DE69535317T2

DE69535317T2 - Aus nematoden extrahierte serinprotease-inhibitoren und die koagulation hemmende proteine

Info

Publication number: DE69535317T2
Application number: DE69535317T
Authority: DE
Inventors: Phillip George Carlsbad VLASUK; Eric Patrick STANSSENS; Hilda Joris MESSENS; Josef Marc LAUWEREYS; Rene Yves LAROCHE; Stephane Laurent JESPERS; Georges Yannick GANSEMANS; Matthew Escondido MOYLE; W. Peter San Diego BERGUM
Original assignee: Dendreon Corp
Current assignee: Dendreon Corp
Priority date: 1994-10-18
Filing date: 1995-10-17
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2015-10-18
Also published as: JP2007145851A; JP3811186B2; US6121435A; US6534629B1; EP0788546B1; HUT77431A; HU225126B1; NZ296648A; PL319782A1; US6096877A; US6090916A; EP1772516A1; US6046318A; EP0788546A1; WO1996012021A3; JP2006117675A; EP0788546B9; DE69535317D1; JP4101833B2; AU4130796A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft spezielle Proteine sowie rekombinante Versionen dieser Proteine, die Serinprotease-Inhibitoren einschließlich potenter Antikoagulantien in menschlichem Plasma sind. Zu diesen Proteinen gehören bestimmte Proteine, die aus Nematoden extrahiert sind. Die vorliegende Erfindung betrifft gemäß einem anderen Aspekt Zusammensetzungen, die diese Proteine enthalten, die als potente und spezifische Inhibitoren von Blutkoagulationsenzymen in vitro und in vivo brauchbar sind, und Verfahren zu ihrer Verwendung als in vitro-Diagnostika oder als in vivo-Therapeutika, um das Gerinnen von Blut zu verhindern. Die Erfindung betrifft gemäß einem weiteren Aspekt Nukleinsäuresequenzen einschließlich mRNA und DNA, die die Proteine kodieren, und ihre Verwendung in Vektoren zum Transfektizieren oder Transformieren von Wirtszellen und als Sonden, um bestimmte verwandte Gene in anderen Spezies und Organismen zu isolieren.
HINTERGRUND UND EINFÜHRUNG IN DIE ERFINDUNG
Normale Hämostase ist das Ergebnis eines empfindlichen Gleichgewichts zwischen den Prozessen der Gerinnselbildung (Blutkoagulation) und Gerinnselauflösung (Fibrinolyse). Die komplexen Interaktionen zwischen Blutzellen, spezifischen Plasmaproteinen und der Gefäßoberfläche halten die Fließfähigkeit des Blutes aufrecht, bis es zu einer Verletzung kommt. Eine Beschädigung der Endothelialbarriere, die die Gefäßwand auskleidet, setzt darunter befindliches Gewebe diesen Blutkomponenten aus. Dies triggert wiederum eine Reihe biochemischer Reaktionen, die das hämostatische Gleichgewicht zu Gunsten der Blutkoagulation ändern, was entweder zu der gewünschten Bildung eines hämostatischen Pfropfens führen kann, der den Blutverlust begrenzt, oder zur unerwünschten Bildung eines okklu siven intravaskulären Thrombus, der zu verringertem oder vollständigem Fehlen von Blutfluss zu dem betroffenen Organ führt.
Die Blutkoagulierungsreaktion ist der Höhepunkt einer Reihe von verstärkten Reaktionen, bei denen mehrere spezifische Zymogene von Serinproteasen in Plasma durch begrenzte Proteolyse aktiviert werden. Diese Reihe von Reaktionen führt zur Bildung einer unlöslichen Matrix, die aus Fibrin und zellulären Komponenten zusammengesetzt ist, die zur Stabilisierung des primären hämostatischen Pfropfen oder Thrombus erforderlich ist. Die Initiierung und das Voranschreiten der proteolytischen Aktivierungsreaktionen erfolgt über einer Reihe von verstärkten Wegen, die an Membranoberflächen an der Stelle der Gefäßverletzung lokalisiert sind (K.G. Mann, M. E. Nesheim, W. R. Church, P. Haley und S. Krishnaswamy, (1990) Blood 76: 1-16, und J. H. Lawson, M. Kalafatis, S. Stram und K. G. Mann, (1994) J. Biol. Chem. 269: 23357–23366).
Die Initiierung der Blutkoagulationsreaktion auf Gefäßverletzung folgt der Bildung eines katalytischen Komplexes, der aus Serinprotease Faktor VIIa und dem nicht-enzymatischen Cofaktor, Gewebefaktor (TF), zusammengesetzt ist (S. I. Rappaport und L. V. M. Rao (1992) Arteriosclerosis and Thrombosis 12: 1112–1121). Diese Reaktion scheint ausschließlich durch die Einwirkung von subendothelialem TF reguliert zu werden, um nach einem fokalen Zusammenbruch der Integrität des Gefäßes zirkulierende Niveaus des Faktors VIIa und dessen Zymogenfaktor VII aufzuspüren. Autoaktivieren führt zu einem Anstieg der Zahl der Faktor VIIa/TF-Komplexe, die für die Bildung des Serinproteasefaktors Xa verantwortlich sind. Es wird angenommen, dass zusätzlich zu dem Faktor VIIa/TF-Komplex die geringe Menge an Faktor Xa, die gebildet wird, die Koagulierungsreaktion durch die proteolytische Modifikation von Faktor IX zu Faktor IX_α vorbereitet, der wiederum durch den Faktor VIIa/TF-Komplex in den aktiven Serinproteasefaktor IXa_β (K. G. Mann, S. Krishnaswamy und Lawson, J.H. (1992) Sem. Hematology 29: 213-226.). Der Faktor IXa_β im Komplex mit Aktivierungsfaktor VIIIa scheint für die Produktion signifikanter Mengen an Faktor Xa verantwortlich zu sein, der nachfolgend die vorletzte Stufe in der Blutkoagulationskaskade katalysiert; die Bildung von Serinprotease Thrombin.
Faktor Xa katalysiert die Bildung von Thrombin nach dem Zusammenfügen des Prothrombinasekomplexes, der aus Faktor Xa, dem nicht-enzymatischen Cofaktor Va und dem Substrat Prothrombin (Faktor II) zusammengesetzt ist, die in den meisten Fällen auf der Oberfläche aktivierter Thrombozyten zusammengefügt werden, die an der Stelle der Verletzung haften (V. Fuster, L. Badimon, J. J. Badimon und J. H. Chesebro (1992) New Engl. J. Med. 326: 310–318). In den arteriellen Gefäßen führt das resultierende verstärkte "Aufkommen" der Thrombinerzeugung, das durch Prothrombinase katalysiert ist, zu einem hohen lokalen Niveau dieser Protease, die für die Bildung von Fibrin verantwortlich ist, und dem weiteren Anlocken weiterer Thrombozyten sowie der kovalenten Stabilisierung des Pfropfens durch die Aktivierung des Transglutaminase-Zymogenfaktors XIII. Außerdem wird die Koagulierungsreaktion durch die Thrombin-vermittelte proteolytische Rückkopplungsaktivierung der nicht-enzymatischen Cofaktoren V und VIII weitergeführt, was zu mehr Prothrombinasebildung und nachfolgender Thrombinerzeugung führt (H. C. Hemker und H. Kessels, (1991) Haemostasis 21: 189–196).
Substanzen, die den Prozess der Blutkoagulation stören (Antikoagulantien), sind, wie gezeigt wurde, wichtige therapeutische Mittel zur Behandlung und Vorbeugung von thrombotischen Störungen (C. M. Kessler (1991) Chest 99: 975–1125 und J. A. Cairns, J. Hirsh, H. D. Lewis, L. Resnekov und P. Theroux, (1992) Chest 102: 4565–4815). Die derzeit zugelassenen klinischen Antikoagulantien sind mit einer Reihe nachteiligen Wirkungen assoziiert, die mit der relativ unspezifischen Natur ihrer Wirkungen auf die Blutkoagulierungskaskade zusammenhängen (M. N. Levine, J. Hirsh, S. Landefeld und G. Raskob, (1992) Chest 102: 352S–363S). Dies hat die Suche nach wirksameren Antikoagulantien motiviert, die die Aktivität der Koagulationskaskade effektiver steuern können, indem sie selektiv spezifische Reaktionen in diesem Prozess stören, die eine positive Wirkung der Verringerung der Komplikationen der Antikoagulanstherapie haben können (J. Weitz und J. Hirsh, (1993) J. Lab. Clin. Med. 122: 364–373). Gemäß einem anderen Aspekt hat sich diese Suche auf normale menschliche Proteine konzentriert, die als endogene Antikoagulantien zur Steuerung der Aktivität der Blutkoagulationskaskade dienen. Verschiedene hämatophage Organismen sind außerdem wegen ihrer Fähigkeit untersucht worden, die Koagulation der Blutmahlzeit während und nach der Nahrungsaufnahme an ihren Wirten zu verhindern, wodurch nahegelegt wird, dass sie effektive Antikoagulansstrategien entwickelt haben, die als therapeutische Mittel brauchbar sein können.
Ein Plasmaprotein, Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI), enthält drei aufeinanderfolgende Kunitz-Domänen, und es ist berichtet worden, dass es die Enzymaktivität von Faktor Xa direkt inhibiert und in einer Faktor Xa-abhängigen Weise die Enzymaktivität des Faktor VIIa-Gewebefaktor-Komplexes inhibiert. G. Salvensen und S. V. Pizzo, "Proteinase Inhibitors: α-Macroglobulins, Serpins, and Kunis", "Hemostasis and Thrombosis, 3. Auflage, Seiten 251–253, J. B. Lippincott Company (Herausgeber R. W. Colman et al. 1994). Es ist über eine cDNA-Sequenz berichtet worden, die TFPI kodiert, und es wurde berichtet, dass das geklonte Protein ein Molekulargewicht von 31.950 Dalton hat und 276 Aminosäuren enthält. G. J. Broze und T. J. Girad, US-5,106,833, Spalte 1, (1992). Es ist über verschiedene rekombinante Proteine berichtet worden, die von TFPI abgeleitet sind. T. J. Girad und G. J. Broze, EP 439 442 (1991); J. S. Rasmussen und O. J. Nordfand, WO 91/02753 (1991); und G. J. Broze und T. J. Girad, US-5,106,833, Spalte 1, (1992).
Es ist berichtet worden, dass Antistasin, ein Protein, das aus 119 Aminosäuren zusammengesetzt ist und sich in der Speicheldrüse des mexikanischen Blutegels, Haementeria officinalis, befindet, die Enzymaktivität von Faktor Xa inhibiert. Tuszynski et al., J. Biol. Chem, 262:9718 (1987); Nutt et al., J. Biol. Chem, 263:10162 (1988). Ein rekombinantes 6000 Dalton-Protein, das 58 Aminosäuren enthält, mit einem hohen Homologiegrad zu den Aminosäuren 1 bis 58 am Amino-Ende von Antistasin, inhibiert, wie berichtet wurde, die Enzymaktivität des Faktors Xa. J. Tung et al., EP 454 372 (30. Oktober 1991); J. Tung et al., US-5,189,019 (23. Februar 1993).
Tick Anticoagulant Peptid (Zeckenantikoagulanspeptid, TAP), ein aus 60 Aminosäuren zusammengesetztes Protein, das aus der Weichzecke Omithodoros moubata isoliert wurde, inhibiert, wie berichtet wurde, die Enzymaktivität von Faktor Xa, jedoch nicht von Faktor VIIa. L. Waxman et al., Science, 248:593 (1990). Es ist auch über TAP berichtet worden, das nach rekombinanten Verfahren hergestellt wurde. G. P. Vlausk et al., EP 419 099 (1991) und G. P. Vlausk et al., US-5,239,058 (1993).
Der Hakenwurm des Hundes, Ancylostoma caninum, der auch Menschen infizieren kann, enthält, wie berichtet wurde, eine potente Antikoagulanssubstanz, die die Koagulation von Blut in vitro inhibiert. L. Loeb und A. J. Smith, Proc. Pathol. Soc. Philadelphia, 7:173–187 (1904). Es wurde berichtet, dass Extrakte von A. caninum die Prothrombinzeit und partielle Thromboplastinzeit in menschlichem Plasma verlängern, wobei der Antikoagulanseffekt, wie berichtet wurde, auf die Inhibierung von Faktor Xa, jedoch nicht Thrombin zurückzuführen ist. J. J. Spellman Jr., und H. L. Nossel, Am. J. Physiol., 220:922-927 (1971). In neuerer Zeit wurde über lösliche Proteinextrakte von A. caninum berichtet, die die Prothrombinzeit und partielle Thromboplastinzeit in menschlichem Plasma in vitro verlängern. Es wurde berichtet, dass der Antikoagulanseffekt auf die Inhibierung des menschlichen Faktors Xa, jedoch nicht Thrombin zurückzuführen ist, M. Cappello et al., J. Infect. Diseases, 167:1474–1477 (1993), und die Inhibierung von Faktor Xa und Faktor VIIa (WO 94/25000; US-5,427,937).
Der menschliche Hakenwurm, Ancylostoma ceylanicum, enthält Berichte zufolge ebenfalls ein Antikoagulans. Es ist berichtet worden, dass Extrakte von A. ceylanicum die Prothrombinzeit und partielle Thromboplastinzeit in Hunde- und Menschenplasma in vitro verlängern. S. M. Carroll et al., Thromb. Haemostas. (Stuttgart), 51:222–227 (1984).
Es ist berichtet worden, dass lösliche Extrakte des nicht hämatophagen Parasiten Ascaris suum ein Antikoagulans enthal ten. Es wurde berichtet, dass diese Extrakte das Gerinnen des Vollbluts sowie die Gerinnungszeit in dem kaolinaktivierten partiellen Thromboplastinzeittest verlängern, jedoch nicht in dem Prothrombinzeittest. G. P. M. Crawford et al., J. Parasitol., 68: 1044–1047 (1982).
Es wurde berichtet, dass Chymotrypsin/Elastaseinhibitor-1 und seine Hauptisoformen, Trypsininhibitor-1 und Chymotrypsin/Elastaseinhibitor-4, isoliert aus Ascaris suum, Serinproteaseinhibitoren sind und ein gemeinsames Muster von fünf Disulfidbrücken haben. V. D. Bernard und R. J. Peanasky, Arch. Biochem. Biophys., 303:367–376 (1993); K. Huang et al., Structure, 2:679–689 (1994) und B. L. Grasberger et al., Structure, 2:669–678 (1994). Es gab keine Angabe, dass die im Bericht genannten Serinproteaseinhibitoren Antikoagulansaktivität hatten.
Es wurde berichtet, dass Sekretionen des Hakenwurms Necator americanus die Gerinnungszeiten von menschlichem Plasma verlängern, die amidolytische Aktivität von humanem FXa unter Verwendung eines fluorogenen Substrats inhibieren, die Freisetzung von durch mehrere Agonisten induzierte Thrombozytendichten Granula inhibieren und Fibrinogen abbauen. D. I. Pritchard und B. Furmidge, Thromb. Haemost. 73:546 (1995) (WO 95/12615).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Proteine mit Serinprotease inhibierender Aktivität und/oder Antikoagulansaktivität, die mindestens eine NAP-Domäne enthalten. Wir bezeichnen diese Proteine als aus Nematoden extrahierte Antikoagulansproteine oder "NAPs". "NAP-Domäne" bezieht sich auf eine Sequenz des isolierten Proteins oder NAPs, die vermutlich die inhibierende Aktivität aufweist, wie nachfolgend näher definiert wird. Die Antikoagulansaktivität dieser Proteine kann durch ihre Aktivitäten bei der Erhöhung der Gerinnungszeit von menschlichem Plasma bei den Prothrombinzeit- (PT) und aktivierten partiellen Thromboplastinzeit- (aPTT)-Assays sowie ihre Fähigkeit zur Inhibierung der Blutkoagulationsenzyme Faktor Xa oder Faktor VIIa/TF bewertet werden. Es wird angenommen, dass die NAP-Domäne für die beobachtete Antikoagulansaktivität dieser Proteine verantwortlich ist. Einige dieser Proteine haben mindestens eine NAP-Domäne, die eine Aminosäuresequenz ist, die weniger als etwa 120 Aminosäurereste enthält und 10 Cystein-Aminosäurereste einschließt.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen und Isolieren eines cDNA-Moleküls, das ein Protein kodiert, welches Antikoagulansaktivität zeigt und eine NPA-Domäne aufweist, und ein rekombinantes cDNA-Molekül, das nach diesem Verfahren hergestellt ist. Dieses Verfahren beinhaltet die Schritte:

(a) Aufbau einer cDNA-Bibliothek aus einer Nematodenspezies; (b) Ligieren dieser cDNA-Bibliothek in einen geeigneten Klonierungsvektor; (c) Einführen dieses Klonierungsvektors, der diese cDNA-Bibliothek enthält, in eine geeignete Wirtszelle; (d) Kontaktieren der cDNA-Moleküle der Wirtszelle mit einer Lösung, die eine Hybridisierungssonde mit einer Nukleinsäuresequenz enthält, die AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG, [SEQ. ID. Nr. 94] enthält, wobei R A oder G ist, Y T oder C ist und i Inosin ist; (e) Detektieren eines rekombinanten cDNA-Moleküls, das mit dieser Sonde hybridisiert, und (f) Isolieren dieses rekombinanten cDNA-Moleküls. Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, das von dieser cDNA kodiert wird, welches Antikoagulansaktivität hat und eine NAP-Domäne einschließt, und rekombinante Proteine, die nach diesem Verfahren hergestellt sind. Dieses Verfahren umfasst die Schritte: (a) Aufbau einer cDNA-Bibliothek aus einer Nematodenspezies;
(b) Ligieren dieser cDNA-Bibliothek in einen geeigneten Klonierungsvektor; (c) Einführen dieses Klonierungsvektors, der diese cDNA-Bibliothek enthält, in eine geeignete Wirtszelle; (d) Kontaktieren der cDNA-Moleküle der Wirtszelle mit einer Lösung, die eine Hybridisierungssonde mit einer Nukleinsäuresequenz enthält, die AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG enthält, wobei R A oder G ist, Y T oder C ist und i Inosin ist (SEQ. ID. Nr. 94]; (e) Detektieren eines rekombinanten cDNA-Moleküls, das mit der Sonde hybridisiert; (f) Isolieren dieses rekombinanten cDNA-Moleküls; (g) Ligieren der Nukleinsäuresequenz des cDNA-Moleküls, welches das rekombinante Protein kodiert, in einen geeigneten Expressionsklonierungsvektor; (h) Transformieren einer zweiten Wirtszelle mit dem Expressionsklonierungsvektor, der diese Nukleinsäuresequenz dieses cDNA-Moleküls enthält, welche dieses rekombinante Protein kodiert; (i) Kultivieren der transformierten zweiten Wirtszelle und (j) Isolieren des rekombinanten Proteins, das von der zweiten Wirtszelle exprimiert wird. Es sei darauf hingewiesen, dass bei der Beschreibung der Produktion rekombinanter Proteine in bestimmten Expressionssystemen, wie COS-Zellen, der Begriff "Transfektion" konventionell anstelle von (und mitunter austauschbar mit) "Transformation" verwendet wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft gemäß einem anderen Aspekt ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten cDNA, die ein rekombinantes Protein mit Antikoagulansaktivität kodiert und eine NAP-Domäne aufweist, umfassend die Schritte:

(a) Isolieren einer cDNA-Bibliothek aus einer Nematode;
(b) Ligieren der cDNA-Bibliothek in einen Klonierungsvektor;
(c) Einführen dieses Klonierungsvektors, der diese cDNA-Bibliothek enthält, in eine Wirtszelle; (d) Kontaktieren der cDNA-Moleküle der Wirtszellen mit einer Lösung, die erste und zweite Hybridisierungssonden enthält, wobei die erste Hybridisierungssonde die Nukleinsäuresequenz hat, die AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GAC TGT GGA ACT CAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AAT GAG GAA CCC CCT GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGC TCA CGT GGT TGT TTA TTA CCT CCT GCT TGC GTA TGC AAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AGG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [SEQ. ID. Nr. 1], enthält und die zweite Hybridisierungssonde die Nukleinsäuresequenz hat, die AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GTC TGT GGA ACT AAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AGT GAG GAA GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGA TCA TTT TCT TGT CCG GGT CCC GCT GCT TGC GTA TGC GAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AAG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [SEQ. ID. Nr. 2] enthält;
(e) Detektieren eines rekombinanten cDNA-Moleküls, das mit der Mischung der Sonden hybridisiert, und (6) Isolieren dieses rekombinanten cDNA-Moleküls. Die vorliegende Erfindung betrifft gemäß einem anderen Aspekt ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten cDNA, die ein Protein mit Antikoagulansaktivität kodiert und eine NAP-Domäne aufweist, umfassend die Schritte: (a) Isolieren einer cDNA-Bibliothek aus einer Nematode; (b) Ligieren dieser cDNA-Bibliothek in einen geeigneten Phagemid-Expressionsklonierungsvektor; (c) Transformieren von Wirtszellen mit diesem Vektor, der diese cDNA-Bibliothek enthält; (d) Kultivieren der Wirtszellen; (e) Infizieren dieser Wirtszellen mit einem Helfer-Phagen;
(f) Trennen der Phagen, die diese cDNA-Bibliothek enthalten, von den Wirtszellen; (g) Kombinieren einer Lösung der Phagen, die diese cDNA-Bibliothek enthalten, mit einer Lösung von biotinyliertem Humanfaktor Xa; (h) Kontaktieren einer mit Streptavidin beschichteten festen Phase mit der Lösung, die die Phagen, die diese cDNA-Bibliothek enthalten, und den biotinylierten Humanfaktor Xa enthalten; (i) Isolieren von Phagen, die an die mit Streptavidin beschichtete feste Phase binden, und (j) Isolieren des rekombinanten cDNA-Moleküls von Phagen, die an die mit Streptavidin beschichtete feste Phase binden.

Gemäß einem bevorzugten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine rekombinante cDNA mit einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus den Nukleinsäuresequenzen, die in 1, 3, 7A bis 7F, 9, 13A bis 13H und 14 gezeigt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch NAPs, die die katalytische Aktivität von FXa inhibieren, NAPs, die die katalytische Aktivität des FVIIa/TF-Komplexes inhibieren, und NAPs, die die katalytische Aktivität einer Serinprotease inhibieren, sowie Nukleinsäuren, die diese NAPs kodieren, und Verfahren zu ihrer Verwendung.
DEFINITIONEN
Der Begriff "Aminosäure" bezieht sich auf die natürlichen L-Aminosäuren; D-Aminosäuren sind in dem Maße eingeschlossen, in dem ein Protein, welches diese D-Aminosäuren einschließt, biologische Aktivität behält. Zu natürlichen L-Aminosäuren gehören Alanin (Ala), Arginin (Arg), Asparagin (Asn), Asparaginsäure (Asp), Cystein (Cys), Glutamin (Gln), Glutaminsäure (Glu), Glycin (Gly), Histidin (His), Isoleucin (Ile), Leucin (Leu), Lysin (Lys), Methionin (Met), Phenylalanin (Phe), Prolin (Pro), Serin (Ser), Threonin (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosin (Tyr) und Valin (Val).
Der Begriff "Aminosäurerest" bezieht sich auf Reste mit der Struktur: (1) -NH-CH(R)C(=O)-, wobei R die α-Kohlenstoff-Seitenkettengruppe einer L-Aminosäure ist, außer bei L-Prolin; oder (2)
bei L-Prolin.
Der Begriff "Peptid" bezieht sich auf eine Sequenz von Aminosäuren, die über ihre α-Amino- und Carboxylatgruppen durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Derartige Sequenzen werden hier in Richtung von Amino zu Carboxy von links nach rechts gezeigt.
Der Begriff "Protein" bezieht sich auf ein Molekül, das aus einem oder mehreren Peptiden zusammengesetzt ist.
Der Begriff "cDNA" bezieht sich auf komplementäre DNA.
Der Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich auf Polymere, in denen Basen (z. B. Purine oder Pyrimidine) an ein Zucker-Phosphat-Grundgerüst gebunden sind. Nukleinsäuren schließen DNA und RNA ein.
Der Begriff "Nukleinsäuresequenz" bezieht sich auf die Sequenz der Nukleoside, die eine Nukleinsäure ausmachen. Derartige Sequenzen werden hier in Richtung von 5' zu 3' von links nach rechts gezeigt.
Der Begriff "rekombinantes DNA-Molekül" bezieht sich auf ein DNA-Molekül, das durch Ligieren von DNA-Stücken miteinander erzeugt wird, die normalerweise nicht benachbart sind.
Der Begriff "mRNA" bedeutet Messenger-Ribonukleinsäure. Der Begriff "Homologie" bezieht sich auf den Ähnlichkeitsgrad von DNA oder Peptidsequenzen.
Die Begriffe "Faktor Xa" oder "fXa" oder "FXa" sind synonym und bedeuten, wie üblicherweise bekannt ist, eine Serinprotease in der Blutkoagulationskaskade von Enzymen, die als Teil des Prothrombinasekomplexes wirkt, um das Enzym Thrombin zu bilden.
Der Begriff "Faktor Xa inhibierende Aktivität" bedeutet eine Aktivität, die die katalytische Aktivität von fXa zu seinem Substrat inhibiert.
Die Formulierung "Faktor Xa selektive inhibierende Aktivität" bedeutet inhibierende Aktivität, die für Faktor Xa selektiv ist, verglichen mit anderen verwandten Enzymen, wie anderen Serinproteasen.
Die Formulierung "Faktor Xa Inhibitor" ist eine Verbindung mit Faktor Xa inhibierender Aktivität.
Die Begriffe "Faktor VIIa/Gewebefaktor" oder "fVIIa/TF" oder "FVIIa/TF" sind synonym und bedeuten, wie allgemein bekannt ist, einen katalytisch aktiven Komplex des Serinproteasekoagulationsfaktors VIIa (fVIIa) und des nicht-enzymatischen Protein-Gewebefaktors (TF), wobei der Komplex auf der Oberfläche einer Phospholipidmembran mit definierter Zusammensetzung zusammengefügt wird.
Der Begriff "fVIIa/TF inhibierende Aktivität" bedeutet eine Aktivität, die die katalytische Aktivität des fVIIa/TF-Komplexes in Gegenwart von fXa oder katalytisch inaktivem fXa-Derivat inhibiert.
Die Formulierung "fVIIa/TF selektive inhibierende Aktivität" bedeutet fVIIa/TF inhibierende Aktivität, die für fVIIa/TF selektiv ist, verglichen mit anderen verwandten Enzymen, wie anderen Serinproteasen einschließlich FVIIa und fXa.
Der Begriff "fVIIa/TF Inhibitor" ist eine Verbindung mit fVIIa/TF inhibierender Aktivität in Gegenwart von fXa oder katalytisch inaktiven fXa-Derivaten.
Der Begriff "Serinprotease" bedeutet, wie allgemein bekannt ist, ein Enzym, das eine Triade der Aminosäuren Histidin, Asparaginsäure und Serin enthält, welches eine Amidbindung katalytisch spaltet, wobei der Serinrest in der Triade kovalent an der katalytischen Spaltung beteiligt ist. Serinproteasen werden durch kovalente Modifizierung des Serinrestes in der katalytischen Triade durch Diisopropylfluorphosphat (DFP) katalytisch inaktiv gemacht.
Der Begriff "Serinprotease inhibierende Aktivität" bedeutet eine Aktivität, die die katalytische Aktivität einer Serinprotease inhibiert.
Die Formulierung "Serinprotease selektiv inhibierende Aktivität" bedeutet inhibierende Aktivität, die für eine Serinprotease selektiv ist, verglichen mit anderen Serinproteasen.
Die Formulierung "Serinprotease-Inhibitor" ist eine Verbindung mit Serinprotease inhibierender Aktivität.
Der Begriff "Prothrombinase" bedeutet, wie allgemein bekannt ist, einen katalytisch aktiven Komplex des Serinproteasekoagulierungsfaktors Xa (fXa) und des nicht-enzymatischen Proteins Faktor Va (fVa), wobei der Komplex auf der Oberfläche einer Phospholipidmembran mit definierter Zusammensetzung zusammengefügt wird.
Die Formulierung "Antikoagulansaktivität" bedeutet eine Aktivität, die das Gerinnen von Blut einschließlich des Gerinnens von Plasma inhibiert.
Die Begriffe "selektiv", "Selektivität" und Permutationen davon bedeuten in Bezug auf NAP-Aktivität für ein bestimmtes Enzym, dass NAP das angegebene Enzym mit mindestens 10 Mal höherer Potenz inhibiert, als es andere, verwandte Enzyme inhibiert. Die NAP-Aktivität ist somit zu diesem angegebenen Enzym selektiv.
Der Begriff "im Wesentlichen gleich" bedeutet bei Verwendung zur Bezeichnung von Proteinen, Aminosäuresequenzen, cDNAs, Nukleotidsequenzen und dergleichen Proteine, cDNAs oder Sequenzen mit mindestens etwa 90 % Homologie mit dem anderen Protein, der anderen cDNA oder der anderen Sequenz.
Der Begriff "NAP" oder "NAP-Protein" bedeutet ein isoliertes Protein, das mindestens eine NAP-Domäne enthält und Serinprotease inhibierende Aktivität und/oder Antikoagulansaktivität hat.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Nukleotidsequenz der AcaNAP5 cDNA [SEQ. ID. Nr. 3]. Die Nummerierung beginnt an dem ersten Nukleotid der cDNA. Die Translatation beginnt am ersten ATG-Codon (Position 14), eine zweite im Rahmen ATG ist an Position 20 vorhanden.
2 zeigt die Aminosäuresequenz des reifen AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4].
3 zeigt die Nukleotidsequenz der AcaNAP6 cDNA [SEQ. ID. Nr. 5]. Die Nummerierung beginnt am ersten Nukleotid der cDNA. Die Translatation beginnt am ersten ATG-Codon (Position 14), eine zweite im Rahmen ATG ist an Position 20 vorhanden.
4 zeigt die Aminosäuresequenz des reifen AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6]. Aminosäuren, die sich von AcaNAP5 unterscheiden, sind unterstrichen. Zusätzlich zu diesen Aminosäureersetzungen enthält AcaNAP6 eine Deletion von zwei Aminosäuren (Pro-Pro), verglichen mit AcaNAP5.
5 zeigt die Aminosäuresequenz von Pro-AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 7].
6 zeigt die Aminosäuresequenz von Pro-AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 8]. Aminosäuren, die sich von Pro-AcaNAP5 unterscheiden, sind unterstrichen. Zusätzlich zu diesen Aminosäureersetzungen enthält Pro-AcaNAP6 eine Deletion von zwei Aminosäuren (Pro-Pro), verglichen mit Pro-AcaNAP5.
7A bis 7F zeigt die Nukleotidsequenzen der cDNAs und deduzierten Aminosäuresequenzen bestimmter NAP-Proteine, die aus Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale und Heligmosomoides polygyrus isoliert wurden. 7A zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül, AceNAP4, isoliert aus Ancylostoma ceylanicum [SEQ. ID. Nr. 9]. 7B zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül, AceNAP5, isoliert aus Ancylostoma ceylanicum [SEQ. ID. Nr. 10]. 7C zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül, AceNAP7, isoliert aus Ancylostoma ceylanicum [SEQ. ID. Nr. 11]. 7D zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül, AduNAP4, isoliert aus Ancylostoma duodenale [SEQ. ID. Nr. 12]. 7E zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül, AduNAP7, isoliert aus Ancylostoma duodenale [SEQ. ID. Nr. 13]. 7F zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül, HpoNAP5, isoliert aus Heligmosomoides polygyrus [SEQ. ID. Nr. 14]. Die EcoRI-Stelle, die dem 5'-Ende des rekombinanten cDNA-Moleküls entspricht, ist in allen Fällen angegeben (unterstrichen). Die Nummerierung jeder Sequenz beginnt an dieser EcoRI-Stelle. AceNAP4 und AduNAP7 kodieren jeweils ein Protein, das zwei NAP-Domänen aufweist, alle anderen Klone in dieser Figur kodieren ein Protein mit einer einzigen NAP-Domäne. Der AduNAP4-cDNA-Klon hat keine volle Länge, d. h. dem rekombinanten cDNA-Molekül fehlt der 5'-terminale Teil des Kodierbereichs, basierend auf einem Vergleich mit anderen Isoformen.
8A bis 8C zeigen die Nukleotidsequenz der Vektoren, pDONG61 (8A) [SEQ. ID. Nr. 15], PDONG62 (8B) [SEQ. ID. Nr. 16] und pDONG63 (8C) [SEQ. ID. Nr. 17]. Das gezeigte HindIII-BamHI-Fragment befindet sich zwischen den HindIII und BamHI-Stellen von pUC119. Die Vektoren ermöglichen das Klonen von cDNAs als SfiI-NotI-Fragmente in den drei unterschiedlichen Leserahmen stromabwärts des filamentösen Phagengens 6. Alle relevanten Restriktionsstellen sind angegeben. Das AAA Lys-kodierende Triplett an Position 373–375 ist das letzte Codon von Gen 6. Dem Gen 6 kodierenden Protein folgt eine Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly [SEQ. ID. Nr. 18] Linkersequenz.
9 zeigt die Nukleotidsequenz des rekombinanten cDNA-Moleküls, AcaNAPc2 cDNA [SEQ. ID. Nr. 19]. Die EcoRI-Stelle, die dem 5'-Ende des rekombinanten cDNA-Moleküls entspricht, ist in allen Fällen angegeben (unterstrichen). Die Nummerierung beginnt an dieser EcoRI-Stelle. Die deduzierte Aminosäuresequenz ist auch gezeigt, der Translationsleserahmen wurde durch den Fusionspartner von Gen 6 bestimmt. Der AcaNAPc2 cDNA fehlt ein Teil des 5'-terminalen Teils des Kodierbereichs, die Homologie mit AcaNAP5 und AcaNAP6 prognostiziert, dass die ersten sieben Aminosäurereste zu dem Sekretionssignal gehören.
10A und 10B zeigen die vergleichenden Wirkungen bestimmter NAP-Proteine auf die Prothrombinzeit- (PT)-Messung (10A) und die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) (10B) von normalem menschlichem Plasma mit Citratzusatz. Ausgefüllte Kreise (•) stehen für Pro-AcaNAP5; helle Dreiecke (Δ) stehen für AcaNAP5 (AcaNAP5^Δ in Tabelle 2) und helle Kreise (O) stehen für native AcaNAP5.
11 zeigt das Alignment der Aminosäuresequenzen, die durch bestimmte NAP cDNAs kodiert sind, die aus verschiedenen Nematoden isoliert wurden. AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 20], AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 21] und AcaNAPc2 [SEQ. ID. Nr. 128] wurden aus Ancylostoma caninum isoliert. AceNAP5 [SEQ. ID. Nr. 22], AceN-AP7 [SEQ. ID. Nr. 23] und AceNAP4 (AceNAP4d1) [SEQ. ID. Nr. 24] und AceNAP4d2 [SEQ. ID. Nr. 25] wurden aus Ancylostoma ceylanicum isoliert. AduNAP4 [SEQ. ID. Nr. 26], AduNAP7 (AduNAP7d1) [SEQ. ID. Nr. 27] und AduNAPd2 [SEQ. ID. Nr. 28] wurden aus Ancylostoma duodenale isoliert. HpoNAP5 [SEQ. ID. Nr. 29] wurde aus Heligmosomoides polygyrus isoliert. Die in dieser Figur gezeigten Aminosäuresequenzen sind wie in den 1, 3, 7A bis 7F und 9 wiedergegeben. Die Sequenzen von reifer AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4] und AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6] (siehe 2 und 4) sind teilweise durch zehn Cysteinreste (nummeriert mit eins bis zehn und fettgedruckt gezeigt) charakterisiert. Alle der Aminosäuresequenzen in dieser Figur enthalten mindestens eine NAP-Domäne. Die AceNAP4 cDNA besteht aus zwei benachbarten Regionen mit den Bezeichnungen AceNAP4d1 [SEQ. ID. Nr. 24] und AceNAP4d2 [SEQ. ID. Nr. 25], die eine erste (d1) und zweite (d2) NAP-Domäne kodieren, in ähnlicher Weise enthält die AduNAP7 cDNA zwei benachbarte Regionen, AduNAP7d1 [SEQ. ID. Nr. 27] und AduNAP7d2 [SEQ. ID. Nr. 28], die eine erste (d1) und zweite (d2) NAP-Domäne kodieren. Das Alignment der Aminosäuresequenzen aller NAP-Domänen wird durch die Cysteine geleitet.
An bestimmten Positionen wurden Striche (---) eingefügt, um das Cystein-Alignment aufrechtzuerhalten und die Abwesenheit einer Aminosäure an jener Position zu zeigen. Dem carboxy-terminalen Rest eines cDNA-kodierten Proteins folgt das Wort "end".
12A und 12B zeigen eine Karte des Expressions/Sekretionsvektors von P. pastoris pYAM7SP8 (12A) und in dem Vektor enthaltenen Sequenzen (12B) [SEQ. ID. Nr. 30]. Wie in 12A gezeigt ist, enthält dieses Plasmid die folgenden Elemente als Insert zwischen dem AOX1-Promoter (dunkler Pfeil in der nicht translatierten 5'AOX Region) und dem AOX1 Transkriptionsterminationssignal (3'T): ein synthetisches DNA-Fragment, welches das saure Phosphatase-Sekretionssignal (S) kodiert, eine synthetische 19-Aminosäure-Pro-Sequenz (P), die mit einer Lys-Arg-Verarbeitungsstelle der KEX2-Protease endet, und eine Multiklonierungsstelle (Mehrfachklonierungsstelle). Das HIS4-Gen, das als Selektionsmarker in der GS115-Transformation dient, wurde durch stellengeführte Mutagenese modifiziert, um die Stul-Erkennungssequenz (HIS4*) zu eliminieren. pBR322-Sequenzen einschließlich des Bla-Gens und des Ursprungs (Origin) (ori) zur Vermehrung in E. coli werden durch eine einfache Linie wiedergegeben. 12B zeigt die folgenden zusammenhängenden DNA-Sequenzen, die in pYAM7SP8 eingebaut werden: Die saure Phosphatase- (PHO1) Sekretionssignalsequenz, Pro-Sequenz- und Multiklonierungsstellen- (MCS) Sequenz. Das ATG-Startcodon des PHO1-Sekretionssignals ist unterstrichen.
13A bis 13H zeigt die Nukleotidsequenzen der cDNAs und deduzierten Aminosäuresequenzen bestimmter NAP-Proteine, die aus Ancylostoma caninum isoliert wurden. 13A zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül AcaNAP23 [SEQ. ID. Nr. 31]. 13B zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül AcaNAP24 [SEQ. ID. Nr. 32]. 13C zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül AcaNAP25 [SEQ. ID. Nr. 33]. 13D zeigt Sequenzen für die rekombinanten cDNA-Moleküle AcaNAP31, AcaNAP42 und AcaNAP46, die alle identisch sind [SEQ. ID. Nr. 34]. 13E zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül AcaNAP44 [SEQ. ID. Nr. 35]. 13F zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül AcaNAP45 [SEQ. ID. Nr. 36]. 13G zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül AcaNAP47 [SEQ. ID. Nr. 37]. 13H zeigt Sequenzen für das rekombinante cDNA-Molekül AcaNAP48 [SEQ. ID. Nr. 38]. Die EcoRI-Stelle, die dem 5'-Ende des rekombinanten cDNA-Moleküls entspricht, ist in allen Fällen angegeben (unterstrichen). Die Nummerierung jeder Sequenz beginnt an dieser EcoRI-Stelle. AcaNAP45 und AcaNAP7 kodieren jeweils ein Protein, das zwei NAP-Domänen aufweist, alle anderen Klone in dieser Figur kodieren ein Protein mit einer einzigen NAP-Domäne.
14 zeigt das Nukleotid und die deduzierte Aminosäuresequenz des rekombinanten cDNA-Moleküls, NamNAP [SEQ. ID. Nr. 39].
15 zeigt die antithrombotische Aktivität von AcaNAP5 und Low Molecular Weight Heparin (LMWH; Enoxaparin^TM), bewertet in dem FeCl₃-Modell der arteriellen Thrombose. Die Aktivitätsdaten werden als prozentuale Häufigkeit der Bildung eines okklusiven Thrombus in der Carotis-Arterie wiedergegeben (Kreise). Die Thrombusbildung begann 150 Minuten nach der subkutanen (s.c.) Verabreichung des Testmittels. Tiefes Wundbluten wurde in einer separaten Tiergruppe quantifiziert, die in identischer Weise, jedoch ohne Gabe von FeCl₃ behandelt wurden (Quadrate). Der Blutverlust an einer tiefen chirurgischen Wunde im Nacken wurde über insgesamt 210 Minuten nach subkutaner Verabreichung der Verbindung quantifiziert.
16 zeigt das Alignment von Aminosäuresequenzen, die reifen NAPs entsprechen, die gemäß den hier offenbarten Verfahren isoliert wurden: nämlich AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 40], AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 41], AcaNAP48 [SEQ. ID. Nr. 42], AcaNAP23 [SEQ. ID. Nr. 43], AcaNAP24 [SEQ. ID. Nr. 44], AcaNAP25 [SEQ. ID. Nr. 45], AcaNAP44 [SEQ. ID. Nr. 46], AcaNAP31, 42, 46 [SEQ. ID. Nr. 47], AceNAP4d1 [SEQ. ID. Nr. 48], AceNAP4d2 [SEQ. ID. Nr. 49], AcaNAP45d1 [SEQ. ID. Nr. 50], AcaNAP47d1 [SEQ. ID. Nr. 51], AduNAP7d1 [SEQ. ID. Nr. 52], AcaNAP45d2 [SEQ. ID. Nr. 53], AcaNAP47d2 [SEQ. ID. Nr. 54], AduNAP4 [SEQ. ID. Nr. 55], AduNAP7d2 [SEQ. ID. Nr. 56], AceNAP5 [SEQ. ID. Nr. 57], AceNAP7 [SEQ. ID. Nr. 58], AcaNAPc2 [SEQ. ID. Nr. 59], HpoNAP5 [SEQ. ID. Nr. 60] und NamNAP [SEQ. ID. Nr. 61]. Jede NAP-Domäne umfasst zehn Cysteinreste, die zum Alignment der Sequenzen und der Aminosäuresequenzen zwischen den Cysteinen verwendet werden. A1 bis A10 stehen für die Aminosäuresequenzen zwischen den Cysteinresten.
17 zeigt die Aminosäuresequenz des reifen AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 62] mit zwei NAP-Domänen.
18 zeigt die Aminosäuresequenz des reifen AcaNAP45 [SEQ. ID. Nr. 63] mit zwei NAP-Domänen.
19 zeigt die Aminosäuresequenz des reifen AcaNAP47 [SEQ. ID. Nr. 64] mit zwei NAP-Domänen.
20 zeigt die Aminosäuresequenz des reifen AduNAP7 [SEQ. ID. Nr. 65] mit zwei NAP-Domänen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung liefert eine Familie von Proteinen, die kollektiv als aus Nematoden extrahierten Antikoagulansproteinen (NAPs) bezeichnet werden. Diese Proteine werden so genannt, weil das erste ursprünglich isolierte Mitglied aus einer Nematode isoliert wurde, dem Hundehakenwurm Ancyclostoma caninum. Die Bezeichnungen NAP oder NAP-Domäne sollten jedoch nicht als die erfindungsgemäßen Proteine auf diese oder eine andere natürliche Quelle einschränkend angesehen werden.
Individuelle NAP-Proteine sind dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine NAP-Domäne und Serinprotease inhibierende und/oder Antikoagulansaktivität haben. Diese Antikoagulansaktivität kann durch Anstiege der Gerinnungszeit in sowohl dem PT- als auch dem aPPT-Assay, die hier beschrieben sind, durch die Inhibierung der Faktor Xa- oder Faktor VIIa/TF-Aktivität, oder durch Demonstrieren der Aktivität in vivo bewertet werden. In solchen Assays verwendetes Blut oder Plasma stammt vorzugsweise von Spezies, die bekanntermaßen mit Nematoden infiziert sind, wie Schweinen, Menschen, Primaten und dergleichen. Die NAP-Domäne ist eine Aminosäuresequenz. Es wird angenommen, dass die NAP-Domäne für die beobachtete inhibierende und/oder Antikoagulansaktivität verantwortlich ist.
Bestimmte repräsentative NAP-Domänen schließen die in 11 und 16 gezeigten Aminosäuresequenzen ein, insbesondere die Sequenzen zwischen den Cysteinen, die in den Figuren als Cystein 1 und Cystein 10 bezeichnet werden, und der Sequenz, die Cystein 10 folgt. Diese Charakteristika, die diese Familie von Proteinen allgemein definieren, sowie die Nukleinsäuremoleküle einschließlich mRNA-Sequenzen und DNA-Sequenzen, die diese Proteine kodieren, werden bereitgestellt. Verfahren zur Herstellung dieser Proteine sowie Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuremolekülen, die diese Proteine kodieren, werden auch bereitgestellt. Die bereitgestellten spezifischen Beispiele sind lediglich beispielhaft, und andere Mitglieder der NAP-Familie von Proteinen sowie Nukleinsäuresequenzen, die sie kodieren, können nach den in diesen Beispielen beschriebenen Verfahren und wie hier beschrieben erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Proteine schließen isolierte NAPs ein, die Proteine mit Antikoagulansaktivität enthalten und mindestens eine NAP-Domäne aufweisen.
In Bezug auf "Antikoagulansaktivität" sind die erfindungsgemäßen gereinigten Proteine als Antikoagulantien wirksam und sind als solche dadurch gekennzeichnet, dass sie das Gerinnen von Blut inhibieren, einschließlich des Gerinnens von Plasma. Gemäß einem Aspekt enthalten die bevorzugten erfindungsgemäßen isolierten Proteine jene, die die Gerinnungszeit von menschlichem Plasma erhöhen, gemessen sowohl in Prothrombinzeit- (PT)-als auch aktivierten partiellen Thromboplastinzeit- (aPTT)-Assays.
In dem PT-Assay wird die Gerinnung durch Zugabe einer festgelegten Menge Gewebefaktor-Phospholipid-Micellenkomplex (Thromboplastin) zu menschlichem Plasma initiiert. Antikoagulantien stören bestimmte Wechselwirkungen an der Oberfläche dieses Komplexes und erhöhen die Zeit, die zum Erreichen der Gerinnung erforderlich ist, relativ zu der Gerinnung, die in Abwesenheit des Antikoagulans beobachtet wird. Die Messung der PT ist zur Bewertung der Antikoagulansaktivität von NAP besonders relevant, weil die Reihe spezieller biochemischer Ereignisse, die erforderlich ist, um in diesem Assay Gerinnung her beizuführen, jenen ähnlich ist, die durch den Hakenwurm in der Natur überwunden werden müssen, um die Nahrungsaufnahme zu erleichtern. Die Fähigkeit von NAP, als Inhibitor in diesem Assay zu wirken, kann seine Aktivität in der Natur widerspiegeln und die Antikoagulansaktivität in vivo vorhersagen. Sowohl in dem Assay als auch in der Natur wird die Koagulierungsreaktion durch die Bildung eines binären Komplexes des Serinproteasefaktors VIIa (fVIIa) und des Proteingewebefaktors (TF) (fVIIa/TF) initiiert, die zur Erzeugung von fXa führt. Das nachfolgende Zusammenfügen (Assemblieren) von fXa zu dem Prothrombinasekomplex ist das Schlüsselereignis, das für die Bildung von Thrombin und schließlich die Gerinnungsbildung verantwortlich ist.
In dem aPTT-Assay wird die Gerinnung durch Zugabe einer festgelegten Menge negativ geladener Phospholipid-Micelle (Aktivator) zu menschlichem Plasma initiiert. Substanzen, die als Antikoagulantien wirken, stören bestimmte Wechselwirkungen an der Oberfläche des Komplexes und erhöhen wiederum die Zeit, um ein bestimmtes Maß an Gerinnung relativ zu demjenigen zu erreichen, das in Abwesenheit des Antikoagulans beobachtet wird. Beispiel B beschreibt solche PT- und aPTT-Assays. Diese Assays können zur Bewertung der Antikoagulansaktivität der erfindungsgemäßen isolierten NAPs verwendet werden.
Die bevorzugten isolierten erfindungsgemäßen NAPs schließen jene ein, die die Gerinnungszeit von menschlichem Plasma in dem PT-Assay verdoppeln, wenn sie in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 500 Nanomol vorhanden sind, und die Gerinnungszeit von menschlichem Plasma in dem aPPT-Assay auch verdoppeln, wenn sie in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 500 Nanomol vorhanden sind. Besonders bevorzugt sind jene Proteine, die die Gerinnungszeit von menschlichem Plasma in dem PT-Assay verdoppeln, wenn sie in einer Konzentration von etwa 5 bis etwa 100 Nanomol vorhanden sind, und die Gerinnungszeit von menschlichem Plasma in dem aPPT-Assay auch verdoppeln, wenn sie in einer Konzentration von etwa 5 bis etwa 200 Nanomol vorhanden sind. Besonders bevorzugt sind jene Proteine, die die Gerinnungszeit von menschlichem Plasma in dem PT-Assay verdoppeln, wenn sie in einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 50 Nanomol vorhanden sind, und die Gerinnungszeit von menschlichem Plasma in dem aPPT-Assay auch verdoppeln, wenn sie in einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 100 Nanomol vorhanden sind.
Antikoagulans- oder antithrombotische Aktivität von erfindungsgemäßen NAPs kann auch unter Verwendung der in Beispiel F vorgestellten in vivo-Modellen bewertet werden. Das in Teil A dieses Beispiels beschriebene FeCl₃-Rattenmodell ist ein Modell von Thrombozyten-abhängiger arterieller Thrombose, das üblicherweise zur Bewertung antithrombotischer Verbindungen verwendet wird. Das Modell bewertet die Fähigkeit einer Testverbindung, die Bildung eines okklusiven Thrombus zu verhindern, der durch FeCl₃ in einem Segment der Carotis-Arterie der Ratte induziert wird. Erfindungsgemäße NAPs sind effektive Antikoagulantien in diesem Modell, wenn sie intravenös oder subkutan verabreicht werden. Der in Teil B von Beispiel F beschriebene tiefe Wundblutungsassay ermöglicht die Messung des Blutverlusts nach Verabreichung einer Antikoagulansverbindung. Ein erwünschter Effekt eines Antikoagulans ist, dass es die Blutkoagulierung oder Thrombusbildung inhibiert, jedoch nicht so stark, dass die Gerinnung insgesamt verhindert wird und dadurch das Bluten potentiert wird. Der tiefe Wundblutungsassay misst somit die Menge des Blutverlusts über den Zeitraum von 3,5 Stunden nach Verabreichung des Antikoagulans. Die in 15 dargestellten Daten zeigen, dass das erfindungsgemäße NAP eine effektive antithrombotische Verbindung in einer Dosis ist, die nicht zu übermäßigem Bluten führt. Im Unterschied dazu führt die Dosis an Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (LMWH), die mit 0 % Okklusion korreliert, zu drei Mal mehr Bluten als die effektive Dosis von NAP.
ALLGEMEINE NAP-DOMÄNE (FORMEL I)
In Bezug auf die "NAP-Domäne" schließen die isolieren Proteine (oder NAPs) der vorliegenden Erfindung mindestens eine NAP-Domäne in ihrer Aminosäuresequenz ein. Bestimmte NAP-Domänen haben eine Aminosäuresequenz mit einem Molekulargewicht von etwa 5,0 bis 10,0 Kilodalton, vorzugsweise etwa 7,0 bis 10,0 Kilodalton, die 10 Cysteinaminosäurereste enthalten.
Bestimmte erfindungsgemäße NAPs zeigen Spezifität für die Inhibierung einer speziellen Komponente in der Koagulationskaskade, wie dem fXa- oder dem fVIIa/TF-Komplex. Die Spezifizität einer inhibierenden Aktivität von NAP für eine Komponente in der Koagulationskaskade kann nach dem Protokoll in Beispiel D bewertet werden. Die Fähigkeit von NAP zur Inhibierung der Aktivität einer Vielfalt von Serinproteasen, die an der Koagulation beteiligt sind, wird somit gemessen und verglichen. Die Fähigkeit eines NAPs zur Inhibierung des fVIIa/TF-Komplexes kann auch unter Verwendung der Protokolle in Beispiel E bewertet werden, die die Fähigkeit eines NAP messen, in inhibierender oder nicht-inhibierender Weise an fXa zu binden und FVIIa zu inhibieren, wenn mit TF komplexiert wurde. AcaNAP5 und AcaNAP6 sind Beispiele für Proteine mit NAP-Domänen, die spezifisch fXa inhibieren. AcaNAPc2 ist ein Protein mit einer NAP-Domäne, das selektive Inhibierung des fVIIa/TF-Komplexes zeigt, wenn fXa oder ein katalytisch aktives oder inaktives Derivat davon vorhanden ist.
NAPS MIT ANTIKOAGULANSAKTIVITÄT EINSCHLIEßLICH NAPS MIT FAKTOR XA INHIBIERENDER AKTIVITÄT (FORMEL II)
Gemäß einem Aspekt schließen erfindungsgemäße NAPs somit auch ein isoliertes Protein mit Antikoagulansaktivität ein, einschließlich eines isolierten Proteins mit Faktor Xa inhibierender Aktivität und mit einer oder mehreren NAP-Domänen, wobei jede NAP-Domäne die Sequenz Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 ("FORMEL II") einschließt, wobei

(a) A1 eine Aminosäuresequenz mit 7 bis 8 Aminosäureresten ist;
(b) A2 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 5 Aminosäureresten ist;
(c) A3 eine Aminosäuresequenz mit 3 Aminosäureresten ist;
(d) A4 eine Aminosäuresequenz mit 6 bis 19 Aminosäureresten ist;
(e) A5 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 4 Aminosäureresten ist;
(f) A6 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 5 Aminosäureresten ist;
(g) A7 ein Aminosäurerest ist;
(h) A8 eine Aminosäuresequenz mit 11 bis 12 Aminosäureresten ist;
(i) A9 eine Aminosäuresequenz mit 5 bis 7 Aminosäureresten ist, und
(j) A10 eine Aminosäuresequenz mit 5 bis 25 Aminosäureresten ist.

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP-Proteine gemäß diesem Aspekt enthalten, und Verfahren zur Inhibierung der Blutkoagulation, bei denen gemäß diesem Aspekt erfindungsgemäße NAP-Proteine verabreicht werden, sind erfindungsgemäß auch vorgesehen. NAP-Proteine gemäß diesem Aspekt der Erfindung haben mindestens eine NAP-Domäne. Bevorzugt sind NAPs mit einer oder zwei NAP-Domänen. NAP-Proteine AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4 und 40] und AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6 und 41] haben eine NAP-Domäne und sind bevorzugte NAPs gemäß diesem Aspekt der Erfindung.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt werden somit isolierte Proteine mit Antikoagulansaktivität einschließlich isolierter Proteine mit Aktivität als Faktor Xa-Inhibitoren mit mindestens einer NAP-Domäne der Formel II bereitgestellt, die die folgende Sequenz einschließt:
Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-AS-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10,
wobei (a) Cys-A1 ausgewählt ist aus SEQ. ID. Nr. 67 und 156; (b) Cys-A2-Cys ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 157 bis 159; (c) A3-Cys-A4 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 160 bis 173; (d) Cys-A5 ausgewählt ist aus SEQ. ID. Nr. 174 und 175; (e) Cys-A6 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 176 bis 178; (f) Cys-A7-Cys-A8 ausgewählt ist aus SEQ. ID. Nr. 179 und 180; (g) Cys-A9 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 181 bis 183 und (h) Cys-A10 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 184 bis 204.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung hat A3 die Sequenz Glu-A3_a-A3_b, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind. A3_a ist insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ala, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu und Thr, und A3_b ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lys, Thr und Arg. Besonders bevorzugte A3-Sequenzen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys und Glu-Thr-Lys.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist ein bevorzugter A7-Aminosäurerest Val oder Ile.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist eine, bei der A8 die Aminosäuresequenz A8_a-A8_b-A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g [SEQ. ID. Nr. 68] einschließt,
worin

(a) A8_a der erste Aminosäurerest in A8 ist,
(b) mindestens einer von A8_a und A8_b ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glu oder Asp, und
(c) A8_c bis A8_g unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind.

Vorzugsweise ist A8_c Gly, A8_d ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phe, Tyr und Leu, A8_e ist Tyr, A8_f ist Arg, und A8_g ist ausgewählt aus Asp und Asn. Eine besonders bevorzugte A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g Sequenz ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 72] und Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 73].
Eine zusätzliche bevorzugte Ausführungsform ist eine, in der A10 eine Aminosequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. Nr. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. Nr. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. Nr. 76] und Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. Nr. 77] einschließt.
NAP-Proteine AcaNAP5 und AcaNAP6 schließen die Aminosäuresequenz Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. Nr. 74] in A10 ein und sind bevorzugte NAPs gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung.
Gemäß einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist ein bevorzugtes NAP-Molekül eines, bei dem

(a) A3 die Sequenz Glu-A3_a-A3_b hat, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind;
(b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist;
(c) A7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Val und Ile;
(d) A8 eine Aminosäuresequenz einschließt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 72] und Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 73], und
(e) A10 eine Aminosequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. Nr. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. Nr. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. Nr. 76] und Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. Nr. 77] einschließt.

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform enthalten, und Verfahren zur Inhibierung der Blutkoagulation, bei denen NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform verabreicht werden, sind erfindungsgemäß auch vorgesehen. NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung haben mindestens eine NAP-Domäne. Bevorzugt sind NAPs mit einer oder zwei NAP-Domänen. Die NAP-Proteine AcaNAP5 und AcaNAP6 haben eine NAP-Domäne und sind bevorzugte NAPs gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist ein NAP-Molekül eines, bei dem

(a) A3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys und Glu-Thr-Lys;
(b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist;
(c) A7 Val oder Ile ist;
(d) A8 eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A8_a-A3_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 78], A8_a-A3_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 79], A8_a-A3_b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 80], A8_a-A3_b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 81] und A8_a-A3_b-Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 82] einschließt, wobei mindestens eine von A8_a und A3_b Glu oder Asp ist;
(e) A9 eine Aminosäuresequenz von fünf Aminosäureresten ist; und
(f) A10 eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. Nr. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. Nr. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. Nr. 76] und Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. Nr. 77] einschließt. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform enthalten, und Verfahren zur Inhibierung der Blutkoagulation, bei denen erfindungsgemäße NAP-Proteine verabreicht werden, sind erfindungsgemäß auch vorgesehen. NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung haben mindestens eine NAP-Domäne. Bevorzugt sind NAPs mit einer oder zwei NAP-Domänen. Bevorzugt sind Proteine mit mindestens einer NAP-Domäne, die im Wesentlichen die gleiche wie AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 40] oder AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 41] ist. NAP-Proteine AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4 und 40] und AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6 und 41] haben eine NAP-Domäne und sind besonders bevorzugte NAPs gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung.

Bevorzugte NAP-Proteine mit Antikoagulansaktivität einschließlich jener mit Faktor Xa inhibierender Aktivität gemäß allen Ausführungsformen, die oben für diesen Aspekt der Erfindung genannt wurden, können von einer Nematodenspezies abgeleitet werden. Eine bevorzugte Nematodenspezies ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus und Heligomosomoides polygyrus. Besonders bevorzugt sind die NAP-Proteine AcaNAP5 und AcaNAP6, die von Ancylostoma caninum abgeleitet sind.
Dieser Aspekt der Erfindung umfasst auch isolierte rekombinante cDNA-Moleküle, die ein Protein mit Antikoagulans- und/oder Faktor Xa inhibierender Aktivität kodieren, wobei das Protein gemäß jeder der oben für isoliertes NAP-Protein mit Antikoagulans- und/oder Faktor Xa inhibierender Aktivität genannten Ausführungsformen definiert ist. Bevorzugte cDNAs gemäß diesem Aspekt der Erfindung kodieren AcaNAP5 und AcaNAP6.
Die Faktor Xa inhibierende Aktivität von NAPs gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann mit den hier beschriebenen Protokollen bestimmt werden. Beispiel A beschreibt ein derartiges Verfahren. Kurz gesagt wird ein NAP mit Faktor Xa für einen Zeitraum inkubiert, danach wird ein Faktor Xa-Substrat zugefügt. Die Rate der Substrathydrolyse wird gemessen, wobei eine langsamere Rate, verglichen mit der Rate in Abwesenheit von NAP, die NAP-Inhibierung von Faktor Xa zeigt. Beispiel C zeigt ein weiteres Verfahren zum Detektieren der inhibierenden Aktivität von NAP für Faktor Xa, wenn er zu dem Prothrombinasekomplex assembliert ist, was die normale physiologische Funktion von fXa in vivo genauer widerspiegelt. Faktor Xa, der zu dem Prothrombinasekomplex assembliert ist, wird, wie hier beschrieben, mit NAP inkubiert, gefolgt von der Zugabe von Substrat. Die Faktor Xa-vermittelte Thrombinerzeugung durch den Prothrombinasekomplex wird durch die Rate der Thrombinerzeugung aus dieser Mischung gemessen.
NAPS MIT ANTIKOAGULANSAKTIVITÄT EINSCHLIEßLICH NAPS MIT FAKTOR VIIA/TF INHIBIERENDER AKTIVITÄT (FORMEL III)
Gemäß einem anderen Aspekt schließen erfindungsgemäße NAPs auch ein isoliertes Protein mit Antikoagulansaktivität einschließlich eines isolierten Proteins mit Faktor VIIa/TF inhibierender Aktivität und mit einer oder mehreren NAP-Domänen ein, wobei jede NAP-Domäne die folgende Sequenz einschließt:
Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 ("FORMEL III"),
worin

(a) A1 eine Aminosäuresequenz mit 7 bis 8 Aminosäureresten ist;
(b) A2 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 5 Aminosäureresten ist;
(c) A3 eine Aminosäuresequenz mit 3 Aminosäureresten ist;
(d) A4 eine Aminosäuresequenz mit 6 bis 19 Aminosäureresten ist;
(e) A5 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 4 Aminosäureresten ist;
(f) A6 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 5 Aminosäureresten ist;
(g) A7 ein Aminosäurerest ist;
(h) A8 eine Aminosäuresequenz mit 11 bis 12 Aminosäureresten ist;
(i) A9 eine Aminosäuresequenz mit 5 bis 7 Aminosäureresten ist; und
(j) A10 eine Aminosäuresequenz mit 5 bis 25 Aminosäureresten ist.

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP-Proteine gemäß diesem Aspekt enthalten, und Verfahren zur Inhibierung der Blutkoagulation, bei denen erfindungsgemäße NAP-Proteine verabreicht werden, sind erfindungsgemäß auch vorgesehen. NAP-Proteine gemäß diesem Aspekt der Erfindung haben mindestens eine NAP-Domäne. Bevorzugt sind NAPs mit einer oder zwei NAP-Domänen. Bevorzugt sind Proteine mit mindestens einer NAP-Domäne, die im Wesentlichen die gleiche wie jene von AcaNAPc2 [SEQ. ID. Nr. 59] ist. Das NAP-Protein AcaNAPc2 [SEQ. ID. Nr. 59] hat eine NAP-Domäne und ist ein besonders bevorzugtes NAP gemäß diesem Aspekt der Erfindung.
Demnach werden gemäß einem bevorzugten Aspekt NAPs mit Antikoagulansaktivität einschließlich Faktor VIIa/TF inhibierender Aktivität und mit mindestens einer NAP-Domäne der Formel III bereitgestellt, wobei die NAP-Domäne die folgende Aminosäuresequenz einschließt:
Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 worin (a) Cys-A1 ausgewählt ist aus SEQ. ID. Nr. 83 und 205; (b) Cys-A2-Cys ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 206 bis 208; (c) A3-Cys-A4 ausgewählt ist aus SEQ. ID. Nr. 209 bis 222; (d) Cys-A5 ausgewählt ist aus SEQ. ID. Nr. 223 und 224; (e) Cys-A6 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 225 bis 227; (f) Cys-A7-Cys-A8 ausgewählt ist aus SEQ. ID. Nr. 228 und 229; (g) Cys-A9 ausgewählt ist aus SEQ. ID. Nr. 230 bis 232; und (h) Cys-A10 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 233 bis 253.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung hat A3 die Sequenz Asp-A3_a-A3_b, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind. A3 ist insbesondere Asp-Lys-Lys.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung hat A5 die Sequenz A5_a-A5_b-A5_c-A5_d [SEQ. ID. Nr. 89:], wobei A5_a bis A5_d unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind. A5_a ist vorzugsweise Leu, und A5_C ist Arg.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist ein bevorzugter A7-Aminosäurerest Val oder Ile, insbesondere Val.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist eine, bei der A8 die Aminosäuresequenz A8_a-A8_b-A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g [SEQ. ID. Nr. 68] einschließt, wobei

Vorzugsweise ist A8_c Gly, A8_d ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phe, Tyr und Leu, A8_e ist Tyr, A8f ist Arg, und A8_g ist ausgewählt aus Asp und Asn. Eine bevorzugte A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g-Sequenz ist Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 70].
Gemäß einer Ausführungsform ist ein bevorzugtes NAP-Molekül eines, bei dem

(a) A3 die Sequenz Asp-A3_a-A3_b hat, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind;
(b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist;
(c) A5 die Sequenz A5_a-A5_b-A5_c-A5_d hat, wobei A5_a bis A5_d unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind; und
(d) A7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Val und Ile. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform enthalten, und Verfahren zur Inhibierung der Blutkoagulation, bei denen erfindungsgemäße NAP-Proteine verabreicht werden, sind erfindungsgemäß auch vorgesehen. NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung haben mindestens eine NAP-Domäne. Bevorzugt sind NAPs mit einer oder zwei NAP-Domänen. Das NAP-Protein AcaNAPc2 hat eine NAP-Domäne und ist ein bevorzugtes NAP gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist ein NAP-Molekül eines, bei dem

(a) A3 Asp-Lys-Lys ist;
(b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist;
(c) A5 die Sequenz A5_a-A5_b-A5_c-A5_d [SEQ. ID. Nr. 85] hat, wobei A5_a bis A5_d unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind,
(d) A7 Val ist; und
(e) A8 eine Aminosäuresequenz A8_a-A8_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 79] einschließt, wobei mindestens eine von A8_a und A8_b Glu oder Asp ist. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform enthalten, und Verfahren zur Inhibierung der Blutkoagulation, bei denen erfindungsgemäße NAP-Proteine verabreicht werden, sind erfindungsgemäß auch vorgesehen. NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung haben mindestens eine NAP-Domäne. Bevorzugt sind NAPs mit einer oder zwei NAP-Domänen. Das NAP-Protein AcaNAPc2 [SEQ. ID. Nr. 59] hat eine NAP-Domäne und ist ein besonders bevorzugtes NAP gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung.

Bevorzugte NAP-Proteine mit Antikoagulansaktivität einschließlich jener mit Faktor VIIa/TF inhibierender Aktivität gemäß allen Ausführungsformen, die oben für diesen Aspekt der Erfindung genannt wurden, können von einer Nematodenspezies abgeleitet werden. Eine bevorzugte Nematodenspezies ist ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus und Heligomosomoides polygyrus. Besonders bevorzugt ist NAP-Protein AcaNAPc2, das von Ancylostoma caninum abgeleitet ist.
Dieser Aspekt der Erfindung umfasst auch isolierte rekombinante cDNA-Moleküle, die ein Protein mit Antikoagulans- und/oder Faktor VIIa/TF inhibierender Aktivität kodieren, wobei das Protein gemäß jeder der oben für isoliertes NAP-Protein mit Antikoagulans- und/oder Faktor VIIa/TF inhibierender Aktivität genannten Ausführungsformen definiert ist. Eine bevorzugte cDNA gemäß diesem Aspekt hat eine Nukleotidsequenz [SEQ. ID. Nr. 19] und kodiert AcaNAPc2 [SEQ. ID. Nr. 59].
Die Faktor fVIIa/TF inhibierende Aktivität von NAPs gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann mit den hier beschriebenen Protokollen bestimmt werden. Beispiel E beschreibt fVIIa/TF Assays. Die fVIIa/TF-vermittelte Spaltung und Freisetzung des tritiierten Aktivierungspeptids aus radiomarkiertem menschlichen Faktor IX (³H-FIX) oder die amidolytische Hydrolyse eines chromogenen Peptidylsubstrats werden gemessen. Interessanterweise erfordern erfindungsgemäße NAP fVIIa/TF-Inhibitoren die Anwesenheit von fXa, um aktive fVII/TF-Inhibitoren zu sein. NAP fVIIa/TF-Inhibitoren waren jedoch in Gegenwart von fXa, bei dem die aktive Stelle mit dem Peptidylchlormethylketon H-Glu-Gly-Arg-CMK (EGR) irreversibel besetzt und dadurch katalytisch inaktiv (EGR-fXa) gemacht worden war, gleich wirksam. Ohne sich auf irgendeine Erklärung festlegen zu wollen, scheint es so zu sein, dass ein NAP mit fVIIa/TF-Inhibierungsaktivität einen binären Komplex mit fXa bildet, indem es an eine spezifische Erkennungsstelle an dem Enzym gebunden wird, die sich von den primären Erkennungsstellen P₄-P₁ am katalytischen Zentrum des Enzyms unterscheidet. Es folgt die Bildung eines quaternären inhibierenden Komplexes mit dem fVIIa/TF-Komplex. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese ist, dass EGR-fXa die Inhibierung von fVII/TF durch NAPs vollständig stützen kann, die fVIIa/TF trotz kovalenter Besetzung der primären Erkennungsstellen (P₄-P₁) innerhalb der katalytischen Stelle von fXa durch das Tripeptidylchlormethylketon (EGR-CMK) inhibieren.
Die fVIIa/TF inhibierende Aktivität von NAPs kann auch unter Verwendung der Protokolle in Beispiel D sowie der in den Beispielen A und C beschriebenen fXa-Assays bestimmt werden. Die Fähigkeit eines NAP zur Inhibierung der katalytischen Aktivität einer Vielfalt von Enzymen wird gemessen und mit seiner inhibierenden Aktivität für den fVIIa/TF-Komplex verglichen. Spezifische Inhibierung von fVIIa/TF durch ein NAP ist für einige Anwendungen ein erwünschtes Charakteristikum.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung beinhaltet ein isoliertes Protein mit Antikoagulansaktivität und cDNAs, die das Protein kodieren, wobei das Protein die katalytische Aktivität des fVIIa/TF-Komplexes in Gegenwart von fXa oder katalytisch inaktivem fXa-Derivat spezifisch inhibiert, jedoch die Aktivität von FVIIa in Abwesenheit von TF nicht spezifisch inhibiert und Prothrombinase nicht spezifisch inhibiert. Bevorzugte Proteine gemäß diesem Aspekt der Erfindung haben die oben für ein isoliertes Protein mit Faktor VIIa/TF inhibierender Aktivität und mit einer oder mehreren NAP-Domänen beschriebenen Charakteristika. Ein bevorzugtes Protein gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist AcaNAPc2.
NAPs gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden durch ihre fVIIa/TF inhibierende Aktivität in Gegenwart von fXa oder einem fXa-Derivat unabhängig davon identifiziert, ob das Derivat katalytisch aktiv ist oder nicht. Die in den Beispielen B, C und F beschriebenen Protokolle sind zur Bestimmung der Antikoagulansaktivität dieser NAPs brauchbar. Das Protokoll in Beispiel A kann die Inaktivität eines NAPs für freies fXa oder Prothrombinase detektieren. Daten, die unter Verwendung der Protokolle in Beispiel E erzeugt wurden, identifizieren NAPs, die entweder katalytisch aktiven oder inaktiven fXa zum Inhibieren des fVIIa/TF-Komplexes erfordern.
NAPS MIT SERINPROTEASE INHIBIERENDER AKTIVITÄT (FORMEL IV)
Gemäß einem weiteren Aspekt beinhalten erfindungsgemäße NAPs auch ein isoliertes Protein mit Serinprotease inhibieren der Aktivität und mit einer oder mehreren NAP-Domänen, wobei jede NAP-Domäne die folgende Sequenz einschließt: Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10, ("FORMEL IV"), wobei

(a) A1 eine Aminosäuresequenz mit 7 bis 8 Aminosäureresten ist;
(b) A2 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 5 Aminosäureresten ist;
(c) A3 eine Aminosäuresequenz mit 3 Aminosäureresten ist;
(d) A4 eine Aminosäuresequenz mit 6 bis 19 Aminosäureresten ist;
(e) A5 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 4 Aminosäureresten ist;
(f) A6 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 5 Aminosäureresten ist;
(g) A7 ein Aminosäurerest ist;
(h) A8 eine Aminosäuresequenz mit 10 bis 12 Aminosäureresten ist;
(i) A9 eine Aminosäuresequenz mit 5 bis 7 Aminosäureresten ist; und
(j) A10 eine Aminosäuresequenz mit 1 bis 25 Aminosäureresten ist.

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP-Proteine gemäß diesem Aspekt enthalten, und Verfahren zur Inhibierung der Blutkoagulation, bei denen erfindungsgemäße NAP-Proteine verabreicht werden, sind erfindungsgemäß auch vorgesehen. NAP-Proteine gemäß diesem Aspekt der Erfindung haben mindestens eine NAP-Domäne. Bevorzugt sind NAPs mit einer oder zwei NAP-Domänen. Bevorzugt sind NAP-Domänen, die Aminosäuresequenzen haben, die im Wesentlichen die gleichen wie die NAP-Domänen von HpoNAP5 [SEQ. ID. Nr. 60] oder NamNAP [SEQ. ID. Nr. 61] sind. NAP-Proteine HpoNAP5 [SEQ. ID. Nr. 60 und 40] und NamNAP6 [SEQ. ID. Nr. 61] haben eine NAP-Domäne und sind bevorzugte NAPs gemäß diesem Aspekt der Erfindung.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt haben NAPs, die Serinproteaseaktivität zeigen, mindestens eine NAP-Domäne der Formel IV, die die folgende Aminosäuresequenz einschließt: Cys-A1- Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10, wobei (a) Cys-A1 ausgewählt ist aus SEQ. ID. Nr. 86 und 254; (b) Cys-A2-Cys ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 255 bis 257; (c) A3-Cys-A4 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 258 bis 271; (d) Cys-A5 ausgewählt ist aus SEQ. ID. Nr. 272 und 273; (e) Cys-A6 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 274 bis 276; (f) Cys-A7-Cys-A8 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 277 bis 279; (g) Cys-A9 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 280 bis 282 und (h) Cys-A10 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 283 bis 307.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat A3 die Sequenz Glu-A3_a-A3_b hat, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind. A3 ist insbesondere Glu-Pro-Lys.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat A5 die Sequenz A5_a-A5_b-A5_c hat, wobei A5_a bis A5_c unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind. A5_a ist vorzugsweise Thr, und A5_c ist Asn. Eine besonders bevorzugte A₅-Sequenz enthält Thr-Leu-Asn oder Thr-Met-Asn.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist ein bevorzugter A7-Aminosäurerest Gln.
Gemäß einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist ein bevorzugtes NAP-Molekül eines, bei dem

(a) A3 die Sequenz Glu-A3_a-A3_b hat, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind;
(b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist;
(c) A5 die Sequenz A5_a-A5_b-A5_c hat, wobei A5_a bis A5_C unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind; und
(d) A7 Gln ist. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform enthalten, und Verfahren zur Inhibierung der Blutkoagulation, bei denen erfindungsgemäße NAP-Proteine verabreicht werden, sind erfindungsgemäß auch vorgesehen. NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung haben mindestens eine NAP-Domäne. Bevorzugt sind NAPs mit einer oder zwei NAP-Domänen. NAP-Proteine HpoNAP5 [SEQ. ID. Nr. 60] und NamNAP [SEQ. ID. Nr. 61] haben eine NAP-Domäne und sind bevorzugte NAPs gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung.

(a) A3 Glu-Pro-Lys ist;
(b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist;
(c) A5 ausgewählt ist aus Thr-Leu-Asn und Thr-Met-Asn; und
(d) A7 Gln ist. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform enthalten, und Verfahren zur Inhibierung der Blutkoagulation, bei denen erfindungsgemäße NAP-Proteine verabreicht werden, sind erfindungsgemäß auch vorgesehen. NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung haben mindestens eine NAP-Domäne. Bevorzugt sind NAPs mit einer oder zwei NAP-Domänen. NAP-Proteine HpoNAP5 [SEQ. ID. Nr. 60] und NamNAP [SEQ. ID. Nr. 61] haben eine NAP-Domäne und sind bevorzugte NAPs gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung.

Bevorzugte NAP-Proteine mit Serinprotease inhibierender Aktivität gemäß allen Ausführungsformen, die oben für diesen Aspekt der Erfindung genannt wurden, können von einer Nematodenspezies abgeleitet werden. Eine bevorzugte Nematodenspezies ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus und Heligomosomoides polygyrus. Besonders bevorzugt sind die NAP-Proteine HpoNAP5 und NamNAP, die von Heligomosomoides polygyrus und Necator americanus abgeleitet sind.
Dieser Aspekt der Erfindung umfasst auch isolierte rekombinante cDNA-Moleküle, die ein Protein mit Serinprotease inhibierender Aktivität kodieren, wobei das Protein gemäß jeder der oben für isoliertes NAP-Protein mit Serinprotease inhibierender Aktivität genannten Ausführungsformen definiert ist. Bevorzugte cDNAs gemäß diesem Aspekt haben Nukleotidsequenzen [SEQ. ID. Nr. 14] (HpoNAP5) und [SEQ. ID. Nr. 39] (NamNAP) und kodieren HpoNAP5 [SEQ. ID. Nr. 60] und NamNAP [SEQ. ID. Nr. 61].
Die Serinprotease inhibierende Aktivität kann unter Verwendung von beliebigen der Assays bestimmt werden, die in den Beispielen A bis F offenbart sind, oder jeglichem üblicherweise verwendeten enzymatischen Assay zum Messen der Inhibierung der Serinproteaseaktivität. Verfahren für mehrere enzymatische Assays finden sich in den Bänden von Methods of Enzymology oder ähnlichen Referenzmaterialien. Bevorzugte NAPs haben Serinprotease inhibierende Aktivität, die gegen Enzyme in der Blutkoagulationskaskade oder gegen Trypsin/Elastase gerichtet ist.
NAPS MIT ANTIKOAGULANSAKTIVITÄT (FORMEL V)
Gemäß einem weiteren Aspekt beinhalten erfindungsgemäße NAPs auch ein isoliertes Protein mit Antikoagulansaktivität und mit einer oder mehreren NAP-Domänen, wobei jede NAP-Domäne die folgende Sequenz einschließt: Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10 ("FORMEL V"), wobei

(a) A1 eine Aminosäuresequenz mit 7 bis 8 Aminosäureresten ist;
(b) A2 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 5 Aminosäuren ist;
(c) A3 eine Aminosäuresequenz mit 3 Aminosäureresten ist;
(d) A4 eine Aminosäuresequenz mit 6 bis 19 Aminosäureresten ist;
(e) A5 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 4 Aminosäureresten ist;
(f) A6 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 5 Aminosäureresten ist;
(g) A7 ein Aminosäurerest ist;
(h) A8 eine Aminosäuresequenz mit 11 bis 12 Aminosäureresten ist;
(i) A9 eine Aminosäuresequenz mit 5 bis 7 Aminosäureresten ist; und
(j) A10 eine Aminosäuresequenz mit 5 bis 25 Aminosäureresten ist.

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP-Proteine gemäß diesem Aspekt enthalten, und Verfahren zur Inhibierung der Blutkoagulation, bei denen erfindungsgemäße NAP-Proteine ver abreicht werden, sind erfindungsgemäß auch vorgesehen. NAP-Proteine gemäß diesem Aspekt der Erfindung haben mindestens eine NAP-Domäne. Bevorzugt sind NAPs mit einer oder zwei NAP-Domänen. Bevorzugte NAPs schließen jene mit mindestens einer NAP-Domäne mit einer Aminosäuresequenz ein, die im Wesentlichen die gleiche wie irgendeine von [SEQ. ID. Nr. 40 bis 58] ist. Die NAP-Proteine AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 40], AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 41], AcaNAP48 [SEQ. ID. Nr. 42], AcaNAP23 [SEQ. ID. Nr. 43], AcaNAP24 [SEQ. ID. Nr. 44], AcaNAP25 [SEQ. ID. Nr. 45], AcaNAP44 [SEQ. ID. Nr. 46], AcaNAP31 [SEQ. ID. Nr. 47], AduNAP4 [SEQ. ID. Nr. 55], AceNAP5 [SEQ. ID. Nr. 57] und AceNAP7 [SEQ. ID. Nr. 58] haben eine NAP-Domäne und sind bevorzugte NAPs gemäß diesem Aspekt der Erfindung. Die NAP-Proteine AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 62], AcaNAP45 [SEQ. ID. Nr. 63], AcaNAP47 [SEQ. ID. Nr. 64] und AduNAP7 [SEQ. ID. Nr. 65] haben zwei NAP-Domänen und sind bevorzugte NAPs gemäß diesem Aspekt der Erfindung.
Bevorzugte erfindungsgemäße NAPs gemäß diesem Aspekt enthalten isolierte Proteine mit Antikoagulansaktivität und mit mindestens einer NAP-Domäne der Formel V, die die folgende Sequenz einschließt:
Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10, wobei (a) Cys-A1 ausgewählt ist aus SEQ. ID. Nr. 87 und 308; (b) Cys-A2-Cys ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 309 bis 311; (c) A3-Cys-A4 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 312 bis 325; (d) Cys-A5 ausgewählt ist aus SEQ. ID. Nr. 326 und 327; (e) Cys-A6 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 328 bis 330; (f) Cys-A7-Cys-A8 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 331 bis 332; (g) Cys-A9 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 333 bis 335 und (h) Cys-A10 ausgewählt ist aus einer von SEQ. ID. Nr. 336 bis 356.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat A3 die Sequenz Glu-A3_a-A3_b, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind. A3_a ist insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ala, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu und Thr, und A3_b ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lys, Thr und Arg. Besonders bevorzugte A3-Sequenzen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys und Glu-Thr-Lys.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist ein bevorzugter A7-Aminosäurerest Val oder Ile.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieser Ausführungsform der Erfindung ist eine, bei der A8 die Aminosäuresequenz A8_a-A8_b-A8_C-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g [SEQ. ID. Nr. 68] einschließt,
wobei

Vorzugsweise ist A8_C Gly, A8_d ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phe, Tyr und Leu, A8_e ist Tyr, A8_f ist Arg, und A8_g ist ausgewählt aus Asp und Asn. Eine bevorzugte A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g-Sequenz ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 72] und Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 73].
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist eine, in der A10 eine Aminosequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. Nr. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. Nr. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. Nr. 76] und Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. Nr. 77] einschließt. Die NAP-Proteine AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4 und 40] und AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6 und 41] schließen die Aminosäuresequenz Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. Nr. 74] in A10 ein und sind bevorzugte NAPs gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung. Das NAP-Protein AcaNAP48 [SEQ. ID. Nr. 42] schließt die Aminosäuresequenz Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. Nr. 75] in A10 ein und ist ein bevorzugtes NAP gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung. Die NAP-Proteine AcaNAp23 [SEQ. ID. Nr. 43], AcaNAP24 [SEQ. ID. Nr. 44], AcaNAP25 [SEQ. ID. Nr. 45], AcaNAP44 [SEQ. ID. Nr. 46], AcaNAP31 [SEQ. ID. Nr. 47] und AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 48, 49 und 62] enthalten die Aminosäuresequenz Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. Nr. 76] und sind bevorzugte NAPs gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung. Die NAP-Proteine AcaNAP45 [SEQ. ID. Nr. 50, 53 und 63], AcaNAP47 [SEQ. ID. Nr. 51, 54 und 64], AduNAP7 [SEQ. ID. Nr. 52, 56 und 65], AduNAP4 [SEQ. ID. Nr. 55], AceNAP5 [SEQ. ID. Nr. 57] und AceNAP7 [SEQ. ID. Nr. 58] enthalten die Aminosäuresequenz Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. Nr. 77] und sind auch bevorzugte NAPs gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung.
Gemäß einer Ausführungsform ist ein bevorzugtes NAP-Molekül eines, bei dem

(a) A3 die Sequenz Glu-A3_a-A3_b hat, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind;
(b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist;
(c) A7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Val und Ile;
(d) A8 eine Aminosäuresequenz einschließt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ, ID. Nr. 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 72] und Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 73], und
(e) A10 eine Aminosequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. Nr. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. Nr. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. Nr. 76] und Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. Nr. 77] einschließt. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform enthalten, und Verfahren zur Inhibierung der Blutkoagulation, bei denen erfindungsgemäße NAP-Proteine verabreicht werden, sind erfindungsgemäß auch vorgesehen. NAP-Proteine gemäß diesem Aspekt der Erfindung haben mindestens eine NAP-Domäne. Bevorzugt sind NAPs mit einer oder zwei NAP-Domänen. Die NAP-Proteine AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4 und 40], AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6 und 41], AcaNAP48 [SEQ. ID. Nr. 42], AcaNAP23 [SEQ. ID. Nr. 43], AcaNAP24 [SEQ. ID. Nr. 44], Aca NAP25 [SEQ. ID. Nr. 45], AcaNAP44 [SEQ. ID. Nr. 46], AcaNAP31 [SEQ. ID. Nr. 47], AduNAP4 [SEQ. ID. Nr. 55], AceNAP5 [SEQ. ID. Nr. 57] und AceNAP7 [SEQ. ID. NO. 58] haben eine NAP-Domäne und sind bevorzugte NAPs gemäß dieser Ausführungsform. Die NAP-Proteine AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 62], AcaNAP45 [SEQ. ID. Nr. 63], AcaNAP47 [SEQ. ID. Nr. 64] und AduNAP7 [SEQ. ID. Nr. 65] haben zwei NAP-Domänen und sind bevorzugte NAPs gemäß dieser Ausführungsform.

(a) A3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys und Glu-Thr-Lys;
(b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist;
(c) A7 Val oder Ile ist;
(d) A8 eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus A8_a-A8_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 78], A8_a-A8_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 79], A8_a-A8_b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 80], A8_a-A8_b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 81] und A8_a-A8_b-Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 82] einschließen, wobei mindestens eine von A8_a und A8_b Glu oder Asp ist;
(e) A9 eine Aminosäuresequenz von fünf Aminosäureresten ist; und
(f) A10 eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. Nr. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. Nr. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. Nr. 76] und Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. Nr. 77] einschließt. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform enthalten, und Verfahren zur Inhibierung der Blutkoagulation, bei denen erfindungsgemäße NAP-Proteine verabreicht werden, sind erfindungsgemäß auch vorgesehen. NAP-Proteine gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung haben mindestens eine NAP-Domäne. Bevorzugt sind NAPs mit einer oder zwei NAP-Domänen. Die NAP-Proteine AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4 und 40], AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6 und 41], AcaNAP48 [SEQ. ID. Nr. 42], AcaNAP23 [SEQ. ID. Nr. 43], AcaNAP24 [SEQ. ID. Nr. 44], AcaNAP25 [SEQ. ID. Nr. 45], AcaNAP44 [SEQ. ID. Nr. 46], AcaNAP31 [SEQ. ID. Nr. 47], AduNAP4 [SEQ. ID. Nr. 55], AceNAP5 [SEQ. ID. Nr. 57] und AceNAP7 [SEQ. ID. NO. 58] haben eine NAP-Domäne und sind bevorzugte NAPs gemäß dieser Ausführungsform. Die NAP-Proteine AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 62], AcaNAP45 [SEQ. ID. Nr. 63], AcaNAP47 [SEQ. ID. Nr. 64] und AduNAP7 [SEQ. ID. Nr. 65] haben zwei NAP-Domänen und sind bevorzugte NAPs gemäß dieser Ausführungsform.

Bevorzugte NAP-Proteine mit Antikoagulansaktivität gemäß allen Ausführungsformen, die oben für diesen Aspekt der Erfindung genannt wurden, können von einer Nematodenspezies abgeleitet werden. Eine bevorzugte Nematodenspezies ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus und Heligomosomoides polygyrus. Besonders bevorzugt sind die NAP-Proteine AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4 and 40], AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6 und 41], AcaNAP48 [SEQ. ID. Nr. 42], AcaNAP23 [SEQ. ID. Nr. 43], AcaNAP24 [SEQ. ID. Nr. 44], AcaNAP25 [SEQ. ID. Nr. 45], AcaNAP44 [SEQ. ID. Nr. 46], AcaNAP45 [SEQ. ID. Nr. 63], AcaNAP47 [SEQ. ID. Nr. 64] und AcaNAP31 [SEQ. ID. Nr. 47], die von Ancylostoma caninum abgeleitet sind; AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 62], AceNAP5 [SEQ. ID. Nr. 57] und AceNAP7 [SEQ. ID. Nr. 58], die von Ancylostoma ceylanicum abgeleitet sind; und AduNAP7 [SEQ. ID. Nr. 65] und AduNAP4 [SEQ. ID. Nr. 55), die von Ancylostoma duodenale abgeleitet sind.
Dieser Aspekt der Erfindung umfasst auch isolierte rekombinante cDNA-Moleküle, die ein Protein mit Antikoagulansaktivität kodieren, wobei das Protein gemäß jeder der oben für isoliertes NAP-Protein mit Antikoagulansaktivität genannten Ausführungsformen definiert ist. Zu bevorzugten cDNAs gemäß diesem Aspekt gehören AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 3], AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 5], AcaNAP48 [SEQ. ID. Nr. 38], AcaNAP23 [SEQ. ID. Nr. 31], AcaNAP24 [SEQ. ID. Nr. 32], AcaNAP25 [SEQ. ID. Nr. 33], AcaNAP44 [SEQ. ID. Nr. 35], AcaNAP31 [SEQ. ID. Nr. 34], AduNAP4 [SEQ. ID. Nr. 12], AceNAP5 [SEQ. ID. Nr. 10], AceNAP7 [SEQ. ID. Nr. 11], AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 9], AcaNAP45 [SEQ. ID. Nr. 36], AcaNAP47 [SEQ. ID. Nr. 37] und AduNAP7 [SEQ. ID. Nr. 13].
Die Antikoagulansaktivität von NAPs gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann mit den hier beschriebenen Protokollen bestimmt werden. Beispiele B und F zeigen spezielle brauchbare Verfahren zur Bewertung der Antikoagulationsaktivität eines NAPs. Die Verfahren, die zum Detektieren von NAPs mit fXa inhibierender Aktivität (Beispiele A, C) und fVIIa/TF inhibierender Aktivität (Beispiel E) beschrieben werden, sind auch zur Bewertung der Antikoagulationsaktivität eines NAPs brauchbar.
OLIGONUKLEOTIDE
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Oligonukleotid, das eine Sequenz enthält, die ausgewählt ist aus:
YG109: TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [SEQ. ID. Nr. 88],
YG103: AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [SEQ. ID. Nr. 89],
NAP-1: AAR-CCN-TGY-GAR-MGG-AAR-TGY [SEQ. ID. Nr. 90] und
NAP-4.RC: TW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NAC-RCA [SEQ. ID. Nr. 91].
Diese Oligonukleotidsequenzen hybridisieren mit Nukleinsäuresequenzen, die NAP-Protein kodieren.
Die isolierten erfindungsgemäßen NAPs schließen jene mit Variationen in der offenbarten Aminosäuresequenz oder den offenbarten Aminosäuresequenzen einschließlich Fragmenten, natürlich vorkommenden Mutationen, allelen Varianten, statistisch erzeugten künstlichen Mutanten und absichtlichen Sequenzvarianten ein, wobei alle hiervon die Antikoagulansaktivität beibehalten. Der Begriff "Fragmente" bezieht sich auf jeden Teil der Sequenz, der weniger Aminosäuren als das vollständige Protein enthält, wie beispielsweise partielle Sequenzen außer Abschnitten am Aminoterminus, Carboxyterminus oder zwischen dem Aminoterminus und Carboxyterminus des vollständigen Proteins.
Die erfindungsgemäßen isolierten NAPs schließen auch Proteine mit einer rekombinanten Aminosäuresequenz oder -sequenzen ein, die die Antikoagulansaktivität der NAP-Domänen-Amino säuresequenz oder -sequenzen beibehält bzw. beibehalten. Die Formulierung "NAP-Protein" oder der Begriff "Protein" bedeutet in Bezugnahme auf ein Protein, das eine NAP-Domäne enthält, ohne Unterscheidung natives NAP-Protein und NAP-Protein, das mit rekombinanten Mitteln hergestellt ist. Zu diesen rekombinanten Proteinen gehören Hybridproteine, wie Fusionsproteine, Proteine, die aus der Expression mehrerer Gene innerhalb des Expressionsvektors resultieren, Proteine, die aus der Expression mehrerer Gene innerhalb des Chromosoms der Wirtszelle resultieren, und können ein Polypeptid mit Antikoagulansaktivität eines offenbarten Proteins einschließen, das über Peptidbindungen an ein zweites Polypeptid gebunden ist. Zu den rekombinanten Proteinen gehören auch Varianten der erfindungsgemäßen NAP-Domäne-Aminosäuresequenz oder -sequenzen, die sich nur durch konservative Aminosäuresubstitution unterscheiden. Konservative Aminosäuresubstitutionen sind in Tabelle 1 von W. R. Taylor, J. Mol. Biol., 188:233 (1986) von als "Sets" definiert. Die rekombinanten Proteine enthalten auch Varianten der erfindungsgemäß offenbarten isolierten NAP-Domänen-Aminosäuresequenz oder -sequenzen, in denen Aminosäuresubstitutionen oder -deletionen vorgenommen wurden, die die Antikoagulansaktivität der isolierten NAP-Domänensequenz oder -sequenzen konservieren.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, das durch biochemische Verfahren aus der Nematode Ancylostoma caninum isoliert wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Dieses Protein erhöht die Gerinnungszeit von menschlichem Plasma in den PT- und aPTT-Assays, enthält eine NAP-Domäne und ist durch einen N-Terminus mit der Aminosäuresequenz Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp [SEQ. ID. Nr. 92] und ein Molekulargewicht von etwa 8,7 Kilodalton bis etwa 8,8 Kilodalton charakterisiert, bestimmt mittels Massenspektrometrie.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beinhalten die Proteine mit Antikoagulansaktivität, die durch rekombinante Verfahren aus der cDNA-Bibliothek hergestellt worden sind, die aus der Nematode Ancylostoma caninum isoliert wurde, beispielsweise AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4 oder 40], AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6 oder 41], Pro-AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 7], Pro-AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 8], AcaNAP48 [SEQ. ID. Nr. 42], AcaNAP23 [SEQ. ID. Nr. 43], AcaNAP24 [SEQ. ID. Nr. 44], AcaNAP25 [SEQ. ID. Nr. 45], AcaNAP44 [SEQ. ID. Nr. 46], AcaNAP31 [SEQ. ID. Nr. 47], AcaNAP45 [SEQ. ID. Nr. 63], AcaNAP47 [SEQ. ID. Nr. 64] und AcaNAPc2 [SEQ. ID. Nr. 59]; isoliert aus der Nematode Ancyclostoma ceylanium, beispielsweise AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 62], AceNAP5 [SEQ. ID. Nr. 57] und AceNAP7 [SEQ. ID. Nr. 58]; isoliert aus der Nematode Ancydostoma duodenale, beispielsweise AduNAP4 [SEQ. ID. Nr. 55] und AduNAP7 [SEQ. ID. Nr. 65]; isoliert aus der Nematode Heligmosmoides polygyrus, beispielsweise HpoNAP5 [SEQ. ID. Nr. 60], und der Nematode Necator americanus, beispielsweise NamNAP [SEQ. ID. Nr. 61]. Die Aminosäuresequenzen dieser Proteine sind in den 11 und 16 und an anderer Stelle gezeigt. Jede derartige bevorzugte Ausführungsform erhöht die Gerinnungszeit von menschlichem Plasma in den PT- und aPTT-Assays und enthält mindestens eine NAP-Domäne.
In Bezug auf "isolierte Proteine" werden die erfindungsgemäßen Proteine durch Verfahren zur Proteinreinigung isoliert, die in der Technik wohl bekannt sind oder wie nachfolgend offenbart sind. Sie können aus einer natürlichen Quelle, aus einer chemischen Mischung nach chemischer Synthese an einer festen Phase oder in Lösung, wie Festphase-automatisierter Peptidsynthese, oder aus einer Zellkultur nach Produktion durch rekombinante Verfahren isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch, wie hier nachfolgend näher erläutert wird, pharmazeutische Zusammensetzungen, die NAP enthalten, und Verfahren zur Verwendung von NAP zum Inhibieren des Prozesses der Blutkoagulation und assoziierter Thrombose. Oligonukleotidsonden, die zum Identifizieren von NAP-Nukleinsäure in einer Probe brauchbar sind, sind erfindungsgemäß auch eingeschlossen, wie nachfolgend näher erläutert wird.
1. AUS NATÜRLICHEN QUELLEN ISOLIERTES NAP
Die erfindungsgemäßen bevorzugten isolierten Proteine (NAPs) können aus natürlichen Quellen isoliert und gereinigt werden. Bevorzugt als natürliche Quellen sind Nematoden, zu geeigneten Nematoden gehören Darmnematoden, wie Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus und Heligmosomoides polygyrus. Besonders bevorzugt als natürliche Quelle ist die hämatophage Nematode, der Hakenwurm Ancylostoma caninum.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Proteine werden aus ihren natürlichen Quellen nach Verfahren isoliert und gereinigt, die in den biochemischen Techniken bekannt sind. Zu diesen Verfahren gehört das Herstellen eines löslichen Extrakts und Anreichern des Extrakts mit chromatographischen Verfahren auf unterschiedlichen festen Trägermatrizes. Zu bevorzugten Reinigungsverfahren gehört die Präparation eines löslichen Extrakts einer Nematode in 0,02 M Tris-HCl, pH 7,4-Puffer, der verschiedene Proteaseinhibitoren enthält, gefolgt von sequentieller Chromatographie des Extrakts durch Säulen, die Concanavalin-A-Sepharose-Matrix, Poros20 HQ-Kationenaustauschermatrix, Superdex30 Gelfiltrationsmatrix und eine C₁₈-Umkehrphasenmatrix enthalten. Die durch diese Chromatographiesäulen aufgefangenen Fraktionen können durch ihre Fähigkeit selektiert werden, die Gerinnungszeit von menschlichem Plasma zu erhöhen, gemessen durch die PT- und aPTT-Assays, oder durch ihre Fähigkeit, die amidolytische Aktivität von Faktor Xa zu inhibieren, wie in einem kolorimetrischen amidolytischen Assay unter Verwendung von gereinigtem Enzym oder anderen Verfahren gemessen wird, die hier in den Beispielen A bis F offenbart werden. Ein Beispiel für ein bevorzugtes Reinigungsverfahren eines erfindungsgemäßen isolierten Proteins beinhaltet dasjenige, welches in Beispiel 1 offenbart ist.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Proteine enthalten, wenn sie aus einer natürlichen Quelle, wie Ancylostoma caninum wie beschrieben gereinigt werden, jene, die die folgende Aminosäuresequenz enthalten: Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp [SEQ. ID. Nr. 92]. Besonders bevorzugt sind die gereinigten Proteine mit dieser Aminosäuresequenz an ihrem Aminoterminus, wie in 2 (AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4]) oder 4 (AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6]) gezeigt ist. Es wurde gezeigt, dass ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Protein die Aminosäuresequenz Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp-Leu-Asp [SEQ. ID. Nr. 92] an ihrem Aminoterminus hat und ein Molekulargewicht von 8,7 bis 8,8 Kilodalton hat, bestimmt mittels Massenspektrometrie.
2. DURCH CHEMISCHE SYNTHESE HERGESTELLTES NAP
Die bevorzugten erfindungsgemäßen isolierten NAPs können durch Standardverfahren synthetisiert werden, die in der chemischen Technik bekannt sind.
Die erfindungsgemäßen isolierten Proteine können unter Verwendung von Festphasensynthese hergestellt werden, wie jener, die von Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85:2149 (1964) beschrieben wurde, oder anderen gleichwertigen Verfahren, die in der chemischen Technik bekannt sind, wie dem von Houghten in Proc. Natl. Acad. Sci., 82:5132 (1985) beschriebenen Verfahren.
Festphasensynthese geht von dem C-Terminus des Peptids aus, indem eine geschätzte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid an ein geeignetes unlösliches Harz gekoppelt werden. Zu geeigneten Harzen gehören jene, die Chlormethyl-, Brommethyl-, Hydroxylmethyl-, Aminomethyl-, Benzhydryl- und t-Alkyloxycarbonylhydrazidgruppen enthalten, an die die Aminosäure direkt gekoppelt werden kann.
Bei dieser Festphasensynthese wird zuerst die carboxyterminale Aminosäure, wobei ihre α-Aminogruppe und, falls erforderlich, ihre reaktive Seitenkettengruppe geeignet geschützt sind, an das unlösliche Harz gekoppelt. Nach Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe, wie durch Behandlung mit Trifluoressigsäure in einem geeigneten Lösungsmittel, wird die nächste Aminosäure oder das nächste Peptid, bei der bzw. dem die α-Aminogruppe und, falls nötig, jegliche reaktive Seitenkettengruppe oder -gruppen geeignet geschützt sind, an die freie α-Aminogruppe der an das Harz gekoppelten Aminosäure gekoppelt.
Weitere geeignet geschützte Aminosäuren oder Peptide werden in der gleichen Weise an die wachsende Peptidkette gekoppelt, bis die gewünschte Aminosäuresequenz erreicht worden ist. Die Synthese kann manuell, durch Verwendung automatisierter Peptidsynthesegeräte oder eine Kombination hiervon erfolgen.
Die Kopplung der geeignet geschützten Aminosäure oder des geeignet geschützten Peptids mit der freien α-Aminogruppe der harzgebundenen Aminosäure kann gemäß konventionellen Kopplungsverfahren durchgeführt werden, wie dem Azidverfahren, gemischten Anhydridverfahren, DCC (Dicyclohexylcarbodiimid)-Verfahren, aktiviertem Esterverfahren (p-Nitrophenylester oder N-Hydroxysuccinimidester), BOP (Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(diamino)phosphoniumhexafluorphosphat)-Verfahren oder Woodward-Reagenz K-Verfahren.
Es ist bei der Peptidsynthese üblich, dass die Schutzgruppen für die α-Aminogruppe der Aminosäuren oder Peptide, die an die an dem unlöslichen Harz befestigte wachsende Peptidkette gekoppelt werden, unter Bedingungen entfernt werden, die die Seitenkettenschutzgruppen nicht entfernen. Nach Abschluss der Synthese ist es auch üblich, das Peptid von dem unlöslichen Harz zu entfernen, und die Seitenkettenschutzgruppen werden während und nach dieser Entfernung entfernt.
Geeignete Schutzgruppen für die α-Aminogruppe aller Aminosäuren und die ω-Aminogruppe von Lysin umfassen Benzyloxycarbonyl, Isonicotinyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrophenyloxycarbonyl, p-Methoxyphenyloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, 2-(4-Biphenyl)-2-propyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Methylsulfonylethoxylcarbonyl, Trifluracetyl, Phthalyl, Formyl, 2-Nitrophenylsulfphenyl, Diphenylphosphinothioyl, Dimethylphosphinothioyl und dergleichen.
Geeignete Schutzgruppe für die Carboxygruppe von Asparaginsäure und Glutaminsäure beinhalten Benzylester, Cyclohexylester, 4-Nitrobenzylester, t-Butylester, 4-Pyridylmethylester und dergleichen.
Geeignete Schutzgruppen für die Guanidinogruppe von Arginin beinhalten Nitro, p-Toluolsulfonyl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, p-Methoxybenzolsulfonyl, 4-Methoxy-2,6-dimethylbenzolsulfonyl, 1,3,5-Trimethylphenylsulfonyl und dergleichen.
Geeignete Schutzgruppen für die Thiolgruppe von Cystein beinhalten p-Methoxybenzyl, Triphenylmethyl, Acetylaminomethyl, Ethylcarbamoyl, 4-Methylbenzyl, 2,4,6-Trimethylbenzyl und dergleichen.
Geeignete Schutzgruppen für die Hydroxygruppe von Serin beinhalten Benzyl, t-Butyl, Acetyl, Tetrahydropyranyl und dergleichen.
Das vollständige Peptid kann durch Behandlung mit flüssiger Fluorwasserstoffsäure, die ein oder mehrere thiohaltige Abfangmittel enthält, bei reduzierten Temperaturen von dem Harz abgespalten werden. Die Spaltung des Peptids von dem Harz durch diese Behandlung entfernt auch alle Seitenkettenschutzgruppen von dem Peptid.
Das abgespaltene Peptid wird in verdünnter Essigsäure gelöst und anschließend filtriert, danach sich erneut falten gelassen und die richtige Disulfidbindungsbildung zu erzeugen, indem in 0,1 M Essigsäurelösung auf eine Peptidkonzentration von etwa 0,5 mM bis etwa 2 mM verdünnt wird. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit Ammoniumhydroxid auf etwa 8,0 eingestellt, und die Lösung wird offen an der Luft etwa 24 bis etwa 72 Stunden gerührt.
Das erneut gefaltete Peptid wird durch Chromatographie, vorzugsweise durch Hochdruck-Flüssigchromatographie an einer Umkehrphasensäule gereinigt, wobei mit einem Gradienten von Acetonitril in Wasser (das auch 0,1 % Trifluoressigsäure enthielt) eluiert wurde, wobei der bevorzugte Gradient von 0 bis etwa 80 % Acetonitril in Wasser lief. Nach Auffangen der Fraktionen, die das reine Peptid enthielten, wurden die Fraktionen zusammengegeben und zu dem festen Peptid lyophilisiert.
3. DURCH REKOMBINANTE VERFAHREN HERGESTELLTES NAP
Die bevorzugten isolierten erfindungsgemäßen NAPs können alternativ mittels rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt werden, die hier gelehrt werden und in der biologischen Tech nik wohl bekannt sind. J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Bände 1 bis 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Rekombinante DNA-Verfahren ermöglichen, dass Segmente von genetischen Informationen, DNA, aus unterschiedlichen Organismen außerhalb der Organismen, von denen die DNA erhalten wurde, miteinander verbunden werden kann und diese Hybrid-DNA in die Zelle eingebracht werden kann, die die Produktion des Proteins ermöglicht, das die ursprüngliche DNA kodiert.
Genetische Informationen, die ein erfindungsgemäßes Protein kodieren, können aus der genomen DNA oder mRNA eines Organismus nach im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren erhalten werden. Bevorzugte Verfahren, um diese genetische Informationen zu erhalten, beinhalten das Isolieren von mRNA aus einem Organismen, Umwandeln derselben in ihre komplementäre DNA (cDNA), Einbauen der cDNA in einen geeigneten Klonierungsvektor und Identifizieren des Klons, der die rekombinante cDNA enthält, die das gewünschte Protein kodiert, mittels Hybridisierung mit passenden Oligonukleotidsonden, die aus bekannten Sequenzen des Proteins aufgebaut sind.
Die genetischen Informationen in der rekombinanten cDNA, die ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, kann zu einem Expressionsvektor ligiert werden, der Vektor in Wirtszellen eingeführt werden und die genetischen Informationen als Protein exprimiert werden, das es kodiert.
(A) Herstellung der cDNA-Bibliothek
Bevorzugte natürliche Quellen für mRNA, aus denen eine cDNA-Bibliothek aufgebaut werden soll, sind Nematoden, zu denen Darmnematoden gehören, wie Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus und Heligmosomoides polygyrus. Besonders bevorzugt als natürliche Quelle der mRNA ist die Hakenwurmnematode Ancylostoma caninum.
Bevorzugte Verfahren zum Isolieren von mRNA, die ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, zusammen mit anderer mRNA aus einem Organismus, beinhalten Chromatographie an Poly-U- oder Poly-T-Affinitätsgelen. Besonders bevorzugte Verfahren zum Isolieren der mRNA aus Nematoden beinhalten das Verfahren und die Materialien, die in dem Reinigungskit QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) bereitgestellt werden.
Bevorzugte Verfahren, um doppelsträngige cDNA aus isolierter mRNA zu erhalten, beinhalten das Synthetisieren einer einsträngigen cDNA an dem mRNA-Templat unter Verwendung von reverser Transkriptase, Abbau der an den cDNA-Strang hybridisierten RNA unter Verwendung einer Ribonuklease (RNase) und Synthetisieren eines komplementären DNA-Strangs durch Verwendung einer DNA-Polymerase, um eine doppelsträngige cDNA zu ergeben. Bei besonders bevorzugten Verfahren werden etwa 3 Mikrogramm aus einer Nematode isolierte mRNA in doppelsträngige cDNA umgewandelt, wobei reverse Transkriptase des Avian Myeloblastosis Virus, Rnase H und DNA-Polymerase I von E. coli und T4 DNA-Polymerase verwendet werden.
Dann wird cDNA, die ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, zusammen mit der anderen cDNA in der wie oben aufgebauten Bibliothek in Klonierungsvektoren ligiert. Klonierungsvektoren enthalten eine DNA-Sequenz, die die cDNA aus der cDNA-Bibliothek akkomodiert. Die Vektoren, die die cDNA-Bibliothek enthalten, werden in Wirtszellen eingeführt, die stabil existieren können und eine Umgebung zur Verfügung stellen, in der der Klonierungsvektor repliziert wird. Zu geeigneten Klonierungsvektoren gehören Plasmide, Bakteriophagen, Viren und Cosmide. Zu bevorzugten Klonierungsvektoren gehören die Bakteriophagen. Besonders bevorzugte Klonierungsvektoren schließen den Bakteriophagen lambda gt11 Sfi-Not Vektor ein.
Die Konstruktion geeigneter Klonierungsvektoren, die die cDNA-Bibliothek und Kontrollsequenzen enthalten, verwenden Standard-Ligierungs- und Restriktionstechniken, die in der Technik wohl bekannt sind. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonukleotide werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschten Form erneut ligiert.
In Bezug auf Restriktionstechniken wird die stellenspezifische Spaltung der cDNA durch Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym unter Bedingungen durchgeführt, die in der Technik allgemein bekannt sind und deren Einzelheiten die Her steller dieser im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme angeben. Siehe beispielsweise die Produktkataloge von New England Biolabs, Promega und Stratagene Cloning Systems.
Allgemein wird etwa 1 Mikrogramm der cDNA durch Behandlung in etwa einer Einheit eines Restriktionsenzyms in etwa 20 Mikrolitern Pufferlösung gespalten. In der Regel wird ein Überschuss an Restriktionsenzym verwendet, um vollständige Spaltung der cDNA zu gewährleisten. Üblicherweise werden Inkubationszeiten von etwa 1 bis 2 Stunden bei etwa 37°C verwendet, obwohl Ausnahmen bekannt sind. Nach jeder Spaltungsreaktion kann das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt werden, gegebenenfalls gefolgt von Chromatographie über eine Gelfiltrationssäule, wie Sephadex^® G50. Alternativ können gespaltene cDNA-Fragmente mittels ihrer Größen durch Elektrophorese in Polyacrylamid oder Agarosegelen getrennt und unter Verwendung von Standardtechniken isoliert werden. Eine allgemeine Beschreibung von Größentrennungen findet sich in Methods of Enzymology, 65:499–560 (1980).
Die mit Restriktionsenzym gespaltenen cDNA-Fragmente werden danach in einen Klonierungsvektor ligiert.
Bei Ligierungstechniken werden stumpfendige Ligierungen üblicherweise in etwa 15 bis etwa 30 Mikrolitern eines pH 7,5-Puffers, der etwa 1 mM ATP und etwa 0,3 bis 0,6 (Weiss) Einheiten T4 DNA-Ligase enthält, bei etwa 14°C durchgeführt. Intermolekulare Ligierungen mit "klebrigem Ende" werden üblicherweise bei gesamten End-DNA-Konzentrationen von etwa 5 bis 100 Nanomol durchgeführt. Intermolekulare stumpfendige Ligierungen (die üblicherweise etwa 10- bis 30-fachen molaren Überschuss an Linkern verwenden) werden mit gesamten End-DNA-Konzentrationen von etwa 1 Mikromol durchgeführt.
(B) Herstellung von cDNA, die NAP kodiert
Klonierungsvektoren, die die wie offenbart hergestellte cDNA-Bibliothek enthalten, werden in Wirtszellen eingebracht, die Wirtszellen werden kultiviert, auf Platten ausgestrichen und danach mit einer Hybridisierungssonde sondiert, um Klone zu identifizieren, die die rekombinante cDNA enthalten, die ein erfindungsgemäßes Protein kodiert. Zu bevorzugten Wirtszellen gehören Bakterien, wenn Phagen-Klonierungsvektoren verwendet werden. Besonders bevorzugte Wirtszellen sind E. coli-Stämme, wie Stamm Y1090.
Alternativ kann die rekombinante cDNA, die ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, durch Expression dieses Proteins an der äußeren Oberfläche eines filamentösen Phagen und anschließendes Isolieren dieses Phagen erhalten werden, indem sie an ein Zielprotein gebunden werden, das an der Blutkoagulation beteiligt ist.
Ein wichtiges und wohl bekanntes Merkmal des genetischen Codes ist seine Redundanz – mehr als eine Triplett-Nukleotidsequenz kodiert eine Aminosäure. Es sind für rekombinante cDNA-Moleküle daher zahlreiche verschiedene Nukleotidsequenzen möglich, die eine spezielle Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen NAPs kodieren. Derartige Nukleotidsequenzen werden als funktionell äquivalent angesehen, da sie in allen Organismen zu der Produktion der gleichen Aminosäurensequenz führen können. Gelegentlich kann eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidins in eine gegebene Nukleotidsequenz eingebaut werden. Derartige Methylierungen beeinflussen die Kodierbeziehung jedoch in keinerlei Weise.
(1) VERWENDUNG VON OLIGONUKLEOTIDSONDEN
Hybridisierungssonden und Primer sind Oligonukleotidsequenzen, die zu dem gesamten oder einem Teil des erwünschten rekombinanten cDNA-Moleküls komplementär sind. Sie können unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens hergestellt werden, beispielsweise den Phosphotriester- und Phosphodiesterverfahren, die in S. A. Narang et al., Methods in Enzymology, 68:90 (1979) beziehungsweise E. L. Brown et al., Methods in Enzymology, 68:109 (1979) beschrieben sind, oder automatisierten Ausführungsformen davon. In einer derartigen Ausführungsform werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsmaterialien verwendet und können wie von Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22:1859–1862 (1981) beschrieben synthetisiert werden. Ein Verfahren zum Synthetisieren von Oligonukleotiden auf einem modifizierten festen Träger ist in US-4 458 066 beschrieben. Sonden unterscheiden sich von Primern dahingehend, dass sie mit einem Enzym, wie Meerrettichperoxidase, oder radioaktivem Atom, wie ³²P, markiert sind, um ihre Detektierung zu erleichtern. Eine synthetisierte Sonde wird durch Nick-Translatation unter Verwendung von DNA-Polymerase I von E. coli radiomarkiert, oder durch Endmarkierung unter Verwendung von alkalischer Phosphatase und T4 Bakteriophagen-Polynukleotidkinase.
Bevorzugte Hybridisierungssonden schließen Oligonukleotidsequenzen ein, die zu einer Strecke der einsträngigen cDNA komplementär sind, die einen Teil der Aminosäuresequenz eines NAPs kodiert, das aus einer Nematode gereinigt wurde, wie dem Hakenwurm Ancylostoma caninum. Beispielsweise kann ein Teil der in 2 (AcaNAP5) [SEQ. ID. Nr. 4] oder 4 (AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6]) gezeigten Aminosäuresequenz verwendet werden. Zu besonders bevorzugten Hybridisierungssonden gehören jene, deren Oligonukleotidsequenz zu der Strecke der einsträngigen cDNA komplementär ist, die die Aminosäuresequenz Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu-Cys-Gly-Glu-Asn-Glu-Trp [SEQ. ID. Nr. 93] kodiert. Zu diesen Hybridisierungssonden gehört die degenerierte Sonde mit der Oligonukleotidsequenz: AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [SEQ. ID. Nr. 94], wobei R A ist oder G, Y T oder C ist, und i Inosin ist. Ein bevorzugtes rekombinantes cDNA-Molekül, das ein erfindungsgemäßes Protein kodiert, wird durch seine Fähigkeit identifiziert, mit dieser Sonde zu hybridisieren.
Zu bevorzugten Hybridisierungssonden gehört auch das Paar NAP-1 [SEQ. ID. Nr. 90] und NAP-4.RC [SEQ. ID. Nr. 91], und das Paar YG109 [SEQ. ID. Nr. 88] und YG103 [SEQ. ID. Nr. 89], die beide in den Beispielen 13 beziehungsweise 12 beschrieben sind.
Nach Identifizierung des Klons, der die gewünschte cDNA enthält, wird Amplifizierung verwendet, um große Mengen eines Gens zu produzieren, das ein erfindungsgemäßes Protein in Form eines rekombinanten cDNA-Moleküls kodiert.
Bevorzugte Amplifizierungsverfahren beinhalten die Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR). Siehe z. B. PCR Technology, W.H. Freeman and Company, New York (Herausgeber H. A. Erlich, 1992). PCR ist ein in vitro-Amplifizierungsverfahren für die Synthese spezieller DNA-Sequenzen. Bei der PCR werden zwei Oligonukleotid-Primer verwendet, die an entgegengesetzte Stränge hybridisieren und die interessierende Region in der cDNA des Klons flankieren. Eine repetitive Reihe von Zyklen, die cDNA-Denaturierung zu Einzelsträngen, Primer-Annealing an die einsträngige cDNA und Extension der Annealing unterzogenen Primern durch DNA-Polymerase beinhalten, führt zu zahlreichen cDNA-Kopien, deren Termini durch die 5-Enden der Primer definiert sind, was in jedem Zyklus ungefähr zu einer Verdoppelung führt. Ibid., Seite 1. Durch PCR-Amplifizierung werden die Kodierdomäne und jegliche zusätzliche Primer-kodierte Information, wie Restriktionsstellen oder Translationssignale (Signalsequenzen, Start-Codons und/oder Stopp-Codons) des zu isolierenden rekombinanten cDNA-Moleküls erhalten.
Bevorzugte Bedingungen für die Amplifizierung von cDNA sind jene unter Verwendung von Taq-Polymerase, die 30 Temperaturzyklen von 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 50°C und 1,5 Minuten bei 72°C verwenden. Zu bevorzugten Primern gehört der Oligo(dT)-NotI-Primer, AATTCGCGGC CGC(T)₁₅ [SEQ. ID. Nr. 95], erhalten von Promega Corp., in Kombination mit entweder (i) dem degenerierten Primer mit der Oligonukleotidsequenz: AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [SEQ. ID. Nr. 94], wobei R A oder G ist, Y T oder C ist, und i Inosin ist, oder (ii) der lambda gt11 Primer Nr. 1218, GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [SEQ. ID. Nr. 96], erhalten von New England Biolabs.
Die Nukleinsäuresequenz eines rekombinanten cDNA-Moleküls, das wie offenbart hergestellt wurde, wird nach Verfahren bestimmt, die auf dem Dideoxy-Verfahren von F. Sanger et al. basieren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463 (1977), wie es ferner von Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) beschrieben wurde.
Bevorzugte rekombinante cDNA-Moleküle, die wie offenbart hergestellt sind, schließen jene mit den Nukleinsäuresequenzen der 1, 3, 7, 9, 13 und 14 ein.
(2) DIE VERWENDUNG VON NAP-CDNAS ALS SONDEN
Besonders bevorzugt als Hybridisierungssonden sind auch Oligonukleotidsequenzen, die im Wesentlichen die gesamte Aminosäuresequenz eines NAPs kodieren, das aus der Nematode, dem Hakenwurm, Ancylostoma caninum, gereinigt wurde. Besonders bevorzugte Sonden beinhalten jene, die von den AcaNAP5- und AcaNAP6-Genen abgeleitet wurden und die folgenden Nukleinsäuresequenzen haben (AcaNAP5-Gen): AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GAC TGT GGA ACT CAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AAT GAG GAA CCC CCT GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGC TCA CGT GGT TGT TTA TTA CCT CCT GCT TGC GTA TGC AAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AGG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [SEQ. ID. Nr. 1], oder 3 (AcaNAP6-Gen): AAG GCA TAC CCG GAG TGT GGT GAG AAT GAA TGG CTC GAC GTC TGT GGA ACT AAG AAG CCA TGC GAG GCC AAG TGC AGT GAG GAA GAG GAG GAA GAT CCG ATA TGC CGA TCA TTT TCT TGT CCG GGT CCC GCT GCT TGC GTA TGC GAA GAC GGA TTC TAC AGA GAC ACG GTG ATC GGC GAC TGT GTT AAG GAA GAA GAA TGC GAC CAA CAT GAG ATT ATA CAT GTC TGA [SEQ. ID. Nr. 2].
Bevorzugte Hybridisierungssonden enthalten auch Sequenzen, die einen wesentlichen Teil der Aminosäuresequenz eines NAPs kodieren, wie das PCR-Fragment, das mit dem Primer-Koppler NAP-1 [SEQ. ID. Nr. 90] und NAP-4.RC [SEQ. ID. Nr. 91] erzeugt wird, wie in Beispiel 13 beschrieben.
(3) DIE VERWENDUNG VON PHAGEN ALS ANZEIGE
Hier wird ein Verfahren zum Selektieren von cDNAs, die die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, aus vollständigen cDNA-Bibliotheken unter Verwendung der Anzeigetechnik mit filamentösen Phagen offenbart. Die momentane Anzeigetechnologie mit filamentösen Phagen basiert auf der in-Frame-Insertion interessierender Kodierregionen in Gen 3 oder Gen 8, die das Attachment-Protein beziehungsweise Haupt-Mantelprotein des Phagen kodieren. Fachleute werden erkennen, dass diese Durchfüh rung mit einer umfangreichen Mischung cDNAs unbekannter Sequenz inhärent in verschiedener Weise problematisch ist, und dass die am besten durchführbare Weise, um eine funktionale Anzeige der cDNA-Produkte zu erhalten, in der Fusionierung der cDNAs über ihr 5'-Ende liegt. cDNA-Bibliotheken ausreichender Größe können in der Tat mehrere cDNAs erhalten, die von derselben mRNA abgeleitet sind, 5'-terminal jedoch an verschiedenen Positionen abgeschnitten sind, so dass einige hiervon als Fusionsprodukte exprimiert werden können. Eine Strategie in dieser Richtung, die auf der Fähigkeit der Leucin-Zipper Jun und Fos zur Bildung von Heterodimeren basiert, wurde unlängst beschrieben. Siehe R. Crameri und M. Suter, Gene, 137:69–75 (1993).
Wir haben eine neue Alternative und einen direkten Weg zum kovalenten Linken von cDNA-Genprodukten an die Phagenoberfläche gefunden; der Fund basiert auf der Beobachtung, dass an den C-Terminus von Phagen-Mantelprotein 6 fusionierte Proteine funktional angezeigt werden können. Diese Beobachtung hat zu der Entwicklung eines Phagemidsystems wie hier beschrieben geführt, das die Expression funktional angezeigter cDNA-Produkte ermöglicht, die wiederum die Affinitätsselektion von Phagenpartikeln zulässt, die die für die Produktion des angezeigten cDNA-Produkts erforderliche cDNA enthalten. Dieses System liefert die Basis für die Isolierung von cDNAs, die ein erfindungsgemäßes Protein kodieren. Rekombinante cDNA-Moleküle, die diese cDNA enthalten, können nach der Isolierung zur Expression der erfindungsgemäßen Proteine in anderen Expressionssystemen verwendet werden. Die auf diese Weise hergestellten cDNA-Moleküle werden als innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung angesehen.
Erfindungsgemäße rekombinante cDNA-Moleküle werden isoliert, indem man eine cDNA-Bibliothek aus einer natürlichen Quelle (wie beispielsweise einer Nematode, wie einem Hakenwurm) herstellt, diese cDNA-Bibliothek in geeignete Phagemidvektoren ligiert, Wirtszellen mit diesen Vektoren, die die cDNAs enthalten, transformiert, die Wirtszellen kultiviert, die transformierten Zellen mit einem geeigneten Helfer-Phagen infiziert, den Phagen von der Wirtszellkultur trennt, Phagen abtrennt, die ein erfindungsgemäßes Protein auf ihrer Oberfläche exprimieren, diese Phagen isoliert und ein rekombinantes cDNA-Molekül aus diesem Phagen isoliert.
Die Phagemid-Vektoren werden mit dem pUC119-Expressionsvektor aufgebaut, der von J. Vieira und J. Messing, Methods in Enzymology, 153:3–11 (1987), beschrieben wurde. Das filamentöse Phagen-Gen 6, das ein Oberflächenprotein des Phagen kodiert, wird an seinen 5' und 3'-Enden durch Verwendung von drei Vorwärts-Primern und einem Rückwärts-Primer unter Verwendung von PCR durch die Zugabe von HindIII beziehungsweise SfiI Restriktionsstellen modifiziert. Dies führt zu drei DNA-Fragmenten, die durch Addition von NotI- und BamHI-Restriktionsstellen mittels PCR an ihre 3'-Enden weiter modifiziert worden sind. Nach separater Verdauung der drei DNA-Fragmente mit HindIII und BamHI wurden die drei DNA-Fragmente in das pUC119 ligiert, um die pDONG61-, pDONG62- und pDONG63-Expressionsvektoren zu ergeben. Diese Vektoren ermöglichen das Insertieren von cDNA als SfiI-NotI-Fragmente in dieselben.
cDNA-Bibliotheken werden aus natürlichen Quellen, wie Nematoden, hergestellt, wie in den Beispielen 2, 9 und 13 beschrieben wird. Bevorzugte Nematoden, aus denen diese Bibliotheken hergestellt werden, schließen die Darmnematoden ein, wie Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus und Heligmosomoides polygyrus.
Eine cDNA-Bibliothek als SfiI-NotI-Fragmente können direkt direktional in die Phagemidvektoren pDONG61, pDONG62 und pDONG63 ligiert werden. Alternativ kann eine cDNA-Bibliothek, die in den lambda-gt11-Phagenvektor wie in Beispiel 2 beschrieben ligiert worden ist, mittels PCR gewonnen werden, gefolgt von Isolierung mit Elektrophorese und danach direktionaler Ligierung in diese Vektoren. In dem letzteren Ansatz verwenden bevorzugte Bedingungen für PCR Taq-Polymerase, die Primer lambda gt11 Primer Nr. 1218 mit der Sequenz GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) [SEQ. ID. Nr. 96] und den Oligo(dT)-NotI Primer mit der Sequenz AATTCGCGGC CGC(T)₁₅, (Promega Corp.) [SEQ. ID. Nr. 95] und 20 Temperaturzyklen von 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 50°C und 3 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 65°C.
Wirtszellen werden mit den pDONG-Expressionsvektoren transformiert, die eine cDNA-Bibliothek enthalten. Zu bevorzugten Wirtszellen gehören E. coli Stämme, wobei der Stamm TG1 besonders bevorzugt ist. Zu bevorzugten Verfahren zur Transformation von E. coli Wirtszellen gehört Elektroporation.
Die transformierten Zellen wurden bei 37°C in LB-Medium durch Zusatz von 1 % Glucose und 100 Mikrogramm/ml Carbenicillin ergänzt, bis die optische Extinktion bei 600 nm den Wert von 0,5 erreichte, und danach mit VCSM13 Helfer-Phagen (Stratagene) mit einer Vielzahl von Infektionen (moi) von 20 infiziert.
Die Phagen wurden durch Zentrifugation von der Kultur getrennt, danach wurden sie durch Ausfällungen mit Polyethylenglykol/Natriumchlorid gereinigt.
Die Phagen, die ein erfindungsgemäßes NAP exprimierten, wurden isoliert, indem die Fähigkeit des NAPs zur Bindung an ein Zielprotein genutzt wurde, das an der Blutkoagulation beteiligt ist, beispielsweise Faktor Xa.
Bevorzugte Verfahren zum Isolieren dieser Phagen beinhalten ein Verfahren, das die Stufen aufweist:

(1) Kombinieren einer Lösung von an Biotin markiertem Faktor Xa mit einer Lösung dieser Phagen;
(2) Inkubieren dieser Mischung;
(3) Kontaktieren einer mit Streptavidin markierten festen Phase mit dieser Mischung;
(4) Inkubieren der festen Phase mit der Mischung;
(5) Entfernen der festen Phase aus der Mischung und Kontaktieren der festen Phase mit Puffer, um ungebundene Phagen zu entfernen;
(6) Kontaktieren der festen Phase mit einem zweiten Puffer, um die gebundenen Phagen von der festen Phase zu entfernen;
(7) Isolieren dieser Phagen;
(8) Transformieren von Wirtszellen mit diesen Phagen;
(9) Kultivieren der transformierten Wirtszellen;
(10) Infizieren transformierter Wirtszellen mit VCSM13-Helfer-Phagen;
(11) Isolieren der Phagen aus der Wirtszellenkultur und
(12) weiteres viermaliges Wiederholen der Stufen (1) bis (11).

Ein besonders bevorzugtes Verfahren zum Isolieren dieser Phagen schließt das Verfahren ein, das in Beispiel 10 detailliert beschrieben ist.
Aus den isolierten Phagen wurde einsträngige DNA hergestellt und ihre Inserts 3' in das filamentöse Phagengen 6 sequenziert.
9 zeigt das rekombinante cDNA-Molekül, AcaNAPc2, das nach dem Phagenanzeigeverfahren isoliert wurde. Die deduzierte Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Proteins, kodiert durch AcaNAP2, ist in dieser Figur auch gezeigt.
(C) Herstellung des rekombinanten NAP
Die erfindungsgemäßen rekombinanten cDNA-Moleküle wurden, wenn sie wie offenbart isoliert worden waren, verwendet, um die Expression der erfindungsgemäßen NAPs zu erhalten. Allgemein wird ein erfindungsgemäßes rekombinantes cDNA-Molekül in einen Expressionsvektor eingebaut, dieser Expressionsvektor wurde in eine passende Wirtszelle eingeführt, die Wirtszelle wurde kultiviert und das exprimierte Protein isoliert.
Expressionsvektoren sind DNA-Sequenzen, die für die Transkription klonierter Kopien von Genen und Translation ihrer mRNAs in einen passenden Wirt erforderlich sind. Diese Vektoren können entweder prokariontische oder eukariontische Gene in einer Vielfalt von Zellen exprimieren, wie Bakterien, Hefe-, Säuger-, Pflanzen- und Insektenzellen. Proteine können auch in zahlreichen Virussystemen exprimiert werden.
Geeignet konstruierte Expressionsvektoren enthalten einen Replikationsursprung für die autonome Replikation in Wirtszellen, oder sind in der Lage, sich in die Wirtszellchromosomen zu integrieren. Diese Vektoren enthalten auch selektive Marker, eine begrenzte Anzahl brauchbarer Restriktionsenzymstellen, eine hohe Kopienzahl und starke Promotoren. Promotoren sind DNA-Sequenzen, die RNA-Polymerase dazu bringen, an DNA zu binden und die RNA-Synthese zu initiieren; starke Promotoren führen diese Initiierung mit hoher Frequenz herbei. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Expressionsvektoren sind operativ an ein rekombinantes erfindungsgemäßes cDNA-Molekül gelinkt, d. h. die Vektoren können sowohl die Replikation des durch Attachment gebundenen, rekombinanten cDNA-Moleküls als auch die Expression des durch das rekombinante cDNA-Molekül kodierten Proteins führen. Expressionsvektoren können Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren und speziell entworfene Plasmide oder Viren enthalten, sind jedoch nicht darauf begrenzt.
Geeignete Wirtszellen für die Expression der erfindungsgemäßen Proteine beinhalten Bakterien, Hefe-, Säuger-, Pflanzen- und Insektenzellen. Mit jedem Typ von Zelle und Spezies sind bestimmte Expressionsvektoren geeignet, wie nachfolgend offenbart wird.
Zur Expression der erfindungsgemäßen Proteine können Prokarionten verwendet werden. Zu geeigneten Bakterien-Wirtszellen gehören die verschiedenen Stämme von E. coli, Bacillus subtilis und verschiedene Spezies von Pseudomonas. In diesen Systemen werden Plasmidvektoren verwendet, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen enthalten, die von Spezies abgeleitet sind, die mit dem Wirt kompatibel sind. Geeignete Vektoren für E. coli sind Derivate von pBR322, einem Plasmid, das von einer E. coli-Spezies abgeleitet ist, von Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977). Übliche prokariontische Kontrollsequenzen, die hier so definiert sind, dass Promotoren für die Transkription, Initiation, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit Ribosombindungsstellensequenzen eingeschlossen sind, beinhalten die β-Lactamase- und Lactosepromotorsysteme (Chang et al., Nature, 198:1056 (1977)), das Tryptophanpromotersystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)) und den lambda-abgeleiteten-P_L Promotor und N-Genribosombindungsstelle (Shimatake et al., Nature, 292:128 (1981)). Es kann jedoch jedes verfügbare Promotorsystem verwendet werden, das mit Proka rionten verträglich ist. Zu bevorzugten Prokariontenexpressionssystemen gehören E. coli und ihre Expressionsvektoren.
Zur Expression der erfindungsgemäßen Proteine können Eukarionten verwendet werden. Eukarionten werden üblicherweise durch die Hefe- und Säugerzellen repräsentiert: Zu geeigneten Hefewirtszellen gehören Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris. Zu geeigneten Säugerwirtszellen gehören COS und CHO (Chinesische Hamsterovar)-Zellen.
Expressionsvektoren für die Eukarionten sind aus Promotoren zusammengesetzt, die von passenden eukariontischen Genen abgeleitet sind. Geeignete Promotoren für Hefezellen-Expressionsvektoren enthalten Promotoren für die Synthese von glykolytischen Enzymen, einschließlich jenen für das 3-Phosphoglyceratkinasegen in Saccharomyces cerevisiae (Hitzman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) und jenen für den Metabolismus von Methanol, wie das Alkoholoxidasegen in Pichia pastoris (Stroman et al., US-4,808,537 und US-4,855,231). Andere geeignete Promotoren beinhalten jene aus dem Enolasegen (M. J. Holland et al.., J. Biol. Chem., 256:1385 (1981)) oder dem Leu2-Gen, erhalten aus Yepl3 (J. Broach et al., Gene, 8:121 (1978)).
Zu bevorzugten Hefeexpressionssystemen gehören Pichia pastoris und ihre Expressionsvektoren. NAP kodierende cDNAs, die in Pichia pastoris exprimiert werden, können gegebenenfalls mutiert werden, um ein NAP-Protein zu kodieren, das einen Prolinrest am C-Terminus einbaut. In einigen Fällen wird das NAP-Protein in einem höheren Niveau exprimiert und kann gegenüber unerwünschter Proteolyse beständiger sein. Eine derartige cDNA und ihre Expression in Pichia pastoris ist in Beispiel 17 beschrieben.
Geeignete Promotoren für Säugerzell-Expressionsvektoren beinhalten die frühen und späten Expressionsvektoren aus SV40 (Fiers et al., Nature, 273:113 (1978)) oder andere virale Promotoren wie jene, die von Polyoma, Adenovirus II, bovinem Papillomavirus oder Avian Sarcoma Viren abgeleitet sind. Geeignete virale und Säuger-Enhancer können in diese Expressionsvektoren ebenfalls eingebaut werden.
Geeignete Promotoren für Pflanzenzell-Expressionsvektoren beinhalten den Nopalin-Synthesepromotor, beschrieben von A. Depicker et al., Mol. Appl. Gen., 1:561 (1978).
Geeignete Promotoren für Insektenzell-Expressionsvektoren beinhalten modifizierte Versionen des Systems, das von Smith et al., US-4,745,051 beschrieben wurde. Der Expressionsvektor enthält einen Baculovirus-Polyhedrin-Promotor, unter dessen Kontrolle ein cDNA-Molekül, das ein Protein kodiert, positioniert werden kann
Wirtszellen werden durch Einführung von erfindungsgemäßen Expressionsvektoren in dieselben transformiert. Die Transformation erfolgt unter Verwendung von für jeden Zelltyp geeigneten Standardtechniken. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, die in S. N. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972) beschrieben ist, oder das RbCl-Verfahren, das in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seite 254, Cold Spring Harbor Press (1982) beschrieben ist, wird für Prokarionten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Die Transformation von Hefe wird wie in P. Van Solingen et al., J. Bacter., 130:946 (1977) und C. L. Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3823 (1979) beschrieben durchgeführt. Säugerzellen ohne viel Zellwand werden mit dem Calciumphosphatverfahren von Graham und van der Eb, Virology, 52:546 (1978) transformiert. Pflanzenzellen werden durch Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wie in C. Shaw et al. Gene, 23:315 (1983) beschrieben transformiert. Zu bevorzugten Verfahren zum Transformieren von E. coli und Pichia pastoris mit Expressionsvektoren gehören Elektroporation.
Transformierte Wirtszellen werden unter Bedingungen, wie Medientyp, Temperatur, Sauerstoffgehalt, Fluidbewegung, usw. kultiviert, die in der biologischen Technik wohl bekannt sind.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Proteine werden aus der Wirtszelle oder dem Medium durch Standardverfahren isoliert, die in der biochemischen Technik wohl bekannt sind und die Verwendung von Chromatographieverfahren einschließen. Bevorzugte Reinigungsverfahren beinhalten sequentielle Chromato graphie eines Extrakts durch Säulen, die Poros20 HQ Anionenaustauschmatrix oder Poros20 HC Kationenaustauschmatrix, Superdex30 Gelfiltrationsmatrix und eine C₁₈-Umkehrphasenmatrix enthalten. Die nach einer derartigen Chromatographiesäule aufgefangenen Fraktionen können durch ihre Fähigkeit selektiert werden, die Gerinnungszeit von menschlichem Plasma zu erhöhen, gemessen durch die PT- und aPTT-Assays, oder durch ihre Fähigkeit, die amidolytische Aktivität von Faktor Xa zu inhibieren, wie in einem kolorimetrischen Assay gemessen wird, oder durch die Demonstration von Aktivität in irgendeinem der anderen hier offenbarten Assays. Beispiele für bevorzugte Reinigungsverfahren eines erfindungsgemäßen rekombinanten Proteins sind in den Beispielen 3, 4, 6, 8, 14 und 15 offenbart.
4. Verfahren zur Verwendung von NAP
Gemäß einem Aspekt beinhaltet die vorliegende Erfindung Verfahren zum Auffangen von Säugerplasma, so dass die Gerinnung des Plasmas inhibiert wird, bei dem man einem Blutauffangröhrchen eine Menge eines erfindungsgemäßen Proteins zufügt, die zur Inhibierung der Bildung eines Gerinnsels ausreicht, wenn Säugerblut in das Röhrchen gesaugt wird, man Säugerblut in das Röhrchen gibt, die roten Blutzellen von dem Säugerplasma trennt und das Säugerplasma auffängt.
Blutauffangröhrchen schließen mit Stopfen versehene Teströhrchen mit Vakuum als Mittel ein, um durch Venenpunktion erhaltenes Blut in die Röhrchen zu ziehen. Zu bevorzugten Teströhrchen gehören jene, die aus Borsilikatglas hergestellt sind und beispielsweise die Abmessungen 10,25 × 47 mm, 10,25 × 50 mm, 10, 25 × 64 mm, 10, 25 × 82 mm, 13 × 75 mm, 13 × 100 mm, 16 × 75 mm, 16 × 100 mm oder 16 × 125 mm haben. Bevorzugte Stopfen beinhalten jene, die leicht von einer Blutauffangnadel durchstochen werden können und, wenn sie auf dem Teströhrchen angeordnet werden, eine ausreichende Versiegelung liefern, um das Eindringen von Luft in das Röhrchen zu verhindern.
Die erfindungsgemäßen Proteine werden den Blutauffangröhrchen in vielen verschiedenen Formen zugefügt, die in der Technik bekannt sind, wie als flüssige Zusammensetzung, feste Zu sammensetzung oder flüssige Zusammensetzung, die in dem Röhrchen zu einem Feststoff lyophilisiert ist. Die diesen Röhrchen zugegebene Menge ist jene Menge, die zur Inhibierung der Bildung eines Gerinnsels ausreicht, wenn Säugerblut in das Röhrchen gesogen wird. Die erfindungsgemäßen Proteine werden Blutauffangröhrchen in solchen Mengen zugegeben, dass die Konzentration dieser Proteine bei Kombination mit 2 bis 10 ml Säugerblut ausreicht, um die Gerinnselbildung zu inhibieren. Diese effektive Konzentration ist in der Regel etwa 1 bis 10.000 nM, wobei 10 bis 1000 nM bevorzugt sind.
Die erfindungsgemäßen Proteine können alternativ derartigen Röhrchen in Kombination mit anderen gerinnungsinhibierenden Additiven zugefügt werden, wie Heparinsalzen, EDTA-Salzen, Citratsalzen oder Oxalatsalzen.
Nachdem Säugerblut in ein Blutauffangröhrchen gezogen worden ist, das entweder ein erfindungsgemäßes Protein oder dasselbe in Kombination mit anderen gerinnungsinhibierenden Additiven enthält, werden die roten Blutzellen durch Zentrifugieren aus dem Säugerplasma abgetrennt. Das Zentrifugieren wird mit g-Kräften, Temperaturen und Zeiten durchgeführt, die in der medizinischen Technik wohl bekannt sind. Typische Bedingungen zum Abtrennen von Plasma von roten Blutzellen beinhalten Zentrifugieren mit einer Zentrifugalkraft von etwa 100 × g bis etwa 1500 × g bei Temperaturen von etwa 5 bis etwa 25°C und für eine Zeit von etwa 10 bis etwa 60 Minuten.
Das Säugerplasma kann aufgefangen werden, indem es in einen separaten Behälter abgegossen wird, indem es in eine Pipette gesogen wird, oder durch andere Mittel, die in der medizinischen Technik wohl bekannt sind.
Gemäß einem anderen Aspekt beinhaltet die vorliegende Erfindung Verfahren zum Verhindern oder Inhibieren von Thrombose (Gerinnselbildung) oder Blutkoagulation bei einem Säuger, wobei man dem Säuger eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Proteins oder einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht.
Die erfindungsgemäßen Proteine oder erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung werden in vivo verabreicht, üblicherweise einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen. Die Proteine oder pharmazeutischen Zusammensetzungen können, indem sie in vivo verwendet werden, einem Säuger auf verschiedenen Weisen verabreicht werden, einschließlich oral, parenteral, intravenös, subkutan, intramuskulär, über das Colon, rektal, nasal oder intraperitoneal unter Verwendung einer Vielfalt von Dosierformen. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise parenteral, wie intravenös auf täglicher Basis. Alternativ -erfolgt die Verabreichung vorzugsweise oral, wie durch Tabletten, Kapseln oder Elixiere, die täglich genommen werden.
Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren werden die erfindungsgemäßen Proteine oder pharmazeutischen Zusammensetzungen allein oder in Kombination miteinander oder in Kombination mit anderen Therapeutika oder in-vivo-Diagnostika verabreicht.
Wie Fachleuten auf dem medizinischen Sektor klar sein wird, variiert eine therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Proteine oder pharmazeutischen Zusammensetzungen in Abhängigkeit von dem Alter, dem Gewicht oder den behantelten Säugerspezies, den speziellen verwendeten Proteinen, dem speziellen Verabreichungsmodus und den gewünschten Wirkungen und der therapeutischen Indikation. Weil diese Faktoren und ihre Beziehung zur Bestimmung dieser Menge in der medizinischen Technik wohl bekannt sind, liegt die Bestimmung der therapeutisch wirksamen Dosierniveaus, der erforderlichen Menge, um das gewünschte Ergebnis der Verhinderung von Thrombose zu erreichen, innerhalb des durchschnittlichen Fachwissens: Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Proteine oder pharmazeutischen Zusammensetzung wird in der Regel mit niedrigeren Dosierniveaus begonnen, wobei die Dosierniveaus erhöht werden, bis die gewünschte Wirkung der Verhinderung von Thrombose in vivo erreicht wird, was eine therapeutisch wirksame Menge definieren würde. Diese Dosen sind bei den erfindungsgemäßen Proteinen allein oder als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung zwischen etwa 0,01 mg/kg und 100 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise zwischen etwa 0,01 und 10 mg/kg Körpergewicht.
5. Anwendbarkeit
Erfindungsgemäße Proteine sind, wenn sie wie offenbart hergestellt und ausgewählt worden sind, als potente Inhibitoren der Blutkoagulation in vitro und in vivo brauchbar. Diese Proteine sind als solche in in vitro-Diagonistikreagentien brauchbar, um das Gerinnen von Blut zu verhindern, und sind auch als in vivo-pharmazeutische Mittel brauchbar, um Thrombose oder Blutkoagulation bei Säugern zu verhindern oder zu inhibieren.
Die erfindungsgemäßen Proteine sind als in vitro-diagnostische Reagentien zur Inhibierung der Gerinnung in Blutentnahmeröhrchen brauchbar. Die Verwendung von mit Stopfen versehenen Teströhrchen mit innewohnendem Vakuum als Mittel, um durch Venenpunktion erhaltenes Blut in das Röhrchen zu ziehen, ist in der medizinischen Technik wohl bekannt. B. L. Kasten, "Specimen Collection", Laboratory Test Handbook. 2. Auflage, Lexi-Comp Inc., Cleveland, Seiten 16–17 (Herausgeber D. S. Jacobs et al. 1990). Derartige Vakuumröhrchen können frei von gerinnungsinhibierenden Additiven sein, wobei sie in diesem Fall für die Isolierung von Säugerserum aus dem Blut brauchbar sind. Sie können alternativ gerinnungsinhibierende Additive enthalten (wie Heparinsalze, EDTA-Salze, Citratsalze oder Oxalatsalze), wobei sie in diesem Fall für die Isolierung von Säugerplasma aus dem Blut brauchbar sind. Die erfindungsgemäßen Proteine sind potente Inhibitoren der Blutgerinnung und können als solche in Blutauffangröhrchen eingebracht werden, um Gerinnung des hineingesogenen Säugerbluts zu verhindern.
Die erfindungsgemäßen Proteine werden allein, in Kombination mit anderen erfindungsgemäßen Proteinen oder in Kombination mit anderen bekannten Gerinnungsinhibitoren in den Blutauffangröhrchen verwendet, beispielsweise mit Heparinsalzen, EDTA-Salzen, Citratsalzen oder Oxalatsalzen.
Die diesen Röhrchen zugegebene Menge oder effektive Menge ist jene Menge, die zur Inhibierung der Bildung eines Blutgerinnsels ausreicht, wenn Säugerblut in das Röhrchen gesogen wird. Die erfindungsgemäßen Proteine werden Blutauffangröhrchen in solchen Mengen zugegeben, dass die Konzentration die ser Proteine bei Kombination mit 2 bis 10 ml Säugerblut ausreicht, um die Bildung von Blutgerinnseln zu inhibieren. Diese effektive Menge ist in der Regel jene, die erforderlich ist, um eine Endkonzentration im Blut von etwa 1 bis 10.000 nM zu ergeben, wobei 10 bis 1000 nM bevorzugt sind.
Die erfindungsgemäßen Proteine können auch zur Herstellung diagnostischer Zusammensetzungen verwendet werden. Gemäß einer Ausführungsform werden diagnostische Zusammensetzungen hergestellt, indem die erfindungsgemäßen Proteine in diagnostisch annehmbaren Trägern gelöst werden, wobei die Träger phosphatgepufferte Salzlösung (0,01 M Natriumphosphat + 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,2 oder Tris-gepufferte Salzlösung (0,05 M Tris-HCl + 0,15 M Natriumchlorid, pH 8,0) einschließen. Gemäß einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Proteine mit anderen festen diagnostisch annehmbaren Trägern nach im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren gemischt werden, um feste diagnostische Zusammensetzungen bereitzustellen. Zu diesen Trägern gehören Puffersalze.
Die Zugabe der erfindungsgemäßen Proteine zu Blutauffangröhrchen kann nach im Stand der Technik wohl bekannten Verfahren bewirkt werden, zu denen Einbringung einer flüssigen diagnostischen Zusammensetzung, einer festen diagnostischen Zusammensetzung oder einer flüssigen diagnostischen Zusammensetzung, die lyophilisiert ist, in solche Röhrchen zu einem feste Pfropfen einer festen diagnostischen Zusammensetzung gehören.
Die Verwendung von Blutauffangröhrchen, die die erfindungsgemäßen diagnostischen Zusammensetzungen enthalten, beinhaltet das Kontaktieren einer effektiven Menge dieser diagnostischen Zusammensetzung mit Säugerblut, das in das Röhrchen gesogen wird. Wenn eine Probe aus 2 bis 10 ml Säugerblut in ein Blutauffangröhrchen gesogen wird und mit dieser diagnostischen Zusammensetzung darin kontaktiert wird, schließt die effektiv zu verwendende Menge in der Regel jene Konzentrationen der Proteine ein, die als diagnostische Zusammensetzung formuliert sind, die in der Blutprobe ausreichen, um die Bildung von Blutgerinnseln zu inhibieren. Bevorzugte effektive Konzen trationen sind etwa 1 bis 10.000 nM, wobei 10 bis 1000 nM besonders bevorzugt sind.
Gemäß einem alternativen Aspekt unserer Erfindung sind die erfindungsgemäßen Proteine auch als pharmazeutische Mittel brauchbar, um Thrombose oder Blutkoagulation bei einem Säuger zu verhindern oder zu inhibieren. Diese Prävention oder Inhibierung von Thrombose oder Blutkoagulation beinhaltet die Verhinderung oder Inhibierung abnormaler Thrombose.
Bedingungen, die durch abnormale Thrombose gekennzeichnet sind, sind in der medizinischen Wissenschaft wohl bekannt und schließen jene ein, die die arteriellen und venösen Gefäße von Säugern beinhalten. In Bezug auf das koronare arterielle Gefäßsystem charakterisiert abnormale Thrombose (Thrombusbildung) das Abreißen eines etablierten atherosklerotischen Plaques, was die Hauptursache des akuten Herzinfarkts und der instabilen Angina ist, und charakterisiert auch die okklusive Koronarthrombusbildung, die entweder aus der thrombolytischen Therapie oder der perkutanen transluminalen Koronarangioplastik (PTCA) resultiert. In Bezug auf das venöse Gefäßsystem charakterisiert abnormale Thrombose den Zustand, der Patienten beobachtet wird, bei denen größere chirurgische Eingriffe in den unteren Extremitäten oder im Abdominalbereich durchgeführt wurden, die oft an Thrombusbildung im venösen Gefäßsystem leiden, das zu reduziertem Blutfluss zu der betroffenen Extremität und einer Prädisposition für die Lungenembolie führt. Abnormale Thrombose charakterisiert ferner disseminierte intravaskuläre Gerinnung (DIC), die häufig in Blutgefäßsystemen während septischem Schock, bestimmten Virusinfektionen und Krebs auftritt, ein Zustand, bei dem es einen raschen Verbrauch von Gerinnungsfaktoren und systemische Koagulation gibt, die zur Bildung lebensbedrohlicher Thrombi führt, die im gesamten Mikrogefäßsystem erfolgt, was zu ausgedehntem Organversagen führt.
Die erfindungsgemäßen NAP-Proteine sind auch brauchbare Immunogene, gegen die Antikörper gebildet werden. Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper, die gegen ein NAP gerichtet sind, sind zu diagnostischen Zwecken und zur Identifi zierung von NAP-Konzentrationsniveaus in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten brauchbar. Immunoassays, die diese Antikörper verwenden, können als diagnostischer Test verwenden, wie zum Detektieren der Infektion eines Säugerwirts durch einen parasitischen Wurm, oder um NAP aus einem parasitischen Wurm im Gewebe eines Säugerwirts zu detektieren. Derartige Immunoassays können auch zur Detektierung und Isolierung von NAP in Gewebehomogenisaten, geklonten Zellen und dergleichen verwendet werden.
NAP kann mit geeigneten Hilfsstoffen als Impfung (Vakzin) gegen parasitische Wurminfektionen bei Säugern verwendet werden. Die Immunisierung mit NAP-Vakzin kann sowohl zur Prophylaxe als auch zur Therapie der parasitischen Infektionen verwendet werden. Erkrankungszustände, die durch parasitische Würmer herbeigeführt werden, können behandelt werden, indem einem mit diesen Parasiten infizierten Tier Anti-NAP-Antikörper verabreicht werden.
Erfindungsgemäße NAP-Proteine mit Serinprotease inhibierender Aktivität sind auch unter Bedingungen oder in Assays brauchbar, bei denen die Inhibierung von Serinprotease erwünscht ist. NAP-Proteine, die die Serinprotease Trypsin oder Elastase inhibieren, sind beispielsweise zur Behandlung der akuten Pankreatitis beziehungsweise akuten entzündlichen Reaktion brauchbar, die durch Leukozyten vermittelt wird.
Die rekombinanten cDNA-Moleküle, die die erfindungsgemäßen Proteine kodieren, sind in einem Aspekt zum Isolieren anderer rekombinanter cDNA-Moleküle brauchbar, die ebenfalls die erfindungsgemäßen Proteine kodieren. Sie sind gemäß einem anderen Aspekt zur Expression der erfindungsgemäßen Proteine in Wirtszellen brauchbar.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsonden sind zum Identifizieren und Isolieren von Nukleinsäure, die NAPs kodiert, aus Nematoden oder anderen Organismen brauchbar. Die Nukleotidsonden sind zudem brauchbare diagnostische Reagentien, um die Anwesenheit von Nematoden-kodierender Nukleinsäure in einer Probe zu detektieren, wie Körperflüssigkeit oder Gewebe von einem Säuger, der verdächtig auf Nematodeninfektion ist. Die Sonden können direkt mit geeigneter Markierung zur Detektierung verwendet werden, um die Anwesenheit von Nematoden-Nukleinsäure zu detektieren, oder können in eher indirekter Weise verwendet werden, wie in einer Reaktion vom PCR-Typ, um Nematoden-Nukleinsäure zu amplifizieren, die in der Probe zur Detektion vorhanden sein kann. Die Bedingungen dieser Verfahren und diagnostischen Assays sind in der Technik leicht zugänglich.
Die vorliegende Erfindung wird nun zur näheren Erläuterung derselben ferner durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
BEISPIELE
Beispiel 1
Isolierung von neuem Antikoagulansprotein (NAP) aus Ancylostoma caninum.
(A) Herstellung des Ancylostoma caninum Lysats
Gefrorene Hundehakenwürmer, Ancylostoma caninum, wurden von Antibody Systems (Bedford, TX, USA) erhalten. Die Hakenwürmer wurden bei –80°C gelagert, bis sie für Homogenisat verwendet wurden.
Hakenwürmer wurden in flüssigem Stickstoff gefroren und im Mörser gemahlen, anschließend mit Homogenisierungspuffer auf Eis mit einem PotterS-Homogenisierer mit einem Teflonkolben homogenisiert (B. Braun Melsungen AG, Deutschland). Der Homogenisierungspuffer enthielt: 0,02 M Tris-HCl pH 7,4, 0,05 M NaCl, 0, 001 M MgCl₂, 0, 001 M CaCl₂, 1, 0 × 10^–5 M E-64 Proteaseinhibitor (Boehringer Mannheim, Deutschland), 1,0 × 10^–5 M Pepstatin A (Isovaleryl-Val-Val-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-Ala-4-amino-3- hydroxy-6-methylheptansäure, ICN Biomedicals, CA, USA), 1,0 × 10^–5 M Chymostatin (Boehringer), 1,0 × 10^–5 M Leupeptin (ICN), 5 × 10^–5 M AEBSF (4- (2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid, ICN), und 5 % (Vol./Vol.) Glycerin. Ungefähr 4 ml Homogenisierungspuffer wurden verwendet, um jedes Gramm gefrorener Würmer (ungefähr 500 Würmer) zu homogenisieren. Unlösliches Material wurde mit zwei sequentiellen Zentrifugationsstufen pelletiert: 19.000 × g_max bei 4°C für 30 Minu ten, gefolgt von 110.000 × g_max bei 4°C für 40 Minuten. Die überstehende Lösung wurde geklärt, indem sie durch einen 0,45 μm Celluloseacetatfilter (Corning, NY, USA) geleitet wurde, um Ancylostoma caniumum Lysat zu ergeben.
(B) Concanavalin A Sepharose-Chromatographie.
Ancylostoma caniumum-Lysat (100 ml) wurde an 22 ml Concanavalin A Sepharose (Pharmacia, Schweden) adsorbiert, die zuvor mit Con A-Puffer (0,02 M Tris-HCl, pH 7,4, 1 M NaCl, 0,002 M CaCl₂) äquilibriert wurde, indem er mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 3 ml/Minute (90 cm/Stunde) auf eine 1,6 × 11 cm Säule dieses Gels geladen wurde. Die Säule befand sich auf Umgebungstemperatur, während das Vorratsgefäß des Lysats während des Verfahrens auf Eisbadtemperatur gehalten wurde. Die Säule wurde anschließend mit 2 Säulenvolumina Con A-Puffer gewaschen. Der Säulendurchfluss und die Waschflüssigkeiten wurden aufgefangen (ungefähr 150 ml) und bei –80°C gelagert, bis die Weiterverarbeitung erfolgte.
(C) Anionenaustauschchromatographie
Der Durchfluss und die Waschflüssigkeit der Concanavalin A-Sepharose-Säule wurde gepuffert, indem festes Natriumacetat auf eine Endkonzentration von 12,5 mM zugegeben wurde. Die Leitfähigkeit wurde durch Verdünnen mit milliQ-Wasser reduziert, und der pH-Wert wurde mit HCl auf pH 5,3 eingestellt. Der während der pH-Werteinstellung gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren mit 15.000 × g_max bei 4 °C für 15 Minuten pelletiert. Die überstehende Lösung wurde geklärt, indem sie durch einen 0,2 μm Celluloseacetatfilter (Corning, NY, USA) geleitet wurde.
Diese geklärte Lösung (Gesamtvolumen ungefähr 600 ml) wurde auf eine Poros20 HQ (Perseptive Biosystems, MA, USA) 1 × 2 cm Säule, die zuvor mit Anionenpuffer (0,05 M Na-Acetat, pH 5,3, 0,1 M NaCl) äquilibriert wurde, mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/Minute (800 cm/Stunde) beladen. Die Säule und die zugesetzte Lösung befanden sich während dieser Reinigungsstufe auf Umgebungstemperatur. Die Säule wurde anschließend mit 10 Säulenvolumina Anionenpuffer gewaschen.
Material, das inhibierende Aktivität aufwies und nach dem folgenden Verfahren in dem Faktor Xa amidolytischen Assay detektiert wurde, wurde mit Kationenpuffer, der 0,55 M NaCl enthielt, mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/Minute (400 cm/Stunde) eluiert.
Eine Probe der Lösung wurde in einem Faktor Xa-amidolytischen Assay wie folgt getestet. In 96-Mulden-Platten, die Faktor Xa und verschiedene Verdünnungen der Probe in Assay-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,4; 140 mM NaCl; 0,1 % BSA) enthielten, wurden Reaktionsmischungen (150 μl) hergestellt. Human-Faktor X wurde von Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN, USA) erhalten und mit Russell's Vipergift nach dem Verfahren von P. E. Bock, P. A. Craig, S. T. Olson und P. Singh, Arch. Biochem. Biophys., 273: 375–388 (1989) aktiviert. Nach 30 Minuten Inkubieren bei Umgebungstemperatur wurden die enzymatischen Reaktionen initiiert, indem 50 Mikroliter einer 1 mM Substratlösung in Wasser (N-α-Benzyloxycarbonyl-D-arginyl-L-glycyl-L-arginin-p-nitroanilid-dihydrochlorid; S-2765; Chromogenix, Mölndal, Schweden) zugegeben wurden, um Endkonzentrationen von 0, 2 nM Faktor Xa und 0, 25 mM S-2765 zu ergeben. Die Substrathydrolyse wurde überwacht, indem die Extinktion bei 405 nM kontinuierlich mit einem V_max kinetischen Plattenablesegerät (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA) gemessen wurde.
(D) Wärmebehandlung
Die Hälfte des 0,55 M NaCl-Eluierungspools (3 ml) aus der Anionenaustauschchromatographie wurde neutralisiert, indem 1 M Tris-HCl, pH 7,5, auf eine Endkonzentration von 50 mM zugegeben wurden, 5 Minuten bei 90°C in einem Glasröhrchen inkubiert wurden und anschließend rasch auf Eis gekühlt wurde. Unlösliches Material wurde pelletiert, indem 20 Minuten bei 4°C mit 19.000 × g_max zentrifugiert wurde. Der Überstand enthielt Material, das Faktor Xa in dem Faktor Xa-amidolytischen Assay inhibierte. Ungefähr 89 % der Faktor Xa inhibierenden Aktivität wurde nach dieser Wärmebehandlung in dem Überstand zurückgewonnen, wobei die Verdünnung berücksichtigt wurde.
(E) Molekularsiebchromatographie unter Verwendung von Superdex30 (Alternative zu der Wärmebehandlungsstufe)
Die Hälfte des 0,55 M NaCl Eluierungspools (3 ml) aus der Anionenaustauschchromatographie wurde auf eine Superdex30 PG (Pharmacia, Schweden) 1,6 × 66 cm Säule geladen, die zuvor mit 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,4, 0,15 M NaCl bei 24°C äquilibriert wurde. Die Chromatographie wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/Minute durchgeführt. Die Faktor Xa inhibierende Aktivität (bestimmt in dem Faktor Xa-amidolytischen Assay) eluierte 56 bis 64 ml in den Versuch (K_av 0,207). Dieses Eluierungsvolumen wäre bei einem kugelförmigen Protein mit einem Molekulargewicht von 14.000 Dalton zu erwarten.
(F) Reverse-Phase-Chromatographie
Hakenwurmlysat, das durch Chromatographie an Concanavalin A-Sepharose, Anionenaustausch und Superdex30 (oder mit der alternativen Wärmebehandlngsstufe) fraktioniert worden war, wurde auf eine 0,46 × 25 cm C18-Säle (218TP54 Vydac; Hesperia, CA, USA) geladen, die dann mit einem linearen Gradienten von 10 bis 35 % Acetonitril mit 0,1 (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute mit einer Geschwindigkeit von 0,625 % Änderung von Acetonitril/Minute entwickelt. Die FXa inhibierende Aktivität (bestimmt in dem Faktor Xa-amidolytischen Assay) eluierte mit ungefähr 30 Acetonitril. Die HPLC-Versuche wurden mit einem Vista 5500 durchgeführt, der an einen Polychrom 9600 Detektor angeschlossen war, der auf 215 nm eingestellt war (Varian, CA, USA). Die Detektorsignale wurde mit einem 4290 Integrator integriert, der von der gleichen Firma erhalten wurde. Faktor Xa inhibierende Aktivität enthaltende Fraktionen wurden im Vakuum getrocknet und danach erneut in FBS (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,4, 015 M NaCl) gelöst.
Die Fraktionen wurden gepoolt und danach auf eine 0,46 × 25 cm C18-Säule (218TP54 Vadac; Hesperia, CA; USA) geladen, die mit einem linearen Gradienten von 10 bis 35 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute mit einer langsameren Geschwindigkeit von 0,4 % Veränderung an Acetonitril/Minute entwickelt wurde. Faktor Xa inhibierende Aktivität enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und anschließend im Vakuum getrocknet.
(G) Molekulargewichtsbestimmung von NAP aus Ancylostoma caninum
Die geschätzte Masse von NAP, das wie in diesem Beispiel beschrieben isoliert wurde, wurde mit Elektrospray-Ionisationsmassenspektroskopie bestimmt.
Ein vakuumgetrocknetes NAP-Pellet wurde in 50 (Vol./Vol.) Acetonitril, 1 % (Vol./Vol.) Ameisensäure gelöst. Die Massenanalyse wurde mit einem VG Bio-Q (Fisons Instruments, Manchester, Großbritannien) durchgeführt.
Die NAP-Probe wurde durch eine Kapillare gepumpt, und an ihrem Ende wurde eine Hochspannung von 4 kV angelegt. Unter dem Einfluss des hohen elektrischen Feldes wurde die Probe in Tröpfchen ausgesprüht, die die Proteinmoleküle enthielten. Unterstützt durch die trocknende Wirkung eines neutralen Gases (N₂) bei 60°C wurde die Tröpfchengröße weiter reduziert, bis das gesamte Lösungsmittel verdampft war und nur die Proteinspezies in der gasförmigen Form verblieben. Es entstand in einer Charge eine Population von Proteinspezies, die sich voneinander unterschieden. Mit einem Quadrupol-Analysegerät wurden die unterschiedlichen Da/e- (Massen/Ladungs)-Werte detektiert. Die Kalibrierung des Instruments wurde mit Pferdeherzmyoglobin (Sigma, Missouri, USA) durchgeführt.
Die geschätzte Masse des wie in den Abschnitten A, B, C, D und F dieses Beispiels beschrieben isolierten NAPs betrug 8734,60 Dalton. Die geschätzte Masse des wie in den Abschnitten A, B, C, E und F isolierten nativen NAPs betrug 8735,67 Dalton.
(H) Aminosäuresequenzierung von NAP aus Ancylostoma caninum
Die Aminosäurebestimmung wurde mit einem 476-A Protein/Peptid-Sequencer mit On Board-Mikrogradient-PTH-Analysator und Modell 610A Datenanalysesystem (Applied Biosystems, CA, USA) durchgeführt. Die Quantifizierung der Reste wurde durch On-Line-Analyse mit dem Systemcomputer (Applied Biosystems, CA, USA) durchgeführt, die Restezuweisung wurde durch visuelle Analyse der HPLC-Chromatogramme durchgeführt. Es wurde bestimmt, dass die ersten zwanzig Aminosäuren des Aminoterminus von nativem NAP wie folgt waren:
Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Cys Gly Thr Gln Lys Pro [SEQ. ID. Nr. 97].
Die Cysteinreste wurden in diese Analyse nicht direkt detektiert, weil die Probe nicht reduziert und anschließend alkyliert wurde. Cysteine wurden den Positionen zugewiesen, an denen keine spezifische Aminosäure identifiziert wurde.
Beispiel 2
Klonen und Sequenzieren des NAP aus Ancylostoma caninum
(A) Herstellung der Hybridisierungssonde
cDNA-Klone mit voller Länge, die NAP kodieren, wurden durch Screening einer cDNA-Biliothek isoliert, die aus der mRNA hergestellt war, die aus der Nematode Ancylostoma caninum mit einem radiomarkierten degenerierten Oligonukleotid isoliert worden waren, deren Sequenz auf den ersten elf Aminosäuren des Aminoterminus von NAP aus A. caninum basierte:
Lys Ala Tyr Pro Glu Cys Gly Glu Asn Glu Trp [SEQ. ID. Nr. 93].
Die 33-Mer-Oligonukleotid-Hybridisierungssonde mit der Bezeichnung YG99 hatte die folgende Sequenz:
AAR GCi TAY CCi GAR TGY GGi GAR AAY GAR TGG [SEQ. ID. Nr. 94]
wobei "R" für A oder G steht; "Y" für T oder C steht, und "i" für Inosin steht. YG99 wurde durch enzymatische Phosphorylierung am 5'-Ende (5'-end labeling kit; Amersham, Buckinghamshire, England) unter Verwendung von gamma-32p-ATP (spezifische Aktivität > 7000Ci/mmole; ICN, Costa Mesa, CA, USA) radiomarkiert und anschließend durch eine NAP^TM 10 Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) geleitet.
(B) Herstellung der cDNA-Bibliothek
Eine cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von beschriebenen Verfahren aufgebaut (Promega Protocols and Applications Guide 2. Auflage; Promega Corp., Madison, WI, USA).
Ausgewachsene Hakenwürmer, Ancylostoma caninum, wurden von Antibody Systems (Bedford, TX, USA) erhalten. Poly(A+) RNA wurde mit dem QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) hergestellt. Etwa 3 Mikrogramm mRNA wurden mit einem Oligo(dT)-Not1 Primer/Adaptor, AATTCGCGGCCGC(T)₁₅ [SEQ. ID. Nr. 95], (Promega Corp.) und AMV (Avian Myeloblastosis Virus) reverse Transkriptase (Boehringer, Mannheim, Deutschland) reverser Transkription unterzogen. Die für die Synthese von doppelsträngiger cDNA-Synthese verwendeten Enzyme waren die Folgenden: E. coli DNA Polymerase I und RNaseH von Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) und T4 DNA Polymerase von Pharmacia.
EcoRI-Linkers (pCGGAATTCCG) [SEQ. ID. Nr. 98] wurden nach Behandlung mit EcoRI Methylase (RiboClone EcoRI Linker Ligation System; Promega) auf die erhaltene cDNA ligiert.
Die cDNAs wurden mit NotI und EcoRI verdaut, über 1,5 Agarosegel geleitet (alles klassierbare Material wurde nach dem Geneclean-Protokoll, BI0101 Inc., La Jolla, CA, USA, eluiert), und unidirektional in die EcoRI-NotI-Arme des lambda gt11 Sfi-NotI-Vektors (Promega) ligiert. Nach in vitro-Packen (GigapackII-Gold, Stratagene, La Jolla, CA, USA) wurde rekombinanter Phage erhalten, indem Stamm Y1090 (Promega) infiziert wurde.
Die Brauchbarkeit der cDNA-Bibliothek wurde durch PCR-Analyse (Taq Polymerase von Boehringer; 30 Temperaturzyklen: 1 Minute bei 95°C; 1 Minute bei 50°C; 3 Minuten bei 72°C) einer Reihe von statistisch ausgesuchten Klons mit dem lambda gt11 Primer Nr. 1218, mit der Sequenz GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) [SEQ. ID. Nr. 96]; Zielsequenzen befanden sich stromaufwärts von dem cDNA-Insert) in Kombination mit dem oben genannten Oligo(dT)-NotI Primer/Adaptor gezeigt; es wurde gefunden, dass die Mehrzahl der Klone cDNA-Inserts von variabler Größe enthielt.
(C) Identifizierung der Klone
Ungefähr 1 × 10⁶ cDNA-Klone (doppelte Plaque-Hebefilter wurden mit Hybond^TM-N; Amersham, hergestellt) wurden einem Screening mit dem radiomarkierten YG99-Oligonukleotid unter Verwendung der folgenden Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsbedingungen unterzogen: 5 × SSC (SSC: 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 5 × Denhardt's Lösung, 20 % Formamid 0,5 % SDS, 100 Mikrogramm/ml schallbehandelte Fischsperma-DNA (Boehringer), über Nacht bei 42°C. Die Filter wurden 4 Mal in 2 × SSC, 0,1 % SDS bei 37°C gewaschen. Nach Belichtung (etwa 72 Stunden) auf Röntgenfilm wurden insgesamt zwischen 350 und 500 Hybridisierungsflecken identifiziert.
Vierundzwanzig positive Klone mit den Bezeichnungen NAP1 bis NAP24 wurden einer zweiten Hybridisierungsrunde mit niedrigerer Plaquedichte unterzogen, außer bei NAP24 wurden Einzelplaques identifiziert, die eine homogene Population von lambda-Phage enthielten. Die einbehaltenen Klone wurden mittels PCR-Amplifikation (Taq-Polymerase von Boehringer, 30 Temperaturzyklen: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 50°C, 1,5 Minuten bei 72°C) unter Verwendung des Oligo(dT)-NotI primer (AATTCGCGGC CGC(T)₁₅) [SEQ. ID. Nr. 95] in Kombination mit entweder (i) YG99 oder (ii) dem lambda gt11 Primer Nr. 1218 analysiert. Die Mehrzahl der Klone (20 von 23) ergaben ein Fragment von etwa 400 bp, wenn der Oligo(dT)-NotI/YG99-Primersatz verwendet wurde, und ein Fragment von etwa 520 bp, wenn die Oligo(dT)-NotI/Nr. 1218 Primerkopplung verwendet wurde. Neunzehn dieser möglichen Klone mit vollständiger Länge wurden weiter charakterisiert.
Die cDNA-Inserts von fünf Klonen wurden als SfiI-NotI-Fragmente an sowohl pGEM-5Zf(–) als auch pGEM-9Zf(–) (Promega) subkloniert. Weil die SfiI-Stellen an lambda gt11 und pGEM-5Zf(-) miteinander nicht kompatibel sind, erforderte das Klonen dieses Vektors die Verwendung eines kleinen Adaptorfragents, das nach Annealing der folgenden, an beiden 5'-Enden phosphorylierten Oligonukleotide erhalten wurden: pTGGCCTAGCG TCAGGAGT [SEQ. ID. Nr.. 99] und pCCTGACGCTA GGCCATGG [SEQ. ID. Nr. 100]. Nach der Herstellung von einsträngiger DNA wurden die Sequenzen dieser cDNAs nach dem Dideoxy-Kettenabbruchverfahren unter Verwendung von Primer Nr. 1233 mit der Sequenz AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA (New England Biolabs) [SEQ. ID. Nr. 101] bestimmt. Es wurde gefunden, dass alle fünf Klone die vollständige Länge hatten, einschließlich eines vollständigen Sekretionssignals. Es wurde gefunden, dass die Klone NAP5, NAP7 und NAP22 einen identischen Kodierbereich hatten. Die Klone NAP6 und NAP11 sind auch identisch, unterscheiden sich jedoch von dem NAP5-Typ des Kodierbereichs. 1 zeigt die Nukleotidsequenz des NAP-Gens, und 2 zeigt die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins, AcaNAP5. In ähnlicher Weise zeigt 3 die Nukleotidsequenz des NAP6-Gens [SEQ. ID. Nr. 5] und 4 zeigt die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins, AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6].
Vierzehn andere mögliche Klone mit vollständiger Länge wurden einer Restriktionsanalyse unterzogen. Das oben genannte 400 bp-PCR-Produkt, das mit der YG99/Oligo(dT)-NotI-Primerkopplung erhalten wurde, wurde mit vier unterschiedlichen Enzymen verdaut, die zwischen einem NAP5- und NAP6-Typ des Klons unterscheiden konnten: Sau96I, Sau3AI, DdeI und HpaII. Die Ergebnisse waren in Übereinstimmung damit, dass 10 von 14 Klonen vom NAP5-Typ waren (z. B. NAP4, NAP8, NAP9, NAP15, NAP16, NAP17, NAP18, NAP20, NAP21 und NAP23), während die restlichen vier vom NAP6-Typ waren (z. B. NAP10, NAP12, NAP14 und NAP19).
Diese Klone wurden umbenannt, um die Herkunft von Ancylostoma caninum widerzuspiegeln, indem die Buchstaben Aca unmittelbar vor die NAP-Bezeichnung gesetzt wurden. Beispielsweise wird NAP5 AcaNAP5, NAP6 wird AcaNAP6 und so weiter.
Beispiel 3
Produktion und Reinigung von rekombinantem AcaNAP5 in P. pastoris
(A) Konstruktion des Expressionsvektors
Das Pichia pastoris Hefeexpressionssystem einschließlich des E. coli/P. pastoris Shuttle-Vektor, pHILD2, ist in zahlreichen US-Patenten beschrieben worden. Siehe z. B. US- 5,330,901; US-5,268,273; US-5,204,261; US-5,166,329; US-5,135,868; US-5,122,465; US-5,032,516; US-5,004,688; US-5,002,876; US-4,895,800; US-4,885,242; US-4,882,279; US-4,879,231; US-4,857,467; US-4,855,231; US-4,837,148; US-4,818,700; US-4,812,405; US-4,808,537; US-4,777,242 und US-4,683,293.
Der zur direkten Expression und Sekretion von rekombinantem AcaNAP5 in P. pastoris verwendete pYAM7SP8-Vektor war ein Derivat des pHILD2-Plasmids (C. W. Despreaux und R. F. Manning, Gene 131: 35–41 (1993)) mit der selben allgemeinen Struktur. Zusätzlich zu den Transkriptions- und Rekombinationselementen von pHILD2, die zur Expression und chromosomalen Integration in P. pastoris erforderlich sind (siehe D. W. Stroman et al., US-4,855,231) enthielt dieser Vektor eine chimäre Präpo-Leadersegenz, die stromabwärts von dem Alkoholoxidase- (AOX1)-Promoter insertiert worden war. Der Präpo-Leader bestand aus dem saure Phosphatase (PH01)-Sekretionssignal von P. pastoris, fusioniert an eine synthetische 19-Aminosäuren-Prosequenz. Diese Prosequenz war eine der beiden 19-aa-Prosequenzen, die von Clements et al., Gene 106: 267–272 (1991) auf Basis der α-Faktor-Leader-Sequenz von Saccharomyces cerevisiae entworfen worden war. Unmittelbar nach der Präpo-Leader-Sequenz gentechnisch verändert befand sich eine synthetische Multiklonierstelle mit den Erkennungssequenzen für die Enzyme StuI, SacII, EcoRI, BalII, NotI, XhoI, SpeI und BamHI, um das Klonen von Fremdgenen zu erleichtern. NAP, wie es von pYAM7SP8 in Pichia pastoris exprimiert worden war, wurde zuerst als Präpo-Produkt übersetzt und anschließend durch die Wirtszelle verarbeitet, um die Prä- und Pro-Sequenzen zu entfernen.
Die Struktur dieses Vektors ist in 12 gezeigt. Die Signalsequenz (S) hat die Nukleinsäureseqenz: ATG TTC TCT CCA ATT TTG TCC TTG GAA ATT ATT TTA GCT TTG GCT ACT TTG CAA TCT GTC TTC GCT [SEQ. ID. Nr. 102]. Die Prosequenz (P) hat die Nukleinsäuresegenz: CAG CCA GGT ATC TCC ACT ACC GTT GGT TCC GCT GCC GAG GGT TCT TTG GAC AAG AGG [SEQ. ID. Nr. 103]. Die multiple Klonierungsstelle (MCS) hat die Nukleinsäuresequenz: CCT ATC CGC GGA ATT CAG ATC TGA ATG CGG CCG CTC GAG ACT AGT GGA TCC [SEQ. ID. Nr. 104].
Der pGEM-9Zf(–) Vektor (Promega), der die AcaNAP5-cDNA enthielt, wurde verwendet, um den Bereich, der das reife AcaNAP5-Protein kodiert, durch Amplifizierung ("PCR-Rescue") zu isolieren (unter Verwendung von Vent Polymerase von New England Biolabs, Beverly, MA, USA; 20 Temperaturzyklen: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 1,5 Minuten bei 72°C). Es wurden die folgenden Oligonukleotid-Primer verwendet:
YG101: GCTCGCTCTA-GAAGCTTCAG-ACATGTATAA-TCTCATGTTG-G [SEQ. ID. Nr. 105]
YG103: AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [SEQ. ID. Nr. 89]
Der YG101-Primer, der auf C-terminale Sequenzen zielt, enthielt eine Extension ohne Annealing, zu der XbaI und HindIII-Restriktionsstellen (unterstrichen) gehörten.
Nach der Verdauung mit XbaI-Enzym wurde das Amplifizierungsprodukt mit der erwarteten Größe aus Gel isoliert und nachfolgend enzymatisch phosphoryliert (T4 Polynukleotidkinase von New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Nach Wärmeinaktivierung (10 Minuten bei 70°C) der Kinase wurde das stumpfendige/XbaI-Fragment zu Expressionszwecken direkt in den Vektor pYAM7SP8 geklont. Das aufnehmende Vektorfragment von pYAM7SP8 wurde durch StuI-SpeI-Restriktion hergestellt und aus Agarosegel gereinigt. Der E. coli-Stamm, WK6 [R. Zell und H.-J. Fritz, EMBO J., 6: 1809–1815 (1987)], wurde mit der Ligierungsmischung transformiert, und ampicillinresistente Klone wurden selektiert.
Basierend auf Restriktionsanalyse wurde ein Plasmidklon zur weiteren Charakterisierung erhalten, der ein Insert mit der erwarteten Größe enthielt und als pYAM7SP-NAP5 bezeichnet wurde. Sequenzbestimmung des Klons pYAM7SP-NAP5 bestätigte das genaue Insertieren des reifen AcaNAP5-Kodierbereichs in Fusion mit dem Präpro-Leader-Signal, wie durch das Konstruktionsschema vorhergesagt wurde, sowie die Abwesenheit von unerwünschten Mutationen in dem Kodierbereich.
(B) Expression von rekombinantem AcaNAP5 in P. pastoris
Der Pichia pastoris-Stamm GTS115 (his4) ist in D. W. Stroman et al., US-4,855,231, beschrieben worden. Alle Manipulationen von P. pastoris wurden im Wesentlichen wie in D. W. Stroman et al., US-4,855,231 beschrieben durchgeführt.
Etwa 1 Mikrogramm pYAM7SP-NAP5-Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines Standard-Elektroporationsprotokolls in den Stamm GTS115 elektroporiert. Das Plasmid wurde zuvor durch SalI-Verdauung linearisiert, wodurch theoretisch die Zielführung und Integration des Plamids in den his4-Chromosomenlocus erleichtert wird.
Die Selektion eines AcaNAP5-Hochexpressorstamms wurde im Wesentlichen wie nachfolgend beschrieben durchgeführt. His+-Transformanten wurden auf MD-Platten gewonnen (Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren (DIFCO), 13,4 g/l; Biotin, 400 μg/l; D-Glucose, 20 g/l; Agar, 15 g/l). Aus der Elektroporation stammende Einzelkolonien (n=60) wurden in 100 μl FM22-Glycerin-PTM1-Medium in Mulden einer 96-Mulden-Platte inokuliert und auf einem Plattenmischer bei 30°C 24 Stunden lang wachsen gelassen. Ein Liter FM22-Glycerin-PTM1-Medium enthielt. 42,87 g KH₂PO₄, 5 g (NH₄)₂SO₄, 1 g CaSO₄-2H₂O, 14,28 g K₂SO₄, 11,7 g MgSO₄-7H₂O, 50 g Glycerin, sterilisiert als 10 ml Lösung, und 1 ml filtersterilisierte PTM1-Spurenelementmineralmischung. Der FM22-Anteil des Mediums wurde als 900 ml Lösung hergestellt, die mit KOH auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt und steril filtriert wurde. Ein Liter des PTM1-Gemisches enthielt 6 g CuSO₄-5H₂O, 0, 8 g KI, 3 g MnSO₄-H₂O, 0, 2 g NaMoO₄·2H₂O, 0, 02 g H₃BO₃, 0,5 g CoCl₂·6H₂O, 20 g ZnCl₂, 5 ml H₂SO₄, 65 g FeSO₄·7H₂O, 0,2 g Biotin.
Die Zellen wurden dann pelletiert und in frischem FM22-Methanol-PTM1-Medium (gleiche Zusammensetzung wie oben, außer dass die 50 g Glycerin durch 0,5 % (Vol./Vol.) Methanol ersetzt wurden, um die Expression des AOX1-Promoters zu induzieren) resuspendiert. Nach einer weiteren Inkubationsperiode von 24 Stunden bei 30°C wurde die Überstände der Minikulturen auf Anwesenheit von sekretiertem AcaNAP5 getestet. Es wurden zwei Klone selektiert, die zu einem hohen Niveau der Synthese und Sekretion von AcaNAP5 führten, wie durch das Auftauchen von hoher Faktor Xa inhibierender Aktivität in dem Kulturmedium gezeigt wurde (wie durch den amidolytischen Faktor Xa-Assay gemessen wird, der in Beispiel 1 beschrieben ist). Nach einer zweiten Screening-Runde wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens, diesmal jedoch auf Schüttelkolbenebene, eine isolierte Wirtszelle gewählt und als P. pastoris GTS115/7SP-NAP5 bezeichnet.
Es wurde gezeigt, dass die Wirtszelle GTS115/7SP-NAP5 einen Methanolnutzungsphänotyp vom Wildtyp (Mut⁺) hatte, wodurch gezeigt wird, dass die Integration der Expressionscassette in das Chromosom von GTS115 die Funktionalität des genomen AQX1-Gens nicht änderte.
Die nachfolgende Produktion des rekombinanten AcaNAP5-Materials wurde in Schüttelkolbenkulturen durchgeführt, wie in D. W. Stroman et al., US-4,855,231 beschrieben ist. Das rekombinante Produkt wurde aus Zellüberstand von Pichia pastoris wie nachfolgend beschrieben gereinigt.
(C) Reinigung von rekombinantem AcaNAP5
(1) Kationenaustauschchromatographie
Nach der Expression wurde der Kulturüberstand von GTS115/75SP-NAP5 (100 ml) mit 16000 UpM (etwa 30.000 × g) 20 Minuten lang zentrifugiert, bevor der pH-Wert mit 1 N HCl auf 3 eingestellt wurde. Die Leitfähigkeit des Überstands wurde durch Zugabe von MilliQ-Wasser auf weniger als 10 mS/cm herabgesetzt. Der verdünnte Überstand wurde geklärt, indem er durch einen 0,22 μm Celluloseacetatfilter (Corning Inc., NY, USA) geleitet wurde.
Das Gesamtvolumen (ungefähr 500 ml) des Überstands wurde auf eine Poros20 HS (Perseptive Biosystems, MA, USA) 1 × 2 cm Säule geladen, die zuvor mit Kationenpuffer (0,05 M Natriumcitrat, pH 3) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/Minute (400 cm/h) äquilibriert wurde. Die Säule und die Probe befanden sich während dieser Reinigungsstufe auf Umgebungstemperatur. Die Säule wurde anschließend mit 50 Säulenvolumina Kationenpuffer gewaschen. Material, das in eine Faktor Xa amidolytischen Assay inhibierende Aktivität hatte, wurde mit einer Durchflussrate von 2 ml/Minute mit Kationenpuffer, der 1 M NaCl enthielt eluiert.
(2) Molekularsiebchromatographie unter Verwendung von Superdex30
Der 1 M NaCl Eluierungspool, der das inhibierende Material (3 ml) aus der Kationenaustauschsäule enthielt, wurde auf eine Superdex30 PG (Pharmacia, Schweden) 1,6 × 66 cm Säule geladen, die zuvor mit 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,4, 0,15 M NaCl bei Raumtemperatur äquilibriert wurde. Die Chromatographie wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/Minute durchgeführt. Die Faktor Xa inhibierende Aktivität eluierte 56 bis 64 ml in den Durchlauf (K_av von 0,207). Dies ist das gleiche Eluierungsvolumen, wie für das native Molekül bestimmt wurde (Beispiel 1, Teil E).
(3) Reverse-Phase-Chromatographie
1 ml der gepoolten Fraktionen aus der Gelfiltrationschromatographie wurden auf eine 0,46 × 25 cm C18-Säule (218TP54 Vadac; Hesperia, CA, USA) geladen, die mit einem linearen Gradienten von 10 bis 35 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute mit einer Geschwindigkeit von 0,4 % Veränderung an Acetonitril/Minute entwickelt wurde. Faktor Xa inhibierende Aktivität, die wie in Beispiel 1 bestimmt wurde, eluierte mit etwa 30 bis 35 Acetonitril und war in mehreren Fraktionen vorhanden. HPLC-Durchläufe wurden auf dem gleichen System wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Fraktionen aus mehreren Durchläufen auf dieser Säule, die die Faktor Xa inhibierende Aktivität enthielten, wurden gepoolt und im Vakuum getrocknet.
(4) Molekulargewichtbestimmung von rekombinantem AcaNAP5
Die geschätzte Masse des wie in den Abschnitten (1) bis (3) dieses Beispiels beschrieben isolierten Hauptbestandteils wurde mit dem gleichen Elektrosprayionisierungs-Massenspektrometriesystem wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt.
Die geschätzte Masse des rekombinanten AcaNAP5 betrug 8735,69 Dalton.
(5) Aminosäuresequenzierung von rekombinantem AcaNAP5
Nach der Reinigung in Abschnitt (1) bis (3) dieses Beispiels wurde das rekombinante AcaNAP5 aus Pichia pastoris Aminosäuresequenzanalyse wie in Beispiel 1 beschrieben unterzogen. Es wurde bestimmt, dass die ersten fünf Aminosäuren des Aminoterminus von AcaNAP5 Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu (SEQ. ID. Nr. 106] waren. Die Sequenz war mit dem nativen NAP-Protein (siehe Beispiel 1) identisch.
Beispiel 4
Produktion und Reinigung von rekombinantem AcaNAP6 in P. pastoris
(A) Konstruktion des Expressionsvektors
Der Expressionsvektor, pYAM7SP-NAP6, wurde in der gleichen Weise wie für pYAM7SP-NAP5 in Beispiel 3 beschrieben hergestellt.
(B) Expression von rekombinantem AcaNAP6 in P. pastoris.
Der Vektor pYAM7SP-NAP6 wurde zum Transformieren des Pichia-Stamms GTS115 (his4) wie in Beispiel 3 beschrieben verwendet.
(C) Reinigung von AcaNAP6
Das rekombinante AcaNAP6, exprimiert aus Pichia-Stamm GTS115 (his4), transformiert mit dem Expressionsvektor PYAM7SP-NAP6, wurde wie für rekombinantes AcaNAP5 in Beispiel 3 beschrieben gereinigt.
Die geschätzte Masse von rekombinantem AcaNAP6 wurde wie in Beispiel 3 beschrieben mit 8393,84 Dalton bestimmt.
Der überwiegende Teil der AcaNAP6-Herstellung hatte den folgenden Aminotermimus: Lys-Ala-Tyr-Pro-Glu [SEQ. ID. Nr. 106].
Beispiel 5
Expression von rekombinantem Pro-AcaNAP5 in COS-Zellen
(A) Konstruktion des Expressionsvektors
Der pGEM-9Zf(–) Vektor (Promega Corporation, Madison, WI, USA), in den die AcaNAP5-cDNA subkloniert wurde, diente als Target für PCR-Rescue des gesamten AcaNAP5-Kodierbareichs einschließlich des nativen Sekretionssignals (unter Verwendung von Vent Polymerase von New England Biolabs, Beverly, MA, USA; 20 Temperaturzyklen: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 50°C und 1,5 Minuten bei 72°C). Die verwendeten Oligonukleotid-Primer waren: (1) YG101, der auf das 3'-Ende des Gens zielte, das ein NAP kodierte und die Sequenz GCTCGCTCTA GAAGCTTCAG ACATGTATAA TCTCATGTTG G [SEQ, ID. Nr. 105] hatte, und (2) YG102, der auf das 5' -Ende des Gens zielte, das ein NAP kodierte und die Sequenz GACCAGTCTA GACAATGAAG ATGCTTTACGCTATCG [SEQ. ID. Nr. 107] hatte. Diese Primer enthalten Extensionen ohne Annealing, die XbaI-Restriktionsstellen (unterstrichen) einschließen.
Nach der Verdauung mit XbaI-Enzym wurde das Amplifizierungsprodukt mit der erwarteten Größe aus einem Agarosegel isoliert und nachfolgend zu Expressionszwecken durch das etwa 450 Basenpaar-XbaI-Stufferfragment des pEF-BOS-Vektors ersetzt [S. Mizushima und S. Nagata, Nucl. Acids Res., 18: 5322 (1990)]. Das aufnehmende Vektorfragment wurde durch XbaI-Verdauung hergestellt und aus einem Agarosegel gereinigt.
Der E. coli-Stamm WK6 [R. Zell und H.-J. Fritz, EMBO J., 6: 1809–1815 (1987)] wurde mit der Ligierungsmischung transformiert. Dreißig zufällig ausgewählte ampicillinresistente Transformanten wurden PCR-Analyse unterzogen (Taq-Polymerase von Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA; 30 Amplifizierungszyklen mit dem folgenden Temperaturprogramm: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 50°C und 1 Minute bei 72°C). Die verwendeten Oligonukleotid-Primer waren:

(i) YG103 mit der Sequenz AAGGCATACC CGGAGTGTGG TG [SEQ. ID. Nr. 89], der dem Aminoterminus des Bereichs entsprach, der reifes NAP kodiert, und (ii) YG60 mit der Sequenz GTGGGAGACC TGATACTCTC AAG [SEQ. ID. Nr. 108], der auf Vektorsequenzen stromabwärts von der Insertierungsstelle zielte, d. h. in dem 3'-untranslatierten Bereich der pEF-BOS-Expressioncassette. Nur Klone, die den Insert in der gewünschten Orientierung beherbergen, können ein PCR-Fragment mit vorhersagbarer Länge ergeben (etwa 250 Basenpaare). Zwei derartige Klone wurden weiter durch Sequenzbestimmung charakterisiert, und es wurde gefunden, dass sie den erwünschten XbaI-Insert enthielten. Einer der Klone mit der Bezeichnung pEF-BOS-NAP5 wurde zum Transfektizieren von COS-Zellen verwendet.

(B) Transfektion von COS-Zellen
COS-7-Zellen (ATCC CRL 1651) wurden mit PEF-BOS-NAP5, pEF-BOS, das ein unbedeutendes Insert enthielt oder wobei DNA weggelassen wurde (nachgeahmte Transfektionen) unter Verwendung von DEAE-Dextran transfektiziert. Bei dem DEAE-Dextran-Verfahren wurden die folgenden Medien und Vorratslösungen verwendet:

(1) COS-Medium: DMEM; 10 % FBS (30 Minuten bei 56°C inkubiert); 0,03 % L-Glutamin; Penicillin (50 internationale Einheiten (I.U.)/ml) und Streptomycin (50 μg/ml) (alle Produkte von Life Technologies).
(2) MEM-HEPES: MEM-Medium von Life Technologies Inc., rekonstituiert gemäß Herstellerangaben, enthielt eine Endkonzentration an HEPES von 25 mM; pH-Wert wurde vor der Filtration auf 7,1 eingestellt (0,22 μm).
(3) DNA-Lösung: 6 Mikrogramm DNA auf 3 ml MEM-HEPES
(4) DEAE-Dextran-Lösung: 30 μl DEAE-Dextran-Vorratslösung (Pharmacia, Uppsala, Schweden; 100 mg/ml in H₂O) auf 3 ml MEM-HEPES.
(5) Transfektizierungsmischung: 3 ml der DEAE-Dextran-Lösung wurden zu 3 ml der DNA-Lösung gegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten bei Umgebungstemperatur stehen gelassen.
(6) Chloroquinlösung: eine 1:100 Verdünnung von Chloroquinvorratslösung (Sigma, St. Louis, MO, USA; 10 mM in Wasser; filtriert durch eine 0,22 μm Membran) in COS-Medium.

Die vorübergehende Transfektion der COS-Zellen wurde wie folgt durchgeführt. COS-Zellen (etwa 3,5 × 10⁶), kultiviert in einem 175 cm² Nunc TC-Kolben (Life Technologies Inc.) wurden ein Mal mit MEM-HEPES gewaschen. 6 ml der Transfektionsmischung wurden in die gewaschenen Zellen pipettiert. Nachdem 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert worden war, wurden 48 ml der Chloroquinlösung zugegeben und die Zellen weitere 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden ein Mal mit frischem COS-Medium gewaschen und schließlich in 50 ml des gleichen Mediums bei 37°C inkubiert.
(C) Kultivieren von transfektizierten COS-Zellen
Drei, vier und fünf Tage nach der Transfektion wurde eine Probe der Kulturüberstände gemäß dem Verfahren in Beispiel 1 in einem Faktor Xa amidolytischen Assay getestet. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass sich die Faktor Xa inhibierende Aktivität in dem Kulturüberstand der Zellen anreicherte, die mit pEF-BOS-NAP5 transfektiziert waren.
Der COS-Kulturüberstand wurde fünf Tage nach der Transfektion geerntet, und das NAP-Protein wurde wie in Beispiel 6 beschrieben gereinigt.
Beispiel 6
Reinigung von rekombinantem Pro-AcaNAP5
(A) Anionenaustauschchromatographie
Der COS-Kulturüberstand, der Pro-AcaNAP5 enthielt, wurde 10 Minuten, bevor festes Natriumacetat auf eine Endkonzentration von 50 mM zugegeben wurde, mit 1500 UpM (etwa 500 × g) zentrifugiert. Die folgenden Proteaseinhibitoren wurden zugefügt (alle Proteaseinhibitoren waren von ICN Biomedicals Inc, Costa Mesa, CA, USA): 1,0 × 10^–5 M Pepstatin A (Isovaleryl-Val-Val-4-amino-3-hydroxy-6-methyl-heptanoyl-Ala-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure), 1,0 × 10^–5 M Leupeptin, 5 × 10^–5 M AEBSF (4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid). Der pH-Wert wurde mit HCl auf 5,3 eingestellt. Der Überstand wurde geklärt, indem er durch einen 0,2 μm Celluloseacetatfilter (Corning Inc., Corning, NY, USA) geleitet wurde.
Dieser geklärte Überstand (Gesamtvolumen ungefähr 300 ml) wurde auf eine Poros20 HQ (Perseptive Biosystems, MA, USA) 1 × 2 cm Säule, die zuvor mit Anionenpuffer (0,05 M Na-Acetat, pH 5,3, 0,1 M NaCl) äquilibriert wurde, mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/Minute (800 cm/Stunde) beladen. Die Säule und die Probe befanden sich während dieser Reinigungsstufe auf Umgebungstemperatur. Die Säule wurde anschließend mit mindestens 10 Säulenvolumina Anionenpuffer gewaschen. Material, das inhibierende Aktivität in einem Faktor Xa amidolytischen Assay hatte, wurde mit einer Durchflussrate von 5 ml/Minute (400 cm/Stunde) mit Anionenpuffer, der 0,55 M NaCl enthielt, eluiert und wurde aufgefangen.
(B) Molekularsiebchromatographie unter Verwendung von Superdex30
Der 0,55 M NaCl Eluierungspool (3 ml) aus der Anionenaustauschchromatographie wurde auf eine Superdex30 PG (Pharmacia, Schweden) 1,6 × 66 cm Säule geladen, die zuvor mit 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,4, 0,15 M NaCl bei 24°C äquilibriert wurde. Die Chromatographie wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/Minute durchgeführt. Material, das in dem Faktor Xa amidolytischen Assay inhibierend war, eluierte 56 bis 64 ml in den Durchlauf (K_av 0,207). Dies war genau das gleiche Eluierungsvolumen, das für das native Molekül bestimmt worden war.
(C) Wärmebehandlung
Der Gesamtpool der Fraktionen mit Faktor Xa inhibierender Aktivität wurde 5 Minuten bei 30°C in einem Glasröhrchen inkubiert und anschließend rasch auf Eis abgekühlt. Unlösliches Material wurde pelletiert, indem 20 Minuten bei 4°C mit 19.000 × g_max zentrifugiert wurde. Der Überstand enthielt die gesamte Faktor Xa inhibierende Aktivität.
(D) Reverse-Phase-HPLC-Chromatographie
Der Überstand der wärmebehandelten Probe wurde auf eine 0,46 × 25 cm C18-Säule (218TP54 Vydac; Hesperia, CA; USA) geladen, die mit einem linearen Gradienten von 10 bis 35 % Acetonitril in 0,1 % (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute mit einer Geschwin digkeit von 0,4 % Veränderung an Acetonitril/Minute entwickelt wurde. Die Faktor Xa inhibierende Aktivität eluierte mit ungefähr 30 % Acetonitril. Die HPLC-Durchläufe wurden auf dem gleichen System wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Faktor Xa inhibierende Aktivität enthaltende Fraktionen wurden im Vakuum getrocknet.
(E) Molekulargewichtsbestimmung
Die geschätzte Masse des wie in den Abschnitten A bis D dieses Beispiels beschrieben isolierten rekombinanten Pro-AcaNAP5 wurde mit dem gleichen Elektrosprayionisierungs-Massenspektrometriesystem wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt.
Die geschätzte Masse des rekombinanten Pro-AcaNAP5 betrug 9248,4 Dalton.
(F) Aminosäuresequenzierung
Nach der Reinigung wurde das rekombinante Pro-AcaNAP5 aus COS-Zellen Aminosäurenanalyse unterzogen, um seine Aminoterminussequenz wie in Beispiel 1 beschrieben zu bestimmen. Es wurde bestimmt, dass die ersten neun Aminosäuren des Aminoterminus von Pro-AcaNAP wie folgt waren: Arg Thr Val Arg Lys Ala Tyr Pro Glu [SEQ. ID. Nr. 109]. Verglichen mit dem nativen AcaNAP5-Protein (siehe Beispiel 1) besitz Pro-AcaNAP5 vier zusätzliche Aminosäuren an seinem N-Terminus. Die Aminosäuresequenz von Pro-AcaNAP5 ist in 5 gezeigt.
Beispiel 7
Expression von rekombinantem Pro-AcaNAP6 in COS-Zellen
Pro-AcaNAP6 wurde im Wesentlichen wie für Pro-AcaNAP5 in Beispiel 5 vorübergehend in COS-Zellen produziert.
Der AcaNAP6-Kodierbareich einschließlich des Sekretionssignals wurde mit den gleichen beiden Oligonukleotid-Primern, die für AcaNAP5 verwendet worden waren, PCR-Rescue unterzogen: (1) YG101, das auf das 3'-Ende des Gens zielte und die Sequenz GCTCGCTCTA GAAGCTTCAG ACATGTATAA TCTCATGTTG G [SEQ. ID. Nr. 105] hatte, und (2) YG102, das auf das 5'-Ende des Gens zielte und die Sequenz GACCAGTCTA GACAATGAAG ATGCTTTACG CTATCG [SEQ.
ID. Nr. 107] hatte. Der YG101-Primer enthielt ein nicht passendes Nukleotid, wenn es mit AcaNAP6 als Target verwendet wurde (unterstrichener T-Rest, vergleiche mit 1 und 3), diese fehlende. Passung ("Mismatch") führte zum Ersetzen eines ATT-Ile-Codons durch ein ATA-Ile-Codon. Das Mismatch beeinflusste die Amplifizierungseffizienz nicht wesentlich.
Die folgende Modifikation von Beispiel 5 wurde eingeführt:
24 Stunden nach der Transfektion der COS-Zellen (die in Beispiel 5, Abschnitt B beschrieben ist) wurde das COS-Medium, das 10 % FBS enthielt, durch 50 ml eines Mediums ersetzt, das aus einer 1:1-Mischung aus DMEM und Nutrient Mixture Ham's F-12 (Life Technologies) bestand. Die Zellen wurden dann weiter bei 37°C inkubiert und die Produktion von Faktor Xa inhibierender Aktivität wie in Beispiel 5 beschrieben detektiert.
Beispiel 8
Reinigung von rekombinantem Pro-AcaNAP6
(A) Anionenaustauschchromatographie
Der COS-Kulturüberstand, der Pro-AcaNAP6 enthielt, wurde 10 Minuten, bevor festes Natriumacetat auf eine Endkonzentration von 50 mM zugegeben wurde, mit 1500 UpM zentrifugiert. Die folgenden Proteaseinhibitoren wurden zugefügt (alle Proteaseinhibitoren waren von ICN Biomedicals Inc, Costa Mesa, CA, USA): 1,0 × 10^–5 M Pepstatin A (Isovaleryl-Val-Val-4-amino-3-hydroxy-6-methyl-heptanoyl-Ala-4-amino3-hydroxy-6-methylheptansäure), 1,0 × 10^–5 M Leupeptin, 5 ×10^–5 M AEBSF (4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid). Der pH-Wert wurde mit HCl auf 5,3 eingestellt. Der Überstand wurde geklärt, indem er durch einen 0,2 μm Celluloseacetatfilter (Corning Inc., Corning, NY, USA) geleitet wurde.
Dieser geklärte Überstand (Gesamtvolumen ungefähr 450 ml) wurde auf eine Poros20 HQ (Perseptive Biosystems, MA, USA) 1 × 2 cm Säule, die zuvor mit Anionenpuffer (0,05 M Na-Acetat, pH 5,3, 0,1 M NaCl) äquilibriert wurde, mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/Minute (800 cm/Stunde) beladen. Die Säule und die Probe befanden sich während dieser Reinigungs stufe auf Umgebungstemperatur. Die Säule wurde anschließend mit mindestens 10 Säulenvolumina Anionenpuffer gewaschen. Material, das inhibierende Aktivität in einem Faktor Xa amidolytischen Assay hatte, wurde mit einer Durchflussrate von 5 ml/Minute (400 cm/Stunde) mit Anionenpuffer, der 0,55 M NaCl enthielt, eluiert und wurde aufgefangen.
(B) Molekularsiebchromatographie unter Verwendung von Superdex30
Der 0,55 M NaCl Eluierungspool (3 ml) aus der Anionenaustauschchromatographie wurde auf eine Superdex30 PG (Pharmacia, Schweden) 1,6 × 66 cm Säule geladen, die zuvor mit 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,4, 0,15 M NaCl bei 24°C äquilibriert wurde. Die Chromatographie wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/Minute durchgeführt. Material, das in dem Faktor Xa amidolytischen Assay inhibierend war, eluierte 56 bis 64 ml in den Durchlauf (K_av 0,207). Dies war genau das gleiche Eluierungsvolumen, das für das native NAP bestimmt worden war.
(C) Reverse-Phase-HPLC-Chromatographie
Die gepoolten Fraktionen aus der Gelfiltration wurden auf eine 0,46 × 25 cm C18-Säule (218TP54 Vydac; Hesperia, CA; USA) geladen, die mit einem linearen Gradienten von 10 bis 35 Acetonitril in 0,1 % (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute mit einer langsameren Geschwindigkeit von 0,4 % Veränderung an Acetonitril/Minute entwickelt wurde. Die Faktor Xa inhibierende Aktivität (bestimmt gemäß Beispiel 1) eluierte mit ungefähr 30 % Acetonitril. Die HPLC-Versuche wurden auf dem gleichen System wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Faktor Xa inhibierende Aktivität enthaltende Fraktionen wurden im Vakuum getrocknet.
(D) Molekulargewichtsbestimmung
Die geschätzte Masse des wie in den Abschnitten A bis C dieses Beispiels beschrieben isolierten rekombinanten Pro-AcaNAP6 wurde mit dem gleichen Elektrosprayionisierungs-Massenspektrometriesystem wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt.
Die geschätzte Masse des rekombinanten Pro-AcaNAP6 betrug 8906,9 Dalton.
(E) Aminosäuresequenzierung
Nach der Reinigung wurde das rekombinante Pro-AcaNAP6 aus COS-Zellen Aminosäurenanalyse wie in Beispiel 1 beschrieben unterzogen. Es wurde bestimmt, dass die ersten fünf Aminosäuren des N-Terminus von Pro-AcaNAP6 wie folgt waren: Arg Thr Val Arg Lys [SEQ. ID. Nr. 110]. Verglichen mit dem nativen NAP-Protein (siehe Beispiel 1) besitzt Pro-AcaNAP6 vier zusätzliche Aminosäuren an seinem Aminoterminus. Die Aminosäuresequenz von Pro-AcaNAP6 ist in 6 gezeigt [SEQ. ID. Nr. 8].
Beispiel 9
Die Verwendung von NAP-DNA-Sequenzen zur Isolierung von Genen, die andere NAP-Proteine kodieren
Die AcaNAP5- und AcaNAP6-cDNA-Sequenzen (aus Beispiel 2) wurden verwendet, um durch Kreuzhybridisierung verwandte Moleküle aus anderen Parasitenspezies zu isolieren.
Die pGEM-9Zf(–) Vektoren (Promega), die die AcaNAP5- und AcaNAP6-cDNAs enthalten, wurden zum PCR-Rescue der Bereiche verwendet, die die reifen NAP-Proteine kodieren (Tag Polymerase von Life Technologies; 20 Temperaturzyklen: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 50°C und 1,5 Minute bei 72°C). Die verwendeten Oligonukleotid-Primer waren: (1) YG109, das auf die C-terminalen Sequenzen von cDNA zielte, die NAP kodieren, und die Sequenz TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [SEQ. ID. Nr. 88] hat, und (2) YG103 mit der Sequenz AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [SEQ. ID. Nr. 89]. Der YG109-Primer enthält ein einziges Nukleotid-Mismatch (unterstrichener T-Rest; vergleiche mit den in 1 und 3 gezeigten Sequenzen), wenn er mit AcaNAP6 als Target verwendet wird. Dies beeinflusste die Amplifizierungseffizienz nicht wesentlich. Die PCR-Produkte mit korrekter Größe (etwa 230 Basenpaare) wurden beide aus einem 1,5 % Agarosegel isoliert. Eine äquimolare Mischung wurde durch zufällige Primer-Extension (T7 QuickPrime Kit; Pharmacia) radiomarkiert und nachfolgend über eine Bio-Spin 30 Säule (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) gegeben.
Ancylostoma ceylanicum (Ace), Ancylostoma duodenale (Adu), und Heligmosomoides polygyrus (Hpo) cDNA-Bibliotheken wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 2 für Ancylostoma caninum beschrieben hergestellt.
Ancylostoma ceylanicum und Heligmosomoides polygyrus wurden von Dr. D. I. Pritchard, Department of Life Science, University of Nottingham, Nottingham, UK, gekauft. Ancylostoma duodenale wurde von Dr. G. A. Schad, The School of Veterinary Medicine, Department of Pathobiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA, gekauft.
In jedem Fall wurden die cDNAs als EcoRI-NotI Fragmente in lambda gt11 direktional geklont Ungefähr 2 × 10⁵ cDNA-Klone aus jeder Bibliothek (doppelte Plaque-Hebefilter wurden mit Hybond^TM-N; Amersham, hergestellt) wurden einem Screening mit den radiomarkierten AcaNAP5- und AcaNAP6-Fragmenten unter Verwendung der folgenden Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsbedingungen unterzogen: 5 × SSC (SSC: 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 5 × Denhardt's Lösung, 0,5 % SDS, 20 % Formamid, 100 Mikrogramm/ml schallbehandelte Fischsperma-DNA (Boehringer), über Nacht bei 42°C. Die Filter wurden 4 Mal 30 Minuten lang in 2 × SSC, 0,1 % SDS bei 37°C gewaschen. Nach Belichtung (etwa 60 Stunden) auf Röntgenfilm wurden im Fall von Ace und Adu insgesamt zwischen 100 und 200 Hybridisierungsflecken identifiziert. Im Fall der Hpo-cDNA-Bibliothek war eine kleine Anzahl von sehr schwachen Flecken sichtbar. Für jede der Bibliotheken wurden acht Positive einer zweiten Hybridisierungsrunde bei niedrigerer Plaquedichte unterzogen, um so einzelne Plaques zu isolieren.
Die einbehaltenen Klone wurden ferner durch PCR-Amplifizierung der cDNA-Inserts unter Verwendung des Oligo(dT)-NotI-Primers (Promega; dies ist der gleiche Primer, der zur Herstellung der ersten Stang-cDNA verwendet wurde, siehe Beispiel 2) [SEQ. ID. Nr. 95] in Kombination mit dem lambda-gt11 Primer Nr. 1218 mit der Sequenz GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [SEQ. ID. Nr. 96] (New England Biolabs; Primer Nr. 1218 zielt auf lambda-Sequenzen, die sich stromaufwärts von der Stelle der cDNA-Insertion befinden) charakterisiert. Die PCR-Amplifizierungen wurden wie folgt durchgeführt: Taq Polymerase von Boehringer; 30 Temperaturzyklen: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 50°C, 1,5 Minuten bei 72°C). Gelelektophoretische Analyse der PCR-Produkte zeigte eindeutig, dass für jede Spezies cDNAs von ungefähr der gleichen Größe wie die AcaNAP5-cDNA (z. B. 400 bis 500 bp) erhalten wurden. Zusätzlich zu diesen cDNAs von AcaNAP5-Größen wurde geschätzt, dass einige Ace- und Adu-cDNAs etwa 700 bp lang waren.
Zur Sequenzbestimmung wurde eine Anzahl von Klonen ausgewählt, die entweder ein 500 bp oder ein 800 bp Insert enthielten. Hierfür wurden die cDNA-Inserts als SfiI-NotI Fragmente in Phagemide vom pGEM-Typ (Promega; siehe Beispiel 2 für Details) subkloniert, wodurch die Herstellung von einsträngiger DNA möglich ist. Die Sequenzierungsergebnisse führte zur Identifizierung von sechs unterschiedlichen neuen NAP-artigen Proteinen, die wie folgt bezeichnet werden: AceNAP4, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AduNAP7 und HpoNAP5. Die Nukleotidsequenzen der cDNAs sowie die deduzierten Aminosäuresequenzen der kodierten Proteine sind in 7A (AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 9]), 7B (AceNAP5) [SEQ. ID. Nr. 10], 7C (AceNAP7) [SEQ. ID. Nr. 11], 7D (AduNAP4) [SEQ. ID. Nr. 12], 7E (AduNAP7) [SEQ. ID. Nr. 13] und 7F (HpoNAP5) [SEQ. ID. Nr. 14] gezeigt. Das AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 9] und AduNAP7 [SEQ. ID. Nr. 13]-cDNAs, die jeweils etwa 700 bp lang waren, kodierten jeweils Proteine, die zwei NAP-Domänen beinhalteten, die anderen isolierten cDNAs kodierten ein Protein mit einer einzigen NAP-Domäne. Der AduNAP4-cDNA-Klon hatte nicht die volle Länge, d. h. dem Klon fehlte der 5'-terminale Tel des Kodierbereichs, der korrekte Leserahmen konnte jedoch basierend auf Aminosequenzhomologie mit der NAP-Familie der verwandten Moleküle zugewiesen werden.
Die identifizierten cDNA-Sequenzen können unter Verwendung der gleichen oder alternativer geeigneter Exprimierungssysteme verwendet werden, um die kodierten Proteine wie in den Beispielen 3, 4, 5 und 7 offenbart zu produzieren. Konditionierte Medien oder Zelllysate können in Abhängigkeit von dem verwendeten System als solche oder nach Fraktionierung (unter Verwendung der Methodik wie in den Beispielen 3, 4, 6 und 8 beschrieben) auf proteaseinhibierende und Antikoagulansaktivität getestet werden. Proteine, die durch cDNAs kodiert sind, die an Sonden- hybridisieren, die von Fragmenten des AcaNAP5-Gens (1) [SEQ. ID. Nr. 3] und/oder des AcaNAP6-Gens (3) [SEQ. ID. Nr. 5] abgeleitet sind und Serinprotease inhibierende und/oder Antikoagulanseigenschaften besitzen, werden als zu der NAP-Familie der verwandten Moleküle gehörend angesehen.
Beispiel 10
Identifizierung von NAP durch funktionale Anzeige von cDNAkodierten Proteinen
(A) Die pDONG-Reihe der Vektoren
Die Nukleotidsequenzen der pDONG-Vektoren, PDONG61 [SEQ. ID. Nr. 15], PDONG62 [SEQ. ID. Nr. 16] und PDONG63 [SEQ. ID. Nr. 17], Derivate von pUC119 [J. Vieira und J. Messing, Methods in Enzymology, 153:3–11 (1987)], sind jeweils in den 8A bis 8C gezeigt.
Zur Konstruktion dieser drei Vektoren wurden HindIII und SfiI Restriktionsstellen durch PCR-Amplifizierung der M13K07-einsträngigen DNA [J. Vieira und J. Messing, Ibid.] mit dem G6BACKHIND-Rückwärts-Primer und G6FORSFI61, G6FORSFI62 oder G6FORSFI63 Vorwärts-Primern am 5'-Ende und 3'-Ende des filamentösen Phagengens 6 addiert. In einer zweiten PCR wurden die drei erhaltenen Fragmente mit G6BACKHIND und G6FORNOTBAMH als Vorwärts-Primer erneut amplifiziert, um NotI- und BamHI-Stellen an das 3'-Ende der Fragmente anzuhängen. Die Sequenzen der oben genannten PCR-Primer sind wie folgt (Restriktionsstellen sind unterstrichen):
G6BACKHIND: ATCCGAAGCT TTGCTAACAT ACTGCGTAAT AAG [SEQ. ID. Nr. 111]
G6FORSFI61: TATGGGATGG CCGACTTGGC CTCCGCCTGA GCCTCCACCT TTATCCCAAT CCAAATAAGA [SEQ. ID. Nr. 112]
G6FORSFI62: ATGGGATGGC CGACTTGGCC CTCCGCCTGA GCCTCCACCT TTATCCCAAT CCAAATAAGA [SEQ. ID. Nr. 113]
G6FORSFI63: TATGGGATGG CCGACTTGGC CGATCCGCCT GAGCCTCCAC CTTTATCCCA ATCCAAATAA [SEQ. ID. Nr. 114]
GAG6FORNOTBAMH: AGGAGGGGAT CCGCGGCCGC GTGATATGGG ATGGCCGACT TGGCC [SEQ. ID. Nr. 115]
Die PCR-Produkte wurden schließlich gelgereinigt, individuell mit HindIII und BamHI verdaut und zwischen den entsprechenden Stellen von pUC119 insertiert. Sequenzbestimmung bestätigte, dass pDONG61, pDONG62 und pDONG63 alle das vorgesehene Insert enthielten.
Die pDONG-Reihe der Vektoren ermöglicht das Klonen von cDNAs als SfiI-NotI-Fragmente. Dieses Klonieren fusioniert die cDNAs in jede der drei Lese- (Translations)-Rahmen an das 3'-Ende des filamentösen Phagengens 6, das eines der Hüllproteine des Phagen kodiert. Infektion eines männchenspezifischen E. coli-Stamms, der ein pDONG-Derivat mit VCSM13-Helferphagen beherbergte (Stratagene, La Jolla, CA, USA), führte zu Rescuing von Pseudovirionen, die einen spezifischen Einzelstrang des pDONG-Derivats einkapseln und auch ein rekombinantes Protein 6 (p6) Fusionsprotein in ihre Hülle einbauen können. Solche cDNAs, bei denen das kodierte Protein funktional als rekombinantes p6-Fusionsprotein auf der Phagenoberfläche gezeigt werden, werden mittels eines nachfolgend beschriebenen Schwenkexperiments identifizierbar.
(B) Transfer der Ancylostoma caninum-cDNA-Bibliothek von Lambda gt11 auf die pDONG-Reihen der Vektoren
Eine Phagen lambda-Zubereitung der gepoolten A. caninum-cDNA-Klone (etwa 1 × 10⁶ Plaques, siehe Beispiel 2) wurde für PCR-Rescue der cDNA-Inserts verwendet (Taq Polymerase von Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA; 20 Temperaturzyklen: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 50°C und 3 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 65°C), wobei der lambda gt11 Primer Nr. 1218 die Sequenz GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [SEQ. ID. Nr. 96] (New England Biolabs, Beverly, MA, USA; Zielsequenzen befanden sich stromaufwärts von dem cDNA-Insert) hatte, in Kombination mit dem Oligo(dT)-NotI Primer/Adaptor (Promega), der für die Synthese der ersten Strangs der cDNA verwendet wurde. Nach der Verdauung mit den Restriktionsenzymen SfiI und NotI wurde der gesamte Größenbereich der Amplifizierungsprodukte aus Agarosegel gewonnen.
Alle Fragmente wurden in die pDONG61, pDONG62 und pDONG63-Vektoren direktional geklont. Die aufnehmenden Vektorfragmente wurden durch Verdauung der CsCl-gereinigten Vektoren mit SfiI und NotI und Reinigung mit dem "Wizard^TM PCR Preps DNA Purification System" (Promega Corp, Madison, WI, USA) hergestellt.
E. coli-Stamm TG1 [J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Clonin g, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Bände 1 bis 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] wurde durch Elektroporation mit den pDONG/cDNA-Ligierungsmischungen transformiert. Elektrotransformierte Zellen wurden eine Stunde bei 37°C in SOC-Medium inkubiert [J. Sambrook et al., Ibid.] und auf LB-Agar ausgestrichen, der 0,1 Glucose und 100 μg/ml Carbenicillin (245 × 245 × 25 mm Platten; Nunc) enthielt. 2,2 × 10⁶, 1,6 × 10⁶ und 1,4 × 10⁶ carbenicillinresistente Transformanten wurden mit pDONG61, pDONG62 beziehungsweise pDONG63 erhalten. Aus jeder jeweiligen Bibliothek, die als 20L, 21L und 22L bezeichnet wurde, wurde eine Anzahl zufällig ausgewählter Transformanten PCR-Analyse unterzogen (Taq Polymerase von Life Technologies, 30 Amplifizierungszyklen mit dem folgenden Temperaturprogramm: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 50°C und 1 bis 3 Minuten bei 72°C), wobei zwei Primer verwendet wurden, die zu Sequenzen passten, die die multiple Klonierungsstelle von pUC119 flankierten (Primer Nr. 1224 mit der Sequenz CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC [SEQ. ID. Nr. 116], und Nr. 1233 mit der Sequenz AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA [SEQ. ID. Nr. 101]; New England Biolabs). Die Ergebnisse zeigten, dass die überwiegende Mehrzahl der Klone ein cDNA-Insert von variabler Größe enthielten
(C) Auf Faktor Xa basierende Affinitätsselektion von cDNA-Klonen, die ein NAP-Protein kodieren
Phagenpartikel aus den 20L, 21L und 22L Bibliotheken wurden wie folgt geborgen (Rescue unterzogen): Jede Bibliothek wurde von den Platten gekratzt und in 100 ml LB Medium, das mit 1 % Glucose und 100 μg/ml Carbenicillin ergänzt worden war, gezüchtet, bis die optische Absorption bei 600 nm den Wert von 0,5 erreichte. Nach Zugabe von VCSM13 Helferphagen (Stragagene) an einer Vielzahl von Infektionen (moi) von 20 wurde die Kultur 30 Minuten bei 37°C stehen gelassen und danach langsam weitere 30 Minuten geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren pelletiert und erneut in 250 ml LB-Medium suspendiert, das mit 100 μg/ml Carbenicillin und 50 μg/ml ergänzt worden war. Die Kulturen wurden über Nacht unter kräftiger Durchmischung bei 30°C wachsen gelassen. Die resultierenden Phagenteilchen wurden durch zwei aufeinanderfolgende Präzipitationen mit Polyethylenglykol/NaCl gereinigt und mit 1 × 10¹³ Virionen pro ml in TRIS-gepufferter Salzlösung (0,05 M Tris, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,4) (TBS) erneut suspendiert. Dann wurden gleiche Mengen der Phagenpartikel aus der 20L, 21L und 22L miteinander gemischt.
Humanfaktor Xa (siehe Beispiel 1 hinsichtlich der Zubereitung) wurde mit Biotin-XX-NHS gemäß den Anweisungen des Herstellers (Pierce) biotinyliert. Die amidolytische Aktivität der Protease wurde durch diese Modifikation nicht beeinflusst, wie durch einen enzymatischen Assay gezeigt wurde, der das chromogene Substrat S-2765 (Chromogenix, siehe Beispiel 1) verwendet. Streptavidin-beschichtete magnetische Perlen (Dynal, 1 mg pro Schwenkrunde) wurden drei Mal mit TBS gewaschen und in TBS bei Umgebungstemperatur geblockt, das mit 2 % Magermilch (Difco) ergänzt worden war. Die magnetischen Perlen wurden nach einer Stunde vor Gebrauch zwei Mal mit TBS gewaschen.
Bei der ersten Schwenkrunde wurden 1 × 10¹³ Phagen aus den gepoolten Bibliotheken 75 Minuten bei 4°C in 200 μl TBS-Puffer inkubiert, der mit 250 nM biotinyliertem Faktor Xa, 5 mM CaCl₂ und 2 % Magermilch ergänzt worden war.
Nach dieser Zeit wurde der Phagenlösung 1 ml blockierte, Streptavidin-beschichtete, magnetische Perlen zugegeben, die in 200 μl TBS resuspendiert worden waren, die 5 mM CaCl₂ und 2 Magermilch enthielt, und wurde eine Stunde bei 4°C unter gelindem Bewegen inkubiert. Die magnetischen Perlen wurden dann mit einem Magneten (Dynal) 10 Mal mit 500 Mikrolitern TBS gespült, die 0,1 % Tween-20 enthielt. Gebundene Phagen wurden von den magnetischen Perlen eluiert, indem sie 10 Minuten mit 500 Mikrolitern 0,1 M Glycin-HCl-Puffer (pH 2,0) inkubiert wurden. Der Überstand wurde mit 150 Mikrolitern 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) neutralisiert.
Zur Phagenvermehrung wurde E. coli Stamm TGI [J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Bände 1 bis 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] bei 37°C in 10 ml LB-Medium gezüchtet, bis die optische Absorption bei 600 nm den Wert von 0,5 erreichte. Die Kultur wurde mit 650 μl Phagen infiziert, die aus den magnetischen Perlen eluiert worden waren, und wurde ohne Schütteln bei 37°C kurz inkubiert. Nach dem Zentrifugieren wurden die infizierten Zellen in 2 ml LB-Medium resuspendiert und auf 245 × 245 × 25 mm Platten ausgestrichen, die mit LB-Agar gefüllt waren, der 1 % Glucose und 100 μg/ml Carbenicillin enthielt. Nachdem über Nacht bei 37°C inkubiert worden war, wurden die Zellen von den Platten gekratzt und in 40 ml LB-Medium resuspendiert, das mit 1 % Glucose und 100 μg/ml Carbenicillin ergänzt worden war. Eine Zellaliqote, die 15 optischen Dichten bei 600 nm entsprach, wurde dann zum Inokulieren von 100 ml LB-Medium verwendet, das 1 % Glucose und 100 μg/ml Carbenicillin enthielt. Das Phagen-Rescue für die nächste Schwenkrunde erfolgte wie oben beschrieben.
Für die zweite Schwenkrunde wurden 6 × 10¹² Phagen während 90 Minuten mit 1 mg blockierten, Streptavidin-beschichteten, magnetischen Perlen in 200 μl TBS inkubiert, die 2,5 mM Ca²⁺ und 2 % Magermilch enthielt (diese Stufe wurde in das Verfahren eingeführt, um Selektion von Streptavidin bindenden Klonen zu vermeiden). Nachdem die Perlen entfernt worden waren, wurde das gleiche Protokoll wie für Runde 1 verwendet. Runden 3, 4 und 5 wurden wie Runde 2 durchgeführt, außer dass die Phageneingabe auf 2 × 10¹² Phagen abgesenkt wurde.
24 individuelle Carbenicillin-resistente Klone, die nach fünf Schwenkrunden gegen biotinylierten Faktor Xa isoliert wurden, wurden dann mittels ELISA analysiert. Streptavidin-be schichtete 96-Mulden-Platten (Pierce) wurden eine Stunde mit 200 μl TBS pro Mulde geblockt, das 2 % Magermilch enthielt, danach wurde eine Stunde mit 100 μl 20 nM biotinylierem Faktor Xa in TBS pro Mulde inkubiert. Für jeden Klon wurden etwa. 10¹⁰ Phagen, verdünnt in 100 μl TBS, das 2 % Magermilch und 0,1 Tween-20 enthielt, zu den Mulden gegeben. Nachdem 2 Stunden inkubiert worden war, wurden die Mulden vier Mal mit 200 μl TBS gespült, das 0,1 % Tween-20 enthielt. Gebundene Phagen wurden sichtbar gemacht, indem nacheinander mit einem Anti-M13-Serum des Kaninchens (siehe Beispiel 11), einer alkalischen Phosphatase, die mit Anti-Kaninchenserum (Sigma) konjugiert war, und p-Nitrophenylphosphat als Substrat (Sigma; inkubiert wurde. Nach 20 Minuten wurden bei 405 nm Absorptionen gemessen. Von den 24 Klonen banden fünf stark an Faktor Xa. Es wurde bei diesen Phagen keine signifikante unspezifische Bindung beobachtet, wenn sie in dem gleichen ELISA getestet wurden, wobei der biotinylierte Faktor Xa weggelassen wurde.
Dann wurde aus den fünf positiven Klonen einsträngige DNA hergestellt, und die Inserts 3' des Gens 6 wurden unter Verwendung des Primers Nr. 1224 mit der Sequenz CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC [SEQ. ID. Nr. 116] (New England Biolabs) automatisiertem DNA-Sequenzieren unterzogen. Es wurde gefunden, dass alle fünf Klone die gleiche 470 bp 5'-abgetrennte cDNA enthielten, die im Rahmen an Gen 6 in pDONG63 fusioniert waren. Die Nukleotidsequenz dieser cDNA sowie die deduzierte Aminosäuresequenz sind in 9 gezeigt [SEQ. ID. Nr, 19] abgebildet. Die cDNA mit der Bezeichnung AcaNAPc2 kodiert ein Protein mit der Bezeichnung NAP Isoform c2, das zu der NAP-Familie der verwandten Proteine gehört.
Beispiel 11
Herstellung von Antiserum gegen M13-Phage
Antiserum gegen M13-Phage wurde in Kaninchen durch subkutane Injektionen von etwa 10¹³ M13K07 Phage in 500 μl PBS (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,4 + 0,15 M Natriumchlorid) in Kombination mit einem gleichen Volumen an Hilfsmittel hergestellt. Der M13K07-Phage wurden im Wesentlichen wie in G. Glaser- Wuttke, J. Keppner und I. Rasched, Biochim. Biophys. Acta, 985: 239–247 (1989) beschrieben CsCl-gereinigt. Die Anfangsinjektion erfolgte komplettem Freund'schem Adjuvans am Tag 0, gefolgt von inkomplettem Freund'schem Adjuvans am 7., 14. und 35. Tag. Antiserum wurde am 42.Tag geerntet.
Die IgG-Fraktion des Antiserum wurde durch Passage durch eine Protein A-Sepharose-Säule unter im Stand der Technik bekannten Bedingungen angereichert.
Beispiel 12
Verwendung von AcaNAP5 oder AcaNAP6-DNA-Sequenzen zum Isolieren zusätzlicher NAP-kodierender Sequenzen aus A. caninum Die AcaNAP5- und AcaNAP6-cDNA-Sequenzen (aus Beispiel 2) wurden verwendet, um durch Kreuzhybridisierung verwandte Moleküle aus den gleichen Parasitenspezies zu isolieren.
Die pGEM-9Zf(–) Vektoren (Promega, Madison, WI, USA), die die AcaNAP5- und AcaNAP6-cDNAs enthalten, wurden zum PCR-Rescue der Bereiche verwendet, die die reifen NAP-Proteine kodieren (Taq Polymerase von Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA); 20 Temperaturzyklen: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 50°C und 1,5 Minuten bei 72°C). Die verwendeten Oligonukleotid-Primer waren: (1) YG109, das auf die C-Terminal kodierenden Sequenzen von cDNA zielte, die AcaNAP5 und AcaNAP6 kodierten, mit der Sequenz TCAGACATGT-ATAATCTCAT-GTTGG [SEQ. ID. Nr. 88], und (2) YG103, das auf die N-Terminal kodierenden Sequenzen von reifer AcaNAP5 und AcaNAP6 zielte, mit der Sequenz AAGGCATACC-CGGAGTGTGG-TG [SEQ. ID. Nr. 89]. Der YG109-Primer enthält ein einziges Nukleotid-Mismatch, wenn er mit AcaNAP6 als Target verwendet wird (unterstrichener T-Rest, verglichen mit den in 3 gezeigten Sequenz [SEQ. ID. Nr. 5]). Dieses Mismatch beeinflusste die Amplifizierungseffizienz nicht wesentlich. Die PCR-Produkte mit korrekter Größe (etwa 230 Basenpaare) für AcaNAP5 und AcaNAP6 wurden beide aus einem 1,5 Agarosegel isoliert. Eine äquimolare Mischung wurde durch zufällige Primer-Extension (T7 QuickPrime Kit; Pharmacia (Schweden)) radiomarkiert und nachfolgend über eine Bio-Spin 30 Säule (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) gegeben.
Ungefähr 750.000 Ancylostoma caninum (Aca)cDNA Klon (siehe Beispiel 2 (B); doppelte Plaque-Hebefilter wurden mit Hybond^TM-N;, Amersham (Buckinghamshire, England) hergestellt) wurden Screening mit dem radiomarkierten AcaNAP5- und AcaNAP6-cDNA-Fragmenten unter Verwendung der folgenden Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsbedingungen unterzogen: 5 × SSC (SSC: 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 5 × Denhardt's Lösung, 0,5 SDS, 20 % Formamid, 100 Mikrogramm/ml schallbehandelte Fischsperma-DNA (Boehringer), über Nacht bei 42°C. Die Filter wurden 4 Mal 30 Minuten lang in 2 × SSC, 0,1 % SDS bei 37°C gewaschen. Nach Belichtung auf Röntgenfilm wurden insgesamt etwa 300 Positive identifiziert.
48 der 300 Positiven wurden PCR-Amplifizierung (Taq Polymerase von Boehringer Mannheim, Deutschland; 30 Temperaturzyklen: 1 Minute bei 95°C; 1 Minute bei 50°C; 1,5 Minuten bei 72°C) unterzogen, wobei der oben genannte YG109 Primer, der für die C-terminal-kodierende Sequenz für AcaNAP5 und AcaNAP6-cDNAs spezifisch ist, und Primer Nr. 1218, der auf lambda-gt11 Sequenzen stromaufwärts von der Stelle der cDNA-Insertion zielt (New England Biolabs, Beverly, MA, USA; GGTGGCGACG ACTCCTGGAG CCCG [SEQ. ID. Nr. 96]), verwendet wurde. 31 von 48. Positiven ergaben ein PCR-Produkt mit einer Größe ähnlich derjenigen, die für eine AcaNAP5/6-Typ-cDNA erwartet wurde.
Die restlichen 17 Positiven wurden als Templat für die Amplifizierung mit Primer Nr. 1218 und einem AcaNAPc2-spezifischen Primer verwendet (z. B. LJ189, der auf den AcaNAPc2 C-Terminus zielt und die Sequenz GTTTCGAGTT CCGGGATATA TAAAGTCC [SEQ. ID. Nr. 117] hat, siehe Beispiel 10 und 9. Keiner der Klone ergab ein PCR-Produkt. Alle 17 Positiven wurden danach einer zweiten Hybridisierungsrunde mit niedrigerer Plaquedichte unterzogen, in allen Fällen wurden einzelne isolierte Klone identifiziert. Die 17 isolierten cDNA-Klone wurden erneut mittels PCR unter Verwendung der Primerkopplungen Nr. 1218/YG109 und Nr. 1218/LJ189 analysiert. Drei von 17 Klonen ergaben ein Amplifizierungsprodukt mit den Nr. 1218/YG109-Primern.
Die restlichen 14 Klone wurden weiter durch PCR-Amplifizierung mit den Primern Nr. 1218 und Oligo(dT)-Not (Promega, Madison, WI, USA, dies ist der gleiche Primer, der zur Herstellung des ersten Strangs der cDNA verwendet wurde, siehe Beispiel 2) analysiert. Alle 14 Klone ergaben ein PCR-Produkt. Gelelektrophoretische Analyse der PCR-Produkte zeigte, dass einige cDNAs erheblich länger als der AcaNAP5-cDNA-Insert war.
Zehn Klone einschließlich jener mit den größten cDNA-Inserts wurden für die Sequenzbestimmung ausgewählt. Hierfür wurden die cDNA-Inserts als SfiI-NotI-Fragmente auf Phagemide vom pGEM-Ty (Promega, Madison, WI, SA) wie in Beispiel 2 beschrieben subkloniert. Die Sequenzierung identifizierte acht zusätzliche NAP-Proteinsegenzen, die wie folgt bezeichnet werden:
AcaNAP23, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP31, AcaNAP44, AcaNAP45, AcaNAP47 und AcaNAP48. Zwei weitere cDNA-Klone mit den Bezeichnungen AcaNAP42 und AcaNAP46 kodierten Proteine, die mit jenen identisch waren, die durch AcaNAP31 [SEQ. ID. Nr. 34] kodiert wurden. Die Nukleotidsequenzen der cDNAs sowie die deduzierten Aminosäuresequenzen der kodierten Proteine sind in 13A (AceNAP23 [SEQ. ID. Nr. 31]), 13B (AceNAP24) [SEQ. ID. Nr. 32], 13C (AceNAP25) [SEQ. ID. Nr. 33], 13D (AcaNAP31) [SEQ. ID. Nr. 34], 13E (AcaNAP44) [SEQ. ID. Nr. 35], 13F (AcaNAP45) [SEQ. ID. Nr. 36], 13G (AcaNAP47 [SEQ. ID. Nr. 37]) und 13H (AcaNAP48 [SEQ. ID. Nr. 38]) gezeigt. Alle Klone hatten die volle Länge und enthielten ein vollständiges Sekretionssignal. Die AceNAP45- [SEQ. ID. Nr. 36] und AcaNAP47- [SEQ. ID. Nr. 37]-cDNAs kodierten jeweils Proteine, die zwei NAP-Domänen beinhalteten, die andere cDNA kodierte ein Protein mit einer einzigen NAP-Domäne.
Beispiel 13
Verwendung von NAP-DNA-Sequenzen zum Isolieren von Sequenzen, die ein NAP-Protein aus Necator americanus kodieren
Die Sequenzen von AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 3], AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 5], AcaNAPc2 [SEQ. ID. Nr. 19], AcaNAP23 [SEQ. ID. Nr. 31], AcaNAP24 [SEQ. ID. Nr. 32], AcaNAP25 [SEQ. ID. Nr. 33], AcaNAP31 [SEQ. ID. Nr. 34], AcaNAP44 [SEQ. ID. Nr. 35], AcaNAP45 [SEQ. ID. Nr. 36], AcaNAP47 [SEQ. ID. Nr. 37], AcaNAP48 [SEQ. ID. Nr. 38], AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 9], AceNAP5 [SEQ. ID. Nr. 10], AceNAP7 [SEQ. ID. Nr. 11], AduNAP4 [SEQ. ID. Nr. 12], AduNAP7 [SEQ. ID. Nr. 13] und HpoNAP5 [SEQ. ID. Nr. 14] (siehe 1, 3, 7 und 13) wurden verwendet, um verwandte Moleküle aus dem hämatophagen Parasiten Necator americanus durch PCR-Klonen zu isolieren.
Consensus-Aminosäuresequenzen wurden aus Homologiebereichen innerhalb der NAP-Proteine erzeugt. Diese Consensus-Sequenzen wurden dann zum Design der folgenden degenerierten PCR-Primer-verwendet: NAP-1, 5'-AAR-CCN-TGY-GAR-MGG-AAR-TGY-3' [SEQ. ID. Nr. 90] entsprach der Aminosäuresequenz NH₂-Lys-Pro-Cys-Glu-(Arg/Pro/Lys)-Lys-Cys [SEQ. ID. Nr. 118]; NAP-4.RC, 5'-TW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NAC-RCA-3' [SEQ. ID. Nr. 91] entsprach der Sequenz NH₂-Cys-(Val/Ile/Gln)-Cys-(Lys/Asp/Glu/Gln)-(Asp/Glu)-Gly-(Phe/Tyr)-Tyr [SEQ. ID. Nr. 119]. Diese Primer wurden paarweise verwendet, um mittels PCR unter Verwendung von N. americanus-cDNA als Templat NAP-spezifische Sonden. zu erzeugen.
Adulte Würmer, N. americanus, wurden von Dr. David Pritchard, University of Nottingham, gekauft. Poly(A+) RNA wurde mit dem QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA) hergestellt. 1 μg mRNA wurde mittels reverser Transkription unter Verwendung von AMV reverser Transkriptase und zufälligen Hexamer-Primern (Amersham, Arlington Hills, IL, USA) verarbeitet. 1/50 des einsträngigen cDNA-Reaktionsprodukts wurde als Templat für ∼ 400 pmol von jedem von NAP-1 und NAP-4. RC mit PCR GeneAmp (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) Reagentien auf einem Perkin-Elmer DNA-Thermozyklusgerät verwendet. Die PCR-Bedingungen waren: Zyklen 1–3, Denaturation bei 96°C für 2 Minuten, Annealing bei 37°C für 1 Minute und Verlängerung bei 72°C für 3 Minuten (Hochfahrzeit zwischen 37°C und 72°C betrug 2 Minuten); Zyklen 4–5, Denaturation bei 94°C für 1 Minute, Annealing bei 37°C für 1 Minute und Verlängerung bei 72°C für 2 Minuten (Hochfahrzeit zwischen 37°C und 72°C betrug 2 Minuten), Zyklen 6–45, Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, Annealing bei 37°C für 1 Minute und Verlängerung bei 72°C für 2 Minuten. Die Verlängerungszeiten wurden für die Zyklen 6–45 um 3 Sekunden/Zyklus erhöht.
Die PCR-Amplifizierung von N. americanus cDNA mit NAP-1 und NAP4.RC führte zu einem Amplifizierungsprodukt von ungefähr 100 bp. Das PCR-Produkt wurde mit [a-32P]-dCTP (Amersham) unter Verwendung von zufälliger Primermarkierung (Stratagene, La Jolla, CA, USA) markiert, und markierte DNA wurde von nicht eingebauten Nukleotiden unter Verwendung einer Chromaspin-10-Säule (Clonetech, Palo Alto, CA, USA) getrennt.
Nach dem folgenden Verfahren wurde eine cDNA-Bibliothek aufgebaut. Aus 1 μg N. americanus Poly(A+) RNA wurde unter Verwendung von AMV reverser Transkriptase und zufälligen Hexamer-Primern (Amersham, Arlington Hills, Il, USA) doppelsträngige cDNA synthetisiert. Unter Verwendung von Standardverfahren wurden cDNA-Fragmente, die größer als ungefähr 300 bp waren, an einem 6 % Polyacrylamidgel gereinigt und an EcoRI-Linker (Stratagene, San Diego, CA, USA) ligiert. Mit Linker versehene cDNA wurde in EcoRI-Schnitt und dephosphorylierten lambda gt10 (Stratagene, San Diego, CO, USA) ligiert und mit einem Gigapack Gold II Verpackungskit (Stratagene, San Diego, CA, USA) verpackt.
Die Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsbedingungen waren 6 × SSC (SSC: 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitat, pH 7,0), 0,02 M Natriumphosphat pH 6,5, 5 × Denhardt's Lösung, 100 μg/ml gescherte denaturierte Lachssperma-DNA, 0,23 % Dextransulfat. Die Vorhybridisierung und Hybridisierung waren bei 42°C, und die Filter wurden 30 Minuten lang bei 45°C mit 2 × SSC nach zwei Vorwäschen mit 2 × SSC für 20 Minuten gewaschen. Die Filter wurden über Nacht auf Röntgenfilm mit zwei Intensivierungsschirmen bei –70°C belichtet.
Ungefähr 400.000 rekombinante Phagen der mit zufälligen Primern verarbeiteten N. americanus-Bibliothek (nicht amplifiziert) wurden Screening mit dem NAP-1/NAP-4. RC PCR-Fragment unterzogen. Etwa elf rekombinante Phagen hybridisierten an diese Sonde, von denen vier für die Nukleotidsequenzanalyse isoliert wurden. Doppelsträngiges Sequenzieren wurde bewirkt, indem die in diesen Phagenisolaten enthaltenen EcoRI-cDNA-Fragmente in pBluescrpt II KS+ Vektor (Stratagene, San Diego, CA, USA) isoliert wurden. Die DNA wurde mit dem Sequenase Version 2.0 Kit (Amersham, Arlington Hills, IL, USA) und M13 Oligonukleotidprimern (Stratagene, San Diego, CA, USA) sequenziert.
Die vier lambda-Isolate enthielten DNA, die ein einziges NAP-Polypeptid mit 79 Aminosäuren kodierte, das an die NAP-Sequenzen von Ancylostoma spp. und H. polygyrus erinnerte. Das NAP-Polypeptid aus N. americanus hatte ein berechnetes Molekulargewicht von 8859,6 Dalton. Das Nukleotid und die deduzierten Aminosäuresequenzen sind in 14 gezeigt.
BEISPIEL 14
Expression von rekombinantem AceNAP4 in COS-Zellen
A. Expression
AceNAP4 wurde im Wesentlichen wie für Pro-AcaNAP5 in Beispiel 5 und Pro-AcaNAP6 in Beispiel 7 vorübergehend in COS-Zellen produziert.
Ein Phagemid vom pGEM-Typ, das die AceNAP4-cDNA (aus Beispiel 9) beherbergte, diente als Ziel für PCR-Rescue des gesamten AceNAP4-Kodierbereichs einschließlich des Sekretionssignals unter Verwendung von zwei XbaI-anhängenden Oligonukleotidprimern. Die verwendeten Primer waren: (1) SHPCR4, der auf das 5'-Ende des Gens zielte und die Sequenz GACCAGTCTA GACCACCATG GCGGTGCTTT ATTCAGTAGC AATA [SEQ. ID. Nr. 120], und (2) SHPCR5, der auf das 3'-Ende des Gens zielte und die Sequenz GCTCGCTCTA GATTATCGTG AGGTTTCTGG TGCAAAAGTG [SEQ. ID. Nr. 121] hatte. Die in den Primern enthaltenen XbaI-Restriktionsstellen sind unterstrichen. Die Primer wurden verwendet, um die AceNAP4-Sequenz gemäß den in Beispiel beschriebenen Bedingungen zu amplifizieren.
Nach der Verdauung mit XbaI-Enzym wurde das Amplifizierungsprodukt mit der erwarteten Größe aus einem Agarosegel isoliert und nachfolgend durch das etwa 450 Basenpaar-XbaI- Stufferfragment des pEF-BOS-Vektors ersetzt [S. Mizushima und S. Nagata, Nucl. Acids Res., 18: 5322 (1990)]. Das in Beispiel 5 beschriebene Protokoll wurde verwendet, um den Klon pEF-BOS-AceNAP4 zu ergeben, von dem mittels PCR unter Verwendung der Primer SHPCR4 und YG60 zuerst gezeigt wurde, dass er das XbaI-Insert in der gewünschten Orientierung beherbergte, und wurde nachfolgend durch Sequenzbestimmung bestätigt. Dieser Klon wurde zum Transfektizieren von COS-Zellen gemäß den Verfahren von Beispiel 5 verwendet.
24 Stunden nach der Transfektion der COS-Zellen (die in Beispiel 5, Abschnitt B beschrieben ist) wurde das COS-Medium, das 10 % FBS enthielt, durch 50 ml eines Mediums ersetzt, das aus einer 1:1-Mischung aus DMEM und Nutrient Mixture Ham's F-12 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) bestand. Die Zellen wurden dann weiter bei 37°C inkubiert und die Produktion von EGR-Faktor Xa abhängiger TF/Faktor VIIa-inhibierender Aktivität wie in Beispiel E beschrieben detektiert.
B. Reinigung von AceNAP4
1. Anionenaustauschchromatographie
Der COS-Kulturüberstand aus den AceNAP4-exprimierenden Zellen wurde 10 Minuten mit 1500 UpM (etwa 500 × g) zentrifugiert, bevor die folgenden Proteaseinhibitoren (ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa, CA, USA) zugefügt wurden (1,0 × 10^–5 M PepstatinA (Isovaleryl-Val-Val-4-amino-3-hydroxy-6-methyl-heptanoyl-Ala-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure), 1,0 × 10^–5 M AEBSF (4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid). Festes Natriumacetat wurde auf eine Endkonzentration von 50 mM zugegeben, bevor der pH-Wert mit 1 N HCl auf 5,3 eingestellt wurde. Der Überstand wurde geklärt, indem er durch einen 0,22 μm Celluloseacetatfilter (Corning Inc., Corning, NY, USA) geleitet wurde.
Der geklärte Überstand (Gesamtvolumen ungefähr 450 ml) wurde auf eine Poros20 HQ (Perseptive Biosystems, MA) 1 × 2cm Säule geladen, die zuvor mit Anionenpuffer (0,05 M Natriumacetat 0,1 M NaCl, pH 5,3) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/Minute äquilibriert worden war. Die Säule und die Probe befanden sich während dieser Reinigungsstufe auf Umgebungstemperatur. Die Säule wurde anschließend mit 10 Säulenvolumina Anionenpuffer und 10 Säulenvolumina 50 mM Natriumacetat, 0,37 M NaCl, pH 5,3 gewaschen.
Material, das EGR-FXa-abhängige fVIIa/TF-amidolytische inhibierende Aktivität (siehe Beispiel E) hatte, wurde mit 50 mM Natriumacetat, 1 M NaCl, pH 5,3 mit einem Durchfluss von 2 ml/Minute eluiert.
2. Reverse-Phase-Chromatographie
Eine Aliquote des Pools der Fraktionen, die nach Anionenaustauschchomatographie aufgefangen wurden, wurde auf eine 0,46 × 25 cm C18-Säule (218TP54 Vydac; Hesperia, CA, USA) geladen, die mit einem linearen Gradienten von 10 bis 35 % Acetonitril in 0,1 % (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute mit einer Geschwindigkeit von 0,4 % Veränderung an Acetonitril/Minute entwickelt wurde. Die EGR-FXa-abhängige TF-FVIIa amidolytische inhibierende Aktivität (siehe Beispiel E) wurde überwacht und Fraktionen, die diese inhibierende Aktivität enthielten, wurden isoliert und im Vakuum getrocknet.
3. Charakterisierung von rekombiniertem AceNAP4
Die AceNAP4-Verbindung zeigte SDS-PAGE-Mobilität an einem 4–20 % Gel in Übereinstimmung mit ihrer Größe, die aus der Sequenz der cDNA vorhergesagt worden war (Coomassie gefärbtes Gel von Material nach der RP-Chromatographie).
BEISPIEL 15
Produktion und Reinigung von rekombinantem AcaNAPc2 in P. pastoris
A. Konstruktion des Expressionsvektors
Die Expression des AcaNAPc2-Gens in P. pastoris wurde unter Verwendung des in Beispiel 3 detailliert beschriebenen Protokolls zur Expression von AcaNAP5 mit den folgenden Modifikationen bewirkt.
Der pDONG63-Vektor, der die AcaNAPc2-cDNA enthielt, beschrieben in Beispiel 10, wurde verwendet, um den Bereich, der das reife AcaNAPc2-Protein kodiert, durch Amplifizierung ("PCR-Rescue") zu isolieren (unter Verwendung von Vent Polymerase von New England Biolabs, Beverly, MA, USA; 20 Temperaturzyklen: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 1,5 Minuten bei 72°C). Es wurden die folgenden Oligonukleotid-Primer verwendet:
LJ190: AAAGCAACGA-TGCAGTGTGG-TGAG [SEQ. ID. Nr. 122]
LJ191: GCTCGCTCTA-GAAGCTTCAG-TTTCGAGTTC-CGGGATATAT-AAAGTCC [SEQ. ID. Nr. 123]
Der LJ191-Primer, der auf C-terminale Sequenzen zielt, enthielt eine Extension ohne Annealing, zu der XbaI und HindIII-Restriktionsstellen (unterstrichen) gehörten.
Nach der Verdauung mit XbaI-Enzym wurde das Amplifizierungsprodukt mit der erwarteten Größe aus Gel isoliert und nachfolgend enzymatisch phosphoryliert (T4 Polynukleotidkinase von New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Nach Wärmeinaktivierung (10 Minuten bei 70°C) der Kinase wurde das stumpfendige XbaI-Fragment zu Expressionszwecken direktional in den Vektor pYAM7SP8 geklont. Das aufnehmende Vektorfragment von pYAM7SP8 wurde durch StuI-SpeI-Restriktion hergestellt und aus Agarosegel gereinigt. Der E, coli-Stamm, WK6 [R. Zell und H.-J. Fritz, EMBO J., 6: 1809–1815 (1987)], wurde mit der Ligierungsmischung transformiert, und ampicillinresistente Klone wurden selektiert.
Basierend auf Restriktionsanalyse wurde ein Plasmidklon zur weiteren Charakterisierung erhalten, der ein Insert mit der erwarteten Größe enthielt und als pYAM7SP-NAPC2 bezeichnet wurde. Sequenzbestimmung des Klons pYAM7SP-NAPC2 bestätigte das genaue Insertieren des reifen AcaNAPc2-Kodierbereichs in Fusion mit dem Präpro-Leader-Signal, wie durch das Konstruktionsschema vorhergesagt wurde, sowie die Abwesenheit von unerwünschten Mutationen in dem Kodierbereich.
(B) Expression von rekombinantem AcaNAPc2 in P. pastoris.
Der Pichia-Stamm GTS115 (his4) ist in D. W. Stroman et al., US-4,855,231, beschrieben worden. Alle Manipulationen von P. pastoris wurden im Wesentlichen wie in D. W. Stroman et al., US-4,855,231 beschrieben durchgeführt.
Etwa 1 Mikrogramm pYAM7SP-NAPc2-Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines Standard-Elektroporationsprotokolls in den Stamm GTS115 elektroporiert. Der Plasmid wurde zuvor durch Verdauung mit SalI linearisiert, wodurch theoretisch das Integrationsereignis in den his4-Chromosomenlocus zielte.
Die Selektion eines AcaNAPc2-Hochexpressionsstamms wurde wie in Beispiel 3 für NAP Isoform 5 (AcaNAP5) beschrieben unter Verwendung von Minikulturscreening durchgeführt. Die Minikulturen wurden unter Verwendung des fVIIa/TFEGR-fXa-Assays (Beispiel E) auf Anwesenheit von sekretiertem AcaNAPc2 getestet, was zur Selektion zweier Klone führte. Nach einer zweiten Screening-Runde wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens, diesmal jedoch auf Schüttelkolbenebene, eine isolierte Wirtszelle gewählt und als P. pastoris GTS115/7SP-NAPc2 bezeichnet.
Es wurde gezeigt, dass die Wirtszelle GTS115/7SP-NAPc2 einen Methanolnutzungsphänotyp vom Wildtyp (Mut⁺) hatte, wodurch gezeigt wird, dass die Integration der Expressionscassette in das Chromosom von GTS115 die Funktionalität des genomen AOX1-Gens nicht änderte.
Die nachfolgende Produktion des rekombinanten AcaNAPc2-Materials wurde in Schüttelkolbenkulturen durchgeführt, wie in D. W. Stroman et al., US-4,855,231 beschrieben ist. Das rekombinante Produkt wurde aus Zellüberstand von Pichia pastoris wie nachfolgend beschrieben gereinigt.
C. Reinigung von rekombinantem AcaNAPc2
1. Kationenaustauschchromatographie
Der Kulturüberstand (100 ml) wurde mit 16000 UpM (etwa 30.000 × g) 20 Minuten lang zentrifugiert, bevor der pH-Wert mit 1 N HCl auf 3 eingestellt wurde. Die Leitfähigkeit des Überstands wurde durch Zugabe von MilliQ-Wasser auf weniger als 10 mS/cm herabgesetzt. Der verdünnte Überstand wurde geklärt, indem er durch einen 0,22 μm Celluloseacetatfilter (Corning Inc., NY, USA) geleitet wurde.
Das Gesamtvolumen (ungefähr 500 ml) des Überstands wurde auf eine Poros20 HS (Perseptive Biosystems, MA, USA) 1 × 2 cm Säule geladen, die zuvor mit Kationenpuffer (0,05 M Natriumcitrat, pH 3) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 ml/Minute äquilibriert wurde. Die Säule und der verdünnte Fermentationsüberstand waren während dieser Reinigungsstufe auf Raumtemperatur. Die Säule wurde anschließend mit 50 Säulenvolumina Kationenuffer und 10 Säulenvolumina Kationenpuffer, der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen. Material, das in einem Prothrombinaseassay inhibierende Aktivität hatte, wurde mit einer Durchflussrate von 2 ml/Minute mit Kationenpuffer, der 1 M NaCl enthielt, eluiert.
2. Molekularsiebchromatographie unter Verwendung von Superdex30
Der 1 M NaCl Eluierungspool, der das EGR-fXa-fVIIa/TF inhibierende Material (3 ml, siehe Beispiel C) aus der Kationenaustauschsäule enthielt, wurde auf eine Superdex30 PG (Pharmacia, Schweden) 1,6 × 60 cm Säule geladen, die zuvor mit 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4, 0,15 M NaCl bei Umgebungstemperatur äquilibriert wurde. Die Chromatographie wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 2 ml/Minute durchgeführt. Die Prothrombinase inhibierende Aktivität (Beispiel C) eluierte 56 bis 64 ml in den Durchlauf und wurde gepoolt.
3. Reverse-Phase-Chromatographie
1 ml der gepoolten Fraktionen aus der Gelfiltrationschromatographie wurden auf eine 0,46 × 25 cm C18-Säule (218TP54 Vydac; Hesperia, CA, USA) geladen, die mit einem linearen Gradienten von 10 bis 30 % Acetonitril in 0,1 % (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure mit einer Geschwindigkeit von 0,5 % Veränderung an Acetonitril/Minute entwickelt wurde. Der Hauptpeak, der mit etwa 20 bis 25 % Acetonitril eluierte, wurde manuell aufgefangen und zeigte Prothrombinase inhibierende Aktivität.
4. Molekulargewichtsbestimmung
Die geschätzte Masse des wie in Abschnitt (1) bis (3) dieses Beispiels beschriebenen Hauptbestandteils wurde mit Elek trospray-Ionisationsmassenspektroskopie bestimmt. Die geschätzte Masse des rekombinanten AcaMAPc2 betrug 9640 Dalton, in vollständiger Übereinstimmung mit dem berechneten Molekulargewicht dieses Moleküls, das von der cDNA-Sequenz abgeleitet ist.
BEISPIEL 16
Expression von AcaNAP42 in P. pastoris
Der pGEM-9Zf(–) Vektor (Promega), der die AcaNAP42-cDNA (Beispiel 12) enthielt, wurde verwendet, um den Bereich, der das reife AcaNAP42-Protein kodiert, durch PCR-Amplifizierung zu isolieren (unter Verwendung von Taq Polymerase von Perkin Elmer, Branchburg, New Jersey, USA; 25 Temperaturzyklen: 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 1 Minuten bei 72°C). Es wurden die folgenden Oligonukleotid-Primer verwendet:
Oligo3: ^5'GAG ACT TTT AAA TCA CTG TGG GAT CAG AAG^3' [SEQ. ID. Nr. 124]
Oligo2: ^5'TTC AGG ACT AGT TCA TGG TGC GAA AGT AAT AAA^3' [SEQ. ID. Nr. 125]
Der Oligo3-Primer, der auf die N-terminale Sequenz zielt, enthielt eine Extension ohne Annealing, zu der die DraI-Restriktionsstelle (unterstrichen) gehörte. Der Oligo2-Primer, der auf die C-terminale Sequenz zielte, enthielt die SpeI-Restriktionsstelle.
Das NAP-Amplifizierungsprodukt mit der erwarteten Größe von ungefähr 250 bp wurde mit DraI und SpeI-Enzymen verdaut, durch Extraktion mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, Volumen/Volumen) gereinigt und in Ethylalkohol ausgefällt. Das aufnehmende Vektorfragment aus pYAM7SP8 (Beispiel 3) wurde mit StuI-SpeI-Restriktion hergestellt durch Extraktion mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, Vol./Vol.) gereinigt und in Ethylalkohol ausgefällt. Der E. coli Stamm XL1-Blue [W. O. Bullock, J. M. Fernande und J. M. Short, Biotechniques 5: 376–379 (1987)] wurde mit der Ligierungsmischung transformiert, die die obigen DNA-Fragmente enthielt, und ampicillinresistente Klone wurden selektiviert.
Basierend auf Restriktionsanalyse wurde ein Plasmidklon zur weiteren Charakterisierung erhalten, der ein Insert mit der erwarteten Größe enthielt und als pYAM75P8-NAP42 bezeichnet wurde. Sequenzbestimmung des Klons bestätigte das richtige Insertieren des reifen Kodierbereichs in Fusion mit dem PHO1/α-Faktor Präpro-Leader-Signal, wie durch das Konstruktionsschema vorhergesagt wurde, sowie die Abwesenheit von unerwünschten Mutationen in dem Kodierbereich.
Etwa 10 μg pYAM 7SP-NAP 42 Plasmid wurde in Pichia Stamm GTS115 (his4) elektroporiert, beschrieben in Beispiel 3. Das Plasmid wurde zuvor durch Verdauung mit NotI verdaut, wodurch das Integrationsereignis in den AOX1-Chromosomenlocus zielte.
Die His+ Transformanten wurden wie in Beispiel 3 beschrieben selektiert. Einzelkolonien (n = 90) aus der Elektroporation wurden in Mulden einer 96-Mulden-Platte, die 100 Mikroliter Glycerin-Minimalmedium enthielt, 24 Stunden auf einer Plattenschüttelmaschine bei Raumtemperatur gezüchtet. Ein Liter des Glycerin-Minimalmediums enthielt 13,4 g Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren (DIFCO); 400 μg Biotin; 10 ml Glycerin und 10 mM Kaliumphosphat (pH 6,0).
Die Zellen wurden pelletiert und in frischem Methanol-Minimalmedium (die gleiche Zusammensetzung wie oben, außer dass die 10 ml Glycerin durch 5 ml Methanol ersetzt wurden) resuspendiert, um den AOX1-Promoter zu induzieren. Nach einer zusätzlichen Inkubationsperiode von 24 Stunden mit Bewegung bei Raumtemperatur wurden 10 Mikroliter Kulturüberstände durch den Prothrombinzeitassay (Beispiel B) getestet. Die Anwesenheit von sekretiertem AcaNAP42 wurde durch die Verlängerung der Koagulationszeit von Humanplasma detektiert.
BEISPIEL 17
Expression von AcaNAPc2/Prolin in P. pastoris Zur Erhöhung der Stabilität und des Expressionsniveaus von AcaNAPc2 wurde eine mutierte cDNA konstruiert, die einen zusätzlichen Prolinrest am C-Terminus des Proteins (AcaNAPc2/Prolin oder "AcaNAPc2P") kodierte. Der Expressionsvektor, pYAM7SP-NAPc2/Prolin, wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 16 beschrieben hergestellt. Der Oligo-8-Primer ist der N-terminale Primer mit DraI-Restriktionsstelle, und der Oligo-9-Primer ist der C-terminale Primer, der die XbaI-Stelle und das Aminosäurecodon, TGG, enthält, um einen Prolinrest an dem C-Terminal der natürlichen Form von AcaNAPc2 zu addieren.
Oligo 8: ^5'GCG TTT AAA GCA ACG ATG CAG TGT GGT G^3'[SEQ. ID. Nr. 126]
Oligo 9: ^5'C GCT CTA GAA GCT TCA TGG GTT TCG AGT TCC GGG ATA TAT AAA GTC^3'[SEQ. ID. Nr. 127]
Nach der Verdauung des Amplifizierungsprodukts (ungefähr (270 bp) mit DraI und XbaI wurde das Amplifizierungsprodukt gereinigt und mit dem Vektorfragment aus pXAM7SP8 ligiert, das durch StuI-SpeI-Restriktion hergestellt worden war. Ein Plasmidkern, der das AcaNAPc2/Prolin-Insert enthielt, wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt und mit pXAM7SP8-NAPc2/Prolin bezeichnet.
Der Vektor pYAM7SP8-NAPc2/Prolin wurde zum Transformieren des Stamms GTS115 (his) wie in Beispiel 16 beschrieben verwendet. Transformanten wurden wie in Beispiel 16 selektiert und gezüchtet. Die Anwesenheit von sekretiertem AcaNAPc2/Prolin in dem Wachstumsmedium wurde durch die Verlängerung der Koagulationszeit von Humanplasma (siehe Beispiel B) detektiert.
BEISPIEL 18
Alternative Verfahren zur Reinigung von AcaNAP5, AcaNAPc2 und AcaNAPc2P
(A) AcaNAP5
Ein alternatives Verfahren zur Reinigung von AcaNAP5 aus Fermentierungsmedium ist wie folgt. Zellen wurden aus einer Fermentierung eines Pichia pastoris Stamms, der AcaNAP5 exprimierte, entfernt, und das Medium wurde gefroren. Das Reinigungsprotokoll wurde eingeleitet, indem gefrorenes Medium über Nacht bei 4°C aufgetaut wurde, es danach mit ungefähr 4 Teilen MilliQ-Wasser verdünnt wurde, um die Leitfähigkeit unter 7 mS abzusenken. Der pH-Wert wurde auf 3,5 eingestellt, und das Me dium wurde unter Verwendung eines 0,22 μm Celluloseacetatfilters filtriert (Corning Inc., Corning, NY, USA).
Die Aktivität des NAP enthaltenden Materials wurde in dem Prothrombinzeit-Gerinnungsassays zu Beginn des Reinigungsverfahrens und in jeder Stufe in dem Verfahren unter Verwendung des Protokolls in Beispiel B bestimmt.
Das filtrierte Medium wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 60 ml/Minute bei Umgebungstemperatur auf eine Pharmacia SP-Fast Flow Säule gegeben, und die Säule wurde mit 10 Säulenvolumina 50 mM Citrat/Phosphat, pH 3,5, gewaschen. Stufenweise Eluierung wurde mit 100 mM NaCl, 250 mM NaCl und danach 1000 mM NaCl, alle in 50 mM Citrat/Phosphat, pH 3,5, durchgeführt. Die PT-Aktivität wurde in dem 250 mM NaCl-Eluat detektiert. Das Gesamteluat wurde dialysiert, bis die Leitfähigkeit unter 8 mS lag.
Der pH-Wert des Materials wurde mit Essigsäure auf 4,5 eingestellt, und es wurde danach bei Umgebungstemperatur auf eine Sulfoethylaspartamidsäule gegeben. Zum Waschen der Säule wurden ungefähr 10 Säulenvolumina 50 mM Ammoniumacetat, pH 4,5/40 % Acetonitril verwendet. Die Säule wurde mit 50 mM Ammoniumacetat, pH 4,5/40 % Acetonitril/200 mM NaCl eluiert, und das Eluat wurde wie zuvor dialysiert oder diafiltriert.
Das Eluat wurde auf 0,1 % TFA eingestellt, bei Umgebungstemperatur auf eine Reverse-Phase-Säule Vydac C18 Protein/Peptid gegeben und mit 0,1 % TFA/19 % Acetonitril, gefolgt von 0,1 % TFA/25 % Acetonitril mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 7 ml/Minute eluiert. NAP wurde in der 0,1 % TFA/25 Acetonitrillösung detektiert und aus dieser gewonnen.
(B) AcaNAPc2 und AcaNAPc2P
AcaNAPc2 oder AcaNAPc2P können wie oben beschrieben mit den folgenden Protokollmodifikationen gereinigt werden. Nach dem Tauen und Verdünnen des Mediums, um eine Leitfähigkeit unter 8 mS zu erreichen, wurde der pH-Wert des AcaNAPc2 enthaltenden Mediums mit NaOH auf pH 5,0 eingestellt. Das filtrierte Medium wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 60 ml/Minute bei Umgebungstemperatur auf eine Pharmacia Q-Fast Flow Säule gegeben, und die Säule wurde mit 10 Säulenvolumina 50 mM Essigsäure, pH 5,0, gewaschen. Stufenweise Eluierung wurde mit 100 mM NaCl, 250 mM NaCl und danach 1000 mM NaCl, alle in 50 mM Essigsäure, pH 5,0, durchgeführt. Die PT-Aktivität wurde in dem 250 mM NaCl-Eluat detektiert. Das gesamte Eluat wurde dialysiert, bis die Leitfähigkeit unter 8 mS lag, und das oben beschriebene Protokoll wurde unter Verwendung von Sulfoethylaspartamid und RP-HPLC-Chromatographie nachgearbeitet.
Beispiel A
Faktor Xa amidolytischer Assay
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen NAPs, als Inhibitoren der katalytischen Aktivität von Faktor Xa zu wirken, wurde bewertet, indem die NAP-induzierte Inhibierung der durch das Humanenzym katalysierten amidolytischen Aktivität bestimmt wurde, wiedergegeben durch Ki*-Werte.
Der für alle Assays verwendete Puffer war HBSA (10 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 % Rinderserumalbumin). Alle Reagentien waren von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), wenn nicht anders angegeben.
Der Assay wurde durchgeführt, indem in geeigneten Mulden einer Corning Mikrotiterplatte 50 μl HBSA, 50 μl der Test-NAP-Verbindung, verdünnt (0,025 bis 25 nM) in HBSA (oder HBSA allein für die Messung der nicht inhibierte Geschwindigkeit) und 50 μl des Faktor Xa Enzyms, verdünnt in HBSA (hergestellt aus gereinigtem Humanfaktor X, erhalten von Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN, USA), gemäß dem von P. E. Bock et al., Archives of Biochem. Biophys. 273: 375 (1989) beschriebenen Verfahren) kombiniert wurden. Das Enzym wurde vor dem Assay, in dem die Endkonzentration 0,5 nM betrug, in HBSA verdünnt. Nach 30 Minuten Inkubieren bei Umgebungstemperatur wurden 50 μl des Substrats 52765 (N-alpha-Benzyloxycarbonyl-Dargininyl-L-glycyl-L-arginine-p-nitroaniliddihydrochlorid, erhalte von Kabi Diagnostics (oder Kabi Pharmacia Hepar Inc., Franklin, OH, USA), in entionisiertem Wasser zubereitet, anschließend vor dem Assay in HBSA verdünnt) in die Mulden gege ben, was ein am Ende vorhandenes Gesamtvolumen von 200 μl und eine Endkonzentration von 250 Mikromolar (etwa 5 Mal Km) ergab. Die Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse des chromogenen Substrats wurde durch die Veränderung der Absorption bei 405 nm unter Verwendung eines Thermo Max^® kinetischen Mikroplattenablesegeräts (Molecular Devices, Palo Alto, CA, USA) über einen Zeitraum von 5 Minuten gemessen, in dem weniger als 5 des zugefügten Substrats genutzt wurden.
Die Verhältnisse von inhibierten Geschwindigkeiten im stationären Zustand vor dem Gleichgewicht, die NAP enthielten (Vi), zu der nicht inhibierten Geschwindigkeit von freiem fXa allein (V₀) wurden gegen die entsprechenden NAP-Konzentrationen aufgetragen. Diese Daten wurden dann direkt an eine Gleichung für eng bindende Inhibitoren angepasst [J. F. Morrison und C. T. Walsh, Adv. Enzymol. 61:201–300 (1988)], aus der die scheinbare inhibierende Gleichgewichtsdissoziationskonstante K_i* berechnet wurde.
Die folgende Tabelle 1 zeigt die Ki*-Werte für die Testverbindungen AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4], AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6] und AcaNAPc2 [SEQ, ID. Nr. 59], hergestellt wie in den Beispielen 3, 4 beziehungsweise 15 beschrieben. Die Daten zeigen die Nützlichkeit von AcaNAP5 und AcaNAP6 als potente in vitro-Inhibitoren von humanem FXa. Im Unterschied dazu inhibierte AcaNAPc2 nicht effektiv die FXa-amidolytische Aktivität, wodurch gezeigt wird, dass es die katalytische Aktivität von freiem fXa nicht beeinflusste. TABELLE 1

^aNI = keine Inhibierung, bis zu 1 μM wurde ein Maximum von 15 % Inhibierung beobachtet.

Beispiel B
Prothrombinzeit- (PT) und aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT)-Assays
Die ex vivo-Antikoagulanswirkungen der erfindungsgemäßen NAPs in Humanplasma wurden bewertet, indem die Verlängerung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) und der Prothrombinzeit (PT) über einen breiten Konzentrationsbereich von jedem Inhibitor gemessen wurden.
Frisches gefrorenes, gepooltes, normales, mit Citrat versehenes Humanplasma wurde von George King Biomedical, Overland Park, KS, USA, erhalten. Die jeweiligen Messungen von aPTT und PT erfolgten unter Verwendung des Coag-A-Mate RA4 automatischen Koagulometers (General Diagnostics, Organon Technica, Oklahoma City, OK, USA) unter Verwendung des automatisierten aPTT Platelin^® L Reagenzes (Organon Technica, Durham, NC, USA) und Simplastin^® Excel (Organon Technica, Durham, NC, USA).
Die Assays wurden durchgeführt, indem eine Reihe von Verdünnungen von jedem getesteten NAP in rasch getautem Plasma hergestellt wurden, gefolgt von der Zugabe von 200 μl oder 100 μl der oben genannten Reagentien zu den Mulden des Assay-Karussels für die aPTT- beziehungsweise PT-Messungen. Alternativ wurden die NAPs in HBSA seriell verdünnt, und 10 μl von jeder Verdünnung wurden zu 100 μl normalem Humanplasma in den Mulden des Coag-A-Mate Assaykarussels gegeben, gefolgt von der Zugabe von Reagenz.
Die NAP-Konzentrationen wurden gegen Gerinnungszeit aufgetragen, und es wurde eine Verdopplungszeitkonzentration berechnet, d. h. eine spezifische Konzentration von NAP, die die Kontrollgerinnungszeit von entweder dem PT oder dem aPTT verdoppelte. Die Kontrollgerinnungszeiten (ohne NAP) in dem PT und APTT waren 12,1 Sekunden beziehungsweise 28,5 Sekunden.
Die folgende Tabelle 2 zeigt die ex vivo Antikoagulanswirkungen von AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4], AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6], AcaNAPc2 [SEQ. ID. Nr. 59] und AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 62] und Pro-AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 7], die durch jeweilige Konzentration wiedergegeben werden, die die Kontrollgerinnungszeit von normalem Humanplasma in den jeweiligen PT- und APTT-Ge rinnungsassays relative zu einem Kontrollassay, bei dem kein derartiges NAP vorhanden war, verdoppeln (Verdopplungskonzentration). Die Daten zeigen die Nützlichkeit dieser Verbindungen als potente Antikoagulantien der Gerinnung von Humanplasma. Die Daten zeigen auch die Äquivalenz von nativem NAP und rekombinantem NAP. TABELLE 2

^a Hergestellt in Pichia pastoris.
^b Natives Protein.
^c Hergestellt in Pichia pastoris (andere rekombinante Charge als (a)).
^d Hergestellt in COS-Zellen.

10A und 10B zeigen auch NAP-induzierte Verlängerung der PT (10A) und aPTT (10B) in dosisabhängiger Weise.
Beispiel C
Prothrombinaseinhibierungsassay
Die Fähigkeit des erfindungsgemäßen MAP, als Inhibitor der Aktivierung von Prothrombin durch Faktor Xa zu wirken, der zu einem physiologischen Prothrombinasekomplex assembliert worden war, wurde durch Bestimmung der jeweiligen Inhibierungskonstante, Ki*, bewertet.
Die Prothrombinaseaktivität wurde mit einem gekoppelten amidolytischen Assay gemessen, wobei ein vorgebildeter Komplex aus Human-FXa, Human-Faktor Va (FVa) und Phospholipidvesikeln zuerst Human-Prothombin zu Thrombin aktiviert. Die amidolytische Aktivität des erzeugten Thrombins wird simultan unter Verwendung eines chromogenen Substrats gemessen. Gereinigtes humanes FVa wurde von Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT, USA) erhalten. Gereinigtes Human-Prothrombin wurde von Celsus Laboratories, Inc. (Cincinnati, OK, USA) erworben. Das chromogene Substrat Pefachrome t-PA (CH₃SO₂-D-Hexahydrotyrosin-glycyl-L-arginin-p-nitroanilid) von Pentapharm Ltd. (Basel, Schweiz) wurde von Centerchem, Inc. (Tarrytown, NY, USA) gekauft. Das Substrat wurde vor Gebrauch in entionisiertem Wasser rekonstituiert. Phospholipidvesikel, die aus Phosphotidylcholin (67 %, Gew./Vol.), Phosphatidylglycerin (16 %, Gew./Vol.), Phosphatidylethanolamin (10 %, Gew./Vol.) und Phosphatidylserin (7 %, Gew./Vol.) bestanden, wurden in Gegenwart von Tensid hergestellt, wie von Ruf et al. [W. Ruf, D. J. Miles, A. Rehemtulla und T. S. Edgington, Methods in Enzymology 222: 209–224 (1993)] beschrieben wurde. Die Phospholipide wurden von Avanti Polar Lipids, (Alabaster, Alabama, USA) gekauft.
Der Prothrombinasekomplex wurde in einem Polypropylenteströhrchen gebildet, indem FVa, FXa und Phospholipidvesikel (PLV) in HBSA, das 3 mM CaCl₂ enthielt, 10 Minuten lang kombiniert wurden. In geeigneten Mulden einer Mikrotiterplatte wurden 50 μl des Komplexes mit 50 μl NAP, das in HBSA verdünnt war, oder HBSA allein (zur Messung von V₀ (nicht inhibierter Geschwindigkeit)) kombiniert. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die dreifachen Reaktionen initiiert, indem eine Substratlösung zugegeben wurde, die Human-Prothrombin und das chromogene Substrat für Thrombin, Pefachrom tPA, enthielt. Die Endkonzentration der Reaktanten in einem Gesamtvolumen von 150 ml HBSA war NAP (0,025 bis 25 nM), FXa (250 fM), PLV (5 μM), Prothrombin (250 nM), Pefachrom tPA (250 μM, 5 × Km) und CaCl₂ (3 mM).
Die Prothrombinaseaktivität von fXa wurde genau wie in Beispiel A beschrieben als Anstieg der Absorption bei 405 nm über 10 Minuten (Geschwindigkeit) unter Bedingungen des stationären Zustands gemessen. Der Absorptionsanstieg war im Zeitverlauf sigmoidal, was die gekoppelten Reaktionen der Aktivierung von Prothrombin durch den FXa-enthaltenden Prothrombinasekomplex und die nachfolgende Hydrolyse von Pefachrom tPA durch das erzeugte Thrombin widerspiegelt. Die Daten für jede Mulde eines Dreierversuchs wurden kombiniert und durch reiterative lineare Regressionsanalyse der kleinsten Quadrate als Funktion von Absorption gegen Zeit² wie beschrieben [S. D. Carson, Comput. Prog. Biomed. 19: 151–157 {1985)] angepasst, um die Anfangsgeschwindigkeit (V_i) der Prothrombinaktivierung zu bestimmen. Die Verhältnisse von inhibierten Anfangsgeschwindigkeiten im stationären Zustand, die NAP enthielten (V_i), zu der nicht inhibierten Geschwindigkeit von Prothrombinase-fXa allein (V₀) wurden gegen die entsprechenden NAP-Konzentrationen aufgetragen. Diese Daten wurden direkt an die Gleichung für eng bindende Inhibitoren wie in dem obigen Beispiel A angepasst, und die scheinbare inhibierende Gleichgewichtsdissoziationskonstante K_i* wurde berechnet.
Die folgende Tabelle 3 zeigt die Dissoziationsinhibitorkonstante (K_i*) von rekombinantem AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4], AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6] und AcaNAPc2 [SEQ. ID. Nr. 59] (alle in Pichia pastoris wie beschrieben hergestellt) gegen die Aktivierung von Prothrombin durch Human-fXa, eingebaut in einen Prothrombinasekomplex. Diese Daten zeigen die Nützlichkeit dieser Verbindungen als Inhibitoren für Human-FXa, der in den Prothrombinasekomplex eingebaut ist.
TABELLE 3
Die in den Beispielen A, B und C wiedergegebenen Daten legen nahe, dass AcaNAP4 und AcaNAP6 mit FXa in ähnlicher Weise in Wechselwirkung treten können, die direkten restriktiven Zugang von sowohl dem Peptidyl- als auch dem makromolekularen Substrat (Prothrombin) zu dem katalytischen Zentrum des Enzyms beinhaltet. Im Unterschied dazu scheint AcaNAPc2 mit FXa in einer Weise in Wechselwirkung zu treten, die lediglich die makromolekularen Wechselwirkungen dieses Enzyms mit dem Substrat und/oder Cofaktor (Faktor Va) stört, während der katalytische Umsatz des Peptidylsubstrats nicht direkt inhibiert wird (siehe Tabelle 1).
Beispiel D
In vitro-Enzymassays für Aktivitäts-Spezifizitäts-Bestimmung
Die Fähigkeit des erfindungsgemäßen NAPs, als selektiver Inhibitor der FXa-katalytischen Aktivität oder TF/VIIa-Aktivität zu wirken, wurde bewertet, indem bestimmt wurde, ob das Test-NAP andere Enzyme in einem Assay in einer Konzentration inhibieren würde, die 100 Mal höher als die Konzentration der folgenden verwandten Serinproteasen war: Thrombin, Faktor Xa, Faktor XIa, Faktor XIIa, Kallikrein, aktiviertes Protein C, Plasmin, rekombinanter Gewebeplasminogenaktivator (rt-PA), Urokinase, Chymotrypsin und Trypsin. Diese Assays werden auch zur Bestimmung der Spezifizität von NAPs mit Serinprotease inhibierender Aktivität verwendet.
(1) ALLGEMEINES PROTOKOLL FÜR ENZYMINHIBIERUNGSASSAYS
Der für alle Assays verwendete Puffer war HBSA (Beispiel A). Alle Substrate wurden in entionisiertem Wasser rekonstituiert und anschließend vor dem Assay in HBSA verdünnt. Der amidolytische Assay zur Bestimmung der Spezifizität der Inhibierung der Serinproteasen wurde durchgeführt, indem in geeigneten Mulden einer Corning-Mikrotiterplatte 50 μl HBSA, 50 μl NAP mit einer spezifizierten Konzentration, verdünnt in HBSA, oder HBSA allein (nicht inhibierte Kontrollgeschwindigkeit, V₀) und 50 μl eines spezifizierten Enzyms (siehe nachfolgend spezifizierte Enzyme) kombiniert wurden. Nach 30 Minuten Inkuba tion bei Umgebungstemperatur wurden Dreierversuchsmulden 50 μl Substrat zugegeben. Die Endkonzentration der Reaktanten in einem Gesamtvolumen von 200 μl HBSA war NAP (75 nM), Enzym (750 pm) und chromogenes Substrat (wie nachfolgend angegeben). Die Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse des chromogenen Substrats wurde als Veränderung der Absorption bei 405 nm in einem Zeitraum von 5 Minuten gemessen, in dem weniger als 5 % des zugefügten Substrats hydrolysiert wurden. Die Geschwindigkeiten der Testproben, die NAP (V_i) enthielten, wurden dann als Prozentsatz der nicht inhibierten Kontrollgeschwindigkeit (V₀) durch die folgende Formel: V_i/V₀ × 100, für jedes der Enzyme ausgedrückt.
(2) Spezifische Enzymessays
(a) Thrombinassay
Die katalytische Thrombinaktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats Pefachrome t-PA (CH₃SO₂-D-Hexahydrotyrosin-glycyl-L-arginin-p-nitroanilin, erhalten von Pentapharm Ltd., Basel, Schweiz) bestimmt. Die Endkonzentration von Pefachrom t-PA betrug 250 μM (etwa die 5-fache Km). Gereinigtes Human-α-Thrombin wurde von Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN, USA) erhalten.
(b) Faktor Xa-Assay
Die katalytische Faktor Xa-Aktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2765 (N-Benzyloxycarbonyl-D-arginin-L-glycin-L-arginin-p-nitroanilin), erhalten von Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH, USA), bestimmt. Alle Substrate wurde vor Gebrauch in entionisiertem Wasser rekonstituiert. Die Endkonzentration von S-2765 betrug 250 μM. (etwa die 5-fache Km). Gereinigter Human-Faktor X wurde von Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN, USA) erhalten, und Faktor Xa (FXa) wurde aus Faktor X wie in [P. E. Bock, P. A. Craig, S. T. Olson und P. Singh, Arch. Biochem. Biophys. 273:375–388 (1989)] beschrieben aktiviert und hergestellt.
(c) Faktor XIa-Assay
Die katalytische Faktor FXIa-Aktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2366 (L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilin), erhalten von Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH, USA) bestimmt. Die Endkonzentration von S-2366 betrug 750 μM. Gereinigtes Human-FXIa wurde von Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN, USA) erhalten.
(d) Faktor XIIa-Assay
Die katalytische FXIIa-Aktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats Spectrozyme FXIIa (H-D-CHT-L-Glycyl-L-arginin-p-nitroanilin), erhalten von American Diagnostics, Greenwich, CT, USA) bestimmt. Die Endkonzentration von Spectrozyme FXIIa betrug 100 μM. Gereinigtes Human-FXIIa wurde von Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN, USA) erhalten.
(e) Kallikrein-Assay
Die katalytische Faktor Kallikrein-Aktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2302 (H-D-Prolyl-L-phenylalanyl-L-arginin-p-nitroanilin), erhalten von Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH, USA), bestimmt. Die Endkonzentration von S-2302 betrug 400 μM. Gereinigtes Human-Kallikrein wurde von Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN, USA) erhalten.
(f) Aktiviertes Protein C (aPC)
Die katalytische Aktivität des aktivierten Protein C wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats Spectrozyme PCa (H-D-Lysyl(-Cbo)-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilin), erhalten. von American Diagnostics, Greenwich, CT, USA) bestimmt. Die Endkonzentration betrug 400 μm (etwa die 4-fache Km). Gereinigtes humanes aPC wurde von Hematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT, USA) erhalten.
(g) Plasmin-Assay
Die katalytische Plasmin-Aktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2366 (L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L- arginin-p-nitroanilin), erhalten von Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH, USA)), bestimmt. Die Endkonzentration von S-2366 betrug 300 μm (etwa die 4-fache Km). Gereinigtes Human-Plasmin wurde von Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN, USA) erhalten.
(h) Rekombinanter Gewebeplasminogenaktivator
Die katalytische rt-PA-Aktivität wurde unter Verwendung des Substrats Pefachrome t-PA (CH₃SO₂-D-Hexahydrotyrosin-glycyl-L-arginin-p-nitroanilin, erhalten von Pentapharm Ltd., Basel, Schweiz) bestimmt. Die Endkonzentration betrug 500 μm (etwa die 3-fache Km). Humanes rt-PA (Activase^®) wurde von Genentech, Inc. (So, San Francisco, CA, USA) erhalten.
(i) Urokinase
Die katalytische Urokinase-Aktivität wurde unter Verwendung des Substrats S-2444 (L-Pyroglutamyl-L-glycyl-L-arginin-p-nitroanilin), erhalten von Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH, USA), bestimmt. Die Endkonzentration von S-2444 betrug 150 μm (etwa die 7-fache Km). Human-Urokinase (Abbokinase^®), gereinigt aus kultivierten menschlichen Nierenzellen, wurde von Abbott Laboratories (North Chicago, IL, USA) erhalten.
(j) Chymotrypsin
Die katalytische Chymotrypsinaktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2586 (Methoxysuccinyl-L-arginyl-L-prolyl-L-tyrosin-p-nitroanilin), erhalten von Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH, USA), bestimmt. Die Endkonzentration von S-2586 betrug 100 μm (etwa die 8-fache Km). Gereinigtes (3 × kristallisiert; CDI) Rinderpankreas-Chymotypsin wurde von Worthington Biochemical Corp. (Freehold, NJ, USA) erhalten.
(k) Trypsin
Die katalytische Trypsin-Aktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2222 (L-Benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl[methylester]-L-arginin-p-nitroanilin), erhalten von Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH, USA), bestimmt. Die Endkonzentration von S-2222 betrug 300 μm (etwa die 5-fache Km). Gereinigtes Humanpankreastrypsin wurde von Scripps Laboratories (San Diego, CA, USA) erhalten.
Tabelle 4 zeigt die Inhibierung der amidolytischen Aktivität von FXa und 10 weiteren Serinproteasen durch entweder rekombinantes AcaNAP-5 [SEQ. ID. Nr. 4] oder rekombinantes AcaNAP-6 [SEQ. ID. Nr. 6] (beide wie beschrieben in Pichia pastoris exprimiert), ausgedrückt als Prozent der Kontrollgeschwindigkeit. Diese NAPs zeigen einen hohen Spezifitätsgrad für die Inhibierung von FXa, verglichen mit den anderen verwandten Serinproteasen.
TABELLE 4
Tabelle 5 zeigt den inhibierenden Effekt von rekombinantem AcaNAPc2 [SEQ. ID. Nr. 59] und rekombinantem AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 62] (beide wie beschrieben in Pichia pastoris exprimiert) auf die amidolytische Aktivität von 11 ausgewählten Serinproteasen. Die Inhibierung wird als Prozent der Kontrollgeschwindigkeit ausgedrückt. Diese Daten zeigen, dass diese NAPs einen hohen Spezifitätsgrad für die Serinproteasen in Tabelle 5 besitzen.
TABELLE 5
Beispiel E
Assays zur Messung der Inhibierung des fVIIa/TF-Komplexes durch NAP
(1) fVIIa/TF fIX-Aktivierungsassay
Dieses Beispiel misst die Fähigkeit von erfindungsgemäßen NAPs, als Inhibitor des katalytischen Komplexes von fVIIa/TF zu wirken, das bei der Initiierung der Koagulierungsreaktion in dem ex vivo-Prothrombinzeitassay (Beispiel B) eine Hauptrolle spielt. Die Aktivierung des tritiierten Faktors IX durch den rFVIIa/rTF/PLV-Komplex wurde bewertet, indem die jeweilige intrinsische Inhibierungskonstante, Ki*, bestimmt wird Lyophilisierter gereinigter rekombinanter Humanfaktor VIIa wurde von BiosPacific, Inc. (Emeryville, CA, USA) erhalten und in HBS (10 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid) vor Gebrauch rekonstituiert. Gereinigter Human-Faktor X wurde von Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN, USA) erhalten, und Faktor Xa (freier FXa) wurde aus Faktor X wie in [P. E. Bock, P. A. Craig, S. T. Olson und P. Singh, Arch. Biochem. Biophys. 273:375–388 (1989)] beschrieben aktiviert und hergestellt. An der aktiven Stelle blockierter Humanfaktor Xa (EGR-FXa), der irreversibel mit L-Glutamyl-L-glycyl-L-arginyl chloromethylketon inaktiviert worden war, wurde von Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT, USA) erhalten. Rekombinanter Humangewebefaktor (rTF) wurde mit einem Baculovirus-Expressionssystem produziert und durch Affinitätschromatographie mit monoklonalem Antikörper bis zur Homogenität gereinigt (Corvas International, Inc., San Diego, CA, USA).
Das gereinigte rTF-Apoprotein wurde in Phospholipidvesikeln (rTF/PLV), die aus Phosphotidylcholin (75 %, Gew./Vol.) und Phosphatidylserin (25 %, Gew./Vol.) bestanden, in Gegenwart von Tensid eingebaut, wie von Ruf et al. [W. Ruf, D. J. Miles, A. Rehemtulla und T. S. Edgington, Methods in Enzymology 222: 209–224 (1993)] beschrieben wurde. Die Phospholipide wurden von Avanti Polar Lipids, (Alabaster, Alabama, USA) gekauft. Der für alle Assays verwendete Puffer war HBSA, HBS, das 0,1 % (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin enthielt. Alle Reagentien wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) erhalten, wenn nicht anders angegeben.
Die Aktivierung von humanem ³H-Faktor IX (FIX) durch den rFVIIa/rTF-Komplex wurde überwacht, indem die Freisetzung des radiomarkierten Aktivierungspeptids gemessen wurde. Gereinigtes Human-fIX wurde von Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT, USA) erhalten und durch reduktive Tritiierung wie beschrieben (Van Lenten & Ashwell, 1971, JBC 246, 1889–1894) radioaktiv markiert. Die resultierende tritiierte Zubereitung von FIX hatte eine spezifische Aktivität von 194 Gerinnungseinheiten/mg, gemessen in immunoverarmtem Plasma mit FIX-Mangel (Ortho), und behielt 97 % seiner Aktivität. Die radiospezifische Aktivität war 2,8 × 10⁸ dpm/mg. Die Km für die Aktivierung von ³H-FIX durch rFVIIa/rTF/PLV betrug 25 nM, was äquivalent zu der Km war, die für unbehandelten (unmarkierten) fIX erhalten wurde.
Der Assay für die Ki*-Bestimmungen wurde wie folgt durchgeführt: rFVIIa und rTF/PLV wurden in einem Polypropylenteströhrchen kombiniert und 10 Minuten lang einen Komplex in HBSA bilden gelassen, welches 5 mM CaCl₂ enthielt. Aliquote von rFVIIa/rTF/PLV-Komplex wurden in den entsprechenden Polypropy lenmikrozentrifugenröhrchen mit EGR-FXa oder freiem FXa, falls eingeschlossen, und jeder der NAP-Testverbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen nach Verdünnung in HBSA oder in HBSA allein (als V₀ (nicht inhibierte Geschwindigkeits)-Kontrolle) kombiniert. Nachdem bei Umgebungstemperatur 60 Minuten inkubiert worden war, wurden die Reaktionen durch Zugabe von ³H-FIX initiiert. Die Endkonzentration der Reaktanten in 420 μl HBSA betrug: rFVIIa [50 pM], rTF [2,7 nM], PLV [6,4 mikromolar], entweder EGR-FXa oder freier FXa [300 pM], rekombinantes NAP [5-1.500 pM], ³H-FIX [200 nM] und CaCl₂ [5 mM]. Außerdem wurde eine Hintergrund-Kontrollreaktion durchgeführt, die alle der obigen Reaktanten außer rFVIIa enthielt.
Zu bestimmten Zeitpunkten (8, 16, 24, 32 und 40 Minuten) wurden 80 μl der Reaktionsmischung in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben, das ein gleiches Volumen an 50 mM EDTA in HBS mit 0,5 BSA enthielt, um die Reaktion zu stoppen, hiernach folgte die Zugabe von 160 μl 6 % (Gew./Vol.) Trichloressigsäure. Das Protein wurde ausgefällt und durch Zentrifugieren mit 16.000 × g 6 Minuten lang bei 4°C von dem Überstand getrennt. Die in dem resultierenden Überstand enthaltene Radioaktivität wurde gemessen, indem Aliquote in Dreierreihen entnommen wurden, die in einen Scintiverse BD (Fisher Scientific, Fairlawn, NJ, USA) gegeben wurden und durch Flüssigszintillationszählung quantifiziert wurden. Die Kontrollgeschwindigkeit der Aktivierung wurde durch lineare Regressionsanalyse der löslichen Zählwerte bestimmt, die im Zeitverlauf unter Bedingungen des stationären Zustands freigesetzt wurden, wobei weniger als 5 % des tritiierten FIX verbraucht wurde. Die Hintergrundkontrolle (< 1,0 der Kontrollgeschwindigkeit) wurde von allen Proben subtrahiert. Die Verhältnisse von inhibierten Geschwindigkeiten im stationären Zustand (V_i) in Gegenwart eines NAP zu der nicht inhibierten Kontrollgeschwindigkeit von rFVIIa/TF allein (V₀) wurde gegen die entsprechenden Konzentrationen von NAP aufgetragen. Diese Daten wurden dann direkt an eine Gleichung für eng bindende Inhibitoren angepasst [J. F. Morrison und C. T. Walsh, Adv. Enzymol. 61:201–300 (1988)], aus der die scheinba re inhibierende Gleichgewichtsdissoziationskonstante K_i* berechnet wurde.
Die Daten für rekombinantes AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAPc2 und AceNAP4 (hergestellt wie beschrieben) sind in Tabelle 6 nach dem folgenden Abschnitt B wiedergegeben.
(2) Faktor VIIa/Gewebefaktor-amidolytischer Assay
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen NAPs, als Inhibitor der amidolytischen Aktivität des fVIIa/TF-Komplexes zu wirken, wurde durch Bestimmen der jeweiligen Inhibierungskonstante, Ki*, in Gegenwart und Abwesenheit von an der aktiven Stelle blockiertem Humanfaktor Xa (EGR-fXa) bewertet.
Die amidolytische rFVIIa/rTF-Aktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S-2288 (H-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilin), erhalten von Kabi Pharmacia Hepar, Inc. (Franklin, OH, USA), bestimmt. Das Substrat wurde vor Gebrauch in entionisiertem Wasser rekonstituiert. rFVIIa und rTF/PLV wurden in einem Polypropylenteströhrchen kombiniert und 10 Minuten lang einen Komplex in HBSA bilden gelassen, welches 3 mM CaCl₂ enthielt. Der Assay für Ki*-Bestimmungen wurde durchgeführt, indem in geeigneten Mulden einer Corning-Mikrotiterplatte 50 μl des rFVIIa/rTF/PLV-Komplexes, 50 μl EGR-FXa und 50 μl von einer der NAP-Testverbindungen mit unterschiedlichen Konzentrationen nach Verdünnen in HBSA oder HBSA allein (zur Messung von V₀ (der nicht inhibierten Geschwindigkeit)) kombiniert wurden. Nachdem 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert worden war, wurden die Reaktionen in Dreierreihen durchgeführt, indem 50 μl S-2288 zugegeben wurde. Die Endkonzentration der Reaktanten in einem Gesamtvolumen von 200 μl HBSA war: rekombinantes NAP (0,025-25 nM), rFVIIa (750 pM), rTF (3,0 nM), PLV (6,4 mikromolar), EGR-FXa (2,5 nM) und S-2288 (3,0 mM, 3X Km).
Die amidolytische Aktivität von rFVIIa/rTF/PLV wurde als linearer Anstieg der Absorption bei 405 nm im Verlauf von 10 Minuten (Geschwindigkeit) mit einem Thermo Max^® Kinetischen Mikroplattenablesegerät (Molecular Devices, Palo Alto, CA, USA) unter Bedingungen im stationären Zustand gemessen, wobei weniger als 5 % des Substrats verbraucht wurden. Die Verhältnisse von inhibierten Geschwindigkeiten im stationären Zustand vor dem Gleichgewicht in Gegenwart von NAP (V_i) zu der nicht inhibierten Geschwindigkeit von freiem fXa allein (V₀) wurden gegen die entsprechenden NAP-Konzentrationen aufgetragen. Diese Daten wurden direkt an die gleiche Gleichung für eng bindende Inhibitoren wie in dem obigen Beispiel E.1. angepasst, aus der die scheinbare inhibierende Gleichgewichtsdissoziationskonstante Ki* berechnet wurde.
Die folgende Tabelle 6 zeigt die Ki*-Werte von rekombinantem AcaNAPc2 [SEQ. ID. Nr. 59], AceNAP4 [SEQ. ID. Nr. 62], AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4] und AcaNAP6 [SEQ. ID. Nr. 6] (hergestellt wie beschrieben in Pichia pastoris) in inhibierenden Assays der rFVIIa/rTF-Aktivität. Die Daten zeigen die Nützlichkeit von AcaNAPc2 und AceNAP4 als potente Inhibitoren des humanen rFVIIa/rTF/PLV-Komplexes in Abwesenheit und Anwesenheit von entweder freiem FXa oder an der aktiven Stelle blockierte FXa. Die in vitro-Aktivität von AcaNAPc2P (siehe Beispiel 1) war im Wesentlichen die gleiche wie AcaNAPc2. TABELLE 6

NI = keine Inhibierung, ND = nicht bestimmt.

Beispiel F
In vivo-Modelle der NAP-Aktivität
(1) Bewertung der antithrombotischen Aktivität von NAP im Rattenmodell von FeCl₃-induzierter thrombozytenabhängiger arterieller Thrombose
Die antithrombotischen (Prävention der Thrombusbildung) Eigenschaften von NAP wurden mit dem etablierten experimentellen Rattenmodell der akuten vaskulären Thrombose bewertet.
Das Ratten-FeCl₃-Modell ist ein gut charakterisiertes Modell der thrombozytenabhängigen arteriellen Thrombose, das zur Erforschung potentieller antithrombotischer Verbindungen verwendet worden ist. K. D. Kurz, B. W. Main und G. E. Sandusky, Thromb. Res., 60: 269–280 (1990). In diesem Modell wird ein thrombozytenreicher okklusiver Thrombus in einem Segment der Carotisarterie der Ratte gebildet, die lokal mit einer frischen Lösung von FeCl₃ behandelt worden ist, die auf einem Stück Filterpapier absorbiert worden war. Es wird angenommen, dass das FeCl₃ in das behandelte Arteriensegment diffundiert und zu Entendothelisierung der betreffenden Gefäßoberfläche führt. Dies führt dazu, dass Blut Subendothelialstrukturen ausgesetzt wird, was wiederum zu Anhaften von Thrombozyten, Thrombinbildung und Thrombozytenaggregation führt. Das Nettoergebnis ist die Bildung eines okklusiven Thrombus. Der Effekt einer Testverbindung auf das Eintreten der Bildung eines okklusiven Thrombus nach Anwendung von FeCl₃ wird durch Ultraschalldurchflussmetrie überwacht und wird als primärer Endpunkt verwendet. Die Verwendung von Durchflussmetrie zur Messung des Blutdurchflusses der Carotisarterie ist eine Modifikation des ursprünglichen Verfahrens, bei dem thermische Detektierung der Gerinnselbildung verwendet wurde. K. D. Kurz, B. W. Main und G. E. Sandusky, Thromb. Res., 60: 269–280 (1990).
(a) Intravenöse Verabreichung
Männliche Harlan Sprague Dawley Ratten (420–450 g) wurden mindestens 72 Stunden vor dem Einsatz aklimatisiert und 12 Stunden vor dem chirurgischen Eingriff bei freiem Zugang zu Wasser fasten gelassen. Die Tiere wurden vorbereitet, mit Nembutal anästhetisiert und anschließend Katheder zur Blutdrucküberwachung, Arzneimittel- und Anästhesieabgabe eingeführt. Die linke Carotisarterie wurde isoliert, indem eine Zervixinzision in der Mittellinie vorgenommen wurde, gefolgt von stumpfer Dissektion und Spreiztechniken, um ein 2 cm Segment des Gefäßes von der Carotisscheide abzutrennen. Unter den proximalen und distalen Enden des isolierten Gefäßes wurde eine Seidennaht eingefügt, um Freiraum für das Platzieren einer Ultraschalldurchflusssonde (Transonic) um das proximale Ende des Gefäßes zu schaffen. Die Sonde wurde dann mit einem stationären Arm gesichert.
Nach dem chirurgischen Eingriff wurden die Tiere statistisch der Kontrollgruppe (Salzlösung) oder der Behandlungsgruppe (rekombinantes AcaNAP5) zugewiesen. Die Testverbindung (hergestellt in P. pastoris gemäß Beispiel 3) wurde nach Platzierung der Durchflusssonde und 5 Minuten vor dem thrombogenen Stimulus als einzelner intravenöser Bolus in den in Tabelle 7 beschriebenen Dosen verabreicht. Bei t = 0 wurde ein Filterpapierstück mit 3 mm Durchmesser (Whatman Nr. 3), getränkt mit 10 μl einer 35 % Lösung FeCl₃ (hergestellt in Wasser), auf das Segment einer isolierten Carotisarterie distal zu der Durchflusssonde aufgebracht. Blutdruck, Blutfluss, Herzfrequenz und Atmung wurden 60 Minuten überwacht. Das Auftreten von Okklusion (definiert als Erreichen eines Blutflusses von Null) wurde als primärer Endpunkt aufgezeichnet.
Die Wirksamkeit von AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4] als antithrombotisches Mittel zur Verhinderung der Thrombusbildung in diesem in vivo-Modell wurde durch die dosisabhängige Reduktion der Häufigkeit der thrombotischen Okklusion gezeigt, wie in der folgenden Tabelle 7 gezeigt ist. TABELLE 7

*–p 0,05 von Salzkontrolle gemäß Fishers Test.

Die effektive Dosis, die 50 % der thrombotischen Okklusionen in diesem Modell verhindert (ED₅₀), kann aus den obigen Daten bestimmt werden, indem die Häufigkeit von Okklusionen gegen verabreichte Dosis bestimmt wird. Dies ermöglicht einen direkten Vergleich der antithrombotischen Wirksamkeit von AcaNAP5 mit anderen antithrombotischen Mitteln, die in diesem Modell ebenfalls wie oben beschrieben untersucht worden sind. Die folgende Tabelle 8 zeigt die ED₅₀-Werte von mehreren bekannten Antikoagulantien in diesem Modell, verglichen mit AcaNAP5. TABELLE 8

^a ED₅₀ ist definiert als die Dosis, die die Häufigkeit einer vollständigen thrombotischen Okklusion bei 50 % der getesteten Tiere verhindert
^b -rekombinantes Zeckenantikoagulanspeptid, Vlasuk et al. Thromb. Haemostas. 70: 212–216 (1993)

(b) Subkutane Verabreichung
Die antithrombotische Wirkung von AcaNAP5, verglichen mit Heparin mit niedrigem Molekulargewicht (Enoxaparin; Lovenox, Rhone-Poulenc Rorer), nach subkutaner Verabreichung wurde mit dem FeCl₃-Modell bei Ratten untersucht. Das Modell wurde in identischer Weise wie oben beschrieben durchgeführt, außer dass die Verbindung subkutan verabreicht wurde und die Wirksamkeit nach zwei unterschiedlichen Zeiten bestimmt wurde: 30 und 150 Minuten nach der Verabreichung. Um dies zu bewirken, wurden beide Carotisarterien nacheinander verwendet. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4] in vivo nach subkutaner Verabreichung ein effektives antithrombotisches Mittel ist. Die Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 9 gezeigt. TABELLE 9

^a ED₅₀ ist als die Dosis definiert, die bei 50 % der getesteten Tiere das Eintreten der vollständigen thrombotischen Okklusion verhindert.

(2) Tiefe Wundblutungsmessung
Ein Modell für tiefes Wundbluten wurde verwendet, um die Wirkung von NAP auf Bluten zu messen und die Wirkung mit derjenigen von Heparin mit niedrigem Molekulargewicht zu vergleichen.
Männliche Ratten wurden anästhetisiert und in identischer Weise wie jene in dem FeCl₃-Modell instrumentell behandelt. Es wurde jedoch kein FeCl₃ auf die Carotisarterie aufgebracht. Die tiefe chirurgische Wunde im Nacken, die die Carotisarterie freilegt, wurde zur Quantifizierung des Blutverlustes im Zeitverlauf verwendet. Der Blutverlust wurde über einen Zeitraum von 3,5 Stunden nach subkutaner Verabreichung von AcaNAP5 oder LMWH (Heparin mit niedrigem Molekulargewicht) verwendet. Die Wunde wurde mit chirurgischen Schwämmen gepackt, die alle 30 Minuten entfernt wurden. Die Schwämme wurden anschließend in Drabkins Reagenz (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) getaucht, das die roten Blutkörperchen lysiert und mit Hämoglobin in kolorimetischer Weise reagiert. Die kolorimetrischen Proben wurden danach durch Messen der Absorption bei 550 nM quantifiziert, die eine Bestimmung der Blutmenge in dem Schwamm liefert.
Die Dosis-Reaktions-Charakteristika für beide Testverbindungen sind in 15 zusammen mit Wirksamkeitsdaten für beide Verbindungen gezeigt. AcaNAP5 [SEQ. ID. Nr. 4] war wesentlich potenter als Heparin mit niedrigem Molekulargewicht zur Verhinderung der okklusiven arteriellen Thrombusbildung in diesem Modell. Außerdem bluteten mit NAP behandelte Tiere weniger als jene, die mit Heparin mit niedrigem Molekulargewicht behandelt worden waren.
Die in Tabellen 7 und 9 sowie 15 wiedergegebenen Daten zeigen eindeutig die Wirksamkeit von NAP zur Verhinderung der okklusive Thrombusbildung in diesem experimentellen Modell. Die Relevanz dieser Daten zur Verhinderung der menschlichen Thrombose wird im Vergleich mit den anderen in Tabelle 8 aufgeführten Antikoagulansmitteln deutlich. Diese Mittel wurden in den gleichen experimentellen Modellen wie hier beschrieben in identischer Weise wie für NAPs und in diesem ex perimentellen Modell beschrieben untersucht, und zeigten antithrombotische Wirksamkeit zur klinischen Verhinderung der Thrombusbildung, wie in den folgenden Literaturzitaten beschrieben ist: Heparin J. Hirsh, N. Engl. J. Med 324:1565–1574 1992, J. A. Cairns et al. Chest 102: 4565–4815 (1992); H. K. Argatroban-Gold et al., J. Am. Coll. Cardiol. 21: 1039–1047 (1993); und Hirulog^TM G.V.R.K. Sharma et al. Am. J. Cardiol. 72: 1357–1360 (1993) und R. M. Lidón et al., Circulation 88: 1495–1501 (1993).
Beispiel G
Schweinemodell der akuten Koronararterienthrombose
Das in diesen Studien verwendete Protokoll ist eine Modifikation eines Thrombosemodells, über das vor kurzer Zeit berichtet wurde (B. R. Lucchesi et al., (1994), Brit. J. Pharmacol. 113:1333–1343).
Die Tiere wurden anästhetisiert und mit arteriellen und venösen Kathedern (linke Arteria carotis communis und Vena jugularis externa) instrumentell versorgt. Im 4. Interkostalraum wurde eine Thoraktomie vorgenommen und das Herz freigelegt. Die linke vordere absteigende (LAD) Koronararterie wurde von dem darüber befindlichen Bindegewebe isoliert und mit einer Doppler-Durchflusssonde und einer Ligaturstenose der Stärke 17 instrumentell versorgt. Es wurde auch eine Anodenelektrode im Inneren des Gefäßes implantiert.
Es wurden Grundlinienmessungen durchgeführt, und das zu testende NAP oder Placebo wurde über die Vena jugularis externa verabreicht. Fünf Minuten nach der Verabreichung wurde ein Gleichstrom (300 μA, DC) an die stimulierende Elektrode angelegt, um Intimaschaden am Koronarendothel zu initiieren und mit der Thrombusbildung zu beginnen. Der Strom wurde über einen Zeitraum von 3 Stunden weiter fortgesetzt. Die Tiere wurden bis entweder eine Stunde nach Beendigung des Stroms oder dem Tod des Tieres beobachtet, wobei das zuerst auftretende Ereignis genommen wurde.
Tabelle 10 zeigt Daten, die die Häufigkeit von Okklusion bei Tieren zeigte, denen AcaNAP5 oder AcaNAPc2P (siehe Bei spiel 17) in drei ansteigenden NAP-Dose verabreicht wurde. Die Häufigkeit der Okklusion bei den Tieren, die Placebo erhielten, war 8/8 (100 %). Die Zeit bis zur Okklusion bei placebobehandelten Tieren war 66, 6 ± 7, 5 Minuten (Mittelwert ± Standardabweichung). Den Gefäßen der mit AcaNAP behandelten Schweine, die während des 4-stündigen Beobachtungszeitraums nicht okkludierten, wurde eine willkürliche Zeit bis zur Okklusion von 240 Minuten zugewiesen, um statistische Vergleiche zu erleichtern.
Die Daten zeigen, dass AcaNAP5 und AcaNAPc2P in dieser Umgebung ähnlich wirksam waren, beide verlängerten die Zeit bis zur Koronararterienokklusion in dosisabhängiger Weise. Außerdem verlängerten beide Moleküle die Zeit bis zur Okklusion signifikant in einer Dosis (0,03 mg/kg i.v.), die nicht zu signifikanten Erhöhungen der Blutungen führte. Diese und andere Daten legen nahe, dass AcaNAP5 und AcaNAPc2P vorteilhafte therapeutische Indizes haben. Tabelle 10. Vergleich der primären Endpunkte zwischen AcaNAPc2P und AcaNAP5 nach intravenöser Dosierung beim Schweinemodell der akuten Koronararterienthrombose

✝ p < 0,05 gegen Salzlösung (8/8), Fisher's Exact; *p < 0,05 gegen Sallösung, ANOVA, Dunnett's Mehrfachvergleichstest.

SEQUENZLISTING

Claims

Isoliertes Protein mit Antikoagulationsaktivität und mit einer oder mehreren aus Nematoden extrahierten Antikoagulationsproteindomänen (NAP-Domänen), wobei jede NAP-Domäne die folgende Sequenz einschließt: Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10, worin (a) A1 eine Aminosäuresequenz mit 7 bis 8 Aminosäureresten ist; (b) A2 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 5 Aminosäureresten ist; (c) A3 eine Aminosäuresequenz mit 3 Aminosäureresten ist; (d) A4 eine Aminosäuresequenz mit 6 bis 19 Aminosäureresten ist; (e) A5 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 4 Aminosäureresten ist; (f) A6 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 5 Aminosäureresten ist; (g) A7 ein Aminosäurerest ist; (h) A8 eine Aminosäuresequenz mit 11 bis 12 Aminosäureresten ist; (i) A9 eine Aminosäuresequenz mit 5 bis 7 Aminosäureresten ist; und (j) A10 eine Aminosäuresequenz mit 5 bis 25 Aminosäureresten ist.
Protein nach Anspruch 1, wobei die Aktivität des Proteins Faktor Xa inhibierende Aktivität einschließt.
Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei A3 die Sequenz Glu-A3_a-A3_b hat, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind.
Protein nach Anspruch 3, wobei A3 die Sequenz Glu-A3_a-A3_b hat, wobei A3_a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ala, Arg, Pro, Lys, Ile, His, Leu und Thr, und A3_b ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lys, Thr und Arg.
Protein nach einem der Ansprüche 3 bis 4, wobei A3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Giu-His-Arg, Glu-Leu-Lys und Glu-Thr-Lys.
Protein nach Anspruch 1, wobei A3 die Sequenz Asp-A3_a-A3_b hat, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind.
Protein nach Anspruch 1 oder 6, wobei A3 Asp-Lys-Lys ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei A4 eine Aminosequenz mit einer anionischen Nettoladung ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 oder 6 bis 8, wobei A₅ die Sequenz A5_a-A5_b-A5_c-A5_d [SEQ. ID. Nr. 85] hat, wobei A5_a bis A5_d unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind.
Protein nach Anspruch 9, wobei A5_a Leu ist und A5_c Arg ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei A7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Val und Ile.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei A8 eine Aminosäuresequenz A8_a-A8_b-A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g [SEQ. ID. Nr. 68] einschließt, wobei (a) A8_a der erste Aminosäurerest in A8 ist, (b) mindestens einer von A8_a und A8_b ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glu oder Asp, und (c) A8_c bis A8_g unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind.
Protein nach Anspruch 12, wobei (a) A8_a Glu oder Asp ist, (b) A8_b ein unabhängig ausgewählter Aminosäurerest ist, (c) A8_c Gly ist, (d) A8_d aus der aus Phe, Tyr und Leu, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, (e) A8_e Tyr ist, (f) A8_f Arg ist und (g) A8_g aus Asp und Asn ausgewählt ist.
Protein nach Anspruch 12 oder 13, wobei (a) A8_a ein unabhängig ausgewählter Aminosäurerest ist, (b) A8_b Glu oder Asp ist, (c) A8_c Gly ist, (d) A8_d aus der aus Phe, Tyr und Leu bestehenden Gruppe ausgewählt ist, (e) A8_e Tyr ist, (f) A8_f Arg ist und (g) A8_g aus Asp und Asn ausgewählt ist.
Protein nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 72] und Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 73].
Protein nach Anspruch 15, wobei A8_c-A8_d-A8_e-A8_f-A8_g Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 70] ist.
Protein nach einem der Ansprüche 2 bis 16, wobei A10 eine Aminosäuresequenz einschließt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. Nr. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. Nr. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. Nr. 76] und Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. Nr. 77].
Protein nach Anspruch 17, wobei A10 die Aminosäuresequenz Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. Nr. 74] einschließt.
Protein nach Anspruch 17, wobei A10 die Aminosäuresequenz Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. Nr. 75] einschließt.
Protein nach Anspruch 19 mit einer NAP-Domäne mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Homologie zu derjenigen von AcaNAP48 [16].
Protein nach Anspruch 17, wobei A10 die Aminosäuresequenz Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. Nr. 76] einschließt.
Protein nach Anspruch 21 mit einer NAP-Domäne mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Homologie zu einer NAP-Domäne ausgewählt aus NAP-Domänen von AcaNAP23 [16], AcaNAP24 [16], AcaNAP25 [16], AcaNAP44 [16], AcaNAP31 [16] und AceNAP4-d1 [16] und AceNAP4-d2 [16].
Protein nach Anspruch 17, wobei A10 die Aminosäuresequenz Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. Nr. 77] einschließt.
Protein nach Anspruch 23 mit einer NAP-Domäne mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Homologie zu einer NAP-Domäne ausgewählt aus NAP-Domänen von AcaNAP45-d1 [16], AcaNAP45-d2 [16], AcaNAP47-d1 [16], AcaNAP47-d2 [16], AduNAP7-d1 [16], AduNAP7-d2 [16], AduNAP4 [16], AceNAP5 [16] und AceNAP7 [16].
Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei (a) A3 die Sequenz Glu-A3_a-A3_b hat, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind; (b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist; (c) A7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Val und Ile; (d) A8 eine Aminosäuresequenz einschließt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 69], Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 70], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 71], Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 72], und Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 73]; und (e) A10 eine Aminosäuresequenz einschließt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. Nr. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. Nr. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. Nr. 76] und Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. Nr. 77].
Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei (a) A3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Glu-Ala-Lys, Glu-Arg-Lys, Glu-Pro-Lys, Glu-Lys-Lys, Glu-Ile-Thr, Glu-His-Arg, Glu-Leu-Lys und Glu-Thr-Lys; (b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist; (c) A7 Val oder Ile ist; (d) A8 eine Aminosäuresequenz einschließt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: A8_a-A8_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 78], A8_a-A8_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 79], A8_a-A8_b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 80], A8_a-A8_b-Gly-Tyr-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 81], und A8_a-A8_b-Gly-Leu-Tyr-Arg-Asp [SEQ. ID. Nr. 82], wobei mindestens einer von A8_a und A8_b Glu oder Asp ist; (e) A9 eine Aminosäuresequenz von fünf Aminosäureresten (f) A10 eine Aminosäuresequenz einschließt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Glu-Ile-Ile-His-Val [SEQ. ID. Nr. 74], Asp-Ile-Ile-Met-Val [SEQ. ID. Nr. 75], Phe-Ile-Thr-Phe-Ala-Pro [SEQ. ID. Nr. 76] und Met-Glu-Ile-Ile-Thr [SEQ. ID. Nr. 77].
Protein nach Anspruch 18, 25 oder 26 mit einer NAP-Domäne mit mindestens 90 % Homologie zu NAP-Domänen ausgewählt aus AcaNAP5 [16] und AcaNAP6 [16].
Protein nach Anspruch 25 oder 26 mit einer NAP-Domäne mit mindestens 90 % Homologie zu einer NAP- Domäne ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ACaNAP5 [16], AcaNAP6 [16], AcaNAP48 [16], AcaNAP23 [16], AcaNAP24 [16], AcaNAP25 [16], AcaNAP44 [16], AcaNAP31 [16], AceNAP4-d1 [16], AceNAP4-d2 [16], AcaNAP45-d1 [16], AcaNAP45-d2 [16], AcaNAP47-d1.[16], AcaNAP47-d2 [16], AduNAP7-d1 [16], AduNAP7-d2 [16], AduNAP4 [16], AceNAP5 [16] und AceNAP7 [16].
Isoliertes Protein mit Antikoagulationsaktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus AcaNAP5 [16], AcaNAP6 [16], AcaNAP48 [16], AcaNAP23 [16], AcaNAP24 [16], AcaNAP25 [16], AcaNAP44 [16], AcaNAP31 [16], AceNAP4 [16], AcaNAP45 [16], AcaNAP47 [16], AduNAP7 [16], AduNAP4 [16], AceNAP5 [16] und AceNAP7 [16].
Isoliertes Protein mit Faktor Xa-inhibierender Aktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus AcaNAP5 [16] und AcaNAP6 [16].
Protein nach Anspruch 1, wobei (a) A3 die Sequenz Asp-A3_a-A3_b hat, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind; (b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist; (c) A5 die Sequenz A5_a-A5_b-A5_c-A5_d [SEQ. ID. Nr. 85] hat, wobei A5_a bis A5_d unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind, und (d) A7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Val und Ile.
Protein nach Anspruch 1, wobei (a) A3 Asp-Lys-Lys ist; (b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist; (c) A5 die Sequenz A5_a-A5_b-A5_c-A5_d hat, wobei A5_a Leu ist, A5_c Arg ist, und A5_b und A5_d unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind [SEQ. ID. Nr. 357]; (d) A7 Val ist; und (e) A8 eine Aminosäuresequenz A8_a-A8_b-Gly-Phe-Tyr-Arg-Asn [SEQ. ID. Nr. 79] einschließt, wobei mindestens eine von A8_a und A8_b Glu oder Asp ist.
Protein nach Anspruch 31 oder 32 mit einer NAP-Domäne mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 Homologie zu derjenigen von AcaNAPc2 [16].
Isoliertes Protein mit Faktor VIIa/TF-inhibierender Aktivität mit einer Nematoden-extrahierten Antikoagulansproteindomäne (NAP-Domäne) mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Homologie zu der NAP-Domäne von AcaNAPc2 [16].
Isoliertes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 34 mit Antikoagulationsaktivität, wobei das Protein die katalytische Aktivität des fVIIa/TF-Komplexes in Gegenwart von fXa oder katalytisch inaktivem fXa-Derivat spezifisch inhibiert und die Aktivität von FVIIa in Abwesenheit von TF nicht spezifisch inhibiert und nicht spezifisch Prothrombinase inhibiert.
Protein nach Anspruch 35, wobei das Protein AcaNAPc2 [16] ist.
Protein mit Antikoagulationsaktivität und mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Homologie zu AcaNAPc2 [16].
Isoliertes Protein mit Serinprotease inhibierender Aktivität und mit einer oder mehreren aus Nematoden extrahierten Antikoagulansproteindomänen (NAP-Domänen) mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Homologie zu NAP-Domänen ausgewählt aus HpoNAP5 [16] und NamNAP [16], worin (a) A1 eine Aminosäuresequenz mit 7 bis 8 Aminosäureresten ist; (b) A2 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 5 Aminosäureresten ist; (c) A3 die Sequenz Glu-A3_a-A3_b hat, wobei A3_a und A3_b unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind; (d) A4 eine Aminosäuresequenz mit 6 bis 19 Aminosäureresten mit einer anionischen Nettoladung ist; (e) A5 die Sequenz A5_a-A5_b-A5_c hat, wobei A5_a bis A5_c unabhängig ausgewählte Aminosäurereste sind; (f) A6 eine Aminosäuresequenz mit 3 bis 5 Aminosäureresten ist; (g) A7 Gln ist; (h) A8 eine Aminosäuresequenz mit 10 bis 12 Aminosäureresten ist; und (i) A9 eine Aminosäuresequenz mit 5 bis 7 Aminosäureresten ist; (j) A10 eine Aminosäuresequenz mit 1 bis 25 Aminosäureresten ist.
Protein nach Anspruch 38, wobei (a) A3 Glu-Pro-Lys ist; (b) A4 eine Aminosäuresequenz mit einer anionischen Nettoladung ist; (c) A5 ausgewählt ist aus Thr-Leu-Asn und Thr-Met-Asn; und (d) A7 Gln ist.
Isoliertes Protein mit Serinprotease inhibierender. Aktivität und mit einer aus Nematoden extrahierten. Antikoagulationsproteindomäne (NAP-Domäne) mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Homologie zu NAP-Domänen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HpoNAP5 [16] und NamNAP [16].
Protein nach einem der Ansprüche 1, 2, 25, 26, 31, 32, 38 oder 39, wobei das Protein zwei NAP-Domänen hat.
Protein mit zwei aus Nematoden extrahierten Antikoagulationsprotein- (NAP)-Domänen, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus AceNAP4 [17], AcaNAP45 [18], AcaNAP47 [19] und AduNAP7 [20].
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 42, wobei das Protein von einer Nematodenspezies abgeleitet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus und Heligomosomoides polygyrus.
Isoliertes rekombinantes cDNA-Molekül, das ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 42 kodiert.
cDNA-Molekül, welches das Protein gemäß Anspruch 18 oder 25 kodiert, das eine Nukleotidsequenz mit mindestens 90 % Homologie zu derjenigen hat, die für AcaNAP5 [1] und AcaNAP6 [3] kodiert.
cDNA-Molekül, welches das Protein mit Faktor Xa inhibierender Aktivität kodiert, das aus der Gruppe bestehend aus Proteinen mit NAP-Domänen mit mindestens 90 % Homologie zu AcaNAP5 [16] und AcaNAP6 [16] ausgewählt ist.
cDNA-Molekül, welches das Protein gemäß Anspruch 20 kodiert, das eine Nukleotidsequenz mit mindestens 90 Homologie zu derjenigen hat, die für AcaNAP48 [13h] kodiert.
cDNA-Molekül, welches das Protein gemäß Anspruch 21 kodiert, das eine Nukleotidsequenz mit mindestens 90 Homologie zu einer solchen hat, die aus der Gruppe bestehend aus cDNAs ausgewählt ist, die für AcaNAP23 [13a], AcaNAP24 [13b], AcaNAP25 [13c], AcaNAP44 [13e], AcaNAP31 [13d] und AceNAP4 [7a] kodieren.
cDNA-Molekül, welches das Protein gemäß Anspruch 23 kodiert, das eine Nukleotidsequenz mit mindestens 90 Homologie zu einer solche hat, die aus der Gruppe bestehend aus cDNAs ausgewählt ist, die für AcaNAP45 [13f], AcaNAP47 [13g], AduNAP7 [7e], AduNAP4 [7d], AceNAP5 [7b] und AceNAP7 [7c] kodieren.
cDNA-Molekül, welches das Protein gemäß Anspruch 26 kodiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus cDNAs, die für AcaNAP5 [1], AcaNAP6 [3], AcaNAP48 [13h], AcaNAP23 [13a], AcaNAP24 [13b], AcaNAP25 [13c], AcaNAP44 [13e], AcaNAP31 [13d], AceNAP4 [7a], AcaNAP45 [13f], AcaNAP47 [13g], AduNAP7 [7e], AduNAP4 [7d], AceNAP5 [7b] und AceNAP7 [7c] kodieren.
cDNA-Molekül, welches das Protein gemäß Anspruch 38 kodiert, das eine Nukleotidsequenz mit mindestens 90 Homologie zu Sequenzen ausgewählt aus cDNAs hat, die für HpoNAP5 [7f] und NamNAP [14] kodieren.
cDNA-Molekül, das ein Protein mit Antikoagulansaktivität kodiert, das aus der Gruppe bestehend aus cDNAs mit mindestens 90 % Homologie zu cDNAs ausgewählt ist, die für AcaNAP5 [1], AcaNAP6 [3], AcaNAP48 [13h], AcaNAP23 [13a], AcaNAP24 [13b], AcaNAP25 [13c], AcaNAP44 [13e], AcaNAP31 [13d], AceNAP4 [7a], AcaNAP45 [13f], AcaNAP47 [13g], AduNAP7 [7e], AduNAP4 [7d], AceNAP5 [7b] und AceNAP7 [7c] kodieren.
Isoliertes rekombinantes cDNA-Molekül nach einem der Ansprüche 44 bis 52, das Protein mit Antikoagulationsaktivität kodiert, wobei das Protein die kataly tische Aktivität des fVIIa/TF-Komplexes in Gegenwart von fXa oder katalytisch inaktivem fXa-Derivat spezifisch inhibiert und die Aktivität von FVIIa in Abwesenheit von TF nicht spezifisch inhibiert und nicht spezifisch Prothrombinase inhibiert.
cDNA-Molekül nach Anspruch 53, wobei die DNA AcaNAPc2 [16] kodiert.
Isoliertes cDNA-Molekül, das ein Protein mit Antikoagulansaktivität mit mindestens 90 % Homologie zu AcaNAPc2 [9] kodiert.
Isoliertes rekombinantes cDNA-Molekül, das ein Protein gemäß Anspruch 32 kodiert.
cDNA-Molekül nach Anspruch 56 mit einer Nukleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Homologie zu AcaNAPc2 [16] kodiert.
cDNA-Molekül nach einem der Ansprüche 44 bis 57, das von einer Nematodenspezies abgeleitet ist.
cDNA-Molekül nach Anspruch 58, wobei die Nematodenspezies ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus und Heligomosomoides polygyrus.
Oligonukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus NAP-1: AAR-CCN-TGY-GAR-MGG-AAR-TGY [SEQ. ID. Nr. 90] und NAP-4.RC TW-RWA-NCC-NTC-YTT-RCA-NAC-RCA [SEQ. ID. Nr. 91].
Verwendung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 42 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Inhibierung der Blutkoagulation.
Verwendung nach Anspruch 61, bei der das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus AcaNAP5 [16], AcaNAP6 [16], AcaNAPc2 [16], HpoNAP5 [16], NamNAP [16].
Verwendung nach Anspruch 61, bei der das Protein eine NAP-Domäne hat, die mindestens 90 % Homologie zu NAP-Domänen aufweist, die aus der Gruppe bestehend aus ACaNAP5 [16], AcaNAP6 [16], AcaNAP48 [16], AcaNAP23 [16], AcaNAP24 [16], AcaNAP25 [16], AcaNAP44 [16], AcaNAP31 [16], AceNAP4-d1 [16], AceNAP4-d2 [16], AcaNAP45-d1 [16], AcaNAP45-d2 [16], AcaNAP47-d1 [16], AcaNAP47-d2 [16], AduNAP7-d1 [16], AduNAP7-d2 [16], AduNAP4 [16], AceNAP5 [16] und AceNAP7 [16] ausgewählt sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 42 enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 64, die ein Protein enthält, das aus der Gruppe bestehend aus AcaNAP5 [16], AcaNAP6 [16], AcaNAPc2 [16], HpoNAP5 [16], NamNAP [16] ausgewählt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 64, die ein Protein mit einer NAP-Domäne enthält, die mindestens 90 % Homologie zu NAP-Domänen aufweist, die aus der Gruppe bestehend aus ACaNAP5 [16], AcaNAP6 [16], AcaNAP48 [16], AcaNAP23 [16], AcaNAP24 [16], AcaNAP25 [16], AcaNAP44 [16], AcaNAP31 [16], AceNAP4-d1 [16], AceNAP4-d2 [16], AcaNAP45-d1 [16], AcaNAP45-d2 [16], AcaNAP47-d1 [16], AcaNAP47-d2 [16], AduNAP7-d1 [16], AduNAP7-d2 [16], AduNAP4 [16], AceNAP5 [16] und AceNAP7 [16] ausgewählt sind.
Isoliertes Protein mit einer Aminosäuresequenz von AcaNAPc2 [16] mit einem zusätzlichen Prolinrest am C-Terminus.
Isoliertes Protein mit Faktor VIIa/Tissue Factor inhibierender Aktivität und einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Homologie mit der Aminosäuresequenz von AcaNAPc2 [16] mit einem zusätzlichen Prolinrest am C-Terminus.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das die Aminosäuresequenz von AcaNAPc2 [16] mit einem zusätzlichen Prolinrest am C-Terminus kodiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Protein kodiert, das Faktor VIIa/Tissue Factor inhibierende Aktivität und das eine mindestens 90 % Homologie mit der Aminosäuresequenz von AcaNAPc2 [16] mit einem zusätzlichen Prolinrest am C-Terminus hat.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Protein mit Faktor VIIa/Tissue Factor inhibierender Aktivität kodiert und das mindestens 90 % Homologie zu der Nukleinsäuresequenz hat, welche die Aminosäuresequenz von AcaNAPc2 [16) mit einem zusätzlichen Prolinrest am C-Terminus kodiert.