DE69632466T3

DE69632466T3 - Lösung die chaotropische mittel enthält und verwendung dieser lösung in verfahren zur isolierung von dna, rna und proteinen

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Publication number: DE69632466T3
Application number: DE69632466T
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-07-31
Filing date: 1996-07-18
Publication date: 2012-05-24
Anticipated expiration: 2016-07-19
Also published as: EP0843724B1; WO1997005248A2; WO1997005248A3; AU6548096A; DE69632466D1; ATE266723T1; EP0843724B2; EP0843724A2; US5945515A; DE69632466T2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung von Nuldeinsäuren (sowohl RNA als auch DNA) und Proteinen aus Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung Nukleinsäure- und Protein-Isolierungsverfahren, die nichttoxische chaotrope Mittel einsetzen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die kontinuierlichen Fortschritte in der Molekularbiologie, Biotechnologie und klinischen Forschung haben zu einer weiterhin ansteigenden Zahl von Verwendungen für DNA, RNA und Proteinen geführt. Zum Beispiel hat die Polymerasekettenreaktions(PCR)-Technologie die Verwendung von DNA und RNA in der Grundlagenforschung, in der klinischen Diagnostik wie beispielsweise der Detektion von Boten-RNA (mRNA) durch Reverstranskriptions-PCR (RT-PCR) und der Verwendung von PCR bei der Detektion von genetischen Defekten dramatisch ausgeweitet. Auf dem Gebiet der Proteine ist die Identifikation von Proteinen durch Western-Blotting ein wichtiges Hilfsmittel zum Studium der Genexpression in der Grundlagenforschung und bei der Identifikation spezifischer Proteine für diagnostische Zwecke, beispielsweise durch die Detektion viraler Proteine, geworden.
Die verstärkte Verwendung von RNA, DNA und Proteinen hat ein Bedürfnis für schnelle, einfache und zuverlässige Verfahren und Reagenzien zur Isolierung von DNA, RNA und Proteinen erzeugt. Bei vielen Anwendungen würde die Sammlung von Proben biologischen Materials und die anschließende Analyse davon wesentlich vereinfacht werden, wenn die drei Zellbestandteile (RNA, DNA und Proteine) gleichzeitig aus einer einzigen Probe isoliert werden könnten. Die gleichzeitige Isolierung ist besonders wichtig, wenn die Probengröße, beispielsweise bei einer Biopsie, so klein ist, daß sie die Auftrennung in kleinere Proben zur Durchführung getrennter Isolationsschritte für DNA, RNA und Proteine ausschließt.
Es existieren bekannte Verfahren zur Isolierung von DNA, RNA und Proteinen aus einer einzigen Probe biologischen Materials. Ein solches Verfahren ist in Coombs, L. M., et al.: ”Simultaneous Isolation of DNA, RNA and Antigenic Protein Exhibiting Kinase Activity from Small Tumor Samples Using Guanidine Isothiocyanate”, Anal. Biochem., 188, 338–343 (1990), beschrieben. Das Verfahren nach Coombs et al. basiert auf der Ultrazentrifugation des Probenhomogenats in einer Guanidin-Cäsiumchlord-Lösung. Die Probe wird in 4 M Guanidinthiocyanat homogenisiert und anschließend mit einer Cäsiumchlorid(CsCl)-Lösung überschichtet und für etwa 18 Stunden bei > 100000 g zentrifugiert. Im Anschluss an die Zentrifugation werden DNA, RNA und Proteine getrennt und über die folgenden 12–24 Stunden gereinigt. Dieses Verfahren weist mehrere Beschränkungen oder Nachteile auf, einschließlich der verlängerten Zeit, die für die Isolierung benötigt wird, und der begrenzten Probenanzahl und -größe, die mit einer Ultrazentrifuge verarbeitet werden kann. Auch die hohen Kosten für eine Ultrazentrifuge können unter bestimmten Umständen hindernd sein.
Ein anderes Verfahren zur gleichzeitigen Isolierung von DNA, RNA und Proteinen aus einer einzigen Probe biologischen Materials ist Gegenstand meines früheren US-Patents Nr. 5,346,994 (das '994-Patent). Das Verfahren beruht auf einer Flüssigphasen-Trennung unter Verwendung von Phenol und Guanidinthiocyanat. Eine biologische Probe wird in der wässrigen Lösung aus Phenol und Guanidinthiocyanat homogenisiert und das Homogenat wird anschließend mit Chloroform gemischt. Im Anschluss an die Zentrifugation trennt sich das Homogenat in eine organische Phase, eine Zwischenphase und eine wässrige Phase. Proteine werden in die organische Phase, DNA in die Zwischenphase und RNA in die wässrige Phase sequestriert. Als nächstes wird jeder Bestandteil aus der entsprechenden Phase unter Verwendung von Ethanol ausgefällt und wird anschließend gewaschen. Die ganze Prozedur kann innerhalb von etwa 2–3 Stunden abgeschlossen werden und ist insbesondere geeignet zur Isolierung hochqualitativer RNA aus verschiedenen Quellen. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht in der Verwendung von hochtoxischem Phenol.
Es gibt viele bekannte Verfahren zur getrennten Isolierung von DNA, RNA und Proteinen aus biologischem Material, d. h. Protokolle zur Isolierung einer einzelnen dieser Komponenten aus einer Probe. Bei typischen DNA-Isolationsverfahren wird eine biologische Probe in einer lysierenden Lösung lysiert, und die DNA wird anschließend nach irgendeinem eine Mehrzahl von Schritten umfassenden Protokoll aus dem Lysat isoliert, was bis zur Vervollständigung eine Stunden bis mehrere Tage in Anspruch nehmen kann. Häufig empfohlene DNA-Isolationsverfahren beinhalten die Verwendung von toxischem Phenol. Siehe Sambrook, J. et al., ”Molecular Cloning”, Bd. 2, S. 9.14–9.23, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und Ausubel, Frederick M. et al., ”Current Protokols in Molecular Biology”, Bd. 1, S. 22.1–2.4.5, John Wiley & Sons, Inc. (1994). Üblicherweise wird eine biologische Probe in einer Detergenzlösung lysiert und der Proteinbestandteil des Lysats wird mit Proteinase für 12–18 Stunden verdaut. Anschließend wird das Lysat mit Phenol extrahiert, um den Großteil der zellulären Bestandteile zu entfernen, und die verbleibende wässrige Phase wird weiter behandelt, um die DNA zu isolieren. Bei einem anderen Verfahren, beschrieben in von Ness et al., U.S.-Patent 5,130,423 , werden nichtkorrosive Phenol-Derivate zur Isolierung von Nukleinsäuren verwendet. Die erhaltene Zubereitung ist eine Mischung aus RNA und DNA.
DNA-Isolationsverfahren, die nichtkorrosive chaotrope Mittel verwenden, sind ebenfalls entwickelt worden. Diese Verfahren, die auf der Verwendung von Guanidinsalzen, Harnstoff und Natriumiodid basieren, beinhalten die Lyse einer biologischen Probe in einer chaotropen wässrigen Lösung und die anschließende Ausfüllung der Roh-DNA-Fraktion mit einem niederen Alkohol. Die endgültige Reinigung der ausgefällten Roh-DNA-Fraktion kann erreicht werden durch eines von verschiedenen Verfahren, einschließlich Säulenchromatographie, wie beschrieben in ”RapidPrep^TM Genomic DNA Isolation Kits For Cells and Tissue: Versatility at Your Fingertips!”, Analects, 13d. 22, Nr. 4, Pharmacia Biotech, 1994, oder Exposition der Rob-DNA gegenüber einem polyanionhaltigen Protein wie in Koller, U.S. Pat. Nr. 5,128,247 , beschrieben.
Ein weiteres Verfahren zur DNA-Isolation, das in Botwell, D. D. L., ”Rapid Isolation of Eukaryotic DNA”, Anal. Biochem. 162, 463–465 (1987), beschrieben ist, beinhaltet das Lysieren von Zellen in 6 M Guanidinhydrochlorid, Ausfällen von DNA aus dem Lysat bei saurem pH durch Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol, und Waschen der DNA mit Ethanol. Es wird jedoch angenommen, daß die erhaltene DNA mit einem Material von niedrigem Molekulargewicht, wie beispielsweise RNA und Pigmenten, kontaminiert sein kann. Diese Schlussfolgerung befindet sich in Übereinstimmung mit der wohlbekannten Beschreibung, wonach unter vergleichbaren Bedingungen RNA aus Zellen oder Gewebelysat ausgefällt werden kann. Siehe Chirgwin, J. M. et al., ”Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease”, Abt. für Biochemie und Biophysik, Univ. Kalifornien, 13d. 18, Nr. 24, S. 5294–5299 (1979).
Natriumiodid, ein anderes chaotropes Mittel, ist zur DNA-Isolierung verwendet worden, jedoch erfordert seine Verwendung einen zusätzlichen Reinigungsschritt, bestehend aus der Adsorption der isolierten DNA an Glasperlen. Obwohl dieses Verfahren relativ einfach ist, führt es zu einem niedrigen Ertrag an isolierter DNA.
Bei einem weiteren Ansatz wird der Großteil von zytoplasmatischen Proteinen und RNA durch Lyse von Zellproben in einer Detergenzlösung entfernt. Das Lysat wird anschließend in Kern- und Cytoplasmafraktionen fraktioniert. Danach wird die DNA durch Lösen der Kernfraktion in einer chaotropen Lösung, Ausfällen und Waschen mit Ethanol gereinigt. Dieses Verfahren, beschrieben in Ciulla, T. A. et al., ”A Simple Method for DNA Purification from Peripheral Blood”, Anal. Biochem. 174, 485–488 (1988), kann innerhalb von etwa 2 Stunden durchgeführt werden und ist geeignet zur Isolierung von DNA aus Vollblut.
Bekannte Techniken zur Isolierung von RNA verwenden typischerweise entweder Guanidinsalze oder Phenolextraktion, wie zum Beispiel in Sambrook, J. et al., ”Molecular Cloning”, Bd. 1, S. 7.3–7.24, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und Ausubel, F. M. et al., ”Current Protocals in Molecular Biology”, Bd. 1, S. 4.0.3–4.4.7, John Wiley & Sons, Inc. (1994) beschrieben. Phenolbasierte Techniken sind Mehrschritt-Verfahren, die mehrere Stunden oder Tage bis zum Abschluß benötigen. Die guanidinbasierten RNA-Isolationsverfahren benötigen gleichermaßen mindestens mehrere Stunden oder erfordern viele Schritte zum Abschluß. In meinem früheren US-Patent Nr. 4,843,155 wurden Phenol- und Guanidinverfahren einzigartig kombiniert, was zu einem einfachen Verfahren zur Isolierung von Gesamt-RNA führte, das innerhalb von 3 Stunden abgeschlossen werden kann. Das Verfahren des '155-Patents wurde weiter in meinem '994-Patent verbessert, das die Vervollständigung der RNA-Isolation in etwa 1 Stunde ermöglicht.
Es existieren auch bekannte Techniken zur gleichzeitigen Isolation von DNA und RNA, wie in meinem früheren '994-Patent referenziert, dessen Offenbarung hier durch Inbezugnahme aufgenommen wird. All diese Techniken verwenden Phenolextraktion als einen notwendigen Schritt zur Isolierung von RNA und DNA, die frei ist von Proteinkontamination.
Die US 5,128,247 betrifft ein Verfahren zur Nukleinsäureisolierung unter Verwendung chaotroper Zusammensetzungen wie beispielsweise Guanidinisothiocyanat in Kombination mit polyanionischen Zusammensetzungen und unter Verwendung von etwa 70% Ethanol oder 50% Isopropanol. Gleichermaßen ist in J. Microbiol. Methods (1994), 19 (3), 167–172, ein Verfahren zur Extraktion von DNA unter Verwendung eines chaotropen Mittels, wie beispielsweise Nal, zusammen mit 40%–50% Isopropanol und 70% Ethanol offenbart. Die US 5,162,507 betrifft ein Verfahren zum Erlangen von reinem rekombinanten IL-2 aus zerstörten Zellen. Die Extraktion wird unter Verwendung von Guanidinhydrochlorid mit einem Reduktionsmittel durchgeführt. Organische Lösungsmittel sind nicht zugegen. Die WO 92/00983 betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren unter Verwendung einer Extraktionslösung enthaltend mindestens eine organische Verbindung wie 4-Hexylresorcin, Resorcin, Benzylalkohol, 2-Methyl-Benzylalkohol etc. Die Probe kann vor der Kombination mit der organischen Verbindung mit einem lysierenden Mittel, wie beispielsweise Guanidinhydrochlorid, zusammengebracht werden. Schließlich wird die Nukleinsäurefraktion durch Zugabe von vier Volumen Ethanol oder einem Volumen Isopropanol ausgefällt. Die EP 0554034 betrifft ein Verfahren zur Isolierung von RNA, DNA und Proteinen unter Verwendung einer Lösung umfassend eine Phenol- und eine Guanidinverbindung. Der Gesamtgehalt organischen Lösungsmittels (d. h. Phenol und Glycerin) beträgt etwa 33%–60%.
Vordem war die Ansicht allgemein anerkannt, daß die Ausfällung von Nukleinsäuren aus chaotropen Lösungsmitteln nicht zu reinen Nukleinsäure-Zubereitungen führt. Im Gegensatz zu dieser Ansicht hat der vorliegende Erfinder jedoch gefunden, das unter bestimmten Bedingungen, die hier in aller Ausführlichkeit beschrieben werden, die Verwendung von chaotropen Mitteln allein zur Isolierung von testfertiger, hochqualitativer DNA und RNA führt. Dieser unerwartete Befund führte zur Entwicklung eines sehr einfachen, wirksamen Verfahrens und Produktes zur gleichzeitigen Isolation von DNA, RNA und Proteinen aus einer einzelnen Probe zur anschließenden Verwendung in der Molekularbiologie, Biotechnologie, klinischen Forschung und anderen Anwendungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung stellen ein hochwirksames, einfaches Mittel zur Extraktion von DNA, RNA und Proteinen aus Zellen bereit. Vorteilhafterweise können diese Ergebnisse ohne die Verwendung von toxischen oder korrosiven Reagenzien und ohne den Einsatz einer teuren Ultrazentrifugen-Ausstattung erreicht werden. Genomische DNA und Gesamt-RNA kann unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren in nur 20 Minuten und Proteine in nur 30 Minuten isoliert werden. Diese Ergebnisse sind wesentlich schneller als bestehende Verfahren zur gleichzeitigen Isolierung von DNA, RNA und Proteinen. Die Erfindung ist auch anwendbar zur separaten Isolierung von RNA allein. Die erhaltene genomische DNA und Gesamt-RNA, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Produkte isoliert wurden, sind von hoher Qualität, die zur Verwendung in der Forschung, Biotechnologie, etc. geeignet ist. Die Erfindung beruht teilweise auf dem unerwarteten Befund, daß bei Verwendung der erfindungsgemäßen Produkte RNA vor DNA ausgefüllt wird, was im Gegensatz zu den Verfahren gemäß dem Stand der Technik steht. Insbesondere befindet sich der Befund, wonach die Lösungsmittellösung der vorliegenden Erfindung RNA vor DNA ausfällt, in starkem Gegensatz zum beschriebenen Stand der Technik, wie beispielsweise Koller, US-Patent Nr. 5,128,247 , worin beschrieben ist, daß DNA eine geringere Löslichkeit als RNA zeigt und offenbar leichter als RNA ausgefällt werden kann. Darüber hinaus sind wesentlich geringere Mengen von organischen Lösungsmitteln erforderlich, um die Ausfällung der Zellbestandteile zu bewirken.
In ihren breitesten Aspekten umfaßt die Erfindung ein Verfahren wie in Anspruch 1 definiert. Die Lösung beinhaltet wirksame Mengen eines chaotropen Mittels (chaotroper Mittel), Puffer, Reduktionsmittel und Wasser (mit organischem/n Lösungsmittel(n)). Das (die) chaotropen) Mittel bewirken die Trennung von Proteinen von Nukleinsäuren (RNA und DNA) und hemmen die Aktivität von nukleinsäureabbauenden Enzymen. Die Wirkungen der Chaotrope werden durch das in der Lösungsmittellösung anwesende Reduktionsmittel potenziert. Die Lösung beinhaltet ein organisches Lösungsmittel, dessen Gegenwart die Solubilisierung von RNA verhindert, wodurch es die Entfernung von RNA aus dem bei der Homogenisierung der Gewebeprobe in der Lösungsmittellösung gebildeten Homogenat durch einen kurzen Zentrifugationsschritt ermöglicht.
Vorzugsweise ist das Reduktionsmittel nicht toxisch, wie beispielsweise 2-Aminoethanthiol. Falls erforderlich, kann dieses durch 2-Mercaptoethanol ersetzt werden; dies ist jedoch eine toxische Zusammensetzung. Das Reduktionsmittel erleichtert die Denaturierung der RNase durch die Chaotrope und erleichtert die Isolierung von unabgebauter RNA.
Die bevorzugten Puffer zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Lösungen beinhalten Tris-Salzsäure, Natriumphosphat, Natriumactetat, Natriumborat-Borsäure und Glycin-Natriumhydroxid.
Wie angegeben, enthält die Lösung ein organisches Lösungsmittel. Die bevorzugten Lösungsmittel sind niedere Alkohole wie beispielsweise Methanol, Ethanol und Isopropanol. Andere wassermischbare Lösungsmittel, die die gewünschte Wirkung erreichen, wie beispielsweise Aceton, Polyethylenglykol und Dimethylsulfoxid, oder Mischungen der vorstehenden Verbindungen, können jedoch verwendet werden. Die wirksame Konzentration von organischen Lösungsmitteln in dem erfindungsgemäßen Produkt liegt im Bereich von etwa 15–30 Volumen-%.
Die Lösung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann zusätzliche Bestandteile enthalten, einschließlich organischer und anorganischer Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumphosphat, Natriumacetat, Natriumnitrit, Lithiumchlorid und Natriumbromid. Darüber hinaus können kompatible Detergenzien wie Sarkosine und Polyoxyethylensorbitan und chelatbildende Mittel wie Ethylendiamintetraessigsäure und Zitronensäure zur Förderung der Gewebe-Solubilisierung und Ausfällung von Nukleinsäuren verwendet werden.
Insgesamt und im Vergleich mit anderen bekannten Methodiken wird die Ausfällung von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer wesentlich reduzierten Menge organischer Lösungsmitte] durchgeführt. Beispielsweise erfordert die Ausfällung von RNA in Sambrook, J. et al., ”Molecular Cloning”, Bd. 1, S. 73–7.24, Cold Spring Harbor Press (1989), die Zugabe von 0,5–2,5 Volumen eines niederen Alkohols zu einem Volumen der chaotropen Lösung. Darüber hinaus wurde die RNA-Präzipitation für mehrere Stunden bei –20–4°C durchgeführt. Im Gegensatz dazu ist die Ausfällung von RNA gemäß dem vorliegenden Verfahren in etwa 3–5 Minuten abgeschlossen und wird bei Raumtemperatur durchgeführt. Hinsichtlich der DNA-Ausfällung beschreibt Botwell, D. D. L. ”Rapid Isolation of Eukaryotic DNA”, Anal. Biochem. 162, 463–465 (1987), die Ausfällung aus chaotropen Lösungen, die mit 2–2,5 Volumen Ethanol durchgeführt werden. Gleichermaßen sind hohe Volumina von Alkohol für die wirksame DNA-Ausfällung aus nicht-chaotropen Lösungen, beispielsweise in Ausubel, F. M. et al., ”Current Protocols in Molecular Biology”, Bd. 1, S. 221–245, John Wiley & Sons, Inc. (1994), empfohlen worden.
Die unerwartet niedrige Konzentration von organischen Lösungsmitteln, die zur Ausfällung von RNA und DNA aus den erfindungsgemäßen chaotropen Lösungen erforderlich sind, macht es möglich, RNA und DNA in hochreiner Form zur Verwendung in der Molekularbiologie und Biotechnologie sowie für klinische Forschungs- und andere Anwendungen zu erhalten.
Diese und andere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Studium der hier gegebenen ausführlichen Beschreibung und Ausführungsbeispiele ersichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A zeigt die elektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren, die gemäß Beispiel 1 isoliert wurden;
1B zeigt die Eignung der Gesamt-RNA für die RT-PCT;
1C zeigt die Eignung der genomischen DNA für PCR;
1D zeigt die Ergebnisse der Proteinanalyse durch Western-Blotting;
2A zeigt die elektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren, die gemäß Beispiele 2 isoliert wurden;
2B zeigt die Ergebnisse der Gesamt-RNA-Analyse durch Northern-Blotting;
2C zeigt die Ergebnisse der Analyse genomischer DNA durch Southern-Blotting;
2D zeigt die Ergebnisse der Proteinanalyse durch Western-Blotting; und
3 zeigt die Ergebnisse der Analyse genomischer DNA durch Elektrophorese wie isoliert in Beispiel 5.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bevorzugte Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung und vergleichende Verfahren werden in den folgenden Ausführungsbeispielen beschrieben.
Beispiel 1 – Gleichzeitige Isolierung von DNA, RNA und Proteinen aus Zellen
Ein erfindungsgemäßes Verfahren wurde verwendet, um DNA, RNA und Proteine aus somatomammotrophen P0-Rattenzellen zu isolieren. Etwa 10⁸ P0-Zellen wurden in 10 ml erfindungsgemäßer Losung lysiert (homogenisiert), die folgendes enthielt: 4 M Guanidinthiocyanat (Amresco, Inc., Solon, OH), 17% Isopropanol, 0,1 M Natriumacetat, 0,1 M 2-Aminoethanthiolhydrochlorid (Sigma, St. Louis, MO) und 0,2% Sarkosyl in Wasser. Die Lösung wurde mit Salzsäure auf pH 7,0 eingestellt. Sofern nichts anderes angegeben, wurden die chemischen Reagenzien von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) erhalten. Anschließend wurden 0,6-ml-Teilmengen des Lysats (Homogenats) eingefroren oder sofort für die Isolation verwendet. Die 0,6-ml-Teilmengen, die wie unten beschrieben verwendet wurden, enthielten 37,3 μg·DNA, wie durch die Diphenylamin-Reaktion festgestellt wurde.
RNA-Isolierung. Das Lysat (0,6 ml) wurde für 8 Minuten bei 10000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die Gesamt-RNA zu sedimentieren. Das Post-RNA-Lysat wurde in ein frisches Reaktionsgefäß transferiert und für die unten beschriebene DNA- und Protein-Isolierung aufbewahrt. Der Niederschlag wurde mit 1 ml 95% Ethanol durch Vortexen und Abpipettieren des Ethanols gewaschen. Schließlich wurde die RNA in Formamid gelöst und bei –20°C aufbewahrt. Die Isolation der Gesamt-RNA war innerhalb von 11 Minuten abgeschlossen. Die isolierte RNA zeigt ein 260/280-Verhältnis von 1,79 ± 0,05, mit einem Ertrag von 49,2 ± 2,8 μg RNA (Mittelwert ± SD, n = 3). Northern-Blotting der isolierten RNA-Präparate zeigte ein nicht abgebautes Muster von mRNA bei Testung auf Wachstumshormon-, Prolaktin-, β-Aktin- und GAPDH-mRNAs.
Für die Verwendung in der Reverstranskriptions-PCR (RT-PCR) wurde eine Teilmenge des RNA-solubilisierten Formamids mit 3 Volumen Ethanol gefällt. Der Niederschlag wurde in Wasser gelöst und für die RT-PCR verwendet.
Es wurde gefunden, dass spektralphotometrische Messungen zur Bestimmung der optischen Dichte von RNA und DNA wesentlich verbessert werden, wenn sie in einer Lösung durchgeführt werden, die Konzentrationen von chelatbildenden Mitteln enthalten, die höher als üblich sind. Für diesen Zweck sollte die Konzentration der (des) chelatbildenden Mittel(s) höher sein als 5 mM, mit einem Optimum für Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 10 mM und für Citrat bei 30 mM. Dies ist ein neuer und unerwarteter Befund. Üblicherweise werden Messungen der optischen Dichte von RNA und DNA in Wasser oder 1 mM EDTA durchgeführt.
Bei einer höheren Konzentrationen von chelatbildenden Mitteln sind die Messungen der optischen Dichte reproduzierbarer und führen zu einem höheren 260/280-Verhältnis. Beispielsweise wies die in Beispiel 1 beschriebene RNA-Zubereitung ein 260/280-Verhältnis von 1,79 ± 0,05 bei Messung in Wasser und ein Verhältnis von 1,97 ± 0,01 bei Messung in 10 mM EDTA auf.
DNA-Isolierung. DNA wurde aus dem Nach-RNA-Lysat durch Zugabe von 0,15 ml Isopropanol ausgefällt. Der dotierende DNA-Niederschlag wurde auf die Pipettenspitze aufgedreht (aufgespult) und in ein neues Reaktionsgefäß transferiert. Das verbliebene Nach-DNA-Lysat wurde für die unten beschriebene Proteinisolierung aufbewahrt. Die DNA wurde durch Mischen mit 1 ml 95% Ethanol und Abpipettieren des Ethanolwaschmittels gewaschen. Die endgültige DNA-Zubereitung wurde durch sanftes Pipettieren in 8 mM NaOH gelöst, gefolgt von einer Neutralisierung der Lösung mit N-[2-hydroxyethyl]piperazin-N-[2-ethansulfonsäure] (HEPES, freie Säure). Die Isolation war in weniger als 14 Minuten abgeschlossen. Die isolierte DNA zeigte ein 260/280-Verhältnis von 1,81 ± 0,02 (SD, n = 3), was das Fehlen einer Proteinkontamination anzeigt. Der durchschnittliche Ertrag bei drei Isolierungen betrug 33,9 + 2,9 (SD, n = 3) μg DNA. Im Vergleich zur ursprünglichen Menge DNA im Lysat, bestimmt durch Diphenylalanin-Reaktion, stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine 91%ige Wiederfindung von DNA bereit.
Proteinisolierung. Proteine wurden durch die Zugabe von 1,8 ml, Isopropanol und Zentrifugation bei 10000 g für 5 Minuten aus dem Nach-DNA-Lysat ausgefällt. Der Niederschlag wurde mit 95% Ethanol gewaschen und in 0,1 N Essigsäure gelöst. Alternativ konnte der Niederschlag in 0,1% Natriumdodecylsulfat oder in Wasser gelöst werden. Die Protein-Isolierung war in 22 Minuten abgeschlossen. Die isolierte Protein-Zubereitung wurde durch Western-Blotting unter Verwendung eines spezifischen Anti-Ratten-Prolaktin-Antikörpers getestet. Die Anwesenheit der prolaktinspezifischen Bande im Western-Blot zeigt die gute Qualität der isolierten Protein-Zubereitung an.
Die Ergebnisse der Tests, die mit der gleichzeitig isolierten RNA, DNA und Proteinen durchgeführt wurden, sind in 1 dargestellt. 1A zeigt die Ergebnisse von Nukleinsäuren, die einer Elektrophorese in 1% Agarosegel unterzogen wurden und mit Ethidiumbromid gefärbt wurden. Die Spuren 1 und 2 zeigen unabgebaute Gesamt-RNA (3 μg/Spur); die Spuren 3 und 4 zeigen genomische DNA mit hohem Molekulargewicht (3 μg/Spur); und die Spuren 5 und 6 zeigen genomische DNA (3 μg), die für 2 Stunden mit EcoR1-Restriktase verdaut wurde. Wie die Ergebnisse zeigen, gibt es keine detektierbare DNA in der RNA-Zubereitung und keine detektierbare RNA in der DNA-Zubereitung. Der vollständige Abbau von DNA durch EcoR1-Restriktase zeigt die gute Qualität der isolierten DNA. Die Fig. B–D zeigen die Ergebnisse von RT-PCR, PCR und Western-Blotting, die mit Gesamt-RNA, genomischer DNA bzw. Proteinen durchgeführt wurden, die wie oben beschrieben isoliert wurden. Die RT-PCR (1B) und PCR (1C) wurden unter Verwendung von Glycerinaldehyde-3-phosphat-Dehydragenase(GAPDH)- bzw. Ratten-Wachstumshormon(GH)-Primern durchgeführt, und die Westernblots (1C) wurden unter Verwendung von Anti-Ratten-Prolaktin-Antikörpern durchgeführt. Die Amplifikation des 374 Basenpaare langen GADPD-DNA-Fragments bei der RT-PCR und des 686 Basenpaare langen GH-DNA-Fragments bei der PCR zeigt, daß die isolierten Nukleinsäure-Zubereitungen (RNA und DNA) angemessen rein für die PCR-Reaktion sind. Die Anwesenheit einer prolaktinspezifischen Bande im Westernblot zeigt die hohe Qualität der isolierten Protein-Zubereitung.
Entsprechende Ergebnisse für die gleichzeitige Isolierung von RNA, DNA und Proteinen wurden erhalten, wenn anstelle von Isopropanol andere wassermischbare organische Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol, Aceton, Dimethylsulfoxid, Polyethylenglykol oder Mischungen dieser Lösungsmittel verwendet werden. Diese wassermischbaren organischen Lösungsmittel können als Bestandteile der lysierenden Lösung und/oder als Fällungsmittel verwendet werden. Alle Lösungsmittel sind von Unternehmen wie Aldrich Chemical Co., Inc. (Milwaukee, WI.) oder Fluka Chemical Corp. (Ronkonkoma, N. Y.) erhältlich.
Beispiel 2 – Gleichzeitige Isolierung von RNA. DNA und Proteinen aus Geweben (nur zu Vergleichzwecken)
Bei dieser Ausführungsform des Verfahrens enthält die Lösung keinen organischen Lösungsmittelbestandteil. Dies erlaubt die Entfernung jeglicher nicht homogenisierter Gewebefragmente aus dem Lysat (Homogenat) durch eine kurze anfängliche Zentrifugation. Danach wird die RNA durch Zugabe von 0,2–0,3 Volumen eines organischen Lösungsmittels aus dem klaren Lysat ausgefällt.
Eine gefrorene Probe Ratten-Hypophyse wurde in einem tragbaren Glas-Teflon-Homagenisierer mit 1 ml einer Lysierungslösung enthaltend 4 M Guanidinthiocyanat, 0,1 M Natriumactetat, 0,1 M 2-Aminoethanthiolhydrochlorid und 0,2% Sarkosyl in Wasser homogenisiert. Die Lösung wurde mit Salzsäure auf pH 7,0 eingestellt. Das Homogenat wurde bei 10000 g für 5 Minuten zentrifugiert. Der klare Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt, mit 0,3 ml Isopropanol gemischt und für 3 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahrt, um die RNA auszufallen. Die ausgefällte RNA wurde durch Zentrifugation bei 10000 g für 8 Minuten entfernt und in Formamid gelöst. Der Nach-RNA-Überstand wurde weiterverarbeitet, um DNA und Proteine in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben zu isolieren. Die DNA und Proteine wurden nacheinander durch Zugabe von 0,5 ml Aceton bzw. 10,75 ml Aceton aus dem Nach-RNA-Lysat ausgefällt. Die isolierte RNA zeigte ein 260/280-Verhältnis von 1,74 und der Ertrag lag bei 0,06 mg. Die DNA zeigte ein 260/280-Verhältnis von 1,78 und der Ertrag lag bei 0,04 mg. Wie in 2A, dargestellt, war keine detektierbare DNA in der RNA-Zubereitung zugegen und keine detektierbare RNA in der DNA-Zubereitung anwesend. Wie in 1A, wurden die Nukleinsäuren einer Elektrophorese in 1% Agarosegel unterzogen und mit Ethidiumbromid gefärbt. Die Spuren 1 und 2, Gesamt-RNA (3 μg/Spur); Spuren 3 und 4, genomische DNA (3 μg/Spur); und Spuren 5 und 6, genomische DNA (3 μg), für 2 Stunden verdaut mit EcoR1-Restriktase.
Die Zubereitungen der Gesamt-RNA, genomischen DNA und Proteine wurden durch Northern-, Southern- und Western-Blotting auf Ratten-Wachstumshormon(GH)-mRNA, GH-Gen bzw. GH getestet. Alle drei Analysen, jeweils dargestellt in den 2B–D zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren hochqualitative RNA-, DNA- und Protein-Zubereitungen ergab.
Beispiel 3 – Isolierung von RNA aus Zellen ohne Zentrifugation des anfänglichen Lysats
Brusttumor-MCF7-Zellen wurden in einer Monolayer-Kultur in einer 3,5-cm-Petrischale angezogen. Am Ende der Kulturperiode wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen wurden durch Zugabe von 1 ml der lysierenden Lösung direkt in die Kulturschale lysiert. Die verwendete lysierende Lösung war die aus Beispiel 1. Das Lysat wurde bei 10000 g für 5 Minuten zentrifugiert und der RNA-Niederschlag wurde mit 95% Ethanol gewaschen und in Formamid gelöst. Die isolierte RNA zeigte ein 260/280-Verhältnis von 1,81 und der Ertrag lag bei 22 μg RNA.
Beispiel 4 – Isolation von RNA aus Geweben mit Zentrifugation des anfänglichen Lysats zur Entfernung von Gewebefragmenten (nur zu Vergleichszwecken)
Rattenniere (0,95 g) wurde in 19 ml einer lysierenden Lösung mit folgender Zusammensetzung homogenisiert: 4 M Guanidintrtiocyanat, 0,1 M Natriumactetat und 0,2% Sarkosyl in Wasser. Die Lösung wurde mit Salzsäure auf pH 7,0 eingestellt. Das Homogenat wurde zur Entfernung ungelösten Materials bei 10000 g für 5 Minuten zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die RNA wurde aus dem Überstand durch Zugabe von 3,8 ml (0,3 Volumen) Isopropanol ausgefällt und bei 10000 g für 8 Minuten zentrifugiert. Der RNA-Niederschlag wurde in Formamid gelöst und bei –20°C aufbewahrt. Die RNA-Zubereitung zeigte ein 260/280-Verhältnis von 1,77 und der Ertrag lag bei 3,9 mg RNA.
Beispiel 5 – Isolierung von DNA aus Zellen ohne Zentrifugation (nur zu Vergleichszwecken)
Die lysierende Lösung, die für diese DNA-Isolierung verwendet wurde, enthielt die folgenden Bestandteile: 4 M Guanidinthiocyanat, 0,1 M Natriumactetat, 17% Isopropanol, 0,2% Sarkosyl in Wasser. Die lysierende Lösung wurde durch Zugabe von 0,4 M NaOH auf pH 9 eingestellt.
Ratten-Hypophyse-P0-Zellen wurden durch wiederholtes Pipettieren in der lysierenden Lösung lysiert. Das Lysat wurde mit 0,4 Volumen Ethanol gemischt und die ausgefällte DNA wurde auf eine Pipettenspitze aufgedreht und zweimal mit 95% Ethanol gewaschen. Die erhaltene DNA wurde in 8 mM NaOH gelöst und auf pH 8,0 mit 0,1 M HEPES-Puffer neutralisiert.
Diese Ausführungsform der Erfindung verkürzt das DNA-Isolations-Protokoll durch Auslassen der Zentrifugation des Lysats noch mehr. Das Weglassen der Zentrifugation führt zu einer nur geringen Kontamination der isolierten DNA mit RNA. Die Analyse der wie oben beschrieben isolierten genomischen DNA wurde durch Elektrophorese derselben in 1% Agarosegel und Färbung mit Ethidiumbromid durchgeführt. Die Spuren 1 und 2 in 3 sind genomische DNA (3 μg/Spur), und die Spuren 3 und 4 sind genomische DNA, die für 2 Stunden mit EcoR1 verdaut wurden. Es ist aus 3 ersichtlich, daß nur eine Rückstandsmenge von RNA im Bereich niedrigen Molekulargewichts des Agarosegels durch die Ethidiumbromid-Färbung festgestellt wurde. Offenbar entfernt das Aufwickeln der DNA auf eine Pipettenspitze hauptsächlich DNA, während der Großteil der teilweise hydrolysierten RNA (wie durch deren geringes Molekulargewicht gezeigt wird) in dem Lysat verbleibt. Die Anwesenheit eines Reduktionsmittels ist für die Isolierung von DNA nicht erforderlich und die lysierende Lösung kann einen pH im Bereich von 6–12 aufweisen. Der alkalische pH kann mit NaOH, KOH oder anderen organischen oder anorganischen alkalischen Reagenzien eingestellt werden. Es wird angenommen, daß die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn das Lysat einen pH zwischen 8–9 aufweist.
Die unerwartete und rasche Hydrolyse von RNA, die bei pH 8–pH 9 auftritt, kann auf die Anwesenheit des chaotropen Mittels zurückgeführt werden. Dieser neue Befund ermöglicht die Isolation von DNA guter Qualität in einem einfachen Ein-Schritt-Verfahren.
Das Protokoll für die DNA-Isolation ohne Zentrifugation kann in weniger als 10 Minuten abgeschlossen werden. Es wird angenommen, daß dies das schnellste und einfachste Verfahren zur Isolierung von genomischer DNA ist. Wichtig ist hierbei, daß die einzige erforderliche Ausstattung für dieses Verfahren Reaktionsgefäße und Pipetten sind. Dies ermöglicht die Durchführung der DNA-Isolierung auf einer Exkursion oder anderswo mit einem begrenzten Zugriff auf Laborausstattung.
Beispiel 6 – Isolierung von DNA aus Geweben mit einer Zentrifugation des Lysats (nur zu Vergleichszwecken)
Ratten-Milz (127 mg) wurde in einem tragbaren Glas-Teflon-Homogenisierer mit 5 ml der in Beispiel 5 beschriebenen lysierenden Lösung homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 10000 g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die DNA wurde ausgefällt und wie in Beispiel 5 gewaschen. Die isolierte DNA zeigte ein 260/280 Verhältnis von 1,76 und der Ertrag lag bei 1,93 mg DNA.
Der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung soll durch die hier beschriebenen spezifischen Beispiele nicht limitiert werden, sondern soll einen Schutzbereich zugewiesen bekommen, der den beigefügten Ansprüchen entspricht.

Claims

Verfahren zum Isolieren von im Wesentlichen reiner und unverdauter RNA, DNA und Proteinen aus Zellen, umfassend die Schritte: a) Homogenisieren einer Zellprobe in einer Lösung, um ein Homogenat zu bilden; b) Gewinnen von im Wesentlichen reiner, unverdauter RNA aus dem Homogenat durch Sedimentation; c) anschließend Präzipitieren von DNA im verbleibenden Homogenat durch Zufügen einer zusätzlichen Menge eines organischen Lösungsmittels, und Gewinnen der präzipitierten DNA durch Sedimentation oder Ausspulen; und d) anschließend Präzipitieren von Proteinen aus dem verbleibenden Homogenat durch Zufügen einer zusätzlichen Menge von organischem Lösungsmittel, und Gewinnen der präzipitierten Proteine durch Sedimentation, wobei die Lösung eine Lösung zum Isolieren von im Wesentlichen reiner und unverdauter RNA, DNA und Proteinen aus biologischem Material ist, wobei die Lösung Folgendes umfasst: mindestens ein chaotropisches Mittel, wobei das/die chaotropische(n) Mittel oder Mischungen davon in einer Konzentration im Bereich von etwa 2 M bis 7 M anwesend ist/sind; einen Puffer, der in einer Menge anwesend ist, die ausreichend ist, um den pH-Wert der Lösung in einem Bereich von 6 bis 7,5 zu halten; und ein organisches Lösungsmittel, das in einer Konzentration im Bereich von 15 bis 30 Vol.-% der Lösung anwesend ist; wobei nicht mehr als etwa 30 Vol.-% des organischen Lösungsmittels anwesend ist, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus C₁-C₃-Alkoholen, Aceton, Polyethylenglykol, Dimethylsulfoxid und Mischungen davon, und wobei das chaotropische Mittel ausgewählt ist aus Guanidinthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Harnstoff, Natriumiodid und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zusätzliche Menge von zum Präzipitieren von DNA zugeführtem organischem Lösungsmittel in einem Verhältnis von 0,15 bis 0,3 Volumina Lösungsmittel pro Volumen des ursprünglichen Homogenats zugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus C₁-C₃-Alkoholen, Aceton, Polyethlenglycol und Dimethylsulfoxid.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das organische Lösungsmittel, das zum Präzipitieren von Proteinen zugeführt wurde, in einem Verhältnis von 3 bis 4 Volumina Lösungsmittel pro Volumen des ursprünglichen Homogenats zugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus C₁-C₃-Alkoholen, Aceton, Polyethylenglycol und Dimethylsulfoxid.
Verfahren zum Isolieren von im Wesentlichen reiner und unverdauter RNA aus Zellen, umfassend die Schritte: a) Homogenisieren einer Zellprobe in einer Lösung, um ein Homogenat zu bilden; und b) Gewinnen von im Wesentlichen reiner RNA aus dem Homogenat durch Sedimentation, wobei die Lösung eine Lösung zum Isolieren von im Wesentlichen reiner und unverdauter RNA, DNA und Proteinen aus biologischem Material ist, wobei die Lösung Folgendes umfasst: mindestens ein chaotropisches Mittel, wobei das/die chaotrapische(n) Mittel oder Mischungen davon in einer Konzentration im Bereich von etwa 2 M bis 7 M anwesend ist/sind; einen Puffer, der in einer Menge anwesend ist, die ausreichend ist, um den pH-Wert der Lösung in einem Bereich von 6 bis 7,5 zu halten; und ein organisches Lösungsmittel, das in einer Konzentration im Bereich von 15 bis 30 Vol.-% der Lösung anwesend ist; wobei nicht mehr als etwa 30 Vol.-% des organischen Lösungsmittels anwesend ist, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus C1-C3-Alkoholen, Aceton, Polyethylenglykol, Dimethylsulfoxid und Mischungen davon, und wobei das chaotropische Mittel ausgewählt ist aus Guanidinthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Harnstoff, Natriumiodid und Mischungen davon.