DE69628291T2

DE69628291T2 - Fermentationsprozess mittels zentrifugation

Info

Publication number: DE69628291T2
Application number: DE69628291T
Authority: DE
Inventors: H. Heath HERMAN
Original assignee: Kinetic Biosystems Inc
Current assignee: KBI Biopharma Inc
Priority date: 1995-03-28
Filing date: 1996-03-27
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2016-03-28
Also published as: ATE240769T1; EP0820337A1; US5821116A; JP4091052B2; WO1996030101A1; DE69628291D1; CA2216467A1; EP0820337B1; US5622819A; EP0820337A4; JPH11502715A; JP2005124590A

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren und eine verbesserte Vorrichtung für die kontinuierliche Zucht von Biokatalysatoren. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zucht von Mikroorganismen, oder von Pflanzen oder Tierzellen, oder subzellulärer Zellenkomponenten als dreidimensionale Anordnungen, die in Zentrifugalkraftfeldern immmobilisiert werden, denen durch Flüssigkeitsströmungen entgegengewirkt wird. Die vorliegende Erfindung erlaubt das Aufrechterhalten von Biokatalysatorkulturen mit extrem hoher Dichte und sie maximiert ihre Produktivität.
Hintergrund der Erfindung
Der Ausdruck "Fermentierung", wie er hierin verwendet wird bedeutet jede aus einer Gruppe von chemischen Reaktionen, die durch lebende oder nichtlebende Biokatalysatoren induziert werden. Der Ausdruck "Zucht", wie er hierin verwendet wird, bedeutet das Suspendieren oder Anlagern jedes solchen Biokatalysators in einem flüssigen Medium oder bedeckt von einem flüssigen Medium für den Zweck der Aufrechterhaltung von chemischen Reaktionen. Der Ausdruck "Biokatalysator", wie er hierin verwendet wird, schließt Enzyme, Vitamine, Enzymaggregate, immobilisierte Enzyme, subzelluläre Komponenten, prokaryotische Zellen und eukaryotische Zellen ein. Der Ausdruck "Zentrifugalkraft" bedeu tet eine Zentripetalkraft, die sich aus der Winkeldrehung eines Gegenstandes ergibt, gesehen von einem sich kongruent drehenden Bezugssystem aus.
Die Zucht von mikrobiellen Zellen (Fermentierung) oder von Tier- und Pflanzenzellen (Gewebezucht) ist einer Vielzahl von kommerziell wichtigen chemischen und biochemischen Produktionsprozessen gemeinsam. Lebende Zellen werden in diesen Prozessen als ein Ergebnis der Tatsache verwendet, daß lebende Zellen unter Verwendung allgemein leicht beschaffbarer Ausgangsmaterialien wirtschaftlich kommerziell wertvolle Chemikalien synthetisieren.
Die Fermentierung schließt das Wachsen oder die Aufrechterhaltung lebender Zellen in flüssigen Nährmedien ein. In einem normalen Massen-Fermentierungsprozeß wird der gewünschte Mikroorganismus oder die eukaryotische Zelle in einem definierten Medium angeordnet, das sich aus Wasser, Nährchemikalien und gelösten Gasen zusammensetzt und es wird ihm (ihr) erlaubt bis zu einer gewünschten Zuchtdichte zu wachsen (oder sich zu vervielfachen). Das flüssige Medium muß alle Chemikalien enthalten, welche die Zelle für ihren Lebensprozeß benötigt und es sollte auch die optimalen Umgebungsbedingungen für ihr kontinuierliches Wachstum oder ihre Reproduktion bereitstellen. Die auf diese Weise aufrechterhaltenen lebenden Zellen erzeugen dann durch Stoffwechselprozesse das gewünschte Produkt (die gewünschten Produkte) aus den Vorstufenchemikalien, die in die Nährstofflösung eingebracht sind. Das gewünschte Produkt (die gewünschten Produkte) werden entweder aus dem flüssigen Medium purifiziert oder aus den Zellen selbst extrahiert.
Es gibt eine Anzahl von Nachteilen, die den typischen Fermentationsprozessen eigen sind. Solche Prozesse erfordern hohe Energiekosten, um die großen Volumen wässeriger Lösung bei einer korrekten Temperatur zu halten, der Prozeß muß kontinuierlich überwacht werden und es müssen Zusätze hinzugegeben werden, um die Nährstoffkonzentration und die pH-Werte bei optimalem Pegel zu halten und es muß äußerste Sorgfalt geübt und ein hoher Auf wand getrieben werden, um die unerwünschten Zellentypen zu sterilisieren und sie dann von dem Zutritt zu dem Zuchtmedium auszuschließen. Solche Fermentierungsverfahren, insbesondere solche, die aerobe(nur von Sauerstoff lebende) Organismen verwenden, sind auf niedrige Produkterträge oder geringe Produktbildungsraten als ein Ergebnis der Unfähigkeit, ausreichende Mengen von gelöstem Sauerstoff zu den Stoffwechsel-Organismen zu liefern, eingeschränkt. Schließlich können solche Massenprozesse oder Halb-Massenprozesse nur über einen begrenzten Zeitraum ablaufen, bevor sich ausgeschiedene Abfälle in den Fermentationsmedien aufbauen, die einen Prozeßabbruch gefolgt von einer Systemreinigung, einer erneuten Sterilisierung und einem erneuten Start, erfordern.
Die Zellenimmobilisierung erlaubt eine viel größere effektive Dichte des Zellwachstums und führt zu einem stark verringerten Verlust von produktiven Zellen in die Ausgangsproduktströme. Ein frühes Verfahren für die Immobilisierung von Zellen oder Enzymen sah das Einschließen solcher Biokatalysatoren in Dextran-, Polyacrylamid-, Nylon-, Polystyren-, Kalziumalginat- oder Agar-Gel-Strukturen oder sphärischen polymeren Mikroträger-Blasen vor. Diese Immobilisierungsverfahren leiden unter einer Anzahl von Nachteilen, wie zum Beispiel störende Beeinflussung der Diffusion von Gasen, schlechte mechanische Eigenschaften und hohe Kompressibilität der Gel-Einschlussmedien, was zu Hochdruckproblemen, zum Zerquetschen der Mikroträgerblasen und zur Zerstörung der angelagerten Zellen durch hydraulische Scherkräfte in den Rührtankreaktoren führt.
US-A 4,939,087 offenbart eine Bio-Verarbeitungsvorrichtung und ein Bio-Verarbeitungsverfahren unter Verwendung der Zentrifugalbeschleunigung von Zellen, um eine Kultur innerhalb einer Reaktionszone in dem Reaktor zu halten. Ein kontinuierlicher Fluß einer Flüssigkeit wird in dem Reaktor aufrechterhalten, der bewirkt, daß eine Kraft erzeugt wird, welche dem Zentrifugalkraftfeld entgegenwirkt. Der Reaktor wird auf einer horizontalen Drehplatte angeordnet und horizontal um eine Achse in der Mitte der horizontalen Platte gedreht. Daher wirkt die Gravitationskraft senkrecht zu den Zentrifugal- und Flüssigkeitsströmungskräften in dem Reaktor. Somit bewirkt während einer Langzeit-Zentrifugierung die Gravitationskraft, daß sich die Partikel in dem untersten Bereich des Zentrifugalreaktors absetzen.
JP-54114474-A beschreibt einen Rotationsbehälter mit einer perforierten Platte an ihrem äußeren Umfang, wobei der Rotationsmittelpunkt des Behälters mit einem Auslaßrohr versehen ist. Der Behälter wird gedreht, um die in seinem Inneren enthaltenen Partikel dicht gegen den äußeren Umfangsrand des Behälters zu packen. Eine Drehachse ist in der Mitte des Zentrifugalbehälters vorhanden, was zu einer Zentrifugalkraft senkrecht zu der Gravitationskraft führt. Ein Fluid wird durch eine perforierte Platte von außen eingeleitet, was zu einer Flüssigkeitskraft senkrecht zu der Gravitationskraft innerhalb des Behälters führt.
Ein anderes Verfahren der Immobilisierung von lebenden Zellen oder Enzymen, das gegenwärtig in Anwendung ist, umfaßt die Verwendung von Packbett-Reaktoren. Bei diesen Verfahren werden freie Zellen oder Zellen, die an Mikroträgerblasen gebunden sind, in eine starre oder halbstarre Einbettungsmasse suspendiert, die in einem Zucht-Bioreaktor angeordnet ist. Diese Verfahren der Immobilisierung leiden alle unter einer Anzahl von Problemen, insbesondere wenn sie auf Produktionsgröße gebracht werden.
Eine in noch neuerer Zeit entwickelte Klasse von Verfahren für die Immobilisierung von Zellen umfaßt das Eingrenzen der gewünschten Zellen zwischen zwei synthetischen Membranen. Solche Prozesse bieten den Zellen eine Umgebung, in welcher das Einleiten der Nährstofflüssigkeit und das Ableiten der verbrauchten Flüssigkeit durch Kanäle erfolgen kann, die von dem die Zellen enthaltenden Raum getrennt sind und die gleichermaßen das Einleiten und Ableiten von Gasen durch ähnlich angeordnete Kanäle ermöglichen, die ebenfalls von dem die Zellen enthaltenden Raum getrennt sind. Leider gibt es bei solchen Verfahren eine Anzahl von Problemen, insbesondere für jede kommerzielle Nutzung im großen Maßstab, da zum Beispiel die Membranen teuer in der Herstellung und schwer zusammenzubauen sind, Zellen sich über Poren anlagern und/oder eine Porenverstopfung durch unlösliche Stoffe in der Nährstoffzuführung erfolgt oder daß der Auslaß verbrauchter Flüssigkeit diese Membran benetzt sowie eine große Anzahl von teueren Ein- und Auslaßöffnungen und äußeren Armaturen.
Eine andere Klasse von Verfahren für die Immobilisierung von Zellen umfaßt die Verwendung von kapillaren Hohlfasern (normalerweise in länglichen Bündeln von vielen Fasern ausgestaltet) mit Mikroporen in den Faserwänden. Normalerweise werden Zellen in einer geschlossenen Kammer gezüchtet, in welche die Faserbündel eingebracht werden. Die wässerigen Nährstofflösungen fließen frei durch die Kapillarvolumen und der hydrostatische Druck dieses Flusses ergibt eine nach außen gerichtete radiale Perfusion der Nährstoffflüssigkeit in den Raum außerhalb der Kapillaren in einem Gradienten, der an der Eintrittsöffnung beginnt. Gleichermaßen treibt dieses Druckdifferential einen nach außen gerichteten Fluss von "verbrauchtem" Medium aus der Zellkammer wieder zurück in die Kapillarvolumen, wodurch Verbrauchsstoffe entfernt werden. Die Zellen wachsen in dem Raum außerhalb der Kapillaren entweder in freier Lösung oder durch Anlagern an die Kapillaren-Außenwände der Fasern. Normalerweise wird Sauerstoff in den Flüssigkeitsbestandteil des Raums außerhalb der Kapillaren mit Hilfe eines Außenbehälters geleitet und gelöst, der mit diesem Raum über einen Pumpmechanismus verbunden ist. Abfallprodukte in dem Kapillaren-Innenraum können durch Umkehrosmose in Fluid beseitigt werden, das außerhalb der Zellkammer zirkuliert. Es gibt eine Anzahl von Schwierigkeiten bei der Anwendung von Zellen-Immobilisierungsverfahren auf der Basis von Kapillar-Hohlfasern. Cracauer u. a. (US-Patent Nr. 4,804,628) hat diese Schwierigkeiten umfassend dokumentiert.
Eine andere Klasse von Verfahren für die Massenzüchtung von lebenden Zellen umfasst die Verwendung von Wirbelbett-Bioreaktoren. Der Hauptnachteil der Wirbelbett-Verfahren und insbesondere einer Variante, die als Airlift-Fermentierungsvorrichtung be zeichnet wird, ergibt sich aus der Notwendigkeit, Luft oder Sauerstoff in Blasenform durch den Reaktor zu leiten und aus der sich daraus ergebenden Existenz einer Gas-Flüssigkeits-Trennfläche über das Reaktorvolumen. Die Existenz von Gasblasen unterbricht die Fluiddynamik und es treten Protein-Aufschäumungen, Zellzerstörung und Denaturierung(Vergällung) von Nährstoffen und Produkten an der großen Gas-Flüssigkeits-Trennfläche auf. Ein Auswaschen von Zellen ist bei kontinuierlichem Betrieb, insbesondere bei Kulturen mit tierischen Zellen, fast unvermeidlich.
Eine andere Klasse von Verfahren für die Massenzüchtung von Zellen ist als Doppelachsen-Bioreaktor-Verarbeitung mit kontinuierlicher Strömung bekannt. In dieser Bioreaktor-Klasse wird die Drehung der Reaktorkammer um eine Achse senkrecht zu der vertikalen Achse verwendet, um ein inneres Mischen der Bioreaktor-Inhalte zu erzielen, während die Drehung um die vertikale Achse große Partikel in radial gerichteten Abständen von der vertikalen Drehachse entfernt hält. Verfahren dieser Klasse sind bei der Immobilisierung von Mikroorganismen mit geringer Masse, insbesondere von solchen, die gasförmige Nährstoffe erfordern und Gas-Abfallprodukte erzeugen, unwirksam.
Ein anderer Typ des Bioreaktors, bezeichnet als "Inhomogener Zentrifugalfilm-Bioreaktor", der für die aerobe Zellzüchtung bestimmt ist, wird durch das US-Patent Nr. 5,248,613 offenbart. Die Aufgabe des Verfahrens ist, das "Mitreißen der maximalen Menge der gasförmigen Phase in die flüssige Phase" zu maximieren, indem ein dünner Flüssigkeitsfilm gebildet wird, um die Gasphase zu berühren, um zentrifugal kleine Flüssigkeitstropfen zu erzeugen, die durch eine relativ stationäre Gasphase in die rezirkulierte flüssige Phase fallen. Schließlich ist ein Verfahren für die Massen-Immobilisierung von lebenden Zellen, bezeichnet als "Kontinuierliche Zentrifugal-Bio-Verarbeitung" durch Van wie, u. a. in dem US-Patent Nr. 4,939,087 offenbart. Bei diesem Verfahren werden Zellen durch einen Geschwindigkeitsgradienten in einem Zentrifugalkraftfeld "eingefangen", um eine Kultur in einer sich drehenden Bioreaktorkammer aufrechtzuerhal ten, in die Flüssigkeitsströme hineingepumpt und aus ihr herausgepumpt werden. Wie in 1 dargestellt ist, ist die Grundidee dabei, ein Partikel in einer sich drehenden Bioreaktorkammer zu suspendieren, was als eine Folge ihrer Drehung dem Partikel eine "Zentrifugalkraft" auferlegt welche normalerweise bewirken würde, daß das Partikel nicht länger zu längeren Zentrifugalradien wandert. Der Flüssigkeitsstrom wird in die Peripherie der sich drehenden Kammer eingeleitet (und bei kürzeren Radien abgesaugt), um eine entgegengesetzte Kraft zu erzeugen, die der Kraft des Zentrifugalkraftfelds entgegenwirkt, mit dem Ergebnis, daß das Partikel bei einem bestimmten radialen Abstand in einer flüssigen Phase immobilisiert wird. Das Wesen des Verfahrens von Sanderson und Bird (Sanderson, R. J. und Bird, K. E. Verfahren in der Zellbiologie, 1977, Nr. 15, S. 1–14), die mathematische Analyse des Partikels und die Fluiddynamik dieses Prozesses sind in 2 dargestellt.
Diese Theorie kann, bei Anwendung auf die Zentrifugalelutriation, wie es durch Sanderson und Bird und durch die Weiterentwickler bei Beckman Instruments erfolgt ist, kurzzeitig für das Separieren von Zellen verschiedener Größe und/oder Dichte verwendet werden. Leider ist sie für die Langzeit-Immobilisierung von Zellen oder Biokatalysatoren vollkommen unanwendbar, da die theoretische Basis nicht korrekt ist. Wie in 3 dargestellt, ist eine zusätzliche Kraft vorhanden, die auf das suspendierte Partikel wirkt und die zu berücksichtigen ist, insbesondere dann, wenn das Partikel über längere Zeitperioden (wie es im Fall von Fermentierungen der Fall sein würde) zu immobilisieren ist. Diese Kraft ist ein Ergebnis der Partikelmasse. Wenn auch Mikroorganismen oder tierische Zellen sehr leicht sind, ist ihre Masse nicht gleich Null und daher hat die Schwerkraft einen Einfluß, der bedeutend ist und der umso größer wird, desto länger die Zeitperioden sind. Das ist auf mehr graphischem Wege in 4 dargestellt, wo gezeigt ist, dass es nicht eine einfache Beschreibung eines radialen Abstands ist, an dem ein Partikel in einem aufgebrachten Zentrifugalkraftfeld in einer fließenden Flüssigkeit immobilisiert werden kann, da die Herleitung nicht den Effekt der Gravitationskraft auf die Masse des Partikels berücksichtigt hat. Das Ergebnis dieser "Abweichung von der Theorie" ist aus Zentrifugal-Elutriations-Experimenten ersichtlich, welche längere Separationszeiten erfordern und ist graphisch in 5 dargestellt. Über längere Zeitperioden bewirkt das Gewicht der suspendierten Partikel (dargestellt als dunkle Kreise in einem kreisförmigen Querschnitt einer Bioreaktorkammer in 5), daß diese Partikel sich an den untersten Bereichen der Bioreaktorkammer absetzen und das Gleichgewicht der Kräfte stören, das sie anfänglich in der Kammer suspendiert hat. Weiterhin führt die "Aggregierung" dieser Partikel zu einem größeren "Partikel" mit praktisch derselben Dichte wie die Einzelpartikel zu einer vergrößerten Zentrifugalwirkung. Das bewirkt, daß die Aggregate zu längeren Radien wandern und schließlich die Flüssigkeitseinlassöffnung verstopfen.
Der Stand der Technik zeigt, daß, wenn auch die Zellimmobilisierung ein sehr vorteilhaftes Verfahren für das Erhöhen der Produktivität von lebenden Zellkulturen ist, es bei jeder Klasse des Verfahrens eine Anzahl von Nachteilen gibt. Ein zentrales Problem aller solcher Zuchtverfahren ist eine ausreichende Anreicherung der gezüchteten Zellen mit Sauerstoff und das Entfernen von Kohlendioxid hat sich als einschränkender Faktor bei der Entwicklung von effizienteren und wirtschaftlicheren Konstruktionen erwiesen.
Lebende Zellen oder biokatalytische subzelluläre Komponenten sind nicht in der Lage einen Nutzen aus dem gasförmigen Sauerstoff zu ziehen. Lebende Zellen oder Biokatalysatoren ziehen ihren Nutzen nur aus Sauerstoff, der in wässerigen Medien gelöst ist, welche die Partikel umgeben. Bei Chargen-Fermentierungen, die für die mikrobielle Produktion gebräuchlich sind, ist das Durchleiten von Luft oder von mit Sauerstoff angereicherten Gasen durch die wässerigen Nährstoffmedien dazu bestimmt, den gelösten Sauerstoff zu ersetzen, der durch den Stoffwechselprozeß der Zellen verbraucht worden ist. Bei diesem Verfahren tritt der größte Teil des Gases ungenutzt aus, während die Pegel des gelösten Sauerstoffs bei demselben Wert bleiben. Gleichermaßen ist das Einleiten von Luft (oder Sauerstoff) in die Nährstofflösung vor ihrer Verwendung bei der Zucht tierischer Zellen dazu bestimmt, den Pegel des gelösten Sauerstoffs in den Medien zu erhalten. Während die normale Sauerstoffkonzentration in Wasser von etwa 0,2 bis 0,3 mM (abhängig von solchen Faktoren wie pH und der Ionenstärke) beträgt, ist es möglich, diese Konzentration auf soviel wie 0,5 mM zu erhöhen, indem man etwa zwei Atmosphären Sauerstoffdruck auf eine Wasserlösung anwendet.
Um ausreichende Sauerstoffkonzentrationen in Fermentierungsmedien aufrechtzuerhalten, hat sich ein großer Teil des Standes der Technik auf das Verstärken des Kontakts zwischen Gas und Flüssigkeit konzentriert, durch (1) Erzeugen einer sehr kleinen Blasengröße (eine Funktion der Porengröße der Einleitfritte); (2) Verwendung einer hohen Rührgeschwindigkeit um die Sauerstoffeintrittsrate in die flüssige Phase zu erhöhen; oder (3) Verwendung eines Gasüberdrucks von ein oder zwei Atmosphären über dem Zuchtmedium, um die Pegel des gelösten Sauerstoffs zu erhöhen. Im Fall einer Zucht von tierischen Zellen hat es die typische Ausgestaltung der Kammern für die Zucht tierischer Zellen bisher schwierig gemacht, Überdrücke größer als einen Bruchteil einer Atmosphäre für die Verwendung in Betracht zu ziehen. Daher verwendet das gebräuchlichste Verfahren zum Erhöhen der Sauerstoffpegel gasdurchlässige Membranen oder Fasern in Kontakt mit der fließenden Nährstoffflüssigkeit, um die Pegel des gelösten Sauerstoffs aufrechtzuerhalten.
Es gibt eine Anzahl von Problemen, die mit diesen Verfahren der Erhöhung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in den Nährstoffmedien verbunden sind. Erstens und am vordringlichsten sind alle diese Verfahren nicht in der Lage, die Konzentrationen des gelösten Sauerstoffs über die Konzentration hinaus zu erhöhen, die bei atmosphärischem Druck erreichbar sind, weil allgemein die anderen Komponenten des Zellzuchtprozesses von empfindlicher Natur sind. Als nächstes, Verfahren, welche ein kraftvolles Rühren der Flüssigkeit-Gas-Mischung anwenden, um erhöhte Raten der Sauerstofflösung zu erzielen, sind nicht auf tierische Zellen anwendbar, die sehr empfindlich sind und leicht durch hydraulische Scherkräfte beschädigt werden können. Schließlich können die Verfahren, die einen erhöhten Gas-Überdruck über dem Zuchtmedium anwenden, um die Konzentrationen des gelösten Sauerstoffs zu erhöhen, auf nicht viel mehr als etwa 1 bis 2 Atmosphären Überdruck gebracht werden. Darüber wird es unmöglich, auf die die Zelle enthaltenden flüssigen Medien zum Zweck der Zellenernte oder Produktisolierung zuzugreifen, ohne die gezüchteten Zellen zu zerstören. Trotzdem sind die Erkenntnisse jeder der vorher angeführten Verfahren es wert, sie einzeln zu behandeln.
US-Patent Nr. 4,897,359 (ausgegeben an Oakley u. a.) offenbart ein Verfahren für das Anreichern eines Mediums für die Zucht von tierischen Zellen mit Sauerstoff für das nachfolgende Einführen in Behälter für die Zellzucht, bei dem ein mit Sauerstoff angereichertes Gas bei einem unbestimmten Druck durch eine Vielzahl von gasdurchlässigen Rohren geleitet wird, die von dem flüssigen Medium, das mit Sauerstoff angereichert werden soll, umgeben ist. Das Verfahren der Erfindung von Oakley u. a. ist nur zur Sicherstellung nützlich, daß die Zellzuchtmedien die maximale Konzentration des gelösten Sauerstoffs aufweisen, die bei atmosphärischem Druck erreichbar ist.
Schließlich wurde, weil die Immobilisierung von Zellen oder Mikroorganismen erfordert, daß eine Zellenbegrenzungskammer Bestandteil des Prozeßsystems ist, die neuere Literatur zum Vergleich überprüft. Es gibt eine Anzahl von Kammern für die Zucht von Zellen. Viele dieser Kammern sehen das Einleiten und das Ableiten eines Flüssigkeitsstroms vor, mehrere haben Sichtöffnungen und alle weisen eine Oberfläche auf, an welche die Zellen angelagert werden können, oder eine Kammer, in welcher suspendierte Zellen gezüchtet werden können. In allen Fällen ist der Betriebsdruck der Zellenbegrenzungskammern eine Atmosphäre (oder weniger) und somit sind diese Kammern für Prozesse ungeeignet, in welchen erhöhte Pegel des gelösten Sauerstoffs gewünscht sind und sie sind zwangsweise auf solche Pegel des gelösten Sauerstoffs eingeschränkt, die bei atmosphärischem Druck erreichbar sind.
Der gegenwärtige Stand der Technik zeigt, daß es drei miteinander in Beziehung stehende Probleme gibt, welche die wirtschaftliche Verwendung von Massenkulturen von Mikroben, tierischen Zellen oder ihrer subzellulären Komponenten beeinträchtigen: (1) Wie aus dem ganzen Umfang der Angaben über den Stand der Technik auf dem Gebiet der Zellimmobilisierung ersichtlich ist, ist der Schwerpunkt vieler Arbeiten die Erhöhung der Dichte der Zellkultur. Es ist offensichtlich, daß die wirtschaftliche Produktion eines biologischen Produktes direkt mit der Fähigkeit in Beziehung steht, effizient große Aggregate des gewünschten Zellentyps zu züchten. Leider führt der Drang zur Erhöhung der Dichte der Zellkultur zu der Entwicklung der zwei sekundären Probleme: (2) zu der Unfähigkeit, eine Zellenansammlung mit hoher Dichte ausreichend zu ernähren; und (3) zu der Unfähigkeit, ausreichend Sauerstoff zu den aeroben Zellenansammlungen zu liefern. Da die Zellendichte erhöht ist, ist das einzige Verfahren für die Zulieferung von ausreichend flüssigen Nährstoff zu der Ansammlung die Verwendung erhöhter Flüssigkeitsdurchsätze, welche in allen Fällen im Stand der Technik letztendlich den Gesamtmaßstab des Immobilisierungsverfahrens begrenzen. Gleichermaßen ist, da die Zelldichte ansteigt, die Unfähigkeit, ausreichend gelösten Sauerstoff zu der Zellenansammlung zu liefern (oder irgendein anderes Gas) ein sogar noch mehr einschränkender Faktor und verringert gravierend den Maßstab der Zucht.
Es besteht daher weiterhin ein Bedarf für eine Vorrichtung und ein Verfahren für das kontinuierliche Züchten, Zuführen und Extrahieren biochemischer Produkte aus entweder mikrobiellen oder eukaryotischen Zellen oder ihren subzellulären Komponenten, bei Aufrechterhaltung lebensfähiger Ansammlungen dieser Biokatalysatoren mit hoher Dichte. Weiterhin ist ein Bedarf für ein Verfahren für die absolute Immobilisierung von Proben-Biokataly satorpopulationen vorhanden, das es erlaubt, die verschiedenen ernährungsmäßigen, Wachstums- und Produktivitäts-Parameter zu untersuchen, um ein genaueres Verständnis der Beziehungen zwischen diesen Parametern und ihren Wirkungen auf die Lebensfähigkeit und Produktivität der Zelle zu erreichen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein neuartiges Zuchtverfahren und eine neuartige Zuchtvorrichtung, bei denen lebende Zellen oder subzelluläre Biokatalysatoren in Bioreaktorkammern immobilisiert werden, die in einem Zentrifugalfeld angebracht sind, wobei Nährstoffflüssigkeiten ohne jede Gasphase(n) in Kontakt mit den Flüssigkeiten in die Immobilisationskammern und aus ihnen heraus strömen. Die Zellen oder Biokatalysatoren werden in einer dreidimensionalen Anordnung von Partikeln geordnet, deren Dichte durch die Größe, Form, Eigendichte und durch die Auswahl von Kombinationen von leicht steuerbaren Parametern, wie zum Beispiel Flüssigkeitsdurchsatz und Winkelgeschwindigkeit der Drehung bestimmt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Zellen oder Biokatalysatoren in den Bioreaktorkammern auf ein definiertes Volumen begrenzt sein. Es werden nur Flüssigkeiten (die gelöste Gase enthalten können) in die Kammern und aus ihnen heraus geleitet. Um zu bewirken, daß Nährstoffflüssigkeiten durch die dreidimensionale Anordnung von Zellen oder Katalysatoren in den Kammern strömen, werden Verdrängerpumpen verwendet, um die Nährstoffflüssigkeiten bei einem positiven hydraulischen Druck durch die Kammern zu bewegen. Die eingeschlossenen Zellen oder Biokatalysatoren bleiben durch den sich ergebenden Anstieg des hydraulischen Drucks solange unbeeinträchtigt, wie Hochfrequenz-Druckschwankungen nicht vorhanden sind. Somit werden den eingeschlossenen Zellen oder Biokatalysatoren zu jeder Zeit während des Prozeßablaufes frische, optimale flüssige Nährstoffmedien zur Verfügung gestellt, wobei die zellulären Produkte am Austritt aus den Eingrenzungskammern unmittelbar zugänglich sind.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um hohe Erträge von industriellen Chemikalien oder pharmazeutischen Produkten aus Biokatalysatoren, wie zum Beispiel Bakterien, Hefen, Pilzen und eukaryotischen Zellen oder subzellulären Organellen, wie zum Beispiel Mitochondrien oder immobilisierte Enzymkomplexe, zu erzielen. Diese Zellen oder zellulären Substrukturen können entweder natürlich auftreten oder können genetisch manipuliert sein, um das gewünschte Produkt zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung kann in zwei der beiden Betriebsarten betrieben werden: (1) in einer Betriebsart, bei der eine Nährstoffbegrenzung verwendet wird, um ein definiertes Bettvolumen des Bioreaktors zu sichern. Diese Betriebsart ist auf Kulturen anwendbar, bei denen die gewünschten Produkte von den immobilisierten Biokatalysatoren freigegeben werden und den Bioreaktor in dem Flüssigkeitsstrom verlassen. (2) in einer Betriebsart, in der eine Überschuß-Nährstoffeingabe verwendet wird, um ein übermäßiges Wachstum der Volumenbeschränkung des Bioreaktors zu bewirken. Diese Betriebsart ist für die kontinuierliche Produktion und den Ausfluß von reifen Zellen, die ein intrazelluläres Produkt enthalten, nützlich.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, durch die Biokatalysatoren in Zentrifugal-Immobilisierungskammern immobilisiert werden, wobei Nährstoffflüssigkeiten in die Kammern eingeleitet werden und die Flüssigkeitsausflüsse, welche das gewünschte Stoffwechselprodukt (die gewünschten Stoffwechselprodukte) enthalten, aus den Kammern austreten.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, durch die Biokatalysatoren, einschließlich von Ansammlungen lebender Zellen, immobilisiert werden können und entweder aerobe oder anaerobe Fermentierungen durchgeführt werden, bei welchen flüs sige Nährstoffe und Substratnährstoffe in Ausgangs-Flüssigkeitsströme umgewandelt werden, die das Produkt enthalten.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, durch die bakterielle Zellenansammlungen immobilisiert und Fermentierungen durchgeführt werden können, bei welchen flüssige Nährstoffe und Substratnährstoffe in Ausgangs-Flüssigkeitsströme umgewandelt werden, die das Produkt enthalten.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, durch die Pilz-Zellenansammlungen immobilisiert und Fermentierungen durchgeführt werden können, bei welchen flüssige Nährstoffe und Substratnährstoffe in Ausgangs-Flüssigkeitsströme umgewandelt werden, die das Produkt enthalten.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, durch die Hefe-Zellenansammlungen immobilisiert und Fermentierungen durchgeführt werden können, bei welchen flüssige Nährstoffe und Substratnährstoffe in Ausgangs-Flüssigkeitsströme umgewandelt werden, die das Produkt enthalten.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, durch die Ansammlungen eukaryotischer tierischer Zellen immobilisiert und Fermentierungen durchgeführt werden können, bei welchen flüssige Nährstoffe und Substratnährstoffe in Ausgangs-Flüssigkeitsströme umgewandelt werden, die das Produkt enthalten.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, durch die Ansammlungen entweder prokaryotischer oder eukaryotischer Pflanzenzellen immobilisiert und Fermentierungen durchgeführt werden können, bei welchen flüssige Nährstoffe und Substratnähr stoffe in Ausgangs-Flüssigkeitsströme umgewandelt werden, die das Produkt enthalten.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, durch die Enzyme oder Enzymsysteme, die auf festen Trägern immobilisiert sind, oder Katalysatoren, die auf festen Trägern immobilisiert sind, oder Zellen oder Zellkomponenten, die auf festen Trägern immobilisiert sind, immobilisiert werden können und katalysierte chemische Umwandlungen erzielt werden können, bei welchen flüssige Nährstoffe und Substratnährstoffe in Ausgangs-Flüssigkeitsströme umgewandelt werden, die das Produkt enthalten.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, durch die Konzentrationen von gelöstem Sauerstoff (oder von anderen gelösten Gasen), die in den Nährstoffflüssigkeitsstrom in eine Zellenbegrenzungskammer eingeleitet sind, in Abhängigkeit von dem angewendeten hydraulischen Druck auf jedes gewünschte Niveau erhöht werden können.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, durch die entweder ein gasförmiges Nährstoffsubstrat (wie zum Beispiel Sauerstoff) in dem Nährstoff-Eintritts-Flüssigkeitsstrom, der in eine Zellbegrenzungskammer geleitet wird, oder ein ausgeschiedenes Atemgas (wie zum Beispiel Kohlendioxid) in dem Austritts-Flüssigkeitsstrom in dem gelösten Zustand gehalten werden können, bis die Flüssigkeit-Gas-Trennung, allgemein stromabwärts weit entfernt von dem Zellenimmobilisierungsabschnitt (von den Zellenimmobilisierungsabschnitten) erwünscht ist.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, durch die die Umwandlung eines zur Verfügung stehenden chemischen Substrats in ein gewünschtes Produkt durch eine Reihe von schrittweise Bioka talysator-Umwandlungen erreicht wird, wobei jede chemische Umwandlung durch eine aus einer Reihe von Zentrifugal-Immobilisierungskammern erzielt wird, die in Reihe oder parallel in den Stromfluss eingesetzt sind.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein nicht spezifisches Verfahren und eine nicht spezifische Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, die ohne wesentliche Veränderung auf jeden Zelltyp angewendet werden kann.
Eine noch andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, durch die Biokatalysatoren in Zentrifugal-Immobilisierungskammern immobilisiert werden können, wobei Medien, die giftige Chemikalien enthalten, den Kammern zugeführt werden und die Biokatalysatoren in den Kammern die giftigen Chemikalien neutralisieren und sie dadurch in umweltfreundliche Produkte umwandeln.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, welche sowohl die Kapital- und Arbeitskosten der Produktion als auch die Produktionseinrichtungen reduzieren.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, welche gegenüber einer Verunreinigung durch opportunistische Organismen viel weniger anfällig sind.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, bei denen die Flüssigkeitsumgebung, in die der gewünschte Biokatalysator eintaucht, im wesentlich über die Zeit unverändert ist, d. h. die pH-Werte, die Innenfestigkeit, die Nährstoffkonzentrationen, die Abfallkonzentrationen oder die Temperatur verändern sich in der Umgebung des Biokatalysators nicht als eine Funktion der Zeit.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein kontinuierliches Fermentierungs- oder Zellzuchtverfahren zur Verfügung zu stellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, in welchen die Zyklen der Proliferation, des Wachstums oder der Produktbildung einfach durch Veränderung der Zusammensetzung der zugeführten Nährstoffe erzielt werden können.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, die über die Lebensdauer der immobilisierten Mikroorganismen oder des Zelltyps fortgesetzt arbeiten können.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für das Züchten von Biokatalysatoren unter Bedingungen zur Verfügung zu stellen, die dadurch den Produktertrag aus dem Biokatalysator wesentlich erhöht.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, welche die Umwandlungseffektivität (des Substrats in das Produkt) des Zuchtprozesses erhöht.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, welche die Kosten für das Heizen und Kühlen der wässerigen Medien, die für die Unterstützung des Zuchtprozesses erforderlich sind, wesentlich zu reduzieren.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, welche höhere Erträge von Produkten, wie zum Beispiel Antibiotika, aus Mikroorganismen-Fermentierungen erzielen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, welche höhere Erträge von Produkten, wie zum Beispiel Enzyme oder andere Proteine, aus Mikroorganismen-Fermentierungen erzielen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, welche höhere Erträge von Produkten, wie zum Beispiel Äthanol oder andere kurzkettige Alkohole und Säuren, aus der Fermentierung von Mikroorganismen erzielen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, welche höhere Erträge von Produkten, wie zum Beispiel Protein-Hormone aus genetisch transformierten Mikroorganismen erzielen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, welche höhere Erträge von Produkten, wie zum Beispiel Protein-Hormone aus eukaryotischen Zellen erzielen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, welche höhere Erträge von Produkten, wie zum Beispiel Aminosäuren, stickstoffhaltigen Basen oder Alkaloiden aus der Fermentierung von Mikroorganismen erzielen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, welche höhere Erträge von Produkten, wie zum Beispiel Äthanol in Kraftstoffqualität aus der Fermentierung durch Hefen von zuckerhaltigem landwirtschaftlichem Material erzielen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, welche die Fermentierungszeit verringern würden, die erforderlich ist, um alkoholische Getränke, wie zum Beispiel Bier und Wein herzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein leicht im Maßstab zu vergrößerndes Verfahren und eine leicht im Maßstab zu vergrößernde Vorrichtung für die Zellzucht oder Fermentierung zur Verfügung zu stellen, die kommerziell verwendet werden kann.
Diese und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Durchsicht der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung der offenbarten Ausführung und der beigefügten Ansprüche deutlich.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die beigefügten Zeichnungen, die einbezogen und Bestandteil der Patentschrift sind, erläutern verschiedene wissenschaftliche Prinzipien und Ausführungen der vorliegenden Erfindung und dienen, zusammen mit der Beschreibung dazu, die Prinzipien der Erfindung zu erläutern.
1 stellt die Hauptmerkmale der Gegenstrom-Zentrifugierung dar.
2 zeigt eine Analyse der bei der Gegenstrom-Zentrifugierung wirkenden Kräfte.
3 zeigt das Hauptproblem bei der Gegenstrom-Zentrifugierung.
4 zeigt den mathematischen Fehler bei der herkömmlichen Behandlung der Gegenstrom-Zentrifugierung.
5 ist eine Darstellung des Einflusses auf immobilisierte Partikel bei Verwendung der herkömmlichen Gegenstrom-Zentrifugierung über lange Zeitperioden.
6 zeigt die Modifikation der im Prozeß der vorliegenden Erfindung verwendeten Gegenstrom-Zentrifugierung.
7 ist eine Darstellung der Mathematik, welche die Bewegung des Partikels infolge der Einwirkung der Gravitation bestimmt, wenn das Partikel in einem Zentrifugalkraftfeld genau entgegengesetzt zu einem Flüssigkeitsstrom festgehalten wird.
8 ist eine Darstellung der sich ergebenden Bewegung eines Partikels unter den Beschränkungen von 7.
9 ist eine mathematische Bewertung der Immobilisierungsbedingungen bei einem vorgegebenen Radius.
10 ist eine Analyse des Gleichgewichts der Zentrifugalkräfte und der Strömungsgeschwindigkeitskräfte in einer rotierenden, zylindrischen Immobilisationskammer.
11 ist eine Analyse des Gleichgewichts der Zentrifugalkräfte und der Strömungsgeschwindigkeitskräfte in einer rotierenden kegelförmigen Immobilisationskammer.
12 ist eine Darstellung einer dreidimensionalen Anordnung von Partikeln in einer rotierenden kegelförmigen Immobilisationskammer.
13 ist eine Darstellung der "Pufferbereiche" zwischen den Schichten in einer dreidimensionalen Anordnung von Partikeln in einer rotierenden kegelförmigen Immobilisationskammer.
14 ist eine mathematische Analyse der Veränderung der Strömungsgeschwindigkeit innerhalb der Schichten in einer zweidimensionalen Anordnung von Partikeln in einer rotierenden kegelförmigen Immobilisationskammer.
15 ist eine Darstellung eines Beispiels einer kegelförmigen Immobilisationskammer und der Randbedingungen, welche diese Dimensionen bestimmen.
16 ist eine Analyse der positionellen Veränderung der Zentrifugal- und Strömungsgeschwindigkeitskräfte in der Kammer von 15 bei einem Durchsatz von 10 Milliliter pro Minute.
17 ist ein Blockdiagramm einer Prozeßgestaltung, die dazu ausgelegt ist, die gewünschten Konzentrationen des gelösten Gases in dem Flüssigkeitseingang zu einem Zentrifugal-Bioreaktor aufrechtzuerhalten.
18 ist eine Darstellung eines Flüssigkeits-Strömungsdruckreglers.
19 ist eine Schnittansicht eines Ausführungsbeispiels des Zentrifugal-Fermentierungs-Prozesses, gesehen parallel zu der Drehachse.
20 ist eine Ansicht des Rotorkörpers von 19, gesehen parallel zu der Drehachse.
21 ist eine Querschnittsansicht einer demontierbaren Biokatalysator-Immobilisierungskammer von 19.
22 ist eine Schnittansicht des Rotorkörpers von 19, gesehen senkrecht zu der Drehachse.
23 ist eine Schnittansicht des Rotorkörpers von 19, geschnitten entlang der gestrichelten Linie, die in 22 dargestellt ist, gesehen parallel zu der Drehachse.
24 ist eine Schnittansicht des Rotorkörpers von 19, geschnitten entlang der gestrichelten Linie, die in 22 dargestellt ist, gesehen parallel zu der Drehachse.
25 ist eine Schnittansicht des Rotorkörpers von 19, geschnitten entlang der gestrichelten Linie, die in 22 dargestellt ist, gesehen parallel zu der Drehachse.
26 ist eine Schnittansicht des Rotorkörpers von 19, geschnitten entlang der gestrichelten Linie, die in 22 dargestellt ist, gesehen parallel zu der. Drehachse.
27 ist eine Schnittansicht des Rotorkörpers von 19, geschnitten entlang der gestrichelten Linie, die in 22 dargestellt ist, gesehen parallel zu der Drehachse.
28 ist eine Darstellung der axialen Kanäle und ihrer Endpunkte in der Drehwelle von 19.
29 ist eine Detailansicht der Verteilungsnabe der Drehwelle von 28.
30 ist eine Querschnittsansicht einer repräsentativen Hochleistungs-Endflächendichtung.
31 ist eine graphische und mathematische Darstellung des Innenraums der Bioreaktor-Immobilisierungskammer von 21.
32 ist ein Diagramm der Durchflüsse und der Rotordrehzahlen, welche die Partikel-Immobilisierung unter den in 15 dargestellten dimensionalen und Randbedingungs-Beschränkungen und für den Rotorkörper von 19 für Partikel mit Sedimentationsraten von 0,001 und 0,01 mm/min bei Durchsätzen bis zu 10 Milliliter pro Minute, sichern.
33 ist ein Diagramm der Durchflüsse und der Rotordrehzahlen, welche die Partikel-Immobilisierung unter den in 15 dargestellten dimensionalen und Randbedingungs-Beschränkungen und für den Rotorkörper von 19 für Partikel mit Sedimentationsraten von 0,1, 1,0 und 10,0 mm/min bei Durchsätzen bis zu 10 Milliliter pro Minute, sichern.
34 ist ein Diagramm der Durchflüsse und der Rotordrehzahlen, welche die Partikel-Immobilisierung unter den in 15 dargestellten dimensionalen und Randbedingungs-Beschränkungen und für den Rotorkörper von 19 für Partikel mit Sedimentationsraten von 0,1, 1,0 und 10,0 mm/min bei Durchsätzen bis zu 100 Millilitern pro Minute, sichern.
35 ist ein Diagramm, welches die Beziehung von Rotorgröße und Volumenleistung der Ausführungen des Prozesses der vorliegenden Erfindung zeigt.
36 ist ein Diagramm, welches die Beziehung von Rotorgröße und Drehzahl zeigt, die erforderlich ist, um eine relative Zentrifugalkraft von 100 × g in den Ausführungen des Prozesses der vorliegenden Erfindung aufrechtzuerhalten.
37 ist ein Blockdiagramm einer Zentrifugalprozeß-Gestaltung, die dazu ausgelegt ist, eine Serienverarbeitung einer Vorstufenchemikalie durch zwei Zentrifugal-Bioreaktoren zu erlauben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Entwicklung des vorliegenden Immobilisierungs- und Zuchtprozesses hat ihren Ursprung in vier getrennten Wissensgebieten. Die Funktion des Gesamtprozesses hängt zwecks seiner korrekten Funktion von der Verwendung von Informationen aus allen vier Gebieten ab. Diese Gebiete sind: (1) das Stokes'sche Gesetz und die Theorie der Gegenstromzentrifugierung; (2) die geometrischen Beziehungen der Strömungsgeschwindigkeit und der Zentrifugalkraftfeldstärke; (3) das Henry'sche Gesetz der Gase; und (4) der Einfluss des hydraulischen Drucks auf Einzel- und Mehrzellenorganismen und auf ihre zellulären oder subzellulären Komponenten.
Der Hauptzweck des Prozesses der vorliegenden Erfindung ist die Immobilisierung der dreidimensionalen Anordnungen von Partikeln (Zellen, subzelluläre Strukturen oder aggregatisierte Biokatalysatoren) und das Bereitstellen einer Flüssigkeitsumgebung für sie, die gelöste Gase enthält, welche ihre Überlebensfähigkeit und Produktivität erhöhen. Solche Zellen können eine prokaryotische Zelle, ein Bakterium oder eine eukaryotische Zelle, wie Algenzellen, Pflanzenzellen, Hefezellen, Pilzzellen, Insektenzellen, Reptilienzellen und Säugetierzellen einschließen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Der Biokatalysator kann eine subzelluläre Komponente, ein Enzymkomplex und/oder ein auf einem festen Träger immobilisierter Enzymkomplex sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Die gelösten Gase der vorliegenden Erfindung schließen Luft, O₂, NH₃, NO₂, Ar, N₂ und H₂ oder jede Mischung davon, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der vorliegende Prozeß verwendet eine neuartige, modifizierte Form der "Gegenstrom-Zentrifugierung", um Partikelanordnungen zu immobilisieren. Eine korrekte Anwendung des Stokes'schen Gesetzes in Kombination mit der Berücksichtigung des Einflusses der Gravitationskraft, die ebenfalls auf die immobilisierten Partikel wirkt, führt zu einer mathematischen Beziehung, welche die relative Immobilisierung von Anordnungen solcher Partikel mit hoher Dichte erlaubt. Der Einfluß der Gravitationskraft, die vorher erläutert wurde und graphisch in 3 bis 5 dargestellt ist, kann durch eine alternative Wahl der Drehachse, wie es in 6 dargestellt ist, eliminiert werden wenn die Drehung um die horizontale Achse (y) anstatt der Drehung um die vertikale Achse (x) gewählt wird, wie es meisten bei biologischen zentrifugierungen der Fall ist, ist der Einfluß der Gravitationskraft auf die immobilisierten Partikel immer auf eine Wirkung nur in der x-z-Ebene beschränkt. Da das dieselbe Ebene ist, in welcher sowohl die Zentrifugalkraft als auch auf den Flüssigkeitsstrom bezogene Kräfte zwangsläufig wirken, ist die Bewegung eines in der Bewegung eingeschränkten Partikels an jedem Punkt in einem Drehzyklus die Resultierende der Summe der drei Arten von Kräften, die auf ihn wirken.
Wie in dem Einsatz A von 7 dargestellt, in dem die Ebene der Figur die x-z-Ebene ist, kann die Wirkung der Gravitationskraft (F_g) an der Position eines Partikels, der in einem radialgerichteten Zentrifugalkraftfeld (F_c) suspendiert ist, während eine genau gleiche und entgegengesetzt wirkende Kraft (F_b), die durch eine nach innen gerichtete strömende Flüssigkeit erzeugt wird, zu dem Partikel hin gerichtet ist, durch die Bewertung der Gleichungen 1 bis 4 berechnet werden, wobei (k) die nach unten gerichtete Verschiebung in der x-z-Ebene infolge der Gravitationskräfte während einer Winkeldrehung der Rotorposition gleich (a) darstellt. Die Analyse der Bewegung eines Partikels unter diesen Einschränkungen und für [2p × (k/a)] < R (ein Partikel mit geringer Masse) führt zu der Bestimmung, daß die Bewegung eine periodische Bewegung ist, d. h. die Partikelbewegung führt zu einer Rückkehr zu ihrem Ausgangspunkt, nachdem eine vollständig Drehung von 360 Grad (nachdem das Gleichgewicht erreicht ist) ausgeführt ist. Wie in 7 dargestellt, führt der Einfluß der Gravitationskraft auf die Bewegung eines Partikels, der ansonsten immobil ist, im Ergebnis der entgegen wirkenden Gleichheit der Zentrifugalkraft und der durch die Strömung bedingten Kräfte zu einer Verkürzung der radialen Position in den Quadranten I und II und zu einer genau gleichen radialen Verlängerung in den Quadranten III und IV. Somit zeigt der radiale Abstand des Partikels von der Drehachse ebenfalls eine periodische Bewegung im Verlauf einer vollständigen Drehung um 360 Grad. Es sollte bemerkt werden, daß die mathematische Messung der Periodizität der Bewegung nur eine Drehung erfordert, wenn die Messung bei entweder 90 oder 180 Grad beginnt, während zwei vollständige Drehungen erforderlich sind, wenn die Messung entweder bei Null oder 180 Grad beginnt, da im letzteren Fall ein neuer radialer Gleichgewichtsabstand vorhanden ist, der sich von den Originalergebnissen unterscheidet.
Die effektive Bewegung eines Partikels durch einen vollständigen Drehzyklus ist in dem Einsatz von 8 dargestellt. Wenn die Seiten eines Behälters, in welchem das Partikel suspendiert ist mit 1 und 2 bezeichnet sind (siehe eingekreiste Zahlen in 8), würde die Bewegung des Partikels im Ablauf eines Drehzyklus einen Kreis beschreiben, dessen Mittelpunkt zu der "Vorderkanten"-Seite des Partikelbehälters verschoben ist. Somit wird ein in einem Zentrifugalkraftfeld, dem ein gleiches Flüssigkeitsströmungskraftfeld entgegenwirkt, suspendiertes Partikel auf eine periodische Bewegung eingeschränkt (und damit effektiv immobilisiert), wenn das Gleichgewicht der radial gerichteten Kräfte über den Ablauf der Bewegung aufrechterhalten werden kann.
Unter Berücksichtigung dieser theoretischen Betrachtungen können wir nun zu den Hypothesen von Sanderson und Bird zurückkehren, die graphisch in 2 gezeigt sind. Eine korrigierte graphische Darstellung ist in 9 gezeigt, in der die Drehachse nun die (y)-Achse ist. Unter diesen Bedingungen kann nun die Hypothese von Sanderson und Bird neu formuliert und auf die Langzeit-Immobilisierung von Partikeln angewendet werden. Es gilt jetzt die Gleichung 3 von 9. Dort ist ein radialer Abstand von der z-Achse (r₂) vorhanden, dessen Bewertung durch die Glei chung 3 eine Position darstellt, in welcher das Partikel relativ in einem Zentrifugalkraftfeld immobilisiert ist, dem, selbst bei Existenz eines Gravitationskraftfelds, genau entgegengesetzt eine nach innen gerichtete Flüssigkeitsströmung entgegenwirkt. Ferner führt eine Vereinfachung des Stokes'schen Gesetzes (Gleichung 1) unter den Bedingungen einer einheitlichen Größe, Form und Dichte der Partikel und einer homogenen Flüssigkeitsströmung zu der Gleichung 2, aus der ersichtlich ist, daß die Sedimentationsgeschwindigkeit eines Partikels (SV) eine einfache lineare Funktion in dem angelegten Zentrifugalkraftfeld ist. Gleichermaßen kann die Gleichung 3 unter denselben Bedingungen umgeschrieben werden, um die Gleichung 4 zu ergeben, in welcher die Flüssigkeits-geschwindigkeit (V in Gleichung 3) durch die Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit (FV) ersetzt ist. Die Gleichung 4 legt nahe, daß ein Kontinuum der Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeiten und der angelegten Zentrifugalkraftfelder vorhanden ist, das durch den Wert der Konstanten (C) ausgedrückt werden kann, wobei alles der Forderung der relativen Partikelimmobilisierung genügt. Ferner könnte, wenn die Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit als eine Funktion von (z) variiert werden könnte, eine getrennte Anwendung dieser Gleichung bei jedem radialen Abstand erfolgen. Die Betrachtung der Folgerungen aus der Gleichung 4 ist für die relative Immobilisierung von dreidimensionalen Anordnungen von Partikeln von Bedeutung, im Gegensatz zu der Immobilisierung von zweidimensionalen Anordnungen von Partikeln bei einem einzelnen radialen Abstand von der Drehachse.
Wenn die Begrenzungskammer, in welcher das Partikel angeordnet ist, zylindrisch ist (wie es graphisch in 10 dargestellt ist), und wenn eine Flüssigkeit aus dieser Kammer aus dem ende fließt, das den größten Abstand von der Drehachse hat, ist es offensichtlich, daß die Strömungsgeschwindigkeit dieses Flüssigkeitsstroms (wie sie in Gleichung 1 von 10 definiert ist) einen einzigen Wert an allen Punkten hat, die durch Partikellagen belegt sind. Daraus ergibt sich, daß, wenn eine zweidimensionale Anordnung von Partikeln sich in einem Positions gleichgewicht bei einem bestimmten radialen Abstand (A₁) befindet, wie es in Gleichung 2 angegeben ist (in welcher CF die Stärke des Zentrifugalfelds und FV die Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit ist), die Partikel gezwungen werden, Positionen an radialen Abständen einzunehmen, die entweder größer oder kleiner als A₁ sind, wie zum Beispiel solche Positionen, die in 10 bei A₂ oder A₃ liegen, wodurch zwangsweise eine Ungleichheit der Haltekräfte vorhanden ist, die zu einer Resttranslation der Partikel führt. Somit erfahren die Partikel, die bei A₂ angeordnet sind, einen längeren radialen Abstand als A₁, eine größere Zentrifugalkraft, als die bei A₁ und wandern zwangsläufig zu längeren radialen Abständen aus (Gleichung 3). Umgekehrt würden Partikel, die anfangs bei A₃ angeordnet sind, einem verringerten Zentrifugalkraftfeld ausgesetzt sein und zu kürzeren radialen Abständen auswandern (Gleichung 4). Daher ist es nicht möglich, eine dreidimensionale Anordnung von Partikeln in einer Begrenzungskammer mit parallelen Wänden zu bilden, wie die Begrenzungskammer von 10.
Wenn jedoch die Begrenzungskammer eine Geometrie aufweist, so daß sich ihre Querschnittsfläche mit abnehmenden Drehradius verringert, wie es graphisch in 11 dargestellt ist, ist es mathematisch möglich, dreidimensionale Anordnungen von immobilisierten Partikeln zu bilden. Das ist eine Folge der Tatsache, daß die mikroskopische Strömungsgeschwindigkeit des Flüssigkeitsstroms sich umgekehrt zu der Querschnittfläche verändert (Gleichung 1), während das relative Zentrifugalkraftfeld sich direkt mit dem Drehradius verändert (Gleichung 2). Wenn daher die Werte der Strömungsgeschwindigkeit und der Drehgeschwindigkeit so gewählt werden, daß eine zweidimensionale Anordnung von Partikeln bei einem Drehradius von A₁ immobilisiert wird (Gleichung 3), ist es mathematisch möglich, das Längenverhältnis der Seitenwände der Begrenzungskammer so einzustellen, daß die Partikel, die anfangs auf dem radialen Abstand A₂ angeordnet sind, ebenfalls eine gleiche Kräftegleichheit erfahren könnten, oder, wie es in Gleichung 4 gezeigt ist, eine Ungleichheit von Kräften, die zu einer Restbewegung zurück zur Mitte der Kammer führt. Ein gleiches Argument kann auf Partikel angewendet werden, die bei A₃ angeordnet sind (siehe Gleichung 5). Obwohl die Geometrie der Begrenzungskammer, wie sie in 11 dargestellt ist, die Geometrie eines Kegelstumpfes ist, ist zu bemerken, daß alternativ, abhängig von der Zwangsbedingung, daß die Querschnittsfläche der Kammer zunimmt, wenn der Drehradius abnimmt, andere Geometrien verwendet werden könnten. Somit ist es, wie in 12 dargestellt, möglich, eine dreidimensionale Anordnung von Partikeln in einem sich verändernden Zentrifugalkraftfeld aufzubauen, dem ein Flüssigkeitsströmungskraftfeld entgegenwirkt, wenn die gewählte Begrenzungskammergeometrie eine Strömungsgeschwindigkeitsverringerung erlaubt, die größer oder gleich der Zentrifugalkraftfeldstärkenverringerung mit abnehmendem Drehradius ist. In der in 12 gewählten Geometrie, die eine Kegelstumpfgeometrie ist, werden die beiden zweidimensionalen Anordnungen von Partikeln bei jedem Drehradius (R_C) jeweils zu einer Bewegung in Richtung zu dem Radius gezwungen, bei dem die entgegengesetzten Kräfte genau gleich sind.
Während auf den ersten Blick die vorher angeführte Beschreibung nahelegt, daß der Resteffekt der Fehlanpassung der Kräfte an allen Radien, außer dem, welcher die Immobilisierung gewährleistet, zu einem "Stopfen" von allen Partikeln in eine enge, auf den entsprechenden. Radius konzentrierte Zone führt, ist das nicht der Fall. Wie graphisch in 13 dargestellt ist, ist zu verzeichnen, das jede Schicht von Partikeln, die sich einer benachbarten Schicht annähert, in einen Bereich bewegt, in welchem ein "dämpfender Effekt" jede Schicht voneinander entfernt hält (die horizontalen Pfeile in 13). Die Erklärung dafür ist die Unfähigkeit der benachbarten Schichten von Partikeln, sich miteinander zu vermischen, ist eine Folge einer Analyse des mikroskopischen Strömungsgeschwindigkeitsprofils durch jede Schicht. In 14 ist eine einzelne repräsentative Schicht von kugelförmigen Partikeln auf einen bestimmten radialen Abstand in einer Kammerschicht von kreisförmigen Querschnitt eingegrenzt. Das Verhältnis der Durchmesser der Partikel zu dem Durchmesser des Querschnitts von 14 ist 12 : 1. Während die Größe der Strömungsgeschwindigkeit durch die unbelegten Bereiche der Kammer leicht aus den Kammerabmessungen an diesem Punkt quantifiziert werden kann, ist die Strömungsgeschwindigkeit durch einen Bereich, der durch eine Schicht von Partikeln belegt ist, als Folge der stark reduzierten Querschnittfläche, durch welche sich die Flüssigkeit bewegen muß, um ein Vielfaches größer, als in ihrer Abwesenheit. Wie es aus dem Diagramm in 14 ersichtlich ist, ist die Zunahme der Strömungsgeschwindigkeit durch eine Schicht der vorher angeführten Abmessungen mehr als doppelt so groß, wie die in dem freien Raum, der an jeder Seite der Schicht angrenzt, ermittelte. Dieser mikroskopische Zuwachs der örtlichen Strömungsgeschwindigkeit in dem Bereich jeder Schicht erzeugt effektiv ein "Polster", welche jede benachbarte Schicht getrennt hält.
Bei der praktischen Anwendung ist ermittelt worden, daß es für den Fall einer Kegelstumpf-Kammergeometrie zu bevorzugen ist, daß der am weitesten entfernte Bereich des Kegelstumpfes der Bereich ist, wo eine genaue Gleichheit der Zentrifugalkräfte und der Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit erreicht wird. Das "Schlankheitsverhältnis" (das Verhältnis des unteren Durchmessers zu dem oberen Durchmesser) des kegelförmigen Bereichs wird durch das gleichzeitige Lösen der beiden in 15 angeführten Gleichungen bestimmt. In Gleichung 2 ist die gewünschte Randbedingung der Immobilität für die "unterste" Schicht der Partikel dargestellt. Es ist festzustellen, daß die Eigen-Sedimentationsrate des Partikels infolge der Gravitation (S. R.) multipliziert mit dem relativen Zentrifugalkraftfeld, das bei diesem radialen Abstand wirkt (RFC) genau gleich der Größe der Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit (F. V) an diesem Punkt ist. In Gleichung 1 wird eine gewünschte Randbedingung an der gegenüberliegenden Oberfläche der Partikelanordnunq dargestellt. Um das Zurückhalten aller Partikel in der Begrenzungskammer zu sichern, wird willkürlich eine Randbedingung gewählt, bei welcher das Produkt von S. R und RFC doppelt so groß ist, wie die Strömungsgeschwindigkeit in einem radialen Abstand. Das gleichzeitige Lösen der Gleichungen für die gewünschte Randbedingung wird verwendet, um das Verhältnis der Durchmesser des Kegelbereichs zu bestimmen, wenn der obere Durchmesser und die Kegellänge gegeben sind.
16 ist ein Profil der relativen Größen der auf die Strömung bezogenen Kräfte und der Zentrifugalkräfte über eine Begrenzungskammer mit kegelförmigem Querschnitt, die im vorliegenden Beispiel die folgenden Abmessungen aufweist: großer Durchmesser = 6 cm, kleiner Durchmesser = 3,67 cm und Höhe = 3 cm. Wir definieren die relative Sedimentationsrate als das Produkt der Eigensedimentationsrate eines Partikels infolge der Gravitation in einem Nährstoffmedium bei seiner optimalen Temperatur und angelegtem Zentrifugalkraftfeld. Für einen gegebenen Durchsatz (im vorliegenden Beispiel 10 ml/min) in eine Kammer mit den angegebenen Abmessungen, bei welcher das proximale Ende der Begrenzungskammer 9,0 cm von der Drehachse entfernt ist, ist das Produkt der Partikel-Eigensedimentationsrate infolge der Gravitation und der Winkelgeschwindigkeit eine Konstante bei dem gegebenem Durchsatz, um den gewünschten Randbedingungen zu genügen (siehe 15). Mit anderen Worten, die Winkelgeschwindigkeit braucht hier nicht vorgeschrieben zu sein, da ihr Wert nur von dem bestimmten Partikeltyp abhängt, der immobilisiert werden soll. Die gestrichelte Linie zeigt die, lineare Veränderung der Zentrifugalkraftfeldstärke in der Begrenzungskammer von unten nach oben, während die ausgezogene Linie den entsprechenden Wert der Strömungsgeschwindigkeit angibt. Am Kammerboden (ihren am weitesten entfernten Bereich) sind die Kräfte gleich und ein Partikel an dieser Position würde keine Restkraft erfahren. An der Oberseite der Kammer würde ein Partikel ein auf die Strömung bezogene Kraft erfahren, die nur halb so groß ist, wie die des Zentrifugalkraftfelds und es würde somit unwahrscheinlich sein, daß er die Kammer verläßt, selbst dann nicht, wenn ein naheliegender Bereich mit abnehmender Querschnittfläche (die Flüssigkeitsauslaßöffnung der Kammer) vorhanden ist, wo die Strömungsgeschwindigkeiten merklich ansteigen.
Aus den vorhergehenden Ausführungen sollte klar sein, daß, abhängig von der erforderlichen Bedingung, die Querschnittfläche anwächst, wenn der Drehradius abnimmt, es auch andere geometrische Kammerausgestaltungen gibt, deren Form manipuliert werden könnte, um die Randbedingungen und die Zwischenbeziehungen zwischen dem angelegten Zentrifugalkraftfeld und den Flüssigkeitsströmungskräften bei jedem radialen Abstand aufzustellen, um die gewünschten resultierenden Kraftverhältnisse in der dreidimensionalen Anordnung zu erreichen. In der Praxis ist es jedoch wegen der anomalen Wirkung der Coriolis-Kräfte, die in einer Ebene quer zu der Drehebene wirken, unerwünscht, Geometrien mit rechteckigen Querschnitten zu verwenden. Im Fall von rechteckigen Querschnitten können diese ansonsten unwichtigen Kräfte zu einer Bewegung der Partikel zwischen den Schichten beitragen.
Aus den vorhergehenden Ausführungen sollte auch klar sein, daß der Einfluß der Gravitationskräfte, die auf die einzelnen Partikelmassen unabhängig von den angelegten Zentrifugalkräften wirken (siehe 7 bis 8), sogar noch unbedeutender ist, als früher angenommen wurde. Insbesondere bringt, da der Grundeinfluß der Gravitation auf ein ansonsten immobilisiertes Partikel darin besteht, entweder eine radiale Verlängerung oder eine radiale Verkürzung zu bewirken, eine solche Bewegung eines Partikels es entweder in einen Bereich mit erhöhter Strömungsgeschwindigkeit (längere Radien) oder mit einer verringerten Strömungsgeschwindigkeit (kürzere Radien) mit nur einer viel geringeren Veränderung der Stärke des Zentrifugalkraftfelds (siehe 16). Folglich wird die periodische Bewegung eines Partikels auf Grund der Gravitationseinflüsse auf seine Eigenmasse bei Vorliegen eines solchen, sich nicht im Gleichgewicht befindlichen Kraftfelds, stark gedämpft und sie stellt in dem Fall von Partikeln mit einer geringen Masse, wie zum Beispiel von Biokatalysatoren, eine "Schwingung an Ort und Stelle" dar.
Aus den vorhergehenden Ausführungen sollte auch ersichtlich sein, daß in praktischem Sinne ein ernsthaftes Problem bei der Aufrechterhaltung der immobilisierten Partikelanordnungen in der vorher angeführten Art und Weise vorhanden sein könnte, wenn diese Partikel aerobe Zellen, Mikroorganismen oder biokatalyti sche Substrukturen sind. Solche Strukturen erfordern zusätzlich zu flüssigen Nährstoffen das Zuliefern bestimmter Nährstoffe, die Gase bei Umgebungstemperaturen und Umgebungsdrücken sind. So sind zum Beispiel die meisten Zellen oder Mikroorganismen, die bei der Produktion von kommerziellen Biochemikalien wertvoll sind, aerob, d. h. sie brauchen Sauerstoff, um zu überleben. Während diese lebenden Organismen (oder ihre subzellulären Bestandteile) Sauerstoff nur in einer gelösten Form verwerten können, war bisher das einzige Verfahren, Sauerstoff bereitzustellen, das Gas durch die Nährstofflüssigkeit, in welcher die Zellen suspendiert sind, um seine Lösbarkeit zu erzielen, in Blasenform oder in Form eines Sprengens zu leiten. Ferner erzeugen die meisten lebenden Organismen (einschließlich bestimmter Anaeroben) Stoffwechselausscheidungen, die Gase sind (zum Beispiel Kohlendioxid oder Methan). Wenn Gasvolumen in Stoffwechselprozesse in dreidimensionale Anordnungen von Partikeln, die vorher erläutert wurden, eingeführt werden oder aus solchen Prozessen entstehen, würde das empfindliche Gleichgewicht der Kräfte, das die Immobilität der Partikel gewährleistet, zerstört sein.
Daher erfordert das korrekte Funktionieren des Zentrifugal-Immobilisierungsprozesses der vorliegenden Erfindung, daß Maßnahmen ergriffen werden, um die Möglichkeit der Einführung von oder der Entstehung eines Gases (von Gasen) in der Begrenzungskammer auszuschließen. Da die einzige Form dieser ansonsten gasförmigen Chemikalien, die durch diese Zellen verwertbar ist (oder durch sie produziert wird) die wässerig gelöste Form ist, ist es diese Form, die dem Prozeß der vorliegenden Erfindung vorbehalten sein muß. Man kann diesen Zustand durch Anwendung des Henry'schen Gesetzes gewährleisten, das im wesentlichen aussagt, daß die Menge eines Gases, welche in einer Flüssigkeit gelöst sein kann, eine Funktion des Systemdrucks ist. Wenn daher der hydraulische Druck des die Flüssigkeit enthaltenden Systems (die Begrenzungskammer und die Flüssigkeitsleitungen, die zu der Kammer führen und aus ihr heraus führen) bei einem hydraulischen Druck gehalten werden, der ausreichend ist, um die erforderliche Menge des Eintrittsgases vollständig aufzulösen und die Löslichkeit aller erzeugten Gase zu sichern, wird es keine Störung der Immobilisierungsdynamik geben.
17 ist ein Blockdiagramm, welches ein Verfahren darstellt, durch das das Halten eines solchen gasfreien, vollständigen Flüssigkeitssystems bei hydraulischen Drücken größer als der Umgebungsdruck erreicht werden kann. In diesem System sind die angeführten Pumpen alle Verdrängerpumpen, d. h. die Flüssigkeit wird zu einer Bewegung durch die Pumpen in die Richtungen gezwungen, die durch die Pfeile angezeigt sind. Die Pumpe 3 ist die Hauptzuführpumpe, welche die Flüssigkeit in die Zellenimmobilisierungskammer, die sich in einem Zentrifugenrotor befindet, hinein- und aus ihr heraus bewegt. Das Ansteigen des hydraulischen Drucks in dem Kreislauf, indem, sich die Pumpe 3 befindet, wird durch Anordnen eines Flüssigkeitsdruckreglers, dem Systemdruckregler, an einer Position in dem Kreislauf stromabwärts von der Zellenimmobilisierungskammer erreicht. Somit führt das Einstellen einer Druckgrenze, die höher ist als der Außendruck, an dem Systemdruckregler dazu, daß keine Flüssigkeit durch diesen Kreislauf strömt, bis die Verdrängerpumpe, die Pumpe 3, genug Flüssigkeit in den Kreislauf bewegt hat, um den hydraulischen Systemdruck auf einen Wert nahe dieser Einstellung anzuheben. Nachdem ein Gleichgewichts-Systemdruck erreicht ist, fließt die unter Druck stehende Flüssigkeit stromabwärts von der Pumpe 3 kontinuierlich bei einem Durchsatz, der von der Steuerung der Pumpe 3 eingestellt ist.
Um eine geeignete Menge eines gewünschten Nährstoffgases in den Flüssigkeitseingang zu der Pumpe 3 zu lösen, ist ein Gas-Flüssigkeits-Adsorptions-Speicherbehälter in der Eintritts-leitung angeordnet, die zu der Pumpe 3 führt. Die gasfreien Flüssigkeiten werden von dem Medien-Speicherbehälter durch die Pumpe 1 in den Gas-Flüssigkeits-Adsorptions-Speicherbehälter bewegt. Mengen des gewünschten Gases (zum Beispiel Luft oder Sauerstoff) werden gleichzeitig über einen Druckregler, der auf den erforderlichen Gasdruck eingestellt ist, in diesen Speicherbehälter geleitet, um die Löslichkeit der gewünschten Konzentration dieses Gases in der Nährstofflüssigkeit zu sichern. Es ist zu bemerken, daß es im stationären Zustand erforderlich ist, daß die Pumpe 1 mit derselben Durchsatzeinstellung betrieben wird, wie die der Pumpe 3. Die Pumpe 2 ist eine Rezirkulationspumpe, die bei einem Durchsatz betrieben wird, der höher ist als der der Pumpen 1 und 3. Die Pumpe 2 wird verwendet, um den Kontakt zwischen den Gas- und Flüssigkeitsphasen des Gas-Flüssigkeits-Adsorptions-Speicherbehälters zu verstärken, damit eine gewünschte Konzentration des in der Nährstoffflüssigkeit gelösten Gases in der Volumenmasse der Flüssigkeit in dem Adsorptions-Speicherbehälter aufrechterhalten bleibt. Wegen der Wirkungsweise der Verdrängerpumpe ist es wichtig, daß die Größe des in dem Systemdruckregler eingestellten Systemdrucks sich bei einem Wert befindet, der höher ist als der Druck der in dem Gas-Flüssigkeits-Adsorptions-Speicherbehälter eingestellt ist. Damit ein ausreichendes Flüssigkeitsvolumen im Gleichgewicht mit der gewünschten Konzentration des Gases (der Gase) zu jeder Zeit zur Verfügung steht, kann am Eingang zu der Pumpe 3 ein Ventil verwendet werden, um zu erlauben, daß ein solches Gleichgewicht vor jeder aktuellen Anwendung vorhanden ist. Gleichermaßen kann durch Schaltventile der Flüssigkeitseintritt zu der Pumpe 3 gegenüber dem, der in 17 angegeben ist, auf jeden anderen gewünschten Eintritts-Speicherbehälter verändert werden, jedoch unter der Zwangsbedingung, daß der hydraulische Druck eines solchen Speicherbehälters niedriger ist, als der Wert des hydraulischen Drucks, der durch den Systemdruckregler eingestellt ist.
18 ist eine Darstellung eines repräsentativen, kommerziell zur Verfügung stehenden Flüssigkeitsdruckreglers. Ein Einströmen von Flüssigkeit in den Regler 14 wird durch ein federbelastetes Nadelventil 10, das gegen einen Sitz 11 drückt, verhindert. Wenn der hydraulische Druck der Eintrittsflüssigkeit groß genug wird, wird das Nadelventil von dem Sitz verdrängt und der Flüssigkeitsstrom kann dann den Druckregler 15 verlassen. Der festgelegte Druck, der durch die Nadelventilfeder 12 ausgeübt wird, kann durch Erhöhen oder Verringerung des Drucks eingestellt werden, der durch die einstellbare Feder 13 ausgeübt wird.
Es sollte klar sein, daß das Blockdiagramm von 17 eine Darstellung eines von vielen Prozeßablaufgestaltungen ist, die verwendet werden können, damit eine gasfreie, unter Druck stehende Flüssigkeit durch eine Zentrifugal-Immobilisierungskammer strömt. Insbesondere kann man sich viele unterschiedliche Verfahren für das Sichern eines ausreichenden Mischens von Gas und Flüssigkeit vorstellen, um die Löslichkeit einer gemessenen Menge von Gas in einer Flüssigkeit zu sichern. Wesentlich für den Prozeß der vorliegenden Erfindung ist: (1) Der Flüssigkeitskreislauf, der die, Zentrifugal-Immobilisierungskammer und die Flüssigkeitsleitungen in die Kammer und aus ihr heraus umfaßt, wird bei einem hydraulischen Druck betrieben, der höher ist, als der Umgebungsdruck; (2) es ist die Lösung einer gewünschten Menge von Gas in der Flüssigkeit vorgesehen, bevor es in den Flüssigkeitskreislauf eingeführt wird, der zu der (den) Zentrifugal-Immobilisierungskammer(n) führt; und (3) der hydraulische Systemdruck wird bei einem Wert aufrechterhalten, der hoch genug ist, um sowohl das Eintrittsgas (die Eintrittsgase) sowie auch das Atemgas (die Atemgase), die durch biologische Systeme im Flüssigkeitskreislauf erzeugt werden können, stromaufwärts von dem Systemdruckregler und stromabwärts von der Pumpe 3 in Lösung zu halten. Bei uns haben sich hydraulische Drücke von 7,03– 140,6 kg/cm² (100–2000 psig) als ausreichend erwiesen, um eine gasfreie Flüssigkeitsumgebung für alle möglichen Bedingungen von Zelldichte und Zellenanzahl aufrechtzuerhalten.
Es gibt bei hydraulischen Drücken unter 703 kg/cm2 (10000 psig) keine meßbaren schädlichen Einflüsse auf die Kultur der tierischen Zellen oder Mikroorganismen oder ihre subzellulären Bestandteile im Ergebnis der Notwendigkeit, den hydraulischen Druck ihrer Umgebung in der Zentrifugal-Begrenzungskammer zu erhöhen. Die erfolgreiche Zucht von lebenden Zellen unter Verwendung des Unterdrucksetzens des Bioreaktor-Kopfraums ist ein erprobtes und etabliertes Zuchtverfahren, trotzdem es im Umfang auf Drücke von weniger als 0,35 kg/cm² (50 psig) beschränkt ist (siehe Yand, J. u. Wang, N. S. (1992) Biotechnol. Prog., 8, S. 244–251 und darin angeführte Bezugsquellen). Bei hydraulischen Drücken von 1055 kg/cm2 bis 2110 kp/cm² (15000 bis 30000 psig) ist eine gewisse Trennung von nichtkovalenten Proteinkomplexen beobachtet worden, obwohl Drücke von mehr als (90000 psig) 6327 kg/cm² erforderlich waren, um monomerische Proteine zu denatusieren (Yarmush, u. a.. (1992) Biotechnol. Prog., 8 S. 168–178). Es ist eine selten eingeschätzte, jedoch gut bekannte Tatsache, daß lebende Zellen (und ihre Bestandteile) durch hydraulische Drücke unter den vorher angeführten Grenzen unbeeinflußt geblieben sind und diese nicht wahrgenommen haben. Das ist am besten zu erkennen, wenn man die Einflüsse des hydraulischen Drucks auf Meeresorganismen betrachtet. Für jede 10 Meter Tiefe unter dem Meeresspiegel wird der Druck um eine Atmosphäre (14,7 psig) größer. So bewohnen zum Beispiel Meeresboden-Organismen, die biochemischen Prozessen und Stoffwechselwegen ausgesetzt sind, die denen ihrer Flachwasser- und terrestischen Gegenstücke identisch sind, ökologische Nischen und vermehren sich ungeachtet dieser Situation stark bei hydraulischen Drücken von mehr als 210 kp/cm² (3000 psig). Gleichermaßen ist der hydraulische Druck, unter dem terrestische Säugetierzellen existieren größer als der Umgebungsdruck, wobei das zum Beispiel bis größer als 90 bis 120 mm Quecksilbersäule beim Menschen gilt. Die Erklärung für die "Unsichtbarkeit" des hydraulischen Drucks in biologischen Systemen ist verständlich, wenn man sich vergegenwärtigt, daß der hydraulische Druck in wässerigen Systemen als "Kraftträger" das Wassermolekül hat. Da die Lipoid-Doppelschicht, welche die Grenzmembran der lebenden Zellen bildet, für die Wassermoleküle völlig durchlässig ist, wird ein angelegter hydraulischer Druck in wässerigen Systemen über die Grenzmembranen der Zellen oder der subzellulären Organellen durch die Bewegung der Wassermoleküle übertragen. Das führt dazu, daß das Innere (die Innenräume) der Zellen schnell mit einem von außen angewendeten wässerigen hydraulischen Druck ins Gleichgewicht kommen.
Es gibt Situationen, in denen hydraulische Drücke für lebende Zellen schädlich sind, wenn zum Beispiel ein Druckfeld in einem wässerigen System mit hoher Frequenz verändert wird. Dann ist es möglich, daß Zellspaltungen durch die Druckdifferentiale über die Zellengrenzmembran auftreten. Die Frequenz, die für solche tödlichen Einflüsse erforderlich sind, ist jedoch sehr hoch und liegt in der Größenordnung von tausenden von Zyklen pro Sekunde. Solange der pulsierende Druck des Pumpens in dem Prozeß der vorliegenden Erfindung unter einer solchen Grenze gehalten wird, gibt es keinen Einfluß auf die Überlebensfähigkeit der Zelle im Ergebnis von Druckschwankungen, selbst nicht für die zerbrechlichsten der Zellen. Ferner bleibt die Zellverdopplung durch die Zucht bei erhöhtem hydraulischen Druck vollkommen unbeeinflußt.
Das Problem der Einleitung und des Absaugens von unter Druck stehenden Flüssigkeitsströmen in ein rotierendes System hinein bzw. aus ihm heraus ist durch Innovationen bei der Dichtungsausgestaltung in den vergangenen zwanzig Jahren gelöst. Es stehen mechanische Hochleistungs-Endflächen-Dichtungen zur Verfügung, die in der Lage sind, bei Drehzahlen von mehr als 5000 Umdrehungen pro Minute zu arbeiten, wobei ein hydraulischer Druck eines Produktstroms von mehr als 140 kg/cm² (2000 psig) aufrechterhalten wird, wie zum Beispiel von der Durametallic Corporation (2104 Factory Street, Kalamazoo, MI 49001). Solche Hochleistungs-Dichtungen haben Leckraten unter 5 Liter pro Jahr. Sie können durch unter Druck gesetzte Kühlflüssigkeiten gekühlt werden, deren unbeabsichtigtes Lecken in den Produktstrom bei den vorher angeführten Leckraten keinen Einfluß auf biologische Systeme hat und sie können in einer Art und Weise betrieben werden, welche die Einhaltung einer absoluten Sterilität in dem Produktstrom sichert. Die etwa unerklärliche Aversion gegenüber der Verwendung von mechanischen Endflächendichtungen in Zentrifugal-Bioreaktorsystemen (siehe zum Beispiel US-Patente Nr. 4,939,087 und 5,151,368) resultiert aus einer erkannten Notwendigkeit für die Verbindung der flexiblen Rohrleitungen (und der komplizierten Mechanismen für ihr "Entwirren") bei herkömmlichen Konstruktionen. Solche Konstruktionen sind im Ergebnis dessen beschränkt auf: (1) hydraulische Drücke nahe einer Atmosphäre als eine Folge der Rohrflexibilitätsanforderungen; und (2) geringe Drehzahlen und kurze Bioreaktor-Laufzeiten im Ergebnis der kräftigen Bewegung dieser biegsamen Verbindungen. Die Verwendung von modernen mechanischen Hochleistungs-Endflächendichtungen eliminiert alle diese Nachteile auf die Leistungsfähigkeit des Zentrifugal-Bioreaktors.
Die Immobilisierung von dreidimensionalen Anordnungen von Partikeln in einem Kraftfeld, bestehend aus nach außen gerichteten Zentrifugalkräften, denen nach innen gerichtete Flüssigkeitsströmungskräfte entgegenwirken, ist beschrieben worden. Der Einfluß der Gravitationskräfte, welche unvermeidlich, selbst auf die kleinsten und leichtesten Partikel über längere Zeitperioden wirken, kann im wesentlichen negiert und auf kurzzeitige "Schwingungen an Ort und Stelle" reduziert werden, indem man die Drehachse richtig wählt. Die Zerreißkräfte der möglichen Einleitung von Gasen in dieses System sind durch das Anheben des hydraulischen Drucks des Flüssigkeitssystems auf Werte berücksichtigt worden, die sichern, daß solche ansonsten gasförmige Chemikalien in der strömenden Flüssigkeit gelöst bleiben. Es ist betont worden, daß die erforderliche Erhöhung des hydraulischen Drucks keinen Einfluß auf biologische Einheiten, wie zum Beispiel Zellen, Mikroorganismen oder ihre subzellulären Bestandteile hat.
In den nachfolgenden Abschnitten wird eine Ausgestaltung und eine Analyse der Leistungsfähigkeit dieser Ausgestaltung des Zentrifugal-Fermentierungs-Prozesses vorgestellt. 19 zeigt die Komponenten einer Vorrichtung der vorliegenden Erfindung. Ein zylindrischer Rotorkörper 20 ist auf einer horizontalen, motorgetriebenen Drehwelle 21 innerhalb einer Sicherheits-Aufnahmekammer montiert, die durch Metallwände 22 begrenzt wird. Der Rotorkörper ist in seiner Position auf der Drehwelle 21 durch Klemmringe 23 befestigt. Die Drehwelle erstreckt sich über einen Abstand außerhalb der Sicherheits-Aufnahmekammer 22 und endet in einem Endlager und einer Endkappe 29, die in einem Außengehäuse 25 montiert sind. Die Flüssigkeitsströme werden mit Hilfe einer mechanischen Endflächendichtung für die Eintrittsflüssigkeit und einer mechanischen Endflächendichtung für die Austrittsflüssigkeit 27, die durch Flüssigkeitskanäle in der Drehwelle 21 verbunden sind, in die Bioreaktorkammern 26 eingeleitet und aus ihnen entfernt. Die typische Abmessungen für einen beispielhaften Rotorkörper (a = 36 cm und b = 15 cm) sind recht zweckmäßig und sind mit den Rotorabmessungen vergleichbar, die Fachleuten bekannt sind.
20 ist eine Ansicht eines typischen Rotorkörpers 20, gesehen parallel zu der Drehachse. Der zylindrische Rotorkörper ist mit einem Wellenmontagekanal 30 durch seine Mitte versehen, um seine Montage auf der Drehwelle zu erlauben und es sind Vertiefungen für die Kammerpositionierung 32 herausgearbeitet, in welchem die demontierbaren, zylindrischen Bioreaktorkammern (26 in 19) angeordnet werden können und er weist ferner radial verlaufende, rechteckige Kanäle 33 auf, in welchen Flüssigkeits-Metalleitungen angeordnet werden können, die mit den Bioreaktoren in Verbindung stehen. Bei der praktischen Verwendung würde ein kreisförmiger Deckel (nicht dargestellt) an der Oberfläche des in 20 dargestellten Rotors befestigt sein, um den Rotor zu schließen.
21 ist eine Darstellung einer der demontierbaren Bioreaktorkammern (in 19 mit 26 bezeichnet). Die Kammer ist zylindrisch und setzt sich aus zwei dickwandigen Metallstücken zusammen, einem oberen Stück 40, welches eine eingearbeitete konische Vertiefung und einen ausgearbeiteten Kanal, der in einer Austritts-Kompressionsarmatur 41 endet, durch die Flüssigkeit aus dem Bioreaktor entfernt werden kann, und einen unteren Teil 42 aus dem gleichen Metall aufweist, der innen bearbeitet ist, um die Biokatalysator-Immobilisierungskammer 43 in einer geeigneten geometrischen Form zu bilden. Die Form der in 21 dargestellten Immobilisierungskammer ist eine Kegelstumpfform mit einem kurzen konischen Volumen an ihrer unteren Fläche. Ein herausgearbeiteter Kanal, der in einer Eintritts-Kompressions armatur 44 endet, erlaubt den Flüssigkeitseintritt in die Biokatalysator-Immobilisierungskammer. Die beiden Teile der Kammer sind durch versenkte Montageschrauben 45 miteinander verschraubt und gegenüber einem inneren positiven Druck durch eine oder mehrere O-Ring-Druckdichtungen abgedichtet. Im Fall bestimmter Kulturen von tierischen Zellen, bei denen ein Kontakt zwischen den immobilisierten Zellen und den inneren Metallwänden der Kammer vermieden werden sollte, kann es zweckmäßig sein, geeignete konische Einsätze aus, zum Beispiel, Polyäthylen vorzusehen, um einen solchen Kontakt zu verhindern. Alternativ könnte das Innere der Immobilisierungskammer mit einem geeigneten Auskleidungsmaterial beschichtet sein, um dieselbe Wirkung zu erzielen.
22 ist eine Querschnittsansicht durch den Rotorkörper (dargestellt in 19 als 20) parallel zu der Drehachse. Wie in dieser Fig. zu sehen ist, sind die Bioreaktorkammern 26 mit einem zentral angeordneten, axialen Kanal 50 und mit einem exzentrisch, axial verlaufenden Flüssigkeitseintrittskanal 51 in der Drehwelle 21 durch Flüssigkeitsaustritts-Transportleitungen 53 und Flüssigkeitseintritts-Transportleitungen 54 verbunden. Jede Flüssigkeits-Transportleitung ist ein Metallrohr, das mit Kompressionsarmaturen verbunden ist, die sowohl in die ausgearbeiteten Kanäle in der Rotorwelle und in die Kompressionsarmaturen an den Bioreaktorkammern geschraubt sind. Wie ebenfalls in 22 dargestellt ist, kann das genaue Bearbeiten des Rotorkörpers durch fünf verschiedene Schnittansichten des Rotorkörpers senkrecht zu der Drehachse (Ansichten von 23 bis 27) überprüft werden, welche Schnittansichten an den Ebenen sind, die durch gestrichelte Linien gekennzeichnet sind.
In 23 bis 27 sind die Abmessungen und die Konfiguration von fünf verschiedenen, innen bearbeiteten Abschnitten des Rotorkörpers 20 dargestellt. Die 23 und 27 zeigen ein Verfahren, durch welches der Rotorkörper 20 auf der Drehwelle (21 in 19) mittels kettenradförmiger Vertiefungen 60 konzentrisch mit dem Wellenmontagekanal 30, welcher die Positionierungsringe (23 in 19) aufnimmt, montiert werden kann. S-1 ist eine Querschnittsansicht des Wellenmontagekanals 30 und der kettenradförungen Vertiefungen 60. 24 zeigt vier radial verlaufende, rechteckige Kanäle 33, die in den Rotorkörper, in den die Flüssigkeitseintrittsleitungen (54 in 22) führen. 25 zeigt die Formen der Kammerpositionierungsvertiefungen 32, die in den Rotorkörper eingearbeitet sind, in welchem die zylindrischen Bioreaktorkammern angeordnet werden und sie zeigt ferner die Beziehungen dieser Vertiefungen zu den radialen, rechteckigen Kanälen 33. Es ist zu bemerken, daß die radialen, rechteckigen Kanäle 33 sich weiter radial erstrecken, als die Kammerpositionierungsvertiefungen 32 und somit einen Stützkanal bilden, an dem die Flüssigkeitsleitungen ruhen, wenn sie nach "oben" verlaufen, um die Verbindung mit einer Eintritts-Kompressionsarmatur (44 in 21) der Bioreaktorkammern (siehe 22) )herzustellen. Durch die Tatsache, daß die Eintrittsflüsigkeitsleitung (eine Länge der Metallrohrleitung) durch ihr Anlagern an eine Wand des entferntesten radialen, rechteckigen Kanals 33 abgestützt wird, wenn sie die Krümmung im rechten Winkel ausführt, um zu ihrem Endpunkt an einer Eintritts-Kompressionsarmatur 44 jeder Bioreaktorkammer zu gelangen (siehe Schnitt S-2, 24), wirkt keine zusätzliche Zentrifugalbeanspruchung infolge der Drehbewegung des Systems auf diese Leitungen.
26 zeigt ausführlich die innere Bearbeitung des Rotorkörpers 20 für die Befestigungsvertiefungen der Flüssigkeitsaustrittsleitung 70, die erforderlich sind, um Arbeitsraum für die mechanische Befestigung der Flüssigkeitsaustritts-Transportleitungen 53 von 22 an einer Austritts-Kompressionsarmatur 41, 21, der Bioreaktorkammern zur Verfügung zu stellen. Wie in 22 dargestellt ist, sind die Flüssigkeitsaustritts-Transportleitungen 53 "U-förmig" gebogen (in der Figur übertrieben dargestellt). Das ermöglicht es, ihre Länge während der mechanischen Verbindung mit den Austritts-Kompressionsarmaturen der Bioreaktorkammern einzustellen. Die Bioreaktorkammern 26 sind gegen Zentrifugalbeanspruchung an den entfernten Wänden der Kammerpositionierungsvertiefungen 32 abgestützt. Auf die Flüs sigkeitsaustrittsleitungen wirkt im Ergebnis der Zentrifugalkräfte kein Gewicht (außer ihrem Eigengewicht).
28 ist eine Ansicht des Bereiches der Drehwelle 21, an welchem der Rotorkörper 20 montiert ist und des Bereiches der Drehwelle, an welchem die mechanische Flüssigkeitsaustritts-Endflächendichtung 27 und die mechanische Flüssigkeitseintritts-Endflächendichtung 28, welche die Flüssigkeitsströme in die Bioreaktorkammern 26 und aus ihnen heraus transportieren, montiert sind. Die Drehwelle 21 enthält zwei axiale Flüssigkeitstransportkanäle, den zentral angeordneten axialen Kanal 51 und den exzentrischen, axialen Flüssigkeitseintrittskanal 50. Der zentral angeordnete axiale Kanal 51 transportiert mittels eines kurzen, radial verlaufendenden Verbindungskanals 82 den Flüssigkeitsaustritt der Bioreaktorkammern zu der mechanischen Flüssigkeitsaustritts-Endflächendichtung 27, während der exzentrische, axiale Flüssigkeitseintrittskanal 50 die Flüssigkeit von der mechanischen Flüssigkeitseintritts-Endflächendichtung 28 zu der Bioreaktorkammer ebenfalls durch einen kurzen, radial verlaufendenden Verbindungskanal 81 transportiert. Der zentral angeordnete axiale Kanal 51 und der exzentrische, axiale Flüssigkeitseintrittskanal 50 erstrecken sich von einem Ende der Welle bis zu dem Bereich, an dem der Rotorkörper angeordnet ist. Die Druckstopfen 80 dichten die axialen Endöffnungen dieser Kanäle ab.
29 ist eine Ansicht der radial angeordneten Flüssigkeitsverteilungskanal-Naben in dem Bereich der Drehwelle 21, in welchem der Rotorkörper montiert wird. Zwei Paare von Kanälen, die radialen Flüssigkeitsaustrittsleitungskanäle 90 und die radialen Flüssigkeitseintrittsleitungskanäle 92, sind in zwei Querschnitte der Welle eingearbeitet. Diese Kanäle stehen im Fall der radialen Flüssigkeitsaustrittsleitungskanäle 90 in direkter Verbindung mit dem zentral angeordneten axialen Kanal 51. Im Fall der radialen Flüssigkeitseintrittsleitungskanäle 92 ist ein zusätzlicher radialer Kanal 94 eingearbeitet, welcher den exzentrischen, axialen Flüssigkeitseintrittskanal 50 mit dem zentra len Anschluß der radialen Flüssigkeitseintrittsleitungskanäle 92 verbindet. Dieser zusätzliche radiale Kanal 94 ist mit einem Kompressionsstopfen 95 an der Oberfläche der Drehwelle 21 abgedichtet. In der aktuellen Praxis, insbesondere bei Betrieb des Rotorsystems mit hoher Drehzahl, kann es vorteilhaft sein, daß beide axialen Kanäle, der zentral angeordnete axiale Kanal 51 und der exzentrische, axiale Flüssigkeitseintrittskanal 50, zu Auswuchtzwecken zu der Drehachse exzentrisch und symmetrisch auf einem Durchmesser der Drehwelle angeordnet sind.
30 ist eine Ansicht einer mechanischen Endflächendichtungsanordnung, wie zum Beispiel die mechanische Flüssigkeitsaustritts-Endflächendichtung 27, die in 19 dargestellt ist. Die mechanische Flüssigkeitsaustritts-Endflächendichtung 27 ist auf der Drehwelle 21 montiert und mit einer Öffnung zu dem inneren Flüssigkeitsraum der Dichtung über einem kurzen, radial verlaufenden Verbindungskanal 82 positioniert, der mit dem zentral angeordneten axialen Kanal 51 in Verbindung steht, der in die Drehwelle 21 eingearbeitet ist. Eine Abdichtung zwischen den rotierenden und stationären Teilen der mechanischen Flüssigkeitsaustritts-Endflächendichtung 27 wird durch den Kontakt der stationären Dichtungsfläche 100 mit der rotierenden Dichtungsfläche 102 erreicht. Im Fall von Hochleistungs-Endflächendichtungen, die in dem Prozeß der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, bei dem die sich ergebenden Zentrifugalkräfte, die auf die Dichtungskomponenten wirken, berücksichtigt werden müssen, sind alle Federelemente in dem stationären Teil der Dichtungsanordnung angeordnet. Wenn auch die in 30 dargestellte Dichtungsausführung eine Einfachdichtung ist, können Doppel- und oder Tandem-Endflächendichtungsgestaltungen sich bei längerer Nutzung als vorteilhaft erweisen. In der Figur sind die unter Druck stehenden Kühlflüssigkeitskanäle und die Ummantelung, die für das Aufrechterhalten des Temperaturgleichgewichts in der Dichtungsanordnung erforderlich sind, nicht dargestellt. Wenn eine solche Dichtungsanordnung auf der rotierenden Welle der vorliegenden Erfindung montiert ist, können über die Kompressionsarmaturanordnung wässerige Flüssigkeiten in den stationären Teil der Dichtungsanordnung gepumpt werden und die gepumpte Flüssigkeit wird einem Weg folgen, der durch die gestrichelte Linie 103 gekennzeichnet ist, um mit dem zentral angeordneten axialen Kanal 51 in Verbindung zu kommen, welcher diese Flüssigkeit von den Bioreaktorkammern 25, die in dem Rotorkörper 20 angeordnet sind (siehe 28), weg transportiert.
Der prinzipielle Nachteil bei der Verwendung von mechanischen Dichtungen für den Transsport von Flüssigkeiten in die rotierenden Systeme und aus ihnen heraus, wobei der Zweck des Systems ist, biologische Substanzen, wie zum Beispiel tierische Zellen oder Mikroorganismen zu züchten, ist bisher das Problem der Aufrechterhaltung von Sterilität gewesen. Mechanische Niederdruckdichtungen haben in der Vergangenheit einen Weg zur Verfügung gestellt, auf dem über die dünne Schicht der inneren Flüssigkeit, welche die Endflächen der Dichtung schmiert, zufällig vorhandene Mikroorganismen Zuritt in die Bioreaktorsysteme erhalten konnten. In dem Prozeß der vorliegenden Erfindung, in dem die innere Flüssigkeit immer bei einem hydraulischen Druck gehalten wird, der größer als der Außendruck ist, wird der gesamte Leckverlust der Flüssigkeit zu dem Äußeren des Systems hin auftreten. Es gibt daher keinen möglichen Weg, welcher zufällig Verschmutzungen in das System einlassen kann. Ferner wird der kleine Leckverlust der inneren Nährstoff- oder Produktflüssigkeit, der aus dem Bioreaktorsystem durch die mechanischen Dichtungen des Prozesses der vorliegenden Erfindung austreten könnte (der zum Beispiel Mikroorganismen bei bestimmten Anwendungen enthalten könnte) nicht freigesetzt, daß er sich in die Umgebung zerstreuen kann. Als Folge der Betriebskennwerte von mechanischen Hochgeschwindigkeits-Hochdruckdichtungen ist es erforderlich, die Dichtungskomponenten mit einer unter Druck stehenden Kühlflüssigkeitsströmung zu umgeben. Es hat sich in der Praxis herausgestellt, daß eine ideale Flüssigkeit, welche die korrekte Viskosität und die korrekten Strömungseigenschaften für das Kühlen solcher Dichtungen aufweist, Glyzerin mit einer Konzentration von 75–85% ist. Jeder Leckverlust von innerer Flüssigkeit in das Äußere des Prozesses der vorliegenden Erfindung führt zu seiner Dispersion in den Körper der rezirkulierten Flüssigkeit. Wir haben ermittelt, daß Glyzerin bei dieser Konzentration vollkommen unfähig ist, das Wachstum einer Anzahl von repräsentativen Tierzellen oder von Mikroorganismen zu unterstützen. Das ist wahrscheinlich eine allgemeine Erscheinung, vornehmlich als Ergebnis der osmotischen Bewegung von Wasser aus den lebenden Zellen in das Glyzerin. Somit dient eine periodische sanitäre Abführung des Kühlflüssigkeitsvolumens des Glyzerins, wenn es durch Leckvolumen verdünnt wird und sein Ersatz durch frisches Glyzerin dazu, die Sterilität an der einzigen Stelle in dem System, an der Flüssigkeit entweichen könnte, aufrechtzuerhalten. Schließlich ist es wichtig zu bemerken, daß, weil es nach längerer Verwendung möglich ist, daß ein Verlust des inneren Systemdrucks oder ein Rißfehler der Dichtungssysteme es der Flüssigkeitsströmung erlauben könnte, über die Dichtflächen in die umgekehrte Richtung zu fließen, kleine Mengen von Glyzerin, die somit in das Bioreaktorsystem gelangen könnten, nicht irgendetwas sein würden, sondern ein zusätzlicher Nährstoff, wenn es in die innere Prozeßflüssigkeit gelangt und diese verdünnt.
Um Daten für eine Analyse der Leistung eines Rotorkörpers mit den Abmessungen, die durch die Buchstaben in den 19, 20, 22 bis 29 gekennzeichnet sind, und mit demontierbaren, zylindrischen Bioreaktor-Immobilisierungskammern, wie die in 21 dargestellten, (die Abmessungen sind durch die Buchstaben angegeben) zu erhalten, war es erforderlich, daß mehrere Maßstabs-Dimensions- und Randgleichungen willkürlich gewählt und verwendet wurden, um die Betriebskennwerte eines typischen Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung zu bestimmen. Die Immobilisierungs-Randgleichungen sind die, welche in den Gleichungen 1 und 2 von 15 angeführt sind. Die Rotorabmessungen, die für dieses Beispiel gewählt und durch die Buchstaben in den 19 bis 29 gekennzeichnet sind, sind folgende:
In dem vorliegenden Beispiel ist die Geometrie des Inneren Immobilisierungsbereichs 43 der beispielhaften Bioreaktorkammer 26 eine Kegelstumpf-Geometrie. Wie in 31 dargestellt ist, kann das dimensionale Problem des "Schlankheitsverhältnisses" des inneren Immobilisierungsbereichs der beispielhaften Bioreaktorkammer auf Grund der Randbedingungs-Einschränkungen auf eine Überprüfung der geometrischen Beziehungen zwischen dem großen und dem kleinen Radius des kegelförmigen Abschnitts und auf der Höhe des kegelförmigen Abschnitts reduziert werden.
Wie es in 31A dargestellt ist, kann der kegelförmige Immobilisierungsbereich einer beispielhaften Bioreaktorkammer (gesehen in der Drehebene) als ein abgeschnittenes Dreieck 110 dargestellt werden, dessen proximale Fläche sich in einem Abstand von R_X von dem Drehmittelpunkt befindet und dessen abgeschnittene Länge R_C ist. Die Zentrifugalkräfte (RFC) wirken so, daß sie eine Translation eines Partikels 111 in dem Immobilisierungsvolumen hin zu längeren Radien bewirken, während die Flüssigkeitsströmungskräfte (FV) so wirken, daß sie eine Translation zu kürzeren Radien bewirken. Gleichung (1) von 31B ist ein Ausdruck für die Größe der relativen Zentrifugalkraft bei einer radialen Länge (R_X) ausgedrückt als Drehgeschwindigkeit. Die Gleichung (2) ist ein Ausdruck für die Größe der Strömungsgeschwindigkeit bei der radialen Länge (R_X) ausgedrückt als Flüssigkeitsdurchsatz und des großen Durchmessers des kegelförmigen Abschnitts. Gleichung (3) ist ein Ausdruck für die Größe der relativen Zentrifugalkraft bei einer radialen Länge (R_X + R_C) ausgedrückt als Drehge schwindigkeit. Gleichung (4) ist ein Ausdruck für die Größe der Strömungsgeschwindigkeit bei dieser letzteren radialen Länge ausgedrückt als Flüssigkeitsdurchsatz und der gegebenen Abmessungen des dargestellten Dreiecks und seiner Abschnitte. Um den "Schlankheitsgrad" des kegelförmigen Abschnitts (das Verhältnis der Durchmesser) zu bestimmen, der bestimmten Randbedingungen genügt, welche die körperlichen Abmessungen des Rotorkörpers vorgeben, haben wir gewählt, den Radius des schmalen Endes des kegelförmigen Abschnitts in Form der Länge (L) des Kegels, aus dem das Dreieck abgeleitet ist, auszudrücken.
Die gewünschten Randbedingungen sind: (1) daß das Produkt der Eigensedimentationsrate des immobilisierten Partikels infolge der Gravitation (SR) und das angelegte Zentrifugalkraftfeld (RCF) genau gleich der Größe der aus der Strömung abgeleiteten Kraft (FV) an dem entferntesten Teil der Kammer ist und (2) daß dieses Produkt doppelt so groß ist, wie die Flüssigkeitsströmungskräfte am naheliegendsten Teil der Kammer. Somit gilt:
Bei einem Zentrifugalradius = R_X + R_C (SR) × (RCF) = FV
Bei einem Zentrifugalradius = R_X (SR) × (RCF) = 2 × FV
Wenn man in diese Gleichungen die Abmessungsangaben für RFC und FV einsetzt, die aus den Gleichungen (1 bis 4) der 31 erhalten werden, haben wir nun zwei simultane Gleichungen, die sich auf den Flüssigkeitsdurchsatz, auf die Drehzahl des Systems und auf die Abmessungen der kegelförmigen Immobilisierungskammer beziehen:
Um zu einer Lösung für diese Gleichungen zu kommen, führen wir die folgenden Substitutionen ein, die auf den körperlichen Abmessungsgrenzen des Beispiels für das Rotorsystem basieren:
R_X = 90 mm
R_C = 30 mm
q = 30 mm
Die simultanen Gleichungen nehmen nun die folgende Form an:
Das Einsetzen der Gleichung (2) in die Gleichung (1) ergibt:
Die Lösung dieses quadratischen Ausdruck ergibt L = 77,4 mm und
Da bereits früher bestimmt wurde (siehe 31 ), daß R1 = Q(L – RQ)/L ist somit der kleinere Radius des Kegelstumpfes, welcher den Randbedingungen genügt:
R1 = 18,4 mm
Nun nehmen die beiden simultanen Gleichungen die folgende Form an: (1) (SR)C1(120) = C2(2,67) (2) (SR)C1(90) = C2(2)
Und durch Subtrahieren der Gleichung (2) von der Gleichung (1) und Zusammenfassen der Ausdrücke erhalten wir: (3) (SR)(30) C1 = (0,67)C2
Das Einsetzen der Werte von C₁ und C₂ in die Gleichung (3) ergibt: (3) (SR)(30)(1,12)(RPM/1000)2 – (0,67)(FR/IIq2)
Wir haben nun in Form der Variablen RPM und FR einen Ausdruck, welcher den gewünschten Randbedingungen und den körperlichen Abmessungsgrenzen genügt:
Somit folgen, wenn die körperlichen Abmessungen des Rotorsystems sowie die der Bioreaktor-Immobilisierungskammer bestimmt sind, die Reihe der Rotorwinkelgeschwindigkeiten (RPM) und der Systemflüssigkeitsdurchsätze (FR), welche die Partikel zur Immobilität in dem Bioreaktor zwingen, einer einfachen Abhängigkeit, die nur von der Eigensedimentationsrate (SR) des Partikelobjektes infolge der Gravitation abhängig ist. Es ist zu bemerken, daß unter den vorher angeführten Bedingungen das maximale Immobilisierungsvolumen etwa 56 Milliliter pro Bioreaktorkammer beträgt.
Das vorliegende Verfahren und die Vorrichtung zur Aufnahme eines Biokatalysators umfaßt den Schritt der Aufnahme des Biokatalysators in wenigstens einer Kammer, die in einem Zentrifugalkraftfeld angeordnet ist, wobei ein kontinuierlicher Fluss einer Flüssigkeit dazu wirkt, eine Kraft zu erzeugen, die dem Zentrifugalkraftfeld entgegengesetzt ist und wobei eine Gravitationskraft zu der resultierenden Vektorsumme aller Kräfte, die auf den Biokatalysator wirken, beiträgt, wobei die Gravitationskraft, die Zentrifugalkraft und die entgegenwirkende Flüssigkeit den Biokatalysator in einer Position in der Kammer immobilisieren, so daß der Effekt der Gravitationskraft auf den Biokatalysator im wesentlichen negiert und auf eine periodische Oszillation reduziert ist.
Es gibt viele alternative Formen für die Bioreaktorkammern, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Eine solche alternative Ausführung ist eine Bioreaktorkammer, deren Innenraum die Form eines geraden Kreiskegels hat, dessen Hauptachse parallel zu dem angelegten Zentrifugalkraftfeld ausgerichtet ist und dessen großer Durchmesser näher zu der Rotationsachse liegt als seine Spitze.
Eine andere alternative Ausführung ist die Bioreaktorkammer mit einem Innenraum in Form eines geraden Kreiskegels, dessen Hauptachse nicht parallel zu dem angelegten Zentrifugalkraftfeld ausgerichtet ist, sondern einen Winkel zwischen 0 und 90 Grad zu dem angelegten Zentrifugalkraftfeld bildet. Ebenfalls ist eine Bioreaktorkammer in die vorliegende Erfindung einbezogen, deren Innenraum die Form eines geraden Kreiskegelstumpfes hat, dessen Hauptachse parallel zu dem angelegten Zentrifugalkraftfeld ausgerichtet ist und dessen großer Durchmesser näher zu der Rotationsachse liegt als sein kleinerer Durchmesser.
Ferner schließt die vorliegende Erfindung eine Bioreaktorkammer mit einem Innenraum in Form eines geraden Kreiskegelstumpfes ein, dessen Hauptachse nicht parallel zu dem angelegten Zentrifugalkraftfeld ausgerichtet ist, sondern einen Winkel zwischen 0 und 90 Grad zu dem angelegten Zentrifugalkraftfeld bildet.
Die vorliegende Erfindung schließt eine Bioreaktorkammer mit einem Innenraum in Form eine Kugel ein, wobei das angelegte Zentrifugalkraftfeld senkrecht zu einem. kreisförmigen Querschnitt der kugelförmigen Bioreaktorkammer wirkt und sie schließt eine Kammer ein, bei welcher das angelegte Zentrifugalkraftfeld nicht senkrecht zu einem kreisförmigen Querschnitt der kugelförmigen Bioreaktorkammer wirkt, sondern einen Winkel zwischen 0 und 90 Grad zu dem kreisförmigen Querschnitt bildet.
Ferner schließt die vorliegende Erfindung eine Bioreaktorkammer mit einem Innenraum in Form einer abgeschnittenen Kugel ein, wobei das angelegte Zentrifugalkraftfeld senkrecht zu einem kreisförmigen Querschnitt der Kugel wirkt und sie schließt eine Kammer ein, bei welcher das angelegte Zentrifugalkraftfeld nicht senkrecht zu einem kreisförmigen Querschnitt der Kugel wirkt, sondern einen Winkel zwischen 0 und 90 Grad zu dem kreisförmigen Querschnitt bildet.
Die vorliegende Erfindung schließt eine Bioreaktorkammer mit einem Innenraum in einer Form ein, der einen sich verändernden kreisförmigen Querschnitt hat, wobei das angelegte Zentrifugalkraftfeld senkrecht zu den kreisförmigen Querschnitten wirkt, und sie schließt eine Kammer ein, bei welcher das angelegte Zentrifugalkraftfeld nicht senkrecht zu den kreisförmigen Quer schnitten wirkt, sondern einen Winkel zwischen 0 und 90 Grad zu den kreisförmigen Querschnitten bildet.
Die vorliegende Erfindung schließt ferner eine Bioreaktorkammer mit einem Innenraum in einer Form ein, der einen sich verändernden elliptischen Querschnitt hat, wobei das angelegte Zentrifugalkraftfeld senkrecht zu den elliptischen Querschnitten wirkt; und sie schließt eine Kammer ein, bei welcher das angelegte Zentrifugalkraftfeld nicht senkrecht zu den elliptischen Querschnitten wirkt, sondern einen Winkel zwischen 0 und 90 Grad zu den elliptischen Querschnitten bildet.
Weiterhin ist in die vorliegende Erfindung eine Bioreaktorkammer eingeschlossen, die einen Innenraum in Form kombinierter kreisförmiger und elliptischer Querschnitte entlang einer Achse senkrecht zu dem angelegten Zentrifugalkraftfeld hat und eine Kammer, die einen Innenraum in Form kombinierter kreisförmiger und elliptischer Querschnitte entlang einer Achse hat, die nicht senkrecht zu dem angelegten Zentrifugalkraftfeld verläuft, sondern einen Winkel zwischen 0 und 90 Grad zu den kreisförmigen und/oder elliptischen Querschnitten bildet.
Der Prozeß der vorliegenden Erfindung ist auf die Immobilisierung von Biokatalysatoren, wie Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen, ihren subzellulären Organellen und natürlichen oder künstlichen Ansammlungen solcher Biokatalysatoren gerichtet. Daher muß das Prozeßsystem in der Lage sein, ziemlich leichte Partikel zu immobilisieren. Es ist bekannt, daß die Sedimentationsraten solcher Partikel wegen ihres Gravitationsbereiches von etwa 0,01 mm/min für kleine Bakterien bis zu 0,1 mm/min, für kleine Tierzellen bis zu mehr als 10,0 mm/min für dickwandige Mikroorganismen (wie zum Beispiel Hefen) und biokatalytischen Ansammlungen, wie zum Beispiel durch Einbetten immobiliaierte Zellen, betragen. Wir haben die Leistungskennwerte des Zentrifugal-Bioreaktorsystems der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der vorher angeführten dimensionalen Ausgestaltungen analy siert und stellen nachfolgend die Ergebnisse dieser Analyse vor.
32 zeigt Profile der Werte der Rotordrehzahl und der Flüssigkeitsdurchsätze, welche den vorher angeführten Randbedingungen genügen und die für die Rotor- und Bioreaktorabmessungen gelten, die in den 19 bis 27 in den Fällen von typischen, biologisch bedeutsamen Partikeln der untersten zwei Sedimentationsratenbereiche angeführt sind. Die obere Linie zeigt das Kontinuum der Flüssigkeitsdurchsätze und der Drehzahlen, die zu der Immobilisierung der Partikel mit einer Eigensedimentationsrate von 0,001 mm/min führen, einem Wert der mehr als einen Faktor von zehn kleiner ist, als je für getestete Mikroorganismen gemessen wurde. Es ist zu bemerken, daß selbst bei einem Durchsatz von 10 Milliliter/min die Rotordrehzahl, die für die Aufrechterhaltung der Immobilisierung erforderlich ist, ein physikalisch annehmbarer Wert ist und daß die maximal erforderliche Zentrifugalkraft etwa 9400 × g beträgt, ein Wert der gut innerhalb der physikalischen Grenzen von Zentrifugalsystemen mit Durchschnittsqualität liegt. Die untere Linie zeigt das entsprechende Profil für Partikel mit einer Sedimentationsrate von 0,01 mm/min, einem Wert, der für typische, repräsentative Bakterien gilt. Wiederum stellt diese Linie ein Kontinuum von Werten dar, welche den Immobilisierungsbedingungen genügen. So reicht zum Beispiel, wenn ein Durchsatz von 2,0 Milliliter/min erforderlich ist, um eine dreidimensionale Anordnung von "Bakterien A" einer bestimmten Größe zu ernähren, eine Rotordrehzahl von nahezu 1200 U/min aus, während ein erforderlicher Durchsatz von 8 Milliliter/min eine Rotordrehzahl von 2500 U/min erfordert. Es ist zu bemerken, daß die schwereren Partikel von SR = 0,01 mm/min nur eine mäßige maximale Zentrifugalkraft von etwa 1000 × g bei einem Durchsatz von 10,0 Milliliter/min erfordern.
33 zeigt Profile der Werte der Rotordrehzahl und der Flüssigkeitsdurchsätze, welche den vorher angeführten Randbedingungen genügen und die für die Rotor- und Bioreaktorabmessungen gelten, die in den 19 bis 27 in den Fällen von typischen, biologisch bedeutsamen Partikeln der höheren drei Sedi mentationsratenbereiche angeführt sind. Die obere Linie zeigt das Kontinuum der Flüssigkeitsdurchsätze und der Drehzahlen, die zu der Immobilisierung der Partikel führen, die größeren Mikroorganismen oder kleinen Tierzellen (z. B. Säugetier-Erythrozyten) mit einer Eigensedimentationsrate von 0,1 mm/min vergleichbar sind. Die mittlere Linie zeigt die entsprechenden Werte für die Immobilisierung typischerer Tierzellen (Durchmesser etwa 30 μm). Während die untere Linie das Kontinuum der Werte zeigt, welche die Immobilisierung von Zellen mit hoher Dichte, wie zum Beispiel von eukaryotischen Hefen sichern. Wie es auch der in 32 gezeigte Trend war, werden die maximalen Rotordrehzahlen und die maximalen Zentrifugalkräfte, die in diesem Durchsatzbereich erforderlich sind, kleiner, wenn die schwerkraftbedingte Partikel-Eigensedimentationsrate ansteigt. Somit erfordert für einen Durchsatz von 10,0 Milliliter/min eine dreidimensionale Anordnung von Tierzellen in Durchschnittsgröße nur eine relative Zentrifugalkraft von 10 × g, um Immobilisierung zu gewährleisten.
34 zeigt Profile der Werte der Rotordrehzahl und der Flüssigkeitsdurchsätze, welche den vorher angeführten Randbedingungen genügen und die für die Rotor- und Bioreaktorabmessungen gelten, die in den 19 bis 27 im Fall von Flüssigkeitsdurchsätzen für soviel wie 100 Milliliter/min für die drei höchsten Sedimentationsratenbereiche, die überprüft wurden; angeführt sind. Somit sind selbst dann, wenn die Flüssigkeitsdurchsätze, die für die Ernährung solcher immobilisierten "Betten" von Partikeln (Bettvolumen zum Beispiel = 56 Milliliter) auf das zehnfache erhöht ist, die maximalen Zentrifugalkräfte und die Rotordrehzahlen, die erforderlich sind, technisch nicht zu bemerken sind. Es ist zu bemerken, daß im Fall von "Tierzellen" (SR = 1,0 mm/min) ein Durchsatz von 100 Milliliter/min einen Durchsatz von 6,0 Litern/Stunde darstellt. Das ist ein Durchsatz, der wesentlich größer ist, als für eine ausreichende Ernährung einer solchen dreidimensionalen Anordnung von Zellen unter jeden vorstellbaren Bedingungen erforderlich ist.
Während es allgemein offensichtlich ist, daß der Einfluß des Immobilisierens einer Population von zum Beispiel Bakterien in einer strömenden Flüssigkeit nicht zu einer Zellbeschädigung als ein Ergebnis des Strömens der Flüssigkeit an der Oberfläche solcher Zellen vorbei führt (da viele Mikroorganaismen außerzelluläre "Schutzschilde" aufweisen, welche ihre Plasmamembranen gegen die Flüssigkeitsscherkräfte schützen), ist es weniger offensichtlich, ob empfindliche Tierzellen (welche keinen solchen extrazellulären Schutz aufweisen) unter diesen Bedingungen überlebensfähig bleiben oder nicht. Wie jedoch in 33 dargestellt ist, beträgt die maximale RCF, die erforderlich ist, um eine Tierzelle von durchschnittlicher Größe in einem Flüssigkeitsstrom von 10 Milliliter/min immobil zu halten, etwa 10 × g. Selbst wenn dieser Strom auf ein Maß angehoben wird, das entscheidend über jedem vorgesehenen Ernährungsbedarf liegt (100 Milliliter/min), ist die maximal erforderliche RCF nur etwa 100 × g (34). Es sollte daran erinnert werden, daß die Immobilisierung einer solchen Zelle in einer strömenden Flüssigkeit das mathematische Äquivalent der Bewegung der Zelle durch eine stationäre Flüssigkeit ist. Somit ist es, da die herkömmliche Laboratoriums-Sedimentation von Tierzellen durch flüssige Medien bei RCFs von mehr als 100 × g eine nicht zu bemerkende Erscheinung ist, unwahrscheinlich, daß die Scherkräfte, die in dem Prozeß der vorliegenden Erfindung auf solche Zellen wirken, irgendeine Beschädigung ihrer Plasmamembranen hervorrufen. Diese Behauptung wird durch die Betriebskennwerte einer darauf bezogenen Vorrichtung, des Beckman-JE-5,0-Zentrifugal-Elutriationssystems, unterstützt, aus dem lebenfähige Tierzellen erfolgreich zurückgewonnen wurden, nachdem sie Strömungsdurchsätzen und RCFs ausgesetzt waren, die größer waren, als die hierin für den Prozeß der vorliegenden Erfindung vorgeschlagenen.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dreidimensionale Anordnungen von biologisch bedeutsamen Partikeln zu immobilisieren und die immobilisierten Partikel ausreichend mit einem vollständigen Flüssigkeitsstrom zu ernähren. Insbesondere sind für den Prototyp-Zentrifugalprozeß im kleinen Maßstab, der vorher angeführt wurde, die erforderlichen Zentrifugalkräfte und Flüssigkeitsdurchsätze nicht unüblich und rufen keine neuartigen Probleme hervor, wie zum Beispiel, daß unverhältnismäßig hohe Drehzahlen oder Durchsätze erforderlich sind. Ferner ist aufgezeigt worden, daß es einen weiten Bereich von paarweisen Durchsätzen und Winkelgeschwindigkeiten gibt, welche die Immobilisierung der dreidimensionalen Anordnungen solcher Partikel aufrechterhalten.
Die Tatsache, daß es einen weiten Bereich von Durchsätzen und entsprechenden Drehzahlen gibt, die verwendet werden können, um solche Anordnungen von Partikeln zu immobilisieren, hat jedoch eine umfassendere Bedeutung. Man kann sicher sagen, daß das Hauptproblem bei einer Zucht in großem Maßstab die Unfähigkeit ist, dichte Massen von stoffwechselaktiven biologischen Einheiten ausreichend zu ernähren. Im Fall einer Kultur von herkömmlichen Säugetierzellen wird aus diesem Grunde zum Beispiel eine durchschnittliche Zelldichte von mehr als 1 × 10⁶ Zellen/Milliliter über längere Zeitperioden selten erreicht. Gleichermaßen werden aus dem gleichen Grund Bakterien-Zelldichten von 1 × 10⁷ in Massenkulturen durch herkömmliche Verfahren selten überschritten. Unter Verwendung der Methodologie des Prozesses der vorliegenden Erfindung können, da die Zelldichte und das effektive "Bett"-Volumen ansteigen (entweder durch zelluläre Proliferation oder durch die Bioreaktorbelastung, die Nährstoffanforderungen von größeren oder dichteren Kulturen durch einen verstärkten Eintritts-Flüssigkeitsstrom erfüllt werden, während gleichzeitig die Größe des angelegten Zentrifugalkraftfelds ansteigt. Unter Verwendung des Prozesses der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Säugetierzellkulturen bei Konzentrationen von zwei Zehnerpotenzen höher aufrechtzuerhalten als herkömmlich, wobei gleichermaßen bakterielle Zelldichten von 1 × 10¹⁰ Zellen/Milliliter realisierbar sind.
Gleichermaßen wird für dichte Kulturen von aeroben Organismen das herkömmliche Problem einer ausreichenden Belieferung der Kultur mit optimal gelöstem Sauerstoff leicht unter Verwendung des Prozesses der vorliegenden Erfindung gelöst. Da es möglich ist, molekularen Sauerstoff in typischen Zuchtmedien bei Konzentrationen von mehr als 100 mM (unter Verwendung eines hydraulischen Drucks von etwa 105 kg/cm² (1500 psig) zu lösen, wird das Problem einer optimalen Belieferung einer Kultur mit jeder vorstellbaren Dichte mit optimal gelöstem Sauerstoff leicht durch Einstellen des hydraulischen Systemdrucks auf einen Wert gelöst, welcher die Löslichkeit der gewünschten Sauerstoffkonzentration aufrechterhält. Die Fähigkeit, Konzentrationen von gelöstem Sauerstoff bei optimalen Werten zu halten, führt zu einer wesentlich erhöhten Produktionseffektivität. Wie durch viele Forscher angegeben wird, ist die Unfähigkeit, zelluläre Produktionseffektivitäten nahe der im Körper erreichten zu erreichen, der Hauptnachteil der konventionellen Tierzuchttechnologien. (The Scientist, 9 Nr. 22, S. 16 vom 14. November 1994). Ferner hat die Fähigkeit, eine nahezu normale aerobe Effektivität in der dichten Kultur zu erreichen, einen anderen, weniger offensichtlicheren Vorteil, nämlich die Erzeugung von Wärme. Anstatt teure Energie zuzuführen, um die flüssige Zellumgebung auf eine optimale Temperatur zu bringen, ist es wahrscheinlich, daß die gepumpte Flüssigkeit des Prozesses der vorliegenden Erfindung bei verringerten Temperaturen an die Zellumgebung geliefert werden muß, um überschüssige Stoffwechselwärme abzuleiten.
Ein anderer wichtiger Vorteil des Prozesses der Erfindung ist die relative Invarianz der chemischen Zusammensetzung der flüssigen Umgebung, in welcher die dreidimensionalen Anordnungen von Biokatalysatoren immobilisiert werden. Da die Anordnungen kontinuierlich mit einer frischen, optimalen Nährstoffeingabe versorgt werden und da diese Anordnungen kontinuierlich durch die Kontinuität des Prozeßablaufes abgelassen werden, ist die chemische Zusammensetzung der zellulären Umgebung über die Zeit vollkommen invariant. Es gibt flache chemische Gradienten der Nährstoffe, des Produkts (der Produkte) und der Stoffwechselprodukte über die radiale Länge dieser Anordnungen. Weil das jedoch die kürzeste Dimension der Anordnung ist, sind diese Gradienten minimal und können leicht durch das Anpassen der Medienzusammen setzung kompensiert werden. So kann zum Beispiel eine pH-Veränderung über die Anordnungstiefe mit minimaler Pufferung kompensiert werden, wobei die Gradienten der Nährstoffzuführung über die Anordnungstiefe gleichermaßen kompensiert werden können. Am wichtigsten ist jedoch die Tatsache, daß Stoffwechsel-Abfallprodukte kontinuierlich durch den Prozeßflüssigkeitsstrom aus der zellulären Umgebung entfernt werden. Da es angedeutet wurde, daß die Unfähigkeit, Stoffwechsel-Abfallprodukte zu entfernen und die Unfähigkeit, die gewünschten Produkte kontinuierlich aus der zellulären Umgebung zu entfernen, ein Hauptfaktor für eine verringerte Zellproduktivität ist, ist es wahrscheinlich, daß die Verwendung des Prozesses der Erfindung die allgemeine zelluläre Produktivität bedeutend erhöht.
Die chemische Zusammensetzung der optimalen Eintrittsflüssigkeit-Nährstoffmedien zu den immobilisierten Populationen von Biokatalysatoren in dem Prozeß der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich wesentlich von der der herkömmlichen Nährstoffmedien. Insbesondere ist die optimale Medienzusammensetzung in diesem Prozeß so, daß die Medien in einem Durchgang durch den Immobilisierungs-Bioreaktor vollständig verbraucht werden. Typische Nährstoffmedien enthalten eine Mischung von bis zu dreißig oder mehr Nährstoffchemikalien, von denen alle in einem großen Überschuß gegenüber dem unmittelbaren Nährstoffbedarf der Biokatalysatoren vorhanden sind, da diese Medien ihre Stoffwechselprozesse über bis zu 100 Stunden in einigen Fällen ununterbrochen aufrechterhalten müssen. Gleichermaßen enthalten herkömmliche Medien Konzentrationen von pH-Pufferverbindungen und Indikatoren und hormonelle Stimuli (fötale Zwischenstufen und/oder Zytokine) in großem Überschuß gegenüber dem unmittelbaren Bedarf der Biokatalysatoren. In dem Prozeß der vorliegenden Erfindung kann das flüssige Eintrittsmedium angepaßt werden, solche Konzentrationen von Nährstoffen und Stimuliermitteln zu enthalten, die direkt durch den unmittelbaren Stoffwechsel der immobilisierten Biokatalysatoren erforderlich sind. Ideal wäre es, wenn die aus dem Bioreaktor ausströmende Flüssigkeit vollkommen frei von Nährstoffen wäre und nur Salze, Stoffwechselabfallprodukte und Produktmoleküle enthalten würde. Die Möglichkeit der Anpassung der Eintrittsmedien, um eine immobilisierte zelluläre Population in einem Ernährungszustand zu halten, welcher entweder die zelluläre Proliferation fördert oder verhindert, wäre somit realisierbar. Es ist höchst unwahrscheinlich, daß eine Nährstoffmischung, die für die Zellteilung optimal ist, auch für die Produktion von Biochemikalien durch Zellen in Ruhe in dem Zellzyklus optimal ist.
Das flüssige Medium kann jede Zusammensetzung sein, die Fachleuten bekannt ist oder es kann einzelne Komponenten einschließen, die für den betreffenden Biokatalysator von Interesse sind. Die Arten der Medien können ein Nährstoffmedium, eine im Gleichgewicht befindliche Salzlösung oder ein Medium sein, das ein oder mehrere organische Lösungsmittel enthält, sind aber nicht darauf beschränkt. Das Medium kann gelöste Gase für das Wachstum des Biokatalysators unter anaeroben oder aeroben Bedingungen enthalten. Das Medium kann so zusammengesetzt sein, daß das Biokatalysatorprodukt oder mobile Biokatalysatoren, die in dem Medium gefunden werden, leichter zu trennen sind.
Eine andere weniger offensichtliche Folge der Verwendung der vorliegenden Prozeßmethodologie ist der Einfluß der Maßstabsänderung. In dem vorher angeführten Prototyp-Beispiel beträgt das Gesamtvolumen des Vier-Bioreaktor-Rotors etwa 224 Milliliter. Es ist jedoch zu bemerken, daß, wenn der Radius des Rotors vergrößert wird, das Volumen mit der dritten Potenz des Radius steigt. Das ist graphisch in 35 dargestellt, wobei der unterste Punkt in diesem Diagramm dem Prototyp-Beispiel entspricht (Gesamtvolumen = 225 Milliliter). Ein Rotor mit einem Radius von 1,5 Metern würde ein Volumen von etwa 120 Litern aufweisen. Weiterhin ist, da die Durchschnittsdichte der Kultur ungefähr das 100fache der von herkömmlichen Zuchtverfahren ist, das äquivalente Kulturvolumen proportional größer. Somit ist eine Zentrifugalfermentierungseinheit mit einem Rotorradius von 1,5 m ungefähr einer 12000-Liter-Fermentierung unter Verwendung der derzeitigen Technologie äquivalent. Schließlich ist zu be merken, daß es einen zusätzlichen Maßstabsvorteil bei der Verwendung des Prozesses der vorliegenden Erfindung gibt. Als eine Folge der Tatsache, daß eine relative Zentrifugalkraft der radialen Länge direkt proportional ist, aber auch direkt proportional dem Quadrat der Winkelgeschwindigkeit ist, werden die erforderlichen Drehzahlen verringert, wenn sich der Drehradius für eine gegebene Zentrifugalkraftfeldstärke vergrößert. Das ist graphisch in 36 dargestellt. Während die erforderliche Drehzahl zum Erhalten einer RCF = 100 × g etwa 810 U/min für einen Rotor mit einem Radius von 18 cm ist, fällt diese erforderliche Drehzahl auf weniger als 300 U/min, wenn der Drehzahlradius auf 1,5 m vergrößert wird. Das bedeutet eine Verringerung der Drehzahl um mehr als 50%.
Während es offensichtlich ist daß eine Maßstabsvergrößerung bei industriellen Produktionseinrichtungen von Wert ist, sollte bemerkt werden, daß eine Miniaturausführung des Zentrifugalfermentierungsprozesses bei der analytischen Untersuchung der "Stoffwechselphysiologie" von kleinen, homogenen Populationen eines bestimmten Zelltyps wertvoll sein könnte. Nach unserer Kenntnis sind die exakten Ernährungsanforderungen für eine maximal Proliferation von, zum Beispiel, einer Bakterienpopulation unbekannt und sie könnten schnell und bequem durch Störung der Zusammensetzung der Nährstofflüssigkeitseingabe in einen immobilisierte Testpopulation bestimmt werden, wobei einige Ausgangsparameter gemessen werden, die das Wachstum anzeigen. Gleichermaßen sind, während es wünschenswert ist, genau zu wissen, welche Nährstoffmischung für die zelluläre Produktion eines biologischen Produkts optimal ist (eine Nährstoffmischung, die höchst unwahrscheinlich mit der identisch ist, welche die Proliferation maximiert), solche Parameter ebenfalls unbekannt. Wir nehmen an, daß Versionen des Prozesses der vorliegenden Erfindung in kleinem Maßstab bei Voranbringen der "analytischen Mikrobiologie" oder der "analytischen Zellbiologie" in einer Art und Weise vorteilhaft sein könnte, die bisher unmöglich auszuführen war.
Die naheliegendste sofortige Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist wahrscheinlich die kontinuierliche Produktion von biologischen Produkten, die in Sekretform oder in anderer Weise in den ausströmenden Flüssigkeitsstrom freigesetzt werden. Man könnte zum Beispiel diesen Prozeß für das kontinuierliche Gewinnen eines Produkts (von Produkten) aus einer immobilisierten Mikroorganismen-Population nutzen, dessen Wachstumsrate (und Sterblichkeitsrate) ernährungsmäßig manipuliert ist, um ein stationäres immobilisiertes "Bettvolumen" zu erhalten. Ein solcher Prozeß könnte theoretisch zeitlich unbegrenzt ablaufen. Gleichermaßen würde die Immobilisierung von sekretabsondernden Tierzellenpopulationen einen kontinuierlichen Ausfluß von Flüssigkeit ergeben, die sich in dem gewünschten Produkt (in den gewünschten Produkten) anreichert.
Im Fall von Produkten, die kein Sekret absondern (wie zum Beispiel die zytosolische Akkumulation von Protein in genetisch hergestellten E. Coli-Bakterien) ist der Prozeß der vorliegenden Erfindung ebenfalls äußerst nützlich. Wenn eine immobilisierte Zellpopulation in dem vorher angeführten Bioreaktorsystem gehalten wird, jedoch unter den Bedingungen einer übermäßigen Nährstoffeingabe, wird die Population schnell auf eine vergrößerte Bettgröße wachsen, die kontinuierlich überschüssige Zellen in den ausströmenden Flüssigkeitsstrom "abgibt". Somit kann der Prozeß der vorliegenden Erfindung als eine "Produktions-Kuh" betrieben werden, d. h. als ein kontinuierlicher Brutapparat für die Produktion und den Ausfluß von reifen Zellen, die sich in dem gewünschten Produkt anreichern. Der Stromabwärts-Trennung und Unterbrechung des ausfließenden Zellstroms, um das interessierende Produkt aufzufangen, würden dann herkömmliche Produktpurifikationsverfahren folgen.
Der Prozeß der vorliegenden Erfindung bietet die Möglichkeit einer kontinuierlichen, seriellen Umwandlung von bio-organischen Substraten über mehrere Zwischenstufen durch zwei oder mehr getrennte Populationen von Tierzellen oder Mikroorganismen. Als eine Folge der Fähigkeit des Prozesses der vorliegenden Erfin dung, biokatalytische Populationen vollständig zu immobilisieren, während ein Flüssigkeitsstrom kontinuierlich in die immobi1isierte Population hinein und aus ihr herausfließt, wird es nun möglich, seriell getrennte, ungleiche immobilisierte Populationen zu einem Strömungsprozeßstrom zu verbinden, mit der Sicherheit, daß keine gegenseitige Verunreinigung einer Population mit der anderen auftreten wird. Um das auszuführen, werden mehrere der hierin beschriebenen Vorrichtungen in Reihe miteinander verbunden, so daß die Materialien von einer Vorrichtung in die andere und darauf in die folgende usw. fließen.
In 37 ist ein Prozeßablauf schematisch dargestellt, in dem ein biochemisches Substrat, das als gelöster Nährstoff in dem Primärmedien-Speicherbehälter vorgesehen ist, in ein "Zwischenprodukt A" durch seinen Durchlauf durch die Biokatalysator-Population, die in der Zentrifuge und dem Rotor #1 immobilisiert ist, umgewandelt und wird dann weiter in das "Produkt B" durch Durchlaufen einer Biokatalysator-Population, die in der Zentrifuge und dem Rotor #2 immobilisiert ist, umgewandelt. Weiterhin ist es möglich, die Zusammensetzung der flüssigen Nährstoffzuführung zwischen den beiden immobilisierten Populationen zu verändern, da keine der Immobilisierungskammern gezwungen ist, bei dem gleichen Durchsatz und der gleichen Winkelgeschwindigkeit wie die andere zu arbeiten. Somit kann, wie es in 37 dargestellt ist, der Flüssigkeitsstrom in die Zentrifuge und den Rotor #2 durch eine zusätzliche Pumpe modifiziert werden, welche die erforderlichen Nährstoffe von dem Medien-Speicherbehälter #2 zuführt. Der Gesamtstrom pro Zeiteinheit durch die Zentrifuge und den Rotor #2 ist lediglich größer als der durch die Zentrifuge und den Rotor #1.
Ein kommerziell wertvolles Beispiel der Nutzung eines solchen seriellen Umwandlungsprozesses dieses Typs ist die biologische Produktion von Essigssäure. Die anaerobe Bio-Umwandlung von Glukose in Äthanol durch eine immobilisierte Population einer Hefe wie Saccharomyces cerevisiae in der Zentrifuge und dem Rotor #1 könnte von einer aeroben Umwandlung von Äthanol in Essigsäure durch eine immobilisierte Population des Bakteriums Acetoibacter acetii, angeordnet in der Zentrifuge und dem Rotor #2, gefolgt werden, wenn gelöster Sauerstoff und Ergänzungsnährstoffe über den Medien-Speicherbehälter #2 zur Verfügung gestellt werden (unter Verwendung von zum Beispiel dem in 17 dargestellten Sauerstoffanreicherungsschema).
In einer gleichen Weise könnte dann, wenn ein Prozeßablaufschema erfordert, daß das gesamte Strömungsvolumen pro Zeiteinheit durch die spezifischen Zentrifugal-Bioreaktor-Einheiten reduziert werden soll, eine Reihe von identischen Zentrifugal-Bioreaktor-Einheiten parallel zu dem Prozeßstromfluß verbunden werden, wobei das resultierende einzelne Strömungsvolumen pro Zeiteinheit dadurch auf den anteilmäßigen Fluss durch jede Einheit reduziert wird. In diesem Fall würden die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung in einer paraallelen Anordnung verbunden werden.
Die mikrobialen Organismen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: getrocknete Zellen oder Naßzellen, die aus der Nährlösung durch Zentrifugieren oder Filtrieren gewonnen werden. Diese mikrobialen Zellen sind in die folgenden Gruppen klassifiziert: Bakterien, Aktinomyzeten (Strahlenpilze), Pilze, Hefen und Algen. Die Bakterien der ersten Gruppe, die naturwissenschaftlich zu der Klasse der Schizomyzeten gehören, sind die Arten Pseudomonas, Acetobacter, Gluconobacter, Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Clostridium, Brevibacterium, Arthrobacter oder Erwinia, usw. (siehe R. E. Buchran und N. E: Gibbons, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Bergey's Handbuch der bestimmenden Bakteriologie), B. Ausgabe, (1974), Williams and Wilkins Co.). Die Aktinomyzeten der zweiten Gruppe, die naturwissenschaftlich zu der Klasse der Schizomyzeten gehören, sind die Arten Streptomyces, Nocardia oder Mycobacterium, usw. (siehe R. E. Buchran und N. E: Gibbons, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Bergey's Handbuch der bestimmenden Bakteriologie), B. Ausgabe, (1974), Williams and Wilkins Co.. Die Pilze der dritten Gruppe, die naturwissenschaftlich zu den Klassen der Phycomyceten (Algenpilze), Askomyzeten (Schlauchpilze), unvollkommenen Pilzen (Fungi imperfecti) und Bacidiomyzeten gehören, sind die Arten Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Monascus oder Neurosporium, usw. (siehe J. A. von Ark "The Genera of Fungi Sporulatin in Pure Culture" (die Arten der Sporenpilze in Reinkultur), in "Illustrated Genera of Imperfect Fungi" (Bilddarstellungen der Arten von unvollkommenen Pilzen) 3. Ausgabe V, von J. Cramer, H. L. Barnett und B. B. Hunter eds. (1970), Burgess Co.). Die Hefen der vierten Gruppe, die naturwissenschaftlich zu der Klasse der Askomyzeten gehören, sind die Arten Sacharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Hansenula, Candida, Torulopsis, Rhodotorula, Kloechera, usw. (siehe J. Lodder, "The Yeasts" (Die Hefen): Eine naturwissenschaftliche Studie, 2. Ausgabe (1970), North-Holland). Die Algen der fünften Gruppe schließen die Grünalgen ein, die zu den Klassen Chlorella und Scedesmus gehören und die blaugrünen Algen, die zu dem Geschlecht Spirulina gehören (siehe H. Tamiya, Studien an Mikroalgen und photosynthetischen Bakterien, (1963), Univ. Tokyo Press). Es ist so zu verstehen, daß die vorher angeführte Auflistung von Mikroorganismen rein repräsentativ für die Typen von Mikroorganismen sind, die bei dem Fermentierungsprozeß gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Der Zuchtprozeß der vorliegenden Erfindung ist auch an Pflanzen- oder Tierzellen anpaßbar, die entweder in Einzelschichten oder in einer Suspensionskultur wachsen können. Die Zelltypen schließen primäre und sekundäre Zellkulturen und diploide und heteroploide Zellreihen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Andere Zellen, die für den Zweck der Virusfortpflanzung und der Gewinnung verwendet werden, sind ebenfalls geeignet. Zellen, wie Hybridomas, neoplastische Zellen und transformierte und untransformierte Zellreihen sind ebenfalls geeignet. Es können primäre Kulturen, die Geweben von Embryonen, Erwachsenen oder Tumoren entnommen wurden, sowie Zellen von feststehenden Zellreihen verwendet werden. Beispiele für typische solche Zellen sind, jedoch nicht darauf beschränkt: primäre Rhesusaffen-Nierenzellen (MK-2), Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK21), Schweine-Nierenzellen (IBRS2), embryonische Kaninchen-Nierenzellen, Maus-Embryo-Fibroblasten, Maus-Drüsen-Karzinomzellen (RAG), Maus-Knochenmark-Tumorzellen (MPC-11), Maus-Maus Hybridoma-Zellen (I-15 2F9), menschliche diploide Fibroblasten (FS-4 oder AG 1523), menschliche Leber-Adeno-Karzinomzellen (SK-HEP-1,) normale menschliche Lymphozytenzellen, normale menschliche Lungen-Embryo-Fibroblasten (HEL 299), menschliche Embryonen-Lungen-Fibroblasten WI38 oder WI26, menschliche Epidermoid-Karzinomzellen HEP Nr. 2, Hals-Karzinomzellen HeLa, Primär- und sekundäre Küken-Fibroblasten und verschiedene transformierte Zelltypen, zum Beispiel SV-40, oder Polyoma-Viren (WI 38 VA13, WI 26 VA4, TCMK-1, SV3T3, usw.). Andere geeignete bekannte Zellreihen, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind Fachleuten mit gewöhnlichen Fachkenntnissen bekannt.
Die Produkte, die durch das Praktizieren der vorliegenden Erfindung erhalten werden können, sind alle Stoffwechselprodukte, die das Ergebnis der Züchtung einer Zelle, entweder einer eukaryotischen oder prokaryotischen Zelle sind, eine subzelluäre Organelle oder Komponente einer Zelle, wie zum Beispiel Mitochondrien, Kernkörperchen, Lysosomen, endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Körper, Peroxysomen oder Plasmamembranen oder Kombinationen davon, oder ein Enzymkomplex, entweder ein natürlicher Komplex oder ein synythetischer Komplex, d. h. eine Vielzahl von Enzymen, die zu Komplexen zusammengefaßt sind, um ein gewünschtes Produkt zu erhalten.
Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit, eine gewünschte Chemikalie aus einer Zelle zu erhalten, ohne den arbeitsaufwendigen Prozeß des Trennens der Gene für die Chemikalie zu durchlaufen und dann die Gene in eine geeignete Hostzelle einzusetzen, so daß die Zelle (und somit die Chemikalie) in kommerziellen Mengen produziert werden kann. Durch das Praktizieren der vorliegenden Erfindung, kann eine Säugetierzelle, von der bekannt ist, daß sie eine gewünschte Chemikalie produziert, gemäß der vorliegenden Erfindung direkt in hoher Dichte gezüch tet werden, um große Mengen der gewünschten Chemikalie herzustellen.
Produkte, die gemäß der vorliegenden Erfindungen hergestellt werden können, schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Immun-Modulatoren, wie zum Beispiel Interferone, Interleukine, Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel Erothropoietin, monoklonare Antikörper, Antibiotika aus Mikroorganismen, Koagulations-Proteine wie zum Beispiel Faktor VIII; fibrinolytische Proteine, wie zum Beispiel Gewebe-Plasminogen-Aktivator und Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren, angiogenische Proteine und Hormone, wie zum Beispiel Wachstumshormone, Prolaktin, Glukagon und Insulin.
Der Ausdruck "Zuchtmedium" umfaßt jedes Medium für das optimale Wachstum von mikrobialen, Pflanzen- oder Tierzellen oder jedes Medium für Enzymreaktionen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Enzymsubstrate, Kofaktoren, Puffer und ähnliches, das für die optimale Reaktion des gewählten Enzyms oder Enzymsystems erforderlich ist. Geeignete Zuchtmedien für das Zellwachstum enthält assimilierbare Quellen von Stickstoff, Kohlenstoff und anorganischen Salzen und sie können auch Puffer, Indikatoren oder Antibiotika enthalten.
Jedes Zuchtmedium, das als optimal für die Zucht von Mikroorganismen, Zellen oder Biokatalysatoren bekannt ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wenn auch solche Medien für die Zucht von lebenden Organismen allgemein von wässeriger Natur sind, können auch organische Lösungsmittel oder mischbare Kombinationen von Wasser und organischen Lösungsmitteln, wie zum Beispiel Dimethylformamid, Methanol, Diäthyläther und ähnliches in den Prozessen verwendet werden, die sich als wirksam erwiesen haben, wie zum Beispiel bei den biologischen Umwandlungen, in denen immobilisierte Biokatalysatoren verwendet werden. Das Durchleiten der flüssigen Medien durch das Prozeßsystem, kann entweder ein Ein-Weg-Durchleiten sein, oder der Flüssigkeitsstrom kann das System wiederholt durchlaufen, um eine höhere Effektivität der Umwandlung des Substrats in ein Produkt zu erzielen. Die gewünschten Nährstoffe und Stimulierungschemikalien können entweder durch Zuführen des Nährstoffes unter geringem Druck oder durch Einspritzen in den Prozeßstrom stromaufwärts der Zellkammer dem Prozeßstrom zugeführt werden.
Es ist zu erkennen, daß die vorliegende Erfindung an jedes der gut bekannten Gewebe-Medien anpaßbar ist, einschließend, jedoch nicht darauf beschränkt: Basal Medium Eagle's (BME), Eagle's Mininum Essential Medium (MEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Ventrex Medium, Roswell Park Medium (RPMI 1640), Medium 199, Ham's F-10, Iscove's Modified Dulbecco Medium, Medium mit phosphatgepufferten Salzen (PBS), und Earle's oder Hank's im Gleichgewicht befindliche Salzlösung (BSS), angereichert mit verschiedenen Nährstoffen. Das alles sind im Handel erhältliche Gewebezucht-Medien und sie werden ausführlich von H. J. Moton (1970), In Vitro 6, S. 89–108 beschrieben. Diese herkömmlichen Zuchtmedien enthalten im wesentlichen bekannte Aminosäuren, Mineralsalze, Vitamine und Kohlenhydrate. Sie sind auch häufig mit Hormonen, wie zum Insulin und Zwischenstufen von Säugetierzellen aangereichert, einschließend, jedoch nicht darauf beschränkt, Rinderkalbserum sowie bakteriostatische und fungistatische Antibiotika.
Obwohl das Zellwachstum oder die Zellenbeatmung in der Zentrifugal-Zellenkammer nicht direkt sichtbar gemacht werden kann., können solche Stoffwechselprozesse leicht durch das chemische Erfassen des Substratverarmung, des Gehalts an gelöstem Sauerstoff, der Kohlendioxidproduktion oder ähnliches überwacht werden. So kann zum Beispiel im Fall einer Fermentierung einer Art von Saccharomyces cerevisiae dem Impfen der Immobilisierungskammer mit einer kleinen Starter-Population von Zellen ein aerobes Fermentierungsregime folgen, in welchem die Abnahme der Glukose, des gelösten Sauerstoffs und die Kohlendioxidproduktion über die Zellenbegrenzungskammer entweder chemisch oder durch geeignete Erfassungselektroden gemessen werden. Somit kann die Zellverdopplung fortschreiten, bis eine optimale Zellbettgröße erreicht ist. Das Herausziehen des eingeführten gelösten Sauerstoffes zu dieser Zeit bewirkt, daß die immobilisierten Hefezellen in die anaerobe Fermentierung von Glukose übergehen, mit einer sich ergebenden Produktion von Äthanol, ein Prozeß, der gleichermaßen chemisch überwacht werden kann.
Gleichermaßen kann der Prozeß der vorliegenden Erfindung ohne jegliche Prozeßmodifikation als ein Bioreaktor für immobilisierte chemische Katalysatoren, Enzyme oder Enzymsysteme verwendet werden. In einem solchen Prozeß werden ein Katalysator, Enzyme oder ein Enzymsystem auf einer festen Unterlage immobilisiert, die einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist: Diatomeenerde (Kieselgur), Siliziumoxyd, Aluminiumoxyd, Keramikbetten, Retortenkohle oder polymerische oder Glasbetten, die dann in die Bioreaktor-Immobilisierungskammer eingeführt werden. Das Reaktionsmedium, entweder wässerige, organische oder gemischte wässerige und organische Lösungsmittel fließen durch das Prozeßsystem und durch die dreidimensionale Anordnung von festen Unterlagen in dem Bioreaktor. Der Katalysator, die Enzyme oder das Enzymsystem wandeln ein Reaktionsmittel in dem Prozeßstrommedium in das gewünschte Produkt oder in die gewünschten Produkte um. Gleichermaßen können in anderen Anwendungen entweder Zellen oder Zellenkomponenten, einschließend, jedoch nicht darauf eingeschränkt, Vektoren, Plasmide oder Nukleinsäure-Sequenzen (RNA oder DNA) oder ähnliches auf einem festen Unterlagegitter immobilisiert und für eine gleiche Verwendung beim Umwandeln eines eingeführten Reaktionsmittels in das gewünschte Produkt eingegrenzt werden.
Die kommerzielle Anwendung der vorliegenden Erfindung kann in der Produktion von medizinisch relevanten, zellulär abgeleiteten Molekülen bestehen, einschließend, jedoch nicht darauf eingeschränkt, Anti-Tumor-Faktoren, Hormone, therapeutische Enzyme, virale Antigene, Antibiotika und Interferone. Beispiel von möglichen Produkt-Molekülen, die vorteilhaft unter Verwenddung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung vorbereitet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt, Rinder- Wachstumshormone, Prolaktin und menschliche Wachtumshormone aus Hypophysenzellen, Plasminogen-Aktivator aus Nierenzellen, Hepatitis-A-Antigen aus gezüchteten Leberzellen, virale Vakzine und Antikörper aus Hydridoma-Zellen, Insulin, Angiogenisis-Faktoren, Fibronektin, HCG, Lymphokine, IgG usw.. Andere Produkte sind einer Person mit gewöhnlichen Kenntnissen im Fachgebiet bekannt.
Die vorhergehende Beschreibung der vorliegenden Erfindung ist nicht erschöpfend und beschränkt die Erfindung nicht auf die offenbarte präzise Form. Viele Modifikationen und Variationen sind möglich. Die spezielle, beschriebene Ausführung ist dazu bestimmt, die Prinzipien der Erfindung und ihre praktische Anwendung bestens zu beschreiben, um es anderen in dem betreffenden Fachgebiet zu erlauben, die vorliegende Erfindung in den verschiedenen Ausführungen und mit verschiedenen Modifikationen, die für die speziell vorgesehene Verwendung geeignet sind, bestmöglich zu nutzen. Es ist beabsichtigt, in den beigefügten Ansprüchen alle solche Modifikationen, Variationen und Veränderungen zu erfassen, die in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen.

Claims

Verfahren zur Aufnahme eines Biokatalysators, bei dem der Biokatalysator in wenigstens einer Kammer in einem Zentrifugalkraftfeld aufgenommen ist, wobei ein kontinuierlicher Fluß einer Flüssigkeit dazu wirkt, eine Kraft zu erzeugen, die dem Zentrifugalkraftfeld entgegengesetzt ist, und wobei eine Gravitationskraft zu der resultierenden Vektorsumme aller Kräfte, die auf den Biokatalysator wirken, beiträgt, wobei die Gravitationskraft, die Zentrifugalkraft und die entgegenwirkende Flüssigkeit den Biokatalysator, in einer Position in der Kammer immobilisieren, so daß der Effekt der Gravitationskraft auf den Biokatalysator im wesentlichen. negiert und auf eine periodische Oszillation reduziert ist, wobei die Flüssigkeit sich auf hydraulischen Druckwerten befindet, die größer als der Umgebungsdruck sind, und wobei. in der Kammer keine Gasphase vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die größere Achse der Kammer parallel mit dem Zentrifugalkraftfeld ausgerichtet ist. 3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die größere Achse der Kammer in einem Winkel zwischen etwa 0 und 90° zu dem Zentrifugalkraftfeld liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Schritt der Aufnahme des Biokatalysators eine Mehrzahl von Kammern in einem Zentrifugalkraftfeld umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Medium, ein gelöstes Gas enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Biokatalysator eine Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Biokatalysator eine subzelluläre Komponente ist.
Verfahren zur Herstellung eines Produkts aus einem Biokatalysator, mit den Schritten: a. Aufnahme des Biokatalysators in wenigstens einer Kammer in einem Zentrifugalkraftfeld, wobei ein kontinuierlicher Fluß einer Flüssigkeit dazu wirkt, eine Kraft zu erzeugen, die dem Zentrifugalkraftfeld entgegenwirkt, und wobei eine Gravitationskraft zu der resultierenden Vektorsumme aller Kräfte, die auf den Biokatalysator wirken, beiträgt, wobei die Gravitationskraft, die Zentrifugalkraft und die entgegenwirkende Flüssigkeit den Biokatalysator in einer Position in der Kammer im wesentlichen immobilisieren, so daß der Effekt der Gravitationskraft auf den Biokatalysator im wesentlichen negiert und auf eine periodische Oszillation reduziert ist, wobei sich die Flüssigkeit auf hydraulischen Druckwerten befindet, die größer als der Umgebungsdruck sind, und wobei in der Kammer keine Gasphase vorhanden ist, und Sammeln des kontinuierlichen Flusses der Flüssigkeit außerhalb der Kammer mit dem Produkt darin.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Medium ein gelöstes Gas enthält.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Biokatalysator eine Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Biokatalysator eine subzelluläre Komponente ist.
Gerät zum Inkubieren eines Biokatalysators, mit: a) wenigstens einer Kammer zum Suspendieren eines Biokatalysators, b) Mitteln zum Drehen der Kammer, um ein Zentrifugalkraftfeld zu erzeugen, wobei die Dreheinrichtung die Kammer um eine im wesentlichen horizontale Drehachse dreht, c) einer Einrichtung zum Pumpen eines flüssigen Mediums durch die Kammer, wobei das flüssige Medium keine Gasphase enthält, und wobei das flüssige. Medium eine Flüssigkeitsströmungskraft erzeugt, d) einer Einrichtung zum Aufrechterhalten eines hydraulischen Drucks in der Kammer auf einem Druckwert; der größer als der umgebene barometrische Druck ist; die so ausgelegt sind, daß, während des Betriebs, eine resultierende Vektorsumme aller Kräfte einschließlich des Zentrifugalkraftfeldes, der Flüssigkeitsströmungskraft und einer Gravitationskraft, die auf den Biokatalysator wirken, den Effekt hat, daß die Gravitationskraft auf den Biokatalysator im wesentlichen negiert und auf eine periodische Oszillation reduziert ist, wobei der Biokatalysator durch die resultierende Vektorsumme aller Kräfte in einer Position in der Kammer im wesentlichen immobilisiert wird.
Gerät nach Anspruch 12, wobei eine Mehrzahl von Geräten in Reihe angeordnet sind.
Gerät nach Anspruch 12, wobei eine Mehrzahl von Geräten parallel angeordnet sind.
Gerät nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei eine Position (r_z) des Biokatalysators innerhalb der Kammer gemäß der Gleichung r_z = kηV_z/(wp²'d²) berechnet werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei der Schritt der Aufnahme des Biokatalysators das Plazieren eines Biokatalysators in einer Mehrzahl von Kammern in einem Zentrifugalkraftfeld umfaßt.
Gerät nach Anspruch 15, wobei weiter die im wesentlichen horizontale Drehachse die y-Achse ist, die Pumpeinrichtung für das flüssige Medium das flüssige Medium entlang einer Achse fördert, die im wesentlichen senkrecht zu der Drehachse steht, und die Gravitationskraft auf den Biokatalysator unter einem Winkel in bezug auf die Drehachse wirkt.
Gerät nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei weiter die Geometrie der Kammer diejenige eines Kegelstumpfes ist.
Gerät nach Anspruch 18, wobei die Kammer weiter ein kurzes zylindrisches Volumen an einem Ende und ein kurzes kegelförmiges Volumen an dem gegenüberliegenden Ende hat.