DE69435023T2

DE69435023T2 - Sequenzen der genotype des hepatitis-c-virus sowie ihre verwendung als arzneimittel und diagnostika

Info

Publication number: DE69435023T2
Application number: DE69435023T
Authority: DE
Inventors: Geert Maertens; Lieven Stuyver
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1993-04-27
Filing date: 1994-04-27
Publication date: 2008-09-11
Anticipated expiration: 2014-04-28
Also published as: JPH07508423A; CN1108030A; ES2294779T3; US20030032005A1; JP2004041206A; AU688323B2; CA2662090A1; ATE373093T1; JP2004041207A; EP0984068A3; US7157226B1; AU6722294A; WO1994025601A2; US7195765B2; US20030008274A1; JP2002233389A; US6762024B2; EP0651807A1; JP2002233388A; FI946066A

Description

Die Erfindung betrifft neue Sequenzen von Genotypen des Hepatitis-C-Virus (HCV) und ihre Verwendung als therapeutische und diagnostische Mittel.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, welche der codierenden Region von typspezifischen Sequenzen, entsprechend dem HCV-Typ 3a, entsprechen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung für Diagnose, Prophylaxe und Therapie.
Das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegt, besteht darin, neue Typ-spezifische Sequenzen der Core- und der E1-Regionen von HCV-Typ 3a bereitzustellen. Diese neuen HCV-Sequenzen sind nützlich, um das Vorhandensein von Typ-3a-HCV-Genotypen in einer biologischen Probe zu diagnostizieren. Darüber hinaus kann die Verfügbarkeit dieser neuen typspezifischen Sequenzen die Gesamtempfindlichkeit des HCV-Nachweises erhöhen und sollte sich auch als nützlich für therapeutische Zwecke erweisen.
Man hat festgestellt, dass Hepatitis-C-Viren (HCV) die Hauptursache von Nicht-A,Nicht-B-Hepatitis sind. Die Sequenzen von cDNA-Klonen, welche das vollständige Genom von mehreren Prototypisolaten abdecken, sind bestimmt worden (Kato et al., 1990; Choo et al., 1991; Okamoto et al., 1991; Okamoto et al., 1992). Ein Vergleich dieser Isolate zeigt, dass die Variabilität in den Nukleotidsequenzen verwendet werden kann, um mindestens 2 unterschiedliche Genotypen zu unterscheiden, Typ 1 (HCV-1 und HCV-J) und Typ 2 (HC-J6 und HC-J8) mit einer durchschnittlichen Homologie von etwa 68%. Innerhalb jedes Typs existieren mindestens zwei Subtypen (z. B. vertreten von HCV-1 und HCV-J), welche eine durchschnittliche Homologie von etwa 79% aufweisen. HCV-Genome, welche dem gleichen Subtyp angehören, zeigen durchschnittliche Homologien von mehr als 90% (Okamoto et al., 1992). Allerdings zeigte die partielle Nukleotidsequenz der NS5-Region der HCV-T-Isolate höchstens 67% Homologie mit den früher veröffentlichten Sequenzen, was auf die Existenz noch eines anderen HCV-Typs hinweist (Mori et al., 1992). Teile der 5'-untranslatierten Region (UR), der Kern-, NS3- und NS5-Regionen dieses Typs 3 sind veröffentlicht worden, was ferner die ähnlichen evolutionären Distanzen zwischen den 3 Hauptgenotypen und ihren Subtypen belegt (Chan et al., 1992).
Die Identifizierung von Typ-3a-Genotypen in klinischen Proben kann mittels PCR mit typ-spezifischen Primern für die NS5-Region erreicht werden. Allerdings ist das Ausmaß, zu welchem dies erfolgreich sein wird, in großem Maße von der Sequenzvariabilität und von dem im Serum vorhandenen Virus-Titer abhängig. Deshalb kann vorhergesagt werden, dass eine routinemäßige PCR im offenen Leseraster, speziell für den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Typ 3a und/oder Gruppe-V-Genotypen (Cha et al., 1992) nicht erfolgreich sein wird. Ein neues Typisierungssystem (LiPA), welches auf der Variation in der hoch konservierten 5'-UR basiert, erwies sich als nützlicher, weil die 5 Haupt-HCV-Genotypen und ihre Subtypen bestimmt werden können (Stuyver et al., 1993). Die Selektion von Hochtiter-Isolaten ermöglicht es, PCR-Fragmente zur Klonierung mit lediglich 2 Primern zu erhalten, wohingegen eine verschachtelte PCR erfordert, dass 4 Primer an die unbekannten Sequenzen des neuen Typs 3a passen.
Neue Sequenzen der 5'-untranslatierten Region (5'UR) sind von Bukh et al. (1992) aufgelistet worden. Für einige von diesen ist kürzlich die E1-Region beschrieben worden (Bukh et al., 1993). Isolate mit ähnlichen Sequenzen in der 5'UR zu einer Gruppe von Isolaten, welche DK12 und HK10, beschrieben von Bukh et al. (1992), und E-b1 bis E-b8, beschrieben und klassifiziert als Typ 3 von Chan et al. (1991), einschließt, sind in der 5'UR, dem carboxyterminalen Teil von E1 und in der NS5-Region als Gruppe IV von Cha et al. (1992; WO 92/19743 ) berichtet und beschrieben worden, und wurden auch von den Erfindern dieser Patentanmeldung (Stuyver et al., 1993) in der 5'UR für das Isolat BR56 beschrieben und als Typ 3 klassifiziert.
Genomische partielle HCV-Sequenzen, welche den 5'UTR-, Core-, E1- und NS5-Regionen von HCV angehören, sind berichtet und als Genotypen GI bis GV klassifiziert worden ( WO 92/19743 ). Partielle Nukleinsäure- und Proteinsequenzen, welche den Core-, NS3- und NS5-Regionen von HCV angehören, aus dem HCV-Subtyp 3a werden in der WO 93/10239 beschrieben. NS5-Sequenzen der HCV-Stämme Ta und Tb und des HCV-Stamms Tr sind von Mori et al. (1992) und Chayama et al. (1993) aufgelistet worden.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, neue HCV-Nukleotid- und Aminosäuresequenzen bereitzustellen, welche den Nachweis von HCV-Infektion ermöglichen.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, neue Nukleotid- und Aminosäure-HCV-Sequenzen bereitzustellen, welche die Klassifikation von infizierten biologischen Fluiden in unterschiedliche serologische Gruppen ermöglichen, die eindeutig mit Typen und Subtypen auf Genom-Ebene verknüpft sind.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, neue Nukleotid- und Aminosäure-HCV-Sequenzen bereitzustellen, welche die insgesamte HCV-Nachweisrate verbessern.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, neue, für den Entwurf von HCV- Impfstoffzusammensetzungen nützliche, HCV-Sequenzen bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche aus Antikörpern besteht, die gegen die Polypeptide erzeugt wurden, die von diesen neuen HCV-Sequenzen codiert werden, für Therapie oder Diagnose.
Die vorliegende Erfindung betrifft genauer gesagt eine Zusammensetzung, umfassend oder bestehend aus mindestens einer Polynukleinsäure, welche mindestens 5 und vorzugsweise 8 oder mehr fortlaufende Nukleotide enthält, gewählt aus mindestens einer der folgenden HCV-Sequenzen:

– eine genomische Sequenz von HCV-Typ 3a, im Genaueren in der folgenden Region:
– die Region, welche die Positionen 417 bis 957 der Core/E1-Region von HCV-Subtyp 3a überspannt,

Es ist anzumerken, dass der Nukleotidunterschied in den Polynukleinsäuren der Erfindung einen Aminosäureunterschied in den von den Polynukleinsäuren codierten, entsprechenden Aminosäuresequenzen beinhalten kann, oder nicht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die mindestens eine Polynukleinsäure umfasst oder enthält, welche ein HCV-Polyprotein codiert, wobei die Polynukleinsäure mindestens 5, vorzugsweise mindestens 8 Nukleotide enthält, entsprechend wenigstens einem Teil einer HCV-Nukleotidsequenz, welche ein HCV-Polyprotein codiert, und wobei das HCV-Polyprotein in seiner Sequenz mindestens einen der folgenden Aminosäurereste enthält: I186, H187, A190, S191, W194, Q231, A237, M280, Q299, L308, L313, wobei die Schreibweise zusammengesetzt ist aus einem Buchstaben, welcher den Aminosäurerest mittels seines Ein-Buchstaben-Codes repräsentiert, und einer Zahl, welche die Aminosäurenummerierung gemäß Kato et al., 1990, repräsentiert.
Jeder der oben erwähnten Reste kann in einer Beliebigen der 2, 5, 7, 11 oder 12 gefunden werden, welche die neuen Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung, aligniert mit bekannten Sequenzen von anderen Typen oder Subtypen von HCV, für die Core-, E1-, E2-, NS3-, NS4- und NS5-Regionen zeigen.
Im Genaueren enthält eine Polynukleinsäure, welche in der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ist, mindestens 5, vorzugsweise 8 oder mehr fortlaufende Nukleotide, entsprechend einer Sequenz von fortlaufenden Nukleotiden, welche aus mindestens einer der HCV-Sequenzen gewählt wird, die die folgenden neuen HCV-Aminosäuresequenzen codieren:

– neue Sequenzen, welche die Aminosäurepositionen 1 bis 319 der Core/E1-Region von HCV-Typ 3a überspannen, wie gezeigt in der 5.

Unter Anwendung des oben erwähnten LiPA-Systems wurden brasilianische Blutspender mit einem hohen Titer an Hepatitis-C-Virus vom Typ 3, Patienten aus Gabun mit einem hohen Titer an Hepatitis-C-Virus vom Typ 4 und ein belgischer Patient mit einer Hochtiter-Infektion mit HCV vom Typ 5 ausgewählt. Nukleotidsequenzen in den Core-, E1-, NS5- und NS4-Regionen, über welche früher noch nicht berichtet worden ist, wurden im Rahmen der Erfindung analysiert. Codierende Sequenzen (mit Ausnahme der Core- bzw. Kern-Region) von jedwedem Typ-4-Isolat sind erstmalig in der vorliegenden Erfindung berichtet. Die NS5b-Region wurde ebenfalls für die neuen Typ-3-Isolate analysiert. Nachdem die NS5b-Sequenzen bestimmt worden waren, war ein Vergleich mit den von Mori et al. (1992) beschriebenen Subtypen Ta und Tb möglich, und die Typ-3-Sequenzen konnten als Typ-3a-Genotypen identifiziert werden. Die neuen Typ-4-Isolate segregierten zu 10 Subtypen, basierend auf Homologien, die in den NS5- und E1-Regionen erhalten wurden. Die neuen Sequenzen vom Typ 2 und 3 konnten ebenfalls von früher beschriebenen Typ-2- oder -3-Subtypen aus in Belgien und den Niederlanden gewonnenen Seren unterschieden werden.
Der Begriff "Polynukleinsäure" bezieht sich auf eine einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäuresequenz, welche mindestens 5 fortlaufende Nukleotide bis zur vollständigen Nukleotidsequenz (z. B. mindestens 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder mehr fortlaufende Nukleotide) enthalten kann. Eine Polynukleinsäure, welche eine Länge von bis zu etwa 100 Nukleotiden aufweist, wird ebenfalls häufig als ein Oligonukleotid bezeichnet. Eine Polynukleinsäure kann aus Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden, Nukleotidanalogen oder modifizierten Nukleotiden bestehen, oder kann für therapeutische Zwecke angepasst worden sein. Eine Polynukleinsäure kann des Weiteren einen doppelsträngigen cDNA-Klon umfassen, welcher für Klonierungszwecke oder für eine In-vivo-Therapie oder zur Prophylaxe verwendet werden kann.
Der Begriff "Polynukleinsäure-Zusammensetzung" bezieht sich auf eine beliebige Art von Zusammensetzung, welche im Wesentlichen die Polynukleinsäuren umfasst. Die Zusammensetzung kann von diagnostischer oder therapeutischer Natur sein.
Der Ausdruck "Nukleotide, entsprechend zu" bezieht sich auf Nukleotide, welche homolog oder komplementär zu einer angegebenen Nukleotidsequenz oder -region innerhalb einer spezifischen HCV-Sequenz sind.
Der Begriff "codierende Region" entspricht der Region des HCV-Genoms, welche das HCV-Polyprotein codiert. Tatsächlich umfasst er das vollständige Genom mit Ausnahme der 5'-untranslatierten Region und der 3'-untranslatierten Region.
Der Begriff "HCV-Polyprotein" bezieht sich auf das HCV-Polyprotein des HCV-J-Isolates (Kato et al., 1990). Der Adeninrest an der Position 330 (Kato et al., 1990) ist der erste Rest des ATG-Codons, welches das lange HCV-Polyprotein von 3010 Aminosäuren in HCV-J und anderen Isolaten vom Typ 1b und von 3011 Aminosäuren in HCV-1 und anderen Isolaten vom Typ 1a und von 3033 Aminosäuren in den Typ-2-Isolaten HC-J6 und HC-J8 (Okamoto et al., 1992) initiiert.

Dieses Adenin wird in der vorliegenden Erfindung auf der Nukleinsäureebene als Position 1 bezeichnet, und dieses Methionin wird als Position 1 auf dem Aminosäureniveau bezeichnet. Da Typ-1a-Isolate 1 Extra-Aminosäure in der NS5a-Region enthalten, besitzen codierende Sequenzen von Typ 1a und 1b eine identische Nummerierung in der Core-, E1-, NS3- und NS4-Region, aber werden sich in der NS5b-Region unterscheiden, wie es in der Tabelle 1 angegeben ist. Typ-2-Isolate besitzen 4 Extra-Aminosäuren in der E2-Region und 17 oder 18 Extra-Aminosäuren in der NS5-Region im Vergleich zu Typ-1-Isolaten und werden sich hinsichtlich der Nummerierung von Typ-1-Isolaten in der NS3/4-Region und NS5b-Regionen unterscheiden, wie es in der Tabelle 1 angegeben wird. TABELLE 1

	Region	Positionen, beschrieben in der vorliegenden Erfindung*	Positionen, beschrieben für HCV-J (Kato et al., 1990)	Positionen, beschrieben für HCV-1 (Choo et al., 1991)	Positionen, beschrieben für HC-J6, HC-J8 (Okamoto et al., 1992)
Nukleotide	NS5b	8023/8235 7932/8271	8352/8564 8261/8600	8026/8238 7935/8274	8433/8645 6342/8681
Nukleotide	NS3/4	4664/5292 4664/4730 4892/5292 3856/4209 4936/5292	4993/5621 4993/5059 5221/5621 4185/4528 5265/5621	4664/5292 4664/4730 4892/5292 3856/4209 4936/5292	5017/5645 5017/5083 5245/5645 4209/4762 5289/5645
		codierende Region der vorliegenden Erfindung	330/9359	1/9033	342/9439
Aminosäuren	NS5b	2675/2745 2645/2757	2675/2745 2645/2757	2676/2746 2646/2758	2698/2768 2668/2780
Aminosäuren	NS3/4	1556/1764 1286/1403 1646/1764	1556/1764 1286/1403 1646/1764	1556/1764 1286/1403 1646/1764	1560/1768 1290/1407 1650/1768
Tabelle 1: Vergleich des HCV-Nukleotid- und Aminosäure-Nummerierungssystems, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde (*), mit der Nummerierung, welche für andere Prototypisolate verwendet wurde. Zum Beispiel gibt 8352/8564 die Region an, bezeichnet durch die Nummerierung vom Nukleotid 8352 bis Nukleotid 8564, wie beschrieben von Kato et al. (1990). Da das Nummerierungssystem der vorliegenden Erfindung bei der Polyprotein-Initiationsstelle beginnt, müssen die 329 Nukleotide der 5'-untranslatierten Region, beschrieben von Kato et al. (1990), subtrahiert werden, und die entsprechende Region wird von Nukleotid 8023 ("8352-329") bis 8235 ("8564-329") nummeriert.

Der Begriff "HCV-Typ" entspricht einer Gruppe von HCV-Isolaten, bei denen das vollständige Genom mehr als 74% Homologie auf dem Nukleinsäureniveau zeigt, oder bei denen die NS5-Region zwischen den Nukleotidpositionen 7932 und 8271 mehr als 74% Homologie auf dem Nukleinsäureniveau zeigt, oder bei denen das vollständige HCV-Polyprotein mehr als 78% Homologie auf dem Aminosäureniveau zeigt, oder bei denen die NS5-Region zwischen den Aminosäuren an Positionen 2645 und 2757 mehr als 80% Homologie auf der Aminosäureebene zeigt, zu Polyproteinen der anderen Isolate der Gruppe, wobei die Nummerierung beim ersten ATG-Codon oder ersten Methionin des langen HCV- Polyproteins des Isolates HCV-J (Kato et al., 1990) beginnt. Isolate, welche verschiedenen Typen von HCV angehören, zeigen Homologien, über das vollständige Genom hinweg, von weniger als 74% auf der Nukleinsäureebene und weniger als 78% auf der Aminosäureebene. Isolate, welche demselben Typ angehören, zeigen üblicherweise Homologien von etwa 92 bis 95% auf der Nukleinsäureebene und 95 bis 96% auf dem Aminosäureniveau, wenn sie dem gleichen Subtyp angehören, und diejenigen, welche dem gleichen Typ aber unterschiedlichen Subtypen angehören, zeigen vorzugsweise Homologien von etwa 79% auf der Nukleinsäureebene und 85–86% auf der Aminosäureebene.
Stärker bevorzugt wird die Definition von HCV-Typen aus der Klassifizierung von HCV-Isolaten gemäß ihren Nukleotid-Distanzen gefolgert, welche wie nachstehend ausführlich angegeben berechnet werden:

(1) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der NS5b-Region zwischen den Nukleotiden 7935 und 8274 (Choo et al., 1991) oder 8261 und 8600 (Kato et al., 1990) oder 8342 und 8681 (Okamoto et al., 1991), zeigen Isolate, welche demselben HCV-Typ angehören, Nukleotiddistanzen von weniger als 0,34, üblicherweise weniger als 0,33 und noch üblicher von weniger als 0,32, und Isolate, welche demselben Subtyp angehören, zeigen Nukleotiddistanzen von weniger als 0,135, üblicherweise weniger als 0,13 und noch üblicher von weniger als 0,125, und folglich zeigen Isolate, welche dem gleichen Typ aber unterschiedlichen Subtypen angehören, Nukleotiddistanzen im Bereich von 0,135 bis 0,34, üblicherweise im Bereich von 0,1384 bis 0,2477 und noch üblicher im Bereich von 0,15 bis 0,32, und Isolate, welche unterschiedlichen HCV-Typen angehören, zeigen Nukleotiddistanzen von mehr als 0,34, üblicherweise größer als 0,35 und noch üblicher größer als 0,358, wobei sie noch üblicher im Bereich von 0,1384 bis 0,2977 liegen,
(2) basierend auf einer phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der Core/E1-Region zwischen den Nukleotiden 378 und 957 zeigen Isolate, welche dem gleichen HCV-Typ angehören, Nukleotiddistanzen von weniger als 0,38, üblicherweise weniger als 0,37 und noch üblicher weniger als 0,364, und Isolate, welche dem gleichen Subtyp angehören, zeigen Nukleotiddistanzen von weniger als 0,17, üblicherweise weniger als 0,16 und noch üblicher weniger als 0,15, noch üblicher weniger als 0,135, noch üblicher weniger als 0,134, und folglich zeigen Isolate, welche dem gleichen Typ aber unterschiedlichen Subtypen angehören, Nukleotiddistanzen im Bereich von 0,15 bis 0,38, üblicherweise im Bereich von 0,16 bis 0,37, und noch üblicher im Bereich von 0,17 bis 0,36, noch üblicher im Bereich von 0,133 bis 0,379, und Isolate, welche verschiedenen HCV-Typen angehören, zeigen Nukleotiddistanzen größer als 0,34, 0,35, 0,36, üblicherweise mehr als 0,365 und noch üblicher größer als 0,37,
(3) basierend auf der phylogenetischen Analyse von Nukleinsäuresequenzen in der NS3/NS4-Region zwischen den Nukleotiden 4664 und 5292 (Choo et al., 1991) oder zwischen den Nukleotiden 4993 und 5621 (Kato et al., 1990) oder zwischen den Nukleotiden 5017 und 5645 (Okamoto et al., 1991), zeigen Isolate, welche demselben HCV-Typ angehören, Nukleotiddistanzen von weniger als 0,35, üblicherweise weniger als 0,34 und noch üblicher weniger als 0,33, und Isolate, welche dem gleichen Subtyp angehören, zeigen Nukleotiddistanzen von weniger als 0,19, üblicherweise weniger als 0,18 und noch üblicher weniger als 0,17, und folglich zeigen Isolate, welche dem gleichen Typ aber verschiedenen Subtypen angehören, Nukleotiddistanzen im Bereich von 0,17 bis 0,35, üblicherweise im Bereich von 0,18 bis 0,34 und noch üblicher im Bereich von 0,19 bis 0,33, und Isolate, welche unterschiedlichen HCV-Typen angehören, zeigen größere Nukleotiddistanzen als 0,33, üblicherweise größer als 0,34 und noch üblicher größer als 0,35.

Region	Core/E1 579 bp	E1 384 bp	NS5B 340 bp	NS5B 222 bp
Isolate*	0,0017–0,1347 (0,0750±0,0245)	0,0026–0,2031 (0,0969±0,0289)	0,0003–0,1151 (0,0637±0,0229)	0,000–0,1323 (0,0607±0,0205)
Subtypen*	0,1330–0,3794 (0,2786±0,0363)	0,1645–0,4869 (0,3761±0,0433)	0,1384–0,2977 (0,2219±0,0341)	0,177–0,3538 (0,2391±0,0399)
Typen*	0,3479–0,6306 (0,4703±0,0525)	0,4309–0,9561 (0,6308±0,0928)	0,3581–0,6670 (0,4994±0,0495)	0,3457–0,7471 (0,5295±0,0627)
*Mittels des PHYLIP-Programms DNADIST erzeugte Figuren sind als Minimum zu Maximum ausgedrückt (Mittelwert±Standardabweichung). Phylogenetische Distanzen für Isolate, welche dem gleichen Subtyp ("Isolate"), verschiedenen Subtypen des gleichen Typs ("Subtypen") und verschiedenen Typen ("Typen") angehören, sind angegeben.

In einer vergleichenden phylogenetischen Analyse von verfügbaren Sequenzen wurden Bereiche für molekulare evolutionäre Distanzen für unterschiedliche Regionen des Genoms berechnet, basierend auf 19781 paarweisen Vergleichen mittels des DNA-DIST-Programms des "Phylogeny-Inference"-Pakets PHYLIP, Version 3.5C (Felsenstein, 1993). Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt und geben an, dass obwohl der Großteil von in jeder Region erhaltenen Distanzen mit der Klassifikation eines bestimmten Isolates übereinstimmt, lediglich die Bereiche, welche in der 340 bp großen NS5B-Region erhalten wurden, nicht-überlappend und daher schlüssig sind. Wie es in der vorliegenden Erfindung ausgeführt wurde, wird es jedoch bevorzugt, Sequenzinformation aus mindestens 2 Regionen zu erhalten, bevor eine letztendliche Klassifizierung eines gegebenen Isolates statfindet.
Die Zuweisung einer Zahl an die unterschiedlichen Typen von HCV und die Nomenklatur der HCV-Typen basieren auf der chronologischen Entdeckung der unterschiedlichen Typen. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Nummerierungssystem könnte gemäß internationalen Übereinkommen oder Richtlinien noch fluktuieren. Zum Beispiel könnte der "Typ 4" zu "Typ 5" oder "Typ 6" verändert werden.
Der Begriff "Subtyp" entspricht einer Gruppe von HCV-Isolaten, bei denen das vollständige Polyprotein eine Homologie von mehr als 90% sowohl auf der Ebene der Nukleinsäure als auch Aminosäure zeigt, oder bei denen die NS5-Region zwischen den Nukleotidpositionen 7932 und 8271 eine Homologie von mehr als 90% auf der Nukleinsäureebene zu den entsprechenden Teilen der Genome der anderen Isolate der gleichen Gruppe zeigt, wobei die Nummerierung mit dem Adeninrest des Initiationscodons des HCV-Polyproteins beginnt. Isolate, welche dem gleichen Typ aber unterschiedlichen Subtypen von HCV angehören, zeigen Homologien von mehr als 74% auf der Nukleinsäureebene und mehr als 78% auf der Aminosäureebene.
Der Begriff "BR36-Subgruppe" betrifft eine Gruppe von Typ-3a-HCV-Isolaten (BR36, BR33, BR34), welche zu 95%, vorzugsweise 95,5%, am stärksten bevorzugt 96% homolog zu den Sequenzen, wie repräsentiert in SEQ ID Nr. 1, 3, 5, 7, 9, 11, in der NS5b-Region von Position 8023 bis 8235 sind.
Es versteht sich, dass extrem variable Regionen, wie die E1-, E2- und NS4-Regionen, niedrigere Homologien als die durchschnittliche Homologie des vollständigen Genoms des Polyproteins aufzeigen.

Unter Anwendung dieser Kriterien können HCV-Isolate in mindestens 6 Typen klassifiziert werden. Mehrere Subtypen können in den Typen 1, 2, 3 und 4 deutlich unterschieden werden: 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 2d, 3a, 3b, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i und 4j, basierend auf Homologien der 5'UR und codierenden Regionen, einschließlich des Teils von NS5 zwischen den Positionen 7932 und 8271. Ein Überblick der meisten berichteten Isolate und ihrer vorgeschlagenen Klassifizierung gemäß dem Typisierungssystem der vorliegenden Erfindung sowie anderer vorgeschlagener Klassifizierungen wird in der Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 HCV-KLASSIFIZIERUNG

	OKAMOTO	MORI	NAKAO	CHA	PROTOTYP
1a	I	I	Pt	GI	HCV-1, HCV-H, HC-J1
1b	II	II	KI	GII	HCV-J, HCV-BK, HCV-T, HC-JK1, HC-J4, HCV-CHINA
1c					HC-G9
2a	III	III	K2a	GIII	HC-J6
2b	IV	IV	K2b	GIII	HC-J8
2c					SB3, ARG6, ARG8, I10, T983
2d					NE92
3a	V	V	K3	GIV	E-b1, Ta, BR36, BR33, HD10, NZL1
3b		VI	K3	GIV	HCV-TR, Tb
3c					BE98
4a					Z4, GB809-4
4b					Z1
4c					GB116, GB358, GB215, Z6, Z7
4d					DK13
4e					GB809-2, CAM600, CAM736
4f					CAM622, CAM627
4g					GB549
4h					GB438
4i					CAR4/1205
4j					CAR1/501
4k					EG29
5a				GV	SA3, SA4, SA1, SA7, SA11, BE95
6a					HK1, HK2, HK3, HK4

Der Begriff "Komplement" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, welche komplementär zu einer angegebenen Sequenz ist und welche in der Lage ist, mit den angegebenen Sequenzen zu hybridisieren.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann viele Kombinationen umfassen. Als Beispiel kann die Zusammensetzung der Erfindung Folgendes umfassen:

– zwei (oder mehr) Nukleinsäuren aus derselben Region oder,
– zwei Nukleinsäuren (oder mehr) aus jeweiligen unterschiedlichen Regionen, für das gleiche Isolat oder für unterschiedliche Isolate,
– oder Nukleinsäuren aus den gleichen Regionen und aus mindestens zwei unterschiedlichen Regionen (für das gleiche Isolat oder für unterschiedliche Isolate).

Die vorliegende Erfindung betrifft genauer gesagt eine Polynukleinsäure-Zusammensetzung, wie oben definiert, worin die Polynukleinsäure einer Nukleotidsequenz entspricht, welche aus einer Beliebigen der folgenden genomischen Sequenzen vom HCV-Typ 3a ausgewählt ist:

– eine genomische HCV-Sequenz vom HCV-Typ 3a mit einer Homologie von wenigstens 76%, am stärksten bevorzugt mehr als 78% oder darüber, zu einer Beliebigen der Sequenzen, wie repräsentiert in SEQ ID Nr. 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 oder 27 (HD10-, BR36- oder BR33-Sequenzen) in der Region, welche die Positionen 417 bis 957 in der Core/E1-Region überspannt, wie gezeigt in der 4;
– eine genomische HCV-Sequenz von HCV-Typ 3a, aufweisend eine Homologie von mindestens 76%, stärker bevorzugt 78% oder darüber, zu einer Beliebigen der Sequenzen, wie repräsentiert in SEQ ID Nr. 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 oder 27 (HD10-, BR36- oder BR33-Sequenzen) in der Region, welche die Positionen 574 bis 957 in der E1-Region überspannt, wie gezeigt in der 4.

Präferenziell geben die oben erwähnten genomischen HCV-Sequenzen Sequenzen aus den codierenden Regionen aller oben erwähnten Sequenzen an.
Gemäß dem Nukleotiddistanz-Klassifizierungssystem (wobei die Nukleotiddistanzen wie oben erläutert berechnet werden) werden die Sequenzen der Zusammensetzung ausgewählt aus:

– einer genomischen HCV-Sequenz vom HCV-Typ 3a, welche dadurch charakterisiert ist, dass sie eine Nukleotiddistanz von weniger als 0,3, vorzugsweise weniger als 0,26, am stärksten bevorzugt weniger als 0,22, zu einer Beliebigen der Sequenzen, wie repräsentiert in SEQ ID Nr. 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 oder 27 in der Region aufweist, welche die Positionen 417 bis 957 in der Core/E1-Region überspannt, wie gezeigt in der 4;
– einer genomischen HCV-Sequenz vom HCV-Typ 3a, welche dadurch charakterisiert ist, dass sie eine Nukleotiddistanz von weniger als 0,35, vorzugsweise weniger als 0,31, am stärksten bevorzugt weniger als 0,27, zu einer Beliebigen der Sequenzen, wie repräsentiert in SEQ ID Nr. 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 oder 27 in der Region aufweist, welche die Positionen 574 bis 957 in der Core/E1-Region überspannt, wie gezeigt in der 4.

In der vorliegenden Anmeldung werden die E1-Sequenzen, codierend die antigene Ektodomäne des E1-Proteins, welche nicht mit den carboxyterminalen Signal-Anker-Sequenzen von E1 überlappt, die von Cha et al. offenbart wurden (1992; WO 92/19743 ), für 4 unterschiedliche Isolate offenbart: BR33, BR34, BR36, HCC153 und HD10, welche alle dem Typ 3a angehören (SEQ ID Nr. 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27).
Ebenfalls innerhalb der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind Sequenzvarianten der Polynukleinsäuren, wie ausgewählt aus Beliebigen der Nukleotidsequenzen, wie angegeben in einer Beliebigen der oben erwähnten SEQ-ID-Nummern, wobei die Sequenzvarianten entweder Deletionen und/oder Insertionen von einem oder mehreren Nukleotiden, hauptsächlich an den Extremitäten von Oligonukleotiden (entweder 3' oder 5'), oder Substitutionen von einigen nicht-essenziellen Nukleotiden durch andere (einschließlich modifizierten Nukleotiden und/oder Inosin) enthalten, wobei zum Beispiel eine Typ-1- oder -2-Sequenz zu einer Typ-3-Sequenz modifiziert werden könnte durch Ersetzen einiger Nukleotide der Sequenz vom Typ 1 oder 2 mit typ-spezifischen Nukleotiden vom Typ 3, wie es in der 1 (NS5-Region), 3 (Core-Region), 4 (Core/E1-Region), 6 und 10 (NS3/NS4-Region) gezeigt wird.
Polynukleinsäuresequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung, welche homolog zu den Sequenzen, wie repräsentiert von einer SEQ ID Nr., sind, können gemäß einer Beliebigen der im Fachgebiet bekannten Techniken charakterisiert und isoliert werden, wie Amplifikation mittels typ- oder subtyp-spezifischen Primern, Hybridisierung mit typ- oder subtyp-spezifischen Sonden unter mehr oder weniger stringenten Bedingungen, serologischen Screeningverfahren (siehe Beispiele 4 und 11) oder mittels des LiPA-Typisierungssystems.
Polynukleinsäuresequenzen der Genome, welche oben angegeben wurden, aus noch nicht in den vorliegenden Beispielen, Figuren und der Sequenzauflistung dargelegten Regionen können durch eine Beliebige der im Fachgebiet bekannten Techniken erhalten werden, wie Amplifikationstechniken unter Verwendung von geeigneten Primern aus den typ- oder subtyp-spezifischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, wie oben definiert, worin die Polynukleinsäure als ein Primer zur Amplifizierung der Nukleinsäure eines bestimmten Isolates wirken kann, welches dem Genotyp angehört, aus welchem der Primer abgeleitet ist.
Ein Beispiel für einen Primer gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung ist HCPr 152, wie gezeigt in der Tabelle 7 (SEQ ID Nr. 79).
Der Begriff "Primer" bezieht sich auf eine einzelsträngige DNA-Oligonukleotidsequenz, die fähig dazu ist, als ein Initiationspunkt für die Synthese eines Primer-Verlängerungsprodukts zu wirken, welches komplementär zu dem zu kopierenden Nukleinsäurestrang ist. Die Länge und die Sequenz des Primers müssen derartig sein, dass sie gestatten, die Synthese der Verlängerungsprodukte zu Primen. Vorzugsweise beläuft sich der Primer auf etwa 5–50 Nukleotide. Die spezifische Länge und Sequenz werden von der Komplexität der geforderten DNA- oder RNA-Ziele als auch von den Bedingungen der Primer-Verwendung, wie der Temperatur und der Innenstärke, abhängen.
Die Tatsache, dass Amplifikations-Primer nicht exakt mit der entsprechenden Matrizensequenz paaren bzw. übereinstimmen müssen, um eine geeignete Amplifikation zu garantieren, ist in der Literatur in weitem Umfang dokumentiert (Kwok et al., 1990).
Das angewandte Amplifikationsverfahren kann entweder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR; Saiki et al., 1988), Ligase-Kettenreaktion (LCR; Landgren et al., 1988; Wu & Wallace, 1989; Barany, 1991), Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991), das Transkriptions-basierende Amplifikationssystem (TAS; Kwoh et al., 1989), Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA; Duck, 1990; Walker et al., 1992) oder die Amplifikation mittels Qβ-Replikase (Lizardi et al., 1988; Lomeli et al., 1989) oder jedwedes andere geeignete Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung von Primerverlängerung sein. Während der Amplifikation können die amplifizierten Produkte zweckmäßig markiert werden, entweder unter Verwendung von markierten Primern oder durch Einbauen von markierten Nukleotiden. Die Markierungen können isotopisch (³²P, ³⁵S etc.) oder nicht-isotopisch (Biotin, Digoxigenin etc.) sein. Die Amplifikationsreaktion wird zwischen 20 und 80 Mal, vorteilhafterweise zwischen 30 und 50 Mal wiederholt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, wie oben definiert, wobei die Polynukleinsäure in der Lage ist, als eine Hybridisierungssonde für den spezifischen Nachweis und/oder die Klassifikation einer Nukleinsäure, enthaltend die Nukleotidsequenz, in Typen zu wirken, wobei das Oligonukleotid gegebenenfalls markiert oder an ein festes Substrat angeheftet ist.
Der Ausdruck "Sonde" bezieht sich auf einzelsträngige sequenzspezifische Oligonukleotide, welche eine Sequenz aufweisen, die komplementär zur Zielsequenz der nachzuweisenden HCV-Genotyp(en) ist.
Vorzugsweise sind diese Sonden etwa 5 bis 50 Nukleotide, weiter bevorzugt etwa 10 bis 25 Nukleotide lang.
Der Ausdruck "fester Träger" kann sich auf jedwedes Substrat beziehen, an welches eine Oligonukleotidsonde gekoppelt werden kann, mit der Maßgabe, dass sie ihre Hybridisierungsmerkmale beibehält, und mit der Maßgabe, dass der Hintergrundspiegel der Hybridisierung niedrig bleibt. Üblicherweise wird das feste Substrat eine Mikrotiterplatte, eine Membran (z. B. Nylon oder Nitrozellulose) oder eine Mikrosphäre (Kügelchen) sein. Vor dem Auftragen auf die Membran oder der Fixierung kann es zweckmäßig sein, die Nukleinsäuresonde zu modifizieren, um die Fixierung zu erleichtern oder die Hybridisierungseffizienz zu verbessern. Derartige Modifikationen können Homopolymer-Tailing, Kopplung mit verschiedenen reaktiven Gruppen, wie aliphatischen Gruppen, NH₂-Gruppen, SH-Gruppen, Carboxylgruppen bzw. Carbonsäuregruppen, oder die Kopplung mit Biotin oder Haptenen beinhalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung einer Zusammensetzung, wie oben definiert, zum Nachweisen des Vorhandenseins von einem oder mehreren HCV-Genotypen, genauer gesagt zum Nachweisen des Vorhandenseins einer Nukleinsäure von einem Beliebigen der HCV-Genotypen, welche eine Nukleotidsequenz, wie oben definiert, aufweist, vorliegend in einer biologischen Probe, welche diese enthalten kann, umfassend mindestens die folgenden Schritte:

(i) gegebenfalls Extrahieren der Proben-Nukleinsäure,
(ii) gegebenfalls Amplifizieren der Nukleinsäure mit mindestens einem der Primer, wie oben definiert, oder jedwedem sonstigen HCV-Subtyp-2d-, HCV-Typ-3-, HCV-Typ-4-, HCV-Typ-5- oder Universal-HCV-Primer,
(iii) Hybridisieren der Nukleinsäuren der biologischen Probe, gegebenfalls unter denaturierten Bedingungen, und wobei die Nukleinsäuren gegebenfalls während oder nach der Amplifikation markiert werden, bei geeigneten Bedingungen mit einer oder mehreren Sonden, wie oben definiert, wobei die Sonden vorzugsweise an ein festes Substrat angeheftet sind,
(iv) Waschen bei geeigneten Bedingungen,
(v) Nachweisen der gebildeten Hybride,
(vi) Schlussfolgern auf die Gegenwart von einem oder mehreren vorhandenen HCV-Genotypen aus dem beobachteten Hybridisierungsmuster.

Vorzugsweise könnte diese Technik in der Core- oder NS5B-Region durchgeführt werden.
Der Begriff "Nukleinsäure" kann auch als Analyt-Strang bezeichnet werden und entspricht einem einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül. Dieser Analyt-Strang ist vorzugsweise positiv- oder negativ-strängige RNA, cDNA oder amplifizierte cDNA.
Der Begriff "biologische Probe" bezieht sich auf jedwede biologische Probe (Gewebe oder Fluid), welche HCV-Nukleinsäuresequenzen enthält, und bezieht sich genauer gesagt auf Blutserum- oder Plasmaproben.
Der Ausdruck "HCV-Subtyp-2d-Primer" bezieht sich auf einen Primer, welcher spezifisch HCV-Subtyp-2d-Sequenzen, welche in einer Probe vorhanden sind, amplifiziert (siehe Beispiel-Abschnitt und Figuren).
Der Begriff "HCV-Typ-3-Primer" bezieht sich auf einen Primer, welcher spezifisch HCV-Typ-3-Sequenzen, welche in einer Probe vorhanden sind, amplifiziert (siehe Beispiel-Abschnitt und Figuren).
Der Begriff "HCV-Typ-4-Primer" bezieht sich auf einen Primer, welcher spezifisch HCV-Typ-4-Genome amplifiziert, welche in einer Probe vorhanden sind.
Der Begriff "Universal-HCV-Primer" bezieht sich auf Oligonukleotidsequenzen, welche zu einer Beliebigen der konservierten Regionen des HCV-Genoms komplementär sind.
Der Begriff "HCV-Typ-5-Primer" bezieht sich auf einen Primer, welcher spezifisch HCV-Typ-5-Genome amplifiziert, die in einer Probe vorhanden sind. Der Begriff "Universal-HCV-Primer" bezieht sich auf Oligonukleotidsequenzen, welche zu einer Beliebigen der konservierten Regionen des HCV-Genoms komplementär sind.
Der Ausdruck "geeignete" Hybridisierungs- und Waschbedingungen ist als stringent aufzufassen, und ist allgemein im Fachgebiet bekannt (z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Gemäß der Hybridisierungslösung (SSC, SSPE etc.) sollten diese Sonden jedoch bei ihrer angemessenen Temperatur hybridisiert werden, um eine hinreichende Spezifität zu erreichen.
Der Ausdruck "markiert" bezieht sich auf die Verwendung von markierten Nukleinsäuren. Dies kann die Verwendung von markierten Nukleotiden, welche während des Polymerase-Schritts der Amplifikation eingebaut werden, wie veranschaulicht von Saiki et al. (1988) oder Bej et al. (1990), oder von markierten Primern beinhalten, oder durch jedwedes sonstige Verfahren erfolgen, welches dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist.
Das Verfahren der Erfindung umfasst die Schritte des In-Kontakt-Bringens von einer Beliebigen der Sonden, wie oben definiert, mit einem der folgenden Elemente:

– entweder eine biologische Probe, in der die Nukleinsäuren für eine Hybridisierung verfügbar gemacht werden,
– oder die in der biologischen Probe enthaltenen, gereinigten Nukleinsäuren,
– oder eine einzelne Kopie, die aus den gereinigten Nukleinsäuren abgeleitet ist,
– oder eine amplifizierte Kopie, die aus den gereinigten Nukleinsäuren abgeleitet ist, wobei die Elemente oder die Sonden an ein festes Substrat gebunden sind.

Der Ausdruck "Schlussfolgern auf das Vorliegen von einem oder mehreren vorhandenen HCV-Genotypen aus dem beobachteten Hybridisierungsmuster" bezieht sich auf die Identifizierung des Vorhandenseins von HCV-Genomen in der Probe durch Analysieren des Bindungsmusters einer Auswahl von Oligonukleotidsonden. Einzelne Sonden können nützliche Information in Bezug auf die Gegenwart oder Abwesenheit von HCV-Genomen in einer Probe liefern. Andererseits ist in der Natur die Variation der HCV-Genome gestreut, sodass eine beliebige einzelne Sonde selten in der Lage ist, allein ein spezifisches HCV-Genom zu identifizieren. Vielmehr kann man auf die Identität eines HCV-Genotyps aus dem Bindungsmuster einer Auswahl an Oligonukleotidsonden schließen, welche für (unterschiedliche) Segmente der unterschiedlichen HCV-Genome spezifisch sind. Abhängig von der Auswahl dieser Oligonukleotidsonden wird jeder bekannte HCV-Genotyp einem spezifischen Hybridisierungsmuster bei Verwendung einer spezifischen Kombination von Sonden entsprechen. Des Weiteren kann jeder HCV-Genotyp von jedwedem anderen HCV-Genotyp, der mit den gleichen Primern amplifiziert wurde, abhängig von der Auswahl der Oligonukleotidsonden unterschieden werden. Ein Vergleich des erzeugten Musters von positiv hybridisierenden Sonden für eine Probe, welche eine oder mehrere unbekannte HCV-Sequenzen enthält, mit einem Schema von erwarteten Hybridisierungsmustern gestattet es, zweifelsfrei auf die in der Probe vorhandenen HCV-Genotypen zu schließen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren, wie oben definiert, worin eine oder mehrere Hybridisierungssonden aus einer Beliebigen von SEQ ID Nr. 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 oder Sequenzvarianten davon gewählt werden, wobei die Sequenzvarianten Deletionen und/oder Insertionen von einem oder mehreren Nukleotiden hauptsächlich an ihren Extremitäten (entweder 3' oder 5') oder Substitutionen von einigen nicht-essenziellen Nukleotiden (d. h. Nukleotide, welche nicht wesentlich zum Unterscheiden zwischen Genotypen sind) durch andere (einschließlich modifizierten Nukleotiden oder Inosin) enthalten, oder wobei die Varianten aus dem Komplement von einer Beliebigen der oben erwähnten Oligonukleotidsonden bestehen, oder wobei die Varianten aus Ribonukleotiden anstatt von Desoxyribonukleotiden bestehen, alles unter der Maßgabe, dass die Varianten-Sonden dazu gebracht werden können, mit der gleichen Spezifität wie die Oligonukleotidsonden, von welchen sie abgeleitet sind, zu hybridisieren.
Um die amplifizierten HCV-Genome voneinander zu unterscheiden, werden die Ziel-Polynukleinsäuren mit einem Satz von sequenzspezifischen DNA-Sonden hybridisiert, welche auf HCV-genotypische Regionen, die in den HCV-Polynukleinsäuren lokalisiert sind, abzielen.
Die meisten dieser Sonden zielen auf die am stärksten typ-spezifischen Regionen von HCV-Genotypen, aber einige können dazu gebracht werden, an mehr als einen HCV-Genotyp zu hybridisieren.
Gemäß der Hybridisierungslösung (SSC, SSPE etc.) sollten diese Sonden stringent bei ihrer geeigneten Temperatur hybridisiert werden, um eine ausreichende Spezifität zu erreichen. Durch geringfügiges Modifizieren der DNA-Sonde jedoch, entweder durch Hinzufügen oder Deletieren von einem oder einigen wenigen Nukleotiden an ihren Extremitäten (entweder 3' oder 5'), oder Substituieren einiger nicht-essenzieller Nukleotide (d. h. Nukleotide, welche zum Unterscheiden zwischen den Typen nicht wesentlich sind) durch andere (einschließlich modifizierter Nukleotide oder Inosin), können diese Sonden oder Varianten davon dazu gebracht werden, spezifisch bei den gleichen Hybridisierungsbedingungen (d. h. der gleichen Temperatur und der gleichen Hybridisierungslösung) zu hybridisieren. Auch das Ändern der Menge (Konzentration) der verwendeten Sonde kann nützlich sein, um spezifischere Hybridisierungsergebnisse zu erhalten. In diesem Zusammenhang sollte es bemerkt werden, dass Sonden der gleichen Länge, ungeachtet ihres GC-Gehaltes, bei ungefähr der gleichen Temperatur in TMACI-Lösungen spezifisch hybridisieren werden (Jacobs et al., 1988).
Geeignete Assay-Verfahren für die Zwecke der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen von Hybriden, welche zwischen den Oligonukleotidsonden und den Nukleinsäuresequenzen in einer Probe gebildet werden, können ein Beliebiges der im Fachgebiet bekannten Assay-Formate umfassen, wie das herkömmliche Dot-Blot-Format, Sandwich-Hybridisierung oder reverse Hybridisierung. Zum Beispiel kann der Nachweis unter Verwendung eines Dot-Blot-Formats bewerkstelligt werden, wobei die nicht-markierte amplifizierte Probe an eine Membran gebunden wird, die Membran unter geeigneten Hybridisierungs- und Waschbedingungen mit mindestens einer markierten Sonde versetzt wird, und die Gegenwart der gebundenen Sonde überwacht wird.
Ein alternatives und bevorzugtes Verfahren ist ein "reverses" Dot-Blot-Format, in welchem die amplifizierte Sequenz eine Markierung enthält. In diesem Format werden die ungebundenen Oligonukleotidsonden an einen festen Träger gebunden und unter geeigneten stringenten Hybridisierungs- und anschließenden Waschbedingungen an die markierte Probe ausgesetzt. Es versteht sich, dass auch ein beliebiges anderes Assay-Verfahren, welches auf der Bildung eines Hybrides zwischen den Nukleinsäuren der Probe und den Oligonukleotidsonden gemäß der vorliegenden Erfindung beruht, angewandt werden kann.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Nachweisen von einem oder mehreren HCV-Genotypen, welche in einer biologischen Probe enthalten sind, die Schritte des In-Kontakt-Bringens von amplifizierten HCV-Nukleinsäurekopien, die aus der biologischen Probe abgeleitet sind, mit Oligonukleotidsonden, welche als parallele Linien auf einem festen Träger immobilisiert worden sind.
Gemäß diesem vorteilhaften Verfahren werden die Sonden in einem Linien-Sonden- bzw. "Line Probe"-Assay- Format (LiPA) immobilisiert. Hierbei handelt es sich um ein reverses Hybridisierungsformat (Saiki et al., 1989) unter Verwendung von Membranstreifen, auf welche mehrere Oligonukleotidsonden (einschließlich negativer oder positiver Kontroll-Oligonukleotide) bequem als parallele Linien aufgebracht werden können.
Die Erfindung betrifft daher ebenfalls einen festen Träger, vorzugsweise einen Membranstreifen, welcher auf seiner Oberfläche eine oder mehrere Sonden, wie oben definiert, trägt, die an den Träger in der Form von parallelen Linien gekoppelt wurden.
Der LiPA ist ein sehr schneller und anwenderfreundlicher Hybridisierungstest. Ergebnisse können 4 Stunden nach dem Start der Amplifikation abgelesen werden. Nach der Amplifikation, während der üblicherweise eine Nicht-Isotop-Markierung in das amplifizierte Produkt eingebaut wird, und alkalischer Denaturierung wird das amplifizierte Produkt mit den Sonden auf der Membran kontaktiert, und die Hybridisierung wird etwa 1 bis 1,5 Stunden lang durchgeführt, sodass hybridisierte Polynukleinsäure detektiert wird. Aus dem erzeugten Hybridisierungsmuster kann der HCV-Typ entweder visuell aber vorzugsweise unter Anwendung von sachdienlicher Software abgeleitet werden. Das LiPA-Format ist vollständig kompatibel mit kommerziell erhältlichen Scanner-Geräten, wodurch die automatische Interpretation der Ergebnisse sehr zuverlässig gemacht wird. Alle diese Vorteile machen das LiPA-Format geeignet für die Verwendung zum HCV-Nachweis in einer Routine-Umgebung. Das LiPA-Format sollte besonders vorteilhaft zum Nachweisen des Vorhandenseins von unterschiedlichen HCV-Genotypen sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren von neuen HCV-Genotypen, welche von den bekannten HCV-Genomen verschieden sind, welches die folgenden Schritte umfasst:

– Bestimmen, zu welchem HCV-Genotyp die in einer biologischen Probe vorhandenen Nukleotide gehören, gemäß dem Verfahren, wie oben definiert,
– im Fall der Beobachtung einer Probe, welche kein Hybridisierungsmuster erzeugt, das mit denjenigen kompatibel ist, die in der Tabelle 3 definiert sind, Sequenzieren des Abschnitts der HCV-Genom-Sequenz, welcher der abweichend hybridisierenden Sonde des zu bestimmenden neuen HCV-Genotyps entspricht.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Zusammensetzung, wie oben definiert, zum Nachweisen von einem oder mehreren Genotypen von HCV, vorhanden in einer biologischen Probe, welche diese enthalten kann, umfassend die folgenden Schritte:

(i) gegebenfalls Extrahieren von Proben-Nukleinsäure,
(ii) Amplifizieren der Nukleinsäure mit mindestens einem der Primer, wie sie oben definiert wurden,
(iii) Sequenzieren der amplifizierten Produkte,
(iv) Rückschließen auf die vorhandenen HCV-Genotypen aus den ermittelten Sequenzen durch Vergleich mit allen bekannten HCV-Sequenzen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, bestehend aus oder umfassend mindestens ein Peptid oder Polypeptid, welches eine fortlaufende Sequenz von wenigstens 5 Aminosäuren umfasst, entsprechend einer fortlaufenden Aminosäuresequenz, codiert von wenigstens einer der genomischen HCV-Sequenzen, wie oben definiert, wobei wenigstens eine Aminosäure von der entsprechenden Region von bekannten HCV-Polyproteinsequenzen (Typ 1 und/oder Typ 2 und/oder Typ 3), wie gezeigt in der Tabelle 3, oder Muteinen davon, abweicht.
Es ist zu bemerken, dass auf der Ebene der Aminosäuresequenz ein Aminosäureunterschied (in Bezug auf bekannte HCV-Aminosäuresequenzen) notwendig ist, was bedeutet, dass die Polypeptide der Erfindung Polynukleinsäuren mit einem Nukleotidunterschied (zu bekannten HCV-Polynukleinsäuresequenzen) entsprechen, der einen Aminosäureunterschied nach sich zieht.
Die neuen Aminosäuresequenzen, wie sie von den offenbarten Nukleotidsequenzen (siehe SEQ ID Nr. 1 bis 62 und 106 bis 123 und 143 bis 218, 223 und 270) abgeleitet sind, zeigen Homologien von lediglich 59,9 bis 78% zu Prototypsequenzen von Typ 1 und 2 für die NS4-Region und von lediglich 53,9 bis 68,8% mit Prototypsequenzen des Typs 1 und 2 für die E1-Region. Da erwartet wird, dass das E1-Protein, als Teil der viralen Hülle, einem Immunangriff ausgesetzt ist, und erwartet wird, dass es Epitope enthält, werden die E1-Epitope der neuen Isolate vom Typ 3, 4 und 5 sich konsistent von den Epitopen unterscheiden, welche in Isolaten vom Typ 1 und 2 vorhanden sind. Dies wird durch die Typspezifität von synthetischen NS4-Peptiden, wie dargelegt im Beispiel 4, und der Typ-Spezifität von rekombinanten E1-Proteinen in Beispiel 11 exemplifiziert.
Nach Alignieren der Aminosäuresequenzen des neuen Typs 3 mit den Prototypsequenzen von Typ 1a, 1b, 2a und 2b können typ- und subtyp-spezifische variable Regionen eingegrenzt werden, wie es in der 5 und 7 dargestellt wird.
In Hinsicht auf die Muteine, welche aus den Polypeptiden der Erfindung abgeleitet sind, gibt die Tabelle 4 einen Überblick über die Aminosäure-Substitutionen, welche die Grundlage für einige der Muteine sein könnten, wie oben definiert.

Die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise mindestens 5 fortlaufende HCV-Aminosäuren, vorzugsweise aber mindestens 8 fortlaufende Aminosäuren, mindestens 10 oder mindestens 15 (z. B. mindestens 9, 11, 12, 13, 14, 20 oder 25 Aminosäuren) der neuen HCV-Sequenzen der Erfindung. TABELLE 4

Aminosäuren	Synonyme Gruppen
Ser (S)	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg (R)	Arg, His, Lys, Glu, Gin
Leu (L)	Leu, Ile, Met, Phe, Val, Tyr
Prc (P)	Pro, Ala, Thr, Gly
Thr (T)	Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gly
Ala (A)	Ala, Pro, Gly, Thr
Val (V)	Val, Met, Ile, Tyr, Phe, Leu, Val
Gly (G)	Gly, Ala, Thr, Pro, Ser
Ile (I)	Ile, Met, Leu, Phe, Val, Ile, Tyr
Phe (F)	Phe, Met, Tyr, Ile, Leu, Trp, Val
Tyr (Y)	Tyr, Phe, Trp, Met, Ile, Val, Leu
Cys (C)	Cys, Ser, Thr, Met
His (H)	His, Gln, Arg, Lys, Glu, Thr
Gln (Q)	Gln, Glu, His, Lys, Asn, Thr, Arg
Asn (N)	Asn, Asp, Ser, Gin
Lys (K)	Lys, Arg, Glu, Gln, His
Asp (D)	Asp, Asn, Glu, Gin
Glu (E)	Glu, Gin, Asp, Lys, Asn, His, Arg
Met (M)	Met, Ile, Leu, Phe, Val

Die Polypeptide der Erfindung, und insbesondere die Fragmente, können durch klassische chemische Synthese hergestellt werden.
Die Synthese kann in homogener Lösung oder in bzw. auf einer Festphase durchgeführt werden.
Zum Beispiel ist die Synthesetechnik in homogener Lösung, welche angewandt werden kann, diejenige, die von Houbenweyl in dem Buch mit dem Titel "Methode der organischen Chemie" (Method of organic chemistry), herausgegeben von E. Wunsh, Band 15-I und II; THIEME, Stuttgart 1974, beschrieben wird.
Die Polypeptide der Erfindung können auch in Festphase gemäß den Verfahren hergestellt werden, welche von Atherton und Shepard in ihrem Buch mit dem Titel "Solid Phase peptide synthesis" (IRL Press, Oxford, 1989) beschrieben werden.
Die Polypeptide gemäß dieser Erfindung können mittels rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden, wie sie von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, beschrieben sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere eine Polypeptid- oder Peptidzusammensetzung, wie oben definiert, wobei die fortlaufende Sequenz in ihrer Sequenz mindestens einen der folgenden Aminosäurereste enthält, welche für die Core/E1-Region vom HCV-Typ 3a der Erfindung, wie gezeigt in 5, spezifisch sind:
I186, H187, A190, S191, W194, Q231, A237, M280, L308, L313,
wobei die Schreibweise aus einem Buchstaben, welcher den Aminosäurerest mittels seines Ein-Buchstaben-Codes repräsentiert, und einer Zahl zusammengesetzt ist, welche die Aminosäurenummerierung gemäß Kato et al., 1990, wie gezeigt in der Tabelle 1 (Vergleich mit anderen Isolaten) repräsentiert. Siehe auch die Nummerierung in den 2, 5, 7 und 11 (Alignment von Aminosäuresequenzen).
Einige der oben erwähnten Aminosäuren können in typ- oder subtyp-spezifischen Epitopen enthalten sein.
Zum Beispiel bezieht sich M231 (detektiert im Typ 5) auf ein Methionin an der Position 231. Ein Glutamin (Q) ist an der gleichen Position 231 in Typ-3-Isolaten vorhanden, wohingegen diese Position in Typ-1-Isolaten von einem Arginin besetzt ist, und in Typ-2-Isolaten von einem Lysin (K) oder einem Asparagin (N) (siehe 5).
Das Peptid oder Polypeptid gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung kann gegebenenfalls markiert oder an einem festen Substrat angeheftet oder an ein Trägermolekül, wie Biotin, gekoppelt oder mit einem geeigneten Hilfsstoff vermischt sein.
Die variable Region im Kernprotein (V-CORE in 5) ist gezeigtermaßen nützlich für die Serotypisierung (Machida et al., 1992).
Fünf typ-spezifische variable Regionen (V1 bis V5) können nach Alignieren von E1-Aminosäuresequenzen der 4 Genotypen, wie gezeigt in der 5, identifiziert werden.
Die Region V1 umfasst die Aminosäuren 192 bis 203, wobei dies die aminoterminalen 10 Aminosäuren des E1-Proteins sind. Die folgenden einmaligen Sequenzen, wie gezeigt in 5, können abgeleitet werden:
LEWRNTSGLYVL (SEQ ID Nr. 83)
Die Region V2 überspannt die Aminosäuren 213 bis 223. Die folgenden einmaligen Sequenzen können in der V2-Region, wie gezeigt in der 5, gefunden werden:
VYEADDVILHT (SEQ ID Nr. 85)
Die Region V3 umfasst die Aminosäuren 230 bis 242. Die folgenden einmaligen V3-Region-Sequenzen können aus der 5 abgeleitet werden:
VQDGNTSTCWTPV (SEQ ID Nr. 87)
VQDGNTSACWTPV (SEQ ID Nr. 241)
Die Region V4 umfasst die Aminosäuren 248 bis 257. Die folgenden einmaligen V4-Region-Sequenzen können aus der 5 abgeleitet werden:
VRYVGATTAS (SEQ ID Nr. 89)
VKYVGATTAS (SEQ ID Nr. 252)
Die Region V5 umfasst die Aminosäuren 294 bis 303. Die folgenden einmaligen V5-Region-Peptide können aus der 5 abgeleitet werden:
RPRRHQTVQT (SEQ ID Nr. 91)
Die oben angegebene Liste von Peptiden sind/ist besonders geeignet für Impfstoff- und Diagnostika-Entwicklung.
Ebenfalls in der vorliegenden Erfindung beinhaltet ist jedwedes synthetische Peptid oder Polypeptid, welches mindestens 5 fortlaufende Aminosäuren, die aus den oben definierten Peptiden abgeleitet sind, in seiner Peptidkette enthält.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, wie oben definiert, wobei die fortlaufende Sequenz aus einer Beliebigen der folgenden HCV-Typ-3a-Aminosäuresequenzen gewählt wird:

– eine Sequenz mit einer Homologie von mehr als 81%, vorzugsweise mehr als 83% und am stärksten bevorzugt mehr als 86% Homologie zu einer Beliebigen der Aminosäuresequenzen, wie repräsentiert in SEQ ID Nr. 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 oder 28 (HD10-, BR36-, BR33-Sequenzen) in der Region, welche die Positionen 140 bis 319 in der Core/E1-Region, wie gezeigt in 5, überspannt;
– eine Sequenz mit einer Homologie von mehr als 81,5%, vorzugsweise mehr als 83% und am stärksten bevorzugt mehr als 86% Homologie zu einer Beliebigen der Aminosäuresequenzen, wie repräsentiert in SEQ ID Nr. 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 oder 28 (HD10-, BR36-, BR33-Sequenzen) in der E1-Region, welche die Positionen 192 bis 319 überspannt, wie gezeigt in der 5.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Vektor, insbesondere zur Klonierung und/oder Expression, wobei der rekombinante Vektor eine Vektorsequenz, eine geeignete prokaryotische, eukaryotische oder virale Promotorsequenz, gefolgt von den Nukleotidsequenzen, wie oben definiert, umfasst, wobei der rekombinante Vektor die Expression von einem Beliebigen der HCV-Typ-3a-abgeleiteten Polypeptide, wie oben definiert, in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt oder in lebenden Säugetieren, bei Injektion als nackte DNA, gestattet, und im Genaueren einen rekombinanten Vektor, welcher die Expression von einem Beliebigen der folgenden HCV-Typ-3a-Polypeptide gestattet, welche die folgenden Aminosäurepositionen überspannen:

– ein Polypeptid, welches an Position 1 beginnt und an einer beliebigen Position in der Region zwischen den Positionen 70 und 326 endet, im Genaueren ein Polypeptid, welches die Positionen 1 bis 70, 1 bis 85, die Positionen 1 bis 120, die Positionen 1 bis 150, die Positionen 1 bis 191, die Positionen 1 bis 200, für die Expression des Core-Proteins, überspannt, und ein Polypeptid, welches die Positionen 1 bis 263, Positionen 1 bis 326 überspannt, für die Expression des Core- und E1-Proteins;
– ein Polypeptid, welches an einer beliebigen Position in der Region zwischen den Positionen 117 und 192 beginnt und an einer beliebigen Position in der Region zwischen den Positionen 263 und 326 endet, für die Expression von E1, oder Formen, bei welchen der vermeintliche Membrananker deletiert ist (Positionen 264 bis 293 plus oder minus 8 Aminosäuren).

Der Begriff "Vektor" kann ein Plasmid, ein Cosmid, einen Phagen oder ein Virus umfassen.
Um die Expression der Polypeptide der Erfindung in Bakterien, wie E. coli, oder in eukaryotischen Zellen, wie in S. cerevisiae, oder in kultivierten Wirbeltier- oder Wirbellosen-Wirten, wie Insektenzellen, chinesischen Hamstereierstock-Zellen (CHO), COS-, BHK- und MDCK-Zellen, durchzuführen, werden die folgenden Schritte ausgeführt:

– Transformation eines geeigneten zellulären Wirtes mit einem rekombinanten Vektor, in welchem eine Nukleotidsequenz, welche eines der Polypeptide der Erfindung codiert, unter der Steuerung der passenden regulatorischen Elemente inseriert worden ist, insbesondere eines Promotors, welcher von den Polymerasen des zellulären Wirtes erkannt wird, und, im Fall eines prokaryotischen Wirtes, einer geeigneten Ribosomenbindungsstelle (RBS), welche die Expression der Nukleotidsequenz in dem zellulären Wirt ermöglichen. Im Fall eines eukaryotischen Wirtes könnte eine beliebige künstliche Signalsequenz oder Prä/Pro-Sequenz vorgesehen werden oder die natürliche HCV-Signalsequenz könnte verwendet werden, z. B. kann für die Expression von E1 die Signalsequenz, beginnend zwischen den Aminosäurepositionen 117 und 170 und endend an der Aminosäureposition 191, verwendet werden, und für die Expression von NS4 kann die Signalsequenz, welche zwischen den Aminosäurepositionen 1646 und 1659 beginnt, verwendet werden
– Kultivieren des transformierten zellulären Wirtes unter Bedingungen, welche die Expression des Inserts ermöglichen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, wie oben definiert, worin das Polypeptid ein rekombinantes Polypeptid ist, welches mittels eines Expressionsvektors, wie oben definiert, exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, wie oben definiert, zur Verwendung in einem Verfahren zum Immunisieren eines Säugers, vorzugsweise von Menschen, gegen HCV, umfassend das Verabreichen einer ausreichenden Menge der Zusammensetzung, gegebenenfalls begleitet von pharmazeutisch annehmbaren Adjuvantien, um eine Immunantwort hervorzurufen, genauer gesagt eine Impfstoffzusammensetzung, welche HCV-Typ 3a und Polypeptide, welche aus den Core- und E1-Polypeptiden abgeleitet sind, einschließt.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren einen Antikörper, welcher nach Immunisierung mit einer Zusammensetzung, wie oben definiert, mittels eines Verfahrens, wie oben definiert, erzeugt wird, wobei der Antikörper mit einem Beliebigen der Polypeptide, wie oben definiert, reaktiv ist und wobei der Antikörper vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper ist.
Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können durch ein beliebiges Hybridom hergestellt werden, welches gemäß klassischen Verfahren aus Milzzellen eines Tieres, insbesondere aus einer Maus oder Ratte, immunisiert gegen die HCV-Polypeptide gemäß der Erfindung oder Muteine davon oder Fragmente davon, wie oben definiert, einerseits, und aus Zellen einer Myelomzelllinie andererseits gebildet werden kann und durch die Fähigkeit des Hybridoms selektiert werden kann, die monoklonalen Antikörper herzustellen, welche die Polypeptid(e) erkennen, die anfänglich für die Immunisierung der Tiere verwendet wurde(n).
Die in der Erfindung beteiligten Antikörper können mit einer geeigneten Markierung vom enzymatischen, fluoreszenten oder radioaktiven Typ markiert sein.
Die monoklonalen Antikörper gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellte humanisierte Versionen von monoklonalen Maus-Antikörpern sein, welche von Teilen der genomischen Maus- und/oder Mensch-DNA-Sequenzen, die für H- und L-Ketten codieren, oder von cDNA-Klonen, die für H- und L-Ketten codieren, abweichen.
Alternativ dazu können die monoklonalen Antikörper gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung humane monoklonale Antikörper sein. Diese Antikörper gemäß der vorliegenden Ausführungsform der Erfindung können auch aus humanen peripheren Blutlymphozyten von Patienten abgeleitet sein, welche mit Typ-3-, Typ-4- oder Typ-5-HCV infiziert waren oder gegen HCV geimpft wurden. Solche humanen monoklonalen Antikörper werden zum Beispiel durch die Repopulation von "Severe Combined Immune Deficiency" (SCID)-Mäusen mit humanen peripheren Blutlymphozyten (PBL) hergestellt (für eine aktuelle Rezension siehe Duchosal et al., 1992).
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der Proteine der Erfindung, von Muteinen davon oder daraus abgeleiteten Peptiden für die Selektion von rekombinanten Antikörpern durch das Verfahren der Repertoire-Klonierung (Persson et al., 1991).
Antikörper, welche gegen Peptide gerichtet sind, die aus einem bestimmten Genotyp abgeleitet sind, können entweder für die Detektion derartiger HCV-Genotypen oder als therapeutische Mittel verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Zusammensetzung, wie oben definiert, zur Einbringung in einen Immuno-Assay zum Nachweisen von HCV, welches in einer biologischen Probe vorhanden ist, die es möglicherweise enthält, umfassend mindestens die folgenden Schritte:

(i) In-Kontakt-bringen der biologischen Probe, welche auf Vorhandensein von HCV-Antikörpern analysiert werden soll, mit einer Beliebigen der Zusammensetzungen, wie oben definiert, vorzugsweise in einer immobilisierten Form unter passenden Bedingungen, welche die Bildung eines Immunkomplexes gestatten, wobei das Polypeptid ein biotinyliertes Polypetid sein kann, welches an ein festes Substrat mittels Streptavidin- oder Avidin-Komplexen kovalent gebunden ist,
(ii) Entfernen von nicht-gebundenen Komponenten,
(iii) Inkubieren der gebildeten Immunkomplexe mit heterologen Antikörpern, welche spezifisch an die Antikörper binden, die in der zu analysierenden Probe vorhanden sind, wobei die heterologen Antikörper eine daran konjugierte, unter geeigneten Bedingungen nachweisbare Markierung aufweisen,
(iv) Nachweisen des Vorhandenseins der Immunkomplexe durch Sichtprüfung oder mittels Densitometrie, und Schlussfolgern auf den vorhandenen HCV-Serotyp aus dem beobachteten Hybridisierungsmuster.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Zusammensetzung, wie oben definiert, zur Einbringung in einen Serotypisierungs-Assay zum Nachweisen von einem oder mehreren serologischen Typen von HCV, vorhanden in einer biologischen Probe, welche es enthalten kann, genauer gesagt zum Nachweisen von E1- und NS4-Antigenen oder Antikörpern der verschieden en nachzuweisenden Typen, kombiniert in einem Assay-Format, umfassend wenigstens die folgenden Schritte:

(i) In-Kontakt-bringen der biologischen Probe, welche auf das Vorhandensein von HCV-Antikörpern oder -Antigenen von einem oder mehreren serologischen Typen analysiert werden soll, mit mindestens einer der Zusammensetzungen, wie oben definiert, einer immobilisierten Form unter geeigneten Bedingungen, welche die Bildung eines Immunkomplexes gestatten,
(ii) Entfernen von nicht-gebundenen Komponenten,
(iii) Inkubieren der gebildeten Immunkomplexe mit heterologen Antikörpern, welche spezifisch an die in der zu analysierenden Probe vorhandenen Antikörper binden, wobei die heterologen Antikörper eine daran konjugierte, unter passenden Bedingungen nachweisbare Markierung aufweisen,
(iv) Nachweisen der Gegenwart der Immunkomplexe durch Sichtprüfung oder mittels Densitometrie, und Schlussfolgern auf das Vorhandensein von einem oder mehreren vorhandenen serologischen HCV-Typen aus dem beobachteten Bindungsmuster.

Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung einer Zusammensetzung, wie oben definiert, zur Immobilisierung auf einem festen Substrat und Einbringung in einen Umkehrphasen-Hybridisierungs-Assay, vorzugsweise zur Immobilisierung als parallele Linien auf einem festen Träger, wie einem Membranstreifen, zum Bestimmen des Vorhandenseins oder des Genotyps von HCV gemäß einem Verfahren, wie oben definiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Kit zum Bestimmen des Vorhandenseins von HCV-Genotypen, wie oben definiert, welche in einer biologischen Probe vorhanden sind, die sie enthalten kann, welches umfasst:

– gegebenenfalls mindestens eine Primer-Zusammensetzung, enthaltend einen beliebigen Primer, ausgewählt aus denjenigen, welche oben definiert sind, oder beliebige andere HCV-Typ-3- oder Universal-HCV-Primer,
– mindestens eine Sondenzusammensetzung, wie oben definiert, wobei die Sonden präferenziell auf einem festen Substrat, und weiter bevorzugt auf ein und demselben Membranstreifen, immobilisiert sind,
– einen Puffer oder Komponenten, notwendig zur Herstellung des Puffers, welcher ermöglicht, dass die Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und den möglicherweise amplifizierten Produkten durchgeführt wird,
– Mittel zum Nachweisen der Hybride, welche aus der vorangehenden Hybridisierung resultieren,
– gegebenenfalls auch beinhaltend eine automatisierte Scan- und Interpretations-Vorrichtung zum Schlussfolgern auf die in der Probe vorhandenen HCV-Genotypen aus dem beobachteten Hybridisierungsmuster.

Der Genotyp kann auch mittels eines typ-spezifischen Antikörpers, wie oben definiert, nachgewiesen werden, welcher mit einer beliebigen Polynukleotidsequenz verbunden ist, die danach mittels PCR amplifiziert werden kann, um den gebildeten Immunkomplex nachzuweisen (Immuno-PCR, Sano et al., 1992); Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Kit zum Bestimmen des Vorhandenseins von HCV-Antikörpern, wie oben definiert, welche in einer biologischen Probe vorhanden sind, die sie enthalten kann, umfassend:

– mindestens eine Polypeptidzusammensetzung, wie oben definiert, vorzugsweise in Kombination mit anderen Polypeptiden oder Peptiden aus HCV-Typ-1, HCV-Typ-2 oder anderen Typen von HCV, wobei die Polypeptide bevorzugt auf einem festen Substrat und weiter bevorzugt auf ein und demselben Membranstreifen immobilisiert sind,
– einen Puffer oder Komponenten, notwendig zur Herstellung des Puffers, welcher die Bindungsreaktion zwischen diesen Polypeptiden und den Antikörpern gegen HCV, vorhanden in der biologischen Probe, ermöglicht,
– Mittel zum Nachweisen der in der vorangehenden Bindungsreaktion gebildeten Immunkomplexe,
– gegebenenfalls auch beinhaltend eine automatisierte Scan- und Interpretations-Vorrichtung zum Schlussfolgern auf die in der Probe vorhandenen HCV-Genotypen aus dem beobachteten Bindungsmuster.

Figuren-Legenden
1
Alignment bzw. Parallel-Übereinanderstellung von Konsensus-Nukleotidsequenzen für jedes der Typ-3a-Isolate BR34, BR36 und BR33, abgeleitet aus den Klonen mit der SEQ ID Nr. 1, 5, 9; Typ-4-Isolate GB48, GB116, GB215, GB358, GB549, GB809, CAM600, CAMG22, GB438, CAR4/1205, CAR1/501 (SEQ ID Nr. 106, 108, 110, 112, 114, 116, 201, 203, 205, 207, 209 und 211); Typ-5a-Isolate BE95 und BE96 (SEQ ID Nr. 159 und 161) und Typ-2d-Isolate NE92 (SEQ ID Nr. 145) aus der Region zwischen den Nukleotiden 7932 und 8271, mit bekannten Sequenzen aus der entsprechenden Region der Isolate HCV-1, HCV-J, HC-J6, HC-J8, T1 und T9, und anderen, wie gezeigt in der Tabelle 3.
2
Alignment von Aminosäuresequenzen, abgeleitet aus den Nukleinsäuresequenzen, wie repräsentiert in 1, aus den Subtyp-3a-Klonen BR34 (SEQ ID Nr. 2, 4), BR36 (SEQ ID Nr. 6, 8) und BR33 (SEQ ID Nr. 10, 12), dem Subtyp-3c-Klon BE98 (SEQ ID Nr. 150) und den Typ-4-Klonen GB48 (SEQ ID Nr. 107), GB116 (SEQ ID Nr. 109), GB215 (SEQ ID Nr. 111), GB358 (SEQ ID Nr. 113), GB549 (SEQ ID Nr. 115), GB809 (SEQ ID Nr. 117); CAM600, CAMG22, GB438, CAR4/1205, CAR1/501 (SEQ ID Nr. 202, 204, 206, 208, 210, 212); den Typ-5a-Klonen BE95 und BE96 (SEQ ID Nr. 160 und 162); sowie dem Subtyp-2d-Isolat NE92 (SEQ ID Nr. 146) aus der Region zwischen Aminosäure 2645 bis 2757, mit bekannten Sequenzen aus der entsprechenden Region der Isolate HCV-1, HCV-J, HC-J6 und HC-J8, T1 und T9, und anderen Sequenzen, wie gezeigt in der Tabelle 3.
3
Alignment von Nukleotidsequenzen des Typs 2d, 3c, 4 und 5a aus den Isolaten NE92, BE98, GB358, GB809, CAM600, GB724, BE95 (SEQ ID Nr. 143, 147, 191, 163, 165, 193 und 151) in der Core-Region zwischen den Nukleotidpositionen 1 und 500 mit bekannten Sequenzen aus der entsprechenden Region von Typ-1-, Typ-2-, Typ-3- und Typ-4-Sequenzen.
4
Alignment von Nukleotidsequenzen für das Subtyp-2d-Isolat NE92 (SEQ ID Nr. 143), die Typ-4-Isolate GB358 (SEQ ID Nr. 118 und 187), GB549 (SEQ ID Nr. 120 und 175) und GB809-2 (SEQ ID Nr. 122 und 169), GB809-4, BG116, GB215, CAM600, CAMG22, CAMG27, GB438, CAR4/1205, CAR4/901 (SEQ ID Nr. 189, 183, 185, 167, 171, 173, 177, 179, 181), Sequenzen für jedes der Subtyp-3a-Isolate HD10, BR36 und BR33 (SEQ ID Nr. 13, 15, 17 (HD10), 19, 21 (BR36) und 23, 25 oder 27 (BR23) und die Subtyp-5a-Isolate BE95 und BE100 (SEQ ID Nr. 143 und 195) aus der Region zwischen den Nukleotiden 379 und 957, mit bekannten Sequenzen aus der entsprechenden Region von Typ 1 und 2 und 3.
5
Alignment von Aminosäuresequenzen, abgeleitet aus den neuen HCV-Nukleotidsequenzen der Core/E1-Region der Isolate BR33, BR36, HD10, GB358, GB549 und GB809, PC oder BE95, CAM600 und GB724 (SEQ ID Nr. 14, 20, 24, 119 oder 192, 121, 123 oder 164, 54 oder 152, 166 und 194) aus der Region zwischen den Positionen 1 und 319, mit bekannten Sequenzen aus Typ 1a (HCV-1), Typ 1b (HCV-J), Typ 2a (HC-JG), Typ 2b (HC-J8), NZL1, HCV-TR, Positionen 7-89 vom Typ 3a (E-b1) und Positionen 8-88 vom Typ 4a (EG-29). V-Core, eine variable Region mit typ-spezifischen Merkmalen im Core-Protein, V1, variable Region 1 des E1-Proteins, V2, variable Region 2 des E1-Proteins, V3, variable Region 3 des E1-Proteins, V4, variable Region 4 des E1-Proteins, V5, variable Region 5 des E1-Proteins.
6
Alignment von Nukleotidsequenzen der Isolate HCCL53, HD10 und BR36, abgeleitet aus Klonen mit SEQ ID Nr. 29, 31, 33, 35, 37 und 39, aus der NS3/4-Region zwischen den Nukleotiden 4664 bis 5292, mit bekannten Sequenzen aus der entsprechenden Region der Isolate HCV-1, HCV-J, HC-J6 und HC-J8, EB1, EB2, EB6 und EB7.
7
Alignment von Aminosäuresequenzen, abgeleitet aus den neuen HCV-Nukuleotidsequenzen der NS3/NS4-Region des Isolates BR36 (SEQ ID Nr. 36, 38 und 40) und BE95 (SEQ ID Nr. 270) . NS4-1 gibt die Region an, welche als synthetisches Peptid 1 der NS4-Region synthetisiert wurde, NS4-5 gibt die Region an, welche als synthetisches Peptid 5 der NS4-Region synthetisiert wurde; NS4-7 gibt die Region an, welche als synthetisches Peptid 7 der NS4-Region synthetisiert wurde.
8
Reaktivität der drei LIPA-selektierten (Stuyver et al., 1993) Typ-3-Seren auf dem Inno-LIA-HCV-Ab-II-Assay (Innogenetics) (links) und auf dem NS4-LIA-Test. Für den NS4-LIA-Test wurden NS4-1-, NS4-5- und NS4-7-Peptide basierend auf den Prototyp-Isolat-Sequenzen von Typ 1 (HCV-1), Typ 2 (HC-J6) und Typ 3 (BR36), wie gezeigt in der Tabelle 4, synthetisiert und als parallele Linien auf einem Membranstreifen wie angegeben aufgetragen. 1, Serum BR33, 2, Serum HD10, 3, Serum DKH.
9
Nukleotidsequenzen von Core/E1-Klonen, welche erhalten wurden aus den PCR-Fragmenten PC-2, PC-3 und PC-4, erhalten aus Serum BE95 (PC-2-1 (SEQ ID Nr. 41), PC-2-6 (SEQ ID Nr. 43), PC-4-1 (SEQ ID Nr. 45), PC-4-6 (SEQ ID Nr. 47), PC-3-4 (SEQ ID Nr. 49) und PC-3-8 (SEQ ID Nr. 51)) des Subtyp-5a-Isolates BE95. Eine Konsensus-Sequenz ist für die Core- und E1-Region von Isolat BE95 gezeigt, präsentiert als PC C/E1, mit SEQ ID Nr. 53. Y) C oder T, R) A oder G, S) C oder G.
10
Alignment von Nukleotidsequenzen von Klonen mit SEQ ID Nr. 197 und 199 (PC-Sequenzen, siehe ebenfalls SEQ ID Nr. 55, 57, 59) und SEQ ID Nr. 35, 37 und 39 (BR36-Sequenzen) aus der NS3/4-Region zwischen den Nukleotiden 3856 bis 5292, mit bekannten Sequenzen aus der entsprechenden Region der Isolate HCV-1, HCV-J, HC-J6 und HC-J8.
11
Alignment von Aminosäuresequenzen von Subtyp-5a-BE95-Isolat-PC-Klonen mit SEQ ID Nr. 56 und 58 aus der NS3/4-Region zwischen den Aminosäuren 1286 bis 1764, mit bekannten Sequenzen aus der entsprechenden Region der Isolate HCV-1, HCV-J, HC-J6 und HC-J8.
12
Alignment von Aminosäuresequenzen vom Subtyp-5a-Isolat BE95 (SEQ ID Nr. 158) in der E1/E2-Region, überspannend die Positionen 328 bis 546, mit bekannten Sequenzen aus der entsprechenden Region der Isolate HCV-1, HCV-J, HC-J6, HC-J8, NZL1 und HCV-TR (siehe Tabelle 3).
13
Alignment der Nukleotidsequenzen des Subtyp-5a-Isolates BE95 (SEQ ID Nr. 157) in der E1/E2-Region mit bekannten HCV-Sequenzen, wie gezeigt in der Tabelle 3.
BEISPIELE
Beispiel 1: Die NS5b-Region von HCV-Typ 3
Typ-3-Seren, selektiert mittels des INNO-LiPA-HCV-Untersuchungs-Kits (Stuyver et al., 1993) aus einer Anzahl von brasilianischen Blutspendern waren im HCV-Antikörper-ELISA (Innotest HCV-Ab-II; Innogenetics) und/oder im INNO-LIA-HCV-Ab-II-Bestätigungstest (Innogenetics) positiv. Lediglich diejenigen Seren, welche nach der ersten Runde von PCR-Reaktionen positiv waren (Stuyver et al., 1993), wurden für die weitere Untersuchung beibehalten.
Reverse Transkription und verschachtelte PCR: RNA wurde aus 50 μl Serum extrahiert und einer cDNA-Synthese unterzogen, wie beschrieben (Stuyver et al., 1993). Diese cDNA wurde als Matrize für PCR verwendet, wofür das Gesamtvolumen auf 50 μl erhöht wurde, enthaltend 10 pmol von jedem Primer, 3 μl 10 × Pfu-Puffer 2 (Stratagene) und 2,5 U Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene). Die cDNA wurde über 45 Zyklen amplifiziert, welche aus 1 min 94°C, 1 min 50°C und 2 min 72°C bestanden. Die amplifizierten Produkte wurden durch Elektrophorese getrennt, isoliert, kloniert und sequenziert, wie beschrieben (Stuyver et al., 1993).
Typ 3a- und 3b-spezifische Primer in der NS5-Region wurden aus den veröffentlichten Sequenzen (Mori et al., 1992) wie folgend gewählt:
für Typ 3a:
für Typ 3b:
Unter Anwendung des Linien-Sonden-Assays (LiPA) (Stuyver et al., 1993) wurden sieben Hochtiter-Typ-3-Seren selektiert und anschließend mit den Primer-Sätzen HCPr161/162 für Typ 3a und HCPr163/164 für Typ 3b analysiert. Keines dieser Seren war positiv mit den Typ-3b-Primern. NS5-PCR-Fragmente, welche erhalten wurden unter Verwendung der Typ-3a-Primer aus Serum BR36 (BR36-23), Serum BR33 (BR33-2) und Serum BR34 (BR34-4), wurden für die Klonierung ausgewählt. Die folgenden Sequenzen wurden von den PCR-Fragmenten erhalten:
Aus Fragment BR34-4:
BR34-4-20 (SEQ ID Nr. 1), BR34-4-19 (SEQ ID Nr. 3)
Aus Fragment BR36-23:
BR36-23-18 (SEQ ID Nr. 5), BR36-23-20 (SEQ ID Nr. 7)
Aus Fragment BR33-2:
BR33-2-17 (SEQ ID Nr. 9), 3R33-2-21 (SEQ ID Nr. 11)
Ein Alignment von Sequenzen mit SEQ ID Nr. 1, 5 und 9 mit bekannten Sequenzen ist in der 1 angegeben. Ein Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen ist in der 2 gezeigt. Die drei Isolate sind zueinander (wechselseitige Homologien von etwa 95%) sowie zu den veröffentlichten Sequenzen vom Typ 3a (Mori et al., 1992) sehr nah verwandt, sind aber nur entfernt verwandt zu Typ- und Typ-2-Sequenzen (Tabelle 5). Deshalb wird es deutlich gezeigt, dass NS5-Sequenzen aus LiPA-selektierten Typ-3-Seren tatsächlich aus einem Typ-3-Genom abgeleitet sind. Durch Analysieren der NS5-Region vom Serum BR34, für welches keine 5'UR-Sequenzen bestimmt wurden, wie beschrieben in Stuyver et al. (1993), wurde darüber hinaus die hervorragende Korrelation zwischen der Typisierung mittels des LiPA und der Genotypisierung, wie abgeleitet aus der Nukleotidsequenzierung, weiter bewiesen.
Beispiel 2: Die Core/E1-Region von HCV-Typ 3
Nach Alignieren der Sequenzen von HCV-1 (Choo et al., 1991), HCV-J (Kato et al., 1990), HC-J6 (Okamoto et al., 1991) und HC-J8 (Okamoto et al., 1992) wurden PCR-Primer in denjenigen Regionen mit geringer Sequenz-variation gewählt. Die Primer HCPr23(+): 5'-CTCATGGGGTACATTCCGCT-3' (SEQ ID Nr. 67) und HCPr54 (–): 5'-TATTACCAGTTCATCATCATATCCCA-3' (SEQ ID Nr. 68) wurden auf einem 392-DNA/RNA-Syntheziser (Applied Biosystems) synthetisiert. Dieser Satz von Primern wurde gewählt, um die Sequenz von Nukleotid 397 bis 957 zu amplifizieren, welche die Aminosäuren 140 bis 319 codiert (Kato et al., 1990): 52 Aminosäuren von dem Carboxyterminus von Core und 128 Aminosäuren von E1 (Kato et al., 1990). Die Amplifikationsprodukte BR36-9, BRR33-1 und HD10-2 wurden kloniert, wie beschrieben (Stuyver et al ., 1993) . Die folgenden Klone wurden von den PCR-Fragmenten erhalten:
Vom Fragment HD10-2:
HD10-2-5 (SEQ ID Nr. 13), HD10-2-14 (SEQ ID Nr. 15), HD10-2-21 (SEQ ID Nr. 17),
Vom Fragment BR36-9:
BR36-9-13 (SEQ ID Nr. 19), BR36-9-20 (SEQ ID Nr. 21),
Vom Fragment BR33-1:
BR33-1-10 (SEQ ID Nr. 23), BR33-1-19 (SEQ ID Nr. 25), BR33-1-20 (SEQ ID Nr. 27).
Ein Alignment der Typ-3-E1-Nukleotidsequenzen (HD10, BR36, BR33) mit SEQ ID Nr. 13, 19 und 23 mit bekannten E1-Sequenzen wird in der 4 wiedergegeben. Vier Variationen wurden in den E1-Klonen aus Serum HD10 und BR36 nachgewiesen, während nur 2 in BR33 gefunden wurden. Alle sind stille Dritt-Buchstaben-Variationen, mit der Ausnahme von Mutationen an der Position 40 (L zu P) und 125 (M zu I). Die Homologien der Typ-3-E1-Region (ohne Core) mit Typ 1- und 2-Prototypsequenzen sind in der Tabelle 5 abgebildet.
Insgesamt 8 Klone, welche die Core/E1-Region von 3 verschiedenen Isolaten abdecken, wurden sequenziert, und der E1-Abschnitt wurde mit den bekannten Genotypen (Tabelle 3) verglichen, wie es in der 5 gezeigt ist. Nach einer Computeranalyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz wurde eine Signal-Anker-Sequenz am Core-Carboxyterminus nachgewiesen, welche, durch Analogie mit Typ 1b (Hijikata et al., 1991), eine Spaltung vor der LEWRN-Sequenz (Position 192, 5) fördern könnte. Die L-zu-P-Mutation in einem der HD10-2-Klone liegt in dieser Signal-Anker-Region und stört möglicherweise die Erkennung durch Signalpeptidase (Computer-Vorhersage). Da keine Beispiele derartiger Substitutionen an dieser Position in früher beschriebenen Sequenzen gefunden wurden, könnte diese Mutation durch einen Fehleinbau durch reverse Transkriptase oder Pfu-Polymerase bedingt worden sein. Die 4 aminoterminalen potenziellen N-verknüpften Glycosylierungsstellen, welche ebenfalls in den HCV-Typen 1a und 2 vorhanden sind, bleiben im Typ 3 konserviert. Die N-Glykosylierungsstelle im Typ 1b (aa 250, Kato et al., 1990) bleibt ein einmaliges Merkmal dieses Subtyps. Alle E1-Cysteine und die vermeintliche Transmembranregion (aa 264 bis 293, Computer-Vorhersage), enthaltend die Asparaginsäure an der Position-279, sind in allen drei HCV-Typen konserviert. Es können die folgenden hypervariablen Regionen abgegrenzt bzw. dargestellt werden: V1 von aa 192 bis 203 (Nummerierung nach Kato et al., 1990), V2 (213-223), V3 (230-242), V4 (248-257) und V5 (294-303). Solche hydrophilen Regionen sind angenommenerweise den Abwehrmechanismen des Wirtes ausgesetzt. Diese Variabilität könnte daher von der Immunantwort des Wirtes induziert worden sein. Zusätzliche vermeintliche N-verknüpfte Glykosylierungsstellen in der V4-Region in allen heute bekannten Typ-1b-Isolaten und in der V5-Region von HC-J8 (Typ 2b) tragen möglicherweise weiter zur Modulation der Immunantwort bei. Deshalb ist eine Analyse dieser Region, in der vorliegenden Erfindung, für Sequenzen von Typ 3 und 4 hilfreich bei der Abgrenzung von Epitopen gewesen, welche in den V-Regionen von E1 liegen, welche kritisch für die zukünftige Entwicklung von Impfstoffen und Diagnostika sein werden.
Beispiel 3: Die NS3/NS4-Region von HCV-Typ 3
Für die NS3/NS4-Grenzregion wurden die folgenden Sätze von Primern in den Regionen von geringer Sequenzvariabilität, nach Alignieren der Sequenzen von HCV-1 (Choo et al., 1991), HCV-J (Kato et al., 1990), HC-J6 (Okamato et al., 1991) und HC-J8 (Okamoto et al., 1992) ausgewählt (Schreibweise in Kleinbuchstaben wird für Nukleotide verwendet, die aus Klonierungszwecken zugefügt wurden):
Es konnten keine PCR-Produkte mit den Primer-Sätzen A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M und N auf statistisch-geprimter cDNA, erhalten aus Typ-3-Seren, erhalten werden. Mit dem Primer-Satz O konnte kein Fragment aus Typ-3-Seren amplifiziert werden. Allerdings wurde ein Schmier, der einige wenige schwach färbbare Banden umfasste, aus dem Serum BR36 erhalten. Nach der Sequenzanalyse von mehreren DNA-Fragmenten, die aus dem Bereich um 300 bp auf dem Agarosegel gereinigt und kloniert worden waren, wurde nur von einem Klon, HCCI53 (SEQ ID Nr. 29) gezeigt, HCV-Information zu enthalten. Diese Sequenz wurde verwendet, um den Primer HCPr152 zu entwerfen.
Ein neuer Primer-Satz P wurde anschließend auf mehreren Seren getestet.
Das 464 bp große HCPr152/66-Fragment wurde aus Serum BR36 (BR36-20) und Serum HD10 (HD10-1) erhalten. Die folgenden Klone wurden von diesen PCR-Produkten erhalten:
Aus Fragment HD10-1:
HD10-1-25 (SEQ ID Nr. 31), HD10-1-3 (SEQ ID Nr. 33),
Aus Fragment BR36-20:
BR36-20-164 (SEQ ID Nr. 35), BR36-20-165 (SEQ ID Nr. 37), BR36-20-166 (SEQ ID Nr. 39).
Die aus Klonen mit SEQ ID Nr. 29, 31, 33, 35, 37 oder 39 erhaltenen Nukleotidsequenzen sind aligniert mit den Sequenzen von Prototyp-Isolaten von anderen Typen von HCV in der 6 gezeigt. Zusätzlich zu einer stillen Dritt-Buchstaben-Variation, führte eine Zweit-Buchstaben-Mutation zu einer E-zu-G-Substitution an der Position 175 der abgeleiteten Aminosäuresequenz von BR36 (7). Serum HD10-Klone waren vollständig identisch. Die zwei Typ-3-Isolate waren beinahe zu 94% homolog in der NS4-Region. Die Homologien mit anderen Typen sind in der Tabelle 5 präsentiert.
Beispiel 4: Analyse der Anti-NS4-Antwort auf typspezifische Peptide
Da die NS4-Sequenz die Information für ein bedeutsames Epitop-Cluster enthält, und da Antikörper gegen diese Region geringe Kreuzreaktivität aufzuzeigen scheinen (Chan et al., 1991), war es lohnend, die typspezifische Antikörperantwort gegen diese Region zu untersuchen. Für jeden der 3 Genotypen, HCV-1 (Choo et al., 1991), HC-J6 (Okamoto et al., 1991) und BR36 (vorliegende Erfindung), wurden drei 20-mer-Peptide synthetisiert, welche die Epitopregion zwischen den Aminosäuren 1688 und 1743 (wie abgebildet in der Tabelle 6) abdecken. Die synthetischen Peptide wurden als parallele Linien auf Membranstreifen aufgetragen. Die Detektion von Anti-NS4-Antikörpern und die Farbentwicklung wurden gemäß des Vorgehens durchgeführt, welches für das INNO-LIA HCV Ab II-Kit (Innogenetics, Antwerpen) beschrieben wurde. Eine Peptidsynthese wurde auf einem 9050-PepSynthesizer (Millipore) durchgeführt. Nach Inkubation mit 15 LiPA-selektierten Typ-3-Seren zeigten 9 Proben Reaktivität gegenüber NS4-Peptiden von mindestens 2 unterschiedlichen Typen, aber es wurde eine deutlich positive Reaktion für 3 Seren (Serum BR33, HD30 und DKH) auf den Typ-3-Peptiden beobachtet, während negativer (Serum BR33 und HD30) oder unbestimmte (Serum DKH) Reaktion auf den Typ-1- und Typ-2-NS4-Peptiden; der Test von 3 Seren erwies sich als negativ für Anti-NS4-Antikörper (8). Unter Verwendung derselben Membranstreifen, beschichtet mit den 9 Peptiden, wie oben angegeben, und wie gezeigt in der 8, wurden ebenfalls 38 Typ-1-Seren (10 vom Typ 1a und 28 vom Typ 1b), 11 Typ-2-Seren (10 vom Typ 2a und 1 vom Typ 2b), 12 Typ-3a-Seren und 2 Typ-4-Seren (wie bestimmt durch das LiPA-Vorgehen) getestet. Wie in der Tabelle 8 gezeigt wird, reagierten die Seren in einer Genotyp-spezifischen Weise mit den NS4-Epitopen. Diese Ergebnisse zeigen, dass typ-spezifische Anti-NS4-Antikörper in den Seren von einigen Patienten nachgewiesen werden können. Solche Genotyp-spezifischen synthetischen Peptide könnten verwendet werden, um Serotypisierungs-Assays zu entwickeln, zum Beispiel eine Mischung der neun Peptide, wie oben angegeben, oder vereinigt mit den NS4-Peptiden aus dem HCV-Typ-4- oder -6-Genotyp oder aus neuen Genotypen, entsprechend der Region zwischen den Aminosäuren 1688 und 1743, oder von synthetischen Peptiden der NS4-Region zwischen den Aminosäuren 1688 und 1743 von mindestens einem der 6 Genotypen, kombiniert mit dem E1-Protein oder Deletionsmutanten davon, oder synthetischen E1-Peptiden von mindestens einem der Genotypen. Solche Zusammensetzungen könnten ferner mit typspezifischen Peptiden oder Proteinen erweitert werden, einschließlich zum Beispiel der Region zwischen den Aminosäuren 68 und 91 des Core-Proteins, oder stärker bevorzugt, der Region zwischen den Aminosäuren 68 und 78. Darüber hinaus können derartige typspezifischen Antigene in vorteilhafter Weise verwendet werden, um derzeitige diagnostische Screening- und Bestätigungs-Assays und/oder HCV-Impfstoffe zu verbessern.
Beispiel 5: Die Core- und E1-Regionen von HCV-Typ 5
Proben-BE95 wurde aus einer Gruppe von Seren selektiert, welche in einem Prototyp-"Line Probe"-Assay, wie früher beschrieben (Stuyver et al., 1993), positiv reagierten, weil ein hoher Titer an HCV-RNA nachgewiesen werden konnte, was die Klonierung von Fragmenten durch eine einzige PCR-Runde ermöglichte. Da noch keine Sequenzen aus irgendeiner codierenden Region vom Typ 5 offenbart worden sind, wurden synthetische Oligonukleotide für die PCR-Amplifikation in den Regionen von geringer Sequenzvariation nach Alignierung der Sequenzen von HCV-1 (Choo et al., 1991), HCV-J (Kato et al., 1990), HC-J6 (Okamoto et al., 1991), HC-J8 (Okamoto et al., 1992) und den neuen Typ-3-Sequenzen der vorliegenden Erfindung HD10, BR33 und BR36 (siehe 5, Beispiel 2) gewählt. Die folgenden Sätze von Primern wurden auf einem 392-DNA/RNA-Synthesizer (Applied Biosystems) synthetisiert:
Die drei Sätze von Primern wurden verwendet, um die Regionen des Typ-5-Isolates PC, wie beschrieben (Stuyver et al., 1993) zu amplifizieren. Der Satz 1 wurde verwendet, um die E1-Region zu amplifizieren und ergab das Fragment PC-4, der Satz 2 war entworfen, um die Core-Region zu ergeben und ergab das Fragment PC-2.
Der Satz 3 wurde verwendet, um die Core-und-E1-Region zu amplifizieren und ergab das Fragment PC-3. Diese Fragmente wurden kloniert, wie es beschrieben wurde (Stuyver et al., 1993). Die folgenden Klone wurden aus den PCR-Fragmenten erhalten:
Aus Fragment PC-2:
PC-2-1 (SEQ ID Nr. 41), PC-2-6 (SEQ ID Nr. 43),
Aus Fragment PC-4:
PC-4-1 (SEQ ID Nr. 45), PC-4-6 (SEQ ID Nr. 47),
Aus Fragment PC-3:
PC-3-4 (SEQ ID Nr. 49), PC-3-8 (SEQ ID Nr. 51)
Ein Alignment von Sequenzen mit SEQ ID Nr. 41, 43, 45, 47, 49 und 51 ist in der 9 angegeben. Eine Konsensus-Aminosäuresequenz (PC C/E1; SEQ ID Nr. 54) kann aus jedem der 2 Klone, kloniert aus jedem der 3 PCR-Fragmente, wie abgebildet in 5, abgeleitet werden, welche mit der Region zwischen den Nukleotiden 1 und 957 (Kato et al., 1990) überlappt. Die 6 Klone sind zueinander sehr nah verwandt (wechselseitige Homologien von etwa 99,7%).
Ein Alignment der Nukleotidsequenz mit der SEQ ID Nr. 53 oder 151 (PC C/E1 aus dem Isolat BE95) mit bekannten Nukleotidsequenzen aus der Core/E1-Region wird in der 3 angegeben. Der Klon ist nur entfernt verwandt zu Sequenzen vom Typ 1, Typ 2, Typ 3 und Typ 4 (Tabelle 5).
Beispiel 6: NS3/NS4-Region von HCV-Typ 5
Es wurden Versuche unternommen, die NS3/NS4-Region des Isolates BE95, welches im Beispiel 5 beschrieben ist, zu klonieren. Die folgenden Sätze an Primern wurden in den Regionen von geringer Sequenzvariabilität nach Alignieren der Sequenzen von HCV-1 (Choo et al., 1991), HCV-J (Kato et al., 1991), HC-J6 (Okamoto et al., 1991) und HC-J8 (Okamoto et al., 1992) und den Sequenzen, welche aus Typ-3-Seren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden (SEQ ID Nr. 31, 33, 35, 37 und 39), ausgewählt; die Schreibweise in Kleinbuchstaben wird für Nukleotide verwendet, welche aus Klonierungszwecken hinzugefügt wurden:
Es konnten keine PCR-Produkte mit den Primer-Sätzen A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M und N oder statistisch-geprimter cDNA, erhalten aus Typ-3-Seren, erhalten werden. Allerdings ergab der Satz O etwas, was ein PCR-Artefakt-Fragment zu sein schien, schätzungsweise bei etwa 1450 Basenpaaren, anstatt der erwarteten 628 Basenpaare. Obwohl es nicht erwartet wird, dass PCR-Artefakt-Fragmente Information des Gens oder Genoms enthalten, welches in dem Experiment angezielt wurde, wurden Bemühungen unternommen, dieses Artefakt-Fragment zu klonieren, welches als Fragment PC-1 bezeichnet wurde. Die folgenden Klone wurden aus dem Fragment PC-1 erhalten:
PC-1-37 (SEQ ID Nr. 59 und SEQ ID Nr. 55), PC-1-48 (SEQ ID Nr. 61 und SEQ ID Nr. 57)
Die aus den 5'- und 3'-Enden der Klone erhaltenen Sequenzen sind in den SEQ ID Nr. 55, 57, 59 und 61 angegeben, und die vollständigen Sequenzen, mit den SEQ ID Nr. 197 und 199, sind aligniert mit den Sequenzen von Prototyp-Isolaten von anderen Typen von HCV in der 10 gezeigt, und das Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen wird in der 11 und 7 gezeigt. Überraschenderweise enthielt der PCR-Artefakt-Klon HCV-Information. Die Positionen der Sequenzen innerhalb des HCV-Genoms sind kompatibel bzw. übereinstimmend mit einer fortlaufenden HCV-Sequenz von 1437 Nukleotiden, was die geschätzte Größe des klonierten PCR-Artefakts-Fragments ist. Der Primer HCPr66 primte korrekt an der erwarteten Position im HCV-Genom. Deshalb muss der Primer HCPr3 zufällig an einer Position 809 Nukleotide stromaufwärts von seiner richtigen Position im HCV-Genom fehl-geprimt haben. Dies konnte nicht erwartet werden, weil keine Sequenzinformation aus einer codierenden Region vom Typ 5 verfügbar war.
Beispiel 7: Die E2-Region von HCV-Typ 5
Das Serum BE95 wurde für Experimente ausgewählt, welche auf die Amplifizierung eines Teils der E2-Region vom HCV-Typ 5 zielten.
Nach Alignieren der Sequenzen von HCV-1 (2), HCV-J (1), HC-J6 (3) und HC-J8 (4) wurden PCR-Primer in denjenigen Regionen mit geringer Sequenzvariation gewählt.
Die Primer HCPr109 (+): 5'-TGGGATATGATGATGAACTGGTC-3' (SEQ ID Nr. 141) und HCPr14 (–): 5'-CCAGG-TACAACCGAACCAATTGCC-3' (SEQ ID Nr. 142) wurden kombiniert, um die aminoterminale Region der E2/NS1-Region zu amplifizieren, und wurden auf einem 392-DNA/RNA-Synthesizer (Applied Biosystems) synthetisiert. Mit den Primern HCPr109 und HCPr14 wurde ein PCR-Fragment von 661 bp erzeugt, enthaltend 169 Nukleotide, welche dem E1-Carboxyterminus entsprechen, und 492 Basen aus der Region, welche den E2-Aminoterminus codiert.
Ein Alignment der Typ-5-E1/E2-Sequenzen mit SEQ ID Nr. 158 mit bekannten Sequenzen ist in der 10 wiedergegeben. Die abgeleitete Proteinsequenz wurde mit den verschiedenen Genotypen verglichen (12, Aminosäuren 328-546). In der E1-Region gab es keine aufgefundenen strukturellen bedeutsamen Extra-Motive. Der aminoterminale Teil von E2 war hypervariabel im Vergleich zu den anderen Genotypen. Alle 6 N-Glykosylierungsstellen und alle 7 Cysteinreste waren in dieser E2-Region konserviert. Um die Alignierung zu bewahren, war es notwendig, eine Lücke zwischen aa 474 und 475, wie für Typ 3a, aber nicht zwischen aa 480 und 481, wie für Typ 2, einzuführen.
Beispiel 8: Die NS5b-Region von HCV-Typ-4
Typ-4-Seren GB48, GB116, GB215 und GB358, selektiert mittels eines Linien-Sonden-Assays (LiPA, Stuyver et al., 1993), sowie die Seren GB549 und GB809, welche mittels dieses LiPA nicht typisiert werden konnten (es wurde nur Hybridisierung mit den Universal-Sonden beobachtet), wurden aus Patienten aus Gabun selektiert. Alle diese Seren waren nach der ersten Runde von PCR-Reaktionen für die 5'-untranslatierte Region (Stuyver et al., 1993) positiv und wurden für eine weitere Untersuchung beibehalten.
RNA wurde aus den Seren isoliert, und cDNA wurde synthetisiert, wie beschrieben im Beispiel 1. Universal-Primer in der NS5-Region wurden nach Alignierung der veröffentlichten Sequenzen wie folgend ausgewählt:
und wurden auf einem 392-DNA/RNA-Synthesizer (Applied Biosystems) synthetisiert. Unter Anwendung des Linien-Sonden-Assays (LiPA) wurden vier Hochtiter-Typ-4-Seren und -2-Seren, welche nicht klassifiziert werden konnten, selektiert und anschließend mit dem Primer-Satz HCPr206/207 analysiert. NS5-PCR-Fragmente, die unter Verwendung dieser Primer aus dem Serum GB48 (GB48-3), Serum GB116 (GB116-3), Serum GB215 (GB215-3), Serum GB358 (GB358-3), Serum GB549 (GB549-3) und Serum GB809 (GB809-3) erhalten wurden, wurden für die Klonierung selektiert. Die folgenden Sequenzen wurden aus den PCR-Fragmenten erhalten:
Aus Fragment GB48-3: GB48-3-10 (SEQ ID Nr. 106)
Aus Fragment GB116-3: GB116-3-5 (SEQ ID Nr. 108)
Aus Fragment GB215-3: GB215-3-8 (SEQ ID Nr. 110)
Aus Fragment GB358-3: GB358-3-3 (SEQ ID Nr. 112)
Aus Fragment GB549-3: GB549-3-6 (SEQ ID Nr. 114)
Aus Fragment GB809-3: GB809-3-1 (SEQ ID Nr. 116)
Ein Alignment von Nukleotidsequenzen mit den SEQ ID Nr. 106, 108, 110, 112, 114 und 116 mit bekannten Sequenzen wird in der 1 angegeben. Ein Alignment von abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit den SEQ ID Nr. 107, 109, 111, 113, 115 und 117 mit bekannten Sequenzen ist in der 2 angegeben. Die 4 Isolate, welche mittels LiPA als Typ 4 typisiert worden waren, sind zueinander sehr nah verwandt (wechselseitige Homologien von etwa 95%), sind aber nur entfernt verwandt zu Sequenzen vom Typ 1, Typ 2 und Typ 3 (z. B. zeigt GB358 Homologien von 65,6 bis 67,7% mit anderen Genotypen, Tabelle 4). Die aus den Seren GB549 und GB809 erhaltene Sequenz zeigt ebenfalls ähnliche Homologien mit den Genotypen 1, 2 und 3 (65,9 bis 68,8% für GB549 und 65,0 bis 68,5% für GB809, Tabelle 4), aber eine intermediäre Homologie von 79,7 bis 86,8% (häufig beobachtet zwischen Subtypen des gleichen Typs) existiert zwischen GB549 oder GB809 zu der Gruppe von Isolaten, welche aus GB48, GB116, GB215 und GB358 besteht, oder zwischen GB549 und GB809. Diese Daten verdeutlichen die Auffindung von 3 neuen Subtypen innerhalb des HCV-Genotyps 4: In der vorliegenden Erfindung werden diese 3 Subtypen als Subtyp 4c, repräsentiert durch die Isolate GB48, GB116, GB215 und GB358, Subtyp 4g, repräsentiert durch Isolat GB549, und Subtyp 4e, repräsentiert durch das Isolat GB809, bezeichnet. Obwohl die beobachteten Homologien zwischen den Subtypen in der NS5-Region auf eine nähere Verwandtschaft zwischen den Subtypen 4c und 4e hinzuweisen scheinen, zeigen die in der E1-Region beobachteten Homologien, dass die Subtypen 4g und 4e die näheste Verwandtschaft aufweisen (siehe Beispiel 8).
Beispiel 9: Die Core/E1-Region von HCV-Typ 4
Aus jedem der 3 neuen Typ-4-Subtypen wurde ein repräsentatives Serum für Klonierungsexperimente in der Core/E1-Region ausgewählt. GB549 (Subtyp 4g) und GB809 (Subtyp 4e) wurden zusammen mit dem Isolat GB358 analysiert, welches aus der Subtyp-4c-Gruppe gewählt wurde.
Synthetische Oligonukleotide:
Nach Alignieren der Sequenzen von HCV-1 (2), HCV-J (1), HC-J6(3) und HC-J8 (4) wurden PCR-Primer in denjenigen Regionen mit geringer Sequenzvariation ausgewählt.
Die Primer HCPr52 (+): 5'-atgTTGGGTAAGGTCATCGATACCCT-3' HCPr23 (+): 5'-CTCATGGGGTACATTCCGCT-3' und HCPr54 (–): 5'-CTATTACCAGTTCATCATCATATCCCA-3' wurden auf einem 392-DNA/RNA-Synthesizer (Applied Biosystems) synthetisiert. Es wurden die Sätze von Primern HCPr23/54 und HCPr52/54 verwendet, aber nur mit dem Primer-Satz HCPr52/54 konnten PCR-Fragmente erhalten werden. Dieser Satz von Primern amplifizierte die Sequenz von Nukleotid 379 bis 957, welche die Aminosäuren 127 bis 319 codiert: 65 Aminosäuren aus dem Carboxyterminus von Core und 128 Aminosäuren von E1. Die Amplifikationsprodukte GB358-4, GB549-4 und GB809-4 wurden kloniert, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist. Die folgenden Klone wurden aus den PCR-Fragmenten erhalten:
Aus Fragment GB358-4: GB358-4-1 (SEQ ID Nr. 118)
Aus Fragment GB549-4: GB549-4-3 (SEQ ID Nr. 120)
Aus Fragment GB809-4: GB809-4-3 (SEQ ID Nr. 122)
Ein Alignment der Typ-4-Core/E1-Nukleotidsequenzen mit den SEQ ID Nr. 118, 120 und 122 mit bekannten Sequenzen ist in der 4 präsentiert. Die Homologien der Typ-4-E1-Region (ohne Core) mit Typ-1-, Typ-2-, Typ-3- und Typ-5-Prototypsequenzen sind in der Tabelle 4 abgebildet. Homologien von 53 bis 66% werden mit repräsentativen Isolaten von Nicht-Typ-4-Genotypen beobachtet. Die beobachteten Homologien in der E1-Region innerhalb von Typ 4, zwischen den verschiedenen Subtypen, liegen im Bereich von 75,2 bis 78,4%. Die kürzlich offenbarten Sequenzen der Core-Region von ägyptischen Typ-4-Isolaten (zum Beispiel EG-29 in der 3), welche von Simmonds et al. (1993) beschrieben wurden, lassen kein Alignment mit den Sequenzen aus Gabun (wie beschrieben in der vorliegenden Erfindung) in der NSB-Region zu und können (einem) unterschiedlichen Typ-4-Subtyp(en) angehören, wie es aus den Core-Sequenzen abgeleitet werden kann. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit den SEQ ID Nr. 119, 121 und 123 werden in der 5 mit anderen Prototyp-Sequenzen aligniert. Wiederum liegt eine typspezifische Variation hauptsächlich in den variablen V-Regionen, welche in der vorliegenden Erfindung angegeben sind, und deshalb werden Typ-4-spezifische Aminosäuren oder V-Regionen bei Diagnose und Therapie für HCV-Typ-4 hilfreich sein.
Beispiel 10: Die Core/E1- und NS5b-Regionen von neuen Subtypen von HCV-Typ 2, 3 und 4
Die Proben NE92 (Subtyp 2d), BE98 (Subtyp 3c), CAM600 und GB809 (Subtyp 4e), CAMG22 und CAMG27 (Subtyp 4f), GB438 (Subtyp 4h), CAR4/1205 (Subtyp 4i), CAR1/501 (Subtyp 4j), CAR1/901 (Subtyp 4?) und GB724 (Subtyp 4?) wurden aus einer Gruppe von Seren gewählt, welche positiv aber abweichend in einem Prototyp-Linien-Sonden-Assay, wie früher beschrieben (Stuyver et al., 1993), reagierten. Ein anderes Typ-5a-Isolat BE100 wurde ebenfalls in der C/E1-Region analysiert, und noch ein anderes Typ-5a-Isolat BE96 in der NS5b-Region. Ein hoher Titer an HCV-RNA konnte detektiert werden, welcher die Klonierung von Fragmenten durch eine einzige PCR-Runde ermöglichte. Da keine Sequenzen aus irgendeiner codierenden Region dieser Subtypen bereits offenbart worden waren, wurden synthetische Oligonukleotide für PCR-Amplifikationen in den Regionen von geringer Sequenzvariation nach Alignieren der Sequenzen von HCV-1 (Choo et al., 1991), HCV-J (Kato et al., 1990), HC-J6 (Okamoto et al., 1991), HC-J8 (Okamoto et al., 1992) und der anderen neuen Sequenzen der vorliegenden Erfindung gewählt.
Es wurden die oben erwähnten Sätze 1, 2 und 3 (siehe Beispiel 5) von Primern verwendet, aber nur mit Satz 1 konnten PCR-Fragmente von allen Isolaten erhalten werden (außer für BE98, GB724 und CARL/501). Dieser Satz von Primern amplifizierte die Sequenz von Nukleotid 379 bis 957, welche die Aminosäuren 127 bis 319 codiert: 65 Aminosäuren aus dem Carboxyterminus von Core und 128 Aminosäuren von E1. Mit Satz 3 konnte die Core/E1-Region aus Isolat NE92 und BE98 amplifiziert werden, und mit Satz 2 konnte die Core-Region von GB358, GB724, GB809 und CAM600 amplifiziert werden. Die Amplifikationsprodukte wurden wie im Beispiel 1 beschrieben kloniert. Die folgenden Klone wurden aus den PCR-Fragmenten erhalten:
Aus Isolat GB724, der Klon mit der SEQ ID Nr. 193 aus der Core-Region,
aus Isolat NE92 der Klon mit der SEQ ID Nr. 143,
aus Isolat BE98, der Klon aus der Core/E1-Region, wobei ein Teil der Sequenz analysiert worden ist und in SEQ ID Nr. 147 angegeben wird,
aus Isolat CAM600 der Klon mit der SEQ ID Nr. 167 aus der E1-Region, oder SEQ ID Nr. 165 aus der Core/E1-Region, wie gezeigt in der 3,
aus Isolat CAMG22, der Klon mit der SEQ ID Nr. 171 aus der E1-Region, wie gezeigt in 4,
aus Isolat GB358, der Klon mit der SEQ ID Nr. 191 in der Core-Region,
aus Isolat CAMG27, der Klon mit SEQ ID Nr. 173 aus der Core/E1-Region,
aus Isolat GB438, der Klon mit SEQ ID Nr. 177 aus der Core/E1-Region,
aus Isolat CAR4/1205, der Klon mit SEQ ID Nr. 179 aus der Core/E1-Region,
aus Isolat CAR1/901, der Klon mit SEQ ID Nr. 181 aus der Core/E1-Region,
aus Isolat GB809, der Klon GB809-4 mit SEQ ID Nr. 189,
aus der Core/E1-Region, der Klon GB809-2 mit SEQ ID Nr. 169 aus der Core/E1-Region und der Klon mit SEQ ID Nr. 163 aus der Core-Region,
und aus dem Isolat BE100, der Klon mit der SEQ ID Nr. 155 aus der Core/E1-Region, wie gezeigt in der 4.
Ein Alignment dieser Core/E1-Sequenzen mit bekannten Core/E1-Sequenzen wird in der 4 präsentiert. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit den SEQ ID Nr. 144, 148, 164, 168, 170, 172, 174, 178, 180, 182, 190, 192, 194, 156, 166 sind in der 5 mit anderen Prototypsequenzen aligniert. Wiederum liegt eine typspezifische Variation hauptsächlich in den variablen V-Regionen, angegeben in der vorliegenden Erfindung, vor, und deshalb werden für Typ 2d, 3c und Typ 4 spezifische Aminosäuren oder Regionen bei Diagnose oder Therapeutika für HCV-Typ (Subtyp) 2d, 3c die verschiedenen Typ-4-Subtypen behilflich sein.
Die NS5b-Region der Isolate NE92, BE98, CAM600, CAMG22, GB438, CAR4/1205, CAR1/501 und BE96 wurde mit dem Primern HCPr206 und HCPr207 (Tabelle 7) amplifiziert. Die entsprechenden Klone wurden kloniert und sequenziert, wie im Beispiel 1, und die entsprechenden Sequenzen (von welchen BE98 teilweise sequenziert wurde) erhielten die folgenden Identifikationsnummern:
NE92: SEQ ID Nr. 145
BE98: SEQ ID Nr. 149
CAM600: SEQ ID Nr. 201
CAMG22: SEQ ID Nr. 203
GB438: SEQ ID Nr. 207
CAR4/1205: SEQ ID Nr. 209
CAR1/501: SEQ ID Nr. 211
BE95: SEQ ID Nr. 159
BE96: SEQ ID Nr. 161
Eine Alignierung dieser NS5b-Sequenzen mit bekannten NS5b-Sequenzen ist in der 1 präsentiert. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit den SEQ ID Nr. 146, 150, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 160, 162 werden in der 2 mit anderen Prototyp-Sequenzen aligniert. Erneut können subtyp-spezifische Variationen beobachtet werden, und deshalb werden für Typ 2d, 3c und Typ 4 spezifische Aminosäuren oder V-Regionen bei Diagnose und Therapeutika für HCV-Typ (Subtyp) 2d, 3c oder die verschiedenen Typ-4-Subtypen hilfreich sein.
Beispiel 11: Genotyp-spezifische Reaktivität von Anti-E1-Antikörpern (Serotypisierung)
E1-Proteine wurden von Vaccinia-Virus-Konstrukten, die eine Core/E1-Region, welche sich von den Nukleotidpositionen 355 bis 978 erstreckt (Core/E1-Klone, welche in den vorangehenden Beispielen beschrieben wurden, einschließlich der Primer HCPr52 und HCPr54), und exprimierte Proteine von L119 (nach dem Initiator-Methionin) zu W326 des HCV-Polyproteins enthielten, exprimiert. Das exprimierte Protein wurde nach der Expression in der geeigneten Wirtszelle (z. B. HeLa, RK13, HuTK-, HepG2) durch Spaltung zwischen den Aminosäuren 191 und 192 des HCV-Polyproteins und durch die Addition von Kohlenhydratmotiven vom Hoch-Mannose-Typ modifiziert. Deshalb konnte ein 30 bis 32 kDa großes Glykoprotein auf einem Western-Blot mittels Detektion mit Serum aus Patienten mit Hepatitis C beobachtet werden.
Als eine Referenz wurde auch ein Genotyp-1b-Klon, der aus dem Isolat HCV-B erhalten worden war, in einer identischen Weise wie oben beschrieben exprimiert, und wurde aus dem rekombinanten Vaccinia-Virus vvHCV-11A exprimiert.

Eine Auswahl von 104 genotypisierten Seren wurde zuerst hinsichtlich Reaktivität mit einem Zelllysat, enthaltend Typ-1b-Protein, exprimiert aus dem rekombinanten Vaccinia-Virus vvHCV-11A, getestet und mit Zelllysat von RK13-Zellen verglichen, welche mit einem Wildtyp-Vaccinia-Virus ('E1/WT') infiziert waren. Die Lysate wurden als eine 1/20-Verdünnung auf eine normale ELISA-Mikrotiter-Platte (Nunc maxisorb) aufbeschichtet und mit einer 1/20-Verdünnung der jeweiligen Seren reagieren gelassen. Die Auswahl bestand aus 14 Typ-1a-, 38 Typ-1b-, 21 Typ-2-, 21 Typ-3a- und 9 Typ-4-Seren. Humane Antikörper wurden anschließend durch einen Ziege-Anti-Mensch-IgG, der mit Peroxidase konjugiert war, detektiert, und die Enzymaktivität wurde nachgewiesen. Die optischen Dichte-Werte der E1- und Wildtyp-Lysate wurden dividiert, und ein Faktor 2 wurde als der Ausschlusswert (cut-off) herangezogen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle A angegeben. Elf von 14 Typ-1a-Seren (79%), 25 von 38 Typ-1b-Seren (66%), 6 von 21 (29%), 5 von 21 (24%), und keines von 9 Typ-4[-Seren] oder Typ-5-Serum (0%) reagierten. Diese Ergebnisse zeigen deutlich das hohe Vorherrschen von Anti-E1-Antikörpern, welche mit dem Typ-1-E1-Protein reaktiv sind, in Patienten, welche mit Typ 1 infiziert waren (36/52 (69%)) (entweder Typ 1a oder Typ 1b), aber das niedrige Vorherrschen oder die Abwesenheit in Nicht-Typ-1-Seren (11/52 (21%)). Tabelle A

Serum	E1/WT
Typ 1a
3748	3,15
3807	3,51
5282	1,99
9321	3,12
9324	2,76
9325	6,12
9326	10,56
9356	1,79
9388	3,5
8366	10,72
8380	2,27
10925	4,02
10936	5,04
10938	1,36
Typ 1b
5205	2,25
5222	1,33
5246	1,24
5250	13,58
5493	0,87
5573	1,75
8243	1,77
8244	2,05
8316	1,21
8358	5,04
9337	14,47
9410	5
9413	5,51
10905	1,26
10919	5,00
10928	8,72
10929	8,26
10931	2,3
10932	4,41
44	2,37
45	3,14
46	4,37
47	5,68
48	2,97
49	1,18
50	9,85
51	4,51
52	1,11
53	5,20
54	0,98
55	1,48
56	1,06
57	3,85
58	7,6
59	3,28
60	3,23
61	7,82
62	1,92
Typ 2
23	0,91
24	1,16
25	2,51
26	0,96
27	1,20
28	0,96
29	2,58
30	8,05
31	0,92
32	0,82
33	5,75
34	0,79
35	0,86
36	0,85
37	0,76
38	0,92
39	1,08
40	2,33
41	2,83
42	1,21
43	0,91
Typ 3
1	6,88
2	1,47
3	3,06
4	6,52
5	10,24
6	2,72
7	1,11
8	1,54
9	1,60
10	1,21
11	1,07
12	1,00
13	0,85
14	0,96
15	0,51
16	1,00
17	1,09
18	0,99
19	1,04
20	1,04
21	0,96
Typ 4
22	0,87
GB48	0,49
GB113	0,68
GB116	0,73
GB215	0,52
GB358	0,56
GB359	0,71
GB438	1,08
GB516	1,04
Typ 5
BE95	0,86

Core/E1-Klone der Isolate BR36 (Typ 3a) und BE95 (Typ 5a) wurden anschließend in die Viren vvHCV-62 bzw. vvHCV-63 hinein rekombiniert. Eine genotypisierte Auswahl von Seren wurde anschließend auf Zelllysaten getestet, die aus RK13-Zellen erhalten wurden, welche mit den rekombinanten Viren vvHCV-62 und vvHCV-63 infiziert waren. Tests wurden wie oben beschrieben durchgeführt, und die Ergebnisse sind in der nachstehend angegebenen Tabelle (Tabelle B) angegeben. Aus diesen Ergebnissen lässt es sich deutlich ersehen, dass, obwohl eine gewisse Kreuzreaktivität stattfindet (speziell zwischen Typ 1 und 3), die erhaltenen Werte eines gegebenen Serums üblicherweise höher gegenüber seinem homologen E1-Protein sind als gegenüber einem E1-Protein von einem anderen Genotyp. Für Typ-5-Seren war keines der 5 Seren gegenüber E1-Proteinen vom Typ 1 oder 3 reaktiv, wohingegen 3 von 5 gezeigtermaßen Anti-E1-Antikörper enthielten, wenn sie gegenüber ihrem homologen Typ-5-Protein getestet wurden. In diesem einfachen Testsystem kann daher eine beträchtliche Anzahl von Seren bereits serotypisiert werden. Kombiniert mit der Reaktivität gegenüber typspezifischen NS4-Epitopen oder Epitopen, die aus anderen typspezifischen Teilen des HCV-Polyproteins abgeleitet sind, kann ein Serotypisierungs-Assay zum Unterscheiden der Haupttypen von HCV entwickelt werden. Um das Problem der Kreuzreaktivität zu lösen, kann die Position von kreuzreaktiven Epitopen durch den Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden (z. B. mittels Kompetition der Reaktivität mit synthetischen Peptiden), und die Epitope, welche eine Kreuzreaktivität hervorrufen, können aus der Zusammensetzung, die in den Serotypisierungs-Assay eingebracht werden soll, herausgelassen werden oder können in das Proben-Verdünnungsmittel eingeschlossen werden, um kreuzreaktive Antikörper heraus zu kompetitieren. Tabelle B

Serum	E1^1b/WT	E1^3a/WT	E1^5a/WT

Typ 1b
8316	0,89	0,59	0,80
8358	2,22	2,65	1,96
9337	1,59	0,96	0,93
9410	16,32	9,60	3,62
9413	9,89	2,91	2,85
10905	1,04	0,96	1,05
10919	3,17	2,56	2,96
10928	4,39	2,28	2,07
10929	2,95	2,07	2,08
10931	3,11	1,49	2,11
5	0,86	0,86	0,96
6	3,48	1,32	1,32
7	6,76	4,00	3,77
8	10,88	3,44	4,04
9	1,76	1,88	1,58
10	9,88	7,48	7,20
11	8,48	8,99	8,45
12	0,76	0,72	0,76
13	5,04	5,67	5,37
14	10,48	10,54	11,22
15	5,18	1,62	1,65
Typ 3
8332	3,39	4,22	0,66
10907	3,24	4,39	0,96
10908	0,99	0,94	0,98
10934	0,86	0,90	0,90
10927	2,58	2,71	2,44
8210	0,82	0,80	0,86
8344	1,09	6,66	1,17
8351	1,21	1,29	1,22
30	0,85	4,11	0,98
32	0,85	2,16	1,04
Typ 5
	0,78	0,95	1,54
BE110	0,79	1,01	4,95
BE95	0,47	0,52	0,65
BE111	0,71	0,75	8,33
BE112	1,01	1,27	2,37
BE113	1,11	1,35	1,60

Tabelle 5. Homologien von neuen HCV-Sequenzen mit anderen bekannten HCV-Typen

Region (Nukleotide)	Isolat (Typ)	1a HCV-1	1b HCV-J	2a HC-J6	2b HC-J8	3a			3b
Region (Nukleotide)	Isolat (Typ)	1a HCV-1	1b HCV-J	2a HC-J6	2b HC-J8	T1	T7	T9	T10
Core (1-573)	PC(5)	83,8 (91,6)	84,8 (92,1)	82,6 (90,1)	82,4 (89,0)
E1 (574-957)	HD10 (3)	61,5 (68,0)	64,6 (68,8)	57,8 (55,5)	56,3 (59,4)
	BR36 (3)	62,0 (66,4)	62,5 (67,2)	56,5 (53,9)	55,2 (58,6)
	BR33 (3)	60,7 (67,2)	63,3 (68,0)	56,5 (54,7)	56,0 (58,6)
	PC (5)	61,4 (64,0)	62,4 (64,8)	54,1 (49,6)	53,3 (47,2)
	GB358 (4a)	62,5 (69,1)	62,8 (65,9)	59,4 (54,0)	54,4 (54,0)
	GB549 (4b)	66,0 (72,2)	62,8 (69,8)	59,1 (56,4)	56,5 (54,0)
	GB809 (4c)	63,3 (69,1)	60,7 (64,3)	56,7 (53,2)	53,0 (51,6)
NS (3856-4209)	PC(5)	74,7 (89)	76,1 (86,4)	71,6 (89,8)	78,0 (89,0)
NS4 (4892-5292)	BR36(3)	67,8 (78,5)	69,8 (75,1)	62,0 (67,5)	61,7 (66,0)
NS4 (4892-5292)	HD10 (3)	69,8 (74,6)	66,6 (69,7)	57,8 (59,9)	59,1 (59,9)
NS4 (4936-5292)	PC (5)	61,3 (62,2)	63,0 (65,5)	52,9 (46,2)	54,3 (43,7)
NS5b (8023-8235)	BR34 (3)	65,7	66,7	63,9	64,3	94,8	93,9	75,6	77,0
	BR36(3)	64,3	67,6	64,8	66,7	94,8	93,4	75,1	76,5
	BR33 (3)	65,7	67,1	64,3	64,8	94,8	93,9	76,0	77,5
	GB358 (4a)	67,7 (76,1)	65,6 (77,0)	66,5 (70,8)	65,6 (71,7)
	GB549 (4b)	68,8 (76,1)	67,1 (77,0)	65,9 (71,7)	65,9 (74,4)
	GB809 (4c)	68,5 (73,5)	65,0 (73,5)	67,7 (69,9)	67,7 (73,5)

Gezeigt sind die Nukleotidhomologien (die Aminosäure-Homologie ist in Klammern angegeben) für die Region, welche in der linken Spalte angegeben ist.

Tabelle 7

Tabelle 8: NS4-SEROTYPISIERUNG

Serum	Typ 1 NS4			Typ 2 NS4			Typ 3 NS4
Serum	1	5	7	1	5	7	1	5	7
Typ 1a
101	3	3	3	–	1	3	+/–	+/–	3
102	1	+/–	2	–	–	2	–	–	1
103	1	3	3	–	+/–	3	–	+/–	3
104	3	3	3	2	2	3	3	+/–	2
105	3	3	3	–	2	2	+/–	+/–	2
106	3	1	1	–	1	2	+/–	+/–	+/–
107	3	3	3	–	2	2	2	–	1
108	3	3	3	–	+/–	2	+/–	1	2
109	3	3	3	+/–	2	3	1	–	3
110	3	3	3	–	+/–	1	–	–	3
Typ 1b
111	+/–	+/–	–	–	–	–	–	–	–
112	–	2	3	–	–	2	–	–	3
113	2	3	3	–	–	1	–	–	3
114	2	3	3	1	+	2	+	1	3
115	3	3	3	–	+	3	–	–	3
116	3	3	3	–	+/–	1	–	–	1
117	3	–	–	3	+/–	–/–	+/–	–	–
118	1	2	3	–	+/–	2	–	+/–	3
119	+/–	2	2	+/–	+/–	2	+	1	2
120	–	3	3	–3	+/–	+/–	–	–	–
121	3	3	3	+/–	2	2	2	2	3
122	3	3	1	–	1	2	2	1	1
123	3	3	2	–	1	2	–	1	1
124	3	3	3		+/–	2	–	–	2
125	3	3	3	1	1	3	2	1	3
126	1	2	2	1	1	1	1	1	1
127	3	2	+/–	–	+/–	1	+/–	+/–	+/–
128	3	3	3	–	+/–	1	2	+/–	+/–
129	2	3	3	–	–	3	–	–	3
130	–	2	1	+/–	–	–	–	–	–
131	–	1	1	–	–	–	–	–	+/–
132	–	–	–	+/–	–	+/–	+/–	–	–
133	3	3	3	–	1	3	–	1	3
134	–	2	2	–	–	–	–	–	–
135	3	3	3	1	+	2	2	1	3
136	–	3	3	+/–	+/–	+/–	+/–	–	3
137	+/–	+/–	+/–	+/–	+/–	+/–	+/–	–	–
138	3	3	3	+/–	2	2	1	+	3
Typ 2a
139	3	–	–	3	3	+/–	1	–	–
140	+/–	–	–	3	3	3	3	–	–
141	2	–	–	2	1	+/–	2	–	–
142	–	–	–	–	+/–	–	–	–	–
143	–	+/–	+/–	1	2	1	1	+/–	+/–
144	1	1	+	1	3	2	1	1	2
145	–	+/–	+/–	3	1	2	2	–	+/–
146	–	–	–	+/–	+/–	–	–	–	–
147	–	+/–	–	3	1	3	–	–	–
148	–	–	–	+/–	–	–	+/–	–	–
Typ 2b
149	–	+/–	+/–	3	3	1	2	+/–	+/–
Typ 3
150	+/–	+/–	+/–	+/–	+/–	+/–	1	3	3
151	–	–	–	–	–	–	2	–	2
152	+/–	–	–	–	–	–	3	–	–
153	–	–	–	–	–	–	–	1	–
154	+/–	1	3	–	+/–	2	2	1	3
155	–	2	3	–	2	2	1	1	3
155	–	–	–	–	–	–	–	–	–
157	–	–	–	+/–	+/–	–	+/–	2	2
155	2	–	–	–	1	2	3	2	2
159	–	–	–	–	+/–	+/–	–	3	3
160	–	–	–	–	+/–	–	–	2	3
161	–	–	–	–	1	1		3	2
Typ 4
162	1	–	–	–	–	–	–	–	–
163	2	–	–	–	+/–	+/–	+/–	–	–

REFERENZEN

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SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

HCV-Subtyp-3a-Polynukleinsäure aus der Gruppe: – genomische HCV-Sequenz mit mindestens 76% Homologie oder mehr zu einer beliebigen Sequenz gemäß SEQ ID NO 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 oder 27 in der Region, die sich über die Nukleotidpositionen 417 bis 957 der Core/E1-Region erstreckt; – genomische HCV-Sequenz mit mindestens 76% oder mehr Homologie zu einer beliebigen Sequenz gemäß SEQ ID NO 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 oder 27 in der Region, die sich über die Nukleotidpositionen 574 bis 957 der E1-Region erstreckt, oder deren Komplement.
HCV-Subtyp-3a-Polynukleinsäure, die eine Sequenz von 8 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden enthält, wobei diese Sequenz nur einmal in einer genomischen HCV-Sequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 oder 27 in der Region, die sich über die Nukleotidposition 417 bis 957 der Core/E1-Region erstreckt, vorkommt.
HCV-Subtyp-3a-Polynukleinsäure, die eine Sequenz von 8 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden enthält, die einem Teil einer genomischen HCV-Sequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 oder 27 in der Region, die sich über die Nukleotidposition 417 bis 957 der Core/E1-Region erstreckt, entsprich, und wobei diese Polynukleinsäure für mindestens einen der folgenden Aminosäurereste des HCV-Polyproteins codiert: I186, H187, A190, S191, W194, Q231, A237, M280, Q299, L308 oder L313, wobei diese Aminosäurebezeichnung aus einem Buchstaben, der den Aminosäurerest gemäß seinem Einbuchstaben-Code darstellt, und einer Ziffer, die die Aminosäure-numerierung in Tabelle 1 darstellt, besteht.
Polynukleinsäure, die von einer HCV-Subtyp-3a-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 abgeleitet ist, wobei diese Polynukleinsäure als Primer für die spezifische Amplifikation einer HCV-Subtyp-3a-Nukleinsäure eines bestimmten Isolats, das zu dem Genotyp, von dem sich der Primer ableitet, gehört, dienen kann.
Polynukleinsäure, die von einer HCV-Subtyp-3a-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 abgeleitet ist, wobei diese Polynukleinsäure als Hybridisierungssonde für den spezifischen Nachweis und/oder die spezifische Einteilung in Typen einer HCV-Subtyp-3a-Nukleinsäure dienen kann.
Verwendung einer Polynukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für den in-vitro-Nachweis des Vorliegens von einem oder mehreren HCV-Genotypen, die in einer biologischen Probe, die diese(n) enthalten kann, verliegen, die mindestens die folgenden Schritte umfaßt: (i) Hybridisieren der Nukleinsäuren der biologischen Probe mit einer oder mehreren Sonden nach Anspruch 5 unter geeigneten Bedingungen, (ii) Waschen unter geeigneten Bedingungen, (iii) Nachweisen der gebildeten Hybride, (iv) Schließen auf das Vorliegen von einem oder mehreren vorhandenen HCV-Genotypen aufgrund des beobachteten Hybridisierungsmusters.
Verwendung einer Polynukleinsäure nach Anspruch 6 für den in-vitro-Nachweis des Vorliegens von einem oder mehreren HCV-Genotypen, die in einer biologischen Probe, die diese(n) enthalten kann, vorliegen, die die Schritte nach Anspruch 6 sowie einen zuvor durchgeführten Schritt, in dem Probenukleinsäure extrahiert wird, umfaßt.
Verwendung einer Polynukleinsäure nach Anspruch 6 für den in-vitro-Nachweis des Vorliegens von einem oder mehreren HCV-Genotypen, die in einer biologischen Probe, die diese(n) enthalten kann, vorliegen, die die Schritte nach Anspruch 6 sowie einen zuvor durchgeführten Schritt, indem Probenukleinsäure extrahiert wird, sowie Amplifikation der Nukleinsäuren mit mindestens einem der Primer nach Anspruch 4 oder einem beliebigen sonstigen HCV-Typ-2-Primer, HCV-Typ-3-Primer, HCV-Typ-4-Primer, HCV-Typ-5-Primer oder HCV-Universalprimer umfaßt.
Peptid oder Polypeptid, das in seiner Sequenz eine aufeinanderfolgende Sequenz von mindestens 20 Aminosäuren eines HCV-Proteins, das von einer beliebigen der genomischen HCV-Sequenzen gemäß SEQ ID NO 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 oder 27 in der Region, die sich über die Nukleotidpositionen 417 bis 957 der Core/E1-Region erstreckt, codiert wird, enthält.
Peptid oder Polypeptid, das in seiner Sequenz eine aufeinanderfolgende Sequenz von mindestens 12 Aminosäuren eines HCV-Proteins, das von einer beliebigen der genomischen HCV-Sequenzen gemäß SEQ ID NO 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 oder 27 in der Region, die sich über die Nukleotidpositionen 417 bis 957 der Core/E1-Region erstreckt, codiert wird, enthält.
Peptid oder Polypeptid, das in seiner Sequenz eine durchgehende Sequenz von mindestens 5 Aminosäuren eines HCV-Proteins, das von einer beliebigen Polynukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 codiert wird, enthält, wobei diese durchgehende Sequenz mindestens einen der folgenden Aminosäurereste des HCV-Polyproteins enthält: I186, H187, A190, S191, W194, Q231, A237, M280, Q299, L308 oder L313, wobei diese Aminosäurebezeichnung aus einem Buchstaben, der den Aminosäurerest gemäß seinem Einbuchstaben-Code darstellt, und einer Ziffer, die die Aminosäurenumerierung in Tabelle 1 darstellt, besteht.
Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die durchgehende Sequenz aus der Reihe der folgenden Peptide stammt: LEWRNTSGLYVL (SEQ ID NO 83) VYEADDVILHT (SEQ ID NO 85) VQDGNTSTCWTPV (SEQ ID NO 87) VQDGNTSTCWTPV (SEQ ID NO 241) VRYVGATTAS (SEQ ID NO 89) RPRRHQTVQT (SEQ ID NO 91) VKYVGATTAS (SEQ ID NO 252).
Rekombinanter Vektor, der eine Vektorsequenz, eine entsprechende prokaryontische, eukaryontische oder Virus-Promotorsequenz und im Anschluß daran die Polynukleinsäuresequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält, wobei der rekombinante Vektor, wenn er als nackte DNA injiziert wird, für vom HCV-Subtyp 3a abgeleitete Polypeptide nach einem der Ansprüche 9 bis 12 in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt oder in lebenden Säugetieren codiert.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 13, der für ein beliebiges der folgenden HCV-Subtyp-3a-Polypeptide, das sich über die folgenden Aminosäurepositionen erstreckt, codiert: – ein Polypeptid, das bei der Aminosäureposition 1 beginnt und für die Expression des Core-Proteins bei einer beliebigen Aminosäureposition in der Region zwischen den Aminosäure positionen 70 und 326 endet und für die Expression des Core-Proteins und des E1-Proteins bei einer beliebigen Aminosäureposition in der Region zwischen den Aminosäurepositionen 1 bis 263 endet; oder – ein Polypeptid, das an einer beliebigen Position der Region zwischen den Aminosäurepositionen 117 und 192 beginnt und für die Expression von E1 an einer beliebigen Aminosäureposition in der Region zwischen den Aminosäurepositionen 263 und 326 endet, oder Formen, bei denen der mutmaßliche Membrananker deletiert ist (Aminosäurepositionen 264 bis 293 plus bzw. minus 8 Aminosäuren); wobei sich diese Bezeichnung auf die Aminosäurenumerierung in Tabelle 1 bezieht.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 14, der die Expression von einem der folgenden HCV-Subtyp-3a-Polypeptide, die sich über die folgenden Aminosäurepositionen erstrecken, ermöglicht: – Polypeptid von den Aminosäurepositionen 119 bis 326 für die Expression von E1, oder Formen, bei denen der mutmaßliche Membrananker deletiert ist (Aminosäurepositionen 264 bis 293 plus bzw. minus 8 Aminosäuren); wobei sich diese Bezeichnung auf die Aminosäurenumerierung in Tabelle 1 bezieht.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei es sich bei dem Polypeptid um ein rekombinantes Polypeptid handelt, das mittels eines Expressionsvektors wie in einem der Ansprüche 13 bis 15 definiert exprimiert wird.
Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 12 für die Verwendung in einem Verfahren zur Immunisierung eines Säugetiers gegen HCV, bei dem man eine ausreichende Menge dieses Peptids oder Polypeptids, damit eine Immunreaktion hervorgerufen wird, verabreicht.
Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 12 für die Verwendung in einem Verfahren zur Immunisierung eines Säugetiers gegen HCV, bei dem man eine ausreichende Menge dieses Peptids oder Polypeptids, damit eine Immunreaktion hervorgerufen wird, sowie pharmazeutisch unbedenkliche Hilfsstoffe verabreicht.
Antikörper, der bei Immunisierung mit einem Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 12 mittels eines Verfahrens wie in den Ansprüchen 17 bis 18 definiert erzeugt wird, wobei der Antikörper spezifisch mit einem der Polypeptide nach einem der Ansprüche 9 bis 12 reaktionsfähig ist.
Verfahren für den in-vitro-Nachweis von HCV, das in einer biologischen Probe, die dieses enthalten kann, vorliegt, das mindestens die folgenden Schritte umfaßt: (i) Inkontaktbringen der biologischen Probe, die auf das Vorliegen von HCV-Antikörpern zu analysieren ist, mit einem beliebigen Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 9 bis 12 oder 16, (ii) Entfernen von nichtgebundenen Komponenten, (iii) Inkubieren der mit heterologen Antikörpern, die spezifisch an die in der zu analysierenden Probe vorliegenden Antikörper binden, gebildeten Immunkomplexe, wobei die heterologen Antikörper unter geeigneten Bedingungen mit einem nachweisbaren Marker konjugiert sind, (iv) Nachweisen des Vorliegens des Immunkomplexes, und zwar entweder visuell oder densitometrisch, und Schließen auf das Vorliegen von HCV.
Verfahren für den in-vitro-Nachweis von HCV, das in einer biologischen Probe, die dieses enthalten kann, vorliegt, das mindestens die folgenden Schritte umfaßt: (i) Inkontaktbringen der biologischen Probe, die auf das Vorliegen von HCV-Antikörpern zu analysieren ist, mit einem beliebigen Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 9 bis 12 oder 16, wobei das Polypeptid in Form eines biotinmarkierten Polypeptids vorliegt und mittels Streptavidin- oder Avidinkomplexen kovalent an ein festes Substrat gebunden ist, (ii) Entfernen von nichtgebundenen Komponenten, (iii) Inkubieren der mit heterologen Antikörpern, die spezifisch an die in der zu analysierenden Probe vorliegenden Antikörper binden, gebildeten Immunkomplexe, wobei die heterologen Antikörper unter geeigneten Bedingungen mit einem nachweisbaren Marker konjugiert sind, (iv) Nachweisen des Vorliegens des Immunkomplexes, und zwar entweder visuell oder densitometrisch, und Schließen auf das Vorliegen von HCV.
Verwendung eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 9 bis 12 oder 16 zum Einbau in einen Serotypbestimmungsassay zum Nachweisen von einem oder mehreren Serotypen von HCV, die in einer biologischen Probe, die diese(n) enthalten kann, vorliegen, die mindestens die folgenden Schritte umfaßt: (i) Inkontaktbringen der biologischen Probe, die auf das Vorliegen von HCV-Antikörpern oder HCV-Antigenen eines oder mehrerer serologischer Typen zu analysieren ist, mit einem beliebigen Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 9 bis 12 oder 16, in immobilisierter Form unter entsprechenden Bedingungen, die die Bildung eines Immunkomplexes gestatten, (ii) Entfernen von nichtgebundenen Komponenten.
Kit zur Bestimmung des Vorliegens von HCV-Genotypen, die in einer biologischen Probe, die diese enthalten kann, vorliegen, das folgendes umfaßt: – mindestens eine Sondenzusammensetzung nach Anspruch 5, – einen Puffer oder Komponenten, die für die Herstellung des Puffers erforderlich sind, wobei dieser Puffer eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und dem HCV-Genotyp ermöglicht, – ein Mittel zum Nachweisen der aus der oben genannten Hybridisierung hervorgegangenen Hybride und Schließen auf den/die HCV-Genotyp(en), der/die in der Probe vorliegt/vorliegen, und zwar aufgrund des beobachteten Hybridisierungsmusters.
Kit zur Bestimmung des Vorliegens von HCV-Genotypen, die in einer biologischen Probe, die diese enthalten kann, vorliegen, das folgendes umfaßt: – mindestens eine Primerzusammensetzung, die einen beliebigen Primer aus der Reihe der in Anspruch 4 definierten Primer oder einen beliebigen anderen HCV-Subtyp-3a oder HCV-Universalprimer enthält, – mindestens eine Sondenzusammensetzung nach Anspruch 5, – einen Puffer oder Komponenten, die für die Herstellung des Puffers erforderlich sind, wobei dieser Puffer eine Hybridisierungsreaktion zwischen diesen Sonden und dem HCV-Genotyp ermöglicht, – ein Mittel zum Nachweisen der aus der oben genannten Hybridisierung hervorgegangenen Hybride und Schließen auf den/die HCV-Genotyp(en), der/die in der Probe vorliegt/vorliegen, und zwar aufgrund des beobachteten Hybridisierungsmusters.
Kit zur Bestimmung des Vorliegens von HCV-Genotypen, die in einer biologischen Probe, die diese enthalten kann, vorliegen, das folgendes umfaßt: (i) mindestens ein Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 12 oder 16, (ii) einen Puffer oder Komponenten, die für die Herstellung des Puffers erforderlich sind, wobei der Puffer eine Bindungsreaktion zwischen diesen Peptiden oder Polypeptiden und den Antikörpern gegen HCV, die in der biologischen Probe vorliegen, ermöglicht, (iii) ein Mittel zum Nachweisen des in der vorhergehenden Bindungsreaktion gebildeten Immunkomplexes.
Verfahren für den in-vitro-Nachweis für, bzw. das in-vitro-Screening auf, HCV-Genotypen, die in einer biologischen Probe vorliegen, das die folgenden Schritte umfaßt: (i) Bereitstellen einer Nukleinsäureprobe, (ii) Amplifizieren einer Polynukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, (iii) Bestimmen der Sequenz einer Polynukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verfahren für den Nachweis für, bzw. das Screening auf, HCV-Genotypen, die in einer biologischen Probe vorliegen, das die folgenden Schritte umfaßt: – Bereitstellen einer Nukleinsäureprobe, – spezifisches Amplifizieren einer Polynukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Kit zum Bestimmen des Vorliegens von HCV-Genotypen, das eine Polynukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfaßt.
Zusammensetzung, die eine Polynukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfaßt.
Zusammensetzung, die ein Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 12 oder 16 umfaßt.