-
Gebiet der Erfindung
-
Die vorliegende Erfindung betrifft
allgemein therapeutische Verfahren, die das operative oder intravenöse Einführen von
Bindungspartnern beinhalten, die auf bestimmte Ziel- bzw. Target-Zellpopulationen
gerichtet sind, wie etwa glatte Muskelzellen, Krebszellen, somatische
Zellen, die eine Modulation zur Linderung eines Erkrankungszustands
erfordern, sowie Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere zur
Behandlung von Zuständen,
wie etwa Stenose in der Folge einer Gefäßverletzung oder Erkrankung,
Krebs, Erkrankungen, die von Hyperaktivität oder Hyperplasie somatischer
Zellen herrühren,
sowie Erkrankungen, die durch Immunsystem-Effektorzellen vermittelt
werden. Auch beschrieben wird das operative oder intravenöse Einführen aktiver Wirkstoffe,
die in der Lage sind, die Proliferation oder Migration oder Konzentration
glatter Muskelproteine zu verändern.
Die Erfindung betrifft auch das Zuweisen oder die gezielte Verabreichung
therapeutischer Wirkstoffe zu glatten Gefäßmuskelzellen, was zu einer
Dilatation und Fixierung des Gefäßlumens
führt (biologischer Stenteffekt).
Auch offenbart wird die kombinierte Verabreichung eines cytocidalen
Konjugats und einer Dauerfreigabe-Dosierungsform eines glatten Gefäßmuskel-Zellinhibitors.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Perkutane transluminale Coronarangioplastik
(PTCA) wird häufig
als Primärbehandlungsmöglichkeit in
vielen Patienten mit einer Coronararterienerkrankung angewendet.
PTCA kann myokardiale Ischämie
in Patienten mit einer Coronararterienerkrankung lindern, indem
sie die Lumenverstopfung reduziert und den coronaren Fluss verbessert.
Die Verwendung dieser operativen Prozedur ist schnell gewachsen,
mit 39.000 Prozeduren, die 1983 durchgeführt wurden, nahezu 150.000
in 1987, 200.000 in 1988, 250.000 in 1989 und für 1994 werden über 500.000
PTCAs pro Jahr geschätzt
(1, 2, 3). Stenose nach PTCA bleibt ein signifikantes Problem, wobei
von 25% bis 35% der Patienten innerhalb 1 bis 3 Monaten eine Restenose
entwicken. Restenose führt
zu signifikanter Morbidität
und Mortalität
und erfordert häufig
weitere Interventionen, wie etwa eine wiederholte Angioplastik oder
eine Coronarbypassoperation. Keine operative Intervention oder postoperative Behandlung
hat sich (bislang) als wirksam erwiesen, Restenose zu verhindern.
-
Die Prozesse, die für die Stenose
nach einer PCTA verantwortlich sind, sind nicht vollständig verstanden
worden, könnte
jedoch aus einer komplizierten Wechselwirkung zwischen verschiedenen
unterschiedlichen biologischen Wirkstoffen und Wegstrecken herrühren. Betrachtet
man histologische Schnitte, können restenotische
Läsionen
ein Überwachstum
glatter Muskelzellen in den Intimaschichten des Gefäßes aufweisen (3).
Verschiedene mögliche
Mechanismen für
die glatte Muskelzellproliferation nach PTCA sind vorgeschlagen worden
(1, 2, 4, 5).
-
Verbindungen, die Berichten zufolge
glatte Muskelzellproliferation in vitro unterdrücken (4, 6, 7), haben ungewünschte pharmakologische
Nebenwirkungen, wenn man sie in vivo anwendet. Heparin ist ein Beispiel einer
solchen Verbindung, die Berichten zufolge die glatte Muskelzellproliferation
in vitro hemmt, aber, wenn sie in vivo angewendet wird, die potenziell
schädliche
Nebenwirkung hat, Koagulation zu hemmen. Heparinpeptide haben, während sie
eine reduzierte antikoagulante Aktivität haben, die ungewünschte pharmakologische
Eigenschaft, dass sie eine kurze pharmakologische Halbwertzeit haben.
Es sind Versuche durchgeführt worden,
diese Probleme zu lösen,
durch Verwendung eines Doppelballonkatheters, d. h. zur örtlichen
Verabreichung des therapeutischen Wirkstoffs am Ort der Angioplastik
(z. B. 8; U.S. Patent Nr. 4,824,436), und durch Verwenden biologisch
abbaubarer Materialien, die mit einem Medikament imprägniert sind,
d. h. zum Kompensieren der Probleme der kurzen Halbwertzeit (z.
B. 9; U.S. Patent Nr. 4,929,602).
-
Verrucarine und Roridine sind trichothecene
Medikamente, die als sekundäre
Metabolite durch den Bodenpilz Myrothecium verrucaria und Myrothecium
roridium erzeugt werden. Verrucarin ist ein makrozyklischer Triester.
Roridin ist ein makrozyklischer Diester von Verrucarol (10). Als
eine Gruppe beziehen sich Trichothecene strukturell auf sesquiterpenoide
Mycotoxine, die von verschiedenen Pilzarten erzeugt werden, und sind
gekennzeichnet durch die 12,13-Epoxytrichothec-9-en-Grundstruktur.
Ihre cytotoxische Aktivität
für eukaryotische
Zellen ist eng korreliert mit ihrer Fähigkeit, an die Zelle zu binden,
internalisiert zu werden und die Protein- und Makromolekülsynthese
in der Zelle zu hemmen.
-
Zumindest fünf Überlegungen würden diesseits
scheinbar die Verwendung inhibitorischer Medikamente ausschließen, um
eine Stenose zu verhindern, die von Überwachstum glatter Muskelzellen
herrührt.
Erstens können
inhibitorische Wirkstoffe die systemische Toxizität haben,
die eine unakzeptable Risikohöhe
für Patienten
mit cardiovaskulären
Erkrankungen erzeugen könnte.
Zweitens könnten
sich die inhibitorischen Wirkstoffe mit der Gefäßwundheilung nach der Operation
stören,
und dies könnte
entweder die Heilung verzögern oder
die Struktur oder Elastizität
der frisch verheilten Gefäßwand schwächen. Drittens
könnten
inhibitorische Wirkstoffe, die glatte Muskelzellen abtöten, das
umgebende Endothel und/oder andere mediale glatte Muskelzellen beschädigen. Tote
und sterbende Zellen geben auch mitogene Wirkstoffe ab, die eine
zusätzliche
glatte Muskelzellproliferation stimulieren könnten und die Stenose verschlimmern
könnten.
Viertens könnte
die Verabreichung therapeutisch wirksamer Mengen eines inhibitorischen
Wirkstoffs von verschiedenen Standpunkten her problematisch sein:
nämlich
a) die Verabreichung einer großen
Anzahl von Molekülen
in die Intrazellularräume
zwischen den glatten Muskelzellen könnte notwendig sein, d. h.
um günstige
Bedingungen zu etablieren, um zu erlauben, dass eine therapeutisch
wirksame Dosis von Molekülen
die Zellmembran quert; b) das Zuweisen eines inhibitorischen Wirkstoffs
in den richtigen Intrazellularraum, d. h. dort, wo dessen Wirkung stattfindet,
könnte
schwierig zu steuern sein; und c) das Optimieren der Assoziation
des inhibitorischen Medikaments mit dessen intrazellulärem Ziel
bzw. Target, z. B. einem Ribosom, während eine intrazellulare Umverteilung
des Medikaments minimiert wird, z. B. benachbarte Zellen, könnte schwierig
sein. Fünftens,
weil die glatte Muskelzellproliferation über mehrere Wochen hinweg stattfindet,
wäre es
a priori ersichtlich, dass die inhibitorischen Medikamente über mehrere
Wochen hinweg verabreicht werden müssten, vielleicht dauerhaft, um
eine günstige
Wirkung zu erzielen.
-
Wie aus dem Vorstehenden ersichtlich,
verbleiben bei der Verwendung inhibitorischen Medikamente, einschließlich cytotoxischer
Wirkstoffe, viele Probleme zu lösen,
um die glatte Muskelzellproliferation wirkungsvoll zu behandeln.
Es wäre
besonders vorteilhaft, neue Methoden zu entwickeln, um Stenose aufgrund des
Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen
nach einer traumatischen Gefäßverletzung
zu unterbinden, wie sie etwa während
einer Gefäßoperation
stattfindet. Zusätzlich
vorteilhaft wäre
die Verabreichung von Verbindungen, die inhibitorische Effekte verlängerter
Dauer auf die glatten Gefäßmuskelzellen
erzeugt. Eine örtliche
Verabreichung dieser Dauerfreigabe-Verbindungen wäre auch bei der Behandlung
anderer Zustände
nützlich,
wo die Targetzellpopulation für
diese Verabreichung zugänglich
ist.
-
Ein Aspekt der Erfindung beinhaltet
die in vivo Platzierung eines Metall-, Kunststoff- oder biologisch abbaubaren
intravaskulären
Stents, der einen therapeutischen Wirkstoff aufweist. Auch angegeben
werden Stents, die einen therapeutischen Wirkstoff aufweisen. Eine
bevorzugte Ausführung
der Erfindung ist ein Stent, der einen therapeutischen Wirkstoff,
wie etwa einen cytoskelettalen Inhibitor oder einen Inhibitor glatter
Muskelzellproliferation aufweist. Ein bevorzuger cytoskelettaler
Inhibitor der Erfindung ist Cytochalasin, wie etwa Cytochalasin
B oder ein strukturelles Analog davon, das funktionell äquivalent
ist. Ein alternativer bevorzugter cytoskelettaler Inhibitor der
Erfindung ist Taxol oder ein strukturelles Analog davon, das funktionell äquivalent ist.
-
Die Stents können eine biologisch abbaubare
Beschichtung oder eine poröse
oder permeable, nicht biologisch abbaubare Beschichtung aufweisen.
Eine bevorzugte Ausführung
der Erfindung ist ein Stent, der eine biologisch abbaubare Beschichtung
oder eine poröse/permeable
nicht biologisch abbaubare Beschichtung aufweist, die den therapeutischen
Wirkstoff aufweist. Eine weiter bevorzugte Ausführung der Erfindung ist ein
Stent, der eine biologisch abbaubare Beschichtung oder eine poröse oder
nicht biologisch abbaubare Beschichtung aufweist, die eine Dauerfreigabe-Dosierungsform
des therapeutischen Wirkstoffs aufweist.
-
In einer alternativen Ausführung kann
ein Stent, z. B. ein biologisch abbaubarer Stent, darin, d. h. in der
Stentmatrix, mit dem therapeutischen Wirkstoff imprägniert sein.
Auch gedacht wird an die Anwendung eines biologisch abbaubaren Stents,
der mit dem therapeutischen Wirkstoff imprägniert ist, und der ferner
mit einer biologisch abbaubaren Beschichtung oder einer porösen oder
permeablen nicht biologisch abbaubaren Beschichtung beschichtet
ist, die eine Dauerfreigabe-Dosierungsform eines therapeutischen
Wirkstoffs aufweist. Diese Ausführung
der Erfindung kann eine differenzierte Freigaberate des therapeutischen
Wirkstoffs vorsehen, d. h. es gäbe
eine schnellere Freigabe des therapeutischen Wirkstoffs von der
Beschichtung, gefolgt durch verzögerte
Freigabe des therapeutischen Wirkstoffs, mit dem die Stentmatrix
imprägniert
ist, beim Abbau der Stentmatrix.
-
Der intravaskuläre Stent sieht ein mechanisches
Mittel vor, um für
eine Vergrößerung des
Lumenquerschnitts eines Gefäßes zu sorgen,
zusätzlich
zu dem, der über
die biologische Stentwirkung des cytoskelettalen Inhibitors vorgesehen
wird, wie etwa Cytochalasin B oder Taxol, das darin freigebbar eingebettet
ist. Ferner sorgt das Platzieren intravaskulärer Stents, die einen therapeutischen
Wirkstoff aufweisen, der ein Inhibitor glatter Muskelzellproliferation
ist, für
eine vergrößerte Effizienz,
indem es die Intimaproliferation reduziert oder verhindert. Diese
Hemmung der glatten Intimamuskelzellen und des durch den glatten
Muskel erzeugten Stroma erlaubt eine schnellere und vollständige Reendothelisierung
nach dem intraventionalen Platzieren des Gefäßstents. Die erhöhte Rate
der Reendothelisierung und Stabilisierung der Gefäßwand nach
der Stentplatzierung kann den Verlust des Lumenquerschnitts und
den verringerten Blutfluss reduzieren, der die primäre Ursache
für Gefäßstentausfälle ist.
-
Für
die Behandlung von Restenose glatter Gefäßmuskelzellen hemmen nutzbare
therapeutische Wirkstoffe die Targetzellaktivität (z. B. Proliferation oder
Migration), ohne die Targetzellen abzutöten. Bevorzugte therapeutische
Gruppen zu diesem Zweck sind Proteinkinaseinhibitoren (z. B. Staurosporin
oder dgl.), Inhibitoren glatter Muskelzellenmigration und/oder -kontraktion
(z. B. die Cytochalasine, wie etwa Cytochalasin B, Cytochalasin
C, Cytochalasin D oder dgl.), Suramin und Stickoxid-Freigabeverbindungen,
wie etwa Nitroglycerin oder analoge oder funktionelle Äquivalente
davon.
-
Beschreibung
der Zeichnungen
-
1 ist
eine Mikrophotographie glatter Gefäßmuskelzellen in einer Arterie
eines 24 Jahre alten männlichen
Patienten mit einem glatten Gefäßmuskel-Bindungsprotein,
das an die Zelloberfläche
und Membrane gebunden ist. Der Patient erhielt das glatte Gefäßmuskel-Bindungsprotein
durch i.v. Verabreichungn 4 Tage, bevor das arterielle Gewebe histologisch
präpariert
wurde.
-
1B ist
eine Mikrophotographie glatter Gefäßmuskelzellen in einer Arterie
eines 24 Jahre alten männlichen
Patienten mit einem glatten Gefäßmuskel-Bindungsprotein,
das an die Zelloberfläche
und Membrane gebunden ist. Der Schnitt wurde ex vivo mit HRP-konjugiertem
Ziegen-Anti-Maus-IgG
reagieren gelassen. Diese Reaktion wurde durch Hinzugabe von 4-Chlor-1-naphthol
sichtbar gemacht. Das Reaktionsprodukt des Substrats bildet ein
unlösliches
violettes oder dunkelbraunes Präzipitat
an dem Reaktionsort (bei #2 gezeigt). Eine Gegenfärbung wurde
angewendet, um Zellkerne sichtbar zu machen (bei #1 gezeigt).
-
2 zeigt
ein erstes Schema für
die chemische Kopplung eines therapeutischen Wirkstoffs mit dem glatten
Gefäßmuskel-Bindungsprotein.
-
3 zeigt
ein zweites Schema für
die chemische Kopplung eines therapeutischen Wirkstoffs mit einem
glatten Gefäßmuskel-Bindungsprotein.
-
4A zeigt
graphisch experimentelle Daten, die die schnelle Bindung des glatten
Gefäßmuskel-Bindungsproteins
an marker-positiven Testzellen in vitro zeigen.
-
4B zeigt
graphisch experimentelle Daten, die die schnelle Bindung des glatten
Gefäßmuskel-Bindungsproteins
an glatte Gefäßmuskelzellen
in vitro zeigen.
-
5A zeigt
graphisch experimentelle Daten, die die ungewünschte Cytotoxizität schon
geringer Pegel eines therapeutischen Konjugats (d. h. RA-NR-AN-01) sowie den
freien RA therapeutischen Wirkstoff zeigen, wenn glatte Gefäßmuskelzellen
für 24
Stunden in vitro behandelt wurden.
-
5B zeigt
graphisch experimentelle Daten, die die Effekte von RA-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat
auf die metabolische Aktivität
von markerpositiven und -negativen Zellen zeigt. Die Daten zeigen
die ungewünschte
nicht spezifische Cytotoxizität
des Konjugats für
alle diese Zellen in einer 24-Stunden-Behandlung
in vitro. Die Nichtspezifität
resultiert aus der extrazellulären
Hydrolyse des Kopplungsliganden, der die getesteten Zellen freiem
Medikament aussetzt.
-
6A zeigt
graphisch experimentelle Daten, die die ungewünschte nichtspezifische Cytotoxizität von PE-NR-AN-01
therapeutischem Konjugat für
marker-positive und marker-negative Testzellen zeigt, nach einer 24-stündigen Behandlung
in vitro, obwohl der 24-stündigen
Behandlung eine Übernachterholungsperiode
folgte, bevor die metabolische Aktivität getestet wurde.
-
6B zeigt
experimentelle Daten, die die nicht-spezifische Cytotoxizität des freien
PE therapeutischen Wirkstoffs auf marker-positive und -negative
Testzellen nach 24 Stunden Behandlung in vitro zeigen.
-
7A zeigt
graphisch experimentelle Daten, die zeigen, dass einer kurzen 5-minütigen "Impuls"-Behandlung, d. h.
anstelle von 24 Stunden, eine [3H] Leucin-Exposition folgt, wobei
der freie RA therapeutische Wirkstoff nicht spezifisch cytotoxisch
war, d. h. für
Kontroll-HT29-marker-negative Zellen, aber im Gegensatz hierzu das
RA-NR-AN-01 therapeutische Konjugat in dieser "Impuls"-Behandlungn nicht cytotoxisch ist.
-
7B zeigt
graphisch experimentelle Daten, die zeigen, dass ein freier RA therapeutischer
Wirkstoff für
Kontroll HT29-marker-negative Zellen nicht spezifisch cytotoxisch
ist, auch in einer 5' "Impuls"-Behandlung, gefolgt
von einer 24-stündigen
Erholungsperiode vor der [3H]Leucin-Exposition, jedoch im Gegensatz
dazu das RA-NR-AN-01 therapeutische Konjugat für Zellen nicht cytotoxisch
ist.
-
7C zeigt
graphisch die Ergebnisse von Experimenten, die zeigen, dass die "Impuls"-Behandlung von Zellen
in vitro mit RA-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat die zelluläre Aktivität in marker-positiven A375-Zellen
hemmt, gemessen durch Proteinsynthese.
-
7D zeigt
graphisch experimentelle Daten, die zeigen, dass eine "Impuls"-Behandlung von Zellen in
vitro mit RA-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat keine langdauernden
inhibitorischen Effekte auf die zelluläre Aktivität in marker-positiven Zellen
ausgeübt
hat, da die Proteinsynthese in A375-Zellen nicht gehemmt wurde,
wenn den Zellen eine Übernachterholungsperiode
vor dem Test in vitro zugestanden wurde.
-
8A zeigt
graphisch experimentelle Daten, die zeigen, dass, während eine "Impuls"-Behandlung von Zellen
in vitro mit freien RA therapeutischem Wirkstoff, nicht spezifisch
cytotoxisch war, das RA-NR-AN-01 therapeutische Konjugat keine langdauernden
inhibitorischen Effekte auf die zelluläre Aktivität in glatten Gefäßmuskelzellen
ausgeübt
hat, wie sich durch die metabolische Aktivität in BO54 Zellen ergibt, denen
eine 48-stündige
Erholungszeit vor dem Test zugestanden wurde.
-
8B zeigt
graphisch experimentelle Daten ähnlich
jenen, die in 8A oben
gezeigt sind, jedoch unter Verwendung eines zweiten markerpositiven
Zelltyps, nämlich
A375, wobei die Daten zeigen, dass eine "Impuls"-Behandlung mit dem RA-RN-AN-01 therapeutischen
Konjugat keine langdauernden inhibitorischen Effekte auf die zelluläre Aktivität ausgeübt hat,
gemessen durch die metabolische Aktivität in A375-Zellen, denen eine
48-stündige Erholungsperiode
vor dem Testen zugestanden wurde.
-
8C zeigt
graphische Ergebnisse ähnlich
jenen, die in 8A und 8B oben aufgezeigt sind, jedoch
unter Verwendung einer markernegativen Kontrollzelltyps, nämlich HT29.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die "Impuls"-Behandlung mit RA-NR-AN-01 therapeutischem
Konjugat keine langdauernden inhibitorischen Erffekte auf die zelluläre Aktivität markernegativer
Kontrollzellen ausgeübt
hat, gemessen durch die metabolische Aktivität in HT29-Zellen, denen eine
24-stündige
Erholungsdauer vor dem Test zugestanden wurde.
-
9A zeigt
eine Stenose aufgrund intimaler glatter Muskelzellproliferation
in einem histologischen Schnitt einer unbehandelten Arterie 5 Wochen
nach Angioplastik in einem Tiermodell.
-
9B zeigt
die Hemmung der Stenose in einem histologischen Schnitt einer Arterie,
die mit therapeutischem Konjugat 5 Wochen nach der Angioplastik
behandelt wurde, in einem Tiermodell.
-
10A zeigt
graphisch experimentelle Daten zum Vergleich der Proteinsynthese-
und DNA-Synthesehemmleistung von Suramin in Bezug auf glatte Gefäßmuskelzellen.
-
10B zeigt
graphisch experimentelle Daten zum Vergleich von Proteinsynthese-
und DNA-Synthesehemmleistung von Staurosporin in Bezug auf glatte
Gefäßmuskelzellen.
-
10C zeigt
graphisch experimentelle Daten zum Vergleich von Proteinsynthese-
und DNA-Synthesehemmleistung von Nitroglycerin in Bezug auf glatte
Gefäßmuskelzellen.
-
10D zeigt
graphisch experimentelle Daten zum Vergleich von Proteinsynthese-
und DNA-Synthesehemmleistung von Cytocyalasin B in Bezug auf glatte
Gefäßmuskelzellen.
-
11 zeigt
einen tangentiellen Schnitt parallel zur Innenoberfläche einer
glatten Gefäßmuskelzelle, die
62.500 Mal vergrößert ist
und durch zahlreiche endocytische Vesikel gekennzeichnet ist, von
denen einige antikörperbeschichtete
Goldperlen enthalten, in dem Prozess, in dem sie durch die Zelle
in vitro internalisiert werden.
-
12 zeigt
eine glatte Muskelzelle, die 62.500-fach vergrößert ist und gekennzeichnet
ist durch eine markierte Akkumulation von Goldperlen in Lysosomen
24 Stunden, nachdem die Zellen in vitro den Perlen ausgesetzt wurden.
-
13 zeigt
eine glatte Muskelzelle, die 62.500-fach vergrößert ist und gekennzeichnet
ist durch die Akkumulation von Goldperlen in Lysosomen in vivo.
-
14 zeigt
eine in vivo Dosis-Antwortstudie des Effekts von Cytochalasin B
auf dem Lumenquerschnitt von Schweine-Femoralarterien.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Die hierin benutzten folgenden Begriffe
haben die nachfolgend angegebenen Bedeutungen.
-
"Therapeutisches
Konjugat" bedeutet
ein glatter Gefäßmuskel
oder ein interstitielles Matrixbindungsprotein, das (z. B. optional
durch einen Linker) mit einem therapeutischen Wirkstoff gekoppelt
ist.
-
"Target" bzw. "Ziel" und "Marker" werden bei der Beschreibung
der Konjugat-Aspekte
der vorliegenden Erfindung austauschbar angewendet und bedeuten
ein Molekül,
das in einer spezifischen Weise durch das Matrix- oder Glatte-Gefäßmuskel-Bindungsprotein
erkannt wird, z. B. ein Antigen, ein Polypeptidantigen oder ein
Zelloberflächen-Kohlehydrat
(z. B. ein Glykolipid, ein Glykoprotein oder ein Proteoglykan),
das an den Zelloberflächenmembranen
einer glatten Gefäßmuskelzelle
oder einer Matrixstruktur exprimiert wird.
-
"Epitop" wird in Bezug auf
eine spezifische Stelle innerhalb des "Target"-Moleküls verwendet, das durch das
Matrix- oder Glatte-Muskel-Bindungsprotein
gebunden wird, z. B. eine Sequenz von drei oder mehr Aminosäuren oder
Sacchariden.
-
"Gekoppelt" wird angewendet,
mit der Bedeutung einer kovalenten oder nicht kovalenten chemischen Assoziation
(d. h. hydrophob durch van der Waals-Kräfte
oder Ladungs-Ladungswechselwirkungen) des Matrix- oder Glatten-Gefäßmuskel-Bindungsproteins
mit dem therapeutischen Wirkstoff. Aufgrund der Natur der angewendeten
therapeutischen Wirkstoffe werden die Bindungsproteine normalerweise
mittels kovalenter Bindung den therapeutischen Wirkstoffen zugeordnet.
-
"Linker" bedeutet einen Wirkstoff,
der das Matrix- oder Glatte-Muskel-Bindungsprotein an einen therapeutischen
Wirkstoff koppelt, z. B. einen organischen chemischen Koppler.
-
"Migration" glatter Muskelzellen
bedeutet die Bewegung dieser Zellen in vivo von den medialen Schichten
eines Gefäßes in die
Intima, wie sie auch in vitro durch Verfolgen der Bewegung einer
Zelle von einem Ort zu einem anderen untersucht werden können (z.
B. mittels Zeitverlauf-Filmaufnahmen oder einem Videorekorder oder
manueller Zählung
der glatten Muskelzellmigration aus einer definierten Fläche in der
Gewebekultur über
die Zeit).
-
"Proliferation", d. h. von glatten
Muskelzellen oder Krebszellen, bedeutet die Zunahme in der Zellzahl, d.
h. durch Mitose der Zellen.
-
"Exprimiert" bedeutet die mRNA-Transkription
und -Translation mit resultierender Synthese, Glykosylation und/oder
Sekretion eines Polypeptids durch eine Zelle, z. B. CSPG, das durch
eine glatte Gefäßmuskelzelle
oder einenericyt synthetisiert wird.
-
"Makrozyklisches
Trichothecen" soll
irgend ein Mitglied der Gruppe strukturell bezogener sesquiterpenoider
makrozyklischer Mycotoxine bedeuten, die durch verschiedene Pilzarten
hergestellt werden, und gekennzeichnet durch die 12,13-Epoxytrichothec-9-en-Grundstruktur,
z. B. Verrucarine und Roridine, die die Produkte des sekundären Metabolismus
des Bodenpilzes Myrothecium verrucaria und Myrothecium roridium
sind.
-
"Dauerfreigabe" bedeutet eine Dosierungsform,
die ausgestaltet ist, um deren therapeutischen Wirkstoff über eine
Zeitdauer freizugeben, die von etwa 3 bis etwa 21 Tagen reicht.
Die Freigabe über
eine längere Zeitdauer
wird auch als eine "Dauerfreigabe"-Dosierungsform der
vorliegenden Erfindung betrachtet.
-
"Dosierungsform" bedeutet eine freie
(ungezielte oder nichtbindungspartnerassoziierte) therapeutische
Wirkstoffformulierung sowie auch therapeutische Dauerfreigabe-Formulierungen,
wie etwa jene, die mikropartikulares oder nanopartikulares, biologisch
abbaubares oder nicht biologisch abbaubares polymeres Material enthalten,
das in der Lage ist, an ein oder mehrere Bindungsproteine oder Peptide
zu binden, um eine darin dispergierte therapeutische Gruppe einer
Targetzellpopulation zuzuführen.
-
"Staurosporin" umfasst Staurosporin,
einen Proteinkinase C-Inhibitor der folgenden Formel
sowie auch Diindoloalkaloide
mit einer der folgenden allgemeinen Strukturen:
-
-
Insbesondere umfasst der Begriff "Staurosporin" K-252 (siehe z.
B. japanische Patentanmeldung Nr. 62,164,626), BMY-41950 (U.S. Patent
Nr. 5,015,578), UCN-01 (U.S. Patent Nr. 4,935,415), TAN-999 (japanische
Patentanmeldung Nr. 01,149,791), TAN-1030A (japanische Patentanmeldung
Nr. 01,246,288), RK-286C (japanische Patentanmeldung Nr. 02,258,724)
und funktionelle Äquivalente
und Derivate davon. Derivate von Staurosporin umfassen jene, die
in den japanischen Patentanmeldungen Nr. 03,72,485; 01,143,877; 02,09,819
und 03,220,194 diskutiert sind, sowie jene in den internationalen
PCT-Anmeldungen
Nr. WO 89 07,105 und WO 91 09,034, und den europäischen Patentanmeldungen Nr.
EP 410,389 und
EP 296,110 . Derivate von K-252, einem
natürlichen
Produkt, sind bekannt. Siehe z. B. japanische Patentanmeldungen
Nr. 63,295,988; 62,240,689; 61,268,687; 62,155,284; 62,155,285;
62,120,388 und 63,295,589, sowie die internationale PCT-Anmeldung Nr. WO
88 07,045 und die europäische
Patentanmeldung Nr.
EP 323,171 .
-
"Cytochalasin" beinhaltet fungale
Metaboliten, die einen inhibitorischen Effekt auf den targetisierten bzw.
abgezielten Zellstoffwechsel aufzeigen, einschließlich Verhinderung
von Kontraktion oder Migration glatter Gefäßmuskelzellen. Bevorzugt hemmen
Cytochalasine die Polymerisierung von monomerem Actin (G-Actin)
in die polymere Form (F-Actin), um hierdurch die Zellfunktionen
zu hemmen, die cytoplasmatische Mikrofilamente benötigen. Cytochalasine
werden typischerweise von Phenylalanin (Cytochalasine), Tryptophan (Chaetoglobosine)
oder Leucin (Aspochalasine) abgeleitet, was in einer Benzyl-, Indo-3-ylmethyl-
oder Isobutylgruppe jeweils an der Position C-3 einer substituierten
Perhydroisoindol-1-on-Komponente resultiert (Formel V oder VI).
-
-
Die Perhydroisoindolkomponente enthält wiederum
einen 11-, 13- oder 14-Atom
carbozyklischen oder sauerstoffhaltigen Ring, der an die Positionen
C-8 und C-9 gekoppelt ist. Alle natürlich auftretenden Cytochalasine
enthalten eine Methylgruppe bei C-5; eine Methyl- oder Methylengruppe
bei C-12; und eine Methylgruppe bei C-14 oder C-16. Beispielhafte
Moleküle
umfassen Cytochalasin A, Cytochalasin B, Cytochalasin D, Cytochalasin
E, Cytochalasin F, Cytochalasin G, Cytochalasin H, Cytochalasin
J, Cytochalasin K, Cytochalasin L, Cytochalasin M, Cytochalasin
N, Cytochalasin O, Cytochalasin P, Cytochalasin Q, Cytochalasin
R, Cytochalasin S, Chaetoglobosin A, Chaetoglobosin B, Chaetoglobosin
C, Chaetoglobosin D, Chaetoglobosin E, Chaetoglobosin F, Chaetoglobosin
G, Chaetoglobosin J, Chaetoglobosin K, Deoxaphomin, Proxiphomin,
Protophomin, Zygosporin D, Zygosporin E, Zygosporin F, Zygosporin
G, Aspochalasin B, Aspochalasin C, Aspochalasin D und dgl., sowie
funktionelle Äquivalente
und Derivate davon. Bestimmte Cytochalasin-Derivate sind angegeben
in den japanischen Patenten Nr. 72 01,925; 72 14,219; 72 08,533;
72 23,394; 72 01924; und 72 04,164. Cytochalasin B wird in dieser
Beschreibung als prototypisches Cytochalasin angewendet.
-
Wie hierin angegeben, umfassen glatte
Muskelzellen und Pericyten jene Zellen, die aus den medialen Schichten
der Gefäße und der
Adventitiagefäße abgeleitet
sind, die in intimalen hyperplastischen Gefäßstellen infolge einer Verletzung
proliferieren, wie etwa jene, die während PTCA hervorgerufen werden.
-
Charakteristika glatter Muskelzellen
umfassen eine histologische Morphologie (unter lichtmikroskopischer
Untersuchung) einer Spindelform mit einem länglichen Kern, der zentral
in der Zelle angeordnet ist, mit vorhandenen Nucleoli und Myofibrillen
im Sarcoplasma. Unter elektronenmikroskopischer Untersuchung haben
glatte Muskelzellen lange schlanke Mitochondrien in dem juxtanuklearen
Sarcoplasma, einige wenige tubuläre
Elemente des granulären
endoplasmatischen Retikulums und zahlreiche Cluster freier Ribosomen. Nahe
einem Pol des Nucleus kann sich auch ein kleiner Golgi-Komplex befinden.
Der Großteil
des Sarcoplasmas ist durch dünne
parallele Myofilamente belegt, die überwiegend längs der
Achse der Muskelzelle orientiert sein können. Diese Actin-haltigen
Myofibrillen können
in Bündeln
angeordnet sein, mit dazwischen verteilten Mitochondrien. Durch
die kontraktive Substanz der Zelle können auch ovale dichte Bereiche
verstreut sein, mit ähnlichen
dichten Bereichen, die in Intervallen längs den Innenaspekten des Plasmalemma
verteilt sind.
-
Die Stents der Erfindung sind nutzbar,
um die Aktivität
der glatten Gefäßmuskelzellen
zu hemmen, zum Reduzieren, Verzögern
oder Beseitigen einer Stenose nach Angioplastik. Der hierin benutzte
Begriff "Reduzieren" bedeutet die Verringerung
der Intimaverdickung, die von der Stimulation der glatten Muskelzellproliferation
nach Angioplastik resultiert, entweder in einem Tiermodell oder
in einem Menschen. "Verzögern" bedeutet die Verzögerung der
Zeit bis zum Einsetzen einer sichtbaren Intimahyperplasie (z. B.
histologisch beobachtet oder durch angiographische Untersuchung)
nach Angioplastik, und kann auch von einer "reduzierten" Restenose begleitet sein. "Eliminieren" der Restenose nach
Angioplastik bedeutet das vollständige "Reduzieren" und/oder vollständige "Verzögern" der Intimahyperplasie
in einem Patienten in einem Ausmaß, das es nicht länger notwendig
macht, operativ zu intervenieren, d. h. einen geeigneten Blutfluss
durch das Gefäß durch
wiederholte Angioplastik, Atherectomie oder Coronararterien-Bypassoperation
wieder herzustellen. Die Effekte des Reduzierens, Verzögerns oder
Eliminierens einer Stenose kann durch Methoden bestimmt werden,
die für
den Fachmann Routine sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf
Angiographie, Ultraschallauswertung, fluoroskopische Abbildung,
endoskopische Faseroptikuntersuchung oder Biopsie und Histologie. Die
therapeutischen Konjugate der Erfindung erreichen diese vorteilhaften
Effekte, indem sie spezifisch an die Zellmembranen glatter Muskelzellen
und Pericyten binden.
-
Therapeutische Konjugate der Erfindung
werden erhalten, indem ein Glatte-Gefäßmuskel-Bindungsprotein
an einen therapeutischen Wirkstoff gekoppelt wird. In dem therapeutischen
Konjugat hat das Glatte-Gefäßmuskel-Bindungsprotein die
Funktion des Targetisierens (Zielens) des therapeutischen Konjugats
zu den glatten Gefäßmuskelzellen
oder Pericyten, und der therapeutische Wirkstoff hat die Funktion,
die Zellaktivität
der glatten Muskelzelle oder des Pericyts zu hemmen.
-
Therapeutische Dosierungsformen (vom
Dauerfreigabetyp) der vorliegenden Erfindung haben die Fähigkeit,
den therapeutischen Wirkstoff zu Targetzellen über eine gehaltene Zeitdauer
abzugeben. Therapeutische Dosierungsformen dieses Aspekts der vorliegenden
Erfindung können
in jeglicher Form vorliegen, die für diesen Zweck geeignet sind.
Bevorzugte therapeutische Dauerfreigabe-Dosierungsformen zeigen eine oder mehrere
der folgenden Eigenschaften:
- – eine mikropartikuläre (z. B.
von 0,5 Mikrometer bis etwa 100 Mikrometer Durchmesser, wobei von
etwa 0,5 bis etwa 2 Mikrometer bevorzugter ist) oder nanopartikuläre (z. B.
von etwa 1,0 Nanometer bis etwa 1000 Nanometer Durchmesser, wobei
von etwa 50 bis etwa 250 Nanometer bevorzugter ist) frei fließende Pulverstruktur;
- – eine
biologisch abbaubare Struktur, die so ausgebildet ist, dass sie über eine
Zeitdauer zwischen etwa 3 bis etwa 180 Tagen biologisch abgebaut
wird, wobei von etwa 10 bis etwa 20 Tagen bevorzugt ist, oder eine nicht
biologisch abbaubare Struktur, um zu erlauben, dass eine Diffusion
eines therapeutischen Wirkstoffs über eine Zeitdauer zwischen
von etwa 3 bis etwa 180 Tagen stattfindet, wobei von etwa 10 bis
etwa 120 Tagen bevorzugt ist;
- – biokompatible
mit Ziel- bzw. Targetgewebe und der örtlichen physiologischen Umgebung,
in die Dosierungsform verabreicht wird, einschließlich biokompatiblen
biologisch zersetzbaren Produkte;
- – Erleichtern
einer stabilen und reproduzierbaren Dispersion eines therapeutischen
Wirkstoffs darin, bevorzugt zur Bildung einer therapeutischen Wirkstoff-Polymermatrix,
wobei die Freigabe der therapeutischen Wirkstoffs durch einen oder
beide der folgenden Wege stattfindet: (1) Diffusion des therapeutischen
Wirkstoffs durch die Dosierungsform (wenn der therapeutische Wirkstoff
in dem Polymer oder Polymergemisch lösbar ist, das die Dosierungsform
bildet); oder (2) Freigabe des therapeutischen Wirkstoffs als die
biologischen Zersetzungsprodukte der Dosierungsform; und
- – die
Fähigkeit,
mit einem oder mehreren zellulären
und/oder interstitiellen Matrixepitop(en) zu binden, wobei von etwa
1 bis etwa 10.000 Bindungsprotein/peptid-Dosierungsformbindungen
bevorzugt ist, und wobei ein Maximum von etwa einer Bindungspeptid-Dosierungsform
pro 150 Quadratangström
der Partikeloberfläche
bevorzugter sind. Die gesamte Bindungszahl ist von der eingesetzten
Partikelgröße abhängig. Die Bindungsproteine
oder -peptide sind in der Lage, die partikuläre therapeutische Dosierungsform
durch kovalente Ligandensandwich oder nicht kovalente Modalitäten zu koppeln,
wie sie hierin angegeben sind.
-
Nanopartikuläre therapeutische Dauerfreigabe-Dosierungsformen
der bevorzugten Ausführungen
der vorliegenden Erfindung sind biologisch abbaubar und binden an
die glatten Gefäßmuskelzellen
und dringen in diese Zellen primär
durch Endozytose ein. Der biologische Abbau dieser Nanopartikel
erfolgt über
die Zeit (z. B. 10 bis 21 Tagen) in prälysomischen Vesikeln und Lysosomen.
Die bevorzugten größeren therapeutischen mikropartikulären Dosierungsformen
der vorliegenden Erfindung binden an die Targetzelloberfläche oder
die interstitielle Matrix in Abhängigkeit
von dem gewählten
Bindungsprotein oder -peptid, und gegeben die therapeutischen Wirkstoffe
zur anschließenden
Aufnahme durch die Targetzelle frei, wobei nur wenige der kleineren Mikropartikel
durch Phagocytose in die Zelle eindringen. Ein Praktiker der Technik
will erkennen, dass der präzise
Mechanismus, durch den eine Targetzelle eine Dosierungsform der
vorliegenden Erfindung assimiliert und metabolisiert, von der Morphologie,
Physiologie und den metabolischen Prozessen dieser Zellen abhängig ist.
-
Die Größe der targetisierten therapeutischen
partikulären
Dauerfreigabe-Dosierungsformen
ist auch in Bezug auf die Art der zellulären Assimilation wichtig. Z.
B. können
kleinere Nanopartikel mit der Interstitialflüssigkeit zwischen den Zellen
fließen
und in das infundierte Gewebe eindringen, bis sie an das normale
oder neoplastische Gewebe binden, welches als das Bindungs/Protein/Peptid
ausgewählt
ist. Dieses Merkmal ist z. B. wichtig, weil die Nanopartikel den
lymphatischen Drainagekanälen
von infundierten primären
neoplastischen Foci, metastatischen Targetfoci entlang dem lymphatischen
Trakt folgen. Die größeren Nanopartikel
haben die Tendenz, dass sie leichter interstitiell in dem infundierten
Primärgewebe
gefangen werden.
-
Bevorzugte Dauerfreigabe-Dosierungsformen
der vorliegenden Erfindung sind biologisch abbaubare Mikropartikulate
oder Nanopartikulate. Besonders bevorzugt werden biologisch abbaubare
Mikropartikel oder Nanopartikel aus einer polymerhaltigen Matrix
gebildet, die durch zufällige
nicht enzymatische hydrolytische Auftrennung biologisch abgebaut
werden, um den therapeutischen Wirkstoff freizugeben, um hierdurch
Poren innerhalb der partikulären
Struktur zu bilden.
-
Zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung sind Polymere bevorzugt, die aus der Kondensation von
Alpha-Hydroxycarboxylsäuren
und zugeordneten Lactonen abgeleitet sind. Eine besonders bevorzugte Komponente
wird aus einem Gemisch thermoplastischer Polyester (z. B. Polylactide
oder Polyglycolide) oder einem Copolymer von Lactiden- und Glycoliden-Komponenten gebildet,
wie ewta Poly(lactid-co-glycolid). Eine beispielhafte Struktur,
ein Zufallspoly-(DL-lactid-co-glycolid) ist unten gezeigt, wobei
die Werte von x und y vom Praktiker der Technik manipulierbar sind,
um gewünschte
mikropartikuläre
oder nanopartikuläre
Eigenschaften zu erhalten.
-
-
Andere Wirkstoffe, die zur Bildung
von partikulären
Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beinhalten
Polyorthoester und Polyacetale (Polymer Letters, 18: 293, 1980)
und Polyorthocarbonate (U.S. Patent Nr. 4,093,709) und dgl.
-
Bevorzugt milchsäure/glycolsäurepolymerhaltige Matrixpartikulate
der vorliegenden Erfindung werden durch emulsionsbasierende Prozesse
hergestellt, die modifizierte Lösungsmittelextraktionsprozesse
darstellen, wie etwa jene, die beschrieben sind in Cowsar et al., "Poly(Lactide-Co-Glycolide)
Microcapsules for Controlled Release of Steroids", Methods Enzymology, 112: 101–116, 1985
(Steroideinschluss in Micropartikulaten); Eldridge et al., "Biodegradable and
Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant
for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level
of Toxin-Neutralizing Antibodies", Infection
and Immunity, 59: 2978–2986,
1991 (Toxoid-Einschluss); Cohen et al., "Controlled Delivery Systems for Proteins
Based on Poly(Lactic/Glycolic Acid) Microspheres", Pharmaceutical Research, 8(6): 713–720, 1991
(Enzymeinschluss); und Sanders et al., "Controlled Release of a Luteinizing
Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide)
Microspheres", J.
Pharmaceutical Science, 73(9): 1294–1297, 1984 (Peptideinschluss).
-
Allgemein enthält die Prozedur zur Bildung
partikulärer
Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung das Lösen des
Polymers in einem halogenierten Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel,
Dispergieren einer therapeutischen Wirkstofflösung (bevorzugt wässrig) darin,
und Hinzufügen
eines zusätzlichen
Wirkstoffs, der als Lösungsmittel
für das
halogenierte Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel
wirkt, jedoch nicht für
das Polymer. Das Polymer präzipitiert
aus der Polymer-halogenierten Kohlenwasserstoff-Lösung auf
Tröpfchen
der therapeutischen Wirkstoff haltigen Lösung und schließt den therapeutischen
Wirkstoff ein. Bevorzugt wird der therapeutische Wirkstoff im Wesentlichen
gleichmäßig in der
Dauerfreigabe-Dosierungsform der vorliegenden Erfindung dispergiert.
Nach der Partikelbildung werden sie mit einem organischen Lösungsmittel
gewaschen und gehärtet.
Vor dem Trocknen bei Raumtemperatur unter Vakuum folgen Schritte
des Wasserwaschens und des Waschens mit wässrigem nicht-ionischen oberflächenaktiven
Stoff.
-
Zum Zwecke der Biokompatibilität werden
partikuläre
Dosierungsformen, die durch darin in Matrixform dispergiertem therapeutischen
Wirkstoff gekennzeichnet sind, vor der Verpackung, Aufbewahrung
oder Verabreichung sterilisiert. Das Sterilisieren kann in jeder
hierfür
geeigneten Art durchgeführt
werden. Z.B. können die
Partikulate mit Gamma-Strahlung bestrahlt werden, vorausgesetzt,
dass das Aussetzen dieser Strahlung die Struktur oder Funktion des
therapeutischen Wirkstoffs, der in der Therapeutischer-Wirkstoff-Polymermatrix oder
dem daran angebrachten Bindungsprotein/peptid nicht nachteilig beeinflusst.
Wenn der therapeutische Wirkstoff oder das Bindungsprotein/peptid
so nachteilig beeinflusst ist, können
die partikulären
Dosierungsformen unter sterilen Bedingungen produziert werden.
-
Die Freigabe des therapeutischen
Wirkstoffs aus den partikulären
Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung kann als Ergebnis sowohl
von Diffusion als auch partikulärer
Matrixerosion erfolgen. Die biologische Abbaurate beeinflusst direkt
die Kinetiken der therapeutischen Wirkstofffreigabe. Die biologische
Abbaurate ist durch Veränderung
der Zusammensetzung und der Struktur der Dauerfreigabe-Dosierungsform
regulierbar. Z. B. kann eine Veränderung
des Lactid/Glycolid-Verhältnisses
in bevorzugten Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung so durchgeführt werden,
wie beschrieben in Tice et al., "Biodegradable
Controlled-Release Parenteral Systems", Pharmaceutical Technology, S. 26–35, 1984;
durch Einschluss von Polymerhydrolyse-modifizierenden Mitteln, wie
etwa Zitronensäure
und Natriumcarbonat, wie beschrieben von Kent et al., "Microencapsulation
of Water Soluble Active Polypeptides", U.S. Patent Nr. 4,675,189; durch Verändern der
Beladung des therapeutischen Wirkstoffs in das Lactid/Glycolidpolymer,
wobei die Abbaurate umgekehrt proportional zur Menge des darin enthaltenen
therapeutischen Wirkstoffs ist, sowie durch sorgfältige Auswahl
eines geeigneten Analogons einer gemeinsamen Familie therapeutischer
Wirkstoffe, die unterschiedliche Potenzen aufzeigen, um die Kernladungen
zu verändern;
und durch Verändern
der Partikelgröße, wie
beschrieben in Beck et al., "Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide)/Norethisterone
Mücrocapsules:
An Injectable Biodegradable Contraceptive", Biol. Reprod., 28: 186–195, 1983
oder dgl. Alle vorgenannten Methoden zum Regulieren der biologischen
Abbaurate beeinflussen die intrinsische Viskosität der polymerhaltigen Matrix,
um hierdurch deren Hydratationsrate zu verändern.
-
Die bevorzugte Lactid/Glycolid-Struktur
ist mit der physiologischen Umgebung des Säugers biologisch kompatibel.
Auch haben diese bevorzugten Dauerfreigabe-Dosierungsformen den
Vorteil, dass deren biologische Zersetzung Milchsäure und
Glycolsäure
erzeugt, die beide normale Stoffwechselprodukte von Säugern sind.
-
Funktionelle Gruppen, die erforderlich
sind, damit die Bindungsprotein/peptid-Partikel-Dosierungsform an die Partikel
bindet, sind optional in der partikulären Struktur enthalten, zusammen
mit den nicht zersetzbaren oder biologisch zersetzbaren Polymereinheiten.
Funktionelle Gruppen, die zu diesem Zweck nutzbar sind, beinhalten
jene, die mit Peptiden reaktiv sind, wie etwa Carboxylgruppen, Amingruppen,
Sulfhydrylgruppen und dgl. Bevorzugte Bindungsverbesserungs-Komponenten
enthalten die terminalen Carboxylgruppen der bevorzugten (Lactid-Glycolid)
polymerhaltige Matrix oder dgl.
-
Ein nutzbares Glattes-Gefäßmuskel-Bindungsprotein
ist eine Polypeptid-, peptidische oder mimetische Verbindung (wie
unten beschrieben), die in der Lage ist, an ein Target bzw. Ziel
oder einen Marker auf einer Oberflächenkomponente einer intakten
oder zerstörten
glatten Gefäßmuskelzelle
derart zu binden, dass sie entweder die Freigabe des therapeutischen
Wirkstoffs extrazellulär
in die interstitielle Zwischenmatrix mit anschließender Diffusion
des therapeutischen Wirkstoffs in die verbleibenden intakten glatten
Gefäßmuskelzellen
und/oder die Internalisierung durch die Zelle in ein intrazelluläres Kompartment
der gesamten targetisierten biologisch abbaubaren Komponente, was
die Ausgabe des therapeutischen Wirkstoffs gestattet. Repräsentative
Beispiele nutzbarer Glatter-Gefäßmuskelzellen-Bindungsproteine
beinhalten Antikörper
(z. B. monoklonale oder polyklonale affinitätsgereinigte Antikörper), F(ab')2,
Fab', Fab und Fv-Fragmente
und/oder komplementäre
determinierende Bereiche (CDR) von Antikörpern oder funktionellen Äquivalenten
davon (z. B. Bindungspeptide und dgl.); Wachstumsfaktoren, Cytokine
und polypeptide Hormone und dgl.; sowie Makromoleküle, die
extrazelluläre
Matrixrezeptoren erkennen (z. B. Integrin und Fibronectin-Rezeptoren
und dgl.).
-
Andere bevorzugte Bindungspeptide,
die beim Targetisieren der Dosierungsformausführung der vorliegenden Erfindung
nützlich
sind, beinhalten jene, die ein intrazelluläres Stoma und Matrix lokalisieren,
die sich zwischen und unter den glatten Gefäßmuskelzellen befindet. Diese
Bindungspeptide liefern den therapeutischen Wirkstoff zu dem Interstitialraum
zwischen den Targetzellen. Der therapeutische Wirkstoff wird in
diese Interstitialräume
zur anschließenden
Aufnahme durch die glatten Gefäßmuskelzellen
freigegeben. Bevorzugte Bindungspeptide dieses Typs sind Epitopen
an Collagen, extrazellulären
Glykoproteinen, wie etwa Tenascin, Reticulum und elastischen Fasern
und anderem interzellulären
Matrixmaterial zugeordnet.
-
Therapeutische Wirkstoffe der Erfindung
werden ausgewählt,
die zelluläre
Aktivität
einer glatten Gefäßmuskelzelle
zu hemmen, z. B. Proliferation, Migration, Zunahme im Zellvolumen,
Zunahme in der extrazellulären
Matrixsynthese (z. B. Collagene, Proteoglycane und dgl.) oder Sekretion
extrazellulärer
Matrixmaterialien durch die Zelle. Bevorzugt wirkt der therapeutische
Wirkstoff entweder: a) als "cytostatischer
Wirkstoff', um die
Zellteilung in proliferierenden Zellen zu verhindern oder zu verzögern, indem
die DNA-Replikation gehemmt wird (z. B. durch ein Medikament, wie
etwa Adriamycin, Staurosporin oder dgl.) oder durch Hemmen der Spindelfaserbildung
(z. B. ein Medikament, wie etwa Colchicin) und dgl.; oder b) als
Inhibitor der Migration glatter Gefäßmuskelzellen von der medialen
Wand in die Intima, z. B. ein "antimigratorischer
Wirkstoff', wie etwa
Cytochalasin; oder c) als ein Inhibitor der intralzellulären Zunahme
im Zellvolumen (d. h. das von einer Zelle belegte Gewebevolumen;
ein "cytoskelettaler
Inhibitor" oder "metabolischer Inhibitor"); oder d) als ein
Inhibitor, der die zelluläre
Proteinsynthese und/oder Sekretion oder Organisation der extrazellulären Matrix
blockiert (d. h. ein "Antimatrixwirkstoff").
-
Repräsentative Beispiele "cytostatischer Wirkstoffe" beinhalten z. B.
modifizierte Toxine, Methotrexat, Adriamycin, Radionuklide (z. B.
etwa jene, die offenbart sind in Fritzberg et al., U.S. Patent Nr.
4,897,255), Proteinkinaseinhibitoren (z. B. Staurosporin), Inhibitoren
spezifischer Enzyme (z. B. wie etwa die Nuclearenzym-DNA-Topoisomerase
II und DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, Adenylguanylcyclase), Superoxiddismutaseinhibitoren,
terminale Deoxynucleotidyltransferase, reverse Transkriptase, gegensinnige
Oligonukleotide, die die glatte Gefäßmuskelzellen-Proliferation
und dgl. unterdrücken,
wie dann, wenn sie in ein Zellkompartment mit geeigneter Dosierung
geliefert werden, die Wirkung haben, die Proliferation einer glatten
Gefäßmuskelzelle
oder eines Pericyten zu beeinträchtigen,
ohne die Zelle abzutöten.
Andere Beispiele "cytostatischer
Wirkstoffe" enthalten
peptidische oder mimetische Inhibitoren (d. h. Antagonisten, Agonisten
oder kompetitive oder nicht kompetitive Inhibitoren) zellulärer Faktoren,
die (z. B. in der Gegenwart extrazellulärer Matrix) die Proliferation
glatter Gefäßmuskelzellen
oder Pericyten auslösen
können;
z. B. Cytokine (z. B. Interleukine, wie etwa IL-1), Wachstumsfaktoren (z. B. PDGF, TGF-alpha
oder -beta, Tumornekrosefaktor, glatte Gefäßmuskel- und endothelial abgeleitete
Wachstumsfaktoren, z. B. Endothelin, FGF), Homingrezeptoren (z.
B. für
Plättchen
oder Leukozyten) und extrazelluläre
Matrixrezeptoren (z. B. Integrine). Repräsentative Beispiele nutzbarer
therapeutischer Wirkstoffe in dieser Kategorie cytostatischer Wirkstoffe
für die
glatte Muskelproliferation enthalten: Subfragmente von Heparin,
Triazolpyrimidin (Trapidil; ein PDGF-Antagonist), Lovastatin und Prostaglandine
E1 oder I2.
-
Repräsentative Beispiele "antimigratorischer
Wirkstoffe" beihalten
Inhibitoren (d. B. Agonisten und Antagonisten, und kompetitive oder
nicht kompetitive Inhibitoren) chemotaktischer Faktoren und ihrer
Rezeptoren (z. B. komplementäre
Chemotaxine, wie etwa C5a, C5a desarg oder C4a; extrazelluläre Matrixfaktoren,
z. B. Collagenabbaufragmente) oder intrazelluläre cytoskelettale Proteine,
die in der Lokomotion involviert sind (z. B. Actin, cytoskelettale
Elemente und Phosphatasen und Kinasen, die bei der Lokomotion involviert
sind). Repräsentative
Beispiele nutzbarer therapeutischer Wirkstoffe in dieser Kategorie
antimigratorischer Wirkstoffe enthalten: Kafteinsäurederivate
und Nilvadipin (ein Calciumantagonist) und Steroidhormone. Bevorzugte
antimigratorische therapeutische Wirkstoffe sind die Cytochalasine.
-
Repräsentative Beispiele von "cytoskelettalen Inhbitoren" enthalten Colchicine,
Vinblastin, Cytochalasine, Taxol oder dgl., die auf die Mikrotubuli
und mikrofilamenten Netzwerke innerhalb einer Zelle wirken.
-
Repräsentative Beispiele "metabolischer Inhibitoren" enthalten Staurosporin,
Trichothecene und modifizierte Diphtherie- und Ricintoxine, Pseudomonas exotoxin
und dgl. In einer bevorzugten Ausführung ist das therapeutische
Konjugat mit einem therapeutischen Wirkstoff aufgebaut, der ein
einfaches Trichothecen oder ein makrozyklisches Trichothecen ist,
z. B. ein Verrucarin oder Roridin. Trichothecene sind Medikamente,
die durch Bodenpilze der Klasse Funig imperfecti produziert werden
oder aus Baccharus megapotamica isoliert sind (Bamburg, J. R. Proc.
Molec. Subcell. Biol. 8: 41–110,
1983; Jarvis /Mazzola, Acc. Chem. Res. 15: 338–395, 1982). Sie scheinen die
am stärksten
toxischen Moleküle
zu sein, die nur Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff enthalten
(Tamm, C. Fortschr. Chem. Org. Naturst. 31: 61–117, 1974). Von ihnen allen
wird berichtet, dass sie in der Höhe des Ribosoms als Inhbitoren
der Proteinsynthese bei den Initüerungs-,
Elongations- oder Terminationsphasen wirken.
-
Es gibt zwei breite Klassen von Trichothecenen:
jene, die nur eine zentrale sesquiterpenoide Struktur haben, und
jene, die einen zusätzlichen
makrozyklischen Ring haben (einfache bzw. makrozyklischen Trichothecene).
Die einfachen Trichothecene können
in drei Gruppen unterteilt werden (d. h. Gruppe A, B und C), wie
in den U.S. Patenten Nr. 4,744,981 und 4,906,452 beschrieben (die
hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden). Repräsentative
Beispiele der Gruppe A einfacher Trichothecene enthalten: Scirpen,
Roridin C, Dihydrotrichothecen, Scirpen-4, 8-Diol, Verrucarol, Scirpentriol,
T-2 Tetraol, Pentahydroxyscirpen, 4-Deacetylneosolaniol, Trichodermin,
Deacetylcalonectrin, Calonectrin, Diacetylverrucarol, 4-Monoacetoxyscirpenol, 4,15-Diacetoxyscirpenol,
7-Hydroxydiacetoxyscirpenol, 8-Hydroxydiacetoxyscirpenol (Neosolaniol),
7,8-Dihydroxydiacetoxyscirpenol, 7-Hydroxy-8-acetyldiacetoxyscirpenol,
8-Acetylneosolaniol, NT-1, NT-2, HT-2, T-2 und Acetyl-T-2-toxin.
-
Repräsentative Beispiele der Gruppe
B einfacher Trichothecene enthalten: Trichothecolon, Trichothecin,
Deoxynivalenol, 3-Acetyldeoxynivalenol, 5-Acetyldeoxynivalenol, 3,15-Diacetyldeoxynivalenol,
Nivalenol, 4-Acetylnivalenol
(Fusarenon-X), 4,15-Idacetylnivalenol, 4,7,15-Triacetylnivalenol und Tetra-Acetylnivalenol. Repräsentative
Beispiele der Gruppe C einfacher Trichothecene enthalten: Crotocol
und Crotocin. Repräsentative
Beispiele der makrozyklischen Trichothecene enthalten Verrucarin
A, Verrucarin B, Verrucarin J (Satratoxin C), Roridin A, Roridin
D, Roridin E (Satratoxin D), Roridin H, Satratoxin F, Satratoxin
G, Satratoxin H, Vertisporin, Mytoxin A, Mytoxin C, Mytoxin B, Myrotoxin
A, Myrotoxin B, Myrotoxin C, Myrotoxin D, Roritoxin A, Roritoxin
B und Roritoxin D. Zusätzlich
ist auch die allgemeine "Trichothecen"-sesquiterpenoide
Ringstruktur in Verbindungen vorhanden, genannt "Baccharine", die aus der höheren Pflanze Baccharis megapotamica
isoliert sind und die in der Literatur beschrieben sind, wie z.
B. offenbart in Jarvis et al. (Chemistry of Alleopathy, ACS Symposium
Series Nr. 268: Ed. A. C. Thompson, 1984, S. 149–159).
-
Repräsentative Beispiele von "Antimatrixwirkstoffen" enthalten Inhbitoren
(d. h. Agonisten und Antagonisten und kompetitive und nicht kompetitive
Inhibitoren) der Matrixsynthese, Sekretion und Zusammenbau, organisatorische
Quervernetzer (z. B. Transglutaminasen quervernetzendes Collagen)
und Matrixwiederaufbau (z. B. nach der Wundheilung). Ein repräsentatives
Beispiel eines nützlichen
therapeutischen Wirkstoffs ist in dieser Kategorie von Antimatrixwirkstoffen
ist Colchicin, ein Inhibitor der Sekretion extrazellulärer Matrix.
-
Für
die Dauerfreigabe-Dosierungsform-Ausführung der vorliegenden Erfindung
sind therapeutische Wirkstoffe bevorzugt jene, die die Glatte-Gefäßmuskelzellaktivität hemmen,
ohne die Zellen abzutöten
(d. h. cytostatische therapeutische Wirkstoffe). Bevorzugte therapeutische
Wirkstoffe zu diesem Zweck zeigen eine oder mehrere der folgenden
Fähigkeiten:
Hemmen der DNA-Synthese vor der Proteinsynthesehemmung, oder Hemmung
der Migration der glatten Gefäßmuskelzellen
in die Intima. Diese therapeutischen Wirkstoffe hemmen die Proteinsynthese
nicht signifikant (d. h. sie töten
die Targetzellen nicht ab), und erleichtern daher die zelluläre Reparatur
und Matrixproduktion, um die Gefäßwandläsion zu
stabilisieren, die durch Angioplastik hervorgerufen wird, um hierdurch
die glatte Muskelzellproliferation zu reduzieren.
-
Beispiele dieser bevorzugten therapeutischen
Wirkstoffe sind Proteinkinaseinhibitoren, wie etwa Staurosporin
(Staurosporin ist erhältlich
bei Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), Cytochalasine, wie
etwa Cytochalasin B (Sigma Chemical Co.) und Suramin (FBA Pharmaceuticals,
West Haven, Connecticut), sowie auch Nitroglycerin (DuPont Pharmaceuticals,
Inc. Manuti, Puerto Rico) oder analoge oder funktionelle Äquivalente
davon. Diese Verbindungen sind cytostatisch und haben gezeigt, dass
sie eine minimale Proteinsynthesehemmung und Cytotoxizität bei Konzentrationen
ausüben,
wo eine signifikante DNA-Synthesehemmung stattfindet (siehe Beispiel
8 und 10A–10D). Ein nutzbares Protokoll
zur Identifizierung therapeutischer Wirkstoffe, die in den Dauerfreigabe-Dosierungsformausführungen
der vorliegenden Erfindung nutzbar sind, sind z. B. in Beispiel
8 aufgeführt.
Ein Praktiker in der Technik ist in der Lage, im Wesentlichen äquivalente experimentelle
Protokolle zu entwerfen, um eine solche Identifizierung unterschiedlicher
Targetzellpopulationen durchzuführen,
wie etwa adhärente
einschichtige Targetzelltypen. Andere Ausführungen der vorliegenden Erfindung
beinhalten Wirkstoffe, die für
Krebszellen cytotoxisch sind. Bevorzugte Wirkstoffe für diese
Ausführungen
sind Roridin A, Pseudomonas exotoxin und dgl. oder analoge oder
funktionelle Äquivalente
davon. Eine Plethora dieser therapeutischer Wirkstoffe, einschließlich Radioisotopen
und dgl., ist identifiziert worden und ist in der Technik bekannt.
Zusätzlich
sind Protokolle für
die Identifikation cytotoxischer Gruppen bekannt und werden in der
Technik routinemäßig angewendet.
-
Glatte-Gefäßmuskelzell-Bindungsproteine
der Erfindung binden an Targets an der Obertläche glatter Gefäßmuskelzellen.
Es wird erkannt, dass spezifische Targets, z. B. Polypeptide oder
Carbohydrate, Proteoglycane und dgl., die den Zellmembranen glatter
Gefäßmuskelzellen
zugeordnet sind, zur Auswahl (z. B. durch Klonierung) oder Konstruktion
(z. B. durch genetisches Engineering oder chemische Synthese) geeigneter spezifischer
Glatter-Gefäßmuskelzell-Bindungsproteine
nutzbar sind. Besonders nützliche "Targets" werden durch die
glatten Muskelzellen internalisiert, z. B. wenn der Membranbestandteil- Antigenturnover bei
der Erneuerung stattfindet. Die Internalisierung durch Zellen kann
auch durch Mechanismen erfolgen, die Phagolysosome, Clathrinbeschichtete
Pits, Rezeptor-vermittelte Neuverteilung oder Endocytose und dgl.
involvieren. In einer bevorzugten Ausführung wird ein solches "Target" hier exemplifiziert
durch Chondroitinsulfatproteoglacane (CSPGs), synthetisiert durch
die glatten Gefäßmuskelzellen
und Pericyten, und einen gesonderten Anteil (hierin Epitop genannt)
des CSPG-Moleküls,
wobei ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 250 kD besonders
bevorzugt ist. Dieses 250 kD Target ist ein N-verknüpftes Glycoprotein,
das eine Komponente eines größeren 400
kD Proteoglycankomplexes ist (14). In einer gegenwärtig bevorzugten
Ausführung
der Erfindung wird ein Glattes-Gefäßmuskelzell-Bindungsprotein durch einen monoklonalen
NR-AN-01 Antikörper
(eine Subkultur von NR-ML-05) bereitgestellt, der an ein Epitop
in einem Glatten-Gefäßmuskel
CSPG-Targetmolekül bindet.
Es wird berichtet, dass der NR-ML-05 genannte Antikörper an 250 kD CSPG bindet,
das durch Melanomzellen synthetisiert ist (Morgan et al., U.S. Patent
Nr. 4,897,255). Es wird auch berichtet, dass glatte Gefäßmuskelzellen
und Pericyten ein 250 kD CSPG sowie auch andere CSPGs synthetisieren
(11). NR-ML-05 Bindung an glatte Muskelzellen ist offenbart worden
(Fritzberg et al., U.S. Patent Nr. 4,879,225). Monoklonale Antikörper NR-ML-05
und Subkultur NR-ML-05 Nr. 85-41-41-A2, Frost # A2106, sind beide
bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD hinterlegt
worden und haben die Zugriffsnummern HB-5350 bzw. HB-9350 erhalten.
NR-ML-05 ist der Verwandte von Subklon NR-AN-01, hierin offenbart,
und strukturell und funktionell hierzu äquivalent. Es versteht sich,
dass NR-AN-01 nur
ein Beispiel eines Glatten-Gefäßmuskelzell-Bindungsproteins
ist, das spezifisch dem 400 kD CSPG-Target assoziiert ist, und dass
auch andere Bindungsproteine, die diesem Target und anderen Epitopen
in diesem Target assoziiert sind (14), auch in den therapeutischen
Konjugaten und Verfahren der Erfindung nutzbar sind. Im vorliegenden
Fall sind auch sechs andere murine monoklonale Antikörper und
zwei humane chimäre
monoklonale Antikörper
ausgewählt
worden, wie hierin beschrieben, die spezifisch auf 250 kD CSPG glatter
Gefäßmuskelzellen
abzielen. Die Antikörper werden
scheinbar auch durch glatte Muskelzellen nach der Bindung an die Zellmembrane
internalisiert. Immunoreaktionsstudien haben auch die Bindung des
murinen MAbs an 250 kD Antigen in 45 humanen normalen Geweben gezeigt
und 30 verschiedene Neoplasmen und einige dieser Ergebnisse sind
zuvor offenbart worden (U.S. Patent Nr. 4,879,225). In dieser Offenbarung
und anderen humanklinischen Studien wurde MAbs auf CSPG 250 kD Antigen,
lokalisiert in glatten Gefäßmuskelzellen
in vivo, gerichtet. Ferner versteht es sich, dass die Aminosäurereste,
die in der kinetischen Multipunktzuordnung der NR-AN-01 monoklonalen
Antikörper
mit einem CSPG Markerantigenepitop (d. h. Aminosäuren, die die komplementaritätsbestimmenden
Regionen darstellen) durch computergestützte molekulare Modellbildung
bestimmt werden und durch die Verwendung von Mutanten, die eine
geänderte
Antikörperbindungsaffinität haben.
Diese Bindungsortaminosäuren
und das dreidimensionale Modell des NR-AN-01 Antigenbindungsorts
dienen als molekulares Modell zur Konstruktion funktioneller Äquivalente,
z. B. kurzer Polypeptide ("minimale
Polypeptide"), die
eine Bindungsaffinität
für CSPG
haben, das durch glatte Gefäßmuskelzellen
und Pericyten synthetisiert ist.
-
In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführung zur
Behandlung von Stenose nach operativen Gefäßprozeduren, z. B. PTCA, hatten
gewählte
Bindungsproteine, z. B. Antikörper
oder Fragmente zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung, eine Bindungsaffinität von > 104 Liter/Mol
für das
glatte Gefäßmuskel
250 kD CSPG, und auch die Fähigkeit,
an glatte Muskelzellen oder Pericyten zu binden oder von diesen
aufgenommen zu werden.
-
Die dreidimensionale Modellbildung
ist auch nutzbar, um andere funktionelle Äquivalente zu konstruieren,
die die Bindung von NR-AN-01 an sein antigenes Epitop nachzuahmen,
z. B. "mimetische" chemische Verbindungen,
die die dreidimensionalen Aspekte von NR-AN-01 nachahmen, das an
sein Epitop in einem CSPG Targetantigen bindet. In der hiesigen
Anwendung bezieht sich "Minimalpolypeptid" auf eine Aminosäuresequenz
von zumindeset sechs Aminosäuren
Länge.
In der hiesigen Anwendung bezieht sich der Begriff "mimetisch" auf ein organisches
chemisches Polymer, das konstruiert ist, um den richtigen Zwischenraum
zur Bindung an die Aminosäuren
von z. B. NR-AN-01
CSPG Target zu erreichen, das durch glatte Gefäßmuskelzellen oder Pericyten
synthetisiert wird.
-
Es versteht sich, dass die Erfinder
auch den Nutzen humaner monoklonaler Antikörper oder "humanisierter" muriner Antikörper als Glattes-Gefäßmuskel-Bindungsprotein in
therapeutischen Konjugaten ihrer Erfindung berücksichtigt haben. Z. B. kann
ein muriner monoklonaler Antikörper "chimärisiert" werden, indem die Nukleotidsequenz
genetisch rekombiniert wird, welche die murine Fv-Region (die z.
B. die Antigenbindungsorte enthält)
mit einer Nukleotidsequenz, die eine humane konstante Domänenregion
und eine Fc-Region
codiert, z. B. in ähnlicher
Weise wie in der europäischen
Patentanmeldung Nr. 0,411,893 A2 offenbart. Humanisierte Glatte-Gefäßmuskel-Bindungspartner
haben, wie erkannt wird, den Vorteil, die Immunoreaktivität des Antikörpers oder
Polypeptids in dem Wirtsrezipienten zu senken, was hierdurch nützlich sein
kann, um in vivo die Halbwertszeit zu vergrößern und die Möglichkeit
schädlicher
Immunreaktionen zu senken.
-
Auch berücksichtigt als nützliche
Bindungspeptide für
Restenosebehandlungs-Dauerfreigabe-Dosierungsformen
der vorliegenden Erfindung sind jene, die am intezlellularen Stroma
oder der Matrix lokalisieren, die sich zwischen und unter den glatten
Gefäßmuskelzellen
befindet. Die Bindungspeptide liefern den therapeutischen Wirkstoff
zu dem Interstitialraum zwischen den Targetzellen. Der therapeutische
Wirkstoff wird in die Interstitialräume freigegeben, zur anschließenden Aufnahme
durch die glatten Gefäßmuskelzellen.
Bevorzugte Bindungspeptide dieses Typs sind Epitopen an Collagen,
extrazellulären
Glycoproteinen wie Tenascin, Reticulum und elastische Fasern, Cytokeratin
und anderen intrazellulären
Matrixkomponenten zugeordnet. Minimalpeptide, mimetische organische
chemische Verbindungen, humane oder humanisierte monoklonale Antikörper und
dgl., die am intrazellularen Stroma und der Matrix lokalisieren,
sind auch als Bindungspeptide in dieser Ausführung der vorliegenden Erfindung
nutzbar. Diese Bindungspeptide können
gemäß bekannten Techniken
identifiziert und konstruiert oder isoliert werden. In bevorzugten
Ausführungen
der vorliegenden Erfindung bindet das interstitielle Matrixbindungsprotein
an ein Targetepitop mit einer Assoziationskonstante von zumindest
10–4 M.
-
Andere bevorzugte Bindungsproteine
oder -peptide, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung nutzbar
sind, enthalten Komponenten, die in der Lage sind, pathologisch
proliferierende normale Gewebe zu lokalisieren, wie etwa Pericyten
der intraokularen Gefäße, die
in regenerativer Augenerkrankung impliziert sind. Der therapeutische
Wirkstoff wird in Targetzellen zur Internalisierung davon durch
diese Dauerfreigabe-Dosierungsformen verabreicht. Minimalpeptide,
mimetische organische Verbindungen und humane oder humanisierte
Antikörper,
die an die erforderlichen pathologisch proliferierenden normalen
Zelltypen lokalisieren, sind auch als Bindungspeptide der vorliegenden
Erfindung nutzbar. Diese Bindungspeptide können gemäß bekannten Techniken identifiziert
und konstruiert oder isoliert werden. Bevorzugte Bindungspeptide
dieser Ausführungen
der vorliegenden Erfindung binden an ein Targetepitop mit einer
Assoziationskonstante von zumindest etwa 10–6 M.
-
Repräsentative "Kopplungs"-Methoden zum Vernetzen des therapeutischen
Wirkstoffs durch kovalente oder nicht kovalente Bindungen mit dem
Glatten-Gefäßmuskel-Bindungsprotein
enthalten chemische Quervernetzer und heterobifunktionelle Quernetzungsverbindungen
(d. h. "Linker"), die reagieren,
um eine Bindung zwischen reaktiven Gruppen (wie etwa Hydroxyl-,
Amino-, Amido- oder Suulfhydrylgruppen) in einem therapeutischen
Wirkstoff und anderen reaktiven Gruppen (ähnlicher Natur) in dem Glatten-Gefäßmuskel-Bindungsprotein zu
bilden. Diese Bindung kann z. B. eine Peptidbindung, eine Disulfidbindung,
eine Thioesterbindung, eine Amidbindung, eine Thioetherbindung und
dgl. sein. In einem illustrativen Beispiel sind Konjugate monoklonaler
Antikörper
mit Medikamenten von Morgan und Foon zusammengefasst worden (Monoclonal
Antibody Therapy to Cancer: Preclinical Models and Investigations,
Basic and Clinical Tumor Immunology, Vol. 2, Kluwer Academic Publishers,
Hingham, MA) und von Uhr J. of Immunol. 133: i–vii, 1984). In einem anderen illustrativen
Beispiel, wo das Konjugat einen radionukleiden cytostatischen Wirkstoff
enthält,
U.S. Patent Nr. 4,897,255, Fritzberg et al., das hierin unter Bezug
aufgenommen wird, enthält
Hinweise zu Kupplungsmethoden, die nutzbar sein können. In
einer gegenwärtig
bevorzugten Ausführung
enthält
das therapeutische Konjugat ein Glattes-Gefäßmuskel-Bindungsprotein, das
kovalent mit einem Trichothecen-Medikament
gekoppelt ist. In diesem Fall kann die kovalente Bindung der Kopplung
zwischen einer oder mehreren Amino-, Sulfhydryl- oder Carboxylgruppen
des Glatten-Gefäßmuskel-Bindungsproteins
gebildet werden und a) dem Trichothecen selbst; b) einer Trichothecen-Hemisuccinatcarboxylsäure; c)
einem Trichothecen-Hemisuccinat (HS) N-hydroxysuccinimidatester; oder d) Trichothecenkomplexen
mit Poly-L-Iysin oder irgend einem polymerischen Träger. Repräsentative
Beispiele von Kupplungsmethoden zur Herstellung therapeutischer
Konjugate, welche einen therapeutischen Trichothecenwirkstoff enthalten,
sind in den U.S. Patenten Nr. 4,906,452 und 4,744,981 beschrieben.
Andere Beispiele, die ein Hydrazid zur Bildung einer Schiffschen
Basenkopplung zwischen Bindungsproteinen und Trichothecenen verwenden,
sind in der anhängigen
U.S. Patentanmeldung Nr. 07/415,154 offenbart.
-
Die Auswahl der Kupplungsmethode
wird durch die Auswahl des Glatten-Gefäßmuskel-Bindungsproteins
oder -Peptids, des Interstitialmatrix-Bindungsproteins oder -peptids und des
therapeutischen Wirkstoffs beeinflusst, und auch durch physikalische
Eigenschaften, wie etwa z. B. der Lagerstabilität und/oder biologische Eigenschaften,
wie etwa z. B. Halbwertszeit in Zellen und Blut, interzellulärer Kompartimentalisierungsweg
und dgl. z. B. haben in einem gegenwärtig bevorzugten therapeutischen
Konjugat, Hemisuccinatkonjugate des therapeutischen Roridin A-Wirkstoffs
eine längere
Serumhalbwertszeit als jene von Verrucarin A, und diese erhöhte Stabilität führt zu einer
signifikant erhöhten
biologischen Aktivität.
-
Die Dauerfreigabe-Ausführung der
vorliegenden Erfindung enthält
einen therapeutischen Wirkstoff, der in einer biologisch nicht abbaubaren
oder biologisch abbaubaren polymerischen Struktur dispergiert ist. Diese
Dispersion wird durchgeführt
gemäß dem Verfahren,
das beschrieben ist durch Cowsar et al., "Poly(Lactide-Co-Glycolide) Mirocapsules
for Controlled Release of Steroids", Methods Enzymology, 112: 101–116, 1985;
Eldridge et al., "Biodegradable
and Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as
an Adjuvant for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid Which Enhances
the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies", Infection and Immunity, 59: 2978–2986, 1991;
Cohen et al., "Controlled
Delivery Systems for Proteins Based on Poly(Lactic/Glycolic Acid)
Microspheres", Pharmaceutical
Research, 8(6): 7113–720,
1991; und Sanders et al., "Controlled
Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from
Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide)
Microspheres", J.
Pharmaceutical Science, 73(9): 1294–1297, 1984.
-
Der physikalische und chemische Charakter
der Dauerfreigabe-Dosierungsform
der vorliegenden Erfindung ist verschiedenen alternativen Anbringungsarten
an Bindungsproteinen oder -peptiden zugänglich. Dosierungsformen (vom
Dauerfreigabetyp) der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, an
Proteine/Peptide z. B. durch kovalente Bindung, intermediäre Ligandensandwich-Anlagerung
oder nicht kovalente Adsorption oder teilweisen Einschluss zu binden.
Wenn die bevorzugten Polymichsäure/glycolsäurepartikulate
mit dem darin dispergierten therapeutischen Wirkstoff gebildet werden,
ist das ungeladene Polymer-Rückgrat sowohl einwärts orientiert
(mit dem darin enthaltenen quasilipophilen therapeutischen Wirkstoff)
als auch auswärts entlang
einem Großteil
der terminalen Carboxygruppen. Diese Oberflächencarboxygruppen können als
kovalente Bindungsstellen (wenn z. B. durch ein Carbodiimid aktiviert)
für nukleophile
Gruppen des Bindungsproteins/peptids dienen. Solche nukleophilen
Gruppen enthalten Lysin-epsilon-aminogruppen (Amidbindung), Serinhydroxylgruppen
(Esterbindung) oder Cysteinmercaptangruppen (Thioesterbindung).
Reaktionen mit bestimmten Gruppen sind vom pH und dem Reduktionszustand
der Reaktionsbedingungen abhängig.
-
Z. B. werden Polymichsäure/glycolsäurepartikulate,
die terminale Carboxylsäuregruppen
aufweisen, mit N-Hydroxybenztriazol in der Gegenwart von wasserlöslichem
Carbodiimid der Formel R-N=C=N-R' reagiert (worin
R eine 3-Dimethylaminopropylgruppe oder dgl. ist und R' eine Ethylgruppe
oder dgl. ist). Die Benztriazol-derivatisierten Partikulate (d.
h. aktivierte Imidattragende Gruppen) werden dann mit einer nukleophilen Protein/Peptidgruppe
reagiert, wie etwa einer verfügbaren
Epsilon-Aminokomponente. Alternativ sind p-Nitrophenol, Tetrafluorphenol,
N-Hydroxysuccinimid oder ähnliche
Moleküle
nützlich,
um einen aktiven Ester mit den terminalen Carboxygruppen der Polymichsäure/glycolsäurepartikulate
in der Gegenwart von Carbodiimid zu bilden. Andere nukleophile Bindungsprotein/peptidgruppen
enthalten Hydroxylgruppen von Serin, endogene freie Thiole von Cystein,
Thiolgruppen, resultierend aus der Reduktion von Bindungsprotein/peptiddisulfidbrücken unter
Verwendung reduzierender Mittel, die allgemein zu diesem Zweck angewendet
werden (z. B. Cystein, Dithiotreitol, Mercaptoethanol und dgl.)
und dgl. Zusätzlich
sind die terminalen Carboxygruppen der Polymilchsäure/glycolsäurepartikulate
durch Reaktion mit Thionylchlorid aktivierbar, um eine Acrylchlorid-derivatisierte
Gruppe zu bilden. Die derivatisierten Partikulate werden dann mit
nukleophilen Bindungspeptid/proteingruppen reagiert, um targetisierte
Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung zu bilden.
-
Das Zuführen von Dauerfreigabe-Dosierungsform-Bindungsprotein
oder -peptidkonjugation kann die Bindungsprotein/peptidtargetzellen-Erkennung
unterbrechen. Ligandensandwichanlagerungstechniken sind nützliche
Alternativen, um eine Dauerfreigabe-Dosierungsform-Bindungsprotein/peptid-Halterung zu erreichen.
Diese Techniken beinhalten die Formung einer primären Peptid-
oder Proteinhülle
unter Verwendung eines Proteins, das an die Targetzellpopulation
nicht bindet. Das Bindungsprotein/peptid wird dann an die primäre Peptid-
oder Proteinhülle
gebunden, um für
das resultierende Partikulat mit funktionellem Bindungsprotein/peptid
vorzusehen. Ein beispielhafter Ligandensandwichansatz beinhaltet
das kovalente Binden von Avidin oder Streptavidin an die Partikulate
durch funktionelle Gruppen, wie sie oben in Bezug auf den "direkten" Bindungsansatz beschrieben
sind. Das Bindungsprotein oder Peptid wird derivatisiert, bevorzugt
minimal, mit funktionalisiertem Biotin (z. B. durch aktiven Ester,
Hydrazid, Iodoacetal, Maleimidyl oder ähnlich funktionelle Gruppen).
Liganden (d. h. Bindungspeptid oder -protein-funktionalisiertes
Biotin)-Bindung an den verfügbaren Biotinbindungsstellen
der primären
Avidin/Streptavidin-Proteinhülle
erfolgt durch die Anwendung einer gesättigten Menge von biotinyliertem
Protein/Peptid.
-
Z. B. werden Polymilchsäure/glycolsäurepartikulate,
die terminale Carboxylsäuregruppen
aufweisen, mit Carbodiimid aktiviert und anschließend mit
Avidin oder Streptavidin reagiert. Das Bindungsprotein oder -peptid
wird mit Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester bei einem 1–3 molaren
Zusatz einer biotinhaltigen Verbindung zu dem Bindungsprotein/peptid
reagiert, um ein biotinyliertes Bindungsprotein/peptid zu bilden.
Ein molarer Überschuss
des biotinylierten Bindungsprotein/peptids wird mit den Avidin-derivatisierten Partikulaten
inkubiert, um eine targetisierte Dosierungsform der vorliegenden
Erfindung zu bilden.
-
Alternativ werden die partikulären Carboxygruppen
biotinyliert (z. B. durch Carbodiimidaktivierung der Carboxygruppe
und anschließende
Reaktion mit Aminoalkylbiotinamid). Die biotinylierten Partikulate
werden dann mit einer Sättigungskonzentration
(d. h. molarem Überschuss)
von Avidin oder Streptavidin inkubiert, um proteinbeschichtete Partikulate
zu bilden, die freie Biotinbindungsstellen aufweisen. Diese beschichteten
Partikel sind dann zu einer Reaktion mit einem molaren Überschuss
eines biotinylierten Bindungsproteins in der Lage, das wie oben
beschrieben gebildet ist. Eine andere Option beinhaltet ein Avidin-
oder Streptavidin-gebundenes Bindungsprotein oder eine Proteinbindung
mit biotinylierten Partikulaten.
-
Zusätzlich kann die Bindungsprotein/peptid-Partikulatanbringung
durch Adsorption des Bindungspeptids an dem Partikulat erfolgen,
was sich aus dem nicht-ionischen Charakter des teilweise freiliegenden
Polymerrückgrats
des Partikulats ergibt. Unter Bedingungen hoher Ionenstärke (z.
B. 1,0 molares NaCl) sind Wasserstoff und hydrophobe partikulatbindende
Protein/Peptidbindung bevorzugt.
-
Darüber hinaus kann das Bindungsprotein/peptid
teilweise in der Partikulatpolymermatrix bei deren Bildung eingeschlossen
werden. Unter diesen Umständen
sorgt das so eingeschlossene Bindungsprotein/peptid für den selektiven
Restbindungscharakter an dem Partikulat. Milde Partikulatbildungsbedingungen, wie
etwa jene, die von Cohen et al., Pharmacuetical Research, 8: 713–720 (1991)
angewendet werden, sind für
diese Ausführung
der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Dieses eingeschlossene Bindungsprotein
ist auch in der Targetzellwiederanlagerung eines teilweise abgebauten
Partikulats nutzbar, das einer Exocytose unterzogen wurde. Andere
polymere Partikulatdosierungsformen (z. B. nicht biologisch abbaubare
Dosierungsformen), die unterschiedliche freiliegende funktionelle
Gruppen aufweisen, können
an Bindungsproteine oder -peptide gemäß den oben diskutierten Prinzipien
gebunden werden.
-
Beispielhafte nicht biologisch abbaubare
Polymere, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung nutzbar sind,
sind Polystyrole, Polypropylene, Styrolacrylcopolymere und dgl.
Solche nicht biologisch abbaubaren Polymere beinhalten, oder können derivatisiert
werden, um funktionelle Gruppen zum Anbringen von Bindungsprotein/peptid
einzubauen, einschließlich
Carboxylsäuregruppen,
aliphatische primäre
Aminogruppen, aromatische Aminogruppen und Hydroxylgruppen.
-
Funktionelle Carboxylsäuregruppen
werden mit dem Bindungsprotein oder -peptid z. B. unter Verwendung
der Reaktionsmechanismen gekoppelt, wie sie oben für Polymilchsäure/glycolsäure biologisch
abbaubare Polymere partikuläre
Dosierungsformen angegeben sind. Primäre aminofunktionelle Gruppen
werden z. B. durch Reaktion derselben mit Succinanhydrid gekoppelt,
um eine terminate Carboxygruppe zu bilden, die an Bindungspeptid/protein
gebunden werden kann, wie oben beschrieben. Zusätzlich können primäre Aminogruppen mit Cyanogenbromid
aktiviert werden und bilden Guanidinkopplungen mit primären Aminogruppen des
Bindungsproteins/peptids. Aromatische funktionelle Aminogruppen
werden z. B. mit salpetriger Säure
diazotisiert, um Diazoniumkomponenten zu bilden, die mit Bindungsprotein/peptidtyrosinen
reagieren, um hierdurch eine Diazobindung zwischen dem nicht biologisch
abbaubaren Partikulat und dem Bindungsprotein/peptid herzustellen.
Funktionelle Hydroxylgruppen werden mit den primären Aminogruppen des Bindungsproteins/peptids
z. B. dadurch gekoppelt, dass die Hydroxylkomponente in eine terminale
funktionelle Carboxylsäuregruppe
umgewandelt wird. Eine solche Umwandlung kann z. B. durch Reaktion
mit Chloressigsäure
erreicht werden, gefolgt durch Reaktion mit Carbodiimid. Sandwich-,
Adsorptions- und Einschlusstechniken, wie sie oben in Bezug auf
biologisch abbaubare Partikulate diskutiert sind, sind analog auf
nicht biologisch abbaubare Partikulat-Bindungsprotein/peptidfixierung
anwendbar.
-
In einer bevorzugten Ausführung ist
das Targeting für
potenziell proliferierende Zellen spezifisch, die in vergrößertem glatten
Muskel in der Intimaregion einer verletzten Gefäßstelle resultieren, z. B.
infolge von Angioplastik, z. B. Pericyten und glatte Gefäßmuskelzellen.
Aspekte der Erfindung beziehen sich auf therapeutische Modalitäten, in
denen das therapeutische Konjugat der Erfindung verwendet wird,
um Glatte-Muskelzellproliferation nach Angioplastik, z. B. PTCA,
Atherektomie und perkutaner transluminaler Coronarrotationatheroblation
zu verzögern,
zu reduzieren oder zu beseitigen.
-
Dauerfreigabe-Dosierungsformen einer
Ausführung
der Erfindung brauchen gegebenenfalls nur in einer antiproliferativen
therapeutischen Dosierung verabreicht werden, die ausreicht, um
die proximalen (6 bis 9) Zellschichten der glatten Tunica media
Muskelzellen, die das Lumen auskleiden, der Dosierungsform auszusetzen.
Die Dosierung ist empirisch bestimmbar, z. B. durch a) Infundieren
von Gefäßen aus
geeigneten Tiermodellsystemen unter Verwendung immunohistochemischer
fluoreszenter oder elektronenmikroskopischer Methoden zum Erfassen
der Dosierungsform und von deren Wirkungen; und b) Durchführen geeigneter in
vitro Studien.
-
In einem repräsentativen Beispiel wird diese
therapeutisch wirksame Dosis erreicht, indem in einer Glatten-Muskelzellgewebekultur
die perizelluluäre
Wirkstoffdosis bestimmt wird, was bei kontinuierlicher Exposition
zu einem therapeutischen Effekt zwischen den toxischen und minimal
wirksamen Dosierungen führt. Dieser
therapeutische Pegel wird in vivo erhalten, indem die Größe, Anzahl
und die therapeutische Wirkstoffkonzentrations- und -freigaberate
bestimmt wird, die für
Partikel erforderlich ist, die zwischen die glatten Muskelzellen
der Arterienwand infundiert wird, um diese perizelluluäre therapeutische
Dosis beizubehalten. Die Dosierungsform sollte den therapeutischen
Wirkstoff mit einer Rate freigeben, die der perizelluluären Dosis
der folgenden beispielhaften therapeutischen Wirkstoffe angenähert ist:
von etwa 0,01 bis etwa 100 Mikrogramm/ml Nitroglycerin, von etwa
1,0 bis etwa 1000 Mikrogramm/ml Suramin, von etwa 0,001 bis etwa
100 Mikrogramn/ml für
Cytochalasin, und von etwa 0,1 bis etwa 105 Nanogramm/ml
Staurosporin.
-
Es versteht sich für den Fachmann,
dass die gewünschten
therapeutisch wirksamen Dosierungen der Dauerfreigabe-Dosierungsform
der Erfindung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, einschließlich z.
B.: a) der Bindungsaffinität
des Bindungsproteins, das der Dosierungsform zugeordnet ist; b)
dem Atmosphärendruck
und der Dauer der Infusion; c) der Zeit, über die die verabreichte Dosierungsform
an dem Zielort verbleibt; d) der Rate der therapeutischen Wirkstofffreigabe
von der Partikeldosierungsform; e) der Natur des angewendeten therapeutischen
Wirkstoffs; f) der Natur der Verletzung und/oder der gewünschten
Therapie; und/oder g) der interzellulären und/oder intrazellulären Lokalisierung
der Partikeldosierungsform. Erfahrene Praktiker, die zur Verabreichung
von Medikamenten mit therapeutisch wirksamen Dosierungen geübt sind
(z. B. durch Überwachung
der therapeutischen Wirkstoffpegel und Beobachten der klinischen
Effekte in Patienten) sind in der Lage, die optimale Dosierung für einen
einzelnen Patienten auf der Basis der Erfahrung und professionellen
Bewertung zu bestimmen.
-
Es versteht sich auch, dass die Auswahl
eines therapeutischen Wirkstoffs, der seine Wirkungen intrazellulär ausübt, z. B.
auf Ribosomen oder DNA-Metabolismus,
die Dosierung und die Zeit beeinflusst, die erforderlich ist, eine
therapeutisch wirksame Dosis zu erreichen, und dass dieser Prozess
in vitro und in Tierstudien als Modell aufgestellt werden kann,
wie etwa jene, die in den unten angegebenen Beispielen beschrieben sind,
um den Konzentrationsbereich herauszufinden, über den die therapeutische
Konjugatoder Dosierungsform verabreicht werden sollte, um ihre Wirkungen
zu erreichen, eine Restenose infolge von Angioplastik zu verzögern, zu
reduzieren oder zu verhindern. Z. B. sind therapeutische Konjugate,
die mit alpha-, beta- oder gamme-Emitter bekannter spezifischer
Aktivitäten
radiomarkiert sind (z. B. Millicurie pro Millimol oder Milligramm
Protein) nutzbar sind, um die therapeutisch wirksame Dosierung zu
bestimmen, indem diese in Tierstudien und im Menschenversuch angewendet
werden, mit quantitativer Bildgebung oder Autoradiographie histologischer
Gewebeschnitte, um die Konzentration des therapeutischen Konjugats
zu bestimmen, die für das
therapeutische Protokoll erforderlich ist. Eine therapeutisch wirksame
Dosis der therapeutischen Konjugat- oder Dosierungsform wird erreicht,
wenn zumindest drei Bedingungen erfüllt sind: nämlich (1) die therapeutische
Konjugat- oder Dosierungsform wird in den intimalen Schichten des
traumatisch verletzten Gefäßes verteilt;
(2) die therapeutische Konjugat- oder Dosierungsform wird innerhalb
des gewünschten
intrazellulären Kompartments
der glatten Muskelzellen verteilt; d. h. im Kompartment, der zur
Wirkung der therapeutischen Wirkstoffs erforderlich ist, oder der
therapeutische Wirkstoff, der extrazellulär von der Dosierungsform freigegeben
wird, wird innerhalb des relevanten intrazellulären Kompartments verteilt;
und (3) der therapeutische Wirkstoff hemmt die gewünschte zelluläre Aktivität der glatten
Gefäßmuskelzelle,
z. B. Proliferation, Migration, vergrößertes Zellvolumen, Matrixsynthese,
Zellkonzentration und dgl., wie oben beschrieben.
-
Optional kann ein zweites irrelevantes
Glattes-Gefäßmuskelzell-Bindungsprotein einem
Patienten verabreicht werden, bevor ihm eine therapeutische Konjugat-
oder Dosierungsform verabreicht wird, um die nicht spezifische Bindung
der therapeutischen Konjugat- oder Dosierungsform an Gewebe zu reduzieren.
In einer bevorzugten Ausführung
kann das irrelevante Bindungsprotein ein Antikörper sein, der nicht an Stellen
in dem Patienten durch antigenspezifische Bindung bindet, sondern
statt dessen in nicht spezifischer Weise bindet, z. B. durch Fc-Rezeptor-bindende
reticuloendotheliale Zellen, Asialorezeptorbindung und durch Bindung
an Ubiquitin-exprimierenden Zellen. Der irrelevante "Blocker" vermindert die nicht
spezifische Bindung der therapeutischen Konjugat- oder Dosierungsform
und reduziert somit Nebenwirkungen, z. B. Gewebetoxizität, die der Verwendung
der therapeutischen Konjugat- oder Dosierungsform zugeordnet sind.
Der irrelevante "Blocker" wird vorteilhaft
von 5 Minuten bis 48 Stunden, am meisten bevorzugt von 15 Minuten
bis eine Stunde, verabreicht, bevor die therapeutische Konjugat-
oder Dosierungsform verabreicht wird, obwohl die Zeitdauer in Abhängigkeit
von dem therapeutischen Konjugat und dem Weg oder der Methode der
Injektion variieren kann. Repräsentative
Beispiele irrelevanter "Blocker" enthalten Antikörper, die
mit Humangewebe und Rezeptoren nicht reaktiv sind, oder zelluläre und Serumproteine,
die aus tierischen Quellen hergestellt sind, sodass bei Tests herausgefunden
wird, dass sie nicht in spezifischer Weise (z. B. mit Ka < 103 M–1)
an Humanzellmembrantargets binden.
-
Es versteht sich, dass die Konjugate
und Dosierungsformen der Erfindung nicht auf die Verwendung zur
Therapie infolge von Angioplastik beschränkt sind; statt dessen wird
die Nützlichkeit
der therapeutischen Konjugate und Dosierungsformen durch ihre Fähigkeit
vorgeschrieben, zelluläre
Aktivitäten
glatter Muskelzellen und Pericyten in der Gefäßwand zu hemmen. Somit enthalten
andere Aspekte der Erfindung therapeutische Konjugate und Dosierungsformen
und Protokolle, die in einer frühzeitigen
therapeutischen Intervention nutzbar sind, um atherosklerotische
Plaques und Bereiche von Gefäßwandhypertrophie
und/oder -hyperplasie zu reduzieren, zu verzögern oder zu beseitigen (und
sogar umzukehren). Therapeutische Konjugate und Dosierungsformen
der Erfindung finden auch ihren Nutzen bei der frühzeitigen Intervention
in präatherosklerotischen
Zuständen,
wobei sie z. B. in Patienten nutzbar sind, die ein hohes Risiko
der Entwicklung von Atherosklerose und/oder Vorzeichen von Hypertension
haben, resultierend von atherosklerotischen Veränderungen in Gefäßen oder
Gefäßstenose
aufgrund einer Hypertrophie der Gefäßwand.
-
Z. B. können in einer anderen Ausführung der
Erfindung die therapeutischen Konjugate und Dosierungsformen in
Situationen eingesetzt werden, in denen Angioplastik nicht ausreicht,
um eine blockierte Arterie zu öffnen,
wie etwa in solchen Situationen, die das Einsetzen eines intravaskuluären Stents
erfordern. In dieser Ausführung
der Erfindung wird ein metallischer, Kunststoff oder biologisch
abbaubarer intravaskulärer
Stent angewendet, der einen therapeutischen Wirkstoff aufweist.
Nützliche
therapeutische Wirkstoffe enthalten cytoskelettale Inhibitoren und
Inhibitoren Glatter-Muskelzellproliferation.
Ein bevorzugter Cytoskelettinhibiotor ist ein Cytochalasin, wie
etwa Cytochalasin B oder ein Analog davon, das ein funktionelles Äquivalent
ist. Ein anderer bevorzugter Cytoskelettinhibitor der Erfindung
ist Taxol oder ein Taxolanalog, das ein funktionelles Äquivalent
ist.
-
Der Stent umfasst bevorzugt eine
biologisch abbaubare Beschichtung oder eine poröse oder permeable nicht biologisch
abbaubare Beschichtung, die den therapeutischen Wirkstoff aufweist.
Eine bevorzugtere Ausführung
der Erfindung ist ein beschichteter Stent, worin die Beschichtung
eine Dauerfreigabe-Dosierungsform des therapeutischen Wirkstoffs
aufweist. In einer alternativen Ausführung kann der biologisch abbaubbare
Stent auch mit dem therapeutischen Wirkstoff imprägniert sein,
d. h. in der Stentmatrix.
-
Ein biologisch abbaubarer Stent mit
dem darin imprägnierten
therapeutischen Wirkstoff, der weiter mit einer biologisch abbaubaren
Beschichtung oder mit einer porösen
oder nicht biologisch abbaubaren Beschichtung beschichtet ist, die
die Dauerfreigabe-Dosierungsform des therapeutischen Wirkstoffs
dispergiert aufweist, ist auch eine Ausführung der Erfindung. Dieser
Stent kann eine unterschiedliche Freigaberate des therapeutischen
Wirkstoffs vorsehen, d. h. es kann eine schnellere Freigabe des
therapeutischen Wirkstoffs von der Beschichtung vorliegen, gefolgt
durch eine verzögerte
Freigabe des therapeutischen Wirkstoffs, der in die Stentmatrix
imprägniert
ist, bei der Zersetzung der Stentmatrix. Bevorzugt ist in dieser
Ausführung
der Erfindung der therapeutische Wirkstoff in der Beschichtung ein
Cytochalasin oder Taxol und ist am meisten bevorzugt Cytochalasin
B oder Taxol oder Analoge davon, die funktionell äquivalent
sind. Der intravaskuläre
Stent sieht somit ein mechanisches Mittel vor, eine vergrößerte Lumenfläche eines
Gefäßes vorzusehen,
zusätzlich zu
dem, das über
die biologische Stentwirkung des cytoskelettalen Inhibitors vorgesehen
wird, wie etwa Cytochalasin B oder Taxol, das darin lösbar eingebettet
ist.
-
Ferner kann die Platzierung intravaskulärer Stents,
die einen therapeutischen Wirkstoff aufweisen, der ein Inhibitor
Glatter-Muskelzellproliferation ist, eine erhöhte Effizienz vorsehen, indem
die Intimaproliferation reduziert oder verhindert wird. Daher ist
auch ein Stent, der ferner ein Cytochalasin aufweist, um die Proliferation
und Migration von Pericyten zu hemmen, die sich in glatten Muskelzellen
umwandeln und zur Intimaverdickung beitragen können, auch eine Ausführung der
Erfindung. Diese Hemmung der glatten Intima-Muskelzellen und des Stroma, das durch
den glatten Muskel und die Pericyten erzeugt wird, kann eine schnellere
und eine vollständigere
Reendothelisierung nach der intraventionellen Platzierung des Gefäßstents
erlauben. Die vergrößerte Reendothelisierungs-
und Stabilisierungsrate der Gefäßwand nach
der Stentplatzierung kann daher den Verlust der Lumenfläche und
den verringerten Blutfluss reduzieren, der die primäre Ursache
von Gefäßstentausfällen ist.
-
Bevorzugt haben, in der Praxis der
Ausführung
dieser Erfindung, die biologisch abbaubaren Mikropartikel, die den
therapeutischen Wirkstoff enthalten, von etwa 1 bis 50 Mikron. Es
ist weiter bevorzugt, dass die Mikropartikel über eine Dauer von 30 bis 120
Tagen biologisch abbaubar sind, bei Freigabe in die Tunica media und
Intima einer Dauerzellkonzentration angenähert von etwa 0,05 μg/ml bis
etwa 0,25 μg/ml
Cytochalasin B in das Cytosol, um hierdurch die Diffusion therapeutischer
Pegel von Cytochalasin B vorzusehen, ohne Toxizität für Zellen
benachbart der Stent/Gefäßwandgrenze.
-
Es ist für den normalen Fachmann bekannt,
dass periphere Gefäße, die
für Gefäßimplantate
in anderen peripheren Stellen oder in Coronararterien-Bypassimplantaten
verwendet werden, häufig
aufgrund postchirurgischer Stenose ausfallen. Da eine Cytochalasin
B-Infusion die Gefäßlumenfläche in operativ
verletzten Gefäßen aufgrund
ihrer biologischen Stentaktivität
beibehält,
wird deren Verabreichung in diesem Prozess die Kontraktionsfähigkeit
des Gefäßes verzögern, was
zu einer größeren Lumenfläche führt. Ferner
ist es ein Vorteil dieser Ausführung
der vorliegenden Erfindung, dass das Verabreichen von Cytochalasin
B auf diese Weise die Konstruktion oder einen Spasmus verhindert,
der häufig
auftritt, nachdem Gefäßimplantate
an ihren beiden proximalen und distalen Stellen anastomisiert sind,
was zu einer beeinträchtigten
Funktion, wenn nicht dem totalen Ausfall, der Gefäßimplantate
führen
kann. Somit sollte die durch Cytochalasin B erzeugte Gefäßverstentung
das Auftreten von Spasmen senken, die von einigen wenigen Tagen
bis einigen Monaten nach der Implantierung auftreten können.
-
Die vorliegende Erfindung sieht auch
eine kombinationstherapeutische Methode vor, die ein cytocidales
therapeutisches Konjugat und einen cytostatischen therapeutischen
Wirkstoff involviert. Das cytocidale Konjugat enthält einen
Bindungspartner (wie etwa ein Protein oder ein Peptid), das in der
Lage ist, spezifisch an glatte Gefäßmuskelzellen zu lokalisieren,
sowie einen aktiven Wirkstoff, der in der Lage ist, diese Zellen abzutöten. Das
cytocidale Konjugat wird, bevorzugt intravenös oder durch irgend einen anderen
passenden Weg dafür,
verabreicht, lokalisiert an die glatten Target-Muskelzellen und zerstört proliferierende
Zellen, die in stenotischen oder restenotischen Ereignissen involviert
sind. Diese zelluläre
Zerstörung
verursacht die Freigabe von mitogenen und anderen metabolischen
Ereignissen, wobei diese Ereignisse allgemein wiederum zur Glatten-Gefäßmuskelzell-Proliferation
führen.
Die antiproliferativen oder antikontraktilen Dauerfreigabe-Dosierungsformen
der vorliegenden Erfindung werden als Nächstes verabreicht, bevorzugt
durch einen Infusionskatheter oder irgend eine passende Dosierungsform
dafür.
Die Dauerfreigabe-Dosierungsform
verzögert
die Glatte-Gefäßmuskelzell-Proliferation
und/oder Migration und Kontraktion, um hierdurch den Lumendurchmesser
beizubehalten. Diese Behandlungsmethode stellt eine biologische
Arteromyectomie dar, die in stenotischen Gefäßen nutzbar sind, resultierend
von Glatter-Gefäßmuskelzell-Hyperplasie
und dgl.
-
Ein noch anderer Aspekt der vorliegenden
Erfindung bezieht sich auf therapeutische Modalitäten zum Beibehalten
eines erweiterten luminalen Volumens nach Angioplastik oder anderer
Gefäßverletzungen.
Eine Ausführung
dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung involviert die Verabreichung
eines therapeutischen Wirkstoffs, der in der Lage ist, die Konzentrationsfähigkeit
glatter Gefäßmuskelzellen
zu hemmen. Beispielhafte Wirkstoffe, die in der Praxis dieses Aspekts
der vorliegenden Erfindung nutzbar sind, sind jene, die in der Lage
sind, zu bewirken, dass eine traumatisierte Arterie ihren Gefäßtonus verliert,
sodass der normale vaskuläre
hydrostatische Druck (d. h. Blutdruck), das schlaffe Gefäß bis oder
nahe seinem maximalen physiologischen Durchmesser erweitert. Der
Verlust des Gefäßtonus kann
durch Wirkstoffe hervorgerufen werden, die sich mit der Bildung
oder Funktion kontraktiler Proteine stören (z. B. Actin, Myosin, Tropomyosin,
Caldesmon, Calponin oder dgl.). Diese Störung kann direkt oder indirekt
auftreten, durch z. B. Hemmung der Calciummodulation, Phosphorylierung
oder anderer metabolischer Wege, die in der Kontraktion glatter
Gefäßmuskelzellen
impliziert sind.
-
Die Hemmung der zellulären Kontraktion
(d. h. Verlust des Gefäßtonus)
kann durch zwei Mechanismen wirken, um den Grad der vaskulären Stenose
zu reduzieren. Erstens begrenzt die Hemmung der zellulären Kontraktion über eine
verlängerte
Zeitdauer die Anzahl glatter Muskelzellen, die von der Tunica media
in die Intima wandern, deren Verdickung in luminaler Gefäßstenose
resultiert. Zweitens bewirkt die Hemmung der zellulären Kontraktion,
dass sich die glatte Muskelzellwand unter dem normalen hydrostatischen
Gefäßdruck (d.
h. Blutdruck) entspannt und erweitert. Therapeutische Wirkstoffe,
wie etwa Cytochalasine, hemmen die glatte Muskelzellkontraktion,
ohne die Proteinsynthese aufzuheben, die für traumatisierte, postangioplastische oder
andere operativ oder erkrankungsbedingt beschädigte glatte Muskelzellen erforderlich
sind, um sich selbst zu reparieren. Die Proteinsynthese ist für die glatten
Muskelzellen auch notwendig, um die Matrix abzusondern, die das
Lumen in einem Zustand nahe seinem maximalen systolischen Durchmesser
fixiert oder zurückhält, wenn
sich die Gefäßläsion stabilisiert
(d. h. ein biologisch induzierter Stenteffekt).
-
Dieser biologische Stenteffekt resultiert
nicht nur in einem erweiterten Gefäßlumenquerschnitt und einer
erhöhten
Blutflussrate durch das Gefäß, sondern
reduziert auch signifikant das elastische Rückfedern infolge von Angioplastik.
Das elastische Rückfedern
ist ein akuter Verschluss des Gefäßes, der einem Vasospasmus
oder einer frühen
Relaxation der Muskelwand zugeordnet ist, aufgrund eines traumatischen
Schocks, der vom Überstrecken
des Gefäßes durch
einen Ballonkatheter während
der Angioplastik resultiert. Dieser Spasmus der Tunica media, der
zur Verringerung des Lumenquerschnitts führt, kann innerhalb Stunden,
Tagen oder Wochen nach der Ballondilatation auftreten, wenn die
Wiederherstellung des Gefäßmuskelwandtonus
stattfindet. Jüngste
Beobachtungen während
mikroskopischer Überprüfung von
Atherectomie-Proben schlagen vor, dass das elastische Rückfedern
in bis zu 25% der angioplastischen Prozeduren auftreten kann, die,
auf der Basis des initialen Post-Behandlungs-Angiogramms als erfolgreich klassifiziert
wurden. Weil die biologische Stentprozedur die Arterienwand nach
der Ballonangioplastik entspannt, kann der Kliniker ein zu starkes
Aufpumpen und seinen resultierenden traumatischen Schock als Mittel
eliminieren, um den Gefäßspasmus
oder das elastische Rückfedern
zu verringern oder zu verzögern.
Das Reduzieren oder Eliminieren des zu starken Aufpumpens senkt
die Verletzung der Muskelwand des Gefäßes, um hierdurch die Determinanten
der Glatten- Muskelzellproliferation
in der Intima zu reduzieren und dadurch das Auftreten oder die Ernsthaftigkeit
der Restenose zu reduzieren.
-
Das biologische Stent senkt auch
das Auftreten von Thrombusbildung. Z. B. wurde in Femoralarterien von
Schweinen, die mit Cytochalasin B behandelt wurden, das Auftreten
muraler Mikrothrombi reduziert im Vergleich Ballontraumatisierten
Arterien, die nicht mit dem therapeutischen Wirkstoff behandelt
wurden. Dieses Phänomen
erscheint als sekundärer
Nutzen, der sich aus dem verstärkten
Blutfluss durch das traumatisierte Gefäß ergeben könnte, wobei der Nutzen durch
die Praxis der vorliegenden Erfindung erhalten wird.
-
Cytochalasine sind beispielhafte
therapeutische Wirkstoffe, die in der Lage sind, einen biologischen Stenteffekt
an glatten Gefäßmuskelzellen
zu generieren. Man glaubt, dass Cytochalasine sowohl die Migration als
auch Kontraktion der glatten Gefäßmuskelzellen
durch Wechselwirkung mit Actin hemmen. Die Cytochalasine interagieren
mit den Enden des filamentösen
Actins, um die Längung
der Aktinfilamente zu hemmen. Niedrige Dosen von Cytochalasinen
(z. B. Cytochalasin B) unterbrechen auch die Mikrofilamentnetzwerke
von Actin. In vitro Daten zeigen auch, dass, nachdem die glatten
Gefäßmuskelzellen
frei von Cytochalasin B geworden sind, Zellen ausreichend polymerisiertes
Actin regenerieren, um die Migration innerhalb 24 Stunden wieder
aufzunehmen. In vivo-Einschätzungen
zeigen auf, dass glatte Gefäßmuskelzellen
den Gefäßtonus innerhalb
vom 2 bis 4 Tagen wiedergewinnen. Es ist während dieser Erholungsperiode,
in der der Lumendurchmesserfixierungs- und biologische Stenteffekt
auftritt.
-
Der therapeutische Wirkstoff kann
targetisiert werden, wird jedoch bevorzugt direkt zu dem traumatisierten
Gefäß nach der
Angioplastik oder dem anderen traumatischen Ereignis verabreicht.
Der biologische Stenteffekt, z. B. von Cytochalasin B, ist erreichbar
mittels einer einzigen Infusion des therapeutischen Wirkstoffs in
den traumatisierten Bereich der Gefäßwand mit einer Dosierungskonzentration
im Bereich von 0,1 Mikrogramm/ml bis etwa 1,0 Mikrogramm/ml.
-
Die Hemmung der Glatten-Gefäßmuskelzell-Migration
(von der Tunica media zur Intima) ist in dem gleichen Dosierungsbereich
demonstriert worden (Beispiel 11); jedoch ist eine Dauereinwirkung
des therapeutischen Wirkstoffs auf das Gefäß bevorzugt, um diese antimigratorischen
Effekte zu maximieren. Wenn die glatten Gefäßmuskelzellen nicht in die
Intima wandern können,
können
sie dort nicht proliferieren. Sollten glatten Gefäßmuskelzellen
in die Intima wandern, hemmt eine anschließend verabreichte post-proliferative
Dauerfreigabe-Dosierungsform die intimate Proliferation. Im Ergebnis
kann die Dauerfreigabe-Dosierungsform der vorliegenden Erfindung,
die ein Cytochalasin oder einen anderen proliferativen therapeutischen
Wirkstoff enthält,
in Kombination mit einem Cytochalasin-freien therapeutischen Wirkstoff
verabreicht werden. Auf diese Weise kann der biologische Stenteffekt
sowie ein antiproliferativer oder antimigratorischer Effekt in einem
einzigen Verabreichungsprotokollerziell werden.
-
Wirkstoffe, die in den Protokollen
der vorliegenden Erfindung anwendbar sind, sind z. B. gemäß den folgenden
Prozeduren identifizierbar. Ein potenzieller Wirkstoff für eine wirkstofftreie
(d. h. nicht targetisierte bzw. ungezielte) Verabreichung zeigt
ein oder mehrere der folgenden Charakteristika:
- (i)
hält ein
erweitertes Lumenvolumen nach Angioplastik (z. B. PTCA, perkutane
transluminale Angioplastik (PTA) oder dgl.) oder einem anderen Trauma,
einschließlich
Atherectomie (z. B. Rotoblater, Laser und dgl.); Coronararterien-Bypassbbehandlungen
oder dgl; oder resultierend von einer Gefäßerkrankung (z. B. Arterosklerose,
sekundäre
Augenerkrankungen auf Gefäßstenose
oder Atropie, stenotische cerebrate Gefäßerkrankungen oder dgl.);
- (ii) die anfängliche
Zunahme des Gefäßquerschnitts,
durch den Wirkstoff erleichtert, führt nicht zu einer oder betonten
chronischen Stenose des Lumens;
- (iii) die Targetzellkonzentration oder Migration; und
- (iv) ist cytostatisch.
-
Bevorzugt hat ein hierin angewendeter
therapeutischer Wirkstoff alle vier Eigenschaften; jedoch sind für die Praxis
der vorliegenden Erfindung die erste und die dritte wichtiger als
die zweite und die vierte. Z. B. wurde Cytochalasin B ausgewertet,
um die Eignung für
die Verwendung in therapeutischen wirkstofffreien Protokollen zu
bestimmen. Der biologische Stenteffekt von Cytochalasin B ist erreichbar
mittels einer einzigen Infusion des therapeutischen Wirkstoffs in
den traumatisierten Bereich der Gefäßwand mit einer Dosiskonzentration
im Bereich von etwa 0,1 Mikrogramm/ml bis etwa 1,0 Mikrogramm/ml.
Ein Wirkstoff, der für
die Dauerfreigabeausführung
der vorliegenden Erfindung nutzbar ist, zeigt ein oder mehrere der
folgenden Eigenschaften:
- (i) hält ein erweitertes
Lumenvolumen nach Angioplastik (z. B. PTCA, perkutaner transluminaler
Angioplastik (PTA) oder dgl.) oder einem anderen Trauma, einschließlich Atherectomie
(z. B. Rotoblater, Laser und dgl.); Coronararterien-Bypassbbehandlungen
oder dgl; oder resultierend von einer Gefäßerkrankung (z. B. Arterosklerose,
sekundäre
Augenerkrankungen auf Gefäßstenose
oder Atropie, stenotische cerebrale Gefäßerkrankungen oder dgl.);
- (ii) hemmt die Targetzellproliferation (z. B. 5 Minuten und
24 Stunden nach der Exposition des Wirkstoffs, in vitro glatte Gefäßmuskelgewebekulturen
demonstrieren einen Hemmpegel von 3H-Thymidinaufnahme und
zeigen bevorzugt eine relativ geringe Hemmung der 3H-Leucinaufnahme);
- (iii) produziert bei einer Dosis, die zur Hemmung der DNA-Synthese
ausreicht, nur milde bis mäßige (z.
B. Grad 2 oder 3 in den unten beschriebenen Assays) morphologische
cytotoxische Effekte;
- (iv) hemmt die Targetzellkonzentration; und
- (v) ist cytostatisch.
-
Bei der Identifikation eines therapeutischen
Wirkstoffs, der ein oder mehrere der vorstehenden Attribute aufzeigt,
wird der Wirkstoff einem zweiten Testprotokoll unterzogen, der beinhaltet,
glatte Gefäßmuskelzellen
dem therapeutischen Wirkstoff länger
auszusetzen.
-
Ein Wirkstoff, der in den Dauerfreigabeausführungen
der vorliegenden Erfindung nutzbar ist, zeigt die folgenden Eigenschaften:
- (i) bei langfristiger (z. B. 5 Tage) Exposition
erzeugt der Wirkstoff den gleichen oder ähnlichen in vitro Effekt auf
eine DNA-Synthese und Proteinsynthese der Glatten-Gefäßmuskel-Gewebekultur,
wie sie oben für
die 5 Minuten und 24 Stunden Exposition beschrieben wurde; und
- (ii) bei einer effektiven Dosis in dem langzeitigen in vitro
Assay für
DNA-Synthesehemmung
zeigt der Wirkstoff milde bis mäßige morphologische
cytotoxische Effekte über
einen längere
Dauer (z. B. 10 Tage).
-
Eine weitere Auswertung potenzieller
antiproliferativer Wirkstoffe innerhalb der vorliegenden Erfindung erfolgt
in einem in vivo Ballon-traumatisierten Schweine-Femoralarterien-Modell.
Bevorzugt demonstrieren diese Wirkstoffe eine 50%ige oder stärkere Hemmung
der Zellprollferation in den Tunica media glatten Gefäßmuskelzellen,
gemäß Indikation
durch eine 1-stündige "BRDU Flash-Markierung" vor dem Sammeln
des Gewebes und der histologischen Auswertung. Wenn ein Wirkstoff
für eine
Zeitdauer wirksam ist, die ausreicht, um eine intimate Glatte-Gefäßmuskelproliferation
von 50% oder größer bei
einer einzigen Einwirkung zu hemmen, ist es ein Wirkstoff innehralb
der vorliegenden Erfindung, der keine Verabreichung in einer Dauerfreigabe-Dosierungsform erfordert.
Wirkstoffe mit einer kürzeren
Aktivitätsdauer
werden für
die Dauerfreigabe ausgewertet, wenn die systemische Toxizität und der
potenzielle therapeutische Index scheinbar eine intravenöse Verabreichung
gestatten, um die 50%ige Hemmung zu erreichen, oder wenn der Wirkstoff
für die
lokale Verabreichung zu den glatten Gefäßmuskelzellen mit Dauerfreigabe
bei einer effektiven antiproliferativen Dosis geeignet ist. Dauerfreigabewirkstoffe
werden in einer Dauerfreigabe-Dosierungsform für Dosisoptimierungs- und -wirksamkeitsstudien
ausgewertet. Bevorzugt senken antiproliferative Wirkstoffe, die
in der Praxis der vorliegenden Erfindung nutzbar sind, die Gefäßstenose
um etwa 50% in Ballon-traumatisierten Schweine-Femoralarterien und,
noch bevorzugter, senken die Gefäßstenose auf
ein ähnliches
Ausmaß in
Schweine-Coronararterien. Diese Wirkstoffe sind dann in klinischen
Versuchen am Menschen auswertbar.
-
Die Zellproliferation (d. h. DNA-Synthese)-Hemmung
ist die primäre
Eigenschaft für
die Dauerfreigabe von Wirkstoffen. Z. B. hemmt Staurosporin eine
Differenz zwischen 3H-Leucin und 3H-Thymidin-Aufnahme derart, dass es bei
verabreichten Dosierungen cytostatisch ist. Längerfristige Toxizitätsstudien
zeigten nicht an, dass eine verlängerte
Exposition dem therapeutischen Wirkstoff die Targetzellen nachteilig
beeinflussen würde.
Zusätzlich
zeigte BRDU-Pulsing an, dass Staurosporin die Targetzellproliferation
hemmt. Jedoch kann alternativ jede geeignete Methode angewendet
werden, um die Fähigkeit
auszuwerten, die Zellproliferation zu hemmen. Demzufolge ist Staurosporin
wirksam darin, ein expandiertes Lumenvolumen zu erhalten.
-
Die Erfindung wird in Bezug auf die
folgenden spezifischen Beispiele besser verständlich.
-
BEISPIEL 1
-
Bindung an
glatte Gefäßmuskelzellen
in der Blutgefäßwand in
vivo
-
1 zeigt
die Bindung von NR-AN-01 (ein murines IgG2b Mab) an glatten Gefäßmuskelzellen
in der Gefäßwand einer
Arterie in einem 24 Jahre alten männlichen Patienten, 4 Tage
nach der i.v. Verabreichung von NR-AN-01. 1 ist eine Mikrophotographie eines histologischen
Schnitts durch den medialen Bereich einer Arterienwand des Patienten
nach NR-AN-01 Verabreichung, wobei der Schnitt ex vivo mit HRP-konjugiertem
Ziegen-anti-Maus-IgG
reagiert wurde. Die Reaktion des HRP-Konjugats mit NR-AN-01 MAb
wurde sichtbar gemacht durch Zugabe von 4-Chlor-1-naphthol oder
3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid
als Peroxidasesubstrat (Chromogen). Das Reaktionsprodukt des Substrats
bildet ein unlösliches
violettes oder dunkelbraunes Präzipitat
am Reaktionsort (bei #2 gezeigt, 1).
Es wurde eine Gegenfärbung
angewendet, um collagenes extrazelluläres Matrixmaterial (bei #2
gezeigt, 1) oder Zellkerne
(#1, 1) sichtbar zu
machen.
-
Glatte Muskelzellen werden unter
mikroskopischer Untersuchung als violett gefärbte Zellen sichtbar gemacht.
Diese Mikrophotographie demonstriert die Fähigkeit von MAb, in vivo spezifisch
an humanen glatten Gefäßmuskel
zu binden, und wird durch die Zellen internalisiert und verbleibt
für verlängerte Dauern
in den Zellen.
-
BEISPIEL 2
-
Therapeutische Konjugate,
die Trichothecen-therapeutische Wirkstoffe enthalten
-
Konjugate von NR-AN-01 und Roridin
A wurden durch chemische Kupplung eines Hemisuccinatderivats des
Trichothecencytotoxins (wie unten beschrieben) an einen monoklonalen
Antikörper
namens NR-AN-01 gebaut. Es wurden zwei Konjugate hergestellt, wobei
einer an die Roridin A 2'-Position
gekoppelt wurde und einer an die 13'-Position. In dieser Synthese wurden
zwei Schemata angewendet, wie in 2 und 3 dargestellt. Das Konjugat
wurde dann von unreagiertem Roridin A durch PD-10 SEPHAROSE® Säulenchromatographie
(Pharmacia; Piscataway, NJ) gereinigt, durch Größenausschluss-Hochdruckflüssigkeitschromatographie
analysiert, und die Säulenfraktionen
wurden durch SDS-PAGE und isoelektrische Fokussierung (IEF) charakterisiert,
wie unten beschrieben.
-
2 zeigt
schematisch das erste Reaktionsschema für die Synthese von Roridin
A-Hemisuccinylsuccinimidat (RA-HS-NHS) durch einen zweistufigen
Prozess mit den Reagenzien: Succinanhydrid, Triethylamin (NEt3) und Dimethylaminopyridin (DMAP) vorliegend
in Dichlormethan (CH2Cl2)
bei Raumtemperatur (RT); und N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC) Reagenzien, ebenfalls in CH2Cl2 bei RT.
-
3 zeigt
schematisch das zweite Reaktionsschema für die Synthese von Roridin
A-Hemisuccinylsuccinimidat (RA-HS-NHS) durch einen fünfstufigen
Prozess mit den Reagenzien: t-Butyldimethylsilylchlorid (TBMS-Cl)
und Imidazol in Dimethylformamid (DMF) bei Raumtemperatur (RT);
Acetanhydrid, Triethylamin (TEA) und Diethylaminopyridin in Dichlormethan
(CH2Cl2) bei RT;
Succinanhydrid, Triethylamin (TEA) und Dimethylaminopyridin (DMAP)
in (CH2Cl2) bei
RT; und N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)
Wirkstoffe.
-
Synthese von 2'-Roridin-A-Hemisuccinsäure (2):
-
Zu 0,5 g (0,94 mmol) Roridin A wurde
15 ml Dichlormethan hinzugefügt.
Zu dieser Lösung
wurde unter Rühren
0,104 g (1,04 mmol) Succinanhydrid hinzugefügt. Zu diesem Reaktionsgemisch
wurde 0,2 ml Triethylamin in 5 ml Dichlormethan hinzugefügt. Zu dem
homogenen Reaktionsgemisch wurde eine katalytische Menge von Dimethylaminopyridin
hinzugefügt
und bei Raumtemperatur über
15 Stunden gerührt.
Dem Abschluss der Reaktion folgte eine Dünnschichtchromatographie (CH2Cl2 : CH3OH = 9,7 : 0,3 mit wenigen Tropfen Essigsäure). Am
Ende der Reaktion wurden 0,3 ml Eisessigsäure hinzugefügt, und
das Lösungsmittel
wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der getrocknete rohe Rest
wurde zwischen Wasser und Methylchlorid aufgeteilt. Die kombinierten
Methylenchloridextrakte (3 × 50
ml) wurden über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, wobei das Lösungsmittel
unter Vakuum entfernt wurde, und getrocknet, zum Erhalt von 0,575
g (96%) eines Rohgemisches dreier Verbindungen. Die präparative
C18 HPLC-Separation des Rohgemisches in 50%igem Acrylonitrilwasser
mit 2%iger Essigsäure
ergab 0,36 g (60%) von 2 als weißem Feststoff.
-
Synthese von Succinimidyl-2'-Roridin A-Hemisuccinat
(3):
-
Zu 0,3 g (0,476 mmol) 2'-Roridin A-Hemisuccinsäure in 30
ml Dichlormethan wurden 0,055 g (0,478 mmol) N-Hydroxysuccinimid
hinzugefügt.
Zu dem klaren Reaktionsgemisch wurden 0,108 g (0,524 mmol) Dicyclohexylcarbodümicd hinzugefügt. Das
Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 6 Stunden gerührt. Dem
Abschluss der Reaktion folgte TLC (CH2Cl2 : CH3OH = 9,7 :
0,3 mit wenigen Tropfen Essigsäure) als
Entwicklungs-Lösungsmittel.
Einige wenige Tropfen von Eisessigsäure wurden zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, und
das Lösungsmittel
wurde unter reduziertem Druck entfernt. Zu dem getrockneten Rest
wurde Dichlormethan hinzugefügt,
und das präzipitierte
DCU wurde gefiltert. Lösungsmittel
von dem Filtrat wurde unter reduziertem Druck beseitigt, um einen
weißen
Feststoff zu erhalten. Aus dem Rohprodukt wurde 0,208 g (60%) von
3 durch präparative
HPLC in 50%igem Acetonitril mit 2% Essigsäure als mobiler Phase gereinigt.
-
Synthese von 13'-t-Butyldimethylsilyl-Roridin
A (4):
-
Zu 72,3 mg (0,136 mmol) Roridin A
in 0,5 ml Dimethylformamidlösung
wurden 0,055 g (0,367 mmol) t-Butyldimethylsilylchlorid und 0,025
g (0,368 mmol) Imidazol hinzugefügt.
Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 15 Stunden gerührt. Dem
Abschluss der Reaktion folgte eine Silikageldünnschichtchromatographie mittels
1%iger MeOH-CHCl3 als Entwicklungs-Lösungsmittel.
Das Lösungsmittel
aus dem Reaktionsgemisch wurde in Vakuum entfernt und getrocknet.
Das Rohprodukt wurde zwischen Wasser und Methylchlorid aufgeteilt.
Lösungsmittel
aus den kombinierten Methylenchloridextrakten wurde unter reduziertem Druck
entfernt und getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie
mittels EtOAc : Hexan (1 : 3) als Eluierungslösungsmittel gereinigt. Lösungsmittel
aus den Eluanten wurde unter reduziertem Druck beseitigt, um 0,66
g (75%) von 4 als Feststoff zu gewinnen.
-
Synthese von 13'-t-Butyldimethylsilyl-2'-Acetyl-Roridin A
(5):
-
Zu 0,1 g (0,155 mmol) von 13'-t-Butyldimethylsilyl-Roridin
A in 10 ml Dichlormethan wurden 0,3 ml Acetanhydrid, 0,2 ml Triethylamin
und einige Kristalle Dimethylaminopyridin hinzugefügt und bei
Raumtemperatur für
2 Stunden aufbewahrt. Dem Abschluss der Reaktion folgte TLC in 1%gem
Methanolmethylenchlorid als Entwicklungs-Lösungsmittel. Das Lösungsmittel
wurde unter reduziertem Druck entfernt und durch eine Silikagelsäule mittels
1 % Methanolchloroform als Eluierungslösungsmittel gereinigt. Das
Lösungsmittel
von den Eluanten wurde unter Vakuum beseitigt, um 0,085 g (80 %)
5 als Feststoff zu gewinnen.
-
Synthese von 2'-Acetyl-Roridin A
(6):
-
Zu 0,05 g (0,073 mmol) 2'-Acetyl-13'-t-Butyldimethylsilyl-Roridin
A in 5 ml Tetrahydrofuran wurden 0,3 ml von 1 M Tetrabutylammoniumfluoridlösung in
THF hinzugefügt.
Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Dem
Abschluss der Reaktion folgte eine Silikagel-Dünnschichtchromatographie
mittels 1%igem MeOH-CHCl3 als dem Entwicklungs-Lösungsmittel.
Das Lösungsmittel
aus dem Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck entfernt
und getrocknet. Das Rohprodukt wurde auf einer Silikagelsäule mittels
1%igem CH3OH-CHCl3 als
Eluierungslösungsmittel
gereinigt. Lösungsmittel
aus den kombinierten Eluanten wurde unter Vakuum beseitigt, um 0,020
g (48%) von 6 als Feststoff zu gewinnen.
-
Synthese von 2'-Acetyl-13-Hemisuccinyl-Roridin
A (7):
-
Zu 0,05 g (0,087 mmol) von 2'-Acetyl-Roridin A
in 1 ml Dichlormethan wurden 0,025 g (0,25 mmol) Succinanhydrid
und 35 ml von Triethylamin hinzugefügt. Einige wenige Kristalle
von Dimethylaminopyridin wurden als Katalysator hinzugefügt. Das
Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Dem
Abschluss der Reaktion folgte eine Dünnschichtchromatographie mittels
5%igem McOH-CH2Cl2 als Entwicklungs-Lösungsmittel.
Am Ende der Reaktion wurden 30 ml Eisessigsäure hinzugefügt. Lösungsmittel von
dem Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck entfernt und
getrocknet. Das Rohprodukt wurde zwischen Wasser und Ethylacetat
aufgeteilt. Lösungsmittel
von den kombinierten Ethylacetatfraktionen wurde unter reduziertem
Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde gereinigt, indem es durch eine
Silikagelsäule
geschickt wurde, um 0,039 g (66%) von 7 als weißem Feststoff zu gewinnen.
-
Synthese von Succinimidyl-2'-Acetyl-13'-Roridin A-Hemisuccinat(8):
-
Zu 0,036 g (0,0050 mmol) von 2'-Acetyl-13'-Roridin A-Hemisuccinsäure in 2
ml Dichlormethan wurden 0,009 g (0,09 mmol) N-Hydroxysuccinimid
hinzugefügt.
Zu einer gerührten
Lösung
wurde 0,012 g (0,059 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt. Das
Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 8 Stunden gerührt. Dem
Abschluss der Reaktion folgte eine Silikageldünnschichtchromatographie mittels
5%igem MeOH-CH2Cl2 als
Entwicklungs-Lösungsmittel.
Einige wenige Tropfen von Eisessigsäure wurden zu dem Reaktionsgemisch
hinzugefügt.
Lösungsmittel
von dem Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck entfernt und
getrocknet. Das Rohprodukt wurde auf einer Silikagelsäule mittels
5% MeOH-CH2Cl2 als
Eluierungslösungsmittel
gereinigt. Das Lösungsmittel
von den kombinierten Eluanten wurde unter Vakuum beseitigt, um 0,025
g (61%) von 8 als weißem
Feststoff zu gewinnen.
-
Konjugation von Succinimidyl-2'-Roridin A-Hemisuccinat
(3) und Succinimidyl-2'-acetyl-13'-Roridin A-Hemisuccinat
(8) mit NR-AN-01 Gesamt-Antikörper
(MAb):
-
Konjugationsreaktionen wurden bei
pH 8,0 in Boratpuffer in der Gegenwart von 25% Dimethylsulfoxid (DMSO)-Lösungsmittel
bei Raumtemperatur bei leichtem Mischen für 45 Minuten vor der Reinigung
durch Gelpermeationschromatographie durchgeführt. Die molaren Trichothecen-Medikamentenprecursor
zu Antikörperangebote
betrugen 25 : 1 und 40 : 1 für
die 2'- bzw. 13'-Roridin A-Analoge
(3 und 8). Die Antikörperkonzentration
war 0,9 bis 1,0 mg/ml während
der Konjugationsreaktion.
-
Eine typische 2'-Analogen (3)-Reaktion mit 25 mg Antikörper war
wie folgt: Zu 4,7 ml von 5,3 mg Ab/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung (d.
h. PBS; 150 mM NaCl; 6,7 mM Phosphat; pH 7,3) wurden 10 ml PBS und
5 ml Boratpuffer (0,5 M, pH 8,0) hinzugefügt. Unter leichtem Rühren wurden
dem Reaktionsgemisch 6,3 ml DMSO, das 1,37 mg Succinimidyl-2'-Roridin A-Hemisuccinat (3)
enthielt, dann tropfenweise über
eine 15 Sekundendauer hinzugefügt.
-
Reinigung:
-
Zur Reinigung wurden 1 ml Reaktionsaliquots
auf Pharmacia PC-10 Sepharose® Säulen gegeben, äquilibriert
in PBS. Das eluierte Konjugat wurde in 2,4 bis 4,8 ml Fraktionen
gesammelt. Die PD-10 gereinigten Konjugataliquots wurden dann gepoolt
und auf einem Amicon PM-10DiAflo® Konzentrator
auf 1,5 bis 2,0 mg Ab/ml konzentriert; steril durch eine 0,2 μ Gelman Acarodisc® gefiltert
und in sterile Glasfläschchen
in 5 ml Volumen abgefüllt.
-
Das 2'-Konjugat wurde in flüssigem Stickstoff
schnellgefroren und dann bis zum Gebrauch bei –70°C aufbewahrt. Das 13'-Rorodin A NR-AN-01-Konjugat
wurde geforen oder gekühlt
aufbewahrt (d. h. bei 5 bis 10°C).
-
Charakterisierung der
Konjugate:
-
Die Proteinkonzentration wurde durch
BCA-Assay mittels der Kupferreaktionsmethode bestimmt (Pierce Chemical
Corp.).
-
Die Abschätzung des Grads der Antikörperderivatisierung
wurde durchgeführt
durch zuerst Hydrolysieren eines Aliquots des Konjugats in 0,2 M
Carbonat, pH 10,3 für
4 Stunden (bei Raumtemperatur für
2'-Konjugat oder
bei 37°C
für das
13'-Konjugat), gefolgt
durch Filtration durch eine PM-30 Membran. Das Filtrat wurde dann
für Roridin
A auf C-18 reverse Phase HPLC untersucht, mittels einer mobilen
Phase eines 50 : 48 : 2 Verhältnisses
von CH3CN : H2O
: HOAC. Es wurde ein Korrekturfaktor von 1,32 angewendet, um eine
parallele makrozyklische Ringzersetzung zu korrigieren, die während der
Hydrolyse des 13'-Konjugats
polare Produkte ergibt.
-
Es wurde auch eine Größenausschluss-Chromatographie
auf DuPont Zorbax® HPLC und isoelektrischer
Fokussierung mittels Serva® Gelplatten (pH 3 bis
10) durchgeführt.
Durch HPLC wurde keine Indikation einer Aggregation beobachtet.
-
Immunoassay von Roridin A-Antikörperkonjugaten
erfolgt durch entweder kompetitive ELISA mittels biotinyliertem
Ab mit Streptavidin/Peroxidase-Detektion
oder durch kompetitiven Zellbindungsassay mittels 125I-arkiertem
Antikörper.
Altenrativ wurde die Immunoreaktivität unter Bedingungen der Antigensättigung
in einem Zellbindungsassay gemessen, worin der Antikörper zuerst
mit I-125 durch die Chloramin-T-Methode spurenmarkiert wurde und
dann anschließend
mit 2'- und 13'-Roridin A-Precursorn
derivatisiert wurde.
-
Die Strukturformel des Trichothecens
ist unten gezeigt:
-
BEISPIEL 3
-
Bindungskinetik glatter
Muskelzellen
-
Zur Verabreichung durch einen i.v.
Katheter ist es erwünscht,
dass die therapeutischen Konjugate der Erfindung in weniger als
3 bis 5 Minuten verabreicht werden, sodass der Blutfluss in dem
Patienten wieder hergestellt werden kann. Daher wurden Studien durchgeführt, um
die Bindungskinetiken des Glatten-Muskel-Bindungsproteins mit einem
Ka von > 109 Liter/mol zu bestimmen. Weil menschliche
glatte Gefäßmuskelzellen
in der Kultur langsam wachsen und sich herausstellte, dass glatte
Muskelzellen des Pavians den humanen CSPG-Zelloberflächenmarker
exprimieren, wurden glatte Arterienmuskelzellen vom Pavian und menschliche A375
M/M (Melanom: ATCC #CRL 1619) Zellen, die den CSPG-Oberflächenmarker
trugen, in vielen der Studien verwendet, die in den Beispielen unten
beschrieben sind.
-
Für
die Bindungskinetikstudien wurden A375 M/M- und BO54-Zellen in sterilen
96 Well-Mikrotiterplatten mit 2500 Zellen/Well angesetzt. Die Platten
wurden in Aluminiumfolie eingewickelt und bei 37°C über Nacht in einer feuchten
Atmosphäre
von 5% CO2/95% Luft inkubiert. Nach angenähert 18
Stunden wurden die Inkubationsplatten entfernt, und die Zellen wurden
mit 0,05% Glutaraldehyd für
5 Minuten fixiert, um einen Membranturnover zu verhindern. Nach
dem Fixieren wurden die Platten im Überschuss mit PBS, das 0,5% Tween-20® enthielt,
gewaschen. Serielle Zweifachverdünnungen
eines NR-AN-01 therapeutischen
Konjugats, das Roridin A enthielt, wurden mit Proteinkonzentrationen
von 10 mg/ml bis 20 ng/ml hergestellt, und jede Lösung wurde
in zwei Wells aliquotisiert. Die Platten wurden bei 4°C mit dem
NR-AN-01 für 5, 15,
30 und 60 Minuten inkubiert, wonach das ungebundene Protein durch
Absaugen entfernt wurde, und es wurde zu jedem Well 100 ml CS-Puffer
hinzugefügt
(55% Hühnerserum/0,5%
Tween-20® in
PBS). CS-Puffer wurde beseitigt, und das NR-AN-01 therapeutische
Konjugat, gebunden an die Zellen, wurde sichtbar gemacht durch Hinzufügen von
100 ml HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO) zu jedem Well; Inkubieren bei 4°C für eine Stunde; Waschen mit
PBS/0,055% Tween®, um ungebundenes Ziegen-IgG
zu beseitigen; und Hinzufügen
von 2,2'-Azino-bis
(3-ethylbenzthiazol-6-sulfonsäure
(ABTS) chromogenes Substrat (d. h. für HRP). Nach Inkubation für 30 Minuten
wurde die an die Zelle gebundene Menge von NR-AN-01 quantifiziert,
durch Messung der Absorption bei 415 nm und 490 nm mittels ELISA
Plattenlesegeräts,
ausgestattet für
die Datenerfassung mit einem Compaq Computer.
-
4A zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, worin A375 M/M marker-positive
Zellen bei 4°C
(d. h. um Membranturnover zu verhindern) für 5 Minuten (offene Quadrate, 4A), 15 Minuten (geschlossene
Rauten, 4A), 30 Minuten
(geschlossene Quadrate, 4A)
oder 60 Minuten (offene Rauten, 4A)
mit unterschiedlichen Konzentrationen von NR-AN-01 (NRAND01 μg/ml) gehalten wurden. Die Bindung
des NR-AN-01 MAb an die A375-Zellen wurde quantifiziert durch Waschen,
um ungebundenen Antikörper
zu beseitigen, Hinzufügen
von HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG zur Reaktion mit dem zellgebundenen
MAb, Waschen, um ungebundenen sekundären Ziegen-Antikörper zu
beseitigen, und Hinzufügen
von 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS)
Substrat für
Peroxidase. Die Farbentwicklung wurde nach 30 Minuten sowohl bei
415 nm als auch 490 nm überwacht
(ABS415.490).
-
4B zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die in ähnlicher
Weise durchgeführt
wurden, wie oben in Bezug auf 4A beschrieben
wurde, jedoch mittels BO54 marker-positiven glatten Muskelzellen,
d. h. anstatt der A375 m/m Zellen.
-
Die in 4A und 4B dargestellten
Ergebnisse zeigen eine signifikante Bindung von NR-AN-01 an A375
und BO54 Zellen innerhalb 5 Minuten bei 4°C auch bei der geringsten Dosis
von 20 nm/ml.
-
BEISPIEL 4
-
Wirkungen von Roridin
A und RA-NR-AN-01 Konjugaten
-
Die Wirkungen von Roridin A (RA)
und RA-NR-AN-01 Konjugaten auf die zelluläre Proteinsynthese (d. h. durch 3H-Leucinaufnahme) und die metabolische Aktivität (d. h.
durch mitochondrialen MTT-Assay) wurden in den Experimenten geprüft, die
unten in BEISPIEL 5 und BEISPIEL 6 im Detail angegeben sind. Die
Studien in BEISPIEL 4 enthalten Experimente zur Bestimmung der Wirkungen
der langdauernden (d. h. 24-stündigen) Behandlung
mit den Wirkstoffen. Die Studien in BEISPIEL 5 enthalten Experimente
zur Bestimmung der Effekte einer "Puls" (d.
h. 5-minütigen)
Behandlung der Zellen. In beiden Studien wurde die zelluläre Spezifität der Wirkung
durch Aufnahme von "Target"-Zellen (d. h. Zellen,
die den CSPG "Marker" tragen) und Nicht-Targetzellen
ausgewertet. Zu Vergleichszwecken wurde auch freies RA (d. h. ungekoppeltes)
in den Studien eingebunden. Die Effekte auf die zelluläre Proteinsynthese
oder metabolische Aktivität
wurde entweder unmittelbar nach der Behandlung ausgewertet, oder
es wurde eine "Erholungsdauer" zugelassen (d. h.
einschließlich der
Inkubation der Zellen über
Nacht bei 37°C),
um die langfristigen Effekte der Wirkstoffe auf die Zellpopulationen
zu bestimmen.
-
Metabolische Effekte nach
24-stündiger
Exposition:
-
Während
es bekannt ist, dass monoklonale Antikörper-Medikamentenkonjugate einen Spezifitätsgrad für Zellen
haben können,
die Markerantigene tragen, wenn in vivo angewendet, hat es sich
herausgestellt, dass es in vielen Systemen schwieriger ist, die
in vitro Spezifität
der Wirkung zu demonstrieren, insbesondere mit Verbindungen, die
lipophil sind. Daher wurden die vorliegenden Experimente durchgeführt, worin
die inhibitorischen Effekte des NR-AN-01 Roridin A-Konjugats auf
Target- und Nichttargetzellen über
24 Stunden getestet wurden. Die Ergebnisse mit RA-NR-AN-01 wurden
mit dem Effekt von freiem Roridin A über die gleiche 24-Stundendauer
verglichen. Ein modifiziertes Methyltetrazoliumblau (MTT)-Assay
wurde mit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid
(Sigma) genutzt, um die zelluläre
metabolische Aktivität
zu bestimmen. Dieser Assay ist dazu gedacht, die zelluläre mitochondriale
Dehydrogenaseaktivität
zu messen. Für einige
dieser Studien wurden M14 (Melanom) und BO54 (glatter Muskel)-Zelllinien als marker-positive
Targetzellen verwendet, und es wurden HT29-Zellen (Colonkarzinom; ATCC#HTB38) als
Nichttargetspezifitätskontrolle
verwendet. In anderen Studien wurde A375 als marker-positive Zelle
verwendet. Die HT29- und M14-Zellen wurden in 96-Well Mikrotiterplatten
mit einer Konzentration von 5,0 × 103 Zellen/Well
angesetzt, und die B054-Zellen wurden mit 2,5 × 103 Zellen/Well
angesetzt. Serielle Zweifachverdünnungen
von freiem Roridin A und 2'RA-HS-NR-AN-01
(d. h. Roridin A, gekopelt durch Hemisuccinat (HS)-Kopplungsmittel
and er 2'-Position an
NR-AN-01) wurden in DMEM über
einen Bereich von Proteinkonzentrationen von 20 mg/ml bis 40 pg/ml hergestellt.
Es wurden Testwirkstoffe (doppelt) zu Mikrotiterwells (100 ml/Wlell)
hinzufügt,
und die Platten wurden in Aluminiumfolie eingewickelt und bei 37°C in angefeuchteter
Atmosphäre,
bestehend auf 5% CO2/95% Luft, für 24 Stunden
inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium entfernt (durch Absaugen),
wurde frisches DMEM hinzugefügt
(100 ml/Well), und die Zellen wurden umgedreht, um für eine zusätzliche über Nacht
(d. h. 16–18
Stunden) "Erholungsdauer" zu inkubieren. Am
Ende der "Erholungsdauer" wurde die zelluläre metabolische
Aktivität
bestimmt, indem zu jedem Well 20 ml einer 5 mg/ml MTT-Lösung hinzugegeben
wurde. Die Platten wurden abgedeckt und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert, und
dann wurde die Reaktion entwickelt, indem 100 ml/Well 10%iger SDS/0,1
N Hcl hinzugefügt
wurde. Das dunkelblaue, in Lösung
gebrachte Formazanreaktionsprodukt wurde bei Raumtemperatur nach
16–18
Stunden entwickelt und mittels eines ELISA Mikrotiterplattenlesegeräts bei einer
Absorption von 570 nm quantifiziert.
-
5A zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, worin BO54 marker-positve
glatte Muskelzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von RA-NR-AN-01
(NRAN01-RA; offene Quadrate, 5A)
oder freiem Roridin A (freies RA; geschlossene Rauten; 5A) für eine Dauer von 24 Stunden
inkubiert wurden, gewaschen wurden und dann zur Kultur für eine zusätzliche
16–18-stündige Übernacht
(o/n) Erholungsdauer zurückgebracht
wurden, bevor die metabolische Aktivität in einem MTT-Assay getestet
wurde. Die Konzentrationen von freiem RA und RA-NR-AN-01 werden
ausgedrückt
als die berechnete Konzentration von Roridin A (in mg/ml aufgetragen
auf einer logarithmischen Skala) in dem Assay (d. h. anstatt dem
totalen mg/ml von NR-AN-01
Protein in dem Assay), sodass direkte Vergleiche möglich sein
können.
Die metabolische Aktivität der
Zellen in dem MTT-Assay wird dargestellt als Prozentsatz der metabolischen
Aktivität,
gemessen in einer unbehandelten Kontrollkultur von Zellen, d. h.
% Kontrolle).
-
5B zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die in ähnlicher
Weise ausgeführt
wurden wie jene, die oben in Bezug auf 5A beschrieben wurden, jedoch unter
Vergleich der Effekte von nur RA-NR-AN-01 (NRAN01-RA) an drei unterschiedlichen
Zelltypen: nämlich
BO54 markerpositiven glatten Muskelzellen (BO54-NRAN01-RA; offene
Quadrate, 5B); HT 29
marker-negativen Kontrollzellen (HT29-NRAN01-RA; geschlossene Rauten, 5B); und M14 marker-positiven
Zellen (M14-NRAN01-RA; geschlossene Quadrate, 5B). Wie oben in Bezug auf 5A beschrieben, werden
die Konzentrationen in dem vorliegenden Experiment als μg/ml Roridin
A ausgedrückt.
Die metabolische Aktivität
der Zellen wird in ähnlicher
Weise wie in 5A ausgedrückt, d.
h. als Prozentsatz der Aktivität,
gemessen in einer unbehandelten Kontrollkultur von Zellen (% Kontrolle).
-
Die in 5A und 5B dargestellten
Ergebnisse zeigen, dass die in dem MTT-Assay gemessene metabolische
Aktivitäten
in allen Populationen von Testzellen signifikant abnahmen, sogar
16–18
Stunden nach einer 24-stündigen Inkubation
in entweder freiem Roridin A oder den 2'- oder 13'-RA-NR-AN-01
Konjugaten. Die Effekte der RA-NR-AN-01 Konjugate schienen nicht
spezifisch inhibitorisch für
sowohl Target (BO54 und M14)- als auch Nichttarget (HT29)-Zellen
(5A und 5B) zu sein. Die inhibitorischen Effekte
wurden bei einer freien Roridin A- oder RA-Konjugatkonzentration
von > 10 ng/ml beobachtet.
-
Zu Vergleichszwecken wurde eine zweite
Studie durchgeführt,
worin die Effekte von Pseudomonas exotoxin (PE)-Konjugaten auf Zellen
in einem ähnlichen
Protokoll ausgewertet wurden. Für
diese Studie wurden Target- und Nichttargetzellen mit PE oder PE-NR-AN-01
für 24
Stunden behandelt, und erhielten dann eine "Erholungsperiode" (wie oben), bevor die metabolische
Aktivität
in einem MTT-Assay getestet wurde.
-
6A zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die in ähnlicher
Weise durchgeführt
wurden, die oben in Bezug auf 5A beschrieben
wurden, jedoch so ausgestaltet, um die metabolischen Effekte auff
PE-NR-AN-01 (NRAN01-PE)
auf Zellen zu untersuchen, d. h. anstatt RA-NR-AN-01. Drei unterschiedliche Zelltypen
wurden angewendet: nämlich
BO54 marker-positive glatte Muskelzellen (BO54; offene Quadrate, 6A); HT29 markernegative
Kontrollzellen (HT29; geschlossene Rauten, 6A); und M14 marker-positive Zellen
(MT14; geschlossene Quadrate, 6A).
In dieser Studie ist die Konzentration des Konjugats in μg/ml NR-AN-01
Protein ausgedrückt
(aufgetragen auf einer log-Skala), und die metabolische Aktivität wird ausgedrückt als
Prozentsatz der MTT-Aktivität,
gemessen in einer unbehandelten Kontrollkultur (% Kontrolle).
-
6B zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die in ähnlicher
Weise ausgeführt
wurden wie jene, die oben in Bezug auf 6A diskutiert wurden, jedoch ausgeführt, um
die mit freiem PPE (PE) erhaltenen Effekte mit den oben erhaltenen
zu vergleichen, d. h. in 6A,
mit PE-NR-AN-01. Die Zellen, die Kulturbedingungen, die Berechnungen
und die Präsentation
der Ergebnisse sind die gleichen wie in 6A oben.
-
Die in 6A und 6B dargestellten
Ergebnisse zeigen, dass eine 24-stündige Exposition von PE-NR-AN-01
oder freiem PE nicht spezifisch inhibitorisch für Zellen der Konzentration
von > 100 ng/ml war.
-
Während
dieser Typ nicht-spezifischer Hemmung als ein potenzieller Wert
für die
biologische Atherectomie gewertet wurde, wurde er nicht als wünschenswert
für die
Behandlung von Restenose nach Angioplastik angesehen, wo tote und
sterbende Zellen Faktoren freigeben können, die die Glatte-Muskelproliferation
stimulieren.
-
BEISPIEL 5
-
Effekte der
Pulsbehandlung auf zelluläre
Aktivität
-
Es wurden zusätzliche Studien durchgeführt, um
die Effekte davon auszuwerten, Zellen kurzfristig, d. h. 5 Minuten,
einem Roridin A-haltigen therapeutischen Konjugat auszusetzen. In
diesen Studien wurde sowohl die metabolische Aktivität (gemessen
in MTT-Assays) als auch die zelluläre Proteinsynthese (gemessen durch 3H-Leucinaufnahme) ausgewertet.
-
Effekte nach 5 Minuten
der Exposition: Proteinsynthese
-
Die Effekte einer 5-minütigen Exposition
für freies
Roridin A (RA) oder ein therapeutisches Konjugat wurden ausgewertet.
Angewendet wurde Roridin A-NR-AN-01,
gekoppelt durch Hemisuccinyl (HS) an entweder der 2'-Position (2'RA-HS-NR-AN-01) oder
der 13'-Position
(13'RA-HS-NR-AN-01).
(Im Falle von 13'RA-HS-NR-AN-01
wurde die 2'-Position
von Roridin A auch acetyliert.) Die RA-, 2'- oder 13'RA-NR-AN-01 Konjugate wurden in sterilem
DMEM über
einen Konzentrationsbereich von 400 ng/ml bis 780 pg/ml Roridin
A zweifach verdünnt.
(DieTestproben wurden alle auf Roridin A normalisiert, sodass direkte
Vergleiche der Effekte bei vergleichbaren Dosierungen durchgeführt werden
konnten.) Proben wurden (doppelt) in doppelte Mikrotiterplatten
mit 100 ml/Well zum Aliquot gebracht und bei Raumtemperatur für 5 Minuten
inkubiert.
-
Sowohl kurzfristige als auch langfristige
Effekte der Testproben auf markerpositive A375- als auch marker-negative
HT29-Zellen wurden bestimmt. Zur Untersuchung der kurzfristigen
Effekte wurde 100 ml/Well [3H]-Leucin (0,5
mCi/ml) unmittelbar nach der 5-minütigen Behandlung mit Konjugat
(oder RA) hinzugefügt, und
die Proteinsynthese wurde über
eine 5-stündige
Dauer ausgewertet. Zur Bestimmung der langfristigen Effekte wurden
die Zellen für
5 Minuten behandelt, gewaschen und dann zur Kultur für eine 24-stündige "Erholungs"-Periode im DMEM-Medium
zurückgebracht,
das entweder 5% NBS/5% Serum Plus®, d.
h. für
A375- oder NT29-Zellen) oder 10% FBS (d. h. für BO54-Zellen) enthielt. Am
Ende der "Erholungs"-Periode wurde das
Inkubationsmedium entfernt (d. h. durch Absaugen), und es wurde 3H-Leucin hinzugefügt (wie oben). In beiden Fällen (d.
h. ob kurzfristig oder langfristig) wurde die Proteinsynthese der
Zellen ausgewertet durch Inkubieren der Zellen mit 3H-Leucin
für 4 Stunden
bei 37°C
in einer feuchten Kammer (wie oben) und alle Ergebnisse wurden durch
Vergleich mit nicht behandelten Zellen (d. h. 100% Kontrolle) berechnet.
Nach 4 Stunden wurde das 3H-Leucin entfernt,
wurden die Zellen von dem Substrat durch Trypsinbehandlung entfernt, abgesaugt
(mittels eines PHDTM Zellerntegeräts (Cambridge
Technology, Inc., Cambridge, MA)) und durch Filtration auf Glasfaserfiltern
gesammelt. Die Glasfaserfilter wurden getrocknet und durch Flüssigszintillationsspektroskopie
in einem Beckman Flüssigszintillationszähler radioaktiv
quantifiziert.
-
7A zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die durchgeführt wurden,
um die Effekte zu untersuchen, Kontroll HT29 marker-negative Zellen über 5 Minuten
unterschiedlichen Konzentrationen von Roridin A (freies RA; offene
Quadrate, 7A) oder
2'-RAN-NR-AN-01
(2'RA-NRAN01; geschlossene
Quadrate, 7A) oder
13'RA-NR-AN-01 (13'RA-NRAN01; geschlossene
Dreiecke, 7A) Konjugaten
auszusetzen. Die Konzentrationen von freiem RA, 2'RA-NR-AN-O1 oder
13'NR-AN-01 werden
ausgedrückt
als die berechnete Konzentration von Roridin A in dem Assay (in μg/ml, aufgetragen
auf einer log-Skala), d. h. anstatt dem gesamten μg/ml von
NR-AN-01 Protein, sodass direkte Vergleiche der Ergebnisse durchgeführt werden können. Für diese
Studien wurden die Zellen für
5 Minuten behandelt, gewaschen und dann zur Kultur für 4 Stunden
zurückgebracht,
wobei während
dieser Zeit die zelluläre
Proteinsynthese ausgewertet wurde, indem 0,5 mCi/ml von 3H-Leucin dem Kulturmedium hinzugefügt wurde.
Am Ende der 4-stündigen
Dauer wurden die zellulären
Proteine gesammelt, und die Radioaktivität wurde bestimmt. Die Ergebnisse
sind ausgedrückt
als der Prozentsatz der Radioaktivität, die in einer Kontroll (nicht
behandelten) NT29-Zellkultur aufgezeichnet wurde (d. h. % Kontrolle).
-
7B zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die die Effekte davon
untersuchen, Kontroll H29 marker-negative Zellen 5 Minuten unterschiedlichen
Konzentrationen von freiem RA (offene Quadrate, 7B), 2'RA-NRAN01 (geschlossene Quadrate, 7B) oder 13'RA-NRAN01 (geschlossene
Dreiecke, 7B) auszusetzen,
wie oben in Bezug auf 7A beschrieben,
wobei jedoch in den vorliegenden Experimenten die Zellen für eine 16–18-stündige Erholungsperiode
(d. h. über
Nacht; o/n) inkubiert wurden, bevor die Proteinsynthese in einem
4-stündigen 3H- Leucinproteinsyntheseassay
getestet wurde. Die Ergebnisse sind in ähnlicher Weise dargeboten wie
oben in 7A.
-
Die in 7A und 7B dargestellten
Ergebnisse zeigen die kurzfristigen bzw. langfristigen Effekte von
RA, 2'RA-HS-NR-AN-01
und 13'RA-HS-NR-AN-01 auf die
Proteinsynthese durch HT29-Kontrollzellen. Die Ergebnisse zeigen
eine Dosis-Antworthemmung der zellulären Proteinsynthese durch freies
Roridin A, jedoch nicht durch RA-NR-AN-01 in HT29-ZeIIen. Die Hemmung,
die durch RA während
den 5 Minuten Inkubation ausgelöst
wurde, war nach den 16–18
Stunden Erholungsdauer (7B)
noch immer vorhanden. Im Gegensatz hierzu führte die Behandlung von Nichttarget
HT29-Zellen mit
2'RA-HS-NR-AN-01
oder 13'RA-HS-NR-AN-01
zu einer detektierbaren Hemmung der Proteinsynthese. Somit legen
diese Ergebnisse (im Gegensatz zu jenen, die über 24 Stunden hinweg erhalten
wurden) einen überraschenden
Grad an Spezifität
in der in vitro Wirkung der NR-AN-01-Konjugate nahe, wenn die Behandlung
in einem 5-minütigen "Puls" verabreicht wurde.
Jedoch war es auch möglich,
dass das NR-AN-01-Konjugat inaktiv war, sodass zusätzliche Experimente
durchgeführt
wurden, um den Effekt der Konjugate auf die Targetzellen auszuwerten.
-
7C zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die die Effekte darauf
untersuchen, A375 m/m marker-positive Zellen 5 Minuten unterschiedlichen
Konzentrationen von freiem RA (offene Quadrate, 7C), 2'RA-NR-AN-01 (geschlossene Quadrate, 7C) oder 13'RA-NR-AN-01 (geschlossene
Dreiecke, 7C) auszusetzen,
wie oben in Bezug auf 7A beschrieben.
In den vorliegenden Studien wurden die A375-Zellen für 5 Minuten
in einem Testwirkstoff inkubiert, gewaschen und auf Proteinsynthese über die nächsten 4
Stunden getestet, indem 0,5 mCi/ml 3H-Leucin zu dem Kulturmedium
hinzugefügt
wurde. Die Ergebnisse der Experimente sind in ähnlicher Weise aufgetragen,
wie sie oben in Bezug auf 7A beschrieben sind.
-
7D zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, welche die Effekte
darauf untersuchen, A375 m/ml marker-positive Zellen 5 Minuten
unterschiedlichen Konzentrationen von freiem RA (offene Quadrate, 7D), 2'RA-NRAN01 (geschlossene Quadrate, 7D), 13'RA-NRAN01 (geschlossene Dreiecke, 7D) auszusetzen, wie oben
in Bezug auf 7B beschrieben.
In den vorliegenden Studien wurden die A375-Zellen für 5 Minuten
in diem Testwirkstoff inkubiert, gewaschen und dann zu der Kultur
für eine 16–18-stündige Erholungsdauer
(d. h. über
Nacht; o/n) Erholung zurückgebracht,
wobei nach dieser Zeit die Proteinsynthese während eines 4-stündigen 3H-Leucinproteinsyntheseassays ausgewertet
wurde. Die Ergebnisse der Experimente sind in ähnlicher Weise aufgetragen,
wie sie oben in Bezug auf 7A beschrieben sind.
-
Die in den 7C und 7D dargestellten
Ergebnisse zeigen die kurzfristigen und langfristigen Effekte jeweils
ovn RA, 2'RA-HS-NR-AN-01
und 13'-RA-HS-NR-AN-01
auf die Proteinsynthese durch A375-Targetzellen. Die Behandlung
von Targetzellen mit entweder dem 2'- oder 13'RA-NR-AN-01 therapeutischen Konjugat
führte
zu einer kurzfristigen Hemmung der Proteinsynthese, d. h. beobachtet
unmittelbar nach der 5-minütigen
Pulsbehandlung (7C).
Diese Feststellungen, in Kombination mit den Feststellungen in 7A und 7B, oben, legen nahe, dass die RA-NR-AN-01-Konjugate
aktiv waren und dass sie spezifisch inhibitorisch für Targetzelten
waren, jedoch nicht für
Nichttargetzellen. Interessanterweise wurden, wenn "Puls"-behandelte Targetzellen
zur Kultur zurückgebracht
werden, keine langfristigen inhibitorischen Effekte beobachtet (7D). Die in den 7C und 7D dargestellten Ergebnisse zeigen wiederum,
dass Roridin A für
Testzellen nicht spezifisch inhibitorisch ist (d. h. in ähnlicher
Weise wie in 7A und 7B, oben) und dass deren
Effekt auf die Zellen auch nach einer 16–18-stündigen Erholungsdauer vorhanden
ist. Somit scheinen die spezifischen Effekte von RA-NR-AN-01-Konjugaten
auf die Targetzellen während
einer "Puls"-Behandlung eine
Eigenschaft des NR-AN-01-Bindungsproteins
zu sein.
-
Die Ergebnisse, die mit BO54 arteriellen
glatten Muskelzellen erhalten wurden, waren ähnlich wie jene, die mit den
obigen A375-Zellen erhalten wurden, d. h. freies Roridin A zeigte
eine Dosis-Antworthemmung der Proteinsynthese im Kurzzeitversuch
von gleich 60%, 66% und 90% Kontrolle bei 200 ng/ml, 100 ng/ml und 50
ng/ml; und im langfristigen Versuch waren die Effekte auf die Proteinsynthese
gleich 27%, 46% und 98% der Kontrolle bei den gleichen Dosierungen.
Im Gegensatz hierzu zeigte das 2'-
oder 13'RA-NR-ANA-01
nur eine 10–20%ige
Hemmung für
die kurz- odere langfristigen Effekte auf die Proteinsynthese (d.
h. > 80% der Kontrolle).
-
Somit zeigen die Ergebnisse einen
kurzfristigen spezifischen umkehrbaren Effekt des Roridin A-konjugierten
NR-AN-01 auf Targetzellen, wenn sie als "Puls"-Behandlung
verabreicht werden. Da jedoch nur die Proteinsynthese in diesen
Experimenten ausgewertet wurde, war es möglich, dass die zelluluäre metabolische Aktivität in den
Zellen als Ergebnis der "Puls"-Behandlung beeinträchtigt werden
könnte.
Daher wurden zusätzliche
Studien durchgeführt,
worin die zelluläre
metabolische Aktivität
nach einer "Puls"-Behandlung ausgewertet
wurde.
-
Effekte nach 5 Minuten
der Exposition: metabolische Aktivität
-
MTT-Assays wurden 48 Stunden ausgeführt, nachdem
Target- und Nichttargetzellen für
5 Minuten RA oder RA-NR-AN-01-Konjugaten ausgesetzt wurden. Die
Targetzellen in diesen Studien enthielten BO54- und A375- und die
Nichttargetzellen enthielten HT29-ZeIIen. Sterile 96 Well-Mikrotiterplatten
wurden mit 2500 Zellen/Well angesetzt, in Aluminiumfolie eingewickelt
und in einer feuchten Kammer, die 5% CO2/95%
Luft für 16–18 Stunden
inkubiert. Serielle zweifache Verdünnungen von Roridin A (RA),
2'RA-HS-NR-AN-01
und 13'RA-HS-NR-AN-01
wurden aus 400 ng/ml bis 780 pg/ml hergestellt, und 100 ml Aliquots
der Verdünnungen wurden
in doppelte Wells eingegeben. Nachdem die Testproben 5 Minuten ausgesetzt
waren, wurden die Zellen gewaschen, um die Testproben zu beseitigen,
und es wurde frisches Medium hinzugefügt. Die Zellen durften sich
48 Stunden vor dem Test erholen: D. h. die Platten wurden für 48 Stunden
inkubiert, und dann wurde die zelluläre metabolische Aktivität bestimmt,
indem 20 ml/Well einer 5 mg/ml MTT-Lösung hinzugefügt wurde. Die
Platten wurden abgedeckt und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert, und
dann wurde die Reaktion, wie oben beschrieben entwickelt (siehe
BEISPIEL 4, oben). Das dunkelblau gelöste Formazanreaktionsprodukt
wurde bei Raumtemperatur nach 16–18 Stunden Inkubation entwickelt.
Die Proben wurden mittels eines ELISA Mikrotiterplattenlesegeräts bei einer
Absorptions von 570 nm quantifiziert.
-
8A zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, welche die Effekte
darauf untersuchen, BO54 marker-positive glatte Muskelzellen 5 Minuten
unterschiedlichen Konzentrationen von Roridin A (offene Quadrate, 8A), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; geschlossene
Rauten, 8A) oder 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; geschlossene
Quadrate, 8A) auszusetzen.
Die Ergebnisse wurden in ähnlicher
Weise ausgeführt
wie oben in Bezug auf 7B beschrieben,
wobei aber die metabolische Aktivität durch einen MTT-Assay geprüft wurde,
d. h. anstatt der Proteinsynthese wie in 7B, und den Zellen wurden auch 48 Stunden
Erholung gegeben (anstatt 24 Stunden wie in 7B). Die Ergebnisse der Experimente
sind in ähnlicher
Weise aufgetragen wie jene, die (oben) in Bezug auf 7A beschrieben sind.
-
8B zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die die Effekte darauf
untersuchen, A375 m/m marker-positive Zellen für 5 Minuten unterschiedlichen
Konzentrationen von Roridin A (offene Quadrate, 8B), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; geschlossene
Rauten, 8B), 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; geschlossene
Quadrate, 8B) auszusetzen.
Die Experimente wurden in ähnlicher
Weise durchgeführt
(und die Ergebnisse aufgetragen) wie jene, die oben in Bezug auf 8A beschrieben sind.
-
8C zeigt
graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die die Effekte darauf
untersuchen, HT29 marker-negative Zellen für 5 Minuten unterschiedlichen
Konzentrationen von Roridin A (offene Quadrate, 8C), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; geschlossene
Rauten, 8C), 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; geschlossene
Quadrate, 8C) auszusetzen.
Die Experimente wurden in ähnlicher
Weise ausgeführt
(und die Ergebnisse aufgetragen) wie jene, die oben in Bezug auf 8A beschrieben sind.
-
Die in den 8A bis 8C dargestellten
Ergebnisse zeigen leichte Unterschiede zwischen den unterschiedlichen
RA-NR-AN-01-Konjugaten bei den höchsten
Dosen, wobei aber bei den geringeren Dosierungen das 2'- und 13'RA-NR-AN-01 die metabolischen
Aktivität
der Targeszellen (d. h. BO54 und A375) oder Nichttargetzellen (d.
h. HT29) über
die längere
Frist (d. h. 48 Stunden) nicht signifikant hemmte. Somit legen die Ergebnisse
nahe, dass die kurzfristige Hemmung der Targetzellproteinsynthese
(7C bis 7D, oben) nicht zu langfristigen metabolischen
Effekten auf die Zellen führt,
wie messbar in MTT-Assays. Dass diese Assays in der Lage waren,
metabolische Veränderungen
in den Zellen infolge einer 5-minütigen Exposition zu detektieren,
ergibt sich aus den Resultaten, die mit freiem Roridin erhalten
wurden. In diesem Fall war freies Roridin A für Target- und Nichttargetzelltypen
nicht spezifisch hemmend, auch wenn die Zellen dem Wirkstoff für nur 5
Minuten ausgesetzt wurden und dann zur Kultur für die 48-stündige Erholungsdauer zurückgebracht
wurden (8A bis 8C).
-
Somit legen die Feststellungen mit
freiem Roridin A nahe, dass MTT-Assay in der Lage war, metabolische
Veränderungen
zu erfassen, die während
einer 5-minütigen Einwirkung
induziert wurden. Zusammengenommen legen diese Feststellungen nahe,
dass die RA-NR-AN-01-Konjugate die Targezellaktivität spezifisch
hemmen können
(d. h. die Proteinsynthese), wenn sie in einer "Puls"-Behandlung
verabreicht werden, und dass diese Effekte reversibel waren, ohne
signifikante langfristige Effekte auf entweder die Proteinsynthese
oder die zelluläre
metabolische Aktivität
(gemessen in einem MTT-Assay). Diese in vitro Eigenschaften von RA-NR-AN-01-Konjugaten
wurden als hochnützlich
für die
Hemmung der Glatten-Muskelzellaktivität in vivo bewertet.
-
Daher wurden als Nächstes Tiermodellstudien
durchgeführt,
um die Effekte dieser therapeutischen Konjugate in vivo auszuwerten.
-
BEISPIEL 6
-
Bestimmung
der Infusionsbedingungen in einem Tiermodell
-
Die therapeutischen Konjugate der
Erfindung sind nutzbar, um eine Stenose nach einem Gefäßtrauma oder
einer Gefäßerkrankung
zu hemmen. In einem illustrativen Beispiel wird ein Gefäßtrauma,
das während Angioplastik
induziert wird, während
der operativen Prozedur behandelt, indem der Katheter entfernt wird,
der zur Durchführung
der Angioplastik verwendet wird, und indem ein Balloninfusionskatheter
in das Gefäß eingeführt wird.
Der Infusionskatheter wird mit der Eintröpfelöffnung (oder alternativ einem
permeablen Membranbereich) in dem traumatisierten Bereich des Gefäßes positioniert
und dann wird Druck angelegt, um das therapeutische Konjugat einzuführen. Z.
B. kann ein Infusionskatheter mit zwei Ballonen angewendet werden,
und wenn ein Ballon jederseits des Verletzungsorts aufgepumpt wird,
entsteht ein Fluidraum, der mit einem geeigneten Infusionsfluid
gefüllt
werden kann, das das therapeutische Konjugat enthält. Es ist
früher
berichtet worden, dass die Infusion von Meerrettichperoxidase (HRP)
Markerenzym bei einem Druck von 300 mmHg über 45 Sekunden in Hund- oder
Menschen-Coronararterien dazu führte,
dass das HRP in die Gefäßwand eindringt (6).
Jedoch ist HRP ein kleineres Molekül als NR-AN-01, und Menschen-
und Hunde-Coronararterien sind auch beträchtlich kleiner als die Carotis-
oder Femoralarterien in dem vorliegenden Hausschwein-Modellsystem.
Es wurden daher Experimente ausgeführt, um in einem Hausschwein-Modellsystem
die Infusionsbedingungen zu bestimmen, die zum Verabreichen eines
therapeutischen Konjugats zu den glatten Gefäßmuskelzellen in Carotis- und
Femoralarterien geeignet sind. Die Verabreichungsbedingungen wurden überwacht,
indem das Eindringen des therapeutischen Konjugats in die Gefäßwand sowie
die spezifische Bindung des therapeutischen Konjugats an die glatten
Gefäßmuskelzellen
in der Gefäßwand ausgewertet
wurden.
-
Unter Verwendung eines Infusionskatheters
wurden die Coronar- und Femoralarterien von Hausschweinen oder nicht-menschlichen
Primaten mit NR-AN-01 für
45 Sekunden bis 3 Minuten bei mehreren Drücken im Bereich von etwa 0,4
Atmosphären
(300 mmHg) bis 3 Atmosphären
infundiert. Nach der Infusion wurden die Gefäße mit steriler Salzlösung gespült und immunohistochemisch
präpariert,
unter Verwendung von HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG, um das
NR-AN-01-Maus-IgG in der Gefäßwand zu
detektieren. Es wurde bestimmt, dass eine volle Durchdringung von
NR-AN-01 in die Gefäßwände bei
einem Druck von 3 Atmosphären
nach 3 Minuten erreicht wurden.
-
Es wurd auch Immunohistologie angewendet,
um zu bestimmen, welche Tiermodellsysteme das Targetantigen für NR-AN-01
exprimiert hatten. Gefäßgewebeschnitte
von leicht verfügbaren
Versuchstierarten wurden NR-AN-01
ausgesetzt, gewaschen und mit HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG in Reaktion gebracht.
Es stellte sich heraus, dass nur nicht-menschliche Primaten und
Schweine sich 250 kD NR-AN-01 Targetantigen mit dem Menschen teilen.
-
Um zu bestimmen, ob NR-AN-01 in spezifischer
Weise an sein Targetantigen in vivo binden könnte, wurden die Coronar- und
Femoralarterien von Hausschweinen mit therapeutischen Konjugaten
mittels eines Infusionskatheters infundiert, wurden die Infusionsstellen
mit steriler Salzlösung
gespült
und dann wurden die Operationsstellen geschlossen, und die Tiere
wurden für
zusätzliche
3–5 Tage
gehalten. Am Ende dieser Zeit wurden die Gefäßinfusionsstellen herausgenommen
und zur Immunohistologie präpariert,
wiederum unter Verwendung von Ziegen-anti-Maus-IgG, um NR-AN-01 zu identifizieren.
NR-AN-01 wurde in der Gefäßwand von
Schweinecoronar- und -femoralarterien 3–5 Tage nach der Operation
identifiziert, und es erschien, dass NR-AN-01 nur glatten Gefäßmuskelzellen
assoziiert war. Diese Feststellungen legen nahe, dass NR-AN-01 in der
Lage ist, spezifisch an sein Targetantigen in vivo zu binden.
-
BEISPIEL 7
-
Hemmung glatter Gefäßmuskelzellen
in vivo
-
Die intimale Glatte-Muskelproliferation,
die einem Ballonkatheter-induzierten Trauma folgt, ist ein gutes
Modell, um die therapeutische Wirksamkeit von Konjugaten zur Hemmung
der Glatten-Muskelzellaktivität in
vivo in Antwort auf ein Gefäßtrauma,
einschließlich
Restenose nach Angioplastik, auszuwerten. Hausschweine wurden angewendet,
um die Effekte von NR-AN-01 zu untersuchen (d. h. in diesen Studien
als Glattes-Gefäßmuskelbindungsprotein
oder einfach VSMBP bezeichnet; und die therapeutischen Konjugate
mit Roridin A sind mit VSMBP-RA bezeichnet). Die Ereignisse, die
normalerweise einer Ballonangioplastik in der Schweinearterie folgen,
sind zuvor beschrieben worden (12). In diesen Studien führte die
Dilatation der Caortisarterie mittels eines übergroßen Ballons (Ballon : Arterienverhältnis angenähert 1,5
: 1) in einer kompletten endothelialen Denudation über einen
Bereich von 1,5–2
cm Länge.
Obwohl diese Länge
der traumatischen Verletzung im Versuch ausgewählt wurde, eine Thrombose zu
minimieren, gab es noch immer eine merkliche Plättchenablagerung und Thrombusbildung.
Die Prozdur resultierte auch in einer Dissektion durch die interne elastische
Schicht in die artielle Media und Necrose der medialen glatten Muskelzellen.
Eine Intimaverdickung aufgrund der glatten Muskelproliferation erschien
7 Tage nach der Verletzung und erreichte eine mittlere maximale
Dicke von 85 mm nach 14 Tagen. Das histologische Bild dieser Neointima
ist sehr ähnlich
dem proliferativen neointimalen Gewebe einer humanen Restenose (13).
-
Es wurde ein Einzeldosis-Testprotokoll
in Hausschweinen mit NR-AN-01-Roridin
A-Konjugaten durchgeführt.
Eine lokalisierte Verabreichung der Testkonjugate, d. h. durch einen
Katheter in einen Bereich eines traumatisierten Gefäßes, das
durch temporäre
Schlupfligaturen begrenzt wurde, war ausgestaltet, um die systemische
Toxizität
zu reduzieren, während
für einen
hohen Pegel dafür
gesorgt wurde, die glatten Targetmuskelzellen auszusetzen. Dieser
intraarterielle Verabreichungsweg in Tiermodellstudien simuliert
die vorgeschlagene Route in humanen Coronararterien. Das Testprotokoll
war ausgestaltet als initiales in vivo Screening von intraarteriolaren,
ortsspezifischen, katheterverabreichten, glatten Gefäßmuskelbindungsprotein (VSMBP)-Konjugaten.
-
Die Toxizität des freien Medikaments wurde
auch ausgewertet, d. h. für
pathobiologische Effekte auf arteriolare glatte Muskelzellen. Die
therapeutisch wirksame Dosis von Roridin A-NR-AN-01-Konjugat wurde durch
in vitro Studien bestimmt, und der richtige intraarteriolare Verabreichungsdruck
wurde bestimmt, indem freie MAb- und Mab-Konjugate Tieren verabreicht
wurde, wie oben in BEISPIEL 7 beschrieben.
-
Sechs Mischlings-Hausschweine (Duroc
X), entwöhnte
Ferkel von angenähert
30 Pfund Körpergewicht,
wurden in dem Experiment verwendet. Die Tiere wurden nach Zufall
dem folgenden Behandlungsregime zugeordnet, wobei jedes Schwein
vier unterschiedliche Behandlungen hatte, aufgeteilt zwischen den
rechten und linken Caortis- und Femoralarterien, deren eine eine
PBS-Kontrolle war
(Tabellen 1–3,
unten).
-
-
Operative Prozedur:
-
Testkonjugate und Kontrollverbindungen
wurden als einzel-intraarterielle Infusion am Ort der endothelialen
Denudierung und des Traumas, induziert durch einen Ballonkatheter,
verabreicht. Beide carotiden und femoralen Arterien wurden über 1 cm
bis 2 cm Endothel durch intraluminale Passage eines 23 cm, Größe 3 (femoral)
und Größe 4 (carotid)
Uresil Vascu-Flo® Silikonverschlussballonkatheters
(Uresil Technology Center, Skokie, IL) abgeschliffen, ausreichend
mit Salzlösung
gedehnt, um einen leichten Widerstand zu erzeugen. Diese Technik
erzeugte eine leichte Dehnung der Arterie. Nach dieser Behandlung
wurden proximate und distale Schlupfligaturen, 3-0 Seide, nahe den
Enden des abgeschliffenen Bereichs platziert, und ein Größe 8 French
Infant Feeding Katheter (Cutter-Resiflex, Berkeley, CA), der an
einer Inflation Pro® (USCI, C. R. Bard, Inc.,
Billerica, MA) Druckspritze angebracht war, wurde verwendet, um
die Testkonjugate und die Kontrollverbindungen direkt zu dem denudierten
Segment bei einem Druck von 3 Atmosphären für 3 Minuten zu verabreichen.
Die Schlupfligaturen wurden nach der 3-minütigen Aussetzdauer und der
Wiederherstellung der arteriellen Bluflusses entfernt. In diesen
Studien wurden Zweige der Femoral- oder Carotisarterien mit einer
00 Seidennaht ligiert, um eine Druckinfusion in dem behandelten
Bereich zu erreichen. Der größte distale
Zweig der Femoralarterie (der Saphena-Arterie) wurde eingeschnitten
und als Eintrittsort für
die Katheter verwendet, die dann in die Hauptfemoralarterie eingeführt wurden.
Nach dieser Katheterisierungsprozedur in der Hauptfemoralarterie
wurde der sekundäre
Zweig ligiert. In diesen Fällen
wurde Ligation oder Inzision verwendet, um den Eintritt der Katheter
zu erlauben, und die Öffnung
wurde dann mit 3 bis 4 Nähten
aus 5-0 Monosilamen-Polybutester (Novafil, D & G Monofil Inc., Monati, PR) verschlossen.
-
Nachfolgende Prozeduren:
-
Nach der Operation wurden die Schweine
während
der Quarantäne
und Operationserholungsdauern in 3 × 5 Fuß Innenlaufställen mit
Zementböden
gehalten. Sie wurden dann für
den Rest der 5-wöchigen
Heilungsdauer vor dem Sammeln der Gewebe zur Histologie zu Innen/Außenlaufställen transferiert.
Die Tiere erholten sich von der Operation normal, ohne Evidenz einer
Blutung oder Entzündung
an den Operationsstellen. Alle sechs Tiere wurden 5 bis 6 Tage nach
der Behandlung mit einem Dopplerstethoskop untersucht, und in jedem
der Tiere waren alle Arterien durchgängig. Nach der Behandlung hatten
alle Tiere einen normalen Appetit, normale Aktivität und normale
Gewichtszunahme.
-
Makroskopische pathologische
und histologische Auswertung:
-
Fünf
Wochen nach der Traumatisierung und Behandlung der Arterien wurden
die Tiere mit 0,6 ml Telazol® (Tiletaminhydrochlorid;
A. H. Robins Co., Richmond, VA) und 0,5 ml Xylazin (Lloyd Laboratories,
Shenandoah, IA) pro 30 Pfund Körpergewicht
durch intramuskulare Injektion sediert, heparinisiert (i.v. 2 ml
Natriumheparin, 1000 Einheiten/ml) und durch i.v. Pentobarbital
euthanasiert. Es wurden beide rechten und linken Carotis- und Femoralarterien
entfernt, wobei das normale Gefäß sowohl
das proximale als auch das distale bis zum behandelten Segment enthielt.
Die Arterien wurden gemessen und der Ort der Ligaturen und allgemeine Abnormalitäten wurden
notiert. Die Arterien wurden mit 2 mm Abständen durch Schnitte und in
der Reihenfolge in Cryoform mit O.C.T (optimaler Schneidtemperatur)
Verbindung (Tissue Tek®, Miles Laboratories Inc.,
Elkhart, IN) angeordnet und in flüssigem Stickstoff gefroren.
Die Blöcke
wurden auf 5 um geschnitten und mit H/E, Massons Trichrome und Movats
Pentachrome für
morphologische Untersuchungen gefärbt. Die Schnitte wurden auch
für die
immunohistologische Färbung
von glattem Gefäßmuskel
verwendet.
-
Die histologische Untersuchung der
Stufenschnitte der Arterien ergab eine merkliche Hemmung der intimalen
Glatten-Muskelproliferation in den Bereichen, die traumatisiert
und mit RA-NR-AN-01-Konjugaten behandelt waren (Tabelle 2). Diese
Hemmung war auch in der submakroskopischen Auswertung der Gefäße evident.
Die Hemmung der intimalen Glatten-Gefäßmuskelproliferation
wrude mit minimaler oder keiner histologischen Evidenz des Glatten-Muskelzelltodes
in der Arterienwand erzeugt. Ein Querschnitt einer solchen traumatisierten
Arterie ist in den 9A und 9B angegeben.
-
Tabelle
2
INTIMALE GLATTE GEFÄßMUSKELPROLIFERATION
IN TRAUMATISIERTEN UND BEHANDELTEN SCHWEINEARTERIEN
-
Die in 9A dargestellten Ergebnisse zeigen (bei
160-facher Vergrößerung)
einen Querschnitt einer unbehandelten Arterie 5 Wochen
nach Angioplastik. Dominante histologische Merkmale der Arterie
enthalten eine Verlagerung des Endothels (siehe #1 in 9A) von der internen elastischen
Schicht weg (sieh #2, 9A),
scheinbar aufgrund der intimalen Glatten-Muskelproliferation (siehe
#3, 9A).
-
Die in 9B dargestellten Ergebnisse zeigen (bei
160-facher Vergrößerung)
einen Querschnitt einer behandelten Arterie 5 Wochen nach Angioplastik
und Infusion des therapeutischen RA-NR-AN-01-Konjugats. Das Gefäß in diesem
Schnitt wurde größeren mechanischen
Belastungen unterzogen als das in 9A gezeigte
Gefäß, mit mehreren
Stellen, wo die externe elastische Membran riss, und es wurde eine
zugeordnete Proliferation glatter Muskelzellen in den äußeren Schichten
der Media beobachtet (siehe #4 in 9B).
Die Behandlung mit therapeutischem Konjugat hemmte die intimate
Hypertrophie, wie sich aus dem Fehlen der Verlagerung des Endothels
(siehe #1, 9B) von
der internen elastischen Schicht (siehe #2, 9B) ergibt. Überraschenderweise wurde dieser
inhibitorische Effekt auf die intimalen glatten Muskelzellen erreicht,
ohne die Hypertrophie der medialen glatten Muskelzellen in Bereichen
zu hemmen, wo die externe elastische Membran gerissen war (siehe
#4, 9B).
-
Dies ist ein besonders glückliches
Ergebnis, weil die Wundheilung in dem behandelten Gefäß fortschreitet,
ohne nachteilige Konsequenzen der Intimahyperplasie und Stenose
oder Nekrose glatter Muskelzellen in der Media.
-
In diesen histologischen Studien
wurden auch Vergleiche der Wirksamkeit sowohl des 2'- als auch 13'-Roridin A-Konjugats
durchgeführt,
mit der Feststellung, dass das 13'-Konjugat (d. h. 13'RA-HS-NR-AN-01) stärker aktiv bei der Hemmung
der intimalen Hyperplasie der glatten Muskelzellen erschien als
das 2'-Konjugat (d.
h. 2'RA-HS-NR-AN-01).
In dieser Studie schien die Niederdruckinfusion des 13'-Konjugats die glatte
Muskelzellproliferation effizienter zu hemmen als der hohe Druck,
und auch das 13'-Konjugat
schien effizienter zu sein als das 2'-Konjugat.
-
In 9B führte das
therapeutische Konjugat, das am Ort nach Angioplastik verabreicht
wurde, in einer angenähert
95%igen Hemmung der Glatten-Muskelhypertrophie,
die das Lumen des unbehandelten Gefäßes einschränkte (9A). Das therapeutische Konjugat übte signifikant
seine Effekte auf die glatten Muskelzellen aus, die von den medialen
glatten Muskelschichten in die Intima wandern, ohne das Endothel
zu beeinträchtigen
noch irgend welche Anzeichen von Nekrose (d. h. Zelltod) in den
glatten Muskelzellen in den medialen Schichten der Arterienwand
zu erzeugen. Die Studien zeigten auch keinerlei histologische Anzeichen einer
mononuklearen Infiltration oder Fibrose, die aus toxischen Effekten
auf die Gefäßwand resultieren
könnten.
Auch wurden sichtbare Anzeichen der Heilung in den intimalen Schichten
behandelter Gefäße beobachtet, und
mit beobachtetem Nachwachstum des Endothels, d. h. Endothelzellen,
die über
die dünne
Schicht glatter Muskelzellen in der Intima hinweg wachsen, die zwischen
dem Endothel und der internen elastischen Schicht liegen (d. h.
#1 und #2 in 9B). Diese
kombinierten histologischen Beobachtungen belegen die hocherwünschten
Merkmale der Wundheilung, des Neuwachstums von Endothel und einer
verbesserten Gefäßstabilität nach einer
Behandlung mit einem therapeutischen Konjugat, das Glatte-Muskelhyperplasie
in den intimalen Schichten des Gefäßes hemmt.
-
BEISPIEL 8
-
Glatte-Gefäßmuskelzell-in
vitro-DNA- und Proteinsynthesehemmung
-
Die Fähigkeit verschiedener therapeutischer
Wirkstoffe, die DNA-Synthese und Proteinsynthese in glatten Gefäßmuskelzellen
zu hemmen, wurde getestet. 3H-Thymidinaufnahme und Cytotoxizitätsassays
wurden gemäß den folgenden
Protokollen durchgeführt.
-
5-Minuten-Exposition: 3H-Leucinaufnahme:
-
Glatte Gefäßmuskelzellen wurden mit 40.000
Zellen/ml in sterile 24 Wellplatten mit 1 mlM/ell angesetzt. Die
Platten wurden über
Nacht bei 37°C,
5% CO2, 95 Luft in einer angefeuchteten
Atmosphäre
(Sättigung)
inkubiert. Logarithmische Verdünnungen
des interessierenden therapeutischen Wirkstoffs wurden mit glatten
Gefäßmuskelzellen
für 5 Minuten
oder 24 Stunden inkubiert. Proben der therapeutischen Wirkstoffe wurden
in DMEM F-12 Medium (Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland)
mit 5%igem fötalem
Rinderserum (FBS, Gibco BRL, Gaithersbur, MD) und 5% Serum Plus® (JRH
Biosciences, Lenexa, KS) verdünnt. Nach
der Inkubation mit therapeutischem Wirkstoff wurde die Lösung abgesaugt,
und es wurde 1 ml/Well von 0,5 Mikrocurie/ml 3N-Leucin
in leucinfreiem DMEM (Dulbecco's
Modified Eagle's
Medium) mit 5% Serum Plus® hinzugefügt. Die
Platten wurden über
Nacht bei 37°C,
5% CO2 in angefeuchteter Atmosphäre nachinkubiert. Die
Zellen wurden visuell mittels eines Umkehrmikroskops unter Verwendung
einer Bewertungsskala eingeteilt, um die Lebensfähigkeit und Zellzahl zu bestimmen.
Die 1 bis 3 Einteilung basiert auf dem Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit
und der Anzahl im Vergleich zu Kontrollwells, wobei 3 = 100%, 2
= 70% bis 100% und 1 = 0% bis 70%. Eine Aufzeichnung dieser Bewertung
unterstützte
die Bestimmung des unmittelbaren cytotoxischen Effekts der therapeutischen
Wirkstoffe. Das Medium wurde dann abgesaugt, und die Zellen wurden
zwei Mal mit kaltem 5%igem TCA gewaschen. 400 Mikroliter 0,2 M NaOH
wurden pro Well hinzugefügt,
und die Platten wurden für
2 Stunden bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Plattform inkubiert.
200 Mikroliter/Well der Zelllösung
wurden in Kunststoffszintillationsfläschchen überführt (Bio-Rad Laboratories),
und 4 Milliliter Bio-Safe® II flüssige Szintillationsflüssigkeit
(Research Products InterCorp. Mount Prospect, IL) wurden vor dem
Umrühren
hinzugefügt.
Die Fläschchen
wurden an einem Beckman LS2800 Flüssigszintillationszähler gezählt, Schnittstelle
mit Beckman "Data
Capture" Software
zur Umwandlung in eine Lotus 1-2-3® Datei
und Analyse mittels Lotus 1-2-3®.
-
5-Minuten Exposition: 3H-Thymidinaufnahme:
-
Glatte Gefäßmuskelzellen wurden in einem
vollständigen
Medium mit 5% FBS (Gibco) über
Nacht bei 37°C
in einer angefeuchteten 5%igen CO2-Umgebung
in sterilen 24 Wellplatten inkubiert. Das Medium wurde von den Wells
abgesaugt, und serumfreies Medium wurde hinzugefügt, ergänzt mit Wachstumsfaktoren (DMEM
: F12 Grundmedium, ergänzt
mit einem Wachstumsfaktorcocktail, Katalognummer 11884, welches enthält Insulin
(5 Mikrogramm/ml), Transferrin (5 Mikrogramm/ml) und Natriumselenit
(5 Nanogramm/ml), erhältlich
bei Sigma Chemical, St. Louis; Missouri). Die Zellen wurden in diesem
Medium für
24 Stunden inkubiert. Für
eine 5-minütige
Exposition einem therapeutischen Wirkstoff wurden logarithmische
Verdünnungen des
therapeutischen Wirkstoffs mit den Zellen in komplettem Medium inkubiert.
Nach 5 Minuten und Absaugen des Mediums wurden 1 ml/Well von 1,0
Mikrocurie/ml 3H-Thymidin, dispergiert in
komplettem Medium, hinzugefügt.
Die 24-stündige
Exposition involvierte die Inkubation der Zellen mit 1 ml/Well von
1,0 Mikrocurie/ml von 3H-Thymidin, dispergiert
in einem kompletten Medium, und es wurden logarithmische Verdünnungen
des therapeutischen Wirkstoffs getestet. In beiden Expositions-Versuchen
wurden die Zellen über
Nacht bei 37°C
in einer angefeuchteten 5%igen CO2-Umgebung behandelt.
Die Zellen wurden auf Lebensfähigkeit
und Zellzahl visuell bewertet. Die Zellen wurden gewaschen und präpariert,
um sie in Kunststoffszintillationsfläschchen zu überführen, wie für das 3H-Leucinprotokoll
beschrieben. Die Fläschchen
wurden an einem Beckman LS2800 Flüssigszintillationszähler gezählt, mit
Schnittstelle zu Beckman "Data
Capture" Software
zur Umwandlung in eine Lotus 1-2-3® Datei
und Analyse mittels Lotus 1-2-3®.
-
Diese Protokolle sind zur Verwendung
mit anderen Targetzellpopulationen geeignet, insbesondere adhärenten einschichtigen
Zelltypen.
-
Morphologische Auswertung
der Cytotoxizität-Puls-Exposition:
-
Glatte Gefäßmuskelzellen wurden mit 4,0 × 104 Zellen/ml Medium/Well auf einem kommerziell
vorbereiteten Vierwellobjektträger
(Nunc. Inc., Naperville, Illinois) angesetzt. Es wurden ausreichend
Objektträger angesetzt,
um zwei gepulste Expositionsdauern (5 Minuten und 24 Stunden) sowie
eine vorgeschriebene Stufung von Auswertungspunkten (24 Stunden
bis 128 Stunden) aufzunehmen. Alle Objektträger wurden doppelt gefahren,
um etwaige Assayanomalien zu entdecken. Der therapeutische Wirkstoff
wurde in dem gleichen Medium verdünnt, das in den 3H-Leucin-
und 3H-Thymidinassays benutzt wurde. Jeder
Vierwellobjektträger
wurde konzentrationsmäßig gruppiert,
zu einer log-größeren Konzentration
(Welt "B"), einer log-niedrigeren Konzentration
(Welt "D"), der minimalen
wirksamen Konzentration (Weil "C"), bestimmt durch
die 3H-Leucin- und 3H-Thymidinassays, wie oben beschrieben. Als
Kontrolle für
normale Morphologie wurde ein Well (Weil "A") unbehandelt
belassen (nur Medium). Die Inkubation erfolgte in einem 37°C, 5 % CO2 befeuchteten Inkubator. Nach jeweils zwei
(5 Minuten und 24 Stunden) Expositionspunkten wurde das therapeutische
Wirkstoffmedium aus jedem Well abgesaugt, einschließlich dem
unbehandelten Well. Dann wurde 1 ml frisches Medium hinzugefügt, um das
abgesaugte Medium zu ersetzen. Die Reinkubation erfolgte, bis jeder
der gestuften Auswertungspunkte erreicht wurde. An diesen Punkten
wurde das Medium abgesaugt und anschließend durch 1 ml 10%igem neutral
gepufferten Formalin für
1 Stunde ersetzt, um die richtige Fixierung zu erlauben. Diese fixierten
Objektträger
wurden in Hematoxylin (nuklear) und Eosin (cytoplasmatisch) zur
morphologischen Auswertung und Einteilung gefärbt.
-
Ergebnisse:
-
Die Ergebnisse des 24-Stunden 3H-Leucin-Proteinhemmassays und des 24-Stunden 3H-Thymidin-DNA-Synthesehemmassays
sind in den 10A– 10D für Suramin, Staurosporin, Nitroglycerin
bzw. Cytochalasin B gezeigt. Alle der getesteten Verbindungen zeigten
einen verfügbaren
therapeutischen Bereich (die Fläche
unter der Kurve des 3H-Leucin-Assays ist
größer als
jene, die von dem 3H-Thymidin-Assay herrührt), was
die Nutzbarkeit in der Praxis von Dauerfreigabe-Dosierungsformausführungen
der vorliegenden Erfindung anzeigt. Insbesondere hemmten die Verbindungen
die Fähigkeit
glatter Gefäßmuskelzellen,
einer DNA-Synthese zu unterliegen, in der Gegenwart von 5% FPS um
ein größeres Ausmaß als sie
die Proteinsynthese glatter Gefäßmuskelzellen
hemmten. Die Protein- und DNA-Synthesehemmeffekte von Suramin, Staurosporin,
Nitroglycerin und Cytochalasin B während einer 5-minütigen und
24-stündigen
gepulsten Exposition sind jeweils in 10A–D gezeigt.
-
BEISPIEL 9
-
Spezifische
Bindung und Internalisierung von targetisierten Partikeln durch
glatte Gefäßmuskelzellen
-
Die Fähigkeit glatter Gefäßmuskelzellen,
an mit Bindungsprotein oder -peptid beschichtete Partikel zu binden
oder diese zu internalisieren, wurde mit monoklonalem Antikörper (NR-AN-01)
beschichteten Goldperlen sowol in vitro als auch in vivo demonstriert.
Die Glatten-Gefäßmuskelzell-Gewebekulturen
(BO54), eine antigenpositive Kontrollzelllinie (A375) sowie eine
antigennegative Kontrollzelllinie (HT29) wurden mit 10 nm Goldperlen
inkubiert, mit einer Gruppe, die mit NR-AN-01 beschichtet war, und
einer zweiten unbeschichteten Kontrollgruppe. Diese Zellen wurden
den Perlen als einschichtige und Zellsuspensionskulturen ausgesetzt, und
wurden auf Bindung und Internalisierung durch Elektronenmikroskopie
zu sechs Zeitpunkten überprüft (d. h.
1 Minute, 5 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 50 Minuten und 24 Stunden).
-
Tabelle 3 zeigt diese Ergebnisse
der Experimente, was anzeigt, dass die Bindung an die Zelloberfläche spezifisch
ist. Das relative Einteilungssystem, das in Tabelle 3 insgesamt
angewendet wurde, repräsentiert eine
subjektive Bewertung der Partikelbindung, worin 0 = keine, 1 = minimal,
2 = mäßig, 3 =
moderat und 4 = deutlich. Wenn sich Partikelaggregate auf der einschichtigen
Oberfläche
sowohl der glatten Muskelzellen als auch der Kontrollzellen ansiedelten,
wurden die Partikel durch Makro- und Mikrophagocytose nicht spezifisch internalisiert.
Wenn die Zellen in der Zellsuspension verblieben, war die nicht
spezifische Internalisierung minimal oder fehlte. Das nicht spezifσsche Anhaften
der Goldperlen ohne NR-AN-01 auf dem von HT29-ZeIIen erzeugten Oberflächenmucin
wurde beobachtet, was zur mäßigsten
nicht spezifischen Internalisierung davon führte. Die Glatte-Gefäßmuskel-Aufnahme
von NR-AN-01 targetisierten
Goldperlen war in Zellsuspensionskulturen hochspezifisch.
-
-
-
-
11 zeigt
einen tangentialen Schnitt parallel zur Innenoberfläche einer
glatten Muskelzelle, gekennzeichnet durch zahlreiche endocytische
Vesikel, von denen einige antikörperbeschichtete
Goldperlen enthalten, im Prozess der Internalisierung durch die
Zelle. Diese endocytischen Vesikel mit an Zelloberflächenantigenen
haftenden Partikeln wurden zur Verschmelzung mit Lysosomen angeregt,
mit einer höheren
als der erwarteten Rate für
den normalen Zelloberflächenmembranumsatz.
Die resultierende merkliche Ansammlung internalisierter Partikel
wurde an dem 24-stündigen
Zeitpunkt beobachtet und ist in 12 gezeigt.
-
Die targetisierte Goldperlen-Glatte-Gefäßmuskelzell-Oberflächenbindung,
Internalisierung und Lysosomenkonzentration wurde auch in vivo beobachtet.
NR-AN-01-beschichtete Goldperlen wurden über einen intravaskulären Katheter
infundiert, offenendig mit einem behandelten Bereich, der proximal
und distal mit Schlupfligaturen verschlossen war, bei 3 atm Druck
angelegt für
3 Minuten in die Wand einer Schweinefemoralarterie unmittelbar nach
einem Ballontrauma. Die Perleninternalisierungsrate variierte mit
dem Grad der Beschädigung,
der während
des Ballontraumas von der glatten Gefäßmuskelzelle gehalten wurde.
Zellen mit minimaler oder keiner Beschädigung internalisierten die
Partikel durch Endocytose und Phagocytose schnell, wobei die internalisierten
Partikel in Lysosomen konzentriert wurden.
-
Zellen, die durch das Trauma getötet wurden,
zeigten eine Oberflächenperlenbinden.
Zellen, die durch das Trauma beschädigt wurden, jedoch überlebten,
waren durch Perlenoberflächenbindung
mit verzögerter
Internalisierung und Lysosomenkonzentration gekennzeichnet. 13 zeigt die Partikelkonzentration
in Lysosomen in vivo eine Woche nach Verabreichung der Perlen.
-
BEISPIEL 10
-
Glatte Gefäßmuskel
in vitro DNA- und Proteinsynthesehemmung durch Staurosporin und
Cytochalasin
-
Die Fähigkeit von Staurosporin und
Cytochalasin, DNA- und Proteinsynthese in glatten Gefäßmuskelzellen
in vitro zu hemmen, wurde getestet. 3H-Leucin- und 3H-Thymidinaufnahme
und Cytotoxizitätsassays wurden
gemäß den folgenden
Protokollen durchgeführt.
-
Kulturzellen:
-
B054-Zellen (glatte Gefäßmuskelzellen
vom Pavian) wurden von Explantaten von Aorta-Glatten-Gefäßmuskelzellen
vom Pavian erhalten. Die Zellen wurden in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium): F-12 Medium
(Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland) mit 5% fötalem Rinderserum
(FBS, Gibco) und 5% Serum Plus® ("komplettes Medium") ausgebreitet, und
eine Ansatzmenge von Zellen wurde im flüssigen Stickstoff zur künftigen
Verwendung in Durchlauf sieben gefroren.
-
5 Minuten-Exposition:
Proteinsyntheseassay:
-
Glatte Gefäßmuskelzellen mit 40.000–50.000
Zellen/ml wurden angesetzt und bearbeitet, wie in BEISPIEL 8 beschrieben, "5 Minuten Exposition; 3H-Leucinaufnahme". Logarithmische
Verdünnungen
von Staurosporin (200 ng/ml, 20 ng/ml, 2 ng/ml, 0,2 ng/ml und 0,02
ng/ml) wurden im kompletten Medium verteilt. Für Cytochalasin B wurden log-Verdünnungen
mit 20 μg/ml,
2,0 μg/ml,
0,2 μg/ml,
0,02 μg/ml
und 0,002 μg/ml
im kompletten Medium verteilt. Das komplette Medium wurde dann zu
den Kontrollwells gegeben. Ein ml/Well jeder therapeutischen Wirkstoffverdünnung wurde
in Vierfachwells gegeben, und der interessierende Wirkstoff wurde
mit den glatten Gefäßmuskelzellen
für 5 Minuten
bei Raumtemperatur in einer steril gelüfteten Haube inkubiert. Nach
der Inkubation des therapeutischen Wirkstoffs wurden die Wells anschließend so
behandelt, wie in BEISPIEL 8 beschrieben, "5 Minuten Exposition; 3H-Leucinaufnahme".
-
5 Minuten Exposition:
DNA-Syntheseassay:
-
Glatte Gefäßmuskel (BO54) Zellen wurden
in 24 Wellplatten ausgesetzt und verarbeitet, wie oben beschrieben,
unter "5 Minuten
Exposition: Proteinsyntheseassay".
Nach 5 Minuten Inkubation mit dem therapeutischen Testwirkstoff
wurde das Medium abgesaugt, und 1 ml/Well von 1,0 μCi/ml 3H-Thymidin
(anstatt von 3H-Leucin), dispergiert im
kompletten Medium, wurde hinzugefügt. Die Zellen wurden dann über Nacht
bei 37°C
in einer feuchten 5 % CO2 Umgebung inkubiert.
Der toxische Effekt des therapeutischen Wirkstoffs wurde dann bestimmt,
wie oben in dem Proteinsyntheseassay beschrieben.
-
24 und 120 Stunden Exposition:
Proteinsyntheseassay:
-
Glatte Gefäßmuskel (BO54) Zellen mit 20.000
Zellen/ml wurden in sterilen 24 Wellplatten angesetzt und im kompletten
Medium (1 ml/Well) über
Nacht bei 37°C,
5% CO2, 95% Luft in einer feuchten Atmosphäre (Sättigung)
inkubiert. Log-Verdünnungen
von Staurosporin (100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml und 0,01 ng/ml)
wurden sequenziell in den zwei Medien verteilt, wie oben beschrieben.
Für Cytochalasin
B wurden log-Verdünnungen
mit 10 μg/ml,
1,0 μg/ml,
0,1 μg/ml,
0,01 μg/ml
und 0,001 μg/ml
sequenziell in den zwei Medien verteilt, wie oben beschrieben:
Medium
(1) = komplettes Medium; und
Medium (2) = DMEM (Leucin-frei)
mit 0,5 μCi/ml 3H-Leucin.
-
Medium (2) wird für die letzte 24 Stunden Inkubationsdauer
des Experiments verwendet.
-
Insbesondere wurde in dem 24 Stunden-Assay
jeder therapeutische Wirkstoff in dem Medium (2) verdünnt, wie
oben erwähnt.
Medium (1) wurde aus den Wells abgesaugt, und Aliquots therapeutischer
Wirkstoffverdünnungen
in Medium (2) wurden vierfach zu den geeigneten Wells gegeben. Medium
(2) wurde dann zu den Kontrollwells gegeben.
-
In dem 120 Stunden-Assay wurde jeder
therapeutische Wirkstoff in Medium (1) verdünnt, wie oben erwähnt. Medium
(1) wurde von den Wells abgesaugt, und Aliquots der therapeutischen
Wirkstoffverdünnungen in
Medium (1) wurden vierfach zu den geeigneten Wells gegeben. Medium
(1) wurde dann zu den Kontrolwells gegeben. Das Medium wurde alle
24 Stunden gewechselt, und es wurde frischer therapeutischer Wirkstoff
zu den Testwells gegeben. Bei 96 Stunden (d. h. dem vierten Tag)
wurde jeder therapeutische Wirkstoff in Medium (2) verdünnt, wie
oben erwähnt.
Medium (1) wurde von den Wells abgesaugt, und Aliquots der therapeutischen Wirkstoffverdünnungen
in Medium (2) wurden vierfach zu den geeigneten Wells gegeben. Medium
(2) wurde dann zu den Kontrollwells gegeben.
-
Die Testwirkstoffe in 3H-Leucin
(und Kontrollen) wurden über
Nacht bei 37°C,
5% CO2 in einer feuchten Atmosphäre inkubiert.
Der toxische Effekt der therapeutischen Wirkstoffe wurde dann bestimmt,
wie oben beschrieben in 5 Minuten Exposition: Proteinsyntheseassay,
oben beschrieben. Zusätzlich
wurden Änderungen in
den Zellen bei jeder Verdünnung
mittels eines Zeiss Mikroskops (Zeiss, Westdeutschland) bei 320X
fotografiert. Das Medium wurde dann abgesaugt und die Zellen wurden
mit TCA bearbeitet, wie oben beschrieben.
-
24 und 120 Stunden Exposition:
DNA-Syntheseassay:
-
Dieser Assay wurde entsprechend der
Prozedur durchgeführt,
wie beschrieben für "24 und 120 Stunden
Exposition: Proteinsyntheseassay",
außer
dass Medium (2) in diesem 24 und 120 Stunden DNA-SYntheseassay ist:
Medium
(2) = komplettes Mediudum mit 1,0 μCi/ml 3H-Thymidin.
Medium
(2) wird für
die letzte 24-stndige Inkubation des Experiments verwendet.
-
Diese Protein- und DNA-Syntheseassays
sind zur Verwendung mit anderen Targetzellpopulationen geeignet,
insbesondere anhaftende einschichtige Zelltypen.
-
Ergebnisse:
-
Die minimal wirksame Dosis (MED)
jedes Wirkstoffs wurde als Prozentsatz der Kontrolle bestimmt, die nur
mit Medium behandelt wurde; 50% der Kontrollwerte wurden als die
cytotoxische Grenzmarke gewählt.
Bei 5 Minuten Exposition zeigte Staurosporin ein MED von 100 ng/ml
in dem Proteinsyntheseassay und 1 ng/ml in dem DNA-Assay. Die 24
Stunden MED für
Staurosporin war 10 ng/ml in dem Proteinsyntheseassay und 1 ng/ml
in dem DNA-Syntheseassay. Beide Assays ergaben eine MED von 1 ng/ml
für eine
120 Stunden Exposition von Staurosporin.
-
Nach 5 Minuten Exposition zeigte
Cytochalasin B eine MED von 10 μg/ml
in dem Proteinsyntheseassay sowie auch in dem DNA-Assay. Die 24
Stunden MED für
Cytochalasin B war 1,0 μg/ml
in dem Proteinsyntheseassay und 0,1 μg/ml in dem DNA-Syntheseassay.
Beide Assays ergaben eine MED von angenähert 0,1 μg/ml für eine 120 Stunden Exposition
von Staurosporin.
-
Therapeutische Cytochalasin C und
Cytochalasin D-Wirkstoffe wurden in 24 und 48 Stunden Expositionen
unter Verwendung der gleichen Verdünnungen getestet, wie sie oben
für Cytochalasin
B beschrieben sind. In 24 Stunden zeigte Cytochalasin C eine MED
von 1,0 μg/ml
in dem Proteinsyntheseassay und eine MED 0,01 μg/ml in dem DNA-Syntheseassay.
In 24 Stunden zeigte Cytochalasin C eine MED von 0,1 μg/ml in dem
Proteinsyntheseassay, und 0,01 μg/ml
in dem DNA-Syntheseassay. Cytochalasin D zeigte eine MED von 1,0 μg/ml in dem
24 Stunden Proteinsyntheseassay, und eine MED von 0,1 μg/ml in dem
24 Stunden DNA-Syntheseassay. Eine 48 Stunden Exposition für Cytochalasin
D ergab eine MED im Bereich zwischen 0,1 und 0,01 μg/ml sowohl
in den Proteinsynthese- als auch DNA-Syntheseassays.
-
BEISPIEL 11
-
Migrationshemmung der
glatten Gefäßmuskelzellen
-
Es wurden Kratzassays gemäß dem folgenden
Protokoll durchgeführt,
um das Ausmaß der
Migrationshemmung der glatten Gefäßmuskelzellen durch Cytochalasin
B zu bestimmen:
-
Glatte Gefäßmuskelzellen (BO54) wurden
aus Explantaten des glatten Aortenmuskels vom Pavian erhalten, wie
in BEISPIEL 10 beschrieben. Die Zellen wurden in flachbödigen 6
Well-Gewebekulturplatten gezüchtet,
die etwa 5 ml Medium enthielten. Die glatten Gefäßmuskelzellen wurden mit 200.000
Zellen/Well plattiert und bei 37°C
in einem befeuchteten 5% CO2 Inkubator für 18 Stunden
platziert. Die Wells wurden dann mit einem sterilen Teil einer einschneidigen
Rasierklinge abgekratzt, die mit einer Klemme oder einer Pinzette gehalten
wurde, und wurden aseptisch mit einem 90°-Winkel in Kontakt mit dem Boden
des Wells gebracht. Die Zellen von der kleinen Fläche entlang
dem Kratzer wurden mit einem sterilen Baumwollspitzenapplikator entfernt,
während
die Klinge in Kontakt mit dem Boden des Wells war. Nach der Inkubation
zeigt das Vorhandensein der Zellen in der "abgekratzten" Fläche
die Zellmigration über
die Kratzlinie hinweg an. Eine Kontrollinkubation zeigte eine signifikante
Zellmigration und dient als Standard, gegenüber dem die Migration der Zellen,
die dem therapeutischen Wirkstoff ausgesetzt waren, verglichen wird.
-
Kurz gesagt, wurde eine Vorratslösung von
Cytochalasin B (Simga Chemical Co.) in Dimethylsulfoxid (DMSO) mit
1 mg/ml hergestellt. Testverdünnungen
von Cytochalasin B oder Kontrollmedium wurden hinzugefügt. Jedes
Experiment enthielt zwei Sätze
von Platten:
Satz A: Testwirkstoff-Exposition für nur 1,
3, 6, 8 und 10 Tage; und
Satz B: Testwirkstoff-Exposition für 1, 3,
6, 8 und 10 Tage, gefolgt von einer siebentägigen Erholungszeit mit Kontrollmedium.
-
Am Ende der zeitgesteuerten Expositionen
wurden beide Plattensätze
fixiert (10% Formalin in PBS) und gefärbt (0,02% Kristallviolett).
Die Testkonzentrationen für
Cytochalasin B waren 1, 01 und 0,01 μg/ml, und eingeschlossen war
eine negative Mediumkontrolle. Frisches Medium und Medikament wurden
drei Mal pro Woche zugeführt.
-
Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse dieser
Experimente. In dieser Tabelle bezeichnet "M" den
Migrationsgrad, wobei – =
keine Migration; +1 = minimal; +2 = mäßig; +3 = moderat; und +4 =
deutlich (maximale Dichte; Grenze der Zellkontakthemmung) Migration
glatter Gefäßmuskelzellen
in den freien Bereich neben dem Kratzer. In dieser Tabelle bezeichnet "T" einen morphologischen Toxizitätsgrad;
wobei – =
keine Toxizität;
+1 = minimal; +2 = mäßig; +3
= moderat; und +4 = deutliche Toxizität. Die Migrationsergebnisse
sind ausgedrückt
als "Grad in dem
freien Bereich des Wells; Grad in einem ungestörten Bereich des Wells). Die
Toxizitätswerte
repräsentieren
einen Grad für
alle Zellen in jedem Well.
-
Die Daten zeigen an, dass Cytochalasin
B die Migration glatter Gefäßmuskelzellen
in dem freien Bereich benachbart dem Kratzer hemmt (+1 bis +2) bei
einer Dosis von 0,1 μg/ml
mit nur minimaler (– bis
+1) morphologischer Toxizität.
Die Daten zeigen auch, dass die behandelten Zellen (0,1 μg/ml) die
Migrationsfähigkeit
wiedergewinnen (+3 bis +4) nach der Entfernung des therapeutischen
Wirkstoffs, auch nach 10 Tagen fortlaufender Exposition dem therapeutischen
Wirkstoff.
-
Tabelle
4
KRATZ-MIGRATIONSASSAY: MIGRATIONSHEMMUNG GLATTER GEFÄSSMUSKELZELLEN
DURCH CYTOCHALASIN B
-
BEISPIEL 12
-
Cytotoxische Effekte des
therapeutischen Wirkstoffs auf glatte Gefäßmuskelzellen – Puls-
und kontinuierliche Exposition
-
Glatte Gefäßmuskelzellen wurden einem
therapeutischen Wirkstoff in einem von zwei Expositionsformaten
ausgesetzt:
-
Puls-Exposition: Das Puls-Expositionsprotokoll
ist oben in BEISPIEL 8 beschrieben (siehe "Morphologische Toxizitätsauswertung – Puls-Exposition").
-
Kontinuierliche Exposition:
-
Es wurde die gleiche Methodik für die morphologische
Toxizitätsauswertung
der kontinuierlichen Exposition angewendet wie für die Puls-Exposition, mit
der
-
Ausnahme, dass die Testwells kontinuierlich
dem therapeutischen Wirkstoff in dem Medium während der Expositionsdauer
ausgesetzt wurden. Das Medium und der therapeutische Wirkstoff wurden
aus jedem Well täglich
abgesaugt, einschließlich
von dem unbehandelten Kontrollwell, und wurden mit 1 ml frischem
Medium und therapeutischem Wirkstoff ersetzt (oder Medium allein
für die
Kontrollwells). Es folgte eine Reinkubation, bis jeder der stufigen
Auswertungspunkte des langfristigen kontinuierlichen Expositionsprotokolls
erreicht war. Diese gestuften Auswertungszeitpunkte lagen bei 6,
24, 48, 72, 96, 120, 168, 216 und 264 Stunden. Zu der bezeichneten
Zeitdauer wurden die jeweiligen Zellen fixiert, gefärbt und
ausgewertet, wie in dem Puls-Expositionsprotokoll.
Die Ergebnisse eines kontinuierlichen Expositionsexperiments sind
in Tabelle 5 für Suramin,
Staurosporin und Cytochalasin B gezeigt. Die in Tabelle 5 dargebotenen
5 Minuten- und 24 Stundendaten sind Korrelate der Daten, die in
den 10A, 10B und 10C enthalten sind.
-
-
In einer in vitro-wirksamen Dosierung
zeigten Cytochalasin B (1 μg/ml;
eine antimigratorische konzentrationswirksame Dosis) und Staurosporin
(1 ng/ml; eine antiproliferative wirksame Dosis) einen Toxizitätsgrad von
1 (minimal) bzw. 2 (mäßig). Unabhängige Studien
haben aufgezeigt, dass ein Grad von 3 (moderat) oder weniger für einen
cytostatischen, antiproliferativen Wirkstoff der vorliegenden Erfindung
bevorzugt ist.
-
BEISPIEL 13
-
In vivo BRDU Assay: Hemmung
der Glatten-Gefäßmuskel-Proliferation
-
BRDU Assay:
-
In vivo Glatte-Gefäßmuskel-Proliferation
wurde quantifiziert durch Messung der Aufnahme des Basisanalogen
5-Borm-2'-deoxyuridin
(BRDU, erhältlich
bei Sigma Chemical Co.) in DNA während
der zellulären DNA-Synthese
und Proliferation. Die BRDU-Aufnahme wurde histochemisch mittels
monoklonaler Anti-BRDU-Antikörper
aufgezeigt. Diese einstündige
Pulsmarkierung gestattet die Auswertung der Zellenanzahl, die während der
Pulsperiode einer Teilung unterliegen.
-
Das oben beschriebene BRDU-Pulsmarkierungsprotokoll
wird als Standardauswertungstechnik mit in vivo Schweine-Gefäßstudien
angewendet. Die folgenden operativen und Behandlungsprozeduren (hierin
z. B. in den Beispielen 7 und 11 diskutiert) und einer postoperativen
Erholungsdauer wurden die Schweine sediert und 1 Stunde vor dem
Sammeln des Gewebes mit BRDU gepulst.
-
Kurz gesagt, die Schweine wurden
durch intramuskuläre
Injektion mit Triletaminhydrochlorid und Xylazin sediert (wie in
Beispiel 7, "Allgemeine
Pathologie und histologische Auswertung"). Das BRDU wurde dann intravenös über die
laterale Ohrvene verabreicht. Jedem 30–40 Pfund Schwein wurden zwei
ml BRDU bei einer Konzentration von 50 mg/ml verabreicht. Eine Stunde
später
wurden die Schweine durch intravenös verabreichtes Pentobarbital getötet. Dann
wurden Testarteriensegmente entfernt (ein Segment enthielt ein proximal
angeordnetes normales Gefäß, und falls
möglich,
distal in Bezug auf das behandelte Arteriensegment). Die Arteriensegmente
wurden in 2 mm Abständen
durchschnitten; der Reihenfolge nach in Cryoformen mit O.C.T. (optimaler
Schneidtemperatur) Verbindung (Tissue Tek®, Miles
Laboratories, Inc., Elkhart, IN) angeordnet; und in flüssigem Sticktstoff
gefroren. Die Blöcke
wurden auf 5 Mikrometer geschnitten und mittels der folgenden Prozedur
immunohistologisch gefärbt,
um BRDU zu erfassen:
-
BRDU-markierte Zellerfassung:
-
Nach der BRDU (1 g BRDU, verdünnt in 17
ml sterilem Wasser und 3 ml 1 N NaOH) Pulsmarkierung, Entfernung
und Schnitt des Testarteriensegments (wie oben), liefert die immunohistochemische
Färbung
mit monoklonalem BRDU-Antikörper ein
visuelles Mittel zur Bestimmung eines Mitoseindex über eine
bestimmte Zeitperiode. Die immunohistochemische Färbemethode
wurde wie folgt durchgeführt:
- 1) 5 μm
Schnitte der Testarterie wurden in kaltem Aceton (–20°C) für 10 Minuten
dehydriert;
- 2) die Schnitte wurden auf Glasmikroskopobjektträgern angebracht,
und die Objektträger
wurden in einem 37°C-Ofen
für 10
Minuten getrocknet;
- 3) die Objektträger
wurden in PBS für
10 Minuten rehydriert;
- 4) die Objektträger
wurden einer Feulgensäure-Hydrolyse
mittels 1 N HCl unterzogen, worin vor der Prozedur zwei Aliquots
1N HCl auf 37°C
und 60°C
vorgewärmt
waren;
- 5) die Objektträger
wurden mit 1 ml 1 N HCl bei 37°C
für 1 Minute
gespült;
- 6) die Objektträger
wurden auf 60°C
1 N HCl für
15 Minuten überführt;
- 7) die Objektträger
wurden mit 1 ml 1 N HCl bei 37°C
für 1 Minute
gespült;
- 8) die Objektträger
wurden bei Raumtemperatur PBS gewaschen, mittels 3 Wechseln von
PBS in 5 Minutenintervallen;
- 9) endogene kreuzreaktive Orte an den Sektionen wurden mit normalem
Ziegenserum (1 : 25 in PBS) für 20
Minuten blockiert;
- 10) die Objektträger
wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8;
- 11) die Schnitte wurden mit Maus-anti-BRDU-Antikörper (DAKO
Corporation, Carpinteria, CA) mit 10 μg/ml für 30 Minuten inkubiert;
- 12) die Objektträger
wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8;
- 13) die Schnitte wurden mit Meerrettichperoxidase markiertem
(HRPO)-Ziegen-anti-Maus-IgG,
(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; Verdünnung 1
: 20 in PBS) und 4% humanem AB-Serum für 30 Minuten inkubiert;
- 14) die Objektträger
wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8;
- 15) die Schnitte wurden mit Farbstoff (3,3'-Diaminobenzidin (DAB; Sigma) mit 5
mg/ml in 200 ml PBS) und 200 μl
von 30% H2O2 für 10 Minuten
inkubiert;
- 16) die Objektträger
wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8;
- 17) die Proben wurden mit Gill I Hämatoxylin gegengefärbt (Gill
1 Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA; 30 Eintauchungen);
- 18) die Objektträger
wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8; mit Bläuelösung gespült (1 g
Lithiumcarbonat in 500 ml dH2O); mit deionisiertem
Wasser gewaschen; und
- 19) die Testproben wurden dann dehydriert, gereinigt und mit
Deckglas versehen.
-
Als Schlussfolgerung dieser Prozedur
zeigt eine positive immunohistologische Färbung an der Reaktionsstelle(n)
eine braune Farbe.
-
Cytocidale Wirkstoffe hemmten die
BRDU-Aufnahme relativ zu einer PBS-Kontrolle; jedoch hemmten Cytochalasin
B und Staurosporin die BRDU-Aufnahme
(d. h. Zellproliferation), ohne die glatten Gefäßmuskelzellen abzutöten. Die
Anzahl der mit BRDU markierten glatten Gefäßmuskelzellen wurde bei 400-facher
Vergrößerung wie
folgt zugeordnet:
- 1 = ≤ 1/Hochleistungsfeld (HPF);
- 2 = 2 bis 5/HPF;
- 3 = > 5 bis ≤ 10/HPF; und
- 4 = > 10/HPF.
-
Sowohl Cytochalasin B als auch Staurosporin
hemmten die Proliferation für
24 Stunden nach einem Ballontrauma (Grad 1), was einen BRDU-Markierungsgrad ergibt, äquivalent
jenem einer vortraumatischen Grundlinie (Grad 1). PBS und monoklonale
Antikörperkontrollen
zeigten einen Grad von 2,5 bis 4 BRDU-Markierung während der
gleichen Zeitdauer. Vier Tage nach dem Trauma zeigten die Arterien,
die mit Cytochalasin B oder Staurosporin behandelt wurden, sowie
die PBS- und monoklonalen Antikörperkontrollen
einen BRDU-Markierungsgrad von 4. Die antiproliferativen, nicht
cytocidalen Eigenschaften von Cytochalasin B und Staurosporin legen
nahe, dass diese Wirkstoffe für
die Dauerfreigabe-Dosierungsformulierungen zur Reduktion von Gefäßstenose
geeignet sind.
-
BEISPIEL 14
-
Biologische
Stentung von ballontraumatisierten Schweinarterien
-
Verwendung
von Cytochalasin B
-
Ballontraumatisierte Schweinearterien,
die mit Cytochalasin B behandelt worden waren, zeigten einen größeren Lumenquerschnitt
an den 4 Tage und 3 Wochen Postbehandlungszeitpunkten im Vergleich
zu Arterien, die mit anderen Testwirkstoffen behandelt waren, oder
Kontrollen. Zehn Femoralarterien (zwei Arterien, erhalten von jedem
der 5 Schweine, die gemäß dem in
Beispiel 7 beschriebenen Einzeldosisprotokoll behandelt worden waren)
wurden histologisch ausgewertet. Der maximale Lumenquerschnitt jeder
Arterie wurde aus digitalisierten mikroskopischen Bildern mit einem
BQ System IV computierisierten morphometrischen Analysesystem (R & M Biometrics,
Inc., Nashville, TN) gemessen und berechnet. Dieses Experiment wurde
mit 5 zusätzlichen
Schweinen (zwei Arterien pro Schwein; Cytochalasin B-Dosis = 0,1 μg/ml, Einwirkung
für 3 Minuten bei
1 atm Druck; gleiche Zeitpunkte) wiederholt. Die aus den zwei Experimenten
erhaltenen Daten wurden zusammengefasst. Es wurde eine Vergrößerung des
Lumenquerschnitts an dem 3 Wochen nach Cytochalasin B-Behandlungszeitpunkt
beobachtet.
-
Der Lumenquerschnitt der traumatisierten
und Cytochalasin B-behandelten Arteriensegmente wurden auch mit
dem Lumenquerschnitt des normalen unbehandelten Bereichs der Femoralarterie
proximal des Testbereichs verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass
der Lumenquerschnitt in dem Testbereich angenähert zwei Mal so groß war wie
der Bereich des normalen Kontrollsegments derselben Arterie. Die
negativen Kontrollwirkstoffe, PBS und monoklonaler Antikörper NR-AN-01,
zeigten keine Vergrößerung oder
eine leichte Verringerung des Lumenquerschnitts im Vergleich zu
dem normalen Kontrollsegment derselben Arterie.
-
Eine Cytochalasin B-Dosis-Antwortstudie
wurde dann an 10 Schweinen, nach dem in Beispiel 7 beschriebenen
Experimentalprotokoll, durchgeführt.
Kurz gesagt, beide Arterien in jedem von zwei Schweinen wurden mit
einer der folgenden Dosen Cytochalasin B behandelt: 0,0 μg/ml (d.
h. eine PBS-Negativkontrolle); 0,01 μg/ml; 0,10 μg/ml; 1,0 μg/ml; und
10,0 μg/ml.
Der Wirkstoff wurde durch einen intraluminalen Katheter bei 1 atm
Druck für
3 Minuten verabreicht, und die Arterien wurden 3 Wochen später durch
das oben beschriebene morphometrische Analysesystem ausgewertet.
Das VerhäΠtnis des
behandelten Arterienlumenquerschnitts zu dem proximalen normalen
Arterienlumenquerschnitt wurde als prozentuale Änderung in der behandelten gegenüber der
normalen Fläche
bestimmt. Ein signifikanter Schwelleneffekt wurde bei Dosierungen
von 0,1 μg/ml
(= 140%ige Zunahme) zu 1,0 μg/ml
beobachtet (14). Die
10 μg/ml
Dosis schien für
die glatten Gefäßmuskelzellen
toxisch zu sein (Daten nicht gezeigt). Die Subschwellenwertdosis
(0,01 μg/ml)
und negative Kontrolle (PBS) zeigten eine a ± ≈20%ige Änderung im Lumenquerschnitt.
Diese Daten legen nahe, dass Cytochalasin B als "biologischer Stent" wirkt, wenn es traumatisierten Arterien
verabreicht wird.
-
BEISPIEL 15
-
Direkte Konjugation von
NR-AN-01-Antikörper
zu funktionellen carboxylischen Gruppen eines Latexpartikels
-
Antikörper-beschichtete Latexpartikel
(ein Modell einer Antikörperbeschichteten
Dauerfreigabe-Dosierungsform) kann mittels der folgenden aseptischen
Technik erhalten werden:
-
Konjugation:
-
Zu 4 ml 0,05 M Natriumborat, pH 8,5,
enthaltend 0,01% Tween-200 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Sigma)
wird 0,5 ml PBS, enthaltend 5 mg NR-AN-01 monoklonaler Antikörper, hinzugefügt. Zu dieser
Lösung
bei Raumtemperatur werden, unter Mischen, 2,5 ml einer wässrigen
Suspension, enthaltend 50 μg
carboxylierter Latexpartikel mit 1 μm Durchmesser, hinzugefügt. Unmittelbar
danach wird 0,50 ml Wasser, enthaltend 100 mg frisch gelösten 1(3-Dimethylaminopropyl)3-ethylcarbodiimid
HCl unter Vermischen hinzugefügt. Die
Lösung
wird dann unter Schütteln
für 1–2 Stunden
bei Raumtemperatur inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird dann mit
50 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,6 verdünnt, enthaltend 0,2% Gelatinstabilisator
(Phosphat/Gelatinpufter). Dieses Gemisch wird mit 40.000 × g für 2 Stunden
bei 4–10°C zentrifugiert.
Der Überstand wird
dekantiert und der Pellet wird in 50 ml Phosphat/Gelatinpufter mittels
leistungsschwacher Beschallung für 10
Sekunden resuspendiert. Die Zentrifugation wird wiederholt, und
der Pellet wird zwei Mal resuspendiert, gefolgt durch Resuspension
in dem Phosphat/Gelatinpuffer. Die konjugierten Partikel werden
dann mittels Standardprotokollen und Sorbitolexzipienten lyophilisiert.
-
Charakterisierung:
-
- (a) Größeneinteilung:
Die Partikelgrößenhomogenität wird durch
Laseranisotropie oder, für
Partikel größer als
1 μm, durch
mikroskopische Untersuchung bewertet.
- (b) Spezifische Bindungsbewertung: Die spezifische Bindung an
glatte Muskelzellen wird durch histologische Untersuchung des Gewebes
oder von Zellpellet-Mikrotomscheibchen nach der Inkubation von Protein/Peptidkonjugaten
mit konjugierten Partikeln bestimmt, mit oder ohne Blockerprotein/peptid,
das in dem Inkubationsgemisch enthalten ist. Bevorzugte Detektionstechniken
beinhalten zweite Antikörperassays
(d. h. Anti-Maus-IgG)
oder Kompetitionsassays (d. h. radioszintigraphische Detektion in
Verbindung mit radioisotopisch markierten Protein/Peptidkonjugaten).
- (c) Bewertung des Ausmaßes
der Protein/Peptidderivatisierung: Diese Bestimmung erfolgt durch
Beschichtung der Latexpartikel mit einem radioisotopisch markierten
Antikörper,
gefolgt durch Detektion der Radioaktivität, die den beschichteten Partikeln
zugeordnet ist.
-
Die Charakterisierung der Antikörper-beschichteten
Partikel ist in Tabelle 6 beschrieben.
-
Tabelle
6
Charakterisierung von NR-AN-01-beschichteten Latexparikeln
-
Der Partikelaggregationseffekt des
pH während
der Antikörperkonjugation
ist in Tabelle 7 angegeben.
-
Tabelle
7
pH-Effekt während
Antikörper-Konjugation-Partkelaggregation
-
Diese Daten legen nahe, dass Proteine
oder Peptide direkt mit Dauerfreigabe-Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung
konjugiert werden können.
Insbesondere werden Polymilch-glycolsäurepartikulate, die terminate
Carboxylsäuregruppen
aufweisen, gemäß der hierin
beschriebenen Prozedur oder alternativen Prozeduren, die in der
Beschreibung hiervon beschrieben sind, konjugiert.
-
Zitate
-
- 1. Popma J. J. et al. 1990. Factors influencing
restenosis after coronary angioplasty. Amer. J. Med. 88: 16N–24N.
- 2. Fanelli, C. et al. 1990. Restenosis following coronary angioplasty.
Amer. Heart Jour. 119: 357–368.
- 3. Johnson, D. E. et al. 1988. Coronary atherectomy: Light microscopic
and immunochemical study of excised tissue (abstract). Circulation
78 (Suppl. II): II-82.
- 4. Liu. M. W. et al. 1989. Restenosis after coronary angiopiasty;
Potential biologic determinants and role of intimal hyperplasia.
Circulation 79: 1374–1387.
- 5. Clowes, A. W. et al. 1985. Significance of quiescent smooth
muscle migration in the injured rat carotic artery. Circ. Res. 56:
139–145.
- 6. Goldman. B. et al. I 987. Influence of pressure on permeability
of normal and diseased muscular arteries zu horseradish peroxidase:
A new catheter approach. Atherosclerosis 65: 215–225.
- 7. Wolinsky, H. et al. 1990. Use of a perforated balloon catheter
to deliver concentrated heparin into the wall of the normal canine
artery. JACC 15 (2): 475–481.
- 8. Nabel, E. G. et al. 1989. Recombinant gene expression in
vivo within endothelial cells of the arterial wall. Science 244:
1342–1344.
- 9. Middlebrook, J. L. et al. 1989. Binding of T-2 toxin to eukaryotic
cell ribosomes. Biochem. Pharm. 38 (18): 3101–3110.
- 10. Barbacid, M. et al. 1974. Binding of [acetyl-"C] trichodermin to
the peptidyl vansferase center of eukaryotic ribosomes. Eur. J.
Biochem. 44: 437–444
- 11. Sclingemann et al. 1990. Am. J. Pathol. 136: 1393–1405.
- 12. Steele P. M., Chesebro J. H.. Stanson A. W.. et al. 1985.
Balloon angioplasty: natural history of the pathophysiological response
to injury in a pig model. Circ. Res. 57: 105–112.
- 13. Schwartz R. S.. Murphy J. G., Edwards W. D.. Camrud A. R,
Vliestra R. E., Holmes D. R. Restenosis after balloon angioplasty.
A practical proliferative model in porcine coronary arteries. Circulation
1990; 82: 2190–2200.
- 14. Bumol, T. F. and R. A. Reisfeld. 1982. Unique gelycoprotein-proteoglycan
complex defined by monoclonal antibody on human melanoma cells.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1245–1249.
-
Während
die bevorzugte Ausführung
der Erfindung dargestellt und beschrieben wurde, versteht es sich,
dass darin verschiedene Änderungen
vorgenommen werden können,
ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.