DE69533478T2 - Photospaltbare konjugate zum nachweis und zur isolierung von biomolekülen - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf Konjugate, die beim Nachweis und bei der Isolierung von Targets aus heterologen Gemischen verwendet werden. Agentien umfassen eine nachweisbare Struktureinheit, die an eine photoreaktive Struktureinheit gebunden ist. Konjugate umfassen Agentien, die durch eine oder mehrere kovalente Bindungen an Substrate gekoppelt sind. Diese Bindungen können leicht und selektiv gespalten oder unter Verwendung von elektromagnetischer Strahlung photolytisch gespalten werden. Zu den Substraten, die an Agentien gekoppelt werden können, gehören Aminosäuren, Peptide, Proteine, Nucleotide, Nucleinsäureprimer für PCR-Reaktionen und Lipide. Die Erfindung bezieht sich auch auf schnelle und effiziente Verfahren zum Nachweis und zur Isolierung von Targets, wie Zellen, Nucleinsäuren und Proteinen, und auf Kits, die diese Komponenten enthalten.
  • Beschreibung des Hintergrunds
  • Grundlegende wissenschaftliche Techniken einschließlich einiger der Hauptdurchbrüche in Molekularbiologie, Chemie und Medizin haben bestimmte Merkmale gemeinsam. Zwei dieser Merkmale sind der spezielle Nachweis und die spezielle Isolierung von einzelnen Komponenten aus komplexen Gemischen. Zum Beispiel sind Elektrophorese und Chromatographie jeweils weit verbreitete Verfahren zum Nachweis oder zur Isolierung von Makromolekülen aus biologischen Proben. Diese Verfahren machen sich einzigartige oder identifizierbare molekulare Eigenschaften der zu isolierenden Komponenten, wie Ladung, Hydrophobie und Molekulargewicht, zu Nutze, um Makromoleküle zu charakterisieren und zu identifizieren. Je nach Isolierungsverfahren können isolierte Makromoleküle häufig als Produkte in nachgeschalteten Verfahren verwendet werden.
  • Einige der nützlicheren Nachweis- und Isolierungsverfahren machen sich physikalische Eigenschaften des interessierenden Elements, des Substrats oder von Molekülen, die leicht an Substrate gebunden werden können, zu Nutze. Eine der verbreitetsten dieser Eigenschaften ist die Radioaktivität bzw. die radioaktive Markierung mit Radionukliden. Die meisten Substanzen sind nicht natürlicherweise radioaktiv und können mit radioaktiven Atomen, die als Radionuklide bezeichnet werden, markiert und unter Verwendung von wohlbekannten Standard-Radiographieverfahren nachgewiesen werden. Radioaktive Elemente sind nachweisbar, da sie große Mengen an Energie in Form von Alpha-, Beta- oder Gammastrahlen emittieren, wenn sie zerfallen. Radioaktivität ist zur Markierung allgemein geeignet, da die Markierung nicht durch den physikalischen Zustand oder die chemische Kombination der zu markierenden Substanz beeinflusst wird. Außerdem kann die spezielle emittierte Strahlung anhand der Natur der Strahlung (z. B. α, β oder γ), ihrer Energie und der Halbwertszeit des Vorgangs identifiziert werden. Targets können in komplexen Gemischen anhand des emittierten Strahlungsprofils identifiziert werden. Weiterhin können radioaktiv markierte Substanzen in chemischen Reaktionswegen und biologischen Systemen radiographisch verfolgt werden.
  • Unglücklicherweise ist Radioaktivität eine Gefahr sowohl für die menschliche Gesundheit als auch für die Umwelt. Der notwendige Arbeitsplatzschutz ist erheblich. Spezielle Laborverfahren, eigens dafür vorgesehene Anlagen und Geräte, ausführliche Protokollführung und spezielle Ausbildung für das Laborpersonal sind für die sichere Verwendung von Radionukliden erforderlich. Die Herstellung von radioaktiven Reagentien ist auch sehr teuer, genauso wie die sichere Entsorgung, was die Kosten für alle Experimente, bei denen radioaktive Agentien beteiligt sind, in die Höhe treibt. Nach den geltenden Richtlinien erfordern weiterhin alle Anwender von Radioaktivität eine spezielle Überwachung, und US-Bundesverordnungen müssen streng und sorgfältig eingehalten werden, was eine enorme Menge an Buchführung erfordert.
  • Verfahren der radioaktiven Markierung liefern auch nicht immer ein Mittel, um Produkte in einer Form zu isolieren, die weiterverwendet werden kann. Die Anwesenheit von Radioaktivität beeinträchtigt die Eignung für weitere biochemische oder biophysikalische Verfahren im Labor und bei Tieren. Dies ist klar im Falle der in-vitro- oder in-vivo-Expression von Proteinen, die biosynthetisch mit radioaktiven Aminosäuren oder anderen radioaktiven Markern markiert sind. Die Schädlichkeit oder zumindest potentielle Schädlichkeit der Radioaktivität überwiegt die Vorteile, die sich durch die Proteinzusammensetzung ergeben könnten.
  • Die Entsorgung von radioaktivem Abfall macht ebenfalls wachsende Sorge, sowohl wegen der potentiellen Gefahr für die Öffentlichkeit als auch wegen des Fehlens von Deponien für radioaktiven Abfall. Außerdem ist die Verwendung der radioaktiven Markierung zeitraubend und erfordert in manchen Fällen bis zu mehreren Tagen zum Nachweis der radioaktiven Markierung. Die lange Zeit, die für solche Experimente notwendig ist, ist ein entscheidender Gesichtspunkt und kann die Forschungsproduktivität ernsthaft behindern. Es stehen zwar schnellere Verfahren des radioaktiven Nachweises zur Verfügung, doch sind sie teuer und erfordern häufig komplexe Bildverstärkungsgeräte.
  • Es gibt viele andere nachweisbare physikalische Eigenschaften, die in Chemikalien und chemischen Struktureinheiten, die zum Nachweis und zur Isolierung von Substanzen verwendet werden können, vorkommen können. Eine dieser physikalischen Eigenschaften ist die Eigenschaft der Lumineszenz, die die Phänomene der Fluoreszenz und der Phosphoreszenz umfasst. Fluoreszente Chemikalien emittieren Strahlung aufgrund der Rückkehr des Moleküls, das aufgrund der Absorption von Strahlung in einen höheren elektronischen Zustand angeregt wurde, in den Grundzustand. Phosphoreszente Moleküle können Strahlung während viel längerer Zeitintervalle emittieren. Der Nachweis der speziellen Wellenlänge der emittierten Strahlungsenergie ermöglicht den Nachweis von Targets, die mit den lumineszenten Chemikalien assoziiert sein mögen.
  • Biolumineszenz verbreitet sich schnell als Verfahren zur Markierung von vielen verschiedenen Typen von Verbindungen. Im Grunde wird ein reduziertes Substrat mit Sauerstoff umgesetzt und in ein oxidiertes Produkt mit einem erhöhten oder angeregten elektronischen Zustand umgewandelt. Das angeregte Molekül kehrt in den Grundzustand zurück und emittiert bei diesem Vorgang Lichtphotonen. Es hat sich gezeigt, dass dieser Vorgang bei mehreren Stämmen von Bakterien und Pilzen, bei marinen Wirbellosen, wie Schwämmen, und bei Garnelen und Quallen vorkommt. Häufig findet man, dass Bakterien, die Licht emittieren, in speziellen Leuchtorganen symbiotisch mit Fischen zusammenleben. Eine Vielzahl von terrestrischen Organismen, wie Regenwürmer, Hundertfüßer und Insekten, besitzen ebenfalls biolumineszente Eigenschaften.
  • Eine Gruppe von Verbindungen, die unter Emission von Licht oxidiert werden, werden als Luciferine bezeichnet, obwohl ihre individuelle Struktur variieren kann. Die oxidierten Produkte werden "Oxyluciferine" und die Enzyme, die den Vorgang katalysieren, "Luciferasen" genannt. Der Gesamtvorgang ist endotherm und erfordert chemische Energie, die in einem oder zwei Molekülen Adenosintriphosphat (ATP) gespeichert ist, pro Photon produzierten Lichts. Zwei Arten von Luciferasesystemen, die in der Molekularbiologie weit verbreitet sind, sind das bakterielle System (Vibrio harveyi oder V. fischeri) und das Leuchtkäfersystem (Photinus pyralis).
  • Zu den weiteren Markierungen, die einem Substrat nachweisbare Eigenschaften verleihen, gehören Chemikalien mit einem einzigartigen Absorptionsspektrum, Elektronenspinresonanzspektrum, optischer Aktivität, Raman-Spektrum oder Resonanz-Raman-Spektrum. Solche Markierungen sind auf vielen Gebieten einschließlich Medizin, Molekularbiologie und Chemie weit verbreitet. Zum Beispiel stellt das Absorptionsspektrum im Sichtbaren oder das Infrarotabsorptionsspektrum eines Moleküls häufig einen einzigartigen Fingerabdruck dar, der es ermöglicht, das Molekül sogar in Anwesenheit eines komplexen Gemischs zu identifizieren. Im Falle der Absorption im Sichtbaren absorbiert das Molekül aufgrund der Anwesenheit eines angeregten elektronischen Zustands des Moleküls, dessen Übergangsenergie vom Grundzustand aus in den Bereich von 1,5 bis 3 eV fällt, Strahlungsenergie über einen speziellen Wellenlängenbereich. Im Falle der Infrarotabsorption werden Banden aufgrund der Anregung von Schwingungsmoden des Moleküls nachgewiesen. Die Frequenz dieser Banden liefert Informationen über die Anwesenheit oder Abwesenheit charakteristischer Molekülgruppen, wie Disulfide, Carbonyle und aromatische Gruppen.
  • Bei einer anderen Anwendung der spektroskopischen Eigenschaften von Molekülen wird NMR-Spektroskopie häufig verwendet, um spezielle Moleküle in einem Gemisch zu identifizieren. Die Kerne von Atomen, wie Protonen bei Wasserstoffatomen, die ein magnetisches Nettomoment besitzen, richten sich, wenn man sie in ein Magnetfeld bringt, entlang dieses Feldes aus und präzessieren um das Feld herum mit einer Frequenz (der Larmor-Frequenz), die von den individuellen Eigenschaften des Teilchens abhängt. Um das NMR-Spektrum zu bestimmen, wird eine Probe von Protonen in ein starkes Magnetfeld gebracht und mit einem Bereich von Radiofrequenzen unter einem Winkel von 90° zum Hauptfeld bestrahlt. Diese Behandlung bewirkt, dass alle Protonen in der Probe Energie bei ihrer charakteristischen Frequenz absorbieren, wobei ihre magnetischen Orientierungen um 90° in Bezug auf ihren ursprünglichen Zustand drehen. Nachdem das angelegte Feld abgeschaltet ist, relaxieren die Moleküle allmählich zum Zustand der Präzession um das Hauptfeld herum. Empfängerspulen, die die Probe umgeben, weisen die Frequenzen von präzessierenden Spins als Gruppe von oszillierenden elektrischen Strömen nach, die das NMR-Signal bilden.
  • Alle diese Verfahren leiden unter ähnlichen Nachteilen. Meistens haben Targets keine einzigartigen nachweisbaren Eigenschaften, wie inhärente Radioaktivität oder Fluoreszenz. Markierungen, die selbst nachweisbar sind und daher auch das Target nachweisbar machen, müssen daran gebunden werden. Der Markierungsvorgang kann jedoch zu einem markierten Produkt führen, das in gewisser Weise permanent geschädigt ist. Zum Beispiel können fluoreszente Chemikalien äußerst toxisch gegenüber Zellen sein. Die langfristige Einwirkung kann zu einem hohen Ausmaß an Zelltod führen. Häufig kann die Markierungsverbindung nachteilige Wirkungen auf die Struktur oder Aktivität eines Targets haben. Die Proteinstruktur wird häufig durch die Ankopplung einer nachweisbaren chemischen Struktureinheit nachteilig beeinflusst. Die Markierung von Nucleinsäuren kann ihre Fähigkeit zur Translation, zur Transcription durch Polymerasen oder zur Wechselwirkung mit DNA-bindenden Proteinen stören. In den meisten Fällen muss die chemische Struktureinheit entfernt werden. Weiterhin führen die Verfahren zur Entfernung dieser chemischen Struktureinheiten, die nachweisbare physikalische Eigenschaften haben, häufig direkt zu einer Veränderung des Moleküls oder zum Zelltod.
  • Es gibt mehrere Verfahren, sowohl komplex als auch einfache, die verwendet werden, um Targetsubstrate selektiv nachzuweisen und zu isolieren. Ein Verfahren, das den Nachweis und die Identifizierung von Nucleinsäuren revolutioniert und stark beschleunigt hat, ist die Technik der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Das Hauptkonzept der PCR ist die schnelle, großmaßstabige Amplifikation von einzigartigen oder sogar nichteinzigartigen Nucleinsäuresequenzen in biologischen Proben. Unter Verwendung von markierten Primern mit spezifischen oder zufälligen Sequenzen kann die Basensequenz sehr kleiner Mengen von Nucleinsäuren durch repetitive Polymerisationsereignisse nachgewiesen, zahlenmäßig vervielfältigt und anschließend charakterisiert werden. Obwohl die gebildeten Nucleinsäuren neu sind, wird die Sequenz der ursprünglichen Probe beibehalten und kann leicht bestimmt werden. Da eine Nucleinsäuresequenz die biologische Codierung für den Aufbau praktisch aller Proteine darstellt, können der Ursprung, das evolutionäre Alter, die Struktur und Zusammensetzung von fast jedem biologischen Organismus oder fast jeder biologischen Probe aus der Kenntnis der Sequenz bestimmt werden. Das Verfahren hat sich in Molekular- und Evolutionsbiologie als brauchbar erwiesen und hat Anwendungen beim Nachweis, der Behandlung und Prävention von Krankheiten und Störungen bei Menschen gezeigt.
  • Die PCR-Technik ist zwar revolutionär, beinhaltet aber dieselben Einschränkungen wie viele herkömmliche Nachweis- und Isolierungsverfahren. Marker, der in Primer und schließlich in neu gebildete Nucleinsäuren eingebaut wurde, muss wieder entfernt werden. Dieser Vorgang ist, wenn er möglich ist, recht zeitraubend und führt häufig zur Modifikation oder Zerstörung der Nucleinsäure.
  • Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, um eine Substanz spezifisch nachweisbar zu machen, besteht in der Verwendung von Bindungsmolekülen, die eine beson dere Affinität zu ausgewählten anderen Molekülen haben, wie es bei der Bindung zwischen einem Antigen und einem antigenspezifischen Antikörper erfolgt. Diese chemischen Paare, die zuweilen als Kopplungsagentien bezeichnet werden, werden häufig in Nachweis- und Isolierungsverfahren verwendet. Normalerweise ist eines der Moleküle in diesem Paar auf einem Affinitätsmedium, wie es in chromatographischem Packungsmaterial verwendet wird, oder auf einem Magnetkügelchen, wie es bei der Isolierung des Zielmoleküls verwendet wird, immobilisiert. Einige der nützlicheren Kopplungsagentien sind Biotin und Avidin oder das verwandte Protein Streptavidin. Diese Agentien werden in vielen Trenntechniken verwendet, um die Isolierung einer Komponente oder einer anderen aus komplexen Gemischen zu erleichtern.
  • Biotin, ein wasserlösliches Vitamin, wird häufig in der Biochemie und Molekularbiologie für eine Vielzahl von Zwecken einschließlich des Nachweises, der Reinigung und Isolierung von Makromolekülen und der cytochemischen Anfärbung verwendet. Biotin hat auch wichtige Anwendungen in der Medizin in den Bereichen der klinischen diagnostischen Assays, der Tumorbildgebung und der Wirkstoffabgabe und wird häufig im Bereich der Affinitätscytochemie für die selektive Markierung von Zellen, subzellulären Strukturen und Proteinen verwendet.
  • Die Nützlichkeit von Biotin geht auf seine Fähigkeit zurück, stark an das tetramere Protein Avidin, das man im Eiweiß und in den Geweben von Vögeln, Reptilien und Amphibien findet, oder an seinen chemischen Vetter Streptavidin, das aus dem Bakterium Streptomyces isoliert wird, zu binden. Typischerweise wird Biotin oder ein Derivat von Biotin zuerst unter Verwendung einer spezifischen chemischen Verknüpfung direkt an ein Zielmolekül, wie ein Protein oder Oligonucleotid, oder an eine Sonde gebunden. Dann wird die Wechselwirkung des verknüpften Biotins mit entweder Streptavidin oder Avidin, das mit einem Affinitätsmedium, wie Magnet- oder Sepharosekügelchen, konjugiert ist, bei der Isolierung des Zielmoleküls verwendet. Alternativ dazu wird die Wechselwirkung des kovalent gebundenen Biotins mit Avidin oder Streptavidin, das mit einem Enzym, wie Meerrettich-Peroxidase (HRP), das eine chromogene Reaktion katalysiert, konjugiert ist, zum Nachweis des Zielmoleküls verwendet. Makromo leküle, die unter Verwendung der Biotin-Avidin-Technik isoliert wurden, sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. Tabelle 1: Makromoleküle, die durch direkte Biotinylierung isoliert wurden
    Figure 00080001
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    22.
    B. Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9591, 1986.
  • Während die Nützlichkeit von Biotin weiter zunimmt, gibt es bei vielen Anwendungen noch größere Nachteile bei der Verwendung der Biotin-Streptavidin-Technik. Dieses Problem ist auf die hohe Affinität zwischen Biotin und Streptavi din zurückzuführen, genau die molekulare Eigenschaft, wegen der es am nützlichsten ist. Sobald ein Zielmolekül oder eine Zelle durch die Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung isoliert worden ist, erfordert die Freisetzung des Zielmoleküls eine Zerstörung dieser Wechselwirkung. Biotin von Streptavidin abzudissoziieren erfordert sehr harte Bedingungen, wie 6–8 M Guanidinium-HCl, pH 1,5. Solche Bedingungen denaturieren auch und inaktivieren dadurch die meisten Proteine und zerstören die meisten Zellen.
  • Zum Beispiel wird häufig ein Biotinderivat, das eine N-Hydroxysuccinimidestergruppe enthält, verwendet, um Biotin über eine Amidbindung an Proteine und Nucleinsäuren zu binden. Die selektive Spaltung dieser Bindung zerstört ähnliche native chemische Bindungen in assoziierten Molekülen. Biotin wird auch häufig bei der Isolierung spezieller Zellen aus einem heterogenen Gemisch von Zellen verwendet, indem man einen gegen ein charakteristisches Zelloberflächenantigen gerichteten biotinylierten Antikörper bindet. Dann kann die Wechselwirkung des biotinylierten Antikörpers mit Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen oder Sepharose-Teilchen effektiv verwendet werden, um Zielzellen zu isolieren. Die Zerstörung der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung erfordert es normalerweise, die Zellen Bedingungen wie einem niedrigen pH-Wert oder mechanischem Rühren auszusetzen, die für das Überleben der Zelle nachteilig sind. Im Allgemeinen ist das Gewinnen des Targets in völlig unmodifizierter Form nicht möglich.
  • Sobald die biotinylierte DNA an Streptavidin gebunden ist, kann sie nur mit äußerster Schwierigkeit wieder freigesetzt werden. Zum Entfernen des Streptavidinmoleküls wurden viele verschiedene Verfahren vorgeschlagen, einschließlich der Verdauung durch Proteinase K (M. Wilchek und E. A. Bayer, Anal. Biochem. 171: 1, 1988). Proteinase K verdaut auch nahegelegene Proteine und erledigt die vollständige Verdauung des Streptavidins ziemlich schlecht. Erhebliche Mengen der Streptavidinmoleküle bleiben gebunden, und weiterhin wird durch die Entfernung des Streptavidins das Biotin nicht freigesetzt. Weiterhin stört biotinylierte DNA die anschließende Verwendung bei einer Vielzahl von Verfahren einschließlich der Transformation von Zellen und Assays auf Hybridisierungsbasis, die zum Nachweis von Erbkrankheiten verwendet werden.
  • Die im Wesentlichen irreversible Bindung von Biotin und Streptavidin ist auch eine schwere Einschränkung für die Durchführung von multiplen oder sequentiellen Assays, um einen speziellen Typ von Biomolekül, makromolekularem Komplex, Virus oder Zelle, der in einer einzigen Probe vorhanden ist, nachzuweisen. Normalerweise kann nur ein einziger Assay durchgeführt werden, da das Enzymnachweissystem auf Streptavidin beruht und Streptavidin fest an das biotinylierte Target oder die biotinylierte Targetsonde gebunden bleibt. Zum Nachweis stehen zwar verschiedene chromogene Systeme zur Verfügung, doch sind sie in Situationen, bei denen große Zahlen von Sonden benötigt werden, nur von begrenzter Anwendbarkeit.
  • Ein zusätzliches Problem bei der Verwendung der Biotin-Avidin-Technik ist die Anwesenheit von endogenem Biotin, entweder frei oder mit anderen Molekülen komplexiert, innerhalb der zu reinigenden oder zu testenden Probe. In diesem Fall kann das endogene Biotin zur Isolierung oder zum Nachweis von Nicht-Target-Molekülen führen. Dies kann in Fällen, bei denen für einen genauen und empfindlichen Nachweis ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis notwendig ist, ein besonders großes Problem sein.
  • Um Biotin von einem daran gebundenen Molekül zu entfernen, wurden mehrere chemisch spaltbare Biotinderivate hergestellt. ImmunoPure-NHS-SS-Biotin (Pierce Chemical; Rockford, IL) besteht aus einem Biotinmolekül, das über eine Disulfidbindung gebunden ist, und einer N-Hydroxysuccinimidestergruppe, die selektiv mit primären Aminen reagiert. Unter Verwendung dieser Gruppe kann NHS-SS-Biotin an ein Protein gebunden werden, und dann kann der Biotinteil entfernt werden, indem man die Disulfidbindung mit Thiolen spaltet. Dieser Ansatz ist von begrenzter Verwendbarkeit, da Thiole normalerweise native Disulfidbindungen in Proteinen zerstören. Weiterhin ist die Zielzelle oder das Zielmolekül nach der Abspaltung immer noch modifiziert, da der Spacer-Arm-Teil des Komplexes nicht entfernt wird und der Spaltungspuffer aus der Probe entfernt werden muss.
  • Ein Verfahren zur Entfernung von Biotin ist die Verwendung von auf Disulfidbasis abspaltbaren Biotinen. Die abgespaltenen Moleküle besitzen jedoch eine reaktive Sulfhydrylgruppe, die eine starke Neigung hat, mit anderen Komponenten des Gemischs Disulfidbindungen zu bilden. Die funktionelle Aktivität dieser Substanzen, die Sulfhydrylgruppen enthalten, ist stark beeinträchtigt. Typischerweise ist die Aktivität eines solchen Proteins reduziert oder beseitigt, und solche Nucleinsäuren hybridisieren nicht mehr, so dass sie zum Klonen ungeeignet sind. Dieses Verfahren ist außerdem langsam und erfordert die Herstellung von komplexen Lösungen.
  • Eine weitere Einschränkung der Biotin-Avidin-Technik ist die Schwierigkeit bei der Entwicklung von automatisierten Systemen für die Isolierung und/oder den Nachweis von Targets aufgrund der Probleme mit der Freisetzung des Targets aus dem Biotin-Avidin-Bindungskomplex. Dies erfordert die Zugabe von speziellen chemischen Reagentien und eine sorgfältige Überwachung der Reaktionen.
  • Zum Nachweis und zur Isolierung von Nucleinsäuren und spezifischen Sequenzen wurde die Biotin-Avidin-Technik mit PCR-Techniken kombiniert. Es bleibt jedoch immer noch ein grundsätzliches Problem, das mit der Schwierigkeit zusammenhängt, das eingebaute Biotin zu entfernen. Wenn man herkömmliche Biotine verwendet, ist dies normalerweise nicht möglich, ohne die Struktur der DNA irreversibel zu verändern. Wie oben diskutiert wurde, kann die Biotinylierung die anschließende Anwendung von biotinylierten Sonden stören sowie die Eigenschaften des PCR-Produkts verändern.
  • PCR-Produkte, die biotinylierte Nucleotide oder Primer enthalten, die für die Isolierung erforderlich sind, können nicht in Verbindung mit biotinylierten Hybridisierungssonden verwendet werden. Die Anwesenheit von Biotin am PCR-Produkt verursacht falsche Signale von dem auf Avidin basierenden enzymabhängigen Nachweissystem. Der Einbau von Biotin in DNA stört die Stranghybridi sierung, möglicherweise aufgrund der Spacer-Arme, die die Nucleotide mit den Biotinmolekülen verbinden. Weiterhin sind PCR-Produkte, die biotinyliert sind, kein geeignetes Material zum Klonieren. PCR-Produkte, die biotinylierte Nucleotide enthalten, sind schwierig zu analysieren. Der Einbau von biotinylierten Nucleotiden in DNA verursacht eine Verringerung der Mobilität während der Gel-Elektrophorese in Agarose. Diese Mobilitätsverschiebung macht die Charakterisierung von PCR-Produkten schwierig. Da die richtige DNA-DNA-Hybridisierung die Basis für eine empfindliche und genaue Charakterisierung und empfindliche Assays ist, sind Biotin-Avidin-Bindungssysteme stark mit Nachteilen behaftet.
  • Weitere Kopplungspartner, die verwendet werden können, um Zielsubstanzen nachzuweisen und zu isolieren, sind Zelladhäsionsmoleküle (CAMs). Einer der wohlcharakterisierten Typen ist das Endothelzellen-Adhäsionsmolekül LEC-CAM (Leukocyten-Endothelzellen-Zelladhäsionsmoleküle), das jetzt Selectin genannt wird. Dieses Molekül bindet selektiv an Leukocyten. Seine natürliche Funktion besteht darin, den Transport von Leukocyten durch eine Endothelschicht von Zellen, wie durch postkapillare Venolen zu Entzündungsstellen oder Gewebeschäden, zu erleichtern. Es gibt viele dieser Adhäsionsmoleküle, die in Menschen und anderen Säugern identifiziert wurden und in Bezug auf die Bindungsspezifität in einem Bereich von sehr allgemein bis hochspezifisch liegen. Dazu gehören die Endothelzellen-Adhäsionsliganden ICAM-1, VCAM-1 und ELAM-1, die β-Integrine, die aus einer Familie von drei Proteinen LFA-1, Mac-1, VL-4, MO-1 und p150/p5 besteht, kohlenhydratbindende CAMs, die auf Endothelzellen, Blutplättchen und Leukocyten auftreten, und die Cadherine, calciumabhängige CAMs, die auf den meisten Zellen vorhanden sind. Die Bindung dieser Moleküle oder die Erzeugung von fusionierten Proteinen, die Adhäsionsdomänen enthalten, können verwendet werden, um die Isolierung und den Nachweis von Bindungspartnern zu erleichtern. Sobald jedoch eine Bindung erfolgt ist, sind komplexe, teure und zeitraubende biochemische Manipulationen und zuweilen recht harte chemische Behandlungen notwendig, um die Moleküle zu dissoziieren. Weiterhin ist die Anwendung dieser Moleküle für die allgemeine Verwendung eingeschränkt, da Bindungspartner für jedes interessierende Target lokalisiert werden müssen.
  • Weitere Kopplungspartner sind Nucleinsäuren und nucleinsäurebindende Proteine, Lipide und lipidbindende Proteine sowie Proteine oder spezifische Domänen, die eine besondere Affinität zueinander haben. Diese Kopplungspartner leiden unter ähnlichen Nachteilen wie das Biotin-Avidin-System und die Adhäsionsmoleküle.
  • Ein weiteres ziemlich breit anwendbares Verfahren zum Nachweise und zur Isolierung ist die Gel-Elektrophorese. Bei diesem Vorgang wird eine gleichmäßige Matrix oder ein Gel zum Beispiel aus Polyacrylamid gebildet, und ein elektrisches Feld wird angelegt. Gemische, die auf ein Ende des Gels aufgetragen werden, wandern gemäß ihrer Größe und Wechselwirkung mit dem elektrischen Feld durch das Gel. Die Beweglichkeit hängt von den einzigartigen Merkmalen der Substanz, wie Konformation, Größe und Ladung, ab. Beweglichkeiten können beeinflusst werden, indem man Porengrößen des Gels ändert, wie etwa durch Bildung eines Konzentrations- oder pH-Gradienten oder durch Veränderung der Zusammensetzung des Puffers (pH, SDS, DOC, Glycin, Salz). Ein- und zweidimensionale Gel-Elektrophorese sind in den meisten Forschungslabors weitgehend Routineverfahren. Zielsubstanzen können durch Passage durch und/oder physikalische Extraktion aus dem Gel gereinigt werden.
  • Zu den Verfahren zum Nachweis und zur Isolierung von Zielsubstanzen gehören auch Zentrifugationstechniken, wie Gleichgewichts-Dichtegradientzentrifugation. Dieses Verfahren beruht auf dem Prinzip, dass sich unter hohen Zentrifugalkräften in Salzlösungen stabile Gradienten bilden. Gemische, die einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation ausgesetzt werden, trennen sich gemäß der spezifischen Dichten in die einzelnen Komponenten auf. Obwohl sie nützlich sind, sind alle diese Verfahren eher quantitativ als qualitativ.
  • Ein größerer Fortschritt in den Nachweis- und Isolierungsmethoden war die Ankunft der Flüssigchromatographie. Chromatographie und insbesondere Säulenchromatographie umfasst einige der effektivsten und flexibelsten Reinigungsverfahren, die zur Verfügung stehen. Den meisten Verfahren gemeinsam ist die Verwendung von offenen Zylindern, die ein hydratisiertes Matrixmaterial ent halten. Einige der typischen Matrixmaterialien, die zur Zeit verwendet werden, zum Beispiel bei der Gelfiltration, Affinitätschromatographie und Ionenaustauschchromatographie, sind Sepharose (kugelförmiges Gel, das aus Agarose hergestellt wird: Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ), Sephadex (kugelförmiges Gel, das durch Vernetzen von Dextran mit Epichlorhydrin hergestellt wird: Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) und Sephacryl (kovalent vernetztes Allyldextran mit N,N'-Methylenbisacrylamid: Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ). Grundsätzlich werden eine heterogene Probe oder ein Gemisch und anschließend ein geeigneter Puffer oben auf die Säule aufgetragen. Substanzen innerhalb des Gemischs zeigen im Vergleich zu anderen Materialien innerhalb der Probe eine unterschiedliche Migration durch die Säule und werden am anderen Ende der Säule in Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen werden individuell auf die Anwesenheit des Targets analysiert, und positive Fraktionen werden vereinigt.
  • Alternativ dazu kann das Target in der Probe auch in Anwesenheit von Puffer selektiv an das Säulenmaterial binden, ein Verfahren, das als Affinitätschromatographie bekannt ist. Nach der Bindung wird ungebundenes Material entfernt, indem man die Säule kontinuierlich mit Puffer wäscht. Zielmoleküle werden anschließend aus der Säule freigesetzt, indem man einen Elutionspuffer aufträgt, der eine Dissoziation verursacht. Fraktionen werden aufgefangen, während sie aus der Säule eluiert werden, und gesammelt. Bei der Gel-Ausschlusschromatographie wird ein vernetztes Dextran als Säulenmatrixmaterial verwendet. Die Vernetzung kann variiert werden, um die effektive Porengröße des Säulenmaterials zu verändern, und das Dextran kann mit einer Vielzahl von chemischen Struktureinheiten gekoppelt werden, um das Target selektiv abzufangen. Ionenaustauschchromatographie macht sich die Tatsache zu Nutze, dass sich Targets, zum Beispiel Proteine, enorm in ihrer Affinität zu positiven oder negativen Ladungen auf Säulenmaterialien unterscheiden können. Die Affinität eines Materials zu einem Target ist proportional zur Salzkonzentration des Puffers. Durch Anheben oder Senken der Salzkonzentration ist es möglich, die Affinität des Targets zum Säulenmaterial zu ändern.
  • Affinitätssäulenchromatographie macht sich chemische Gruppen zu Nutze, die eine spezielle Anziehung auf die interessierenden Targets ausüben. Zum Beispiel binden Enzyme vorzugsweise an bestimmte natürlicherweise damit assoziierte Cofaktoren. Säulenmaterialien mit daran gebundenen Cofaktoren binden selektiv an solche Zielenzyme. Die Enzymreinigung wird zu einer relativ einfachen und geradlinigen Angelegenheit. In ähnlicher Weise können enzymspezifische Antikörper entweder kovalent oder nichtkovalent an eine Säulenmatrix gekoppelt werden. Die einzigartige Affinität eines Antikörpers zu seinem Zielantigen ermöglicht die selektive Entfernung des Targets aus einem heterologen Gemisch von Substanzen. Nachweis und Isolierung ist wiederum eine recht einfache Angelegenheit.
  • Zwei relativ gut bewährte Verfahren, HPLC (high performance liquid chromatography) einschließlich Umkehrphasen-HPLC und Ausschluss-HPLC sowie die jüngere Technik FPLC (fast performance liquid chromatography), mit der sich größere Probenvolumina handhaben lassen als mit HPLC, beruhen auf Standard-Chromatographietechniken, aber unter Verwendung von extrem hohen Drücken (5000 bis 10 000 psi und mehr). Aufgrund der höheren Drücke können feinere Säulenmaterialien verwendet werden, und Trennungen können schneller und mit besserer Auflösung durchgeführt werden. Obwohl Chromatographie ein unschätzbar wertvolles Werkzeug ist, hat sie ebenfalls ihre Grenzen. Die zu trennenden Materialien müssen in einem geeigneten Puffer, der die Säule nicht beeinträchtigt, in Lösung gebracht werden. Weiterhin müssen Substratgemische und Targets innerhalb einer vertretbaren Zeit durch eine Säule gegeben werden können. Durch HPLC kann diese Zeit zwar zuweilen verkürzt werden, doch können damit nur kleine Mengen nachgewiesen werden, und die hohen Drücke können isoliertes Säulenmaterial beschädigen.
  • Weiterhin wird Bezug genommen auf Thiele et al., Anal. Biochem., 1994, 218, 330, wo zwei Derivate des Peptidhormons Cholecystokinin (CCK-8s) offenbart sind, die eine photolytisch abspaltbare o-Nitrobenzylestergruppe enthalten. Ein Analogon, [3H]4-(Biotin-ε-Ahx-oxymethyl)-3-(nitrobenzoyl-Gly-Orn(propionyl)-ε-Ahx-CCK-8s, wurde biotinyliert, während das andere, 4-Alanyloxymethyl-3- nitrobenzoyl-ε-Ahx-CCK-8s, eine freie Aminogruppe zur Kopplung an aminoreaktive Affinitätsmatrices aufwies.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung überwindet die Probleme und Nachteile, die mit den derzeitigen Strategien und Entwürfen zusammenhängen, und stellt neue Verfahren zum Nachweis und zur Isolierung von Molekülen aus komplexen Gemischen bereit.
  • Die Erfindung betrifft Konjugate, die ein bioreaktives Agens umfassen, das photolytisch abspaltbar an ein Substrat gekoppelt ist, wobei das Agens eine nachweisbare Struktureinheit umfasst, die an eine photoreaktive Struktureinheit gekoppelt ist, wobei das Konjugat selektiv mit elektromagnetischer Strahlung gespalten werden kann, so dass das Substrat freigesetzt wird.
  • Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Konjugat, das eine chemische Struktur umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
    Figure 00170001
    besteht, wobei SUB ein Substrat umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Proteinen, Peptiden, Aminosäuren, Aminosäureanaloga, Nucleinsäuren, Nucleosiden, Nucleotiden, Lipiden, Vesikeln, Detergentien-Micellen, Zellen, Viruspartikeln, Fettsäuren, Sacchariden, Polysacchariden, anorganischen Molekülen und Metallen besteht; R1 und R2 aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Alkyl, substituiertem Alkyl, Aryl, substituiertem Aryl, -CF3, -NO2, -COOH und -COOR besteht, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können; A eine zweiwertige funktionelle Gruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -O-, -S- und -NR1- besteht; Y eine oder mehrere mehratomige Gruppen umfasst, die gleich oder verschieden sein können, V eine oder mehrere wahlfreie einatomige Gruppen umfasst, die gleich oder verschieden sein können; Q eine wahlfreie Spacer-Struktureinheit umfasst; m1 und m2 ganze Zahlen von 1 bis 5 sind, die gleich oder verschieden sein können; und D eine nachweisbare Struktureinheit umfasst, die von R1 und R2 verschieden ist.
  • Die genannten Substrate können pharmazeutische Wirkstoffe sein, wie Cytokine, Immunsystemmodulatoren, Agentien des Blutbildungssystems, Chemotherapeutika, Radioisotope, Antigene, Antineoplastika, rekombinante Proteine, Enzyme, PCR-Produkte, Rezeptoren, Hormone, Impfstoffe, Haptene, Toxine, Antibiotika, naszierende Proteine, Zellen, synthetische Pharmaka sowie Derivate und Kombinationen davon.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die das Konjugat und außerdem einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie Wasser, ein Öl, ein Lipid, ein Saccharid, ein Polysaccharid, Glycerin, ein Collagen oder eine Kombination davon, umfassen. Pharmaka können bei der Prophylaxe und bei Behandlungen von Krankheiten und Störungen beim Menschen und anderen Säugern verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung von Targets aus einem heterologen Gemisch. Kurz gesagt, ein Konjugat, wie es in Anspruch 1 definiert ist, wird hergestellt, indem man ein bioreaktives Agens durch eine kovalente Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, an ein Substrat koppelt, wobei das bioreaktive Agens aus einer photoreaktiven Struktureinheit, die an eine nachweisbare Strukturein heit gebunden ist, besteht. Das Konjugat wird mit dem heterologen Gemisch in Kontakt gebracht, um das Substrat mit einem oder mehreren Targets zu koppeln. Das gekoppelte Konjugat wird aus dem Gemisch abgetrennt und mit elektromagnetischer Strahlung behandelt, um das Substrat freizusetzen, und die Targets werden isoliert. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Targets wie Immunsystemmodulatoren, Cytokine, Agentien des Blutbildungssystems, Proteine, Hormone, Genprodukte, Antigene, Zellen, Toxine, Bakterien, Membranvesikel, Viruspartikel und Kombinationen davon aus heterologen Gemischen, wie biologischen Proben, proteinhaltigen Zusammensetzungen, Nucleinsäuren, Biomasse, immortalisierten Zellkulturen, Primärzellkulturen, Vesikeln, Tiermodellen, Säugern, Zell- und Zellmembranextrakten, Zellen in vivo und Kombinationen davon, zu isolieren.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Zielmoleküle, die nach den obigen Verfahren isoliert wurden und in pharmazeutischen Zusammensetzungen oder anderen Zusammensetzungen und Gemischen für gewerbliche Anwendungen verwendet werden können.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung von Targets aus einem heterologen Gemisch. Ein Konjugat gemäß der Erfindung wird hergestellt, das ein bioreaktives Agens umfasst, das durch eine kovalente Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, an ein Substrat gekoppelt ist, wobei das bioreaktive Agens aus einer photoreaktiven Struktureinheit, die an eine nachweisbare Struktureinheit gebunden ist, besteht und das Substrat ein Vorläufer des Targets ist. Das Konjugat wird mit dem heterologen Gemisch in Kontakt gebracht, um das Substrat in Targets einzubauen. Das eingebaute Target wird aus dem Gemisch abgetrennt, mit elektromagnetischer Strahlung behandelt, so dass das Substrat freigesetzt wird, und die Targets werden isoliert. Dieses Verfahren ist zum Nachweis und zur Isolierung von naszierenden Proteinen, Nucleinsäuren und anderen biologischen Substanzen geeignet.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung von Targets aus einem heterologen Gemisch. Ein Konjugat gemäß der Erfindung wird hergestellt, das ein bioreaktives Agens umfasst, das durch eine kovalente Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, an einen Rezeptor gekoppelt ist, wobei das bioreaktive Agens aus einer photoreaktiven Struktureinheit, die an eine nachweisbare Struktureinheit gebunden ist, besteht. Das Konjugat wird mit dem heterologen Gemisch in Kontakt gebracht, um den Rezeptor mit Targets zu koppeln, und das Rezeptor-Target-Kopplungsprodukt wird aus dem Gemisch abgetrennt. Das abgetrennte Konjugat wird mit elektromagnetischer Strahlung behandelt, um den Rezeptor freizusetzen, und die Targets werden isoliert.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung von Zielzellen aus einem heterologen Gemisch. Ein Konjugat gemäß der Erfindung wird hergestellt, das ein bioreaktives Agens umfasst, das durch eine kovalente Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, an einen Zellrezeptor gekoppelt ist, wobei das bioreaktive Agens aus einer photoreaktiven Struktureinheit, die an eine nachweisbare Struktureinheit gebunden ist, besteht. Das Konjugat wird mit dem heterologen Gemisch in Kontakt gebracht, um den Rezeptor mit Zielzellen zu koppeln. Das gekoppelte Konjugat wird aus dem Gemisch abgetrennt und mit elektromagnetischer Strahlung behandelt, um das Substrat freizusetzen. Dann lassen sich die Zielzellen leicht isolieren, zum Beispiel durch Automatisierung.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung eines photolytisch abspaltbaren Oligonucleotids. Ein Konjugat gemäß Anspruch 1 wird hergestellt, das ein bioreaktives Agens umfasst, das an ein Phosphoramidit, das ein Purin-Phosphoramidit oder ein Pyrimidin-Phosphoramidit sein kann, gekoppelt ist. Das Oligonucleotid wird unter Verwendung von photolytisch spaltbaren Phosphoramiditen synthetisiert. Das Verfahren kann manuell durchgeführt oder zur Durchführung mit einem Oligonucleotid-Synthesizer automatisiert werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung der in-vivo-Halbwertszeit eines Pharmakons in einem Patienten. Ein Konjugat gemäß der Erfindung wird gebildet, indem man das Pharmakon über eine kovalente Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, an ein bioreaktives Reagens koppelt, wobei das bioreaktive Agens eine photoreaktive Struktureinheit, die an eine nachweisbare Struktureinheit gebunden ist, umfasst. Das Konjugat wird dem Patienten verabreicht, und wenigstens zwei oder mehr biologische Proben werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung des Konjugats aus dem Patienten entnommen. Die Proben werden mit elektromagnetischer Strahlung behandelt, um das Pharmakon von dem bioreaktiven Agens freizusetzen, und die Menge des bioreaktiven Agens in den biologischen Proben wird bestimmt. Die in-vivo-Halbwertszeit des Pharmakons kann bestimmt werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zur gesteuerten Freisetzung eines Substrats in ein Medium. Ein Konjugat gemäß der Erfindung wird hergestellt, das aus einem bioreaktiven Agens besteht, das durch eine kovalente Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, an das Substrat gekoppelt ist, wobei das bioreaktive Agens aus einer photoreaktiven Struktureinheit, die an eine nachweisbare Struktureinheit gebunden ist, besteht. Das Konjugat wird an eine Oberfläche eines Artikels gebunden, der in das Medium gebracht wird. Die Oberfläche des Artikels wird zur gesteuerten Freisetzung des Substrats in das Medium einer abgemessenen Dosis elektromagnetischer Strahlung ausgesetzt.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis eines Zielmoleküls in einem heterologen Gemisch. Ein Konjugat gemäß der Erfindung wird gebildet, indem man ein Substrat mit einer kovalenten Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, an ein bioreaktives Agens koppelt, wobei das bioreaktive Agens aus einer nachweisbaren Struktureinheit, die an eine photoreaktive Struktureinheit gebunden ist, besteht. Das Konjugat wird mit dem heterologen Gemisch in Kontakt gebracht, um das Substrat mit einem oder mehreren Zielmolekülen zu koppeln. Ungekop pelte Konjugate werden entfernt, und die gekoppelten Konjugate werden mit elektromagnetischer Strahlung behandelt, um die nachweisbare Struktureinheit freizusetzen. Die freigesetzte nachweisbare Struktureinheit kann jetzt leicht nachgewiesen werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis eines Zielmoleküls in einem heterologen Gemisch. Ein Konjugat gemäß der Erfindung, das ein Substrat umfasst, das an ein bioreaktives Agens gekoppelt ist, wird gebildet und mit einem heterologen Gemisch in Kontakt gebracht, um das Konjugat mit einem oder mehreren Zielmolekülen zu koppeln. Ungekoppelte Konjugate werden entfernt, und die gekoppelten Konjugate werden mit elektromagnetischer Strahlung behandelt, um das Substrat freizusetzen. Das freigesetzte Substrat wird nachgewiesen und kann weiter isoliert werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung eines PCR-Produkts. Ein bioreaktives Agens wird mit einer kovalenten Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, mit einem oder mehreren Oligonucleotidprimern konjugiert, wobei das konjugierte bioreaktive Agens eine chemische Struktur hat, die aus der Gruppe von Verbindungen gemäß Anspruch 1 ausgewählt ist. Eine Nucleinsäuresequenz wird mit den konjugierten Oligonucleotidprimern (PCR)-amplifiziert. Die amplifizierten Sequenzen werden isoliert und anschließend mit elektromagnetischer Strahlung behandelt, um das bioreaktive Agens freizusetzen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung einer Störung durch die gesteuerte Freisetzung eines Therapeutikums an einer ausgewählten Stelle. Ein Konjugat gemäß der Erfindung wird gebildet, indem man ein bioreaktives Agens mit einer kovalenten Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, an das Therapeutikum bindet, wobei das bioreaktive Agens aus einer nachweisbaren Struktureinheit, die an eine photoreaktive Struktureinheit gebunden ist, besteht, wobei die nachweisbare Struktureinheit eine Affinität zu der ausgewählten Stelle hat. Das Konjugat wird einem Patienten, der die Störung hat, verabreicht. Die ausgewählte Stelle wird zur gesteuerten Freisetzung des Therapeutikums zur Behandlung der Störung einer abgemessenen Dosis elektromagnetischer Strahlung ausgesetzt.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Kits zum Nachweis einer Störung in biologischen Proben, die die Konjugate gemäß der Erfindung enthalten, die aus einem bioreaktiven Agens besteht, das kovalent an ein Diagnostikum mit einer Affinität zu einem Indikator der Störung in der biologischen Probe gebunden ist, wobei die kovalente Bindung mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Kits, die ein Konjugat der Erfindung umfassen, wobei das Substrat ein Oligonucleotid ist. Das photolytisch abspaltbare Oligonucleotid kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein und kann Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme besitzen, die beim Klonieren und anderen Verfahren in der Molekularbiologie nützlich sind.
  • Weitere Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung werden zum Teil in der folgenden Beschreibung dargelegt und gehen zum Teil aus dieser Beschreibung hervor oder können durch praktische Durchführung der Erfindung erfahren werden.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 Beispiele für photolytisch abspaltbare Agentien.
  • 2 Photolytisch abspaltbare Biotine mit verschiedenen photoreaktiven Struktureinheiten.
  • 3 Schematische Darstellung von photolytisch abspaltbarem Biotin.
  • 4 Mechanismus der photolytischen Spaltung in Systemen auf 2-Nitrobenzyl-Basis.
  • 5 Synthese von photolytisch abspaltbarem Biotin.
  • 6 Chemische Variationen von photolytisch abspaltbaren Agentien.
  • 7 Photolyse von PCBs.
  • 8 PCB-Konjugate.
  • 9 Mögliche Aminosäureverknüpfungen von PCB.
  • 10 (A) Aminoacylierung von tRNA und (B) Vergleich zwischen enzymatischer und chemischer Aminoacylierung.
  • 11 Die vier grundlegenden Schritte bei der Isolierung von reinem Substrat mit Hilfe von PCB.
  • 12 Verfahren zum Nachweis von Zielprotein und seines Antikörpers mit Hilfe von PCB.
  • 13 PCB-Phosphoramidite und PCB-Nucleotide.
  • 14 Zwei Verfahren (A und B) zur Isolierung eines PCR-Produkts mit Hilfe von PCB.
  • 15 Vergleich von Verfahren zum Aufbau einer cDNA-Bibliothek (A) mit PCB und (B) ohne PCB.
  • 16 PCB-Lipide.
  • 17 Immunoselektive Zelltrennung mit Hilfe von PCB.
  • 18 Synthese eines photolytisch spaltbaren Biotin-NHS-Esters, Verbindung 18.
  • 19 Synthese eines photolytisch spaltbaren Biotin-NHS-Esters, Verbindung 25.
  • 20 Verfahren zum sequentiellen ELISA mit Hilfe von PCB.
  • 21 Synthese von photolytisch abspaltbarem Cumarin.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Wie sie hier verkörpert und ausführlich beschrieben ist, betrifft die vorliegende Erfindung Konjugate, die beim Nachweis und bei der Isolierung von Targets, wie Chemikalien, Makromolekülen, Zellen und beliebiger identifizierbarer Substanzen, aus einem Gemisch verwendet werden. Agentien umfassen eine nachweisbare Struktureinheit, die an eine photoreaktive Struktureinheit gebunden ist. Konjugate umfassen Agentien, die durch eine oder mehrere kovalente Bindungen, welche aufgrund der Anwesenheit der photoreaktiven Struktureinheit mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden können, an Substrate gekoppelt sind. Die Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zur Isolierung und zum Nachweis von Targets unter Verwendung dieser Agentien und Konjugate, auf Kits, die diese Verfahren verwenden, zum Nachweis von Krankheiten oder Störungen bei Patienten, und auf Verfahren zum Nachweis und zur Isolierung fast jeder beliebigen Substanz aus einem heterologen Gemisch.
  • Es gibt viele Verfahren, die zur Zeit zum Nachweis und zur Isolierung einer gewünschten Substanz oder eines Targets aus einem komplexen Gemisch zur Verfügung stehen. Die meisten dieser Verfahren erfordern die spezifische Markierung der nachzuweisenden Substanz oder des nachzuweisenden Targets, den Nachweis dieser Markierung und die anschließende Entfernung der Markierung von dem Target. Obwohl sie geradlinig sind, sind die derzeitigen Nachweis- und Isolierungsmethoden mit mehreren Problemen verbunden. Zum Beispiel ist es häufig schwierig, ein Target spezifisch an eine Markierung zu binden. Die Affinität der Markierung zu dem Target kann gering sein, es sind auf speziellen Substanzen möglicherweise keine geeigneten Befestigungspunkte verfügbar, und die Markierung und das Target können einfach chemisch oder physikalisch unverträglich sein. Außerdem kann die Markierung die funktionelle Aktivität des Targets behindern oder völlig zerstören und dadurch den Zweck der Isolierung zunichte machen. Isolierte Targets sind unvermeidlich kontaminiert oder aufgrund der Anwesenheit einer toxischen oder schädigenden Markierung inaktiviert. Ein typisches Beispiel für diese Art von Problem ist die Isolierung von Zellen, an die nach einer Selektion durch Kopplung an Streptavidin Biotin gebunden ist. Wegen der starken Affinität von Biotin zu Streptavidin ist das Isolierungsverfahren relativ geradlinig und spezifisch, doch sind die isolierten Zellen häufig tot und sterben aufgrund der toxischen Wirkungen der Kopplungsagentien oder der harten Isolierungsverfahren. Dies gilt auch, wenn man versucht, aktive Proteine zur späteren Verwendung aus biologischen Proben und anderen komplexen Gemischen zu isolieren. Durch die Anwesenheit von Markierung kann das Proteinprodukt denaturiert oder inaktiv oder einfach unannehmbar für die in-vivo-Verwendung unter derzeitigen FDA-Normen und -Richtlinien sein. Durch die Entfernung des Agens werden diese Probleme zuweilen überwunden, doch die Verfahren zum Abtrennen und Entfernen der Markierung aus dem Target sind im Allgemeinen ziemlich hart, erfordern einen erheblichen Zeit-, Mühen- und Kostenaufwand und führen meistens zu recht geringen Ausbeuten des Endprodukts. Die Lebensfähigkeit und die funktionelle Aktivität des Targets ist häufig stark beeinträchtigt und häufig zerstört.
  • Die Erfindung überwindet diese Probleme, indem sie nachweisbare bioreaktive Agentien bereitstellt, die Targets nachweisen und isolieren können. Agentien, die zur Bildung eines Konjugats der Erfindung verwendet werden können, umfassen eine nachweisbare Struktureinheit und eine photoreaktive Struktureinheit, und sie können kovalent mit einer Vielzahl von Zielsubstraten gekoppelt sein. Eine kovalente Bindung zwischen Agens und Substrat kann aus einer Vielzahl von chemischen Struktureinheiten einschließlich Aminen, Hydroxygruppen, Imidazolen, Aldehyden, Carbonsäuren, Estern und Thiolen gebildet werden. Agens-Substrat-Kombinationen werden hier als Konjugate bezeichnet. Durch die Anwesenheit der nachweisbaren Struktureinheit können Konjugate schnell und genau nachgewiesen und das Target isoliert werden. Weiterhin lassen sich diese Konjugate selektiv spalten, was bei Isolierungsverfahren einzigartige Vorteile bietet. Das Substrat kann schnell und effizient vom Agens getrennt werden. Komplexe technische Verfahren und gut ausgebildete Experten sind erforderlich. Es brauchen nicht für jedes neue Target, das isoliert werden soll, neue Bindungs- und Trennverfahren entwickelt zu werden. Nach der Isolierung ist es relativ einfach, das Konjugat mit elektromagnetischer Strahlung zu behandeln und das Substrat freizusetzen. Das freigesetzte Substrat ist vorzugsweise funktionell aktiv und strukturell unverändert. Dennoch können je nach dem Punkt der Anbindung kleinere chemische Veränderungen in der Struktur vorkommen. Im Allgemeinen ist bevorzugt, dass solche Veränderungen die funktionelle Aktivität nicht beeinflussen. Wenn die funktionelle Aktivität nicht erhalten zu werden braucht, spielen solche Veränderungen keine Rolle und können sogar nützlich sein, um nach den Verfahren der Erfindung isolierte Targets zu identifizieren und zu unterscheiden.
  • Targets, wie der Ausdruck hier verwendet wird, sind solche Substanzen, die unter Verwendung der Agentien, Konjugate und Verfahren der Erfindung identifiziert, charakterisiert oder isoliert werden. Substrate, wie der Ausdruck hier verwendet wird, sind solche Substanzen, die kovalent an das bioreaktive Agens gebunden sind. Substrate können auch als Targets bezeichnet werden, wenn das Target, das identifiziert wird, spezifisch an das bioreaktive Agens bindet.
  • Ein bioreaktives Agens kann eine nachweisbare Struktureinheit umfassen, die an eine photoreaktive Struktureinheit gebunden ist, wobei die photoreaktive Struktureinheit wenigstens eine Gruppe enthält, die unter Bildung eines Konjugats kovalent an ein Substrat binden kann. Das resultierende Konjugat kann selektiv gespalten werden, so dass das Substrat freigesetzt wird oder alternativ dazu irgendeine chemische Gruppe oder ein Agens des Konjugats freigesetzt wird. Die Spaltung, wie der Ausdruck hier verwendet wird, erfolgt durch photolytische Spaltung oder durch ein Spaltungsereignis, das durch die Anwendung von Strahlung auf das Konjugat ausgelöst wird. Die angewendete Strahlung kann eine oder mehrere Wellenlängen aus dem elektromagnetischen Spektrum umfassen, einschließlich Röntgenstrahlen (etwa 0,1 nm bis etwa 10,0 nm; oder etwa 1018 bis etwa 1016 Hz), ultraviolette (UV) Strahlen (etwa 10,0 nm bis etwa 380 nm; oder etwa 8·1016 bis etwa 1015 Hz), sichtbares Licht (etwa 380 nm bis etwa 750 nm; oder etwa 8·1014 bis etwa 4·1014 Hz), infrarotes Licht (etwa 750 nm bis etwa 0,1 cm; oder etwa 4·1014 bis etwa 5·1011 Hz), Mikrowellen (etwa 0,1 cm bis etwa 100 cm; oder etwa 108 bis etwa 5·1011 Hz) und Radiowellen (etwa 100 cm bis etwa 104 m; oder etwa 104 bis etwa 108 Hz). Es können auch mehrere Formen von Strahlung gleichzeitig, in Kombination oder schrittweise koordiniert angewendet werden. Die Strahlungseinwirkung kann über einen Zeitraum von Sekunden, Minuten oder Stunden konstant sein oder mit Pulsen mit vorbestimmten Abständen variiert werden.
  • Typischerweise wird die Strahlungsquelle in einem speziellen Abstand von dem zu bestrahlenden Konjugat platziert. Dieser Abstand kann empirisch bestimmt oder aus dem zwischen der Quelle und der bestrahlten Probe erzeugten Energieverlust und der von der Quelle emittierten Energiemenge berechnet werden. Das Konjugat kann in Lösung vorliegen oder an einen festen Träger gebunden sein, bei dem es sich um eine Art von Glas-, Keramik-, Polymer- oder Halbleiteroberflächen handeln kann. Typische feste Träger sind Nitrocellulosemembranen, Agarosekügelchen, magnetische Kügelchen, die mit Streptavidin beschichtet sind, Halbleiteroberflächen und Harze. Vorzugsweise handelt es sich bei der angewendeten Strahlung um UV-, sichtbare oder IR-Strahlung mit einer Wellenlänge von etwa 200 nm bis etwa 1000 nm, besonders bevorzugt von etwa 260 nm bis etwa 600 nm und besonders bevorzugt von etwa 300 nm bis etwa 500 nm. Strahlung wird kontinuierlich oder in Form von Pulsen während Stunden, Minuten oder Sekunden und vorzugsweise während der kürzestmöglichen Zeitspanne, um jede Gefahr einer Beschädigung des Substrats zu minimieren, und aus Zweckmäßigkeit verabreicht. Die Strahlung kann weniger als etwa eine Stunde lang, vorzugsweise weniger als etwa 30 Minuten lang, besonders bevorzugt weniger als etwa zehn Minuten lang und ganz besonders bevorzugt weniger als etwa eine Minute lang verabreicht werden. Sichtbare, UV- und IR-Strahlung sind auch deshalb bevorzugt, weil diese Strahlungsformen alle drei bequem und kostengünstig aus kommerziell erhältlichen Quellen erzeugt werden können.
  • Die Leistungsdichte oder Intensität des Lichts pro Fläche, die notwendig ist, um die kovalente Bindung selektiv zu spalten, ist sehr gering, so dass der photolytische Spaltungsvorgang praktizierbar ist. Durch die Maximierung der Effizienz wird auch die Belichtungszeit minimiert, die notwendig ist, um eine selektive Spaltung zu erreichen und ein Minimum an unerwünschten Hintergrundeffekten zu ergeben.
  • Ein Teil des bioreaktiven Agens ist die nachweisbare Struktureinheit. Die nachweisbare Struktureinheit ist eine chemische Gruppe, Struktur oder Verbindung, die eine spezifisch identifizierbare physikalische Eigenschaft hat, die von den physikalischen Eigenschaften anderer Substanzen, die in dem heterologen Gemisch vorhanden sind, unterscheidbar ist. Fluoreszenz, Phosphoreszenz und Lumineszenz einschließlich Elektrolumineszenz, Chemilumineszenz und Biolumineszenz sind allesamt nachweisbare physikalische Eigenschaften, die man bei den meisten Substanzen nicht findet, die aber bekanntermaßen bei anderen vorkommen oder induzierbar sind. Zum Beispiel sind reaktive Derivate von Dansyl, Cumarinen, Rhodamin und Fluorescein allesamt inhärent fuoreszent, wenn sie mit Licht einer speziellen Wellenlänge angeregt werden, und können spezifisch an andere Substanzen gebunden werden. Cumarin hat eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute, höher als selbst eine Dansyl-Struktureinheit, was den Nachweis erleichtert, wenn sehr geringe Mengen an Target gesucht werden. Cumarin ist strukturell ähnlich wie Tryptophan, was zum Beispiel bei der Translation naszierender Proteine mit nichtnativen Aminosäuren von Nutzen sein kann. Es kann auch von Nutzen sein, bestimmte nachweisbare Struktureinheiten miteinander zu kombinieren, um den Nachweis oder die Isolierung zu erleichtern. Vorzugsweise ist die nachweisbare Struktureinheit eine fluoreszierende Verbindung, und die bevorzugten fluoreszierenden Verbindungen sind in Tabelle 3 aufgelistet; sie alle sind kommerziell erhältlich (Sigma Chemical; St. Louis, MO).
  • Tabelle 3: Fluoreszente Markierungsverbindungen
    • 4-Acetamido-4'-isothiocyanatostilben-2,2'-disulfonsäure
    • 7-Amino-4-methylcumarin (AMC)
    • 7-Amino-4-trifluormethylcumarin
    • N-(4-Anilino-1-naphthyl)maleimid
    • 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)
    • 5-(4,6-Dichlortriazin-2-yl)aminofluorescein (DTAF)
    • 4,4'-Diisothiocyanatostilben-2,2'-disulfonsäure
    • Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC)
    • Chinolizinofluoresceinisothiocyanat (QFTTC)
    • Dansylchlorid Eosinisothiocyanat
    • Erythrosin B Fluorescamin
    • Fluorescen Fluorescein-Derivate
    • 4-Methylumbelliferon o-Phthaldialdehyd
    • Rhodamin B Rhodamin-B-Derivate
    • Rhodamin 6G Rhodamin 123
    • Sulforhodamin B Sulforhodamin 101
    • Sulforhodamin-101-säurechlorid
  • Lumineszenz kann auch bei bestimmten Chemikalien, die als Luciferine bezeichnet werden, induziert werden. Energiereiche Moleküle, wie ATP, liefern chemische Energie für katalytische Aktivitäten von Luciferase-Enzymen, was bewirkt, dass die Luciferine Licht emittieren. Reagentien sowohl für das bakterielle Luciferase-System (Vibrio harveyi oder V. fischeri) als auch für das Leuchtkäfer-Luciferase-System (Photinus pyralis) sind aus einer Vielzahl von kommerziellen Quellen erhältlich (z. B. Sigma Chem. Co.; St. Louis, MO).
  • Vorzugsweise hat das lumineszente Agens eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute bei einer Anregungswellenlänge, die von derjenigen verschieden ist, die man zur Durchführung der photolytischen Spaltung verwendet. Nach der Anregung bei solchen Wellenlängen ist das Agens in niedrigen Konzentrationen entweder visuell oder unter Verwendung von herkömmlichen Lumineszenzdetektoren und Fluoreszenzspektrometern nachweisbar. Elektrolumineszenz, die durch Agentien wie Rutheniumchelate und ihre Derivate oder durch Agentien, die Nitroxid-Struktureinheiten und ähnliche Derivate aufweisen, erzeugt wird, ist bevorzugt, wenn man eine extreme Empfindlichkeit wünscht (J. DiCesare et al., BioTechniques 15: 152–59, 1993). Diese Agentien sind im Femtomolarbereich und darunter nachweisbar.
  • Das Anlegen eines elektrischen Felds induziert bei bestimmten Chemikalien auch eine nachweisbare Reaktion aufgrund einer elektrischen Nettoladung, die eine Migration des Substrats in einem elektrischen Feld induziert. Magnetismus kann ebenfalls eine nachweisbare Eigenschaft sein, wenn eine magnetisierte Substanz wie Eisen oder ein anderes magnetisiertes Metall die nachweisbare Struktureinheit oder mit dieser assoziiert ist.
  • Weitere Formen von nachweisbaren physikalischen Eigenschaften sind eine identifizierbare elektrische Polarisierbarkeit, Elektronenspinresonanz und Raman-Streuung. Agentien können auch eine chemische, biochemische, enzymatische, elektrochemische oder photochemische Reaktion, wie eine Farbänderung, als Reaktion auf äußere elektromagnetische Felder oder die Einführung anderer Substanzen eingehen. Bei diesen elektromagnetischen Feldern und Substanzen kann es sich um einen Katalysator oder ein anderes Reaktantenmolekül handeln, das den Nachweis des bioreaktiven Agens ermöglicht oder das Agens in eine nachweisbare Struktureinheit umwandelt.
  • Alle diese Markierungsmittel können unter Verwendung eines geeigneten Detektors oder Nachweissystems, wie eines Spektrometers oder von elektrophoretischen oder chromatographischen Systemen, spezifisch nachgewiesen werden. Zuweilen kann ein visuell unterscheidbares Nachweissystem vorzuziehen sein, wie eines, das eine photoelektrische Zelle auslöst, oder eines, das manuell nachgewiesen und aufgezeichnet werden kann. Spektrometer einschließlich Absorptions- und Fluoreszenzspektrometern sind sehr empfindliche Detektoren spezifischer Absorptionen und Emissionen von vielen nachweisbaren Struktureinheiten. Der Nachweis und das Sortieren des Targets können automatisiert sein, wie im Falle von Fluoreszenz-aktivierten Zellsortern (FACS), die Zellen mit einem Fluoreszenzmarker nachweisen und isolieren. Targets können auch manuell nachgewiesen und sortiert werden, bei magnetisierten Konjugaten zum Beispiel ganz einfach mit Hilfe eines Magneten.
  • Weitere physikalische Eigenschaften, die leicht und genau nachgewiesen werden können, sind Farbigkeit (z. B. violett = etwa 400–430 nm, blau = etwa 450–500 nm, grün = etwa 550 nm, gelb = etwa 600 nm, orange = etwa 650 nm, rot = etwa 700–750 nm), elektromagnetische Extinktion, Enzymaktivität oder die Fähigkeit, spezifisch an ein Kopplungsagens zu binden. Zu den geeigneten Kopplungsagentien gehören Biotin, Avidin, Streptavidin, Nucleinsäuren, nucleinsäure- und lipidbindende Proteine, Haptene, Antikörper, Rezeptoren, Kohlenhydrate, immunogene Moleküle sowie Derivate und Kombinationen davon. Die nachweisbare Struktureinheit kann eine Kombination dieser Eigenschaften aufweisen, was es ermöglicht, sie aus einer Vielzahl von Hintergrundmaterialien zu selektieren. Einige Beispiele für die chemischen Strukturen von photolytisch abspaltbaren Agentien der Erfindung sind in 1 abgebildet.
  • Eine weitere bevorzugte nachweisbare Struktureinheit ist ein Kopplungsagens, und das bevorzugte Kopplungsagens ist Biotin oder ein Biotinderivat. Biotin enthaltende bioreaktive Agentien werden hier als photolytisch abspaltbare Biotine oder PCBs bezeichnet. Die Bindung zwischen dem Eiklarprotein Avidin, einem tetrameren Protein, das man in Vogeleiern findet, und dem wasserlöslichen Vitamin Biotin ist eine der stärksten Wechselwirkungen, die in der Biologie bekannt sind, mit einer Assoziationskonstante (Ka) von etwa 1015 M–1, die die von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen übertrifft (M. Wilchek und E. A. Bayer, Methods Enzymol. 184, 1990). Das bakterielle Gegenstück zu Avidin ist Streptavidin, das man in Streptomyces avidinii findet und das geringfügig spezifischer für Biotin ist als Avidin. Diese starke Wechselwirkung führte zusammen mit der Fähigkeit, Biotin kovalent mit einer Vielzahl von Substraten einschließlich Proteinen, Nucleinsäuren, Lipiden und Rezeptorliganden, wie Neuropeptiden und Hormonen, zu verknüpfen, zu einer großen Palette von Verwendungen für diese Kopplungsmittel, die alle unter Verwendung von PCB verbessert oder verstärkt werden können.
  • Eine Vielzahl von Biotinyl-Struktureinheiten kann verwendet werden, um ein PCB-Molekül zu bilden. Biotin (C10H16N2O3S) hat ein Molekulargewicht von 244,31 Dalton und besteht aus einem Ring, der mit einer Alkylkette verknüpft ist, die mit einer Carboxygruppe endet. Zahlreiche Modifikationen können an der Biotin-Struktureinheit vorgenommen werden; dazu gehören Änderungen im Ring, im Spacer-Arm und in der Endgruppe, von denen alle noch eine hohe Affinität zu Streptavidin, Avidin und ihren Derivaten aufweisen. Beispiele für photolytisch abspaltbare Biotine, die auf der Grundlage verschiedener photoreaktiver Struktureinheiten entworfen werden können, sind in 2 gezeigt.
  • Der Nachweis und die Isolierung von chemischen, biochemischen und biologischen Materialien unter Verwendung der Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin beruht normalerweise auf der Immobilisierung von Avidin oder Streptavidin auf einer Oberfläche (z. B. Membranen, Gelen, Filtern, Mikrotiternäpfen, Magnetkügelchen). Auf diese Oberfläche wird eine Lösung aufgetragen, die Biotin enthält, das an Targets gekoppelt ist, die dann an die streptavidinbeschichtete Oberfläche binden. Biotinhaltige Targetmoleküle können isoliert und nichtbiotinylierte Komponenten weggewaschen werden. Alternativ dazu können auch biotinylierte Targetmoleküle aus einem heterogenen Gemisch abgetrennt werden, wobei man streptavidinhaltige Affinitätssäulen verwendet. Biotinylierte Makromoleküle einschließlich Nucleinsäuren (DNA oder RNA), Proteinen und proteinhaltigen Komplexen und sogar Zellen, deren Oberfläche biotinyliert oder an einen biotinylierten Antikörper gebunden wurde, können mit diesen Techniken nachgewiesen und isoliert werden.
  • Wie gesagt, kann Biotin an eine Vielzahl von Molekülen einschließlich Proteinen, Kohlenhydraten und Nucleinsäuren gekoppelt werden. Durch die Verfügbarkeit von Biotinderivaten wurde dieser Bereich noch weiter ausgedehnt. Zum Beispiel wurden Biotinderivate mit Funktionen hergestellt, die reaktiv gegenüber Aminen, Phenolen, Imidazolen, Aldehyden, Carbonsäuren und Thiolen sind. Biotin kann auch in Proteine, DNA und RNAA eingebaut werden, indem man das Biotin zuerst an Bausteine von Makromolekülen, wie Aminosäuren oder Nucleotide, bindet, die direkt an diese Moleküle gebunden oder während ihrer Synthese durch chemische oder enzymatische Mittel eingebaut werden können.
  • Im Unterschied zu herkömmlichen Biotinen ermöglichen es photolytisch abspaltbare Biotine, das gebundene Substrat in völlig unmodifizierter Form von dem immobilisierten Avidin, Streptavidin oder ihren Derivaten freizusetzen oder zu eluieren. Dies ist äußerst nützlich und aus mehreren Gründen eine wichtige Verbesserung gegenüber bestehenden Biotinen. Die Biotinylierung des Targetmaterials kann seine anschließende Verwendung oder Charakterisierung behindern. Die Biotinylierung eines Proteins kann seine Aktivität, elektrophoretische Beweglichkeit, Fähigkeit zur Bindung eines Substrats, Antigenität, Fähigkeit zur Rekonstitution zu einer nativen Form und Fähigkeit zur Bildung von Komplexen mit mehreren Untereinheiten verändern. Bei Verwendung von photolytisch abspaltbarem Biotin dagegen werden alle nativen Eigenschaften und Funktionen zur weiteren Verwendung und Charakterisierung in ihrer nativen Form zurückgebildet, sobald das Biotin photolytisch von dem Protein oder Proteinbindungskomplex abgespalten ist. In Tabelle 4 sind einige der Substrate aufgeführt, mit denen ein photolytisch abspaltbares Agens wie PCB verknüpft werden kann.
  • Tabelle 4: Chemische Bindung von photolytisch abspaltbaren Biotinen mit verschiedenen Molekülen
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  • Es gibt mehrere chemische Struktureinheiten, die in bioreaktiven Agentien und Konjugaten der Erfindung verfügbar sind. Zum Beispiel ist eine in PCB eingeführte NHS-Ester-Funktion hochreaktiv und kann selektiv mit aliphatischen Aminogruppen reagieren, die in Proteinen vorhanden sind. Ein weiteres Beispiel ist eine Phosphoramidit-Struktureinheit, die hochreaktiv ist und selektiv mit Hydro xygruppen von Nucleinsäuren reagieren kann. In Fällen, bei denen chemische Struktureinheiten wie Carboxy- (-COOH) oder Phosphatgruppen einer Modifikation bedürfen, kann ein Vorläufer von PCB in Form des Stammalkohols verwendet werden, um geeignete Bindungen des Estertyps zu bilden. Diese Derivate können chemisch mit einer Vielzahl von Makromolekülen und molekularen Komponenten einschließlich Aminosäuren, Nucleotiden, Proteinen und Polypeptiden, Nucleinsäuren (DNA, RNA, PNA), Lipiden, Hormonen und Molekülen, die als Liganden für Rezeptoren fungieren, verknüpft sein.
  • Die Anwendung der Biotin-Avidin-Technik zum Nachweis und zur Isolierung von chemischen und biologischen Materialien wurde auch durch die Verwendung von Bindungsmolekülen verbreitert, die man zuerst biotinyliert und dann selektiv mit dem zu isolierenden Zielmolekül wechselwirken lässt. Die Isolierung des Zielmoleküls oder der Zelle wird durch die Bindung des biotinylierten Bindungskomplexes an die streptavidinhaltige Säule oder an die streptavidinbeschichteten Magnetkügelchen erleichtert. Zu den Bindungsmolekülen gehören Antikörper, die selektiv an spezifische Antigene binden, DNA-Sonden, die selektiv an spezifische DNA-Sequenzen binden, und Liganden, die selektiv an spezifische Rezeptoren binden. Dieser Ansatz wurde verwendet, um eine Vielzahl von Makromolekülen und Zellen zu isolieren (Tabellen 2 und 3). Solche Isolierungsverfahren erfordern jedoch, dass das biotinylierte Target von dem gebundenen Streptavidin freigesetzt wird. Das Aufbrechen dieser Bindung erfordert typischerweise nichtphysiologische Bedingungen, wie niedrigen pH und hohe Konzentration an Guanidinium-HCl, was für das Zielmolekül oder die Zielzelle gewöhnlich schädigend ist. Selbst nach dem Aufbrechen der Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung bleibt das Ziel- oder Bindungsmolekül teilweise oder vollständig biotinyliert, was spätere Verwendungen stören kann. Weiterhin sind die Elutionsbedingungen nichtphysiologisch und können ebenfalls zerstörerisch auf das Zielmolekül oder die Zielzelle wirken. Dagegen kann das Substrat bei Verwendung von photolytisch abspaltbaren Biotinen schnell und leicht mit wenig oder keiner Wirkung auf die Konformation oder Aktivität des Substrats vom Biotin abgespalten werden.
  • Die Verwendung von PCB in einem der gewöhnlichen Nachweis- und Reinigungsverfahren einschließlich der oben diskutierten stellt eine erhebliche Ersparnis an Zeit, Energie und letztlich Kosten dar. Außerdem sind eine Vielzahl von Derivaten von Avidin und Streptavidin kommerziell erhältlich, die durch chemische oder genetische Mittel modifiziert wurden. Dieselben Derivate können auch mit PCB verwendet werden. Ein Beispiel dafür ist ImmunoPure NeutrAvidin, das kommerziell vertrieben wird (Pierce Chemical; Rockford, IL). Dieses Protein ist ein modifiziertes Avidinderivat, das deglycosyliert wurde und die RYD-Domäne, die als universelle Erkennungssequenz für viele Zellrezeptoren dient, nicht enthält. Die unspezifische Adsorption an andere Proteine und Zelloberflächen ist stark reduziert.
  • Die hauptsächlichen molekularen Elemente eines photolytisch abspaltbaren Biotins (PCB) sind eine photoreaktive Struktureinheit und eine Biotinyl-Struktureinheit, die die nachweisbare Struktureinheit bildet (3). Die photoreaktive Struktureinheit und die Biotinyl-Struktureinheit sind über einen Spacer-Arm unter Bildung des PCB-Moleküls miteinander verknüpft. Die photoreaktive Struktureinheit enthält einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring, der mit Funktionen derivatisiert ist, die durch X, Y und A-C(O)-G dargestellt werden, wobei X eine Verknüpfung von PCB mit dem biomolekularen Substrat ermöglicht. In der bevorzugten Ausführungsform stellt Y ein Substitutionsmuster an einem Phenylring dar, der einen oder mehrere Substituenten, wie Nitro- oder Alkoxygruppen, enthält. Die Funktion W stellt die Gruppe dar, die eine Verknüpfung der Vernetzer-Struktureinheit mit der photoreaktiven Struktureinheit ermöglicht. Der Zweck des Spacer-Arms besteht darin, die Zugänglichkeit der Biotin-Struktureinheit für eine effektive Wechselwirkung mit Streptavidin zu erhöhen und dadurch die Bindungseffizienz zu erhöhen. Typischerweise können diese aufgebaut werden, indem man entweder lange Alkylketten verwendet oder mehrere Repetiereinheiten von Caproyl-Struktureinheiten, die über Amidbindungen miteinander verknüpft sind, verwendet.
  • Die Wahl der photolabilen Gruppe, des Spacer-Arms und der Biotinyl-Struktureinheit hängt ab vom Zielsubstrat einschließlich der Aminosäuren, Proteine, Antikörper, Nucleotide, DNA oder RNA, Lipide, Kohlenhydrate und Zellen, an die das photolytisch abspaltbare Biotin gebunden werden soll. Sie hängt auch von den genauen Bedingungen der photolytischen Spaltung und der gewünschten Wechselwirkung zwischen der Biotinyl-Struktureinheit und Streptavidin, Avidin oder ihren Derivaten ab. Einige der verschiedenen Wahlmöglichkeiten für die photolabile Gruppe und die Linker-Arme für PCB sind in 2 gezeigt.
  • Weitere Typen von Kopplungsmitteln sind Antikörper, Antikörperfragmente und Antigene. Antikörper haben den Vorteil, dass sie mit großer Spezifität an ihr jeweiliges Antigen binden können. Substrate, die Antigene sind, können anhand ihrer Fähigkeit nachgewiesen werden, spezifisch an verfügbare Antikörper oder an Antikörper, die leicht erzeugt werden können, zu binden. Geeignete Antikörper oder Antikörperfragmente können monoklonal oder polyklonal sein und gehören vorzugsweise zur Klasse IgG, können aber auch zu den Klassen IgM, IgA, IgD oder IgE gehören. Andere bevorzugte nachweisbare Struktureinheiten sind Nucleinsäuren. Kurze Sequenzen von RNA oder DNA oder Oligonucleotide mit einer Länge von vorzugsweise weniger als etwa dreißig Nucleotiden und sogar nur vier bis zehn Nucleotiden können anhand ihrer Fähigkeit nachgewiesen werden, spezifisch mit einer komplementären Nucleinsäure zu hybridisieren, und können direkt oder indirekt unter Verwendung von PCR, die eine spezifische Sequenz, die anschließend nachgewiesen wird, stark amplifiziert, nachgewiesen werden. In ähnlicher Weise sind auch Bindungsproteine und Rezeptor-Ligand-Kombinationen als nachweisbare Markierungen geeignet.
  • Die zweite Komponente des bioreaktiven Agens ist die photoreaktive Struktureinheit. Die photoreaktive Struktureinheit ist eine chemische Struktureinheit, die mit einem Substrat eine oder mehrere kovalente Bindungen bilden kann, die mit elektromagnetischer Strahlung gespalten werden können. Diese Bindungen können mit einer chemischen Gruppe auf dem Substrat, wie zum Beispiel einem Amin, Phenol, Imidazol, Aldehyd, einer Carbonsäure oder einem Thiol, gebildet werden. Das photoreaktive Agens ist ein substituierter aromatischer Ring, der wenigstens eine mehratomige Gruppe und gegebenenfalls eine oder mehrere einatomige Gruppen enthält. Der aromatische Ring ist vorzugsweise ein fünf- oder sechsgliedriger Ring. Die Substitutionen umfassen die mehratomigen und wahlfreien einatomigen Gruppen. Die mehratomige Gruppe sorgt für Elektronenkanalisierungseigenschaften, um Elektronen zu bestimmten Orten innerhalb der chemischen Struktur anzuziehen oder abzustoßen, wodurch die Bedingungen zur Schaffung der selektiv spaltbaren kovalenten Bindungen geschaffen oder etabliert werden. Einige einatomige Gruppen, wie Halogenide, können die Frequenz oder Wellenlänge der elektromagnetischen Strahlung, die die Spaltung induziert, anpassen. Als solche sorgen einatomige Gruppen für eine Feinabstimmung des Spaltungsereignisses und sensibilisieren so Konjugate für vorbestimmte Frequenzen oder Strahlungsintensitäten.
  • Eine Klasse von photoreaktiven Struktureinheiten sind 2-Nitrobenzyl-Derivate. In ihrem Grundzustand haben Agentien und Konjugate auf 2-Nitrobenzyl-Basis eine intramolekulare Wasserstoffbrücke zwischen benzylischem Wasserstoff und der ortho-Nitrogruppe (-CH···O2N)(B. Brzezinski et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2: 2257–61, 1992). Bei Bestrahlung mit Wellenlängen von über 300 nm erfahren diese chemischen Verbindungen einen Übergang zu einem angeregten Zustand. Es erfolgt eine Protonenübertragungsreaktion vom benzylischen Kohlenstoffatom zum Sauerstoff in der Nitrogruppe und anschließend eine Elektronenverschiebung (4). Diese Reaktion führt zur Bildung einer instabilen Spezies, die Aci-Nitro-Ion genannt wird und die sich in schnellem Gleichgewicht mit einer cyclischen Form befindet. In der cyclischen Zwischenstufe erfolgen eine Elektronenverschiebung und Sauerstoffübertragung vom Stickstoff auf den benzylischen Kohlenstoff, was zur Bildung von 2-Nitroso-Derivaten und zur Freisetzung eines Substrats, das eine gute Abgangsgruppe ist, führt (J. A. McCray et al., Annu. Rev. Biophys. Chem. 18: 239–70, 1989).
  • Die chemische Synthese von PCB-NHS-Ester beinhaltet drei Hauptschritte: (1) Erzeugung der photoreaktiven Struktureinheit, zum Beispiel 5-Methyl-2-nitroacetophenon. (2) Erzeugung einer geeigneten Aminogruppe und Bindung an einen biotinhaltigen Spacer. (3) Erzeugung von Hydroxygruppen und Derivatisierung als N-Hydroxysuccinimidylcarbonat (NHS-Ester). Diese Schritte sind in 5 schematisch dargestellt.
  • Bioreaktive Agentien können auch auf der Grundlage anderer photoreaktiver Struktureinheiten synthetisiert werden. Chemische Synthesen von zwei anderen Klassen von photolytisch abspaltbaren Struktureinheiten, 3,5-Dimethoxybenzyl und 2-Nitrobenzolsulfenyl (2), kann unter Verwendung von ähnlichen Synthesestrategien durchgeführt werden. Diese 2-Nitrobenzylgruppen enthalten alle eine benzylische Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung in ortho-Stellung zu einer Nitrogruppe, was für ihre Photolabilität notwendig ist. Bei der Entwicklung dieser photolabilen Gruppen als Schutzgruppen traten Schwierigkeiten auf, da die anschließenden Reaktionen dieser Carbonylverbindungen zur Bildung von gekoppelten Azoverbindungen führten, die als interne Lichtfilter wirken (V. N. R. Pillai, Synthesis 1, 1980). Diese Komplikationen wurden in der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung von α-substituierten o-Nitrobenzyl-Verbindungen überwunden. Bioreaktive Agentien, die ein nachweisbares photolytisch spaltbares Konjugat gemäß der Erfindung bilden, können zum Beispiel durch die folgende Formel dargestellt werden:
    Figure 00390001
    wobei X aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Halogen, N2, CH2-Halogen, -N=C=O, -N=C=S, -S-S-R, NC2H4, -NC4H2O2, -OH, -NHNH2, -OP(OR3)N(R4)R5 und -OCO-G besteht, wobei G aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Halogen, N3, O-Estern und N-Amiden besteht, R1, R2, R3, R4 und R5 aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Alkyl, substituiertem Alkyl, Aryl, substituiertem Aryl, -CF3, -NO2, -COOH und -COOR besteht, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können, A eine zweiwertige funktionelle Gruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -O-, -S- und -NR1- besteht; Y eine oder mehrere mehratomige Gruppen gemäß Anspruch 1 umfasst, die gleich oder verschieden sein können, V eine oder mehrere wahlfreie einatomige Gruppen gemäß Anspruch 1 umfasst, die gleich oder verschieden sein können; Q eine wahlfreie Spacer-Struktureinheit umfasst; ml und m2 ganze Zahlen von 0 bis 5 sind, die gleich oder verschieden sein können; und D eine selektiv nachweisbare Struktureinheit gemäß Anspruch 1 umfasst. Bei dem O-Ester kann es sich um Cyanomethyl, o- und p-Nitrophenyl, 2,4-Dinitrophenyl, 2,4,5-Trichlorphenyl, Pentachlorphenyl, Pentafluorphenyl, N-Hydroxyphthalimidyl, N-Hydroxysuccinimidyl, 1-Hydroxypiperidinyl, 5-Chlor-8-hydroxychinolyl, 1-Hydroxybenzotriazolyl, 3,4-Dihydro-4-oxobenzotriazin-3-yl (DHBT), 2,3-Dihydro-2,5-diphenyl-3-oxothiophen-1,1-dioxid-4-yl (TDO), 1,2-Benzisoxazolyl, 2-Hydroxypyridyl oder Derivate oder Kombinationen davon handeln. Bei dem N-Amid handelt es sich um ein Imidazolyl, Benzimidazolyl, Benzisoxazolyl, 3,5-Dioxo-4-methyl-1,2,4-oxadiazolidinyl oder Derivate oder Kombinationen davon.
  • Zu den mehratomigen Gruppen, die an den aromatischen Ring gebunden sein können, gehören Nitrogruppen (-NO2), Sulfoxidgruppen, wie -SO3, Alkylgruppen, wie Methyl- (-CH3) und Ethylgruppen (-CH2CH3), Alkoxygruppen, wie (-OCH3) und Derivate und Kombinationen davon. Geeignete einatomige Gruppen sind Halogenide, wie Chlorid (-Cl), Fluorid (-F), Iodid (-I), Bromid (-Br) und Wasserstoff (-H). Diese Gruppen können sich auf einer der verfügbaren Positionen um den Ring herum befinden. Die Auswahl und Positionierung der mehratomigen und einatomigen Gruppen kann die Wellenlänge der elektromagnetischen Strahlung, die erforderlich ist, um eine Spaltung zu induzieren, und die Zeitdauer, während der die Strahlung angewendet werden muss, um eine effiziente Spaltung zu induzieren, beeinflussen. Die chemischen Struktureinheiten an R1, R2, R3, R4 und/oder R5 können ebenfalls die Photoreaktion beeinflussen.
  • Es ist zuweilen nützlich, eine Spacer-Struktureinheit in das Agens einzubinden, die zwischen der photoreaktiven Struktureinheit und der nachweisbaren Struktureinheit gebunden ist. Die Anwesenheit des Spacers kann für die Substratbin dung sterisch vorteilhaft sein. Die Spacer-Struktureinheit (Q) kann einen verzweigten oder geradkettigen Kohlenwasserstoff, ein polymeres Kohlenhydrat oder ein Derivat oder eine Kombination davon umfassen. Die bevorzugte Spacer-Struktureinheit wird durch die folgende Formel dargestellt:
    Figure 00410001
    wobei W und W' jeweils aus der Gruppe, die aus -C(O)-, -C(O)-NH-, -HN-C(O)-, -NH-, -O-, -S- und -CH2- besteht, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können, und n1 und n2 ganze Zahlen von 0–10 sind, die gleich oder verschieden sein können, wobei, wenn entweder n1 oder n2 = 0 ist, W und W' wahlfrei sind. Beispiele für die chemische Struktur von bioreaktiven Agentien sind in 6 abgebildet.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere photolytisch spaltbare Konjugate, die bioreaktive Agentien umfassen, welche photolytisch abspaltbar an Substrate gekoppelt sind. Konjugate haben die Eigenschaft, dass sie mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden können, wobei das Substrat freigesetzt wird. Substrate sind solche Chemikalien, Makromoleküle, Zellen und andere Substanzen, die zum Nachweis und zur Isolierung von Targets verwendet werden oder verwendet werden können. Substrate, die selektiv von Konjugaten abgespalten werden, können durch photolytische Spaltung modifiziert, aber immer noch funktionell aktiv sein, oder sie können durch die photolytische Spaltung völlig unmodifiziert aus dem Konjugat freigesetzt werden. Substrate können beliebig mit Agentien gekoppelt, entkoppelt und wieder neu gekoppelt werden.
  • Zu den geeigneten Substraten gehören Proteine, Peptide, Aminosäuren, Aminosäureanaloga, Nucleinsäuren, Nucleoside, Nucleotide, Lipide, Vesikel, Detergentien-Micellen, Zellen, Viruspartikel, Fettsäuren, Saccharide, Polysaccharide, anorganische Moleküle und Metalle. Substrate können auch Derivate und Kombinationen dieser Substanzen, wie Fusionsproteine, Protein-Kohlenhydrat- Komplexe und metallorganische Verbindungen umfassen. Substrate können auch pharmazeutische Wirkstoffe sein, wie Cytokine, Immunsystemmodulatoren, Agentien des Blutbildungssystems, rekombinante Proteine, Chemotherapeutika, Radioisotope, Antigene, Antineoplastika, Enzyme, PCR-Produkte, Rezeptoren, Hormone, Impfstoffe, Haptene, Toxine, Antibiotika, naszierende Proteine, synthetische Pharmaka sowie Derivate und Kombinationen davon.
  • Substrate können auch Targets oder ein Teil der Targets sein, wie eine Aminosäure in der Synthese von naszierenden Polypeptidketten, wobei es sich bei den Substraten um eine Aminosäure oder ein Aminosäurederivat handeln kann, die bzw. das in die wachsende Peptidkette eingebaut wird. Substrate können auch Nucleotide oder Nucleotidderivate als Vorläufer in der Synthese einer Nucleinsäure sein. Konstrukte, die zur Herstellung von synthetischen Oligonucleotid-Konjugate geeignet sind, können Phosphoramidite oder Derivate von dATP, dCTP, dTTP und dGTP und auch ATP, CTP, UTP und GTP enthalten. Die resultierenden Nucleinsäure-Konjugate können in PCR-Techniken, in der Antisense-Therapie und für prophylaktische und diagnostische Anwendungen verwendet werden. Substrate können Targets sein, zum Beispiel wenn es möglich ist, das bioreaktive Agens in einem Gemisch spezifisch mit Substrat umzusetzen, so dass die Reaktion das Konjugat erzeugt. Solche Konjugate sind geeignet, wenn es wünschenswert ist, ein Target durch ein biologisches oder eine andere Art von System hindurch zu verfolgen, wie bei der Bestimmung der Halbwertszeit eines Pharmakons.
  • Die photolytische Spaltung von Konjugaten der Erfindung sollte vorzugsweise freigesetztes Substrat nicht schädigen oder die Substrataktivität beeinträchtigen. Proteine, Nucleinsäuren und andere Schutzgruppen, die in der Peptid- und Nucleinsäurechemie verwendet werden, sind bekanntermaßen gegenüber den meisten Strahlungswellenlängen oberhalb 300 nm stabil. PCB-Carbamate erfahren zum Beispiel eine Photolyse bei Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht (320–400 nm), was zur Freisetzung des unveränderten Substrats und von Kohlendioxid führt (7). Die Ausbeute und Belichtungszeit, die für die photolytische Freisetzung des Substrats notwendig sind, hängen stark von der Struktur der photoreaktiven Struktureinheit ab. Im Falle von unsubstituierten 2-Nitrobenzyl-PCB-Derivaten werden die Ausbeute der Photolyse und die Gewinnung des Substrats durch die Bildung von Nebenprodukten erheblich reduziert, welche als interne Lichtfilter wirken und in der Lage sind, mit Aminogruppen des Substrats zu reagieren. In diesem Fall variieren die Bestrahlungszeiten von etwa 1 Minute bis etwa 24 Stunden, vorzugsweise weniger als 4 Stunden, besonders bevorzugt weniger als zwei Stunden und ganz besonders bevorzugt weniger als eine Stunde, und die Ausbeuten betragen etwa 1% bis etwa 95% (V. N. R. Pillai, Synthesis, 1980). Im Falle von alpha-substituierten 2-Nitrobenzyl-Derivaten (Methyl, Phenyl) gibt es eine beträchtliche Zunahme der Geschwindigkeit der photolytischen Entfernung sowie der Ausbeute an freigesetztem Substrat (J. E. Baldwin et al., Tetrahedron 46: 6879, 1990; J. Nargeot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2395, 1983).
  • Die Wahl eines besonderen bioreaktiven Agens hängt davon ab, welche molekularen Gruppen des Substrats derivatisiert werden sollen. Zum Beispiel führt die Reaktion eines photolytisch abspaltbaren Biotin-NHS-Esters mit einem Protein zur Bildung einer kovalenten Bindung mit primären Aminogruppen, wie an der ε-Position von Lysinresten oder der α-NH2-Gruppe am N-Terminus eines Proteins. Normalerweise sind mehrere Lysinreste an der Oberfläche eines Proteins exponiert und stehen für eine solche Reaktion zur Verfügung. Alternativ dazu können auch mehrere andere photolytisch abspaltbare Biotine verwendet werden, die mit Hydroxygruppen (-OH), die in Tyrosin-, Threonin- und Serinresten vorhanden sind, Carboxygruppen (-COOH), die in Aspartat- und Glutamatresten vorhanden sind, und Sulfhydrylgruppen (-SH), die in Cysteinresten vorhanden sind, reagieren (Tabelle 4). So steht eine Vielzahl von Gruppen zur Verfügung, die wahrscheinlich an der Oberfläche eines Zielproteins vorhanden sind.
  • Die Bindung von photolytisch abspaltbarem Biotin an Moleküle, die Proteine binden, wie Rezeptorliganden, Hormone, Antikörper, Nucleinsäuren und Proteine, die Glycoproteine binden, kann wegen der Vielzahl von reaktiven Gruppen, die für photolytisch abspaltbare Biotine zur Verfügung stehen, ebenfalls bewerkstel ligt werden. Zum Beispiel kann photolytisch abspaltbares Biotin zweckmäßigerweise mit Antikörpern verknüpft werden, die gegen ein besonderes Protein gerichtet sind. Alternativ dazu können photolytisch abspaltbare Biotine auch mit DNA und RNA oder mit einer Vielzahl von kleinen Molekülen einschließlich Rezeptorliganden und Hormonen verknüpft werden. Die Wichtigkeit der Biotinylierung von Bindungskomplexen für die Isolierung von Proteinen, wie Membranrezeptoren und Spliceosomen, wurde bereits unter Verwendung von herkömmlichen Biotinen oder nicht photolytisch abspaltbaren Biotinen aufgezeigt.
  • Die Wahl der nachweisbaren Struktureinheit hängt vom Substrat, seiner Umgebung und dem gewünschten Nachweis- und Isolierungsverfahren ab. Zum Beispiel kann ein in geringen Konzentrationen vorhandenes Substrat ein empfindliches Nachweisverfahren, wie Fluoreszenzspektroskopie, erfordern, so dass eine fluoreszente Struktureinheit, wie Cumarin, notwendig ist. Die Wellenlänge der Fluoreszenzemission kann durch die Wahl der nachweisbaren Struktureinheit so ausgewählt werden, dass keine Störung durch natürliche Fluorophore erfolgt, die in dem Gemisch vorhanden sein können. In Fällen, in denen eine schnelle Isolierung des Substrats gewünscht wird, kann die Wahl der nachweisbaren Struktureinheit von der Verfügbarkeit eines geeigneten Kopplungsmittels bestimmt werden. Zum Beispiel kann ein Antigen, das als nachweisbare Struktureinheit dient, verwendet werden, wenn ein geeigneter Antikörper zur Verfügung steht. Da die nachweisbare Struktureinheit, die reaktive Gruppe und die photoreaktiven Struktureinheiten im bioreaktiven Agens chemisch getrennt vorliegen, können ihre Eigenschaften jeweils so angepasst werden, dass sie die vielfachen Anforderungen für den Nachweis und die Isolierung eines besonderen Substrats erfüllen.
  • Konjugate der Erfindung können über die nachweisbare Struktureinheit, das Substrat oder jede andere chemische Gruppe der Struktur an einen festen Träger gebunden sein. Der feste Träger kann Konstrukte aus Glas, Keramik, Kunststoff, Metall oder eine Kombination dieser Substanzen umfassen. Zu den geeigneten Strukturen und Konstrukten gehören Kunststoffstrukturen, wie Mikrotiterplattennäpfe oder die Oberfläche von Stäbchen, Blättchen, Kügelchen oder Mikrokugeln, Legierungs- und anorganische Oberflächen, wie Halbleiter, zwei- und dreidimensionale Hybridisierungs- und Bindungschips sowie Magnetkügelchen, Chromatographie-Matrixmaterialien und Kombinationen dieser Materialien.
  • Wie oben diskutiert, kann es sich bei der mehratomigen Gruppe um eine oder mehrere Nitrogruppen, Alkylgruppen, Alkoxygruppen oder Derivate oder Kombinationen davon handeln. Bei der wahlfreien einatomigen Gruppe kann es sich um eine oder mehrere Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iodgruppen oder um Wasserstoff handeln. Die mehratomigen und einatomigen Gruppen und die chemischen Struktureinheiten an R1 und R2 können die Photolysereaktion beeinflussen, wie etwa die Frequenz der Strahlung, die die photolytische Spaltung einleitet, oder die zur Ausführung eines Spaltungsereignisses notwendige Belichtungszeit. Die Spacer-Struktureinheit (Q) kann ein verzweigter oder unverzweigter Kohlenwasserstoff oder ein polymeres Kohlenhydrat sein und wird vorzugsweise durch die folgende Formel dargestellt:
    Figure 00450001
    wobei W und W' jeweils aus der Gruppe, die aus -CO-, -CO-NH-, -HN-CO-, -NH-, -O-, -S- und -CH2- besteht, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können, und n1 und n2 ganze Zahlen von 0–10 sind, die gleich oder verschieden sein können, wobei, wenn entweder n1 oder n2 = 0 ist, W und W' wahlfrei sind. Spezielle Beispiele für Konjugate der Erfindung sind in 8 abgebildet.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Konjugate, bei denen es sich um pharmazeutische Zusammensetzungen handelt. Zusammensetzungen müssen unbedenklich und nichttoxisch sein und können Patienten, wie Menschen und anderen Säugern, verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie Wasser, Ölen, Lipiden, Saccha riden, Polysacchariden, Glycerinen, Collagenen und Kombinationen davon, gemischt und Patienten verabreicht werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen mit photolytisch freisetzbaren Substraten sind zum Beispiel für die Abgabe von pharmazeutischen Wirkstoffen mit kurzen Halbwertszeiten geeignet. Solche Agentien können nicht über übliche Mittel verabreicht werden, ohne inaktiviert zu werden, bevor sie wirken können. Pharmazeutische Wirkstoffe in Form von Konjugaten, die kovalent an bioreaktive Agentien gebunden sind, sind stabiler als isolierte Agentien. Nach der allgemeinen Verabreichung der Zusammensetzung an den Patienten wird die zu behandelnde Stelle einer geeigneten Strahlung ausgesetzt, die das Substrat freisetzt, das eine unmittelbare positive Reaktion bei einem Patienten erzeugt. Die Entkopplung von dem bioreaktiven Agens am Punkt der maximalen biologischen Wirkung ist ein Vorteil, der bei Verwendung von üblichen Verabreichungs- oder Stabilisierungsverfahren nicht zur Verfügung steht. Analog können auch andere Körperbereiche des Patienten vor der biologischen Wirkung des pharmazeutischen Wirkstoffs geschützt werden. Folglich ist unter Verwendung dieser Konjugate eine ortsgerichtete und ortsspezifische Abgabe eines pharmazeutischen Wirkstoffs möglich.
  • Ein Konjugat der Erfindung kann in einem Verfahren zur Isolierung von Targets aus einem heterologen Gemisch verwendet werden. Bioreaktive Agentien werden mit dem Gemisch in Kontakt gebracht, um mit dem Target zu reagieren und das Konjugat zu bilden. Alternativ dazu können auch Konjugate mit dem heterologen Gemisch in Kontakt gebracht werden, um das Substrat innerhalb des Konjugats an ein oder mehrere Targets zu koppeln. Konjugate können durch beliebige, zur Zeit verfügbare Techniken (z. B. Tabelle 5) aus dem Gemisch abgetrennt werden.
  • Tabelle 5: Affinitätstechniken unter Verwendung von Avidin
    Figure 00470001
  • Verfahren wie die chemische oder physikalische Trennung von Komponenten des Gemischs, Elektrophorese, Elektroelution, Sedimentation, Zentrifugation, Filtration, magnetische Trennung, chemische Extraktion, Affinitätstrennungsverfahren, wie Affinitätschromatographie, oder ein anderes chromatographisches Verfahren, wie Ionenaustausch, Gradiententrennung, HPLC oder FPLC, sowie Kombinationen dieser Techniken sind wohlbekannt und ermöglichen eine schnelle Isolierung mit einer hohen Rückgewinnungseffizienz (z. B. M. Wilchek et al., Methods Enzymol. 184, 1990; M. Wilchek et al., Anal. Biochem. 171: 1, 1988). Nach der Abtrennung oder Isolierung können die Targets leicht quantifiziert werden, wobei man verfügbare Verfahren verwendet, wie optische Extinktion oder Transmission (z. B. Nucleinsäuren, Proteine, Lipide) oder Bradford- (M. Bradford, Anal. Biochem. 72: 248, 1976) oder Lowry-Assay (O. Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265, 1951)(z. B. Proteine), die beide kommerziell erhältlich sind. Nach der Trennung werden die gekoppelten Konjugate mit elektromagnetischer Strahlung behandelt, um das Substrat freizusetzen. Falls gewünscht, können dann die Substrattargets von dem freigesetzten bioreaktiven Agens abgetrennt werden, so dass man im Wesentlichen oder vollständig reine Targets erhält.
  • Zu den Targets, die nach diesem Verfahren in hochgereinigter Form nachgewiesen und isoliert werden können, gehören fast alle Chemikalien, Moleküle oder Makromoleküle einschließlich Immunsystemmodulatoren, Agentien des Blutbildungssystems, Cytokine, Proteine, Hormone, Genprodukte, Antigene, Zellen einschließlich fetaler und Stammzellen, Toxine, Bakterien, Membranvesikel, Viruspartikel und Kombinationen davon. Der Nachweis und die Isolierung werden durch die Fähigkeit des bioreaktiven Agens, Substrat zu binden, bestimmt. Zum Beispiel können Nucleinsäuren durch Basenpaarung an komplementäre Nucleinsäuren, an nucleinsäurebindende Proteine oder an chemische Struktureinheiten, die spezifisch mit chemischen Struktureinheiten reagieren, die man an Nucleinsäuren findet, gebunden werden. Proteine können mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die spezifisch für diese Proteine sind, oder mit chemischen Struktureinheiten, die spezifisch mit chemischen Struktureinheiten reagieren, die man an den interessierenden Proteinen findet, gebunden werden. Substrate können zum Beispiel Vorläufer von Targets sein, wie eine oder mehrere der natürlich oder nichtnatürlich vorkommenden Aminosäuren, wobei das Target ein naszierendes Protein ist, oder ein oder mehrere Ribonucleotide, Desoxyribonucleotide oder Primer, wenn das Target eine Nucleinsäure ist. Der Vorläufer kann zum Beispiel durch in-vivo- oder in-vitro-Replikation, Transcription oder Translation in Zielmoleküle eingebaut werden. Das Target kann ein Protein oder ein proteinhaltiger Komplex, eine Nucleinsäure, eine Gensequenz oder ein PCR-Produkt sein. Die Substrate können auch Rezeptoren sein, die an Liganden, welche spezifisch für die Rezeptormoleküle sind, binden oder in anderer Weise damit assoziieren. Zu den Rezeptoren, die isoliert werden können, gehören Cytokine, wobei das Target ein Cytokinrezeptor ist, und Antigene, wobei das Target ein Antikörper ist. Bevorzugte Konjugate für den Nachweis und die Isolierung eines Targets aus einem heterologen Gemisch sind photolytisch abspaltbare Biotine, die mit Antikörpern (polyklonal, monoklonal, Fragmente) verknüpft sind, photolytisch abspaltbare Cumarine, die mit Antikörpern verknüpft sind, photolytisch abspaltbare Dansyle, die mit Lipiden verknüpft sind, und Derivate und Modifikationen davon.
  • Bei dem heterologen Gemisch, das das Target enthält, kann es sich um eine biologische Probe, irgendeine proteinhaltige Zusammensetzung, wie ein Zell- oder zellfreier Extrakt, nucleinsäurehaltige Zusammensetzungen, eine Biomasse, die zum Beispiel vegetatives oder mikrobielles Material enthält, eine Zellkultur von primären oder immortalisierten Zellen, Lipidvesikel oder sogar Tiere handeln. Tiere können verwendet werden, um Targets nachzuweisen, die im Körper oder in Teilen des Körpers vorhanden sein können, oder alternativ, um Targets wie Makromoleküle oder Zellen aus Tiermodellen zu gewinnen und zu isolieren. Bei dem Substrat kann es sich auch um Proteine, Peptide, Aminosäuren, Aminosäureanaloga, Nucleoside, Nucleotide, Lipide, Vesikel, Detergentien-Micellen, Fettsäuren, Saccharide, Polysaccharide, anorganische Moleküle, Metalle sowie Derivate und Kombinationen davon handeln.
  • Bei einer Anwendung dieses Verfahrens kann das Substrat eine integrale Komponente des Targets, wie ein Nucleotid beim Nachweis und der Isolierung von naszierenden Nucleinsäuren oder eine Aminosäure beim Nachweis und der Isolierung von naszierenden Proteinen, sein. Das Substrat wird durch chemische oder enzymatische Techniken in das Target eingebaut und anhand der Anwesenheit der nachweisbaren Struktureinheit nachgewiesen und isoliert. Kurz gesagt, Konjugate werden mit Reagentien in einem heterologen Gemisch in Kontakt gebracht, wie zum Beispiel in einem Replikations-, Transcriptions-, Translations- oder gekoppelten Transcriptions-/Translations-System. Substrate werden durch die Wirkung von Komponenten im System, wie Enzymen, Vorläufermolekülen und anderen Reagentien des Systems, in Targets eingebaut. Konjugatgekoppelte Targets werden aus dem Gemisch abgetrennt und mit elektromagnetischer Strahlung behandelt, um das Target freizusetzen, das dann isoliert wird.
  • Konjugate können durch Inkubation mit einem heterologen Gemisch in Kontakt gebracht werden, wie zum Beispiel beim enzymatischen Einbau eines makromolekularen Vorläufers in ein naszierendes Makromolekül, der entweder in vivo oder in vitro erfolgen kann. Nucleinsäure-Polymerasen bauen Vorläufernucleotide oder Nucleinsäureprimer in Nucleinsäuren ein. In-vitro-Inkubationen in zellfreiem Reaktionsgemisch werden typischerweise bei einer Temperatur von etwa 4°C bis etwa 45°C, vorzugsweise bei etwa 12°C bis etwa 37°C und besonders bevorzugt bei etwa Raumtemperatur durchgeführt. Der Einbau von Konjugaten in naszierende Makromoleküle kann je nach den Inkubationsbedingungen in etwa 5 Minuten, etwa 15 Minuten oder etwa einer Stunde beendet sein, oder er kann zwei, drei oder mehr Stunden erfordern, bis er beendet ist. Wenn das heterologe Gemisch ein Tier oder ein Tiermodell ist, werden in-vivo-Inkubationen im Allgemeinen bei Körpertemperatur durchgeführt und können Stunden oder Tage dauern, bis sich die Konjugate auf Bereiche des Tierkörpers verteilt haben, die weit von der Einführungsstelle entfernt sein können, Konjugate mit Targets reagiert haben und an Targets gekoppelte Konjugate gewonnen worden sind.
  • Eine der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung bezieht sich auf den Nachweis oder die Isolierung von Protein unter Verwendung von photolytisch abspaltbarem Biotin. Bei einer Anwendung dieser Ausführungsform wird PCB über die Bildung von kovalenten Bindungen mit speziellen chemischen Gruppen des Proteins mit einem Protein umgesetzt, so dass ein Konjugat der Erfindung entsteht. Das Protein kann entweder das zu isolierende oder nachzuweisende Target oder eine Sonde für das Targetprotein, wie ein Antikörper, sein. Das Targetprotein kann dann unter Verwendung von Streptavidin-Affinitätsmethoden isoliert werden.
  • Eine weitere Anwendung dieser Ausführungsform betrifft die Verwendung von photolytisch abspaltbarem Biotin zur Isolierung von naszierenden Proteinen, die durch in-vitro- oder in-vivo-Proteinsynthese erzeugt werden können. Grundsätzlich werden photolytisch abspaltbare Biotine synthetisiert und mit Aminosäuren, die spezielle Blockierungsgruppen enthalten, verknüpft (PCB-Aminosäuren). Diese Konjugate werden auf tRNA-Moleküle geladen und unter Verwendung eines Translations- oder gekoppelten Transcriptions-/Translations-Systems in Peptide und Proteine eingebaut. PCB-Aminosäuren der Erfindung haben die Eigenschaft, dass eine photolytische Spaltung erfolgt, sobald sie mit Licht bestrahlt werden, wobei eine native Aminosäure plus das freie Biotinderivat entsteht. Solche Proteine können in strukturell und/oder funktionell unveränderter Form isoliert werden.
  • Das detaillierte Verfahren für die Herstellung von photolytisch spaltbaren Biotin-Aminosäuren und ihren Einbau in die naszierenden Proteine beinhaltet ein paar grundlegende Schritte. Zuerst wird photolytisch abspaltbares Biotin synthetisiert und mit einer Aminosäure, die eine geeignete Blockierungsgruppe aufweist, verknüpft. Diese PCB-Aminosäure-Konjugate werden auf tRNA-Moleküle geladen und anschließend in einem in-vivo- oder in-vitro-Translationssystem in naszierende Proteine eingebaut. Alternativ dazu wird zuerst ein tRNA-Molekül enzymatisch mit einer Aminosäure, wie Lysin, beladen, die dann mit einem reaktiven PCB gekoppelt wird. Naszierende Proteine werden unter Verwendung von immobilisiertem Streptavidin von den anderen Synthesekomponenten abgetrennt und isoliert. Durch photolytische Abspaltung des PCB-Streptavidin-Komplexes von dem naszierenden Protein entsteht ein reines und natives naszierendes Protein.
  • PCB wird an eine Aminosäure gebunden, wobei man zum Beispiel die Seitenkettengruppen, wie eine Aminogruppe (Lysin), aliphatische und phenolische Hydroxygruppen (Serin, Threonin und Tyrosin), Sulfhydrylgruppen (Cysteine) und Carboxylatgruppe (Asparagin- und Glutaminsäure), verwendet (9). Die Synthese kann durch direkte Kondensationen mit in geeigneter Weise geschützten Stammaminosäuren erreicht werden. Zum Beispiel kann die Seitenketten-Aminogruppe des Lysins durch Modifikation der ε-Aminogruppe mit PCB modifiziert werden. Die Synthese zum Beispiel von PCB-Methionin beinhaltet primär eine Modifikation der α-Aminogruppe. PCB-Methionin kann auf eine Start-tRNA geladen werden, die sich nur an Startstellen an der Proteinsynthese beteiligen kann, was zum Einbau eines einzigen PCB pro Kopie des naszierenden Proteins führt.
  • Ein Verfahren zum Einbau einer photolytisch spaltbaren Biotin-Aminosäure in ein naszierendes Protein beinhaltet eine Fehlaminoacylierung von tRNA. Normalerweise wird eine tRNA-Spezies mit einer einzigen, von ihr erkannten nativen Aminosäure beladen. Diese selektive Beladung, die hier enzymatische Aminoacylierung genannt wird, wird durch Enzyme bewerkstelligt, die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen genannt werden, und erfordert, dass die auf ein tRNA-Molekül zu ladende Aminosäure einer nativen Aminosäure strukturell ähnlich ist. Eine chemische Fehlaminoacylierung kann verwendet werden, um eine tRNA mit nichtnativen Aminosäuren, wie photolytisch spaltbaren Aminosäuren, zu beladen. Die spezifischen Schritte bei der chemischen Fehlaminoacylierung von tRNAs sind in 10 abgebildet.
  • Wie gezeigt, werden tRNA-Moleküle zuerst durch sukzessive Behandlungen mit Periodat, Lysin (pH 8,0) und alkalischem Phosphat (Neu et al., J. Biol. Chem. 239: 2927–34, 1964) verkürzt, wobei die 3'-terminalen Reste entfernt werden. Alternativ dazu kann die Verkürzung auch durch genetische Manipulation erfolgen, wobei ein verkürztes Gen, das für das tRNA-Molekül codiert, aufgebaut und transcribiert wird, so dass verkürzte tRNA-Moleküle entstehen (Sampson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1033, 1988). Zweitens werden geschützte acylierte Dinucleotide, pdCpA, synthetisiert (Hudson, J. Org. Chem. 53: 617, 1988; E. Happ, J. Org. Chem. 52: 5387, 1987). PCB-Aminosäuren, die an ihren Seitenketten und/oder α-Aminogruppen in geeigneter Weise unter Verwendung von Standard-Schutzgruppen, wie Fmoc, blockiert sind, werden hergestellt und in Gegenwart von Carboxygruppen-aktivierenden Reagentien mit dem synthetischen Dinucleotid gekoppelt. Die anschließende Entfernung der Fmoc-Schutzgruppen ergibt ein aminoacyliertes Dinucleotid.
  • Drittens wird die photolytisch spaltbare Biotin-Aminosäure über das seinen Schutzgruppen entledigte Dinucleotid mit der verkürzten tRNA ligiert. Die durch diesen Vorgang gebildete Bindung unterscheidet sich zwar von derjenigen, die aus der tRNA-Aktivierung durch eine Aminoacyl-tRNA-Synthetase resultiert, doch ist das letztendliche Produkt dasselbe. T4-RNA-Ligase erkennt den O-Acyl-Substituenten nicht und ist daher unempfindlich gegenüber der Natur der gebundenen Aminosäure (10). Die Fehlaminoacylierung einer Vielzahl von nichtnativen Aminosäuren lässt sich leicht durchführen. Das Verfahren ist hochempfindlich und spezifisch für die Strukturen der tRNA und der Aminosäure.
  • Aminoacylierte tRNA, die mit einer photolytisch spaltbaren Biotin-Aminosäure verknüpft ist, kann auch erzeugt werden, indem man eine herkömmliche Aminoacyl-Synthetase einsetzt, um eine tRNA mit einer nativen Aminosäure zu amino acylieren, oder indem man spezielle chemische Reaktionen einsetzt, die die mit der tRNA verknüpfte native Aminosäure spezifisch modifizieren, so dass ein photolytisch spaltbares Biotin-Aminoacyl-tRNA-Derivat entsteht. Diese Reaktionen werden als Post-Aminoacylierungs-Modifikationen bezeichnet. Solche Post-Aminoacylierungs-Modifikationen fallen nicht unter das Verfahren der Fehlaminoacylierung, da die tRNA zuerst mit der von ihr erkannten beschriebenen Aminosäure aminoacyliert wird.
  • Im Gegensatz zur chemischen Aminoacylierung ist die Verwendung von Post-Aminoacylierungs-Modifikationen, um photolytisch spaltbare Biotin-nichtnative-Aminosäuren in naszierende Proteine einzubauen, sehr nützlich, da sie viele der Schritte, die bei der Fehlaminoacylierung durchzuführen sind, vermeidet. Weiterhin können viele der photolytisch spaltbaren Biotinderivate hergestellt werden, die reaktive Gruppen aufweisen, die spezifisch mit der gewünschten Seitenkette von Aminosäuren reagieren. Zum Beispiel bei der Post-Aminoacylierungs-Modifikation von Lysin-tRNALys kann ein N-Hydroxysuccinimid-Derivat von PCB hergestellt werden, das mit leicht zugänglichen primären ε-Aminogruppen reagieren und Reaktionen, die mit anderen nucleophilen Gruppen an der tRNA oder mit α-Aminogruppen der aminoacylierten nativen Aminosäure erfolgen, minimieren würde. Diese anderen unspezifischen Modifikationen können die Struktur der tRNA verändern und ihre Beteiligung an der Proteinsynthese schwer beeinträchtigen. Eine unvollständige Kettenbildung könnte ebenfalls vorkommen, wenn die α-Aminogruppe der Aminosäure modifiziert wird. Post-Aminoacylierungs-Modifikationen zum Einbau von Lysin-Biotin-nichtnativen-Aminosäuren in naszierende Proteine wurden aufgezeigt (tRNAnscend TM; Promega; Madison, WI) und zum Nachweis von naszierendem Protein, das Biotin enthält, unter Verwendung von Western-Blots und anschließenden enzymatischen Assays auf Biotin verwendet (T. V. Kurzchalia et al., Eur. J. Biochem., 172: 663–68, 1988). Diese Biotinderivate sind jedoch nicht photolytisch spaltbar, was es im Falle von NHS-Derivaten von PCB ermöglicht, die Biotinbindung zum Lysin photochemisch zu spalten.
  • PCB-Aminosäuren können auch mittels Festphasen-Peptidsynthese in Polypeptide eingebaut werden. Zuerst werden PCB-Aminosäuren derivatisiert, wobei man die basenlabile Fluorenylmethyloxycarbonyl-(Fmoc)-Gruppe zum Schutz der α-Aminofunktion und säurelabile t-Butyl-Derivate zum Schutz von reaktiven Seitenketten verwendet. Die Synthese wird auf einem Harz des Polyamidtyps durchgeführt. Aminosäuren werden für die Kopplung als symmetrische Anhydride oder Pentafluorphenylester aktiviert (E. Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1989). Zweitens werden Aminosäuren und PCB miteinander gekoppelt, und die PCB-Aminosäure wird in die Polypeptidkette integriert. Seitenketten-PCB-Derivate, wie ε-Amino-Lys, Seitenketten-PCB-Aminosäureester von Glu und Asp, Ester von Ser, Thr und Tyr, werden zum Einbau an einer beliebigen Stelle des Polypeptids verwendet. PCB-Aminosäuren können auch ortsspezifisch entweder an vorbestimmten Positionen oder am N-Terminus der Kette in die Kette eingebaut werden, wobei man zum Beispiel PCB-derivatisiertes Methionin verwendet, das an die Start-tRNA gebunden ist.
  • Aus PCB-Aminosäuren kann ein breites Spektrum von Polypeptiden gebildet werden, zum Beispiel Cytokine und rekombinante Proteine, sowohl eukaryontische als auch prokaryontische (z. B. α-, β- oder γ-Interferone; Interleukin-1, -2, -3 usw.; Epidermis-, Fibroblasten-, Stammzell- und andere Arten von Wachstumsfaktoren), sowie Hormone, wie die adrenocorticotropen Hormone (ACTHs), Insulin, das Parathormon (bPTH), der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β) und das Gonadotropin-freisetzende Hormon (GnRH)(M. Wilchek et al., Methods Enzymol. 184: 243, 1990; F. M. Finn et al., Methods Enzymol. 184: 244, 1990; W. Newman et al., Methods Enzymol. 184: 275, 1990; E. Hazum, Methods Enzymol. 184: 285, 1990). Diese Hormone behalten ihre Bindungsspezifität für den Hormonrezeptor bei. Ein Beispiel ist das GnRH-Hormon, bei dem ein Biotin durch Reaktion eines d-Biotin-p-Nitrophenylesters an die ε-Aminogruppe von Lys-6 gebunden wurde. Dieses biotinylierte Hormon kann für die Isolierung des GnRH-Rezeptors unter Verwendung von avidinbeschichteten Säulen verwendet werden.
  • Nach dem Einbau oder der Bindung von PCB in bzw. an ein Protein, einen Proteinkomplex oder ein anderes aminosäurehaltiges Target wird das Target unter Verwendung eines einfachen vierstufigen Verfahrens isoliert (11). Zuerst wird ein bioreaktives Agens (PCB) synthetisiert. Zweitens wird ein Substrat unter Bildung eines Konjugats an das bioreaktive Agens gekoppelt. Drittens wird das Target über die selektive Wechselwirkung des photolytisch abspaltbaren Biotins mit Avidin, Streptavidin oder ihren Derivaten von anderen Materialien in dem Gemisch getrennt. Abgefangene Targets können auf einem festen Träger, wie Magnetkügelchen, Affinitätssäulenpackungsmaterialien oder Filtern, immobilisiert werden, was die Entfernung von Kontaminanten erleichtert. Schließlich wird das photolytisch abspaltbare Biotin durch Bestrahlung mit einer Wellenlänge, die bewirkt, dass die kovalente Bindung des photolytisch abspaltbaren Biotins aufbricht, vom Target gelöst. Targets werden in Lösung in einer gewünschten Konzentration gelöst oder suspendiert. In denjenigen Situationen, bei denen konjugatgekoppelte Targets nicht an feste Träger gebunden sind, kann nach der Freisetzung von Targets ein weiterer Schritt des magnetischen Abfangens erfolgen, um magnetische Teilchen zu entfernen, die jetzt eine Avidin/Streptavidin-gebundene Biotin-Struktureinheit enthalten, die durch die photolytische Abspaltung des PCB freigesetzt wurde. Es wird also ein völlig unverändertes Protein in jede beliebige Lösung in gereinigter Form und bei fast jeder beliebigen Konzentration freigesetzt.
  • Bei einem weiteren Beispiel für die Verwendung von PCB umfasst das Konjugat einen PCB-gekoppelten Antikörper. Die Verwendung von photolytisch abspaltbarem Biotin liefert ein Mittel für die Gewinnung des Zielmoleküls und des Antikörpers für die anschließende Verwendung. Die Freisetzung eines Proteins aus einem Bindungskomplex kann anschließend an die Freisetzung des Bindungskomplexes aus dem immobilisierten Streptavidin durchgeführt werden. Dies ist ein Vorteil, da es die Durchführung der Freisetzung unter wohlkontrollierten Bedingungen ermöglicht. Zum Beispiel erfordert die Elution eines Targetproteins von einer Affinitätssäule häufig Änderungen im Puffer und/oder die Verwendung eines konkurrierenden Mittels, wie eines Epitops, das um eine Antikörper-Bindungsstelle konkurriert. Dies kann eine lange Einwirkung von schädigenden Bedingungen auf das Protein oder die Notwendigkeit erhöhter Mengen des konkurrierenden Mittels, was zu teuer sein kann, erfordern. Sobald der Proteinkomplex dagegen durch photolytische Spaltung aus dem immobilisierten Streptavidin entfernt wurde, kann der Komplex bequemer abgetrennt werden. Wenn Antikörper als Substrat verwendet werden, besteht ein zusätzlicher Vorteil der Erfindung darin, dass der Antikörper ebenfalls in unveränderter und gereinigter Form zurückgewonnen werden kann.
  • Ein einfaches Schema für die Verwendung eines PCB-Antikörpers ist in den 12A und 12B gezeigt. Mit photolytisch abspaltbarem Biotin gekoppelter Zielprotein/Antikörper wird dann mit Streptavidin immobilisiert. Zielprotein/Antikörper wird durch Bestrahlung mit Licht entkoppelt, und der Zielprotein/Antikörper wird freigesetzt. Das Zielprotein wird von dem Antikörper getrennt, wobei man zum Beispiel erhöhte oder gesenkte Salzkonzentrationen (NaCl, KCl) verwendet, und zurückgewonnen. Wie in 12B gezeigt ist, wird alternativ dazu das Target von dem Antikörper entfernt, indem man ein Epitop-PCB-Konjugat verwendet, das um die Antikörper-Bindungsstelle konkurriert. Dann wird das Antikörper-Epitop-PCB-Konjugat durch Immobilisierung mit Streptavidin von dem Target isoliert. Dann wird der Antikörper-Epitop-Komplex freigesetzt, indem man den Biotin-Epitop-Komplex photolytisch spaltet. Eine Vielzahl von anderen Molekülen, die mit Proteinen wechselwirken, kann ebenfalls in Verbindung mit PCB zur Proteinisolierung verwendet werden, wie in Tabelle 2 gezeigt ist; dazu gehören Polypeptide, Proteinkomplexe und kleine Liganden.
  • PCB-Derivate, die an Antikörper oder andere Makromoleküle, wie DNA, die als Hybridisierungssonden dienen, gebunden oder in diese eingebaut sind, können ebenfalls mit Vorteil für den sequentiellen multiplen Nachweis von Targets verwendet werden. Wie im Falle von herkömmlichen Assays für ein Target auf der Basis von Streptavidin-Biotin-Wechselwirkungen wird die Gegenwart des Targets durch einen Streptavidin-Enzym-Komplex signalisiert, der an die biotinylierte Sonde bindet und ein amplifiziertes Signal erzeugt, indem er ein Substrat in ein Produkt umwandelt, das aufgrund einer unterscheidbaren physikalischen Eigenschaft, wie Farbe oder Lumineszenz, leicht nachweisbar ist. Im Gegensatz zu herkömmlichen Biotinen können die PCB-Derivate jedoch vollständig entfernt werden, was die Abtrennung und Entfernung des Streptavidin-Enzym-Komplexes und die anschließende Zugabe neuer Sonden und Streptavidin-Komplexe zum Nachweis zusätzlicher Targetmoleküle erlaubt. Ein ähnlicher Vorteil existiert bei der cytochemischen Markierung auf der Basis der Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung. In diesem Fall kann die Markierung durch Licht vollständig entfernt werden, was die Verwendung zusätzlicher spezifischer cytochemischer Markierungen erlaubt.
  • In einer anderen Anwendung der bevorzugten Ausführungsform kann photolytisch abspaltbares Biotin oder ein PCB-Derivat in ein DNA- (Desoxyribonucleinsäure), RNA- (Ribonucleinsäure) oder PNA-Molekül (Polynucleinsäureamid; P. E. Nielsen et al., Sci. 254: 1497–1500, 1991) eingebaut werden, das zum Beispiel durch chemische Synthese, PCR, Nick-Translation oder DNA- oder RNA-Polymerasen hergestellt wird (Tabelle 6). Target-DNA oder -RNA kann dann isoliert werden, indem man Streptavidin-Affinitätsverfahren verwendet, die den oben diskutierten Verfahren ähnlich sind. Die Isolierung erfolgt zum Beispiel unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Magnetkügelchen, die mit Streptavidin beschichtet sind. Die Kügelchen binden fest an alle DNA und RNA, die das PCB-Derivat enthält, während alle anderen Moleküle weggewaschen werden. Das photolytisch abspaltbare Biotin wird dann durch Bestrahlung von der Target-Nucleinsäure entfernt.
  • Der Einbau von PCB in Nucleinsäuren, wie DNA und RNA, beinhaltet die Synthese und Verwendung von Verbindungen, die durch die Derivatisierung von Nucleotiden mit photolytisch abspaltbaren Biotinen gebildet werden. Beispiele für die Nucleotide, die unter Verwendung von photolytisch abspaltbarem Biotin modifiziert sind, sind in 13A gezeigt.
  • Der unspezifische Einbau von PCB-Struktureinheiten in Nucleinsäuren wird zum Beispiel unter Verwendung von Hydrogensulfit-katalysierter Cytosin-Transaminierung und anschließender Reaktion mit PCB-NHS-Ester oder PCB-NH-NH2 (PCB-Hydrazid) erreicht. Alternativ dazu kann 5'-Phosphat durch Reaktion mit wasserlöslichem Carbodiimid, Imidazol und Diamin in Phosphoramidit umgewandelt und das resultierende Phosphoramidit mit PCB-NHS-Ester umgesetzt werden.
  • Es wurden zahlreiche Verfahren entwickelt, um während der Festphasensynthese eine Aminogruppe am 5'-Ende von geschützten Oligonucleotiden einzuführen. Dazu gehören die Carbonyldiimidazol-vermittelte Modifikation von 5'-OH mit Diamin und die Einführung einer aliphatischen Amin-Struktureinheit am 5'- oder 3'-Ende während der Synthese unter Verwendung von speziellen Phosphoramiditen. Es wurden auch bifunktionelle Phosphoramidite entwickelt, die den Einbau von reaktiven Aminogruppen an mehreren Stellen in synthetischen Oligonucleotiden ermöglichen. Diese Verfahren erzeugen Oligonucleotid-Produkte, die aliphatische Aminogruppen tragen, welche durch Reaktion mit den jeweiligen PCB-NHS-Estern leicht in PCB-Carbamate umgewandelt werden können. In analoger Weise wie bei herkömmlichem Biotin können PCB-Struktureinheiten während der Festphasensynthese auch direkt in Oligonucleotide eingebaut werden, wobei man die jeweiligen PCB-Phosphoramidite verwendet.
  • Synthetische Oligonucleotide mit vorbestimmten oder statistischen Sequenzen haben eine Vielzahl von Verwendungen, wie zum Beispiel als Primer, Hybridisierungssonden und Antisense-Sequenzen. Bei der Synthese von DNA- und RNA-Oligonucleotiden wird Phosphoramiditchemie verwendet; sie wird routinemäßig mit einem automatischen Synthesizer durchgeführt, wobei die wachsenden Nucleinsäureketten an einem festen Träger, wie CPG (Glas mit definierter Porengröße), befestigt sind. Auf diese Weise können Phosphoramidite und andere Reagentien im Überschuss hinzugefügt und durch Filtration wieder entfernt werden. Der Synthesecyclus umfasst vier Reaktionen. Zuerst werden säurelabile Tritylgruppen von den 5'-OH-Gruppen entfernt, Zweitens werden Phosphoramidite an die 5'-OH-Gruppen gekoppelt. Drittens werden nicht umgesetzte 5'-OH-Gruppen geschützt, indem man sie mit Acetylgruppen blockiert. Schließlich wird die Bindung zwischen den Nucleotiden durch Oxidation von Phosphit in Phosphotriester umgewandelt. Dieser Cyclus wird wiederholt, bis die gewünschte Sequenz erhalten wird, und dann wird das Oligonucleotid von dem festen Träger abgespalten und gereinigt, wobei man zum Beispiel Gel-Elektrophorese und HPLC verwendete.
  • Die Kopplungseffizienz für jeden Schritt ist vorzugsweise so hoch wie möglich, wie etwa über 90% oder etwa 97–99%. Nicht umgesetzte Moleküle werden bei jedem Schritt durch Blockieren mit Acetylgruppen entfernt, wodurch die Bildung unerwünschter Sequenzen verhindert wird. Rohes Oligonucleotid enthält neben der Sequenz in voller Länge auch zahlreiche kürzere Sequenzen, die auch Fehlsequenzen genannt werden. Die Reinigung eines so komplexen Gemischs ist schwierig, insbesondere wenn man eine Sequenz in voller Länge aus geringfügig kürzeren Fehlsequenzen (z. B. n – 1; n – 2) isolieren muss. Dieses Problem wird noch schwieriger, wenn man lange DNA- oder RNA-Sequenzen synthetisiert, weil dann die Kopplungseffizienzen geringer und die Zahl der Fehlsequenzen höher sind. 5'-PCB-Phosphoramidite können verwendet werden, um Oligonucleotide der vollen Länge während der Festphasensynthese an automatisierten Nucleinsäure-Synthesizern an ihrem 5'-Ende selektiv zu labilisieren.
  • PCB-Phosphoramidite können die PCB-Struktureinheit enthalten, die über einen Spacer-Arm mit einer Phosphoramidit-Funktion verknüpft ist, was eine effiziente Bindung an Avidin ermöglicht. Dieses Reagens reagiert selektiv mit der 5'-OH-Gruppe an einem Zuckerring und kann bei automatisierten Synthesizern verwendet werden. Biotinylierte Sequenzen können auch unter Verwendung von Standard-Synthesecyclen hergestellt werden, wobei die Kopplungseffizienz durch Tritylanalyse überwacht wird. Typische Kopplungseffizienzen liegen bei etwa 90–95%. Außerdem führt die photolytische Spaltung von 5'-PCB-Nucleinsäuren zur Bildung von 5'-phosphorylierten Sequenzen. Für die meisten Anwendungen in der Molekularbiologie sind 5'-phosphorylierte Oligonucleotide erforderlich.
  • Alternativ dazu können PCB-Struktureinheiten auch während der Synthese an einer beliebigen Position einschließlich des 3'-Terminus in Oligonucleotide eingebaut werden sowie auch an mehreren Stellen mit Hilfe von PCB-Phosphoramiditen, die sich zum Beispiel bifunktionelle nichtnucleosidische Gerüste zu Nutze machen. Enzyme einschließlich der Taq-DNA-Polymerase, die in PCR- Reaktionen verwendet wird, und anderer DNA- und RNA-Polymerasen sind in der Lage, biotinylierte Nucleotide in Nucleinsäuren einzubauen. Die PCR-Technik umfasst den Vorgang des Amplifizierens von einer oder mehreren spezifischen Nucleinsäuresequenzen in einer Nucleinsäure unter Verwendung von Primern und Agentien für die enzymatische Polymerisation mit anschließendem Nachweis der jetzt amplifizierten Sequenz (R. K. Saiki et al., Sci. 230: 1350, 1985; T. J. White et al., Trends Gent. 5: 185, 1989). Die Grundtechniken sind beschrieben im US-Patent Nr. 4,683,195, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird, und Variationen davon sind in den US-Patenten Nr. 5,043,272, 5,057,410 und 5,106,727 beschrieben, auf die hier ebenfalls ausdrücklich Bezug genommen wird. Es gibt mehrere Beispiele, in denen biotinylierte Nucleotide während PCR-Anwendungen effizient eingebaut wurden. Diese Studien zeigen, dass in Gegenwart von PCB-Nucleotiden durchgeführtes PCR zu einer starken Amplifikation von Ziel-DNA-Fragmenten und einer gleichzeitigen Markierung mit PCB führt. Die für die PCR-Reaktion erforderlichen Primer können ebenfalls markiert sein.
  • Tabelle 6 führt verschiedene enzymatische Verfahren auf, die den Einbau von PCB-Nucleotiden zur Erzeugung von markierten Sonden für viele Anwendungen, wie in-situ-Hybridisierung und PCR, ermöglichen.
  • Tabelle 6: Enzymatische Verfahren zum Einbau von PCB-Nucleotiden
    Figure 00610001
  • Die Biotin-Avidin-Technik wird auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Biomedizin zur Zeit häufig als Mittel verwendet, um die Produkte der DNA- und RNA-Synthese effizient zu isolieren sowie spezifische Sequenzen in Nucleinsäuren nachzuweisen. Die Isolierung beinhaltet normalerweise die Bindung oder den Einbau von Biotin an bzw. in die DNA oder RNA mit anschließender Trennung durch die Wechselwirkung des Biotins mit Streptavidin. Zum Beispiel wird dieses Verfahren verbreitet für die Isolierung von DNA verwendet, die das Produkt der Polymerase-Kettenreaktion ist. Der Nachweis beinhaltet typischerweise die Her stellung von biotinmarkierten Nucleinsäuresonden. Diese Sonden haben weitverbreitete Anwendung in Genstruktur- und Genfunktionsstudien, der Diagnose von Human-, Tier- und Pflanzenpathogenen und dem Nachweis von humanen genetischen Abnormalitäten gefunden.
  • Herkömmliche Methoden sind jedoch durch die Schwierigkeit begrenzt, Biotin von der Nucleinsäure zu lösen oder daraus freizusetzen. Insbesondere ist es in hohem Maße wünschenswert, unveränderte DNA oder RNA zu erhalten, nachdem sie durch die Biotin-Avidin-Wechselwirkung abgetrennt wurde. Zum Beispiel kann die Anwesenheit von Biotin an der naszierenden DNA deren anschließende Verwendung in der Klonierungs- oder Hybridisierungsanalyse stören. Außerdem verhindert die Nichtentfernbarkeit von Biotin aus einer biotinylierten Nucleinsäuresonde nach einem enzymabhängigen Assay die Durchführung von zusätzlichen Hybridisierungsassays an derselben Probe.
  • Die Verwendung von photolytisch spaltbaren Biotinen bei der Isolierung oder dem Nachweis von Nucleinsäuren vermeidet viele der oben aufgeführten Schwierigkeiten, indem sie ein schnelles und effektives Verfahren zur Entfernung des Biotins in einem einzigen Schritt bereitstellt. Im Falle der auf Biotin-Avidin basierenden Isolierung von DNA wird dadurch auch der Schritt der Freisetzung der DNA von dem immobilisierten Avidin bewerkstelligt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung, die die Verwendung eines Konjugats der Erfindung umfasst, beruht die Isolierung von Nucleinsäuren auf drei grundlegenden Schritten. Zuerst wird ein photolytisch abspaltbares Biotinderivat durch enzymatische oder chemische Mittel oder alternativ dazu durch Einbau eines photolytisch spaltbaren Biotinnucleotids in eine Nucleinsäure durch enzymatische oder chemische Mittel an einem Nucleinsäuremolekül befestigt. Die Wahl eines bestimmten photolytisch abspaltbaren Biotins hängt davon ab, welche molekularen Gruppen an der Nucleinsäure derivatisiert werden sollen. Zum Beispiel kann die Bindung von photolytisch abspaltbarem Biotin an eine Nucleinsäure bewerkstelligt werden, indem man eine kovalente Bindung mit den aromatischen Amin-, Zuckerhydroxy- oder Phosphatgruppen bildet (Tabelle 4). PCB kann auch durch chemische oder enzymatische Mittel in Oligonucleotide eingebaut werden. Dann wird das Nucleinsäuremolekül durch die selektive Wechselwirkung des photolytisch abspaltbaren Biotins mit Avidin, Streptavidin oder ihre Derivate, die auf einem Material wie Magnetkügelchen, Affinitätssäulen-Packungsmaterialien oder Filtern immobilisiert sein können, abgetrennt. Verfahren zur Abtrennung von Nucleinsäuren aus anderen Molekülen in einem komplexen Gemisch unter Verwendung von photolytisch abspaltbarem Biotin haben sich gut bewährt und sind ähnlich den herkömmlicheren Verfahren unter Verwendung von nichtabspaltbarem Biotin. Dies beinhaltet typischerweise eine Affinitätstechnik auf der Basis der Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung, wodurch die biotinhaltige Nucleinsäure aufgrund ihrer Wechselwirkung mit Streptavidin immobilisiert wird. Wie in Tabelle 5 gezeigt ist, beinhalten diese Techniken streptavidinbeschichtete Magnetkügelchen, Streptavidin-Sepharose-Säulen und Streptavidin-konjugierte Filter, von denen alle kommerziell erhältlich sind. Zum Beispiel werden Nucleinsäuremoleküle, die PCB entweder durch Anbindung oder durch Einbau enthalten, unter Verwendung von streptavidinbeschichteten Magnetkügelchen isoliert. Dann wird der Pool der ungebundenen Biomoleküle gewaschen, um andere Reaktanten, Puffer und Salze zu entfernen. Schließlich wird das photolytisch abspaltbare Biotin durch Bestrahlung mit einer Wellenlänge, die bewirkt, dass die kovalente Bindung des photolytisch abspaltbaren Biotins aufgebrochen wird, von der Nucleinsäure gelöst. Das bioreaktive Agens kann so entfernt werden, dass eine im Wesentlichen oder völlig reine Nucleinsäure zurückbleibt.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von photolytisch spaltbaren Konjugaten gemäß der Erfindung in Verbindung mit PCR-Amplifikation. Bei Verfahren zur Isolierung eines PCR-Produkts können ein oder mehrere Oligonucleotidprimer als Substrate verwendet werden. Die Nucleinsäuresequenz des Targets wird unter Verwendung der konjugierten Primer durch PCR amplifiziert. Kovalente Bindungen zwischen dem Primer und dem bioreaktiven Agens sind mit elektromagnetischer Strahlung selektiv spaltbar, so dass die amplifizierten Sequenzen freigesetzt werden. Zu den Nucleotidsequenzen, die nach diesem Verfahren selektiv amplifiziert werden können, gehören Nucleotid sequenzen, die man in biologischen Proben, bakterieller DNA und eukaryontischer DNA findet. Im Gegensatz zu herkömmlichen Biotinen bietet PCB ein effektives Verfahren, um ein biotinyliertes DNA-Produkt der Polymerase-Kettenreaktion vollständig zu entfernen, und liefert ein Mittel, um in einem einzigen Schritt gleichzeitig das PCR-Produkt von dem Avidin- oder Streptavidin-Bindungsmedium freizusetzen und die Biotinylierung zu entfernen.
  • Zu den weiteren Vorteilen gegenüber herkömmlichen Biotinen gehört der Wegfall der Notwendigkeit spezieller Reagentien oder Puffer. Nach der photolytischen Abspaltung von Biotin aus dem PCR-Produkt ist die resultierende DNA für das Klonieren und andere übliche Verwendungen in der Molekularbiologie geeignet. Nach der photolytischen Abspaltung von Biotin aus dem PCR-Produkt kann dieses mit Standard-Analyseverfahren, wie Gel-Elektrophorese, genau analysiert werden. Hybridisierungssonden, die PCB enthalten, können sterilisiert werden, wobei das Biotin vollständig entfernt wird, so dass die Target-DNA unter Verwendung einer zweiten biotinylierten Sonde erneut sondiert werden kann. Das in DNA eingebaute PCB behält im Unterschied zu den mehreren Biotinderivaten, bei denen die Eigenschaften von Biotin zum Zwecke einer leichten Freisetzung abgeschwächt werden (z. B. Iminobiotin), die hohe Bindungsaffinität zu Avidin bei.
  • Zwei Verfahren zur Isolierung von PCR-Produkten unter Verwendung von PCB sind in den 14A und 14B dargestellt. In beiden Verfahren kann die Quelle für den anfänglichen Pool von Zellen, aus dem die Target-DNA amplifiziert werden soll, aus einer Vielzahl von Quellen einschließlich peripherem Blut und Biopsiegeweben stammen. Nach der Zelllyse wird der Rohextrakt des Gesamtgenoms einer PCR unterzogen.
  • In Verfahren A (14A) werden DNA-Primer aus den flankierenden Sequenzen der Target-DNA unter Einbau von photolytisch abspaltbarem Biotin an den 5'-Enden synthetisiert. Zu diesem Zweck kann ein PCB-Phosphoramidit während der DNA-Synthese direkt am 5'-Ende des Oligonucleotidprimers eingeführt werden. Eine Reihe von PCR-Cyclen wird unter Verwendung von normalen dNTPs durchgeführt. Dieses Verfahren führt zu einem PCR-Produkt, bei dem sich das photolytisch abspaltbare Biotin jeweils am 5'-Ende der komplementären Stränge befindet. PCR-Produkte werden aus dem Gemisch, das noch andere Komponenten des PCR-Gemischs einschließlich Nucleotiden, Enzymen und Puffern enthält, abgetrennt, indem man Streptavidin verwendet, wie es auf beschichteten Magnetkügelchen vorhanden ist (z. B. Dynabeads M-280 Streptavidin), die das am 5'-Ende der DNA vorhandene photolytisch abspaltbare Biotin binden. Ein typisches zu befolgendes Verfahren besteht darin, 40 μl gewaschene Dynabeads M-280 Streptavidin mit 40 μl des PCR-Gemischs zu mischen und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren. Dann werden die Dynabeads isoliert, wobei man magnetische Mittel, wie DYNAL Magnetic Particle Concentrator, verwendet. Restliche Primer werden aufgrund der Anwesenheit von photolytisch abspaltbarem Biotin am 5'-Ende an das Streptavidin-Bindungsmaterial gebunden. Eine kleine Zentrifugationssäule, wie NAP-5 (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ), kann verwendet werden, um kleinere Moleküle und Primer zu entfernen, bevor das Abfangen durch Streptavidin-Magnetkügelchen durchgeführt wird. Das immobilisierte PCR-Produkt, das jetzt an Streptavidin gebunden ist, wird photolysiert, wobei Biotin aus der DNA freigesetzt und das unmodifizierte PCR-Produkt gewonnen wird.
  • In Verfahren B (14B) ist das Problem der Primerkontamination beseitigt. DNA-Primer werden ohne 5'-Biotinylierung für die flankierenden Sequenzen der Target-DNA synthetisiert, wobei man herkömmliche Oligonucleotidsynthese verwendet. Normale dNTPs werden zusammen mit einem kleinen Pool PCB-dUTP in die PCR-Reaktionen eingeführt. Zweckmäßigerweise können die dNTPs und PCB-dUTP in Aliquoten, die in Verbindung mit PCR-Reaktionen verwendet werden sollen, vorgemischt werden. Die PCR-Produkte werden aus dem Gemisch, das weitere Komponenten des PCR-Gemischs einschließlich Nucleotiden, Enzymen, Puffern und Primern enthält, abgetrennt, indem man Streptavidin verwendet, wie es auf beschichteten Magnetkügelchen vorhanden ist (z. B. Dynabeads M-280 Streptavidin).
  • Das immobilisierte PCR-Produkt, das jetzt an Streptavidin gebunden ist, wird photolysiert, wobei Biotin aus der DNA freigesetzt und das unmodifizierte PCR- Produkt gewonnen wird. Verfahren A kann manchmal zu bevorzugen sein, wenn die immobilisierte DNA, die an Streptavidin gebunden ist, einem Assay unter Verwendung einer biotinylierten Sonde unterzogen werden soll. In diesem Fall konnte der gesamte Komplex nach dem Assay durch photolytische Spaltung freigesetzt werden, und dann erfolgte ein zusätzlicher Trennschritt, bei dem die biotinylierte Sonde entfernt wurde und das PCR-Produkt zur weiteren Verwendung, wie zum Klonieren, frei zurückblieb. Alternativ dazu kann auch Verfahren B zu bevorzugen sein, wenn die Freisetzung eines primerfreien Produkts ohne einen dazwischen durchgeführten Assay erforderlich ist. Dabei würde man auch eine höhere Ausbeute erhalten, da es mehr PCB-Moleküle pro DNA-Molekül gibt.
  • PCR wird auch verbreitet beim Nachweis einer Vielzahl von mit Krankheiten verbundenen Markern verwendet. Tabelle 7 zeigt die verschiedenen Verwendungen von PCR zum Nachweis von Krankheiten und Störungen und die potentiellen Verwendungen von PCR mit eingebautem PCB in solchen diagnostischen und forensischen Anwendungen.
  • Tabelle 7: PCR-Verwendung zum Nachweis von mit Krankheit verbundener DNA/RNA
    Figure 00670001
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Methodik auf der Grundlage von PCB für die Isolierung und den Nachweis von PCR-Produkten auf diagnostische Assays für eine Vielzahl von Krankheiten, den Nachweis von Mutationen sowie die Identifizierung von einzigartigen DNA-Sequenzen angewendet werden. Zum Beispiel stellen serologische Assays, wie Western-Blots sowie Immunofluoreszenz- und Radioimmunfällungsassays, ein schnelles und empfindliches Verfahren bereit, um ein Screening auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV-1 durchzuführen. Weiterhin werden bei der derzeitigen Analyse auf PCR-Basis stark konservierte Bereiche der viralen Genome als Targets für die Amplifikation verwendet und beinhalten eine Hybridisierung unter Verwendung von 32P-markierten Oligomersonden in Lösung gegenüber einem einzigen Strang eines amplifizierten Produkts. Diese Tests können nur für den direkten Nachweis des Virus verwendet werden. Ein nützlicher Assay zum Nachweis von HIV würde nicht nur aktives Virus nachweisen, sondern auch die Anwesenheit von latentem Virus, das sein Genom noch nicht exprimiert hat, aber noch in Zellen vorhanden ist. Dies würde die Bestimmung sowohl von latentem als auch von aktiv replizierendem Virus ermöglichen. Dies wäre besonders nützlich bei Neugeborenen, bei denen die mütterlichen Antikörper serologische Tests stören können.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können Konjugate der Erfindung verwendet werden, um effizient genomische oder cDNA-Bibliotheken zu erzeugen. Der Aufbau einer PCR-orientierten cDNA-Bibliothek aus Gesamt-RNA kann den einzigen methodischen Ansatz liefern, um eine zellspezifische Genexpression zu analysieren, wenn die Menge des biologischen Gewebes stark eingeschränkt ist. Dieser Ansatz ist besonders gut anwendbar, wenn ein spezieller Reiz zur Modifikation oder Differenzierung einer kleinen Zahl von Zellen innerhalb einer Population führt.
  • Derzeitige Schemata zum Aufbau zum Beispiel von cDNA-Bibliotheken erfordern die Isolierung von zellulärer RNA und gewöhnlich die weitere Reinigung von mRNA aus den häufigeren rRNA- und tRNA-Komponenten. Der Hauptvorteil bei Verfahren, die auf PCR beruhen, besteht darin, dass eine mRNA-Reinigung nicht notwendig ist. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn das biologische Material begrenzt ist, wobei eine effiziente mRNA-Reinigung unmöglich wäre. Die allgemeine Strategie ist in 15 schematisch dargestellt.
  • Intakte RNA hoher Qualität wird unter Verwendung des Guanidin-Hydrochlorid-Verfahrens hergestellt (S. J. Gurr et al., PCR: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, 1991). Der erste cDNA-Strang wird unter Verwendung von AMV-Reverser-Transcriptase in Gegenwart von PCB-dCTP in einem 1 : 1-Verhältnis zu dCTP (die endgültige Konzentration der beiden sollte dieselbe wie bei anderen dNTPs sein) synthetisiert. Daraufhin erfolgt eine Entfernung von Oligo-dT-Primern, die unter Verwendung von magnetischem Abfang mit anschließender Bestrahlung schnell und quantitativ durchgeführt werden kann. Derzeitige Verfahren verwenden CTAB-Fällung, die zu einem Verlust von wert vollen cDNA: RNA-Hybriden führt, und daraufhin erfolgt ein Homopolymer-Tailing unter Verwendung von Oligo-dG (A. Otsuka, Gene 13: 339, 1981). Nach dem Homopolymer-Tailing wird die RNA hydrolysiert, wodurch die cDNA harten Bedingungen, wie 50 mM NaOH bei 65°C, ausgesetzt wird. Diese Schritte sind bei Verwendung von PCB-Nucleotid-Konjugaten nicht notwendig. Die Synthese des zweiten Strangs und die Amplifikation der cDNA wird durch PCR in Gegenwart von PCB-Nucleotiden erreicht. Alle PCR-Produkte werden in Ethanol ausgefällt und mit einem in geeigneter Weise gespaltenen Vektor ligiert. Diese Vektoren werden unter Verwendung von magnetischem Abfang und Bestrahlung schnell gereinigt. Diese Vektoren können einem Screening unter Verwendung von PCB-modifizierten Hybridisierungssonden unterzogen werden, um den interessierenden Vektor selektiv zu entfernen. Dieser Vektor kann dann magnetisch abgefangen und bestrahlt werden, wobei man einen reinen Vektor erhält, der die interessierende DNA enthält.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung erleichtert das Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese. Zum Beispiel ist Cassetten-Mutagenese ein starker Ansatz zur Schaffung von ortsspezifischen Mutanten, der die Sequenzierung von ganzen Genen, um die Einführung der Mutation zu bestätigen, vermeidet. Grundlegende Schritte in der Cassetten-Mutagenese erfordern die Konstruktion eines Vektors, der das interessierende Gen mit wohl voneinander getrennten, einzigartigen Restriktionsstellen enthält. Ein Restriktionsabbau eines Vektors, der das interessierende Gen enthält, unter Verwendung von zwei einzigartigen Restriktionsenzymen wird durchgeführt, so dass eine Cassette von doppelsträngiger DNA, wo die Mutation eingeführt werden soll, entfernt wird.
  • Die Cassette, die die gewünschte Mutation enthält, wird unter Verwendung von automatisierter Oligonucleotidsynthese synthetisiert. Der gespaltene Vektor und die Cassette werden ligiert, wobei ein vollständiger Vektor entsteht. Diese ligierten Gemische werden in Wirtszellen transformiert, und die Kolonien werden einem Screening unterzogen, indem man die Cassettenbereiche von Plasmid-Mini-Preps sequenziert. Dieses Verfahren ist zwar in der Lage, schnell und genau eine große Zahl von ortsspezifischen Mutanten zu erzeugen, wie im Fall von Bacteriorhodopsin gezeigt wurde (H. G. Khorana, J. Biol. Chem. 263: 7439, 1988), doch gibt es mehrere Bereiche, wo unter Verwendung von PCB Zeit und Ressourcen gespart werden können.
  • Nach der anfänglichen Vektorrestriktion wird die neue mutantenhaltige Cassette entweder chemisch oder enzymatisch mit PCB markiert. Das anschließende Ligierungsgemisch wird unter Verwendung der Streptavidin-Wechselwirkung gereinigt, zum Beispiel durch magnetisches Abfangen mit Hilfe von Dynabead-280-Streptavidin. Das Abfangen führt zu einer selektiven Isolierung des rekombinanten Vektors, der die PCB-Cassette enthält, und der freien PCB-markierten Cassette. Durch Photolyse wird der mutantenhaltige Vektor in reiner Form in jeder gewünschten Lösung und Konzentration freigesetzt. Bei den anschließenden Transformanten besteht eine sehr hohe Wahrscheinlichkeit, dass sie nur die gewünschte Mutante enthalten.
  • Bei derzeitigen Vorschriften ist nach dem Restriktionsabbau des Vektors eine vollständige Reinigung des doppelt restringierten Vektors, zum Beispiel durch Agarose-Gel-Elektrophorese, häufig schwierig. Der Größenunterschied der resultierenden DNA-Fragmente ist typischerweise sehr gering. Zum Beispiel beträgt die Größe einer typischen Cassette etwa 30 Basenpaare (bp) und die eines typischen Vektors etwa 5000 bp. Der Abbau mit Restriktionsenzym zur Entfernung der Cassette erzeugt Fragmente von 5000 bp und 30 bp, die leicht voneinander unterschieden und isoliert werden können. Dies hieße jedoch anzunehmen, ein vollständiger Abbau sei erfolgt. Bei einem partiellen Abbau würde ein zusätzliches Fragment von 5030 bp entstehen, das nicht leicht nachzuweisen und noch viel weniger zu unterscheiden oder zu isolieren ist. Die ineffektive Reinigung des restringierten Vektors erzeugt also eine größere Chance der Ligierung ohne Einbau der mutanten Cassette. Bei der Verwendung von PCB wird die Gel-Elektrophorese und die anschließende Elution der restringierten Fragmente vermieden. Magnetisches Abfangen kann sogar im Ligierungsgemisch durchgeführt werden.
  • Liposomen werden verbreitet für die Zielsteuerung und die Einführung von biologisch wichtigen Materialien in Zellen durch Verschmelzen mit der Zellmembran verwendet (G. Gregoriadis (Hrsg.), Liposome Technology, Vol. III, CRC Press, Boca Raton, FL, 1984). Das Avidin-Biotin-System ist für in-vitro-Studien geeignet, um zwischen eingekapselten Liposomen und Zielzellen zu vermitteln. Diese Studien beinhalten die Verwendung von biotinhaltigen Phospholipiden, um Biotin in Membranen einzuführen (E. A. Bayer et al., Biochim. Biophys. Acta 550: 464, 1979). Mit dem Avidin-Biotin-System wurde auch versucht, Wirkstoffe zielgesteuert in Zellen einzuführen. In diesen Studien ist bestimmt worden, dass die Wirkungen der Biotinylierung auf die Eigenschaften des modifizierten Lipid- und biotinylierten Moleküls diese zwar chemisch verändern, doch ihre fundamentalen Eigenschaften aufrechterhalten. Zum Beispiel ist das biotinylierte Lipid vollständig in organische Lösungsmittel extrahierbar, bildet Liposomen und gemischte Liposomen und ist in letzteren korrekt orientiert (B. Rivnay et al., Methods Enzymol. 149: 119, 1987). Fettsäurekomponenten bilden das Innere der Doppelschicht, und die Biotinyl-Kopfgruppen sind zur wässrigen Umgebung des Lösungsmittel hin exponiert. Die Verwendung von biotinylierten Lipiden für die Liposomenherstellung ermöglicht also eine fast irreversible Bindung der Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung. Obwohl Biotin und seine Wechselwirkung eine leichte Manipulation dieser Liposomen erlaubt, schlägt jeder Versuch, diese Liposomen unter Verwendung von immobilisiertem Streptavidin, wie durch streptavidinbeschichtete Magnetkügelchen, zu konzentrieren oder zu abzutrennen, fehl, da es praktisch unmöglich ist, die konzentrierten/abgetrennten Liposomen von gebundenem Streptavidin zu trennen.
  • Durch die Verwendung von PCB-Lipiden werden diese Einschränkungen leicht überwunden, da die PCB-Lipid-haltigen Liposomen durch Bestrahlung in den gewünschten Konzentrationen in gewünschte Lösungen freigesetzt werden. Zu den Schritten, die bei den Manipulationen von Liposomen unter Verwendung von PCB-Lipiden beteiligt sind, gehören: (1) Bindung eines photolytisch abspaltbaren Biotinderivats an ein Liposom durch chemische Mittel oder alternativ dazu Einbau eines photolytisch spaltbaren Biotin-Lipids (PCB-Lipid) in ein Liposom, indem man zuerst das Lipid mit PCB derivatisiert und anschließend ein Liposom herstellt (PCB-Liposom), (2) Konzentration oder Abtrennung des PCB-Liposoms durch die selektive Wechselwirkung des photolytisch abspaltbaren Biotins mit Avidin, Streptavidin oder ihren Derivaten, die normalerweise auf einem Material, wie Magnetkügelchen, Affinitätssäulenpackungsmaterialien und Filtern, immobilisiert werden, und (3) Lösung des photolytisch abspaltbaren Biotins aus dem PCB-Liposom durch Bestrahlung mit einer Wellenlänge, die bewirkt, dass die kovalente Bindung des photolytisch abspaltbaren Biotins aufbricht.
  • Die Verfahren zur direkten Bindung verschiedener photolytisch abspaltbarer Biotine direkt an Liposomen beinhalten eine Modifikation der funktionellen Gruppen an den Lipidmolekülen unter Verwendung von PCB. Die Wahl eines besonderen photolytisch abspaltbaren Biotins hängt davon ab, welche molekularen Gruppen auf den Lipiden, die das Liposom bilden, derivatisiert werden sollen. Zum Beispiel könnte die Bindung des photolytisch abspaltbaren Biotins an ein Liposom bewerkstelligt werden, indem man eine kovalente Bindung mit der Aminogruppe am Phosphatidylserin bildet. Obwohl mehrere gruppenspezifische PCB-Derivate zur Verfügung stehen, die eine Modifikation einer beliebigen funktionellen Gruppe unter Bildung von PCB-Lipid erlauben, seien Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin beispielhaft erwähnt. PCB-Phosphatidylserin und PCB-Phosphatidylethanolamin sind in 16 gezeigt.
  • Die Konzentration und Abtrennung von Liposomen aus einem heterologen Gemisch wird unter Verwendung von photolytisch abspaltbarem Biotin leicht durch bewährte Verfahren erreicht, die ähnlich den herkömmlicheren Verfahren unter Verwendung von nichtspaltbaren Biotin-Lipiden sind. Dies beinhaltet normalerweise eine Affinitätstechnik auf der Basis der Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung, wodurch die Biotin enthaltenden Liposomen aufgrund ihrer Wechselwirkung mit Streptavidin immobilisiert werden. Diese Techniken beinhalten streptavidinbeschichtete Magnetkügelchen, Streptavidin-Sepharose-Säulen und Streptavidin-konjugierte Filter, von denen alle kommerziell erhältlich sind. Nach dem Konzentrieren der PCB-Liposomen unter Verwendung der Affinitätswechselwirkung mit Streptavidin können Liposomen durch Bestrahlung in einer gewünschten Lösung und mit der gewünschten Konzentration freigesetzt werden.
  • Die Avidin-Biotin-Technik wird häufig im Bereich der Affinitätscytochemie verwendet, wo spezielle Zellstrukturen oder subzelluläre Komponenten durch selektive Markierung lokalisiert werden. Zwei verschiedene Ansätze, die Immunohistochemie (IHC) und in-situ-Hybridisierung (ISH) genannt werden, stehen zur Verfügung. Bei der IHC ist ein primärer Antikörper oder Bindungsligand, der biotinyliert ist (alternativ dazu kann auch ein biotinylierter sekundärer Antikörper verwendet werden), gegen ein spezifisches Antigen auf der Oberfläche einer Zelle oder zellulären Struktur gerichtet. Dann wird die Zelle oder zelluläre Struktur durch Auftragung eines Reporterkomplexes lokalisiert, der aus einem Avidin-Enzym-Konjugat, einem Avidin-Fluoreszenzmarker oder einem Avidin-Ferritin-Komplex für die elektronenmikroskopische Lokalisierung bestehen könnte.
  • Bei der ISH wird eine DNA-Sonde, die biotinyliert ist, verwendet, um den Ort einer spezifischen mRNA- oder DNA-Sequenz in einzelnen Zellen oder Gewebeschnitten zu markieren. Ein ähnlicher Bereich von Reporterkomplexen auf Avidinbasis wie in der Immunohistochemie kann verwendet werden, einschließlich Enzym-, Fluoreszenz- und Ferritin-konjugierter Avidine. Eine starke Einschränkung der herkömmlichen Anwendung dieser beiden Techniken ist jedoch die Schwierigkeit, den Biotin-Marker-Komplex zu entfernen, sobald ein Marker auf die Probe angewendet wurde. Die Entfernung des Markers würde es ermöglichen, zusätzliche Marker anzubringen und dadurch ein Mittel bereitzustellen, um die Beziehung zwischen verschiedenen zellulären und subzellulären Komponenten in einem Gewebe zu kartieren. Die Verwendung von PCB liefert ein bequemes Mittel, um dieses Ziel zu erreichen, da die photolytische Spaltung des Linkers, der den Antikörper oder die DNA-Sonde und PCB miteinander verbindet, zur Freisetzung des Markerkomplexes führt.
  • In-situ-Hybridisierungstechniken werden verwendet, um spezielle zelluläre DNA oder DNA, die in einzelnen Zellen oder Gewebeschnitten ungleichmäßig verteilt ist, nachzuweisen und virale Nucleinsäuresequenzen, die häufig auf Brennpunkte verteilt sind, nachzuweisen. Im Gegensatz zu Southern-, Northern- oder Dot-Blot-Hybridisierungsassays, die den mittleren Gehalt an Zielmolekülen pro Zelle im extrahierten Gewebe bestimmen, weist ISH spezielle Zielsequenzen nach, die in einer kleinen Zahl von Zellen, die erhebliche Mengen an Zielmolekülen enthalten, als Brennpunkte verteilt sind (E. J. Gowans et al., Nucleic Acid Probes, R. H. Symons (Hrsg.), CRC Press, Boca Raton, FL, 1989).
  • Die derzeitige Technik ist durch die Tatsache beschränkt, dass ein einziger Gewebeschnitt, Chromosomenpräparat oder Zellpräparat nur einmal verwendbar ist und eine Sondierung der Verteilung eines zweiten Targets, bei dem es sich um eine andere Gruppe von Sequenzen, die coreguliert werden oder korreliert sind, handeln würde, fast unmöglich ist. PCB-markierte Sonden bieten einen vollständig nicht-invasiven Ansatz für mehrere in-situ-Hybridisierungen mit einer so wertvollen Probe. Kombiniert mit mehreren in-situ-Hybridisierungen kann ein zusammengesetztes Bild der Verteilung von verschiedenen Nucleinsäuren konstruiert werden. Die Vorschrift für ISH ist an veröffentlichte Verfahren angelehnt (D. J. Brigati et al., Virol. 126: 32, 1983; I. Guerin-Reverchon et al., J. Immunol. Meth. 123: 167, 1989). Das Verfahren beinhaltet ein sorgfältiges Fixieren und Schneiden von Geweben, bei denen es sich entweder um Paraffinschnitte oder um Gefrierschnitte handeln kann. Durch die Fixierung sollen nicht nur Nucleinsäuren fixiert, sondern auch der Schnitt fest an den Objektträger gebunden werden. Glutaraldehyd wird für DNA- und Paraformaldehyd für RNA-Nachweis verwendet. Beide Schritte beinhalten wahlfreie Denaturierungsschritte, die notwendig sind, wenn dsDNA oder dsRNA das Ziel der Reaktion ist. Weitere Schritte beinhalten die Herstellung von verschiedenen Sonden, die unter Verwendung von PCB markiert werden, und die Hybridisierung dieser Sonden in sequentieller Weise. ISH folgt denselben allgemeinen Prinzipien wie eine Lösungs- und Filterhybridisierung (R. J. Britton et al., Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames und S. J. Higgins (Hrsg.), IRL Press, Oxford, 1985). Dann wird PCB-markierte Sonde mit Hilfe verschiedener Techniken, die Streptavidin-konjugierte Nachweissysteme verwenden, nachgewiesen. Es wird ein Bild erhalten, das die Verteilung der ersten Sonde in dem Gewebeschnitt oder Chromosomenbild zeigt. Photolyse führt zur Freisetzung des Nachweisaggregats zusammen mit der Biotin-Struktureinheit. Dann werden ISH und Nachweis mit einer zweiten Sonde wiederholt, und ihre Verteilung wird erhalten. Es entsteht ein zusammengesetztes Bild, das die Verteilung einer Vielzahl von Sonden in dem Gewebeschnitt zeigt.
  • In-situ-Hybridisierungs-(ISH)-Techniken werden ebenfalls verwendet, um entweder spezifische zelluläre DNA- oder RNA-Sequenzen auf dem chromosomalen Niveau in einzelnen Zellen oder Gewebeschnitten nachzuweisen. Das Verfahren wird als Hybridisierungshistochemie bezeichnet. ISH ist nicht nur für den Nachweis von zellulären Nucleinsäuresequenzen, die in Geweben oder Zellen ungleichmäßig verteilt sind, sondern auch für den Nachweis von viralen Nucleinsäuresequenzen, die häufig in Brennpunkten verteilt sind, ideal geeignet. Der Nachweis von Nucleinsäure durch ISH erfüllt das primäre Ziel, die interzelluläre und intrazelluläre Verteilung von Zielmolekülen in der Probe genau widerzuspiegeln. Im Allgemeinen kann ISH verwendet werden, um DNA, die normalen oder abnormalen Genen entspricht, nachzuweisen, um den Ort bestimmter DNA-Sequenzen im Chromosom zu identifizieren und um das Expressionsniveau dieser Gene durch mRNA-Nachweis zu messen.
  • Insbesondere ist mRNA ein häufiges Ziel für eine in-situ-Hybridisierungsreaktion in Studien der Genexpression und Zelldifferenzierung. In den speziellen Fällen von virusinfizierten Zellen können entweder virale genomische Nucleinsäure oder RNA-Transcripte nachgewiesen werden. ISH ist besonders wertvoll, wenn man eine histologische Kartierung von Zielzellen innerhalb eines Gewebes vornehmen möchte. Dagegen messen Southern-, Northern- oder Dot-Blot-Hybridisierungsassays die Gesamtkonzentration der Zielmoleküle pro Zelle in dem extrahierten Gewebe. Wenn bei der Anwendung der Immunchemie und der in-situ-Hybridisierung PCB anstelle von Biotin verwendet wird, ist das Verfahren zur Lokalisierung eines Markers fast identisch. Ein wichtiger Vorteil ist jedoch die Fähigkeit, den Marker in Form eines PCB-Avidin-Marker-Komplexes vollständig zu entfernen, indem man die Probe einfach bestrahlt, wodurch die PCB-Bindung zum Antikörper oder zur Hybridisierungssonde photolytisch gespalten wird. Durch diesen Schritt wird die Probe, typischerweise ein Gewebeschnitt, für weitere sequentielle Markierung durch zusätzliche, unterschiedliche Sonden verfügbar.
  • Es besteht häufig eine Notwendigkeit, zu bestimmen, ob antigene Peptide, Hormone oder virale Genprodukte, die mit immunhistochemischen Techniken intrazellulär nachgewiesen werden, eine de-novo-Synthese oder lediglich eine Ablagerung und passive Anhäufung darstellen. Es ist auch nützlich, zu bestimmen, ob eine spezielle mRNA, die durch ISH nachgewiesen wird, zu einem Proteinprodukt translatiert wird. Die Verwendung von PCB erleichtert eine solche Bestimmung, da die sequentielle Befragung einer einzigen Probe unter Verwendung desselben Enzym-Avidin-verknüpften Reporterkomplexes möglich ist. Dieser Ansatz vermeidet Komplikationen aufgrund der Verwendung von unterschiedlichen Proben.
  • Viele verschiedene Gene, die anders nur schwierig oder unmöglich zu lokalisieren sind, können unter Verwendung von Konjugaten der Erfindung lokalisiert werden. Neurotransmitter-Rezeptoren sind Mitglieder großer Genfamilien. Durch eine Kombination von Expressionsstrategien und Homologie-Klonierung wurden jetzt Dutzende von Rezeptor-Genen in dieser Familie kloniert. Zu diesen Genen gehören diejenigen, die Rezeptoren für Glutamat, Glycin und γ-Aminobuttersäure (GABA) codieren. Die Klonierung hat die Existenz von unterschiedlichen Neurotransmitter-Rezeptoren in Zahlen gezeigt, die von Neurophysiologen nicht erwartet wurden. Die Bedeutung dieser überraschenden Rezeptor-Homogenität ist noch nicht bekannt, doch ISH hat gezeigt, dass einzelne Rezeptor-Subtypen im Gehirn in einzigartigen Mustern exprimiert werden. Ein wichtiges Ziel besteht darin, die Verteilung dieser Rezeptoren im Gehirn zu bestimmen. Gewöhnlich geschieht dies unter Verwendung von vielen dünnen Schnitten, die jeweils einer anderen Hybridisierungssonde ausgesetzt werden. Diese Experimente leiden jedoch unter der Verwendung von mehreren Gewebeschnitten. Dagegen würde die Verwendung von PCB eine wiederholte Analyse desselben Rattenhirnschnitts ermöglichen, um die vollständige Verteilung jeder Rezeptorexpression zu bestimmen.
  • Weiterhin können klonierte Gene und Marker durch ISH in speziellen Bereichen von Chromosomen lokalisiert werden. Sequenzen können in subchromosomalen Bereichen lokalisiert werden, indem man radioaktiv markierte Sonden direkt mit Metaphasenpräparaten hybridisiert. Metaphasenpräparate werden hergestellt, indem man Zellen verwendet, deren Teilung durch eine Chemikalie wie Colcemid, das die Mitosespindel zerstört, in der Metaphase blockiert wurde. Nach dem Fixieren und Anfärben entwickelt sich auf jedem Chromosom ein Muster von hellen und dunklen Bändern, so dass die Chromosomen identifiziert werden können. Nach der ISH wird der Ort der radioaktiven Sonde durch die Verteilung von Silberkörnern in einer photographischen Emulsion, die über das Präparat geschichtet wird, offenbart. Der Nachweis einzelner Kopien von humanen Genen ist jedoch schwierig und kann nur erfolgen, indem man die Verteilung von Körnern in bis zu 30 oder mehr Metaphasenpräparaten miteinander kombiniert.
  • PCB bietet den einzigartigen Vorteil, dass die Sonde nach der Lokalisierung einer speziellen genetischen Sequenz auf einem Chromosom photolytisch freigesetzt und eine zweite Sonde angewendet werden kann. In Fällen, bei denen zu nahe beieinander liegende Sequenzen nachgewiesen werden sollen, kann die vorherige Entfernung der Sonde wesentlich sein, um eine Störung durch die ursprüngliche Sonde zu vermeiden. Außerdem erlaubt das Verfahren die Verwendung einer großen Zahl von Sonden, die nacheinander anzuwenden sind, und ist nicht durch die Verfügbarkeit verschiedener Markerkomplexe, die gleichzeitig gemessen werden können, beschränkt. Diese Technik könnte auch mit Vorteil für die schnelle Ordnung mehrerer Sonden auf einem Chromosom verwendet werden.
  • Eine wichtige Anwendung der Biotin-Avidin-Technik ist die Abtrennung von Zellen aus einem komplexen Gemisch, das häufig eine Vielzahl von unterschiedlichen Zelltypen enthält. Zu den Zellen, die verwendet werden können, gehören Zellen innerhalb einer biologischen Probe, Gewebekulturzellen, Bakterienzellen und kranke Zellen. Die Zellen können Säugerzellen sein, wie Säuger-Stammzellen oder fetale Säugerzellen. Zu den Rezeptoren gehören Antikörper, die gegen die klassischen Zelloberflächenrezeptoren und andere Oberflächenproteine gerichtet sind, aber auch jedes Zelloberflächenmolekül, das eine spezifische Affinität zu einem anderen Molekül hat. Vorzugsweise ist der Rezeptor ein Antikörper, der einen Zelloberflächenmarker auf der Zielzelle erkennt, oder ein spezifisches Protein, das einen Zelloberflächenliganden oder ein anderes Makromolekül auf der Zielzelle erkennt. PCB-modifizierte Antikörper, die spezifisch für Oberflächenantigene, Rezeptoren oder Liganden auf der Zelle sind, können für die Zelltrennung oder Zellsortierung mit zum Beispiel einer Apparatur wie einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsorter (FACS) verwendet werden. Wenn diese PCB-Antikörper mit streptavidinbeschichteten Magnetkügelchen verknüpft sind, können sie an die spezifische Zellpopulation, die ein besonderes Antigen trägt, binden und dann mit Hilfe von immunmagnetischer Trennung (IMS) abgetrennt werden.
  • Die derzeitigen Methoden erlauben keine vorsichtige Abtrennung dieser Magnetteilchen aus einer getrennten oder sortierten Zellpopulation. PCB-modifizierte Antikörper können jedoch nach Bestrahlung leicht von den Magnetteilchen abgetrennt werden. IMS, die PCB-Antikörper beinhaltet, kann beim Zellsortieren, zur Gewebegruppenbestimmung und zur selektiven Anreicherung von Mikroorganismen unter Verwendung von Modifikationen von früher beschriebenen Vorschriften (A. Elbe, J. Immunol. 149: 1694, 1992; S. Qin, Sci. 259: 974, 1993; L. Leclercq, Immunol. Lett. 28: 135, 1991) verwendet werden.
  • Bei herkömmlichen Verfahren wird ein biotinylierter Antikörper verwendet, der selektiv an ein Antigen bindet, das nur auf der Zielzelle vorkommt. Dann können die Zielzellen unter Verwendung von streptavidinbeschichteten Magnetkügelchen oder Affinitätssäulen auf Streptavidin-Basis aus dem Gemisch isoliert werden. Das Affinitätsmaterial enthält zuweilen einen sekundären Antikörper, der gegen den primären Antikörper gerichtet ist. Eine starke Einschränkung dieses Ansatzes ist die Schwierigkeit, die Zellen freizusetzen, sobald sie durch die Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung an das Affinitätsmedium gebunden sind. Normale Verfahren, die die Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung oder die Antikörper-Antigen-Wechselwirkung aufbrechen sollen, können die Gesamtlebensfähigkeit der freigesetzten Zellen reduzieren. Dies ist ein schwerer Nachteil, wenn die Zellen später zum Kultivieren oder für eine Transplantation verwendet werden sollen. Ähnlich können auch Bedingungen wie ein niedriger pH-Wert, die die Antikörper-Antigen-Wechselwirkung aufbrechen, eine Zellschädigung verursachen. Eine Standardtechnik ist die Inkubation über Nacht in einem Kulturmedium mit anschließendem kräftigem Mischen. Dies verursacht ein Abstoßen des Antigens, das an der Bindung beteiligt ist. Dieses Verfahren ist jedoch zeitraubend, kann zu einem Zellabbau führen und führt zu keiner vollständigen Freisetzung. Ein alternatives Verfahren besteht darin, die Antikörper-Antigen-Wechselwirkung mit einer enzymatischen Behandlung aufzubrechen, die für eine Zelle ebenfalls schädigend sein kann. Ein weiteres Verfahren ist die Verwendung von Anti-FAB-Antikörpern, die mit dem Antigen konkurrieren sollen. Solche Verfahren sind zeitraubend, aufgrund der Verwendung von Antikörpern teuer und nur teilweise effektiv. Diese Verfahren zur Ablösung (Freisetzung) von Zellen sind alle besonders ineffektiv, wenn die Antikörper-Antigen-Wechselwirkung stark ist oder die Bindung mehrere Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen beinhaltet, die miteinander gemischt sind. Herkömmliche Biotine, die chemisch abgespalten werden können, wie NHS-SS-Biotin (Sulfosuccinimidyl-2-(biotinamido)ethyl-1,3-dithiopropionat; Pierce Chemical; Rockford, IL), führen zu schweren Problemen, da das Abspaltungsmedium, das aus einer hohen Konzentration von Reduktionsmitteln, wie Thiolen, besteht, eine Reduktion der Protein-Disulfidbindungen und einen anschließenden Verlust der Lebensfähigkeit der Zelle verursacht.
  • Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren bietet photolytisch abspaltbares Biotin eine kostengünstige, effektive und schnelle Methode, um immobilisierte Zellen freizusetzen, indem man einfach Bestrahlung mit Licht verwendet. Die Freisetzung erfolgt aufgrund der photolytischen Spaltung der kovalenten Bindung zwischen dem Antikörper und dem Biotin. Während der Antikörper noch an die freigesetzte Zelle gebunden bleibt, ist dies normalerweise kein Problem für die Zellintegrität oder für die zusätzliche Verwendung der abgetrennten Zellen. Da die photolytische Spaltung in kurzen Zeiträumen durchgeführt werden kann und zur fast vollständigen Entfernung des photolytisch abspaltbaren Biotins führt, verläuft die Freisetzung schnell und vollständig.
  • Weiterhin können unter Verwendung von photolytisch spaltbaren Konjugaten Zellen, die eine sehr kleine Population der Zellenprobe darstellen, genau und effizient selektiert werden. Dies ermöglicht Verfahren wie die Selektion von Immunzellen, Stammzellen, fetalen Zellen, Vorläuferzellen und fast allen Zelltypen aus Lymph- (z. B. interstitiell, lymphatisch), Blut- (z. B. arterielles und peripheres Blut) oder Gewebeproben (Organe, Weichgewebe, Muskeln). Dann können die selektierten und isolierten Zellen in sehr großen Zahlen kultiviert und möglicherweise wieder in denselben oder in einen anderen Patienten eingeführt werden. Die kultivierten Zellen können auch in der Gentherapie durch die Einführung von genetischem Material in kultivierte Zellen verwendet werden. Solche Techniken sind unter Verwendung herkömmlicher Nachweis- und Isolierungsverfahren nicht möglich.
  • Derselbe Ansatz kann auch verwendet werden, indem man photolytisch abspaltbares Biotin mit anderen zellspezifischen Makromolekülen, wie zellassoziierten Liganden oder Antigenen, verknüpft. Zum Beispiel könnten B-Zellen, die einen spezifischen Immunglobulinrezeptor für ein Target-Antigen exprimieren, isoliert werden, indem man photolytisch abspaltbares Biotin an das Target-Antigen bindet und es dann an ein streptavidinbeschichtetes Kügelchen bindet. Alternativ dazu könnten unter Verwendung dieses Ansatzes auch ein Hybridom-Screening und eine Stammzellselektion durchgeführt werden.
  • Die drei grundlegenden Schritte, die an der Zellisolation unter Verwendung von PCB beteiligt sind, sind (1) Bindung eines photolytisch abspaltbaren Biotins oder eines Moleküls, das ein photolytisch abspaltbares Biotinderivat enthält einschließlich Antikörpern, Rezeptorliganden und Antigen an die Oberfläche der Zielzelle durch eine photochemisch spaltbare Bindung, (2) Abtrennung des Zelltyps von anderen Zellen und Materialien in dem komplexen Gemisch durch die selektive Wechselwirkung des photolytisch abspaltbaren Biotins mit Avidin, Streptavidin oder ihren Derivaten und (3) Ablösung des photolytisch abspaltbaren Biotins von dem Zelltyp durch Bestrahlung mit einer Wellenlänge, die bewirkt, dass die kovalente Bindung des photolytisch abspaltbaren Biotins aufbricht. Diese Schritte unter Verwendung von PCB können in Kombination mit gewöhnlichem Biotin durchgeführt werden. In diesem Fall können Zellen, die zwei oder mehr Oberflächenmarker enthalten, von denjenigen, die nur einen enthalten, getrennt werden. Jeder dieser Schritte ist in 17 gezeigt.
  • Mehrere Anwendungen für die Verwendung von PCB für die Zelltrennung bietet klare Vorteile gegenüber der vorhandenen Technik. Ein übliches Verfahren zur Isolierung von Zellen besteht darin, die Zelle mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren, der über ein Antikörper-Fluoreszenzfarbstoff-Konjugat gegen die Zielzelle gerichtet ist. Dann können die Zellen abgetrennt werden, indem man eine fluoreszenzaktivierte Zellsortiervorrichtung verwendet, und für eine Vielzahl von Zwecken einschließlich der Zelltypbestimmung, Hybridomproduktion und Gewebekultivierung verwendet werden. Bei dieser Technik bleiben die abgetrennten Zellen jedoch mit dem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Dies kann zu einer Reduktion der Zelllebensfähigkeit führen, ihre Verwendung in therapeutischen Anwendungen verhindern, wo der Farbstoff toxisch sein kann, und die weitere Sortierung auf Fluoreszenzbasis in Subspezies von Zellen verhindern. Ein Beispiel wäre die Abtrennung von Lymphocyten unter Verwendung von charakteristischen Antigenen, wie CD2, CD4, CD8 und CD19, mit anschließender Sortierung in Subspezies.
  • Ein alternativer Ansatz besteht darin, einen Antikörper zu verwenden, der mit PCB konjugiert ist. In diesem Fall kann die Zelle mit einem Avidin-Fluorescein-Komplex markiert werden, der in einer Vielzahl von Formen kommerziell erhältlich ist (Tabelle 8). Der Fluoreszenzmarker kann dann durch photolytische Abspaltung des PCB entfernt werden, was zur Freisetzung des PCB-Avidin-Fluoreszenzfarbstoff-Komplexes führt. Es gibt eine Vielzahl von Fluoreszenzmarkern, die in einem Bereich außerhalb der Absorptionsbande des PCB absorbieren, so dass eine photolytische Spaltung während der Zellsortierung vermieden wird.
  • Tabelle 8: Kommerziell erhältliche Avidin-Fluoreszenzfarbstoff-Komplexe
    Figure 00820001
  • Ein weiteres Beispiel für die Nützlichkeit der PCB-Methode für die Zellisolierung ist die Isolierung von B-Zellen für die Hybridomproduktion. Kurz gesagt, die Bildung von Hybridomen zum Zweck der Produktion von monoklonalen Antikörpern beinhaltet die Fusion von Myelomzellen mit B-Lymphocyten. Im Allgemeinen wird eine heterogene Population von B-Zellen verwendet, die verschiedene Immunglobulinrezeptoren enthält. Das Hybridom, das den gewünschten Antikörper exprimiert, wird dann durch Screening selektiert, indem man auf Bindung zu einem besonderen Antigen testet. Dieses Screeningverfahren kann zeitraubend und teuer sein. Das Screening könnte vermieden werden, wenn es ein Verfahren zur Isolierung einer besonderen Population von B-Zellen gäbe, die nur den gewünschten Immunglobulinrezeptor exprimieren. Im Prinzip könnte dies bewerkstelligt werden, indem man ein biotinyliertes Antigen verwendet, wie ein Polypeptid mit einer spezifischen Sequenz, das nur an diejenigen B-Zellen bindet, die die spezifischen Immunglobulinrezeptoren für das Antigen exprimieren. Diese Unterpopulation von B-Zellen könnte dann selektiert werden, indem man Avidin-Affinitätstechniken, wie avidinbeschichtete Magnetkügelchen, verwendet. Der anschließende Schritt der Hybridombildung wird jedoch immer noch verhindert, es sei denn, die B-Zellen können in lebensfähiger Form aus dem Avidin-Biotin-Komplex freigesetzt werden.
  • Bei Verwendung von PCB-Biotin wird dieses Problem vermieden, indem ein einfaches Verfahren zur Freisetzung der B-Zellen in lebensfähiger Form nach der Immobilisierung durch die Biotin-Avidin-Wechselwirkung bereitgestellt wird. Die photolytische Spaltung der photolytisch spaltbaren Biotinbindung zu dem Antikörper führt zur Freisetzung der B-Zellen und des gebundenen Antigens, das jetzt in unmodifizierter Form vorliegt. Da keine chemische Behandlung erforderlich ist, behalten die Zellen ihre Lebensfähigkeit für eine weitere Fusion mit den Myelomzellen. Weiterhin ist das Verfahren schnell und für die Automatisierung geeignet.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Targets, die nach dem obigen Verfahren isoliert wurden und in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können, um Krankheiten und Störungen zu behandeln oder zu verhindern. Pharmazeutische Zusammensetzungen können die isolierten Targets sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie Wasser, Öle, Lipide, Saccharide, Polysaccharide, Glycerine, Collagene oder Kombinationen dieser Komponenten, umfassen. Die Zusammensetzung wird Patienten für die Behandlung oder Prävention von bestimmten Krankheiten und Störungen und für die ortsspezifische Verabreichung von pharmazeutischen Wirkstoffen verabreicht.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der in-vivo-Halbwertszeit eines Pharmakons in einem Patienten. Konjugate gemäß der Erfindung werden gebildet, indem man das Pharmakon. über eine kovalente Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, an ein bioreaktives Reagens koppelt. Die Konjugate werden dem Patienten verabreicht, und danach werden zwei oder mehr biologische Proben entnommen. Die Proben werden mit elektromagnetischer Strahlung behandelt, um das Pharmakon von dem bioreaktiven Agens freizusetzen, und die Menge des bioreaktiven Agens in den biologischen Proben wird bestimmt, und daraus wird die in-vivo-Halbwertszeit des Pharmakons bestimmt.
  • Das Pharmakon kann eine Zusammensetzung sein, die Cytokine, Immunsystemmodulatoren, Agentien des Blutbildungssystems, Chemotherapeutika, Radioisotope, Antigene, Antineoplastika, rekombinante Proteine, Enzyme, PCR-Produkte, Nucleinsäuren, Hormone, Impfstoffe, Haptene, Toxine, Antibiotika, naszierende Proteine, synthetische und rekombinante Pharmaka sowie Derivate und Kombinationen dieser Komponenten umfasst. Die Konjugate können den Patienten durch parenterale Verabreichung, sublinguale Verabreichung, enterale Verabreichung, pulmonale Resorption, topische Applikation und Kombinationen davon verabreicht werden. Zu den Tieren, die getestet werden können, gehören Säuger, wie Menschen, Rinder, Schweine, Schafe, Hunde, Katzen, Pferde und Nager. Bei den biologischen Proben, die entnommen werden, kann es sich um eine Probe von peripherem Blut, Blutplasma, Serum, Liquor, Lymphe, Urin, Stuhl, ophthalmischen Flüssigkeiten, Organen und Körpergeweben handeln.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die gesteuerte Freisetzung eines Substrats in ein Medium. Konjugate gemäß der Erfindung, die aus einem bioreaktiven Agens bestehen, das durch eine kovalente Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, an das Substrat gekoppelt ist, werden gemäß der obigen Beschreibung hergestellt. Diese Konjugate werden an eine Oberfläche eines Artikels gebunden, der in das Medium eingebracht wird. Die Oberfläche des Artikels wird einer abgemessenen Dosis elektromagnetischer Strahlung ausgesetzt, und das Substrat wird in das Medium freigesetzt, um eine günstige Wirkung auszuüben. Alternativ dazu kann auch ein Artikel an einer ausgewählten Stelle platziert werden, und die Konjugate, die eine Affinität zu dem Artikel aufweisen, werden an einer distalen Stelle verabreicht. Die Konjugate wandern dann zu der ausgewählten Stelle und üben eine beabsichtigte Funktion aus. Nach der Beendigung dieser Funktion wird Strahlung angewendet, und das Substrat wird aus den fixierten bioreaktiven Agentien freigesetzt. Das freigesetzte Substrat kann auf natürliche Weise aus dem System des Patienten beseitigt werden. Dies kann in hohem Maße nützlich sein, zum Beispiel bei der Strahlentherapie für Krebspatienten.
  • Bevorzugt sind Strahlungswellenlängen, die das Medium durchdringen können. Je nach der Menge und Frequenz der Strahlungseinwirkung kann die Freisetzung gesteuert und über einen bestimmten Zeitraum fortgesetzt werden. Dieses verfahren ist für die gesteuerte und ortsspezifische Verabreichung von pharmazeutischen Zusammensetzungen an einen Patienten geeignet. In solchen Fällen kann das Medium, in das der Artikel gegeben wird, Blut, Lymphe, interstitielle Flüssigkeit oder ein Gewebe sein. Die gesteuerte Freisetzung kann auch in Gewebekultur durchgeführt werden, um eine konstante oder periodische Menge eines Substrats an eine Zellkulturflüssigkeit oder eine ausgewogene Salzlösung zur Aufnahme durch Zellen zu verabreichen. Zu den Artikeln, die an Substrat gekoppelt und innerhalb oder in der Nähe des Körpers eines Patienten platziert werden können, gehören Artikel, die Kohlenhydrate, Lipide, Proteine, Polysaccharide, Cellulose, Metalle einschließlich Magneten, organische Polymere und Kombinationen davon umfassen. Vorzugsweise ist die Oberfläche des Artikels mit Streptavidin beschichtet, und das bioreaktive Agens ist photolytisch abspaltbares Biotin.
  • Alternativ dazu können Artikel, die Konjugate oder Agentien enthalten, an der Stelle der Störung, wie einem Tumor, eingesetzt werden. Der pharmazeutische Wirkstoff, wie zum Beispiel ein radioaktives Agens, wird dem Patienten verabreicht und wird an die fixierten Konjugate oder Agentien gebunden. Wirkungen, die sich dem pharmazeutischen Wirkstoff zuordnen lassen, werden lokalisiert. Der Artikel wird einer gemessenen Dosis elektromagnetischer Strahlung ausgesetzt, und die pharmazeutischen Wirkstoffe werden in den Körper freigesetzt und ausgeschieden. Dieses Verfahren wird bevorzugt, wenn nur eine kurzfristige Einwirkung des pharmazeutischen Wirkstoffs gewünscht wird, oder um potentiell schädliche Agentien effizient zu entfernen, nachdem sie ihre gewünschten Wirkungen ausgeübt haben.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines photolytisch abspaltbaren Oligonucleotids. Ein bioreaktives Agens wird hergestellt, das aus einer photoreaktiven Struktureinheit besteht, die an eine nachweisbare Struktureinheit gekoppelt ist und ein Phosphoramidit enthält. Das Oligonucleotid wird unter Verwendung von herkömmlicher Phosphoramiditchemie synthetisiert. Die Nucleotidvorläufer umfassen ein oder mehrere photolytisch abspaltbare Phosphoramidite, wie Purin-Phosphoramidite (Uracil, Cytosin, Thymin) oder Pyrimidin-Phosphoramidite (Adenin, Guanin) als Ribose- oder Desoxyriboseformen oder Derivate davon. Dieses Verfahren kann manuell oder automatisch unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Oligonucleotid-Synthe sizers durchgeführt werden. Photolytisch abspaltbare Oligonucleotide können als Primer oder Sonden, in Diagnosekits und in jedem Fall, in dem eine Nucleinsäure verwendet werden kann, verwendet werden.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Zielmoleküls in einem heterologen Gemisch. Konjugate werden gebildet, indem man ein Substrat mit einer kovalenten Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, an ein bioreaktives Agens koppelt. Die Konjugate werden mit dem heterologen Gemisch in Kontakt gebracht, um das Substrat mit einem oder mehreren Zielmolekülen zu koppeln. Ungekoppelte Konjugate werden entfernt, und die gekoppelten Konjugate werden mit elektromagnetischer Strahlung behandelt, um die nachweisbare Struktureinheit freizusetzen. Die Anwesenheit von Zielmolekülen kann durch Nachweis der Anwesenheit der freigesetzten nachweisbaren Struktureinheit nachgewiesen werden. Zielmakromoleküle können Proteine, Peptide, Nucleinsäuren, Lipide, Polysaccharide, Metallverbindungen, Viren, Bakterien, eukaryontische Zellen, Parasiten sowie Derivate und Kombinationen davon sein. Sobald sie nachgewiesen wurden, können Zielmakromoleküle isoliert werden, und die isolierte Menge kann durch eine der gängigen Techniken quantifiziert werden, die dem Fachmann zur Verfügung stehen.
  • Eine spezielle Anwendung der Streptavidin-Biotin-Technik ist der Nachweis von Targets in der medizinischen Diagnose. Im Allgemeinen ist das Target ein biotinyliertes Molekül oder eine biotinylierte Sonde für das Zielmolekül. Die Wechselwirkung von Streptavidin mit dem biotinylierten Target oder der Sonde wird durch ein mit Streptavidin konjugiertes Enzym amplifiziert, das eine chromogene Reaktion katalysiert. Zum Beispiel ist eine Vielzahl von Enzymen, die mit Streptavidin konjugiert sind, kommerziell erhältlich; dazu gehören Meerrettich-Peroxidase, β-Galactosidase, Glucose-Oxidase und Alkalische Phosphatase. Jedes dieser Enzyme katalysiert eine chromogene Reaktion. Zusätzliche Nachweisverfahren beinhalten das Konjugieren von Streptavidin mit fluoreszenten, chemifluoreszenten, radioaktiven oder elektronendichten Molekülen.
  • Ein Beispiel für die Biotin-Avidin-Wechselwirkung in der medizinischen Diagnose bildet auch die Grundlage für ein weites Feld von enzymabhängigen immunspezifischen Assays (ELISA). In diesem Fall wird ein Antikörper, der spezifisch für das Zielmolekül ist, der primäre Antikörper, oder ein sekundärer Antikörper, der gegen den primären Antikörper gerichtet ist, biotinyliert. Der Nachweis erfolgt mit einem Streptavidin-Enzym-Konjugat gemäß der obigen Beschreibung. Eine große Zahl von Immunassays wurde auf der Grundlage dieses Ansatzes entwickelt. Es ist jedoch unter Verwendung der herkömmlichen Technik nicht leicht, mehrere Immunoassays mit derselben Probe durchzuführen, da es kein einfaches Verfahren gibt, um den Avidin-Enzym-Komplex zu entfernen, sobald er an ein Biotinderivat gebunden ist, ohne die Probe zu beschädigen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden kann PCB viele Male für mehrfache Assays an derselben Probe wiederverwendet werden, um ein mehrfaches Screening nach Pathogenen und anderen Markern menschlicher Krankheiten durchzuführen.
  • Die Biotin-Avidin-Wechselwirkung bildet auch die Basis für empfindliche Verfahren zum Nachweis spezifischer Nucleinsäuresequenzen, wie das Screening von humanen DNA-Proben. DNA- oder RNA-Sonden, die mit einer Target-DNA-Sequenz hybridisieren, werden biotinyliert. DNA, die die Targetsequenz enthält, wird mit einem Streptavidin-Enzym-Konjugat nachgewiesen. Dieses Verfahren wird in Verbindung mit der Polymerase-Kettenreaktion verwendet, wobei das Target-Gen oder die Target-Sequenz, nach der gesucht werden soll, zuerst mit Hilfe von spezifischen Primern amplifiziert wird. Die Einführung von Biotinnucleotiden in den Primer oder direkt in das naszierende PCR-Produkt unter Verwendung von biotinylierten Nucleotiden erleichtert die Isolierung der Target-DNA. Eine Vielzahl von biotinylierten Nucleotiden, wie Biotin-dUTP, steht für solche Zwecke zur Verfügung. Dieses Verfahren hat jedoch wenigstens zwei Einschränkungen.
  • Erstens verhindert die Anwesenheit von Biotin in der amplifizierten Target-DNA die Verwendung von biotinylierten Sonden ohne vorherige Entfernung der Biotinylierung. Die Anwesenheit von endogenem Biotin oder von biotinhaltigen Molekülen in der Probe reduziert auch die Empfindlichkeit dieses Assays.
  • Zweitens senkt die Anwesenheit von Biotin in der Target-DNA die Hybridisierungseffizienz und damit die Empfindlichkeit des Assays. Wie oben diskutiert wurde, werden diese Probleme durch die Verwendung von PCB-Derivaten, wie PCB-Nucleotiden, effektiv beseitigt, indem die vollständige Entfernung von Biotin aus dem Verfahren ermöglicht wird.
  • Die Konjugate und Verfahren der Erfindung können in Verbindung mit einer Vielzahl von diagnostischen Assays verwendet werden, die den Nachweis von naszierendem Protein beinhalten. Zum Beispiel wurden diagnostische Assays für Krebs entwickelt, die auf der in-vitro-Expression von PCR-amplifizierten Genen und anschließender Untersuchung des naszierenden Proteinprodukts mit Hilfe von Gel-Elektrophorese beruhen (S. M. Powell et al., N. Engl. J. Med. 329: 1982, 1993). Die Isolierung solcher Proteine und die anschließende Empfindlichkeit solcher Tests könnte durch den Einbau von PCB-Aminosäuren erhöht werden.
  • Biotin-Streptavidin-Technik wird verbreitet als Grundlage für nichtradioaktives ELISA einschließlich diagnostischer Assays für spezifische Indikatoren von Krankheiten und Störungen verwendet, wie mit Krankheiten verknüpfter Antigene einschließlich Adenovirus-Antigen (K. Mortensson-Egnund et al., J. Virol. Methods 14: 57, 1986), Rinderleukämievirus (E. N. Esteban et al., Cancer Res. 45: 3231, 1985), Flavivirus (E. A. Gould et al., J. Virol. Methods 11: 41, 1985), Hepatitis-B-Oberflächenantigen (C. Kendall et al., J. Immunol. Methods 56: 329, 1983), Herpes-simplex-Virus-Antigen (K. Adler-Strorthz et al., J. Clin. Microbiol. 18: 1329, 1983), Respiratory-Syncytial-Virus (A. Hornsleth et al., J. Med. Virol. 18: 113, 1986), bakterieller Antigene (R. H. Yolken et al., J. Immunol. Methods 56: 319, 1983) und Melanom-assoziierter Antigene (humane)(A. C. Morgan et al., Cancer Res. 43: 3155, 1983). Die Nützlichkeit dieser Assays kann beeinträchtigt sein, wenn endogenes Biotin in der Probe vorhanden ist. In diesem Fall wird ein falscher Hintergrund erhalten, da der Streptavidin-Reporter-Enzym-Komplex sowohl auf unspezifische Biotine als auch auf die gegen das Zielprotein gerichteten biotinylierten Antikörper reagiert. Obwohl es mehrere Ansätze gab, den Hintergrund aufgrund der unspezifischen Bindung des Avidins oder Streptavidins an nichtbiotinylierte Targets zu beseitigen, einschließlich der Verwendung von Puffern mit hoher Ionenstärke (C. J. P. Jones et al., Histochem. J. 19: 264, 1987), Milchproteinen (R. C. Duhamel et al., J. Histochem. Cytochem. 33: 711, 1985) und Lysozym (E. A. Bayer et al., Anal. Biochem. 163: 204, 1987) sowie veränderter Streptavidine, wie ImmunoPure NeutrAvidin (Pierce Chemical; Rockford, IL), war keiner davon sehr effektiv in Bezug auf die Beseitigung des Hintergrunds aufgrund von endogenem Biotin.
  • Die Verwendung von photolytisch abspaltbaren Biotinen in Verbindung mit Immunoassays verringert das Problem, indem ein Mittel bereitgestellt wird, um das Hintergrundniveau des unspezifischen Biotins zu bestimmen. Der ELISA-Assay wird zuerst unter Verwendung von herkömmlichen Methoden durchgeführt, außer dass der gegen das Protein gerichtete Antikörper mit photolytisch abspaltbarem Biotin gebunden wird (19). Der mit dem Sondenantikörpersystem verknüpfte Streptavidin-Reporterenzym-Komplex wird dann über eine Abspaltung des photolytisch abspaltbaren Biotins mit Licht entfernt. Durch die Spaltung wird der von unspezifischem gebundenem Biotin gebundene Reporterenzym-Avidin-Komplex nicht freigesetzt, da dieses Biotin nicht abspaltbar ist. Das aus dem übrigen Biotin erhaltene Signal kann als Maß für das in der Probe vorhandene endogene Biotin verwendet und von dem in Schritt 1 erhaltenen primären Signal subtrahiert werden.
  • Das Hintergrundsignal aufgrund von endogenem Biotin in einem auf Biotin-Avidin basierenden ELISA kann einfach unter Verwendung von photolytisch abspaltbarem Biotin nachgewiesen werden. Der ELISA wird gemäß den normalen Verfahren unter Verwendung eines Streptavidin-Reporterenzym-Komplexes durchgeführt. Der Streptavidin-Reporterenzym-Komplex wird dann jedoch mit Licht entfernt, und das System wird erneut dem Assay unterzogen, um das Hintergrundniveau des endogenen Biotins zu bestimmen.
  • Eine zweite Anwendung von photolytisch abspaltbaren Biotinen ist ihre Verwendung zur Durchführung von multiplen ELISA-Assays auf Biotinbasis an derselben Probe. Dies beruht auf der Fähigkeit, den Streptavidin-Reporterenzym-Komplex durch photolytische Spaltung der PCB-Bindung mit Licht vollständig zu entfer nen. In diesem Fall kann ein zweiter ELISA durchgeführt werden, wobei man eine andere Antikörpersonde und einen anderen Reporterenzym-Komplex verwendet, die vom ersten ELISA nicht gestört werden, wie es in 20 gezeigt ist. Normalerweise ist ein solcher multipler ELISA nicht möglich, da das Signal, das von einer zweiten Antikörpersonde kombiniert mit einem Streptavidin-Reporterenzym-Komplex erhalten wurde, nicht leicht vom ursprünglichen Signal getrennt werden kann.
  • In einem herkömmlichen Biotin-Avidin-ELISA bleibt der Streptavidin-Reporterenzym-Komplex zum Beispiel auch nach der Entfernung des chromogenen Produkts des Reporterenzyms an den Sondenantikörper gebunden. Er erzeugt also immer noch ein chromogenes Produkt, selbst nachdem ein zweiter ELISA durchgeführt wurde, und stört das Signal dieses zweiten Immunoassays. Dagegen wird durch die Entfernung des Streptavidin-Enzym-Komplexes durch Spaltung des photolytisch spaltbaren Biotins mit Licht und anschließendes Waschen dieses Problem beseitigt, da das ursprüngliche Reporterenzym nicht mehr vorhanden ist.
  • Bei einer anderen Anwendung der Erfindung erfordert der Nachweis von Pathogenen, wie Mikroorganismen, aus biologischem Material häufig deren Isolierung und Kultivierung. Je effektiver der Isolierungsschritt, desto zuverlässiger und schneller wird wegen der Entfernung anderer Kontaminanten und der Konzentration des Target-Pathogens der Kultivierungsschritt sein. Während es für die Abtrennung von Mikroorganismen eine Vielzahl von Affinitätstechniken gibt, wie mit selektiven Antikörpern konjugierte Magnetkügelchen, bleibt immer noch das Problem der Freisetzung der Mikroorganismen in lebensfähiger Form, in der sie zum Kultivieren und zum empfindlichen Nachweis geeignet sind. Dagegen liefert PCB, das mit dem Antikörper oder Bindungsliganden verknüpft ist, ein nichtschädigendes und schnelles Mittel für die photochemische Freisetzung des Mikroorganismus in lebensfähiger Form.
  • Diese Anwendung der Erfindung liefert zum Beispiel die Basis für die Entwicklung von schnellen diagnostischen Assays für eine Vielzahl von Pathogenen, die an der Human- und Tierkrankheit beteiligt sind, wobei diese Assays vorher unter Verwendung von herkömmlicher Biotin-Streptavidin-Technik nicht möglich war. Unter Verwendung dieses Ansatzes könnten auch Mikroorganismen zum Zwecke der Abreicherung oder des Nachweises aus Lebensmitteln, Milch, Boden und anderen Materialien isoliert werden.
  • Ein Konjugat gemäß der Erfindung kann in Verfahren zur Behandlung einer Störung durch die gesteuerte Freisetzung eines Therapeutikums an einer ausgesuchten Stelle verwendet werden. Konjugate werden gebildet, indem man ein bioreaktives Agens mit einer Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv gespalten werden kann, an ein Therapeutikum koppelt, wobei das bioreaktive Agens aus einer steuerbaren Struktureinheit, die an eine photoreaktive Struktureinheit gebunden ist, besteht und die steuerbare Struktureinheit eine Affinität zu der ausgewählten Stelle hat. Konjugate werden einem Patienten, der die Störung hat, verabreicht, und die ausgewählte Stelle wird zur gesteuerten Freisetzung des Therapeutikums einer abgemessenen Dosis elektromagnetischer Strahlung ausgesetzt, um die Störung zu behandeln. Zu den Störungen, die nachgewiesen werden können, gehören Infektionen, wie bakterielle Infektionen, virale Infektionen und Parasiteninfektionen, Neoplasmen, wie ein Tumor, und genetische Störungen, wie eine Überproduktion oder ein Mangel an einem Enzym oder einem anderen genetischen Produkt.
  • Bei den Therapeutika kann es sich um Toxine, Immunsystemmodulatoren, blutbildende Agentien, Proteine, Nucleinsäuren, Substratanaloga, Transcriptions- und Translationsfaktoren, Antigene und Kombinationen davon handeln. Bei den steuerbaren Struktureinheiten kann es sich um Antikörper, wie monoklonale oder polyklonale Antikörper, oder ein Antikörperfragment handeln.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft diagnostische Kits zum Nachweis von oder zum Screening nach Krankheiten und Störungen bei Patienten. Kits enthalten ein Konjugat gemäß der Erfindung, das aus einem bioreaktiven Agens besteht, das kovalent an ein Diagnostikum mit einer Affinität zu einem Indikator der Störung in der von dem Patienten erhaltenen biologischen Probe gebunden ist. Der Indikator kann eine Anwesenheit oder Abwesenheit, eine erhöhte oder gesenkte Menge oder Konzentration eines charakteristischen Markers der Störung sein, wie ein Antigen oder Antikörper, ein Cytokin, ein spezifischer Zelltyp (z. B. B-Zellen, cytotoxische, Suppressor- oder Helfer-T-Zellen, Makrophagen, Stammzellen), ein besonderes Enzym, Nucleinsäure oder Protein. Zu den Störungen, die nachgewiesen werden können, gehören Infektionen, Neoplasmen und genetische Störungen. Zu den Infektionen, die nachgewiesen werden können, gehören bakterielle Infektionen, virale Infektionen und Parasiteninfektionen. Zu den Neoplasmen, die nachgewiesen werden können, gehören Tumoren. Zu den genetischen Störungen, die nachgewiesen werden können, gehört eine Überproduktion oder ein Mangel an einem Enzym. Zu den biologischen Proben, die zu der Probe gegeben werden können, gehören Proben von peripherem Blut, Blutplasma, Serum, Liquor, Lymphe, Urin, Stuhl, ophthalmischen Flüssigkeiten, Organen und Körpergeweben. Solche Kits können auch verwendet werden, um die Anwesenheit von fetalen oder Stammzellen in einer biologischen Probe nachzuweisen oder ein Screening danach durchzuführen, wobei diese Zellen isoliert und kultiviert oder weiter analysiert werden können.
  • Es können auch Kits verwendet werden, um die Anwesenheit von mehreren Nucleinsäuren und/oder Proteinen zum Beispiel auf einem Elektroblot nachzuweisen, wobei man eine Reihe von mit Biotin verknüpften sekundären Sonden verwendet. Nachdem jede Sonde eingeführt wurde, könnte die Biotinbindung gespalten werden, so dass der enzymatische Assaykomplex entfernt werden kann, damit man eine neue sekundäre Sonde einführen kann. Ein solcher Ansatz wäre als Basis für medizinische diagnostische Assays äußerst nützlich, wobei mehrere Antigene oder Nucleinsäuresequenzen schnell und automatisch sondiert werden müssen.
  • Der Kit kann auch ein Nucleinsäure-Mutagenesekit zur Verwendung in molekularbiologischen Anwendungen, wie Einführung oder Korrektur von Mutationen in DNA oder RNA, sein. Die Nucleinsäure kann ein Oligonucleotid zur Verwendung in Anwendungen des PCR- oder Cassetten-Typs sein. Solche Oligonucleotide können einzelsträngig oder doppelsträngig sein und enthalten vorzugsweise intern eine oder mehrere Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen sowie ligierbare 5'- und 3'-Enden, die auch einen Teil der Restriktionsenzym-Erkennungsstelle enthalten. Alternativ dazu können auch ein oder mehrere Enden blockiert sein, um die gerichtete Kopplung zu erleichtern.
  • Die folgenden Beispiele werden angegeben, um verschiedene Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Synthese von photolytisch abspaltbaren Agentien
  • 5 g oder 27,6 mmol 5-Methyl-2-nitrobenzoesäure (5, Verbindung "6"; Aldrich Chemical; Milwaukee, WI) wurden unter Rühren in kleinen Portionen zu 10 ml (16,4 g oder 148 mmol) Thionylchlorid gegeben. Das Gemisch wurde 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssiges Thionylchlorid wurde im Vakuum entfernt, was das Säurechlorid ("7") ergab. Magnesiumdrehspäne (1,07 g oder 44,2 mmol), absolutes Ethanol (6 ml), Chlorbenzol (8 ml) und 0,1 ml trockenes CCl4 wurden unter Rückfluss erhitzt, bis der größte Teil des Magnesiums reagiert hatte. Eine Lösung von Diethylmalonat (4,82 g oder mmol) in 10 ml Chlorbenzol wurde hinzugefügt, und dann erfolgte die Zugabe des Säurechlorids (5,49 g) in 10 ml Chlorbenzol. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang gerührt, und 1,7 ml konzentrierte H2SO4 in 17 ml H2O wurden hinzugefügt, und es wurde weitere 15 Minuten lang gerührt. 20 ml Chloroform wurden hinzugefügt, und die Schichten wurden getrennt. Die wässrige Schicht wurde dreimal mit 10 ml extrahiert, und die Extrakte wurden kombiniert, getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 8,25 ml Essigsäure gelöst. 5,4 ml H2O und 1 ml konzentrierte H2SO4 wurden hinzugefügt, das Gemisch wurde 6 Stunden lang am Rückfluss gehalten, mit wässrigem Na2CO3 neutralisiert und dreimal mit 20 ml CHCl3 extrahiert. Die Extrakte wurden kombiniert, getrocknet, und die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde aus 70%igem Ethanol kristallisiert, was 4,46 g oder etwa 81% 5-Methyl-2-nitroacetophenon ergab. 5-Methyl-2-nitroacetophe non (3,51 g oder 19,6 mmol), N-Bromsuccinimid (3,66 g oder 20,6 mmol) und Benzoylperoxid (46 mg oder 0,01 Äqu.) wurden 5 Stunden lang in 20 ml CCl4 am Rückfluss gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, das Filtrat wurde konzentriert und aus CCl4 kristallisiert, wobei 3,64 g (72%) 5-Brommethyl-2-nitroacetophenon ("8") entstanden. Verbindung 8 (2,0 g oder 7,75 mmol) wurde zu einer Lösung von Hexamethylentetramin (1,14 g oder 8,13 mmol) in 15 ml Chlorbenzol gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt, der Niederschlag wurde abfiltriert und mit 10 ml Chlorbenzol und 20 ml Diethylether gewaschen. Der Niederschlag (2,93 g oder 7,36 mmol) wurde in 35 ml 95%igem Ethanol suspendiert, und anschließend wurde konzentrierte HCl (3,12 ml oder 5 Äqu.) hinzugefügt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und zur Trockne eingedampft. Zu dem Rückstand wurden 10 ml DMF gegeben, und anschließend wurde 6-Biotinamidocapronsäure (3,29 g oder 1,25 Äqu.) in 35 ml N-Methylpyrrolidon, Dicyclohexylcarbodiimid (2,28 g oder 1,5 Äqu.) und Triethylamin (1,28 ml oder 1,25 Äqu.) hinzugefügt. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, der Niederschlag wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde zur Ausfällung in 700 ml Diethylether geschüttet. Der Niederschlag wurde getrocknet und auf einer Silicagel-Säule gereinigt, wobei man einen Stufengradienten (5–20%) von MeOH in CHCl3 verwendete, was 2,27 g (etwa 58%) Verbindung 11 ergab.
  • Verbindung 11 (1 g oder 1,87 mmol) wurde in 15 ml 70%igem EtOH gelöst (5). Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt, und Natriumborhydrid (141 mg oder 4 Äqu.) wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde 30 Minuten lang bei 0°C und weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde unter Zugabe von 1 ml Aceton abgebrochen, mit 0,1 N HCl neutralisiert, konzentriert, der Überstand wurde verworfen, der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet, was 0,71 g (etwa 71%) Verbindung 12 ergab.
  • Verbindung 12 (1,07 g oder 2 mmol) wurde in 10 ml DMF gelöst. N,N'-Disuccinimidylcarbonat (Fluka Chemical; Ronkonkoma, NY)(1 g, 1,5 Äqu.) wurde hinzugefügt, gefolgt von 0,081 ml oder 3 Äqu. Triethylamin (5). Nach 5 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Lösungsmittel abgedampft, und der Rückstand wurde nacheinander mit 0,1 N NaHCO3, Wasser, Dioxan und Diethylether gewaschen und dann getrocknet, was 1,04 g (etwa 69%) des Esters 5-(5-Biotinamidocaproamidomethyl)-1-(2-nitro)phenylethyl-N-hydroxysuccinimidylcarbonat (PCB-NHS) ergab (Verbindung 13). Schmp. = 13–114°C (unkorrigiert); CI-MS (M+ = 676,5); UV-VIS: λ = 204 nm, ε1 = 19190 M–1·cm–1; λ2 = 272 nm, ε2 = 6350 M–1·cm–1 in Phosphatpuffer, pH = 7.4.
    1H NMR (DMSO-d6, Varian XL-400 MHz), [δppm]: 8.48 (t, 1H), 8.05–8.03 (d, 1H), 7.75–7.71 (t, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.46–7.45 (d, 1H), 6.44 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 6.28–6.27 (m, 1H), 4.39 (m, 2H), 430 (m, 1H), 4.12 (m, 1H), 3.57 (d, 2H), 3.09 (m, 1H), 3.01–2.99 (m, 2H), 2.79 (m, 5H), 2.58–2.55 (d, 1H), 2.17–2.15 (m, 2H), 2.04–2.02 (m, 2H), 1.72–1.71 (m, 2H), 1.66–1.43 (m, br, 6H), 1.38–1.36 (m, br, 2H), 1.26-1.25 (m, br, 3H);
    IR (KBr); νC=O: 1815 und 1790 cm–1.
  • Synthese von PCB-NHS-Ester (18): 2-Brom-2'-nitroacetophenon ("14") (Aldrich Chemical; Milwaukee, WI)(1 g; 4,09 mmol) wurde durch Reaktion mit 1,05 Äqu. Hexamethylentetramin und Hydrolyse zu 2-Amino-2'-nitroacetophenon-Hydrochlorid ("15") umgewandelt, und dieses wurde unter Verwendung von DCC (1,5 Äqu.) in DMF mit 5-Biotinamidocapronsäure (1,25 Äqu.) gekoppelt, was 2-(5-Biotinamidocaproamido)-2'-nitroacetophenon ("16") (etwa 52% Ausbeute) ergab, das reduziert (etwa 75% Ausbeute; "17") und wie beschrieben in das reaktive NHS-Derivat ("18") 2-(5-Biotinamidocaproamido)-2'-nitrophenylethyl-N-hydroxysuccinimidylcarbonat (etwa 69% Ausbeute) umgewandelt wurde.
  • Synthese von PCB-NHS-Ester (19): 3-Amino-4-methoxybenzoesäure ("19") (Aldrich Chemical; Milwaukee, WI) (5 g oder 29,9 mmol) wurde in 40 ml Essigsäure suspendiert. Unter Rühren wurde Essigsäureanhydrid (3 ml oder 1,04 Äqu.) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. 25 ml 0,1 N HCl wurden hinzugefügt, und der Niederschlag wurde abfiltriert und mit 3 × 10 ml 0,1 N HCl und 5 × 10 ml Wasser gewaschen, was 5,97 g (etwa 95%) ergab. 3-(N-Acetyl)amino-4-methoxybenzoesäure ("20")(5 g oder 23,5 mmol) wurde bei 0°C unter kräftigem Rühren zu 20 ml rauchender Salpetersäure gegeben. Die Lösung wurde eine weitere Stunde lang bei 0°C gerührt und auf 200 g Eis gegossen. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit 5 × 20 ml Wasser gewaschen und getrocknet, was 4,38 g (etwa 72%) 2-Nitro-4-methoxy-5-(N-acetyl)aminobenzosäure ("21") ergab, die wie oben beschrieben in 2-Nitro-4-methoxy-5-(N-acetyl)aminoacetophenon ("22") (etwa 63% Ausbeute) umgewandelt wurde. 2-Nitro-4-methoxy-5-(N-acetyl)aminoacetophenon ("22") (1 g oder 4,76 mmol) wurde in 5 ml DMF gelöst, und die Lösung wurde zu 5-Biotinamidocaproylchlorid gegeben, das getrennt davon aus 5-Biotinamidocapronsäure (1,55 g oder 1 Äqu.) und 5 ml Thionylchlorid hergestellt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und zu 100 ml Diethylether gegeben. Der Niederschlag wurde gereinigt, wobei man eine kleine Silicagel-Säule und einen Stufengradienten von MeOH in CHCl3 verwendete, was 1,16 g (etwa 47%) 2-Nitro-4-methoxy-5-(5-biotinamidocaproamido)acetophenon ("23") ergab. Dieses Zwischenprodukt wurde in den entsprechenden Alkohol (etwa 85% Ausbeute) und mit etwa 69% Ausbeute in das reaktive NHS-Esterderivat 5-(5-Biotinamidocaproamido)-4-methoxy-1-(2-nitro)phenylethyl-N-hydroxysuccinimidylcarbonat ("25") umgewandelt.
  • Synthese von photolytisch abspaltbarem Cumarin (21): 5-Aminomethyl-2-nitroacetophenon-Hydrochlorid ("26")(1,15 g oder 5 mmol) wurde in 20 ml DMF gelöst. Zu dieser Lösung wurden 7-Methoxycumarin-4-essigsäure ("27") (Aldrich Chemical; Milwaukee, WI) (1,46 g oder 1,25 Äqu.) und Dicyclohexylcarbodiimid (1,55 g oder 1,5 Äqu.) und anschließend Triethylamin (0,7 ml oder 1 Äqu.) gegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, 20 ml CHCl3 wurden hinzugefügt, die Lösung wurde mit 0,1 N NaHCO3 (3 × 15 ml) gewaschen, und die organische Schicht wurde getrocknet und auf einer Silicagel-Säule gereinigt, wobei man einen Stufengradienten von MeOH in CH2Cl2 verwendete, was 1,37 g (etwa 64%) "28" ergab. Verbindung 28 (1 g oder 2,33 mmol) wurde in 15 ml 95%igem EtOH gelöst, die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt, und Natriumborhydrid (176 mg oder 4 Äqu.) wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 0°C gerührt, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml Aceton abgebrochen und mit 0,1 N HCl neutralisiert. Dann wurde die Lösung mit 3 × 15 ml CHCl3 extrahiert. Die Extrakte wurden kombiniert, getrocknet und auf einer Silicagel-Säule gereinigt, wobei man einen Stufengradienten von MeOH in CH2Cl2 verwendete, was 832 mg (etwa 83%) Verbindung 29 ergab. Verbindung 29 (1,29 g oder 3 mmol) wurde in 10 ml DMF-Acetonitril (1 : 1) gelöst. N,N'-Disuccinimidylcarbonat (Fluka Chemical; Ronkonkoma, NY)(1,15 g oder 1,5 Äqu.) wurde hinzugefügt, gefolgt von Chloroform. Die Lösung wurde mit 3 × 15 ml 0,1 N NaHCO3 gewaschen, die Lösungsmittel wurden abgedampft, und der Rückstand wurde aus Acetonitril umkristallisiert, was 1,22 g (etwa 71%) photochemisch abspaltbaren Cumarin-NHS-Ester ("30") ergab.
  • Beispiel 2: Synthese von photochemisch spaltbaren Konjugaten - PCB-Aminosäuren
  • PCB-Aminosäuren wurden durch Derivatisierung der α-Aminogruppe der Aminosäure hergestellt. Derivate wurden entweder aus PCB-Chlorformiaten oder ihren entsprechenden N-Hydroxysuccinimidylestern und Aminosäuren in einem schwach alkalischen Medium hergestellt, wobei man eine Modifikation des Verfahrens von Sigler et al. verwendete (Biopolymers 22: 2157, 1983; L. Lapatsanis et al., Can. J. Chem. 60: 976, 1982; A. Paquet, Can. J. Chem. 60: 2711, 1977). Dieses Verfahren wurde auch für die Synthese von ε-NH2-PCB-Lys verwendet, wobei die α-Aminogruppe von Lys mit Fmoc geschützt wird. PCB-Aminosäuren wurden auch durch Derivatisierung der Carboxy- oder Hydroxygruppe hergestellt. Kurz gesagt, die Carboxyreste von Asparaginsäure und Glutaminsäure wurden unter Verwendung von PCB-OH verestert. α-Aminogruppen wurden als Fmoc-Derivate geschützt, und α-Carboxygruppen wurden als t-Butylester geschützt. Die Veresterung der Carboxy-Seitenkette wurde unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) vermittelt (P. Sieber, Helv. Chim. Acta 60: 2711, 1977). Eine Veresterung wurde auch durchgeführt, indem man PCB-Chlorformiat mit den Hydroxy-Seitenketten von in geeigneter Weise geschützten Threonin- oder Serinresten umsetzte (M. Bednarek et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 21: 196, 1983; H. Kessler et al., Tetrahedron 281, 1983).
  • Herstellung und photolytische Spaltung von PCB-Leucin-Enkephalin: Leucin-Enkephalin (Sigma Chemical; St. Louis, MO)(15,5 μmol/ml in 0,1 N NaHCO3, pH 8,0) und PCB-NHS-Ester (17 μmol/ml in DMF) wurden miteinander gemischt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zu diesem Zeitpunkt zeigte die HPLC-Analyse die vollständige Umsetzung von Leu-Enk zu PCB-Leu-Enk. Die HPLC-Analyse wurde mit einem Waters System (Waters Chromatography; Marlboro, MA) durchgeführt, das einen U6K-Injektor, 600-Controller, eine Novapak-C10-Säule (3,9 × 150 mm) und einen 996-Photodioden-Array-Detektor umfasste. Tests wurden durchgeführt, wobei man einen linearen Gradienten von 30–45% B über 10 Minuten und anschließend 45% B isokratisch während 10 Minuten verwendete.
  • PCB-Leu-Enk (1,93 μmol/ml in Phosphatpuffer, pH 7,4) wurde mit einer UV-Lampe mit langer Wellenlänge (Black Ray XX-15 UV-Lampe; UVP Inc.; San Gabriel, CA) in einem Abstand von 15 cm bestrahlt (Emissionspeak 365 nm, Lampenintensität = 1,1 mW/cm2 in einem Abstand von 31 cm). Eine HPLC-Analyse zeigte eine vollständige photolytische Freisetzung von Leu-Enk innerhalb von 5 Minuten und bestätigte die Authentizität des freigesetzten Materials auf der Basis der Retentionszeit und der UV-Spektren.
  • PCB-Leu-Enk (10 nmol) wurde 30 Minuten lang in einer Suspension von Kügelchen aus monomerem-Avidin-Agarose (15 nmol) inkubiert. Die Suspension wurde 3 Minuten lang zentrifugenfiltriert (16 000 × g). Die Bindungseffizienz wurde zu etwa 94% bestimmt. Eine Probe wurde in Phosphatpuffer (2 ml) resuspendiert und gemäß der obigen Beschreibung bestrahlt. Freigesetztes Leu-Enk wurde einem Assay unter Verwendung von Fluorescamin unterzogen. Emissionsspektren wurden mit einem SLM-48000-Fluorimeter unter Verwendung einer Anregung bei 380 nm (λ = 488 nm) gemessen. Die photolytische Freisetzung von Leu-Enk wurde nach 5 Minuten Bestrahlung quantifiziert.
  • Beispiel 3: Festphasensynthese von PCB-Polypeptiden
  • PCB-Aminosäuren wurden durch Festphasen-Peptidsynthese in Polypeptide eingebaut. Standardverfahren für den Einsatz von basenlabilen Fluorenylmethyloxy-(Fmoc)-Gruppen zum Schutz einer α-Aminofunktion und von säurelabilen t- Butyl-Derivaten zum Schutz von α-Carboxygruppen und reaktiven Seitenketten wurden verwendet. Die Synthese wurde an einem Harz des Polyamidtyps durchgeführt. Aminosäuren wurden als symmetrische Anhydride oder Pentafluorphenylester für die Kopplung aktiviert (E. Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1989). Die PCB-Aminosäure für den ortsspezifischen Einbau in eine Polypeptidkette wurde mit einer PCB-Struktureinheit derivatisiert. Seitenketten-PCB-Derivate, wie ε-Amino-Lys, Seitenketten-PCB-Aminosäureester von Glu und Asp sowie Ester von Ser, Thr und Tyr wurden in das Polypeptid eingebaut. Diese PCB-Aminosäuren waren während der Festphasen-Peptidsynthese in 20% Piperidin/DMF (Fmoc-Entfernung) und 1–95% Trifluoressigsäure (t-Bu, t-Boc-Entfernung, Abspaltung des Peptids vom Polyamidharz) stabil (E. Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1989).
  • Beispiel 4: Nachweis und Isolierung von naszierenden Proteinen
  • Fehlaminoacylierung von tRNA: Die allgemeine Strategie, die zur Erzeugung von fehlaminoacylierter tRNA verwendet wird, ist in 10 gezeigt und beinhaltet die Verkürzung von tRNA-Molekülen, Dinucleotidsynthese, Aminoacylierung des Dinucleotids und Lipase-vermittelte Kopplung.
  • Verkürzte tRNA-Moleküle wurden durch Periodat-Abbau in Gegenwart von Lysin und Alkalischer Phosphatase erzeugt, grundsätzlich nach der Beschreibung von Neu und Heppel (J. Biol. Chem. 239: 2927–34, 1964). Kurz gesagt, 4 mmol unbeladene E.-coli-tRNALys-Moleküle (Sigma Chemical; St. Louis, MO) wurden mit zwei aufeinanderfolgenden Behandlungen mit 50 mM Natriummetaperiodat und 0,5 M Lysin, pH 9,0, bei 60°C während 30 Minuten in einem Gesamtvolumen von 50 μl verkürzt. Die Reaktionsbedingungen waren derart, dass die Temperatur stets über 50°C lag und ein 10facher Überschuss an Metaperiodat verwendet wurde. Überschüssiges Periodat wurde durch Behandlung mit 5 μl 1 M Glycerin zerstört. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 8,5 eingestellt, indem man 15 μl Tris-HCl bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,1 M hinzufügte. Das Reaktionsvolumen wurde auf 150 μl erhöht, indem man 100 μl Wasser hinzufüg te. Alkalische Phosphatase (15 μl, 30 Einheiten) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde wiederum zwei Stunden lang bei 60°C inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte Ethanolfällung von Gesamt-tRNA, Waschen mit Ethanol, Trocknen des Sediments und Auflösen des Sediments in 20 μl Wasser. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt, wobei man die verkürzte tRNA erhielt.
  • Die Dinucleotidsynthese wurde grundsätzlich gemäß Hudson (J. Org. Chem. 53: 617–24, 1988) durchgeführt und kann als dreistufiges Verfahren, Desoxycytidin-Schutz, Adenosin-Schutz und Dinucleotidsynthese, beschrieben werden.
  • Desoxycytidin-Schutz: Alle Reaktionen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. Zuerst wurden die 5'- und 3'-Hydroxygruppen von Desoxycytidin geschützt, indem man sie 2 Stunden lang unter ständigem Rühren mit 4,1 Äquivalenten Trimethylsilylchlorid umsetzte. Exocyclische Aminfunktionen wurden geschützt, indem man sie 3 Stunden lang mit 1,1 Äquivalenten Fmoc-Cl umsetzte. Die Entfernung der Schutzgruppen von den 5'- und 3'-Hydroxygruppen erfolgte durch die Zugabe von 0,05 Äquivalenten KF und 30 Minuten Inkubation. Das resultierende Produkt wurde mit einer Ausbeute von 87% erzeugt. Phosphatgruppen wurden hinzugefügt, indem man diese Verbindung mit 1 Äquivalent Bis(2-chlorphenyl)phosphorochloridat versetzte und das Gemisch 2 Stunden lang bei 0°C inkubierte. Die Ausbeute betrug in diesem Fall 25–30%.
  • Adenosin-Schutz: Trimethylsilylchlorid (4,1 Äquivalente) wurde zu den Adenosinresten gegeben, und es wurde 2 Stunden inkubiert, und danach wurden 1,1 Äquivalente Fmoc-Cl eingeführt, und die Inkubation wurde 3 Stunden lang fortgesetzt. Die TMS-Schutzgruppen wurden mit 0,5 Äquivalenten Fluoridionen entfernt, wie es oben beschrieben ist. Das Fmoc-geschützte Adenosin wurde in 56% Ausbeute erhalten. Um die 2'-Hydroxygruppe weiter zu schützen, wurde die Verbindung 22 drei Stunden lang mit 1,1 Äquivalenten Tetraisopropyldisiloxylchlorid (TIPDSCl2) umgesetzt, wobei Verbindung 23 in einer Ausbeute von 68–70% entstand. Die Verbindung wurde durch Inkubation mit 20 Äquivalenten Dihydropyran und 0,33 Äquivalenten p-Toluolsulfonsäure in Dioxan während etwa 4–5 Stunden in Verbindung 24 umgewandelt. Diese Verbindung wurde direkt ohne Isolierung durch die Zugabe von 8 Äquivalenten Tetrabutylammoniumfluorid in einem Gemisch von Tetrahydrofuran, Pyridin und Wasser umgesetzt.
  • Dinucleotidsynthese: Das geschützte Desoxycytidin, Verbindung 20 (19) und das geschützte Adenosin wurden durch die Zugabe von 1,1 Äquivalenten 2-Chlorphenylbis(1-hydroxybenzotriazolyl)phosphat in Tetrahydrofuran unter ständigem Rühren während 30 Minuten umgesetzt. Daraufhin erfolgte die Zugabe von 1,3 Äquivalenten geschütztes Adenosin in Gegenwart von N-Methylimidazol während 30 Minuten. Die Kopplungsausbeute betrug etwa 70%, und das Protonen-NMR-Spektrum des gekoppelten Produkts ist wie folgt:
    (δ 8.76 m, 2H), (δ 8.0 m, 3H), (δ 7.8 m, 3H), (δ 7.6 m, 4H), (δ 7.5 m, 3H), (δ 7.4 m, 18H), (δ 7.0 m, 2H), (δ 4.85 m, 14H), (δ 4.25 m, 1H); (δ 3.6 m, 2H), (δ 32 m, 2H) (δ 2.9 m, 3H), (δ 2.6 m, 1H), (δ 2.0–12 m, 7H).
  • Die Aminoacylierung des Dinucleotids erfolgte durch Verknüpfen des Nα-geschützten Nε-PCB-Lys mit dem Dinucleotid über eine Esterbindung. Zuerst wurde die geschützte Aminosäure mit 6 Äquivalenten Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat und 60 Äquivalenten 1-Hydroxybenzotriazol in Tetrahydrofuran aktiviert. Das Gemisch wurde 20 Minuten lang unter ständigem Rühren inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 1 Äquivalent Dinucleotid in 3 Äquivalenten N-Methylimidazol, und die Reaktion wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Entfernung der Schutzgruppen erfolgte durch die Zugabe von Tetramethylguanidin und 4-Nitrobenzaldoxim und ständiges Rühren während weiterer 3 Stunden. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Essigsäure und Inkubation beendet, wiederum unter ständigem Rühren während 30 Minuten bei 0°C, wobei das aminoacylierte Dinucleotid entstand.
  • Die Ligierung der tRNA mit dem aminoacylierten Dinucleotid erfolgte grundsätzlich so, wie es von T. G. Heckler et al. beschrieben wurde (Tetrahedron 40: 87–94, 1984). Kurz gesagt, verkürzte tRNA-Moleküle (8,6 OD260-Einheiten/ml) und aminoacylierte Dinucleotide (4,6 OD260-Einheiten/ml) wurden 16 Stunden lang bei 4°C mit 340 Einheiten/ml T4-RNA-Ligase inkubiert. Der Reaktionspuffer umfasste 55 mM Na-Hepes, pH 7,5, 15 mM MgCl2, 250 μM ATP, 20 μg/ml BSA und 10% DMSO. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch auf eine Endkonzentration von 50 mM NaOAc, pH 4,5, verdünnt und enthielt 10 mM MgCl2. Das resultierende Gemisch wurde auf eine DEAE-Cellulosesäule (1 ml) aufgetragen, die mit 50 mM NaOAc, pH 4,5, 10 mM MgCl2 bei 4°C äquilibriert war. Die Säule wurde mit 0,25 mM NaCl gewaschen, um RNA-Ligase und andere Nicht-tRNA-Komponenten zu entfernen. Die tRNA-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und bei 4°C auf eine BD-Cellulosesäule geladen, die mit 50 mM NaOAc, pH 4,5, 10 mM MgCl2 und 1,0 M NaCl äquilibriert worden war. Nicht umgesetzte tRNA wurde durch Waschen mit 10 ml desselben Puffers entfernt. Reine fehlaminoacylierte tRNA wurde erhalten, indem man die Säule mit Puffer, der 25% Ethanol enthielt, eluierte.
  • Herstellung von Extrakt: Weizenkeim-Embryoextrakt wurde durch Flotation von Weizenkeimen zur Anreicherung von Embryos hergestellt, wobei man ein Gemisch von Cyclohexan und Kohlenstofftetrachlorid (1 : 6) verwendete, und anschließend wurde über Nacht getrocknet (etwa 14 Stunden). Flotierte Weizenkeimembryos (5 g) wurden in einem Mörser mit 5 Gramm gepulvertem Glas vermahlen, so dass man ein feines Pulver erhielt. Extraktionsmedium (Puffer I: 10 mM Tris-Acetat-Puffer, pH 7,6, 1 nM Magnesiumacetat, 90 mM Kaliumacetat und 1 mM DTT) wurde zu kleinen Portionen gegeben, bis eine glatte Paste erhalten wurde. Das Homogenisat, das aufgebrochene Embryos enthielt, und 25 ml Extraktionsmedium wurden zweimal bei 23 000 × g zentrifugiert. Der Extrakt wurde auf eine Sephadex-G-25-Feinsäule aufgetragen und in Puffer II (10 mM Tris-Acetat-Puffer, pH 7,6, 3 mM Magnesiumacetat, 50 mM Kaliumacetat und 1 mM DTT) eluiert. Eine hellgelbe Bande, die im Hohlraumvolumen wanderte, wurde in Form von 1-ml-Fraktionen aufgefangen (5–23), die in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden.
  • Herstellung der Matrize: Matrizen-DNA wurde hergestellt, indem man Plasmid-pSP72-bop mit EcoRI linearisiert. Restringierte lineare Matrizen-DNA wurde durch Phenolextraktion und DNA-Fällung gereinigt. Eine mRNA-Synthese in großem Maßstab wurde durch in-vitro-Transcription durchgeführt, wobei man das SP6-Ribomax-system (Promega; Madison, WI) verwendete. Gereinigte mRNA wurde unmittelbar vor der Verwendung 10 Minuten lang bei 67°C denaturiert.
  • Zellfreie Translationsreaktionen: Das Einbaugemisch (100 μl) enthielt 50 μl S-23-Extrakt, 5 mM Magnesiumacetat, 5 mM Tris-Acetat, pH 7,6, 20 mM Hepes-KOH-Puffer, pH 7,5, 100 mM Kaliumacetat, 0,5 mM DTT, 0,375 mM GTP, 2,5 mM ATP, 10 mM Creatinphosphat, 60 μg/ml Creatin-Kinase und 100 μg/ml mRNA, die die für Bacteriorhodopsin codierende genetische Sequenz enthielt. Fehlaminoacyliertes PCB-Lysin wurde in einer Menge von 170 μg/ml hinzugefügt, und die Konzentrationen der Magnesiumionen und des ATP wurden optimiert. Das Gemisch wurde eine Stunde lang bei 25°C inkubiert.
  • Isolierung von naszierenden Proteinen, die PCB-Lysin enthielten: Streptavidinbeschichtete magnetische Dynabeads M-280 (Dynal; Oslo, Norwegen) mit einer Bindungskapazität von 10 μg biotinyliertes Protein pro mg Kügelchen. Kügelchen in Konzentrationen von 2 mg/ml wurden wenigstens dreimal gewaschen, um stabilisierendes BSA zu entfernen. Das Translationsgemisch, das in naszierendes Protein eingebautes PCB-Lysin enthielt, wurde mit streptavidinbeschichteten Kügelchen gemischt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Magnetfeld wurde 0,5–1,0 Minuten lang angelegt, wobei man einen Magnetteilchenkonzentrator (MPC)(Dynal; Oslo, Norwegen) verwendete, und der Überstand wurde mit Pipetten entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde dreimal gewaschen, und die Magnetkügelchen wurden in 50 μl Wasser suspendiert.
  • Eine Photolyse wurde in einer Quarzküvette durchgeführt, wobei man eine Black-Ray UV-Lampe mit langer Wellenlänge, Modell B-100 (UV Products, Inc.; San Gabriel, CA) verwendete. Die Emissionspeakintensität betrug ungefähr 1100 μW/cm2 bei 365 nm. Der magnetische Abfang wurde wiederholt, um die Kügelchen zu entfernen. Die erhaltenen naszierenden Proteine wurden quantifiziert, und die Ausbeuten wurden auf 70–95% geschätzt.
  • Beispiel 5: In-vitro-Synthese von naszierenden Proteinen unter Verwendung von photolytisch spaltbaren Konjugaten
  • Post-Aminoacylierungs-Verknüpfung: Eine schematische Darstellung der am Einbau von PCB-Aminosäure beteiligten Schritte zum Nachweis und/oder zur Isolierung von Targets unter Verwendung von Post-Aminoacylierungs-Verknüpfung ist in 10 gezeigt. E.-coli-tRNALys (Sigma Chem.; St. Louis, MO) wurde mit Lysin aminoacyliert (A. E. Johnson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3075, 1978). Der in Dimethylsulfoxid gelöste NHS-Ester von PCB (Verbindung 13) wurde bei 0°C zur Lösung von Lys-tRNALys gegeben, und die modifizierte tRNA wurde unter Verwendung einer benzoylierten DEAE-Cellulose-Säule gereinigt (U. C. Kreig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8604, 1986). mRNA wurde in einem zellfreien Weizenkeimsystem translatiert, wie es von Sonar et al. beschrieben ist (Biochem. 32: 13777, 1993). Naszierende Proteine, die PCB-Lysin enthalten, wurden durch Acetonfällung gereinigt, um PCB-Lysyl-tRNA zu entfernen, und anschließend wurden naszierende Proteine, die PCB-Lysin enthielten, unter Verwendung von streptavidinbeschichteten Magnetkügelchen magnetisch abgefangen. Material, das nach dem magnetischen Abfang erhalten wurde, wurde 10 Minuten lang bestrahlt, um das naszierende Protein freizusetzen.
  • Beispiel 6: Synthese von photolytisch spaltbaren Konjugaten - PCB-Nucleotide
  • Synthese von PCB-dUTP (13A): 5-(3-Aminoallyl)-dUTP-Ammoniumsalz ("31")(Sigma Chemical; St. Louis, MO) (10 mg oder 16,6 μmol) wurde in 200 μl 0,1 N NaHCO3 gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von PCB-NHS (Verbindung 13; 12,5 mg oder 1 Äqu.) in 100 μl DMF gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, konzentriert und durch halbpräparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt (Novapak-C18-Säule; Waters Chromatography; Marlboro, MA), wobei man einen 10–50%igen linearen Gradienten von Acetonitril (B) in 5 mM Triethylammoniumacetat (A) über 30 Minuten verwendete. Fraktionen, die PCB-dUTP enthielten, wurden kombiniert, lyophilisiert und bis zu einer Konzentration von 5 mM wieder in TE-Puffer (pH 7,4) aufgelöst, und die Lösung wurde für den enzymatischen Einbau in Nucleinsäuren verwendet (Ausbeute etwa 56%). Ähnliche Verfahren wurden jeweils verwendet, um PCB-UTP, PCB-(d)ATP und PCB-(d)CTP unter Verwendung von 5-(3-Aminohexyl)(desoxy)cytidintriphosphat herzustellen.
  • Beispiel 7: Synthese von photolytisch spaltbaren Konjugaten - PCB-Phosphoramidite
  • Synthese von PCB-Phosphoramidit (13B): 5-(5-Biotinamidocaproamidomethyl)-2-nitroacetophenon ("37")(534 mg oder 1 mmol) wurde durch azeotrope Verdampfung mit Pyridin (3 × 2 ml) wasserfrei gemacht und in 5 ml Pyridin gelöst. 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (406 mg oder 1,2 Äqu.) und 4-Dimethylaminopyridin (6 mg oder 0,05 Äqu.) wurden hinzugefügt, und die resultierende Lösung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Zehn ml CHCl3 und 20 ml 0,1 N wässriges NaHCO3 wurden hinzugefügt, die gebildeten Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde getrocknet, zur Trockne eingedampft und auf einer Silicagelsäule unter Verwendung eines 0–5% Stufengradienten von MeOH in CHCl3 gereinigt, was 576 mg (etwa 69%) Verbindung 38 ergab. Die Zwischenstufe 38 (836 mg oder 1 mmol) wurde in 8 ml 95%igem EtOH gelöst. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt und kräftig gerührt. Zu der Lösung wurde portionsweise NaBH4 (19 mg oder 2 Äqu.) gegeben, und die Lösung wurde nach weitere 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit 2 ml Aceton abgebrochen, 10 ml CHCl3 und 10 ml 0,1 N wässriges NaHCO3 wurden hinzugefügt, die Schichten wurden getrennt, die organische Schicht wurde getrocknet und zur Trockne eingedampft, was 704 mg (etwa 84%) Verbindung 39 ergab, die ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Verbindung 39 (838 mg oder 1 mmol) wurde in einem Gemisch von CHCl3 (5 ml) und Diisopropylethylamin (0,68 ml oder 4 Äqu.) gelöst. Zu dieser Lösung wurde 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (225 μl oder 1 Äqu.) gegeben, und die Lösung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Ethylacetat (5 ml) wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde mit einer NaCl-Lösung (3 × 1 ml) und H2O (2 ml) gewaschen. Getrocknete Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, und es wurde auf einer Silicagelsäule unter Verwendung eines Stufen gradienten von Triethylamin in CH2Cl2 mit einer Ausbeute von 789 mg (etwa 74%) gereinigt.
  • Beispiel 8: Chemische Synthese von Oligonucleotiden unter Verwendung von PCB-Phosphoramiditen
  • Automatisierte Synthese und Reinigung von Oligonucleotiden unter Verwendung von 5'-PCB-Phosphoramidit: Eine 0,1 M Lösung von 5'-PCB-Phosphoramidit in wasserfreiem Acetonitril wurde hergestellt. Die Flasche mit der Lösung wurde in den zusätzlichen Phosphoramidit-Anschluss des DNA/RNA-Synthesizers 392 von Applied Biosystems gebracht. Eine Oligodesoxynucleotid-Sequenz wurde programmiert und synthetisiert, wobei 40 nmol CE-Säule und die Standardsynthesevorschrift verwendet wurden. Die einzige notwendige Modifikation war eine ausgedehnte Detritylierung (180 s), die notwendig war, um die Tritylgruppen von der N1-Position von Biotin zu entfernen. Nach der Synthese wurde 5'-PCB-Oligodesoxynucleotid vom festen Träger abgespalten und durch 16 Stunden Behandlung mit konzentriertem Ammoniak bei 50°C von den Schutzgruppen befreit. Das rohe Oligonucleotid wurde gefriergetrocknet und in 1 ml Phosphatpuffer, pH 7,4, gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Suspension von monomeres-Avidin-Agarose-Kügelchen (Sigma Chemical; St. Louis, MO) (40 nmol) gegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Suspension wurde filtriert und mit 3 × 1 ml Phosphatpuffer gewaschen, in 3 ml Phosphatpuffer resuspendiert und 10 Minuten lang unter vorsichtigem Rühren gemäß der obigen Beschreibung bestrahlt. Das Gemisch wurde filtriert, das Filtrat wurde gefriergetrocknet und wieder aufgelöst (Ausbeute = 3,8 OD260).
  • Beispiel 9: Enzymatische Synthese von DNA und RNA unter Verwendung von PCB-Nucleotiden
  • Für die Biotinylierung von Nucleinsäuresonden stehen mehrere enzymatische und chemische Verfahren zur Verfügung. Zu den enzymatischen Verfahren zum Einbau von PCB-Nucleotiden in DNA gehören die Nick-Translation und die Ersetzungssynthese unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase. Es kann auch eine terminate Markierung von DNA unter Verwendung von Terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase durchgeführt werden. Für die PCB-Markierung von RNA können mehrere RNA-Polymerase-Enzyme verwendet werden. Die Nick-Translation wurde in Anwesenheit von PCB-dCTP auf der Basis der für die Biotinylierung entwickelten Verfahren durchgeführt (P. R. Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633, 1981). Für doppel- und einzelsträngige DNA-Moleküle wurde enzymatische Schwanzbildung verwendet. PCB-Nucleotide wurden an das 3'-Ende der DNA addiert. Biotinylierte Sonden mit internen Biotin-Struktureinheiten bilden weniger stabile Hybride als Sonden mit externen Biotinen, und die auf diese Weise synthetisierten biotinylierten Sonden haben eine größere Empfindlichkeit als Sonden, die am 5'-Ende einfach biotinyliert sind (E. P. Diamandis et al., Clin. Chem. 37: 625, 1991).
  • Herstellung von PCB-markierter RNA: Die PCB-Markierung von RNA wurde in einem Standard-Phagen-T7-RNA-Polymerase-Transcriptionssystem unter Verwendung des PCB-UTP erreicht. Um einzelsträngige biotinylierte RNA als Sonde herzustellen wurde die geeignete DNA-Sequenz in einen geeigneten Vektor einkloniert, der den T7-Promotor stromaufwärts von dem Polylinker-Bereich enthält. Nach der Linearisierung des DNA-Klons stromabwärts des klonierten Einschubs wurde das RNA-Transcript definierter Länge durch die T7-RNA-Polymerase unter Verwendung von ATP, CTP, GTP und PCB-UTP als Substraten erzeugt.
  • Beispiel 10: Isolierung von hämatopoetischen Zellen für die autologe Knochenmarktransplantation
  • Knochenmark wird aus dem hinteren Darmbeinkamm (Crista iliaca posterior) von normalen gesunden und leukämischen Patienten in Heparin entnommen. Mononukleäre Zellen geringer Dichte werden durch Sedimentation auf Ficoll-Hypaque (Sigma Chemical; St. Louis, MO) abgetrennt. CD34-positive Zellen werden isoliert, wobei man PCB-markierte monoklonale Anti-CD34-Antikörper (My10) verwendet. Mononukleäre Knochenmarkzellen werden in Konzentrationen von 106/ml in Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM; Irvine Scientific; Santa Anna, CA) mit 20% FCS gegeben. Zellen werden über Nacht unter Gewebekulturbedingungen kultiviert, um adhärente Zellen zu entfernen. Nichtadhärente Zellen werden isoliert, zweimal in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in PBS auf 107/ml verdünnt. PCB-markierte Anti-CD34-Antikörper werden in einer Menge von 5 μg/ml zu der Zellsuspension gegeben und eine Stunde lang bei 4°C inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit vorsichtig gemischt wurde. Nach der Inkubation werden die Zellen zweimal in 5% FCS/PBS gewaschen und in demselben Volumen resuspendiert. Streptavidinbeschichtete Magnetkügelchen (Dynabeads; Oslo, Norwegen) werden zu der Suspension gegeben, die eine Stunde lang unter Mischen bei 4°C inkubiert wurde. Die Kügelchen und die damit assoziierten Zellen werden einem Magneten ausgesetzt und aus der Suspension abgetrennt und in 5% FCS/PBS gegeben. Die photolytische Spaltung erfolgt durch 4 Minuten Bestrahlung der Kügelchen mit einer UV-Lampe mit langer Wellenlänge (Black Ray XX-15 UV-Lampe; UVP Inc.; San Gabriel, CA) in einem Abstand von 15 cm (Emissionspeak 365 nm, Lampenintensität = 1,1 mW/cm2 in einem Abstand von 31 cm). Die freigesetzten Kügelchen werden durch magnetischen Abfang isoliert. Die Zellsuspension wird durch Anfärben mit FITC-konjugiertem My10-Antikörper mit anschließender FACS-Analyse auf CD34-positive Zellen getestet, und es wurde bestimmt, dass mehr als 95% CD34-positive Zellen vorhanden waren.
  • Beispiel 11: Bestimmung der in-vivo-Halbwertszeit einer pharmazeutischen Zusammensetzung
  • Zellfreie Translationsreaktionen werden durchgeführt, indem man 10 μl PCB-Cumarin-Aminosäure-tRNAleu (hergestellt durch chemische Fehlaminoacylierung gemäß der obigen Beschreibung und mit 1,7 mg/ml in TE suspendiert), 50 μl S-23-Extrakt, 10 μl Wasser und 10 μl einer Lösung von 50 mM Magnesiumacetat, 50 mM Tris-Acetat, pH 7,6, 200 mM Hepes-KOH-Puffer, pH 7,5, 1 M Kaliumacetat, 5 mM DTT, 3,75 mM GTP, 25 mM ATP, 100 mM Creatinphosphat und 600 μg/ml Creatin-Kinase miteinander mischt. Dieses Gemisch wird auf Eis gehalten, bis man 20 μl 500 μg/ml humane IL-2-mRNA (die 26 Leucin-Codons enthält), die von rekombinanter IL-2-cDNA transcribiert und isoliert wurde, hinzufügt. Das Gemisch wird eine Stunde lang bei 25°C inkubiert und auf Eis gelegt. 100 μl Streptavidin-beschichtete magnetische Dynabeads (2 mg/ml) werden zu dem Gemisch gegeben, das 30 Minuten lang auf Raumtemperatur gehalten wurde. Nach der Inkubation wird das Gemisch 5 Minuten lang in einer Mikrofuge mit 3000 × g zentrifugiert, oder ein Magnetfeld wird unter Verwendung eines MPC an die Lösung angelegt. Der Überstand wird entfernt, und das Verfahren wird dreimal mit TE wiederholt. Das endgültige gewaschene Sediment wird in 50 μl 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, resuspendiert und in eine Quarzküvette übertragen. UV-Licht aus einer Black-Ray-UV-Lampe mit langer Wellenlänge wird ungefähr eine Sekunde lang auf die Suspension angewendet. Mit einem MPC wird 1,0 Minuten lang ein Magnetfeld an die Lösung angelegt, und der Überstand wird mit einer Pipette entfernt. Der Überstand wird sterilfiltriert und mit gleichen Volumina sterilem Puffer, der 50% Glycerin, 1,8% NaCl und 25 mM Natriumhydrogencarbonat enthält, gemischt. Die Proteinkonzentration wird bestimmt, indem man die OD260 misst.
  • 0,25 ml der resultierenden Zusammensetzung werden in Konzentrationen von 1 mg/ml i. v. in die Schwanzvene von zwei Balb/c-Mäusen injiziert. Zwei Kontrollmäuse werden ebenfalls mit einem vergleichbaren Puffervolumen injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 5 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten, 2 Stunden und 6 Stunden) werden 100-μl-Serumproben aus den Fußballen erhalten und zu 400 μl 0,9%iger Kochsalzlösung gegeben. Die Serumproben werden zu einer Lösung von mit Anti-Cumarin-Antikörper beschichteten Dynabeads (2 mg/ml) gegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Mit einem MPC wird 1 Minute lang ein Magnetfeld an die Lösung angelegt, und der Überstand wird mit einer Pipette entfernt. Die Fluoreszenz bei 470 nm wird gemessen, und die Proben werden mit monoklonalem Antikörper, der für Ratten-IL-2-Protein spezifisch ist, behandelt. In jeder Probe wird der Gehalt an IL-2-Protein quantifiziert und mit der nachgewiesenen Fluoreszenzmenge gleichgesetzt. Aus den erhaltenen Ergebnissen wird die in-vivo-Halbwertszeit von IL-2 genau bestimmt.
  • Beispiel 12: Polymerase-Kettenreaktionen mit PCB
  • Die Schritte, die an der PCR-Amplifikation von DNA-Sequenzen unter Verwendung von PCB beteiligt sind, sind in 12 gezeigt. Das unten beschriebene experimentelle Verfahren beruht auf einer Kombination von beschriebenen Vorschriften (Y. Lo et al., Nucl. Acids Res. 16: 719. 1988; R. K. Saiki et al., Sci. 239: 487, 1988). Das synthetisierte PCB-dCTP wurde (50 μM) zu dem Gemisch von dATP, dGTP, dTTP (alle 200 μM) und dCTP (150 μM) gegeben. Das Reaktionsgemisch bestand aus einer Target-DNA-Quelle (gesamte isolierte genomische DNA), flankierenden Primern und der thermostabilen Polymerase (Taq-Polymerase). Das Reaktionsgemisch wurde 25 bis 30 Amplifikationscyclen unterzogen. Die Proben wurden 1 Minute lang von 70 auf 95°C erhitzt, um die DNA zu denaturieren, und 2 Minuten lang auf 40°C abgekühlt, um die Primer zu assoziieren. Die Proben wurden wiederum 1 Minute lang auf 70°C erhitzt, um die Polymerase zu aktivieren, und 0,5 Minuten lang bei dieser Temperatur inkubiert, um die assoziierten Primer zu verlängern. Nach dem letzten Cyclus wurden die Proben noch weitere 5 bis 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert, um zu gewährleisten, dass die letzte Verlängerung beendet war. Ein magnetischer Abfang der Nucleinsäuren wurde durchgeführt, wobei streptavidinbeschichtete Magnetkügelchen verwendet wurden. Das abgefangene Material wurde mit geeigneten Puffern gewaschen und in der gewünschten Konzentration resuspendiert. Proben wurden 10 Minuten lang bestrahlt, wobei das PCR-Produkt in unmodifizierter Form freigesetzt wurde.
  • Nucleinsäuren wurden entweder in immobilisierter Form oder in Lösung nachgewiesen oder abgetrennt (gereinigt), wobei man PCB-markierte Nucleinsäuresonden verwendete. Es wurde eine Hybridisierung durchgeführt, wobei man DNA : DNA-, DNA : RNA- und RNA : RNA-Hybride erhielt. Diese Experimente beinhalten zuerst die Hybridisierung mit PCB-markierten Sonden und anschließend das Abfangen der Hybride unter Verwendung von streptavidinbeschichteten immobilisierten Trägern. Diese Hybride wurden von anfänglichen unerwünschten Komponenten freigewaschen und mit Hilfe von Bestrahlung von dem immobilisierten Träger freigesetzt (G. Gebeyehu et al., Nucl. Acids Res. 15: 4513, 1987; T. Ito et al., Nucl. Acids Res. 20: 3524, 1992). Die Hybridisierung von ssDNA-Molekülen mit PCB-Sonde beinhaltete die Inkubation dieser Komponenten in einem Hybridisierungspuffer bei 42°C während 30 Minuten. Die Hybridisierungsbedingungen wurden für jede Sonde und jedes experimentelle System optimiert. PCB-markierte Sonden hatten niedrigere Schmelztemperaturen als radioaktiv markierte Sonden und erfordern geringfügig modifizierte Hybridisierungsbedingungen. Diese Hybride wurden unter Verwendung von immobilisiertem Streptavidin (Dynabeads M280 Streptavidin) selektiv von den Reaktionskomponenten entfernt. Die photochemische Freisetzung von Komplexen führte zur Isolierung von reinem Hybrid.
  • Beispiel 13: Synthese von PCB-Liposomen
  • Einbau von PCB-Lipiden in Liposomen: PCB-Lipide wurden in Chloroform : Methanol in einem Verhältnis von 2 : 1 mit herkömmlichen Lipiden gemischt. Das Lipidgemisch wurde unter Stickstoff zur Trockne eingedampft, und die getrockneten Lipide wurden in DMSO als Lösungsmittel auf eine endgültige Konzentration von 1 mg/ml suspendiert. Die Liposomen wurden unter Stickstoff 10 Minuten lang in einer eiskalten Kammer mit Ultraschall behandelt. Die resultierende Suspension wurde 20 Minuten lang mit 10 000 U/min zentrifugiert, und der Überstand, der PCB-Liposomen enthielt, war gebrauchsfertig. Befriedigende Ergebnisse wurden mit nur 5% (Moläquivalent) PCB-Lipiden erhalten. Die chemischen Strukturformeln für PCB-Phosphatidylethanolamin und PCB-Phosphatidylserin sind in 16 gezeigt.
  • Beispiel 14: PCB für die in-situ-Hybridisierung
  • Die allgemeine Methodik für in-situ-Hybridisierungsreaktionen kann in Probenvorbereitung, Auswahl des Indikatormoleküls und der Sonde, Hybridisierung, Waschen sowie Autoradiographie und Nachweis unterteilt werden.
  • Probenvorbereitung: Gefrorene Gewebeschnitte von 5 bis 6 μm werden auf gelatinebeschichteten Objektträgern montiert und vor der Fixierung 30 min lang an der Luft getrocknet. Daraufhin erfolgt eine Fixierung von DNA oder RNA unter Verwendung von entweder Glutaraldehyd oder Paraformaldehyd. Während dieser Fixierungsschritte können wahlfreie Denaturierungsschritte (z. B. 100°C während 5 Minuten) mit anschließendem Abschrecken in eiskaltem Puffer (notwendig, wenn dsDNA oder dsRNA das Target der Reaktion ist) eingeführt werden. Im Falle von Zellen und Zellkulturen werden diese Zellen (1 × 106 Zellen) durch Cytozentrifugation oder Abstrich auf gelatinebeschichteten Objektträgern abgeschieden. Die Zellen werden an der Luft getrocknet und für DNA oder RNA fixiert.
  • Auswahl des Indikatormoleküls und der Sonde: Obwohl Isotopennachweis mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung von Nicht-Isotopenverfahren bietet, können auch letztere effektiv verwendet werden. Markierte Sonden können durch eine Vielzahl von Techniken erzeugt werden, die von synthetischen Oligonucleotiden bis zu herausgeschnittenen Plasmideinschüben reichen.
  • Hybridisierung: Die ISH folgt denselben allgemeinen Prinzipien wie eine Lösungs- und Filterhybridisierung. Die Standard-Reaktionstemperaturen betragen ungefähr Tm – 25°C (Tm ist die Temperatur, bei der 50% der Hybride dissoziieren). Die Reaktionstemperatur wird auf ein Niveau reduziert, das mit der Konservierung histologischer Details durch die Zugabe von 50% Formamid zum Hybridisierungsgemisch verträglich ist. Für typische DNA-DNA-Hybridisierungsreaktionen beträgt die Temperatur also 37°C, für RNA-DNA 44°C und für RNA-RNA 50°C. Die Oberfläche des Objektträgers, der die Probe trägt, wird vorsichtig mit einem Luftstrom angeblasen, und die endgültige Hybridisierungsmischung wird über die Oberfläche pipettiert. Der Film wird dann während der erforderlichen Zeit und bei der erforderlichen Temperatur flach in einem Bad aus Paraffinöl inkubiert.
  • Waschen: Das Paraffinöl wird ablaufen gelassen, und das überschüssige Öl wird durch zweimaliges Waschen mit Chloroform entfernt, und die Objektträger werden an der Luft getrocknet. Es wird unter hochstringenten Bedingungen gewaschen, um den Hintergrund zu reduzieren.
  • Autoradiographie und Nachweis: Der Nachweis erfolgt im Falle von radioaktiv isotopenmarkierten Sonden unter Verwendung von entweder mit Röntgenfilm oder Emulsion beschichteten Deckgläschen und im Falle von enzymatischen Nachweisverfahren nach anderen Methoden.
  • Beispiel 15: Isolierung von verschiedenen Zellpopulationen mit Agentien die bei unterschiedlichen Wellenlängen photolytisch abgespalten werden
  • Zwei unterschiedliche Konjugate werden erzeugt, jedes mit einem anderen antigenspezifischen Antikörper, der an ein anderes bioreaktives Agens gekoppelt ist. Konjugat A umfasst Verbindung 30 (21), ein PCB-bioreaktives-Agens, das an einen für den Zelloberflächenmarker CD34 (ein Stammzellenmarker) spezifischen Antikörper gekoppelt ist, und erfährt eine photolytische Spaltung durch eine Strahlung von 300 nm. Konjugat B umfasst Verbindung 25 (19), ein PCB-bioreaktives-Agens, das an einen für den Zelloberflächenmarker CD3 (ein T-Zell-Marker) spezifischen Antikörper gekoppelt ist, und erfährt eine photolytische Spaltung durch eine Strahlung von 400 nm.
  • Die Konjugate A und B werden in zwei Parallelansätzen mit Proben von peripherem Blut inkubiert, die von gesunden menschlichen Freiwilligen erhalten wurden. Inkubationen werden bei Raumtemperatur (22°C) unter leichtem Wiegen, um für einen maximalen Antikörper-Antigen-Kontakt zu sorgen, durchgeführt. Nach 30 Minuten Inkubation werden die Zellen in 100-mm-Gewebekulturplatten, die mit Streptavidin beschichtet sind, gegeben und weitere 30 Minuten lang inkubiert. Nach der Streptavidin-Biotin-Bindung werden die Platten vorsichtig in PBS gewaschen, um alle Zellen, die nicht anhaften, zu entfernen.
  • Nach dem Waschen wird eine Gruppe von Platten mit elektromagnetischer Strahlung von 300 nm behandelt, und die freigesetzten Zellen werden isoliert. Diese Gruppe wird dann mit elektromagnetischer Strahlung von 400 nm behandelt, und die bei dieser Frequenz freigesetzten Zellen werden isoliert. Eine zweite Gruppe von Platten wird mit Strahlung von 400 nm behandelt, die freigesetzten Zellen werden isoliert, die Platten werden wiederum bei 300 nm behandelt, und die freigesetzten Zellen werden wiederum isoliert. Durch Bestimmung der Zahl der Zellen, die nach jeder Behandlung und aus jeder Gruppe von Platten isoliert wurden, wird die Zahl der Zellen in einer Probe von peripherem Blut bestimmt, die den Zelloberflächenmarker für CD34, CD3 und sowohl CD34 als auch CD3 tragen.
  • Weitere Ausführungsformen und Verwendungen der Erfindung sind für den Fachmann anhand einer Betrachtung der Beschreibung und der praktischen Durchführung der hier offenbarten Erfindung ersichtlich.

Claims (12)

  1. Konjugat, das eine chemische Struktur umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus
    Figure 01150001
    besteht, wobei SUB ein Substrat umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Nucleosiden, Aminosäuren, Peptiden, Phosphoramiditen und Liposomen besteht; R1 und R2 aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Alkyl, substituiertem Alkyl, Aryl, substituiertem Aryl, -CF3, -NO2, -COOH und -COOR besteht, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können; A eine zweiwertige funktionelle Gruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus -O-, -S- und -NR1- besteht; Ym1 eine Gruppe ist, wobei Y eine oder mehrere mehratomige Gruppen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Nitrogruppen, Sulfoxidgruppen, Alkylgruppen, Alkoxygruppen besteht, wobei die mehratomigen Gruppen gleich oder verschieden sein können und ml eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist; Vm2 eine Gruppe ist, wobei V eine oder mehrere einatomige Gruppen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Chlorid, Fluorid, Iodid, Bromid und Wasserstoff besteht, wobei die einatomigen Gruppen gleich oder verschieden sein können und m2 eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist; Q eine Spacer-Struktureinheit umfasst; und D eine selektiv nachweisbare Struktureinheit umfasst, die von R1 und R2 verschieden ist, wobei D aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Struktureinheiten von Biotin, Cumarin, Dansyl, Rhodaminen, Fluoresceinen, Dinitrophenyl und Antigenen besteht.
  2. Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei Q eine verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoff-Spacer-Struktureinheit umfasst.
  3. Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei Q durch die Formel
    Figure 01160001
    dargestellt wird, wobei W und W' jeweils aus der Gruppe, die aus -CO-, -CO-NH-, -HN-CO-, -NH-, -O-, -S- und -CH2- besteht, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können; und n1 und n2 ganze Zahlen von 0–10 sind, die gleich oder verschieden sein können, wobei, wenn entweder n1 oder n2 = 0 ist, W und W' wahlfrei sind.
  4. Konjugat gemäß Anspruch 1, das eine Formel hat, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht:
    Figure 01170001
    Figure 01180001
  5. Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei das Substrat ein pharmazeutisches Mittel ist.
  6. Konjugat gemäß Anspruch 5, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasser, Ölen, Lipiden, Sacchariden, Polysacchariden, Glycerinen, Collagenen und Kombinationen davon besteht.
  7. Verfahren zur Isolierung eines PCR-Produkts, das die folgenden Schritte umfasst: a) Konjugieren eines bioreaktiven Mittels mit einem oder mehreren Oligonucleotid-Primern mit einer kovalenten Bindung, die mit elektromagnetischer Strahlung selektiv spaltbar ist, wobei das konjugierte bioreaktive Mittel eine chemische Struktur hat, die aus der in Anspruch 1 beanspruchten Gruppe von Verbindungen ausgewählt ist; b) Amplifizieren einer Nucleinsäuresequenz durch PCR mit den konjugierten Primern; und c) Behandeln der amplifizierten Sequenzen mit elektromagnetischer Strahlung, so dass das bioreaktive Mittel freigesetzt wird.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Nucleinsäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Nucleinsäuresequenzen besteht, die man in biologischen Proben, bakterieller DNA und eukaryontischer DNA findet.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die nachweisbare Struktureinheit magnetisch ist.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die nachweisbare Struktureinheit eine elektrische Nettoladung hat.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Spacer-Struktureinheit einen verzweigten oder geradkettigen Kohlenwasserstoff umfasst.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei Q durch die Formel
    Figure 01190001
    dargestellt wird, wobei W und W' jeweils aus der Gruppe, die aus -C(O)-, -C(O)-NH-, -HN-C(O)-, -NH-, -O-, -S- und -CH2- besteht, ausgewählt sind und gleich oder verschieden sein können, wobei, wenn entweder n1 oder n2 = 0 ist, W und W' wahlfrei sind.
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