DE69532855T2

DE69532855T2 - Lichtwellenleiter-verfahren zur detektion spezifischer bindungsreaktionen nach der streulichtmethode

Info

Publication number: DE69532855T2
Application number: DE69532855T
Authority: DE
Inventors: I. Donald STIMPSON; Julian Gordon; V. Joanell HOIJER
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1994-09-22
Filing date: 1995-09-20
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2015-09-21
Also published as: ATE498123T1; EP0783683B1; US5599668A; WO1996009532A1; EP1441217A3; US5843651A; JP3608665B2; JPH10506190A; ES2221930T3; EP1441217B1; ATE263967T1; DE69532855D1; EP1441217A2; DE69536137D1; AU3636295A; ES2358508T3; CA2197321A1; EP0783683A1; CA2197321C

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft mehrere Gebiete, insbesondere Bindungspartner-Wechselwirkungen, abklingende Wellenleiter und Lichtstreuung. Ausdrücklicher betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren von einem oder mehreren spezifischen Bindungsanalyten, insbesondere DNA oder Oligonukleotide, durch Lichtstreuungsverfahren, wobei die Streuung verursacht wird durch einen partikulären Marker, der durch spezifische Bindungskräfte innerhalb der Eindringtiefe der abklingenden Welle eines Wellenleiters gehalten wird.
Hintergrund der Erfindung
Totale innere Reflexion ("TIR") ist auf dem Gebiet bekannt und wird beschreiben mit Bezug auf 1. TIR arbeitet nach dem Prinzip, dass Licht 10, das in einem dichteren Medium 12 (d.h. das einen höheren Brechungsindex N₁ aufweist) wandert und das auf die Grenzfläche 14 zwischen dem dichteren Medium und einem dünneren Medium 16 (d. h. mit dem niedrigeren Brechungsindex N₂) auftrifft, innerhalb des dichteren Mediums 12 total reflektiert wird, wenn es auf die Grenzfläche in einem Winkel θ_R größer als dem kritischen Winkel θ_C auftrifft, wobei der kritische Winkel definiert ist durch die Gleichung: θC = arcsin (N2/N1) Unter diesen Bedingungen wird eine elektromagnetische Wellenform erzeugt, die als "abklingende Welle" bekannt ist. Wie in Fig. 1B gezeigt bildet das elektrische Feld, das mit dem Licht in dem dichteren Medium verbunden ist, eine stehende sinusförmige Welle 18 senkrecht zu der Grenzfläche. Die abklingende Welle dringt in das dünnere Medium 16 ein, aber ihre Energie E zerstreut sich exponentiell als eine Funktion des Abstandes Z von der Grenzfläche, wie unter 20 gezeigt. Ein Parameter, der als "Eindringtiefe" (d_p, gezeigt in Fig. 1A unter 22) bekannt ist, ist definiert als der Abstand von der Grenzfläche, bei welchem die abklingende Wellenenergie auf das 0,368-fache des Energiewertes an der Grenzfläche abgefallen ist. [Siehe Sutherland, et al., J. Immunol. Meth., 74:253-265 (1984), wo d_p definiert ist als die Tiefe, bei der E=(e^–1) E₀.] Die Eindringtiefe berechnet sich folgendermaßen:
Faktoren, die dazu neigen, die Eindringtiefe zu erhöhen, sind: zunehmender Einfallswinkel θ_R; nahe beieinanderliegende Brechungsindizes der beiden Medien (d.h. N₂/N₁->1); und zunehmende Wellenlänge λ. Wenn zum Beispiel ein Quarz-TIR-Element (N₁=1,46) in ein wässeriges Medium (N₂=1,34) gelegt wird, ist der kritische Winkel θ_C 66° (=arcsin 0, 9178) . Wenn Licht von 500 nm auf die Grenzfläche unter θ_R 70° auftrifft (d.h. größer als der kritische Winkel), ist die Tiefe d_p ungefähr 270 nm.
Innerhalb der Eindringtiefe kann die abklingende Welle in dem dünneren Medium (typischerweise eine Reaktionslösung) Fluoreszenz in der Probe anregen. Dieses Phänomen ist auf dem Gebiet verwendet worden mit Bezug auf Immunoassays. Harrick et al., Anal. Chem., 45:687 (1973). Vorrichtungen und Verfahren, die TIR-Fluoreszenz für Immunoassays verwenden, sind auf dem Gebiet beschrieben worden durch Hirschfield, US-Patente 4.447.564, 4.577.109 und 4.654.532; Hirschfield und Block, US- Patente Nr. 4.716.121 und 4.582.809 und US-Serial-Nr. 07/863,553, veröffentlicht als WO 93/20240 (Abbott Labs), welche hier alle durch Literaturverweis mit aufgenommen sind. Ein immunospezifisches Mittel wird an die Oberfläche des Elementes angeheftet und mit fluoreszierend markierten spezifischen Bindungspartnern in dem dünneren Medium reagieren gelassen. Die spezifische Bindung führt dazu, dass die fluoreszierenden Marker innerhalb der Eindringtiefe gebunden werden. Die emittierte Fluoreszenz (bei der verschobenen Wellenlänge) treibt zurück in das TIR-Element, breitet sich innerhalb des TIR-Elementes entlang des gleichen Wegs aus wie die stehende sinusförmige Welle (aber bei einer unterschiedlichen Wellenlänge) und wird als die Ausgabe des Elementes detektiert.
TIR wurde auch in Zusammenhang mit Lichtstreuungsdetektion in einer Technik verwendet, die als Scattered Total Internal Reflectance ("STIR", gestreutes totales inneres Reflexionsvermögen) ) bezeichnet wird. Siehe z.B. US-Patente 4.979.821 und 5.017.009 für Schutt, et al., und WO 94/00763 (Akzo N. V.). Gemäß dieser Technik wird ein Lichtstrahl über die Oberfläche eines TIR-Elementes hinweg unter einem geeigneten Winkel abgetastet, und die Lichtenergie wird bis auf die abklingende Welle vollständig reflektiert. Partikel wie rote Blutzellen, kolloidales Gold oder Latex, die innerhalb der Eindringtiefe spezifisch gebunden sind, werden das Licht streuen, und das gestreute Licht wird durch ein Photodetektionsmittel detektiert. WO 94/00763 beschreibt auch Abtasten des Lichtstrahls über mehrere Orte von spezifischen Bindungsgliedern hinweg, welche entweder (1) das gleiche Bindungsglied bei unterschiedlicher Konzentration sind, um einen breiteren Dynamikbereich zu erzielen, oder (2) unterschiedliche Bindungsglieder, um auf unterschiedliche Analyte in einem Multiplex-Format zu prüfen. Abtasten des Lichtstrahls über vielfache Stellen hinweg und Sammeln des gestreuten Lichts an jeder einzelnen Stelle ist ein sehr zeitaufwendiges Verfahren.
In US-Patent 4.608.344 für Carter et al. wird ein Lichtwellenleiter als das TIR-Element eingesetzt. In einer Variation sind vielfache Bindungsstellen auf dem Wellenleiter in speziellen Linien oder Rastern angeordnet, um ein Beugungsgittermuster von Streulicht zu erzeugen. Dadurch dass dann nur nach bestimmten Ordnungen von Streulicht geschaut wird, minimieren diese Verfahren die Streuung, die durch Oberflächenunvollkommenheiten und/oder Verunreinigungen wie Staubpartikel verursacht wird (siehe Fig. 14 und Spalten 17–19).
Die praktische Verwendung der Carter- und STIR-Vorrichtungen ist streng begrenzt durch die ernsthafte Hintergrundstreuung von Partikeln in Lösung. Dieser Hintergrund begrenzt die Sensitivität der Detektion von gebundenen Partikeln, die mit Analyt assoziiert sind. Die geringe Leistung wurde kompensiert durch anspruchsvolle Elektronik und Optik, die die kleine Menge von Signal über den hohen Hintergrundpegeln unterscheiden konnte. Die Elektronik- und Optikkomplexität führt zu sehr teuren Systemen.
Zuletzt lehrt US-Patent 5.192.502 für Attridge et al. eine Vorrichtung, die parallele Platten umfasst, die einen Hohlraum bilden zur Aufnahme eines Probenfluids. Eine Platte dient als ein Wellenleiter und die andere ist mit einer Schicht aus einem lichtabsorbierenden Material überzogen.
Ein anderer interessanter allgemeiner Stand der Technik schließt die Offenbarung von Drmanac et al., US-Patent 5.202.231 ein, welche ein neues Verfahren zur Erzeugung von Nukleinsäuresequenzinformationen beschreibt, das als Sequenzieren durch Hybridisierung (SBH) bekannt ist. Gemäß diesem Verfahren wird eine feste Phase, die daran gebunden eine Anordnung von Oligonukleotiden von bekannter Sequenz enthält, mit markierter DNA aus einer Probe hybridisieren gelassen. Folglich ermöglicht ein einziges Hybridisierungsexperiment die Untersuchung von einer großen Zahl von unterschiedlichen Stellen auf einem DNA-Molekül. Die Diagnose von mehreren humanen genetischen Erkrankungen wie Duchenne-Muskeldystrophie oder zystische Fibrose wird wahrscheinlich die Auflösungsleistung eines Systems vom SBH-Typ erfordern, um die Mutation, die mit dem Krankheitszustand assoziiert ist, auf eine genaue und kostenwirksame Art zu bestimmen. Eine besondere Implementierung des SBH-Verfahrens nutzt eine große Zahl von Oligonukleotiden, die in einer hochdichten zweidimensionalen Anordnung immobilisiert sind. Eine solche Vorrichtung ist ein "DNA-Chip" genannt worden analog zu den hochdichten Schaltungen, die von der Elektronikbranche produziert werden. Eine Probe von unbekannter DNA wird auf den Chip aufgebracht und das Muster der Hybridisierung bestimmt und analysiert, um Sequenzinformationen zu erhalten. WO 92/10588 und WO 92/10092 (Affymax Technologies N.V.) enthalten ähnliche Offenbarungen sowie ein photolithographisches Verfahren zur Herstellung solcher Chips.
Da die Stringenzbedingungen die Hybridisierung beeinträchtigen, kann eine feine Differenzierung und Spezifität erhalten werden, wenn die Stringenz genau kontrolliert werden kann. Somit könnten die Schmelzkurven eine zusätzliche Dimension für das DNA-Chipsystem bereitstellen und eine bessere Differenzierung von nah verwandten Sequenzen ermöglichen, ein Interesse an der Implementierung der SBH-Technologie. Die Fähigkeit, die Temperatur zu ändern und in Echtzeit die Chiphybridisierungsmuster zu überwachen, wäre von großer Nützlichkeit, besonders wo es eine breite Variation des GC-Gehaltes gibt. Livshits et al., J. Biomol. Struct. & Dynamics, 11:783–795 (1994) beschreiben ein DNA-Sequenzierungsverfahren, wo eine Unterscheidung von perfekten und unvollständigen Hybridisierungen in einem System von auf Gel immobilisierter DNA unter Verwendung von radioaktiven oder fluoreszierenden Markern möglich war. Das Gel wurde einminütigen Waschungen alle 5°C unterzogen, um Marker zu entfernen, der mit unvollständig hybridisierter DNA assoziiert war. Die Autoren beanspruchen, dass das Gel vorteilhaft wäre wegen einer höheren Kapazität zur Immobilisierung und höheren Unterscheidungsleistung als andere Oberflächen. Jedoch erlegt die Notwendigkeit, überschüssigen Marker von der Oberfläche zu waschen, sowie die relativ lange Zeit zum Abtasten der gesamten Oberfläche, um eine Messung zu erhalten, merkliche Beschränkungen auf. Wenn zum Beispiel eine Minute erforderlich ist, um eine vollständige DNA-Chipanordnung zu lesen, und eine einminütige Waschung bei jeder inkrementellen Temperatur notwendig ist, dann würde eine Hochauflösungs-Schmelzkurve (z.B. alle 1°C) von 30 bis 70°C eine Stunde benötigen., Die Temperatur müsste bei jeder inkrementellen Temperatur eine Minute lang konstant gehalten werden, bis alle Flecken auf dem Chip gemessen sind.
Ebenfalls von Interesse ist die Offenbarung der sich im Miteigentum befindlichen, mitanhängigen US-Anmeldung Serial-Nr. 08/140.383, eingereicht am 21. Oktober 1993 und mit dem Titel APPARATUS AND METHOD FOR DETECTING A TARGET LIGAND, deren technischen Bestandteile hierin durch Literaturverweis eingegliedert sind. Diese Anmeldung beschreibt die Verwendung einer Charge-coupled device(ladungsgekoppelten Vorrichtung)-"CCD"-Kamera und Bildbearbeitungssoftware, um spezifische Bindungszielliganden abzubilden und zu detektieren, die an räumlich getrennten, vielfachen Orten auf einer einzigen festen Phase angeordnet sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Herausforderung, der das Humane Genom-Projekt beim vollständigen Sequenzieren des menschlichen Genoms gegenübersteht, ist, die Geschwindigkeit der Erfassung von DNA-Sequenzdaten um zwei Größenordnungen zu erhöhen. Die vorliegende Anmeldung beschreibt als eine bevorzugte Ausführungsform ein Detektionsverfahren, das einen zweidimensionalen Lichtwellenleiter verwendet, welcher Messung von Echtzeitbindung oder -schmelzen eines Licht-streuenden Markers an vielfachen Einfangstellen auf einem Träger, der eine DNA-Anordnung umfasst, ermöglicht. Das erlaubt die Sammlung von Hybridisierungsdaten genauso schnell, wie es Bildaufzeichnung erlaubt. Die Verfahren beruhen auf der Streuung der abklingenden Welle, wodurch nur Marker, der innerhalb der Eindringtiefe eingesperrt ist, ein Signal erzeugt. Eine Abbildung des Streulichts ermöglicht die Abfrage der gesamten Anordnung gleichzeitig. Die Hybridisierungsspezifität ist äquivalent zu der, die mit einem herkömmlichen System und Autoradiographie erhalten wird. Schmelzkurven sind konsistent mit Flüssigphasen-Schmelzkurven für die gleichen Sequenzkombinationen, und so kleine Differenzen wie ein einzelnes Basenpaar sind leicht unterscheidbar.
Grenzwertverdünnung etabliert die Detektion von Zielen bei so kleinen Konzentrationen wie etwa 0,4 nM, was vergleichbar ist mit den besten derzeitigen Fluoreszenz-basierten Systemen. Es wird erwartet, dass diese Methodologie ein leistungsfähiges Werkzeug zur schnellen, kostenwirksamen Detektion von Sequenzvariationen bereitstellen wird.
Somit ist die vorliegenden Erfindung, in einem Aspekt, ein Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit oder Menge von einem oder mehreren spezifischen Bindungsanalyten in einer Fluid-Probe, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) Bereitstellen einer Wellenleiter-Vorrichtung, wobei die Wellenleiter-Vorrichtung folgendes umfasst: (i) ein transparentes Element, das einen Brechungsindex größer als den der Fluid-Probe hat; (ii) einen Licht-empfangenden Rand; und (iii) eine reaktive Oberfläche, die ein erstes spezifisches Bindungsglied von mindestens einem verwandten Bindungspaar umfasst, das an einer Vielzahl von Stellen auf der Oberfläche des Elementes immobilisiert ist, wobei andere nicht-Situs-Abschnitte der reaktiven Oberfläche kein spezifisches Bindungsglied daran immobilisiert haben; worin das erste spezifische Bindungsglied, durch intermediäre verwandte Bindungspaare wenn gewünscht, in der Lage ist, zumindest einen Analyten spezifisch zu binden;
(b) in Kontakt bringen der reaktiven Oberfläche mit einer Probe, von der vermutet wird, dass sie den einen oder mehrere Analyten enthält, und mit einem Licht-streuenden Marker, der an ein spezifisches Bindungsglied eines zweiten verwandten Bindungspaares angeheftet ist, das, durch intermediäre verwandte Bindungspaare wenn gewünscht, in der Lage ist, diesen einen oder mehrere Analyten spezifisch zu binden in dem Fall eines Sandwich-Assays, oder das immobilisierte erste spezifische Bindungsglied des ersten verwandten Bindungspaares in dem Fall eines kompetitiven Assays; wobei Licht-streuende Marker-Komplexe gebildet werden, die an die Vielzahl von Stellen angeheftet sind, im Verhältnis zu der Menge an Analyt in der Probe;
(c) Beleuchten des Licht-empfangenden Randes des Wellenleiters mit Licht, das wirksam ist, um eine totale innere Reflexion innerhalb des Wellenleiters zu erzeugen, wodurch gleichzeitig im Wesentlichen die gesamte reaktive Oberfläche beleuchtet wird;
(d) im Wesentlichen gleichzeitiges Sammeln von Streulicht, wenn es welches gibt, von jeder Stelle und von nicht-Situs-Abschnitten der Oberfläche;
(e) Vergleichen des Grades an Lichtstreuung an jeder Stelle mit entweder (i) dem Grad an Lichtstreuung an einem nicht-Situs-Abschnitt, oder (ii) dem Grad an Lichtstreuung an einer anderen Stelle, oder beidem, wodurch die Lichtstreuung an jeder Stelle mit der Anwesenheit oder Menge des Analyten korreliert, für welchen das immobilisierte spezifische Bindungsglied an der Stelle spezifisch ist.

Gemäß dem obigen Verfahren gibt es vielfache Stellen auf einem einzelnen Wellenleiter; der Wellenleiter wird auf einmal vollständig beleuchtet und Streuung von allen Stellen unverzüglich gesammelt, entweder durch Photodetektoren oder visuell.
Unter einem separaten Gesichtspunkt ist die Erfindung ein Verfahren zum visuellen Detektieren der Anwesenheit oder ungefähren Menge von mindestens einem spezifischen Bindungsanalyten in einer Fluid-Probe, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) Bereitstellen einer Wellenleiter-Vorrichtung, wobei die Wellenleiter-Vorrichtung folgendes umfasst: (i) ein transparentes Element, das einen Brechungsindex größer als den der Fluid-Probe hat; (ii) einen Licht-empfangenden Rand; und (iii) eine reaktive Oberfläche, die ein erstes spezifisches Bindungsglied von mindestens einem verwandten Bindungspaar umfasst, das an mindestens einer Teststelle auf der Oberfläche des Elementes immobilisiert ist, wobei andere nicht-Situs-Abschnitte der reaktiven Oberfläche kein spezifisches Bindungsglied daran immobilisiert haben; worin das erste spezifische Bindungsglied, durch intermediäre verwandte Bindungspaare wenn gewünscht, in der Lage ist, zumindest einen Analyten spezifisch zu binden;
(b) in Kontakt bringen der reaktiven Oberfläche mit einer Probe, von der vermutet wird, dass sie den Analyten enthält, und mit einem Licht-streuenden Marker, der an ein erstes spezifisches Bindungsglied eines zweiten verwandten Bindungspaares angeheftet ist, das, durch intermediäre verwandte Bindungspaare wenn gewünscht, in der Lage ist, diesen Analyten spezifisch zu binden in dem Fall eines Sandwich-Assays, oder das immobilisierte erste spezifische Bindungsglied in dem Fall eines kompetitiven Assays; wobei Licht-streuende Marker-Komplexe gebildet werden, die an der Stelle angeheftet sind, im Verhältnis zu der Menge an Analyt in der Probe;
(c) Beleuchten des Licht-empfangenden Randes des Wellenleiters mit Licht, das wirksam ist, um eine totale innere Reflexion innerhalb des Wellenleiters zu erzeugen;
(d) visuelles Untersuchen der reaktiven Oberfläche auf Lichtstreuung und Vergleichen des Grades an Lichtstreuung an der Teststelle mit entweder (i) dem Grad an Lichtstreuung an einem nicht-Situs-Abschnitt, oder (ii) dem Grad an Lichtstreuung an einer anderen Stelle, oder beidem, wobei die Lichtstreuung an der Stelle mit der Anwesenheit oder Menge des Analyten korreliert.

Dieses Verfahren ist nicht beschränkt auf vielfache Stellen, erfordert aber visuelle Detektion.
Ein anderer Gegenstand, ebenfalls nicht beschränkt auf vielfache Stellen, ist eine Bestimmung der Streuung unter Verwendung eines Geschwindigkeits-Ausleseverfahrens. Somit umfasst unter diesem Gesichtspunkt die Erfindung folgendes:

(a) Bereitstellen einer Wellenleiter-Vorrichtung, wobei die Wellenleiter-Vorrichtung folgendes umfasst: (i) ein transparentes Element, das einen Brechungsindex größer als den der Fluid-Probe hat; (ii) einen Licht-empfangenden Rand; und (iii) eine reaktive Oberfläche, die ein erstes spezifisches Bindungsglied von mindestens einem verwandten Bindungspaar umfasst, das an einer Stelle auf der Oberfläche des Elementes immobilisiert ist, wobei andere nicht-Situs-Abschnitte der reaktiven Oberfläche kein spezifisches Bindungsglied daran immobilisiert haben; worin das erste spezifische Bindungsglied, durch intermediäre verwandte Bindungspaare wenn gewünscht, in der Lage ist, zumindest einen Analyten spezifisch zu binden;
(b) in Kontakt bringen der reaktiven Oberfläche mit einer Probe, von der vermutet wird, dass sie den Analyten enthält, und mit einem Licht-streuenden Marker, der an ein spezifisches Bindungsglied eines zweiten verwandten Bindungspaares angeheftet ist, das, durch intermediäre verwandte Bindungspaare wenn gewünscht, in der Lage ist, diesen Analyten spezifisch zu binden in dem Fall eines Sandwich-Assays, oder das immobilisierte erste spezifische Bindungsglied in dem Fall eines kompetitiven Assays; wobei Licht-streuende Marker-Komplexe gebildet werden, die an der Stelle angeheftet sind, im Verhältnis zu der Menge an Analyt in der Probe;
(c) Beleuchten des Licht-empfangenden Randes des Wellenleiters mit Licht, das wirksam ist, um eine totale innere Reflexion innerhalb des Wellenleiters zu erzeugen, wodurch gleichzeitig im Wesentlichen die gesamte reaktive Oberfläche beleuchtet wird;
(d) im Wesentlichen gleichzeitiges Sammeln von Streulicht, wenn es welches gibt, von dieser Stelle und von nicht-Situs-Abschnitten der Oberfläche zu einem ersten Zeitpunkt t₁ unter Verwendung einer Photodetektor-Vorrichtung;
(e) Wiederholen der Schritte (c) und (d) mindestens einmal, um gestreutes Licht zu sammeln, wenn es welches gibt, von dieser Stelle und von nicht-Situs-Abschnitten zu einem zweiten Zeitpunkt t₂; und
(f) Vergleichen des Grades an Lichtstreuung an dieser Stelle zum Zeitpunkt t₁ mit dem Grad an Lichtstreuung an dieser Stelle zum Zeitpunkt t₂, wobei die Lichtstreuung an der Stelle mit der Anwesenheit oder Menge des spezifischen Analyten korreliert, und die Differenz über der Zeit in der Streuung von Licht eine kinetische Information liefert, die die Menge von Analyt anzeigt, der an dieser Stelle vorhanden ist.

Dieser Gesichtspunkt kann auf einzelne oder vielfache Stellen angewendet werden, aber es ist unwahrscheinlich, dass visuelle Detektion möglich ist, da feine Variationen im Signal über der Zeit vorkommen können. Zeitlich abgestimmte Auslesungen können fortlaufend oder diskret vorgenommen werden. Bei fortlaufendem Auslesen können anfängliche Geschwindigkeiten aus der anfänglichen Steigung des Zeitverlaufs bestimmt werden.
Eine besonders nützliche Anwendung für die Erfindung liegt in Echtzeit-Oligonukleotid-Schmelzstudien. Entsprechend betrifft unter einem anderen Gesichtspunkt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines Segments einer unbekannten Nukleinsäure oder zur Unterscheidung zweier nah verwandter Nukleotidsequenzen, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) Bereitstellen einer Wellenleiter-Vorrichtung, wobei die Wellenleiter-Vorrichtung folgendes umfasst: (i) ein transparentes Element, das einen Brechungsindex größer als den der Fluid-Probe hat; (ii) einen Licht-empfangenden Rand; und (iii) eine reaktive Oberfläche, die eine Vielzahl von Stellen umfasst, an denen Oligonukleotide immobilisiert sind, wobei diese Stellen eine Anordnung von Oligonukleotiden definieren mit unterschiedlichen Sequenzen zum Hybridisieren mit der unbekannten Nukleinsäure, wobei andere nicht-Situs-Abschnitte der Oberfläche von diesem Element kein spezifisches Bindungsglied daran immobilisiert haben;
(b) in Kontakt bringen der reaktiven Oberfläche unter hybridisierenden Bedingungen mit der unbekannten Nukleinsäure, worin die unbekannte Nukleinsäure, entweder direkt oder durch intermediäre verwandte Bindungspaare wenn gewünscht, markiert ist mit einem Licht-streuenden Marker; wodurch Licht-streuende Marker-Komplexe gebildet werden, die an jene Stellen der reaktiven Oberfläche angeheftet sind, welche komplementär sind zu der Sequenz der unbekannten Nukleinsäure;
(c) Beleuchten des Licht-empfangenden Randes des Wellenleiters mit Licht, das wirksam ist, um eine totale innere Reflexion innerhalb des Wellenleiters zu erzeugen, wodurch gleichzeitig im Wesentlichen die gesamte reaktive Oberfläche beleuchtet wird;
(d) im Wesentlichen gleichzeitiges Sammeln von Streulicht, wenn es welches gibt, von jeder Stelle und von nicht-Situs-Abschnitten der Oberfläche;
(e) Vergleichen des Grades an Lichtstreuung an jeder Stelle mit entweder (i) dem Grad an Lichtstreuung an einem nicht-Situs-Abschnitt; oder (ii) dem Grad an Lichtstreuung an einer anderen Stelle; und
(f) weiterhin die inkrementelle Erhöhung der stringenten Bedingungen an der reaktiven Oberfläche der Wellenleiter-Vorrichtung umfasst, um die Dissoziation von gebundener Nukleinsäure von den Stellen einzuleiten, und Wiederholen der Schritte (d) und (e) bei jedem Inkrement; wodurch einzelne Basenpaar-Unterschiede zwischen den Oligonukleotiden und der unbekannten Nukleinsäure von perfekten Übereinstimmungen unterschieden werden können durch Unterschiede in den Dissoziationseigenschaften.

Zuletzt betrifft unter einem Gesichtpunkt, der nicht beschränkt ist auf zweidimensionale Wellenleiter oder gar auf gleichzeitige Beleuchtung, die Erfindung auch ein verbessertes Verfahren zur Lichtstreuung, welches reduzierte Hintergrundsignale ergibt. Somit ist die Erfindung auch ein Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit oder Menge eines spezifischen Bindungsanalyten in einer Fluid-Probe, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) Bereitstellen einer TIR-Vorrichtung, wobei die Vorrichtung folgendes umfasst: (i) ein transparentes TIR-Element, das einen Brechungsindex größer als den der Fluid-Probe hat; (ii) einen Licht-empfangenden Rand; und (iii) eine reaktive Oberfläche, die ein erstes spezifisches Bindungsglied von mindestens einem verwandten Bindungspaar umfasst, das an mindestens einer Stelle auf der Oberfläche des Elementes immobilisiert ist, wobei andere nicht-Situs-Abschnitte der reaktiven Oberfläche kein spezifisches Bindungsglied daran immobilisiert haben; worin das erste spezifische Bindungsglied, durch intermediäre verwandte Bindungspaare wenn gewünscht, in der Lage ist, diesen Analyten spezifisch zu binden;
(b) in Kontakt bringen der reaktiven Oberfläche mit (i) der Probe, von der vermutet wird, dass sie den Analyten enthält; (ii) einem Licht-streuenden Marker, der an ein erstes spezifisches Bindungsglied eines zweiten verwandten Bindungspaares angeheftet ist, das, durch intermediäre verwandte Bindungspaare wenn gewünscht, in der Lage ist, diesen Analyten spezifisch zu binden in dem Fall eines Sandwich-Assays, oder das immobilisierte erste spezifische Bindungsglied in dem Fall eines kompetitiven Assays, wodurch Licht-streuende Marker-Komplexe gebildet werden, die an der Stelle angeheftet sind, im Verhältnis zu der Menge an Analyt in der Probe; und (iii) einer Lösung eines Licht-absorbierenden Glieds, das ausreichend ist, um eine wirksame O.D. von mindestens 15 zu gewährleisten;
(c) Beleuchten des Licht-empfangenden Randes des TIR-Elementes mit Licht, das wirksam ist, um eine totale innere Reflexion innerhalb des Elementes zu erzeugen;
(d) Detektieren des Streulichts und Vergleichen des Grads von Streulicht an der Stelle mit dem Grad von Lichtstreuung an einem nicht-Situs-Abschnitt, wodurch Hintergrundstreuung durch Absorption durch das Licht-absorbierende Material minimiert wird.

Unter allen obigen Gesichtspunkten kann der spezifische Bindungsanalyt ein Oligonukleotid oder eine Nukleinsäure sein. Es kann unter den meisten Gesichtspunkten auch ein Antigen oder Antikörper sein. Obwohl alle Gesichtspunkte vorzugsweise vielfache Stellen haben, benötigen das bestimmte Gesichtspunkte nicht. Die Anzahl der "vielfachen" oder "Vielzahl von" Stellen kann so klein wie zwei und so groß wie mehrere Tausend sein.
Unter jedem der obigen Gesichtspunkte kann das Wellenleiter-Element eine ebene Oberfläche wie eine Glasplatte umfassen. Unter jedem Gesichtspunkt ist es möglich, eine zweite Platte bereitzustellen, welche an dem Element befestigt ist, um einen kapillaren Kanal dazwischen zu bilden. Die Reaktionsfläche sollte in den Kanal hinein zeigen, so dass der Kanal als ein Reaktionsgefäß verwendet werden kann, um Reagenzien über die reaktive Oberfläche fließen zu lassen. Außerdem ist unter jedem Gesichtspunkt bevorzugt, die Oberfläche mit einem metalöslichen Protein wie Casein zu beschichten. Diese Beschichtung dient dazu, unspezifische Bindungsstellen zu blockieren und den Fluss von Flüssigkeiten über die Oberfläche zu erleichtern.
Der Licht-streuende Marker (light scattering label, LSL) kann in allen Fällen kolloidale Partikel sein wie kolloidales Gold oder Selen oder winzige Latex-Partikel. Es ist außerdem in allen Ausführungsformen möglich, ein Licht-absorbierendes Material (LAM) in der Lösung auf der Reaktionsfläche zu verwenden. Das hat den Vorteil, Hintergrundstreuung sehr nah an ihrer Quelle zu reduzieren. Das LAM erhöht den O.D.-Wert der Lösung auf mindestens 15 und liefert einen dunklen Hintergrund, gegen welchen sich Streuung an den Stellen als ein heller Bereich zeigt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht die Prinzipien der totalen inneren Reflexion ("TIR"), wie sie auf dem Gebiet bekannt ist, und ist ausführlicher in dem Abschnitt Hintergrund der Erfindung beschrieben. Links zeigt 1 die Reflexion von Licht an einer Grenzfläche und rechts eine Auftragung der Energie des elektrischen Feldes E als eine Funktion des Abstands Z von der Grenzfläche.
2A, 2B und 2C sind jeweils perspektivische seitliche und Querschnittsansichten einer Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung. 2C ist ein vergrößerter Querschnitt entlang der Linie C–C von 2B.
3 ist eine Darstellung in einem Diagramm von einer Ausführungsform der Erfindung, wo ein Oligonukleotid an der Wellenleiter-Oberfläche immobilisiert ist und innerhalb der Eindringtiefe der abklingenden Welle ein komplementäres Oligonukleotid einfängt, das einen Biotinanteil trägt, an welchen ein kolloidales Selen-Lichtstreupartikel angeheftet ist.
4 – 7, 8A und 9 – 12 sind gedruckte Darstellungen der tatsächlichen Videobilder, die von den Wellenleitern aufgenommen wurden, wie in den Beispielen ausführlicher beschrieben. Die Videobilder wurden in einen 8-Bit-Framegrabber eingespeist, der die Informationen digitalisierte. Die digitalisierte Datei wurde in eine Zeichnungsanwendung importiert, von welcher sie auf einem hochauflösenden Drucker ausgedruckt wurde.
8B und 8C sind DNA-Dissoziationen oder Schmelzkurven. Bei jeder Temperatur ist der mittlere Intensitätswert aufgezeichnet, der in Beispiel 5 für diese Temperatur gebildet wurde.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die verschiedenen Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung werden jetzt ausführlicher beschrieben werden.
TIR-Elemente und Wellenleiter-Vorrichtungen
Die physikalischen Prinzipien von totaler innerer Reflexion ("TIR") und abklingender Wellen sind in dem Abschnitt Hintergrund der Erfindung bekannt gemacht worden. Wie hierin verwendet bedeutet "TIR-Element" jedes beliebige transparente Material, das eine Grenzfläche bereitstellt, die zur totalen inneren Reflexion in der Lage ist. Das Element kann zum Beispiel eine Küvette, ein Stab oder eine Platte sein. Die abklingende Welle eines TIR-Elementes kann nur an dem Punkt oder an den Punkten der totalen inneren Reflexion vorhanden sein. Im Gegensatz dazu verweist ein "Wellenleiter" auf ein zweidimensionales TIR-Element, so dass Licht an vielfachen Punkten total intern reflektiert wird, wodurch eine abklingende Welle erzeugt wird, die im Wesentlichen gleichförmig über der gesamten oder nahezu der gesamten Oberfläche ist. Ein zweidimensionaler Wellenleiter kann von der Form planar oder gekrümmt sein. Der Einfachheit halber wird ein planarer Wellenleiter als die bevorzugte Ausführungsform beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das TIR-Element ein zweidimensionaler Wellenleiter. 2A – 2C veranschaulichen eine bevorzugte Ausführungsform, worin eine Wellenleiter-Vorrichtung 30 ein planares Wellenleiter-Element 32 und eine parallele planare Platte 34 umfasst. Das Wellenleiter-Element hat somit parallele Oberflächen 36 und 38 sowie einen Licht-empfangenden Rand 40. Ähnlich hat die Platte 34 parallele Oberflächen 42 und 44. Das Wellenleiter-Element 32 und die Platte 34 werden auf eine parallele Art mit Abstand angeordnet zusammengehalten, so dass die Element-Oberfläche 38 und die Platten-Oberfläche 42 einen engen Kanal 46 bilden. Das Element und die Platte können durch jedes zweckdienliche Mittel zusammengehalten werden, einschließlich Klebstoffmittel 48 bestehend aus einem beidseitigen Klebeband, das entlang der Ränder des Elementes und der Platte angeordnet ist. Der Kanal 46 ist vorzugsweise ziemlich eng, damit Kapillartransfer einer Fluid-Probe dadurch ermöglicht wird. Zum Beispiel sollte die Höhe weniger als etwa 1 mm sein, vorzugsweise weniger als etwa 0,1 mm.
Das Element 32 sollte aus einem optisch transparenten Material gefertigt sein, wie Glas, Quarz, Kunststoffen wie Polycarbonat, Acryl oder Polystyrol. Der Brechungsindex des Wellenleiters muss größer sein als der Brechungsindex des Probenfluids, wie auf dem Gebiet zum Bewirken von totalem inneren Reflexionsvermögen bekannt ist. Für eine wässerige Probenlösung ist der Brechungsindex n etwa 1,33, so dass der Wellenleiter typischerweise einen Brechungsindex größer als 1,35, normalerweise etwa 1,5 oder mehr hat. Der Wellenleiter kann ein Stück Kunststoff oder Glas sein, zum Beispiel können ein Standard-Glasobjektträger oder ein Deckglas verwendet werden.
Die Platte 34 kann aus ähnlichen Materialien konstruiert sein. Wie in 2A und 2B zu sehen ist, ist das Lichtempfangende Ende 40 des Wellenleiter-Elementes 32 in einem engen Schlitz 50 einer Maske 52 angeordnet, um die Wirkungen von Streulicht, das von der Lichtquelle 54 ausgeht, zu minimieren. Minimierung von Streulicht wird auch verbessert durch die Verwendung von Licht-absorbierenden Materialien wie unten besprochen.
Die Lichtquelle 54 zum Erzeugen des einfallenden Lichtstrahls kann annähernd jede Quelle von elektromagnetischer Energie sein, einschließlich Energie in dem sichtbaren, ultravioletten und nahen IR-Spektrum. Der Ausdruck "Licht" ist somit ziemlich breit ausgelegt und ist nicht beschränkt auf den sichtbaren Bereich, außer in den Ausführungsformen, die visuell detektiert werden. Nicht-sichtbare Wellenlängen werden durch Detektoren detektiert, die für die jeweilige Wellenlänge optimiert sind, wie auf dem Gebiet gut bekannt ist. Das Licht kann monochromatisch oder polychromatisch sein, gebündelt oder ungebündelt, polarisiert oder unpolarisiert. Bevorzugte Lichtquellen umfassen Laser, Licht-emittierende Dioden, Blitzlichter, Bogenlampen, Glühlampen und Fluoreszenzentladungslampen. Die Lichtquelle, die zum Beleuchten des Wellenleiter-Elementes verwendet wird, kann ein Niederwatt-Helium-Neon-Laser sein. Für eine tragbare Wegwerfvorrichtung wie die, die in Beispiel 1 unten beschrieben wird, kann die Lichtquelle ein kleiner Glühlampenkolben sein, der durch eine Batterie betrieben wird, so wie sie in einer Taschenlampe verwendet wird. Vorzugsweise umfasst die Lichtquelle ein Potentiometermittel zum Variieren der Intensität der Lichtquelle. Alternativ können Filter und/oder Linsen eingesetzt werden, um die Intensität auf einen geeigneten Pegel einzustellen.
Die Detektionsmittel zum Bestimmen des Grads an Lichtstreuung sind ausführlich unten beschrieben, umfassen aber kurz gesagt sowohl instrumentelle als auch visuelle Mittel. Es ist ein bedeutendes Merkmal der Erfindung, dass Lichtstreuungsereignisse über dem gesamten Wellenleiter im Wesentlichen gleichzeitig überwacht werden können, ob mit dem Auge und dem Gehirn eines Betrachters oder durch Photodetektionsvorrichtungen einschließlich CCD-Kameras, die Bilder formen, die unter Verwendung von Computern digitalisiert und verarbeitet werden. In jedem Fall wird nur eine einzige, multifunktionelle reaktive Oberfläche verwendet und wird gleichzeitig durch die abklingende Welle beleuchtet.
Reaktive Oberflächen
Gemäß der Erfindung wird eine reaktive Oberfläche, die aus mindestens einer Stelle besteht, auf einer Seite des Wellenleiter-Elementes gebildet. Während einige Ausführungsformen nur eine einzige Teststelle haben können, nutzt die Erfindung am besten eine Vielzahl solcher Stellen, und Vielfach-Situs-Vorrichtungen werden hierin beschrieben werden. Vielfache Teststellen können die gleichen oder verschiedene spezifische Bindungsglieder enthalten. Ein "Situs" oder eine "Stelle" (Mehrzahl = "Stellen" hierin) ist definiert als der abgegrenzte Bereich, in welchem ein spezifisches Bindungsglied für einen Analyten immobilisiert ist, wobei zu verstehen ist, dass nicht-Situs-Abschnitte der Oberfläche außerhalb des abgegrenzten Bereichs ebenfalls existieren werden. Das immobilisierte spezifische Bindungsglied wird hierin bezeichnet als ein "Einfangglied" oder "Einfang-SBM (specific binding member)". Vorzugsweise ist die Stelle ein kleiner Fleck oder Punkt und die nicht-Situs-Abschnitte umgeben die Stelle. Selbstverständlich sind viele andere Situs-Größen und – Konfigurationen möglich und liegen innerhalb der Erfindung. Eine Stelle kann auch als eine Linie oder ein Balken konfiguriert sein; als ein Buchstaben oder eine Zahl; als ein Kreis, Rechteck oder Dreieck; oder als jede andere grafische Form, wie zum Beispiel jede beliebige Grafik, die typischerweise in Computer-Icon- oder -Clipart-Sammlungen verwendet wird.
Die Fläche (Größe) einer Stelle muss nur groß genug sein, um genügend spezifisches Bindungsglied zu immobilisieren, um den Einfang des markierten Analyten und des Licht-streuenden Partikels zu ermöglichen. Das ist teilweise von der Dichte der Stelle abhängig, wie unten besprochen. Zum Beispiel sind so kleine Situs-Flächen wie mit 150 μm Durchmesser erfolgreich verwendet worden (siehe Beispiel 7 und 10). Solche kleinen Flächen sind bevorzugt, wenn viele Stellen auf einer reaktiven Oberfläche platziert sein werden, was eine hohe "Stellendichte" ergibt. Die praktische Untergrenze der Größe ist etwa 1 μm im Durchmesser. Zur visuellen Detektion sind Flächen erwünscht, die groß genug sind, um ohne Vergrößerung detektiert zu werden; zum Beispiel mindestens etwa 1 bis etwa 50 mm²; bis zu einer Größe von 1 cm² oder sogar größer. Es gibt keine obere Größenbegrenzung, außer wie durch Herstellungskosten und Benutzerfreundlichkeit bestimmt; jede gewünschte Situs-Größe oder -Form ist geeignet.
Vielfach-Situs-Vorrichtungen können die gleichen oder verschiedene SBMs an jeder Stelle enthalten. Falls es die gleichen sind, können die Vielzahl von Stellen ähnliche Konzentrationen haben und dadurch replizierte Informationen bieten, oder sie können verschiedene Konzentrationen des SBM haben und dadurch eine semi-quantitative Bestimmung oder Kalibrierung gegen einen Standard bieten. Falls die SBMs verschieden sind, kann die Vorrichtung genutzt werden für vielfache Detektionen von mehreren Analyten gleichzeitig. In einem speziellen Fall von verschiedenen SBMs können eine oder mehrere Stellen als eine positive Kontrolle dienen. Selbstverständlich sind Kombinationen von all dem oben genannten (z.B. vielfache semiquantitative Bestimmungen) in Vorrichtungen mit vielen Stellen möglich.
Für Vielfach-Situs-Vorrichtungen können die Stellen in jedem beliebigen zweckdienlichen Muster oder jeder zweckdienlichen Anordnung angeordnet sein. Der Abstand zwischen Stellen wird abhängig sein von der Auflösung des Detektionssystems, wie unten beschrieben, und dem Herstellungsverfahren, das zum Erzeugen des Stelle verwendet wird. Abhängig von der Herstellungsfähigkeit gilt, je höher die Auflösung der Detektion, umso näher können die Stellen sein. Es sollte eine ausreichende Trennung der immobilisierten Einfang-SBMs vorhanden sein, damit die Reaktion von jedem dieser Glieder individuell mit dem entsprechenden Bindungsglied in einer Fluid-Probe und/oder einem Licht-streuenden markierten Glied unterschieden werden kann von einer Reaktion an einer anderen Stelle ohne wesentliche Störung aufgrund von in der Nähe immobilisierten Bindungspaargliedern und deren assoziierten Licht-streuenden Partikeln. Vorzugsweise trennt ein nicht-Situs-Abschnitt jede einzelne Stelle deutlich ab. Eine sehr einfache Anordnung ist ein kartesisches Gitter, aber vielfache Stellen können als Linien, Muster und auch als andere Grafiken konfiguriert werden. In Vielfach-Situs-Reaktionsoberflächen werden eine oder mehrere Stellen oftmals eine positive Kontrolle, eine negative Kontrolle, eine Reihe von Kalibierstandards oder eine beliebige Kombination davon darstellen.
Eine bevorzugte Situs-Konfiguration ist die Form eines Kreuzes, welches zu einem "Plus"-Symbol für den Fall eines positiven Ergebnisses führt. In einer Variation davon ist nur der vertikale Abschnitt oder die vertikalen Abschnitte des Kreuzes eine Analytbindungsstelle, während der horizontale Aspekt des Plus ein Bindemittel enthält, das für Marker spezifisch ist, was unabhängig ist von der Anwesenheit von Analyt. Eine solche Konfiguration ist beschrieben in US-Patent 5.008.080, "Solid Phase Analytical Device and Method for Using Same", für Brown et al., Konfigurationen von dieser Variation arbeiten als eine Verifikation für den Assay, indem ein Minus"–"-Symbol produziert wird, egal ob Analyt vorhanden ist oder nicht, und ein Plus"+"-Symbol produziert wird, wenn Analyt vorhanden ist. Neben der "plus/minus"-Verifikationskonfiguration sind andere Formen dieser Variation ebenfalls möglich, wie in dem zitierten Patent offenbart.
In der Zwei-Ebenen-Vorrichtung von 2A – 2C ist die reaktive Oberfläche 60 vorzugsweise auf der Oberfläche 38 von Wellenleiter-Element 34 geformt, welche in den Kanal 48 hinein gerichtet ist. Siehe 2C. Das erleichtert das In-Kontakt-bringen von Probe und/oder Licht-streuendem Markerreagens mit der Stelle der reaktiven Oberfläche, indem Kapillarfluss über die reaktive Oberfläche ermöglicht wird. Der Fluss kann gesteigert werden durch die Verwendung eines absorbierenden oder saugfähigen Materials wie Papier an einem Ende des Kanals. Selbstverständlich ist die Zwei-Ebenen-Vorrichtung nur eine Ausführungsform. Ein einfaches zweidimensionales Wellenleiter-Element kann ebenfalls verwendet werden, wobei die Reaktionsoberfläche auf einer Seite beschichtet ist. Es muss jedoch möglicherweise mit der Reaktionsoberfläche in einer nach oben zeigenden Richtung ausgerichtet werden, um den Kontakt mit der Probe und dem Lichtstreuenden Markerreagens zu erleichtern. Streuung von Licht in der abklingenden Welle kann dann von der Unterseite aus beobachtet werden, auf Wunsch unter Verwendung eines Spiegels.
Spezifische Bindungsglieder und Immobilisierung auf der reaktiven Oberfläche
In dem Verfahren der Erfindung werden ein oder mehrere Einfangglieder zuerst auf der Oberfläche eines optischen Wellenleiters immobilisiert, um eine reaktive Oberfläche zu bilden. Ein spezifisches Bindungsglied ("specific binding member, SBM") ist jedes Glied eines verwandten Bindungspaares. Ein "verwandtes Bindungspaar" ist jede beliebige Ligand-Rezeptor-Kombination, die spezifisch aneinander binden wird, im Allgemeinen durch nichtkovalente Wechselwirkungen wie ionische Anziehungen, Wasserstoffbrückenbindung, Vanderwaals-Kräfte, hydrophobe Wechselwirkungen und dergleichen. Beispiele für verwandte Paare und Wechselwirkungen sind auf dem Gebiet gut bekannt und schließen, als Beispiele und nicht als Beschränkungen, folgendes ein: immunologische Wechselwirkungen zwischen einem Antikörper oder Fab-Fragment und seinem Antigen, Hapten oder Epitop; biochemische Wechselwirkungen zwischen einem Protein (z.B. Hormon oder Enzym) und seinem Rezeptor (zum Beispiel Avidin oder Streptavidin und Biotin) oder zwischen einem Kohlenhydrat und einem Lecitin; chemische Wechselwirkungen wie zwischen einem Metall und einem Chelatbildner; und Nukleinsäurebasenpaarung zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen. Ein jüngst berichtetes spezifisches Bindungspaar ist das Beptid-Nukleinsäure-Analog oder "PNA", das beschrieben ist in WO 92/20702 und WO 92/20703. beide von Buchardt et al., und in Flam, Science, 262: 1647, (1993), welches ein verwandtes Bindungspaar mit Nukleinsäuren oder anderen PNAs bildet. Für Nukleinsäure wird verstanden, dass 2'-Desoxyribonukleinsäure (DNA) sowie Ribonukleinsäure (RNA) eingeschlossen sind, wenn die Stabilität es zulässt.
Die Herstellung von Antikörper-SBMs ist ein altes und gut bekanntes Verfahren und muss nicht im Detail beschrieben werden. Kurz gesagt, ein Tier wird mit dem gewünschten Hapten immunisiert oder gereizt gemäß einem Immunisierungsplan. Oftmals ist das Hapten gekoppelt an ein Trägermolekül wie BSA, um die Erkennung zu verbessern. Nach einem geeigneten Zeitraum wird dem Tier Blut entnommen und Antikörper werden extrahiert. Alternativ können Antikörper aus Aszites-Fluid erhalten werden. Hoch spezifische monoklonale Antikörper können auf Wunsch hergestellt werden unter Verwendung der jetzt herkömmlichen Verfahren von Kohler und Milstein, Nature, 256, 495 (1975). Antikörper haben zahlreiche Amino-, Carboxyl- und Sulfhydrylgruppen, die für Kopplungsreaktionen genutzt werden können.
Die Synthese von Oligonukleotid-SBMs ist ebenfalls ziemlich routinemäßig unter Verwendung von automatisierten Synthesegeräten wie dem ABI 480. Diese Instrumente präparieren Oligonukleotide von nahezu jeder gewünschten Sequenz in Längen bis zu etwa 75–100 Basen. Längere Polynukleotide können auf Wunsch hergestellt werden durch bekannte Klonierungsverfahren oder durch Synthese von kürzeren Segmenten und Zusammenbau. Auf Wunsch können Oligonukleotide mit terminalen Aminen oder anderen reaktiven Gruppen zum Koppeln modifiziert werden. Eine etwas veraltete, aber immer noch nützliche Übersicht der Kopplungschemie ist zu finden in Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 1(3): 165–187 (1990).
SBMs können kovalent an den Wellenleiter angelagert werden durch chemische Kopplungsmittel, die auf dem Gebiet bekannt sind. Die reaktive Oberfläche kann direkt mit einer Vielzahl von chemisch reaktiven Gruppen derivatisiert werden, welche dann, unter bestimmten Bedingungen, stabile kovalente Bindungen mit dem aufgebrachten SBM bilden. Alternativ kann die reaktive Oberfläche zuerst mit chemisch derivatisierten Polymeren wie Dextran oder PEG beschichtet werden, welche dann kovalente Bindungen mit aufgebrachten SBMs bilden. Bestimmte Arten von Detergenzien können außerdem auf die reaktive Oberfläche aufgezogen werden, dann in situ derivatisiert werden und mit SBMs umgesetzt werden. Zum Beispiel enthalten Glas- und Quarzwellenleiter Gruppen, die aktiviert werden können zu reaktiven Hydroxyl- und Siloxygruppen, welche an spezifische Bindungsglieder über Linker gekoppelt werden können. Solche Linker umfassen zum Beispiel bekannte homo- und heterobifunktionelle Linker.
Es ist selbstverständlich vorzuziehen, SBMs an der reaktiven Oberfläche so zu binden, dass die spezifischen Bindungseigenschaften des Bindungsglieds nicht verloren gehen. Zum Beispiel können Antikörper über ihren Fc-Abschnitt gekoppelt werden, wie gelehrt in US-Patent 5.191.066 (Bienarz et al.); und Oligonukleotide können über terminale Amine oder andere funktionelle Gruppen gekoppelt werden. Linkerarme wie gelehrt durch US-Patent 4.948.882 für Ruth können an "sterisch toleranten" Positionen von Basenanteilen platziert werden, um Kopplung an feste Phasen ohne Verlust der Hybridisierungsfähigkeiten zu erleichtern. In noch einem anderen Verfahren kann die reaktive Oberfläche mit Streptavidin beschichtet werden durch physikalische Adsorption, dann mit einem Biotin-markierten Bindungspaarglied umgesetzt werden, um eine gut charakterisierte, biologisch reaktive Oberfläche zu erzeugen.
In jüngerer Zeit beschrieb WO 92/10092 (Affymax Technologies, N.V.; Fodor et al.) ein Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden direkt auf einem festen Träger unter Verwendung von Photolithographietechniken.
Zur Überraschung der Anmelder muss das SBM nicht kovalent an die reaktive Oberfläche gekoppelt sein. SBMs können an der Oberfläche adsorbiert werden oder damit Komplexe bilden unter Verwendung von Proteinüberzugsschichten. Die Beobachtung, dass die verschiedenen nicht-kovalenten Kräfte, die das Einfang-SBM (z.B. DNA) und das Marker-SBM (z.B. Antikörper) an Ort und Stelle halten, viel labiler sind als DNA-Hybridisierungskräfte, war eine ziemliche Überraschung. Jedoch ist das teilweise wegen der zufälligen Wahl von Bedingungen, namentlich der Ionenstärke, welche relativ niedrige Schmelztemperaturen für DNA erlaubt (siehe Beispiele). Es kann möglich sein, die Schmelztemperatur (durch Erhöhen der Ionenstärke) bis zu einem Punkt zu erhöhen, wo der DNA-Duplex nicht länger das schwache Glied in der Kette ist.
Die Dichte (Menge pro Einheit Fläche) von Einfang-SBM auf der reaktiven Oberfläche korreliert positiv mit der Sensitivität des Systems. Unter Verwendung von Oligonukleotid-SBMs können etwa 5000 DNA-Moleküle pro Quadrat-μm erreicht werden durch die hierin beschriebenen Fleckenbildungsverfahren. Andere Verfahren der Chipkonstruktion, zum Beispiel die oben erwähnten Photolithographietechniken, können andere Dichten ergeben. Die geschätzte theoretische maximale Dichte für Nukleinsäure-SBMs ist etwa 250.000 Moleküle pro Quadrat-μm. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass Chips von dieser Dichte erhalten werden können oder dass sie optimale Leistung bereitstellen würden in Hinblick auf die auferlegten sterischen Einschränkungen. Optimale Dichte für beste Sensitivität schließt einen Kompromiss ein zwischen Maximieren der Zahl der Bindungsstellen pro Einheitsfläche und Maximieren des Zugangs zu solchen Stellen, wobei die Diffusionskinetikanforderungen und sterische Betrachtungen bedacht werden müssen.
Eine Aufbringung des Einfang-SBM auf die reaktive Oberfläche kann vollbracht werden durch jedes beliebige zweckdienliche Verfahren. Zum Beispiel kann eine manuelle Verwendung von Mikropipetten oder Mikrokapillarröhrchen zweckdienlich verwendet werden zum Auftüpfeln des Einfangglieds auf die reaktive Oberfläche. Es ist jedoch bevorzugt, diesen Prozess für Bequemlichkeit, Reproduzierbarkeit und Kosteneinsparungen zu automatisieren. Mechanische Aufbringung ist besonders wünschenswert, wenn der Assay in einer Untersuchung im großen Maßstab, wie Routine-Screening-Anwendungen, verwendet wird. Automatisierte Aufbringungsverfahren umfassen zum Beispiel positive Verdrängungspumpen, x-y-Positioniertische und/oder Tintenstrahlsprüh- oder -drucksysteme und dergleichen.
Falls geeignet, können die SBMs erst in eine Lösung gebracht werden, um den Prozess des Abscheidens von Proben auf der reaktiven Oberfläche zu erleichtern. Geeignete Lösungen für diesen Zweck haben nur die generelle Anforderung, dass nach dem Trocknen das SBM seine Spezifität (d.h. seine spezifischen Bindungseigenschaften) im Wesentlichen beibehält und dass es die Brechungseigenschaften des Elementes nicht signifikant stört. Das Volumen von Lösung, das abgeschieden werden soll, ist abhängig von der Konzentration von SBM in der Lösung.
Idealerweise werden Lösungen vorbereitet in einem Konzentrationsbereich von etwa 0,5 bis 500 μM, so dass ein kleiner Tropfen (etwa 2 μl) die gewünschte Menge SBM enthält. Typischerweise werden wiederholte Aufbringungen von SBMs bei niedrigeren Konzentrationen bevorzugt, um kein SBM zu verschwenden. Diese werden wiederholt, bis genügend SBM vorhanden ist, wobei darauf geachtet werden muss, dass sich die Aufbringung an nahegelegenen Stellen nicht überlappt. Auf Wunsch kann ein Quervernetzungsmittel eingeschlossen werden, um die Menge von SBM an der Einfangstelle zu erhöhen, vorausgesetzt, dass das Quervernetzungsmittel die spezifischen Bindungseigenschaften nicht stört.
Nachdem das SBM an einer oder mehreren Stellen der reaktiven Oberfläche abgeschieden worden ist, wird das Glied trocknen gelassen und wird dadurch auf der reaktiven Oberfläche immobilisiert. Verdampfung ist das bevorzugte Trocknungsverfahren und kann bei Raumtemperatur (etwa 25°C) durchgeführt werden. Falls erwünscht kann die Verdampfung bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt werden, solange die Temperatur die Fähigkeit der Einfangglieder, spezifisch mit deren entsprechenden Bindungspaargliedern in Wechselwirkung zutreten, nicht signifikant hemmt. Wo zum Beispiel das immobilisierte Einfang-SBM ein Protein ist, sollten nichtdenaturierende Temperaturen eingesetzt werden.
Zusätzlich zur Immobilisierung von Einfang-SBM auf der reaktiven Oberfläche wird die reaktive Oberfläche vorzugsweise behandelt, um nichtspezifische Wechselwirkungen zwischen der reaktiven Oberfläche und Analytbindungsgliedern in einer Fluid-Probe, die getestet werden soll, zu blockieren. In dem Fall eines Protein-SBM (z.B. Antigen, Antikörper oder PNA) auf der reaktiven Oberfläche sollte das Blockierungsmaterial nach Immobilisierung des SBM aufgebracht werden. Geeignete Proteinblockierungsmaterialien sind Casein, Zein und Rinderserumalbumin (BSA). Andere Blocker können Detergenzien oder langkettige wasserlösliche Polymere sein. Das Blockierungsmaterial kann zweckdienlich auf die reaktive Oberfläche als eine wässerige oder gepufferte wässerige Lösung aufgebracht werden. Die Blockierungslösung kann auf die reaktive Oberfläche aufgebracht werden jederzeit, nachdem die ersten Einfang-SBMs immobilisiert sind. In dem Fall eines Nukleinsäure-SBM kann das Blockierungsmaterial vor oder nach der Immobilisierung des SBM aufgebracht werden. Geeignete Blocker umfassen solche, die oben beschrieben sind, sowie 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1- bis 5-fache Denhardt-Lösung (eine 1-fache Denhardt-Lösung entspricht 0,02 Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon und 0,2 mg/ml BSA).
Für Casein ist herausgefunden worden, dass es ein bevorzugtes Blockierungsmittel sowohl für DNA- als auch für Antikörper-SBMs ist, und ist erhältlich von Sigma Chemical, St. Louis, MO (Katalog-Nr. C-3400). Casein gehört zu einer Klasse von Proteinen, die bekannt sind als "metalösliche" Proteine (siehe z.B. US-Patent 5.120.643 für Ching et al., dessen technischen Tatbestände hier durch Literaturhinweis eingefügt werden), welche eine chemische Behandlung benötigen, um sie löslicher zu machen. Solche Behandlungen umfassen saure oder alkalische Behandlung, und es wird angenommen, dass sie eine Spaltung und/oder partielle Hydrolyse des intakten Proteins durchführen. Andere metalösliche Proteine umfassen Zein (Sigma Katalog-Nr. Z-3625) und ein Nichtalbumin-Eiweißprotein (Sigma Katalog-Nr. A-5253). Casein ist ein Milchprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 23.600 (Rinder-beta-Casein), aber wie hierin verwendet verweisen "Casein" oder "alkalisch behandeltes Casein" beide auf eine partiell hydrolysierte Mischung, die aus einer alkalischen Behandlung resultiert wie beschrieben in Beispiel 1 von US-Patent 5.120.643. Ein Elektrophoresegel (20% Polyacrylamid TBE) des so behandelten Caseins zeigt eine Mischung von Fragmenten vorwiegend mit einem Molekulargewicht von weniger als 15.000, wie durch ein diffundiertes Band unter dieser Markierung gezeigt wird.
Es ist möglich, dass die Blocker, insbesondere Casein, der Oberfläche eine hydrophobe Natur verleihen, die die "Filmbildungswirkung (sheeting action)" erleichtert, die in den Beispielen beschrieben wird. "Filmbildung" tritt auf, wenn Wasser, das auf die Oberfläche aufgebracht wird, von dem Element in einem zusammenhängenden Tropfen hinuntergekippt werden kann statt in vielen kleinen Tröpfchen. Es wird jedoch angenommen, dass die Gleichförmigkeit der Beschichtung bedeutender ist als ihre Hydrophobie. Elemente, die in Kanal-Vorrichtungen wie in Beispiel 1 geformt sind, zeigen eine solche Filmbildungswirkung. Es wird angenommen, dass das den Fluss und die Diffusion innerhalb des Kanals erleichtert.
Es sollte verstanden werden, dass das erste spezifische Bindungsglied, falls erwünscht, für den Analyten durch die Intermediarität von zusätzlichen verwandten Paaren spezifisch sein kann. Zum Beispiel könnte ein Oligonukleotid-SBM biotinyliert sein und an die reaktive Oberfläche über ein Biotin-Avidin-verwandtes Bindungspaar angelagert werden. Eine derartige Anlagerung wird beschrieben durch Hansen in EP 0 139 489 (Ortho). Ähnlich könnte ein Oligonukleotid an die reaktive Oberfläche angelagert sein durch eine Mediatorsonde, wie offenbart durch Stabinsky in US-Patent 4.751.177 (Amgen). Bei Verwendung von intermediären verwandten Bindungspaaren muss man bedenken, dass der gesamte Abstand von der Grenzfläche (an der reaktiven Oberfläche) bis zu dem Licht-streuenden Marker die Eindringtiefe nicht besonders überschreiten sollte. Unter diesem Gesichtspunkt ist geschätzt worden, dass der Durchmesser eines Immunglobulin-Antikörpers etwa 5 nm und dass die Länge von DNA-20-mer (in β-Helixform) etwa 6,8 nm ist. Das lässt Raum übrig für vielfache verwandte Paare in einer typischen Eindringtiefe von 200–300 nm (siehe Hintergrund der Erfindung). Es sollte auch verstanden werden, dass verwandte Bindungswechselwirkungen den nachfolgenden Reaktionsbedingungen standhalten müssen, was zum Beispiel für einige Anwendungen erhöhte Temperaturen einschließen kann. Längere Oligonukleotide oder solche mit höherem GC-Gehalt sind stabiler und sind in diesem Fall bevorzugt.
Licht-streuende Marker
Eine andere wichtige Komponente der vorliegenden Erfindung ist der Licht-streuende Marker oder Partikel ("light scattering label, LSL"). Ein LSL ist ein Molekül oder ein Material, häufig ein Partikel, welches verursacht, dass einfallendes Licht elastisch gestreut wird, d.h. im Wesentlichen ohne Absorbieren der Lichtenergie. Beispielhafte LSLs umfassen kolloidales Metall und nichtmetallische Marker wie kolloidales Gold oder Selen; rote Blutzellen; und angefärbte Kunststoffpartikel, aus Latex, Polystyrol, Polymethylacrylat, Polycarbonat oder ähnlichen Materialien. Die Größe von solchen partikulären Markern reicht von 10 nm bis 10 μm, typischerweise von 50 bis 50 nm, und vorzugsweise von 70 bis 200 nm. Je größer das Partikel, umso größer die Licht-streuende Wirkung, aber das gilt sowohl für gebundene Partikel als auch für Partikel in dem Hauptteil der Lösung, so dass sich der Hintergrund ebenfalls mit der Partikelgröße vergrößert. Geeignete Partikel-LSLs sind erhältlich von Bangs Laboratories, Inc. Carmel, IN, USA.
In der vorliegenden Erfindung ist das LSL an das erste spezifische Bindungsglied eines zweiten verwandten Bindungspaares angelagert. Das zweite spezifische Bindungspaarglied kann als ein "Marker-SBM" bezeichnet werden, und der Komplex aus LSL und Marker-SBM wird als "Marker-Konjugat" bezeichnet oder nur als "Konjugat". Die Natur und Spezifität des Marker-SBM ist abhängig von dem Format des Assays. Für ein Kompetitiv-Assay-Format ist das Marker-SBM ein Analog des Analyten und bindet spezifisch mit dem Einfang-SBM in Konkurrenz mit dem Analyten. Für ein direktes Sandwich-Assay-Format ist das Marker-SBM spezifisch für ein zweites Epitop auf dem Analyten. Das ermöglicht, dass der Analyt zwischen dem Einfang-SBM und dem Marker-SBM eingeschoben ("ge-sandwiched") werden kann. In einem indirekten Sandwich-Assay-Format ist das Marker-SBM spezifisch für eine Stelle oder eine Reportergruppe, die mit dem Analyten assoziiert ist. Sobald zum Beispiel ein antigener Analyt eingefangen ist, kann ein biotinylierter Antikörper verwendet werden, um den Analyten in "Sandwichform" dazwischenzulegen, und Biotin-spezifisches Marker-SBM wird verwendet. Dieses indirekte Sandwich-Format ist außerdem nützlich für Nukleinsäuren. In diesem Fall ist das Einfang-SBM ein Oligonukleotid, das komplementär ist zu dem Ziel, und das Ziel enthält ein spezifisches Bindungsreportermolekül (z.B.
Biotin oder ein Hapten, das typischerweise über ein Amplifikationsverfahren wie LCR oder PCR eingegliedert wurde), und das Marker-SBM wird gewählt, dass es für die Reportergruppe spezifisch ist.
Selbstverständlich kann das Marker-SBM für seinen jeweiligen Partner (Analyt oder erstes SBM, abhängig von dem Format) durch intermediäre verwandte Paare spezifisch sein, wie es der Fall war mit dem Einfang-SBM. Falls zum Beispiel der Analyt ein Oligonukleotid ist wie ein Amplifikationsprodukt, das eine Haptenreportergruppe trägt, könnte ein Sandwich-Assay-Format ein LSL konjugiert an Antihapten-Antikörper einschließen. Somit ist das Marker-SBM über das Hapten-Antihapten-verwandte Bindungspaar für den Analyten spezifisch. Ein Beispiel für ein Nukleinsäure-intermediäres verwandtes Paar ist beschrieben in Schneider et al., US 4.882.269 (Princeton University). Die gleichen Betrachtungen zum Abstand von der Grenzfläche und zur Stabilität der verwandten Paare sollten für Marker-SBMs sowie für Einfang-SBMs angestellt werden.
Ungeachtet des Assayformates muss das Marker-SBM an den Licht-streuenden Marker angelagert werden, um das Konjugat zu bilden. Wie mit Einfang-SBMs kann das Marker-SBM kovalent an den LSL gebunden sein, aber das ist nicht wesentlich. Physikalische Adsorption von Marker-SBM an partikuläre LSLs ist ebenfalls geeignet. In einem solchen Fall muss die Anlagerung nur stark genug sein, um den nachfolgenden Reaktionsbedingungen zu widerstehen ohne wesentlichen Verlust von LSL, z.B. von Waschschritten oder anderem Fluidfluss.
Eine große Zahl an kovalenten Anlagerungsstrategien, die zur Kopplung des LSL und des Marker-SBM geeignet sind, existieren in der Literatur. Zum Beispiel kann eine Aminogruppe in ein Marker-SBM eingeführt werden durch Standardsynthesechemie (wie sie erhältlich ist von Genosys Biotechnologies, Inc. The Woodlands, TX, USA). Die Chemie zum Aktivieren eines LSL zur kovalenten Kopplung an ein Amin-modifiziertes SBM umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Cyanbromid, N-Hydroxysuccinimid oder Carbodiimid. AFFINITY CHROMATOGRAPHY von W. H. Scouten, 1981, John Wiley & Sons, und SOLID PHASE BIOCHEMISTRY, ANALYTICAL AND SYNTHETIC ASPECTS von W. H. Scouten, 1983, John Wiley & Sons) beschreiben solche Aktivierungstechniken. In einigen Fällen, zum Beispiel N-Hydroxysuccinimid und Carbodiimid, muss das LSL Oberflächen-Carboxylgruppen enthalten; zur Cyanbromidaktivierung muss das LSL Oberflächen-Hydroxylgruppen enthalten. Gut bekannte hetero- und homobifunktionelle Linker könnten ebenfalls in solchen kovalenten Konjugationen eingesetzt werden. LSL-Partikel mit den geeigneten chemischen Gruppen und dem geeigneten Durchmesser zur Verwendung als LSL können von mehreren kommerziellen Quellen erhalten werden (zum Beispiel Bangs Laboratories, Inc., Carmel, IN, USA). Kovalente Kopplung von LSL an das Marker-SBM kann Vorteile in Systemen bereitstellen, wo stringente Bedingungen erforderlich sind, um die Bindungsspezifität zu verbessern, da solche Bedingungen die nicht kovalente Adsorption von Marker-SBM an einen LSL stören könnte.
Licht-absorbierende Materialien
Unter einem bevorzugten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Licht-absorbierendes Material ("LAM") zu der Mischung von Probe und Marker-Konjugat hinzugegeben. Das LAM ist ausgelegt, um zu verhindern, dass Streulicht die Lichtstreuungsreaktion stört. Streulicht ergibt sich primär aus mikroskopischen Unvollkommenheiten in der reflektierenden Grenzfläche und aus Streuung der abklingenden Welle durch Partikel, die bis zu der Eindringtiefe wandern, aber nicht darin gebunden sind. Wenn das LAM in dem Hauptteil der Lösung dispergiert ist, absorbiert und minimiert es die Wirkung von solchem Streulicht besser, als wenn ein derartiges Material auf eine Oberfläche aufgeschichtet wird, um eine undurchlässige Schicht zu bilden (wie nach dem Stand der Technik). Das LAM sollte eine endgültige wirksame optische Dichte ("O.D.") von mindestens 15 bereitstellen; vorzugsweise mehr als 100; am besten 300 oder mehr. Eine "wirksamer" O.D. berücksichtigt die Wellenlänge des einfallenden Lichts und ist die O.D. bei der Wellenlänge von monochromatischem Licht und die O.D. bei der häufigsten Wellenlänge von polychromatischem Licht.
Geeignete LAMs schließen das Konjugat selbst sowie zahlreiche Licht-absorbierende Farbstoffe ein. Lichtabsorbierende Farbstoffe sind alle Verbindungen, die Energie aus dem elektromagnetischen Spektrum absorbieren, Idealerweise bei Wellenlängen, die der/den Wellenlänge(n) der Lichtquelle entsprechen. Wie auf dem Gebiet bekannt ist, bestehen Farbstoffe generell aus konjugierten heterozyklischen Strukturen, die beispielhaft durch die folgenden Klassen von Farbstoffen dargestellt werden: Azofarbstoffe, Diazofarbstoffe, Triazinfarbstoffe, Lebensmittelfarben oder biologische Färbemittel. Spezielle Farbstoffe umfassen: Coomasie Brilliant Blue R-250-Farbstoff (Biorad Labs, Richmond, CA); Reactive Red 2 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), Bromphenolblau (Sigma); Xylencyanol (Sigma); und Phenolphthalein (Sigma). Das Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators von Floyd J. Green, veröffentlicht durch Aldrich Chemical Company, Inc. (Milwaukee, WI), stellt eine Fülle von Daten für andere Farbstoffe bereit. Mit diesen Daten können Farbstoffe mit den geeigneten Lichtabsorptionseigenschaften ausgewählt werden, um mit den Wellenlängen übereinzustimmen, die durch die Lichtquelle emittiert werden.
Vorzugsweise stören diese LAMs nicht die Absorption von Marker-SBM auf dem LSL, oder die Spezifität von immobilisiertem Marker-SBM. Falls zum Beispiel das Marker-SBM ein Peptid, Polypeptid oder Protein ist, denaturiert das LAM vorzugsweise nicht das Peptid, Polypeptid oder Protein. Ähnlich denaturiert das LAM, wenn das Marker-SBM eine Nukleotidsequenz ist, vorzugsweise nicht die Nukleotidsequenz. Sobald die Farbstoffe auf der Basis der Lichtabsorptionseigenschaften ausgewählt sind, können sie empirisch bewertet werden, um sicherzustellen, dass der Farbstoff die spezifischen Bindungsereignisse nicht stört, die zur Implementierung des Wellenleiter-Assays erforderlich sind.
Überraschenderweise kann das Konjugat selbst außerdem als ein LAM dienen. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung einer Konzentration von Marker-Konjugat höher als notwendig, zum Beispiel Konzentrationen, die eine wirksame O.D. von mindestens 15, vorzugsweise mehr als 300, am besten mehr als 500 bereitstellen, die Detektion ebenso verbessert. Verfahren zum Konzentrieren eines Konjugats umfassen Affinitätsreinigung oder Zentrifugation, wie beschrieben in den Beispielen 2 und 3. Obwohl Farbstoffe in Zusammenhang mit konzentriertem Konjugat verwendet werden können, ist herausgefunden wurden, dass hohe Konzentrationen von Konjugaten allein normalerweise ausreichend sind. Dieses Phänomen der Zugabe von mehr Marker, um Signal-Rausch-Pegel zu verbessern, ist nahezu beispiellos in diagnostischen Assays und läuft sehr stark der aktuellen Denkweise entgegen.
Während LAMs ein optisches Merkmal der Erfindung sind, führt deren Verwendung zu der Fähigkeit, höhere Konzentrationen von Marker-Konjugat, höhere Intensitäten von Licht und größere Markerpartikel zu verwenden, welche alle die Leistung gegenüber Systemen verbessern, die kein Licht-absorbierendes Material enthalten. Die gesteigerte Wirkung der Verwendung eines LAM ergibt sich wahrscheinlich aufgrund der Elimination von Streulicht an einem Punkt viel näher an der Quelle als in jedem bekannten Verfahren nach dem Stand der Technik. Beschichtungen auf der Wellenleiter-Oberfläche gegenüber der Reaktionsoberfläche können nur Streulicht absorbieren, das diese Oberfläche erreicht. Streulicht in der Lösung ist immer noch frei, um unerwünschte Streuung herbeizuführen.
Verfahren der Verwendung
Assayverfahren gemäß der Erfindung nutzen TIR-Elemente oder Wellenleiter, wie oben beschrieben, und umfassen kompetitive und direkte oder indirekte Sandwich-Assay-Formate. Ein indirektes Sandwich-Format ist in 3 dargestellt.
Zuerst wird ein TIR-Element oder ein Wellenleiter 62 wie oben besprochen hergestellt, wobei mindestens ein Einfang-SBM an einer oder mehreren Stellen in der reaktiven Oberfläche an der Grenzfläche 64 immobilisiert wird. Das Einfang-SBM ist spezifisch für den Analyten. In 3 ist das SBM ein Einfang-Oligonukleotid, gezeigt bei 66, hat die Sequenz 5'-AGTGGAGGTCAACGA (Sequenzidentifikationsnummer 3) und ist an der Grenzfläche 64 immobilisiert. Vorzugsweise gibt es vielfache SBMs, die an verschiedenen Stellen immobilisiert sind, die räumlich durch nicht-Situs-Abschnitte getrennt sind.
In einem Sandwich-Format wird die Fluid-Probe, die auf die Anwesenheit oder Menge von Analyt zu testen ist, dann in Kontakt gebracht mit dem Einfang-SBM auf der reaktiven Oberfläche. Die einzige generelle Anforderung an diesen Verfahrensschritt ist, dass die Probe in direktem Kontakt mit den räumlich getrennten immobilisierten SBMs ist, um Bindung zwischen Analyt und dem Einfang-SBM zu bewirken. Sanftes Mischen der Fluid-Probe, nachdem sie mit der reaktiven Oberfläche in Kontakt gebracht worden ist, ist außerdem in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt, aber nicht notwendig. Ein solches Mischen kann helfen, einen engen Kontakt zwischen der Fluid-Probe und dem immobilisierten SBM – sicherzustellen. Anstelle von Mischen fördert ein Kapillarfluss von Probenfluid über die reaktive Oberfläche hinweg ebenfalls guten Kontakt und Binden von Analyt an das Einfang-SBM.
Als nächstes wird ein Marker-Konjugat ebenfalls in Kontakt mit der reaktiven Oberfläche unter Bindungsbedingungen gebracht. Das Marker-Konjugat bindet an den Analyten (oder an eine Reportergruppe, die an den Analyten angeheftet ist), um einen Licht-streuenden spezifischen Bindungskomplex an oder in der Nähe der reaktiven Oberfläche zu bilden. In dem Sandwich-Format können die Probe und das Konjugat wahlweise gemischt werden, bevor die reaktive Oberfläche mit beiden Komponenten in Kontakt gebracht wird, oder das beschriebene zweistufige Verfahren kann verwendet werden. Falls erwünscht können die Verfahren praktisch ausgeführt werden unter Verwendung eines LAM, welches zu dem Konjugat oder der Probe-Konjugat-Mischung hinzugegeben würde.
Bezugnehmend auf 3 besteht das Marker-Konjugat aus dem Licht-streuenden kolloidalen Selenpartikel 68, an welches Antibiotin-Antikörper 70 immobilisiert sind. Der Analyt ist das Oligonukleotid, das unter 72 gezeigt ist, 5'-TCGTTGACCTCCRCT (Sequenzidentifikationsnummer 12), welches mit einer Biotin ("Bi")-Reportergruppe 74 markierten worden ist. Die Komplementarität der Oligonukleotide und die Antikörperspezifität für Biotin halten den LSL innerhalb der Eindringtiefe 76 des Wellenleiters.
Zahlreiche Verfahren sind zur Einlagerung einer solchen Reportergruppe. in Probennukleinsäure bekannt. Zum Beispiel könnte die Probe amplifiziert werden unter Verwendung einer Technik wie PCR oder LCR, worin die Primer den Reporter tragen könnten. Alternativ können Reporter an einzelne Nukleotidtriphosphate gekoppelt werden, welche dann eingelagert werden in Erweiterungsprodukte, die aus Probe hergestellt werden. Dieses Einlagerungsverfahren wird mit PCR funktionieren und auch mit der LCR-Variation, die als Gap-LCR bekannt ist.
Das Element wird dann auf eine Art und Weise beleuchtet, um totale innere Reflexion zu bewirken. Lichtquellen und physikalische Prinzipien von TIR sind bereits beschrieben worden. In 3 ist die Streuung der abklingenden Welle unter 78 veranschaulicht. Ein Schlitz wird vorzugsweise verwendet, um Streulicht zu verringern. An den Stellen, wo sich Lichtstreuende spezifische Bindungskomplexe gebildet haben, wird die Streuung von Licht beobachtet als hellere Bereiche gegenüber dem dunkleren Hintergrund der nicht-Situs-Abschnitte (siehe z.B. 4–8A und 9–12). Je heller die Stelle erscheint, umso mehr LSL ist gebunden und umso mehr Analyt ist an dieser Stelle vorhanden. Das Verfahren kann verwendet werden zur quantitativen oder semiquantitativen Bestimmung durch Einlesen der Grautöne in einen Computer und, unter Verwendung von Kalibratoren, Bewerten der Menge von Analyt, die an jeder Stelle vorhanden ist.
In einem kompetitiven Format sind die TIR-Vorrichtung und die reaktive Oberfläche wie oben. Das LSL jedoch ist ein Analyt-Analog, welches mit Probenanalyt um das Einfang-SBM konkurriert. Folglich ist die Helligkeit des Flecks umgekehrt verwandt mit der Menge von Analyt. In diesem Format müssen die Probe und das Konjugat gemischt werden vor dem Kontakt von jedem einzelnen mit der reaktiven Oberfläche. Ein LAM ist in kompetitiven Formaten genauso nützlich wie in Sandwich-Formaten.
Es sollte herausgestellt werden, dass das Phänomen, das verschiedentlich bekannt ist als "Anstiegsflanke (leading edge)" oder "Beschattung (shadowing)", nicht als ein Problem mit der vorliegenden Erfindung beobachtet wird. Dieses Phänomen ist in chromatographischen Fluss-Vorrichtungen zu sehen, wo die Bindung von Marker an Stellen stromabwärts kleiner ist als die Bindung an Stellen stromaufwärts. Dieses Phänomen wird prinzipiell vermieden, da die Faktoren, die die Bindung von LSL steuern, vorherrschend Diffusion sind, nicht Chromatographie, auch wenn einige Ausführungsformen einen Strömungskanal nutzen.
Während es möglich ist, die Vorrichtung der Erfindung zu nutzen, indem ein Lichtstrahl nacheinander auf einzelne Stellen gerichtet wird und kleine Orte von abklingender Wellenerzeugung wie nach dem Stand der Technik gebildet werden, wird entschieden stärker bevorzugt, den gesamten Wellenleiter auf einmal zu beleuchten, wodurch eine abklingende Wellenenergie über die ganze reaktive Oberfläche hinweg erzeugt wird. Diese gleichzeitige Beleuchtung der ganzen reaktiven Oberfläche ist es, was eine gleichzeitige Untersuchung und einen Vergleich aller Stellen ermöglicht und dadurch eine viel schnellere Detektion erlaubt, als vorher möglich war. Ein Hauptvorteil der Systeme der Erfindung ist, dass sie ermöglichen, dass Echtzeit-Bindung und/oder -Dissoziationskinetik beobachtet wird, und dass sie die Entwicklung eines sichtbaren Signals in wenigen Sekunden, z.B. 1 bis 20 Sekunden, in der bevorzugten Ausführungsform ermöglichen. Die ganze reaktive Wellenleiteroberfläche kann auf einmal gesehen (und/oder detektiert) werden und sie wird überall gleichzeitig beleuchtet, so dass die Akkumulation von LSL an einer Stelle in Echtzeit beobachtet werden kann, da es keinen Bedarf gibt, jede Stelle entweder zur Beleuchtung mit einfallendem Licht oder zur Detektion von gestreutem Licht abzutasten.
Dieses Ergebnis ist irgendwie überraschend im Hinblick auf die vorherigen Lehren bezüglich TIR. Typischerweise befinden sich die Detektoren von TIR-Elementen an dem Auslass des Elementes, um das Licht zu sammeln, wenn es das Element verlässt. Es ist immer angenommen worden, dass das Licht, das das Element verlässt, durch das Bindungsereignis geändert wurde. Tatsächlich wären Detektionen unter Verwendung von Auslasslicht nicht möglich ohne eine derartige Modifikation des Lichts durch die Bindungsereignisse. Folglich erwartet man, dass das Licht irgendwie durch das Bindungsereignis verändert wird. In Hinblick darauf könnte man nicht garantieren, dass sich das Licht auf die gleiche Art und Weise verhalten würde nach Treffen auf eine zweite Bindungsstelle, und die Lehren raten somit von Vielfach-Situs-Elementen ab, die gleichzeitig durch eine gemeinsame Lichtquelle beleuchtet werden. Die vorliegende Erfindung findet überraschenderweise heraus, dass das intern reflektierte Licht an einer stromabwärts liegenden Stelle (bezüglich der Lichtquelle) nicht gestört wird durch Bindungsereignisse an einer stromaufwärts liegenden Stelle.
Des weiteren kann der Grad oder das Ausmaß von Bindung in Echtzeit überwacht werden, wenn verschiedene Bedingungen geändert werden. Wo zum Beispiel die SBMs Oligonukleotiden sind, denen erlaubt ist, Strangpaarung zu bilden, und die sich ändernde Bedingung Stringenz ist, kann Dissoziation der Stränge von Nukleinsäure (welche zu einer Befreiung des LSL in den Hauptteil der Lösung führt, wo er abklingende Wellenenergie nicht streuen kann) tatsächlich beobachtet werden als ein Verlust des hellen Flecks an der Stelle. Wie auf dem Gebiet bekannt ist kann Hybridisierungsstringenz kontrolliert werden, indem Parameter wie Temperatur und Ionenstärke variiert werden. Erhöhen der Temperatur steigert die Stringenz und destabilisiert den Duplex. Herkömmliche Heizblöcke können für diese Technik verwendet werden und die bevorzugte oben beschriebene Zweiplatten-Vorrichtung kann einfach auf dem Heizblock ruhen. Oligonukleotidschmelztemperaturen Tm können erhalten werden, welche gute Korrespondenz mit Lösungsphasenschmelztemperaturen zeigen. Die Stringenz wird außerdem erhöht, indem die wirksame Konzentration von Kationen erniedrigt wird, wie durch Verdünnung mit Wasser. Somit stellen der Wellenleiter und die Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Mechanismus zur Echtzeitüberwachung von Oligonukleotidschmelztemperaturen bereit. Durch Kontrollieren der Stringenz auf diese Art und Weise kann man einen perfekt komplementären Strang von einem Strang unterscheiden, der gerade eine einzige Basenfehlpaarung enthält. Ein solches System wird große Nützlichkeit bei der Gensequenzierung und in Diagnoseverfahren finden.
Änderungen der Bedingungen, die sich auf die Antikörper-Hapten-Wechselwirkungen auswirken, können auf eine ähnliche Weise bewertet werden, indem Antikörper und Haptene für die Oligonukleotidpaare ersetzt werden. Zum Beispiel wird eine steigende Temperatur Proteinbindungsmittel (z.B. Antikörper) denaturieren, was somit zu einem Verlust der Bindungsfähigkeit führt. Diese Denaturierung von Protein kann in Echtzeit überwacht werden unter Verwendung der Erfindung. Es sollte ins Gedächtnis zurückgerufen werden, dass alle verwandten Bindungspaare, die zum Halten des SBM an der Wellenleiteroberfläche oder zum Festbinden des LSL an dem Marker-SBM genutzt werden, vorzugsweise solchen geänderten Bedingungen widerstehen sollten, so dass die Bindung von Analyt an dem Einfang-SBM das überwachte Dissoziationsereignis ist.
Es sollte beachtet werden, dass ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung der ist, dass die Reagenzien und die Probe, z.B. Konjugat-Probe-Lösung, nicht von der Einfangstelle weggewaschen werden müssen, um eine Detektion zu ermöglichen. Bei fluoreszierenden und radioaktiven Markern muss der ungebundene Marker von der Oberfläche entfernt werden, um ein unerwünschtes Signal zu verhindern. Jedoch diffundieren die ungebundenen LSLs in der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen von der Eindringtiefe weg und hören sogar ohne ein physikalisches Entfernen auf, ein Signal zu ergeben. Die Eliminierung der Notwendigkeit, ungebundene Komponenten von der Oberfläche wegzuwaschen, trägt merklich zu der Geschwindigkeit bei, mit der ein Assay durchgeführt werden kann.
In einer einzigartigen Umkehrung der Schmelztemperatur-Bestimmungen können die Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung als ein kalibriertes Thermometer verwendet werden, um die genauen Temperaturen eines Wellenleiters zu überwachen, oder als eine Fertigungsqualitätskontrolle, um die Gleichmäßigkeit der Wärmeübertragung zu überwachen. Als ein Thermometer werden eine Reihe von Oligonukleotidpaaren von bekannten inkrementellen Schmelztemperaturen in einer Situs-Reihe auf der reaktiven Oberfläche platziert. Wenn die Temperatur erhöht wird, wird das Paar mit der niedrigsten Schmelztemperaturen zuerst dissoziieren, gefolgt von nachfolgenden Paare in der Reihenfolge ihrer Schmelztemperaturen. Die Temperatur der reaktiven Oberfläche kann bestimmt werden durch Kenntnis der Schmelztemperaturen dieser Kalibratoroligonukleotide. Eine "leiterähnliche" Wirkung wird erhalten, falls die Oligonukleotidpaare in einer linearen Anordnung in der Reihenfolge ihrer bekannten Schmelztemperaturen abgeschieden sind.
Des weiteren kann die Gleichmäßigkeit der Wärmeübertragung in einer Qualitätskontrolleinstellung überwacht werden, wenn der ganze Wellenleiter mit Oligonukleotiden mit identischen Schmelztemperaturen bedeckt ist. Dissoziation sollte gleichzeitig an allen Stellen vorkommen, wenn die Erwärmung gleichmäßig ist. Ein solcher Chip kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob der Heizblock Schwankungen zeigt, die zu "heißen Flecken (hot spots)" oder "kalten Flecken (cold spots)" führen.
Detektion von Streulicht
Wie oben angedeutet, kann das Streulicht visuell oder durch photoelektrische Mittel detektiert werden. Zur visuellen Detektion führt das Auge, und Gehirn eines Betrachters die Bildverarbeitungsschritte durch, die zu der Bestimmung von Streuung an einer bestimmten Stelle führen. Streuung wird beobachtet, wenn die Stelle heller erscheint als der umgebende Hintergrund (siehe z.B. die Figuren, die mit Beispielen assoziiert sind). Falls die Anzahl von Stellen klein ist, vielleicht ein Dutzend oder weniger, können die Verarbeitungsschritte im Wesentlichen gleichzeitig bewirkt werden. Falls die Anzahl der Stellen groß ist (einige Hundert oder mehr), ist ein photoelektrisches Detektionssystem erwünscht.
Photoelektrische Detektionssysteme schließen alle Systeme ein, die ein elektrisches Signal verwenden, das durch die Lichtintensität an der Stelle moduliert wird. Zum Beispiel sind Photodioden, ladungsgekoppelte Bausteine, Phototransistoren, Photoresistoren und Photomultiplier geeignete photoelektrische Detektionsvorrichtungen. Vorzugsweise sind die Detektoren in einer Anordnung entsprechend der Anordnung von Stellen auf der reaktiven Oberfläche angeordnet, wobei einige Detektoren nicht-Situs-Abschnitten entsprechen. Bevorzugter sind jedoch digitale Darstellungen der reaktiven Oberfläche, so wie solche, die durch eine ladungsgekoppelte Baustein(CCD)-Kamera in Kombination mit verfügbarem Framegrabber und Bildverarbeitungs-Software gemacht werden.
Einige Beispiele für die Verwendung von CCD-Kameras, Framegrabber-Karten, Computer und Bildverarbeitungs-Software sind zu finden in der mit anhängigen, sich im Miteigentum befindlichen US-Anmeldung Serial-Nr. 08/140.838, eingereicht am 21. Oktober 1993, welche hierin durch Literaturverweis eingegliedert wird. Kurz gesagt, die CCD-Kamera oder Videokamera formt ein Bild von der gesamten reaktiven Oberfläche, einschließlich aller Situs- und nicht-Situs-Abschnitte, und speist dieses Bild in eine Framegrabber-Karte eines Computers ein. Das Bild wird durch den Framegrabber in Digitalinformationen umgewandelt, indem jedem Pixel ein numerischer Wert zugeordnet wird. Das Digitalsystem kann binär sein (z.B. hell=1 und dunkel= 0), aber eine 8-Bit-Graustufenskala ist bevorzugt, worin ein numerischer Wert einem Pixel zugewiesen wird, so dass eine Null (0) ein schwarzes Bild und zweihundertfünfundfünfzig (255) ein weißes Bild darstellt, wobei die Zwischenwerte verschiedene Schattierungen von Grau an jedem Pixel darstellen.
Die digitale Information kann auf einem Monitor angezeigt werden, oder sie kann in einem RAM oder in jeder beliebigen Speichervorrichtung zur weiteren Manipulation gespeichert werden. Zwei Arten der Manipulation verdienen Erwähnung. Zuerst kann die digitalisierte Datendatei umgewandelt werden und in eine Software-Zeichenanwendung importiert werden. Das erlaubt das Drucken des Bildes für Archivierungszwecke, wie es mit den Videobildern erfolgte, die in den Beispielen erzeugt wurden, um 4–7, 8A und 9–12 zu produzieren. Eine geeignete Zeichenanwendung ist die Software Publishers PaintBrush (Zsoft Corp., Atlanta, Georgia); auch wenn viele andere Softwarepakete Dateiimporte in einer großen Vielfalt von Dateiformationen einschließlich "roh", TIFF, GIF, PCX, BMP, RLE und viele andere akzeptieren werden oder konvertieren werden. Zum Drucken und für Archivierungsmanipulationen sollten die Konvertierungen und Importe den Inhalt der Daten nicht ändern, so dass eine wahre und getreue Darstellung des Bildes resultiert.
Zweitens kann Bildverarbeitungs-Software verwendet werden, um die Digitalinformationen zu analysieren und die Grenzen oder Konturen von jeder Stelle zu bestimmen und den Mittelwert oder repräsentativen Wert der Intensität an jeder Stelle. Die Intensität korreliert positiv mit der Menge von LSL, die an der Stelle vorhanden ist, und die Menge von LSL, die vorhanden ist, korreliert (negativ oder positiv, je nach Assayformat) mit der Menge von Analytbindungsglied an einer solchen Stelle. Diese Art der Datenmanipulation wird deutlich in den Beispielen 2 und 5 und erzeugte 8B und 8C.
Vielfache Bilder von der gleichen Stelle können akkumuliert werden und über die Zeit analysiert werden. Für repetitive Bilder wird der Wellenleiter oder das TIR-Element entweder mehrmals beleuchtet, oder, was wahrscheinlicher ist, die Lampe bleibt einfach an, bis Bilder zu jeder gewünschten Zeit erstellt worden sind. Durch Vergleich der Lichtstreuung zum ersten Zeitpunkt t₁ mit der Streuung zum zweiten Zeitpunkt t₂ können kinetische Informationen erhalten werden. Diese Kinetischen Informationen sind besonders wertvoll, wenn der Assay zum Ziel hat, quantitativ zu sein, da die Zeit-Abhängigkeit (d.h. die Geschwindigkeit) der Zunahme oder Abnahme der Menge von Lichtstreuung die Pegel der Bindungspaarglieder, die in der Fluid-Probe vorhanden sind, genauer anzeigen kann als die Gesamtmenge von Streuung durch die Reaktion an jedem beliebigen gegebenen Reaktionspunkt mit der Zeit. Zusätzlich kann die Verwendung von vielfachen Bildern einen Datensatz bereitstellen, über welchen die Zunahme an detektiertem Streulicht von einer bekannten Funktion bezüglich der Zeit ist. Messen der Geschwindigkeit der Änderung der Intensität von Streulicht aus einer gegebenen Region der reaktiven Oberfläche über der Zeit stellt eine Reaktionsgeschwindigkeit bereit. Durch Verwendung der Reaktionskinetik wird die Geschwindigkeit mit einem quantitativen Maß der Analytkonzentration in der Probenlösung korreliert. Selbstverständlich können Daten zu mehr als zwei Zeitpunkten gesammelt werden; im Allgemeinen gilt, je mehr Datenpunkte erhalten werden, umso zuverlässiger sind die Kinetik- oder Geschwindigkeitsinformationen.
Ein alternatives Verfahren kann anstelle der Reaktionskinetik verwendet werden. In diesem Verfahren wird die Streulichtintensität über der Zeit integriert. Die durch diese Integration erhaltene Fläche korreliert mit der Konzentration des Analyten in Lösung.
Verschiedene Ausführungsformen der Erfindung werden jetzt durch ausführliche Beispiele gezeigt werden. Die Beispiele sind lediglich veranschaulichend und sind nicht beabsichtigt, die Erfindung zu begrenzen.
BEISPIELE
Beispiel 1. hCG-Immunoassay unter Verwendung von Farbstoff-LAM
A. Bindung von Einfang-SBM an den Wellenleiter
Der hierin verwendete Wellenleiter war ein mit Antikörper beschichtetes Standarddeckglas, kommerziell erhältlich von Corning (Corning, N.Y.; Katalog-Nr. 2, 22 mm im Quadrat). Die reaktive Oberfläche wurde auf dem Glaswellenleiter erzeugt durch Aufbringen einer kleinen Menge (ungefähr 2 μl) einer Antikörperlösung (z.B. Affinitäts-gereinigtes polyklonales Ziegen-Anti-bhCG, 10 mM Phosphat, pH 7,4, 120 mM NaCl) auf eine begrenzte, ungefähr kreisförmige Fläche. Die Antikörperkonzentration in der Vorratslösung war 3,3 mg/ml und konnte direkt verwendet werden, oder der Antikörper konnte 1:10 verdünnt werden in 1%iger Saccharose (1 Gew-% pro Volumen [Gew/Vol] Saccharose gelöst in Wasser) vor der Auftragung. In jedem Fall wurde Antikörper im Überschuss bezüglich der Menge von Protein aufgebracht, das auf der Oberfläche des Wellenleiters zurückgehalten werden konnte, und dieser überschüssige Antikörper wurde mit Wasser abgewaschen und trocken gelassen.
Nach der Immobilisierung des Antikörpers auf dem Wellenleiter wurde die Glasoberfläche mit 0,05% alkalisch behandeltem Casein in Wasser behandelt, um unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Glasoberfläche und dem Material in der Fluid-Probe zu blockieren. Ein ausreichendes Volumen der 0,05%igen Caseinlösung, um die Oberfläche zu bedecken, wurde bei Raumtemperatur 1–5 Minuten lang inkubiert, und dann wurde das Glas mit Wasser unter Verwendung einer Waschflasche gewaschen. Das Casein beschichtete die Oberfläche durch physikalische Adsorption und führte zu einer Oberfläche, die ""Filmbildungswirkung" zeigte, d.h. durch vorsichtiges Aufbringen des Wasserstroms wurde das gesamte Wasser auf der Chipoberfläche durch Gravitationsströmung entfernt.
B. Zusammenbau der Vorrichtung
Eine Vorrichtung zur Aufnahme der Assayreagenzien bestand aus zwei Deckgläsern, wie in 2A–2C gezeigt. Ein Deckglas (der Wellenleiter) enthielt das gebundene Einfang-SBM und das andere Deckglas erzeugte den Kanal, um die Proben-Konjugat-Lösung aufzunehmen. Die zwei Deckgläser wurden versetzt und zusammengehalten durch doppelseitiges Klebeband (Arcare 7710B, Adhesives Research Inc., Glen Rock, Penn), um einen Kanal von 16 mm Breite und ungefähr 75 μm Dicke (der Dicke des doppelseitigen Klebebandes) zu bilden. Der erzeugte Kanal nimmt ungefähr 25 μl Volumen auf.
C. Beleuchtung des Wellenleiters
Der Wellenleiter wurde dann beleuchtet mit einer Lichtquelle bestehend aus einer 150-Watt-Glühbirne mit einer Schlitzöffnung von etwa 2 mm. Der Wellenleiter wurde in den Lichtquellenschlitz so eingesetzt, dass Licht in den 2 mm dicken Licht-empfangenden Rand des Wellenleiters hinein gestrahlt wurde (siehe 2A). Obwohl der Wellenleiter in den Schlitzt bei ungefähr 45° bezüglich der Maske eingesetzt wurde, wurden keine Versuche unternommen, den Winkel des einfallenden Lichts zu optimieren oder Licht zu eliminieren, das auf das Element in weniger als dem kritischen Winkel auftraf.
D. Zugabe von Probe, Licht-streuendem Konjugat, Lichtabsorbierendem Farbstoff
Als nächstes wurde eine Lösung, die Probe, ein Lichtstreuendes Konjugat und einen Licht-absorbierenden Farbstoff enthielt, zu der reaktiven Oberfläche hinzugesetzt, so dass die Einfangstelle bedeckt war. Das Konjugat wurde hergestellt unter Verwendung eines kolloidalen Selenpartikels (US-Patent Nr. 4.954.452 für Yost, et al.) wie folgt: 1 ml Selenkolloid (Konzentration 32 O.D. bei der Wellenlänge des Absorptionsmaximums von 546 nm) wurde 10 Sekunden lang gemischt mit 2,5 μl monoklonalem Anti-ahCG-Antikörper (1 mg/ml, in PBS) und 30 μl 20%igem BSA (20 g/100 ml gelöst in Wasser). Zehn μl des Selenkonjugats wurden dann zu 40 μl hCG-Kalibrator hinzugegeben (hCG-Urine Controls von Abbott Laboratories (Abbott Park, IL, Katalog-Nr. 3A28-02)). Zuletzt wurden 2 bis 3 μl blauer Nahrungsmittelfarbstoff von McCormick (McCormick, Hunt Valley, MD) zu dieser Mischung hinzugegeben, was eine endgültige O.D. von 140–200 bei 630 nm ergab.
E: Detektion des Lichtstreuungssignals
Streulicht abgeleitet von der Wechselwirkung der abklingenden Lichtwelle mit dem Licht-streuenden Marker kann visuell detektiert werden oder mittels eines Standardvideoanalysensystems. In dem Fall visueller Detektion wurde ein Signal in ungefähr 1 Minute beobachtet und wurde innerhalb von 5 Minuten sehr gut sichtbar. Dieses visuelle Signal wurde aufgezeichnet unter Verwendung einer Standard-8-Bit-CCD(charged coupled device=ladungsgekoppelter Baustein)-Kamera (Cohu Modell 4815, Cohu Inc., San Diego, CA). Eine digitale Darstellung des Bildes wurde erzeugt unter Verwendung eines Framegrabbers (Imaging Technology Incorporated, PC VISION plus Framegrabber-Baugruppe; Woburn, Mass) in einem Compac DeskPro 386/20e (Compaq Computer Corporation, Houston, TX). Die digitalisierte Bilddatendatei wurde konvertiert und importiert in die Software Publishers PaintBrush (ZSoft Corp., Atlanta, Georgia), von welcher das Bild auf einem Drucker mit einer Auflösung von 300 dpi ausgedruckt wurde. Das gedruckte Bild ist in 4 gezeigt.
Beispiel 2. Verbesserter hCG-Wellenleiter-Assay
A. Assaykonfiguration
Der Assay wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, jedoch wurde das Selenkonjugat um einen Faktor von 30 folgendermaßen konzentriert. Zehn ml Selenkolloid, O.D. 32 bei 546-nm-Licht, wurde gemischt mit 25 μl Anti-hCG-Antikörper (1 mg/ml, beschrieben in Beispiel 1) und 300 μl 20%igem BSA (siehe Beispiel 1). Die resultierende Lösung wurde in zwei Zentrifugenröhrchen mit 6 ml Kapazität gebracht und unter Verwendung der Zentrifuge Modell Centra-4B (International Equipment Company, Needham Heights, MA) bei 5.000 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert, um das Selenkonjugat zu pelletieren. Etwa 9,66 ml des Überstandes, strohgelb von der Farbe, wurde entfernt, so dass der Selenpellet zurückblieb, tiefrot in der Farbe, ungestört. Die Selenkonjugatpellets wurden wieder suspendiert und kombiniert in den restlichen 0,33 ml Überstand. Die hCG-"Proben" waren die stark positiven, schwach positiven und Null-hCG-Urine-Kontrollen von Abbott Laboratories (Abbott Park, IL; Katalog-Nr. 3A28-02), welche jeweils 250, 50 und 0 mIU/ml hCG enthielten. Zusätzlich wurden 0,5 ml 10%iges Casein (100 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% Gew/Vol Casein) zu jeder der Kontrollen hinzugegeben als ein Blockierungsmittel, um unspezifische Bindung zu verhindern, endgültige Caseinkonzentration 0,9%. Die Wellenleiter wurden wie in Beispiel 1 beschrieben konstruiert, außer dass der polyklonale Anti-hCG-Antikörper auf die Glasoberfläche mit einer Glaskapillaren so aufgetragen wurde, dass die Stelle ein von Hand gezeichnetes "plus"-Symbol war.
Gleiche Volumina von 30-fach konzentriertem Selenkonjugat (oben beschrieben) und Probe wurden gemischt und sofort auf den Wellenleiter aufgetragen. In diesem Fall war die optische Dichte der Konjugat-Proben-Mischung (ungefähr 465 O.D.) so groß, dass Zugabe des Nahrungsmittelfarbstoffes nicht notwendig war, um Hintergrundstreuung zu verhindern. Zusätzlich erhöhte die hohe Konzentration von Konjugat sowohl die Sensitivität als auch die Geschwindigkeit der Wellenleitersignalentwicklung, überraschenderweise ohne eine Erhöhung der Hintergrundstreuung. Die 0-mIU/ml-Probe ergab kein nennenswertes Signal, die 25-mIU/ml-Probe (Endkonzentration) ergab ein sichtbares Signal in etwa 30 Sekunden und die 125-mIU/ml-Probe (Endkonzentration) ergab ein Signal in 5 Sekunden oder weniger. 5, abgebildet, digitalisiert und gedruckt wie in Beispiel 1-D, zeigt ein blasses "Plus"-Signal in 1 Sekunde für die stark positive hCG-Probe (125 mIU/ml). Zeitpunkt=0 zeigt den Wellenleiterkanal, der sich mit der Konjugatlösung füllt; Zeitpunkt=1 Sekunde zeigt die anfängliche, nahezu sofortige Bildung eines sichtbaren Plussignals; und Zeitpunkt=5 und 20 Sekunden zeigen ein deutlich sichtbares Plussignal.
B. Sensitivitätsbestimmung
Wellenleiterchips wurden hergestellt wie oben, jedoch wurde ein einzelner Fleck von Antikörperlösung (siehe Beispiel 1; polyklonaler Anti-hCG-Antikörper mit 1 ml/ml) auf den Wellenleiter aufgetragen, um eine einzelne Stelle auf der reaktiven Oberfläche zu bilden. Um die Sensitivität in diesem System zu bewerten, wurde das Experiment wiederholt mit 6 Proben, durchgeführt bei 0 mIU/ml, und 5 Proben, durchgeführt bei 31 mIU/ml (hCG-Nennkonzentrationen, tatsächliche Messungen wurden nicht durchgeführt). Die Proben und das Konjugat wurden 1 Minute lang gemischt, auf den Wellenleiterkanal aufgetragen und ein Digitalvideobild nach 1 Minute Signalbildung unter Verwendung eines Framegrabbers und einer CCD-Videokamera erfasst. Die Digitalbilder bestehen aus einer Reihe von 8-Bit-Graustufenwerten im Bereich von 0 (schwarz) bis 255 (weiß). Die Digitaldatei besteht somit aus einer Reihe von derartigen Zahlen und jede Zahl entspricht einem einzelnen und eindeutigen Pixelort von dem Bild.
Die resultierenden digitalisierten Daten wurden unter Verwendung der Software Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) analysiert , wobei eine kreisförmige Fläche, ungefähr die Größe eines Signalflecks, verwendet wurde, um die numerischen Graustufenwerte der Bilddatei zu messen. Die Digitalwerte innerhalb der kreisförmigen Messfläche wurden gemittelt, d.h. jeder Wert innerhalb des Kreises wurde addiert und die resultierende Summe wurde dividiert durch die Anzahl solcher Werte. Solche Werte wurden für die Einfangstelle und für einen repräsentativen nicht-Situs-Abschnitt neben der Signalstelle als Hintergrund erhalten. Die Differenz, Signal minus Hintergrund, bildete den Messwert. Die Daten, die für dieses Experiment erhalten wurden, sind in Tabelle 2.1 gezeigt:
TABELLE 2.1
Das mittlere Netto-Signal für das 0-mIE/ml-Experiment ist 6,6±0,7 mIE/ml und für das 31-mIE/ml-Experiment 29,2±7,8 mIE/ml. Daher ergeben, durch lineare Interpolation, 1 Graustufe=1,4 mIE/ml und ein Nettosignalwert gleich 2 Standardabweichungen über dem 0-mIE/ml-Nettosignal, d.h. 1,4, eine Sensitivitätsbewertung von etwa 2 mIE/ml.
Beispiel 3 Thyroid-stimulierendes Hormon(TSH)-Immunoassay
A. Einfangreagenz an die feste Phase binden
Ein Wellenleiter wurde hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1, außer dass die Antikörper-Einfangstelle auf der Glasoberfläche des Wellenleiters erzeugt wurde durch Auftragen einer kleinen Menge (ungefähr 2 μl) einer Antikörperlösung zusammengesetzt aus Affinitäts-gereinigtem polyklonalen Anti-αTSH-Antikörper bei einer Konzentration von 0,25 bis 0,5 mg/ml.
Die Antikörperlösung enthält 1% Saccharose. Der Antikörper wurde trocknen gelassen und wurde dadurch immobilisiert und wurde auf der Glasoberfläche absorbiert, mit HPLC-Wasser gespült und zwangsweise. luftgetrocknet. Im Anschluss an die Immobilisierung wird die Glasoberfläche für weniger als 1 Minute mit 0,05%igem alkalisch behandeltem Casein (100 mM Tris, pH 7,8, 150 mM NaCl) behandelt, um unspezifische Wechselwirkungen zwischen der reaktiven Oberfläche und Material in der Fluid-Probe zu blockieren; und um den Fluss durch den Kanal zu befördern. Das überschüssige Casein wird von dem Träger mit HPLC-Wasser in einer "Filmbildungswirkung" weggespült. Jede verbleibende Flüssigkeit wird durch Zwangsluft getrocknet.
Die Wegwerfvorrichtung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben zusammengesetzt und wurde in die Schlitzöffnung der Lichtquelle eingesetzt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
B. Zugabe von Probe und konzentriertem Licht-streuenden Konjugat
Als nächstes wurde eine Lösung, die Probe und ein Lichtstreuendes Konjugat enthielt, zu der reaktiven Oberfläche hinzugegeben, so dass die Einfangstelle bedeckt war. Lichtstreuendes Konjugat wurde hergestellt durch Markieren eines zweiten Antikörpers (monoklonaler Anti-bTSH; 10 μg/ml) mit Selenkolloid von Beispiel 1, verdünnt auf 16 O.D. (Wellenlänge des Absorptionsmaximums 546 nm). Nach Mischen für 10 Sekunden wurde die Konjugation blockiert mit 0,6%igem BSA und bei 8000 Upm 3–5 Minuten gedreht, um sie einzuengen. Das Konjugat wurde in 1/20tel seines ursprünglichen Volumens resuspendiert. Als nächstes wurden 15 μl Probenpuffer, welcher aus 7,5 μl Selenkonjugat bestand, gemischt mit 7,5 μl 10%igem alkalisch behandeltem Casein (100 mM Tris, pH 7,8, 150 mM NaCl), um eine endgültige Caseinkonzentration von 2,5% zu ergeben, mit 15 μl TSH-Probe gemischt. Die TSH-Proben waren die IMx^® Ultrasensitive hTSH Assay-Kalibratoren A-F, die kommerziell erhältlich sind von Abbott Laboratorien (Katalog-Nr. A3A62-01) und TSH-Gehalte wie folgt haben: A=0, B=0,5, C=2, D=10, E=40 und F=100 μIU/ml. Diese Kalibratoren wurden verwendet bei einer 1:1-Verdünnung mit dem Probenpuffer, was eine Endkonzentration ergab von der Hälfte dessen, was als die Konzentration des Kalibrators angegeben ist.
C. Detektion des Lichtstreuungssignals
Streulicht abgeleitet aus der Wechselwirkung der abklingenden Lichtwelle mit dem Licht-streuenden Marker wurde visuell und mittels eines Standardvideoanalysensystems (siehe z.B. Beispiel 1) detektiert. In dem Fall von visueller Detektion wurde ein Signal in ungefähr 1 Minute beobachtet. 6 wurde abgebildet, digitalisiert und gedruckt wie in Beispiel 1-D. Wie in 6 gezeigt wird ein Signal über dem Hintergrund in 1 Minute deutlich beobachtet. Die bewertete Sensitivität des Systems mit visueller Detektion ist 0,25 μIU/ml TSH. Ein Signal bei 0,125 μIU/ml TSH ist durch das Auge kaum sichtbar und über Null unterscheidbar.
Beispiel 4. DNA-Hybridisierungsassay
A. DNA-Wellenleiterkonstruktion
DNA-Wellenleiter für die Detektion von humanen genetischen Mutationen, die zystische Fibrose verursachen, wurden aus Glasträgern mit 1 cm im Quadrat konstruiert. Oligonukleotide wurden auf dem Glas immobilisiert, um vielfache Einfangstellen in der reaktiven Oberfläche bereitzustellen. Insbesondere wurden neun verschiedene Oligonukleotide, bezeichnet als CAT01 bis CAT09 (Sequenzidentifikationsnummer 1-9) auf die Glasoberfläche des Wellenleiters aufgebracht, um ein 3 × 3-Anordnungsmuster zu bilden, so dass die CAT-Nr. der Position entspricht, die durch die gleiche Ziffer auf einem Standardtastentelefon belegt wird. DNA-Flecken waren etwa 2 mm im Durchmesser und etwa 2 mm voneinander entfernt. Die Sequenz und Mutationsstelle von CAT01 bis CAT09 (Sequenzidentifikationsnummern 1–9) sind in Tabelle 4.1 gezeigt.
TABELLE 4.1
Die humanen genetischen Mutationen werden durch Standardnotation angezeigt. Zum Beispiel zeigt Δ508 eine 3-Basenpaar-Deletion an Position 508 des transmembranen Leitfähigkeitsregulator-Polypeptids für zystische Fibrose an (J. Zielenski, et al. Genomics 10:214-228, 1991). "WT" zeigt die Wildtypus- oder normale Sequenz an dieser Position an. Die Anwesenheit der Aminogruppe an dem 3'-Ende des Oligonukleotids erleichtert die Immobilisierung der DNA auf der Oberfläche des Wellenleiters, jedoch ist der Mechanismus derzeit nicht bekannt. Die DNA-Lösungen wurden hergestellt durch Synthecell (Columbia, MD) und wurden 1:20 in PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7,4) verdünnt und auf die Glasoberfläche des Wellenleiters aufgebracht unter Verwendung des stumpfen Endes eines Bohrmeißels mit ungefähr 1 mm Durchmesser. Die DNA wurde auf einer sauberen Glasoberfläche oder auf einer Glasoberfläche immobilisiert, die zuvor mit 0,05%igem Casein beschichtet wurde; Hybridisierungsergebnisse waren ununterscheidbar. Die Endkonzentrationen von DNA, die auf die Glasoberfläche des Wellenleiters aufgetragen wurden, reichten von einem hohen Wert von 14 μM für CAT02 bis zu einem niedrigen Wert von 0,9 μM für CAT08 und wurden bestimmt durch Vergleich mit der Konzentration des Ausgangsmaterials, das von Synthecell erhalten wurde. Nach Auftragung wurden die DNA-Lösungen auf dem Chip bei Raumtemperatur trocknen gelassen, oder an feuchten Tagen zwischen etwa 35% und 80% relativer Luftfeuchte in einem Inkubatorset bei 50–70°C bis zur Trockenheit (etwa 10 Minuten). Diese Prozedur bildete neun "Flecken" oder Hybridisierungseinfangstellen in der oben beschriebenen 3 × 3-Anordnung.
B. Hybridisierung
Um die DNA-Wellenleiter-Leistung zu bewerten wurden neun zusätzliche Oligonukleotide, CAT21B bis CAT29B (Sequenzidentifikationsnummern 10–18), synthetisiert durch Synthecell, mit einem Biotinmarker an dem 3'-Ende. Die Sequenzen der Test-DNA-Oligonukleotide sind in Tabelle 4.2 aufgelistet.
TABELLE 4.2
Die Oligonukleotide wurden so gestaltet und benannt, dass CAT21B (Sequenzidentifikationsnummer 10) komplementär ist zu CAT01 (Sequenzidentifikationsnummer 1), CAT22B (Sequenzidentifikationsnummer 11) komplementär ist zu CAT02 (Sequenzidentifikationsnummer 2), und so weiter bis CAT29B (Sequenzidentifikationsnummer 18), was komplementär ist zu CAT09 (Sequenzidentifikationsnummer 9). Die Konzentrationen variierten von einem hohen Wert von 473 mM für CAT25B (Sequenzidentifikationsnummer 14) bis zu einem niedrigen Wert von 151 mM für CAT27B (Sequenzidentifikationsnummer 16). Jede der neun DNA-Proben wurde mit 1 μl in 1 ml Hybridisierungspuffer (1% Casein, 10 mM Tris pH 7,4, 15 mM NaCl) verdünnt, und eine unterschiedliche Probe wurde auf jede der neun verschiedenen DNA-Wellenleiter aufgetragen und bei Raumtemperatur (ungefähr 23°C) 5 Minuten lang inkubiert. Die Oberflächen der DNA-Wellenleiter wurden mit PBS unter Verwendung einer Waschflasche gewaschen und dann unter PBS gelagert bis zur Detektion von Hybridisierung.
C. Detektion von Hybridisierung
Hybridisierung der neun unterschiedlichen Biotinmarkierten DNAs wurde in dem Wellenleiter detektiert durch Licht, das von einem Selen-anti-Biotin-Konjugat gestreut wurde. Das Selen-Konjugat wurde hergestellt durch Zugabe von 2,5 μl Anti-Biotin (polyklonaler Kaninchen-Biotin-Antikörper, 1,13 mg/ml in PBS, pH 7,4 – siehe EP 0 160 900 B1 für Mushahwar et al., entsprechend US-Serial-Nr. 08/196.885) zu 1 ml Selenkolloid (Konzentration 32 O.D.) von Beispiel 1, gefolgt durch Zugabe von 30 μl Rinderserumalbumin (Pulver-BSA gelöst in Wasser, um eine 20%ige Lösung (Gew/Vol) zu ergeben). Fünfzig μl der Konjugatlösung wurden auf die Oberfläche des DNA-Wellenleiters aufgetragen und Licht in die Seite des Wellenleiters hinein gerichtet, um Bindung von Selen an die verschiedenen DNA-Einfangstellen zu beobachten. Positive Hybridisierung war an vielen Stellen innerhalb von 1 Minute sichtbar. Die DNA-Wellenleiter wurden mit PBS gewaschen, um überschüssiges Selenkonjugat zu entfernen, beleuchtet, um Wellenleiter-erregte Lichtstreuung zu bewirken, und abgebildet unter Verwendung einer CCD-Kamera Cohu Modell 4815. Die Abbildung wurde digitalisiert und gedruckt wie in Beispiel 1-D und ist in 7 gezeigt. Das vollständige Muster der DNA-Hybridisierung wurde detektiert unter Verwendung des Wellenleiters in einer Einzelbild-Messung und ermöglichte die Bestimmung der DNA-Sequenz des Oligos, das auf den Wellenleiter aufgetragen war. In dem Fall von CAT21B (Sequenzidentifikationsnummer 10) und CAT22B (Sequenzidentifikationsnummer 11) (die ersten zwei Rahmen von 7) war das Hybridisierungsmuster relativ einfach, da es vernachlässigbare Sequenzhomologie von diesen Oligonukleotiden mit anderen DNA-Einfangstellen als CAT01 (Sequenzidentifikationsnummer 1) bzw. CAT02 (Sequenzidentifikationsnummer 2) gab. In dem Fall von CAT23B-CAT29B (Sequenzidentifikationsnummern 12–18) jedoch führt signifikante Sequenzhomologie zu einem komplizierteren Bindungsmuster.
Beispiel 5: Echtzeit-DNA-Schmelzen
A. DNA-Wellenleiterkonstruktion
Wellenleiter, die zwei DNA-Einfangflecken enthielten, wurden hergestellt durch Aufbringen von 1 μl einer Oligonukleotidlösung, die CAT03 (Sequenzidentifikationsnummer 3) und CAT04 (Sequenzidentifikationsnummer 4; 1:20-Verdünnung in PBS) auf das Wellenleiterdeckglas (beschichtet mit 0,05%igem Casein wie in Beispiel 1), gefolgt von Trocknen bei Raumtemperatur. Überschüssige DNA wurde von den zwei Flecken mit Wasser weggespült und dann wurden die Chips bei Raumtemperatur getrocknet. Der DNA-Wellenleiter mit zwei Flecken wurde mit einem anderen Deckglas verbunden, um eine Wegwerfvorrichtung zur Aufnahme der Assayreagenzien wie in Beispiel 1 zu bilden.
B. Hybridisierung und Detektion
Eine Lösung von entweder CAT23B (Sequenzidentifikationsnummer 12) oder CAT24B (Sequenzidentifikationsnummer 13) wurde hergestellt durch Verdünnen von 1 μl in 1 ml 1%igem Casein, 10 mM Tris, pH 7,4, 15 mM NaCl. Die Lösung wurde in den Kanal der Wellenleiterwegwerfvorrichtung durch Kapillarströmung eingeführt und Hybridisierung für einen Zeitraum von 5 Minuten bei Raumtemperatur zugelassen. Die DNA-Lösung wurde aus dem Kanal verdrängt durch Einführung eines Selenkonjugats (Beispiel 4), und der Wellenleiter wurde in die Lichtquelle gebracht, um Detektion zu bewirken. Innerhalb von Sekunden erschienen zwei helle Flecken an den DNA-Einfangstellen, die anzeigten, dass Hybridisierung stattgefunden hatte. Hybridisierung zwischen CAT23B (Sequenzidentifikationsnummer 12) und CAT03 (Sequenzidentifikationsnummer 3) wurde erwartet, ebenso wie Hybridisierung zwischen CAT23B (Sequenzidentifikationsnummer 12) und CAT04 (Sequenzidentifikationsnummer 4), da die Differenz zwischen CAT23B (Sequenzidentifikationsnummer 12) und CAT04 (Sequenzidentifikationsnummer 4) nur ein einzelnes Basenpaar war. Unter Bedingungen von niedriger Temperatur (d.h. Raumtemperatur) und hohem Salzgehalt (15 mM NaCl) gab es keine ausreichende Diskriminierung in dem Hybridisierungsprozess, um eine einzelne Basenfehlpaarung zu unterscheiden.
C. Echtzeitschmelzen
Nach Beobachtung des Raumtemperatur-Hybridisierungsmusters wurde die Temperatur des DNA-Wellenleiters erhöht unter Verwendung eines Heizblocks, der angelegt wurde an die Nicht-Wellenleiter-Seite des Kanals (nämlich das zweite Deckglas, das zum Bilden des Kanals der Wegwerfvorrichtung verwendet wurde). Die Wirkung von Wärme auf das Hybridisierungsmuster wurde in Echtzeit aufgezeichnet unter Verwendung einer CCD-Kamera und eines Videokassettenrecorders (VCR), die auf die Wellenleiteroberfläche fokussiert waren. Die Temperatur des Heizblocks unter dem Wellenleiter (d.h. in Kontakt mit dem zweiten Deckglas, das zum Bilden des Kanals der Wegwerfvorrichtung verwendet wurde) wurde unter Verwendung eines Thermoelementes gemessen. Eine digitale Temperaturausgabe (Watlow, Series 965 Temperaturcontroller, Watlow Controls, Winona, MN) wurde aufgezeichnet durch Abbildung mit der CCD-Kamera. Wenn sich die Temperatur erhöhte, verringerte sich die Intensität der DNA-Stellen, wie von DNA-Schmelzen erwartet wurde. Zusätzlich waren die DNA-Stellen, die die fehlgepaarte hybridisierte DNA enthielten, bei niedrigeren Temperaturen am schmelzen als die Stellen, welche die genau gepaarte DNA enthielten. Als ein Ergebnis war es möglich, zwischen genauer Paarungs- und Einzelbasenfehlpaarungshybridisierung zu unterscheiden und dadurch die Detektion von Einzelbasenmutationen zu ermöglichen. Daten in der Form von Videobildern wurden für jedes 1°C-Inkrement gesammelt und wurden unter Verwendung des Framegrabbers wie zuvor digitalisiert. 8A ist die gedruckte Darstellung der Daten in 5°C-Intervallen, welche zeigten, dass bei etwa 50°C die fehlgepaarten Flecken zu verblassen beginnen, aber die perfekt gepaarten Paare bleiben sichtbar bis etwa 60°C. Die Intensität der Einfangstellen wurde wie in Beispiel 2 gemessen und die mittlere Fleckintensität wurde für jede Temperatur berechnet. 8B ist eine Schmelzkurvenauftragung für CAT23B (Sequenzidentifikationsnummer 12) und 8C ist eine Schmelzkurvenauftragung für CAT24B (Sequenzidentifikationsnummer 13). Schmelztemperaturen werden als der Punkt auf halben Weg zwischen dem oberen und unteren Plateau bewertet.
Beispiel 6. Sensitivität des DNA-Hybridisierungsassays
Die Sensitivität des Wellenleiter-DNA-Hybridisierungsassays wurde bewertet durch Beobachten der Streusignalintensität, wenn die Konzentration von DNA, die auf den Wellenleiter aufgebracht wurde, reduziert wurde. Vier identische DNA-Wellenleiter wurden hergestellt durch Aufbringen von 0,5 μl CAT01 (Sequenzidentifikationsnummer 1) und CAT03 (Sequenzidentifikationsnummer 3), welche getrennt 1:20 in PBS verdünnt wurden. Diese Prozedur wurde 2 mal wiederholt, um eine 2 × 2-Anordnung zu bilden mit CAT01 (Sequenzidentifikationsnummer 1) in der oberen linken und unteren rechten Ecke (wie betrachtet) und mit CAT03 (Sequenzidentifikationsnummer 3) in der oberen rechten und unteren linken Ecke (wie betrachtet). Die DNA-Flecken wurden in einem Ofen bei 70°C 15 Minuten lang getrocknet und ohne Abwaschen von überschüssiger DNA wurde ein zweites Deckglas angebracht, um einen Kanal zu bilden wie in Beispiel 1. CAT23B-DNA (Sequenzidentifikationsnummer 12) wurde verdünnt in Hybridisierungspuffer (1% Casein, 10 mM Tris, pH 7,4, 15 mM NaCl), um Konzentrationen von 39,6 nM, 4 nM und 0,4 nM zu ergeben. Hybridisierungspuffer allein wurde als die vierte Konzentration von DNA (0 nM) verwendet. Dreißig μl von jeder DNA-Lösung wurden in eine der vier Wellenleitervorrichtungen eingeführt. Die DNA-Lösung wurde auf die offene Spalte an einem Ende der Wellenleiter-Wegwerfvorrichtung aufgebracht und der Kanal wurde nachfolgend durch Kapillarwirkung gefüllt. Die Lösungen wurden bei Raumtemperatur 10 Minuten lang inkubiert, um zu ermöglichen, dass sich Hybridisierung ereignet. Als nächstes wurden 30 μl Selen-anti-Biotin-Konjugat (Beispiel 4) auf ein Ende des Kanals aufgebracht und ein Papiertaschentuch an das gegenüberliegende Ende des Kanals angelegt, um die DNA-Lösung zu entfernen und durch Verdrängung den Kanal mit Konjugatlösung zu füllen. Die Hybridisierung wurde detektiert durch Beleuchten des DNA-Wellenleiters, während der Kanal mit Konjugatlösung gefüllt wurde. Nach einer Minute Selenkonjugatbindung wurde eine digitale Abbildung des Wellenleitersignals erfasst unter Verwendung einer Cohu CCD-Kamera mit 30 Einzelbildern pro Sekunde. Das importierte und gedruckte Bild von jedem der vier Chips ist in 9 gezeigt. Spezifische Hybridisierung wurde angezeigt durch die Anwesenheit von Signal allein an den CAT03-Stellen (Sequenzidentifikationsnummer 3). Es gab kein Signal von irgendeiner Stelle auf dem Chip mit 0 nM Probe und kein Signal von den CAT01-Stellen (Sequenzidentifikationsnummer 1) bei irgendeiner Konzentration. Die niedrigste Konzentration von DNA, die in dem Experiment verwendet wurde, 0,4 nM CAT03, wurde durch den Wellenleiter unter diesen Bedingungen detektiert und stellt ein ungefähres Maß für die Sensitivität dar. Als ein typischer Vergleich berichten Pease et al., Proc Natl. Acad. Sci., 91:5022-5026, 1994 die Detektion einer Konzentration von 10 nM von fluoreszierend markierter DNA in Zusammenhang mit einem Laser-Abtastsystem in einer Lesezeit von Minuten anstatt von 1/30 einer Sekunde.
Beispiel 7. Detektion von DNA-Wellenleiter mit hoher Stellendichte
Ein DNA-Wellenleiter mit hoher Stellendichte (definiert als die Anzahl der Stellen/Chip im Unterschied zu der Menge DNA pro Stelle) wurde erzeugt durch mehrfache Aufbringungen eines einzelnen Oligonukleotids, CAT01 (Sequenzidentifikationsnummer 1). Ein Asymtek Automove 102 XYZ-Tisch (Asymtek, Carlsbad, CA) wurde programmiert, um einen Stift mit 150 μm Durchmesser in eine Lösung von CAT01-DNA (1:20-Verdünnung von CAT01 in PBS) einzutauchen und dann die Oberfläche eines mit Casein beschichteten Glaswellenleiters mit 1 cm im Quadrat mit dem Stift zu berühren. Der Prozess wurde 323 wiederholt, um eine 18 × 18-Anordnung von DNA-Flecken mit 150 μm Durchmesser mit 300 μm Abstand voneinander zu bilden (die 18 × 18-Anordnung sollte 324 Flecken aufweisen, jedoch wurde das Setzen von einem Fleck durch einen Programmierfehler ausgelassen, was zu einem "Loch" in dem oberen rechten Abschnitt (wie betrachtet) der Anordnung und somit zu 323 Flecken führte). Die vollständige Anordnung belegte ein Quadrat von ungefähr 5, 1 mm pro Seite (26 mm2) in der Mitte des 1-Zentimeter-Quadrat-Wellenleiters.
Die resultierenden Wellenleiter wurden getrocknet, mit Wasser gewaschen und wieder getrocknet zur Vorbereitung der Hybridisierung. Hybridisierung wurde ausgeführt durch Setzen einer Lösung von CAT21B (Sequenzidentifikationsnummer 10) 1:1000 verdünnt in 1% Casein, 10 mM Tris, pH 7,4, 15 mM NaCl, auf die Oberfläche des Wellenleiters, so dass die gesamte Anordnung 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bedeckt wurde. Die DNA-Lösung wurde von der Oberfläche des Wellenleiters unter Verwendung von PBS gespült, und dann wurde Hybridisierung detektiert durch Bedecken der Oberfläche des Wellenleiters mit Selen-anti-Biotin-Konjugat (Beispiel 4) und Beleuchten des Wellenleiters. Hybridisierung der CAT21B-DNA (Sequenzidentifikationsnummer 10) an die DNA-Anordnung konnte visuell in ungefähr 30–60 Sekunden beobachtet werden. Die überschüssige Konjugatlösung wurde weggewaschen, indem der Chip in eine Schale mit PBS gelegt wurde. Das Hybridisierungsmuster wurde aufgezeichnet durch Digitalisierung eines Videobildes unter Verwendung eines Framegrabbers wie zuvor. Eine gedruckte Darstellung der Bilddaten ist in 10 gezeigt. Wie gesehen werden kann ermöglicht die Wellenleiter-Detektion die gleichzeitige Messung und Differenzierung von allen 323 Hybridisierungsstellen.
Beispiel 8. Dissoziation von hybridisierter DNA durch niedrige Ionenstärke
Ein anderer Vorteil der Wellenleiter-Detektion ist die Wiederverwendbarkeit. In diesem Fall muss die Proben-DNA, die auf eine Oberfläche des Wellenleiters hybridisiert ist, von dem Chip abgezogen werden, ohne dass die auf der Oberfläche fixierte DNA beeinträchtigt wird. Dieses Beispiel zeigt die Nützlichkeit des Wellenleiters, um den Regenerationsprozess zu überwachen.
Zystische Fibrose-DNA-Wellenleiter, die Oligonukleotide CAT01 bis CAT09 (Sequenzidentifikationsnummern 1–9) in einer 3 × 3-Anordnung tragen, wurden konstruiert wie in Beispiel 4 beschrieben, unter Verwendung eines Deckglases Nr. 2 mit 22 mm im Quadrat. Ein Strömungskanal wurde gebildet durch Anbringen eines zweiten Deckglases auf den Wellenleiter unter Verwendung eines Silikon-Klebemittels (Dow Corning, Midland, MI) und zwei Stücke Rohrleitung an gegenüberliegenden diagonalen Ecken, um einen Einlass und einen Auslass bereitzustellen. Die Deckgläser wurden versetzt, wie in Beispiel 1 beschrieben, um die Einführung von Licht in das obere Deckglas hinein zu ermöglichen, welches als der Wellenleiter agierte. Eine Lösung von CAT23B ((Sequenzidentifikationsnummer 12), welches perfekt komplementär ist zu CAT03 (Sequenzidentifikationsnummer 3)) in Hybridisierungspuffer (1% Casein in 10 mM Tris, pH 7,4, 12 mM NaCl) wurde manuell in den Strömungskanal hinein gepumpt unter Verwendung einer Spritze; die Strömung wurde gestoppt und die Hybridisierung wurde 1 Minute lang ausgeführt. Als nächstes wurde eine Lösung von Selen-anti-Biotin-Konjugat (Beispiel 4) in den Kanal gepumpt, die die DNA-Lösung verdrängte; die Strömung wurde gestoppt; und Hybridisierung wurde detektiert durch Wellenleiter-Beleuchtung in der Anwesenheit von Konjugat (wie zuvor). Als nächstes wurde der Kanal gewaschen, indem PBS hineingepumpt wurde, um die Konjugatlösung zu verdrängen.
Zuletzt wurde der hybridisierte DNA-Selen-anti-Biotin-Konjugat-Komplex von der Oberfläche des Wellenleiters dissoziiert, indem reines Wasser in den Kanal hinein gepumpt wurde. Das Wasser erhöht die Stringenzbedingungen, indem es das NaCl verdünnte, um die Ionenstärke zu erniedrigen. Die Dissoziation von der DNA und dem Selen von den Einfangstellen wurde in Echtzeit beobachtet und aufgezeichnet unter Verwendung einer Videokamera und eines VCR. Zu verschiedenen Zeiten des Dissoziationsprozesses wurde das Videobild unter Verwendung eines Framegrabbers erfasst, digitalisiert und gedruckt wie zuvor, und die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Wegen überschüssiger Luftblasen in der Strömungskammer ist nur die obere rechte 2 × 2-Anordnung gezeigt; z.B. vier Stellen entsprechend den Zahlen 2 (CAT02, Sequenzidentifikationsnummer 2), 3 (CAT03, Sequenzidentifikationsnummer 3), 5 (CAT05, Sequenzidentifikationsnummer 5) und 6 (CAT06, Sequenzidentifikationsnummer 6). Wie gesehen werden kann wurde der Prozess der Dissoziation verfolgt von der ersten Einführung von Medium mit geringer Ionenstärke bis zu der endgültigen Entfernung von im Wesentlichen dem gesamten Wellenleitersignal von dem DNA-Chip. Somit ermöglicht der Wellenleiter dem Bediener, den Regenerationsprozess des DNA-Wellenleiters für eine Wiederverwendung zu überwachen. Insbesondere Echtzeitinformationen für die Regeneration können verwendet werden, um die Regenerationszeit zu kontrollieren und dadurch Verarbeitungszeiten in einer diagnostischen Anwendung zu verbessern.
Beispiel 9. Vielfach-Antikörpertest für DNA
Ein Vielfach-Antikörpertest für bi-haptenierte DNA-Produkte wurde gebildet unter Verwendung eines gemeinsamen Biotin-SBM und eines verschiedenen "Einfang-SBM", das für jedes der 3 Oligonukleotidprodukte einzigartig ist. Solche bihaptenierte Oligonukleotide sind repräsentativ für Produkte, die erhalten werden durch eine Multiplex-Ligasekettenreaktion wie offenbart ist in US Serial-Nr. 07/860.702, eingereicht am 31.03.92, veröffentlicht als WO 93/20227 (Abbott Labs). Der Wellenleiter wurde konstruiert durch Immobilisieren von Anti-Fluorescein-, Anti-Adamantan- und Anti-Chinolin-monoklonalen Antikörpern auf ein Mikroskop-Deckglas Corning Nr. 2-Glas. Anti-Adamantan-Antikörper sind offenbart in US-Serial-Nr. 808.508, eingereicht am 17.12.91, und in PCT/US93/05534. Anti-Chinolin-Antikörper sind offenbart in US-Serial-Nr. 07/858.820, eingereicht am 27.03.92, veröffentlicht als WO 93/20094. Alle diese Dokumente sind hierin durch Literaturverweis eingegliedert.
Die Antikörper wurden 1:10 in Wasser verdünnt und ungefähr 0,5 μl auf den Wellenleiter aufgebracht, wobei 3 räumlich getrennte Flecken gebildet wurden, wie in 12a gezeigt, mit Anti-Fluorescein in der oberen rechten Spitze (Fleck Nr. 1), Anti-Adamantan links (Fleck Nr. 2) und Anti-Chinolin unten rechts (Fleck Nr. 3). Ein zweites Deckglas wurde auf den Wellenleiter aufgebracht, um einen Kanal zu bilden (wie in Beispiel 1). Synthetische einzelsträngige DNA, die ein Biotin an dem 3'-Ende und entweder Fluorescein, Adamantan oder Chinolin an dem 5'-Ende enthielt, wurde verdünnt mit 3 μl in 50 μl 1% Casein, 10 mM Tris, pH 7,4, 15 mM NaCl. Die endgültigen DNA-Konzentrationen waren ungefähr 100 nM. Die DNA-Sequenzen sind in Tabelle 9.1 gezeigt.
TABELLE 9.1
Die resultierenden Lösungen wurden mit gleichen Volumina Anti-Biotin-Selen-Konjugat (Beispiel 4) gemischt und in den Wellenleiterkanal durch Kapillarwirkung eingeführt. 12b bis 12d zeigen die Ergebnisse unter Verwendung von DNA-Lösungen, die eine einzelne markierte Spezies enthalten.
Sequenzidentifikationsnummer 21 ist in 12b verwendet, Sequenzidentifikationsnummer 19 ist in 12c verwendet und Sequenzidentifikationsnummer 20 ist in 12d verwendet. In 12e führte eine Mischung von Chinolin-Biotin-DNA und Fluorescein-Biotin-DNA zu detektierbaren Signalen an den zwei entsprechenden Einfangstellen (Flecke 1 und 3). Damit ermöglicht das Wellenleitersystem die gleichzeitige Detektion von vielfachen Analyten in einer Mischung.
Die obigen Beispiele beschreiben mehrere spezifische Ausführungsformen der Erfindung, aber die Erfindung ist nicht beschränkt auf diese speziellen Beispiele. Vielmehr ist die Erfindung, die zu schützen ist, definiert durch die angehängten Ansprüche.
SEQUENZLISTE

Claims

Ein Verfahren zum Detektieren der Anwesenheit oder Menge von einem oder mehreren spezifischen Bindungsanalyten in einer Fluid-Probe, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Bereitstellen einer Wellenleiter-Vorrichtung, wobei die Wellenleiter-Vorrichtung folgendes umfasst: (i) ein transparentes Element, das einen Brechungsindex größer als den der Fluid-Probe hat; (ii) einen Lichtempfangenden Rand; und (iii) eine reaktive Oberfläche, die ein erstes spezifisches Bindungsglied von mindestens einem verwandten Bindungspaar umfasst, das an einer Vielzahl von Stellen auf der Oberfläche des Elements immobilisiert ist, wobei andere nicht-Situs Abschnitte der reaktiven Oberfläche kein spezifisches Bindungsglied daran immobilisiert haben; worin das erste spezifische Bindungsglied durch intermediäre verwandte Bindungspaare, wenn gewünscht, in der Lage ist, zumindest einen Analyten spezifisch zu binden; (b) in Kontakt bringen der reaktiven Oberfläche mit einer Probe, von der vermutet wird, dass sie den einen oder mehrere Analyten enthält, und mit einem Licht-brechenden Marker, der an ein spezifisches Bindungsglied eines zweiten verwandten Bindungspaares angeheftet ist, das durch intermediäre verwandte Bindungspaare, wenn gewünscht, in der Lage ist, diesen einen oder mehrere Analyten spezifisch zu binden, in dem Fall eines Sandwich-Assays, oder das immobilisierte erste spezifische Bindungsglied des ersten verwandten Bindungspaares in dem Fall eines kompetitiven Assays; wobei Lichtbrechende Marker-Komplexe gebildet werden, die an die Vielzahl von Stellen angeheftet sind, im Verhältnis zu der Menge an Analyt in der Probe; (c) Beleuchten des Licht-empfangenden Randes des Wellenleiters mit Licht, das wirksam ist, um eine totale interne Reflexion innerhalb des Wellenleiters zu erzeugen, wodurch gleichzeitig im wesentlichen die gesamte reaktive Oberfläche beleuchtet wird; (d) im wesentlichen gleichzeitiges Sammeln von sichtbar detektierbarem gebrochenen Licht, wenn es welches gibt, von jeder Stelle der Oberfläche; (e) Vergleichen des Grades an Lichtstreuung an jeder Stelle mit entweder (i) dem Grad an Lichtstreuung an einem nicht-Situs-Abschnitt der reaktiven Oberfläche, die kein spezifisches Bindungsglied daran immobilisiert hat, oder (ii) dem Grad an Lichtstreuung an einer anderen Stelle, oder beidem, wodurch die Lichtstreuung an jeder Stelle mit der Anwesenheit oder Menge des Analyten korreliert, für welchen das immobilisierte spezifische Bindungsglied an der Stelle spezifisch ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Verfahren weiterhin ein zweites transparentes Element umfasst, das an das erste Element gebunden ist, um einen zweidimensionalen kapillaren Kanal dazwischen zu bilden, so dass die reaktive Oberfläche in dem Kanal gebildet wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das nach Schritt (e) einen weiteren Schritt umfasst, von Verändern der Bedingungen an der reaktiven Oberfläche der Wellenleiter-Vorrichtung zur Einleitung der Dissoziation des Analyten von dem immobilisierten ersten spezifischen Bindungsglied, und Wiederholen der Schritte (c), (d) und (e) bei den veränderten Bedingungen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Schritt (d) die visuelle Überprüfung der reaktiven Oberfläche auf Lichtstreuung einschließt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1: worin das gebrochene Licht, das in Schritt (d) gesammelt wurde, zu einem ersten Zeitpunkt erreicht wird, t₁; und wobei das Verfahren weiterhin die Wiederholung der Schritte (c) und (d) zumindest einmal umfasst, um gebrochenes Licht zu sammeln, wenn es welches gibt, von den Stellen und nicht-Situs-Abschnitten zu einem zweiten Zeitpunkt, t₂; worin das Vergleichen in Schritt (e) das Vergleichen des Grades an Lichtstreuung zum Zeitpunkt t₁ mit dem Grad an Lichtstreuung zum Zeitpunkt t₂ einschließt und die Differenz über die Zeit in der Streuung von Licht eine kinetische Information liefert, die die Menge an Analyten anzeigt, der an dieser Stelle anwesend ist.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin: das Verfahren für die Bestimmung der Nukleotid-Sequenz eines Segments von unbekannter Nukleinsäure oder für die Unterscheidung zweier nah verwandter Nukleotid-Sequenzen ist; wobei der Analyt eine Nukleinsäure ist und das Bindungsglied eine Anordnung von Oligo-Nukleotiden ist, die unterschiedliche Sequenzen haben zum Hypridisieren mit der Nukleinsäure; wobei das in Kontakt bringen von Schritt (b) unter hypridisierenden Bedingungen auftritt, worin die Nukleinsäure mit einem Licht-brechenden Marker markiert wird, wodurch Lichtbrechende Marker-Komplexe gebildet werden, die an die Stellen der reaktiven Oberfläche angeheftet sind, die ein Oligo-Nukleotid haben, komplementär zu der Sequenz der unbekannten Nukleinsäure; und wobei das Verfahren weiterhin die inkrementelle Erhöhung der stringenten Bedingungen an der reaktiven Oberfläche der Wellenleiter-Vorrichtung umfasst, um die Dissoziation von gebundener Nukleinsäure von den Stellen einzuleiten und das Wiederholen der Schritte (d) und (e) bei jedem Inkrement; wodurch einzelne Basenpaar-Unterschiede zwischen den Oligo-Nukleotiden und der Nukleinsäure von den perfekten Übereinstimmungen unterschieden werden können, durch Unterschiede in den Dissoziations-Eigenschaften.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin: der Schritt (b) das in Kontakt bringen der reaktiven Oberfläche mit einer Lösung von einem Licht-absorbierenden Glied einschließt, das ausreichend ist, um eine wirksame O.D. von mindestens 15 zu gewährleisten; und worin, während dem Schritt (d), die Hintergrund-Streuung durch die Absorption durch das Licht-absorbierende Material minimiert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die spezifischen Bindungsglieder mindestens eines von Antikörpern oder Antigenen sind.