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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung von Nukleinsäure und
insbesondere die Isolierung von DNA oder RNA aus Zellen.
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Die
Isolierung von DNA oder RNA ist ein wichtiger Schritt bei vielen
biochemischen und diagnostischen Verfahren. Beispielsweise ist die
Abtrennung von Nukleinsäuren
aus den komplexen Gemischen, in denen sie sich oft befinden, häufig notwendig,
ehe andere Untersuchungen und Verfahren, z. B. Nachweis, Klonierung,
Sequenzierung, Amplifikation, Hybridisierung, cDNA-Synthese usw.
durchgeführt
werden können;
die Anwesenheit von großen
Mengen an zellulärem
oder anderem verunreinigenden Material, z. B. Proteine oder Kohlenhydrate,
in solchen komplexen Gemischen behindert oft viele der in der Molekularbiologie
verwendeten Reaktionen und Verfahren. Außerdem kann DNA RNA-Präparationen
verunreinigen und umgekehrt. Folglich werden Verfahren zur Isolierung
von Nukleinsäuren
aus komplexen Gemischen wie etwa Zellen, Geweben usw. benötigt, nicht
nur im Hinblick auf den präparativen
Aspekt sondern auch bei den vielen heutzutage verwendeten Verfahren,
welche auf die Identifizierung von DNA oder RNA angewiesen sind,
beispielsweise die Diagnose von mikrobiellen Infektionen, die forensische
Wissenschaft, Gewebe- und Bluttypisierung, Nachweis von genetischen
Variationen usw.
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Im
Hinblick auf die Identifizierungen von RNA ist es für eine eindeutige
Diagnose wichtig, dass sicher ist, dass die nachgewiesene Sequenz
von einem RNA-Molekül stammt
und nicht von einer Verunreinigung mit genomischer DNA in der Probe.
Aus diesem Grund sind Verfahren für die Trennung der RNA von
DNA wichtig. Für
die RNA-Isolierung sind auch schnelle Verfahren erforderlich, da
RNA-Moleküle
normalerweise sehr instabil sind und von den in Zellen und Körperflüssigkeiten
vorhandenen RNAsen schnell abgebaut werden. Die Qualität der RNA
ist wahrscheinlich der wichtigste Faktor bei der Bestimmung der
Qualität
der Endergebnisse in Protokollen unter Verwendung von mRNA, insbesondere
für die cDNA-Synthese.
Es ist aus mehreren Gründen
wichtig, eine DNA-Kontamination von RNA-Präparationen zu vermeiden. Erstens
erhöht
DNA die Viskosität,
was die Handhabung der Probe erschwert, zu einer schlechten RNA-Ausbeute
und auch zu einer qualitativ schlechten RNA führt, mit der Wahrscheinlichkeit
einer DNA-Kontamination.
Eine DNA-Kontamination kann auch RNAse-Enzyme abfangen und Anwendungen
stromabwärts
wie etwa eine RT-PCR wertlos machen.
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Für die Isolierung
von Nukleinsäuren
ist eine Reihe von Verfahren bekannt, aber im Allgemeinen beruhen
diese auf einer komplexen Reihe von Extraktions- und Waschschritten und sind zeitaufwändig und
umständlich
durchzuführen.
Außerdem
ist oft die Verwendung von Materialien wie etwa Alkohole und andere
organische Lösungsmittel,
chaotropen Substanzen und Proteinasen betroffen, was nachteilig
ist, da solche Materialien dazu neigen, viele enzymatische Reaktionen
und andere Verarbeitungsapplikationen stromabwärts zu stören.
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Folglich
betreffen die klassischen Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäuren aus
komplexen Ausgangsmaterialien wie etwa Blut oder Blutprodukten oder
Gewebe die Lyse des biologischen Materials durch ein Detergens oder
eine chaotrope Substanz, möglicherweise
in Gegenwart von proteinabbauenden Enzymen, gefolgt von mehreren
Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln,
beispielsweise Phenol und/oder Chloroform, eine Ethanolpräzipitation,
Zentrifugationen und eine Dialyse der Nukleinsäuren. Die Reinigung der RNA
von DNA kann eine selektive Präzipitation
mit LiCl oder eine selektive Isolierung mit saurem Guanidiniumthiocyanat
in Kombination mit Phenolextraktionen und einer Ethanolpräzipitation
betreffen. Solche Verfahren sind nicht nur umständlich und zeitaufwändig in
der Durchführung,
die relativ große
Anzahl von erforderlichen Schritten steigert auch das Risiko eines
Abbaus, Probenverlusts oder einer Kreuzkontamination von Proben,
wenn mehrere Proben gleichzeitig bearbeitet werden. Im Fall einer
RNA-Isolierung ist das Risiko einer Kontamination mit DNA relativ
hoch.
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Bei
der Reinigung von RNA ist es häufig
erwünscht,
speziell mRNA zu isolieren. Die meisten mRNA-Reinigungsstrategien
betreffen die Isolierung von Gesamt-RNA und Fraktionierung der isolierten
RNA. Die Präparation
von mRNA mit hoher Qualität
ist ein wichtiger Schritt bei der Analyse der Genstruktur und Genregulierung.
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Die
meisten eukaryontischen mRNAs besitzen einen Poly(A)-Schwanz, der
normalerweise eine Länge von
etwa 50–300
Nukleotiden aufweist. Solche mRNA wird als polyadenylierte oder
Poly(A)+-mRNA bezeichnet. Durch Abtrennung
dieser polyadenylierten RNA von der nicht adenylierten RNA, welche
95% oder mehr der Gesamt-RNA einer Zelle ausmacht, wird dieser Poly(A)-Schwanz
ausgenutzt und es wird eine Art einer Aftinitätsabtrennung, welche gegen
den Poly(A)-Schwanz
gerichtet ist, durchgeführt.
Die konventionelle Technologie hat die Reinigung von Gesamt-RNA
als einen ersten Schritt und die Auswahl von Poly(A)+-RNA
durch Affinitätschromatographie
unter Verwendung von Oligo(dT)-Zellulose
als den zweiten Schritt betroffen. Diese Strategie ist ziemlich
zeitaufwändig
und arbeitsintensiv. Eine alternative Strategie für die Reinigung
von mRNA ist die Verwendung von Trägermaterialien wie etwa Mikroplatten,
Latex, Agarose oder Magnetbeads, an welche Oligo(dT) gebunden ist.
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Während der
letzten vier Jahre ist die Anwendung einer durch Magnetbeads unterstützte Strategie
für eine
Poly(A)+-RNA-Selektion zunehmend beliebt
geworden, da sich diese Beads bei mRNA-Bearbeitungen als günstig erwiesen
haben. In vielen Ansätzen
hängen
die Ausbeute und die Qualität
der Produkte davon ab, wie schnell die mRNA von Nukleasen und anderen
Kontaminationen gereinigt werden kann. Unter Verwendung der Trenntechnologie
mit Magnetbeads kann intakte Poly(A)+-RNA
entweder aus Gesamt-RNA-Präparationen oder,
wichtiger, direkt aus rohen Lysaten von festen Geweben, Zellen oder
Körperflüssigkeiten
schnell erhalten werden. Das gesamte Verfahren kann in einem Mikrozentrifugenröhrchen ohne
Phenolextraktionen oder Ethanolpräzipitationen durchgeführt werden.
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Ein
bei der RNA-Reinigung üblicher
Ansatz, welcher in Verbindung mit dem Festphasenlansatz verwendet
werden kann, ist die Durchführung
der Lyse des biologischen Materials und die nachfolgende Hybridisierung
an Oligo-dT in LiCl und LiDS/SDS-Puffern, wobei Extraschritte wie
etwa eine Phenolextraktion oder ein Proteinase K-Verdau vermieden
wird. Die gesamte direkte mRNA-Isolierung dauert ungefähr 15 min
und da die mRNA für
mehr als 30 min im Lysepuffer stabil ist, stellt das die hohe Qualität der gereinigten
mRNA sicher. Aber ein Nachteil dieses Verfahrens ist der, dass die
mRNA pro Gewichtseinheit an Gewebe durch die Menge des verwendeten
Gewebes beeinflusst wird und oberhalb eines kritischen Schwellenwerts
an lysierten Zellen die Ausbeute der mRNA sinkt.
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Ein
anderer üblicher
Ansatz für
eine direkte mRNA-Isolierung ist, wie oben erwähnt, die Verwendung von Guanidiniumisothiocyanat
(GTC) und Sarkosyl. Ein GTC-Puffersystem wird aufgrund der Fähigkeit
dieses chaotropen Salzes, RNAsen zu hemmen, von den meisten Wissenschaftlern
bevorzugt. Dies kann auch in Kombination mit dem Magnetbead-Ansatz
verwendet werden. Aber die Viskosität von Zelllysaten in 4 M GTC ist
hoch und die Beads werden nicht effizient von dem Magneten angezogen,
was sowohl bei Beads als auch bei anderen Festphasen ein gesteigertes
Risiko einer DNA-Kontamination und geringere Ausbeuten ergibt.
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Kürzlich wurden
andere Verfahren vorgeschlagen, welche von der Verwendung einer
Festphase abhängen.
In US-A-5,234,809 wird beispielsweise ein Verfahren beschrieben,
bei dem Nukleinsäuren
in Gegenwart eines chaotropischen Mittels wie etwa einem Guanidiniumsalz
an eine Festphase in Form von Silicapartikeln gebunden wird und
dabei vom Rest der Probe abgetrennt wird. WO 91/12075 beschreibt
ein Verfahren, bei dem eine Nukleinsäure an der Oberfläche einer
Festphase mittels Präzipitation
abgefangen wird. Im Allgemeinen werden Alkohole und Salz als Präzipitationsmittel
verwendet.
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Obwohl
solche Verfahren den Trennungsprozess der Nukleinsäure beschleunigen,
gibt es Nachteile, welche mit der Verwendung von Alkoholen, chaotropen
Substanzen und anderen ähnlichen
Mitteln verbunden sind. Chaotrope Substanzen müssen mit einer hohen Molarität verwendet
werden, was viskose Lösungen
ergibt, mit welchen eine Bearbeitung schwierig sein kann, insbesondere
bei der Arbeit mit RNA. Amplifikationsverfahren wie etwa PCR und
andere, auf Enzymen basierende Reaktionen sind sehr sensitiv gegenüber den hemmenden
oder anderweitig störenden
Wirkungen von Alkoholen und anderen Mitteln. Außerdem ist bekannt, dass das
Trocknen des Nukleinsäurepellets,
welches nach einer Alkoholpräzipitation
notwendig ist, und die Probleme beim Lösen von Nukleinsäuren auch
zu Artefakten bei auf Enzymen basierenden Verfahren wie etwa der
PCR führen.
Da solche Verfahren nun eine Stütze
der Molekularbiologie sind, besteht ein Bedarf an verbesserten Verfahren
der Nukleinsäureisolierung
und insbesondere an Verfahren, welche schnell und einfach durchzuführen sind,
und welche die Verwendung von chaotropen Substanzen oder eine Alkoholpräzipitation
vermeiden. Es besteht auch ein Bedarf an einem Verfahren, welches
die Differenzierung zwischen RNA und DNA ermöglicht und eine gesonderte
Isolierung von beiden Arten der Nukleinsäure aus der gleichen Probe ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung möchte
solche Verfahren bereitstellen.
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Insbesondere
ist nun gefunden worden, dass Nukleinsäure in einer Form aus einer
Probe isoliert werden kann, welche für eine Amplifikation oder andere
Verfahren stromabwärts
geeignet ist, durch ein einfach und leicht durchzuführendes
Verfahren, das die Behandlung der Probe mit einem Detergens betrifft
und es ermöglicht,
dass die Nukleinsäure
an ein Trägermaterial
gebunden wird, woraufhin die Nukleinsäure beispielsweise durch Entfernen
des Trägers
leicht von der Probe getrennt werden kann. Die Bindung der Nukleinsäure ist
unabhängig
von ihrer Sequenz.
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren
bereit zum Isolieren von Nukleinsäure aus einer Probe, wobei
das Verfahren das Inkontaktbringen der Probe mit einem Detergens
und einem partikulären
Trägermaterial
umfasst, wobei lösliche
Nukleinsäure
in der Probe mittels sequenzunabhängiger Bindung in Gegenwart
des Detergens und ohne chaotropes Mittel an die Oberfläche des
Trägers
gebunden wird, und Abtrennen des Trägers mit der gebundenen Nukleinsäure von
der Probe.
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Die
Nukleinsäure
kann DNA, RNA oder eine beliebige natürlich vorkommende oder synthetische
Modifikation davon und Kombinationen davon sein. Bevorzugt ist die
Nukleinsäure
aber DNA, welche genomisch oder cDNA sein kann und einzel- oder
doppelsträngig
oder in einer anderen beliebigen Form vorliegen kann.
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Wenn
das erfindungsgemäße Verfahren
verwendet wird, um DNA zu isolieren, kann es günstigerweise mit einem weiteren
Schritt gekoppelt werden, um RNA aus der gleichen Probe zu isolieren.
Die Verwendung des Verfahrens in solchen Zweischritt-RNA-Trennungen
wird unten ausführlicher
beschrieben.
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Die
Proben können
ein beliebiges Material darstellen, das Nukleinsäure enthält, einschließlich beispielsweise
Nahrungsmittel und ähnliche
Produkte, klinische Proben und Umweltproben. Aber im Allgemeinen ist
die Probe eine biologische Probe, welche ein beliebiges virales
oder zelluläres
Material enthalten kann, umfassend alle prokaryontischen oder eukaryontischen
Zellen, Viren, Bakteriophagen, Mycoplasmen, Protoplasmen und Organellen.
Solch ein biologisches Material kann folglich alle Arten von tierischen
Zellen von Säugetieren
und Nicht-Säugetieren,
Pflanzenzellen, Algen einschließlich
Blaugrünalgen,
Pilzen, Bakterien, Protozoen usw. umfassen. Beispielhafte Proben
umfassend folglich Gesamtblut und von Blut stammende Produkte wie
etwa Plasma, Serum und Buffy Coat, Urin, Stuhl, Rückenmarksflüssigkeit
oder beliebige andere Körperflüssigkeiten,
Gewebe, Zellkulturen, Zellsuspensionen usw.
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Die
Probe kann auch relativ reine Ausgangsmaterialien wie etwa ein PCR-Produkt oder halbreine
Präparationen
enthalten, welche durch andere Gewinnungsverfahren für Nukleinsäure erhalten
werden.
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Die
Nukleinsäure
enthaltende Probe kann im Allgemeinen leicht mit dem Detergens und
einer Festphase kontaktiert werden, welche vor, gleichzeitig mit
oder nach dem Detergens zugegeben werden kann. Falls nötig, können dem
ein oder mehrere verschiedene Schritte vorangestellt werden, um
Strukturkomponenten wie etwa Zellwände zu zerstören oder
eine Lyse zu erreichen. Verfahren, um dieses zu erreichen, sind
im Fachgebiet gut bekannt. Obwohl einige Zellen, beispielsweise
Blutzellen, durch das Detergens alleine lysiert werden können, können folglich
beispielsweise andere Zellen, z. B. Pflanzen- oder Pilzzellen oder
feste tierische Gewebe, eine kräftigere
Behandlung erfordern wie etwa beispielsweise Mahlen in flüssigem Stickstoff, Erhitzen
in Gegenwart des Detergens, eine alkalische Lyse in Gegenwart des
Detergens. Für
Proben, beispielweise in Form von Paraffinschnitten und dergleichen
kann eine Lyse (und Schmelzen des Paraffins) durch Erhitzen bewirkt
werden, beispielsweise unter Verwendung einer Mikrowelle (Banerjee,
S. K. et al., 1995, Biotechniques 18: 769–773). Auch be stimmte kompaktere
Gewebe können
eine Enzymbehandlung erfordern, beispielsweise unter Verwendung
von Proteinase K, um eine ausreichende Freisetzung der Nukleinsäure zu erhalten.
Die verschiedenen Bestandteile werden gemischt und einfach für eine geeignete
Zeitdauer stehen gelassen, damit die Nukleinsäure an den Träger binden
kann. Falls andere Agenzien wie etwa Enzyme, z. B. Proteinase K,
verwendet werden, können
sie günstigerweise
in dem Detergens enthalten sein. Der Träger wird dann aus der Lösung durch
ein beliebiges günstiges
Mittel entfernt, welches natürlich
von der Art des Trägers abhängt und
alle Formen zum Entfernen des Trägers
aus dem Probenüberstand
oder umgekehrt enthält,
beispielsweise Zentrifugation, Dekantieren, Pipettieren usw.
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Die
Bedingungen während
dieses Verfahrens sind nicht kritisch, und es hat sich beispielsweise
als günstig
erwiesen, die Probe einfach mit dem Detergens in Gegenwart einer
Festphase zu mischen und sie bei Raumtemperatur für 5–20 min
vor der Trennung stehen zu lassen. Wie oben erwähnt, ist die Reaktionsdauer nicht
kritisch und oftmals sind bereits 5 min ausreichend. Falls es praktischer
ist, können
aber längere
Zeiträume
verwendet werden, beispielsweise 0,5–3 h oder sogar über Nacht.
Das Mischen kann durch ein beliebiges zweckmäßiges Mittel durchgeführt werden
einschließlich
beispielsweise einer einfachen Bewegung durch Rühren oder Schütteln. Falls
erwünscht,
können
auch höhere
oder niedrigere Temperaturen verwendet werden, dies ist aber nicht
notwendig.
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Das
Detergens kann ein beliebiges Detergens sein und es ist eine riesige
Anzahl bekannt und in der Literatur beschrieben. Folglich kann das
Detergens ionisch sein, einschließlich anionisch und kationisch,
nicht ionisch oder zwiterionisch. Der Begriff "ionisches Detergens" wie hierin verwendet, umfasst ein beliebiges
Detergens, welches bei Lösung
in Wasser teilweise oder vollständig
in ionischer Form vorliegt. Es hat sich gezeigt, dass anionische
Detergenzien besonders gut funktionieren und bevorzugt werden. Geeignete
anionische Detergenzien umfassen beispielsweise Natriumdodecylsulfat
(SDS) oder andere Alkalimetallalkylsulfatsalze oder ähnliche
Detergenzien, Sarkosyl oder Kombinationen davon.
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Praktischerweise
kann das Detergens in einer Konzentration von 0,2 bis 30% (w/v)
verwendet werden, beispielsweise von 0,5 bis 30%, bevorzugt von
0,5 bis 15%, mehr bevorzugt von 1 bis 10%. Bei anionischen Detergenzien
hat sich gezeigt, dass Konzentrationen von 1,0 bis 5%, beispielsweise
von 0,5 bis 5% gut funktionieren.
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Das
Detergens kann in einer einfachen wässrigen Lösung bereitgestellt werden,
welche alkalisch oder sauer sein kann, oder mehr bevorzugt in einem
Puffer. Es kann jeder beliebige geeignete Puffer verwendet werden,
einschließlich
beispielsweise Tris, Bicine, Tricine und Phosphatpuffer. Praktischerweise
kann eine Quelle monovalenter Kationen, z. B. ein Salz, enthalten
sein, um das Einfangen der Nukleinsäure zu verbessern, obwohl dies
nicht notwendig ist. Geeignete Salze umfassen Chloridsalze, z. B.
Natriumchlorid, Lithiumchlorid usw. bei Konzentrationen von 0,1
bis 1 M, beispielsweise von 250 bis 500 mM. Wie oben erwähnt, können andere
Bestandteile wie etwa Enzyme auch enthalten sein.
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Andere
optionale Bestandteile in der Detergenszusammensetzung umfassen
Chelatbildner, z. B. EDTA, EGTA, und andere Polyaminocarbonsäuren, günstigerweise
bei Konzentrationen von 1 bis 50 mM usw., Reduktionsmittel wie etwa
Dithiotreitol (DTT) oder β-Mercaptoethanol
bei Konzentrationen von beispielsweise 1 bis 10 mM.
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Bevorzugte
Detergenszusammensetzungen können
beispielsweise umfassen:
100 mM Tris-HCl pH 7,5
10 mM
EDTA
2% SDS
oder:
100 mM TrisCl pH 7,5
10 mM
EDTA
5% SDS
10 mM NaCl
oder:
100 mM TrisCl pH
7,5
500 mM LiCl
10 mM EDTA
1% LiDS
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Das
Detergens fungiert in dem Verfahren so, dass das Nukleinsäure enthaltende
Material lysiert wird, beispielsweise dass die Zellen und Nuklei
die Nukleinsäure
freisetzen. Es wird auch angenommen, dass das Detergens bei der
Zerstörung
der Bindung von Proteinen, beispielsweise DNA bindenden Proteinen,
an die Nukleinsäure
hilfreich ist und das Problem von Kontaminationen in der Probe,
welche dem Trägermaterial
anhaften, verringert.
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Das
partikuläre
Trägermaterial
kann ein beliebiges der bekannten Träger oder Matrizen sein, welche für die Immobilisierung,
Trennung usw. gegenwärtig
weithin verwendet oder vorgeschlagen werden.
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Günstigerweise
kann der Träger
aus Glas, Silica, Latex oder einem Polymermaterial bestehen. Bevorzugt
sind Materialien, welche für
die Bindung der Nukleinsäure
eine große
Oberfläche
bereitstellen. Obwohl eine Bindung an theoretische Betrachtungen
nicht erwünscht
ist, wird angenommen, dass der Bindungsprozess der Nukleinsäure dadurch
unterstützt
werden kann, dass die Nukleinsäure
um den Träger "herumgewickelt wird". Solche Träger besitzen
im Allgemeinen eine unregelmäßige Oberfläche und
können
beispielsweise porös
sein. Partikuläre
Materialien, beispielsweise Beads, sind aufgrund ihrer größeren Bindungskapazität im Allgemeinen
bevorzugt, insbesondere polymere Beads.
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Günstigerweise
umfasst ein partikuläres
Trägermaterial,
welches erfindungsgemäß verwendet
wird, sphärische
Beads. Die Größe der Beads
ist nicht kritisch, aber sie können
beispielsweise im Durchmesserbereich von mindestens 1 und bevorzugt
mindestens 2 μm
liegen und einen maximalen Durchmesser von bevorzugt nicht mehr
als 10 und mehr bevorzugt nicht mehr als 6 μm aufweisen. Es hat sich beispielsweise
gezeigt, dass Beads mit einem Durchmesser von 2,8 μm und 4,5 μm besonders
gut funktionieren.
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Monodisperse
Partikel, das bedeutet, solche Partikel, die im Wesentlichen eine
einheitliche Größe aufweisen
(beispielsweise eine Größe mit einer
Standardabweichung des Durchmessers von weniger als 5%), besitzen
den Vorteil, dass sie eine sehr einheitliche Reproduzierbarkeit
der Reaktion bereitstellen. Monodisperse Polymerpartikel, welche
durch das in US-A-4,336,173 beschriebene Verfahren hergestellt werden,
sind besonders geeignet.
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Nicht
magnetische Polymerbeads, die zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren
geeignet sind, sind von Dyno Particles AS (Lillestrøm, Norwegen)
ebenso wie von Qiagen, Pharmacia und Serotec erhältlich.
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Um
die Manipulation und Trennung zu unterstützen, sind jedoch magnetische
Beads bevorzugt. Der Begriff "magnetisch", wie hierin verwendet,
bedeutet, dass der Träger
einen magnetischen Moment aufweisen kann, der ihm verliehen wird,
wenn er in einem Magnetfeld platziert wird, und folglich unter der
Wirkung dieses Felds verschoben werden kann. Mit anderen Worten,
ein Träger,
der magnetische Partikel umfasst, kann leicht durch magnetische
Aggregation entfernt werden, wodurch ein schneller, einfacher und
effizienter Weg der Trennung der Partikel nach dem Nukleinsäurebindungsschritt
bereitgestellt wird, und das ist ein weit weniger rigoroses Verfahren
als traditionelle Verfahren wie etwa eine Zentrifugation, wobei
Scherkräfte
erzeugt werden, welche Nukleinsäuren
degradieren können.
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Unter
Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
können
folglich die magnetischen Partikel mit daran haftender Nukleinsäure auf
einer geeigneten Oberfläche
durch Anwendung eines Magnetfelds entfernt werden, beispielsweise
unter Verwendung eines Dauermagneten. Es ist normalerweise ausreichend,
einen Magneten an die Seite des Gefäßes anzulegen, welches das
Probengemisch enthält,
um die Partikel an der Wand des Gefäßes zu aggregieren und den
Rest der Probe wegzuschütten.
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Besonders
bevorzugt sind superparamagnetische Partikel, beispielsweise die
von Sintef in EP-A-106 873 beschriebenen Partikel, da die magnetische
Aggregation und das Klumpen der Partikel während der Reaktion vermieden
werden kann, wodurch eine einheitliche Nukleinsäureextraktion sichergestellt
wird. Die gut bekannten magnetischen Partikel, welche von Dynal
AS (Oslo, Norwegen) als DYNABEADS verkauft werden, sind für eine Verwendung
in der vorliegenden Erfindung besonders geeignet.
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Funktionalisierte,
beschichtete Partikel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
können
durch Modifikation der Beads hergestellt werden gemäß den US-Patenten
4,336,173, 4,459,378 und 4,654,264. Folglich können Beads oder andere Träger mit
verschiedenen Arten einer funktionalisierten Oberfläche her gestellt
werden, beispielsweise positiv geladen oder hydrophob. Schwach und
stark positiv geladene Oberflächen,
schwach negativ geladene neutrale Oberflächen und hydrophobe Oberflächen, z.
B. mit Polyurethan beschichtete Oberflächen, haben sich als gut funktionierend
erwiesen.
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Es
ist auch möglich,
Trägermaterialien
zu verwenden, welche so modifiziert worden sind, dass sie das selektive
Einfangen von gewünschten
Zellen, Viren usw. erlauben, welche die Nukleinsäure enthalten. Folglich können beispielsweise
Träger
verwendet werden, welche Antikörper
oder andere Bindungsproteine tragen, die für einen gewünschten Zelltyp spezifisch
sind. Dies kann einen Selektivitätsgrad
in die Isolierung der Nukleinsäure
einbringen, da nur Nukleinsäure
von einer gewünschten
Zielquelle innerhalb eines komplexen Gemischs abgetrennt werden
kann. Folglich kann beispielsweise solch ein Träger verwendet werden, um den
gewünschten
Zelltyp usw. aus der Probe abzutrennen und zu entfernen, danach
wird das Detergens zugegeben, um eine Lyse, eine Freisetzung der
Nukleinsäure
und eine Bindung an den Träger
zu erreichen.
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Die
Präparation
von solchen selektiven Zelleinfangmatrizen ist im Stand der Technik
gut bekannt und wird in der Literatur beschrieben.
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Ebenso
kann der Träger
mit Bindungspartnern bereitgestellt werden, um das selektive Einfangen
der Nukleinsäuren
zu unterstützen.
Beispielsweise können
komplementäre
DNA- oder RNA-Sequenzen oder DNA-Bindungsprotein verwendet werden,
oder virale Proteine, welche an virale Nukleinsäure binden. Die Anheftung von
solchen Proteinen an das Trägermaterial
kann erreicht werden unter Verwendung von Verfahren, die im Stand
der Technik gut bekannt sind.
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Obwohl
es nicht notwendig ist, kann es günstig sein, einen oder mehrere
Waschschritte in das erfindungsgemäße Isolierungsverfahren einzubringen,
beispielsweise nach der Abtrennung des Trägers aus der Probe. Im Fall
von magnetischen Beads kann dies günstigerweise durchgeführt werden,
ehe die DNA von den Beads freigesetzt wird. Es können beliebige konventionelle
Waschpuffer oder andere Medien verwendet werden. Im Allgemeinen
sind Puffer mit einer niedrigen bis moderaten Ionenstärke bevorzugt,
z. B. 10 mM Tris-HCl bei pH 8,0/10 mM NaCl. Falls erwünscht, können auch
andere Standardwaschmedien verwendet werden, z. B. Waschmedien,
welche Alkohole enthalten.
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Nach
dem Abtrennungsschritt und beliebigen optionalen Waschschritten,
welche erwünscht
sein können,
kann der Träger,
welcher die Nukleinsäure
trägt, übertragen
werden, z. B. resuspendiert oder eingetaucht in ein beliebiges geeignetes
Medium, z. B. Wasser oder Puffer mit einer geringen Ionenstärke. In
Abhängigkeit von
dem Träger
und der Art der gewünschten
nachfolgenden Bearbeitung kann es wünschenswert sein oder nicht,
die Nukleinsäure
von dem Träger
abzulösen.
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Im
Fall eines partikulären
Trägermaterials,
wie etwa magnetische oder nicht magnetische Beads, kann dieses in
vielen Fällen
direkt verwendet werden, beispielsweise in einer PCR oder anderen
Amplifikationen, ohne die Nukleinsäure vom Träger zu eluieren. Auch für viele
Verfahren des Nachweises oder der Identifizierung von DNA ist eine
Elution nicht notwendig, da im Allgemeinen ausreichende Längen der
DNA vorliegen, welche für
die Hybridisierung an Oligonukleotide und für eine Amplifikation ausreichend
sind, obwohl die DNA mit der Oberfläche der Beads auf zufällige Art
und Weise in Kontakt ist und an einer Vielzahl von Punkten durch Wasserstoffbindung
oder ionische oder andere Kräfte
gebunden ist.
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Aber,
falls erwünscht,
kann die Elution der Nukleinsäure
leicht erreicht werden durch Verwendung bekannter Mittel, beispielsweise
durch Erhitzen, z. B. auf 65°C
für 5–10 min,
und danach kann der Träger
aus dem Medium entfernt werden, wobei die Nukleinsäure in Lösung bleibt.
Solch ein Erhitzen wird bei einer PCR automatisch durch den DNA-Denaturierungsschritt
erhalten, welcher dem Zyklusprogramm vorangeht.
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Falls
es erwünscht
ist, RNA von der DNA zu entfernen, kann dies erreicht werden durch
Zerstörung der
RNA vor dem DNA-Abtrennschritt, beispielsweise durch Zugabe einer
RNAse oder einer Lauge wie etwa NaOH.
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Wie
oben erwähnt,
kann das erfindungsgemäße Verfahren
alternativ verwendet werden, um nacheinander DNA und RNA aus der
Probe abzutrennen. Es kann auch verwendet werden, um in einem Verfahren
für die
RNA-Reinigung DNA aus einer Probe zu entfernen.
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Günstigerweise
kann die aufeinanderfolgende Abtrennung unter Verwendung von zwei
unterschiedlichen Festphasen stattfinden, beispielsweise Festphasen,
welche zwischen DNA und RNA unterscheiden können. Folglich kann solch ein
Verfahren die Durchführung
eine Abtrennung im ersten Schritt zur Isolierung von DNA wie oben
beschrieben umfassen. Dann kann eine weitere Festphase zu der Probe
zugegeben werden, um die in der Probe verbleibende RNA einzufangen,
entweder unter Verwendung einer Festphase, welche die RNA oder eine
beliebige Nukleinsäure
binden kann, oder einer Festphase, welche speziell RNA-Moleküle (z. B.
durch Tragen einer komplementären
Nukleinsäuresonde)
oder eine Unterart von RNA-Molekülen,
z. B. polyadenylierte RNA einfangen kann. Auf diese Art und Weise
ist es möglich,
DNA und RNA oder Unterarten von beiden aus der gleichen Probe schnell
zu isolieren und zu trennen. Dies kann nützlich sein, beispielsweise durch
Messung der isolierten DNA, um die Menge der Zellen abzuschätzen, welche
für eine
RNA-Extraktion verwendet werden, wodurch eine Referenz zwischen
unterschiedlichen Proben erhalten wird.
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Aber
das Verfahren der DNA-Isolierung der Erfindung kann auch leicht
als einleitender Schritt mit anderen konventionellen Verfahren der
RNA-Reinigung kombiniert werden, beispielsweise kann eine erfindungsgemäße DNA-Isolierung
mit einem Detergens vor einem selektiven RNA-Präzipitationsschritt, beispielsweise unter
Verwendung von LiCl oder vor einem RNA-Trennungsschritt unter Verwendung
von GTC und Sarkosyl durchgeführt
werden.
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In
einem repräsentativen
Verfahren wird die Probe in Gegenwart des Detergens lysiert und
die DNA kann an ein Trägermaterial
binden, wodurch die DNA durch Entfernen des Trägers leicht aus der Probe abgetrennt
werden kann. Falls erwünscht,
kann die DNA schnell und leicht weiter gehandhabt werden bei einer
Amplifikation oder anderen Verfahren stromabwärts. Dann kann die RNA isoliert
werden. Dies kann mit einem auf einer Festphase basierendem System
wie oben beschrieben, einschließlich
einer Wiederholung des erfindungsgemäßen Verfah rens, oder durch
konventionelle Verfahren wie etwa Extraktionen, Präzipitationen
oder Affinitätschromatographie
durchgeführt
werden.
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Eine
besonders vorteilhafte Ausführungsform
der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Isolierungsverfahrens,
um vor der Isolierung von RNA DNA aus einer Probe zu entfernen,
so dass die Viskosität
der lysierten Probe verringert wird und eine spezielle Isolierung
von RNA-Molekülen
begünstigt
wird, was wiederum die Möglichkeit
einer DNA-Kontamination der RNA verringert oder vermeidet. Solch
ein Verfahren weist auch den Vorteil auf, dass es schnell durchzuführen ist.
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Die
Erfindung ist vorteilhafterweise einer Automatisierung zugänglich,
insbesondere wenn Partikel und im Besonderen magnetische Partikel
als Träger
verwendet werden.
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Die
verschiedenen Reaktionspartner und Bestandteile, welche zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens
erforderlich sind, können
günstigerweise
in Form eines Kits bereitgestellt werden. Solche Kits stellen einen
weiteren Aspekt der Erfindung dar.
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Am
einfachsten stellt dieser Aspekt der Erfindung ein Kit zur Isolierung
von Nukleinsäure
aus einer Probe bereit, umfassend ein Trägermaterial und ein oder mehrere
Detergenzien.
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Gegebenenfalls
kann solch ein Kit Puffer, Salze, Mittel zur Lyse, beispielsweise
Proteinasen, Chelatbildner und Reduktionsmittel enthalten.
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Zur
Isolierung von RNA können
die Kits weiterhin Mittel zur Isolierung von RNA umfassen, z. B.
ein zweites Trägermaterial
zur Isolierung von RNA, beispielsweise einen Träger, bereitgestellt mit Sonden
zum Einfangen von RNA, z. B. Oligo-dT oder Sonden mit einer komplementären Sequenz
des gewünschten
Ziels, oder ein chaotropes oder selektiv präzipitierendes Mittel.
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Die
Erfindung wird nun ausführlicher
in den folgenden, nicht beschränkenden
Beispielen unter Bezugnahme auf die Abbildungen beschrieben, worin:
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1 ein
Scan der optischen Dichte von DNA ist, isoliert wie in Beispiel
1 beschrieben (die Ordinate zeigt die Extinktion (OD), die Abszisse
zeigt die Wellenlänge
(nm)). Maximale Extinktion (0,427) bei 257,6 nm; die minimale Extinktion
(0,292) bei 236,4 nm; bei einem Schwellenwert von 0,100;
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2 eine
Gelelektrophorese einer DNA-Probe zeigt, die wie in Beispiel 1 isoliert
wurde (Spur 1: Isolierung; Spur 2: λ Hind III (Molekulargewichtsmarker));
-
3 eine
Agarosegelelektrophorese des PCR-Produkts von Beispiel 2 zeigt (Spur
1: PCR-Produkt; Spur 2: λ Hind
III; Spur 3: negative PCR-Kontrolle); und
-
4 eine
Agarosegelelektrophorese des PCR-Produkts von Beispiel 5 zeigt (Spur
1: λ Hind
III; Spuren 2 und 3: Isolierungen A bzw. B; Spuren 4 und 5: Negativkontrolle;
Spur 6: λ Hind
III).
-
5 zeigt
den Vergleich zwischen traditionell isolierter DNA und DNA, welche
mit Dynabeads DNA DIRECT isoliert wurde. Das Feld 1 zeigt die Menge
der genomischen DNA, welche von 10 μl Gesamtblut mit Dynabeads DNA
DIRECT einschließlich
des optionalen Elutionsschritts (Spuren 1 und 2), mit Dynabeads
DNA DIRECT, wobei der Elutionsschritt ausgelassen wurde (Spuren
3 und 4) und mit einer traditionellen DNA-Isolierung (Spuren 5 und
6) isoliert wurde. Der Molekulargewichtsmarker in Spur 7 ist λ Hind III.
Das Feld II zeigt die Integrität
der DNA, die mit Dynabeads DNA DIRECT isoliert wurde. Die Spuren
1 und 2 zeigen eine AMXY-PCR von 20 ng DNA, die mit Dynabeads DNA
DIRECT von einem männlichen
bzw. weiblichen Spender isoliert wurde. Die Spuren 4 und 5 zeigen
eine AMXY-PCR von 200 ng DNA, die mit traditionellen Verfahren von
einem weiblichen bzw. einem männlichen
Spender isoliert wurde. Spur 3 ist die Negativkontrolle.
-
6 zeigt
die Reproduzierbarkeit von Dynabeads DNA DIRECT. Die Figur zeigt
fünf unabhängige Isolierungen
mit Dynabeads DNA DIRECT von jedem von zwei Spendern. Die Hälfte der
aus 10 μl
Blut erhaltenen DNA ist im oberen Teil der Figur gezeigt, 20% des
Produkts von PCR-Reaktionen, die mit 10% der isolierten DNA gestartet
wurden, wird im unteren Teil der Figur gezeigt. Die Molekulargewichtsmarker
sind λ Hind III
(die mit M bezeichnete Spur) oder eine 100 bp Leiter (die mit L
bezeichnete Spur).
-
7 zeigt
die Wirkung von verschiedenen Koagulantien. Die Figur zeigt Isolierungen
mit Dynabeads DNA DIRECT aus Gesamtblut, welches nicht antikoaguliert
wurde und aus Blut, welches mit EDTA, Citrat oder Heparin antikoaguliert
wurde. Die zwei Isolierungen aus Blut mit dem gleichen Antikoagulans
wurden mit Blut von unterschiedlichen Spendern (A oder B) durchgeführt. Ein
Viertel der aus 10 μl
Blut erhaltenen DNA ist im oberen Teil der Figur gezeigt, außer für Heparin,
wobei die Hälfte
der aus 5 μl
erhaltenen DNA gezeigt ist. 20% des Produkts von PCR-Reaktionen,
welche mit 10% der isolierten DNA gestartet wurden, ist im unteren
Teil der Figur gezeigt, außer
für Heparin,
wobei 20% der isolierten DNA als Ausgangsmaterial verwendet wurde.
-
8 zeigt
die Wirkung der Lagerungsbedingungen der Probe. Feld I zeigt Isolierungen
mit Dynabeads DNA DIRECT aus EDTA-Blut, welches frisch verwendet
worden ist, für
4 Tage im Kühlschrank
aufbewahrt wurde oder für
4 Tage eingefroren war. Die zwei Isolierungen aus Blut mit den gleichen
Lagerbedingungen wurden mit Blut von unterschiedlichen Spendern
durchgeführt.
Die Hälfte
der aus 10 μl
Blut erhaltenen DNA ist im oberen Teil der Figur gezeigt, 20% des
Produkts von PCR-Reaktionen, welche mit 10% der isolierten DNA gestartet
wurden, ist im unteren Teil der Figur gezeigt. Feld II zeigt Isolierungen
mit Dynabeads DNA DIRECT aus Citrat-Blut, welches frisch verwendet
worden ist oder luftgetrocknet und wieder hydratisiert wurde. Die
zwei Isolierungen von Blut mit den gleichen Lagerungsbedingungen
wurden mit Blut von unterschiedlichen Spendern durchgeführt. Die
Hälfte
der aus 10 μl
Blut erhaltenen DNA ist im oberen Teil der Figur gezeigt, 20% des
Produkts von PCR-Reaktionen, die mit 10% der isolierten DNA gestartet
wurden, ist im unteren Teil der Figur gezeigt.
-
9 zeigt
Dynabeads DNA DIRECT aus Knochenmark und Kulturzellen. Feld I zeigt
Isolierungen mit Dynabeads DNA DIRECT von 1, 2 und 5 μl Knochenmark
von jedem von zwei Spendern. A oder B über den Spuren bezeichnet die
Identität
des Spenders. Die Hälfte
der erhaltenen DNA ist im oberen Teil der Figur gezeigt, 20% des
Produkts der PCR-Reaktionen, die mit 10% der isolierten DNA gestartet
wurden, ist im unteren Teil der Figur gezeigt. Feld II zeigt zwei
Isolierungen mit Dynabeads DNA DIRECT von 4 × 105 Daudi-Zellen. Ein
Zehntel der erhaltenen DNA ist im oberen Teil der Figur gezeigt,
20% des Produkts von PCR-Reaktionen, die
mit 1 μl
von insgesamt 120 μl
isolierter DNA gestartet wurden, ist im unteren Teil der Figur gezeigt.
Der Molekulargewichtsmarker für
die genomische DNA ist λ Hind
III und eine für
die PCR-Produkte 100 bp-Leiter.
-
10 zeigt
Dynabeads DNA DIRECT aus mit Formalin fixiertem, in Paraffin eingebettetem
Material. Spur A zeigt 20% des PCR-Produkts aus einer Reaktion,
die mit DNA gestartet wurde, die mittels DNA DIRECT aus einem mit
Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Schnitt der Leber
isoliert wurde. Spur M ist ein Molekulargewichtsmarker (100 bp-Leiter),
Spur B ist eine Positivkontrolle (PCR aus 20 ng humaner DNA) und
Spur C ist eine Negativkontrolle (PCR aus Wasser).
-
11 zeigt
Dynabeads DNA DIRECT bei einer mRNA-Reinigung. mRNA wurde mit Dyanbeads
Oligo(dT)25 nach der Entfernung von DNA
mit Dynabeads DNA DIRECT aus 1 Million Daudi-Zellen pro Probe isoliert.
Es wurden steigende Mengen der DNA DIRECT Dyanbeads verwendet, um
die genomische DNA zu entfernen; 1 mg in Spur 1 und 2; 2 mg in Spur
3 und 4; 5 mg in Spur 5 und 6 und 10 mg in Spur 7 und B. Spur 9 und
10 sind Kontrollen, bei denen vor der direkten mRNA-Reinigung keine
DNA entfernt wurde. Die zusätzlichen
Banden im oberen Teil des Bildes zeigen kontaminierende genomische
DNA in den Spuren 9 und 10. Die zwei starken Banden in allen Spuren
stellen die ribosomale RNA dar.
-
12 zeigt
die Ergebnisse einer DNA-Isolierung und PCR-Amplifikation aus (A)
Bakterien, (B) Pilzen, (C) Algen und (D) Pflanzen. Bei allen Proben
wurde die DNA mit 200 μl
DNA DIRECT (1 Probentest) isoliert und 20% der isolierten DNA und
10% der PCR-Produkte wurden mittels Agaroseelektrophorese analysiert. Bei
den Bakterien wurden 2,5% der isolierten DNA pro PCR-Reaktion verwendet,
bei den anderen Proben wurden 5% verwendet. 16S rRNA-Regionen wurden
aus bakterieller genomischer DNA und aus Chloroplasten-DNA von Algen
amplifiziert. Aus der genomischen DNA von Pilzen und Algen wurde
18S rRNA amplifiziert. Eine Amplifikation der Gruppe I-Intron-Chloroplasten-trnL
und Teile des genomischen B15C-Gens sind bei Pflanzen gezeigt. Die
Negativkontrolle ist eine PCR von Proben, ohne dass DNA auf die
gleiche Art und Weise wie in den anderen Reaktionen präpariert
wurde.
-
Beispiel 1
-
DNA-Isolierung aus Zellkultur
-
4 × 106 HL60-Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen
und pelletiert. Das Pellet wurde in 10 μl PBS gelöst und es wurde 1 mg Dynabeads® M-280*
(erhältlich
durch Autoklavieren einer Suspension von Dynabeads® M-280,
tosylaktiviert (erhältlich
von Dynal A/S, Oslo, Norwegen) in Wasser), resuspendiert in 0,1
ml Lysepuffer [5% SDS/10 mM TrisCl pH 8,0/1 mM EDTA], zugegeben.
Danach folgte sofort die Zugabe von 1 ml Lysepuffer, und die Suspension
wurde für
5 min bei Raumtemperatur inkubiert, wonach die Dynabeads® mit gebundener
DNA von einem Magneten angezogen wurden und die flüssige Phase
entfernt wurde. Die feste Phase wurde dann zweimal mit 1 ml Waschpuffer
[50 mM NaCl/10 mM TrisCl pH 8,0/1 mM EDTA] gewaschen. Schließlich wurden
die Beads mit gebundener DNA in 0,1 ml Wasser resuspendiert und
für 5 min
bei 65°C
inkubiert. Die Beads wurden von einem Magneten angezogen und die
flüssige
Phase wurde entfernt. Die flüssige
Phase wurde dann im Hinblick auf den DNA-Gehalt untersucht. Die
Ergebnisse von einem Scan der optischen Dichte (1)
stimmen mit denen von reiner DNA überein. Das Verhältnis OD260/OD280 beträgt 1,75;
reine DNA in Wasser oder TE besitzt ein Verhältnis von 1,7 – 1,9. Bei
reiner DNA kann die Konzentration durch die OD260 der
Lösung
bestimmt werden. Eine Lösung
mit 50 μg/ml
besitzt eine OD260 = 1,0. Aus der Messung der
OD260 (Tabelle 1) von 0,436 (0,1 ml Gesamtvolumen,
10 mm Lichtweg), kann die Ausbeute als 2,18 μg DNA berechnet werden, 82%
der 2,67 μg,
was der geschätzte
DNA-Gehalt des Ausgangsmaterials war. Eine Gelelektrophorese einer
Probe der isolierten DNA (2) zeigt,
dass das meiste davon in einer Form mit hohem Molekulargewicht (> 20 kb) vorliegt.
-
Tabelle
1
Perkin Elmer Lambda Bio UV/Vis-Spektrometer
Anwendung
Nr. 3: Verhältnis
260/280 nm
-
Beispiel 2
-
Isolierung von DNA aus
Gesamtblut und enzymatische Anwendung ohne Elution
-
5 μl Gesamtblut
(EDTA-Blut) wurde in 50 μl
5% SDS lysiert und es wurden 50 μg
Dynabeads® M-280* in
5 μl PBS
zugegeben. Das Lysat wurde für
1 min bei Raumtemperatur inkubiert, ehe 0,5 ml TrisCl, pH 7,5 zugegeben
wurden. Das Lysat wurde dann weiterhin für 1 min bei Raumtemperatur
inkubiert, ehe die Beads mit gebundener DNA von einem Magneten angezogen
wurden und die flüssige
Phase entfernt wurde. Die Beads wurden dann einmal mit 0,5 ml 10
mM TrisCl, pH 7,5 gewaschen, ehe die Beads mit gebundener DNA in 40 μl TE (10
mM TrisCl, pH 8,0/1 mM EDTA) resuspendiert wurden. 4 μl der Isolierung
wurde als Ausgangsmaterial für
eine PCR (GAPDH-PCR wie in Beispiel 7 beschrieben) verwendet. Die
PCR-Reaktion ergab große Mengen
eines Produkts, wie durch eine Agarosegelelektrophorese sichtbar
gemacht wurde (3). 10 μl einer 50 μl-PCR-Reaktion wurde auf das
Gel geladen.
-
Beispiel 3
-
Beispiel
1 wurde wiederholt unter Verwendung der folgenden Kombination von
Lysepuffern und Waschpuffern, und es wurden die folgenden Ergebnisse
erhalten:
(wobei +++ eine sehr gute DNA-Isolierung anzeigt)
1 × TE ist
10 mM TrisCl, pH 8,0/1 mM EDTA, 10 × TE ist 100 mM TrisCl, pH
8,0/10 mM EDTA
-
Beispiel 4
-
Gemäß dem Verfahren
von Beispiel 1 können ähnliche
Ergebnisse erreicht werden unter Verwendung von Dynabeads® M-450,
unbeschichtet (Dynal A/S, Oslo, Norwegen).
-
Beispiel 5
-
Isolierung von DNA von
CD2-positiven Zellen, die aus Blut mit einer immunmagnetischen Trennung
erhalten werden
-
Dieses
Experiment bestand aus zwei identischen Isolierungen. 50 μl Blut wurde
mit 50 μl
PBS [150 mM NaCl/10 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,4] und
10 μl (4 × 106 Beads) Dynabeads® M-450 Pan-T (CD2) (erhältlich von
Dynal AS, Oslo, Norwegen) gemischt. Das Gemisch wurde dann für 30 min
bei Raumtemperatur mit sanftem Neigen und Rotation inkubiert. Der
Zell/Beads-Komplex wurde von einem Magneten angezogen und die Flüssigkeit
wurde entfernt. Der Zell/Beads-Komplex wurde dann 4× in 200 μl PBS gewaschen,
ehe 200 μg
Dynabeads® M-280*
(wie oben) und 200 μl
Lysepuffer [100 mM Tris-HCl, pH 8,0/500 mM LiCl/10 mM EDTA, pH 8,01/1%
LiDS] zugegeben wurden. Das Gemisch wurde für 5 min bei Raumtemperatur
inkubiert, ehe der DNA/Beads-Komplex von einem Magneten angezogen
wurde und der Überstand
entfernt wurde. Der DNA/Beads-Komplex wurde 2 × mit 200 μl Waschpuffer [10 mM Tris-HCl,
pH 8,0/150 mM LiCl/1 mM EDTA, pH 8,0] gewaschen und in 50 μl Wasser
resuspendiert. Nach 5 min bei 65°C
wurden die Beads von einem Magneten angezogen und der Überstand
wurde in ein neues Röhrchen übertragen.
5 μl des Überstands
wurden als Templat für
eine Polymerase-Kettenreaktion (GAPDH-PCR wie in Beispiel 7 beschrieben)
verwendet, was große Mengen
eines Produkts ergab, wie mittels Agarosegelelektrophorese sichtbar
gemacht wurde (4).
-
Beispiel 6
-
Vergleich von Ausbeute
und Integrität
zwischen DNA, die mit einem traditionellen Verfahren isoliert wurde
und DNA die durch das vorliegende Verfahren isoliert wurde
-
Bei
der Verwendung eines traditionellen Verfahrens, basierend auf einer
Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation,
wurde genomische DNA aus 5 ml antikoaguliertem EDTA-Blut isoliert.
Vier Isolierungen von 10 μl
der gleichen Blutprobe wurden unter Verwendung von Dynabeads DNA
DIRECT (Kit, kommerziell erhältlich
von Dynal AS, Oslo, Norwegen, enthaltend Beads, die mit den Dynabeads® M-Z80* wie
in Beispiel 1 beschrieben äquivalent
sind) durchgeführt.
Die DNA von zwei der Isolierungen wurde für 5 min bei 65°C eluiert, während die
DNA der anderen zwei Isolierungen in Gegenwart der Dynabeads belassen
wurde. Die gesamte DNA von den vier Isolierungen mit Dynabeads DNA
DIRECT wurde auf ein Agarosegel geladen, ebenso 0,2% der traditionell
isolierten DNA. Die Fraktion der geladenen, traditionell isolierten
DNA entspricht der Ausbeute von 10 μl Blut (0,2% von 5 ml).
-
Die
traditionelle DNA-Isolierung wurde durchgeführt gemäß dem Verfahren von John und
Mitarbeitern (John, S. W. M., G. Weitzner, R. Rosen und C. R. Scriver.
1991. "A Rapid Procedure
for Extracting Genomic DNA from Leukocytes". Nucl. Acid. Res. 19(2): 408).
-
Mit
Dynabeads DNA DIRECT wurde die Lyse des Bluts erreicht durch Mischen
von 200 μl
(1 Probentest) Dynabeads DNA DIRECT mit 10 μl des Bluts in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (200 μg unbeschichtete
Dynabeads in Lyse/Bindepuffer). Die Lysate wurden dann bei Raumtemperatur
für 5 min
auf der Werkbank gelassen, so dass die Adsorption der genomischen
DNA an die Dynabeads ermöglicht
wurde.
-
Der
DNA/Dynabeads-Komplex wurde von einem Magneten (Dynal's Magnetic Particle
Collector E (MPC-E)) angezogen, und das Lysat wurde abgesaugt und
verworfen.
-
Der
Komplex wurde dann zweimal in Waschpuffer (eines der Bestandteile
des Kits) gewaschen durch Anziehen des Komplexes an einen Dynal-MPC
und Verwerfen des Überstands.
Schließlich
wurde der Komplex in 10 μl
TE, pH 8,0 (bereitgestellt im Kit) resuspendiert.
-
Wenn
eine Elution durchgeführt
wurde, bestand sie aus Erhitzen der Suspension auf 65°C für 5 min und
dann Anziehen der Beads an einen Magneten. Die DNA-haltige, wässrige Phase
wurde dann entfernt und für
die Experimente verwendet.
-
Die
DNA wurde auf 1,5%-igen Agarosegeien, die mit Ethidiumbromid gefärbt wurden,
sichtbar gemacht. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und
die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid
667-Film dokumentiert.
-
Das
Ergebnis dieses Experiments ist in Feld I von 5 gezeigt.
Die Ausbeute pro μl
Blut ist bei den zwei Verfahren ähnlich
(Spuren 1–4
gegenüber
den Spuren 5–6),
und während
des Elutionsschritts wird sehr wenig DNA verloren (Spuren 1–2 gegenüber den
Spuren 3–4).
Das Molekulargewicht der DNA aus beiden Verfahren beträgt mehr
als 20 kb und sie läuft
langsamer als die 23,13 kb-Bande
des λ Hind
III-Molekulargewichtsmarkers.
-
DNA
DIRECT wurde verwendet, um DNA aus ACD-Blut von zwei unterschiedlichen
Spendern zu isolieren, einem männlichen
und einem weiblichen. Von jeder der Isolierungen wurden 10% als
Ausgangsmaterial für
eine PCR-Amplifikation eines Amplikons in dem X-Y-homologen Amelogenin
(AMXY)-Gen (Akane, A., K. Matsubara, H. Nakamura, S. Takahashi und
K. Kimura. 1994. "Purification
of Highly Degraded DNA by Gel Filtration for PCR". BioTechniques 16 (2): 235–238) verwendet,
ebenso wie 200 ng von jeder der zwei traditionellen DNA-Isolierungen.
-
Die
Isolierung mit DNA DIRECT und die traditionelle DNA-Isolierung wurden
wie im ersten Teil dieses Beispiels beschrieben durchgeführt.
-
Alle
PCR-Reaktionen wurden in einem 50 μl-Reaktionsvolumen durchgeführt, 10 × PCR-Puffer
(Perkin Elmer) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 × xugegeben,
dNTPs (Pharmacia) wurden bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM
zugegeben und pro Reaktion wurde 1 Unit Amplitaq (Perkin Elmer)
verwendet. Pro Reaktion wurden jeweils 5 pmol der Primer AMXY-1
F (5'-CTGATGGTTGGCCTCAAGCCT-GTG-3') und AMXY-4R (5'-TTCATTGTAAGAGCAAAGCAAACA-3') zugegeben. Die
PCR wurde in einem Perkin Elmer GeneAmp PCR-System 9600 durchgeführt. Die
PCR-Bedingungen für
das AMXY-Amplikon betrugen 4 min bei 94°C, 38 × [30 sek bei 94°C, 30 sek
bei 55°C,
1 min bei 72°CJ,
10 min bei 72°C.
-
10 μl der 50 μl-PCR-Reaktionen
wurden auf 1,5%-igen Agarosegelen, die mit Ethidiumbromid gefärbt wurden,
sichtbar gemacht. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und
die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid
667-Film dokumentiert.
-
Die
Ergebnisse dieses Experiments sind in Feld II der 5 gezeigt.
Das X-Y-homologe
Amelogeningen ist bekanntermaßen
empfindlich gegenüber
einem DNA-Abbau (Akane et al. 1994, siehe oben). Mit steigendem
Abbau wird das 908 bp lange X-Band zunehmend schwächer im
Vergleich zu dem 719 bp langen Y-Band.
Aus Feld II der 5 ist ersichtlich, dass die
relative Stärke
der X- und Y-Banden
vergleichbar ist für DNA,
die mit Dynabeads DNA DIRECT und dem traditionellen Verfahren isoliert
wurde, was darauf hindeutet, dass bei beiden Verfahren das Ausmaß des Abbaus
gleich ist. Die PCR-Reaktionen von traditionell isolierter DNA ergaben
etwas mehr Produkt als die Reaktionen aus DNA, die mit DNA DIRECT
isoliert wurde. Der Grund dafür
ist, dass zehnmal mehr Templat in den PCR-Reaktionen aus traditionell
isolierter DNA verwendet wurde als in den PCR-Reaktionen aus DNA,
die mit DNA DIRECT isoliert wurde.
Lyse/Bindepuffer:
0,5
M LiCl
1% LiDS
0,1 M TrisCl, pH 7,5
10 mM EDTA
5
mM Dithiothreitol (DTT)
Waschpuffer:
0,15 M LiCl
10
mM Tris-HCl, pH 8,0
1 mM EDTA
-
Beispiel 7
-
Fünf unabhängige DNA-Isolierungen
aus Blutproben von jedem von zwei Spendern
-
Für dieses
Experiment verwendeten wir das Dynabeads DNA DIRECT-Kit, welches
von Dynal AS, Oslo, Norwegen kommerziell erhältlich ist. Die Pufferzusammensetzungen
sind wie in Beispiel 6 beschrieben.
-
Es
wurden fünf
DNA-Isolierungen durchgeführt
von jeder von zwei mit Citrat behandelten Blutproben mit relativ
geringen Zahlen weißer
Blutzellen (Probe A: 3,6 × 106 Zellen/ml, Probe B: 2,6 × 106 Zellen/ml).
-
Die
Lyse des Bluts wurde erreicht durch Mischen von 200 μl (ein Probentest)
Dynabeads DNA DIRECT mit Blut in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
Dann wurden die Lysate bei Raumtemperatur für 5 min auf der Werkbank belassen,
um eine Adsorption der genomischen DNA an die Dynabeads zu ermöglichen.
-
Der
DNA/Dynabeads-Komplex wurde mit einem Magneten angezogen (Dynal's Magnetic Particle
Collector E (MPC-E)), und das Lysat wurde abgesaugt und verworfen.
-
Der
Komplex wurde dann zweimal in Waschpuffer (ein Bestandteil des Kits)
gewaschen durch Anziehen des Komplexes durch ein Dynal-MPC und Verwerfen
des Überstands.
Schließlich
wurde der Komplex in 40 μl
TE, pH 8,0 (im Kit bereitgestellt) resuspendiert. Diese Resuspension
wurde für
eine PCR und Gelelektrophorese ohne Elution verwendet.
-
Von
jeder Isolierung wurden 10% als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation
eines Amplikons im Glyerinaldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH)-Gen
verwendet. Alle PCR-Reaktionen wurden in einem 50 μl-Reaktionsvolumen
durchgeführt,
10 × PCR-Puffer
(Perkin Elmer) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 × zugegeben,
dNTPs (Pharmacia) wurden bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM
zugegeben und pro Reaktion wurde 1 Unit Amplitaq (Perkin Elmer)
verwendet. 5 pmol von jedem der Primer GAPDH-Forward (5'-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3') und GAPDH-Reverse (5'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3') wurden pro Reaktion
zugegeben. Die PCR wurde in einem Perkin Elmer GeneAmp PCR-System
9600 durchgeführt. Die
PCR-Bedingungen für
das GAPDH-Amplikon waren 4 min bei 94°C, 34 × [30 sek bei 94°C, 30 sek
bei 61°C,
1 min bei 72°C],
10 min bei 72°C.
-
Sowohl
genomische DNA als auch PCR-Produkte wurden auf mit Ethidiumbromid
gefärbten 1,5%-igen
Agarosegelen sichtbar gemacht. 10 μl der 50 μl-Reaktion wurden auf ein Agarosegel
geladen, ebenso 50% der isolierten genomischen DNA. Die Elektrophorese
wurde in 1 × TAE-Puffer
durchgeführt
und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem
Polaroid 667-Film dokumentiert.
-
Die
Ergebnisse aus diesem Experiment sind in 6 gezeigt.
Zwischen den unterschiedlichen Isolierungen kann keine signifikante
Abweichung beobachtet werden. Ähnliche
Ergebnisse wurden mit anderen Koagulantien ebenso wie von Spendern
mit höheren
Zahlen weißer
Blutzellen erhalten.
-
Beispiel 8
-
DNA-Isolierung aus Blut
mit unterschiedlichen Antikoagulantien
-
Dynabeads
DNA DIRECT (Kit, kommerziell erhältlich
von Dynal AS, Oslo, Norwegen) wurde verwendet, um DNA aus unbehandeltem
Gesamblut ebenso wie aus Blut zu isolieren, welches mit EDTA, Citrat
oder Heparin antikoaguliert wurde. Von jeder Art des Ausgangsmaterials
wurden zwei getrennte Isolierungen mit Blut von unterschiedlichen
Spendern durchgeführt.
Die Pufferbestandteile im Kit sind wie in Beispiel 6 beschrieben.
-
Die
Lyse der DNA-haltigen Zellen aus Blut wurde erreicht durch Mischen
von 200 μl
(1 Probentest) Dynabeads DNA DIRECT mit 5 μl Heparinblut oder 10 μl der anderen
Blutproben in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Dann wurden die Lysate
bei Raumtemperatur für
5 min auf der Werkbank gelassen, um eine Adsorption der genomischen
DNA an die Dynabeads zu ermöglichen.
-
Der
DNA-Dynabead-Komplex wurde durch einen Magneten (Dynal's Magnetic Particle
Collector E (MPC-E)) angezogen und das Lysat wurde abgesaugt und
verworfen.
-
Dann
wurde der Komplex zweimal in Waschpuffer (ein Bestandteil des Kits)
gewaschen durch Anziehen des Komplexes durch einen Dynal-MPC und
Verwerfen des Überstands.
Schließlich
wurde der Komplex in 20 bis 40 μl
TE, pH 8,0 resuspendiert (bereitgestellt im Kit). Wir verwendeten
als Standardvolumen 40 μl, wenn
das Ausgangsmaterial Heparinblut war jedoch 20 μl.
-
Von
jeder Isolierung wurden 10% (20% der Heparinproben) als Ausgangsmaterial
für eine
PCR-Amplifikation eines Amplikons im Glyerinaldehydphosphatdehydrogenase
(GAPDH)-Gen verwendet. Die PCR wurde direkt mit der Suspension in
TE durchgeführt,
wobei die Dynabeads vorlagen. Alle PCR-Reaktionen wurden in einem
50 μl-Reaktionsvolumen
durchgeführt,
10 × PCR-Puffer
(Perkin Elimer) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 × zugegeben,
dNTPs (Pharmacia) wurden bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mM
zugegeben und es wurde pro Reaktion 1 Unit Amplitaq (Perkin Elmer)
verwendet. Von jedem der Primer GAPDH-Forward (5'-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3') und GAPDH-Reverse (5'-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3') wurden pro Reaktion
5 pmol zugegeben. Die PCR wurde in einem Perkin Elmer GeneAmp PCR-System
9600 durchgeführt.
Die PCR-Bedingungen für
das GAPDH-Amplikon waren 4 min bei 94°C, 34 × [30 sek bei 94°C, 30 sek
bei 61 °C,
1 min bei 72°C],
10 min bei 72°C.
-
10 μl der 50 μl-Reaktion
wurden auf ein Agarosegel geladen, ebenso 25% (50% der Heparinproben) der
isolierten genomischen DNA. Sowohl genomische DNA als auch PCR-Produkte
wurden auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegelen
sichtbar gemacht. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und
die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid
667-Film dokumentiert.
-
Die
Ergebnisse dieses Experiments sind in 7 gezeigt.
Da die Isolierungen von heparinisierten Proben nur aus 5 μl Blut durchgeführt wurden,
ist die Verwendung von 20% der DNA aus diesen Isolierungen als Ausgangsmaterial
für die
PCR vergleichbar mit der Verwendung von 10% der anderen Isolierungen,
welche jeweils von 10 μl
Blut durchgeführt
wurden. Wenn dies in Betracht gezogen wird, ist ersichtlich, dass
die Art des verwendeten Antikoagulans das Ergebnis nicht signifikant
beeinflusst.
-
In
dem soeben beschriebenen Experiment wurde Lithiumheparin verwendet.
In diesem System werden mit Lithium- und Natriumheparin ähnliche
Ergebnisse erhalten, obwohl gezeigt wurde, dass Lithiumheparin in
anderen Systemen inhibitorische Wirkungen besitzt (Panaccio, M.,
M. Georgesz und A. M. Lew. 1993. „FoLT PCR: A Simple PCR Protocol
for Amplifying DNA Directly from Whole Blood". BioTechniques 14(3): 238–243). DNA
DIRECT funktioniert ebenso gut bei Blut, welches mit ACD (Feld II
der 5) oder mit CPD (Daten nicht gezeigt) antikoaguliert
wird.
-
Beispiel 9
-
Isolierung von DNA aus
Blutproben die unter verschiedenen Bedingungen gelagert wurden
-
Dynabeads
DNA DIRECT (Kit, kommerziell erhältlich
von Dynal AS, Oslo, Norwegen) wurde verwendet, um DNA aus EDTA-Blut
von zwei verschiedenen Spendern zu isolieren. Das restliche Blut
der Blutproben wurde dann in zwei Teile geteilt, ein Teil wurde
bei +4°C
gelagert und ein Teil wurde bei –20°C gelagert. Nach 4 Tagen wurden
die eingefrorenen Proben aufgetaut und die DNA wurde sowohl von
den gefrorenen Proben als auch den Proben isoliert, die bei +4°C gehalten
wurden. Die Pufferkomponenten des Kits sind wie in Beispiel 6 beschrieben.
-
Die
Lyse des Bluts wurde erreicht durch Mischen von 200 μl (ein Probentest)
von Dynabeads DNA DIRECT mit Blut in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
Die Lysate wurden dann bei Raumtemperatur 5 min auf der Werkbank
belassen, um eine Adsorption genomischen DNA an die Dynabeads zu
ermöglichen.
-
Der
DNA/Dynabeads-Komplex wurde von einem Magneten (Dynal's Magnetic Particle
Collector E (MPC-E)) angezogen und das Lysat wurde abgesaugt und
verworfen.
-
Der
Komplex wurde dann zweimal in Waschpuffer (ein Bestandteil des Kits)
gewaschen durch Anziehen des Komplexes mit einem Dynal-MPC und Verwerfen
des Überstands.
Schließlich
wurde der Komplex in 40 μl
TE, pH 8,0 resuspendiert (bereitgestellt im Kit). Sowohl eine PCR
als auch eine Agarosegelelektrophorese wurde direkt mit der Suspension
in TE durchgeführt,
wobei die Dynabeads vorhanden waren.
-
Von
jeder der 6 Isolierungen (frisch, im Kühlschrank gelagert und eingefroren)
wurden 10% als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation des
GAPDH-Amplikons
verwendet, wie in Beispiel 8 beschrieben. Sowohl genomische DNA
als auch PCR-Produkte wurden auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen
Agarosegelen sichtbar gemacht. 10 μl der 50 μl-Reaktion wurden auf das Gel
geladen, ebenso 50% der isolierten genomischen DNA. Die Elektrophorese
wurde in 1 × TAE-Puffer
durchgeführt
und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film
dokumentiert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Feld I von 8 gezeigt.
In diesem System wurde kein abträglicher
Effekt der viertägigen
Lagerung bei +4 oder –20°C beobachtet.
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Unter
Verwendung von Dynabeads DNA DIRECT wie früher in diesem Beispiel beschrieben,
wurde DNA aus zwei mit Citrat behandelten Blutproben isoliert und
von den zwei Proben wurden 10 μl
auf eine Plastikoberfläche
aufgetropft und bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Die getrockneten
Bluttropfen wurden in 1,5 ml-Röhrchen übertragen,
40 μl PBS
wurde zugegeben und die Röhrchen
wurden mit sanfter Bewegung für
90 min bei Raumtemperatur belassen, ehe DNA mit Dynabeads DNA DIRECT
isoliert wurde. Von jeder der 4 Isolierungen (frisch und getrocknet)
wurden 10% als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation des GAPDH-Amplikons
wie in Beispiel 8 beschrieben verwendet. Sowohl genomische DNA als
auch PCR-Produkte wurden auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen
Agarosegelen sichtbar gemacht. 10 μl der 50 μl-Reaktion wurden auf das Gel
geladen, ebenso 50% der isolierten genomischen DNA. Die Elektrophrose
wurde in 1 × TAE-Puffer
durchgeführt,
und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid 667-Film
dokumentiert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Feld II
von 8 gezeigt. Die Ausbeute von getrocknetem Blut
ist gut und die isolierte DNA ist für eine PCR geeignet.
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Beispiel 10
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DNA-Isolierung
aus Knochenmark und Kulturzellen
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DNA-Isolierungen aus Knochenmark
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1,
2 und 5 μl
heparinisiertes Knochenmark von jedem von zwei gesunden Spendern
wurden als Ausgangsmaterial für
die DNA-Isolierung mit DNA DIRECT verwendet. Die Pufferbestandteile
sind wie in Beispiel 6 beschrieben. Die Lyse des Knochenmarks wurde
erreicht durch Mischen von 200 μl
(ein Probentest) Dynabeads DNA DIRECT mit 1–5 μl heparinisiertem Knochenmark
in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Die Lysate wurden dann
bei Raumtemperatur für
5 min auf der Werkbank belassen, um eine Adsorption der genomischen
DNA an die Dynabeads zu ermöglichen.
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Der
DNA/Dynabeads-Komplex wurde von einem Magneten (Dynal's Magnetic Particle
Collector E (MPC-E)) angezogen und das Lysat wurde abgesaugt und
verworfen.
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Der
Komplex wurde dann zweimal in Waschpuffer (ein Bestandteil des Kits)
gewaschen durch Anziehen des Komplexes mit einem Dynal-MPC und Verwerfen
des Überstands.
Schließlich
wurde der Komplex in 40 μl
TE, pH 8,0 resuspendiert (bereitgestellt im Kit). Sowohl eine PCR
als auch eine Agarosegelelektrophorese wurde direkt mit der Suspension
in TE durchgeführt,
wobei die Dynabeads vorhanden waren.
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Von
jeder der 6 Isolierungen wurden 10% als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation des GAPDH-Amplikons
verwendet, wie in Beispiel 8 beschrieben.
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Sowohl
genomische DNA als auch PCR-Produkte wurden auf mit Ethidiumbromid
gefärbten 1,5%-igen
Agarosegelen sichtbar gemacht. 10 μl der 50 μl-Reaktion wurden auf das Agarosegel geladen, ebenso
50% der isolierten genomischen DNA. Die Elektrophorese wurde in
1 × TAE-Puffer
durchgeführt
und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem
Polaroid 667-Film
dokumentiert.
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Die
Ergebnisse dieses Experiments sind in Feld I der 9 gezeigt.
Aus Feld I der 9 ist ersichtlich, dass die
Ausbeute pro Volumen Ausgangsmaterial aus Knochenmark höher ist
als aus Blut (5–8). Dies
ist erwartungsgemäß, da die
Konzentration an DNA-haltigen Zellen im Knochenmark viel höher ist
als in Blut. 5 μl
Knochenmark ist nahe der oberen Grenze dessen, was durch einen Probentest
DNA DIRECT handhabbar ist. Ein gutes Verhältnis zwischen Probengröße und DNA-Ausbeute
wird im Intervall von 1–5 μl Probengröße beobachtet, aber
sogar die Ausbeute von 1 μl
ist ausreichend für
mindestens 10 PCR-Reaktionen.
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DNA-Isolierung aus kultivierten
Zellen
-
Zwei
Proben von 4 × 105 Daudi-Zellen wurden als Ausgangsmaterial
für die
DNA-Isolierung mit DNA DIRECT verwendet. Die DNA-Isolierung aus
4 × 105 kultivierten Zellen (Zelllinie Daudi) wurde
wie oben beschrieben durchgeführt,
außer
dass 1 ml (fünf
Probentests) Dynabeads DNA DIRECT verwendet wurde. Entsprechend
wurden die Waschschritte in 1 ml Waschpuffer durchgeführt. Der
DNA/Dynabeads-Komplex wurde in 120 μl TE resuspendiert und es wurde
wie beim Knochenmark kein Elutionsschritt nach der Resuspension durchgeführt.
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Von
jeder der Isolierungen wurde 1 μl
von insgesamt 120 μl
als Ausgangsmaterial für
eine PCR-Amplifikation des GAPDH-Amplikons verwendet, wie in Beispiel
8 beschrieben.
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Sowohl
genomische DNA als auch PCR-Produkte wurden auf mit Ethidiumbromid
gefärbten 1,5%-igen
Agarosegelen sichtbar gemacht. 10 μl der 50 μl-Reaktion wurden auf das Agarosegel geladen, ebenso
10% der isolierten genomischen DNA. Die Elektrophorese wurde in
1 × TAE-Puffer
durchgeführt
und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem
Polaroid 667-Film
dokumentiert.
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Die
Ergebnisse dieses Experiments sind in Feld II der 9 gezeigt,
welche zeigt, dass mindestens 120 PCR-Reaktionen aus einer Isolierung
dieses Maßstabs
durchgeführt
werden können.
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Beispiel 11
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Isolierung von DNA aus
einem mit Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Schnitt
der Leber
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Dynabeads
DNA DIRECT (Kit, kommerziell erhältlich
von Dynal AS, Oslo, Norwegen) wurde verwendet, um DNA aus einem
mit Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten Leberschnitt zu
isolieren. Die Pufferbestandteile des Kits und die Beadkonzentration
sind wie in Beispiel 6 beschrieben.
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Überschüssiges Paraffin
wurde von den Rändern
der Probe mit einer Skalpellklinge entfernt. Die Lyse der Probe
wurde erreicht durch Zugabe von 200 μl (ein Probentest) Dynabeads
DNA DIRECT zu der Probe in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
Die Lysate wurden dann bei Raumtemperatur für 5 min auf der Werkbank belassen,
um die Adsorption der genomischen DNA an die Dynabeads zu ermöglichen.
Das Lysat, welches DNA und Dynabeads enthielt, wurde in ein frisches
Röhrchen übertragen,
wobei Zelltrümmer
und Paraffin zurückgelassen
wurden.
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Der
DNA/Dynabeads-Komplex wurde durch einen Magneten (Dynal's Magnetic Particle
Collector E (MPC-E)) angezogen und das Lysat wurde abgesaugt und
verworfen.
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Der
Komplex wurde dann zweimal in Waschpuffer (ein Kitbestandteil) durch
Anziehen des Komplexes an ein Dynal-MPC und Verwerfen des Überstands
gewaschen. Schließlich
wurde der Komplex in 10 μl
sterilem Wasser resuspendiert. Diese Suspension mit den Dynabeads
darin wurde als Ausgangsmaterial für eine PCR-Amplifikation des
GAPDH-Amplikons verwendet, wie in Beispiel 8 beschrieben. Das PCR-Produkt
wurde auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegel
sichtbar gemacht. 10 μl
der 50 μl-Reaktion
wurden auf das Gel geladen. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer
durchgeführt
und die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem
Polaroid 667-Film dokumentiert. Das Ergebnis dieses Experiments ist
in 10 gezeigt. Aus dem mit Formalin fixierten, in
Paraffin eingebetteten Leberschnitt ist klar PCR-amplifizierbares Material erhalten worden.
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Beispiel 12
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Entfernung von genomischer
DNA mit DNA DIRECT vor einer mRNA-Isolierung
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mRNA
wurde aus 1 Million Daudi-Zellen pro Probe isoliert. Die Zellen
wurden in 0,75 ml Lyse/Bindepuffer lysiert, wobei DNA DIRECT Dynabeads
in dem Puffer vorlagen. Die Proben wurden für 5 min inkubiert und die DNA/Dynabeads-Komplexe wurden gesammelt
durch Anwenden eines Dynal-MPC-E-Magneten für 2 min. Um die genomische
DNA zu entfernen, wurden verschiedene Mengen DNA DIRECT-Beads verwendet; 1,
2, 5 und 10 mg pro Probe (11).
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Das
Lysat von jeder Probe wurde gemäß dem Standardverfahren
(Dynal's mRNA DIRECT
Kit-Protokoll) in neue Röhrchen
mit 1 mg Dynabeads Oligo(dT)25 übertragen.
Die Dynabeads wurden mit dem Lysat gemischt, um die polyadenylierte
mRNA durch Hybridisierung für
5 min bei Raumtemperatur einzufangen. Die mRNA-Dynabead-Komplexe
wurden mit dem MPC-E-Magneten gesammelt durch Platzieren der Röhrchen in dem
Magnetgestell für
2 min. Die Lösung
wurde entfernt und verworfen. Eine Waschlösung mit LiDS (0,75 ml) wurde
zugegeben und die Beads wurden sorgfältig durch Auf- und Abpipettieren
gewaschen. Die mRNA-Dynabead-Komplexe wurden mit dem Magneten gesammelt
und die Waschprozedur wurde einmal mit Waschpuffer mit LiDS und
zweimal mit Waschpuffer ohne Detergens wiederholt. Schließlich wurde
die gereinigte mRNA durch Inkubation bei 65°C für 2 min von den Dynabeads in
20 μl 5
mM Tris-HCl, pH 7,5-Puffer eluiert. Die Eluate wurden durch eine
nicht denaturierende Gelelektrophorese in einem 1,0%-igen Agarosegel
mit Ethidiumbromid analysiert. 11 die
Ergebnisse aus diesem Experiment.
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Die
EtBr-Färbung
zeigt sowohl doppelsträngige
DNA als auch rRNA aufgrund der Sekundärstruktur. Die zwei Banden
mit ribosomaler DNA sind in allen Spuren klar sichtbar. In Spur
9–10 in 11 ist
etwas genomische DNA als Kontamination nach dem mRNA-Reinigungsverfahren
vorhanden. In dem empfohlenen mRNA-Verfahren von Dynal ist ein DNA-Scherungsschritt
nach der Zelllyse eingefügt,
um die Möglichkeit
einer DNA-Kontamination zu verringern. Durch Verwendung der DNA-Entfernung
mit DNA DIRECT Beads ist dieser Scherungschritt nicht notwendig.
Lyse/Bindepuffer:
0,5
M LiCl
1% LiDS
0,1 M TrisCl, pH 7,5
10 mM EDTA
5
mM Dithiothreitol (DTT)
Waschpuffer mit LiDS:
0,15 M LiCl
0,1%
LiDS
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
1 mM EDTA
Waschpuffer:
0,15
M LiCl
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
1 mM EDTA
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Beispiel 13
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Allgemeines Verfahren
zur DNA-Isolierung: PCR-Ready-DNA von Bakterien, Pilzen Algen Pflanzen
und Vertebraten
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E.
coli und Bacillus cereus wurden über
Nacht bei 37°C
in LB-Medium angezogen, Agrobacterium tumefaciens wurde über Nacht
in YEB-Medium für
etwa 40 h bei 28°C
angezogen (Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbour Laboratory, NY.). Cyanobakterien
und Prochlorthrix wurden in NIVA-Medium für 14 Tage bei 18°C angezogen
unter Verwendung einer Beleuchtung von 20 Mikro-Einstein (Norwegian
Institute of Water Research, 1991, „Culture collection of algae"). 20–200 Millionen
Bakterien oder 450 000 Cyanobakterien wurden pro DNA-Isolierung
verwendet.
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Für das Myzelwachstum
wurden Agarplatten mit 2% Malzextrakt verwendet und für 14 Tage
bei Raumtemperatur inkubiert. Myzelien wurden durch Abkratzen der
Fläche
der Agarplatten mit einem Spatel isoliert. Die Fruchtkörper der
Pilze wurden von natürlichen
Populationen erhalten. Pro DNA-Isolierung wurden im Bereich von
1–3 mg
luftgetrocknete und 3–20
mg frische Fruchtkörper
der Pilze verwendet.
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Die
Bäckerhefe
Saccharomyces cerevisiae wurde von einem kommerziellen Anbieter
erhalten. Die Algen wurden unter Beleuchtung in IMR-Medium für 7 Tage
kultiviert (Eppley, R et al., 1967, Exp. Mar. Biol. Ecol. 1, 191–208). Frische
Blätter
von Arabidopsis thaliana und Gerste (Hordeum vulgare) wurden von
jungen Pflanzen (3 Wochen alt) gepflückt. Epithelien wurden von
Flossen von Barschen (Perca fluvatilis) erhalten. Etwa 1 mg Feuchtgewicht
Hefe, 30–100
mg junge Pflanzenblätter
und 100–400
mg Barsch wurden pro DNA-Isolierung verwendet.
-
Mehrzellige
Gewebe mit festen Zellwänden
wurden mechanisch zerbrochen, um die DNA-Ausbeute zu erhöhen. Die
Fruchtkörper
von Pilzen wurden mit Zangen für
etwa 2 min zerkleinert. Pflanzenblätter wurden für 2 min
in flüssigem
Stickstoff mit einem Pistill (Kontes Scientific Instruments, Vineland,
New Jersey, USA) homogenisiert. Für alle anderen Proben war für das Brechen
der Zellen keine mechanische Arbeit erforderlich.
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DNA-Isolierung
-
Die
DNA-Isolierungen wurden unter Verwendung von Dynabeads DNA DIRECT
(Kit, kommerziell erhältlich
von Dynal AS, Oslo, Norwegen) durchgeführt. Die Lyse der Zellen und
Organismen wurde erreicht durch Mischen von 200 μl Dynabeads DNA DIRECT (200 μg unbeschichtete
Dynabeads in Lyse/Bindepuffer) mit der Probe in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
Dann wurden die Lysate für
5–15 min
bei Raumtemperatur auf der Werkbank belassen, um eine Adsorption
der genomischen DNA an die Dynabeads zu ermöglichen. Bei einigen Bakterien
und bei Pflanzen wurde eine Inkubation bei 65°C für 15 min verwendet, um die Lyse
vor dem Adsorptionsschritt zu verbessern.
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Der
DNA/Dynabeads-Komplex wurde von einem Magneten (Dynal's Magnetic Particle
Collector E (MPC-E)) angezogen, und das Lysat wurde abgesaugt und
verworfen.
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Dann
wurde der Komplex zweimal in Waschpuffer (ein Kitbestandteil) gewaschen
durch Anziehen des Komplexes an einen Dynal-MPC und Verwerfen des Überstands.
Schließlich
wurde der Komplex in 40 μl
TE, pH 8,0 (im Kit bereitgestellt) durch heftiges Pipettieren resuspendiert.
Die Elution wurde durchgeführt
durch Erhitzen der Suspension auf 65°C für 5 min und dann Anziehen der
Beads mit einem Magneten. Die DNA-haltige wässrige Phase wurde dann entfernt
und für
die Experimente verwendet.
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Die
DNA wurde auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegelen
sichtbar gemacht. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und die
Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid
667-Film dokumentiert.
Lyse/Bindepuffer:
0,5
M LiCl
1% LiDS
0,1 M TrisCL, pH 7,5
10 mM EDTA
5
mM Dithiothreitol (DTT)
Waschpuffer:
0,15 M LiCl
10
mM Tris-HCl, pH 8,0
1 mm EDTA
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Für eine Bewertung
der Ausbeute mit dem DNA DIRECT-Isolierungsprotokoll wurden Standardverfahren,
die auf Phenol/Chloroform basieren, verwendet. Algen-, Vertebraten-
und Bakrterien-DNA wurde mit dem vom Sambrook, J. et al., 1989,
siehe oben, beschriebenen Protokoll isoliert. Die Cyanobakterien
wurden mit Tonerde Typ A-5 (Sigma Chemicals Co., St. Louis, USA)
vor der Isolierung homogenisiert, um eine vollständige Lyse sicherzustellen.
Pflanzen- und Pilz-DNA wurde mit dem von Scott, O. R. und Bendich,
A. J., 1994, in "Plant
Molecular Biology Manual",
Seite D1: 1–8,
Kluwer Academic Publisher, Belgien, beschriebenen Protokoll isoliert.
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PCR-Amplifikationen
-
Für jeden
Probentyp wurde die Reproduzierbarkeit getestet durch Verwendung
getrennter DNA-Isolierungen, DNA-Verdünnungsreihen und mehreren PCR-Assays. Die DNA-Isolierungsreagenzien
und PCR-Reagenzien wurden in jedem einzelnen Experiment im Hinblick
auf die Abwesenheit einer Kontamination kontrolliert. Alle PCR-Reaktionen
wurden in einem 50 μl-Reaktionsvolumen
durchgeführt,
enthaltend: 15 pmol Primer, 20 μmol
dNTP, 10 mM Tris-HCl, pH 8,8, 1,5 mM MgCl2,
50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 1 Unit thermostabile DynaZyme Polymerase
(Finnzymes Oy, Finnland) und 0,1–5 μl isolierte DNA. Die PCR wurde
in einem Perkin Elmer GeneAmp PCR-System 9600 durchgeführt.
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Amplikons und Oligonukleotidprimer
-
Alle
PCR-Reaktionen wurden mit einem DNA-Denaturierungsschritt bei 94–97°C für 3–5 min begonnen
und endeten mit einem Extensionsschritt bei 72°C für 5 min.
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Bakterien und Algen
-
Das
Amplikon war eine 16S rRNA-Region, welche den Basen 334 bis 939
von E. coli entsprach, gemäß der IUD-Nummerierung
von Bakterien und Algenchloroplasten (Brosius, J., et al., 1978,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 57, 4801–4805). Primer: CC 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC-3' CG: 5'-CTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC-3' Der Primer CC besitzt
am 5'-Ende eine
komplementäre
Sequenz zum -21 M13-Universalprimer,
wodurch er für
eine direkte DNA-Sequenzierung geeignet ist. Amplifikation: 30 Zyklen
von 96°C
für 15
sek und 70°C
für 2 min.
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Algen:
Es wurde mit den Primern A und B, die von Medlin et al., 1990, Gene,
71, 491–499
beschrieben werden, eine 18S rRNA-Region amplifiziert.
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Amplifikation:
35 Zyklen von 94°C
für 30
sek, 50°C
für 1 min
und 72°C
für 1 min.
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Pilze:
Es wurde eine 18S rRNA-Region (ca. 600 bp) mit den Primern NS3 und
NS4 amplifiziert, wie von White et al., 1990 in "PCR Products, a Guide to Methods and
Applications", von
Innis, M. A. et al., Seite 315–322,
Academic Press, New York, beschrieben.
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Amplifikation:
5 Zyklen von 94°C
für 30
sek, 53°C
für 30
sek und 72°C
für 1 min,
gefolgt von 25 Zyklen von 94°C
für 30
sek, 50°C
für 30
sek ansteigend mit 15 sek bei jedem Zyklus, und 72°C für 1 min.
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Pflanzen:
Es wurde mit den Primern C und D, die von Fangan et al., 1994 in
BioTechniques 16, 484–494
beschrieben werden, das tRNL-Gruppe I-Intron in Chloroplasten amplifiziert.
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Amplifikation:
30 Zyklen von 94°C
für 30
sek, 55°C
für 30
sek und 72°C
für 1 min.
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Es
wurde ein Teil des Arabidopsis thaliana-Gens B15C (800 bp) amplifiziert
mit den Primern: 5'-CGGGATCCCTAGGAGACACGGTGCCG-3' und 5'-GGAATTCGATCGGCGGTCTTGAAAC-3' Amplifikation: 35
Zyklen von 94°C
für 30
sek, 59°C
für 30
sek und 72°C
für 1 min.
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Ein
Teil des Gerstengens B15C (800 bp) wurde amplifiziert mit den Primern
5'-CGGATCCCGTCATCCTCTTCTCGCACCCC-3' und 5'-GGAATTCCCTTCTTGGAGGGCAGGTCGGCG-3'.
-
Amplifikation:
35 Zyklen von 94°C
für 30
sek, 60°C
für 30
sek und 72°C
für 1 min.
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Barsch:
Es wurde ein Mitochondrien-D-Loop-Fragment (800–900 bp) amplifiziert mit den
Primern HV2, beschrieben von Hoelzel et al., 1991, Mol. Biol. Evol.,
8, 475–493,
und dem Primer 5'-GGTGACTTGCATGTGTAAGTTCA-3'.
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Amplifikation:
30 Zyklen von 96°C
für 1 min,
52°C für 2 min
und 72°C
für 2 min.
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Die
amplifizierten Fragmente wurden auf mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%-igen Agarosegelen
sichtbar gemacht. Die Elektrophorese wurde in 1 × TAE-Puffer durchgeführt und
die Ergebnisse wurden mit einer DS34-Polaroidkamera und einem Polaroid
667-Film dokumentiert.
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Die
Ergebnisse der Experimente sind in 12 und
Tabelle 2 gezeigt.
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Bakterien:
Das Standardprotokoll ergab für
die untersuchten Bakterien DNA-Ausbeuten
im Bereich von 100–1000
ng (12A). Für einige Cyanobakterien ergab
sich eine wesentliche Steigerung der DNA-Ausbeute (von 500 ng bis
mehr als 1 mg) durch Verbesserung der Lyse mit einem zusätzlichen
anfänglichen
Inkubationsschritt bei 65°C
für 15
min. In allen Fällen
wurden bei Verwendung von 0,25% der isolierten DNA gute Amplifikationen
erhalten.
-
Pilze:
Die höchste
DNA-Ausbeute wurde von den getrockneten Fruchtkörpern (300–500 ng) erhalten, verglichen
mit frischen Fruchtkörpern
(100–200
ng) ( 12B). Die Myzelien ergaben eine
geringere DNA-Gewinnung, wahrscheinlich aufgrund ihrer geringen
Anzahl pro Zellen pro Probe. Aber in den meisten Fällen waren
5% der isolierten DNA ausreichend, um schöne PCR-Produkte zu ergeben (Tabelle
2, 12B). Bei den Fruchtkörpern wurden
0,5–5%
der DNA für
jede PCR venrwendet.
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Algen:
Alle untersuchten Algen ergaben bei Verwendung des Standardprotokolls
und einem DNA DIRECT-Probentest (Tabelle 2, 12C)
eine DNA-Ausbeute im Bereich von 200–400 ng. Schöne PCR-Ergebnisse
wurden bei Verwendung von 5% der isolierten DNA pro PCR-Reaktion
sowohl bei einer Amplifikation von genomischer DNA als auch von
Chloroplasten-DNA erhalten.
-
Pflanzen:
Um eine gute DNA-Ausbeute von Pflanzenblättern zu erhalten, war eine
Homogenisierung in flüssigem
Stickstoff notwendig. Ein zusätzlicher
anfänglicher
Inkubationsschritt bei 65°C
für 15
min verbesserte ebenso die Ergebnisse ( 12D).
Schöne
PCR-Ergebnisse wurden sowohl bei der Amplifikation von genomischer
DNA als auch von Chloroplasten-DNA erhalten, wenn 5% der isolierten
DNA pro PCR-Reaktion verwendet wurden.
-
Fische:
Aus Fischepithel wurde unter Verwendung des Standardprotokolls und
einem Probentest routinemäßig eine
DNA-Ausbeute von 300–500
ng erhalten (Tabelle 2). Mitochondriale DNA wurde schön amplifiziert
bei Verwendung von 5% der isolierten DNA.
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Die
PCR-Produkte von allen untersuchten Spezies konnten leicht durch
eine Festphasensequenzierung (Hultman et al., 1989, Nucleic Acids
Res., 17, 4937–4946)
direkt sequenziert werden.
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Tabelle
2: DNA-Isolierung und PCR-Amplifikation aus verschiedenen Organismen