DE69612772T3 - Bedrucken von Bibliotheken von Molekularketten - Google Patents

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    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft die Synthese und Anordnung von Materialien an bekannten Stellen. Insbesondere stellt eine erfindungsgemäße Ausführungsform ein Verfahren und eine entsprechende Vorrichtung bereit zur selektiven Anordnung einer Reihe Oligonucleotide auf einem Träger durch die Standard-Dimethoxytrityl(DMT)-Chemie. Die Erfindung kann zur Herstellung eines Oligomers, eines Peptids, einer Nucleinsäure, eines Oligosaccharids, eines Phospholipids, eines Polymers oder artgleicher Arzneimittel eingesetzt werden, insbesondere zur Erzeugung von Quellen chemischer Diversität, die zum Screenen nach biologischer Aktivität gebraucht werden.
  • Die Industrie setzt verschiedene Verfahren zur Synthese von Oligonucleotidgruppen ein oder hat solche beschrieben. Bei einem solchen Verfahren werden kleine Gummiröhrchen als Reaktionskammern gebraucht, so dass eine eindimensionale Anordnung entsteht, wenn die Reaktionsmitteln nacheinander zugegeben werden. Dieses Verfahren hat Vorteile beim Gebrauch der Standard-DMT-Chemie. Solche Verfahren haben jedoch häufig eine begrenzte Auflösung. Üblicherweise ist die kleinste Zelle etwa 1 mm groß. Das Verfahren ermöglicht auch nicht die Synthese einer ausreichend großen Anzahl Polymersequenzen zum wirksamen wirtschaftlichen Screening. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass es bspw. nicht möglich ist, eine Reihe Oligonucleotide an ausgewählten Bereichen eines Trägers zu bilden.
  • Weitere typische Verfahren sind in dem US-Patent 5,143,854 und der PCT WO 93/09668 beschrieben, beide hier durch die Bezugnahme für alle Zwecke enthalten. Solche Verfahren finden verbreitet Gebrauch und werden in der Industrie als Weg bereitend angesehen. Bei manchen Anwendungen sind jedoch alternative Verfahren und chemische Synthesemöglichkeiten für Stoffbanken gefragt.
  • US-A-5318679 betrifft ein Verfahren zur Herstellung chemischer Verbindungen, in denen photogeschützte chemische Einheiten, die an der Oberfläche eines Trägers angebracht sind, selektiv bestrahlt werden, so dass die ausgewählten Bereiche auf der Oberfläche entschützt und für eine chemische Reaktion zugänglich werden, wobei die Oberfläche mit dem Laserstrahl eines Laserdruckers bestrahlt wird und der Laser eine Wellenlänge im ultravioletten Bereich aufweist.
  • EP-A 0619321 betrifft ein Verfahren zur Herstellung ausgewählter chemischer Sequenzen an bekannten Positionen auf einer einzelnen Trägeroberfläche, umfassend: das Aussetzen eines ausgewählten und reaktiven Bereichs auf der Trägeroberfläche gegenüber einem Aktivator, so dass der Bereich mit Ammoniak reagieren kann; das Umsetzen des resultierenden aktivierten Trägerbereichs mit dem Ammoniak und das Wiederholen der Schritte 1 bis 2 so oft wie nötig, wobei mindestens ein Teil der Bereichs den ersten zwei Schritten mindestens zweimal ausgesetzt wird.
  • Gefragt ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung hochdichter Oligonucleotidreihen durch Gebrauch der DMT-Chemie sowie anderer geeigneter Oligonucleotid-Syntheseverfahren, wie das Verfahren und die Vorrichtung zur herkömmlichen Phosphoramidit-Synthese einer räumlich bestimmten Anordnung Oligomere (z. B. Polynucleotide, Polypeptide, Oligosaccharide und dergleichen), jeweils mit einer im Wesentlichen vorbestimmten Sequenz Einheiten (d. h. polymerisierten Monomereinheiten).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Ausbilden von Polymeren unterschiedlicher Monomersequenz bereitgestellt, umfassend:
    das Bereitstellen eines Trägers mit einer Schicht Linkermoleküle darauf, wobei jedes Linkermolekül eine Schutzgruppe trägt;
    das Anwenden einer Trennschicht über der Schicht Linkermoleküle, wobei in dem Anwendschritt ausgewählte freiliegende Bereiche in der Schicht Linkermoleküle hergestellt werden;
    Aussetzen ausgewählter freiliegender Bereiche der Schicht Linkermoleküle einem Entschützungsmittel ausschließlich in der Dampfphase für ein Entfernen der Schutzgruppe; und
    Ankoppeln ausgewählter Monomere zur Herstellung ausgewählter Polymere auf dem Träger;
    wobei das Entschützungsmittel ein Säuredampf ist, ausgewählt aus der Gruppe Trichloressigsäure, Dichloressigsäure und Salzsäure und eine Temperatur von 20°C bis 50°C besitzt; und
    wobei das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe Polynucleotide und Oligonucleotide.
  • In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Synthese einer Aminosäure oder eines Polynucleotids bereitgestellt, beinhaltend die Schritte:
    • a) Bereitstellen eines Oligonucleotides mit einem proximalen und einem distalen Ende, wobei das proximale Ende an einen Träger mit einer Oberfläche gekoppelt ist und das distale Ende eine entfernbare Schutzgruppe trägt;
    • b) Entfernen der Schutzgruppe mit einem Entschützungsmittel ausschließlich in der Dampfphase für ein Freilegen einer funktionellen Gruppe; und
    • c) kovalentes Binden eines Oligonucleotides an die freigelegte funktionelle Gruppe; wobei die Oberfläche des Trägers beim Entfernungsschritt durch eine Maske gezielt geschützt sind; und wobei das Dampfphasen-Entschützungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe Trichloressigsäure, Dichloressigsäure und Salzsäure und es eine Temperatur von 20°C bis 50°C besitzt.
  • Hierin werden ein Verfahren und eine Vorrichtung offenbart zur Bildung einer Reihe Polymere wie Oligonucleotide und verwandte Polymere (z. B. Peptid-Nucleinsäuren) an ausgewählten Bereichen eines Trägers durch Gebrauch der herkömmlichen Bindungs chemie (z. B. Standard-DMT-Oligonucleotid-Synthesechemie). Das Verfahren und die Vorrichtung umfassen den Gebrauch ausgewählter Druckverfahren zur Verteilung von Materialien wie Trennmaterialien, Entschützungsmittel, Basengruppen, Nucleoside, Nucleotide, Nucleotidanaloge, Aminosäuren, Iminosäuren, Trägermaterialien und dergleichen auf ausgewählte Bereiche eines Trägers. Die Druckverfahren können in einigen Ausführungsformen bspw. mit der Standard-DMT-Chemie zur Synthese von Oligonucleotiden verwendet werden und insbesondere mit ausgewählten dampfförmigen Entschützungsmitteln.
  • So stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zur Bildung von Polymeren mit unterschiedlichen Monomersequenzen auf einem Träger. Gemäß einer Ausführungsform wird das Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden mit vorbestimmter Polynucleotidsequenz auf einem festen Träger verwendet, üblicherweise in Form einer räumlich bestimmten Anordnung, worin die Sequenz des Oligonucleotids stellungsmäßig bestimmt ist. Das vorliegende Verfahren umfasst Schritte zum Bereitstellen eines Trägers mit einer Linkermolekülschicht darauf. Die Linkermolekülschicht besitzt ein Linkermolekül und eine Schutzgruppe. Das Verfahren umfasst auch einen Schritt zum Aufbringen einer Trennschicht, die mindestens einen Teil der Linkermolekülschicht überdeckt. Die Trennschicht schirmt den darunter liegenden Teil vor dem Zusammentreffen mit einem Reaktionsmittel ab, das ansonsten mit dem darunter liegenden Teil reagieren könnte und das nach der Trennschicht aufgebracht wird, wodurch die vorbestimmte chemische Reaktion im Wesentlichen für die Bereiche, auf dem der Träger mit dem Trennmaterial bedeckt ist, verhindert wird. Durch den Auftragungsschritt entstehen ausgewählte freiliegende Bereiche der Linkermolekülschicht. Das Verfahren umfasst einen Schritt, bei dem die ausgewählten freiliegenden Bereiche der Linkermolekülschicht (z. B. Bereiche, die nicht mit dem Trennmaterial bedeckt sind) einem Entschützungsmittel ausgesetzt werden, ausschließlich in der Dampfphase, um die Schutzgruppe zu entfernen, wobei das Entschützungsmittel ein Säuredampf ist, ausgewählt aus der Gruppe Trichloressigsäure, Dichloressigsäure und Salzsäure und eine Temperatur von 20°C bis 50°C besitzt.
  • Das Verfahren kann ein Verfahren zum Aufbringen eines Mittels auf ausgewählte Bereiche eines Trägers umfassen. Das vorliegende Verfahren umfasst Schritte zum Überziehen eines Trägers mit einer oberen Schicht und zum selektiven Auftragen eines Mittels mit einem Bestandteil aus der Gruppe aus Trennmaterial, Rezeptor, Entschützungsmittel, Monomergruppe, Trägermaterial und Aktivator auf ausgewählte Bereiche der oberen Trägerschicht.
  • Hierin sind Verfahren offenbart zum Synthetisieren einer räumlichen Anordnung Polymere mit verschiedenen Monomersequenzen (wie bspw. eine Auswahl Oligonucleotide mit einzigartigen Sequenzen), worin die Zusammensetzung (z. B. Nucleotidsequenz) jedes Polymers positionsgemäß durch seine Stellung in der Raumanordnung bestimmt ist. Das Verfahren verwendet im Allgemeinen einen Maskierungsschritt, wobei ein Trennmaterial in räumlicher Verteilung auf einen Träger aufgebracht wird, so dass mindestens ein Schritt des Monomeradditionszykluses auf dem Teil des Trägers, der mit dem Trennmaterial bedeckt ist, unterbunden wird. Das Verfahren umfasst das Aufbringen eines Trennmaterials auf einem ersten räumlich bestimmten Teil eines Trägers, wobei der Träger wahlweise auch eine Schicht Linkermoleküle und/oder entstehende Polymere (z. B. entstehende Oligonucleotide) enthält und das Trennmaterial, das den ersten räumlich definierten Teil des Trägers bedeckt, den darunter liegenden Bereich vor dem Zusammentreffen mit einem anschließend aufgebrachten Reagenzmittel abschirmt, das ansonsten mit dem darunter liegenden Bereich reagieren könnte und für einen vollständigen Monomeradditionszyklus benötigt wird, bei dem eine Monomereinheit kovalent an ein wachsendes Polymer oder einen Linker geknüpft wird, so dass im Wesentlichen eine chemische Reaktion auf dem ersten räumlich bestimmten Bereich unterbunden wird, der mit dem Trennmaterial bedeckt ist, und ein restlicher ungeschützter Bereich des Trägers bereitgestellt wird (d. h. der oder die Bereiche, die nicht mit dem Trennmaterial bedeckt ist), der frei ist und mit dem anschließend aufgebrachten Reaktionsmittels reagieren und eine chemischen Reaktion eingehen kann, die für einen ganzen Monomeradditionszyklus (d. h. einer Polymerverlängerung) erforderlich ist. Das anschließend aufgebrachte Reaktionsmittel ist üblicherweise ein Monomer (z. B. ein Nucleotid, Nucleosid, Nucleosidderivat, eine Aminosäure und dergleichen), ein Entschützungsmittel zur Entfernung von Schutzgruppen, die die Polymerverlängerung hemmen (z. B. zur Entfernung von DMT-Gruppen durch Säurehydrolyse), ein Kopplungsmittel (z. B. Phosphoramidit wie Cyanoethylphosphoramiditnucleosid), ein Cappingmittel (z. B. Essigsäureanhydrid und 1-Methylimidazol) und/oder ein Oxidationsmittel (z. B. Iod, wie in einem Iod:Wasser:Pyridin:Tetrahydrofuran-Gemisch). Das Verfahren sichert ferner, dass nach dem Aufbringen des Trennmaterials das oder die Reaktionsmittel aufgebracht werden und chemisch mit dem ungeschützten Bereich des Trägers für eine geeignete Zeit und unter geeigneten Reaktionsbedingungen umgesetzt werden können. Nach dem Umsetzen des ungeschützten Bereichs mit dem oder den Reaktionsmitteln wird die Monomeraddition abgeschlossen und das Trennmaterial entfernt (nicht notwendigerweise in dieser Reihenfolge); dabei kommt es während des Monomeradditionszykluses in dem ungeschützten Bereich des Trägers zu einer Monomeraddition an das (die) Polymer(e) und in dem geschützten Bereich des Trägers erfolgt im Wesentlichen keine Monomeraddition an das (die) Polymer(e).
  • Hierin offenbart ist ein Verfahren, in welchem der Maskierungsschritt wiederholt eingesetzt wird, wobei ein Trennmaterial auf einen räumlich bestimmten Bereich des Trägers aufgebracht wird, so dass Monomeradditionszyklen in diesem Bereich gehemmt werden. Eine erste Trennmaske wird über einen ersten räumlich bestimmten Bereich auf einen Träger gelegt, wodurch: (1) ein erster mit der Trennmaske bedeckter geschützter Bereich entsteht und (2) ein erster ungeschützter Bereich, umfassend den Bereich des Trägers, der nicht von der Trennmaske abgedeckt ist. Nach dem Anbringung der ersten Trennmaske wird der ersten Monomeradditionszyklus abgeschlossen, wodurch eine Monomereinheit kovalent an den ersten ungeschützten Bereich gekoppelt wird, so dass ein üblicherweise kovalent an den Träger gebundenes wachsendes Polymer verlängert oder gestartet wird und der erste Monomeradditionszyklus in dem ersten geschützten Bereich im Wesentlichen nicht zu einer Addition einer Monomereinheit an die wachsenden Polymere führt. Die erste Trennmaske wird entfernt, gleichzeitig mit, vor oder nach Abschluss des ersten Monomeradditionszyklus und es folgen ein oder mehrere weitere Zyklen, bei denen weitere Trennmasken aufgebracht werden, die weitere geschützte Bereiche, die sich räumlich von dem ersten geschützten Bereich unterscheiden, bedecken können, und wobei mindestens ein weiterer Monomeradditionszyklus jedem Zyklus durch Entfernen der Trennschicht folgt und gegebenenfalls nochmals einer Trennmaske aufgetragen und ein weiterer Monomeradditionszyklus gestartet wird bis Polymere einer vorbestimmten Länge (Anzahl eingearbeiteter Monomereinheiten) entstanden sind.
  • Ein wiederholtes Maskierungs-/Syntheseverfahren kann folgende Schritte umfassen:
    • (1) Aufbringen eines Trennmaterials auf einen Träger mit einer reaktiven Oberfläche, die kovalent an eine Monomereinheit binden kann oder reagieren kann mit einem Entschützungsmittel oder anderen Reagenzien, die erforderlich sind zum Abschluss eines Monomeradditionszyklus, wobei die reaktive Fläche mit einem Linker und/oder einer Monomereinheit oder einem wachsenden Polymer (z. B. einem 3'-verknüpften Nucleosid oder 3'-verknüpften Polynucleotid) derivatisiert ist, wobei das Trennmaterial einen Teil der reaktiven Oberfläche bedeckt, so dass ein geschützter Bereich entsteht, der anschließend nicht mit einer Monomereinheit oder einem Reaktionsmittel, das zum Abschließen eines Monomeradditionszyklus erforderlich ist, reagieren kann, und der übrige Bereich des Trägers ein ungeschützter Bereich ist, der mit einer Monomereinheit reagieren kann oder mit einem Reaktionsmittel, das zum Abschluss eines Monomeradditionszyklus benötigt wird;
    • (2) Zusammenbringen des Trägers mit Reaktionsmitteln, die zum Abschluss eines Monomeradditionszyklus erforderlich sind, wo bei eine Monomereinheit kovalent an die reaktive Oberfläche des Trägers gebunden wird (z. B. ein Linker, ein 3'-verknüpftes Nucleosid oder ein 3'-verknüpftes entstehendes Polynucleotid) in einem ungeschützten Bereich;
    • (3) Entfernen des Trennmaterials; und
    • (4) Wiederholen der Schritte 1, 2 und 3 in 0 bis 5000 Zyklen, vorzugsweise 2 bis 250 Zyklen, weiter bevorzugt von 4 bis 100 Zyklen und üblicherweise von etwa 7 bis 50 Zyklen, bis auf einem Teil des Trägers eine vorbestimmte Polymerlänge erreicht ist. Das Muster des aufgebrachten Trennmaterials kann in jedem Zyklus anders sein als im vorherigen oder, falls vorhanden, dem oder den nachfolgenden Zyklen, oder es kann gleich sein. Häufig wird in Schritt (2) mindestens ein zum Abschluss eines Monomeradditionszyklus erforderliches Reaktionsmittel in der Dampfphase aufgebracht.
  • Hierin offenbart ist ein Träger mit einer räumlichen Anordnung Polymere mit vorbestimmter Länge bereitgestellt, die durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt wurden.
  • Gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Aufbringen eines Trennmaterials oder Reaktionsmittels, das für einen Monomeradditionszyklus erforderlich ist, auf einen Träger, wobei das Verfahren das Übertragen des Trennmaterials oder Reaktionsmittels als geladenes Tröpfchen durch elektrostatische Interaktion umfasst, wie beispielsweise in einem Tintenstrahl- oder Tröpfchenstrahl-Druckkopf oder ähnlichen Vorrichtungen. In einer Ausführungsform eignet sich das Trennmaterial oder Reaktionsmittel zum Gebrauch bei der Polynucleotid(Oligonucleotid)-Synthese. Gemäß einer Ausführungsform ist der Träger ein Silicium- oder Glasträger oder eine geladene Membran (z. B. Nylon-66 oder Nitrocellulose).
  • Auch wird hier ein Verfahren zur Synthese von Polynucleotiden auf einem Träger offenbart, wobei das Verfahren das Aufbringen mindestens eines Reaktionsmittels umfasst, das erforderlich ist zur Anknüpfung eines Nucleotids an ein wachsendes Polynucleotid- oder Linkermolekül, das an einen Träger gebunden ist, wobei das Reaktionsmittel beim Aufbringen im Wesentlichen in der Dampfphase vorliegt.
  • Ein weiteres Verständnis der Beschaffenheit und Vorteile vorliegender Erfindung kann durch Bezugnahme auf spätere Teile der Beschreibung und angefügte Zeichnungen gewonnen werden.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • Es zeigt:
  • 1–3 im Querschnitt und vereinfacht dargestellt einen Träger, der erfindungsgemäß verarbeitet wird;
  • 4–13 ausgewählte erfindungsgemäße Druckverfahren;
  • 14 im Querschnitt und vereinfacht dargestellt eine Vorrichtung zur Erlangung räumlicher Selektivität;
  • 15 eine Schablone zum schmierfreien Aufbringen einer Maske auf einen Träger;
  • 16 das Photo der Fluoreszenzdarstellung eines fluorgrundierten Werkstücks, das selektiv vor einer Flüssigkeits-Entschützung durch einen Lack abgeschirmt wurde;
  • 17 ein Photo von Tröpfchen nicht-gehärteten Epoxids und Pumpenöl, die ein Werkstück bedecken;
  • 18 das Photo des Musters eines nicht-gehärteten flüssigen Epoxids auf einem Werkstück aus Glas;
  • 19 das Photo in 100 μm Auflösung einer Probe mit einem Epoxid-Trennmuster;
  • 20 das SEM-Photo in 75 μm Auflösung einer Probe mit einem Epoxid-Trennmuster;
  • 21 das Photo eines Fluoreszenzmusters nach Dampfentschützung durch eine unbeschichtete Silicium-Schablonenmaske;
  • 22 das Photo aus 21 in Nahansicht; 23 das Photo eines Musters Epoxyharzfarbe, übertragen von einem Nickelrost;
  • 24 und 25 die Photos von Fluoreszenzdarstellungen nach der Dampfphasenentschützung durch ein Epoxymuster;
  • 26 eine 2 × 2-Anordnung Oligonucleotide, gebildet durch Ausmaskieren von Entschützungsmitteln hinter A (Senk rechtabdeckung) und einem ersten T bei der Synthese von 3'-CGCATTCCG;
  • 27 die Leseergebnisse einer Anordnung nach der Hybridisierung mit 10 nM Zieloligonucleotid 5'-GCGTAGGC-Fluoreszein für 15 Minuten bei 15°C;
  • 28 und 29 die Scanergebnisse nach der Hybridisierung an eine neu hergestellte Probe der gleichen Zielsequenz wie in 26 und 27;
  • 30 eine Reihe gleicher Oligos wie in 26 und 27, hergestellt durch Versetzen der Reaktionskammer bei Zugabe der Basen A und der ersten T in der Sequenz 3'-CGCATTCCG;
  • 31 und 32 die Scanergebnisse nach der Hybridisierung mit 10 nM 5'-GCGTAGGC-Fluoreszein.
  • Beschreibung spezifischer Ausführungsformen Begriffsbestimmungen
  • Nachstehende Begriffe haben, wie hier verwendet, folgende allgemeine Bedeutung:
    • 1. Ligand: Ein Ligand ist ein Molekül, das von einem bestimmten Rezeptor erkannt wird. Beispiele von Liganden, die durch diese Erfindung untersucht werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Agonisten und Antagonisten für Zellmembranrezeptoren, Toxine und Gifte, virale Epitope, Hormone (z. B. Opiate, Steroide, usw.), Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate, Cofaktoren, Arzneimittel, Lectine, Zucker, Oligonucleotide, Nucleinsäuren, Oligosaccharide, Proteine und monoklonale Antikörper.
    • 2. Monomer: Ein Mitglied der Gruppe kleiner Moleküle, die zusammengefügt ein Polymer sind oder bilden können. Die Gruppe Monomere umfasst beispielsweise, ist jedoch nicht beschränkt auf, die Gruppe gewöhnlicher L-Aminosäuren, die Gruppe D-Aminosäuren, die Gruppe synthetischer und/oder natürlicher Aminosäuren, die Gruppe Nucleotide und die Gruppe der Pentosen und Hexosen. Die bestimmte Ordnungsfolge der Monomere in dem Polymer wird hier als "Sequenz" des Polymers bezeichnet. Wie hier verwendet, betreffen Monomere alle Mitglieder einer Basisgruppe zur Synthese eines Polymers, die beispielsweise unter anderem umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf, Polynucleotide, Polypeptide und kleine Moleküle wie Benzodiazepine, β-drehende Nachahmungen und Protoprostaglandine. Dimere der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren bilden beispielsweise eine Basisgruppe von 400 Monomeren zur Synthese von Polypeptiden. Es können verschiedene Monomerbasisgruppen in aufeinander folgenden Schritten zur Synthese eines Polymers eingesetzt werden. Ferner können alle Gruppen geschützte Mitglieder enthalten, die nach der Synthese modifiziert werden. Die Erfindung ist hierin in erster Linie mit Blick auf die Herstellung von Molekülen beschrieben, die Monomersequenzen wie Aminosäuren enthalten, lässt sich jedoch leicht auf die Herstellung anderer Polymere anwenden. Solche Polymere umfassen beispielsweise sowohl geradkettige als auch cyclische Polymere von Nucleinsäuren, Polysacchariden, Phospholipiden und Peptiden mit entweder α-, β-, oder ω-Aminosäuren, Heteropolymeren, worin ein bekanntes Arzneimittel kovalent an eins der Vorstehenden gebunden ist, Polynucleotiden, Polyurethanen, Polyestern, Polycarbonaten, Polyharnstoffen, Polyamiden, Polyethyleniminen, Polyarylensulfiden, Polysiloxanen, Polyimiden, Polyacetaten oder andere Polymere, die bei der Durchsicht dieser Offenbarung offensichtlich werden. Solche Polymere sind "divers", wenn Polymere mit verschiedenen Monomersequenzen an unterschiedlichen vorbestimmten Bereichen eines Trägers gebildet werden. Verfahren zur Cyclisierung und Polymerumkehr von Polymeren sind beschrieben in der Anmeldung 07/796,727, eingereicht am 22.11.1991 (jetzt US-Patent 5,242,974 , erteilt am 7. September 1993 mit dem Titel "POLYMER REVERSAL ON SOLID SURFACES",). Eine Polymergruppe sind Polynucleotide und Peptid-Nucleinsäuren.
    • 3. Peptide: Polymere, worin die Monomere alpha-Aminosäuren sind, welche über eine Amidbindung miteinander verbunden sind, werden auch als Polypeptide bezeichnet. In dieser Beschreibung ist zu berücksichtigen, dass die Aminosäuren die optische L-Isomere oder D-Isomere sein können. Peptide haben häufig eine Länge von zwei oder mehr Aminosäuremonomeren und sind oftmals mehr als 20 Aminosäuremonomere lang. Es werden die üblichen Abkürzungen für Aminosäuren verwendet (z. B. P für Prolin). Diese Abkürzungen sind beschrieben in Stryer, Biochemistry, 3. Ausgabe, 1988, der hier durch die Bezugnahme für alle Zwecke enthalten ist. Peptidanaloge werden in der pharmazeutischen Industrie häufig als Nicht-Peptid-Arzneimittel verwendet mit Eigenschaften, die denen des Templatpeptids entsprechen. Dieser Typ Nicht-Peptid-Verbindung wird als "Peptidmimetics" oder "Peptidomimetics" bezeichnet (Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15: 29, Veber und Freidinger (1985) TINS S. 392 und Evans et al. (1987) J. Med. Chem. 30: 1229, die hier durch die Bezugnahme enthalten sind) und werden häufig mit Hilfe der rechnergestützten Molekülmodellierung entwickelt. Peptidnachbildungen, die eine ähnliche Struktur aufweisen wie therapeutisch nützliche Peptide, können eingesetzt werden zur Erzeugung einer äquivalenten therapeutischen oder prophylaktischen Wirkung. Im Allgemeinen sind bei Peptidomimetics ein oder mehrere Peptidbindungen wahlweise durch eine Bindung ersetzt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis und trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- und -CH2SO-, durch Verfahren, die in dem Gebiet bekannt und weiter beschrieben sind in nachstehenden Veröffentlichungen: Spatola, A. F. in "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins", B. Weinstein, Hrsg. Marcel Dekker, New York, S. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (März 1983), Bd. 1, Ausgabe 3, "Peptide Backbone Modifications" (Allgemeinübersicht); Morley, J. S., Trends Pharm Sci (1980) S. 463–468 (Allgemeinübersicht); Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res (1979) 14:177–185 (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola, A. F. et al., Life Sci (1986) 38:1243–1249 (-CH2-S); Hann, M. M., J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307–314 (-CH-CH-, cis und trans); Almquist, R. G. et al., J Med Chem (1980) 23:1392–1398 (-COCH2-); Jennings-White, C. et al., Tetrahedron Lett (1982) 23:2533 (-COCH2-); Szelke, M. et al., europäische Anmeldung EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH2-); Holladay, M. W. et al., Tetrahedron Lett (1983) 24:4401–4404 (-C(OH)CH2-); und Hruby, V. J., Life Sci (1982) 31:189–199 (-CH2-S-); die jeweils hier durch die Bezugnahme enthalten sind. Eine besonders bevorzugte Nicht-Peptid-Bindung ist -CH2NH-. Solche Peptidnachahmungen können wesentliche Vorteile gegenüber Polypeptidausführungsformen haben, unter anderen bspw.: eine wirtschaftlichere Herstellung, eine höhere chemische Stabilität, bessere pharmakologische Eigenschaften (Halbwertszeit, Absorption, Wirksamkeit, Leistungsfähigkeit usw.), eine veränderte Spezifität (z. B. ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten)und eine verringerte Antigenizität. Die systematische Substitution ein oder mehrerer Aminosäuren einer Konsensussequenz mit einer D-Aminosäure des gleichen Typs (z. B. D-Lysin anstelle von L-Lysin) kann zur Erzeugung stabilerer Peptide vorgenommen werden. Zudem können beschränkte Peptide (einschließlich cyclisierte Peptide), die eine Konsensussequenz enthalten oder eine zur Konsensussequenz im Wesentlichen identische Abwandlung, können durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren erzeugt werden (Rizo and Gierasch (1992) Ann. Rev. Biochem. 61:387, hierin durch die Bezugnahme enthalten) beispielsweise durch Zugeben interner Cysteineinheiten, die intramolekulare Disulfidbrücken bilden können, welche das Peptid cyclisieren.
    • 4. Rezeptor: Ein Molekül, das eine Affinität für einen bestimmten Liganden aufweist. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder synthetisch hergestellte Moleküle sein. Sie können auch in ihrem unveränderten Zustand eingesetzt werden oder als Aggregate mit anderen Molekülen. Rezeptoren können gebunden sein, kovalent oder nicht-kovalent, an ein Bindeglied, entweder direkt oder über eine spezifische Bindesubstanz. Beispiele von Rezeptoren, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Antikörper, Zellmembranrezeptoren, monoclonale Antikörper und Antiseren, die an spezifische Antigendeterminanten binden (wie an Viren, Zellen oder andere Materialien), Arzneimittel, Polynucleotide, Nucleinsäuren, Peptide, Cofaktoren, Lectine, Zucker, Polysaccharide, Zellen, Zellmembranen und Organellen. Rezeptoren werden manchmal auf dem Gebiet als Antiliganden bezeichnet. So wie der Begriff Rezeptoren hier verwendet wird, ist kein Unterschied in der Bedeutung beabsichtigt. Ein "Ligand-Rezeptor-Paar" entsteht, wenn zwei Makromoleküle durch die molekulare Erkennung zusammenkommen und einen Komplex bilden. Einzelne Beispiele für Rezeptoren, die durch die Erfindung untersucht werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: a) Mikroorganismus-Rezeptoren: Die Bestimmung von Liganden, die an Rezeptoren binden wie spezifische Transportproteine oder Enzyme, die für das Überlegen von Mikroorganismen entscheidend sind, ist bei einer neuen Klasse Antibiotika nützlich. Von besonderem Wert sind Antibiotika gegen opportunistische Pilze, Protozoa und solche Bakterien, die gegenüber derzeit verwendeten Antibiotika resistent sind. b) Enzyme: z. B. die Bindungsstellen von Enzymen wie Enzymen, die für die Spaltung von Neurotransmittern verantwortlich sind; die Bestimmung der Liganden, die an bestimmte Rezeptoren binden, so dass man die Wirkung der Enzyme, die die verschiedenen Neurotransmitter spalten, abändern kann, ist nützlich bei der Entwicklung von Arzneimitteln, die zur Behandlung von Störungen der Neurotransmission verwendet werden können. c) Antikörper: Die Erfindung ist beispielsweise nützlich zur Untersuchung der Ligand-Bindungsstelle auf dem Antikörpermolekül, das zu dem Epitop eines Antigen, das von Interesse ist, passt; die Bestimmung einer Sequenz, die das Antigenepitop nachahmt, kann zur Entwicklung von Impfstoffen führen, deren Immunogen auf ein oder mehreren solcher Sequenzen beruht, oder zur Entwicklung verwandter diagnostischer Mittel oder Verbindungen, die zur therapeutischen Behandlung geeignet sind, wie für Autoimmunkrankheiten (z. B. durch Blockieren der Bindung auf den "Selbst"-Antikörpern). d) Nucleinsäuren: Nucleinsäuresequenzen kann man synthetisieren, um DNA- oder RNA-Bindesequenzen aufzustellen. Polynucleotide, welche Oligonucleotide umfassen, bestehen aus Nucleotiden, üblicherweise 5' zu 3' über eine Phosphordiesterbindung oder eine Phosphorthiolatbindung oder dergleichen verknüpft. Der Begriff "entspricht" bedeutet hierin, dass eine Polynucleotidsequenz homolog ist (d. h. identisch, nicht streng evolutionsmäßig verwandt) zu der ganzen oder einem Teil der Bezugs-Polynucleotidsequenz, oder dass eine Polypeptidsequenz identisch zu einer Bezugs-Polypeptidsequenz ist. Im Gegensatz dazu bedeutet der Begriff "komplementär zu" hierin, dass die komplementäre Sequenz homolog ist zu der ganzen oder einem Teil der Bezugs-Polynucleotidsequenz. Zur Verdeutlichung: die Nucleotidsequenz "TATAC" entspricht einer Bezugssequenz "TATAC" und ist komplementär zu einer Bezugssequenz "GTATA". Polynucleotide können Nucleotide mit einer Vielfalt Basen umfassen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf: Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Uridin, Inosin, Deazaguanosin, N2-Dimethylguanosin, 7-Methylguanosin, N6-Δ2-Isopentyl-2-methylthioadenosin, 2'-O-Methyladenin, 2'-O-Methylthymin, 2'-O-Methylcytosin, 2'-O-Methylguanin, Pseudouridin, Dihydrouridin, 4-Thiouridin und dergleichen. e) Katalytische Polypeptide: Polymere, vorzugsweise Polypeptide, die eine chemische Reaktion beschleunigen können, bei der ein oder mehrerer Reaktionspartner in ein oder mehrere Produkte umgewandelt werden. Solche Polypeptide umfassen im Allgemeinen eine Bindungsstelle, die spezifisch ist für mindestens ein Reagens oder Reaktionszwischenprodukt und eine aktive Funktionalität nahe der Bindungsstelle, wobei die Funktionalität das gebundene Reaktionsmittel chemisch modifizieren kann. Katalytische und andere Polypeptide sind beispielsweise beschrieben in den PCT-Veröffentlichungen WO 90/05746 , WO 90/05749 und WO 90/05785 , die hier durch die Bezugnahme für alle Zwecke enthalten sind. f) Hormonrezeptoren: Beispielsweise Insulin- und Wachstumshormonrezeptoren. Die Bestimmung der Liganden, die mit hoher Affinität an einen Rezeptor binden, ist beispielsweise nützlich für die Entwicklung eines oral zu verabreichenden Ersatzmittels für die täglichen Injektionen, die Diabetiker benötigen, um die Diabetessymptome zu lindern, und in einem anderen Fall für die Entwicklung eines Ersatzmittels für das seltene menschliche Wachstumshormon, das nur aus Leichen oder durch rekombinante DNA-Technologie gewonnen werden kann. Weitere Beispiele sind die vasokonstriktiven Hormonrezeptoren; die Bestimmung von Liganden, die an einen Rezeptor binden, kann zur Entwicklung von Arzneimitteln zur Regelung des Blutdrucks führen. g) Opiatrezeptoren: Die Bestimmung von Liganden, die an Opiatrezeptoren im Gehirn binden, ist nützlich zur Entwicklung weniger suchtfördernder Ersatzmittel für Morphin und verwandte Drogen.
    • 5. Träger: Ein Material mit einer starren oder halbstarren Oberfläche. In vielen Ausführungsformen ist mindestens eine Oberfläche des Trägers im Wesentlichen eben, obwohl es bei manchen Ausführungsformen gefragt sein kann, die Synthesebereiche für verschiedene Polymere beispielsweise durch Vertiefungen, erhöhte Bereiche, eingeätzte Rillen oder dergleichen physikalisch zu trennen. Gemäß weiterer Ausführungsformen können kleine Perlen auf der Oberfläche bereitgestellt werden, die nach Abschluss der Synthese freigelassen werden können. Häufig ist der Träger eine Silicium- oder Glasoberfläche oder eine geladene Membran wie Nylon-66 oder Nitrocellulose.
    • 6. Schutzgruppe: Ein Material, das an eine Monomereinheit gebunden ist und das selektiv davon entfernt werden kann, so dass eine aktive Stelle, wie in dem bestimmten Beispiel einer Aminosäure einer Amingruppe, freigelegt wird. In dem bestimmten Beispiel eines Polynucleotids, das mittels Phosphoramiditchemie synthetisiert wird, kann die Schutzgruppe eine Tritylether(DMT-Ether)-Gruppe sein, gebunden an ein Nucleotid über eine 5'-Hydroxylposition.
    • 7. Vorbestimmter Bereich: Ein vorbestimmter Bereich ist eine lokalisierte Fläche auf einem Träger, die zur Bildung eines ausgewählten Polymers bestimmt ist, war oder vorgesehen ist und hierin ansonsten als "ausgewählter" Bereich oder einfach als "Bereich" bezeichnet ist. Der vorbestimmte Bereich kann jede geeignete Form haben, z. B. rund, rechteckig, elliptisch, keilförmig usw. sein. In manchen Ausführungsformen ist der vorbestimmte Bereich und damit die Fläche, auf der die bestimmte Polymersequenz synthetisiert wird, kleiner als etwa 1 cm2, weiter bevorzugt weniger als 1 mm2, noch weiter bevorzugt weniger als 0,5 mm2 und in manchen Ausführungsformen etwa 0,125 bis 0,5 mm2. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen haben die Bereiche eine Fläche von weniger als etwa 10.000 μm2 oder, weiter bevorzugt, weniger als 100 μm2. Innerhalb dieser Bereiche wird das darin synthetisierte Polymer vorzugsweise in einer im Wesentlichen reinen Form synthetisiert. Ein vorbestimmter Bereich kann ein abgeschirmter oder ein nicht-abgeschirmter Bereich sein.
    • 8. Im Wesentlichen rein: Ein Polymer wird innerhalb eines vorbestimmten Bereichs eines Trägers als "im Wesentlichen rein" betrachtet, wenn es Eigenschaften entfaltet, durch die es sich von anderen vorbestimmten Bereichen unterscheidet. Üblicherweise wird die Reinheit bezogen auf die biologische Aktivität oder Funktion als Folge einer einheitlichen Sequenz bestimmt. Solche Eigenschaften werden üblicherweise durch die Bindung mit einem ausgewählten Liganden oder Rezeptor bestimmt. Vorzugsweise ist der Bereich ausreichend rein, so dass das überwiegende Molekül in dem vorbestimmten Bereich die gewünschte Sequenz ist. Gemäß bevorzugten Aspekten der Erfindung ist das Polymer 5% rein, weiter bevorzugt über 10%, vorzugsweise mehr als 20% und weiter bevorzugt mehr als 80%, noch weiter bevorzugt mehr als 90%, weiter bevorzugt mehr als 95% rein, wobei Reinheit hierbei dem Verhältnis entspricht von der Anzahl Ligandmoleküle, die in einem vorbestimmten Bereich mit der gewünschten Sequenz gebildet werden, zu der Gesamtanzahl Moleküle, die in dem vorbestimmten Bereich entstehen.
    • 9. Monomeradditionszyklus: Ein Monomeradditionszyklus ist ein Zyklus, der die chemischen Reaktionen enthält, die zur Bildung der kovalenten Bindung eines Monomers an das entstehende Polymer oder den Linker notwendig sind, so dass das Polymer mit der gewünschten chemischen Bindung (z. B. 5'-3'-Phosphodiesterbindung, Peptidbindung usw.) verlängert wird. Die nachstehenden Schritte umfassen üblicherweise einen Monomeradditionszyklus bei der Phosphoramidit-basierenden Oligonucleotidsynthese, wobei dies ein Beispiel ist und die Erfindung in keiner Weise beschränkt: (1) Entschützung, umfassend das Entfernen der DMT-Gruppe vom 5'-geschützten Nucleosid (welches Teil eines entstehenden Polynucleotids sein kann), wobei das 5'-Hydroxylende durch kovalentes Anknüpfen von DMT blockiert wird; eine solche Entschützung erfolgt üblicherweise mit einem geeigneten Entschützungsmittel (z. B. einer protischen Säure: Trichloressigsäure oder Dichloressigsäure) und kann die physikalische Entfernung (z. B. durch Waschen wie mit Acetonitril) der entfernten Schutzgruppe (z. B. der abgespaltenen Dimethyltritylgruppe) umfassen; (2) Kopplung, umfassend das Umsetzen ein oder mehrerer Phosphoramiditnucleoside, häufig mit Tetrazol aktiviert, mit dem entschützten Nucleosid; (3) wahlweise umfassend das Cappen zum Abschneiden nicht-umgesetzter Nucleoside von einer weiteren Teilnahme an nachfolgenden Monomeradditionszyklen, wie durch Umsetzen mit Essigsäureanhydrid und N-Methylimidazol zur Acetylierung freier 5'-Hydroxylgruppen und (4) Oxidation, wie durch Iod in Tetrahydrofuran/Wasser/Pyridin zur Umwandlung der trivalenten Phosphittriesterbindung in einen pentavalenten Phosphittriester, der wiederum durch Umsetzen mit Ammoniumhydroxid in einen Phosphordiester umgewandelt werden kann. Hinsichtlich der Phosphoramiditsynthese von Polynucleotiden sind daher üblicherweise nachstehende Reaktionsmittel für einen vollständigen Monomeradditionszyklus erforderlich: Trichloressigsäure oder Dichloressigsäure, ein Phosphoramiditnucleosid, ein Oxidationsmittel wie Iod (z.B. Iod/Wasser/THF/ Pyridin) und wahlweise N-Methylimidazol zum Cappen.
    • 10. Spezifische Hybridisierung steht hier für die Bildung von Hybriden zwischen einer Polynucleotidprobe (z. B. einem erfindungsgemäßen Polynucleotid, das Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen aufweisen kann) und einem spezifischen Zielpolynucleotid (z. B. einem Analytpolynucleotid), wobei die Probe bevorzugt an das spezifische Zielpolynucleotid hybridisiert und im Wesentlichen nicht an Polynucleotide, die aus Sequenzen bestehen, die im Wesentlichen nicht identisch sind zu der des Zielpoly nucleotids. Der Fachmann wird jedoch erkennen, dass die für die spezifische Hybridisierung an ein Zielpolynucleotid erforderliche Mindestmenge Polynucleotid von mehreren Faktoren abhängt: unter anderen vom G/C-Gehalt, der Positionierung der Mismatch-Basen (falls vorhanden), dem Grad der Einzigartigkeit der Sequenz im Vergleich zur Population der Zielpolynucleotide und der chemischen Beschaffenheit des Polynucleotids (z. B. Methylphosphonat-Rückgrat, Phosphorthiolat, usw.)
  • Wie oben beschrieben, stellt die Erfindung den Gebrauch eines Trägers mit einer Oberfläche mit einer Schicht Linkermoleküle darauf bereit. Der Grund für die Trägermoleküle in bestimmten Ausführungsformen die Aufgabe, die Rezeptorerkennung bei den synthetisierten Polymeren zu erleichtern. Die Linkermoleküle enthalten jeweils eine Schutzgruppe. Eine Schicht Trennmaterial wird auf die Oberfläche des Trägers aufgebracht und insbesondere die Linkermolekülschicht. Das Trennmaterial wird selektiv durch eine Vielfalt Druckverfahren aufgebracht, so dass freiliegende Bereiche entstehen. Dann kann ein Entschützungsschritt mit einem Entschützungsmittel auf die freiliegenden Bereiche angewendet werden. Der Entschützungsschritt erfolgt durch Verwendung eines Entschützungsmittels in der Dampfphase. Diese Schrittfolge kann zur ausgewählten Synthese einer Anordnung Oligonucleotide verwendet werden.
  • Die Erfindung stellt auch den Gebrauch ausgewählter Druckverfahren bereit zum Aufbringen von Entschützungsmitteln, Trennmaterialien, Nucleosiden und dergleichen zur Synthese einer Anordnung Oligonucleotide. Vorzugsweise sollte der Typ Druckverfahren ein ausreichendes Volumen Druckmaterial auf die ausgewählten Bereiche des Trägers übertragen in einer einfachen, genauen und kostenwirksamen Weise. Beispiele verschiedener Druckverfahren, bspw. für die Synthese einer Anordnung Oligonucleotide, sind hierin beschrieben. Weitere Beispiele dieser erfindungsgemäßen Ausführungsformen können auf die Synthese von DNA-Reihen angewendet werden, wie beschrieben in der An meldung 07/796,243 von Winkler et al. und dem US-Patent 5,143,854 von Pirrung et al.
  • Beispiele geeigneter Phosphoramiditsyntheseverfahren sind in dem Benutzerhandbuch zu Applied Biosystems Modell 391, S. 6–1 bis 6–24 beschrieben, erhältlich von Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404, und sind dem Fachmann im Allgemeinen bekannt.
  • Die chemische Synthese von Polypeptiden ist in dem Gebiet bekannt und weiter beschrieben in Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91: 501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser et al. (1989) Science 243: 187; Merrifield, B. (1986) Science 232: 342; Kent, S. B. H. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57: 957; und Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, die hier durch die Bezugnahme enthalten sind.
  • Die erfindungsgemäßen Polynucleotidreihen haben, wenn sie einmal synthetisiert sind, viele auf dem Gebiet anerkannte Verwendungen. Die synthetisierten Sequenzen können beispielsweise, was keine Beschränkung darstellt, als Hybridisierungsproben oder PCR-Amplimere eingesetzt werden zum Nachweis des Vorliegens spezifischer DNA oder mRNA, beispielsweise zur Diagnose einer Krankheit, die durch das Vorliegen eines erhöhten mRNA-Spiegels in den Zellen gekennzeichnet ist, zur Identifizierung eines Krankheitsallels oder zur Gewebetypisierung (d. h. zum Nachweis von Gewebe, das durch die Expression bestimmter mRNAs gekennzeichnet ist) und dergleichen. Die Sequenzen können auch zum Nachweis genomischer Gensequenzen in einer DNA-Probe verwendet werden wie zur gerichtsmedizinischen DNA-Analyse (z. B. durch RFLP-Analyse, PCR-Produktlängenverteilung usw.) oder zur Diagnose von Krankheiten, die gekennzeichnet sind durch die Amplifikation und/oder Umordnung eines kennzeichnenden Gens.
  • Erfindungsgemäße Ausführungsformen
  • Eine erfindungsgemäße Ausführungsform kann kurz durch nachstehendes Verfahren umrissen werden.
    • 1. Bereitstellen eines Trägers.
    • 2. Bilden einer Schicht Linkermoleküle auf dem Träger.
    • 3. Mechanisches Aufbringen eines Trennmusters mit freiliegenden Bereichen auf die Linkermoleküle.
    • 4. Entschützen der Linkermoleküle in den freiliegenden Bereichen durch Standard-DMT-Chemie.
    • 5. Strippen des Trennmusters.
    • 6. Anwenden der übrigen Syntheseschritte.
  • Diese Schrittfolge liefert eine Ausführungsform, bei der eine Trennschicht mit Standard-DMT-Chemie verwendet wird. Dies liefert neben anderen Merkmalen eine gewünschte Selektivität, eine leichte Synthese, geringe Kosten, einen hohen Kontrast und eine hohe Auflösung. Natürlich wird diese Schrittfolge nur als Beispiel gezeigt und beschränkt nicht den Umfang der hier angefügten Ansprüche.
  • Eine alternative erfindungsgemäße Ausführungsform kann kurz durch nachstehendes Verfahren umrissen werden:
    • 1. Bereitstellen eines Trägers;
    • 2. Bilden einer Schicht Linkermoleküle auf dem Träger;
    • 3. Selektives Aufbringen eines Druckmediums durch ein Druckverfahren (kein photosensitives Druckverfahren) auf die Linkermoleküle;
    • 4. Durchführen der übrigen Syntheseschritte.
  • Diese Schrittfolge ermöglicht das selektive Aufbringen eines Druckmediums auf einen Träger durch die verschiedenen hierin beschriebenen Druckverfahren. Diese Druckverfahren benutzen einfach keine außergewöhnlichen photoempfindlichen Materialtypen, obwohl später photoempfindliche Schritte mit der hierin beschriebenen Lehre kombiniert werden können. Ein Entschützungsmittel wird in Dampfform auf den Träger aufgebracht. Dementsprechend stellt die Erfindung das selektive Aufbringen einer Vielfalt Druckmedien auf einen Träger bereit, ohne dass dabei herkömmliche photoempfindliche Materialien benötigt werden.
  • 1 zeigt eine Ausführungsform gemäß vorliegendem Verfahren. Ein Träger 12 ist im Querschnitt gezeigt. Der Träger kann biologisch sein, nicht-biologisch, organisch, anorganisch oder eine Kombination davon und kann vorliegen als Teilchen, Stränge, Präzipitate, Gele, Schichten, Röhren, Kugeln, Behältern, Kapillaren, Kissen, Scheiben, Filme, Platten, Schlitten und dergleichen. Der Träger kann jede geeignete Form haben wie eine Scheibe, ein Quadrat, eine Kugel, ein Kreis usw. Der Träger ist vorzugsweise flach, kann jedoch eine Vielfalt anderer Oberflächenanordnungen aufweisen. Der Träger kann beispielsweise erhöhte und tieferliegende Bereiche aufweisen, auf denen die Synthese erfolgt. Der Träger und seine Oberfläche bilden vorzugsweise eine starre Unterlage, auf der die hier beschriebenen Reaktionen erfolgen können. Der Träger kann beispielsweise ein funktionalisiertes Glas sein, Si-, Ge-, GaAs-, GaP-, SiO2-, SiN4-modifiziertes Silicium oder eines aus einer großen Vielfalt Gele oder Polymere wie (Poly)tetrafluorethylen, Polypropylen, Polyethylen, (Poly)vinylidendifluorid, Polystyren, Polycarbonat oder eine Kombination davon. Andere Trägermaterialien werden für den Fachmann beim Lesen dieser Offenbarung leicht zu erkennen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Träger ein flaches Glas oder einkristalliges Silicium mit Oberflächenreliefeigenschaften von weniger als 10 μm. In einer anderen bevorzugen Ausführungsform ist der Träger ein Polypropylenmaterial.
  • Die Oberflächen des festen Trägers sind gewöhnlich, jedoch nicht immer, aus dem gleichen Material wie der Träger. Die Oberfläche kann daher aus einer großen Vielfalt Materialien beschaffen sein, beispielsweise aus Polymeren, Kunststoffen, Harzen, Polysacchariden, Siliciumdioxid oder auf Siliciumdioxid beruhenden Materialien, Kohlenstoff, Metallen, anorganischen Glasen, Membranen oder einem der oben aufgeführten Trägermaterialien. In manchen Ausführungsformen kann die Oberfläche für den Gebrauch von Gitterbindungsgliedern ausgestat tet sein, die fest an die Oberfläche des Trägers angebracht sind. Vorzugsweise enthält die Oberfläche reaktive Gruppen, welches Carboxyl, Amino, Hydroxyl oder dergleichen sein können. Am meisten bevorzugt hat die Oberfläche Si-OH-Oberflächenfunktionalitäten, wie sie auf Siliciumdioxidoberflächen vorkommen. Zur Synthese von Polynucleotiden durch Phosphoramiditchemie kann ein Linker, bestehend aus -COCH2CH2CONHCH2CH2-CH2-Siloxan gebundenem Glasträger, zum Anbringen an ein DMT-geschütztes Nucleosid durch die Bildung einer Carboxylbindung am 3'-Hydroxyl des Nucleosids verwendet werden.
  • Der Träger 12 umfasst eine Oberfläche 14 mit einer Schicht Linker-(oder Spacer-)Moleküle 16 darauf. Die Linkermoleküle haben vorzugsweise eine ausreichende Länge, so dass Polymere in einem fertiggestellten Träger frei mit den auf dem Träger freiliegenden Molekülen Wechselwirken können. Die Linkermoleküle sollten etwa 4 bis 40 Atome lang sein, so dass sie eine ausreichende Exponierung bereitstellen. Die Linkermoleküle können beispielsweise unter anderem Arylacetylen sein, Ethylenglycololigomere mit 2 bis 10 Monomereinheiten, Diamine, Diacide, Aminosäuren und Kombinationen davon. Wahlweise können die Linker der gleiche Molekültyp sein, der synthetisiert wird (d. h. wachsende Polymere) wie Oligonucleotide oder Oligopeptide.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Linkermoleküle PEG-Linker. Natürlich hängt der Typ verwendeter Linkermoleküle von der bestimmten Anwendung ab.
  • Die Linkermoleküle können an den Träger über Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen angeknüpft sein, bspw. durch den Gebrauch von (Poly)trifluorchlorethylen-Oberflächen, oder vorzugsweise durch Siloxanbindungen (bspw. durch Verwenden von Glas- oder Siliciumoxid-Oberflächen). Siloxanbindungen mit der Oberfläche des Trägers können gemäß einer Ausführungsform gebildet werden durch Umsetzen der Linkermoleküle, die Trichlorsilylgruppen enthalten. Die Linkermoleküle können wahlweise in einer geordneten Reihe angebracht werden, d. h. als Teile der Kopfgruppen. Gemäß einer alternativen Ausführungsform können die Linkermoleküle an die Oberflächen des Trägers adsorbiert sein.
  • Die Linkermoleküle oder der Träger selbst sowie hierin verwendete Monomere werden mit einer funktionalen Gruppe bereitgestellt, an die eine Schutzgruppe gebunden ist. Vorzugsweise ist die Schutzgruppe am distalen oder endständigen Ende des Linkermoleküls, gegenüber dem Träger. Die Schutzgruppe kann entweder eine negative Schutzgruppe sein (d. h. die Schutzgruppe macht die Linkermoleküle bei der Aussetzung weniger reaktiv gegenüber einem Monomer) oder eine positive Schutzgruppe (d. h. die Schutzgruppe macht die Linkermoleküle bei der Aussetzung reaktiver gegenüber einem Monomer). Im Fall negativer Schutzgruppen ist ein zusätzlicher Schritt der Reaktivierung erforderlich. In manchen Ausführungsformen wird dies durch Erwärmung erreicht.
  • In einem anschließenden Schritt enthält der Träger 12 ein Trennmuster 18 mit darauf ausgebildeten ausgewählten freiliegenden Bereichen 20. Jeder der freiliegenden Bereiche entspricht einer "Öffnung" im Trennmaterial, dort wo Schutzgruppen von den Linkermolekülen entfernt werden sollen. Die Schutzgruppen können von den Linkermolekülen durch Eintauchen in die Entschützungslösung entfernt werden. Beispiele von Entschützungslosungen umfassen unter anderem Trichloressigsäure und Salzsäure.
  • Die Trennmuster können aus jedem geeigneten Material sein, das bestimmte Bereiche der Linkermolekulschicht abdecken kann, so dass diese Bereiche vor der anschließenden Behandlung geschützt werden. Das Trennmuster kann bspw. unter anderem Materialien umfassen wie einen Lack, ein Öl, eine Abdeckschablone, eine Siliconmaske, ein Epoxid, ein Siliconöl, ein Polyester, eine Siliciummembranmaske, eine Flüssigkeit, die eine Grenze für Schutzgruppen bereitstellt, einen Feststoff, der eine Grenze für Schutzgruppen bereitstellt, sowie Kombinationen davon. Der Lack kann einen Lack umfassen wie Pactra-63-1 und an dere, häufig mit Eigenschaften, die so gestaltet sind, dass der Lack beständig ist gegenüber heißem Kraftstoff. Ein Epoxid kann jeden geeigneten Typ Epoxidmaterial umfassen wie West-105 und andere. Ausgewählte Öle sind ein Rotationspumpenol wie Mowioc-MC110, ein Silikonbl wie Dow-Corning-704 und weitere. Materialien des Polyestertyps können TAP-SB und dergleichen umfassen sowie Kombinationen davon.
  • Das Trennmuster wird als Flüssigkeit oder Dampf durch eine Vielfalt Verfahren aufgebracht. Beispiele ausgewählter Wege zum Aufbringen des Trennmaterials umfassen Streich-, Sprühverfahren, ausgewählte Druckverfahren und andere.
  • Es können ausgewählte Druckverfahren zum Aufbringen des flüssigen Trennmaterials verwendet werden. Die ausgewählten Verfahren zum Drucken umfassen unter anderem einen Präge- oder Hochdruck (die älteste Form), Gravüre- oder Tiefdruck, SchabIonendruck und Lithographie. Die 4 bis 17, die nachstehend ausführlicher beschrieben werden, zeigen eine Vielfalt Drucktechniken, die zum Aufbringen des Trennmaterials verwendet werden. Manche dieser Verfahren, wie sie in der Druckindustrie angewendet werden, stammen aus Printing Technology, J. Michael Adams, David D. Faux, Lloyd J. Ricker (3. Ausgabe, Delmar, 1988), das hier durch die Bezugnahme für alle Zwecke enthalten ist.
  • Nachdem die Linkermolekülschicht entschützt wurde, wird das Trennmaterial durch Verfahren des chemischen Nass-Strippens, Aceton, IPA und andere gestrippt. Die Linkermolekülschicht wird dann gewaschen oder auf eine andere Weise mit einer ersten Monomerschicht wie dem Rezeptor "A" in 3 zusammengebracht. Das erste Monomer reagiert mit der aktivierten funktionalen Gruppe der Linkermoleküle, welche entschützt worden sind. 3 zeigt eine vereinfachte Querschnittdarstellung des Trägers 12, der Linkermolekülschicht 16 und der Monomerschicht "A". Die in 1 bis 3 gezeigte Schrittfolge kann wiederholt werden, so dass die gewünschte Monomersequenz an ausgewählten Bereichen erreicht wird und eine Anordnung Oligo nucleotide, Peptide, weitere Polymere und dergleichen entsteht.
  • 4 bis 7 zeigt Druckverfahren als Präge- oder Hochdruck 50, Gravüre- oder Tiefdruck 60, Schablonendruck 70 bzw. Lithographie 80. Das Prägedrucken 50 beruht auf dem Gebrauch erhöhter Merkmale 52 zur Übertragung des Druckmediums auf einen Träger. Beim Gravüre- oder Tiefdruck 60 werden abgesenkte Merkmale 62 zum Aufbringen der gewünschten Form auf einen Träger benutzt. Der Schablonendruck 70, umfassend den Siebdruck, Abdeckmaskendruck, Sprühdruck und weitere, erfolgt durch mechanische Öffnungen 72 einer Schablone 74. Die Lithographie ist eine Druckform, bei der Bereiche 82 einer Oberfläche chemisch behandelt werden, so dass sie selektiv das Druckmedium zurückhalten. Jedes dieser Verfahren kann zum Aufbringen eines Trennmaterials, Trägermaterials, eines Entschützungsmittels oder eines Polymereinheitsmusters auf einen Träger verwendet werden.
  • Jüngere Druckenarten umfassen die Xerographie (welche das Laserdrucken umfasst), den Tintenstrahldruck (oder Druckmediumstrahldruck) und weitere. 8 bis 13 zeigen die jüngeren Arten des Druckens.
  • 8 zeigt eine Form des Xerographiedrucks 90. Der Xerographiedruck richtet sich auf das Drucken durch ein elektrisches Ladungsmuster. Die Schritte beim Xerographiedrucken umfassen häufig Schritte der Beladung 91, Belichtung 92, Entwicklung 93, Übertragung 94, Fixierung 95 und Reinigung 96.
  • 9 bis 10 zeigt zwei Formen des Druckens, bekannt als Tintenstrahldrucken oder in diesem Fall Druckmediumstrahldrucken. Bei diesem Typ des Druckens wird Druckmedium durch eine Anordnung kleiner Öffnungen gepresst, welche über ein Werkstück läuft und daher in Wirklichkeit ein Abkömmling des Schablonendrucks ist. 9 zeigt ein kontinuierliches Tintenstrahlverfahren 110. Das kontinuierliche Druckmediumstrahlverfahren umfasst einen Träger 111, eine Auffanganordnung 112, eine Kreislaufführung 113, eine Ablenkschleife 114, eine Beschichtungsplatte 115, eine Platte mit Öffnungen 116 und weitere Bestandteile. Der Drucker vom Druckmediumstrahltyp kann in einem einzigen Durchlauf ein Muster des ausgewählten Druckmediums liefern. Die Aufldsung eines solchen Druckverfahrens kann bis zu etwa 200 μm oder weniger sein.
  • Der Druckkopf umfasst einen Träger 121, eine Heizanordnung 122, eine Trenneinrichtung 123, ein Druckmedium 124, eine Düsenplatte 125 und den Druckmediumstrahler 126. Die Heizanordnung 122 kann auf einer Unterschicht 127 gebildet sein, die über dem Träger liegt, einem beständigen Heizelement 128, das über der Unterschicht liegt, einem Leiter 129 und einer darüber liegenden Schicht zur Inaktivierung 130. Der Drop-on-Demand-Druckkopf hat die Fähigkeit, geregelte Mengen Flüssigkeit wie Trennmedium, Trägermaterial, Monomereinheiten und dergleichen auf die Oberfläche eines Werkstücks zu bringen.
  • Eine vereinfachte Querschnittsansicht einer Offset-Rotationspresse 140 ist in 11 gezeigt. Die Offset-Rotationspresse umfasst einen Druckzylinder 141, einen Gummizylinder 142, einen Plattenzylinder 143, Druckmediumwalzen 144, eine Losungsmittelwalze 145 und einen Träger 146. Die Abbildung wird übertragen (oder abgesetzt) von einem Plattenzylinder auf einem Gummizylinder, der die Abbildung umkehrt. Die Abbildung gelangt dann, während sie zwischen dem Gummizylinder und dem Druckzylinder bewegt wird, zu dem Druckträger (oder der Druckschicht.
  • Eine weitere Form des Offsetdrucks wie der Gravüre-Offsetdruck 150 ist in 12 gezeigt. Der Gravüre-Offsetdruck umfasst Schritte der Übertragung des Druckmediums 151, Weiterführung 152 und das Drucken 153. Man kann ein Abstreifmesser 154 verwenden, um das Medium 155 während des Druckmedium-Übertragungsschritts in die Kerben 158 zu pressen. Das Druckmedium wird dann auf einen Gummizylinder 156 übertragen, häufig bedeckt mit einem Gummiüberzug 157. Der Gummizylinder druckt dann das Druckmedium auf einen Träger. Ein Beispiel des Gravü re-Offsetdrucks ist gezeigt in Mikami et al., IEEE-Übertragungen auf Elektronenvorrichtungen 41, 306, (März 1994), das hierin durch die Bezugnahme für alle Zwecke enthalten ist. Mikami et al. verwendet den Offsetdruck zur Herstellung einer Anordnung dünner Filmtransistoren für Flachbildschirme. Durch den Gravüre-Offsetdruck können Merkmale mit einer Größe bis hinab auf etwa 30 μm hergestellt werden.
  • Noch ein weiteres Druckverfahren 160 ist in 13 gezeigt. Das Druckverfahren umfasst den Gebrauch eines Plattenzylinders 162, einer Anzahl Verteilerwalzen 164, einer Anzahl Formwalzen 166, eine Farbauftragwalze 168, eine Farbhebewalze 169 und andere Bestandteile. Dieser Verfahrenstyp stellt eine gleichmäßigere Verteilung des Trennmediums, des Trägermediums, der Entschützungsmittel oder der Polymereinheiten (oder herkömmlicher Tinte) in den ausgewählten Anwendungen bereit.
  • In bevorzugten Ausführungsformen wird die räumliche Selektivität und insbesondere die lokale Selektivität durch das Einschließen der Flüssigkeit in einer Kontakt habenden Schablonenmaske erreicht. Zu beachten ist, dass „lokale Selektivität" das Verfahren zur Bildung der Flüssigkeitsgrenze an ausgewählten oder vorbestimmten Bereichen betrifft. Eine Flüssigkeit kann an feste Oberflächen binden und diese dann mit den ausgewählten Werten der Oberflächen- und Zwischenflächenenergien zusammenziehen. Der Zug bestimmt sich durch den Druck P in folgendem Verhältnis P = T/Rworin ist:
    • P
    der Ansaugdruck zwischen den zwei Flächen;
    T
    die Oberflächenspannung der Flüssigkeit; und
    R
    der Krümmungsradius des Meniskus.
  • Das Verhältnis geht von einem kleinen Kontaktwinkel aus, der jedoch nicht so klein ist, dass Flüssigkeit entlang der Oberflächen der Festkörper kriecht. Ein Beispiel dieses Verfahrens ist gezeigt in D. B. Tuckerman und R. F. W. Pease, vorgestellt bei dem US/Japan-VLSI-Symposium, Kaanapaali, HI 1983 (Tuckerman et al.) und hierin für alle Zwecke durch die Bezugnahme enthalten. Tuckerman et al. beschreibt den Gebrauch von DC-704-Öl zum Anbringen integrierter Schaltungs-Chips auf diese Weise.
  • Ein geeigneter Wert für R erfordert häufig, dass das Flüssigkeitsvolumen den Spalt zwischen den festen Trennflächen und dem Trägers ausfüllt. Bei zu wenig Flüssigkeit leert sich der Spalt aus und entwässert bestimmte Bereiche, wodurch an diesen Bereichen keine Entschützung erfolgt. Zuviel Flüssigkeit entspricht einem größeren Wert R und einer Verringerung der Anziehungskraft P. Natürlich hängt die ausgewählte Flüssigkeitsmenge von der jeweiligen Anwendung ab.
  • 14 zeigt im Querschnitt eine vereinfachte Ansicht der Vorrichtung 170, die zur Erreichung einer lokalen Selektivität verwendet wird. Die Vorrichtung umfasst ein Glaswerkstück 172, eine Schablone 174, eine obere Elektrode 176, eine Maskenhalterung (oder untere Elektrode) 178 und weitere Merkmale. Das Glaswerkstück ist zwischen der oberen Elektrode und der Maskenhalterung angeordnet. Eine Spannung wie etwa 20.000 Volt wird an die obere Elektrode angelegt, während die Maskenhalterung (oder die untere Elektrode) ein Potential von etwa 0 Volt hat. Der Spannungsunterschied liefert die elektrostatische Kraft zum Anbringen des Werkstücks an die Schablone. Der Anziehungsdruck zwischen der Schablone und dem Werkstück reicht von etwa 0,5 gm-Kraft/cm2 bis etwa 50 gm-Kraft/cm2 und ist vorzugsweise etwa 5 gm-Kraft/cm2.
  • Die Verbindung zwischen der Schablone und dem Werkstück ermöglicht, dass das Entschützungsmittel auf die freigelegten Bereiche 179 des Werkstücks geleitet werden. Ein Entschützungsmittel 177 wie Dampfphasen-TCA kann beispielsweise über freiliegende Bereiche des Werkstücks fließen, so dass diese selektiv entschützt werden.
  • Die Vorrichtung umfasst eine Einspannvorrichtung 180 zur Ausrichtung einer Schablone 181, beschichtet mit einem flüssigen Trennmaterial auf dem Werkstück 183, wie gezeigt in 15. Die Einspannvorrichtung verhindert im Wesentlichen, dass das flüssige Trennmaterial auf nicht ausgewählte Zellbereiche des Werkstücks verschmiert. Wie gezeigt umfasst die Einspannvorrichtung unter anderem einen Werkstückhalter 184, eine Schablonenhalterung 185 und Gleitflächen 186. Die Schablonenhalterung umfasst unter anderem eine Dichtung 187, eine SchabIonenhalterung 188, die Schablonenmaske 181, einen Spacer 189 und Gleitflächen 186.
  • Zur Ausrichtung der beschichteten Schablone auf dem Werkstück wird die beschichtete Schablone fest auf den Schablonenhalter der Schablonenhalterung gedrückt. Die Schablonenhalterung wird dann in eine Vertiefung 191 des Werkstückhalters eingeführt. Die beschichtete Schablone wird fest an die Oberfläche des Werkstücks angedrückt. Die Toleranz zwischen den Gleitflächen ist etwa 1,0 μm bis 10,0 μm und vorzugsweise etwa 2,5 μm. Der Anziehungsdruck zwischen der Schablone und dem Werkstück reicht von etwa 0,8 gm-Kraft/cm2 bis 50 gm-Kraft/cm2 und ist vorzugsweise etwa 5 gm-Kraft/cm2. Eine Dichtung aus einem Material wie Teflon, Polyisopren, Polymethylmethacrylat und andere ist zwischen dem Spacer und der Schablonenmaskenhalterung angeordnet. Diese Dichtung fängt den Stoß zwischen der Schablone und dem Werkstück ab, so dass sie beim Ausüben von Druck zusammengeschweißt werden.
  • Hierin wird auch eine hochauflösende Schablonenmaske zum kontaktlosen Ionenstrahldruck, zur Innenstrahl-Projektionslithographie und dergleichen offenbart. Die hochauflösende Schablonenmaske umfasst beispielsweise eine Siliciummembranmaske, eine Epoxidtrennmaske und andere. Ein weiteres Beispiel einer hochauflösenden Schablonenmaske kann elektrogeformten Nickel umfassen. Eine hochauflösende Schablonenmaske umfasst Merkmale mit einer Größe von etwa 0,5 μm bis 50 μm, jedoch unter etwa 100 μm. Eine hochauflösende Schablonenmaske hat auch eine Dicke von etwa 2 bis 20 μm und ist vorzugsweise etwa 5 μm oder weniger. Ein Beispiel einer solchen Maske wird von Nanostructures, Inc. hergestellt.
  • Die hochauflösende Schablonenmaske haftet durch vorstehend genannte Verfahren an das Werkstück an. Die Schablonenmaske haftet bspw. direkt durch Ansetzen an die Oberfläche des Werkstücks an. Wahlweise kann die Schablonenmaske durch ein Grenzflächenfluid an das Werkstück angebracht werden. Ferner haftet die Schablonenmaske neben anderen Kräften durch den Einsatz elektrostatischer Kräfte an das Werkstück. Die Vorrichtung aus 14 und 15 kann auch zum Anbringen der hochauflösenden Schablone auf das Werkstück verwendet werden. Natürlich hängt der Typ der hochauflösenden Schablonenmaske von der jeweiligen Anwendung ab.
  • Wie oben gemäß dem ersten und dem zweiten Aspekt der Erfindung beschrieben, stellt die Erfindung den Gebrauch von Dampfphasen-Entschützungsmitteln bereit. Die Dampfphasen-Entschützungsmittel können unter anderem bei Niederdruck und Atmosphärendruck eingeführt werden. Der Einsatz solcher Dampfphasen-Entschützungsmittel ermöglicht eine einfache Verarbeitung des Werkstücks mit Linkermolekülen und Trennmaterial.
  • Die Entschützung kann in einem gerichteten Strom Entschützungsmittel bei niedrigem Druck erfolgen. Die Niederdruckentschützung erfolgt, indem zunächst das Werkstück mit Linkermolekülen und Trägermaterial vom Synthesegerät entfernt wird. Das Werkstück wird dann in eine Vakuumkammer überführt, vorzugsweise eine Vakuumkammer mit ausgesprochen geringem Druck. Das Entschützungsmittel wird dann mit einer ausgewählten Geschwindigkeit in die Vakuumkammer eingemischt, so dass die Ausrichtung des Entschützungsmittelstroms begünstigt wird. Vorzugsweise hat die Vakuumkammer einen Druck von etwa 10–5 Torr bis 1 Torr zur Unterstützung der Stromausrichtung. Die Entschützungsmittel können unter anderem bspw. entweder eine 2%-ige Lösung TCA in DCP enthalten, feste TCA und Kombinationen davon. Durch den Einsatz der TCA/DCP-Lösung oder fester TCA reicht der Dampfdruck von etwa 0,1 mTorr bis 1 Torr zur Begünstigung eines gerichteten Stroms Entschützungsmittel.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgen die Entschützungsschritte bei Atmosphärendruck. Dabei wird das Werkstück bei Atmosphärendruck und vorzugsweise bei Raumtemperatur über eine Lösung Entschützungsmittel gehalten. Ein Beispiel eines Entschützungsmittels ist TCA, DOP und dergleichen sowie Kombinationen davon. Die TCA kann mit DOP zu einer 2%-igen Lösung gemischt werden. Wahlweise kann TCA in Reinform bei Raumtemperatur eingesetzt werden oder bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20°C bis 50°C und vorzugsweise bei etwa 20°C. Das Werkstück wird für etwa 1 Minute oder weniger über die TCA-Typ-Entschützungsmittel gehalten. Die TCA kann auch durch erzwungene Konvektion und dergleichen gegen das Werkstück geblasen werden und selbst mit Wasserdampf, einem Trägergas oder dergleichen gemischt werden.
  • Ein Vorteil des Dampfphasen-Entschützungsmittels, selbst bei Atmosphärendruck, ist, dass keine mechanischen Handlungen erfolgen, die das physikalische Trennmustermaterial beschädigen könnten. Ein weiterer Vorteil des Dampfphasen-Entschützungsmittels ist sein einfacher Gebrauch mit ausgewählten Werkstücken.
  • Beispiele
  • 1. Einsatz von Lack-Trennmaterial
  • Es wurde ein Versuch mit einem gewöhnlichen derivatisierten 2 × 3 Inch Objektglas durchgeführt. Es wurde ein ABI-Synthetisator, Modell-392, verwendet zum Aufbringen von PEG-Linker-CC–DMT(Linkerschicht-2 Polymereinheiten-Schutzgruppe) auf eine Seite des Objektglases. Das Objektglas, auch Werkstück genannt, wurde dann zum Aufbringen eines Trennmaterials aus der Reaktionskammer des Synthetisators heraus genommen.
  • Zum Auffinden eines geeigneten Trennmaterials wurden Proben der in Frage kommenden Materialien mit einem feinen Farbpinsel auf die Linkerschicht aufgebracht. Der feine Farbpinsel erzeugte Kennzeichen aus dem Trennmaterial bis hinunter auf etwa 100 μm. Man ließ das Trennmaterial an der Luft trocknen, üblicherweise bei Raumtemperatur. Vorgesehen ist, dass das Trennmaterial über den ausgewählten Bereichen der Linkerschicht einen Einschluss bildet. Die Bereiche außerhalb der ausgewählten Bereiche blieben zur Weiterbearbeitung wie durch einen Entschützungsschritt und einer weiteren Synthese freigelegt.
  • In diesem Versuch wurde ein Lack, bekannt als Pactra-63-1 als wirksames Trennmaterial ausgemacht. Mit einem feinen Pinsel wurde der Lack als im Durchmesser etwa 0,1 mm bis 1 mm große Tröpfchen auf die Linkerschicht aufgebracht. Der Lack wurde vor der anschließenden Weiterverarbeitung mehrere Stunden bei Raumtemperatur getrocknet.
  • Dem Aufbringen des Trennmaterials folgte ein Entschützungsschritt. In diesem Versuch wurde das Werkstück in eine Entschützungslosung eingetaucht, so dass die Schutzgruppen von der Linkerschicht entfernt wurden.
  • Nach dem Entschützen wurde das Trennmaterial gestrippt. In diesem Versuch erfolgte das Strippen durch den Einsatz von Aceton, das vorsichtig über den Lack gestrichen wurde. Der Gebrauch von Aceton in diesem Verfahren beeinflusste nicht die nachfolgenden Kopplungsverfahren.
  • Nach dem Strippen wurde das Werkstück zurück in die Reaktionskammer des Synthetisators gebracht. In der Reaktionskammer wurde das Werkstück mit einer Fluoreszenzgrundierung gekoppelt. Nach dem Entfernen aus der Reaktionskammer wurde das Werkstücks etwa 5 bis 10 Minuten in eine Lösung aus Ethylendiamin/Ammoniak eingetaucht.
  • Das Werkstück wurde dann unter ein konfokales Fluoreszenzscanmikroskop gelegt und untersucht. Die entschützten Bereiche fluoreszierten stark und die erfolgreich abgeschirmten Bereiche (oder ausgewählten Bereiche) des Trennmaterials fluoreszierten nicht. Der Versuch zeigt die Wirksamkeit des Lack-Trennmaterials.
  • Um den Versuch richtig zu kontrollieren, wurden Versuchs- und Kontrollgruppen synthetisiert und untersucht, wie gezeigt in Tabelle 1.
    # TYP VERFAHREN ERGEBNIS
    1 Kontrolle Aufbringen des Trennmusters, Strippen und Scannen Keine Fluoreszenz
    2 Kontrolle Aufbringen des Trennmusters, Strippen, Fluoreszenzgrundierung und Scannen Volle Fluoreszenz
    3 Probe Aufbringen des Trennmusters, Strippen, Entschützen, Fluoreszenzgrundierung und Scannen Selektive Fluoreszenz
    Tabelle 1: Beispiel- und Kontrollgruppen für den Trennmaterial-Bildungsversuch
  • 16 zeigt das Photo einer Fluoreszenzdarstellung des fluoreszenzgrundierten Werkstücks, das durch einen Lack selektiv von der Flüssigkeitsentschützung abgeschirmt wurde. Das Photo 200 zeigt ein Werkstück 202 mit freiliegenden Bereichen 204 und geschützten Bereichen 205. Wie in Tabelle 1 gezeigt, schirmt die Trennmaterialschicht, die den Lack enthält, die Schutzgruppen wirksam vor einer Entschützung ab. Das Kontrastverhältnis zwischen den freiliegende und den geschützten Bereichen 205 ist etwa 20:1.
  • Aus diesem Versuch ist ersichtlich, dass mindestens ein Materialtyp wie der Lack als wirksames Trennmaterial zur vollständigen Entschützung und zum vollständigen Schutz verwendet werden kann. Das Lack-Trennmaterial ist leicht aufzubringen und trocknet bei Raumtemperatur. Es ist auch ersichtlich, dass mindestens ein Materialtyp wie Aceton den Lack wirksam von der Linkerschicht strippen kann, das Kopplungsverfahren jedoch nicht beeinträchtigt.
  • 2. Einsatz der Dampfphasen-Entschützung
  • Es wurde auf einem gewöhnlichen Werkstück eine Dampfphasen-Entschützung ausgeführt. Das Werkstück war ein gewöhnliches 2 × 3 Inch derivatisiertes Objektglas. Es wurde ein ABI-Synthetisator, Modell-392, zum Aufbringen von PEG-Linker-CC-DMT (Linkerschicht-2 Polymereinheiten-Schutzgruppe) auf einer Seite des Objektglases verwendet. Das Objektglas, auch als Werkstück genannt, war wie zuvor fluoreszenzgrundiert. Die Versuche wurden mit einer Vielfalt ausgewählter Trennmaterialien und Entschützungsmitteldrücken, wie nachstehend aufgeführt, durchgeführt.
  • A. Niederdruck-Entschützung
  • Um die Grundsätze der Niederdruck-Entschützung darzulegen, führte man einen Versuch durch, wobei ein Entschützungsmittel im Vakuum auf das fluoreszenzgrundierte Werkstück aufgebracht wurde. In diesem Versuch wurde das Werkstück von dem Synthetisator entfernt und in eine Vakuumkammer gelegt. Das Entschützungsmittel wurde bei ausgewähltem Druck, gemessen mit einem Unterdruckmanometer, durch ein Dosierventil eingemischt. Das Unterdruckmanometer zeigte Drücke von etwa 0,1 Millitorr bis 1 Torr an. Bei diesen Drücken sollte der Entschützungsmittelstrom im Wesentlichen ausgerichtet sein. Es wurden in diesem Versuch zwei Arten Entschützungsmittel, wie nachstehend aufgeführt, verwendet.
    # VERFAHREN ERGEBNIS
    1 Aufbringen einer 2%-igen Lösung TCA in DOP bei einem Druck von etwa 0,1 mTorr bis 1 Torr. Entschützung teilweise abgeschlossen.
    2 Aufbringen dampfförmiger TCA auf feste TCA bei einem Druck von etwa 0,1 mTorr bis 1 Torr. Entschützung teilweise abgeschlossen.
    Tabelle 2: Niederdruck-Entschützungsversuche
  • Aus Tabelle 2 wird deutlich, dass das Aufbringen der Entschützungsmittel bei niedrigem Druck zumindest zur teilweisen Entschützung von den Entschützungsmitteln führte. Ein Vorteil des Gebrauchs der Entschützungsmittel bei niedrigem Druck ist die Ausrichtung des Stroms der Entschützungsmittel. Durch Regeln der Ausrichtung der Entschützungsmittel können mechanische Abdeckungen wie Schablonenmasken als Abtrennung für nachfolgende Bearbeitung verwendet werden, ohne in (engem) Kontakt mit dem Werkstück zu sein.
  • B. Atmosphärendruck-Gasphasen-Entschützung
  • Es erfolgte auch ein Versuch, worin die Entschützungsmittel bei Atmosphärendruck dem Werkstück zugeführt wurden. Die Werkstücke wurden wie in vorstehendem Versuch bei niedrigem Druck vorbereitet. Es wurde ein Lack, bekannt als Pactra-63-1 in Form von etwa 0,1 mm bis 1 mm großen Tröpfchen auf die Linkermolekülschicht jedes der Werkstücke aufgebracht. Vor der wieteren Bearbeitung wurde der Lack mehrere Stunden bei Raumtemperatur getrocknet. Die Werkstücke wurden dann verschiedenen Entschützungsschritten ausgesetzt, wie in Tabelle 3 gezeigt.
    # VERFAHREN ERGEBNIS
    1 Halten des Werkstücks etwa 60 Sek. über ein Testrohr mit einer Lösung aus etwa 2% TCA/DCP. Vollständige Entschützung unter den Lacktröpfchen und ansonsten teilweise Entschützung.
    2 Halten des Werkstücks etwa 60 Sek.bei etwa 20°Cüber ein Gefäß mit fester TCA. Vollständige Entschützung unter den Lacktröpfchen und vollständige Entschützung anderswo.
    3 Halten des Werkstücks etwa 60 Sek.über ein Gefäß mit fester, auf etwa 70°C er-wärmter TCA. Teilweise Entschützung unter den Lacktröpfchen und vollständige Entschützung anderswo. Die Lacktröpfchen hielten der heißen TCA nicht stand, die dem Anschein nach auf dem Werkstück kondensierte.
    Tabelle 3: Atmosphärendruck-Entschützungsversuche
  • Alle Proben 1, 2 und 3 wurden nach dem Entschützen fluoreszenzgrundiert und gescannt, um die Wirksamkeit der Entschützungsmittel zu ermitteln. Von den Beispielen der Tabelle 3 zeigt das Verfahren nach Probe 2 Ergebnisse, die am wirksamsten erscheinen. Die Entschützung bei Raumtemperatur (etwa 20°C) bei Gebrauch von fester TCA lieferte den vollständigen Schutz unter den Lacktröpfchen und ansonsten eine vollständige Entschützung, eindeutig gefragte Ergebnisse.
  • C. Atmosphärendruck-Entschützung mit flüssigen Trennmaterialien
  • Es wurde auch eine Atmosphären-Entschützung durchgeführt, wobei eine Vielfalt verschiedener Trennmaterialien eingesetzt wurden. Diese Trennmaterialien umfassten ein Epoxid wie West-105 (ein ungehärtetes Epoxyharz), ein Rotationspumpenöl wie Mowioc-MC-110, ein Siliconöl wie Dow-Corning-704 und einen Polyester wie TAP-SB. Die Werkstücke wurden wie zuvor beschrieben hergestellt und die Versuche mit dem festen TCA- Entschützungsmittel bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Proben wurden für eine Dauer von etwa 20 bis 60 Sekunden über die feste TCA gehalten. Alle Flüssigkeiten dienten scheinbar als wirksame Trennschicht, d. h., die Bereiche unter der Flüssigkeit wurden geschützt. Das West-105-Epoxid schien die besten Ergebnisse zu liefern, indem es die schärfsten Kanten aufwies, und wurde daher für nachfolgende hierin beschriebene Versuche ausgewählt.
  • 17 zeigt ein Photo mit Tröpfchen aus nicht-gehärtetem Epoxid und Pumpenöl, die ein Werkstück bedecken. Das Photo 300 zeigt ein Werkstück 302 mit freiliegenden Bereich 304 und geschützten Bereichen 306, 308. Wie gezeigt umfassen die geschützten Bereiche aufgemalte Flecken nicht-geschützten Epoxids 306 (die Flecken auf der linken Seite der gestrichelten Linie) und Flecken Vakuumpumpenöl 308 (die Flecken auf der rechten Seite der gepunkteten Linie). Auf dem Photo schienen die Flecken nicht-gehärteten Epoxids schärfere Kanten zu haben als die Vakuumpumpenölflecken. Das Kontrastverhältnis des nicht-gehärteten Epoxids war etwa 20:1.
  • D. Atmosphärendruck-Entschützung mit lokaler Selektivität
  • Es wurden Versuche durchgeführt, wobei die Vorrichtung aus 14 eingesetzt wurde und eine Flüssigkeitsgrenzschicht zwischen einem Werkstück und einer Schablonenmaske. Die Schablonenmaske war elektrogeformtes Nickel und gleichmäßig mit einer Schicht flüssigem Trennmaterial wie einem Epoxid oder einem Polyester beschichtet. In diesem Versuch wurde die Flüssigkeit hergestellt, indem das West-105-Epoxidmaterial in Aceton aufgelöst wurde. Eine Lösung aus 0,1 ml Epoxid in 10 ml Aceton wurde über eine Sonotek-Ultraschall-Spraydüse auf das Objektglas aufgebracht. Das Objektglas wurde dann bei etwa 3000 Umdrehungen pro Minute rotiert, so dass die Oberfläche mit der Lösung senkrecht zur Umdrehungsachse war. Selbstverständlich hängt die Rotationsgeschwindigkeit und -dauer von der gewünschten Dicke des Films aus zurückbleibender Lösung ab. Das Objektglas wurde dann mit dem Film nach unten auf die Schablonenmaske gelegt. Eine Elektrode von etwa 22 kV auf der Rückseite des Objektglases führte elektrostatische Kraft auf das Werkstück, üblicherweise bei etwa einem Anziehungsdruck von etwa 200 Pa (oder etwa 2 × 10–3 Atmosphären oder 2 g-Kraft/cm2). Das Objektglas wurde dann von der Maske entfernt, welche eine Beschichtung aus Trennmaterial zurückbehielt.
  • Die Ausrichtung der beschichteten Schablonenmaske mit dem Werkstück erfolgte durch Gebrauch der Ausrichtungsvorrichtung aus 15. Die Ausrichtungsvorrichtung brachte die Schablonenmaske mit dem Werkstück zusammen, ohne dass mehr als ein kleiner Teils in Größe einer Zelle verschmierte, üblicherweise etwa 2,5 μm in diesem Versuch. Es wurde eine Maske mit einem 1000 Mesh/Inch (25 μm tiefen) Raster als Schablonenmaske verwendet.
  • 18 zeigt ein SEM-Photo 400 in 1300-facher Vergrößerung eines flüssigen nicht-gehärteten Epoxymusters auf einem Glas-Werkstück (nach Entfernung der Schablonenmaske). Wie gezeigt umfasst das Photo ein Glas-Werkstück 402, ein Rastermuster von nicht-gehärtetem Epoxid 403 und freiliegende Bereiche 404. Die Rastermusterlinien sind im Querverlauf etwa 7 μm. Das Photo zeigt die Genauigkeit der vorstehend beschriebenen Vorrichtung zum Aufbringen eines Epoxidtrennmaterials auf eine Werkstückoberfläche ohne Verschmieren.
  • 19 zeigt ein Photo 500 einer Probe mit 100 μm Auflösung. Das Photo 500 zeigt ein Werkstück 502 mit freiliegenden Bereichen 504 und geschützten Bereichen 506. Das Werkstück wurde wie zuvor beschrieben hergestellt. Eine Schablonenmaske aus Nickel wurde mit West-105-Epoxid (ein nicht-gehärtetes Epoxidharz) beschichtet und elektrostatisch gegen das Werkstück gehalten. Die Freiräume zwischen den geschützten Bereichen waren alle etwa 100 μm lang, von Innenkante zu Innenkante. Das Kontrastverhältnis zwischen den freiliegenden und geschützten Bereichen betrug etwa 200:1. Das Photo zeigt deutlich die Wirksamkeit von vorliegender Vorrichtung und West-105-Epoxid. Zu beachten ist, dass der halbbogenförmige Bereich 508 auf West-105-Epoxid zurückzuführen ist, das mit einem feinen Farbpinsel aufgetragen wurde.
  • 20 zeigt das Photo einer Probe in 75 um Auflösung. Das Photo 600 zeigt ein Werkstück 602 mit freiliegenden Bereichen 604 und geschützten Bereichen 606. Das Werkstück wurde wie zuvor hergestellt. Es wurde eine Schablonenmaske aus Nickel mit West-105-Epoxid (ein nicht-gehärtetes Epoxidharz) beschichtet und elektrostatisch gegen das Werkstück gehalten. Die Freiräume zwischen den geschützten Bereichen waren alle etwa 75 μm lang, von Innenkante zu Innenkante. Die Breite der Stränge betrug etwa 25 μm. Das Kontrastverhältnis zwischen den freiliegenden und geschützten Bereichen war geringer als das in 19. Mit dem Anbringen noch schmalerer Stränge an das Werkstück verringerte sich das Kontrastverhältnis zwischen den freiliegenden und geschützten Bereichen. Das Photo 600 zeigt ein Kontrastverhältnis von etwa 4:1 bis etwa 2:1.
  • E. Atmosphärendruck-Entschützungs-Siliciummembranmaske
  • Es wurde ein Versuch mit hochauflösenden Siliciumschablonenmasken durchgeführt, hergestellt durch kontaktlosen Ionenstrahldruck und Innenstrahl-Projektionslithographie. Es wurde eine Maske von Nanostructures, Inc. verwendet mit einer Membrandicke von etwa 2 bis 4 μm. Die Maske wurde in etwa 3 mm große Öffnungen auf einem Aluminiumrahmen gesetzt. Die Maskenstruktur mit Rahmen wurde elektrostatisch an das Werkstück angebracht, ohne den Gebrauch eines Grenzflächenfluids (wegen des Risikos, dass die empfindliche Membran zerreißt). Das Werkstück wurde, wie vorstehend erwähnt, in oben beschriebener Weise hergestellt. Es erfolgte ein Schritt der Dampfphasen-Entschützung auf dem Werkstück mit der angebrachten Maskenstruktur. Das Werkstück wurde wie in vorstehenden Versuchen fluoreszenzgrundiert und abgetastet. In diesem Versuch waren die Ergebnisse vielversprechend, wie die Photos in 21 und 22 zeigen.
  • 21 zeigt das Photo des Fluoreszenzmusters von der Dampf-Entschützung durch die unbeschichtete Siliciumschablonenmaske. Das Photo 700 umfasst ein Werkstück 702 mit freiliegenden Bereichen 706 und geschützten Bereich 704. Wie festgestellt, waren die geschützten Bereiche durch die Siliciummaske geschützt. Das Fluoreszenz-Kontrastverhältnis überstieg 10:1 für Merkmale von etwa 50 μm, was deutlich wünschenswerte Ergebnisse sind. Es erfolgte kein wesentliches "Unterschneiden" (Reaktion unter der Schablone), vermutlich aufgrund der teilweisen Abtrennung durch Teilchenkontamination.
  • Andere Bereiche litten auch unter Unterschneidung, wie ersichtlich ist aus den relativen Größen der mit Pfeilen gekennzeichneten Merkmale 708 in dem Photo aus 22. Das Unterschneiden an solchen Bereichen wie den mit Pfeilen gekennzeichneten ist vermutlich auf Teilchenkontaminationen zurückzuführen, die einen guten Kontakt verhindern. Natürlich lässt sich dieses Problem zumindest teilweise durch richtige Verfahrenskontrollen und dergleichen beheben.
  • In anderen Versuchen trat weniger Unterschneidung bei kleineren, wie etwa 5 μm oder kleineren, Merkmalen auf. Es wird angenommen, dass kleinere Abmessungen wegen der kleineren Merkmale einen besseren Kontakt zwischen dem Werkstück und der Maskenstruktur hatten. Die kleineren Merkmale sind nachgiebiger, so dass die elektrostatische Kraft zwischen Maske und Werkstückoberfläche besser eine gute Verbindung halten kann.
  • F. Atmosphärendruck-Entschützung mit 105-Epoxyabtrennung
  • Es wurden auch Versuche durchgeführt zur Untersuchung der Maskierungsstärke von 105-Epoxid, hergestellt durch West, gegen die Dampfphasen-Entschützung. Die Werkstückproben wurden, wie oben erwähnt, bis zum Entschützungsschritt wie in vorstehenden Versuchen hergestellt. Ein Film aus 105-Epoxid wurde bis zu einer Dicke von etwa 0,8 +/–0,3 μm (etwa 1 mg auf eine 4 × 4 cm2 Oberfläche) spinbeschichtet. Es wurden dünne Siliciumfragmente in einen Bereich nahe dem Zentrum des Gesichtfelds ge legt und per Hand kleine Markierungen in der Nähe davon eingeritzt, so dass ein nicht-maskierter Bereich entstand. Die Bereiche unter der Siliciumschicht wurden vollständig abgedeckt, die markierten Bereiche blieben ganz ungeschützt und die freiliegenden Bereiche des Epoxyfilms standen in Frage. Nach dem Anordnen dieser Bereiche wurde das Werkstück vor dem Dampfphasen-Entschützungsschritt etwa 24 Stunden in einem Exsikkator getrocknet.
  • Es erfolgte ein Dampfphasen-Entschützungsschritt auf dem oben beschriebenen Probewerkstück. Die Probe wurde dann abgetastet.
  • Die Fluoreszenz-Zählrate ist in nachstehender Tabelle 4 für alle Bereiche gezeigt.
    # BEREICH FLUORESZENZ-ZÄHLRATE
    1 Bereich mit freiliegendem 105-Epoxid auf dem Werkstück. etwa 390 bis 490
    2 Bereich, in dem Siliciumfragmente das 105-Epoxid bedecken. etwa 330 bis 390
    3 Bereich, in dem das 105-Epoxid eingekerbt wurde, so dass nicht-geschützte Flächen entstehen. etwa 1530 bis 1630
    Tabelle 4: Fluoreszenz-Zählrate von 105-Epoxid-Proben
  • Tabelle 4 zeigt, dass ein dünner Epoxidfilm bspw. mindestens etwa 75 der Entschützungswirkung hemmt. Weitere Versuche mögen erforderlich sein,. so dass man stärkere Kontraste zwischen geschützten und ungeschützten Bereichen erzielt.
  • Es wurde ein weiterer Versuch durchgeführt, wobei ein feines Rastermuster aus 105-Epoxid auf ein Werkstück aufgebracht wurde. Das Werkstück wurde bis zum Entschützungsschritt durch ein dem oben beschriebenen ähnliches Verfahren hergestellt. Es wurde ein feines, deutliches Epoxid-Rastermuster mit 25 μm Halbabstand auf einen Mittelbereich des Werkstücks aufgebracht. Außerhalb des Mittelbereichs wurde kein Epoxid aufgebracht. Zusätzliche Streifen (runter bis etwa 25 μm) Epoxid wurden mit einem ultradünnen Farbpinsel aufgetragen.
  • Nach etwa 24 Stunden Lufttrocknen in einem Exsikkator wurde das Werkstück einem Dampfphasen-Entschützungsschritt unterzogen. Die gescannte Fluoreszenzdarstellung war einheitlich hell, außer im Mittelbereich, der durch das Epoxidmuster abgedeckt war. In dem abgedeckten Bereich war das Rastermuster sichtbar, der Kontrast und die Helligkeit waren jedoch gering. Die Signalstärke in den normalerweise freien Bereichen des Rastermusters war wesentlich geringer als in den Bereichen, die mehr als etwa 100 μm vom Epoxidmuster entfernt lagen. Demnach scheint es, als hemme das West-105-Material die Entschützung innerhalb eines Umkreises von etwa 100 μm.
  • Es wurden weitere Versuche durchgeführt, wobei dünnere Markierungen des 105-Epoxids, einer Epoxidfarbe (TAP "Copon" klar), einem Polyesterharz (TAP-Kunststoffe) und einem Dow-Corning-704-Silikonöl gebraucht wurden. Bei geringer Vergrößerung waren die Ergebnisse wie zuvor, d. h. die Fluoreszenzdarstellung der Ölmarkierungen waren unscharf, aber die Polyester- und Epoxidsubstanzen waren in Ordnung. Bei hoher Auflösung (einer Auflösung von etwa 100 μm oder weniger) zeigte das 105-Epoxid jedoch weniger scharfe Kanten als sowohl die Epoxyfarben- als auch die Polyestermarkierungen. Insbesondere die Epoxyfarbmuster zeigten eine 1 μm Pixelgröße auf dem Scanner und wurden daher als bevorzugtes Trennmaterial bestimmt.
  • G. Atmosphärendruck-Entschützung mit TAP-"Copon"-Klarlack
  • Bei dem Versuch mit der Epoxyfarbe wurden Druckmuster aus TAP-"Copon"-Klarlack gebildet, indem eine Lösung aus 1:4 (Lack:Sprühverdünner) auf ein 500 Mesh/Inch Nickelraster (Buckbee Mears) gestrichen wurde. Das Raster mit dem frischen Lack wurde dann elektrostatisch an das Werkstück angekoppelt, wobei das Farbmuster auf die Oberfläche des Werkstücks übertragen wurde. Das Raster wurde dann von der Oberfläche des Werkstücks entfernt und hinterließ ein Farbmuster.
  • 23 zeigt das Photo 800 des vom Nickelraster übertragenen Farbmusters. Das Photo 800 umfasst ein Werkstück 802 mit einem Epoxyfarbmuster 804 und freiliegenden Bereichen 806. Der Abstand in den freiliegenden Bereichen ist bei allen etwa 25 μm und das Muster umfasst Stränge, jeweils mit einer Breite von etwa 20 μm. Diese Druckart ist ein Beispiel für hochauflösenden Gravüredruck, wie vorstehend beschrieben. Das übertragene Farbmuster diente bei den nachfolgenden Entschützungsschritten als Trennmaterial. Wie gezeigt waren die Farbmuster scharf (und feinlinig), so dass eine wirksame Abdeckung zum Drucken eines Trennmusters entstand, mit dem verschiedene Oligonucleotid-Anordnungen erreicht werden können.
  • 24 und 25 zeigen Photos von Fluoreszenzdarstellungen nach der Dampfphasen-Entschützung durch ein Epoxymuster, ähnlich zu denen, die in dem Photo von 23 gezeigt sind. Beide Photos zeigen gute Kontrastverhältnisse zwischen den freiliegenden und den geschützten Bereichen. Die Photos zeigen keine sichtbare Wirkung in der unmittelbaren Umgebung und das Kontrastverhältnis übersteigt 10:1, was deutlich wünschenswerte Ergebnisse sind.
  • 3. Hybridisierungsbeispiele
  • Es wurden ausgewählte Versuche durchgeführt, um zu zeigen, das vorstehende Verfahren bei Synthese von Oligonucleotiden wirksam sind. Es wurden 2 × 2 Reihen Oligonucleotide auf Trägern 1002 hergestellt, wobei Siliciumfragmente (Teile von Siliciummaterial) eingesetzt wurden, die elektrostatisch als Rohmaske an die Base Nr. 4 (A) und Nr. 5 (T) gekoppelt wurden. 26 zeigt eine 2 × 2 Anordnung 1000 Oligonucleotide, gebildet durch Ausmaskieren der Entschützungsmittel hinter A (Vertikalmaske 1009) und dem ersten T in der Synthese von 3'-CGCATTCCG 1004. Ein 10 nM-Zielmolekül 5'-GCGTAGGC-Fluoreszin wurde bei 15°C in einer Fließzelle der Reihe ausgesetzt, die dann mit einem Scanner abgetastet wurde. Die vier Proben waren 3'-CGCATCCG (Gegenstück) 1005, 3'-CGCTCCG (Deletion) 1006, 3'-CGCTTCCG (Substitution) 1007 und 3'-CGCATTCCG (Addition) 1004.
  • 27 zeigt das Photo eines typischen Fluoreszenzscanergebnisses, das die in den vier Bereichen erhaltenen Zählwerte zeigt. Der Gegenstückbereich ist der am stärksten fluoreszierende, was auf die stärkste Hybridisierung an das Gegenstück und die schwächste an die Deletion hinweist. Die weißen Punkte traten am häufigsten im Gegenstückbereich auf, was eine Eigenart aller Versuche mit diesem speziellen Zielmolekül war. Andere Proben wurden mit einem frisch hergestellten Zieloligo hybridisiert, und es wurden bessere Ergebnisse erhalten (wie in 28), die weiter verstärkt wurden durch 15 Minuten Hybridisieren bei 10°C und anschließendem Scannen bei 15°C. Die Zählergebnisse in dem Gegenstückbereich 105 waren mehr als doppelt so hoch mit einem nur leichten Anstieg in den Nicht-Gegenstückbereichen, wie gezeigt in 29.
  • Da die Synthese der Proben, mit Ausnahme der Addition, zur maskierten Entschützung zumindest ein Entfernen vom Synthetisator umfasste, wurden Kontrollversuche durchgeführt, bei denen die anderen drei Proben als fortlaufende Sequenzen auf der Rückseite von drei getrennten Trägern gebildet wurden. Diese Sequenzen wurden hybridisiert und gescannt, um festzustellen, ob wesentliche Unterschiede in den Zählergebnisse vorliegen bei denen, die fortlaufend auf der Rückseite entstehen konnten, und denen, die auf der Vorderseite durch Einsatz der Maskierung ausgebildet wurden. Es wurde kein wesentlicher Unterschied zu denen festgestellt, die auf der Vorderseite unter Verwendung der Maskierung entstanden. Daher nehmen wir an, dass ein oder zwei Unterbrechungen der maskierten Dampfphasen-Entschützung das Wachstums der Proben nicht wesentlich nachteilig stört.
  • Es wurde eine weitere Untersuchung an einer Reihe 2000 von vier Oligos aus 26 durchgeführt, wobei die Reaktionskammer um den Träger herum bewegt wurde an Base 4 und 5, wie gezeigt in 31, zum direkten Vergleich des Verhaltens einer (einfachen) Reihe, hergestellt mit Dampfphasen-Entschützung an ein oder zwei Basen, durchweg mit der herkömmlichen ABI-Chemie. Die Ergebnisse sind in 28 und 29 gezeigt. Die Ergebnisse waren ähnlich zu denen, die mit der durch Dampfphasen-Entschützung hergestellten Anordnung erzielt wurden, einschließlich der erhöhten Selektivität und dem Signal des Gegenstückbereich nach 15 Minuten Hybridisierung bei 10°C. Daher wurde kein messbarer Unterschied zwischen den mit Dampfphasen-Entschützung gewonnenen Ergebnissen und den auf herkömmliche Weise erhaltenen beobachtet.
  • Während das Vorstehende eine vollständige Beschreibung spezifischer Ausführungsformen darstellt, können auch zahlreiche Modifikationen, alternative Anwendungen und Äquivalente verwendet werden. Während sich die Beschreibung auf die Synthese von Oligonucleotid-Anordnungen bezieht, ist es auch möglich, vorliegende Erfindung auf Peptiden, kleine Moleküle, andere Polymere oder dergleichen anzuwenden. Wahlweise lassen sich die Ausführungsformen auch mit Peptiden, anderen Polymeren oder dergleichen durchführen.
  • Die vorstehende Beschreibung und Zeichnungen beschränken daher den Umfang der Erfindung, der durch angefügte Ansprüche bestimmt ist, in keiner Weise.

Claims (15)

  1. Verfahren zum Ausbilden von Polymeren unterschiedlicher Monomersequenz auf einem Träger, umfassend: das Bereitstellen eines Trägers mit einer Schicht Linkermoleküle darauf, wobei jedes Linkermolekül eine Schutzgruppe trägt; das Anwenden einer Trennschicht über der Schicht Linkermoleküle, wobei in dem Anwendschritt ausgewählte freiliegende Bereiche in der Schicht Linkermoleküle hergestellt werden; Aussetzen ausgewählter freiliegender Bereiche der Schicht Linkermoleküle einem Entschützungsmittel ausschließlich in der Dampfphase für ein Entfernen der Schutzgruppe; und Ankoppeln ausgewählter Monomere zur Herstellung ausgewählter Polymere auf dem Träger; wobei das Entschützungsmittel ein Säuredampf ist, ausgewählt aus der Gruppe Trichloressigsäure, Dichloressigsäure und Salzsäure und eine Temperatur von 20°C bis 50°C besitzt; und wobei das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe Polynucleotide und Oligonucleotide.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Anwendschritt ausgewählt ist aus einer Gruppe Prägedruck, Hochdruck, Gravüredruck, Tiefdruck, Schablonendruck, Lithographie, Xerographie, Tintenstrahldruck und Tröpfchenstrahldruck.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Anwendschritt ausgewählt ist aus einer Gruppe Schablonendruck und Lithographie.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Trennschicht ausgewählt ist aus einer Gruppe Lack, Epoxy, Öl, Polyester, Polyurethan, Siliconöl und Siliciummaterial.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Trennschicht eine Flüssigkeit ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Entschützungsmittel ein Trägergas enthält.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Entschützungsmittel Wasserdampf enthält.
  8. Verfahren zum Ausbilden von Polymeren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Entschützen bei Atmosphärendruck erfolgt.
  9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, wobei das Entschützen bei einem Druck im Bereich von etwa 10–5 mm Hg bis etwa 1 mm Hg erfolgt.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Entschützungsmittel mit einem Trägergas gemischt wird.
  11. Verfahren zur Synthese einer Aminosäure oder eines Polynucleotids, beinhaltend die Schritte: a) Bereitstellen eines Oligonucleotides mit einem proximalen und einem distalen Ende, wobei das proximale Ende an einen Träger mit einer Oberfläche gekoppelt ist und das distale Ende eine entfernbare Schutzgruppe trägt; b) Entfernen der Schutzgruppe mit einem Entschützungsmittel ausschließlich in der Dampfphase für ein Freilegen einer funktionellen Gruppe; und c) kovalentes Binden eines Oligonucleotides an die freigelegte funktionelle Gruppe; wobei die Oberfläche des Trägers beim Entfernungsschritt durch eine Maske gezielt geschützt sind; und wobei das Dampfphasen-Entschützungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe Trichloressigsäure, Dichloressigsäure und Salzsäure und es eine Temperatur von 20°C bis 50°C besitzt.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Oligonucleotid aus Schritt c) ein proximales Ende und ein distales Ende besitzt und das distale Ende eine entfernbare Schutzgruppe aufweist und wobei das Verfahren weiter beinhaltet die Wiederholung der Schritte b) und c).
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei in Schritt a) eine Anzahl Oligonucleotide an den Träger gekoppelt wird für die Ausbildung einer Anordnung.
  14. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Maske ausgewählt ist aus der Gruppe Epoxy, Siliconöl, Metall, Siliciummaterial, Lack, Öl und Polyester.
  15. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Maske durch elektrostatische Kräfte am Platz gehalten wird.
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