate von 10 Hz, beträgt die Einschaltdauer für das erste und das letzte zu lesende Pixel 55% bzw. 95%, was unter Berücksichtigung der sehr schnellen Abtastrate ausgezeichnet ist.
Der flexible Lesemodus der CID hat zusätzliche Vorteile. Ist die Lichtintensität aufgrund von Absorption oder Lichtstreuung auf einer Seite der Kapillarenanordnung höher als auf der anderen, kann die entsprechende Teilanordnung von der Seite her gescannt werden, auf der die Lichtintensität höher ist, so dass das Signal-Rausch-Verhältnis über die Kapillarenanordnung gleichmäßiger ist. Wird die Kapillarenanordnung mit einem Lichtprofil in Gaußscher Form beleuchtet, kann die Fluoreszenz von der Mitte der Kapillarenanordnung die mittleren Pixel sättigen, bevor sich in den Pixel an den Seiten genügend Ladung angesammelt hat. Um dies zu berücksichtigen, können die mittleren Pixel mit kürzeren Integrationszeiten und die Pixel an den Seiten nach längeren Integrationszeiten gelesen werden.
Ein direkter Vergleich der elektrophoretischen Trennungen von DNA-Fragmenten aus einer Sanger-Reaktion nach (a) dem optimierten Ablauf des CID-Betriebs wie in Tabelle 1, Spalte 1, gezeigt, und (b) mit einem handelsüblichen DNA-Sequencer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien) wurde durchgeführt. Bei der Testprobe handelte es sich um die Reihe der von der Iowa State University Nucleic Acid Facility unter Verwendung der normalen mit Farbstoff markierten Terminatoren (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien) und Taq-Polymerase hergestellten DNA-Fragmentleiter (PGEM/U). Für die Fluoreszenzdetektion wurde ein 515 nm-Tiefpassfilter benutzt. Das Verfahren zum Herstellen der Probe unterschied sich in keiner Weise von dem Verfahren, das zum Herstellen der Proben für den handelsüblichen DNA-Sequencer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien) benutzt wurde. Die injizierte Probe war in Konzentration und Zusammensetzung identisch mit den Empfehlungen für das Beschicken des handelsüblichen Geräts. Die Testprobe wurde getrennt analysiert (mit dem handelsüblichen Gerät sequenziert) und für gut befunden. Die Empfindlichkeit und zeitliche Auflösung des optimierten Ablaufs des CID-Betriebs (Tabelle 1) wurden als klar ausreichend für Anwendungen bei der DNA-Sequenzierung befunden.
6. Belichtungszeitgradient. Bei der DNA-Separation mittels Kapillarelektrophorese wandern unterschiedlich große Fragmente mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Ihre Verweilzeiten am Detektionsfenster sind unterschiedlich. Die größeren Fragmente eluieren später und bleiben länger am Detektionsfenster. Außerdem werden die Peaks der größeren Fragmente aufgrund eines Verlusts an Trenneffizienz breiter. Wenn die Kamera durchgängig mit derselben Bildrate läuft, enthalten die Peaks der größeren Fragmente mehr Datenpunkte als die der kürzeren Fragmente. Läuft die Kamera jedoch mit einer niedrigeren Bildrate, um ein größeres Fragment zu untersuchen, kann die Gesamtfluoreszenz von dem betreffenden Fragment in weniger Abtastpunkten konzentriert sein. Dies entspricht einer Änderung der Verschiebungsrate entsprechend der Wanderungsgeschwindigkeit im Zeitverzögerungs-Integrationsmodus. Das Signal-Rausch-Verhältnis wird dadurch verbessert. Dies ist sehr nützlich, weil die größeren Fragmente in einer Probe für die DNA-Sequenzierung typischerweise in niedrigeren Konzentrationen als die kürzeren Fragmente vorliegen, was auf die Natur der Polymerasereaktion zurückzuführen ist. Außerdem ist die Peakintensität eines Fragments wegen des „elektrokinetischen Injektions-Bias" umgekehrt proportional zu seiner Wanderungszeit. Dank der Flexibilität der vom Anwender programmierbaren Funktionen der CID kann die Belichtungszeit während der Elektrophorese dynamisch geändert werden, um die unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten der DNA-Fragmente zu berücksichtigen.
Die Belichtungszeit kann auf mehrere Mikrosekunden genau programmiert werden. Bei diesen Anwendungen war ein linearer Belichtungszeitgradient angemessen. Um einen feineren Gradienten zu erzielen, kann das Verhältnis zwischen Belichtungszeit und Wanderungszeit an eine aus experimentellen Daten hergeleitete numerische Funktion angepasst werden. Die Belichtungszeit kann dann entsprechend der angepassten Funktion in Echtzeit eingestellt werden. Um dies nachzuweisen, wurde dieselbe Separation von DNA-Sequenzierungsfragmenten durch einen Bandpassfilter beobachtet, um die Anzahl der Peaks und die Signalpegel zu verringern. Es ist klar, dass das Signal-Rausch-Verhältnis für die größeren Fragmente nach Implementierung eines Belichtungszeitgradienten besser war (16A und 16B). Ein 515 nm-Tiefpassfilter plus ein 540 nm-Kurzpassfilter wurden bei der Fluoreszenzdetektion verwendet, um gezielt sowohl die Anzahl der Peaks als auch das Signal-Rausch-Verhältnis zu verringern. Dennoch ist in 8B eine abfallende Grundlinie zu sehen, weil der Hintergrund ebenfalls über progressiv längere Zeiträume integriert wird, was jedoch nach dem Lauf ohne weiteres korrigiert werden kann.
7. Datenverarbeitung. Es gibt mehrere Möglichkeiten zum Speichern und Verarbeiten der Pixeldaten aus einer Kamera. Während des Analyselaufs können die Daten im RAM-Speicher oder auf der Festplatte im Host-Computer gespeichert werden. Für die Speicherung im RAM sollte das Datenvolumen jedes Bildrahmens klein sein. Anderenfalls reicht der installierbare Erweiterungsspeicher eines typischen Desktop-Computers nicht aus, um die Daten eines vollständigen Laufs zu speichern. Der Geschwindigkeitsvorteil der Speicherung der Daten im RAM während des Laufs ist offensichtlich. Auch braucht der Computer die große Anzahl von Bilddateien für Tausende von Bildern auf einer Festplatte nicht erneut zu lesen, um die Bilddateien bei der anschließenden Datenverarbeitung, die viele Stunden Rechnerzeit beansprucht, in entsprechende Elektropherogramme umzusetzen.
Das bei jedem Lauf mit einer CID generierte Datenvolumen ist klein. Für einen einstündigen Analyselauf mit einer Bildrate von 2 Hz in einer 100-Kapillarenanordnung mit zwei Detektionskanälen werden nur 1,44 MB Daten generiert. Benutzt man das Mehrwellenlängen-Fluoreszenzdetektionssystem (Verteilen der Fluoreszenz über 100 Pixel und Komprimieren im Verhältnis 10 : 1 durch „Binning") für eine 100-Kapillarenanordnung, müssen pro Bildrahmen 2.000 Pixel gespeichert werden, und das generierte Datenvolumen beträgt 14,4 MB. Wenn die CID-Kamera eine Teilanordnung liest, werden die Pixeldaten in den Grundspeicher oder erweiterten Speicher des Host-Computers übertragen. Bei einer zweifarbigen 100-Kapillarenanordnung müssen nur 400 Pixel gelesen werden. Auf einem Desktop-Computer mit 16 MB erweitertem Speicher können 20.000 Bildrahmen als ganze Zahlen gespeichert werden. Arbeitet die Kamera mit einer Bildrate von 2 Hz, entspricht dies 2,7 Stunden, was länger als typische Kapillarelektrophorese-Sequenzierungsläufe ist. Bei einer 250-Kapillarenanordnung beträgt die maximal verfügbare Laufzeit 1,1 Stunden. Selbst dies liegt nahe der geschätzten 1,5 Stunden, die zum Lesen von 500 Basen bei der DNA-Sequenzierung mittels Kapillarelektrophorese in linearem Polyacrylamid nötig sind. Mit Hilfe des Belichtungszeitgradienten wird die Anzahl der Datenpunkte weiter reduziert, um die problemlose Speicherung von Daten für 1,5 Stunden in 16 MB Speicher zu ermöglichen. Außerdem belegt das Bild einer Kapillare zwei Pixel, wobei die Mitten von zwei nebeneinander liegenden Kapillaren auf abwechselnde Pixel fokussiert werden. Das Pixel zwischen diesen beiden Pixeln entspricht den Kapillarwänden und enthält nutzlose Daten. Das Datenvolumen kann daher durch Überspringen der leeren Pixel um weitere 50% verringert werden. Schließlich können bei einem Desktop-Computer bis zu 64 MB für die Datenspeicherung zu gewiesen werden. Daher kann das vorliegende System ohne weiteres für mehrere Hundert oder Tausend Kapillaren in einer Anordnung angepasst werden.
Bei diesem System werden die Pixeldaten für einen Rahmen zuerst in den Grundspeicher des Host-Computers gegeben. Werden mehrere zerstörungsfreie Lesevorgänge angewandt, wird die durchschnittliche Intensität jedes Pixels berechnet und nur die gemittelten Pixeldaten werden gespeichert. Nach Abschluss der Elektrophorese wird das Elektropherogramm für jede Kapillare durch direktes Auslesen der Intensitäten der entsprechenden Pixel in allen Rahmen aus dem erweiterten Speicher erstellt. Die reorganisierten Daten für alle Kapillaren werden dann im Binärformat auf der Festplatte gespeichert, das mit normaler Chromatographie-Software wie zum Beispiel ChromPerfect (Justice Innovations, Palo Alto, Kalifornien) direkt verarbeitet werden kann. Alternativ können eingebaute Peak-Suchalgorithmen benutzt werden, um die Peaks zu integrieren, so lange die Daten noch im Arbeitsspeicher sind, um Verarbeitungszeit zu sparen.
Durch Verwendung von zwei räumlich getrennten Anregungslaserstrahlen können die markierten DNA-Fragmente zweimal angeregt werden, um ein Zweikanal-Zweifarb-Verfahren für das „Base Calling" zu erreichen, ohne das Bild aufteilen zu müssen. Der Zeitpunkt des Auftretens desselben DNA-Fragments in den beiden Kanälen ist jedoch unterschiedlich. Daher muss die Zeitskala eines Kanals geändert und an die das anderen Kanals angepasst werden, um die Basen auslesen zu können. Für den Fall, dass die Bildrate nicht geändert wird, kann die Zeitskalenkorrektur einfach durch Multiplizieren der Zeitskala des ersten Kanals mit dem Verhältnis der Wirklänge im zweiten Kanal zu der im ersten Kanal erfolgen. Nach der Zeitskalenkorrektur kann die Wanderungszeit eines Peaks in den beiden Kanälen exakt abgestimmt werden. Mit einem Belichtungszeitgradienten wird die Zeitskalenkorrektur für die beiden Kanäle komplizierter, ist jedoch mit dem richtigen Umwandlungsalgorithmus durchaus zu bewältigen. Die wichtige Bedingung für eine exakte Korrelation der Zeitskalen für die beiden Kanäle besteht darin, die gesamte Kapillare auf derselben Temperatur zu halten und sicherzustellen, dass die Beschichtung und die Polymermatrix in der Kapillare gleichmäßig sind, weil die Zeitskalenkorrektur auf der Annahme basiert, dass ein DNA-Fragment in einer Kapillare mit konstanter Geschwindigkeit wandert.
Beispiel V. Zweifarb-Base-Calling-Verfahren für die DNA-Sequenzierung auf der Grundlage der Standardchemie mit vier Markierungen nach Sanger
Nachstehend wird ein Verfahren zur Nucleotidbestimmung bei der DNA-Sequenzierung, das heißt das sog. „Base Calling", beschrieben, das elegant und sehr genau ist, unabhängig von der Konzentration ist (Einbaugeschwindigkeit für die Polymerase), auch für sehr schlecht aufgelöste Peaks geeignet ist (was möglicherweise eine Ausweitung des „Base Calling" auf größere Fragmente oder den Verzicht auf einen gewissen Teil der Auflösung im Austausch gegen eine höhere Trenngeschwindigkeit gestattet), einen minimalen Rechenaufwand erfordert (höhere Geschwindigkeit und geringerer Aufwand für die Datenverarbeitung) und mit den an anderer Stelle hierin beschriebenen hochlichtstarken optischen Systemen für die Anregung/Detektion verträglich ist.
Trennung. Fused-Silica-Kapillaren von 45 bis 60 cm Länge mit einem Innendurchmesser von 75 μm und einem Außendurchmesser von 150 μm oder 360 μm (Polymicro Technologies, Inc., Phoenix, Arizona) wurden für die Trennung benutzt. Die Innenwand der Kapillare war mit Polyacrylamid beschichtet oder mit 0,1 M HCl behandelt, wie in den Beispielen I und II beschrieben. Die Siebmatrix wurde durch Lösen von 1,5% Poly(ethylenoxid) (PEO) mit einem M_n von 8.000.000 und 1,4% PEO mit einem M_n von 600.000 in Laufpuffer hergestellt, wobei es sich um 1 × TBE mit 3,5 M Harnstoff handelte. Die Proben für die DNA-Sequenzierung (PGEM/U) wurden aus der Sanger-Reaktion nach Standardverfahren (Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornien, DyeDeoxy-Terminatoren und zyklische Sequenzierung mit Taq-Polymerase) in der DNA Facility der Iowa State University hergestellt. Die Kapillaren wurden mit einer 5 ml-Kanüle (Becton Dickinson & Co., Franklin Lakes, New Jersey) über 10 bis 15 Minuten durch Druck auf die Kanüle mit einer Metallklemme gefüllt. Nach jedem Lauf wurde die Matrix mit Stickstoffdruckgas bei 300 psi (15 × 10³ Torr) (in 2 Minuten) oder mit einer 100 μl-Kanüle (Hamilton Company, Reno, Nevada) (in 30 Sekunden) herausgedrückt. Vor dem Spülen wurde der TEFLON-Schlauch zum Verbinden der Kapillare mit den Druckgeräten zuerst mit Wasser gefüllt, damit die Kapillare nicht durch getrocknete Partikel verstopft werden konnte. Zwei 20 ml-Probephiolen aus Glas, in denen der Laufpuffer enthalten war, wurden als Pufferreservoir benutzt. Die matrixgefüllte Kapillare wurde vor dem Injizieren 10 Minuten lang vorlaufen gelassen. Das Injizieren erfolgte bei –9 kV bis –12 kV für 20 Sekunden bzw. 15 Sekunden, je nach Länge der Kapillare. Die Elektrophorese erfolgte durch Anlegen von –9 kV bis –15 kV am Injektionsende mit einem Hochspannungsnetzteil (Spellman, Plainview, New York).
Versuchsaufbau. Der Gesamtaufbau ähnelte dem in Beispiel IV beschriebenen Aufbau, wies jedoch eine andere Kapillarenhalterung und eine neue räumliche Anordnung der optischen Filter auf, um eine Zweistrahl- oder Einstrahlanregung zu ermöglichen. Eine Kapillare wurde auf einem Aluminiumblock von 1,6 cm (B) × 6,0 cm (L) × 6,5 cm (H) befestigt. Über die Breite der Halterung wurden zwei 0,3 cm breite und 3 cm tiefe Rillen eingearbeitet, um die beiden optischen Kanäle zu bilden. Die tiefen Rillen trugen zur Verringerung des Grundrauschens aufgrund von Streulicht bei. Die beiden Kanäle wurden im Abstand von 0,9 cm zueinander angebracht, um Störungen durch Streulicht zwischen den beiden Detektionskanälen zu verringern, wenn das Verfahren mit zwei Wellenlängen und Zweistrahlanregung benutzt wurde. Die Kapillare wurde flach auf die Halterung über die Rillen aufgelegt und mit Klebeband (Scotch Klebeband, 3M, St. Paul, Minnesota) befestigt. Die CID-Kamera wurde über der Kapillarenhalterung aufgestellt, so dass die Kapillare entlang der Spalten des CID-Bildfelddetektors ausgerichtet war, wie in Beispiel IV beschrieben. Die Halterung war breit genug, um bis zu 100 Kapillaren mit 150 μm Außendurchmesser aufzunehmen.
Ein luftgekühlter Ar⁺-Laser (Uniphase, San Jose, Kalifornien, Modell 2213-150ML) mit Mehrlinienemission wurde zur Anregung benutzt. Die 488 nm- und 514 nm-Linien wurden mit einem Glasprisma getrennt. Für die Zweistrahlanregung mit zwei Wellenlängen wurden durch Wegätzen der Beschichtung mit kochender Schwefelsäure auf der Kapillare zwei Detektionsfenster von 0,5 cm im Abstand von 1,2 cm gebildet. Die Detektionsfenster befanden sich an den Detektionskanälen, die an den Rillen auf der Aluminiumhalterung ausgerichtet waren. Der 488 nm-Strahl und der 514 nm-Strahl wurden mit Linsen mit einer Brennweite von 10 cm (Oriel, Stratford, Connecticut) auf derselben Seite der Kapillarenhalterung fokussiert. Die Kanten der beiden Linsen waren abgefräst, um sie seitlich nebeneinander mit den Mittelpunkten der Linsen im Lichtweg anordnen zu können. Die Laserstrahlen verliefen senkrecht zu der Kapillare und zu der CID-Kamera. Eine Quarzplatte von 5 cm × 8 cm × 2 mm wurde im Abstand von 4 mm horizontal über die Kapillare gelegt. Auf der Quarzplatte waren ein 600 nm-Präzisions-Interferenztiefpassfilter (Ealing Electro-optics, South Natick, Massachusetts) und ein Glasfilter RG610 (Schott Glass, Duryea, Pennsylvania) oben auf dem 514 nm-Anregungskanal angeordnet. Ein 488 nm-Raman-Kantenfilter mit einem Durchmesser von 0,5" (1,3 cm) (Physical Optics, Torrance, Kalifornien) war oben auf dem 488 nm-Anregungskanal angeordnet.
Für die Zweistrahlanregung mit einer Wellenlänge wurde der 488 nm-Strahl mit einem Strahlteiler (Melles Griot, Irvine, Kalifornien) in zwei Strahlen aufgeteilt, um beide Detektionsfenster zu beleuchten. Strahlfokussierung und Filteranordnung waren dieselbe wie bei dem Zweistrahlanregungsverfahren mit zwei Wellenlängen.
Für die Einstrahlanregung mit einer Wellenlänge wurde nur ein 488 nm-Strahl auf die Kapillare fokussiert. Das Bild des beleuchteten Bereichs wurde mit einer geneigten Glasplatte oder einem optischen Filter in zwei Bilder geteilt (9). Zur Einrichtung dieses Systems wurden zuerst die relativen Positionen der CID-Kamera und der Kapillare so ausgerichtet, dass das Bild des Detektionsfensters auf den mittleren Teil des Bildfelddetektors fokussiert werden konnte. Ein 488 nm-Raman-Kantenfilter mit einem Durchmesser von 63 mm (Kaiser Optical Systems, Ann Arbor, Michigan, Modell Notch-Plus) war an dem Kameraobjektiv (Nikon 28/1.4 AFD, Filtergröße 72 mm) angebracht. Ein Filter RG610 (Schott Glass) von 5 cm × 5 cm × 3 mm war im Winkel von 30 Grad relativ zur Brennebene der Kamera geneigt. Mit der Oberkante des Filters RG610 parallel zu dem Laserstrahl und zur Mitte des Gesichtsfelds weisend wurde der Filter verschoben, bis die Oberkante des Filters etwa 0,5 cm über das Detektionsfenster vorstand. Licht von der Hälfte des Gesichtsfelds, die durch den Filter abgedeckt war (roter Kanal), wurde auf diese Weise zur Seite des Filters verschoben. Die Emission war so als ein Bild fokussiert, das neun Reihen des CID-Bildfelddetektors vom Originalbild entfernt war. Licht von der anderen Hälfte des Gesichtsfelds (blauer Kanal) wurde wie vorstehend beschrieben fokussiert. Der Abstand zwischen den beiden Bildern kann durch Einstellen des Neigungswinkels des Filters RG610 geändert werden.
Der Filter RG610 diente dem zweifachen Zweck der Bildverschiebung und optischen Filterung. Der Filter RG610 unterdrückte auch das stärkste Laserstreulicht, das einen Fächer senkrecht zur Kapillarenanordnung bildet. Dies ist sehr wichtig, um den Streulicht-Hintergrund im blauen Kanal zu verringern. Obwohl das auf den Filter RG610 auftreffende Laserstreulicht eine gewisse Fluoreszenz hervorrief, war der fluoreszierende Teil des Filters RG610 außerhalb des Fokus und verursachte kein signifikantes Hintergrundrauschen im Bildfeld des CID-Detektors. Zur präzisen Fokussierung kann der Unterschied in den effektiven Längen des optischen Wegs für das Licht in den beiden Hälften des Gesichtsfelds mit einer Quarzplatte kompensiert werden. Die Quarz platte kann im selben Winkel wie der Filter RG610 geneigt werden und deckt in der gleichen Weise wie der Filter RG610 die andere Hälfte des Gesichtsfelds ab.
Der CID-Betrieb wurde in Beispiel IV beschrieben. Die Datenanalyse erfolgt mit einem Chromatographie-Softwarepaket namens „CP" (ChromPerfect, Justice Innovations, Palo Alto, Kalifornien) und QuattroPro for DOS (Borland, Scotts Valley, Kalifornien).
Peakhöhenverhältnisse. Die Spektraleigenschaften der vier Standard-Farbstoffmarkierungen (FAM, JOE, ROX und TAMRA, ABD Division von Perkin Elmer, Foster City, Kalifornien) für die Sanger-Reaktion wurden mit Hilfe eines Peakhöhenverhältnis-Codierverfahrens unterschieden, wenn für die beiden Spektralkanäle zwei Tiefpassfilter benutzt wurden. Für eine Kapillare wurden zwei Elektropherogramme generiert, eines für jeden Spektralkanal. Die mit der Standard-Chromatographie-Software erhaltenen Integrationsergebnisse wurden in ASCII-Dateien gespeichert. Nur die Wanderungszeiten und Peakhöhen wurden in ein Arbeitsblatt für das „Base Calling" importiert. Die Wanderungszeit wurde als Index zur Anpassung der Peaks von derselben Base in den beiden Spektralkanälen benutzt.
Verschiedene Kombinationen von Filtern wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeiten zur Unterscheidung der vier Markierungen untersucht. Der Raman-Kantenfilter ließ mehr Licht durch (was immer wünschenswert) ist und unterschied besser zwischen Adenosin (A) und Guanin (G) DNA-Fragmenten als ein 515 nm-Tiefpass-Sperrfilter. Anderseits unterschied ein 610 nm-Tiefpass-Sperrfilter besser zwischen Cytosin (C) und Thymidin (T) DNA-Fragmenten als ein 600 nm-Filter und wurde gewählt, auch wenn letzterer mehr Licht durchließ. Als die beste Kombination erwies sich der 488 nm-Raman-Kantenfilter und der Filter RG610. Mit beiden Filtern konnten alle Basen in beiden Spektralkanälen detektiert werden. Das Peakhöhenverhältnis wurde somit für alle Basen berechnet. Der Hauptvorteil der Verwendung von Tiefpassfiltern ist der, dass die optische Leistung/Lichtstärke maximiert wird. Dies ist wichtig, weil die Detektionsgrenze bestimmt, wie weit man die Basen in einem bestimmten Sequenzierungslauf auslesen kann.
Anhand der Peakhöhenverhältnisse wurde ein Histogramm erstellt. Um die Kriterien zum Auslesen der Basen (d. h. zum Bestimmen der Nucleotide, die durch die DNA-Fragmente repräsentiert sind, die in einem DNA-Sequenzierungsexperiment produziert werden) mit guter Sicherheit festzulegen, wurden für den Kalibrierungsschritt nur die Peaks innerhalb eines guten Trennauflösungsbereichs herangezogen. Peaks im Längenbereich von 250 Basenpaaren erfüllten diese Anforderung. Die Peaks fielen in vier getrennte Cluster (17). Die gestrichelten Linien waren die Trennungspunkte für die Bestimmung der Nucleotidbasen („Base Calling"). Die benutzte Anregungswellenlänge betrug 488 nm, und die Fluoreszenzemission wurde mit dem 610 nm- im Vergleich zum 515 nm-Tiefpassfilter detektiert. Aus den Positionen der Lücken zwischen den vier Clustern wurden drei Verhältnisse bestimmt, nämlich R₁, R₂ und R₃. In der Kalkulationstabelle wurde eine Formel eingerichtet, um alle Basen automatisch mit G < R₁, R₁ < A < R₂, R₂ < T < R₃ und R₃ < C auszulesen. Standardabweichungen der Peakhöhenverhältnisse wurden für alle gleichartigen Basen innerhalb des lesbaren Basenpaarbereichs berechnet. Die Grenzen der vier Cluster, d. h. R₁, R₂ und R₃, waren daher mit einer Sicherheit von mindestens 99,7% (η 3 σ) definiert. So lange der optische Aufbau nicht geändert wird, ändern sich die Kriterien für das Herauslesen der Basen, wobei es sich einfach um die Werte R₁, R₂ und R₃ handelt, nicht. Eine Serie unbekannter DNA-Proben kann danach in dem kalibrierten System bis zu der lesbaren Länge sequenziert werden.
Beim Analysieren eines Elektropherogramms mit der CP-Software beginnt die Integration an der vordersten Flanke des ersten Peaks und endet an der Hinterflanke des letzten Peaks. In diesem Fall bestimmte CP die korrekte Grundlinie im gesamten Bereich ohne manuelles Eingreifen. Die aufgrund des Belichtungszeitgradienten ansteigende Grundlinie hatte keinen Einfluss auf die Fähigkeit von CP, die richtige Grundlinie zu wählen. CP konnte jedoch nicht alle Peaks automatisch detektieren und erkannte einige nur teilweise aufgelöste Peaks (R < 1,0) nicht. Dies war der Hauptgrund für Sequenzierungsfehler.
Bei der Zweistrahlanregung mit zwei Wellenlängen beruhte das „Base Calling" auf Unterschieden in den Fluoreszenzspektren und den Absorptionsspektren. Es lieferte auch ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis für die beiden Rhodamin-Markierungen (FAM und JOE). Die DNA-Fragmente wurden zweimal angeregt, während sie die beiden Detektionsfenster passierten. Gestreutes 514 nm-Licht führte jedoch zusätzlichen Hintergrund in den 488 nm-Kanal ein, wo der Raman-Kantenfilter benutzt wurde, da dieser 514 nm-Licht nicht herausfilterte. Eine sorgfältige Ausrichtung und richtige Einstellung war nötig, um die Interferenzen zu minimieren. Die beiden Kanäle mussten physikalisch voneinander getrennt werden, indem eine Abschirmung zwischen ihnen angeordnet wurde. Die physikalische Trennung war besonders wichtig, wenn die Kapillarenanordnung zur Anpassung des Brechungsindex in Flüssigkeit eingetaucht war, weil die Rayleigh- und Raman-Streuung in Flüssigkeit viel stärker als an Luft ist. Das Laserstreulicht verteilte sich nicht nur außerhalb der Kapillare, sondern breitete sich durch interne Reflexion aufgrund der Unterschiede im Brechungsindex von Matrix, Kapillarwand und Luft auch innerhalb der Kapillare aus. Es wurde festgestellt, dass es vorteilhaft ist, zwischen den beiden Detektionsfenstern mehrere Millimeter der Polyimidbeschichtung auf der Kapillare zu belassen. Die Beschichtung absorbierte das Laserstreulicht, das sich von einem Detektionskanal entlang der Kapillare zum anderen Detektionskanal hin ausbreitete.
Alle nicht identifizierten Basen beim Zweistrahlanregungsverfahren mit zwei Wellenlängen wiesen Merkmale auf, bei denen die benachbarten Peaks nicht aufgelöst waren und daher ungenauen Peakhöhen zugewiesen wurden oder von der Standard-Chromatographie-Software übersehen wurden. Eine Sichtprüfung der Rohdaten zeigte jedoch Schultern oder ungewöhnlich breite Peaks entsprechend 1,0 > R > 0,5 in der Separation.
Zwei Aspekte dieses „Base Calling"-Verfahrens konnten verbessert werden. Die Anpassung der Wanderungszeiten durch Normalisieren auf die zurückgelegte relative Strecke hängt von einheitlichen Geschwindigkeiten (Temperatur, Matrixhomogenität) entlang der gesamten Kapillare ab. Die beiden Laserstrahlen erzeugten auch Streulicht, das sich gegenseitig beeinflussen (die vom Raman-Kantenfilter durchgelassene 514 nm-Laserlinie) und das Signal-Rausch-Verhältnis verringern kann. Daher wurde nur die 488 nm-Laserlinie verwendet. Alle vier Standardfarbstoffmarkierungen absorbieren bei 488 nm, wenn auch nicht mit der gleichen Effizienz. Zunächst wurde der Ansatz mit zwei Fenstern beibehalten, aber der Ausgang eines Lasers wurde aufgeteilt, um den roten Kanal zu begünstigen (Passieren des 610 nm-Filters), um so die geringere Absorption dieser beiden Farbstoffmarkierungen auszugleichen. Die Ergebnisse war im Wesentlichen dieselben wie bei Verwendung von zwei Wellenlängen zur Anregung. Die Vorteile waren weniger Streulicht (kein 514 nm-Licht) und die Einfachheit des Arbeitens mit einem Laser mit nur einer Linie. Eine Anpassung der Wanderungszeiten in den beiden Kanäle war aber dennoch nötig.
Ein bessere Lösung bestand darin, nur einen Laser und ein Anregungsfenster zu benutzen. Oberflächlich betrachtet scheint dies für das „Base Calling" mit den vier Farbstoffmarkierungen nach der Sanger-Reaktion nicht geeignet. 9 zeigt eine elegante Lösung, bei der das Bild in zwei Emissionskanäle mit maximaler Lichtleistung aufgeteilt wird. In diesem Fall war es nicht nötig, die Zeitskala der in den beiden Spektralkanälen erhaltenen Elektropherogramme umzuwandeln, um die Peaks eines DNA-Fragments in den beiden Spektralkanälen anzupassen. Dies vereinfachte die Datenanalyse und verbesserte die Genauigkeit der Nucleotidbestimmung. Bei Verwendung eines CID-Detektors und Anwendung eines Belichtungszeitgradienten (siehe Beispiel IV) beseitigte das Einstrahlanregungsverfahren auch die Möglichkeiten einer Nichtübereinstimmung von Peaks aufgrund der ungleichmäßigen Verteilung von Temperatur oder Spannung entlang einer Kapillare. Dies liegt daran, dass die Peakanpassung beim Zweistrahlanregungsverfahren auf der Annahme beruht, dass ein DNA-Fragment mit konstanter Geschwindigkeit durch eine Kapillare wandert. Vor allem aber bot das Einstrahlanregungsverfahren die Freiheit, das System in jedem nötigen Gradientenmodus zu betreiben, um die Auflösung oder Detektierbarkeit zu verbessern, zum Beispiel durch Anwendung des Belichtungszeitgradienten, Temperaturgradienten und Spannungsgradienten oder Kombinationen dieser Gradientenverfahren.
Bei Verwendung der Einstrahlanregung mit einer Wellenlänge im Bereich von 330 Basenpaaren betrug die „Base Calling"-Genauigkeit 99,3%, das heißt es traten nur zwei Fehler auf. Von den vier Gs zwischen Basenpaar 51 und 54 wurde ein G übersehen. Der andere Fehler trat bei Basenpaar 317 auf, wo A irrtümlich als T identifiziert wurde. Bei Fragmenten mit einer Länge von mehr als 250 Basenpaaren ist besondere Sorgfalt nötig, weil die Auflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis verringert sind. Wenn teilweise aufgelöste Peaks von der Software aufgeteilt werden, ist die Position der Aufteilung kritisch. Einige der Peaks werden in einem Spektralkanal aufgelöst, in dem anderen aber nicht. Wurde das Herauslesen der Basen bis zu 353 Basenpaaren fortgesetzt, verringerte sich die Genauigkeit auf 97,1%. Obwohl das Signal-Rausch-Verhältnis für eine Integration über 353 Basenpaare hinaus ausreichte, war es praktisch nicht sinnvoll, weitere Basen auszulesen, weil dies in etwa der Vertrauensgrenze für die durch Taq katalysierte Sanger-Reaktion entspricht.
Verhältniskurven. Das vorstehend beschriebene, auf den Daten mit einer Anregungslaser- und zwei Emissionswellenlängen beruhende „Base Calling"-Verfahren wurde später weiter verbessert. Anstatt sich auf Software zu Identifizierung von Peaks und zur Bestimmung der Peakhöhen in jedem Kanal zu verlassen, wurde eine Verhält niskurve (auch „Ratiogramm" genannt) erzeugt, die das Punkt für Punkt in jedem Datenintervall berechnete Verhältnis von Signalen aus den beiden Kanälen angibt. Ähnliche Verhältniskurven sind in der Flüssigkeitschromatographie benutzt worden, um die Peakreinheit bei Verwendung von Diodenmatrixdetektoren oder Mehrwellenlängen-Schnellscan-Detektoren zu bestimmen. Software ist in mehreren handelsüblichen Messinstrumenten enthalten. Der Gedanke ist der, dass das Verhältnis der Intensitäten bei zwei unabhängigen Wellenlängen unabhängig von der Konzentration ist (die um den Peak variiert) und verwendet werden kann, um die nicht aufgelösten Komponenten in gemischten Peaks auszusortieren. So lange das Gesamt-Signal-Rausch-Verhältnis gut ist, können selbst Peaks mit einer Auflösung von R < 0,5 in vielen Fällen identifiziert werden, indem man die Verhältnisse an der Anstiegsflanke und der Abstiegsflanke der Mischpeaks notiert. Das normale Elektropherogramm wird dennoch benötigt, um zu bestimmen, wo die Verhältnisse sinnvoll sind und wo die Signale im Rauschpegel liegen und daher nutzlos sind. Die Peaks müssen jedoch nicht von der Chromatographie-Software aufgelöst werden, und Fehler bei der Bestimmung der Peakhöhen (soweit nicht aufgelöst) werden vermieden.
12 zeigt eine Verhältniskurve auf dem Elektropherogramm, das durch den Raman-Kantenfilter erhalten wurde, bei dem alle Peaks unabhängig von der Markierung erfasst sind. Die horizontalen Linien sind Artefakte zur Verhinderung von Teilungsfehlern, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis zu niedrig ist, um ein sinnvolles Verhältnis zu bestimmen. Das Rohsignal aus der Anregung mit 488 nm/Raman-Kantenfilter ist unten aufgetragen (dünne Linie). Die ausgelesenen Basen sind auf der Abzisse aufgetragen. Die Genauigkeit betrug 99% bis zu 340 Basen. Beachten Sie die Besonderheit bei Markierung 800. Sie war klar breiter als die umgebenden Merkmale, was auf eine überlappende Gruppe von Fragmenten hinweist. Die Verhältniskurve zeigt klar, dass die Anstiegsflanke vom Charakter her „A" und die Abstiegsflanke „G" war. Auch wenn dieses Merkmal nach dem Peakhöhenverfahren mit der Chromatographie-Software zu einem „Base Calling"-Fehler geführt hat, konnte es mit diesem neuartigen Verfahren korrekt identifiziert werden. Andere erwähnenswerte Abschnitte sind die Bereiche um die Markierungen 600 und 1.180, wo teilweise aufgelöste Merkmale auf ähnliche Weise korrekt identifiziert werden konnten.
Das Festlegen der Grundlinie für die Peaks ist wichtig für die Genauigkeit. Alle drei Fehler (unter 340 Basenpaaren) traten in einem Bereich um 260 Basenpaare auf, wo der einfache Grundlinien-Auswahlalgorithmus für einige der Fluoreszenzintensitäten im 488 nm-Sperrkanal negative Werte lieferte. In gleicher Weise gab es eine Reihe von Fehlern im Bereich um 350 Basenpaare, wo die Hintergrundsubtraktion unzureichend war. Verbesserungen der Software sollten ein exaktes Herauslesen der Basen für DNA-Fragmente mit einer Länge von mehr als 400 Basenpaaren ermöglichen, weil die Peakauflösung dort immer noch über 0,5 liegt.
Die vorstehenden ausführlichen Beschreibungen und Beispiele sind nur zum besseren Verständnis angegeben. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass verschiedene Modifikationen an den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung vorgenommen werden können, ohne vom Wesen der Erfindung gemäß den anliegenden Ansprüchen abzuweichen. Die Erfindung schließt alle derartigen Modifikationen im Rahmen der anliegenden Ansprüche ein.

Claims

System zur kapillaren Elektrophorese, umfassend: eine Kapillarenanordnung (2) von koplanaren parallelen Kapillaren, wobei jede Kapillare (1) eine einen Innenbereich (23) definierende ringförmige Wand, ein Einlassende (17) und ein Ausflussende (18) aufweist; eine Quelle (7) kohärenten Lichts, dazu ausgelegt, einen Strahl (8) kohärenten Lichts über die Kapillarenanordnung (2) zu schicken; und einen Bildfelddetektor (16) mit einem mit der Kapillarenanordnung optisch verbundenen Pixelfeld (22); gekennzeichnet dadurch daß: jede Kapillare (1) einen ersten transparenten Bereich (4) ihrer ringförmigen Wand (3) aufweist, wodurch ein senkrecht zu den Kapillaren (1) durch die Kapillarenanordnung verlaufender transparenter Weg (5) definiert wird; die Quelle (7) kohärenten Lichts dazu ausgelegt ist, den Strahl (8) kohärenten Lichts durch die ringförmigen Wände (3) der Kapillaren (1) entlang des transparenten Wegs (5) durch die ersten transparenten Bereiche (4) zu schicken; jede Kapillare (1) einen zweiten transparenten Bereich (4, 14) aufweist; und der Bildfelddetektor (16) mit dem inneren Bereich mindestens einer Kapillare (1) über den zweiten transparenten Bereich (4, 14) ihrer ringförmigen Wand (3) optisch verbunden ist.
System nach Anspruch 1, wobei die Kapillarenanordnung mindestens 100 koplanare parallele Kapillaren (1) aufweist.
System nach Anspruch 1 oder 2, wobei die parallelen Kapillaren (1) unmittelbar nebeneinander liegen.
System nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der erste transparente Bereich (4), durch den der Strahl kohärenten Lichts geschickt wird, von einem Medium mit Brechungsindex von 1,3 bis 1,5 umgeben ist.
System nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Kapillarenanordnung (2) in Wasser eingetaucht ist.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtstrahlquelle (7) zur Abgabe von kohärenten Licht mit einem Strahldurchmesser von höchstens 300 Mikrometer in den Kapillaren (1) ausgelegt ist.
System nach Anspruch 6, wobei die Lichtstrahlquelle (7) zur Abgabe von kohärenten Licht mit einem Strahldurchmesser von höchstens 75 Mikrometer in den Kapillaren (1) ausgelegt ist.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend eine Strahlenaufweitungseinrichtung (10) zum Aufweiten des Strahls kohärenten Lichts im wesentlichen senkrecht zur Kapillarenanordnung.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einer Bildgebungslinse (26) zur Verbindung zwischen der mindestens einen Kapillare und den Pixeln (22) des Bildfelddetektors (16).
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Bildfelddetektor (16) eine zur Kapillarenanordnung (2) parallele ebene Oberfläche aufweist.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Bildfelddetektor (16) ein zweidimensionaler Bildfelddetektor ist.
System nach Anspruch 11, wobei der zweidimensionale Bildfelddetektor ein ladungsgekoppeltes Bauelement (CCD) ist.
System nach Anspruch 11, wobei der zweidimensionale Bildfelddetektor ein Ladungsinjektions-Bauelement (CID) ist.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Bildfelddetektor (2) in Linie ausgerichtete und so angeordnete Pixel (22) aufweist, daß mindestens eine Kapillare (1) mit weniger als sechs Pixeln (22) optisch verbunden ist.
System nach Anspruch 14, wobei mindestens eine Kapillare (1) mindestens eine Seitenwand (25) am Innenbereich (23) aufweist, so daß mindestens ein Pixel (27, 29) mit der mindestens einen Seitenwand (25) optisch verbunden ist.
System nach Anspruch 15, wobei die mindestens eine Kapillare eine erste und eine zweite Seitenwand auf gegenüberliegenden Seiten des Innenbereichs (23) aufweist und die höchstens sechs Pixel eine Gruppe von Pixeln enthalten, die ein Anfangspixel (27), eine mittlere Gruppe (28) von einem oder mehreren Pixeln und ein Endpixel (29) aufweisen, so daß das Anfangspixel mit der ersten Seitenwand, die mittlere Gruppe von Pixeln mit dem Innenbereich (23) und das Endpixel mit der zweiten Seitenwand optisch verbunden sind.
System nach Anspruch 16, wobei die mittlere Gruppe von Pixeln (28) aus einem Pixel (22) besteht.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend eine zum Aufteilen der Fluoreszenzemission in einen ersten und einen zweiten Emissionskanal angeordnete standardmäßige Tiefpassfiltereinrichtung (32), wobei der Bildfelddetektor (16) zur gleichzeitigen Detektion der Fluoreszenzemission im ersten und zweiten Emissionskanal eingerichtet ist.
System nach Anspruch 18, wobei ein weiterer Tiefpassfilter (33) so angeordnet ist, daß die Fluoreszenzemission diesen weiteren Tiefpassfilter (33) durchquert, und wobei der standardmäßige Tiefpassfilter (32) so zwischen dem weiteren Tiefpassfilter (33) und dem zweiten transparenten Bereich (4, 14) der ringförmigen Wand (3) angeordnet ist, daß ein Teil der Fluoreszenzemission den standardmäßigen Tiefpassfilter (32) durchquert, so daß die Fluoreszenzemission dadurch in einen ersten und zweiten Emissionskanal aufgeteilt wird.
System nach Anspruch 19, wobei der standardmäßige Tiefpassfilter (32) mit einem Winkel von zwischen 1° und 89° relativ zum weiteren Tiefpassfilter (33) angeordnet ist.
System nach Anspruch 19 oder 20, wobei der weitere Tiefpassfilter (33) einen Raman-Tiefpassfilter (33) mit einem Wellenlängenabschneidewert von ungefähr der Wellenlänge des Strahls kohärenten Lichts aufweist.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich der erste und der zweite transparente Bereich (4, 14) berühren oder überlappen.
System nach Anspruch 22, wobei der erste und der zweite transparente Bereich (4) vollständig um die Kapillare herum verlaufen.
Verfahren zum Detektieren von fluoreszierenden Zielspezien in einer Probe mittels kapillarer Elektrophorese, umfassend die folgenden Schritte: (a) Aufstellen einer Kapillarenanordnung von koplanaren parallelen Kapillaren (1), die jeweils eine einen Innenbereich (23) definierende ringförmige Wand, ein Einlassende (17) und ein Ausflussende (18) aufweisen; (b) optisches Verbinden der Kapillarenanordnung mit dem ein Pixelfeld (22) umfassenden Bildfelddetektor (16); (c) Einführen einer eine fluoreszierende Zielspezie enthaltenden Probe in das Einlassende mindestens einer Kapillare, so daß die Probe durch die Kapillare dem Ausflussende entgegen wandert; (d) Induzieren von Fluoreszenzemission von der Zielspezie mit einem Strahl (8) kohärenten Lichts; und (e) Detektieren der Fluoreszenzemission von der Zielspezie mittels des Bildfelddetektors; gekennzeichnet dadurch, daß: der Strahl kohärenten Lichts entlang eines durch die Kapillarenanordnung (2) senkrecht zu den Kapillaren (1) verlaufenden transparenten Wegs (5) geschickt wird, der durch jeweilige erste transparente Bereiche (4) der ringförmigen Wände (3) der Kapillaren (1) definiert ist; und die Fluoreszenzemission, die in der durch die mindestens eine Kapillare (1) wandernde Zielspezie induziert wird, den Bildfelddetektor (16) über einen zweiten transparenten Bereich (4, 14) der ringförmigen Wand (3) der mindestens einen Kapillare (1) erreicht.
Verfahren nach Anspruch 24, ferner umfassend einen Schritt zwischen den Schritten (d) und (e), in dem die Fluoreszenzemission in einen ersten und einen zweiten Emissionskanal aufgeteilt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Aufteilung der Fluoreszenzemission mittels eines standardmäßigen Tiefpassfilters (32) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei ein weiterer Tiefpassfilter (33) so zwischen dem Bildfelddetektor und dem zweiten transparenten Bereich der ringförmigen Wand angeordnet ist, daß die Fluoreszenzemission diesen weiteren Tiefpassfilter durchquert, und der standardmäßige Tiefpassfilter so zwischen dem weiteren Tiefpassfilter und dem zweiten transpa renten Bereich der ringförmigen Wand angeordnet ist, daß ein Teil der Fluoreszenzemission den standardmäßigen Tiefpassfilter vor dem weiterem Tiefpassfilter durchquert.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der standardmäßige Tiefpassfilter (32) mit einem Winkel von ungefähr 1° bis 89° relativ zum weiteren Tiefpassfilter (33) angeordnet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei die fluoreszierende Zielspezie ein DNA-Fragment umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die fluoreszierende Zielspezie ein DNA-Fragment umfaßt und das Verfahren ferner beinhaltet: Aufteilen der Fluoreszenzemission in einen ersten und einen zweiten Emissionskanal zwischen den Schritten (d) und (e) und (f) Identifizieren der Sequenz des DNA-Fragments, indem das Verhältnis der Emissionsintensitäten im ersten und zweiten Emissionskanal als eine Funktion der Probenwanderzeit graphisch dargestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei die mindestens eine Kapillare eine erste und eine zweite Seitenwand auf verschiedenen Seiten des Innenbereichs aufweist und das Pixelfeld eine Gruppe von Pixeln mit einem Anfangspixel, einer mittleren Gruppe von einem oder mehreren Pixeln und ein Endpixel enthält, wobei das Verfahren vor dem Einführen der Probe ferner das optische Verbinden des Anfangspixels mit der ersten Seitenwand, der mittleren Gruppe von Pixeln mit dem Innenbereich und des Endpixels mit der zweiten Seitenwand umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die mittlere Gruppe von einem oder mehreren Pixeln ein Pixel umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, ferner umfassend das Auswählen eines Pixels aus jeder der mittleren Gruppen von Pixeln vor dem Detektieren der Fluoreszenzemission, wobei Schritt (e) das Detektieren der Fluoreszenzemission mittels eines ausgewählten Pixels umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei jedes Mitglied einer jeden mittleren Gruppe von Pixeln ein Signal mit einer zur Intensität der detektierten Fluoreszenzemission direkt proportionalen Intensität abgibt und wobei der Schritt, in dem ein Pixel aus jeder der mittleren Gruppen ausgewählt wird, einen vor Schritt (c) durchgeführten Kalibrierungsschritt umfaßt, in dem: ein Fluoreszenzmedium in die mindestens eine Kapillare eingeführt wird; Fluoreszenzemission vom fluoreszierenden Medium durch Bestrahlen des Mediums mit einem Strahl kohärenten Lichts mit einer Wellenlänge von ungefähr 200 bis 1500 nm induziert wird; die Fluoreszenzemission vom fluoreszierenden Medium durch die zweiten transparenten Bereiche mittels der mittleren Gruppe von Pixeln detektiert wird; die Intensität des von jeder der mittleren Gruppen von Pixeln abgegebenen Signals bestimmt wird: die von jeder der mittleren Gruppen von Pixeln produzierten Signalintensitäten verglichen werden; und ein Pixel aus der mittleren Gruppe von Pixeln ausgewählt wird, welches ein Signal mit der größten Intensität produziert.
Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, wobei der Bildfelddetektor ein Ladungsinjektions-Bauelement ist und Random-Access-Programmierung bei der Auswahl des einen Pixels aus jeder der mittleren Gruppen benutzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 35, ferner umfassend: (f) Bestimmen der Probenwanderzeit für eine Zielspezie durch Verarbeiten des von einem ausgewählten Pixel produzierten Signals.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 36, wobei der Bildfelddetektor ein Ladungsinjektions-Bauelement ist und ein ausgewähltes Pixel während einer Belichtungszeit Fluoreszenzemission detektiert, wobei das Verfahren ferner die Anwendung von Belichtungszeitprogrammierung beinhaltet, um während der Probenwanderung die Belichtungszeit für das ausgewählte Pixel im wesentlichen invers zur Intensität der Fluoreszenz-emission einer Zielspezie zu variieren.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Belichtungszeitprogrammierung einen der folgenden Schritte umfaßt: (a) Programmieren eines Belichtungszeitgradienten, oder (b) Programmieren einer Rückkopplungsschleife, um die Belichtungszeit im wesentlichen invers zur von dem ausgewählten Pixel detektierten Fluoreszenzemissionsintensität zu variieren.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei dem Schritt der Random-Access-Programmierung ein zusätzlicher Schritt folgt, in dem Belichtungszeitprogrammierung angewendet wird, um die Belichtungszeit für das ausgewählte Pixel während der Probenwanderung im wesentlichen invers zur Intensität der Fluoreszenzemission der Zielspezie zu variieren.