DE69628651T2

DE69628651T2 - Zusammensetzungen und verfahren für die schnelle analyse von retikulozyten

Info

Publication number: DE69628651T2
Application number: DE69628651T
Authority: DE
Inventors: Ran Young KIM; Johanna Kantor
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1995-04-21
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2016-04-20
Also published as: JP3600247B2; DE69628651D1; JPH11508353A; WO1996033396A1; ATE242877T1; EP0842410A1; EP0842410B1; ES2201182T3; US5773299A; US5691204A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und stabile wässerige Reagenz-Zusammensetzungen zur schnellen Analyse für Reticulozyten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung automatisierbare Verfahren und stabile wässerige Reagenz-Zusammensetzungen zur raschen Analyse von Reticulozyten unter Verwendung von Lichtbrechungs- und Fluoreszenzflusscytometrietechniken. Die Verfahren und stabilen wässerigen Reagenz-Zusammensetzungen erlauben die rasche Analyse von Reticulozyten, die durch Zählung und Reifegrad darstellbar sind, auf Multi-Parameter hematologischen Instrumenten mit hohem Durchsatz. Das Verfahren erlaubt ebenfalls die echt-Zeit Analyse von Reticulozyten und Zählungen von Zellen in Vollblut ("CBD"), einschließlich Zellkern-haltiger roter Blutzellenzählungen ("NRBC"), ohne einen getrennten Inkubationsschritt.
HINTERGRUND
Die roten Blutzellen ("RBC") treten in dem Blutstrom normalerweise als Reticulozyten ein. Die Erythropoese beginnt mit dem Erythroblasten und schreitet vor durch ungefähr fünf Generationen von intermediären, zellkernhaltigen Zellen im Knochenmark und endet mit den Reticulozyten. Der Reticulozyt ist eine unreife rote Blutzelle, welche weiterhin reticuläres Material (ribosomale und messenger RNA) enthält, obwohl in diesem Entwicklungsschritt die Zelle bereits den Zellkern abgestoßen hat.
Unter den Bedingungen der Anemie oder der Hypoxie kann dieses Verfahren verkürzt sein. Somit können unter diesen Bedingungen Reticulozyten in einem frühereren Stadium als normal in den Blutstrom eintreten. Diese frühen Reticulozyten werden durch die zusätzliche Menge von RNA erkannt, welche sie enthalten, sowie durch ihre größere Größe, ihre niedrigeren Hemoglbingehalt und durch den größeren Zeitraum während dessen sie als Reticulozyten im Blutstrom existieren.
In dem frühen Dreißiger-Jahren differenzierten L. Heilmeyer (Ztschr. Klin. Ned. 121: 361–379, 1932) Reticulozyten in vier Altersgruppen gemäß der Menge von Reticulum (vital färbbare Substanz, die in den Reticulozyten enthalten ist), welche sie enthalten. Traditionell enthält Gruppe I 30 oder mehr Reticulum, Gruppe II enthält 15–30, Gruppe III enthält 3–15, und Gruppe IV enthält 1–2 Reticulum. Die normale Reticulozytenzahl liegt zwischen 0,5 bis 2,5% der RBC Zählung für Erwachsene und von etwa 2,0 bis 6,0% der RBC Zählung für neugeborene Säuglinge. Hinsichtlich der Altersgruppen wird beim normalen Erwachsenen die Mehrzahl der Reticulozyten in Gruppe IV sein, und keine in Gruppe I.
Die Reticulozytenzahl ist ein Ausmaß der Produktion roter Blutzellen. Sie ist somit nützlich bei der Diagnose und Behandlung von Anemie. Historisch wurden die Reticulozytenzahlen sehr eng verknüpft mit der Etiologie und Einteilung der Anemien. Die Reticulozytenzahl ist erhöht bei hemolytischen Anemien, Pyruvatkenasemangel, Sichelzellanemie, Thalassemien und vermindert bei der megaloblastischen Anemie, aplastischen Anemie, und der allgemeinen Knochenmarksdysfunktion. Kürzlich wurde die Reticulozytenzählung ebenfalls verwendet, um die toxischen Wirkungen chemotherapeutischer Wirkstoffe auf das Knochenmark zu beurteilen. Daher haben Hematologen einstimmig die Reticulozytenzählung und den Reticulozytenreifungsindex als sehr wertvolle Informationen bewertet.
Das am häufigsten verwendete Verfahren zur Zählung von Reticulozyten ist das manuelle mikroskopische Verfahren. Brilliant Cresol blau wurde hauptsächlich verwendet bis das neue Methylen Blau ("NMB") 1949 durch G. Brecher (Am. J. Clin. Pathol. 19: 895–896, 1949) eingeführt wurde. Die neuste National Committee for Clinical Laboratory Standards ("NCCLS") Veröffentlichung (NCCLS DOC. H44-P) beschreibt die NMB Färbung, in der ein identisches Blutvolumen gemischt wird mit NMB Färbung und für etwa fünfzehn Minuten inkubiert wird, damit der RNA gestattet wird, auszufällen. Blutausstriche werden dann gemacht und die gefärbten Reticulozyten werden mikroskopisch gezählt.
Eine Miller Okularscheibe wird in ein Okular eingesetzt. Die Fläche des kleineren Quadrats, welche innerhalb des Okulars gesehen wird, ist 1/9 der Fläche des größeren Quadrats. Die roten Blutzellen werden in dem kleineren Quadrat gezählt, wogegen die Reticulozyten in dem größeren Quadrat gezählt werden. Zwanzig aufeinanderfolgende Felder werden gezählt und der Prozentsatz der Reticulozyten wird berechnet, indem die Gesamtzahl der Reticulozyten in dem größeren Quadraten dividiert wird durch die Gesamtzahl der roten Blutzellen in den kleinen Quatdraten nach Multiplikation mit 9. Der Nachteil des manuellen Verfahrens, ist es das es arbeitsintensiv, ungenau, zeitaufwändig und subjektiv ist.
Viele Versuche wurden unternommen, um diese Nachteile durch das Mittel der Fluss-cytometrischen Technologie zu korrigieren. In den Achtziger-Jahren wurden Pyronin Y ("PY") und Acridin Orange ("AO") verwendet, um Reticulozyten im Flußcytometer zu färben und zu zählen. Verschiedene halb automatische, Fluss-cytometrische Verfahren sind nur verfügbar zur Zählung von Reticulozyten aus einer Vollblutprobe. Bei jedem der existierenden Verfahren wird ein Verdünner, welcher einen organischen kationischen Farbstoff enthält, wie zum Beispiel Auamin 0 ("AuO"), oder Thiazol Orange ("TO") verwendet, um die RNA innerhalb der Reticulozyten zu färben. Während des Inkubationszeitraums penetriert der Farbstoff langsam die Zellmembran und bindet an die RNA innerhalb jedes Reticulozyten. Die Menge von erzeugten Signal durch die gefärbten Reticulozyten, wenn die Probe durch die Aufnahmezone hindurchtritt, ist im wesentlichen proportional zu dem RNA Gehalt innerhalb jedes Reticulozyten. Ein Flußcytometer, welches mit der geeigneten Anregungslichtquelle und Emissionsnachweissystemen ausgerüstet ist, kann daher verwendet werden, um den Prozentsatz von Reticulozyten in einer Vollblutprobe zu bestimmen.
Allerdings gibt es viele-Problemquellen, die die Automatisierung von Reticulozytenverfahren erschweren, insbesondere falls die Vorrichtung ein hematologisches Multi-Parameter-System ist. Die wichtigste ist, die Notwendigkeit eine gefärbte Probe "off-line" herzustellen. Dieser Probenvorbereitungsschritt er fordert eine längere Inkubationszeit von mehreren Minuten oder noch länger, bevor der Farbstoff die Zelle penetriert hat, um die Reticulozyten RNA ausreichend zu färben, um die Probe von einem Flußcytometer verarbeiten zu lassen. Zusätzlich sind die Mehrzahl der Farbstoffe, die derzeit verwendet werden, um RNA in Reticulozyten zu färben, instabil in wässeriger Lösung und binden nicht nur an RNA und DNA sondern können auch an die Plastikröhren, Glasoberflächen, einschließlich der Flußzelle der Vorrichtung binden. Dies erfordert die lange und aufwändige Maßnahme des Reinigens des kompletten Systems nach der Durchführung eines Tests.
Das U.S. Patent 3,684,377 von Kaminsky, et al., U.S. Patent 3,883,247 von Adams und das U.S. patent 4,336,029 von Natale, beschreiben alle die Verwendung von AO zur Färbung von Reticulozyten. Obwohl AO hervorragende Eigenschaften zur Färbung von Reticulozyten besitzt (es bindet an RNA und erzeugt eine rote Fluoreszenz), bindet es ebenfalls an Plasma und erzeugt eine hohe Hintergrundprobenstromfluoreszenz, was es erschwert, einen guten Rauschabstand ("S/N"-Abstand) zu erzielen. Noch problematischer bei der Verwendung von AO in einem Flußcytometer ist die Neigung von AO an Plastikröhren und Oberflächen von Flußzellen zu binden, was zu den Nachweisproblemen hinzukommt. Weiterhin erfordern die AO Verfahren 5 bis 7 Minuten Inkubation, welches ein zu langer Zeitraum ist, um in die hematologischen Multi-Kanal-Analysatoren heutiger Tage mit hohem Durchlauf integriert zu werden.
Das U.S. Patent 4,707,451 von Sage, Jr. beschreibt eine Reagenz-Zusammensetzung bestehend aus Thioflavin T oder Chrysanilin. Die Farbstoffaufnahme durch die Reticulozyten dauert etwa 7 Minuten bei diesem Verfahren und die Hintergrundfluoreszenz ist zu hoch, um einen guten S/N-Abstand bei dem Nachweis von Gruppe IV Reticulozyten zu erzielen.
Das U.S. Patent 4,883,867 von Lee et al. beschreibt einen Farbstoff zur Färbung von RNA und DNA. TO ist ihr bevorzugter Farbstoff zur Reticulozytenanalyse und das Verfahren erfordert eine minimale Inkubationszeit von 30 Minuten. Obwohl TO eine hohe Nukleinsäurebindungsaffinität und Quantumertrag besitzt, ist das Verhältnis der Membranpenetration von TO sehr langsam (30 Minuten) und ist somit ungeeignet zur Verwendung in einem klinischen hematologischen Multi-Parameter-Instrument mit hohem Durchsatz.
Das U.S. Patent 4,971,917 von Kuroda beschreibt eine Reagenz-Zusammensetzung welche AuO und ein Carbonatsalz enthält, um die unspezifische Färbung gereifter Erythrozyten zu reduzieren. Das U.S. Patent 4,985,176 beschreibt ein weiteres Reticulozytenfärbereagenz zur Fluß-cytometrischen Anwendung, worin AuO eingebracht ist als ein bevorzugter Farbstoff, und die Probeninkubationszeit zum Färben liegt irgendwo zwischen 30 Sekunden bis 20 Minuten. Die Nachteile zu der Verwendung von AuO in einem Flußcytometer sind, dass der Farbstoff, wie AO, eine Affinität nicht nur für DNA und RNA aufweist, sondern auch für verschiedene Arten von Plastik und Glasoberflächen, was es sehr schwierig macht, die Verfahren in ein hematologisches Multi-Parameter-Instrument einzubringen. TOA Medical Electronics Co., Ltd. haben es erreicht, ein AuO Verfahren in ihren Sysmex® R-1000 und R-3000 automatischen autonomen Reticulozytenanalysatoren einzubringen, waren jedoch nicht in der Lage, das Verfahren in ihren hematologischen Multi-Parameter-Instrumente zu implementieren, wie zum Beispiel dem NE8000 oder SE9000 Instrumenten.
Das U.S. Patent 5,284,771 von Colella et al. beschreibt ein Verfahren und eine Reagenz-Zusammensetzung, welches die Be- handlung einer Vollblutprobe mit einer einzelnen Reagenz-Zusammensetzung umfasst, welches einen kationischen Farbstoff (Oxazin® 750) enthält, um RNA in Reticulozyten zu färben und einen zwitterionischen sphärischen Wirkstoff zur Eliminierung des Ausrichtungsrauschens der flachen Blutzellen umfasst, wenn das gefärbte Produkt einem Fluß-cytrometischen Lichtmesssystem ausgesetzt ist.
Kürzlich hat Miles Inc. das obige Verfahren in ihrem neuesten H*3® Hematologieinstrument eingebracht. Dieses Instrument ist mit einem Helium/Neon ("HeNe") elektro-optischen Nachweissystem ausgestattet und Oxazin® 750 Nukleinsäurefarbstoff wird verwendet, um Reticulozyten zu färben während ein zwitterionisches Tensid verwendet wird, um die roten Blutzellen und Reticulozyten in eine sphärische Form zu bringen zur Vorbereitung für volumetrische Messungen. Das H*3® Reticulozytenverfahren ist nur ein halb-automatisiertes Verfahren, welches die manuelle Mischung des Blutes mit dem Reticulozytenreagenz erfordert, gefolgt durch eine 15 minütige off-line Inkubation. Die Sensitivität des Verfahrens beim Nachweis von Gruppe IV Reticulozyten ist schlecht.
Coulter Corporation haben ebenfalls ein halbautomatisiertes Reticulozytenverfahren in ihre hematologischen STKS® und Maxim® Analysatoren eingebracht. Coulter benennt seine Technologie: VCS (Volume, Conductivity and Scatter; Volumen, Leitfähigkeit und Streuung). Bei der Durchführung von VCS wird eine Blutprobe zunächst gemischt mit Coulter's Retic Farbstoff (welcher NMB enthält). Die Mischung wird dann bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Danach wird ein kleines Volumen der gefärbten Blutprobe mit einer Aufhellungslösung verdünnt, welche Schwefelsäure enthält. Die Genauigkeit des Verfahrens leidet stark unter schlechter Sensitivität und einer schlechten Auflösung der roten Blutzellen. Dies ist eine Folge von Reticulozytenstroma (lysiert durch die Aufhellungslösung), weiteren Zellen-Debris und Trombozyten, welche Rauschen erzeugen, was es sehr schwierig macht, die eigentlichen Signale zu differenzieren. Nur verklumpte Trombozyten werden Signale erzeugen, welche größer sind und welche daher nicht mit den Signalen interferieren werden, die durch rote Blutzellen und Reticulozytenstroma erzeugt werden.
Das U.S. Patent 4,981,803 von Kuroda beschreibt ein Reagenz, welches AuO zur Reticulozytenzählung durch Fluß-cytometrische Verfahren enthält, welche zwei Lösungen umfasst, und zwar eine Lagerlösung zum Färben, in der ein Farbstoff (AuO) in einem nicht wässerigen Lösungsmittel aufgelöst ist, und eine Pufferlösung, welche die optimalen Färbebedingungen für RNA in Reticulozyten enthält. Kuroda behauptet, dass durch die Kombination dieser beiden Lösungen kurz vor der Färbung eine stabile endgültige Färbelösung für Reticulozytenzählung immer erzielt werden kann. Die Probleme dieses Verfahrens sind zahlreich. Am hervorstechendsten hat die Gruppe der nicht wässerigen Lösungs mittel, welche gewählt wurde, (Ethylenglykol, Triethylenglykol, Diethylenglykol) einen hohen Brechungsindex. Solche Brechungsindices machen sie ungeeignet zur Verwendung in einem hematologischen Multi-Parameter-Analyzer. Dies ist eine Folge der wässerigen Abgrenzlösung, welche notwendig ist, (wie zum Beispiel Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) und welche einen Brechungsindex von etwa 1,334 besitzt. Wie in dem Kuroda Patent beschrieben, sind andere Lösungsmittel, wie zum Beispiel Methanol, Ethanol oder Propanol (welche einen Brechungsindex in der Nähe der Kochsalzgrenzschicht haben) hoch volatil und sind somit ebenfalls ungeeignet. Darüber hinaus ist es technisch sehr schwierig, solche kleinen Mengen von Lagerlösungen mit großen Mengen wässerigen Puffers on-line zu mischen, wie dies durch diese Verfahrensweise erfordert wird, um ein stabiles Reticulozytenreagenz zu erzielen.
Somit bestand ein über längeren Zeitraum ein Bedürfnis für ein schnelles und genaues Verfahren zur Reticulozytenanalyse, welches in einem Flußcytometer eingebracht werden kann oder in ein hematologichen Multi-Parameter-Analyzer mit hohem Durchsatz, unter Verwendung eines Reagenz, welches in einer wässerigen Umgebung stabil ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Verfahren für die gleichzeitige Zählung von CBCs und von Reticulozyten in einer Vollblutprobe, ohne das Bedürfnis für einen getrennten Inkubationsschritt für die Reticulozytenzählung, wird bereitgestellt.
Eine Ausführungsform stellt ein wässeriges, Nukleinsäurefärbendes Reagenz bereit, das eine Reticulozyten-färbende Menge eines asymmetrischen Cyaninfarbstoffs umfasst, von etwa 20 mM bis etwa 60 mM einer Pufferlösung gewählt aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Hepes, Bis-Tris und Trispuffer, und einer Farbstoff-stabilisierenden Menge eines nicht ionischen Tensids, gewählt aus der Gruppe bestehend aus N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropyl]cholami, n-Dodecyl-D-Maltosid, einem Polyoxypropylen-polyoxyethylenblock Copolymer, n-Tetradecyl-D-Maltosid, Decanoyl-N-methyl-glucamid, n-Dodecyl-D-glucopyranosid und n-Decyl-D-glu copyranosid. Das Reagenz hat einen pH von etwa 6,0 bis etwa 8,0 und eine Osmolarität, eingestellt auf etwa 230 bis etwa 340 mOsm/l mit mono- oder divalenten Alkalisalzen, welche nicht mit dem Cyaninfarbstoff interagieren oder in der wässerigen Reagenzlösung ausfallen.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Zählung von Reticulozyten bereitgestellt. Zunächst wird ein Aliquot einer Vollblutprobe gemischt mit dem wässerigen, Nukleinsäure-färbenden Reagenz. Dieses Proben/Reagenzaliquot wird dann zu einer optischen Flußzelle zur Analyse transportiert, und zwar ohne dass das Aliquot getrennt inkubiert wird. Während die Zellen durch eine belichtete optische Flußzelle hindurch treten, im wesentlichen eine Zelle an einem Zeitpunkt, werden die Lichtbrechungs- und Fluoreszenzcharakteristika nachgewiesen und die Zählung der Reticulozyten in der Probe wird daraus ermittelt.
Eine weitere Ausführungsform liefert ein wässeriges, Nukleinsäure-färbendes Reagenz, das von etwa 0,1 μg/ml bis etwa 0,3 μg/ml eines Farbstoffes umfasst, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Sybr 11, Sybr 14, Sybr 16 und Syto 12 (alle erhältlich von Molecular Probes, Eugene, OR), von etwa 40 mM bis etwa 60 mM Imidazolpuffer und eine Farbstoff-stabilisierende Menge eines nicht ionischen Tensids gewählt aus der Gruppe bestehend aus N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropyl]cholamid und einem Polyoxypropylen-polyoxyethylen blockcopolymer, worin das Reagenz einen pH von etwa 6,8 bis etwa 7,2 hat und eine Osmolarität eingestellt auf etwa 280 bis etwa 310 mOsm/l mit einem mono-, oder divalenten Alkalisalz gewählt aus der Gruppe bestehend aus NaCl, KCl, LiCl, CaCl₂, MgCl₂ und ZnCl₂.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur gleichzeitigen Zählung für Reticulozyten und eine vollständige Blutzellzählung bereitgestellt. Während ein Aliquot einer Vollblutprobe hinsichtlich einer CBC Bestimmung analysiert wird, wird ein zweites Aliquot der Probe gemischt mit dem wässerigen Nukleinsäure-färbenden Reagenz und die Reticulozytenkomponente der Probe wird wie oben beschrieben analysiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1a ist eine zweidimensionale FRCScan® Darstellung (Cytogramm) von Vorwärts-Brechung ("FSC") vs. grüne Fluoreszenz-("FL1")-Signale einer klinischen Probe mit 5,63 Reticulozyten.
1b ist ein FL1 Histogramm der gesperrten roten Blutzellen-("RBC")-Population aus der 1a.
1c ist ein FACScan® Cytogramm von FSC vs. FL1 Signale einer klinischen Probe mit 2,63 Reticulozyten und erhöhter weißer Blutzell-("WBC")-Population.
1d ist ein FL1 Histogramm der gesperrten RBC Population aus der 1c.
2a und 2b sind graphische Darstellungen der Ergebnisse einer Zeitstudie, die eine FACScan® Instrument durchgeführt wurden.
3a ist ein FACScan® Cytogramm von FSC vs. FL1 Signale einer klinischen Probe mit erhöhter Reticulozyten.
3b ist ein FL1 Histogramm der gesperrten RBC Populationen der Blutprobe aus der 3a.
4a ist ein Abbott Laboratories Hematologieanalyzercytogramm einer Probe von normalen Blut, das die vier Dekaden log Intermediate Winkel Lichtbrechung ("IAS") gegen die vier Dekaden log FL1 zeigt.
4b ist ein FL1 Histogramm der gesperrten RBC Population und Reticulozytenpopulation aus der 4a. Das 1-fache Vergrößerung des Histogramms zeigt den RBC Spitzenwert und die 5-fache Vergrößerung des Histogramms zeigt die Reticulozyten-Population.
5a ist ein Abbott Laboratories Hematologieanalyzercytogramm von IAS vs. FL1 einer klinischen Blutprobe mit sehr niedrigen Reticulozyten aber erhöhten WBC.
5b ist ein FL1 Histogramm der gesperrten RBC und Reticulozytenpopulation aus 5a. Sowohl die 1- und 5-fache Vergrößerung des Histogramms sind gezeigt.
6a ist ein Abbott Laboratories Hematologieanalyzer- cytogramm von IAS vs. FL1 einer anti-koagulierten klinischen Blutprobe mit erhöhten Reticulozyten (20,5) und WBC (96,4 Tausend/Liter) Niveaus.
6b is t ein FL1 Histogramm der gesperrten RBC und Reticulozytenpopulation aus der 6a. Sowohl die 1- und 5-fache Vergrößerung des Histogramms sind gezeigt.
7 ist eine graphische Darstellung des Vergleichs von Reticulozytenergebnissen. die durch die Ausführung des National Committee for Clinical Laboratory Standards ("NCCLS") Verfahrens gegenüber einem automatisiertem Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielt wurden.
8 ist eine graphische Darstellung, die einen Vergleich von linearer Regressionsdaten für Reticulozytenergebnisse zeigt, die erzielt wurden durch Ausführung eines Thiazol orange Färbeverfahrens gegenüber einem automatisierten Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von Reticulozyten. Die gleichen klinischen Proben die in der 7 gezeigt sind, wurden für diese Analyse verwendet.
9 ist eine graphische Darstellung der Linearität der prozentualen Reticulozyten, die durch Ausführung eines automatisierten Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen wurden.
10 ist ein Lager-Zeit-Überlebensstudien-Emission-Spektrum der an RNR gebundenenen proprietären Cyaninfarbstoffe, Sybr 11 (Molecular Probes, Eugene, OR) in Anwesenheit und unter Fehlen von verschiedenen nicht ionischen Tensiden. Die Reagenzien wurden bei Raumtemperatur für dreieinhalb Monate aufbewart.
11 ist ein Lager-Zeit-Überlebensstudien-Emission-Spektrum des an RNA gebundenen Cyanin-proprietären Farbstoffs, Sybr 11, welches vier-monatige Stabilität unter Kühlbedingungen zeigt.
12 ist ein Lager-Zeit-Überlebensstudien-Emission-Spektrum des an RNA gebundenen proprietären Cyaninfarbstoffs, Sybr 11, welches eine Stabilität bei drei-wöchiger erhöhter Temperatur zeigt.
13 ist ein Zeit-Studien-Emission-Spektrum des RNA gebundenen proprietären Cyaninfarbstoffs, Sybr 16 (Molecular Probes, Eugene, OR) in Bis-Tris Puffer mit und ohne 1,0% Polyoxypropylen-polyoxyethylen Blockcopolymer ("Pluronic® F127") und bei Raumtemperatur für sechseinhalb Monate gelagert.
14 ist ein Lager-Zeit-Überlebensstudien-Emission-Spektrum des an RNA gebundenen proprietären Cyaninfarbstoffs, Sybr 11 in unterschiedlichen Puffern mit 0,2% Pluronic® F127. Alle Reagenzien wurden bei Raumtemperatur für sechs Wochen gelagert.
15a ist ein FACScan® Cytometer zweidimensionales Darstellung von FSC vs. FL1 Signale.
15b ist das FL1 Histogramm der gesperrten roten Blutzellpopulation aus der 15a.
15c ist eine Zeitstudie durchgeführt an den FACScan® Flußcytometer ausgedruckt als Reticulozyten % von 15 Sekunden bis 4,0 Minuten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Verfahren und stabile wässerige Reagenziensysteme zur schnellen und genauen Analyse einer Blutprobe hinsichtlich der Reticulozyten durch Verwendung von Fluß-cytometrischen Verfahrensweisen. Im allgemeinen betreffen diese Ausführungsformen die schnelle und gleichzeitige Analyse von Reticulozyten und vollständigen Blutzellzählungen ("CBC"), einschließlich von nukleierten roten Blutzellen ("NRBC"). Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die Anwendung eines analytischen Instrumentes und eines Verfahrens zur Analyse von Blut umfassen. Im allgemeine umfasst ein solches analytisches Instrument einen automatisierten Impedanz-Analyzer. In einem solchen automatisierten Instrument wird ein automatisierter Lichtbrechung-Analyzer integriert mit dem automatisierten Impedanz-Analyzer und ein automatisierter Fluoreszenz-Analyzer wird integriert mit dem automatisiertem Lichtbrechung-Analyzer.
Zum Zwecke dieser Offenlegung wird ein automatisierter Analyzer unterschieden insofern, dass ein Bediener nicht bei der Analyse der Probe eingreifen muss, das bedeutet, dass nach dem der Bediener die Probe in den automatisierten Analyzer einführt, keine weitere Intervention des Bedieners erforderlich ist. Zusätzlich quantifiziert und klassifiziert ein hematologischer Analyzer die Zellen in im wesentlichen absoluten Ausdrücken. Ein solcher Analyzer verwendet mindestens die elektrischen Impedanz und die optischen Lichtbrechungseigenschaften der Zellen (oder beides), um die Zellen hinsichtlich ihrer Größe und Form zu Klassifizieren.
Implementationen der Erfindung können im allgemeinen einen automatisierten hematologischen Analyzer mit einer Steuerung verwenden, welcher die verschiedenen Analysatoren überwacht und steuert, Daten aus den Analysatoren sammelt und ein Ergebnis berichtet. Beispielhaft dargestellt, erlaubt die Integration des Analyzers mit einer Steuerung einem Bediener, Daten über eine Vollblutprobe in die Steuerung einzugeben. Der Bediener wählt mit Hilfe der Steuerung eine Serie von Tests aus, die an der Vollblutprobe durchgeführt werden sollen. Der Bediener stellt die Vollblutprobe den integrierten Analysatoren in einer zentralisierten Probenverarbeitungsfläche bereit. Die Steuerung aktiviert die Analysatoren, was den Analysatoren gestattet automatisch die Analysen an der Vollblutprobe durchzuführen unter Anleitung der Steuerung. Die Steuerung verwendet Daten, die aus den Analysatoren erzielt werden, um ein Ergebnis zu formulieren. Die Steuerung liefert das Ergebnis an den Bediener. Es sollte ebenfalls festgehalten werden, dass keine Bedienerhandlung notwendig ist, nach dem die Vollblutprobe den integrierten Analysatoren bereitgestellt wurde. Da die Vollblutprobenherstellung vollständig automatisiert ist, werden in einer bevorzugte Ausführungsform herkömmliche Hematologietests zunächst durchgeführt, worauf die inkubierten Probentests folgen. Da die Analysatoren mit der Steuerung integriert sind, erzielt die Steuerung Daten sowohl aus dem Hematologie-Analyzer und aus dem Flußcytometrie-Analyzer. Somit ist die Steuerung in der Lage, eine kombinierte Patientenblutanalyse an den Bediener zu liefern Während spezifischer Ausführungsformen der Erfindung im Detail beschrieben werden, um dieses Verständnis zu vereinfachen soll festgestellt werden, dass andere Ausführungsformen ebenfalls möglich sind. Jegliche gewünschte Kombination von Elementen der beschriebenen Ausführungsformen ist ebenfalls möglich. In einem Aspekt der Erfindung wird eine stabile wässerige Reagenz-Zusammensetzung bereitgestellt. Dieses Reagenz umfasst folgendes: einen asymmetrischen Cyaninfarbstoff, mit der Fähigkeit Reticulozyten zu färben, von etwa 20 mM bis etwa 50 mM eines Puffers gewählt aus der Gruppe bestehend aus Imidazolpuffer, 4-(2-Hydroxyethyl)-1-perperazinethan-sulfonsäure ("Hepes") Puffer, Bis (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethan-sulfonsäure ("Bis-Tris") Puffer und Tris Hydroxymethyl Amionmethan ("Tris") Puffer; ein pH von etwa 6,0 bis etwa 8,0; eine Osmolarität eingestellt auf etwa 230 bis etwa 340 mOsm/L mit einem mono- oder divalenten Alkalisalz, und ein nicht ionisches Tensid (von etwa 5 mg/dl bis etwa 1,0 g/dl abhängig von dem Tensid), welches die Membrandurchdringung vereinfacht und den Cyaninfarbstoff in einer wässerigen isotonischen Lösung stabilisiert. Vorzugsweise sind die Farbstoffe substituiert und zeigen verstärkte Fluoreszenz unter Bindung mit DNA oder RNA. Noch stärker bevorzugt umfasst das Reagenz von etwa 0,1 μg/ml bis etwa 0,3 μg/ml eines zyklisch substituierten asymmetrischen Cyaninfarbstoffes.
Ein weiterer Aspekt bringt mit sich Verfahren für den raschen und kontinuierlichen Nachweis zur Zählung von Reticulozyten und CBC Differenzialen, unter Verwendung des vorliegenden erfinderischen Reagenziensystems. Solche Verfahren sind einzigartig aufgrund der besonderen Abwesenheit des Bedürfnisses einen getrennten Inkubationsschritt bereitzustellen. Die minimale erforderliche Inkubationszeit von etwa 10 bis 60 Sekunden ist alles was notwendig ist.
Eine solche Ausführungsform ist ein Verfahren zur Zählung von Reticulozyten aus einer Vollblutprobe während gleichzeitig ein getrenntes Aliquot der Probe differenziert wird, um eine vollständige Blutzell ("CBC") Analyse zu erhalten. Dieses Verfahren umfasst das Leiten einer oder mehrerer Aliquote der Probe in verschiedenen Positionen innerhalb eines automatischen Analyzers zur Analyse und Differenzierung, während ein Reticulozyten-Aliquot der Probe mit einem färbenden Reagenz kombiniert wird. Dieses Reagenz umfasst eine Reticulozyten färbende Menge eines asymmetrischen Cyaninfarbstoffes, von etwa 20 mM bis etwa 60 mM einer Pufferlösung, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Hepes, Bis-Tris und Tris Puffer und eine Farbstoffstabilisierende Menge eines anionischen Tensids gewählt aus der Gruppe bestehend aus N,N-bis[3-D-Glukon-amidopropyl]cholamid, n-Dodecyl-D-Maltosid, einem Polyoxypropylen-polyoxyethylen Blockcopolymer, n-Tetradecyl-D-Maltosid, Decanoyl-N-methyl-glucamid, n-Dodecyl-D-glucopyranosid und n-Decyl-D-glucopyranosid worin das Reagenz einen pH von etwa 6,0 bis etwa 8,0 hat und eine Osmolarität eingestellt auf etwa 230 bis etwa 340 mOsm/l mit einem mono- oder divalenten Alkalisalz, welches nicht mit dem Cyaninfarbstoff interagiert oder in der wässerigen Reagenzlösung ausfällt wie zum Beispiel NaCl, KCl, LiCl, CaCl₂, MgCl₂ und ZnCl₂. Das kombinierte Reagenzien/Reticulozytenaliquot wird dann in eine optische Sendezone eines automatischen Analysators geleitet. Danach wird das Reagenzien/Reticulozytenaliquot durch eine beleuchtete Sendezone hindurchgeleitet, im wesentlichen eine Zelle zu einem Zeitpunkt, um Fluoreszenz und Lichtbrechungsereignisse zu bewirken. Diese Ereignisse werden detektiert und die Anzahl von Reticulozyten, die in der Probe vorhanden sind, wird daraus bestimmt.
Die asymmetrischen Farbstoffe, welche anwendbar sind mit dem Reagenziensystem gemäß der vorliegenden Erfindung haben im allgemeinen die folgenden Charakteristika:

1. Absorptionsmaximum: 488 + 20 nm
2. Hohe Nukleinsäurebindungsaffinität
3. Hohe Kontenertrag: ≥0,1
4. Einen molaren Extinktionscoeffizienten: ≥10,000
5. Fluoreszenzverstärkung nach Bindung von RNA oder DNA: ≥20
6. Membran Permeationsgeschwindigkeit: <2 Minuten

Üblicherweise sind die Farbstoffe, die bei diesem erfinderischen wässerigen Reagenz verwendet werden, und Reticulozytenzählungsverfahren hoch instabil in wässerigen Umgebungen. Die Stabilitätsdaten für verschiedene in dieser Klasse getestete Farbstoffe sind in den 10 bis 14 gezeigt.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst von etwa 0,05 μg/ml bis etwa 0,5 μg/ml Sybr 11, ein proprietärer Farbstoff, vertrieben durch Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), von etwa 20 mM bis etwa 50 mM Imidazolpuffer und von etwa 5 mg/dl bis etwa 20 mg/dl N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropyl]cholamid ("BIGCHAP"), von etwa 0,02 bis etwa 0,055% Proclin® 300 (5-Chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on + 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on). Der pH wird eingestellt auf von etwa 6,8 bis etwa 7,2 mit 1 N HCl und die Osmolarität eingestellt mit NaCl von etwa 270 bis etwa 310 mOsm/l.
Ein Hauptinhaltsstoff des Reagenziensystems ist der Farbstoff. Eine solche Klasse von Farbstoffen sind asymmetrische Cyaninfarbstoffe wie jene beschrieben in WO94/24213, "ZYKLISCH -ASYMMETRISCHE FARBSTOFFE". Zusätzlich zeigen die in dieser Erfindung verwendeten Farbstoffe verstärkte Fluoreszenz bei Bindung an DNA oder DNA. Solche nützlichen Farbstoffe müssen ebenfalls eine hohe Bindungsaffinität an RNA und DNA haben und einen hohen Quantumertrag. Es wird vorausgesetzt, dass eine Mehrzahl von asymmetrischen Cyaninfarbstoffen, welche die Charakteristika, die hierin beschrieben und beansprucht sind, zeigen, verwendet werden können. Einige der Beispiele für solche Farbstoffe umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Sybr 11, Sybr 14, Sybr 16, ebenfalls erhalten von Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) ("MPI"). Weitere asymmetrische Cyaninfarbstoffe wie zum Beispiel Syto 12, ebenfalls von MPI, sind ebenfalls nützlich bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung. Syto 12 soll ein neutraler asymmetrischer Cyaninfarbstoff sein, welcher ein substituiertes Benzazoliumringsystem umfasst, angeheftet an eine Methinbrücke an ein Pyridin- oder Chinolinringsystem.
Ein weiterer Inhaltsstoff des Reagenziensystems ist ein Puffer, dessen pKa von etwa 6,0 bis etwa 8,0 ist, und welcher fähig ist, die erforderliche (zur Färbung von RNA oder DNA) Konzentration des Cyaninfarbstoffes in einer wässerigen Lösung zu halten über einen verlängerten Zeitraum. Solche Puffer sollten nicht mit den Cyaninfarbstoffen oder den nicht ionischen verwendeten Tensiden bei der Ausführung dieser Erfindung reagieren, um den Farbstoff zu stabilisieren. Beispielhafte Puffer umfassen Imidazol, Hepes, Bis-Tris und Tris.
Ein weiterer Inhaltsstoff des Reagenziensystems ist ein nicht ionisches Tensid. Abhängig von dem Tensid oder der Kombination von nicht ionischen Tensiden, welche verwendet werden, sollte die Konzentration von etwa 5 mg/dl bis etwa 1 g/dl sein. Das oder die Tensid e) scheinen die Geschwindigkeit der Cyaninfarbstoffpermeation durch die Zellmembran (innerhalb 30 Sekunden) zu verstärken. Zusätzlich werden die Löslichkeit und die Stabilität des Cyaninfarbstoffes in einer isotonischen wässerigen Lösung durch das Tensid verstärkt. Ein solches Tensid oder solche Tenside sollten jedoch nicht den Cyaninfarbstoff ausfällen oder mit ihrem Reagieren oder rote Blutzellen lysieren, und zwar selbst bei den niedrigen Konzentrationen. Beispiele solcher Tenside sind, sind jedoch nicht beschränkt auf, BIGCHAP, n-Dodecyl-D-Maltosid, Polyoxypropylen-polyoxyethylen Blockcopolymer ("Pluronic® F127"), n-Tetradecyl-D-Maltosid, Decanoyl-N-methyl-glucamid, n-Dodecyl-D-glucopyranosid und n-Decyl-D-glucopyranosid.
Ein weiterer Inhaltsstoff des Reagenziensystems ist ein mono- oder divalentes Alkalisalz, um die Osmolarität der Reagenzie von etwa 230 mOsm/l bis etwa 340 mOsm/l einzustellen, um die Lyse von roten Blutzellen, einschließlich der Reticulozyten oder der weißen Zellen zu verhindern. Solche Salz sollten nicht mit einem der Cyaninfarbstoffe reagieren oder in Lösung ausfallen. Beispiele für solche Salze umfassen NaCl, KCl, LiCl, CaCl₂, MgCl₂, ZnCl₂ und weitere.
Ein fakultativer Inhaltsstoff ist ein Konservierungsstoff, um mikrobielles Wachstum in des Reagenz zu verhindern. Ein solcher Konservierungsstoff sollte die Lichbrechung oder Fluor reszenzaussendungseigenschaften der Zellen oder gefärbten Zellen nicht verändern. Beispiele solcher Konservierungsstoffe umfassen Proclin® 300, Proclin® 150, Natriumazid und andere.
Unter Verwendung des oben beschriebenen Reagenziensystems ist die schnelle Analyse von Reticulozyten in einem Flußcytometer oder anderen automatisierten hematologischen Analysatoren möglich. In einer Ausführungsform werden 5 μl einer Vollblutprobe gemischt mit 1,0 ml des Reagenziensystems, welches hierin offenbart und beansprucht ist und die Probenreagenzmischung wird durch ein kommerziell verfügbares Flußcytometer innerhalb 30 bis 60 Sekunden von Mischen hindurchgeleitet und mit so wenig wie (10) zehn Sekunden. Die 1a bis 1d zeigen die Ergebnisse eines solchen Verfahrens unter Verwendung einer Vollblutprobe hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gestattet die schnelle und quantitative Analyse von Reticulozyten in einem automatisierten Multi-Parameter-Hematologie-Analyzer. Die U.S. Patentanmeldung Seriennr. 08/283,379, betitelt "VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR DURCHFÜHRUNG EINER AUTOMATISCHEN ANALYSE", eingereicht am 1. August 1994, legt einen automatisierten hematologischen Analyzer offen, welcher unter anderen den axialen Lichtverlust eines Lichtbrechungssignals ("ALL") und intermediäre Winkel-Lichtbrechung ("IAS") verwendet, sowie die Detektion verschiedener fluoreszierender Signale, um dem Instrument zu gestatten, automatisch zwischen Zellen und Subklassen von Zellen aus einer Vollblutprobe zu differenzieren.
Insgesamt wird jedoch ein Verfahren zur Durchführung der vorliegenden Erfindung das Mischen einer Vollblutprobe mit einem Reagenz zur Färbung der DNA jeglicher vorhandener Reticulozyten umfassen, das Hindurchleiten der Mischung, im wesentlichen mit einer Zelle zu einem Zeitpunkt, durch eine beleuchtete optische Flußzelle, die Detektion des gebrochenen Lichts und der daraus ausgesendeten Fluoreszenz und die Bestimmung der Menge von Reticulozyten, die in der Probe vorhanden sind, und zwar ohne das Unterwerfen der Proben/Reagenzmischung einem getrennten Inkubationsschritt oder Zeitraum. Eine Reagenzie gemäß dieser Erfindung umfasst von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 0,3 μg/ml eines, asymmetrischen Cyaninfarbstoffs; von etwa 20 mM bis etwa 60 mM eines Puffers gewählt aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Hepes, Bis-Tris, und Tris Puffer; von etwa 5 mg/dl bis etwa 1, 0 g/dl eines nicht ionischen Tensids, abhängig von dem Tensid oder der Kombination von Tensiden, und das Reagenz hat einen pH von etwa 6,0 bis etwa 8,0; und eine Osmolarität eingestellt bis etwa 230 bis etwa 340 mOsm/l mit einem mono- oder divalenten Alkalisalz.
Um eine Vollblutprobe hinsichtlich des Prozentsatzes sowie auch den Absolutzahlen von Reticulozyten auf dem oben beschriebenen Multi-Parameter-Hematologie-Analyzer zu analysieren, werden etwa 18,75 μl einer Vollblutprobe über eine Probenaspirationssonde in eine RBC Schale abgelegt, welche etwa 7856 μl einer Verdünner/Abtrennlösung (eine isotonische Kochsalzlösung) enthält und die Flüssigkeiten werden gemischt. Die verdünnte Probe wird dann zu einer abgetrennten Impedanzöffnung transportiert, um elektronisch die absoluten RBC Zählungen der Probe zu bestimmten (siehe Details der Instrumentenkalibration zur RBC Analyse in U.S. Patent Applikationsseriennr. 08/283,379, betitelt "VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR DURCHFÜHRUNG VON AUTOMATISIERTEN ANALYSEN", eingereicht am 1. August 1994. In der Zwischenzeit werden etwa 200 μl der verdünnten Probe in einen anderen Behälter ("Reticulozyten empfangende Schale") überführt, welcher 600 μl des Reagenz der vorliegenden Erfindung enthält, wo sie gemischt wird. Die vorbereitete (gemischte) Probe wird dann zu der abgetrennten optischen Flußzelle zum Nachweis transportiert. Der Messprozess beginnt sobald der Zellstrom durch die Flußzelle hindurch tritt, im wesentlichen eine Zelle zu einem Zeitpunkt, in einem laminaren fließenden Probenstrom umflossen durch ein Verdünner/Abtrennlösung. Das Volumen wird bestrahlt mit einem Lichtstrahl und wird in den zwei Dimensionen begrenzt, die in normaler Ausrichtung zu der Flußachse stehen, durch den hydrodynamisch gebündelten Zellstrom, und in der Dimension, die parallel zu der Flußachse steht, durch den vertikalen Strahlengürtel des Laserstrahls, welcher etwa 17 Mikron beträgt. Bei Durchführung dieses Testes ist die Probenflußrate etwa 2,0 μl pro Sekunde und das entsprechende beleuchtete Fühlvolumen des RBC und Reticulozytenprobenstroms entspricht ungefähr einen elliptischen Zylinder mit den Dimensionen von etwa 80 × 5 × 17 Mikron. Die 17 Mikron-Dimension wird gemessen entlang der Achse des Zylinders.
Zu diesem Punkt, und wie gezeigt in den zweidimensionalen Eigenschaftenabstand von IAS und FL1 in dem Cytogramm aus der 4a wird das Vorhandensein einer Zelle bestimmt durch eine intermediäre Winkelbrechungsphotodiode, welche Licht in einem 3° bis 10° Konus detektiert und eine photomultiplier Röhre ("PMT"), welche grüne Fluoreszenz detektiert, FL1. Wenn Zellen durch das zuvor erwähnte beleuchtete Volumen hindurchtreten, werden Pulse erzeugt und durch diese Detektoren gemessen. Die Amplituden der Pulse werden dann gefiltert, verstärkt, digitalisiert und in Listen-Modus in den entsprechenden zweidimensionalen Eigenschaftenraum von ihrer IAS und FL1 gespeichert. Die Zellen werden 8 Sekunden lang gezählt. Bei der Flußrate und dem Verdünnungsverhältnis, das oben beschrieben ist, und mit einem normalen menschlichen RBC Zählung von 5 Millionen pro Mikroliter von Blutvolumen, wäre die entstehende Ereigniszählrate 5950 pro Sekunde. Die Algorithmen werden dann auf den Listen-Modusdaten des zuvor erwähnten Eigenschaftenraums von IAS und FL1 verwendet und die folgenden Parameter werden innerhalb von 20 Sekunden Berechnungszeit gemessen:

1. RBC Filter: weiße Blutzellen (WCB) und Trombozyten werden ausgeschlossen durch das Abtrennen der RBC Population, einschließlich Reticulozyten, jedoch unter Ausschluss von WBC und Trombozyten.
2. Der Prozentsatz von Reticulozyten: Die abgetrennten RBC Population wird erneut analysiert gemäß der Größe ihrer FL1 Signale. Eine lange Anpassung wird angewendet auf das FL1 Histogramm, um den Bereich zu definieren, welcher zu reifen RBC gehört und die Zellen deren FL1 Signale oberhalb des Bereiches liegen, werden als Reticulozyten bezeichnet. Reticulozytenprozent wird berechnet durch das Teilen der Zählung von Reticulozyten durch die gesamte RBC Zählung.
3. Die absolute Reticulozytenzählung: Erzielt durch die Multiplikation des Prozentsatzes von Reticulozyten mit der, absoluten RBC Zählungen der Probe aus den CBC Modus.
4. Reticulozyten Reifungsindex ("RMI"): RMI wird ausgedrückt als der Prozentsatz von Reticulozyten deren FL1 Signale mehr als eine (1) Standardabweichung ("S. D.") oberhalb der mittleren Fluoreszenz einer normal Reticulozytenpopulation liegt.

Eine solche Beschreibung ist rein zur Bequemlichkeit und keinesfalls ist der Ausdruck des RMIs gemäß der vorliegenden Erfindung beschränkt auf die hierin beschriebenen Algorithmen.
Die folgenden Beispiele zeigen die Ergebniszusammensetzungen und Verfahren, die die gleichen verwenden für die schnelle Analyse von Reticulozyten und der Verwendung von Lichtbrechungs- und Fluoreszenzfluß cytometrischen Techniken. Es soll verstanden werden, dass die folgenden Beispiel rein für darstellende Zwecke dienen und nicht den Schutzumfang dieser Erfindung in irgendeiner Art und Weise einschränken sollen.
Beispiel 1
Fünf (5) Mikroliter einer chemischen Probe wurden gemischt mit 1,0 ml des Reagenz, das 50 mM Imidazolspuffer, pH eingestellt mit 1 N HCl auf 8, 0 + 0, 1, 6, 4 g/l NaCl, 0, 1 Mikrogramm pro ml von Sybr 14 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), 0,2% Pluronic® F127 und 0,03% Proclin® 300 umfasste. Die Proben/Reagenzmischung wird dann innerhalb von 30–60 Sekunden durch ein FACScan® Flußcytometer (Becton Dickinson & Co.) hindurchgeleitet, um die Geschwindigkeit der Membran-Permeation durch den Farbstoff in der Reagenz-Zusammensetzung zu bestimmen. 1a ist eine zweidimensionale Darstellung der Vorwärtsstreuung (FSC) vs. grüne Fluoreszenz (FL1) Signale; 1b ist das FL1 Histogramm der begrenzten roten Zellenpopulation, was die gefärbte Reticulozytenpopulation rechts von der reifen Blutzellpopulation offenlegt. 1c und 1d zeigen die Ergebnisse einer zweiten klinischen Probe dargestellt in einer ähnlichen Art und Weise wie die 1a bzw. 1b.
Beispiel 2
2a ist eine Zeitstudie die an den FACScan® Flußzytometer durchgeführt wurde ausgedrückt als Reticulozyten % über einen verlängerten Zeitraum (von 30 Sekunden bis 30 Minuten) und 2b ist ausgedruckt als die Reticulozyten mittlerer FL1. Wie aus den Figuren ersichtlich erreicht der Prozentsatz der Reticulozyten einen stabilen Zustand innerhalb 30 Sekunden und die Färbungsintensität erreicht etwa 80% des Spitzenwertes innerhalb von 30 Sekunden. Eine solche schnelle Färbung durch die Mittel der vorliegenden Erfindung erlaubt das Einbringen des Verfahrens und des Reagenz, das hierin offenbart sind, in automatisierte hematologische Anahyzer, so wie auch Flußcytometer, ohne das Bedürfnis für getrennte Inkubationsausrüstung oder Verfahren.
Beispiel 3
Fünf (5) Mikroliter einer klinischen Probe mit etwa 15% Reticulozyten wurden gemischt mit 1,0 ml der Reagenzie gemäß der vorliegenden Erfindung bestehend aus 50 mM Imidazolpuffer, pH eingestellt mit 1 N HCl auf 7,0 + 0,1, 6,4 g/l NaCl, 0,2 Mikrogramm/ml Sybr 11 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), 0,2% Pluronic® F127 und 0,03 Proclin® 300. Die Probe/Reagenzmischungen wurden dann auf einen FACScan® Flußcytometer innerhalb 30 Sekunden durchgeführt, um den Prozentsatz der Reticulozyten in den Proben zu bestimmen. 3a ist eine zweidimensionale Darstellung der FSC gegen die FL1 Signale und 3b ist das FL1 Histogramm der begrenzten roten Blutzellpopulation. Wie die Daten zeigen, sind weiße Blutzellen und Trombozyten gut getrennt von den roten Blutzellen und der Reticulozytenpopulation, die FL1 Intensität der gefärbten Reticulozyten ist so, dass die Definition des Bereiches der Reticulozyten in dem FL1 Histogramm der roten Blutzellen leicht ist für die quantitative Analyse der Reticulozytenkonzentration in einer Blutprobe.
Beispiel 4
Für dieses Beispiel wurde ein automatisierter hematologischer Multi-Paratmeter-Analyzer mit hohem Durchsatz (US Patentanmeldungsseriennr. 08/283,379, betitelt als "VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR DURCHFÜHRUNG VON AUTOMATISIERTER ANALYSE", eingereicht am 1. August 1994) verwendet. 18,75 μl einer EDTA-antikoagulierten Vollblutprobe von einem normalen Menschen wurden mittels einer Probenaspirationssonde in die RBC-Schale abgeführt, der etwa 7856 μl einer Verdünner/Abtrennlösung enthielt (eine isotonische Phosphatpufferkochsalzlösung) und gemischt. Die verdünnte Probe wurde dann zu einer abgetrennten Impedanzöffnung transportiert, um die absolute rote Blutzellzählung der Probe zu bestimmen. Gleichzeitig wurden etwa 200 Mikroliter der verdünnten Vollblutprobe in die Reticulozyten-Schale übergeleitet, die 600 Mikroliter des Reagenz der vorliegenden Er- findung enthielt. Dieses Reagenz bestand aus 50 mM Imidazolpuffer, pH eingestellt mit 1 N HCl auf 7,0 + 0,1, 6,4 g/l NaCl, 0,2 μg/ml Sybr 11, 10 mg pro ml BIGCHAP, 0,03% Proclin® 300. Die Proben/Reagenzmischung wurde dann zu der abgetrennten optischen Flußzelle zur Lichtbrechung und Fluoreszenzbestimmung transportiert. Der Nachweisprozess des Systems wurde zuvor oben beschrieben und der gesamte Inhalt des U.S. Patent Seriennr. 08/283,379, benannt "VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR DURCHFÜHRUNG AUTOMATISIERTER ANALYSE" und eingereicht am 1. August 1994. Die Übertragungszeit für den Transport der Probe/Reagenzmischung kann so gering sein, wie zehn (10) Sekunden. Die RBC Population einschließlich Reticulozyten wird beschränkt auf den IAS vs. FL1 Cytogramm (4a) und das FL1 Histogramm der beschränkten RBC Population (4b) wird für Reticulozytenzählungen und RMI Messungen verwendet. Die 1 × Darstellung des FL1 Histogramm wird so bemessen, um den Spitzenwert der RBC Population zu zeigen und die 5 × Darstellung zeigt die Reticulozytenpopulation. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, eine Probe hinsichtlich der Reticulozyten zu analysieren, während gleichzeitig eine CBC Analyse bestimmt wird, und ohne das Bedürfnis für zusätzliche Inkubationsausrüstung oder Verfahren, oder off-line Vorbereitungsschritte.
Beispiel 5
Eine klinische Probe mit einer geringen Konzentration von Reticulozyten und erhöhten weißen Blutzellen (WBC) – wie durch Referenzverfahren bestimmt – wird mittels einer Aspirationsonde in die RBC-Schale des Instrumentes abgelagert, das in US Patentanmeldungsseriennr. 08/283,379 baschreiben wurde, die etwa 7856 μl einer Verdünner/Abtrennlösung (einer isotonischen Kochsalzlösung) enthält, und wird gemischt. Die verdünnte Probe wird dann zu der abgetrennten Impedanzöffnung transportiert, um die absoluten RBC Zählungen der Probe zu bestimmen. In der Zwischenzeit werden etwa 200 Mikroliter der verdünnten Probe in die Reticulozyten-Schale transportiert, welche 600 Mikroliter des Reagenz der vorliegenden Erfindung enthält, bestehend aus 50 mM Imidazolpuffer, pH eingestellt mit 1 N HCl auf 7,0 + 0,1, 6;4 g/l NaCl, 0,2 Mikrogramm pro 1,0 ml Sybr 11, 0,2% Pluronic® F127 und 2,5 mg/dl n-Dodecyl-D-Maltosid, 0,03% Proclin® 300 und gemischt.
Die Proben/Reagenzmischung wurde dann zu der abgetrennten opti schen Flußzelle 100 zum Nachweis transportiert. Der Nachweisprozess des Systems wurde bereits umbeschrieben. Die RBC Population einschließlich der Reticulozyten wird begrenzt an dem IAS vs. FL1 Cytogramm (5a) und das FL1 Histogramm der begrenzten RBC Population (5b) wird verwendet für Reticulozytenzählungen und RMI Messungen (retikulare Zählungen waren zu niedrig, um einen RMI für diese Probe zu berechnen). Die 5b FL1 Histogramme werden so vergrößert, um sowohl den RBC Populationsspitzenwert (1-fache Darstellung) und die Reticulozytenpopulation (5-fache Darstellung) zu zeigen. Keine nachweisbare Reticulozytenpopulation ist in dieser Probe nachweisbar.
Beispiel 6
Für dieses Beispiel wurde eine klinische Probe mit erhöhten Reticulozyten (20% wie in einem Referenzverfahren bestimmt) und erhöhten WBC (96 k/l) verwendet. Die Probe wurde verarbeitet wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Ergebnisse sind in den 6a und 6b gezeigt. Wie die Daten zeigen, schließt die vorliegende Erfindung genau WBC und Trombozyten aus und ist in der Lage sowohl abgedunkelte wie helle Reticulozyten zu identifizieren und zu zählen. Das System erzeugte einen erhöhten RMI Wert von 69,2% an dieser Probe unter Verwendung des oben beschriebenen Algorithmus.
Beispiel 7
Siebenundsiebzig (77) klinische Proben wurden mit einem Multi-Paratmeter-Hematologie-Analyzer mit hohem Durchsatz wie in Beispiel 4 beschrieben untersucht, und ebenfalls mit einem FACScan® Flußcytometer wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht, allerdings unter Verwendung eines Thiazol orange (TO) Verfahrens, welches eine 30 minütige Inkubation bei Raumtemperatur erfordert (U.S. Patent 4,883,867). Das NCCLS Referenzverfahren (siehe Stand der Technik Abschnitt für Details) wurde ebenfalls an jeder Probe durchgeführt. Dann wurden die Ergebnisse der vorliegenden, inkubationsfreien, erfinderischen Verfahrens verglichen mit jenen der TO und NCCLS Ergebnisse. Die linearen Regressionsplots sind dargestellt in den 7 und 8. Wie die Daten zeigen, korrelieren die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung gut sowohl mit dem NCCLS mikroskopischen Verfahren (R = 0,982, Gefälle = 1,05, Y-Treffpunkt = 0,002) und dem TO Verfahren (R = 0,986, Gefälle = 0,964, Y-Treffpunkt = 0,005).
Beispiel 8
Zwei EDTA-anti-koagulierte Hasenblutproben wurden erzielt, eine von einem normalen Hasen (Probe Nr. 1) und eine andere von einem Hasen mit Reticulozytose (Probe Nr. 2). Probe Nr. 1 enthielt 1,9% Reticulozyten und Probe Nr. 2 enthielt über 90% Reticulozyten. Die Linearitätsproben wurden hergestellt gemäß dem folgenden Protokoll:

1. RBC Konzentration beider Proben wurde eingestellt auf 3,5 + 0,05 M/L.
2. Sechs (6) Niveaus von Linearitätsproben wurden hergestellt durch Mischung der beiden Proben wie in der Tabelle unterhalb gezeigt:
3. Die Proben wurden mit dem Hematologieanalyzer der U.S. Patentanmeldungsseriennr. 08/283,379 analysiert.
4. Die theoretischen Werte für Reticulozyten % und absolute Zählung pro μl wurden berechnet gemäß der folgenden Gleichung: Theoretische visuelle % der Probe = [(n/1,5) × A%] + [(m/1,5) × B%] × 100 worin: n = Volumen der Probe 1 in der Linearitätsprobe m = Volumen der Probe 2 in der Linearitätsprobe 1,5 = Gesamtvolumen der Linearitätsprobe A% = optische % in der unteren Probe Nr. 1 B% = optische % in der unteren Probe Nr. 2 Theoretische optische absolut Zahl = [(n × A#) + (m × B#)]/1,5 × theoretische optische % der Probe, worin: n = Volumen von Probe 1 in der Linearitätsprobe m = Volumen von Probe 2 in der Linearitätsprobe 1,5 = Gesamtvolumen der Linearitätsprobe A# = optische # in der unteren Probe Nr. 1 B# = optische # in der unteren Probe Nr. 2
5. Die Linearitätskurve wurde dargestellt unter Verwendung der Abszisse der theoretischen Werte und die Ordinate für die Werte erzielt aus den Multi-Paratmeter-Hematologie-Instrument.

Die Ergebnisse sind in der 9 dargestellt. Die Daten zeigen, liefern das Verfahren und die Reagenzien der vorliegenden Erfindung eine lineare Antwort bis zu einer Reticulozytenkonzentration von 90%.
Beispiel 9
Die Stabilität verschiedener Reagenzien hergestellt der vorliegenden Erfindung bei denen verschiedene Tenside beurteilt wurden, sind in den 10–14 gezeigt. Dies wird erzielt durch den Zusatz von RNA zu den Reagenzien und das Untersuchen der Emission-Spektren der Cyaninnukleinsäuren, die an RNA gebunden sind, mit einem HITACHI F4500® Instrument (Anregung 488 nm) gemäß dem folgenden Protokoll:

1. RNA (Kalbsleber RNA, Sigma Cat. Nr. R7251) Lösungen (1 mg/ml) wurden in entionisiertem Wasser hergestellt.
2. 100 μl von jeder RNA Lagerlösung wurden zugesetzt zu 1,6 ml eines Testreagenz gemäß der vorliegenden Erfindung und gemischt.
3. Das Emission-Spektrum der Cyaninnukleinsäurefärbung gebunden an RNA wurde dann von 450 nm bis 650 nm mit einem HITACHI F4500® Instrument (Anregung 488 nm) gescannt. Die volle Skala für RNA gebundenen Cyaninfarbstoff wird auf 2,000 für alle Testreagenzien eingestellt.

Beispiel 10
10 ist das Emission-Spektrum des an RNA gebundenen Sybr 11 Farbstoffs (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) in 50 mM Imidazolpuffer hergestellt wie beschrieben in Beispiel 4, außer dass 5 unterschiedliche Tenside beurteilt wurden hinsichtlich ihrer Wirksamkeit bei der Stabilisierung des Cyaninfarbstoffes, Sybr 11 in einer wässerigen Lösung. Sämtlichen Reagenzien wurden bei Raumtemperatur für einen Zeitraum für 3,5 Monaten gelagert. Ausgehend von dem höchsten Spitzenwert:

A = BIGCHAP (10 mg%);
B = Maltosid (5 mg%);
C = Pluronic® F127 (0,2%);
D = Cholinsäure, kein Salz (10 mg%);
E = Zusatz eines Tensids;
F = Octansäure, kein Salz (10 mg%).

Wie die Daten zeigen, sind BIGCHAP, Maltosid und Pluronic® F127 sehr wirksam bei der Erhaltung des Farbstoffes in einer wässerigen gepufferten Lösung während Cholinsäure, Natriumsalz und Octansäure, Natriumsalz dies nicht waren. Tatsächlich verkürzte der Zusatz von Octansäure zu der Reagenzie die Lagerzeit des Farbstoffes.
Beispiel 11
11 ist das Emission-Spektrum des RNA gebundenen Cyaninfarbstoffes, Sybr 11, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, mit BIGCHAP oder Pluronic® F127 Tensiden und gelagert bei 4°C für 4 Monate. Ausgehend von dem höchsten Spitzenwert:

A = frisch hergestellte Kontrollreagenzie;
B = BIGCHAP (10 mg%);
C = Pluronic® F127 (0,2%);
D = Pluronic® F127 (1,0%);
E = kein Tensid.

Wie in der Figur gezeigt, ist keine signifikante Verschlechterung des Farbstoffes in der vorliegenden Erfindung während des 4-monatigen Testzeitraums.
Beispiel 12
12 ist das Emission-Spektrum des RNA gebundenen Cyaninfarbstoffes, Sybr 11, welcher eine drei (3) wöchige erhöhte Temperaturstabilität bei dem Reagenz der vorliegenden Erfindung mit 5 mg% BIGCHAP zeigt. Die Testreagenzien wurden hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben und ein RNA Zusatz wurde hergestellt gemäß dem Protokoll von Beispiel 9. Ausgehend von dem höchsten Spitzenwert:

A = 4°C;
B = 25°C;
C = 37°C;
D = 45°C.

Wie die Daten zeigen, führt der Zusatz des nicht ionischen Tensids BIGCHAP zu einer geeigneten wässerigen gepufferten Lösung zu einer verringerten Sensitivität des Cyaninfarbstoffes gegenüber erhöhten Temperaturen, und macht diesen somit stabiler.
Beispiel 13
13 ist das Emissionspektrum des RNA gebundenen Sybr 16 in Bis-Tris Puffer mit und ohne 1,0% Pluronic® F127. Die Reagenzien wurden hergestellt wie beschrieben in Beispiel 4, außer dass der Imidazolpuffer ersetzt wurde durch einen Bis-Tris Puffer und Sybr 11 wurde ersetzt durch Sybr 16 Farbstoff (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) und bei Raumtemperatur für 6,5 Monate gelagert.
Ausgehend von dem höchsten Spitzenwert:

A = Sybr 16 Reagenz mit 1,0% Pluronic® F127;
B = Sybr 16 in Bis-Tris Puffer ohne ein Tensid;
C = Sybr 16 in Imidazolpuffer ohne ein Tensid;
D = Sybr 16 in Glycyl-Clycinpuffer mit 1,0% Pluronic® F127.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Stabilisierung dieses Zellenfarbstoffes eine geeignete Kombination eines Puffers und eines Tensids erfordert.
Beispiel 14
14 ist das Emission-Spektrum des RNA gebundenen Sybr 11 Cyaninfarbstoffes in verschiedenen Puffern, zusammen mit 0,2% Pluronic® F127. Sämtliche Reagenzien wurden bei Raumtemperatur für sechs Wochen gelagert.
Ausgehend von dem höchsten Spitzenwert:

A = Trispuffer;
B = Bis-Tris Puffer;
C = Imidazol;
D = Hepespuffer;
E = Glycyl-Glycinpuffer;
F = Phosphatpuffer.

Wie diese Daten zeigen, konservieren Tris, Bis-Tris und Imidazolpuffer den Farbstoff gut, wogegen Glycyl-Glycin und Phosphatpuffer dies nicht tun.
Beispiel 15
Fünf (5) Mikroliter einer normalen Probe mit etwa 2,3% Reticulozyten wurden gemischt mit 1,0 ml des Reagenz gemäß der vorliegenden Erfindung bestehend aus 50 mM Trispuffer, pH eingestellt auf 1 N HCl auf 7,0 + 0,1, Osmolarität eingestellt auf 290 mOsm/l mit NaCl, 0,2 μg/ml Syto 12 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), 0,2% Pluronic® F127 und 0,03 Proclin® 300. Die Proben/Reagenzmischung wurden auf einem FACScan® Flußcytometer innerhalb von 15 Sekunden durchgeführt, um den Prozentsatz von Reticulozyten in der Probe zu bestimmen. 15a zeigt das FACScan® Cytometer zweidimensionale Display der FSC gegen FL1 Signale; und 15b zeigt das FL1 Histogramm der beschränkten roten Blutzellenpopulation. 15c ist eine Zeitstudie durchgeführt auf den FACScan® Flußcytometer ausgedrückt als Reticulozytenprozent von 15 Sekunden bis 4,0 Minuten. Wie in den Figuren ersichtlich, trennt das RBC + Reticulozytenfenster klar die Reticulozyten von den Trombozyten und weißen Blutzellen und die Reticulozytenfärbung ist so schnell, dass der Prozentreticulozyten das stabile Stadium innerhalb von 15 Sekunden erreicht. Eine solche rasche Färbung erlaubt die Einbringung des Nachweises in automatisierte hematologische Analyzer sowie auch in Flußcytometer.

Claims

Ein wässeriges Nukleinsäurefärbereagenz, das folgendes umfasst: eine Reticulozyten-färbende Menge eines asymmetrischen Cyaninfarbstoffs; von etwa 20 mM bis etwa 60 mM einer Pufferlösung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Hepes, Bis-Tris und Tris Puffern; und eine Farbstoff-stabilisierende Menge eines nicht ionischen Tensids, gewählt aus der Gruppe bestehend aus N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropyl]cholamid, n-Dodecyl-D-Maltosid, einem Polyoxypropylen-polyoxyethylen Blockcopolymer, n-Tetradecyl-D-Maltosid, Decanoyl-N-methyl-glucamid, n-Dodecyl-D-Glucopyranosid und n-Decyl-D-glucopyranosid, worin das Reagenz einen pH von etwa 6,0 bis etwa 8,0 besitzt und eine Osmolarität, die eingestellt ist auf etwa 230 bis etwa 340 mOsm/l mit einem mono- oder divalenten Alkalisalz, welches nicht mit dem Cyaninfarbstoff interagiert oder in der wässerigen Reagenzlösung ausfällt.
Das Reagenz von Anspruch 1, worin der asymmetrische Cyaninfarbstoff zyklisch substituiert ist.
Das Reagenz von Anspruch 1, worin der asymmetrisch Cyaninfarbstoff gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sybr 11, Sybr 14, Sybr 16 und Syto 12.
Das Reagenz von Anspruch 1, worin der asymmetrische Cyaninfarbstoff Sybr 11 ist.
Das Reagenz von Anspruch 3, worin die Reticulozytenfärbende Menge des asymmetrischen Cyaninfarbstoffs von etwa 0,1 μl/ml bis etwa 0,3 μg/ml ist.
Das Reagenz von Anspruch 5, worin der Puffer Imidazol ist.
Das Reagenz von Anspruch 5, worin das nicht-ionische Tensid in einer Menge von etwa 0,1 g/dl bis etwa 1,0 g/dl vorhanden ist.
Das Reagenz von Anspruch 7, worin das nicht-ionische Tensid ein Polyoxypropylen-polyoxyethylen Blockcopolymer ist.
Das Reagenz von Anspruch 5, worin das nicht-ionische Tensid in einer Menge von etwa 5 mg/dl bis etwa 20 mg/dl vorhanden ist.
Das Reagenz von Anspruch 9, worin das nicht-ionische Tensid N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropyl]cholamid ist.
Das Reagenz von Anspruch 1, welches weiterhin eine wirksame Menge eines Konservierungsstoffes umfasst, der mikrobielles Wachstum hemmt.
Das Reagenz von Anspruch 11, worin der Konservierungsstoff gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proclin^® 300, Proclin^® 150 und Natriumazid.
Ein Verfahren zur Zählung von Reticulozyten aus einer Vollblutprobe, während gleichzeitig ein separates Aliquot der, Probe differenziert wird, um eine vollständige Blutzellen ("CBC") -Analyse zu erzielen, worin das Verfahren folgendes umfasst: a) Leiten eines oder mehrerer Aliquote der Probe in verschiedene Positionen innerhalb eines automatisierten Analysators zur Analyse und Differenzierung; b) Kombinieren eines Reticulozyten-Aliquots der Probe mit einem Reagenz, das folgendes umfasst: eine Reticulozytenfärbende Menge eines asymmetrischen Cyaninfarbstoffes, von etwa 20 mM bis etwa 60 mM einer Pufferlösung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Hepes, Bis-Tris und Tris-Puffern, und eine Farbstoff-stabilisierende Menge eines nicht-ionischen Tensids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N,N-bis[3-D- Glucon-amidopropyl]cholamid, N-Dodecyl-D-Maltosid, ein Polyoxypropylen-polyoxyethylen Blockcopolymer, n-Tetradecyl-D-Maltosid, Decanoyl-N-methyl-glucamid, n-Dodecyl-D-glucopyranosid und n-Decyl-D-glucopyranosid, worin das Reagenz einen pH von etwa 6,0 bis etwa 8,0 hat und eine Osmolarität, die eingestellt ist auf etwa 230 bis etwa 340 mOsm/l mit einem mono- oder divalenten Alkalisalz, welches nicht mit dem Cyaninfarbstoff interagiert oder in der wässerigen Reagenzlösung ausfällt während das kombinierte Reagenz/Reticulozytenaliquot in eine optische Aufzeichnungszone eines automatisierten Analysators geleitet wird; c) Veranlassen, dass das kombinierte Reagenz/Reticulozytenaliquot durch die Aufzeichnungszone hindurchgeleitet wird, und zwar wesentlichen eine Zelle zu einem Zeitpunkt; d) Beleuchten der gefärbten Probe in der optischen Abtastzone mit einem einfallenden Lichtstrahl, um Fluoreszenzereignisse zu bewirken; e) Messen der Fluoreszenzereignisse für die Reticulozyten in der Probenlösung, wenn die gefärbten Reticulozyten durch die optische Abtastzone hindurchtreten; und f) Bestimmen der Anzahl von Reticulozyten, die in der Probe vorhanden sind, durch das Zählen der gemessenen Fluoreszenzereignisse der gefärbten Reticulozyten.
Das Verfahren von Anspruch 20, worin die zyklisch substituierten Cyaninfarbstoffe gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sybr 11, Sybr 14 und Sybr 16.
Ein Verfahren zur Zählung von Reticulozyten aus einer Vollblutprobe, worin das Verfahren folgendes umfasst: a) Kombinieren eines Aliquots der Probe mit einem Reagenz, das folgendes umfasst: eine Reticulozyten-färbende Menge eines asymmetrischen Cyaninfarbstoffes, von etwa 20 mM bis etwa 60 mM einer Pufferlösung gewählt aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Hepes, Bis-Tris und Tris Puffer, und eine Farbstoffstabilisierende Menge eines nicht-ionischen Tensids, gewählt aus der Gruppe bestehend aus N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropyl] cholamid, n-Dodecyl-D-Maltosid, einem Polyoxypropylen-polyoxyethylen Blockcopolymer, n-Tetradecyl-D-Maltosid, Decanoyl-N-methyl-glucamid, n-Dodecyl-D-glucopyranosid und n-Decyl-D-glucopyranosid, worin das Reagenz einen pH von etwa 6,0 bis etwa 8,0 hat und eine Osmolarität, die eingestellt ist auf etwa 230 bis etwa 340 mOsm/l mit einem mono- oder divalenten Alkalisalz, welches nicht mit dem Cyaninfarbstoff interagiert oder in der wässerigen Reagenzlösung ausfällt, während das kombinierte Reagenz/Reticulozytenaliquot zu einer optischen Abtastzone eines automatisierten Analysators geleitet wird; b) Bewirken, dass das Reagenz/Reticulozytenaliquot durch die Abtastzone im wesentlichen mit einer Zelle zu einem Zeitpunkt hindurchtitt; c) Beleuchten der gefärbten Probe in der optischen Abtastzone mit einem einfallenden Lichtstrahl, um Fluoreszenzereignisse zu bewirken; d) Messen der Fluoreszenzereignisse für die Reticulozyten in der Probenlösung, wenn die gefärbten Reticulozyten durch die optische Abtastzone hindurchtreten; und e) Bestimmen der Anzahl von Reticulozyten, die in der Probe enthalten sind, durch Zählen der gemessenen Fluoreszenzereignisse der gefärbten Reticulozyten.